DE69835612T2 - Methoden zur regulierung der serin/threonin protein kinase funktion mit 5-azaquinoxalinderivaten - Google Patents

Methoden zur regulierung der serin/threonin protein kinase funktion mit 5-azaquinoxalinderivaten Download PDF

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Description

  • Hintergrund der Erfindung
  • Die folgende Beschreibung des Hintergrunds der Erfindung wird gegeben, damit die Erfindung besser verstanden wird, aber sie gilt nicht als Stand der Technik der Erfindung.
  • Die zelluläre Signaltransduktion ist ein fundamentaler Mechanismus, durch den externe Stimuli, die verschiedene Zellprozesse steuern, in das Zellinnere weitergegeben werden. Einer der biochemischen Schlüsselmechanismen der Signaltransduktion beinhaltet die reversible Phosphorylierung der Proteine, die die Regulation der Aktivität der reifen Proteine ermöglicht, indem ihre Struktur und Funktion verändert werden.
  • Die am besten charakterisierten Proteinkinasen in Eukaryonten phosphorylieren Proteine an der Alkoholgruppierung von Serin-, Threonin- und Tyrosin-Resten. Diese Kinasen werden zum großen Teil in zwei Gruppen unterteilt, und zwar solche, die spezifisch für die Phosphorylierung von Serin und Threonin sind, und solche, die spezifisch für die Phosphorylierung von Tyrosin sind. Einige Kinasen, die als Kinasen "mit doppelter Spezifität" bezeichnet werden, können sowohl an Tyrosin-, als auch an Serin-/Threonin-Resten phosphorylieren.
  • Proteinkinasen können ebenfalls durch ihre Lokalisierung in der Zelle charakterisiert werden. Einige Kinasen sind Transmembran-Rezeptorproteine, die Liganden außerhalb der Zellmembran binden können. Die Bindung der Liganden verändert die katalytische Aktivität der Rezeptorproteinkinase. Andere sind Nicht-Rezeptor-Proteine, denen eine Transmembrandomäne fehlt. Nicht-Rezeptorproteinkinasen können in einer Vielzahl von zellulären Kompartimenten von der inneren Oberfläche der Zellmembran zum Kern gefunden werden.
  • Viele Kinasen sind an den regulatorischen Kaskaden beteiligt, wo ihre Substrate andere Kinasen umfassen, deren Aktivitäten durch ihren Phosphorylierungszustand reguliert werden. Schließlich wird die Aktivität eines stromabwärts gelegenen Effektors durch eine Phosphorylierung moduliert, die auf einer Aktivierung eines solchen Wegs beruht.
  • Die Serin/Threonin-Kinasefamilie beinhaltet Elemente, die viele Schritte von Signalkaskaden regulieren, einschließlich Kaskaden, die das Zellwachstum, die Wanderung, Differenzierung, Genexpression, Muskelkontraktion, den Glucosemetabolismus, die zelluläre Proteinsynthese, und die Regulation des Zellzyklus steuern.
  • Ein Beispiel für eine Nicht-Rezeptorproteinkinase, die die Proteinziele an Serin- und Threonin-Resten phosphoryliert, ist RAF (rapidly accelerated fibrosarcoma, rasch beschleunigtes Fibrosarkom). RAF moduliert die katalytische Aktivität anderer Proteinkinasen, wie die Proteinkinase, die die mitogenaktivierte Proteinkinase (MAPK) phosphoryliert und somit aktiviert. RAF selbst wird durch das in der Membran verankerte Protein RAS aktiviert, das wiederum in Reaktion auf ligandenaktivierte Tyrosinrezeptorproteinkinasen aktiviert wird, wie den Rezeptor für den epidermalen Wachstumsfaktor (EGFR) und den Rezeptor für den von Plättchen hergeleiteten Wachstumsfaktor (PDGFR). Die biologische Bedeutung von RAF bei der Steuerung von zellulären Ereignissen wird von dem Befund unterstrichen, dass veränderte Formen von RAF in Organismen Krebs verursachen können. Ein Beweis für die Bedeutung von RAF in Malignitäten wird in Monia et al., 1996, Nature Medicine 2: 668 gegeben, das hiermit gesamtinhaltlich einschließlich aller Figuren und Tabellen durch Bezugnahme aufgenommen ist.
  • In einem Versuch, neue Behandlungen für Krebs und andere Erkrankungen zu entdecken, haben Forscher auf dem Gebiet der Biomedizin und Chemiker Moleküle, die die Funktion der Proteinkinasen hemmen, entworfen, synthetisiert und getestet. Einige kleine organische Moleküle bilden eine Klasse von Verbindungen, die die Funktion von Proteinkinasen modulieren. Beispiele für Moleküle, von denen beschrieben wurde, dass sie die Funktion der Proteinkinasen hemmen, sind bismonocyclische, bicyclische oder heterocyclische Arylverbindungen (PCT WO 92/20642), Vinylen-Azaindol-Derivate (PCT WO 94/14808), 1-Cyclopropyl-4-pyridylchinolone (US-Patent Nr. 5 330 992), Styrylverbindungen (von Levitzki, et al., US-Patent Nr. 5 217 999 mit dem Titel "Styryl Compounds which inhibit EGF Receptor Protein Tyrosine Kinase, Lyon & Lyon Docket Nr. 208/050"), styrylsubstituierte Pyridylverbindungen (US-Patent Nr. 5 302 606), bestimmte Chinazolin-Derivate (EP-Anmeldung Nr. 0 566 266 A1), Seleoindole und Selenide (PCT WO 94/03427), tricyclische Polyhydroxylverbindungen (PCT WO 92/21660), und Benzylphosphonsäureverbindungen (PCT WO 91/15495).
  • Die Verbindungen, die die Zellmembranen durchqueren können und gegenüber saurer Hydrolyse beständig sind, sind potentiell vorteilhafte Therapeutika, da sie sehr stark biologisch verfügbar werden, nachdem sie Patienten oral verabreicht werden. Viele dieser Proteinkinase-Inhibitoren hemmen jedoch die Funktion von Proteinkinasen nur schwach. Zudem hemmen viele eine Anzahl von Proteinkinasen und verursachen daher vielfache Nebenwirkungen als Therapeutika für Krankheiten.
  • Trotz des beträchtlichen Fortschritts, der bei der Entwicklung von Verbindungen zur Behandlung von Krebs erzielt wurde, besteht im Fachgebiet weiterhin ein Bedarf daran, die besonderen Strukturen und Substitutionsmuster zu identifizieren, die die zur Modulation der Funktion bestimmter Proteinkinasen fähigen Verbindungen bilden.
  • Kurze Beschreibung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft teilweise Verfahren zur Modulation der Funktion von Serin/Threonin-Proteinkinasen mit auf 5-Azachinoxalin beruhenden Verbindungen. Dabei beinhalten die Verfahren Zellen, die eine Serin/Threonin-Proteinkinase, wie z.B. RAF, exprimieren. Darüber hinaus werden von der Erfindung Verfahren zur Vorbeugung und Behandlung von in Verbindung mit Serin/Threonin-Proteinkinase stehenden anomalen Zuständen in Organismen mit einer mit den hier beschriebenen Verfahren identifizierten Verbindung beschrieben. Weiterhin betrifft die Erfindung mit erfindungsgemäßen Verfahren identifizierte Verbindungen umfassende pharmazeutische Zusammensetzungen.
  • I. Verfahren zum Durchmustern von Verbindungen, die die Serin/Threonin-Proteinkinase-Funktion modulieren
  • Die erfindungsgemäßen Verfahren liefern Maßnahmen zur Modulation der Funktion von Rezeptor- und cytosolischen Serin/Threonin-Proteinkinasen. Diese Verfahren bieten Maßnahmen zur Modulation der Enzyme in vitro und in vivo. Für In-vivo-Anwendungen betreffen die erfindungsgemäßen Verfahren teilweise Verfahren zur Identifikation von Verbindungen, die die Funktion von Serin/Threonin-Proteinkinasen modulieren.
  • Die Erfindung betrifft somit in einem ersten Aspekt ein Verfahren zur Modulation der Funktion einer Serin/Threonin-Proteinkinase mit einer auf Azabenzimidazol beruhenden Verbindung. Die Azabenzimidazol-Verbindung ist gegebenenfalls mit organischen Gruppen substituiert. Das Verfahren umfasst das Zusammenbringen der Zellen, die die Serin/Threonin-Proteinkinase mit der Verbindung exprimieren.
  • Der Begriff "Funktion" betrifft die zelluläre Rolle einer Serin/Threonin-Proteinkinase. Die Serin/Threonin-Proteinkinasefamilie beinhaltet Mitglieder, die viele Schritte in Signalkaskaden regulieren, einschließlich Kaskaden, die das Zellwachstum, die Wanderung, Differenzierung, Genexpression, Muskelkontraktion, den Glucosemetabolismus, die zelluläre Proteinsynthese und Regulation des Zellzyklus steuern.
  • Der Begriff "katalytische Aktivität" im Zusammenhang mit der Erfindung definiert die Rate, mit der eine Proteinkinase ein Substrat phosphoryliert. Die katalytische Aktivität kann gemessen werden, beispielsweise durch Bestimmen der Menge eines Substrats, das in ein Produkt umgewandelt wird, als Funktion der Zeit. Die Phosphorylierung eines Substrats erfolgt am aktiven Zentrum einer Proteinkinase. Das aktive Zentrum ist gewöhnlich ein Hohlraum, in dem das Substrat an die Proteinkinase bindet und es phosphoryliert wird.
  • Der Begriff "Substrat", wie er hier verwendet wird, betrifft ein Molekül, das durch eine Serin/Threonin-Proteinkinase phosphoryliert wird. Das Substrat ist vorzugsweise ein Peptid und stärker bevorzugt ein Protein. In Bezug auf die Proteinkinase RAF sind bevorzugte Substrate MEK (Mitogen and extracellular regulated Kinase, Mitogen- und extrazelluläre regulierte Kinase) und MEK-Substrat-MAPK.
  • Der Begriff "aktiviert" betrifft die Steigerung der zellulären Funktion einer Proteinkinase. Die Proteinkinasefunktion ist vorzugsweise die Wechselwirkung mit einem natürlichen Bindungspartner und am stärksten bevorzugt die katalytische Aktivität.
  • Der Begriff "hemmt" betrifft die Herabsetzung der zellulären Funktion einer Proteinkinase. Die Proteinkinasefunktion ist vorzugsweise die Wechselwirkung mit einem natürlichen Bindungspartner und am stärksten bevorzugt katalytische Aktivität.
  • Der Begriff "moduliert" betrifft die Veränderung der. Funktion einer Proteinkinase durch Steigern oder Senken der Wahrscheinlichkeit, dass sich ein Komplex zwischen einer Proteinkinase und einem natürlichen Bindungspartner bildet. Ein Modulator steigert vorzugsweise die Wahrscheinlichkeit, dass sich ein solcher Komplex zwischen der Proteinkinase und dem natürlichen Bindungspartner bildet, stärker bevorzugt steigert oder senkt er die Wahrscheinlichkeit, dass sich ein Komplex zwischen der Proteinkinase und dem natürlichen Bindungspartner, je nach der Konzentration der Verbindung, die der Proteinkinase ausgesetzt ist, bildet und am stärksten bevorzugt senkt er die Wahrscheinlichkeit, dass sich ein Komplex zwischen der Proteinkinase und dem natürlichen Bindungspartner bildet. Ein Modulator aktiviert vorzugsweise die katalytische Aktivität einer Proteinkinase, insbesondere aktiviert oder inhibiert er die katalytische Aktivität einer Proteinkinase, die von der Konzentration der Verbindung abhängt, die der Proteinkinase ausgesetzt wird, oder am stärksten bevorzugt hemmt er die katalytische Aktivität einer Proteinkinase.
  • Der Begriff "Komplex" betrifft ein Gefüge von mindestens zwei aneinander gebundenen Molekülen. Signaltransduktionskomplexe enthalten oft mindestens zwei Proteinmoleküle, die aneinander gebunden sind. Eine Protein-Tyrosin-Rezeptorproteinkinase, GRB2, SOS, RAF und RAS bilden beispielsweise zusammengebaut einen Signaltransduktionskomplex in Reaktion auf einen mitogenen Liganden.
  • Der Begriff "natürlicher Bindungspartner" betrifft Polypeptide, die an eine Proteinkinase in Zellen binden. Natürliche Bindungspartner können bei der Weiterverbreitung eines Signals in einem Proteinkinase-Signaltransduktions-Prozess eine Rolle spielen. Ein Wechsel bei der Wechselwirkung zwischen einer Proteinkinase und einem natürlichen Bindungspartner kann sich selbst als erhöhte oder gesenkte Wahrscheinlichkeit, dass die Wechselwirkung zustande kommt, oder als gesteigerte oder gesenkte Konzentration des Komplexes aus Proteinkinase und natürlichem Bindungspartner manifestieren.
  • Ein natürlicher Bindungspartner einer Proteinkinase kann an einen intrazellulären Bereich einer Proteinkinase mit hoher Affinität binden. Eine hohe Affinität stellt eine Gleichgewichts-Bindungskonstante in der Größenordnung von 10–6 M oder weniger dar. Zudem kann ein natürlicher Bindungspartner ebenfalls transient mit dem intrazellulären Bereich einer Proteinkinase Wechselwirken und ihn chemisch modifizieren. Die natürlichen Bindungspartner einer Proteinkinase werden ausgewählt aus einer Gruppe, die SRC-Homologie-Domänen 2 (SH2) oder 3 (SH3), andere Phosphoryl-Tyrosin-Bindungsdomänen (PTB), Guaninnukleotid-Austauschfaktoren, Proteinphosphatasen, und andere Proteinkinasen umfasst, aber nicht darauf beschränkt ist. Verfahren zur Bestimmung von Änderungen der Wechselwirkungen zwischen Proteinkinasen und ihren natürlichen Bindungspartnern sind im Stand der Technik leicht zugänglich.
  • Der Begriff "Serin/Threonin-Proteinkinase" betrifft ein Enzym mit einer Aminosäuresequenz mit mindestens 10% Aminosäureidentität zu anderen Enzymen, die Proteine an Serin- und Threonin-Resten phosphorylieren. Eine Serin/Threonin-Proteinkinase katalysiert die Zugabe von Phosphat zu Proteinen an Serin- und Threoninresten. Serin/Threonin-Proteinkinasen können als membrangebundene Proteine oder cytosolische Proteine vorliegen.
  • Der Begriff "zusammenbringen", wie er hier verwendet wird, betrifft das Mischen einer Lösung, die eine erfindungsgemäße 5-Azachinoxalin-Verbindung umfasst, mit einem flüssigen Medium, worin die Zellen der Verfahren gebadet werden. Die Lösung, die die Verbindung umfasst, kann ebenfalls eine andere Komponente, wie Dimethylsulfoxid (DMSO) umfassen, die die Aufnahme der 5-Azachinoxalin-Verbindung oder -Verbindungen in die Zellen der Verfahren ermöglicht.
  • Die Lösung, die die 5-Azachinoxalin-Verbindung umfasst, kann zu dem Medium dazugegeben werden, worin die Zellen durch Verwendung einer Zufuhrvorrichtung, wie einer Vorrichtung auf Pipettenbasis oder auf Spritzenbasis, gebadet werden.
  • Der Begriff "auf 5-Azachinoxalin beruhende Verbindung" betrifft eine organische 5-Azachinoxalin-Verbindung, die mit chemischen Substituenten substituiert ist. 5-Azachinoxalin-Verbindungen haben die allgemeine Struktur:
    Figure 00080001
  • Der Begriff "substituiert" betrifft erfindungsgemäß eine 5-Azachinoxalin-Verbindung, die mit einer beliebigen Zahl chemischer Substituenten derivatisiert ist.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung das Verfahren zur Modulation der Funktion einer Serin/Threonin-Proteinkinase, worin die Proteinkinase RAF ist.
  • Die RAF-Proteinkinase phosphoryliert Proteinziele auf Serin- oder Threonin-Resten. Ein solches Proteinziel ist die Proteinkinase (MEK), die die mitogenaktivierte Proteinkinase (MAPK) phosphoryliert und somit aktiviert. RAF selbst wird durch das membrangebundene guanintriphosphathydrolysierende Enzym RAS in Reaktion auf die mitogenstimulierten Rezeptorprotein-Tyrosinkinasen, wie den Rezeptor für den epidermalen Wachstumsfaktor (EGRF) und den Rezeptor für den von Plättchen abgeleiteten Wachstumsfaktor (PDGFR) aktiviert.
