SK4722000A3 - Methods of in vitro modulating serine/threonine protein kinase function, identification method of corresponding modulators, of 5-azaquinoxaline-based compounds, method for the production thereof and pharmaceutical compositions - Google Patents

Description

Spôsob in vitro modulácie funkcie serínovej/treonínovej proteínkinázy, spôsob identifikácie príslušných modulátorov, zlúčeniny na báze 5-azachinoxalínu, spôsob ich výroby a farmaceutické kompozície

Oblasť techniky

Vynález sa týka spôsobu in vitro modulácie funkcie serínovej/treonínovej proteínkinázy, spôsobu identifikácie príslušných modulátorov, zlúčenín na báze 5-azachinoxalínu, spôsobu ich výroby a farmaceutických kompozícií na ich báze.

Doterajší stav techniky

Doterajší stav techniky, ktorý je ďalej opísaný, nie je v žiadnom ohľade na ujmu novosti a invenčnosti riešenia podľa vynálezu a uvádza sa len na bližšie porozumenie vynálezu.

Trandukcia bunkového signálu je základný mechanizmus, ktorého, prostredníctvom sú externé stimuly regulujúce rozličné bunkové procesy prenášané dovnútra buniek. Jeden z kiúčových biochemických mechanizmov signálovej transdukcie zahŕňa reverzibilnú fosforyláciu proteínov, ktorá reguluje aktivitu vyzretých bielkovín zmenou ich štruktúry a funkcie. Najlepšie charakterizované proteínkinázy pri eukaryotoch fosforylujú bielkoviny na alkoholovej skupine serínových, treonínových a tyrozínových zvyškov. Tieto kinázy sa rozpadajú do dvoch skupín, do skupiny kináz špecifických pre fosforyláciu serínu a treonínu a do skupiny kináz špecifických pre fosforyláciu tyrozínu. Niektoré kinázy majú tzv. „duálnu špecifitu, čo

1cU znamená, že sú schopné fosforylovať zvyšky tyrozínu aj zvyšky serínu/treonínu.

Proteínkinázy sa môžu charakterizovať aj svojím umiestnením v bunke. Niektoré kinázy sú transmembránové receptorové bielkoviny schopné viazať ligandy zvonku bunkovej membrány. Naviazanie ligandov narúša kinázovú katalytickú aktivitu receptorovej bielkoviny. Iné kinázy sú nereceptorové bielkoviny bez transmembránovej domény. Nereceptorové proteínkinázy sa nachádzajú v celom rade bunkových kompartmentov, od vnútor ného povrchu bunkovej membrány až k jadru.

Γ Γ η e r e η e cr.rf

Mnoho kináz hrá úlohu v regulačných kaskádach, kde ich substráty môžu zahŕňať iné kinázy, ktorých aktivity sú regulované ich stavom fosforylácie. Napokon je efektorová aktivita modulovaná fosforyláciou rezultujúcou z aktivácie celej metabolickej dráhy.

Rodina serinových/treoninových proteinkináz zahŕňa kinázy regulujúce mnoho krokov v signálnych kaskádach, vrátane kaskád kontrolujúcich bunkový rast, migráciu, diferenciáciu, génovú expresiu, kontrakciu svalov, metabolizmus glukózy, syntézu bunkových proteínov a reguláciu bunkového cyklu.

Príkladom non-receptorovej proteínkinázy, ktorá fosforyluje cieľové bielkoviny na zvyškoch serínu a treonínu, je RAF. RAF moduluje katalytickú aktivitu ďalších proteinkináz, ako je napríklad proteínkináza, ktorá fosforyluje, a tým aktivuje mitogénom aktivovanú proteínkinázu (MAPK). RAF sama o sebe je aktivovaná v membráne ukotveným proteínom RAS, ktorý je sám aktivovaný ligandom aktivovanou tyrozínovou receptorovou proteínkinázou, ako je napríklad receptor pre epidermálny rastový faktor (EGFR) a receptor pre rastový faktor derivovaný z krvných doštičiek (PDGFR). Biologická významnosť kinázy RAF je zdôraznená faktom, že pozmenené formy kinázy RAF môžu spôsobiť rozvoj rakoviny. Dôkazom poukazujúcim na dôležitosť kinázy RAF pri malignitách je práca autorov Monia et al., 1996, Náture Medicíne 2:668, ktorá je týmto v celom svojom rozsahu vrátane všetkých obrázkov a tabuliek začlenená do predkladaného vynálezu ako referencia.

V snahe objaviť nové terapeutické postupy na liečbu nádorových a iných ochorení biomedicínski chemici a výskumní pracovníci navrhli, syntetizovali a testovali molekuly, ktoré inhibujú funkciu proteinkináz. Niektoré malé organické molekuly vytvárajú triedu zlúčenín, ktoré modulujú funkciu proteínkináz.

Opísali sa príklady molekúl, ktoré inhibujú funkciu proteínkináz. Jedná sa o bis monocyklické, bicyklické alebo heterocyklické arylové zlúčeniny (PCT WO 92/20642), deriváty vinylénazaindolu (PCT WO 94/14808), l-cyklopropyl-4-pyridylchinolóny (patent US Patent č. 5330992), styrylové zlúčeniny (Levitzki et al., US Patent č. 5217999, nazvaný „Styrylové zlúčeniny, ktoré inhibujú EGF receptorovú proteínovú tyrozínkinázu, Lyon a Lyon spis č. 208/050), styrylom substituované pyridylové zlúčeniny (patent US Patent č. 5302606), určité chinazolínové deriváty (prihláška EP č. 0 566 266 Al), selenoindoly a selenidy (PCT WO 94/03427), tricyklické polyhydroxylové zlúčeniny (PCT WO 92/21660) a zlúčeniny na báze benzylfosfónovej kyseliny (PCT WO 91/15495).

Zlúčeniny, ktoré môžu prekonať bunkovú membránu a sú rezistentné voči kyslej hydrolýze, sú potenciálne výhodnými terapeutikami pre svoju biodostupnosť po perorálnom podaní pacientom. Avšak mnoho z týchto inhibítorov proteínkináz inhibuje len slabo ich funkciu. Okrem toho mnoho z nich inhibuje celý rad proteínkináz a spôsobuje preto významné vedľajšie účinky pri terapeutickom použití.

Napriek významnému pokroku, ktorý bol dosiahnutý vo vývoji zlúčenín určených na liečbu nádorových,ochorení, trvá stále potreba identifikovať molekuly a substitučné varianty, ktoré by mohli tvoriť zlúčeniny schopné modulácie funkcie konkrétnych proteínkináz.

Podstata vynálezu

Časť predkladaného vynálezu je zameraná na metódy modulácie funkcie serinovových/treoninových proteinkináz pomocou zlúčenín na báze 5-azachinoxalínu. Metódy zahŕňajú bunky, ktoré exprimujú serínovú/treonínovú proteínkinázu, ako je napríklad RAF. Vynález okrem toho opisuje metódy prevencie a liečby abnormálnych stavov so vzťahom k serinovým/treoninovým proteinkinázam pomocou zlúčeniny identifikovanej v predkladanom vynáleze. Vynález sa ďalej týka farmaceutických preparátov obsahujúcich zlúčeniny identifikované pomocou metód predkladaného vynálezu.

I. Metódy detekcie zlúčenín, ktoré modulujú funkciu serinovej/treonínovej proteínkinázy

Metódy predkladaného vynálezu predstavujú prostriedok na moduláciu funkcie receptorových aj cytosólových serínových/treonínových proteinkináz. Tieto metódy predstavujú prostriedok na moduláciu enzýmov za podmienok in vitro aj in vivo. Na podanie in vivo sa metódy predkladaného vynálezu týkajú čiastočne metódy identifikácie zlúčenín, ktoré modulujú funkciu serínových/treonínových kináz.

Z tohto dôvodu vynález po prvé uvádza metódu modulácie funkcie serínovej/treonínovej proteínkinázy pomocou 5-azachinoxalínovej zlúčeniny. 5-Azachinoxalínová zlúčenina je voliteľne substituovaná organickými skupinami. Metóda je tvorená kontaktom buniek exprimujúcich serínovú/treonínovú proteínkinázu so zlúčeninou, ktorý je predmetom predkladaného vynálezu.

Termín „funkcia novej proteínkinázy. kináz zahŕňa kinázy, sa týka bunkovej úlohy serínovej/treoníRodina serínových/treonínových proteínktoré regulujú mnoho krokov v signálnych

- c kaskádach, vrátane kaskád kontrolujúcich bunkový rast, migráciu, diferenciáciu, génovú expresiu, kontrakciu svalov, metabolizmus glukózy, syntézu bunkových proteínov a reguláciu bunkového cyklu.

Termín „moduluje” sa týka schopnosti zlúčeniny narušiť funkciu proteínkinázy. Modulujúca látka aktivuje katalytickú aktivitu proteínkinázy, najlepšie aktivuje alebo inhibuje katalytickú aktivitu proteínkinázy v závislosti od koncentrácie zlúčeniny vystavenej proteínkináze a úplne najlepšie inhibuje katalytickú aktivitu proteínkinázy.

Termín „katalytická aktivita v kontexte predkladaného vynálezu definuje stupeň fosforylácie substrátu proteínkinázou. Katalytická aktivita sa môže merať napríklad určením množstva substrátu premeneného ná produkt v čase. Fosforylácia substrátu prebieha na aktívnom mieste proteínkinázy. Aktívne miesto je za normálnych okolností dutina, v ktorej je substrát naviazaný na proteínkinázu a je fosforylovaný.

Tu používaný termín „substrát” sa týka molekuly fosforylovanej serínovou/treonínovou proteínkinázou. Substrátom je najlepšie peptid a úplne najlepšie proteín. Vo vzťahu k proteínkináze RAF sú preferovanými substrátmi MEK a substrát pre MEK MAPK.

Termín „aktivuje” sa týka zvyšovania bunkovej funkcie proteínkinázy. Funkciou proteínkinázy je najlepšie interakcia s prirodzeným väzbovým partnerom a úplne najlepšie katalytická aktivita.

Termín „inhibuje sa týka znižovania bunkovej funkcie proteínkinázy. Funkciou proteínkinázy je najlepšie interakcia s prirodzeným väzbovým partnerom a úplne najlepšie katalytická aktivita.

Termín „moduluj e sa týka zmeny funkcie proteínkinázy zvýšením alebo znížením pravdepodobnosti tvorby komplexu medzi proteínkinázou a prirodzeným väzbovým partnerom. Modulačná látka preferovane zvyšuje pravdepodobnosť tvorby takého komplexu medzi proteínkinázou a prirodzeným väzbovým partnerom, viac preferovane zvyšuje alebo znižuje pravdepodobnosť tvorby takého komplexu medzi proteínkinázou a prirodzeným väzbovým partnerom v závislosti od koncentrácie zlúčeniny vystavenej proteínkináze a najviac preferovane znižuje pravdepodobnosť tvorby takého komplexu medzi proteínkinázou a prirodzeným väzbovým partnerom. Modulátor preferovane aktivuje katalytickú aktivitu proteínkinázy v závislosti od koncentrácie zlúčeniny vystavenej proteínkináze alebo úplne najlepšie inhibuje katalytickú aktivitu proteínkinázy.

Termín „komplex” sa týka spojenia aspoň dvoch molekúl naviazaných na seba. Komplexy signálovej transdukcie často obsahujú aspoň dve proteínové molekuly naviazané navzájom na seba. Napríklad pri proteínovej tyrozínovej receptorovej proteínkináze sa spájajú zložky GRB2, SOS, RAF a RAS za vzniku signálneho transdukčného komplexu v závislosti od mitogénneho ligandu.

Termín „prirodzený väzbový partner” sa týka polypeptidov, ktoré sa viažu na proteínkinázu v bunkách. Prirodzení väzboví partneri hrajú úlohu v šírení signálu v procese proteínkinázovej signálnej transdukcie. Zmena v interakcii medzi proteínkinázou a prirodzeným väzbovým partnerom sa môže sama manifestovať vo zvýšení alebo znížení pravdepodobnosti tvorby interakcie alebo vo zvýšení alebo znížení pravdepodobnosti komplexu proteínkináza/prirodzený väzbový partner. Prirodzený väzbový partner proteínkinázy sa môže s vysokou afinitu viazať na intracelulárnu oblasť proteínkinázy. Vysoká afinita predstavuje rovnovážnu väzbovú konštantu rádovo 10'⁶ M alebo menej. Navyše môže prirodzený väzbový partner prechodne interagovať s intracelulárnou oblasťou proteínkinázy a chemicky ju modifikovať. Prirodzení väzboví partneri proteínkinázy sú vybraní zo skupiny, ktorá obsahuje, ale nie je obmedzená na SRC homológne 2 (SH2) alebo 3 (SH3) domény, iné fosforyltyrozín väzbové (PTB) domény, guanínové nukleotidové výmenné faktory, proteínfosfatázy a ďalšie kinázy. Metódy určenia zmien interakciou mezi proteínkinázami a ich prirodzenými väzbovými partnermi sú lahko dostupné v odbore.

Termín „serínová/treonínová proteínkináza sa týka enzýmu s aminokyselinovou sekvenciou s aspoň 10% aminokyselinovou identitou s inými enzýmami, ktoré fosforylujú proteíny na serínových alebo treonínových zvyškoch. Serínová/treonínová proteínkináza katalyzuje väzbu fosfátu na proteíny cez serínové alebo treonínové zvyšky. Serínové/treonínové proteínkinázy môžu existovať ako membránové väzbové alebo cytosólové proteíny.

Tu používaný termín „kontakt sa týka zmiešania roztoku tvoreného 5-azachinoxalínovou zlúčeninou, ktorá je predmetom predkladaného vynálezu, s tekutým médiom na inkubáciu buniek. Roztok obsahujúci zlúčeninu môže byť tvorený aj ďalšou zložkou, ako je napríklad dimetylsulfoxid (DMSO), ktorá uľahčuje vychytanie 5-azachinoxalínovej zlúčeniny alebo zlúčenín do buniek, ktoré sú predmetom predkladaných metód. Roztok obsahujúci 5-azachinoxalínovú zlúčeninu môže byť pridaný k bunkovému inkubačnému médiu použitím transportného zariadenia, ako je napríklad zariadenie s použitím pipety alebo injekčnej striekačky.

Termím „5-azachinoxalínová zlúčenina sa týka 5-azachinoxalínovej organickej zlúčeniny substituovanej chemickými substituentmi. 5-Azachinoxalínové zlúčeniny majú všeobecný vzorec:

N. .N

Termín „substituovaný majúci vzťah k predkladanému vynálezu sa týka 5-azachinoxalínovej zlúčeniny, ktorá je derivatizovaná akýmkoľvek množstvom chemických substituentov.

V preferovanej forme predkladaného vynálezu sa vynález týka metódy modulácie funkcie serínovej/treonínovej proteínkinázy, kde proteínkinázou je RAF.