  • Die erfindungsgemäßen Verfahren können Verbindungen erfassen, die die Funktion der RAF-Proteinkinase in Zellen modulieren. RAF phiosphoryliert eine Proteinkinase (MEK), die wiederum die mitogenaktivierte Proteinkinase (MAPK) phosphoryliert. Tests, die nur die Phosphorylierung von MEK durch RAF überwachen, sind nicht empfindlich, weil MEK nicht signifikant genug phosphoryliert wird. Zur Bewältigung dieses Empfindlichkeits-Dilemmas, wird die Phosphorylierung von MEK und MAPK in den erfindungsgemäßen Tests verfolgt. Das MAPK-Phosphorylierungssignal amplifiziert das MEK-Phosphorylierungssignal und ermöglicht, dass eine RAF-abhängige Phosphorylierung in den Tests, wie Enzymimmuntests, verfolgt wird. Zudem erfolgt der erfindungsgemäße Test in einem Hochdurchsatzformat, so dass viele Verbindungen in einem kurzen Zeitraum rasch überwacht werden können.
  • In einem anderen Aspekt beschreibt die Erfindung ein Verfahren zur Identifikation von Verbindungen, die die Funktion der Serin/Threonin-Proteinkinase modulieren, umfassend die Schritte Zusammenbringen der Zellen, die die Serin/Threonin-Proteinkinase exprimieren, mit der Verbindung, und Überwachen der Wirkung auf die Zellen.
  • Der Begriff "Überwachen" betrifft die Beobachtung der Wirkung der Zugabe der Verbindungen zu den Zellen des Verfahrens. Die Wirkung kann in einer Änderung des Zellphänotyps, der Zellproliferation, der katalytischen Proteinkinase-Aktivität oder der Wechselwirkung zwischen einer Proteinkinase und einem natürlichen Bindungspartner manifestiert werden.
  • Der Begriff "Wirkung" betrifft eine Änderung oder ein Fehlen einer Änderung in einem Zellphänotyp oder einer Zellproliferation. "Wirkung" kann ebenfalls eine Änderung oder ein Fehlen einer Änderung der katalytischen Aktivität der Proteinkinase beschreiben. "Wirkung" kann ebenfalls eine Änderung oder ein Fehlen einer Änderung der Wechselwirkung zwischen der Proteinkinase und einem natürlichen Bindungspartner beschreiben.
  • Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung betrifft das Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, die die Funktion von Serin/Threonin-Proteinkinase modulieren, worin die Wirkung eine Änderung oder ein Fehlen einer Änderung des Zellphänotyps ist.
  • Der Begriff "Zellphänotyp" betrifft die äußerliche Erscheinung einer Zelle oder eines Gewebes oder die Funktion der Zelle oder des Gewebes. Beispiele für den Zellphänotyp sind die Zellgröße (Reduktion oder Vergrößerung), Zellproliferation (erhöhte oder verringerte Anzahl der Zellen), Zelldifferenzierung (eine Änderung oder ein Fehlen der Änderung der Zellform), Zellüberleben, Apoptose (Zelltod) oder die Verwendung eines metabolischen Nährstoffs (z.B. Glucoseaufnahme). Änderungen oder das Fehlen von Änderungen im Zellphänotyp werden leicht durch Techniken des Standes der Technik gemessen.
  • Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung das Verfahren zur Identifikation von Verbindungen, die die Funktion der Serin/Threonin-Proteinkinase modulieren, worin die Wirkung eine Änderung oder das Fehlen einer Änderung der Zellproliferation ist.
  • Der Begriff "Zellproliferation" betrifft die Rate, mit der sich eine Gruppe von Zellen teilt. Die Anzahl von Zellen, die in einem Gefäß wachsen, kann durch einen Fachmann quantifiziert werden, wenn dieser die Anzahl der Zellen in einem definierten Volumen mit einem üblichen Lichtmikroskop optisch zählt. Alternativ können die Zellproliferationsraten durch Laborvorrichtungen quantifiziert werden, die die Dichte der Zellen in einem geeigneten Medium optisch oder konduktiv messen.
  • Bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Identifikation von Verbindungen, die die Funktion der Serin/Threonin-Proteinkinase modulieren, worin die Wirkung eine Änderung oder ein Fehlen einer Änderung der Wechselwirkung zwischen der Serin/Threonin-Proteinkinase mit einem natürlichen Bindungspartner ist.
  • Der Begriff "Wechselwirkung" beschreibt im Zusammenhang mit der Erfindung einen Komplex, der sich zwischen einem intrazellulären Bereich einer Proteinkinase und einem natürlichen Bindungspartner oder einer Verbindung bildet. Der Begriff "Wechselwirkung" kann sich ebenfalls auf einen Komplex ausdehnen, der sich zwischen einer erfindungsgemäßen Verbindung mit intrazellulären Bereichen und extrazellulären Bereichen der untersuchten Proteinkinasen bildet. Eine cytosolische Proteinkinase hat zwar keinen extrazellulären Bereich, jedoch birgt eine Rezeptor-Proteinkinase einen extrazellulären und einen intrazellulären Bereich.
  • Der Begriff "intrazellulärer Bereich", wie er hier verwendet wird, betrifft den Teil einer Proteinkinase, der im Inneren einer Zelle vorliegt. Der Begriff "extrazellulärer Bereich", wie er hier verwendet wird, betrifft einen Teil einer Proteinkinase, der außerhalb der Zelle vorliegt.
  • Bei einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung das Verfahren zur Identifikation von Verbindungen, die die Funktion der Serin/Threonin-Proteinkinase modulieren, welches weiterhin die folgenden Schritte umfasst: (a) Lysieren der Zellen, so dass ein Lysat erhalten wird, das Serin/Threonin-Proteinkinase enthält; (b) Adsorbieren der Serin/Threonin-Proteinkinase an einen Antikörper; (c) Inkubation der adsorbierten Serin/Threonin-Proteinkinase mit einem oder mehreren Substraten; und (d) Adsorbieren des oder der Substrate an einen festen Träger oder einen Antikörper. Der Schritt Überwachen der Wirkung der Zellen, umfasst das Messen der Phosphatkonzentration von dem oder den Substraten.
  • Der Begriff "Lysieren", wie er hier verwendet wird, betrifft ein Verfahren zum Unterbrechen der Integrität einer Zelle; so dass dessen Inhalt freigesetzt wird. Die Zelllyse wird durch viele Techniken, die dem Fachmann bekannt sind, bewerkstelligt. Das Verfahren erfolgt vorzugsweise durch Ultraschallbehandlung oder Zellschertechniken und stärker bevorzugt durch Detergenztechniken.
  • Der Begriff "Antikörper", wie er hier verwendet wird, betrifft ein Proteinmolekül, das spezifisch an eine Proteinkinase bindet. Ein Antikörper bindet vorzugsweise an eine Proteinkinase-Klasse, und stärker bevorzugt an die RAF-Proteinkinase.
  • Der Begriff "bindet spezifisch", wie er hier verwendet wird, betrifft einen Antikörper, der eine Proteinkinase mit höherer Affinität bindet als eine andere Proteinkinase oder ein zelluläres Protein. Ein Antikörper, der speziell an eine Proteinkinase bindet, bindet eine höhere Konzentration der spezifischen Proteinkinase als eine andere Proteinkinase oder ein zelluläres Protein.
  • Der Begriff "Adsorbieren", wie er hier verwendet wird, betrifft die Bindung eines Moleküls an die Oberfläche eines Antikörpers oder festen Trägers. Beispiele für feste Träger sind chemisch modifizierte Cellulose, wie Phosphocellulose, und Nylon. Antikörper können an feste Träger gebunden sein, worin Techniken verwendet werden, die dem Fachmann gut bekannt sind. Siehe z.B. Harlo & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, 1989, Cold Spring Harbor Laboratories.
  • Der Begriff "Messen der Phosphatkonzentration", wie er hier verwendet wird, betrifft Techniken, die dem Fachmann gemeinhin bekannt sind. Diese Techniken können die Quantifizierung der Konzentration der Phosphatkonzentrationen innerhalb eines Substrats oder die Bestimmung der relativen Mengen an Phosphat innerhalb eines Substrats beinhalten. Diese Techniken können die Adsorption des Substrates an eine Membran und das Erfassen der Menge Phosphat in dem Substrat durch Messung der Radioaktivität beinhalten.
  • Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Identifikation von Verbindungen, die die Funktion von Serin/Threonin-Proteinkinase modulieren, weiterhin umfassend die folgenden Schritte: (a) Lysieren der Zellen, so dass ein Lysat erhalten wird, das RAF enthält; (b) Adsorbieren von RAF an einen Antikörper; (c) Inkubieren des adsorbierten RAF mit MEK und MAPK; und (d) Adsorbieren von MEK und MAPK an einen festen Träger oder einen oder mehrere Antikörper. Der Schritt Messen der Wirkung auf die Zellen umfasst das Überwachen der Phosphatkonzentration von MEK und MAPK.
  • Die Erfindung betrifft in einer bevorzugten Ausführungsform das Verfahren zur Identifikation von Verbindungen, die die Funktion der Serin/Threonin-Proteinkinase modulieren, worin die auf 5-Azachinoxalin beruhende Verbindung die Struktur der Formel I, wie sie hier definiert ist, aufweist oder von einer der Subgruppen, wie sie hier definiert ist.
  • Der Begriff "Verbindung" betrifft die Verbindung oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz, Ester, Amid, Prodrug, Isomer oder Metabolit davon.
  • Der Begriff "pharmazeutisch verträgliches Salz" betrifft eine Formulierung einer Verbindung, die die biologische Aktivität und die Eigenschaften der Verbindung nicht aufhebt. Pharmazeutisch verträgliche Salze können erhalten werden durch Umsetzen einer erfindungsgemäßen Verbindung mit anorganischen oder organischen Säuren, wie Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Salpetersäure, Phosphorsäure, Methansulfonsäure, Ethansulfonsäure, p-Toluolsulfonsäure, Salicylsäure und dergleichen.
  • Der Begriff "Prodrug" betrifft ein Mittel, das in vivo in das Stamm-Medikament umgewandelt wird. Prodrugs können in einigen Situationen leichter als das Stamm-Medikament verabreicht werden. Das Prodrug kann beispielsweise durch orale Verabreichung biologisch verfügbar gemacht werden, das Stamm-Medikament jedoch nicht, oder das Prodrug kann die Löslichkeit verbessern, damit eine intravenöse Verabreichung ermöglicht wird.
  • Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Identifikation von Verbindungen, die die Funktion der Serin/Threonin-Proteinkinase modulieren, worin die auf 5-Azachinoxalin beruhende auf Verbindung die Struktur der Formel I hat, worin die auf 5-Azachinoxalin beruhende Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe der SAQAR-Verbindungen.
  • Der Begriff "SAQAR-Verbindungen" betrifft die Gruppe der auf 5-Azachinoxalin beruhenden Verbindungen mit einer Struktur, wie sie in der Formel I angegeben ist, die in der nachstehenden Tabelle von A-1 bis A-90 durchnummeriert sind.
  • Figure 00140001
  • Figure 00150001
  • Figure 00160001
  • II. Verfahren zur Vorbeugung oder Behandlung anormaler Zustände
  • In einem weiteren Aspekt wird in der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Vorbeugung oder Behandlung eines anomalen Zustands in einem Organismus vorgestellt. Das Verfahren umfasst die folgenden Schritte: (a) Verabreichen einer erfindungsgemäßen Verbindung, wie sie hier durch die Formel I mit allen hier angegebenen Beschränkungen spezifiziert ist, an einen Organismus; und (b) Fördern oder Unterbrechen der anomalen Wechselwirkung.
  • Der Begriff "Organismus" betrifft ein Lebewesen, das mindestens eine Zelle umfasst. Ein Organismus kann einfach, wie eine eukaryotische Zelle, oder komplex, wie ein Säugetier sein. In bevorzugten Ausführungsformen betrifft ein Organismus Menschen oder Säugetiere.
  • Der Begriff "Verhindern" betrifft das erfindungsgemäße Verfahren, mit dem die Möglichkeit gesenkt wird, oder die Wahrscheinlichkeit eliminiert wird, dass ein Organismus den anomalen Zustand übernimmt oder entwickelt.
  • Der Begriff "Behandeln" betrifft das erfindungsgemäße Verfahren, das eine therapeutische Wirkung hat, und die den anomalen Zustand in dem Organismus zumindest teilweise abschwächt oder aufhebt.
  • Der Begriff "therapeutische Wirkung" betrifft die Hemmung des Zellwachstums, das einen anomalen Zustand (z.B. Krebs) verursacht oder dazu beiträgt. Der Begriff "therapeutische Wirkung" betrifft ebenfalls die Hemmung der Wachstumsfaktoren, die den anomalen Zustand verursachen oder dazu beitragen. Eine therapeutische Wirkung lindert in gewissem Maße ein oder mehrere Symptome des anomalen Zustands. In Bezug auf die Behandlung einer Krebserkrankung bedeutet eine therapeutische Wirkung einen oder mehrere der folgenden Punkte: (a) eine Reduktion der Tumorgröße; (b) Hemmung (d.h. Verlangsamung oder Abstoppen) der Tumor-Metastase; (c) Hemmung des Tumorwachstums; und (d) Lindern, in gewissem Maße, eines oder mehrerer Symptome, die mit dem anomalen Zustand einhergehen. Verbindungen, die Wirkung gegen Leukämien zeigen, können wie hier beschrieben identifiziert werden, außer dass die Verbindungen die Zellproliferation oder das Zellwachstum verlangsamen oder senken, statt die Metastase zu hemmen.
  • Der Begriff "anomaler Zustand" betrifft eine Funktion in den Zellen oder Geweben eines Organismus, die von ihren normalen Funktionen in diesem Organismus abweicht. Ein anomaler Zustand kann die Zellproliferation, Zelldifferenzierung oder das Zellüberleben betreffen.
  • Aberrante Zellproliferationszustände umfassen Krebserkrankungen, wie fibrotische und mesangiale Störungen, anomale Angiogenese und Vasculogenese, Wundheilung, Psoriasis, Diabetes mellitus und Entzündung.
  • Aberrante Differenzierungszustände umfassen, sind aber nicht eingeschränkt auf neurodegenerative Störungen, langsame Wundheilungsraten und Gewebe-Transplantationstechniken.
  • Aberrante Zellüberlebenszustände sind Zustände, in denen die Wege für den programmierten Zelltod (Apoptose) aktiviert oder aufgehoben sind. Eine Anzahl von Proteinkinasen sind mit den Apoptose-Wegen assoziiert. Aberrationen in der Funktion von einer der Proteinkinasen könnten zur Zellimmortalität oder zu vorzeitigem Zelltod führen.
  • Zellproliferation, Differenzierung und Überleben sind Phänomene, die sich einfach durch Verfahren des Standes der Technik messen lassen. Diese Verfahren können das Beobachten der Anzahl von Zellen oder der Erscheinung der Zellen unter einem Mikroskop über die Zeit (beispielsweise Tage) beinhalten.
  • Der Begriff "Verabreichen" betrifft allgemein das Bereitstellen an einen Organismus und spezifisch ein Verfahren zum Aufnehmen einer Verbindung in die Zellen oder Gewebe eines Organismus. Der anomale Zustand kann verhindert oder behandelt werden, wenn die Zellen oder Gewebe des Organismus innerhalb oder außerhalb des Organismus existieren. Zellen, die außerhalb des Organismus existieren, lassen sich in Zellkulturschalen halten oder züchten. Für Zellen, die sich innerhalb des Organismus befinden, gibt es viele Techniken im Stand der Technik zur Verabreichung der Verbindungen, einschließlich (aber nicht eingeschränkt auf) orale, parenterale, dermale, Injektions- und Aerosol-Anwendungen. Für Zellen außerhalb des Organismus gibt es viele Techniken im Stand der Technik zur Verabreichung der Verbindungen, einschließlich (aber nicht eingeschränkt auf) Zellmikroinjektionstechniken, Transformationstechniken und Träger-Techniken.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Vorbeugung oder Behandlung eines anormalen Zustands in einem Organismus, worin die auf 5-Azachinoxalin beruhende Verbindung eine in der Formel I, wie sie hier definiert ist, angegebene Struktur oder eine der hier angegebenen Untergruppen davon aufweist.
  • In weiteren bevorzugten Ausführungsformen betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Vorbeugung oder Behandlung eines anormalen Zustands in einem Organismus, worin die eine in der Formel I angegebene Struktur aufweisende, auf 5-Azachinoxalin beruhende Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SAQAR-Verbindungen.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Vorbeugung oder Behandlung eines anormalen Zustands in einem Organismus, worin es sich bei dem Organismus um ein Säugetier handelt.
  • Der Begriff "Säugetier" bezieht sich vorzugsweise auf solche Organismen wie Mäuse, Ratten, Kaninchen, Meerschweinchen und Ziegen, stärker bevorzugt auf Affen und Menschenaffen und am stärksten bevorzugt auf den Menschen.
  • In noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Vorbeugung oder Behandlung eines anormalen Zustands in einem Organismus, worin es sich bei dem anormalen Zustand um eine Krebserkrankung oder eine fibrotische Erkrankung handelt.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Vorbeugung oder Behandlung eines anomalen Zustands in einem Organismus, worin die Krebserkrankung ausgewählt ist aus der Gruppe Lungenkrebs, Ovarialkarzinom, Brustkrebs, Hirnkarzinom, intraaxiales Hirnkarzinom, Darmkrebs, Prostatakrebs, Sarkom, Kaposi-Sarkom, Melanom und Gliom.
  • In noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Vorbeugung oder Behandlung eines anormalen Zustands in einem Organismus, worin das Verfahren auf einen mit einer Aberration in einem Signaltransduktionsweg assoziierten anormalen Zustand, der durch eine Wechselwirkung zwischen einer Serin/Threonin-Proteinkinase und einem natürlichen Bindungspartner gekennzeichnet ist, angewandt wird.
  • Der Begriff "Signaltransduktionsweg" betrifft die Weiterverbreitung eines Signals. Gewöhnlich wird ein extrazelluläres Signal durch die Zellmembran übertragen, so dass es zu einem intrazellulären Signal wird. Dieses Signal kann dann eine Zellreaktion stimulieren. Der Begriff umfasst auch Signale, die sich vollständig in einer Zelle verbreiten. Die an den Signaltransduktionsprozessen beteiligten Polypetidmoleküle sind gewöhnlich Rezeptor- und Nicht-Rezeptorproteinkinasen, Rezeptor- und Nicht-Rezeptorproteinphosphatasen, Nucleotidaustauschfaktoren, und Transkriptionsfaktoren.
  • Der Begriff "Aberration", im Zusammenhang mit einem Signaltransduktionsprozess, betrifft eine Proteinkinase, die in einem Organismus über- oder unterexprimiert wird, derart mutiert ist, dass ihre katalytische Aktivität niedriger oder höher als die Proteinkinase-Aktivität des Wildtyps ist, derart mutiert ist, dass sie nicht länger mit einem natürlichen Bindungspartner wechselwirken kann, nicht länger durch eine andere Proteinkinase oder Proteinphosphatase modifiziert ist, oder nicht länger mit einem natürlichen Bindungspartner wechselwirkt.
  • Der Begriff "fördert oder unterbricht die anomale Wechselwirkung" betrifft ein Verfahren, das durch Verabreichen einer erfindungsgemäßen Verbindung an Zellen oder Geweben in einem Organismus erfolgt. Eine Verbindung kann eine Wechselwirkung zwischen einer Proteinkinase und natürlichen Bindungspartnern fördern, indem günstige Wechselwirkungen mit mehreren Atomen an der Komplexgrenzfläche eingegangen werden. Alternativ kann eine Verbindung die Wechselwirkung zwischen einer Proteinkinase und natürlichen Bindungspartnern hemmen, indem günstige Wechselwirkungen, die zwischen Atomen an der Komplexgrenzfläche gebildet werden, beeinträchtigt werden. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Vorbeugung oder Behandlung eines anomalen Zustands in einem Organismus, worin die Serin/Threonin-Proteinkinase RAF ist.
  • III. Erfindungsgemäße Verbindungen und pharmazeutische Zusammensetzungen
  • In einem weiteren Aspekt werden von der vorliegenden Erfindung 5-Azachinoxalin-Verbindungen mit in der Formel I:
    Figure 00210001
    angegebenen Strukturen vorgestellt, worin
    • (a) R1, R2 und R6 jeweils unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe: (i) Wasserstoff; (ii) gesättigtes oder ungesättigtes Alkyl; (iii) ein Amin der Formel NX2X3, worin X2 und X3 unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe Wasserstoff, gesättigtes oder ungesättigtes Alkyl und fünfgliedrige oder sechsgliedrige Aryl- oder Heteroarylringgruppierungen; (iv) Halogen oder Trihalogenmethyl; (v) ein Keton der Formel -CO-X4, worin X4 ausgewählt ist aus der Gruppe Wasserstoff, Alkyl und fünfgliedrige oder sechsgliedrige Aryl- oder Heteroarylgruppierungen; (vi) eine Carbonsäure der Formel -(X5)n-COOH oder -ester der Formel -(X6)n-COO-X7, worin X5, X6 und X7 unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe Alkyl und fünfgliedrige oder sechsgliedrige Aryl- oder Heteroarylgruppierungen und worin n gleich 0 oder 1 ist; (vii) ein Alkohol der Formel (X8)n-OH oder eine Alkoxygruppierung der Formel -(X8)n-O-X9, worin X8 und X9 unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe Wasserstoff, gesättigtes oder ungesättigtes Alkyl und fünfgliedrige oder sechsgliedrige Aryl- oder Heteroarylringgruppierungen, worin der Ring gegebenenfalls mit einem oder mehreren Substituenten, unabhängig ausgewählt aus der Gruppe Alkyl, Halogen, Trihalogenmethyl, Carboxylat, Nitro und Ester, substituiert ist und worin n gleich 0 oder 1 ist; (viii) ein Amid der Formel -NHCOX10, worin X10 ausgewählt ist aus der Gruppe Alkyl, Hydroxyl und fünfgliedrige oder sechsgliedrige Aryl- oder Heteroarylringgruppierungen, worin der Ring gegebenenfalls mit einem oder mehreren Substituenten, unabhängig ausgewählt aus der Gruppe Alkyl, Halogen, Trihalogenmethyl, Carboxylat, Nitro oder Ester, substituiert ist; (ix) -SO2NX11X12, worin X11 und X12 unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe Wasserstoff, Alkyl und fünfgliedrige oder sechsgliedrige Aryl- oder Heteroarylringgruppierungen; (x) eine fünfgliedrige oder sechsgliedrige Aryl- oder Heteroarylringgruppierung, gegebenenfalls substituiert mit einem, zwei oder drei Substituenten, unabhängig ausgewählt aus der Gruppe Alkyl-, Halogen-, Trihalogenmethyl-, Carboxylat-, Nitro- und Estergruppierungen; (xi) ein Aldehyd der Formel -CO-H; und (xii) ein Sulfon der Formel -SO2-X13, worin X13 ausgewählt ist aus der Gruppe gesättigtes oder ungesättigtes Alkyl und fünfgliedrige oder sechsgliedrige Aryl- oder Heteroarylgruppierungen; und
    • (b) X1 ausgewählt ist aus der Gruppe Stickstoff und Schwefel.
  • Der Begriff "gesättigtes Alkyl" betrifft eine Alkylgruppierung, die keine Alken- oder Alkingruppierungen enthält. Die Alkylgruppierung kann verzweigt oder nicht-verzweigt sein.
  • Der Begriff "ungesättigtes Alkyl" betrifft eine Alkylgruppierung, die mindestens eine Alken- oder Alkingruppierung enthält. Die Alkylgruppierung kann verzweigt oder nicht-verzweigt sein.
  • Der Begriff "Amin" betrifft eine chemische Gruppierung der Formel NR1R2, worin R1 und R2 unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, gesättigtem oder ungesättigtem Alkyl und fünfgliedrigen oder sechsgliedrigen Aryl- oder Heteroarylringgruppierungen, worin der Ring gegebenenfalls mit einem oder mehreren Substituenten substituiert ist, die unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Alkyl-, Halogen-, Trihalogenmethyl-, Carboxylat-, Nitro- und Estergruppierungen.
  • Der Begriff "Aryl" betrifft einen aromatischen Rest, der mindestens einen Ring mit einem konjugierten pi-Elektronensystem aufweist, und carbocyclische Aryl- (z.B. Phenyl) und heterocyclische Arylgruppen (z.B. Pyridin) beinhaltet. Der Begriff "carbocyclisch" betrifft eine Verbindung, die eine oder mehrere kovalent geschlossene Ringstrukturen aufweisen, und dies beinhaltet, dass die Atome, die das Gerüst des Rings bilden, sämtlich Kohlenstoffatome sind. Der Begriff unterscheidet somit carbocyclische von heterocyclischen Ringen, in denen das Ringgerüst, mindestens ein Atom enthält, das sich von Kohlenstoff unterscheidet. Der Begriff "Heteroaryl" betrifft eine Arylgruppe, die mindestens einen heterocyclischen Ring enthält.
  • Der Begriff "Halogen" betrifft ein Atom, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Fluor, Chlor, Brom und Iod.
  • Der Begriff "Keton" betrifft eine chemische Gruppierung mit der Formel -(R)n-CO-R', worin R und R' ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus gesättigtem oder ungesättigtem Alkyl und fünfgliedrigen oder sechsgliedrigen Aryl- oder Heteroarylringgruppierungen, und worin n gleich 0 oder 1 ist.
  • Der Begriff "Carbonsäure" betrifft eine chemische Gruppierung der Formel -(R)n-COOH, worin R ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus gesättigtem oder ungesättigtem Alkyl und fünfgliedrigen oder sechsgliedrigen Aryl- oder Heteroarylgruppierungen, und worin n gleich 0 oder 1 ist.
  • Der Begriff "Ester" betrifft eine chemische Gruppierung der Formel -(R)n-COOR', worin R und R' unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus gesättigtem oder ungesättigtem Alkyl und fünfgliedrigen oder sechsgliedrigen Aryl- oder Heteroarylgruppierungen, und worin n gleich 0 oder 1 ist.
  • Der Begriff "Alkohol" betrifft einen chemischen Substituenten der Formel -ROH, worin R ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, gesättigtem oder ungesättigtem Alkyl und fünfgliedrigen oder sechsgliedrigen Aryl- oder Heteroarylringgruppierungen, worin der Ring gegebenenfalls substituiert ist mit einem oder mehreren Substituenten, unabhängig ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Alkyl-, Halogen-, Trihalogenmethyl-, Carboxylat-, Nitro- und Estergruppierungen.
  • Der Begriff "Amid" betrifft einen chemischen Substituenten der Formel -NHCOR, worin R ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Alkyl, Hydroxyl und fünfgliedrigen oder sechsgliedrigen Aryl- oder Heteroarylringgruppierungen, worin der Ring gegebenenfalls substituiert ist mit einem oder mehreren Substituenten, die unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Alkyl, Halogen, Trihalogen, Carboxylat, Nitro oder Ester.
  • Der Begriff "Alkoxygruppierung" betrifft einen chemischen Substituenten der Formel -OR, worin R Wasserstoff oder eine gesättigte oder ungesättigte Alkylgruppierung ist.
  • Der Begriff "Aldehyd" betrifft eine chemische Gruppierung der Formel -(R)n-CHO, worin R ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus gesättigtem oder ungesättigtem Alkyl und fünfgliedrigen oder sechsgliedrigen Aryl- oder Heteroarylringgruppierungen und worin n gleich 0 oder 1 ist.
  • Der Begriff "Sulfon" betrifft eine chemische Gruppierung der Formel -SO2-R, worin R ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus gesättigtem oder ungesättigtem Alkyl und fünfgliedrigen oder sechsgliedrigen Aryl- oder Heteroarylringgruppierungen.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung auf 5-Azachinoxalin beruhende Verbindung mit einer in der Formel I angegebenen Struktur, worin R3 und R4 unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe Wasserstoff und gesättigtes oder ungesättigtes Alkyl.
  • In noch einer weiteren bevorzugt Ausführungsform betrifft die Erfindung eine auf 5-Azachinoxalin beruhende Verbindung mit einer Struktur der Formel I angegebenen Struktur, worin R3 und R4 jeweils für Wasserstoff stehen.
  • In weiteren bevorzugten Ausführungsformen betrifft die Erfindung eine auf 5-Azachinoxalin beruhende Verbindung mit einer in der Formel I angegebenen Struktur, worin R1 und R2 ausgewählt sind aus der Gruppe Wasserstoff, gesättigtes oder ungesättigtes Alkyl, eine fünfgliedrige oder sechsgliedrige Aryl- oder Heteroarylringgruppierung, gegebenenfalls substituiert mit einem, zwei oder drei Substituenten, unabhängig ausgewählt aus der Gruppe Alkyl-, Halogen-, Trihalogenmethyl-, Hydroxy-, Alkoxy-, Carboxylat-, Nitro- oder Estergruppierungen.
  • In noch weiteren bevorzugten Ausführungsformen betrifft die Erfindung eine auf 5-Azachinoxalin beruhende Verbindung mit einer in der Formel I angegebenen Struktur, worin R1 für Phenyl, gegebenenfalls substituiert mit einem, zwei oder drei Substituenten, unabhängig ausgewählt aus der Gruppe Alkyl-, Halogen-, Hydroxy- und Alkoxygruppierungen, steht.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung eine auf 5-Azachinoxalin beruhende Verbindung mit einer in der Formel I angegebenen Struktur, worin R1 für Phenyl steht.
  • In noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung eine auf 5-Azachinoxalin beruhende Verbindung mit einer in der Formel I angegebenen Struktur, worin R1 für 4-Hydroxyphenyl steht.
  • In weiteren bevorzugten Ausführungsformen betrifft die Erfindung eine auf 5-Azachinoxalin beruhende Verbindung mit einer in der Formel I angegebenen Struktur, worin R2 ausgewählt ist aus der Gruppe Wasserstoff, gesättigtes oder ungesättigtes Alkyl sowie Phenyl, gegebenenfalls substituiert mit einem, zwei oder drei Substituenten, unabhängig ausgewählt aus der Gruppe Alkyl-, Halogen-, Hydroxy- und Alkoxygruppierungen.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung eine auf 5-Azachinoxalin beruhende Verbindung mit einer in der Formel I angegebenen Struktur, worin R2 für Wasserstoff steht.
  • In noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung eine auf 5-Azachinoxalin beruhende Verbindung mit einer in der Formel I angegebenen Struktur, worin R2 für Methyl steht.
  • In noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung eine auf 5-Azachinoxalin beruhende Verbindung mit einer in der Formel I angegebenen Struktur, worin R2 für Phenyl steht.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung eine auf 5-Azachinoxalin beruhende Verbindung mit einer in der Formel I angegebenen Struktur, worin das X1 für Stickstoff steht.
  • In weiteren bevorzugten Ausführungsformen betrifft die Erfindung eine auf 5-Azachinoxalin beruhende Verbindung mit einer in der Formel I angegebenen Struktur, worin R6 ausgewählt ist aus der Gruppe Wasserstoff; gesättigtes oder ungesättigtes Alkyl, gegebenenfalls substituiert mit einer fünfgliedrigen oder sechsgliedrigen Aryl- oder Heteroarylringgruppierung, gegebenenfalls substituiert mit einem, zwei oder drei Substituenten, unabhängig ausgewählt aus der Gruppe Alkyl-, Halogen-, Trihalogenmethyl-, Hydroxy-, Alkoxy-, Carboxylat-, Nitro- und Estergruppierungen; und eine fünfgliedrige oder sechsgliedrige Aryl- oder Heteroarylringgruppierung, gegebenenfalls substituiert mit einem, zwei oder drei Substituenten, unabhängig ausgewählt aus der Gruppe Alkyl-, Halogen-, Trihalogenmethyl-, Hydroxy-, Alkoxy-, Carboxylat-, Nitro- und Estergruppierungen.
  • In noch weiteren bevorzugten Ausführungsformen betrifft die Erfindung eine auf 5-Azachinoxalin beruhende Verbindung mit einer in der Formel I angegebenen Struktur, worin die Gruppierungen R6 und X1 zusammengenommen eine Verbindung bilden, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SAQAR-Substituenten.
  • Der Begriff "SAQAR-Substituenten" bezieht sich auf die Gruppe der Substituenten Benzylanimo, 4-Fluorbenzylamino, 2-Carboxybenzylamino, 3-Carboxybenzylamino, 4-Carboxybenzylamino, 2-Nitrobenzylamino, 3-Nitrobenzylamino, 4-Nitrobenzylamino, 2-Methylbenzylamino, 3-Methylbenzylamino, 4-Methylbenzylamino, 2-Chlorbenzylamino, 3-Chlorbenzylamino, 4-Chlorbenzylamino, 2-Fluorbenzylamino, 3-Fluorbenzylamino, 4-Fluorbenzylamino, 2-(Trifluormethyl)benzylamino, 3-(Trifluormethyl)benzylamino, 4-(Trifluormethyl)benzylamino, Phenethyl-1-amino, Phenylamino, 2-Carboxyphenylamino, 3-Carboxyphenylamino, 4-Carboxyphenylamino, 2-Nitrophenylamino, 3-Nitrophenylamino, 4-Nitrophenylamino, 2-Methylphenylamino, 3-Methylphenylamino, 4-Methylphenylamino, 2-Chlorphenylamino, 3-Chlorphenylamino, 4-Chlorphenylamino, 2-Fluorphenylamino, 3-Fluorphenylamino, 4-Fluorphenylamino, 2-(Trifluormethyl)phenylamino, 3-(Trifluormethyl)phenylamino, 4-(Trifluormethyl)phenylamino, Pyrid-2-amino, Pyrid-3-amino, Pyrid-4-amino und Pyrid-2-methylamino.