Proteínkináza RAF fosforyluje cieľové proteíny na serínových alebo treonínových zvyškoch. Jedným takým cieľovým proteínom je proteínkináza (MEK), ktorá fosforyluje a následne aktivuje mitogénom aktivovanú proteínkinázu (MAPK). RAF sama o sebe je aktivovaná v membránovo viazaným guaníntrifosfát hydrolyzujúcim enzýmom RAS v odpovedi na mitogénom stimulované receptorové proteínové tyrozínkinázy, ako je napríklad receptor pre epidermálny rastový faktor (EGFR) a receptor pre rastový faktor derivovaný z krvných doštičiek (PDGFR).

Pomocou metód, ktoré sú predmetom predkladaného vynálezu, možno detegovať zlúčeniny, ktoré moduluj ú funkciu proteínkinázy RAF v bunkách. RAF fosforyluje proteínkinázu (MEK), r r ^{r r} c

- · ktorá ďalej fosforyluje mitogénom aktivovanú proteínkinázu (MAPK). Analýzy, ktoré monitorujú len fosforyláciu MEK prostredníctvom RAF nie sú citlivé, pretože stupeň fosforylácie MEK nie je významný. Aby sa prekonal tento problém senzitivity, sleduje sa v predkladanom vynáleze fosforylácia MEK aj MAPK. MAPK fosforylačný signál násobí MEK fosforylačný signál a umožňuje sledovať RAF-dependentnú fosforyláciu, napríklad pomocou enzýmovo viazanej imunosorpčnej analýzy (ELISA). Analýza, ktorá je predmetom predkladaného vynálezu sa navyše uskutočňuje vysokokapacitne, čo umožňuje rýchle monitorovanie mnohých zlúčenín v krátkom.časovom úseku.

V ďalšom aspekte opisuje vynález metódu identifikácie zlúčenín, ktoré modulujú funkciu serínových/treonínových proteínkináz. Táto metóda je tvorená krokmi kontaktu buniek exprimujúcich serínovú/treonínovú proteínkinázu so zlúčeninou a monitorovania efektu na bunkách.

Termín „monitorovanie sa týka pozorovania účinku po pridaní zlúčeniny k bunkám, ktoré sú predmetom predkladanej metódy. Účinok sa môže manifestovať zmenou bunkového fenotypu, bunkovej proliferácie, katalytickej aktivity proteínkinázy alebo zmenou interakcie medzi proteínkinázou a prirodzeným väzbovým partnerom.

Termín „efekt opisuje zmenu alebo chýbanie zmeny v bunkovom fenotype alebo bunkovej proliferácii. „Efekt môže opisovať aj zmenu alebo chýbanie zmeny katalytickej aktivity proteínkinázy. „Efekt môže opisovať aj zmenu alebo chýbanie zmeny interakcie medzi proteínkinázou a prirodzeným väzbovým partnerom.

Preferovaná forma predkladaného vynálezu sa týka metódy identifikácie zlúčenín, ktoré modulujú funkciu serínovej/treonínovej proteínkinázy, kde efektom je zmena alebo absencia zmeny v bunkovom fenotype.

Termín „bunkový fenotyp sa týka vonkajšieho vzhľadu bunky alebo tkaniva alebo funkcie bunky alebo tkaniva. Príkladom bunkového fenotypu je veľkosť bunky (zmenšenie alebo zväčšenie), bunková proliferácia (zvýšenie alebo zníženie počtu buniek), bunková diferenciácia (zmena alebo absencia zmeny tvaru bunky), prežitie bunky, apoptóza (bunková smrť) alebo utilizácia metabolických živín (napríklad vychytávanie glukózy). Zmeny alebo absencia zmien v bunkovom fenotype je lahko meratelná pomocou techník známych v odbore.

V ďalšej preferovanej forme predkladaného vynálezu sa vynález týka metódy identifikácie zlúčenín, ktoré modulujú funkciu serínovej/treonínovej proteínkinázy, kde efektom je zmena alebo absencia zmien v bunkovej proliferácii.

Termín „bunková proliferácia sa týka stupňa bunkového delenia skupiny buniek. Počet buniek rastúcich v nádobke môže kvantifikovať osoba vyznajúca sa v odbore, kedy táto osoba vizuálne odčíta počet buniek v definovanom objeme použitím bežného svetelného mikroskopu. Alternatívne sa môže stupeň bunkovej proliferácie kvantifikovať laboratórnym zariadením, ktoré opticky alebo kondukčne meria denzitu buniek v príslušnom médiu.

V ďalšej preferovanej forme predkladaného vynálezu sa vynález týka metódy identifikácie zlúčenín, ktoré modulujú funkciu serínovej/treonínovej proteínkinázy, kde efektom je f r r r zmena alebo absencia zmeny interakcie medzi serínovou/treonínovou proteínkinázou a prirodzeným väzbovým partnerom.

Termín „interakcia” v kontexte predkladaného vynálezu opisuje komplex vytvorený medzi intracelulárnou oblasťou proteínkinázy a prirodzeným väzbovým partnerom alebo zlúčeninou. Termín „interakcia” môže byť rozšírený aj na komplex vytvorený medzi zlúčeninou, ktorá je predmetom predkladaného vynálezu, a intracelulárnymi a extracelulárnymi oblasťami študovanej proteínkinázy. Aj keď cytosolová proteínkináza nemá extracelulárnu oblasť, receptorová proteínkináza obsahuje extracelulárnu aj intracelulárnu oblasť.

Tu používaný termín „intracelulárna oblasť” sa týka časti proteínkinázy, ktorá existuje vnútri bunky. Tu používaný termín „extracelulárna oblasť” sa týka časti proteínkinázy, ktorá existuje mimo bunky.

V preferovanej forme predkladaného vynálezu sa vynález týka metódy identifikácie zlúčenín, ktoré modulujú funkciu serínovej/treonínovej proteínkinázy. Táto metóda sa ďalej skladá z nasledovných krokov: a) lýzy buniek na získanie lyzátu obsahujúceho serínovú/treonínovú proteínkinázu; b) adsorpcie serínovej/treonínovej proteínkinázy na protilátku; c) inkubácie adsorbovanej serínovej/treonínovej proteínkinázy so substrátom alebo substrátmi; a d) adsorpcie substrátu alebo substrátov na pevnú matricu alebo-protilátkuKrok monitorovania efektu na bunky sa skladá z merania koncentrácie fosfátu v substráte alebo substrátoch.

Tu používaný termín „lýza” sa týka metódy disrupcie integrity bunky, čím dochádza k uvoľneniu vnútorného prostredia. Bunkovú lýzu možno dosiahnuť mnohými spôsobmi známymi osobám skúseným v odbore. Jedná sa najlepšie o sonikáciu alebo iné techniky určené na rozbíjanie buniek a úplne najlepšie o detergentné techniky.

Tu používaný termín „protilátka” sa týka bielkovinovej molekuly, ktorá sa špecificky viaže na proteínkinázu. Protilátka sa preferovane viaže na jednu triedu proteínkinázy a úplne preferovane sa viaže na proteínkinázu RAF.

Tu používaný termín „špecificky sa viaže” sa týka protilátky, ktorá sa viaže na proteínkinázu s vyššou afinitou ako iná proteínkináza alebo bunková bielkovina. Protilátka, ktorá sa špecificky viaže na proteínkinázu, viaže väčšie množstvo špecifickej proteínkinázy ako akákoľvek iná proteínkináza alebo bunková bielkovina.

Tu používaný termín „adsorpcia sa týka väzby molekuly k povrchu protilátky alebo pevnej matrice. Príkladom pevných matríc je chemicky modifikovaná celulóza, ako je napríklad fosfocelulóza a nylon. Protilátky sa môžu naviazať na pevné matrice použitím technik dobre známych osobám vyznajúcim sa v odbore. Viď napríklad Harlo a Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, 1989, Cold Spring Harbor Laboratories.

Tu používaný termín „meranie koncentrácie fosfátu” sa týka techník bežne známych osobám vyznajúcim sa v odbore. Tieto techniky zahŕňajú kvantifikáciu koncentrácie fosfátu v substráte alebo určenie relatívnych množstiev fosfátu v substráte. Tieto techniky môžu zahŕňať absorpciu substrátu na membránu a detekciu množstva fosfátu v substráte pomocou merania rádioaktivity.

V ďalšej preferovanej forme predkladaného vynálezu sa vynález týka metódy identifikácie zlúčenín, ktoré modulujú funkciu serínovej/treonínovej proteínkinázy. Táto metóda sa ďalej skladá z nasledovných krokov: a) lýzy buniek na získanie lyzátu obsahujúceho RAF; b) adsorpcie RAF na protilátku; c) inkubácie absorbovanej RAF s MEK a MAPK; a d) adsorpcie MEK a MAPK pevnú matricu alebo protilátku. Krok merania efektu na bunky sa skladá z monitorovania koncentrácie fosfátu v MEK a MAPK.

V preferovanej forme predkladaného vynálezu sa vynález týka metódy identifikácie zlúčenín, ktoré modulujú funkciu serínovej/treonínovej proteínkinázy. V tejto metóde má 5-azachinoxalínová zlúčenina štruktúru definovanú v predkladanom vynáleze vzorcami I, II alebo III· alebo v akejkoľvek podskupine zlúčenín definovaných vzorcami I, II alebo III.

Termín „zlúčenina sa týka. zlúčeniny alebo jej farmaceutický prijateľnej soli, esteru, amidu, prolieku, izoméru alebo metabolitu.

Termín „farmaceutický prijateľná sol sa týka formulácie zlúčeniny, ktorá nenarúša biologickú aktivitu a vlastnosti východiskovej zlúčeniny. Farmaceutické soli sa môžu získať reakciou zlúčeniny, ktorá je predmetom predkladaného vynálezu s anorganickými alebo organickými kyselinami, ako je napríklad kyselina chlorovodíková, bromovodíková, sírová, dusičná, fosforečná, metánsulfónová, etánsulfónová, p-toluénsulfónová, salicylová a podobne.

Termín „proliek” sa týka látky, ktorá je premenená na vlastný účinný liek za podmienok in vivo. Prolieky môžu byť v niektorých situáciách aplikované ľahšie ako vlastné účinné e r r c r r lieky. Proliek môže byť napríklad biodostupný po perorálnom podaní, zatiaľ čo vlastný účinný liek nie je biodostupný, alebo liek vo forme prolieku môže byť lepšie rozpustný a môže byť tak aplikovaný intravenóznou cestou.

V ďalšej preferovanej forme predkladaného vynálezu sa vynález týka metódy identifikácie zlúčenín, ktoré modulujú funkciu serínovej/treonínovej proteínkinázy a kde 5-azachinoxalínová zlúčenina má štruktúru definovanú v predkladanom vynáleze vzorcami I, II alebo III, kde 5-azachinoxalínová zlúčenina je vybraná zo skupiny tvorenej zlúčeninami SAQAR.

Termín „zlúčeniny SAQAR” sa týka skupiny 5-azachinoxalínových zlúčenín majúcich štruktúru definovanú v predkladanom vynáleze vzorcom I, a číslovania A^_1 až A-90 podía nasledovnej tabulky:

R'

(I)

Γ Γ

Zlúčenina č.	R2	R1	R^1
A-1	H	4-hydroxyfenyl	fenylamino
A-2	H	4-hydroxyfenyl	benzylamino
A-3	metyl	fenyl	metoxy
A-4	fenyl	fenyl	metoxy
A-5	metyl	fenyl	4-fluórbenzylamino
A-6	fenyl	fenyl	4-fluórbenzylamino
A-7	H	fenyl	fenylamino
A-8	H	4-hydroxyfenyľ	2-karboxybenzylamino
A-9	H	4-hydroxyfenyl	3-karboxybenzylamino
A-10	H	4-hydroxyfenyl	4-karboxybenzylamino
A-ll	H	4-hydroxyfenyl	2-nitrobenzylamino
A-12	H	4-hydroxyfenyl	3-nitrobenzylamino
A-13	H	4-hydroxyfenyl	4-nitrobenzylamino
A-14	H	4-hydroxyfenyl	2-metylbenzylamino
A-15	H	4-hydroxyfenyl	3-metylbenzylamino
A-16	H	4-hydroxyfenyl	4-metylbenzylamino
A-17	H	4-hydroxyfenyl	2-chlórbenzylamino
A-18	H	4-hydroxyfenyl	3-chlórbenzylamino
A-19	H	4-hydroxyfenyl	4-chlórbenzylamino
A-20	H	4-hydroxyfenyl	2-fluórbenzylamino
A-21	H	4-hydroxyfenyl	3-fluórbenzylamino
A-22	H	4-hydroxyfenyl	4-fluórbenzylamino
A-23	H	4-hydroxyfenyl	2-(trifluórmetyl)benzylamino
A-24	H	4-hydroxyfenyl	3-(trifluórmetyl)'benzylamino
A-25	H	4-hydroxyfenyl	4-(trifluórmetyl)benzylamino
A-26	H	4-hydroxyfenyl	fenetyl-l-amino
A-27	H	4-hydroxyfenyl	2-karboxyfenylamino
A-28	H	4-hydroxyfenyl	3-karboxyfenylamino
A-29	H	4-hydroxyfenyl	4-karboxyfenylamino
A-30	H	4-hydroxyfenyl	2-nitrofenylamino

Zlúčenina č.	R2	R1	R6Xx
A-31	H	4-hydroxyfenyl	3-nitrofenylamino
A-32	H	4-hydroxyfenyl	4-nitrofenylamino
A-33	H	4-hydroxyfenyl	2-metylfenylamino
A-34	H	4-hydroxyfenyl	3-metylfenylamino
A-35	H	4-hydroxyfenyl	4-metylfenylamino
A-36	H	4-hydroxyfenyl	2-chlórfenylamino
A-37	H	4-hydroxyfenyľ	3-chlórfenylamino
A-38	H	4-hydroxyfenyl	4-chlórfenylamino
A-39	H	4-hydroxyfenyl	2-fluórfenylamino
A-40	H	4-hydroxyfenyl	3-fluórfenylamino
A-41	H	4-hydroxyfenyl	4-fluórfenylamino
A-42	H	4-hydroxyfenyl	2- (trifluórmetyl)- fenylamino
A-43	H	4-hydroxyfenyl	3-(trifluórmetyl)- fenylamino
A-44	H	4-hydroxyfenyl	4-(trifluórmetyl)- fenylamino
A-45	H	4-hydroxyfenyl	pyrid-2-amino
A-4 6	H	4-hydroxyfenyl	pyrid-3-amino
A-47	H	4-hydroxyfenyl	pyrid-4-amino
A-48	H	4-hydroxyfenyl	pyrid-2-metylamino
A-49	H	fenyl	2-karboxybenzylamino
A-50	H	fenyl	3-karboxybenzylamino
A-51	H	fenyl	'4-karboxybenzylamino
A-52	H	fenyl	2-nitrobenzylamino
A-53	H	fenyl	3-nitrobenzylamino
A-54	H	fenyl	4-nitrobenzylamino
A-55	H	fenyl	2-metylbenzylamino
A-56	H	fenyl	3-metylbenzylamino
A-57	H	fenyl	4-metylbenzylamino