  • Der Begriff „Benzylamino" bezieht sich auf eine Gruppe mit einer in der folgenden Formel dargestellten Struktur:
    Figure 00280001
    worin der Arylring gegebenenfalls in 2-, 3- oder 4-Stellung substituiert sein kann.
  • Der Begriff „Phenylamino" bezieht sich auf eine Gruppe mit einer in der folgenden Formel dargestellten Struktur:
    Figure 00290001
    worin der Arylring gegebenenfalls in 2-, 3- oder 4-Stellung substituiert sein kann.
  • Der Begriff „Phenethyl-1-amino" bezieht sich auf eine Gruppe mit einer in der folgenden Formel dargestellten Struktur:
    Figure 00290002
  • Der Begriff „Pyrid-2-amino" bezieht sich auf einen Pyridinring, der mit einer NH-Gruppe in 2-Stellung substituiert ist. In ähnlicher Weise beziehen sich die Begriffe „Pyrid-3-amino" und „Pyrid-4-amino" auf einen Pyridinring, der mit einer NH-Gruppe in 3- bzw. 4-Stellung substituiert ist.
  • In noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung eine auf 5-Azachinoxalin beruhende Verbindung mit einer in der Formel I angegebenen Struktur, worin die auf 5-Azachinoxalin beruhende Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe der SAQAR-Verbindungen.
  • IV. Erfindungsgemäße Syntheseverfahren
  • In einem weiteren Aspekt wird durch die vorliegende Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung vorgestellt, die eine Verbindung mit einer Struktur der Formel I, wie sie hier definiert ist, oder einer der hier angegebenen Untergruppen davon oder ihr Salz sowie ein physiologisch verträgliches Träger- oder Verdünnungsmittel umfasst.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, wobei die auf 5-Azachinoxalin beruhende Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe der SAQAR-Verbindungen.
  • Der Begriff "pharmazeutische Zusammensetzung" betrifft ein Gemisch aus einer erfindungsgemäßen 5- Azachinoxalin-Verbindung mit anderen chemischen Komponenten, wie Verdünnungsmitteln oder Trägern. Die pharmazeutische Zusammensetzung erleichtert die Verabreichung der Verbindung an einen Organismus. Mehrere Techniken zur Verabreichung einer Verbindung gibt es im Stand der Technik, einschließlich, aber nicht eingeschränkt auf orale, Injektions-, Aerosol-, parenterale und topische Verabreichung. Pharmazeutische Zusammensetzungen lassen sich auch erhalten durch Umsetzen von Verbindungen mit anorganischen Säuren, wie Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Salpetersäure, Phosphorsäure, Methansulfonsäure, Ethansulfonsäure, p-Toluolsulfonsäure, Salicylsäure und dergleichen.
  • Der Begriff "physiologisch verträglich" definiert einen Träger oder ein Verdünnungsmittel, das die biologische Aktivität und die Eigenschaften der Verbindung nicht aufhebt.
  • Der Begriff "Träger" definiert eine chemische Verbindung, die die Aufnahme einer Verbindung in Zellen oder Geweben erleichtert. Beispielsweise ist Dimethylsulfoxid (DMSO) ein gemeinhin verwendeter Träger, da er die Aufnahme vieler organischer Verbindungen in die Zellen oder Gewebe eines Organismus erleichtert.
  • Der Begriff "Verdünnungsmittel" definiert chemische Verbindungen, die in Wasser verdünnt sind, das die interessierende Verbindung löst und die biologisch aktive Form der Verbindung stabilisiert. Salze, die in gepufferten Lösungen gelöst sind, werden im Stand der Technik als Verdünnungsmittel verwendet. Eine gemeinhin verwendete Pufferlösung ist eine phosphatgepufferte Salzlösung, da sie die Salzbedingungen von menschlichem Blut nachahmt. Da Puffersalze den pH-Wert einer Lösung bei niedrigen Konzentrationen steuern können, modifiziert ein gepuffertes Verdünnungsmittel kaum die biologische Aktivität einer Verbindung.
  • In noch einem weiteren Aspekt wird durch die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Synthese einer erfindungsgemäßen Verbindung vorgestellt, das die folgenden Schritte umfasst: (a) Umsetzen von 2-Amino-6-chlor-3-nitropyridin mit einem zweiten Reaktanden in einem Lösungsmittel sowie in Gegenwart einer Base, wobei der zweite Reaktand ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Alkohol und einem Amin, unter Erhalt der ersten Zwischenstufe; (b) Umsetzung der ersten Zwischenstufe mit einem 1,2-Dion in Gegenwart eines Katalysators und eines Reduktionsmittels; und (d) Auf reinigen des Endprodukts.
  • Der Begriff "1,2-Dion" bezieht sich auf eine chemische Gruppierung der Formel R1-C(O)C(O)-R2, worin R1 und R2 unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe Wasserstoff; gesättigtes oder ungesättigtes Alkyl, gegebenenfalls substituiert mit einer fünfgliedrigen oder sechsgliedrigen Aryl- oder Heteroarylringgruppierung, gegebenenfalls substituiert mit einem, zwei oder drei Substituenten, unabhängig ausgewählt aus der Gruppe Alkyl-, Halogen-, Trihalogenmethyl-, Hydroxy-, Alkoxy-, Carboxylat-, Nitro- und Estergruppierungen; und eine fünfgliedrige oder sechsgliedrige Aryl- oder Heteroarylringgruppierung, gegebenenfalls substituiert mit einem, zwei oder drei Substituenten, unabhängig ausgewählt aus der Gruppe Alkyl-, Halogen-, Trihalogenmethyl-, Hydroxy-, Alkoxy-, Carboxylat-, Nitro- und Estergruppierungen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung das Verfahren der Synthese einer erfindungsgemäßen Verbindung, wobei es sich bei dem Lösungsmittel um n-Butanol handelt.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Synthese einer erfindungsgemäßen Verbindung, wobei es sich bei der Base um Kaliumcarbonat in Pulverform handelt.
  • In noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung das Verfahren der Synthese einer erfindungsgemäßen Verbindung, wobei der zweite Reaktand ausgewählt ist aus der Gruppe der SAQAR-Reaktanden.
  • Der Begriff "SAQAR-Reaktanden" bezieht sich auf die Gruppe der Reaktanden Benzylamin, 4-Fluorbenzylamin, 2-Carboxybenzylamin, 3-Carboxybenzylamin, 4-Carboxybenzylamin, 2-Nitrobenzylamin, 3-Nitrobenzylamin, 4-Nitrobenzylamin, 2-Methylbenzylamin, 3-Methylbenzylamin, 4-Methylbenzylamin, 2-Chlorbenzylamin, 3-Chlorbenzylamin, 4-Chlorbenzylamin, 2-Fluorbenzylamin, 3-Fluorbenzylamin, 4-Fluorbenzylamin, 2-(Trifluormethyl)benzylamin, 3-(Trifluormethyl)benzylamin, 4-(Trifluormethyl)benzylamin, Phenethyl-1-amin, Anilin, 2-Carboxyanilin, 3-Carboxyanilin, 4-Carboxyanilin, 2-Nitroanilin, 3-Nitroanilin, 4-Nitroanilin, 2-Toluidin, 3-Toluidin, 4-Toluidin, 2-Chloranilin, 3-Chloranilin, 4-Chloranilin, 2-Fluoranilin, 3-Fluoranilin, 4-Fluoranilin, 2-(Trifluormethyl)anilin, 3-(Trifluormethyl)anilin, 4-(Trifluormethyl)anilin, 2-Aminopyridin, 3-Aminopyridin, 4-Aminopyridin und 2-Methylaminopyridin.
  • In noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung das Verfahren zur Synthese einer erfindungsgemäßen Verbindung, wobei der dritte Reaktand ausgewählt ist aus der Gruppe 4-Hydroxyphenylglyoxal, 1-Phenyl-1,2-propandion und Benzil.
  • Der Begriff „Katalysator", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf ein chemisches Molekül, das bei Zugabe zu einer Gruppe von Reaktanden die Geschwindigkeit, mit der die Reaktanden unter Bildung von Produkten umgesetzt werden, erhöhen kann. Dem Durchschnittsfachmann sind vielerlei Arten von Katalysatoren allgemein bekannt.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung Verfahren zur Synthese von erfindungsgemäßen Verbindungen, wobei es sich bei dem Reduktionsmittel um Wasserstoff handelt.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung Verfahren zur Synthese von erfindungsgemäßen Verbindungen, wobei es sich bei dem Katalysator um Raney-Nickel handelt.
  • Die oben angegebene kurze Beschreibung der Erfindung stellt keine Einschränkung dar, und weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung sind aus der folgenden Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen sowie aus den Ansprüchen ersichtlich.
  • Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
  • Die vorliegende Erfindung betrifft zum Teil Verfahren zur Modulation der Funktion von Serin/Threonin-Proteinkinasen mit auf 5-Azachinoxalin beruhenden Verbindungen. Die Erfindung betrifft zudem zum Teil Verfahren zur Identifikation von Verbindungen, die die Funktion der Serin/Threonin-Proteinkinasen modulieren. Die Verfahren beinhalten Zellen, die eine Serin/Threoninproteinkinase exprimieren, wie RAF.
  • RAF ist eine Nicht-Rezeptorproteinkinase, die zur Zellmembran rekrutiert wird, wenn sie an aktiviertes RAS, ein Guanintriphosphat hydrolysierendes Enzym, bindet. RAS wird aktiviert, wenn eine aktivierte Rezeptorprotein-Tyrosinkinase, wie EGFR oder PDGFR, an ein Adaptorprotein, GRB2, und einen Guaninnukleotid-Austauschfaktor, SOS, bindet. SOS entfernt Guanindiphosphat aus RAS, ersetzt es durch Guanintriphosphat und aktiviert dadurch RAS. RAS bindet dann an RAF und aktiviert es somit. RAF kann dann andere Proteinziele auf Serin- und Threonin-Resten phosphorylieren, wie die Kinase (MEK), die die mitogenaktivierte Proteinkinase (MAPK) phosphoryliert und somit aktiviert. Somit dient RAF als intermediärer Regulationsfaktor der mitogenaktivierten Signaltransduktion.
  • Aufgrund der wichtigen regulatorischen Rolle von RAF in Zellen können Modifikationen der Aminosäuresequenz von RAF dessen Funktion verändern und somit das Zellverhalten verändern. Die Rolle von RAF bei der Zellproliferation wird durch die Beobachtung unterstrichen, dass Mutationen der Aminosäuresequenz von RAF mit Tumoren und Krebserkrankungen einhergehen. Da die krebserzeugenden Mutationen von RAF zu RAF-Molekülen führen, die eine ungeregelte katalytische Aktivität aufweisen, können Inhibitoren von RAF die Zellproliferation, die in diesen Zellen zu Krebs führt, abschwächen oder sogar ganz aufheben.
  • Erfindungsgemäße Verfahren können Verbindungen erfassen, die die Funktion der Proteinkinase RAF in den Zellen modulieren. RAF phosphoryliert eine Proteinkinase (MEK), die wiederum mitogenaktivierte Proteinkinase (MAPK) phosphoryliert. Tests, die nur die Phosphorylierung von MEK durch RAF überwachen, sind nicht empfindlich, da MEK nicht signifikant genug phosphoryliert wird. Zur Bewältigung dieses Empfindlichkeits-Dilemmas wird die Phosphorylierung von MEK und MAPK in den erfindungsgemäßen Tests untersucht. Das MAPK-Phosphorylierungssignal amplifiziert das MEK-Phosphorylierungssignal und ermöglicht, dass die RAF-abhängige Phosphorylierung im Enzymimmuntest verfolgt wird. Daneben wird der erfindungsgemäße Test vorzugsweise in einem Hochdurchsatzformat durchgeführt, so dass viele Verbindungen rasch in einem kurzen Zeitraum überwacht werden können.
  • Die erfindungsgemäßen Verfahren haben Verbindungen identifiziert, die die Funktion der RAF-Proteinkinase hemmen. Diese Verbindungen sind auf 5-Azachinoxalin beruhende Derivate. Zwar wurden auf 5-Azachinoxalin beruhende Derivate auf ihre Fähigkeit zur Hemmung von Enzymen untersucht, die an der Nukleotidsynthese in Bakterien beteiligt sind, jedoch wurden viele dieser Verbindungen hinsichtlich der Proteinkinasehemmung noch nicht signifikant untersucht.
  • Da RAF signifikante Aminosäurehomologie gegenüber anderen Serin/Threonin-Proteinkinasen zeigt, können die auf 5-Azachinoxalin beruhenden erfindungsgemäßen Verbindungen wahrscheinlich andere Serin/Threonin-Proteinkinasen als RAF hemmen. Somit betreffen die erfindungsgemäßen Verfahren ebenfalls andere Serin/Threonin-Proteinkinasen als RAF, einschließlich Rezeptor- und Nicht-Rezeptor-Serin/Threonin-Proteinkinasen.
  • Die erfindungsgemäßen Verfahren betreffen ebenfalls andere Verbindungen, die die RAF-Funktion in Zellen modulieren, da der Hochdurchsatzaspekt der Verfahren ermöglicht, dass eine breite Anordnung von Molekülen in einem kurzen Zeitraum getestet werden kann. Daher können die erfindungsgemäßen Verfahren bestehende Moleküle identifizieren, die nicht in der vorliegenden Erfindung offenbart sind, die die RAF-Funktion modulieren.
  • I. Biologische Aktivität der auf 5-Azachinoxalin beruhenden Verbindungen
  • Die auf 5-Azachinoxalin beruhenden erfindungsgemäßen Verbindungen wurden auf ihre Fähigkeit zur Hemmung der RAF-Proteinkinasefunktion untersucht. Die biologischen Tests und die Ergebnisse dieser Hemmstudien sind hier beschrieben. Die zur Messung der Modulation der Proteinkinasefunktion durch die auf 5-Azachinoxalin beruhende Verbindung verwendeten Verfahren ähneln denjenigen, die in der US-Patentanmeldung mit der laufenden Nr. 08/702 232 von Tang et al., mit dem Titel "Indolinone Combinatorial Libraries and Related Products and Methods for the Treatment of Disease", (Lyon & Lyon Akten-Nr. 221/187), eingereicht am 23. August 1996, hinsichtlich des Hochdurchsatz-Aspektes der Erfindung beschrieben sind. Die Anmeldung mit der Nr. 08/702 232 ist hiermit vollinhaltlich, einschließlich sämtlicher Zeichnungen, durch Bezugnahme aufgenommen.
  • II. Ziel-Erkrankungen, die sich zur Behandlung durch auf 1,4,5-Triazanaphthalin beruhende Verbindungen eignen
  • Die hier beschriebenen Verfahren, Verbindungen und pharmazeutischen Zusammensetzungen sind so ausgelegt, dass sie proliferative Zellstörungen hemmen, indem die Funktion der RAF-Proteinkinase moduliert wird. Proliferative Störungen führen zu einer ungewünschten Zellproliferation von einer oder mehreren Zellpopulationen in einem mehrzelligen Organismus, was den Organismus schädigt. Die hier beschriebenen Verfahren, Verbindungen und pharmazeutischen Zusammensetzungen können sich ebenfalls zur Behandlung und Verhinderung anderer Störungen in Organismen eignen, wie Störungen, die mit dem vorzeitigen Zelltod einhergehen (d.h. neurologische Erkrankungen) oder Entzündung. Diese Störungen können eine Folge von RAF-Molekülen sein, die nicht korrekt funktionieren, oder eine Folge der RAF-verwandten Proteinkinasemoleküle, die nicht korrekt funktionieren.
  • Veränderungen der Funktion der RAF-Proteinkinase oder Proteinkinasen, die RAF betreffen, können zu verstärkten oder herabgesetzten Zellproliferationsereignissen führen, die in bestimmten Erkrankungen offensichtlich sind. Aberrante Zellproliferationszustände beinhalten Krebserkrankungen, fibrotische Erkrankungen, mesangiale Störungen, anomale Angiogenese und Vaskulogenese, Wundheilung, Psoriasis, Restenose und Entzündung.
  • Fibrotische Erkrankungen betreffen die anomale Bildung der zellulären extrazellulären Matrix. Ein Beispiel für eine fibrotische Störung ist eine hepatische Zirrhose. Die hepatische Zirrhose ist durch eine erhöhte Konzentration von extrazellulären Matrixbestandteilen charakterisiert, was zur Bildung einer hepatischen Vernarbung führt. Die hepatische Zirrhose kann Erkrankungen wie die Leberzirrhose verursachen.
  • Mesangiale Zellproliferationsstörungen erfolgen aufgrund einer anomalen Proliferation mesangialer Zellen. Mesangiale Proliferationsstörungen beinhalten verschiedene menschliche Nierenerkrankungen, wie Glomerulonephritis, diabetische Nephropathie, maligne Nephrosklerose, thrombotische Mikroangiopathiesyndrome, Transplantatabstoßung und Glomerulopathien.
  • Bevorzugte Arten von Krebserkrankungen, die durch die erfindungsgemäßen Verfahren und Verbindungen behandelt werden können, sind Lungenkrebs, Ovarialkarzinom, Brustkrebs, Hirnkarzinom, intraaxiales Hirnkarzinom, Kolonkrebs, Prostatakrebs, Kaposi-Sarkom, Melanom und Gliom. Der Beweis, dass die erfindungsgemäßen Verbindungen und Verfahren sich effizient verwenden lassen, um die Proliferation von Krebszellen zu bekämpfen und umzukehren, wird hiermit durch Bezugnahme bereitgestellt.
  • Angiogene und vaskulogene Störungen beruhen auf einer übermäßigen Proliferation der Blutgefäße. Die Proliferation der Blutgefäße ist notwendig bei einer Vielzahl von normalen physiologischen Prozessen, wie bei der Embryonalentwicklung, Bildung von Corpus Luteum, Wundheilung und Organ-Erneuerung. Die Proliferation von Blutgefäßen ist jedoch ebenfalls essentiell bei der Krebstumorentwicklung. Andere Beispiele für Blutgefäß-Proliferationsstörungen beinhalten Arthritis, worin neue kapillare Blutgefäße in das Gelenk einwandern und den Knorpel zerstören. Zudem beinhalten Blutgefäß-Proliferationserkrankungen Augenerkrankungen, wie diabetische Retinopathie, worin neue Kapillaren in der Retina in den Glaskörper einwandern, bluten und Blindheit verursachen. Umgekehrt werden Krankheiten, die mit dem Schrumpfen, Zusammenziehen oder dem Verschließen von Blutgefäßen einhergehen, wie eine Restenose, ebenfalls mit der entgegengesetzten Regulation von Proteinkinasen in Zusammenhang gebracht.
  • Vaskulogenese und Angiogenese gehen ebenfalls mit dem Wachstum maligner fester Tumore und Metastasen einher. Ein stark wachsender Krebstumor erfordert für ein fortgesetztes Wachsen eine nährstoff- und sauerstoffreiche Blutversorgung. Folglich wächst eine anormal große Zahl von kapillaren Blutgefäßen oft zusammen mit dem Tumor, die dem Tumor als Versorgungsleitungen dienen. Neben der Zufuhr von Nährstoffen zu dem Tumor liefern die in einen Tumor eingebetteten Blutgefäße einen Zugang für Tumorzellen, um in den Blutkreislauf einzutreten, und bilden in dem Organismus an entfernten Stellen Metastasen. Folkman, 1990, J. Natl. Cancer Inst. 82: 4-6.
  • Eine unzureichende RAF-Aktivität kann Zellproliferationsstörungen stimulieren. Moleküle, die speziell zur Modulation der Funktion der RAF-Proteinkinase ausgelegt sind, hemmen die Zellproliferation. Insbesondere Antisense-Nukleinsäuremoleküle, die so ausgelegt sind, dass sie die Messenger-RNA binden, die die RAF-Proteinkinase codiert, und die Translation dieser Botschaft blockieren, kehrten die Transformation von A549-Zellen effizient in vitro um. Monia et al., 1996, Nature Medicine 2: 688, das hiermit vollinhaltlich einschließlich sämtlicher Figuren und Tabellen aufgenommen ist. A549-Zellen sind menschliche maligne Zellen.
  • Diese RAF-gezielten Antisense-Untersuchungen liefern den Beweis, dass die erfindungsgemäßen 5-Azachinoxalin-Moleküle die die Funktion der RAF-Proteinkinase modulieren, die Proliferation maligner Zellen in einem Organismus einschränken und wahrscheinlich umkehren können. Diese 5-Azachinoxalin-Verbindungen können beispielsweise in den hier bereitgestellten in-vitro-Verfahren untersucht werden. Die 5-Azachinoxalin-Verbindungen können darüber hinaus auf ihre Wirkung auf Tumorzellen in vivo durch Fremdtransplantat-Verfahren, die hier ebenfalls beispielhaft bereitgestellt werden, untersucht werden.
  • Es existieren mindestens zwei Wege, in denen eine unzureichende RAF-Aktivität eine ungewünschte Zellproliferation eines bestimmten Zelltyps stimulieren kann: (1) die direkte Stimulation des Wachstums der jeweiligen Zelle, oder (2) das Erhöhen der Vaskularisierung eines bestimmten Bereichs, wie eines Tumorgewebes, wodurch das Wachstum des Gewebes erleichtert wird.
  • Die Verwendung der vorliegenden Erfindung wird erleichtert, indem zuerst identifiziert wird, ob die Zellproliferationsstörung von RAF gesteuert wird. Sobald solche Störungen identifiziert sind, lassen sich Patienten, die an einem solchen Zustand leiden, durch Analyse ihrer Symptome analysieren, indem dem Arzt oder dem veterinärmedizinischen Fachmann bekannte Verfahren verwendet werden. Solche Patienten lassen sich dann wie hier beschrieben behandeln.
  • Die Bestimmung, ob die Zellproliferationsstörung von RAF gesteuert wird, kann erfolgen, indem zuerst das Ausmaß der RAF-Aktivität bestimmt wird, die in der Zelle oder in einem bestimmten Ort des Körpers des Patienten auftritt. Im Falle von Krebszellen kann das Ausmaß von einer oder mehreren RAF-Aktivitäten mit nicht durch RAF gesteuerten Krebserkrankungen und durch RAF gesteuerten Krebserkrankungen verglichen werden. Haben die Krebszellen ein höheres Ausmaß an RAF-Aktivität als die durch RAF gesteuerten Krebserkrankungen, vorzugsweise gleich oder größer als durch RAF gesteuerte Krebserkrankungen, dann sind sie Kandidaten für die Behandlung mit den beschriebenen RAF-modulierenden Verfahren und Verbindungen der Erfindung.
  • Im Fall von Zellproliferationsstörungen, die aufgrund einer ungewünschten Proliferation von Nicht-Krebszellen entstehen, wird das Ausmaß der RAF-Aktivität mit dem Ausmaß verglichen, das bei der allgemeinen Bevölkerung auftritt (z.B. das durchschnittliche Ausmaß, das bei der allgemeinen Bevölkerung von Menschen und Tieren auftritt, unter Ausschluss solcher Menschen oder Tiere, die an einer Zellproliferationsstörung leiden). Ist die ungewünschte Zellproliferationsstörung durch ein höheres RAF-Ausmaß charakterisiert als es bei der allgemeinen Bevölkerung auftritt, dann ist die Störung ein Kandidat zur Behandlung, worin die beschriebenen RAF-modulierenden Verfahren und Verbindungen der Erfindung verwendet werden.
  • III. Pharmazeutische Zusammensetzungen und Verabreichung von auf 5-Azachinoxalin beruhenden Verbindungen
  • Verfahren zur Herstellung von pharmazeutischen Formulierungen der Verbindungen, Verfahren zur Bestimmung der Mengen der an einen Patienten zu verabreichenden Verbindungen, und die Modi zur Verabreichung der Verbindungen an einen Organismus sind in der US-Patentanmeldung mit der laufenden Nr. 08/702 232 von Tang et al. mit dem Titel "Indolinone Combinatorial Libraries and Related Products and Methods for the Treatment of Disease" (Lyon & Lyon Akten-Nr. 221/187), eingereicht am 23. August 1996, und in der Internationalen Patentveröffentlichung mit der Nummer WO 96/22976, von Buzzetti et al., mit dem Titel "Hydrosoluble 3-Aryliden-2-Oxindole Derivatives as Tyrosin Kinase Inhibitors", veröffentlicht am 1. August 1996, offenbart, die jeweils vollinhaltlich einschließlich ihrer Zeichnungen durch Bezugnahme aufgenommen sind. Der Fachmann erkennt, dass sich diese Beschreibungen auf die vorliegende Erfindung anwenden lassen und leicht daran angepasst werden können.
  • Beispiele
  • Die nachfolgenden Beispiele stellen keine Beschränkung dar und dienen lediglich der Darstellung verschiedener Aspekte und Merkmale der vorliegenden Erfindung. Die Beispiele beschreiben Verfahren zur Synthese erfindungsgemäßer Verbindungen und Verfahren zum Messen einer Wirkung einer Verbindung auf die Funktion der RAF-Proteinkinase.
  • Die in den Verfahren verwendeten Zellen sind kommerziell erhältlich. Die in den Zellen enthaltenen Nukleinsäurevektoren sind ebenfalls kommerziell erhältlich, und die Sequenzen der Gene für verschiedene Proteinkinasen sind leicht in Sequenz-Datenbanken zugänglich. Somit kann ein Fachmann die Zelllinie leicht rechtzeitig wieder erzeugen, indem die kommerziell erhältlichen Zellen, die kommerziell erhältlichen Nukleinsäurevektoren und die Proteinkinase-Gene mit Techniken, die dem Durchschnittsfachmann leicht zugänglich sind, kombiniert werden.
  • Beispiel 1: Verfahren zur Synthese von erfindungsgemäßen auf 5-Azachinoxalin beruhenden Verbindungen
  • Die Erfindung wird nachstehend anhand der folgenden nicht limitierenden Beispiele veranschaulicht, bei denen falls nicht anders angegeben:
    • (i) Verdampfungen durch Rotationsverdampfung unter Vakuum erfolgten:
    • (ii) die Arbeiten unter einer Atmosphäre eines Inertgases wie Stickstoff erfolgten;
    • (iii) Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) auf Merck LiChrosorb RP-18-Umkehrphasen-Silica, das von E. Merck, Darmstadt, Deutschland erhalten wurde, erfolgte;
    • (iv) die Ausbeuten lediglich zu Veranschaulichungszwecken angegeben sind und nicht notwendigerweise das erzielbare Maximum darstellen;
    • (v) Schmelzpunkte nicht korrigiert sind und mit einem HWS Mainz SG 2000 Digital-Schmelzpunkt-Gerät bestimmt wurden;
    • (vi) die Strukturen sämtlicher Verbindungen der Formel (I) dieser Erfindung durch Protonen-Magnetresonanzspektroskopie auf einem Bruker AMX500-NMR Spektralphotometer, durch Elementar-Mikroanalyse und, in bestimmten Fällen, durch Massenspektroskopie bestätigt wurden;
    • (vii) die Reinheit der Strukturen durch Dünnschichtchromatographie (DC) mittels Silicagel (Merck Silicagel 60 F254) oder durch HPLC erfolgte; und
    • (viii) Zwischenprodukte gewöhnlich nicht vollständig charakterisiert wurden, und die Reinheit durch Dünnschichtchromatographie (DC) oder durch HPLC bestimmt wurde.
  • Syntheseverfahren
  • Verbindung A-2: 6-Benzylamino-3-(4-hydroxyphenyl)-5-azachinoxalin
  • 4-Hydroxyphenylglyoxal wurde aus 4-Hydroxyacetophenon (Lancaster, Acros) gemäß dem veröffentlichten Verfahren (J. Amer. Chem. Soc., 71, 1045 (1949)) dargestellt.
  • 2-Amino-6-benzylamino-3-nitropyridin wurde aus 2-Amino-6-chlor-3-nitropyridin wie folgt dargestellt: 2-Amino-6-chlor-3-nitropyridin (17,35 g, 0,10 Mol), Benzylamin (Fluka) (10,72 g, 0,10 Mol) sowie gepulvertes Kaliumcarbonat (10,4 g, 0,035 Mol) in n-Butanol (100 ml) wurden 2 Stunden am Rückfluss erhitzt. Die Suspension wurde filtriert und der Feststoff nach Abkühlen auf Raumtemperatur durch Filtration gesammelt, mit Butanol gewaschen und im Vakuum bei 50°C getrocknet, so dass 2-Amino-6-benzylamino-3-nitropyridin (22,2 g, 91%, Fp. 145-146°C) erhalten wurde.
  • 6-Benzylamino-3-(4-hydroxyphenyl)-5-azachinoxalin wurde aus 2-Amino-6-benzylamino-3-nitropyridin wie folgt dargestellt: 2-Amino-6-benzylamino-3-nitropyridin (25 g, 0,10 Mol) wurde unter 5,5 bar H2 in Gegenwart von 10 g Raney-Ni in 400 ml Dioxan bei 60°C hydriert. Nach 2 Stunden wurde das Reaktionsgemisch auf Raumtemperatur abgekühlt, filtriert, und nach Zugabe von 4-Hydroxyphenylglyoxal 2 Stunden unter einer Argonatmosphäre gerührt. Die Suspension wurde dann mit Wasser verdünnt, der Feststoff durch Filtration gesammelt, mit Wasser gewaschen, aus 2-Propanol umkristallisiert und bei 50°C im Vakuum getrocknet, so dass 6-Benzylamino-3-(4-hydroxyphenyl)-5-azachinoxalin (8 g, 24,4%, Fp. 271-273°C) erhalten wurde.
  • Verbindung A-1: 6-Phenylamino-3-(4-hydroxyphenyl)-5-azachinoxalin
  • Ersetzt man in der Vorschrift für die Verbindung A-2 Benzylamin durch Phenylamin, so erhält man mit dem gleichen Verfahren 6-Phenylamino-3-(4-hydroxyphenyl)-5-azachinoxalin.
  • Verbindung A-5: 6-(4-Fluorbenzylamino)-2-methyl-3-phenyl-5-azachinoxalin
  • Ersetzt man in der Vorschrift für die Verbindung A-2 4-Hydroxyphenylglyoxal durch 1-Phenyl-1,2-propandion sowie Benzylamin durch 4-Fluorbenzylamin, so erhält man mit dem gleichen Verfahren 6-(4-Fluorbenzylamino)-2-methyl-3-phenyl-5-azachinoxalin.
  • Verbindung A-6: 2,3-Diphenyl-6-(4-fluorbenzylamino)-5-azachinoxalin
  • Ersetzt man in der Vorschrift für die Verbindung A-2 4-Hydroxyphenylglyoxal durch Benzil sowie Benzylamin durch 4-Fluorbenzylamin, so erhält man mit dem gleichen Verfahren 2,3-Diphenyl-6-(4-fluorbenzylamino)-5-azachinoxalin.
  • Verbindung A-7: 3-Phenyl-6-phenylamino-5-azachinoxalin
  • Ersetzt man in der Vorschrift für die Verbindung A-2 4-Hydroxyphenylglyoxal durch Phenylglyoxal sowie Benzylamin durch Anilin, so erhält man mit dem gleichen Verfahren 3-Phenyl-6-phenylamino-5-azachinoxalin.