Zlúčenina č.	Rz	R1	RbX1
A-58	H	fenyl	2-chlórbenzylamino
A-59	H	fenyl	3-chlórbenzylamino
A-60	H	fenyl	4-chlórbenzylamino
A-61	H	fenyl	2-fluórbenzylamino
A-62	H	fenyl	3-fluórbenzylamino
A-63	H	fenyl	4-fluórbenzylamino
A-64	H	fenyl	2-(trifluórmetyl)- benzylamino
A-65	H	fenyl	3-(trifluórmetyl)- benzylamino
. A-66	H	fenyl	4-(trifluórmetyl)- benzylamino
A-67	H	fenyl	fenety1-1-amino
A-68	H	fenyl	2-karboxyfenylamino
A-69	H	fenyl	3-karboxyfenylamino
A-70	H	fenyl	4-karboxyfenylamino
A-71	H	fenyl	2-nitrofenylamino
A-72	H	fenyl	3-nitrofenylamino
A-73	H	fenyl	4-nitrofenylamino
A-74	H	fenyl	2-metylfenylamino
A-7 5	H	fenyl	3-metylfenylamino
A-76	H	fenyl	4-metylfenylamino
A-77	H	fenyl	2.-chlór f eny lamino
A-78	H	fenyl	3-chlórfenylamino
A-79	H	fenyl	4-chlórfenylamino
A-80	H	fenyl	2-fluórfenylamino
A-81	H	fenyl	3-fluórfenylamino
A-82	H	fenyl	4-fluórfenylamino
A-83	H	fenyl	2-(trifluórmetyl)fenylamino

t f ŕ f

Zlúčenina č.	R'	R1	R’X1
A-84	H	fenyl	3-(trifluórmetyl)- fenylamino
A-85	H	fenyl	4-(trifluórmetyl)- fenylamino
A-86	H	fenyl	pyrid-2-amino
A-87	H	fenyl	pyrid-3-amino
A-88	H	fenyl	pyrid-4-amino
A-89	H	fenyl	pyrid-2-metylamino
A-90	H	4-metoxyfenyl	fenylamino

II. Metódy prevencie alebo liečby abnormálnych stavov

V ďalšom aspekte sa vynález týka metódy prevencie alebo liečby abnormálnych stavov organizmov. Táto metóda je tvorená nasledovnými krokmi: a) podaním zlúčeniny, ktorá je predmetom predkladaného vynálezu a ktorá je tu špecifikovaná vzorcom I so všetkými obmedzeniami tu uvedenými; b) podnietením alebo narušením abnormálnej interakcie.

Termín „organizmus sa týka akejkoľvek identity tvorenej aspoň jednou bunkou. Organizmus môže byť jednoduchá eukaryotická bunka alebo komplexný organizmus, ako je napríklad cicavec. V preferovaných formách predkladaného vynálezu sa organizmus vzťahuje na človeka alebo cicavca.

Termín „prevencia sa týka metódy, ktorá je predmetom predkladaného vynálezu a ktorá vedie k zníženiu pravdepodobnosti alebo k eliminácii možnosti rozvoja abnormálneho stavu organizmu.

Γ Γ ’·

Termín „liečba sa týka metódy, ktorá je predmetom predkladaného vynálezu a ktorá má terapeutický účinok a aspoň čiastočne zmierňuje abnormálne stavy organizmu.

Termín „terapeutický efekt sa týka inhibície bunkového rastu spôsobujúceho alebo spolu sa podieľajúceho na abnormálnom stave (napríklad na nádorovom ochorení). Termín „terapeutický efekt sa týka aj inhibície rastových faktorov spôsobujúcich alebo spolu sa podieľajúcich na abnormálnom stave. Terapeutický efekt zmierňuje do určitej miery jeden alebo viac symptómov abnormálneho stavu. S ohľadom na terapiu nádorových ochorení sa terapeutický efekt týka. jedného alebo viacerých z nasledovných bodov: a) zmenšenia velkosti nádoru; b) inhibície (t.j. spomalenia alebo zastavenia) metastáz nádorového ochorenia; c) inhibície nádorového rastu; a d) určitého zmiernenia jedného alebo viacerých príznakov spojených s abnormálnym stavom. V predkladanom vynáleze sú identifikované zlúčeniny vykazujúce účinnosť proti leukémiám, ktoré spomaľujú alebo znižujú bunkovú proliferáciu alebo bunkový rast, aj keď neinhibujú metastázovanie.

Termín „abnormálny stav sa týka funkcie buniek alebo tkanív organizmu, ktorá sa odchyľuje od ich normálnej funkcie v organizme. Abnormálny stav sa týka bunkovej proliferácie, bunkovej diferenciácie alebo prežívania buniek.

Aberantné stavy bunkovej proliferácie zahŕňajú nádory, ako napríklad nádory fibrotického a mezangiálneho pôvodu, abnormálnu angiogenézu a vaskulogenézu,-hojenie rán, psoriázu, diabetes mellitus a zápaly.

Aberantné stavy bunkovej diferenciácie zahŕňajú, ale nie sú obmedzené na neurodegeneratívne ochorenie, pomalé hojenie rán a techniky transplantácie tkanív.

Aberantné stavy prežívania buniek zahŕňajú stavy, pri ktorých je aktivovaná alebo odstránená metabolická cesta programovanej bunkovej smrti (apoptóza). S apoptózou je spojený celý rad proteínkináz. Aberácia funkcie akejkoľvek proteínkinázy môže viesť k nesmrteľnosti bunky alebo k jej predčasnému odumretiu.

Bunková proliferácia, diferenciácia a prežívanie sú fenomény, ktoré môžu byť jednoducho merané pomocou metód známych v odbore. Tieto metódy môžu zahŕňať pozorovanie počtu buniek alebo ich vzhľadu pod mikroskopom v danom čase (napríklad dni).

Termín „podanie sa všeobecne týka aplikácie zlúčeniny do organizmu a špecifickejšie metódy inkorporácie zlúčeniny do buniek alebo tkanív organizmu. Môže sa zabrániť rozvoju abnormálneho stavu alebo môže byť liečený za podmienky existencie buniek alebo tkanív v organizme alebo mimo neho. Bunky existujúce mimo organizmu môžu byť udržiavané alebo kultivované v miskách pre bunkové kultúry. Pre bunky existujúce v organizme existuje mnoho techník podania zlúčenín zahŕňajúc (ale neobmedzujúc sa na) perorálne, parenterálne, dermálne a injekčné podanie alebo·, aplikáciu vo forme aerosólu Pre bunky existujúce mimo organizmu existuje mnoho techník podania zlúčenín vrátane (ale neobmedzujúc sa na) techniky bunkovej mikroinjikácie, transformačnej a nosičovej techniky.

V preferovanej forme predkladaného vynálezu sa vynález týka metódy prevencie alebo.liečby abnormálnych stavov

Γ r r- - r r- C f f r /

organizmu, kde 5-azachinoxalínová zlúčenina má štruktúru definovanú v predkladanom vynáleze vzorcom I, alebo akoukoľvek jeho podskupinou.

V ďalších preferovaných formách predkladaného vynálezu sa vynález týka metódy prevencie alebo liečby abnormálnych stavov organizmu, kde 5-azachinoxalínová zlúčenina charakterizovaná vzorcom I je vybraná zo skupiny tvorenej zlúčeninami SAQAR.

V ďalšej preferovanej forme predkladaného vynálezu sa vynález týka metódy prevencie alebo liečby abnormálnych stavov organizmu, kde organizmom je cicavec.

Termín „cicavec” sa týka preferovane organizmov, ako sú myši, potkany, morčatá a kozy, lepšie však opíc a úplne najlepšie človeka.

V ďalšej preferovanej forme predkladaného vynálezu sa vynález týka metódy prevencie alebo liečby abnormálnych stavov organizmu, kde abnormálnym stavom je nádorové alebo fibrotické ochorenie.

V ďalšej preferovanej forme predkladaného vynálezu sa vynález týka metódy prevencie alebo liečby abnormálnych stavov organizmu, kde nádorové ochorenie patrí do skupiny tvorenej nádormi pľúc, ovárií, prsníka, mozgu, intraaxiálnymi mozgovými nádormi, nádormi čreva, prostaty, s.arkómami, Kaposiho sarkómami, melanómami a gliómami.

V ďalšej preferovanej forme predkladaného vynálezu sa vynález týka metódy prevencie alebo liečby abnormálnych stavov organizmu, kde je metóda použitá pri abnormálnych stavoch spojených s poruchou signálovej transdukcie charakterizovanej c Γ interakciou medzi serínovou/treonínovou proteínkinázou a prirodzeným väzbovým partnerom.

Termín „signálová transdukcia sa týka šírenia signálu. Všeobecne sa jedná o prenesenie extracelulárneho signálu cez bunkovú memmbránu tak, že sa z neho stane signál intracelulárny. Tento signál môže potom stimulovať bunkovú odpoveď. Tento termín zahŕňa aj signály, ktoré sú šírené priamo v bunke. Peptidové molekuly, ktoré účinkujú v procesoch signálovej transdukcie, sú typicky receptorové alebo non-receptorové proteínkinázy, receptorové alebo non-receptorové proteínfosfatázy, nukleotidové výmenné faktory a transkripčné faktory.

Termín „aberácia v spojení s procesom signálovej transdukcie sa týka proteínkinázy, ktorá je zvýšene alebo znížene exprimovaná v organizme, zmutovaná tak, že jej katalytická aktivita je nižšia alebo vyššia ako aktivita prirodzenej proteínkinázy, alebo zmutovaná tak, že nemôže dôjsť k interakcii s prirodzeným väzbovým partnerom, alebo nemôže byť modifikovaná inou proteínkinázou alebo proteínfosfatázou.

Termín „podpora alebo narušenie abnormálnej interakcie sa týka metódy tvorenej podaním zlúčeniny, ktorá je predmetom predkladaného vynálezu, bunkám alebo do tkanív organizmu. Zlúčenina môže podporovať interakciu medzi proteínkinázou a prirodzenými väzbovými partnermi pomocou interakcií s mnohými atómami na rozhraní komplexu. Zlúčenina môže alternatívne inhibovať interakciu medzi proteínkinázou a prirodzenými väzbovými partnermi vytvorením interakcií medzi atómami na rozhraní komplexu. V ďalšej preferovanej forme predkladaného vynálezu sa vynález týka metódy prevencie alebo liečby abnormálnych stavov organizmu, kde serínovou/treonínovou kinázou je RAF.

III. Zlúčeniny a farmaceutické preparáty, ktoré sú predmetom predkladaného vynálezu

V ďalšom aspekte sa vynález týka 5-azachinoxalínových zlúčenín, ktoré majú štruktúru definovanú vzorcom I:

kde

a) R¹, R² a R⁶ sú nezávisle vybrané zo skupiny tvorenej (i) vodíkom;

(ii) nasýteným' alebo nenasýteným alkylom;

(iii) amínom charakterizovaným vzorcom NX²X³, kde X² a X³ sú nezávisle vybrané zo skupiny tvorenej vodíkom, nasýteným alebo nenasýteným alkylom a päť- alebo šesťčlenným arylovým alebo heteroarylovým kruhom;

(iv) halogénom alebo trihalogénmetylovou skupinou;

(v) ketónom charakterizovaným vzorcom -CO-X⁴, kde X⁴ je vybraný zo skupiny tvorenej vodíkom, alkylom a päť- alebo šesťčlenným arylovým alebo heteroarylovým kruhom;

(vi) karboxylovou kyselinou charakterizovanou vzorcom -(X⁵)_n-COOH, alebo esterom charakterizovaným vzorcom

- (X⁶) „-COO-X⁷, kde X⁵, X⁶ a X⁷ sú nezávisle vybrané zo skupiny tvorenej alkylom a päť- alebo šesťčlenným arylovým alebo heteroarylovým kruhom, a kde n je 0 alebo 1;

(vii) alkoholom charakterizovaným vzorcom -(X⁸)n-OH, alebo alkoxyskupinou charakterizovanou vzorcom -(X⁸)n-O-X⁹, kde X⁸ a X⁹ sú nezávisle vybrané zo skupiny tvorenej vodíkom, nasýteným alebo nenasýteným alkylom a päť- alebo šesťčlenným arylovým alebo heteroarylovým kruhom, a kde kruh je volitelne substituovaný jedným alebo viacerými substituentmi nezávisle vybranými zo skupiny tvorenej alkylom, halogénom, trihalogénmetylom, karboxylátom, nitroskupinou a esterovou skupinou a kde n je 0 alebo 1;

(viii) amidom charakterizovaným vzorcom -NHCOX¹⁰, kde X¹⁰ je vybraný zo skupiny tvorenej alkylom, hydroxylom a päť- alebo šesťčlenným arylovým alebo heteroarylovým kruhom, a kde kruh je volitelne substituovaný jedným alebo dvoma substituentmi nezávisle vybranými zo skupiny tvorenej alkylom, halogénom, trihalogénmetylom, karboxylátom, nitroskupinou a esterovou skupinou;

(ix) -SC^NX^X¹², kde X¹¹ a X¹² sú nezávisle vybrané zo skupiny tvorenej vodíkom, alkylom a päť- alebo šesťčlenným arylovým alebo heteroarylovým kruhom;

(x) päť- alebo šesťčlenným arylovým alebo heteroarylovým kruhom volitelne substituovaným jedným, dvoma alebo tromi substituentmi nezávisle vybranými zo skupiny tvorenej alkylom, halogénom, trihalogénmetylom, karboxylátom, nitroskupinou a esterovou skupinou;

(xi) aldehydom charakterizovaným vzorcom -CO-H; a (xii) sulfónom charakterizovaným vzorcom -SO₂X¹³, kde X¹³ je vybraný zo skupiny tvorenej nasýteným alebo nenasýteným alkylom a päť- alebo šesťčlenným arylovým alebo heteroarylovým kruhom;

b) X¹ je nezávisle vybraný zo skupiny tvorenej dusíkom, sírou a kyslíkom.

Termín „nasýtený alkyl sa týka alkylovej skupiny, ktorá neobsahuje alkénovú ani alkínovú skupinu. Alkylová skupina môže byť rozvetvená alebo nerozvetvená.

Termín „nenasýtený alkyl sa týka alkylovej skupiny, ktorá obsahuje aspoň jednu alkénovú alebo alkínovú skupinu. Alkylová skupina môže byť. rozvetvená alebo nerozvetvená.

Termín „amín sa týka chemickej skupiny charakterizovanej vzorcom -NR¹R², kde R¹ a R² sú nezávisle vybrané zo skupiny tvorenej vodíkom, nasýteným alebo nenasýteným alkylom a päťalebo šesťčlenným arylovým alebo heteroarylovým kruhom, kde kruh je voliteľne substituovaný jedným alebo viacerými substituentmi nezávisle vybranými zo skupiny tvorenej alkylom, halogénom, trihalogénmetylom, karboxylátom, nitroskupinou a esterovou skupinou.