  • Verbindungen A-8-A-26
  • Ersetzt man in der Vorschrift für die Verbindung A-2 Benzylamin durch das entsprechende substituierte Benzylamin, so erhält man mit dem gleichen Verfahren die folgenden Verbindungen:
    Verbindung A-8: 6-(2-Carboxybenzylamino)-3-(4-hydroxyphenyl)-5-azachinoxalin
    Verbindung A-9: 6-(3-Carboxybenzylamino)-3-(4-hydroxyphenyl)-5-azachinoxalin
    Verbindung A-10: 6-(4-Carboxybenzylamino)-3-(4-hydroxyphenyl)-5-azachinoxalin
    Verbindung A-11: 3-(4-Hydroxyphenyl)-6-(2-nitrobenzylamino)-5-azachinoxalin
    Verbindung A-12: 3-(4-Hydroxyphenyl)-6-(3-nitrobenzylamino)-5-azachinoxalin
    Verbindung A-13: 3-(4-Hydroxyphenyl)-6-(4-nitrobenzylamino)-5-azachinoxalin
    Verbindung A-14: 3-(4-Hydroxyphenyl)-6-(2-methylbenzylamino)-5-azachinoxalin
    Verbindung A-15: 3-(4-Hydroxyphenyl)-6-(3-methylbenzylamino)-5-azachinoxalin
    Verbindung A-16: 3-(4-Hydroxyphenyl)-6-(4-methylbenzylamino)-5-azachinoxalin
    Verbindung A-17: 6-(2-Chlorbenzylamino)-3-(4-hydroxyphenyl)-5-azachinoxalin
    Verbindung A-18: 6-(3-Chlorbenzylamino)-3-(4-hydroxyphenyl)-5-azachinoxalin
    Verbindung A-19: 6-(4-Chlorbenzylamino)-3-(4-hydroxyphenyl)-5-azachinoxalin
    Verbindung A-20: 6-(2-Fluorbenzylamino)-3-(4-hydroxyphenyl)-5-azachinoxalin
    Verbindung A-21: 6-(3-Fluorbenzylamino)-3-(4-hydroxyphenyl)-5-azachinoxalin
    Verbindung A-22: 6-(4-Fluorbenzylamino)-3-(4-hydroxyphenyl)-5-azachinoxalin
    Verbindung A-23: 3-(4-Hydroxyphenyl)-6-[2-(trifluormethyl)benzylamino]-5-azachinoxalin
    Verbindung A-24: 3-(4-Hydroxyphenyl)-6-[3-(trifluormethyl)benzylamino]-5-azachinoxalin
    Verbindung A-25: 3-(4-Hydroxyphenyl)-6-[4-(trifluormethyl)benzylamino]-5-azachinoxalin
    Verbindung A-26: 3-(4-Hydroxyphenyl)-6-(phenylethyl-1amino)-5-azachinoxalin
  • Verbindungen A-27-A-48
  • Ersetzt man in der Vorschrift für die Verbindung A-2 Benzylamin durch das entsprechende substituierte Anilin, so erhält man mit dem gleichen Verfahren die folgenden Verbindungen:
    Verbindung A-27: 6-(2-Carboxyphenylamino)-3-(4-hydroxyphenyl)-5-azachinoxalin
    Verbindung A-28: 6-(3-Carboxyphenylamino)-3-(4-hydroxyphenyl)-5-azachinoxalin
    Verbindung A-29: 6-(4-Carboxyphenylamino)-3-(4-hydroxyphenyl)-5-azachinoxalin
    Verbindung A-30: 3-(4-Hydroxyphenyl)-6-(2-nitrophenylamino)-5-azachinoxalin
    Verbindung A-31: 3-(4-Hydroxyphenyl)-6-(3-nitrophenylamino)-5-azachinoxalin
    Verbindung A-32: 3-(4-Hydroxyphenyl)-6-(4-nitrophenylamino)-5-azachinoxalin
    Verbindung A-33: 3-(4-Hydroxyphenyl)-6-(2-methylphenylamino)-5-azachinoxalin
    Verbindung A-34: 3-(4-Hydroxyphenyl)-6-(3-methylphenylamino)-5-azachinoxalin
    Verbindung A-35: 3-(4-Hydroxyphenyl)-6-(4-methylphenylamino)-5-azachinoxalin
    Verbindung A-36: 6-(2-Chlorphenylamino)-3-(4-hydroxyphenyl)-5-azachinoxalin
    Verbindung A-37: 6-(3-Chlorphenylamino)-3-(4-hydroxyphenyl)-5-azachinoxalin
    Verbindung A-38: 6-(4-Chlorphenylamino)-3-(4-hydroxyphenyl)-5-azachinoxalin
    Verbindung A-39: 6-(2-Fluorphenylamino)-3-(4-hydroxyphenyl)-5-azachinoxalin
    Verbindung A-40: 6-(3-Fhuorphenylamino)-3-(4-hydroxyphenyl)-5-azachinoxalin
    Verbindung A-41: 6-(4-Fluorphenylamino)-3-(4-hydroxyphenyl)-5-azachinoxalin
    Verbindung A-42: 3-(4-Hydroxyphenyl)-6-[(2-trifluormethyl)phenylamino]-5-azachinoxalin
    Verbindung A-43: 3-(4-Hydroxyphenyl)-6-[(3-trifluormethyl)phenylamino]-5-azachinoxalin
    Verbindung A-44: 3-(4-Hydroxyphenyl)-6-[(4-trifluormethyl)phenylamino]-5-azachinoxalin
    Verbindung A-45: 3-(4-Hydroxyphenyl)-6-(pyrid-2-amino)-5-azachinoxalin
    Verbindung A-46: 3-(4-Hydroxyphenyl)-6-(pyrid-3-amino)-5-azachinoxalin
    Verbindung A-47: 3-(4-Hydroxyphenyl)-6-(pyrid-4-amino)-5-azachinoxalin
    Verbindung A-48: 3-(4-Hydroxyphenyl)-6-(pyrid-2-methylamino)-5-azachinoxalin
  • Verbindungen A-49-A-67
  • Ersetzt man in der Vorschrift für die Verbindung A-2 Benzylamin durch das entsprechende substituierte Benzylamin sowie 4-Hydroxyphenylglyoxal durch Phenylglyoxal, so erhält man mit dem gleichen Verfahren die folgenden Verbindungen:
    Verbindung A-49: 6-(2-Carboxybenzylamino)-3-phenyl-5-azachinoxalin
    Verbindung A-50: 6-(3-Carboxybenzylamino)-3-phenyl-5-azachinoxalin
    Verbindung A-51: 6-(4-Carboxybenzylamino)-3-phenyl-5-azachinoxalin
    Verbindung A-52: 6-(2-Nitrobenzylamino-3-phenyl)-5-azachinoxalin
    Verbindung A-53: 6-(3-Nitrobenzylamino)-3-phenyl-5-azachinoxalin
    Verbindung A-54: 6-(4-Nitrobenzylamino)-3-phenyl-5-azachinoxalin
    Verbindung A-55: 6-(2-Methylbenzylamino)-3-phenyl-5-azachinoxalin
    Verbindung A-56: 6-(3-Methylbenzylamino)-3-phenyl-5-azachinoxalin
    Verbindung A-57: 6-(4-Methylbenzylamino)-3-phenyl-5-azachinoxalin
    Verbindung A-58: 6-(2-Chlorbenzylamino)-3-phenyl-5-azachinoxalin
    Verbindung A-59: 6-(3-Chlorbenzylamino)-3-phenyl-5-azachinoxalin
    Verbindung A-60: 6-(4-Chlorbenzylamino)-3-phenyl-5-azachinoxalin
    Verbindung A-61: 6-(2-Fluorbenzylamino)-3-phenyl-5-azachinoxalin
    Verbindung A-62: 6-(3-Fluorbenzylamino)-3-phenyl-5-azachinoxalin
    Verbindung A-63: 6-(4-Fluorbenzylamino)-3-phenyl-5-azachinoxalin
    Verbindung A-64: 3-Phenyl-6-[2-(trifluormethyl)benzylamino]-5-azachinoxalin
    Verbindung A-65: 3-Phenyl-6-[3-(trifluormethyl)benzylamino]-5-azachinoxalin
    Verbindung A-66: 3-Phenyl-6-[4-(trifluormethyl)benzylamino]-5-azachinoxalin
    Verbindung A-67: 3-Phenyl-6-(phenethyl-1-amino)-5-azachinoxalin
  • Verbindungen A-68-A-89
  • Ersetzt man in der Vorschrift für die Verbindung A-2 Benzylamin durch das entsprechende substituierte Anilin sowie 4-Hydroxyphenylglyoxal durch Phenylglyoxal, so erhält man mit dem gleichen Verfahren die folgenden Verbindungen:
    Verbindung A-68: 6-(2-Carboxyphenylamino)-3-phenyl-5-azachinoxalin
    Verbindung A-69: 6-(3-Carboxyphenylamino)-3-phenyl-5-azachinoxalin
    Verbindung A-70: 6-(4-Carboxyphenylamino)-3-phenyl-5-azachinoxalin
    Verbindung A-71: 6-(2-Nitrophenylamino)-3-phenyl-5-azachinoxalin
    Verbindung A-72: 6-(3-Nitrophenylamino)-3-phenyl-5-azachinoxalin
    Verbindung A-73: 6-(4-Nitrophenylamino)-3-phenyl-5-azachinoxalin
    Verbindung A-74: 6-(2-Methylphenylamino)-3-phenyl-5-azachinoxalin
    Verbindung A-75: 6-(3-Methylphenylamino)-3-phenyl-5-azachinoxalin
    Verbindung A-76: 6-(4-Methylphenylamino)-3-phenyl-5-azachinoxalin
    Verbindung A-77: 6-(2-Chlorphenylamino)-3-phenyl-5-azachinoxalin
    Verbindung A-78: 6-(3-Chlorphenylamino)-3-phenyl-5-azachinoxalin
    Verbindung A-79: 6-(4-Chlorphenylamino)-3-phenyl-5-azachinoxalin
    Verbindung A-80: 6-(2-Fluorphenylamino)-3-phenyl-5-azachinoxalin
    Verbindung A-81: 6-(3-Fluorphenylamino)-3-phenyl-5-azachinoxalin
    Verbindung A-82: 6-(4-Fluorphenylamino)-3-phenyl-5-azachinoxalin
    Verbindung A-83: 3-Phenyl-6-[(2-trifluormethyl)phenylamino]-5-azachinoxalin
    Verbindung A-84: 3-Phenyl-6-[(3-trifluormethyl)phenylamino]-5-azachinoxalin
    Verbindung A-85: 3-Phenyl-6-[(4-trifluormethyl)phenylamino]-5-azachinoxalin
    Verbindung A-86: 3-Phenyl-6-(pyrid-2-amino]-5-azachinoxalin
    Verbindung A-87: 3-Phenyl-6-(pyrid-3-amino]-5-azachinoxalin
    Verbindung A-88: 3-Phenyl-6-(pyrid-4-amino]-5-azachinoxalin
    Verbindung A-89: 3-Phenyl-6-(pyrid-2-methylamino]-5-azachinoxalin
  • Verbindung A-90: 6-Phenylamino-3-(4-methoxyphenyl)-5-azachinoxalin
  • Ersetzt man in der Vorschrift für die Verbindung A-1 4-Hydroxyphenyl durch 4-Methoxyphenyl, so erhält man mit dem gleichen Verfahren 6-Phenylamino-3-(4-methoxyphenyl)-5-azachinoxalin.
  • Beispiel 2: Test zur Messung der Phosphorylierungsfunktion von RAF
  • Der folgende Test beschreibt die Menge der RAF-katalysierten Phosphorylierung ihres Zielproteins MEK sowie das Ziel von MEK, nämlich MAPK. Die RAF-Gensequenz ist beschrieben in Bonner et al., 1985, Molec. Cell. Biol. 5: 1400-1407 und ist leicht zugänglich in mehreren Gensequenz-Datenbanken. Die Konstruktion des Nukleinsäure-Vektors und der für diesen Anteil der Erfindung verwendeten Zelllinien sind vollständig beschrieben in Morrison et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 8855-8859.
  • Materialien und Reagenzien
    • 1. Sf9 (Spodoptera frugiperda)-Zellen; GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD.
    • 2. RIPA-Puffer: 20 mM Tris/HCl pH-Wert 7,4, 137 mM NaCl, 10% Glycerin, 1 mM PMSF, 5 mg/l Aprotenin, 0,5% Triton X-100;
    • 3. Thioredoxin-MEK-Fusionsprotein (T-MEK): T-MEK-Expression und Reinigung durch Affinitäts-Chromatographie erfolgten gemäß den Verfahren des Herstellers. Katalog Nummer K 350-01 und R 350-40, Invitrogen Corp., San Diego, CA.
    • 4. His-MAPK (ERK 2); MAPK mit His-Ende wurde in XL1-Blue-Zellen exprimiert, die mit pUC18-Vektor transformiert waren, der His-MAPK codierte. His-MAPK wurde durch Ni-Affinitäts-Chromatographie gereinigt. Kat. Nummer 27-4949-01, Pharmacia, Alameda, CA, wie hier beschrieben.
    • 5. Schaf-Anti-Maus-IgG: Jackson Laboratories, West Grove, PA. Katalog Nummer 515-006-008, Lot Nummer 28563
    • 6. RAF-1 Proteinkinase spezifischer Antikörper: URP2653 von UBI.
    • 7. Beschichtungspuffer: PBS; phosphatgepufferte Salzlösung, GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD.
    • 8. Waschpuffer: TBST-50 mM Tris/HCl pH-Wert 7,2, 150 mM NaCl, 0,1% Triton X-100
    • 9. Blockierungs-Puffer: TBST, 0,1% Ethanolamin pH-Wert 7,4.
    • 10. DMSO, Sigma, St. Louis, MO
    • 11. Kinase-Puffer (KB): 20 mM Hepes/HCl pH-Wert 7,2, 150 mM NaCl, 0,1% Triton X-100, 1 mM PMSF, 5 mg/l Aprotenin, 75 μM Natriumorthovanadat, 0,5 MM DTT und 10 mM MgCl2.
    • 12. ATP-Mix: 100 mM MgCl2, 300 μM ATP, 10 μCi γ-33P ATP (Dupont-NEN)/ml.
    • 13. Stop-Lösung: 1% Phorphorsäure; Fisher, Pittsburgh, PA.
    • 14. Wallac Cellulose-Phosphat-Filtermatten; Wallac, Turku, Finnland.
    • 15. Filterwaschlösung: 1% Phosphorsäure, Fisher, Pittsburgh, PA.
    • 16. Tomtec-Plattenernter, Wallac, Turku, Finnland.
    • 17. Wallac Beta-Plattenleser Nummer 1205, Wallac, Turku, Finnland.
    • 18. Nunc V-Boden-Polypropylen-Platten mit 96 Vertiefungen für Verbindungen Applied Scientific Katalog Nummer AS-72092.
  • Verfahren
  • Sämtliche nachfolgenden Schritte wurden, wenn nicht anders angegeben, bei Raumtemperatur durchgeführt.
    • 1. ELISA-Platten-Beschichtung: ELISA-Vertiefungen werden mit 100 μl affinitätsgereinigtem Schaf-Anti-Maus-Antiserum (1 μg/100 μl Beschichtungspuffer) über Nacht bei 4°C beschichtet. ELISA-Platten können zwei Wochen verwendet werden, wenn sie bei 4°C aufbewahrt werden.
    • 2. Umdrehen der Platte und Entfernen der Flüssigkeit. Zugabe von 100 μl Blockierungs-Lösung und Inkubation für 30 min.
    • 3. Entfernen der Blockierungslösung und viermaliges Waschen mit Waschpuffer. Überführen der Platte auf ein Papiertuch, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen.
    • 4. Zugeben von 1 μg Antikörper, der spezifisch für RAF-1 ist, in jede Vertiefung und Inkubation für 1 Std. Waschen wie in Schritt 3 beschrieben.
    • 5. Auftauen der Lysate aus RAS/RAF-infizierten Sf9-Zellen und Verdünnen mit TBST auf 10 μg/100 μl. Zugabe von 10 μg verdünntem Lysat zu den Vertiefungen und Inkubation für 1 Std. Schütteln der Platte während der Inkubation. Negative Kontrollen erhalten kein Lysat. Lysate aus RAS/RAF-infizierten Sf9-Insekten-Zellen werden hergestellt, nachdem die Zellen mit rekombinanten Baculoviren bei einer MOI von 5 für jedes Virus infiziert werden, und 48 Std. später geerntet. Die Zellen werden einmal mit PBS gewaschen und in RIPA-Puffer lysiert. Unlösliches Material wird durch Zentrifugation entfernt (5 min bei 10 000 × g). Aliquote der Lysate werden in Trockeneis/Ethanol gefroren und bei –80°C bis zum Gebrauch aufbewahrt.
    • 6. Entfernen von nicht-gebundenem Material und Waschen, wie oben beschrieben (Schritt 3).
    • 7. Zugeben von 2 μg T-MEK und 2 μg HIS-MAEPK pro Vertiefung und Einstellen des Volumens auf 40 μl mit Kinase-Puffer. Verfahren zum Reinigen von T-MEK und MAPK aus Zellextrakten werden hier durch Bezugnahme aufgenommen.
    • 8. Vorverdünnen der Verbindungen (Stammlösung 10 mg/ml DMSO) oder Extrakte 20fach in TBST plus 1% DMSO. Zugabe von 5 μl der vorverdünnten Verbindungen/Extrakte zu den in Schritt 6 beschriebenen Vertiefungen. 20 minütiges Inkubieren. Kontrollen erhalten kein Medikament.
    • 9. Beginn der Kinasereaktion durch Zugabe von 5 μl ATP-Mix; Schütteln der Platten auf einem ELISA-Plattenschüttler während der Inkubation.
    • 10. Beenden der Kinasereaktion nach 60 min durch Zugabe von 30 μl Stop-Lösung zu jeder Vertiefung.
    • 11. Unterbringung der Phosphozellulosematte und der ELISA-Platte in dem Tomtec-Plattenernter. Ernten und Waschen des Filters mit der Filter-Waschlösung entsprechend den Empfehlungen des Herstellers. Trocknen der Filtermatten. Verschließen der Filtermatten und Unterbringen in der Halterung. Unterbringen der Halterung in der Radioaktivitäts-Nachweis-Vorrichtung und Quantifizieren des radioaktiven Phosphors auf den Filtermatten.
  • Alternativ können 40 μl-Aliquote aus einzelnen Vertiefungen der Testplatte zu den entsprechenden Stellen auf der Phosphozellulose-Matte überführt werden. Nach dem Lufttrocknen der Filter werden die Filter in eine Schale überführt. Die Schale wird vorsichtig gerüttelt, worin die Waschlösung in 15 min-Intervallen 1 Std. lang gewechselt wird. Die Filtermatten werden luftgetrocknet. Die Filtermatten werden abgedichtet und in einer Halterung untergebracht, die zum Messen des radioaktiven Phosphors in den Proben geeignet ist. Die Halterung wird in einer Nachweisvorrichtung untergebracht und der radioaktive Phosphor auf den Filtermatten quantifiziert.