Termín „aryl sa týka aromatickej skupiny, ktorá má aspoň jeden kruh so systémom π elektrónov a zahŕňa karbocyklické (napríklad fenyl) aj heterocyklické arylové skupiny (napríklad pyridín). Termín karbocyklický sa týka zlúčeniny, ktorá obsahuje jednu alebo viac kovalentne uzavretých kruhových štruktúr a kde atómami tvoriacimi kostru kruhu sú vždy atómy uhlíka. Termín týmto rozlišuje karbocyklické kruhy od heterocyklických, v ktorých kostra kruhu obsahuje aspoň jeden atóm, ktorý nie atómom uhlíka. Termín „heteroaryl” sa týka arylovej skupiny, ktorá obsahuje aspoň jeden heterocyklický kruh.

Termín „halogén” sa týka atómu vybraného zo skupiny tvorenej fluórom, chlórom, brómom a jódom.

Termín „ketón” sa týka chemickej skupiny charakterizovanej vzorcom -(R)_n-CO-R' , kde R a R' sú nezávisle vybrané zo skupiny tvorenej nasýteným alebo nenasýteným alkylom a päť- alebo šesťčlenným arylovým alebo heteroarylovým kruhom, a kde n je 0 alebo 1.

Termín „karboxylová kyselina” sa týka chemickej skupiny charakterizovanej vzorcom -(R)_n-COOH, kde R je vybraný zo skupiny tvorenej nasýteným alebo nenasýteným alkylom a päť- alebo šesťčlenným arylovým alebo heteroarylovým kruhom, a kde n je 0 alebo 1.

Termín „ester” sa týka chemickej skupiny charakterizovanej vzorcom -(R)_n-COOR', kde R a R' sú nezávisle vybrané zo skupiny tvorenej nasýteným alebo nenasýteným alkylom a päť- alebo šesťčlenným arylovým alebo heteroarylovým kruhom, a kde n je 0 alebo 1.

Termín „alkohol” sa týka chemického substituenta charakterizovaného vzorcom -ROH, kde R je vybraný zo skupiny tvorenej vodíkom, nasýteným alebo nenasýteným alkylom a päť- alebo šesťčlenným arylovým alebo heteroarylovým kruhom, kde kruh je volitelne substituovaný jedným alebo viacerými substituentmi nezávisle vybranými zo skupiny tvorenej alkylom, halogénom, trihalogénmetylom, karboxylátom, nitroskupinou a esterovou skupinou.

r r r r r r r r 27

Termín „amid sa týka chemického substituenta charakterizovaného vzorcom -NHCOR, kde R je vybraný zo skupiny tvorenej vodíkom, alkylom, hydroxylom a päť- alebo šesťčlenným arylovým alebo heteroarylovým kruhom, kde kruh je voliteľne substituovaný jedným alebo viacerými substituentmi nezávisle vybranými zo skupiny tvorenej alkylom, halogénom, trihalogénmetylom, karboxylátom, nitroskupinou a esterovou skupinou.

Termín „alkoxyskupina sa týka chemického substituenta charakterizovaného vzorcom -OR, kde R je vodík alebo nasýtený alebo nenasýtený alkyl.

Termín „aldehyd sa týka chemickej skupiny charakterizovanej vzorcom -(R)_n-CHO, kde R je vybraný zo skupiny tvorenej nasýteným alebo nenasýteným alkylom a päť- alebo šesťčlenným arylovým alebo heteroarylovým kruhom, a kde n je 0 alebo 1.

Termín „sulfón sa týka chemickej skupiny charakterizovanej vzorcom -SO₂-R, kde R je vybraný zo skupiny tvorenej nasýteným alebo nenasýteným alkylom a päť- alebo šesťčlenným arylovým alebo heteroarylovým kruhom.

V ďalšej preferovanej forme predkladaného vynálezu sa vynález týka 5-azachinoxalínových zlúčenín, ktoré majú štruktúru charakterizovanú v predkladanom vynáleze vzorcom I, kde R¹ a R² sú nezávisle vybrané zo skupiny tvorenej vodíkom, nasýteným alebo nenasýteným alkylom a päť- alebo šesťčlenným arylovým alebo heteroarylovým kruhom, kde kruh je voliteľne substituovaný jedným, dvoma alebo troma substituentmi nezávisle vybranými zo skupiny tvorenej alkylom, halogénom, trihalogénmetylom, karboxylátom, nitroskupinou a esterovou skupinou.

V ďalšej preferovanej forme predkladaného vynálezu sa vynález týka 5-azachinoxalínových zlúčenín, ktoré majú štruktúru charakterizovanú v predkladanom vynáleze vzorcom I, kde R¹ je fenyl volitelne substituovaný jedným, dvoma alebo tromi substituentmi nezávisle vybranými zo skupiny tvorenej alkylom, halogénom, hydroxyskupinou alebo alkoxyskupinou.

V ďalšej preferovanej forme predkladaného vynálezu sa vynález týka 5-azachinoxalínových zlúčenín, ktoré majú štruktúru charakterizovanú v predkladanom vynáleze vzorcom I, kde R¹ je fenyl.

V ďalšej preferovanej forme predkladaného vynálezu sa vynález týka 5-azachinoxalínových zlúčenín, ktoré majú štruktúru charakterizovanú v predkladanom vynáleze vzorcom I, kde R¹ je 4-hydroxyfenyl.

V ďalšej preferovanej forme predkladaného vynálezu sa vynález týka 5-azachinoxalínových zlúčenín, ktoré majú štruktúru charakterizovanú v predkladanom vynáleze vzorcom I, kde R² je nezávisle vybraný zo skupiny tvorenej vodíkom, nasýteným alebo nenasýteným alkylom a fenylom volitelne substituovaným jedným, dvoma alebo tromi substituentmi nezávisle vybranými zo skupiny tvorenej alkylom, halogénom, hydroxyskupinou a alkoxyskupinou.

V ďalšej preferovanej forme predkladaného vynálezu sa vynález týka 5-azachinoxalínových zlúčenín, ktoré majú štruktúru charakterizovanú v predkladanom vynáleze vzorcom I, kde R² je vodík.

V ďalšej preferovanej forme predkladaného vynálezu sa vynález týka 5-azachinoxalínových zlúčenín, ktoré majú r r štruktúru charakterizovanú v predkladanom vynáleze vzorcom I, kde R² je metyl.

V ďalšej preferovanej forme predkladaného vynálezu sa vynález týka 5-azachinoxalínových zlúčenín, ktoré majú štruktúru charakterizovanú v predkladanom vynáleze vzorcom I, kde R² je fenyl.

V ďalšej preferovanej forme predkladaného vynálezu sa vynález týka 5-azachinoxalínových zlúčenín, ktoré majú štruktúru charakterizovanú v predkladanom vynáleze vzorcom I, kde X¹ je dusík alebo kyslík.

V ďalšej preferovanej forme predkladaného vynálezu sa vynález týka 5-azachinoxalínových_zlúčenín, ktoré majú štruktúru charakterizovanú v predkladanom vynáleze vzorcom I, kde X¹ je kyslík.

V ďalšej preferovanej forme predkladaného vynálezu sa vynález týka 5-azachinoxalínových zlúčenín, ktoré majú štruktúru charakterizovanú v predkladanom vynáleze vzorcom I, kde X¹ je dusík.

V ďalšej preferovanej forme predkladaného vynálezu sa vynález týka 5-azachinoxalínových zlúčenín, ktoré majú štruktúru charakterizovanú v predkladanom vynáleze vzorcom I, kde R⁶ je nezávisle vybraný zo skupiny tvorenej vodíkom, nasýteným alebo nenasýteným alkylom volitelne substituovaným a päť- alebo šesťčlenným arylovým alebo heteroarylovým kruhom, kde kruh je voliteľne substituovaný jedným, dvoma alebo troma substituentmi nezávisle vybranými zo skupiny tvorenej alkylom, halogénom, trihalogénmetylom, hydroxyskupinou, alkoxyskupinou, karboxylátom, nitroskupinou a esterovou skupinou, a päť- alebo šesťčlenným arylovým alebo heteroarylovým kruhom volitelne substituovaným jedným, dvoma alebo troma substituentmi nezávisle vybranými zo skupiny tvorenej alkylom, halogénom, trihalogénmetylom, hydroxyskupinou, alkoxyskupinou, karboxylátom, nitroskupinou a esterovou skupinou.

V ďalšej preferovanej forme predkladaného vynálezu sa vynález týka 5-azachinoxalínových zlúčenín, ktoré majú štruktúru charakterizovanú v predkladanom vynáleze vzorcom I, kde R⁶ a R¹ tvoria zlúčeninu, ktorá je vybraná zo skupiny tvorenej substituentmi SAQAR.

Termín „substituenty SAQAR sa týka skupiny substituentov obsahujúcich metoxy, benzylamino, 2-karboxybenzylamino,

3-karboxybenzylamino, 4-karboxybenzylamino, 2-nitrobenzylamino

3-nitrobenzylamino, 4-nitrobenzylamino, 2-metylbenzylamino,

3-metylbenzylamino, 4-metylbenzylamino, 2-chlórbenzylamino, 3-chlórbenzylamino, 4-chlórbenzylamino, 2-fluórbenzylamino,

3-fluórbenzylamino, 4-fluórbenzylamino, 2-(trifluórmetyl)benzylamino, 3-(trifluórmetyl)benzylamino, 4-(trifluórmetyl)benzylamino, fenetyl-l-amino, fenylamino, 2-karboxyfenylamino, 3-karboxyfenylamino, 4-karboxyfenylamino, 2-nitrofenylamino, 3-nitrofenylamino, 4-nitrofenylamino, 2-metylfenylamino, 3-metylfenylamino, 4-metylfenylamino, 2-chlórfenylamino, 3-chlórfenylamino, 4-chlórfenylamino, 2-fluórfenylamino,

3-fluórfenylamino, 4-fluórfenylamino, 2-(trifluórmetyl)fenylamino, 3-(trif luórmetyl) fenylamino·, 4-(trif luórmetyl) f enylamino, fenylamino, pyrid-2-amino, pyrid-3-amino, pyrid-4-amino a pyrid-2-metylamino.

Termín „benzylamino sa týka skupiny charakterizovanej nasledovným vzorcom:

r r r r r r

kde arylový kruh môže byť substituovaný v polohe 2, 3 alebo 4.

Termín „fenylamino sa týka skupiny charakterizovanej nasledovným vzorcom:

kde arylový kruh môže byť substituovaný v polohe 2, 3 alebo 4.

Termín „fenetyl-l-amino sa týka skupiny charakterizovanej nasledovným vzorcom:

Termín „pyrid-2-amino sa týka pyridínového kruhu, ktorý je substituovaný skupinu NH v polohe 2. Podobne termíny „pyrid-3-amino a „pyrid-4-amino sa týkajú pyridínového kruhu, ktorý je substituovaný skupinou NH v polohe 3 a 4.

V ďalšej preferovanej forme predkladaného vynálezu sa vynález týka 5-azachinoxalínových zlúčenín, ktoré majú štruktúru charakterizovanú v predkladanom vynáleze vzorcom I, kde 5-azachinoxalínová zlúčenina je vybraná zo skupiny tvorenej substituentmi SAQAR.

IV. Syntetické metódy, ktoré sú predmetom predkladaného vynálezu

V ďalšom aspekte sa predkladaný vynález týka farmaceutického preparátu tvoreného zlúčeninou, ktorá je charakterizovaná vzorcom I, alebo akoukoľvek jej podskupinou, jej soľou a fyziologicky prijateľným nosičom alebo diluentom.

V ďalšom aspekte sa predkladaný vynález týka farmaceutického preparátu, kde 5-azachinoxalínová zlúčenina je vybraná zo skupiny tvorenej zlúčeninami SAQAR.

Termín „farmaceutický preparát sa týka smesi 5-azachinoxalínovej zlúčeniny, kt^orá je predmetom predkladaného vynálezu, s inými chemickými komponentmi, ako sú napríklad diluenty alebo nosiče. Farmaceutický preparát uľahčuje podanie zlúčeniny do organizmu. Existuje mnoho spôsobov podania zlúčeniny, vrátane podania perorálneho, injekčného, vo forme aerosólu, podania parenterálneho a topického. Farmaceutické preparáty sa môžu získať reakciou zlúčeniny s anorganickými kyselinami, ako je napríklad kyselina chlorovodíková, kyselina bromovodíková, kyselina sírová, kyselina dusičná, kyselina fosforečná, kyselina metánsulfónová, kyselina etánsulfónová, kyselina p-toluénsulfónová, kyselina salicylová a podobne.

Termín „fyziologicky prijateľný definuje nosič alebo diluent, ktorý nenarúša biologickú aktivitu a vlastnosti zlúčeniny.

Termín „nosič definuje chemickú zlúčeninu, ktorá uľahčuje inkorporáciu zlúčeniny do buniek alebo tkanív. Bežne používaným nosičom je napríklad dimetylsulfoxid (DMSO), pretože

3S uľahčuje vychytávanie mnohých organických zlúčenín do buniek alebo tkanív organizmu.

Termín „diluent definuje chemické zlúčeniny rozriedené vo vode, ktoré rozpúšťajú zlúčeninu, ktorá je predmetom záujmu, a súčasne stabilizujú biologicky aktívnu formu zlúčeniny. V odbore sa používajú soli rozpustené v tlmivých roztokoch. Jedným z bežne používaných tlmivých roztokov je fosfátový tlmivý roztok, pretože napodobňuje iónové podmienky v ludskej krvi. Pretože tlmivé roztoky kontrolujú pH roztoku pri nízkych koncentráciách, dochádza len zriedka k zmene biologickej aktivity zlúčeniny vplyvom tlmivého roztoku.

V ďalšom aspekte sa vynález týka metódy syntézy zlúčeniny, ktorá je predmetom predkladaného vynálezu. Táto metóda je tvorená krokmi: a) reakcia 2-amino-6-chlór-3-nitropyridínu s druhým reaktantom v solvente a v prítomnosti zásady, kde druhý reaktant je vybraný zo skupiny tvorenej alkoholom a amínom, čo vdie k vzniku prvého medziproduktu; b) reakcia prvého medziproduktu s 1,2-diónom v prítomnosti katalyzátora a redukujúcej látky, a d) purifikácia konečného produktu.

Termín „1,2-dión sa týka chemickej skupiny charakterizovanej vzorcom R^x-C (0) C ( (0)-R², kde R¹ a R² sú nezávisle vybrané zo skupiny tvorenej vodíkom, nasýteným alebo nenasýteným alkylom voliteľne substituovaným päť- alebo šesťčlenným arylovým alebo heteroarylovým kruhom, kde kruh je volitelne substituovaný jedným, dvoma alebo tromi substituentmi nezávisle vybranými zo skupiny tvorenej alkylom, halogénom, trihalogénmetylom, hydroxyskupinou, alkoxyskupinou, karboxylátom, nitroskupinou a esterovou skupinou a päť- alebo šesťčlenným arylovým albo heteroarylovvým kruhom volitelne substituovaným jedným, dvoma alebo tromi substituentmi nezávisle vybranými zo skupiny

3½ tvorenej alkylom, halogénom, trihalogénmetylom, hydroxyskupinou, alkoxyskupinou, karboxylátom, nitroskupinou a esterovou skupinou.

V preferovanej forme predkladaného vynálezu sa vynález týka metódy syntézy zlúčeniny, ktorá je predmetom predkladaného vynálezu, kde solventom je n-butanol.

V ďalšej preferovanej forme predkladaného vynálezu sa vynález týka metódy syntézy zlúčeniny, ktorá je predmetom predkladaného vynálezu, kde zásadou je uhličitan draselný.

V ďalšej preferovanej forme predkladaného vynálezu sa vynález týka metódy syntézy zlúčeniny, ktorá je predmetom predkladaného vynálezu, kde druhý reaktant je vybraný zo skupiny tvorenej reaktantmi SAQAR.

Termín „reaktanty SAQAR sa týka skupiny reaktantov obsahujúcej metanol, benzylamín, 2-karboxybenzylamín, 3-karboxybenzylamín, 4-karboxybenzylamín, 2-nitrobenzylamín, 3-nitrobenzylamín, 4-nitrobenzylamín, 2-metylbenzylamín,

3-metylbenzylamín, 4-metylbenzylamín, 2-chlórbenzylamín, 3-chlórbenzylamín, 4-chlórbenzylamín, 2-fluórbenzylamín,

3-fluórbenzylamín, 4-fluórbenzylamín, 2-(trifluórmetyl)benzylamín, 3-(trifluórmetyl)benzylamín, 4-(trifluórmetyl)benzylamín, fenetyl-l-amín, anilín, 2-karboxyanilín, 3-karboxyanilín, 4-karboxyanilín, 2-nitroanilín, 3-nitroanilín, 4-nitroanilín, 2-toluidín, 3-toluidín, 4-toluidín, 2-chlóranilín,

3- chlóranilín, 4-chlóranilín, 2-fluóranilín, 3-fluóranilín,

4- fluóranilín, 2-(trifluórmetyl)anilín, 3-(trifluórmetyl)anilín, 4-(trifluórmetyl)anilín, anilín, 2-aminopyridín, 3-aminopyridín, 4-aminopyridín a 2-metylaminopyridín.

f r r p ŕ r r r r r

V preferovanej forme predkladaného vynálezu sa vynále týka metódy syntézy zlúčeniny, ktorá je predmetom predkladaného vynálezu, kde tretím reaktantom je skupina tvorená 4-hydroxyfenylglyoxálom, 1-fenyl-1,2-propándiónom a benzilom.

Tu používaný termín „katalyzátor” sa týka chemickej molekuly, ktorá po pridaní ku skupine reaktantov reaguje za vzniku produktov. Osobám vyznajúcim sa v odbore je známych mnoho typov katalyzátorov.

V ďalšej preferovanej forme predkladaného vynálezu sa vynález týka metódy syntézy zlúčeniny, ktorá je predmetom predkladaného vynálezu, kde redukujúcou látkou je vodík.

V ďalšej preferovanej forme predkladaného vynálezu sa vynález týka metódy syntézy zlúčeniny, ktorá je predmetom predkladaného vynálezu, kde katalyzátorom je Raneyho nikel.

Opis predkladaného vynálezu uvedený vyššie nie je limitujúci a z nasledovného opisu preferovaných foriem predkladaného vynálezu a z patentových nárokov budú zrejmé ďalšie rysy a výhody.

Opis preferovaných foriem predkladaného vynálezu

Časť predkladaného vynálezu je zameraná na metódy modulácie funkcie serínových/treonínových proteínkináz pomocou

5-azachinoxalínových zlúčenín. Navyše sa časť vynálezu týka metód identifikácie zlúčenín, ktoré modulujú funkciu serínových/treonínových proteínkináz. Metódy využívajú bunky, ktoré exprimujú serínové/treonínové proteínkinázy, ako je napríklad RAF.

Γ f r RAF je non-receptorová proteínkináza, ktorá sa po naviazaní na RAS, enzým hydrolyzujúci guaníntrifosfát, premiestňuje na bunkovú membránu. RAS sa aktivuje po naviazaní aktivovanej receptorovej proteínovej tyrozínkinázy, ako je napríklad EGFR alebo PDGFR, na adaptorovú bielkovinu, GRB2 a guanínnukleotidový výmenný faktor SOS. SOS odstraňuje guaníndifosfát z RAS, nahrádza ho guaníntrifosfátom, a tým aktivuje RAS. RAS potom viaže RAF a následne ho aktivuje. RAF môže potom fosforylovať ďalšie proteíny na serínových a treonínových zvyškoch, ako je napríklad kináza MEK, ktorá fosforyluje a následne aktivuje mitogénom aktivovanú proteínkinázu (MAPK). RAF teda slúži ako intermediálny kontrolný faktor v mitogénmi aktivovanej signálovej transdukcii.

Vzhľadom na dôležitú regulačnú úlohu RAF v bunkách môžu zmeny aminokyselinovej sekvencie RAF narušiť jej funkciu a následne modifikovať správanie bunky. Úloha RAF v bunkovej proliferácii je zdôraznená pozorovaním asociácie výskytu nádorových ochorení s mutáciami v aminokyselinovej sekvencii RAF. Pretože mutácie RAF, ktoré mali za následok vznik nádorového ochorenia, viedli k tvorbe molekúl RAF, ktoré vykazovali neregulovanú katalytickú aktivitu, môžu inhibítory RAF zmierniť alebo dokonca zabrániť bunkovej proliferácii, ktorá vedie k nádorovému bujneniu v týchto bunkách.

Pomocou metód, ktoré sú predmetom predkladaného vynálezu, sa môžu detegovať zlúčeniny, ktoré modulujú funkciu proteínkinázy RAF v bunkách. RAF fosforyluje proteínkinázu MEK, ktorá následne fosforyluje mitogénom aktivovanú proteínkinázu MAPK. Metódy, ktoré monitorujú len fosforyláciu MEK pomocou RAF, nie sú citlivé, pretože stupeň fosforylácie MEK nie je významný. Aby sa prekonal tento problém, je monitorovaná v analýzach, ktoré sú predmetom predkladaného vynálezu, fosforylácia MEK aj r ŕ

MAPK. Fosforylačný signál MAPK amplifikuje fosforylačný signál

MEK a umožňuje sledovanie RAF-dependentnej fosforylácie pomocou enzýmovo viazanej imunosorpčnej analýzy (ELISA). Analýza, ktorá je predmetom predkladaného vynálezu, je navyše uskutočňovaná vysokokapacitne, čo umožňuje rýchle monitorovanie i

mnohých zlúčenín v krátkom časovom úseku.

Pomocou metód, ktoré sú predmetom predkladaného vynálezu, boli identifikované zlúčeniny, ktoré inhibujú funkciu proteínkinázy RAF. Tieto zlúčeniny patria medzi 5-azachinoxalínové deriváty. Aj keď sa testovala schopnosť 5-azachinoxalínových derivátov inhibovať enzýmy syntetizujúce nukleotidy v baktériách, mnoho z týchto zlúčenín sa dôkladne nepreskúmalo s ohľadom na inhibíciu proteínkináz.

Pretože RAF vykazuje významnú aminokyselinovú homológiu s inými serínovými/treonínovými proteínkinázami, môžu pravdepodobne 5-azachinoxalínové zlúčeniny, ktoré sú predmetom predkladaného vynálezu, inhibovať aj iné serínové/treonínové proteínkinázy ako len RAF, vrátane receptorových a non-receptorových serínových/treonínových proteínkináz.

Metódy, ktoré sú predmetom predkladaného vynálezu, sa týkajú aj ďalších zlúčenín, ktoré modulujú funkciu RAF v bunkách, pretože opísané metódy umožňujú testovať veľké množstvo molekúl v krátkom časovom úseku. Z tohto dôvodu sa môžu pomocou metód, ktoré sú predmetom predkladaného vynálezu, identifikovať molekuly neopísané v predkladanom vynáleze, ktoré modulujú funkciu STK.

I. Biologická aktivita 5-azachinoxalínových zlúčenín

5-Azachinoxalínové zlúčeniny, ktoré sú predmetom predkladaného vynálezu, sa testovali na svoju schopnosť inhibovať funkcie proteínkinázy RAF. Biologické analýzy a výsledky týchto inhibičných štúdií sa tu uvádzajú. Metódy používané na meranie modulácie funkcie proteínkináz 5-azachinoxalínovými zlúčeninami sú s ohľadom na širokú použiteľnosť podobné tým, ktoré sú opísané v prihláške U.S. Application seriál No. 08/702232 Táng et al. nazvanej „Indolinone Combinatorial Libraries and Related Products and Methods for the Treatment of Disease (Lyon a Lyon spis č. 221/187), zaregistrovanej 23. augusta 1996. Prihláška 08/702232 je v predkladanom vynáleze začlenená ako referencia v celom svojom rozsahu vrátane vyobrazení.

II. Cieľové ochorenia určené na liečbu 1,4,5-triazanaftalénovými zlúčeninami

Tu opísané metódy, zlúčeniny a farmaceutické preparáty sú navrhnuté na inhibíciu ochorení na podklade bunkovej proliferácie pomocou modulácie funkcie proteínkinázy RAF. Proliferačné ochorenia majú za následok nežiaducu bunkovú proliferáciu jednej alebo viacerých skupín buniek v multicelulárnom organizme, čo vedie k jeho poškodeniu. Tu opísané metódy, zlúčeniny a farmaceutické preparáty môžu byť užitočné aj v liečbe a prevencii iných ochorení organizmu, ako sú napríklad choroby so vzťahom k predčasnému odumieraniu buniek (t.j. neurologické ochorenia) alebo zápaly. Tieto ochorenia môžu byť výsledkom nevhodnej funkcie molekúl RAF alebo nevhodnej funkcie proteínkinázových molekúl príbuzných s RAF.

Alterácia proteínkinázy RAF alebo proteínkinázových molekúl príbuzných s RAF môže viesť k zvýšeniu alebo zníženiu bunkovej proliferácie, ako je zrejmé pri určitých ochoreniach.

e t r s- e r r r

Stavy s narušením bunkovej proliferácie zahŕňajú nádory, fibrotické ochorenia, mezangiálne choroby, abnormálnu angiogenézu a vaskulogenézu, hojenie rán, psoriázu, restenózy a zápal.

Fibrotické ochorenia majú vzťah k abnormálnej tvorbe bunkovej extracelulárnej matrice. Príkladom fibrotického ochorenia je pečeňová cirhóza. Pečeňová cirhóza je charakterizovaná zvýšenou koncentráciou zložiek extracelulárnej matrice vedúcou k zajazveniu tkaniva pečene. Pečeňová cirhóza môže spôsobiť ochorenie, ako je napríklad cirhóza pečene.

Poruchy proliferácie mezangiálnych buniek sa vyskytujú v dôsledku abnormálnej proliferácie mezangiálnych buniek, Tieto poruchy zahŕňajú rozličné ľudské choroby obličiek, ako sú napríklad glomerulonefŕitída, diabetická nefropatia, malígna nefroskleróza, trombotické mikroangiopatické syndrómy, rejekcia transplantátu a glomerulopatia.

Preferovanými typmi nádoru, ktoré môžu byť liečené pomocou metód a zlúčenín, ktoré sú predmetom predkladaného vynálezu, sú pľúcne nádory, nádory vaječníkov, nádory prsníka, nádory mozgu, intraaxiálne mozgové nádory, nádory hrubého čreva, nádory prostaty, Kaposiho sarkómy, melanómy a gliómy. Dôkaz, že metódy a zlúčeniny, ktoré sú predmetom predkladaného vynálezu, môžu účinne zastaviť a zvrátiť proliferáciu nádorových buniek, je v predkladanom vynáleze zahrnutý ako referencia.

Angiogénne a vaskulogénne ochorenia vznikajú v dôsledku nadmernej proliferácie krvných ciev. Proliferácia krvných ciev je nevyhnutná pre celý rad normálnych fyziologických procesov, ako je napríklad embryonálny vývoj, utváranie corpus luteum, hojenie rán a regenerácia orgánov. Proliferácia krvných ciev je však nevyhnutná aj pre vývoj nádorov. Ďalšie príklady proliferačných ochorení zahŕňajú artritídu, kde novotvorené krvné cievy invadujú do kĺba a ničia chrupavku. Proliferačné ochorenia krvných ciev navyše zahŕňajú choroby oka, ako je napríklad diabetická retinopatia, kde novotvorené kapiláry v sietnici invadujú do sklovca, krvácajú a spôsobujú slepotu. Na druhej strane ochorenie charakterizované zúžením, kontrakciou alebo uzavretím krvných ciev, ako sú napríklad restenózy, majú pôvod aj v chybnej regulácii proteínkináz.

Vaskulogenéza a angiogenéza sú okrem toho spojené s rastom malígnych solídnych nádorov a metastáz. Rýchlo rastúce nádory vyžadujú zásobovanie krvou bohatou na živiny a kyslík, aby mohli pokračovať v raste. V dôsledku toho dochádza spolu s rastom nádoru k vzniku abnormálne velkého množstva krvných kapilár, ktoré podporujú rast nádoru. Okrem zásobovania nádoru živinami, zaisťujú novotvorené krvné cievy v nádorovom tkanive bránu pre nádorové bunky na vstup do cirkulácie a na metastázovanie do vzdialených miest v organizme. Folkman, 1990, J. Natl. Cancer Inst. 82:4-6.

Nevhodná aktivita RAF môže stimulovať bunkovú proliferáciu a z nej vyplývajúce ochorenia. Dokázalo sa, že molekuly špecificky navrhnuté na moduláciu funkcie proteínkinázy RAF inhibujú bunkovú proliferáciu. Konkétne sa jedná o tzv. „antisense molekuly nukleových kyselín, ktoré viažu mRNA kódujúcu proteínkinázu RAF a blokujú tak transláciu. Pri týchto molekulách bolo dokázané, že účinne zabraňujú transformácii buniek A549 za podmienok in vitro. Monia et al., 1996, Náture Medicíne 2:688; táto referencia je týmto začlenená v celom svojom rozsahu do predkladaného vynálezu vrátane všetkých obrázkov a tabuliek. Bunky A549 sú ľudské malígne bunky.

r r

Tieto „antisense štúdie zamerané proti RAF predkladajú dôkaz, že 5-azachinoxalínové molekuly, ktoré sú predmetom predkladaného vynálezu a ktoré modulujú funkciu proteínkinázy RAF, môžu zastaviť a pravdepodobne aj zvrátiť proliferáciu malígnych buniek v organizme. Tieto 5-azachinoxalínové zlúčeniny sa môžu testovať pomocou metód in vitro, ktoré sú v predkladanom vynáleze uvedené ako príklad. 5-Azachinoxalínové zlúčeniny sa môžu okrem toho testovať na efekt na nádorové bunky za podmienok in vivo pomocou xenotransplantačných metód, kttoré sú v predkladanom vynáleze tiež uvedené ako príklad.

Existujú aspoň dve cesty nechcenej stimulácie bunkovej proliferácie konkrétneho typu buniek v dôsledku nevhodnej aktivity RAF: 1) priama stimulácia rastu konkrétnej bunky alebo 2) zvýšenie vaskularizácie konkrétnej oblasti, ako je napríklad nádorové tkanivo, čím dochádza k uľahčeniu rastu tkaniva.