  • Die IC50-Werte wurden gemäß dem Protokoll für die folgenden auf 5-Azachinoxalin beruhenden Verbindungen in dem RAF-1-ELISA-Test gemessen:
    Figure 00530001
  • Ein IC50-Wert ist die Konzentration des auf 5-Azachinoxalin beruhenden Inhibitors, der zum Senken der Maximalmenge des phosphorylierten Zielproteins oder des Zellwachstums um 50% erforderlich ist. Die IC50-Werte, die in dem RAF-1-Phsophorylierungs-Test gemessen wurden, sind in der Tabelle 1 dargestellt: TABELLE 1
    Figure 00540001
  • Beispiel 3: Reinigung von MAPK und MEK
  • Die MAPK- und MEK-Proteine werden leicht in Zellen exprimiert, indem ein Gen, das diese Proteine codiert, in einen kommerziell erhältlichen Vektor subkloniert wird, der die Proteine mit einer poly-Histidin-Markierung exprimiert. Gene, die diese Proteine codieren, sind leicht von Laboratorien verfügbar, die gewöhnlich mit diesen Proteinen arbeiten, oder durch Klonieren dieser Gene von Zellen, die cDNA-Banken enthalten. Die Banken sind kommerziell leicht erhältlich und ein Fachmann kann leicht Nukleinsäuresonden entwerfen, die zu cDNA-Molekülen homolog sind, die MEK oder MAPK aus den Nukleinsäuresequenzen von MEK und MAPK codieren, welche in mehreren Gen-Datenbanken, wie Genbank, erhältlich sind. Die Klonierung eines Gens kann in einem kurzen Zeitraum bewerkstelligt werden, worin Techniken verwendet werden, die dem Fachmann derzeit geläufig sind.
  • Die Reinigung der MEK- und MAPK-Proteine aus Zellextrakten kann mit dem folgenden Protokoll erfolgen, das von Robbins et al, 1993, J. Biol. Chem. 268: 5097-5106 angepasst wurde:
    • 1. Die Zellen werden durch Ultraschallbehandlung, osmotischen Stress oder French-Press-Techniken, die dem Fachmann geläufig sind, lysiert. Ein geeigneter Ultraschallbehandlungspuffer wird nachstehend bereitgestellt.
    • 2. Ein fester Träger, der mit Nickel oder Kobalt konjugiert ist, wird mit dem nachstehend beschriebenen Äquilibrierungspuffer äquilibriert. Die poly-Histidin-Markierung bindet spezifisch an die Nickel- und Kobalt-Atome auf dem festen Träger. Die Äquilibrierung kann durch dreimaliges Waschen des Harzes mit einem Volumen des Äquilibrierungspuffers erzielt werden, das dem 10fachen Volumen des festen Trägers entspricht. Der feste Träger ist dem Durchschnittsfachmann leicht verfügbar.
    • 3. Das Zelllysat wird zu dem festen Träger gegeben und in einem Gefäß für einen bestimmten Zeitraum äquilibriert. Alternativ kann der feste Träger in eine Proteinchromatographiesäule gepackt werden, und das Lysat kann durch den festen Träger geströmt werden.
    • 4. Der feste Träger wird mit dem nachstehend beschriebenen Waschpuffer gewaschen.
    • 5. Das MEK- oder MAPK-Protein aus dem festen Träger wird mit einer Menge Elutionspuffer (nachstehend bereitgestellt) eluiert, welcher einen signifikanten Anteil des Proteins aus dem festen Träger entfernt.
  • Ultraschallbehandlungspuffer
    • 50 mM Natriumphosphat pH-Wert 8,0
    • 0,3 M Natriumchlorid
    • 10 mM β-Mercaptoethanol
    • 1% NP40
    • 10 mM NaF
    • 0,5 mM Pefablock
  • Äquilibrierungspuffer
    • 50 mM Natriumphosphat pH-Wert 8,0
    • 0,3 M Natriumchlorid
    • 10 mM β-Mercaptoethanol
    • 1% NP40
    • 10 mM NaF
    • 1mM Imidazol
  • Waschpuffer
    • 50 mM Natriumphosphat pH-Wert 8,0
    • 0,3 M Natriumchlorid
    • 10 mM β-Mercaptoethanol
    • 1% NP40
    • 10 mM NaF
    • 10 mM Imidazol
  • Elutionspuffer
    • 50 mM Natriumphosphat pH-Wert 8,0
    • 0,3 M Natriumchlorid
    • 10 mM β-Mercaptoethanol
    • 1% NP40
    • 10 mM NaF
    • 10-500 mM Imidazol
  • Beispiel 4: Test zum Messen der Phosphorylierungsfunktion des EGF-Rezeptors
  • Die EGF-Rezeptorkinase-Aktivität (EGFR-NIH3T3-Test) in ganzen Zellen wurde gemessen wie eingehend beschrieben in der PCT-Veröffentlichung WO9640116, eingereicht am 5. Juni 1996, von Tang et al., mit dem Titel "Indolinone Compounds for the Treatment of Disease", die hiermit vollinhaltlich einschließlich der Zeichnungen unter Bezugnahme aufgenommen ist.
  • Die in dem EGF-Rezeptor-Phosphorylierungstest gemessenen IC50-Werte sind in der Tabelle 2 gezeigt: TABELLE 2
    Figure 00560001
  • Beispiel 5: Test zur Messung der Wirkung von auf 5-Azachinoxalin beruhenden Verbindungen auf das Wachstum von Zellen, die RAS exprimieren
  • Der folgende Test misst die Wachstumsraten für NIH-3T3-Zellen, die RAS exprimieren. Der Zweck des Tests ist die Bestimmung der Wirkungen der Verbindungen auf das Wachstum von NIH-3T3-Zellen über die Expression von H-Ras.
  • Materialien
    • sterile Flachbodenplatten mit 96 Vertiefungen
    • sterile Rundbodenplatten mit 96 Vertiefungen
    • sterile Pipetten mit 25 ml- oder 100 ml-Reservoir, Mehrkanal-Pipetman
    • sterile Pipettenspitzen
    • sterile 15 ml- und 50 ml-Röhrchen
  • Reagenzien
    • 0,4% SRB in 1% Essigsäure
    • 10 mM Tris-Base
    • 10% TCA
    • 1% Essigsäure
    • steriles DMSO (Sigma)
    • Verbindung in DMSO (Stammlösung mit 100 mM oder weniger)
    • Trypsin-EDTA (GIBCO BRL)
  • Zelllinie:
  • 3T3/H-Ras (NIH 3T3-Klon 7, Zellen, die das genomische Fragment von onkogenem H-Ras exprimieren).
  • Die Zellen können nach dem folgenden Protokoll konstruiert werden:
    • 1. Ein Genfragment, das Ras codiert, wird in einen kommerziell erhältlichen Vektor subkloniert, der NIH-3T3-Zellen stabil transfiziert. Das Fragment stammt von dem genomischen transformierenden Allel von cHa-ras.
    • 2. NIH-3T3-Zellen werden mit dem subklonierten Vektor durch ein Calciumphosphatverfahren transfiziert.
  • Zellen, die das Ras-Konstrukt exprimieren, werden in 2% Serum in DMEM selektiert. Sichtbare Foki werden nach 2 Wochen beobachtet. Die transformierten Zellen werden vereinigt, so dass eine stabil transformierte Zelllinie erzeugt wird.
  • Wachstumsmedium:
    • 2% Kälberserum/DMEM + 2 mM Glutamin, Pen/Strep
  • Protokoll:
  • Tag 0: Ausplattieren der Zellen:
  • Dieser Teil des Tests erfolgt in einer Laborbox mit laminarer Strömung.
    • 1. Trypsinisierung der Zellen. 200 μl Zellsuspension werden zu 10 ml Isoton gegeben. Die Zellen werden mit einem Coulter-Zähler gezählt.
    • 2. Die Zellen werden in Wachstumsmedium auf 60 000 Zellen/ml verdünnt. Jeweils 100 μl Zellen werden in die Vertiefungen einer Flachbodenplatte mit 96 Vertiefungen überführt, so dass 6000 Zellen pro Vertiefung erhalten werden.
    • 3. Die Hälfte der Platte (4 Reihen) für jede Verbindung und die 4fache Anzahl Vertiefungen für jede Verbindungskonzentration und ein Satz mit 4 Vertiefungen für die Mediumskontrolle wird verwendet.
    • 4. Die Platten werden vorsichtig geschüttelt, so dass die Zellen gleichmäßig anhaften können.
    • 5. Die Platten werden in einem 10% CO2-Inkubator bei 37°C inkubiert.
  • Tag 1: Zugabe der Verbindung:
  • Dieser Teil des Tests erfolgt in einer Laborbox mit laminarer Strömung.
    • 1. In einer Rundbodenplatte mit 96 Vertiefungen werden 120 μl Wachstumsmedium, das 2x End% DMSO enthält, und das in der höchsten Screening-Konzentration der Verbindung gefunden wird, in die Spalten 1 bis 11 gegeben. Ist die höchste Konzentration beispielsweise 100 μl und besteht diese aus einer 100 mM Stammlösung, so ist 1X DMSO 0,1% und 2X DMSO ist 0,2%. Diese Platte wird zum Austitrieren der Verbindung verwendet, und zwar 4 Reihen pro Verbindung.
    • 2. In einem sterilen 15 ml-Röhrchen wird eine 2X-Lösung der höchsten Screening-Konzentration der Verbindung in Wachstumsmedium plus 2X DMSO hergestellt. Es wird 1 ml pro Zelllinie benötigt. Die Ausgangskonzentration der Verbindung ist gewöhnlich 100 μM, jedoch kann diese Konzentration je nach der Löslichkeit der Verbindung variieren.
    • 3. 240 μl der 2X Ausgangsverbindungslösung werden in die vierfache Anzahl Vertiefungen in Spalte 12 der Rundbodenplatte mit 96 Vertiefungen hinzugefügt. Von rechts nach links werden 1 : 2 Verdünnungsreihen über die Platte hergestellt, indem 12 μl von Spalte 12 in Spalte 11, von Spalte 11 in Spalte 10 usw. bis zu Spalte 2 überführt werden. 100 μl der Verbindungs-Verdünnungen und 100 μl Medium werden in Spalte 1 auf 100 μl Medium auf Zellen in den entsprechenden Vertiefungen einer Flachbodenplatte mit 96 Vertiefungen überführt. Das Gesamtvolumen pro Vertiefung sollte 200 μl sein.
    • 4. Die Platte wird zurück in den Inkubator überführt und 3 Tage inkubiert.
  • Tag 4: Entwicklung des Tests
  • Dieser Teil des Tests erfolgt auf der Laborbank.
    • 1. Das Medium wird abgesaugt. In die Vertiefungen werden jeweils 200 μl kalte 10% TCA zur Fixierung der Zellen gegeben. Die Platte wird mindestens 60 min bei 4°C inkubiert.
    • 2. Die TCA wird verworfen und die Vertiefungen 5mal mit Leitungswasser gespült. Die Platten werden verkehrt herum auf Papiertüchern getrocknet.
    • 3. Die Zellen werden mit 100 μl/Vertiefung 0,4% SRB 10 min lang gefärbt.
    • 4. SRB wird abdekantiert und die Vertiefungen 5mal mit 1% Essigsäure gespült. Die Platten werden verkehrt herum auf Papiertüchern vollständig getrocknet.
    • 5. Der Farbstoff wird mit 100 μl/Vertiefung 10 mM Tris-Base 5 bis 10 min auf einem Schüttler solubilisiert.
    • 6. Die Platten werden auf einem Dynatech ELISA-Plattenlesegerät bei 570 nm mit Bezug auf 630 nm gelesen.
  • Ausgewählte Verbindungen hemmten die Wachstumsraten der Zellen, die RAS überexprimieren, wie in Tabelle 3 veranschaulicht ist. TABELLE 3
    Figure 00600001
  • Beispiel 6: Test zum Messen der Wirkung der auf 5-Azachinoxalin beruhenden Verbindungen auf das Wachstum von A549-Zellen
  • Der folgende Test misst die Wachstumsraten für A549-Zellen. Der Zweck des Tests ist die Bestimmung der Wirkungen der Verbindungen auf das Wachstum von Lungenkarzinomzellen A549 beim Menschen. A549-Zellen sind leicht von kommerziellen Quellen, wie ATCC (CCL185), erhältlich.
  • Materialien:
    • sterile Flachbodenplatten mit 96 Vertiefungen
    • sterile Rundbodenplatten mit 96 Vertiefungen
    • sterile Pipetten mit 25 ml- oder 100 ml-Reservoir, Mehrkanal-Pipetman
    • sterile Pipettenspitzen
    • sterile 15 ml- und 50 ml-Röhrchen
  • Reagenzien
    • 0,4% SRB in 1% Essigsäure
    • 10 mM Tris-Base
    • 10% TCA
    • 1% Essigsäure
    • steriles DMSO (Sigma)
    • Verbindung in DMSO (Stammlösung mit 100 mM oder weniger)
    • Trypsin-EDTA (GIBCO BRL)
  • Zelllinie und Wachstumsmedium:
    • Menschliche Lungenkarzinom-Zellen A549 (ATCC CCL185) 10% fötales Kälberserum in Ham's F12-K
  • Protokoll
  • Tag 0: Zellplattierung:
  • Dieser Teil des Tests erfolgt in einer Laborbox mit laminarer Strömung.
    • 1. Trypsinisierung der Zellen. 200 μl Zellsuspension werden zu 10 ml Isoton gegeben. Die Zellen werden mit einem Coulter-Zähler gezählt.
    • 2. Die Zellen werden in Wachstumsmedium auf 20 000 Zellen/ml verdünnt. Jeweils 100 μl Zellen werden in die Vertiefungen einer Flachbodenplatte mit 96 Vertiefungen überführt, so dass 2000 Zellen pro Vertiefung erhalten werden.
    • 3. Die Hälfte der Platte (4 Reihen) für jede Verbindung und die 4fache Anzahl Vertiefungen für jede Verbindungskonzentration und ein Satz von 4 Vertiefungen für die Mediumskontrolle wird verwendet.
    • 4. Die Platten werden vorsichtig geschüttelt, so dass die Zellen gleichmäßig anhaften können.
    • 5. Die Platten werden in einem 10% CO2-Inkubator bei 37°C inkubiert.
  • Tag 1: Zugabe der Verbindung:
  • Dieser Teil des Tests erfolgt in einer Laborbox mit laminarer Strömung.
    • 1. In einer Rundbodenplatte mit 96 Vertiefungen werden 120 μl Wachstumsmedium, das 2x End% DMSO enthält, und das in der höchsten Screening-Konzentration der Verbindung gefunden wird, in die Spalten 1 bis 11 gegeben. Ist die höchste Konzentration beispielsweise 100 μM und besteht diese aus einer 100 mM Stammlösung, so ist 1X DMSO 0,1% und 2X DMSO ist 0,2%. Diese Platte wird zum Austitrieren der Verbindung verwendet, und zwar 4 Reihen pro Verbindung.
    • 2. In einem sterilen 15 ml-Röhrchen wird eine 2X-Lösung der höchsten Screening-Konzentration der Verbindung in Wachstumsmedium plus 2X DMSO hergestellt. Es wird 1 ml pro Zelllinie benötigt. Die Ausgangskonzentration der Verbindung ist gewöhnlich 100 μM, jedoch kann diese Konzentration je nach der Löslichkeit der Verbindung variieren.
    • 3. 240 μl der 2X Ausgangsverbindungslösung werden in die vierfache Anzahl Vertiefungen in Spalte 12 der Rundbodenplatte mit 96 Vertiefungen hinzugefügt. Von rechts nach links werden 1 : 2 Verdünnungsreihen über die Platte erzeugt, indem 120 μl von Spalte 12 in Spalte 11, Spalte 11 in Spalte 10 usw. bis zu Spalte 2 überführt werden. 100 μl der Verbindungs-Verdünnungen und 100 μl Medium werden in Spalte 1 auf 100 μl Medium auf Zellen in den entsprechenden Vertiefungen einer Flachbodenplatte mit 96 Vertiefungen überführt. Das Gesamtvolumen pro Vertiefung sollte 200 μl sein.
    • 4. Die Platte wird zurück in den Inkubator überführt und 3 Tage inkubiert.
  • Tag 5: Entwicklung des Tests
  • Dieser Teil des Tests erfolgt auf der Laborbank.
    • 1. Das Medium wird abgesaugt. In die Vertiefungen werden jeweils 200 μl kalte 10% TCA zur Fixierung der Zellen gegeben. Die Platte wird mindestens 60 min bei 4°C inkubiert.
    • 2. Die TCA wird verworfen und die Vertiefungen 5mal mit Leitungswasser gespült. Die Platten werden verkehrt herum auf Papiertüchern getrocknet.