Použitie predkladaného vynálezu je uľahčené po prvé identifikáciou, či je ochorenie na podklade bunkovej proliferácie spôsobené aktivitou RAF. Ak je také ochorenie identifikované, môžu sa pacienti postihnutí týmto ochorením identifikovať pomocou analýzy ich príznakov pomocou postupov, ktoré sú dobre známe lekárom alebo veterinárom vyznajúcim sa v odbore. Títo pacienti sa potom môžu liečiť tak, ako sa opisuje v predkladanom vynáleze.

Určenie, či je ochorenie na podklade bunkovej proliferácie spôsobené aktivitou RAF, sa môže uskutočniť po prvé určením aktivity RAF v bunkách alebo v špecifickej lokalizácii v tele pacienta. Napríklad v prípade nádorových buniek sa môže aktivita jednej alebo viacerých RAF porovnať medzi nádormi s normálnou alebo zvýšenou aktivitou RAF. Ak majú nádorové bunky ' Γ rovnakú alebo vyššiu aktivitu, ako je aktivita pri nádorových ochoreniach vznikajúcich na podklade zvýšenej aktivity RAF, sú vhodnými kandidátmi na liečbu použitím opísaných RAF modulujúcich metód a zlúčenín, ktoré sú predmetom predkladaného vynálezu.

V prípade ochorenia na podklade bunkovej proliferácie, ktoré vznikajú v dôsledku nechcenej proliferácie nenádorových buniek, je aktivita RAF porovnaná s aktivitou vyskytujúcou sa v bežnej populácii (napríklad priemerná aktivita vyskytujúca sa v bežnej populácii ľudí alebo zvierat, okrem ľudí alebo zvierat trpiacich ochorením na podklade bunkovej proliferácie) . Ak je nechcená porucha bunkovej proliferácie charakterizovaná vyššou aktivitou RAF, ako je aktivita vyskytujúca sa v bežnej populácii, jedná sa o poruchu, ktorá je vhodným kandidátom na liečbu použitím opísaných RAF modulujúcich metód a zlúčenín, ktoré sú predmetom predkladaného vynálezu.

III. Farmaceutické preparáty a aplikácie 5-azachinoxalínových zlúčenín

Metódy prípravy farmaceutických preparátov obsahujúcich zlúčeniny, metódy určenia množstva zlúčenín, ktoré majú byť podané pacientovi, a spôsoby podania zlúčenín organizmu sú uvedené v patentovej prihláške U.S. Application Seriál No. 08/702232 autorov Táng et al., ktorá je nazvaná „Indolinone Combinatorial Libraries and Related Products and Methods for the Treatment of Disease (Lyon a Lyon spis č. 221/187) a zaregistrovaná 23. augusta 1996. Tieto metódy sú ďalej uvedené v medzinárodnom patente č. WO 96/22976 autorov Buzetti et al., ktorý je nazvaný „Hydrosoluble 3-Aryliden-2-Oxoinole Derivatives as Tyrosin Kinase Inhibitors a publikovaný 1. augusta 1996. Obidva dokumenty sú v predkladanom vynáleze začlenené f r r r r r r r r ^r r r r e r r e c c r c r r r ±3 Γ- $,--:.ako referencia v celom svojom rozsahu vrátane vyobrazení.

Osoby vyznajúce sa v odbore ocenia, že tento opis je aplikovatelný na predkladaný vynález a môže byť preň lahko upravený.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Nižšie uvedené príklady nijako neobmedzujú predkladaný vynález a len reprezentujú rozličné aspekty a rysy predkladaného vynálezu. Príklady opisujú metódy syntézy zlúčenín, ktoré sú predmetom predkladaného vynálezu a metódy merania efektu zlúčeniny na funkciu proteínkinázy RAF.

Bunky používané v metódach sú komerčne dostupné. Vektory nukleových kyselín vychytávané bunkami sú tiež komerčne dostupné a sekvencie génov rozličných proteínkináz sú lahko dostupné v sekvenčných bankách. Preto osoba vyznajúca sa v odbore môže ľahko vytvoriť vhodným spôsobom bunkové línie pomocou komerčne dostupných buniek, komerčne dostupných vektorov nukleových kyselín a génov pre proteínkinázy použitím techník, ktoré sú ľahko dostupné osobám vyznajúcim sa v odbore.

Príklad 1: Postupy syntézy 5-azachinoxalínových zlúčenín, ktoré sú predmetom predkladaného vynálezu

Predkladaný vynález bude teraz ilustrovaný pomocou nasledovných neobmedzujúcich príkladov, v ktorých, ak nie je uvedené inak:

(i) odparenie sa uskutočnilo v rotačnej odparke pod vákuom;

(ii) operácie sa uskutočnili pod atmosféroou inertného plynu, ako je napríklad dusík;

(iii) vysokoúčinná kvapalinová chromatografia (HPLC) sa uskutočnila na sorbente Merck LiChrosorb RP-18 silika s

H-f reverznou fázou, ktorý bol získaný od spoločnosti E. Merck, Darmstadt, Nemecko;

(iv) výťažky sú uvedené len na ilustráciu a neznamenajú nutne najvyšší dosiahnuteľný výťažok;

(v) teploty topenia nie sú upravované a sú získané pomocou digitálneho zariadenia na určovanie teploty topenia HSW Mainz SG 2000;

(vi) Štruktúry všetkých zlúčenín, ktoré sú v predkladanom vynáleze charakterizované vzorcom I, sa potvrdili protónovou magnetickou rezonančnou spektroskopiou na spektrofotometri Bruker AMX500-NMR, ďalej pomocou elementárnej mikroanalýzy a v niektorých prípadoch pomocou hmotnostnej spektroskopie;

(vii) Čistota štruktúr sa určila pomocou tenkovrstvovej chromatografie (TLC) na silikagéle (Merck Silica Gel 60 F254) alebo pomocou HPLC; a (viii) Medziprodukty neboli všeobecne úplne charakterizované a ich čistota sa určila pomocou tenkovrstvovej chromatografie (TLC) alebo pomocou HPLC.

Syntetické postupy

Zlúčenina A-2:

6-Benzylamino-3- (4-hydr'oxyfenyl) -5-azachinoxalín

4-Hydroxyfenylglyoxál sa pripravil zo 4-hydroxyacetofenónu (Lancaster, Acros) podľa publikovanej metódy (J. Amer. Chem. Soc., 71, 1045 (1949)).

2-Amino-6-benzylamino-3-nitropyridín sa pripravil z 2-amino-6-chlór-3-nitropyridínu nasledovným spôsobom: 2-amino-6-chlór-3-nitropyridín (17,35 g, 0,10 mol), benzylamín (Fluka) (10,72 g, 0,10 mol) a práškový uhličitan draselný (10,4 g, 0,035 mol) v n-butanole (100 ml) sa zohrievalo pod spätným

Is chladičom 2 hodiny. Suspenzia sa prefiltrovala a po ochladení na izbovú teplou premyla butanolom a vysušila pri teplote 50 °C vo vákuu, čo viedlo k vzniku 2-amino-6-benzylamino-3-nitropyridínu (22,2 g, 91 %, teplota topenia 145 až 146 °C) .

6-Benzylamino-3-(4-hydroxyfenyl)-5-azachinoxalín sa pripravil z 2-amino-6-benzylarnino-3-nitropyridínu nasledovným spôsobom: 2-Amino-6-benzylamino-3-nitropyridín (25 g, 0,10 mol) sa hydrogenoval pod tlakom 550 kPá H₂ v prítomnosti 10 g Raneyho niklu v 400 ml dioxánu pri'teplote 60 °C. Po 2 hodinách sa reakčná zmes ochladila na izbovú teplotu, prefiltrovala a pridal sa 4-hydroxyfenylglyoxál a premiešaval 2 hodiny v argónovej atmosfére. Suspenzia sa potom zriedila vodou, precipitát sa zhromaždil filtráciou, premyl vodou, prekryštalizoval z 2-propanolu a vysušil pri teplote 50 °C vo vákuu, čo viedlo k vzniku 6-benzylamino-3-(4-hydroxyfenyl)-5-azachinoxalínu (8 g, 24,4 %, teplota topenia 271 až 273 °C).

Zlúčenina A-l:

6-Fenylamino-3-(4-hydroxyfenyl)-5-azachinoxalín

Substitúciou fenylamínu na miesto benzylamínu v postupe pre zlúčeninu A-2 vedie identický proces k vzniku 6-fenylamino-3-(4-hydroxyfenyl)-5-azachinoxalínu.

Zlúčenina A-3:

6-Metoxy-2-metyl-3-fenyl-5-azachinoxalín

Substitúciou 1-fenyl-1,2-propándiónu na miesto 4-hydroxyfenylglyoxálu a metanolu na miesto benzylamínu v postupe pre zlúčeninu A-2 vedie identický proces k vzniku 6-metoxy-2-metyl-3-fenyl-5-azachinoxalínu.

Ϊ6 r ŕ

Zlúčenina A-4:

6-Metoxy-2,3-difenyl-5-azachinoxalin

Substitúciou benzylu na miesto 4-hydroxyfenylglyoxálu a metanolu na miesto benzylaminu v postupe pre zlúčeninu A-2 vedie identický proces k vzniku 6-metoxy-2,3-difenyl-5-azachinoxalínu.

Zlúčenina A-5:

6-(4-Fluórbenzylamino)-2-metyl-3-fenyl-5-azachinoxalin

Substitúciou 1-fenyl-l,2-propándiónu na miesto 4-hydroxyfenylglyoxálu a 4-fluórbenzylaminu na miesto benzylaminu v postupe pre zlúčeninu A-2 vedie identický proces k vzniku 6-(4-fluórbenzylamino)-2-metyl-3-fenyl-5-azachinoxalínu.

Zlúčenina A-6:

2,3-Difenyl-6-(4-fluórbenzylamino)-5-azachinoxalin

Substitúciou benzylu na miesto 4-hydroxyfenylglyoxálu a

4-fluórbenzylaminu na miesto benzylaminu v postupe pre zlúčeninu A-2 vedie identický proces k vzniku 2,3-difenyl-6-(4-fluórbenzylamino)-5-azachinoxalinu.

Zlúčenina A-7:

3-Fenyl-6-fenylamino-5-azachinoxalín

Substitúciou fenylglyoxálu na miesto 4-hydroxyfenylglyoxálu a anilínu na miesto benzylaminu v postupe pre zlúčeninu A-2 vedie identický proces k vzniku 3-fenyl-6-fenylamino-5-azachinoxalínu.

e e e r. c e c r r r r r c ' ^r c.·' I ' ^;

Zlúčenina A-8 až A-26

Substitúciou príslušného substituovaného benzylaminu na miesto benzylaminu v postupe pre zlúčeninu A-2 vedie identický proces k vzniku nasledovných zlúčenín:

Zlúčenina A-8: 6-(2-karboxybenzylamino)-3-(4-hydroxyfenyl)-5-azachinoxalín

Zlúčenina A-9: 6-(3-karboxybenzylamino)-3-(4-hydroxyfenyl)-5-azachinoxalín

Zlúčenina A-10: 6-(4-karboxybenzylamino)-3-(4-hydroxyfenyl)-5-azachinoxalín

Zlúčenina A-ll: 3-(4-hydroxyfenyl)-6-(2-nitrobenzylaminol)-5-azachinoxalín

Zlúčenina A-12: 3-(4-hydroxyfenyl)-6-(3-nitrobenzylaminol)-5-azachinoxalín

Zlúčenina A-13: 3-(4-hydroxyfenyl)-6-(4-nitrobenzylaminol)-5-azachinoxalín

Zlúčenina A-14: 3-(4-hydroxyfenyl)-6-(2-metylbenzylaminol)-5-azachinoxalín

Zlúčenina A-15: 3-(4-hydroxyfenyl)-6-(3-metylbenzylaminol) -5-azachinoxalín

Zlúčenina A-16: 3-(4-hydroxyfenyl)-6-(4-metylbenzylaminol)-5-azachinoxalín

Zlúčenina A-17: 6-(2-chlórbenzylamino)-3-(4-hydroxyfenyl)-5-azachinoxalín

Zlúčenina A-18: 6-(3-chlórbenzylamino)-3-(4-hydroxyfenyl) -5-azachinoxalín

Zlúčenina A-19: 6-(4-chlórbenzylamino)-3-(4-hydroxyfenyl) -5-azachinoxalín

Zlúčenina A-20: 6-(2-fluórbenzylamino)-3-(4-hydroxyfenyl)-5-azachinoxalín

Zlúčenina A-21: 6-(3-fluórbenzylamino)-3-(4-hydroxyfenyl)-5c - -azachinoxalín

Zlúčenina A-22: 6-(4-fluórbenzylamino)-3-(4-hydroxyfenyl)-5-azachinoxalin

Zlúčenina A-23: 3-{4-hydroxyfenyl)-6-[2-(trifluórmetyl)benzylamino) -5-azachinoxalín

Zlúčenina A-24: 3-(4-hydroxyfenyl)-6-[3-(trifluórmetyl)benzylamino) -5-azachinoxalin

Zlúčenina A-25: 3-(4-hydroxyfenyl)-6-[4-(trifluórmetyl)benzylamino) -5-azachinoxalin

Zlúčenina A-26: 3-(4-hydroxyfenyl)r6-(fenetyl-l-aminol)-5-azachinoxalin

Zlúčenina A-27 až A-48

Substitúciou príslušného substituovaného anilínu na miesto benzylamínu v postupe pre zlúčeninu A-2 vedie identický proces k vzniku nasledovných zlúčenín:

Zlúčenina A-27 -azachinoxalín Zlúčenina A-28 -azachinoxalín Zlúčenina A-29 -azachinoxalín Zlúčenina A-30 -azachinoxalín Zlúčenina A-31 -azachinoxalín Zlúčenina A-32 -azachinoxalín Zlúčenina A-33 -azachinoxalín Zlúčenina A-34

6-(2-karboxyfenylamino)-3-(4-hydroxyfenyl)-56-(3-karboxyfenylamino)-3-(4-hydroxyfenyl)-56-(4-karboxyfenylamino)-3-(4-hydroxyfenyl)-53-(4-hydroxyfenyl)-6-(2-nitrofenylaminol)-53-(4-hydroxyfenyl)-6-(3-nitrofenylaminol)-53-(4-hydroxyfenyl)-6-(4-nitrofenylaminol)-53- (4-hydroxyfenyl)-6-(2-metylfenylaminol)-53-(4-hydroxyfenyl)-6-(3-metylfenylaminol)-5b-3

-azachinoxalín

Zlúčenina A-35: 3-(4-hydroxyfenyl)-6-(4-metylfenylaminol)-5-azachinoxalín

Zlúčenina A-36: 6-(2-chlórfenylamino)-3-(4-hydroxyfenyl) -5-azachinoxalín

Zlúčenina A-37: 6-(3-chlórfenylamino)-3-(4-hydroxyfenyl)-5-azachinoxalín

Zlúčenina A-38: 6-(4-chlórfenylamino)-3-(4-hydroxyfenyl)-5-azachinoxalín

Zlúčenina A-39: 6-(2-fluórfenylamino)-3-(4-hydroxyfenyl)-5-azachinoxalín

Zlúčenina A-40: 6-(3-fluórfenylamino)-3-(4-hydroxyfenyl)-5-azachinoxalín

Zlúčenina A-41: 6-(4-fluórfenylamino)-3-(4-hydroxyfenyl)-5-azachinoxalín

Zlúčenina A-42: 3- (4-hydroxyfenyl)'-6- [2-(trifluórmetyl) fenyl amino)-5-azachinoxalín

Zlúčenina A-43: 3-(4-hydroxyfenyl)-6-[3-(trifluórmetyl)fenyl amino)-5-azachinoxalín

Zlúčenina A-44: 3-(4-hydroxyfenyl)-6-[4-(trifluórmetyl) fenyl amino)-5-azachinoxalín

Zlúčenina A-45: 3-(4-hydroxyfenyl)-6-(pyrid-2-aminol)-5-azachinoxalín

Zlúčenina A-46: 3-(4-hydroxyfenyl)-6-(pyrid-3-aminol)-5-azachinoxalín

Zlúčenina A-47: 3-(4-hydroxyfenyl)-6-(pyrid-4-aminol)-5-azachinoxalín

Zlúčenina A-48: 3-(4-hydroxyfenyl)-6-(pyrid-2-metylaminol)-5-azachinoxalín

Zlúčenina A-49 až A-67 c· r

Substitúciou príslušného substituovaného benzylamínu na miesto benzylamínu a fenylglyoxálu na misto 4-hydroxyfenylglyoxálu v postupe pre zlúčeninu A-2 vedie identický proces k vzniku nasledovných zlúčenín:

Zlúčenina A-49 xalín

Zlúčenina A-50 xalín

Zlúčenina A-51 xalín

Zlúčenina A-52 xalín

Zlúčenina A-53 xalín

Zlúčenina A-54 xalín

Zlúčenina A-55 xalín

Zlúčenina A-56 xalín

Zlúčenina A-57 xalín

Zlúčenina A-58 xalín

Zlúčenina A-59 xalín

Zlúčenina A-60 xalín

Zlúčenina A-61 xalín

Zlúčenina A-62 xalín

6-(2-karboxybenzylamino)-3-fenyl-5-azachino6-(3-karboxybenzylamino)-3-fenyl-5-azachino6-(4-karboxybenzyl^mino)-3-fenyl-5-azachino6-(2-nitrobenzylamino)-3-fenyl-5-azachino6-(3-nitrobenzylamino)-3-fenyl-5-azachino6-(4-nitrobenzylamino)-3-fenyl-5-azachino6-(2-metylbenzylamino)-3-fenyl-5-azachino6-(3-metylbenzylamino)-3-fenyl-5-azachino6-(4-metylbenzylamino)-3-fenyl-5-azachino6-(2-chlórbenzylamino)-3-fenyl-5-azachino6-(3-chlórbenzylamino)-3-fenyl-5-azachino6- (4-chlórbenzylamiho)-3-fenyl-5-azachino6-(2-fluórbenzylamino)-3-fenyl-5-azachino6-(3-fluórbenzylamino)-3-fenyl-5-azachino£4

e r λ tZlúčenina A-63: 6-(4-fluórbenzylamino)-3-fenyl-5-azachinoxalín

Zlúčenina A-64: 3-fenyl-6-[2-(trifluórmetyl)benzylamino)-5-azachinoxalín

Zlúčenina A-65: 3-fenyl-6-[3-(trifluórmetyl)benzylamino)-5-azachinoxalín

Zlúčenina A-66: 3-fenyl-6-[4-(trifluórmetyl)benzylamino)-5-azachinoxalín

Zlúčenina A-67: 3-fenyl-6-(fenetyl-l-amino)-5-azachinoxalín

Zlúčenina A-68 až A-89

Substitúciou príslušného substituovaného anilínu na miesto benzylamínu a fenylglyoxálu na misto 4-hydroxyfenylglyoxálu v postupe pre zlúčeninu A-2 vedie identický proces k vzniku nasledovných zlúčenín:

Zlúčenina	A-68
xalín
Zlúčenina	A-69
xalín
Zlúčenina	A-70
xalín
Zlúčenina	A-71
Zlúčenina	A-72
Zlúčenina	A-73
Zlúčenina	A-74
Zlúčenina	A-75
Zlúčenina	A-76
Zlúčenina	A-77
Zlúčenina	A-78
Zlúčenina	A-79
Zlúčenina	A-80

6-(2-karboxyfenylamino)-3-fenyl-5-azachino6-(3-karboxyfenylamino)-3-fenyl-5-azachino6-(4-karboxyfenylamino)-3-fenyl-5-azachino6-(2-nitrofenylamino)-3-fenyl-5-azachinoxalín 6-(3-nitrofenylamino)-3-fenyl-5-azachinoxalín 6-(4-nitrofenylamino)-3-fenyl-5-azachinoxalín 6-(2-metylfenylamino)-3-fenyl-5-azachinoxalín f*

6-(3-metylfenylamino)-3-fenyl-5-azachinoxalín 6-(4-metylfenylamino)-3-fenyl-5-azachinoxalín 6-(2-chlórfenylamino)-3-fenyl-5-azachinoxalín 6-(3-chlórfenylamino)-3-fenyl-5-azachinoxalín 6-(4-chlórbenzylamino)-3-fenyl-5-azachinoxalín 6-(2-fluórfenylamino)-3-fenyl-5-azachinoxalín £2.

Zlúčenina	A-81:
Zlúčenina	A-82:
Zlúčenina	A-83:
-azachinoxalín
Zlúčenina	A-84:
-azachinoxalín
Zlúčenina	A-85:
-azachinoxalín
Zlúčenina	A-86:
Zlúčenina	A-87:
Zlúčenina	A-88:
Zlúčenina	A-89:
xalín
Zlúčenina	A-90:

6-Fenylamino-36-(3-fluórfenylamino)-3-fenyl-5-azachinoxalín 6-(4-fluórfenylamino)-3-fenyl-5-azachinoxalín 3-fenyl-6-[2-(trifluórmetyl)fenylamino)-53-fenyl-6-[3-(trifluórmetyl)fenylamino)-53-fenyl-6-[4-(trifluórmetyl)fenylamino)-53-fenyl-6-(pyrid-2-aminol)-5-azachinoxalín 3-fenyl-6-(pyrid-3-aminol)-5-azachinoxalín 3-fenyl-6-(pyrid-4-aminol)-5-azachinoxalín 3-fenyl-6“(pyrid-2-metylaminol)-5-azachino(4-metoxyfenyl)-5-ázachinoxalín

Substitúciou 4-metoxyfenylu na miesto 4-hydroxyfenylu v postupe pre zlúčeninu A-l vedie identický procees k vzniku 6-fenylamino-3-(4-metoxyfenyl)-5-azachinoxalínu.

Príklad 2: Stanovenie fosforylačnej funkcie RAF

Nasledovná metóda zaznamenáva stupeň fosforylácie cielového proteínu MEK, ako aj cieľa proteínu MEK, proteínu MAPK, katalyzovanej pomocou RAF. Sekvencia génu pre RAF je opísaná v publikácii autorov Bonner et al., 1985, Molec. Celí Biol. 5: 1400-1407 a je ľahko dostupná v databankách génových sekvencii. Konštrukcia vektora nukleovej kyseliny a použitých bunkových línií využívaných v predkladanom vynáleze je úplne opísaná v publikácii autorov Morrison et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:855-8859.

«* “

Materiál a reagencie

1. Bunky Sf9 (Spodoptera frugiperda]; GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD.

2. Tlmivý roztok RIPA: 20 mM Tris/HCl pH 7,4, 137 mM NaCl, 10% glycerol, 1 mM PMSF, 5 mg/1 aprotenínu, 0,5% Tritonu X100;

3. Tioredoxín-MEK fúzny proteín (T-MEK): Expresia T-MEK a purifikácia afinitnou chromatografiou sa uskutočnila podlá postupov podlá výrobcu. Katalógové č. K 350-01 a R 350-40, Invitrogen Corp., San Diego, CA.

4. His-ΜΑΡΚ (ERK 2); MAPK s histidínovou kotvou sa exprimovala v XL1 Blue cells transformovaných vektorom pUC18 kódujúcim His-MAPK. His-ΜΑΡΚ sa purifikovala Ni-afinitnou chromatografiou. Katalógové č. 27-4949-01, Farmácie. Alameda, Kalifornia, ako sa opisuje v predkladanom vynáleze.

5. Ovčí antimyší IgG: Jackson Laboratories, West Grove,

PA, Katalógové č. 515-006-008, šarža 28563

6. Špecifická protilátka proti proteínkináze RAF-1:

URP2653 od UBI.

7. Poťahovací tlmivý roztok: PBS; fosfátový tlmivý roztok, GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD.

8. Premývací tlmivý roztok: TBST - 50 mM tris/HCl pH 7,2, 150 mM NaCl, 0,1% Triton X-100.

9. Blokujúci tlmivý roztok: TBST, 0,1% etanolamín pH 7,4.

10. DMSO, Sigma, St. Louis, Mo.

11. Kinázový tlmivý roztok (KB) : 20 mM Hepes/HCl pH 7,2, 150 mM NaCl, 0>l% triton X-100, 1 mM PMSF, 5 mg/1 aprotenínu, 75 mM ortovanadátu sodného, 0,5 MM DTT a 10 mM MgCl₂.

12. Zmes ATP: 100 mM MgCl₂, 300 uM ATP, 10 nCi g-³³P ATP (Dupont-NEN)/ml.

13. Zastavujúci roztok: 1% kyselina fosforečná; Fisher, Pitsburgh, PA.

&ŕ

14. Celulózové filtre Wallac; Wallac, Turku, Fínsko.

15. Filtrovací premývací roztok: 1% kyselina fosforečná; Fisher, Pitsburgh, PA.

16. Platničkový harvester Tomtec, Wallac, Turku, Fínsko.

17. Wallac beta platničkový reader, Wallac, Turku, Fínsko.

18. Polypropylénové platničky NUNC s 96 jamkami s dnom v tvare písmena V, Applied Scientific, katalógové č. AS-72092

Postup

Všetky nasledovné kroky sa uskutočňovali pri izbovej teplote, pokial nie je uvedené inak.

1. Potiahnutie platničky ELISA: Jamky ELISA sa potiahnú cez noc pri teplote 4 °C pomocou 100 mL ovčieho antimyšieho afinitne purifikovaného antiséra (1 ug/100 ul poťahovacieho tlmivého roztoku). Platničky ELISÁ sa môžu použiť 2 týždne, pokial sa skladujú pri teplote 4 °C.

2. Platničku obráťte a odstráňte tekutú zložku. Pridajte 100 ul blokujúceho roztoku a inkubujte 30 minút.

3. Odstráňte blokujúci roztok a premyte 4-krát pomocou premývacieho tlmivého roztoku. Položte platničku na papierový obrúsok na odstránenie nadbytku tekutiny.

4. Pridajte do každej jamky 1 mg špecifickej protilátky proti RAF-1 a inkubujte 1 hodinu. Premyte tak, ako sa opisuje v kroku 3.

5. Rozmrazte lyzáty z RAS/RAF infikovaných Sf9 buniek a zrieďte ich pomocou TBST na 10 ug/100 ul. Pridajte 10 ug zriedeného lyzátu do jamiek a inkubujte 1 hodinu. Pretrepávajte platničku počas inkubácie. Negatívne kontroly neobsahujú žiadny lyzát. Lyzáty z RAS/RAF infikovaných Sf9 hmyzích buniek sú pripravené po infikácii buniek rekombinantnými bakulovírusmi pri MOI 5 pre každý vírus a pozbierané o 48 hodín neskôr. Bunky sa raz premyjú pomocou PBS a lyžujú v tlmivom •55 roztoku RIPA. Nerozpustný materiál sa odstráni centrifugovaním (5 minút pri 10000 g). Alikvóty lyzátov sa zamrazia v suchom lade/etanole a uskladnia pri teplote -80 °C až do použitia.

6. Odstráňte nenaviazaný materiál a premyte tak, ako sa opisuje vyššie (krok 3).

7. Pridajte 2 ug T-MEK a 2 ug His-MAEPK na jamku a upravte objem na 40 ul pomocou kinázového tlmivého roztoku. Metódy purifikácie T-MEK a MAPK z bunkových extraktov sa tu uvádzajú vo forme príkladu.

8. Predrieďte zlúčeniny (zásobhý roztok 10 mg/ml DMSO) alebo extrakty 20-krát v TBST plus 1% DMSO. Pridajte 5 ul predriedených zlúčenín/extraktov do jamiek opísaných v kroku 6. Inkubujte 20 minút. Kontroly neobsahujú žiadny liek.

9. Začnite kinázovú reakciu pridaním 5 ul zmesi ATP. Premiešavajte platničky v priebehu inkubácie na platničkovej pretrepávačke ELISA.

10. Zastavte kinázovú reakciu po 60 minútach pridaním 30 ul zastavovacieho roztoku do každej jamky.

11. Umiestnite fosfocelulózový filter a platničku ELISA do platničkového harvestera Tomtec. Zoberte a premyte filter premývacím roztokom podľa doporučenia výrobcu. Vysušte filtre. Utesnite filtre a umiestnite ich do držiaka. Vložte držiak do zariadenia na detekciu rádioaktivity a kvantifikujte rádioaktívny fosfor na filtroch.

Alternatívne sa môžu preniesť 40 ul alikvóty z jednotlivých jamiek platničky do korešpondujúcich polôh na fosfocelulózovom filtri. Po vysušení filtra vzduchom položte filtre na misku. Jemne misku premiešavajte a vymieňajte premývací roztok v 15minútových intervaloch 1 hodinu. Vysušte filtre vzduchom. Utesnite filtre a umiestnite ich do držiaka vhodného na meranie rádioaktívneho fosforu vo vzorkách. Vložte držiak do zariadenia na detekciu rádioaktivity a kvantifikujte rádioaktívny fosfor na filtroch.

r c r

Hodnoty IC₅₀ sa merali podlá protokolu pre nasledovné 5-azachinoxalínové zlúčeniny v RAF-1 ELISA analýze:

(A-1) (A-2)

(A-7) (A-36)

Hodnota IC50 je koncentrácia 5-azachinoxalínového inhibítora požadovaného na zníženie maximálneho množstva fosforylovaného cieľového proteínu alebo bunkového rastu o 50 %, Hodnoty IC50 merané v RAF-1 fosforylačnej analýze sú uvedené v tabuľke 1.