    • 3. Die Zellen werden mit 100 μl/Vertiefung 0,4% SRB 10 min lang gefärbt.
    • 4. SRB wird abdekantiert und die Vertiefungen 5mal mit 1% Essigsäure gespült. Die Platten werden verkehrt herum auf Papiertüchern vollständig getrocknet.
    • 5. Der Farbstoff wird mit 100 μl/Vertiefung 10 mM Tris-Base 5 bis 10 min auf einem Schüttler solubilisiert.
    • 6. Die Platten werden auf einem Dynatech ELISA-Plattenlesegerät bei 570 nm mit Bezug auf 630 nm gelesen.
  • Ausgewählte Verbindungen hemmten die Wachstumsraten von A549-Zellen, wie in Tabelle 4 veranschaulicht ist. TABELLE 4
    Figure 00630001
  • Beispiel 7: Verfahren zur Bestimmung der biologischen Aktivität von RAF-Modulatoren in vivo
  • Fremd-Transplantat-Untersuchungen lassen sich zur Überwachung der Wirkung der erfindungsgemäßen Verbindungen auf die Hemmung von Ovar-, Melanom-, Prostata-, Lungen- und Brustdrüsen-Tumorzellen verwenden. Das Protokoll für den Test ist eingehend beschrieben in der PCT-Veröffentlichung WO9640116, eingereicht am 5. Juni 1996, von Tang et al., mit dem Titel "Indolinone Compounds for the Treatment of Disease", die hiermit vollinhaltlich einschließlich der Zeichnungen, unter Bezugnahme aufgenommen ist.
  • Die hier veranschaulichend beschriebene Erfindung kann in Abwesenheit eines jeden Elements oder aller Elemente bzw. einer jeden Beschränkung oder aller Beschränkungen, die hier nicht spezifisch offenbart sind, praktiziert werden. Die hier eingesetzten Begriffe und Ausdrücke werden als Begriffe zur Beschreibung und nicht zur Beschränkung verwendet, und die Verwendung solcher Begriffe und Ausdrücke soll keinen Ausschluss irgendwelcher Äquivalente der gezeigten und beschriebenen Merkmale oder von Teilen davon bedeuten, sondern es wird anerkannt, dass im Rahmen der beanspruchten Erfindung verschiedene Modifikationen möglich sind. Es ist somit selbstverständlich, dass die Erfindung zwar spezifisch anhand der bevorzugten Ausführungsformen und wahlfreien Eigenschaften beschrieben ist, jedoch können Modifikationen und Abwandlungen von den hier offenbarten Konzepten durch den Fachmann vorgenommen werden, und dass solche Modifikationen und Abwandlungen im Rahmen der Erfindung liegen sollen, die durch die beigefügten Ansprüche definiert werden.
  • Diejenigen Literaturangaben, die zuvor nicht durch Bezugnahme aufgenommen wurden, einschließlich sowohl Patent- als auch Nicht-Patent-Literaturangaben, sind hiermit ausdrücklich für alle Zwecke durch Bezugnahme aufgenommen. Weitere Ausführungsformen liegen im Bereich der folgenden Ansprüche.

Claims (18)

  1. Auf 5-Azachinoxalin beruhende Verbindung mit einer in der Formel I angegebenen Struktur:
    Figure 00650001
    worin (a) R1, R2, R3 und R4 jeweils unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe: (i) Wasserstoff; (ii) gesättigtes oder ungesättigtes Alkyl, das gegebenenfalls mit einer fünfgliedrigen oder sechsgliedrigen Aryl- oder Heteroarylringgruppierung substituiert ist, worin die Ringgruppierung gegebenenfalls mit einem, zwei oder drei Substituenten, jeweils unabhängig ausgewählt aus der Gruppe Alkyl-, Halogen-, Trihalogenmethyl-, Carboxylat-, Nitro- und Estergruppierungen, substituiert ist; (iii) ein Amin der Formel NX2X3, worin X2 und X3 unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe Wasserstoff, gesättigtes oder ungesättigtes Alkyl und fünfgliedrige oder sechsgliedrige Aryl- oder Heteroarylringgruppierungen; (iv) Halogen oder Trihalogenmethyl; (v) ein Keton der Formel -CO-X4, worin X4 ausgewählt ist aus der Gruppe Wasserstoff, Alkyl und fünfgliedrige oder sechsgliedrige Aryl- oder Heteroarylgruppierungen; (vi) eine Carbonsäure der Formel -(X5)n-COOH oder -ester der Formel -(X6)n-COO-X7, worin X5, X6 und X7 unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe Alkyl und fünfgliedrige oder sechsgliedrige Aryl- oder Heteroarylgruppierungen und worin n gleich 0 oder 1 ist; (vii) ein Alkohol der Formel (X8)n-OH oder eine Alkoholatgruppierung der Formel -(X8)n-O-X9, worin X8 und X9 unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe gesättigtes oder ungesättigtes Alkyl und fünfgliedrige oder sechsgliedrige Aryl- oder Heteroarylringgruppierungen, worin der Ring gegebenenfalls mit einem oder mehreren Substituenten, unabhängig ausgewählt aus der Gruppe Alkyl, Halogen, Trihalogenmethyl, Carboxylat, Nitro und Ester, substituiert ist und worin n gleich 0 oder 1 ist; (viii) ein Amid der Formel -NHCOX10, worin X10 ausgewählt ist aus der Gruppe Alkyl, Hydroxyl und fünfgliedrige oder sechsgliedrige Aryl- oder Heteroarylringgruppierungen, worin der Ring gegebenenfalls mit einem oder mehreren Substituenten, unabhängig ausgewählt aus der Gruppe Alkyl, Halogen, Trihalogenmethyl, Carboxylat, Nitro oder Ester, substituiert ist; (ix) -SO2NX11X12, worin X11 und X12 unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe Wasserstoff, Alkyl und fünfgliedrige oder sechsgliedrige Aryl- oder Heteroarylringgruppierungen; (x) eine fünfgliedrige oder sechsgliedrige Aryl- oder Heteroarylringgruppierung, gegebenenfalls substituiert mit einem, zwei oder drei Substituenten, unabhängig ausgewählt aus der Gruppe Alkyl-, Halogen-, Trihalogenmethyl-, Carboxylat-, Nitro- und Estergruppierungen; (xi) ein Aldehyd der Formel -CO-H; (xii) ein Sulfon der Formel -SO2-X13, worin X13 ausgewählt ist aus der Gruppe gesättigtes oder ungesättigtes Alkyl und fünfgliedrige oder sechsgliedrige Aryl- oder Heteroarylgruppierungen; und (b) R6 ausgewählt ist aus der Gruppe: (i) ein Amin der Formel NX2X3, worin X2 und X3 unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe Wasserstoff, gesättigtes oder ungesättigtes Alkyl und fünfgliedrige oder sechsgliedrige Aryl- oder Heteroarylringgruppierungen; (ii) Halogen oder Trihalogenmethyl; (iii) ein Keton der Formel -CO-X4, worin X4 ausgewählt ist aus der Gruppe Wasserstoff, Alkyl und fünfgliedrige oder sechsgliedrige Aryl- oder Heteroarylgruppierungen; (iv) eine Carbonsäure der Formel -(X5)n-COOH oder -ester der Formel -(X6) -COO-X7, worin X5, X6 und X7 unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe Alkyl und fünfgliedrige oder sechsgliedrige Aryl- oder Heteroarylgruppierungen und worin n gleich 0 oder 1 ist; (v) ein Alkohol der Formel (X8)n-OH oder eine Alkoholatgruppierung der Formel -(X8)n-O-X9, worin X8 und X9 unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe gesättigtes oder ungesättigtes Alkyl und fünfgliedrige oder sechsgliedrige Aryl- oder Heteroarylringgruppierungen, worin der Ring gegebenenfalls mit einem oder mehreren Substituenten, unabhängig ausgewählt aus der Gruppe Alkyl, Halogen, Trihalogenmethyl, Carboxylat, Nitro und Ester, substituiert ist und worin n gleich 0 oder 1 ist; (vi) ein Amid der Formel -NHCOX10, worin X10 ausgewählt ist aus der Gruppe Alkyl, Hydroxyl und fünfgliedrige oder sechsgliedrige Aryl- oder Heteroarylringgruppierungen, worin der Ring gegebenenfalls mit einem oder mehreren Substituenten, unabhängig ausgewählt aus der Gruppe Alkyl, Halogen, Trihalogenmethyl, Carboxylat, Nitro oder Ester, substituiert ist; (vii) -SO2NX11X12, worin X11 und X12 unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe Wasserstoff, Alkyl und fünfgliedrige oder sechsgliedrige Aryl- oder Heteroarylringgruppierungen; (viii) eine fünfgliedrige oder sechsgliedrige Aryl- oder Heteroarylringgruppierung, gegebenenfalls substituiert mit einem, zwei oder drei Substituenten, unabhängig ausgewählt aus der Gruppe Alkyl-, Halogen-, Trihalogenmethyl-, Carboxylat-, Nitro- und Estergruppierungen; (ix) ein Aldehyd der Formel -CO-H; (x) ein Sulfon der Formel -SO2-X13, worin X13 ausgewählt ist aus der Gruppe gesättigtes oder ungesättigtes Alkyl und fünfgliedrige oder sechsgliedrige Aryl- oder Heteroarylgruppierungen; und (xi) gesättigtes oder ungesättigtes Alkyl, das gegebenenfalls mit einer fünfgliedrigen oder sechsgliedrigen Aryl- oder Heteroarylringgruppierung substituiert ist, worin die Ringgruppierung gegebenenfalls mit einem, zwei oder drei Substituenten, jeweils unabhängig ausgewählt aus der Gruppe Alkyl-, Halogen-, Trihalogenmethyl-, Carboxylat-, Nitro- und Estergruppierungen, substituiert ist; (c) X1 ausgewählt ist aus der Gruppe Stickstoff und Schwefel.
  2. Verbindungen nach Anspruch 1, worin R1, R2, R3 und R4 unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe: (i) Wasserstoff; (ii) gesättigtes oder ungesättigtes Alkyl, gegebenenfalls substituiert mit einer fünfgliedrigen oder sechsgliedrigen Aryl- oder Heteroarylringgruppierung, gegebenenfalls substituiert mit einem, zwei oder drei Substituenten, unabhängig ausgewählt aus der Gruppe Alkyl-, Halogen-, Trihalogenmethyl-, Carboxylat-, Nitro- und Estergruppierungen; und (iii) eine fünfgliedrige oder sechsgliedrige Aryl- oder Heteroarylringgruppierung, gegebenenfalls substituiert mit einem, zwei oder drei Substituenten, unabhängig ausgewählt aus der Gruppe Alkyl-, Halogen-, Trihalogenmethyl-, Carboxylat-, Nitro- und Estergruppierungen, und worin R6 ausgewählt ist aus (i) eine fünfgliedrige oder sechsgliedrige Aryl- oder Heteroarylringgruppierung, gegebenenfalls substituiert mit einem, zwei oder drei Substituenten, unabhängig ausgewählt aus der Gruppe Alkyl-, Halogen-, Trihalogenmethyl-, Carboxylat-, Nitro- und Estergruppierungen (ii) gesättigtes oder ungesättigtes Alkyl, gegebenenfalls substituiert mit einer fünfgliedrigen oder sechsgliedrigen Aryl- oder Heteroarylringgruppierung, gegebenenfalls substituiert mit einem, zwei oder drei Substituenten, unabhängig ausgewählt aus der Gruppe Alkyl-, Halogen-, Trihalogenmethyl-, Carboxylat-, Nitro- und Estergruppierungen.
  3. Verbindungen nach Anspruch 2, worin R3 und R4 für Wasserstoff stehen.
  4. Verbindungen nach Anspruch 3, worin R1 und R2 unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe: (i) Methyl, gegebenenfalls substituiert mit Phenyl, gegebenenfalls substituiert mit Substituenten, ausgewählt aus der Gruppe Alkyl- und Halogengruppierungen; und (ii) Phenyl, gegebenenfalls substituiert mit Substituenten, ausgewählt aus der Gruppe Alkyl- und Halogengruppierungen.
  5. Verbindung nach Anspruch, worin R1 und R2 unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe Wasserstoff, Methyl, Phenyl und 4-Hydroxyphenyl.
  6. Verbindungen nach Anspruch 4, worin das X1 für Stickstoff steht.
  7. Verbindung nach Anspruch 6, worin die Substituenten R6 und X1 zusammengenommen eine Gruppierung, ausgewählt aus der Gruppe Benzylamino, 4-Fluorbenzylamino, 2-Carboxybenzylamino, 3-Carboxybenzylamino, 4-Carboxybenzylamino, 2-Nitrobenzylamino, 3-Nitrobenzylamino, 4-Nitrobenzylamino, 2-Methylbenzylamino, 3-Methylbenzylamino, 4-Methylbenzylamino, 2-Chlorbenzylamino, 3-Chlorbenzylamino, 4-Chlorbenzylamino, 2-Fluorbenzylamino, 3-Fluorbenzylamino, 4-Fluorbenzylamino, 2-(Trifluormethyl)benzylamino, 3-(Trifluormethyl)benzylamino, 4-(Trifluormethyl)benzylamino, Phenetyl-1-amino, Phenylamino, 2-Carboxyphenylamino, 3-Carboxyphenylamino, 4-Carboxyphenylamino, 2-Nitrophenylamino, 3-Nitrophenylamino, 4-Nitrophenylamino, 2-Methylphenylamino, 3-Methylphenylamino, 4-Methylphenylamino, 2-Chlorphenylamino, 3-Chlorphenylamino, 4-Chlorphenylamino, 2-Fluorphenylamino, 3-Fluorphenylamino, 4-Fluorphenylamino, 2-(Trifluormethyl)phenylamino, 3-(Trifluormethyl)phenylamino, 4-(Trifluormethyl)phenylamino, Pyrid-2-amino, Pyrid-3-amino, Pyrid-4-amino und Pyrid-2-methylamino, bilden.
  8. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine auf 5-Azachinoxalin beruhende Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 7 oder ein Salz davon sowie ein physiologisch unbedenkliches Träger- oder Verdünnungsmittel.
  9. Auf 5-Azachinoxalin beruhende Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 7 oder ein Salz davon zur therapeutischen Verwendung.
  10. Verwendung einer auf 5-Azachinoxalin beruhenden Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 7 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer durch die zelluläre Expression einer Serin/Threonin-Proteinkinase modulierten Krankheit, worin es sich bei der Krankheit um eine Krebserkrankung, insbesondere Lungenkrebs, Ovarialkarzinom, Brustkrebs, Hirnkarzinom, intraaxiales Hirnkarzinom, Darmkrebs, Prostatakrebs, Sarkom, Kaposi-Sarkom, Melanom und Gliom, oder eine fibrotische Erkrankung handelt.
  11. Verwendung einer auf 5-Azachinoxalin beruhenden Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 7 zur in-vitro-Behandlung, worin die Funktion einer Serin/Threonin-Proteinkinase moduliert wird.
  12. Verwendung nach Ansprüchen 10 und 11, worin es sich bei der Serin/Threonin-Proteinkinase um RAF handelt.
  13. Verwendung einer auf 5-Azachinoxalin beruhenden Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 7 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Krebs oder einer fibrotischen Erkrankung.
  14. Verwendung nach Anspruch 13, worin das Arzneimittel zur Behandlung einer Krebserkrankung, ausgewählt aus der Gruppe Lungenkrebs, Ovarialkarzinom, Brustkrebs, Hirnkarzinom, intraaxiales Hirnkarzinom, Darmkrebs, Prostatakrebs, Sarkom, Kaposi-Sarkom, Melanom und Gliom.
  15. Verwendung nach Anspruch 13 oder 14, worin das Arzneimittel für die Behandlung eines Zustands vorgesehen ist, der mit einer Aberration in einem Signaltransduktionsweg assoziiert ist, die durch eine Wechselwirkung zwischen einer Serin/Threonin-Proteinkinase und einem natürlichen Bindungspartner charakterisiert ist, worin es sich bei dem Zustand um eine Krebserkrankung, insbesondere Lungenkrebs, Ovarialkarzinom, Brustkrebs, Hirnkarzinom, intraaxiales Hirnkarzinom, Darmkrebs, Prostatakrebs, Sarkom, Kaposi-Sarkom, Melanom und Gliom, oder eine fibrotische Erkrankung handelt.
  16. Verwendung nach Anspruch 15, worin es sich bei der Serin/Threonin-Proteinkinase um RAF handelt.
  17. Verfahren zur Modulation der Funktion einer Serin/Threonin-Proteinkinase in-vitro, bei dem man die Serin/Threonin-Proteinkinase exprimierende Zellen mit einer auf 5-Azachinoxalin beruhenden Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 7 in Kontakt bringt.
  18. Verfahren nach Anspruch 17, worin es sich bei der Serin/Threonin-Proteinkinase um RAF handelt.
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