S7

Tabulka 1

Zlúčenina i	IC50 (uM)
A-l	11,5
A-2	00 Γ
A-7	33
A-36	: 45,6
A-77	20,3
A-90	98,0

Príklad 3: Purifikácia MAPK a MEK

Proteíny MAPK a MEK sa lahko exprimujú v bunkách pomocou subklonovania génu kódujúceho tieto proteíny do komerčne dostupného vektora, ktorý exprimuje proteíny s polyhistidínovou kotvou. Gény kódujúce tieto proteíny sú lahko dostupné v laboratóriách, ktoré normálne pracujú s týmito proteínmi alebo pomocou klonovania týchto génov z buniek obsahujúcich knižnice cDNA. Knižnice sú lahko dostupné a osoba vyznajúca sa v odbore môže lahko pripraviť próby nukleových kyselín homológnych k cDNA molekúl kódujúcich MEK alebo MAPK zo sekvencii nukleových kyselín MEK a MAPK dostupných v databázach génov, ako je napríklad Genbank. Klonovanie génu sa môže dosiahnuť v krátkom časovom úseku použitím techník bežne dostupných osobám skúseným sa v odbore.

Purifikácia proteínov MEK a MAPK z bunkových extraktov sa môže uskutočniť použitím nasledovného protokolu, ktorý je upravený podlá Robbinsa et al., 1993, J. Biol. Chem. 268: 5097-5106:

1. Uskutočnite lýzu buniek pomocou sonikácie, osmotického stresu alebo prešu French pomocou techník dostupných osobám vyznajúcim sa v odbore. Vhodný sonikačný tlmivý roztok je uvedený nižšie.

2. Ekvilibrujte pevnú matricu, ktorá je konjugovaná s niklom alebo kobaltom ekvilibračným tlmivým roztokom uvedeným nižšie. Polyhistidínová kotva sa špecificky viaže na atómy niklu a kobaltu na pevnej matrici. Ekvilibrácia sa môže dosiahnuť premytím živice trikrát ekvilibračným tlmivým roztokom s objemom rovným 10 objemom pevnej matrice. Pevná matrica je lahko dostupná osobám vyznajúcim sa v odbore.

3. Pridajte bunkový lyzát k pevnej matrici a ekvilibrujte v nádobe určitý čas. Alternatívne sa môže pevná matrica naplniť do chromatografickej kolóny a lyzát sa môže naliať na kolónu obsahujúcu pevnú matricu.

4. Premyte pevnú matricu premývacím tlmivým roztokom uvedeným nižšie.

5: Uskutočnite elúciu proteínu MEK' a MAPK z pevnej matrice elučným tlmivým roztokom (uvedený nižšie), ktorým odstránite významnú časť proteínu z pevnej matrice.

Sonikačný tlmivý roztok mM fosfát sodný, pH 8,0

0,3 M chlorid sodný mM β-merkaptoetanol

1% NP40 mM NaF

0,5 mM Pefablock

Ekvilibračný tlmivý roztok mM fosfát sodný, pH 8,0 0,3 M chlorid sodný £9 mM β-merkaptoetanol 1% NP40 10 mM NaF 1 mM imidazol

Premývací tlmivý roztok mM fosfát sodný, pH 8,0 0,3 M chlorid sodný 10 mM β-merkaptoetanol 1% NP40

10¹mM NaF mM imidazol

Elučný tlmivý roztok mM fosfát sodný, pH 8,0 0,3 M chlorid sodný 10 mM β-merkaptoetanol 1% NP40 mM NaF

10-500 mM imidazol

Príklad 4: Stanovenie fosforylačnej funkcie RAF EGF receptora

Aktivita EGF receptorovej kinázy (EGFR-NIH3T3 analýza) sa merala v celých bunkách, ako sa opisuje detailne v PCT publikácii WO9640116, zaregistrovanej 5. júna 1996 autormi

Táng et al., ktorá je nazvaná „Indolinone Compounds for the Treatment of Disease a ktorá je v predkladanom vynáleze začlenená ako referencia v celom svojom rozsahu vrátane vyobrazení.

Hodnoty IC50 merané v analýze na'EGF receptorovú fosforyláciu sú uvedené v tabuľke 2.

Tabulka 2

Zlúčenina	, - JCso (uM)
A-2	>50
A-3	>100
A-4	>100
A-5	>100
A-6	>100
• A-7	.........>50 :

Príklad 5: Stanovenie efektu 5-azachinoxalínových zlúčenín na rast buniek exprimujúcich RAS

Nasledovná metóda meria stupeň rastu buniek NIH-3T3 exprimujúcich RAS. Účelom metódy je určenie účinkov zlúčenín na rast buniek NIH-3T3 exprimujúcich H-Ras.

Materiál

96-jamkové sterilné platničky s plo.chým dnom 96-jamkové sterilné platničky s guľatým dnom sterilná 25 ml alebo 100 ml nádoba pipety, viackanálová pipeta sterilné pipetové špičky sterilné 15 ml a 50 ml skúmavky

Reagencie

0,4% SRB v 1% kyseline octovej mM Tris zásada

10% TCA

1% kyselina octová sterilný DMSO (Sigma) zlúčenina v DMSO (100 mM alebo slabší zásobný roztok)

Trypsín-EDTA (GIBCO BRL)

Bunková línia

3T3/H-Ras (NIH 3T3 kloň 7 buniek exprimujúcich genomický fragment onkogénneho H-Ras)

Bunky sa môžu pripraviť použitím nasledovného protokolu:

1. Subklonujte fragment génu kódujúci Ras do komerčne dostupného vektora, ktorý bude stabilne transfekovať NIH-3T3 bunky. Fragment je z genomickej transformujúcej alely cHa-ras.

2. Transfekujte NIH-3T3 bunky subklonovanýcm vektorom pomocou metódy s kalciumfosfátom. Vyberte bunky exprimujúce konštrukt Ras v 2% sére v DMEM. Po dvoch týždňoch sa pozorujú viditeiné ložiská. Vytvorte pool transformovaných buniek, aby ste získali stabilne transformovanú bunkovú líniu.

Rastové médium

2% teľacie sérum/DMEM + 2mM glutamín, Pen/Strep

Protokol

Deň 0: Umiestnenie buniek

G2

r r- r r r r

Táto časť metódy sa uskutočňuje v boxe s laminárnym prúdením.

1. Trypsinizujte bunky. Preneste 200 ml bunkovej suspenzie k 10 ml izotonického rozoku. Spočítajte bunky pomocou prístroja Coulter Counter.

2. Naried’te bunky v rastovom médiu na 60 000 buniek/ml. Preneste 100 ml buniek do každej jamky v 96-jamkovej platničke s plochým dnom, aby v každej jamke bolo 6000 buniek.

3. Použite polovicu platničky (4 rady) pre každú zlúčeninu a pracujte v kvadruplete pre každú.koncentráciu zlúčeniny.

Pre kontrolné médium použite 4 jamky.

4. Platničky jemne premiešajte, aby došlo k jednotnému prichyteniu buniek.

5. Inkubujte platničky pri teplote 37 °C v inkubátore s 10% CO₂.

Deň 1: Pridanie zlúčeniny

Táto časť metódy sa uskutočňuje v boxe s laminárnym prúdením.

1. Do 96-jamkovej platničky s plochými dnami pridajte 120 ml rastového média obsahujúceho 2x najvyšiu finálnu koncentráciu DMSO, ktorá sa našla pri skríningu koncentrácií zlúčenín v stĺpcoch 1 až 11. Napríklad ak je najvyššia koncentrácia 100 ul a tá je pripravená zo 100 mM zásobného roztoku, lx DMSO je 0,1% a 2x DMSO je 0,2%. Táto platnička sa použije na titrovanie zlúčeniny, 4 rady na jednu zlúčeninu.

2. V sterilnej 15 ml skúmavke pripravte 2x roztok s najvyššou skríningovou koncentráciou zlúčeniny v rastovom médiu plus 2x DMSO. Treba 1 ml na bunkovú líniu. Východisková koncentrácia zlúčeniny je obvykle 100 uM, ale táto koncentrácia sa môže líšiť v závislosti od solubility zlúčeniny.

Γ * £2

3. Preneste v kvadruplete 240 ul 2x roztoku východiskovej zlúčeniny do jamiek v stĺpci 1.2 v 96-jamkovej platničke s guľatými dnami. Uskutočnite sériu riedení 1:2 v celej platničke sprava dolava prenesením 12 ul zo stĺpca 12 do stĺpca 11, zo stĺpca 11 do stĺpca 10 atď. až k stĺpcu 2. Preneste 100 ul zlúčeniny a 100 ul média do stĺpca 1, na 100 ul média na bunky v korešpondujúcich jamkách 96-jamkovej platničky s plochými dnami. Celkový objem na jamku by mal byť 200 ul.

4. Vráťte platničku do inkubátora a inkubujte 3 dni.

Deň 4: Vyvinutie analýzy

Táto časť analýzy sa uskutočňuje na laboratórnom stole.

1. Ašpirujte alebo vylejte médium. Pridajte 200 ml 10% studenej TCA do každej jamky, aby-ste zafixovali bunky. Inkubujte platničku aspoň 60 minút pri teplote 4 °C.

2. Odstráňte TCA a premyte jamky 5-krát tečúcou vodou. Vysušte platničky hlavou nahor na papierových obrúskoch.

3. Farbite bunky pomocou 100 ul 0,4% SRB na jamku 10 minút.

4. Vylejte SRB a premyte jamky 5-krát pomocou 1% kyseliny octovej. Vysušte kompletne platničky hlavou nahor na papierových obrúskoch.

5. Solubilizujte farbivo pomocou 100 ul lOmM zásady Tris 5 až 10 minút na pretrepávačke.

6. Odčítajte platničky v zariadení Dynatech ELISA Plate Reader pri vlnovej dĺžkee 570 nm s referenciou pri 630 nm.

Vybrané zlúčeniny inhibovali rast buniek overexprimujúcich RAS, ako sa ilustruje v tabulke 3.

Γ r r c

Tabulka 3

Zlúčenina	ICso (uM) RAS/NIH3T3
A-l	1,04
A-2	7,6 .
A-6	13, 5
A-36	0,18
A-77	0,7

Príklad 6: Stanovenie efektu 5-azachinoxalínových zlúčenín na rast buniek A549

Nasledovná metóda meria stupeň rastu buniek A549. Účelom metódy je určenie účinkov zlúčenín na rast buniek A549 ľudského karcinómu pľúc. Bunky A549 sú dostupné z komerčných zdrojov, ako j napríklad ATCC (CCL185).

Materiál

96-jamkové sterilné platničky s plochým dnom

96-jamkové sterilné platničky s gulatým dnom sterilná 25 ml alebo 100 ml nádoba pipety, viackanálová pipeta sterilné pipetové špičky sterilné 15 ml a 50 ml skúmavky

Reagencie

0,4% SRB v 1% kyseline octovej lOmM Tris zásada

10% TCA

1% kyselina octová sterilný DMSO (Sigma) zlúčenina v DMSO (lOOmM alebo slabší zásobný roztok)

Trypsín-EDTA (GIBCO BRL)

Bunková línia

Bunky A549 ludského karcinómu plúc (ATCC CCL185).

10% fetálne teľacie sérum v Ham F12-K

Protokol

Deň 0: Umiestnenie buniek

Táto časť metódy sa uskutočňuje v boxe s laminárnym prúdením.

1. Trypsinizujte bunky. Preneste 200 ml bunkovej suspenzie k 10 ml izotonického rozoku. Spočítajte bunky pomocou prístroja Coulter Counter.

2. Narieďte bunky v rastovom médiu na 20 000 buniek/ml. Preneste 100 ul buniek do každej jamky v 96-jamkovej platničke s plochým dnom, aby v každej jamke bolo 2000 buniek.

3. Použite polovicu platničky (4 rady) pre každú zlúčeninu a pracujte v kvadruplete pre každú koncentráciu zlúčeniny.

Pre kontrolné médium použite 4 jamky.

4. Platničky jemne premiešajte, aby došlo k jednotnému prichyteniu buniek.

5. Inkubujte platničky pri teplote 37 °C v inkubátore s 10% CO₂.

Deň 1: Pridanie zlúčeniny

Táto časť metódy sa uskutočňuje v boxe s laminárnym prúdením.

1. Do 96-jamkovej platničky s plochými dnami pridajte 120 ul rastového média obsahujúceho 2x najvyšiu finálnu koncentráciu DMSO, ktorá sa našla pri skríningu koncentrácií zlúčenín v stĺpcoch 1 až 11. Napríklad ak je najvyššia koncentrácia 100 uM a tá je pripravená zo 100 mM zásobného roztoku, lx DMSO je 0,1% a 2x DMSO je 0,2%. Táto platnička sa použije na titrovanie zlúčeniny, 4 rady na jednu zlúčeninu.

2. V sterilnej 15 ml skúmavke pripravte 2x roztok s najvyššou skríningovou koncentráciou zlúčeniny v rastovom médiu plus 2x DMSO. Treba 1 ml na bunkovú líniu. Východisková koncentrácia zlúčeniny je obvykle 100 uM, ale táto koncentrácia sa môže líšiť v závislosti od solubility zlúčeniny.

3. Preneste v kvadruplete 240 ul 2x roztoku východiskovej zlúčeniny do jamiek v stĺpci 12 v 96-jamkovej platničke s guľatými dnami. Uskutočnite sériu riedení 1:2 v celej platničke sprava doľava prenesením 12 ml 'zo stĺpca 12 do stĺpca 11, zo stĺpca 11 do stĺpca 10 atď. až k stĺpcu 2. Preneste 100 ml zlúčeniny a 100 ml média do stĺpca 1, na 100 ml média a bunkách v korešpondujúcich jamkách 96-jamkovej platničky s plochými dnami. Celkový objem na jamku by mal byť 200 ml.

4. Vráťte platničku do inkubátora a inkubujte 3 dni.

Deň 4: Vyvinutie analýzy

Táto časť analýzy sa uskutočňuje na laboratórnom stole.

1. Ašpirujte alebo vylejte médium. Pridajte 200 ml 10% studenej TCA do každej jamky, aby ste zafixovali bunky. Inkubujte platničku aspoň 60 minút pri teplote 4 °C.

2. Odstráňte TCA a premyte jamky 5-krát tečúcou vodou. Vysušte platničky hlavou nahor na papierových obrúskoch.

3. Farbite bunky pomocou 100 ml 0,4% SRB na jamku 10 minút.

4. Vylejte SRB a premyte jamky 5-krát pomocou 1% kyseliny octovej. Vysušte kompletne platničky hlavou nahor na papierových obrúskoch.

5. Solubilizujte farbivo pomocou 100 ml lOmM zásady Tris 5 až 10 minút na pretrepávačke.

6. Odčítajte platničky v zariadení Dynatech ELISA Plate Reader pri vlnovej dĺžke 570 nm s referenciou pri 630 nm.

Vybrané zlúčeniny inhibovali rast buniek A549, ako sa ilustruje v tabuľke 4.

Tabuľka 4

•Zlúčenina	IC50 (uM) A549
	A-2	25,1 >10 (2% FBS)
• ......	- ····'· A-6..... ............	.........23,8 >10 (2% FBS)

Príklad 7: Metóda určenia biologickej aktivity modulátorov RAF in vivo

Na monitorovanie účinku zlúčenín, ktoré sú predmetom predkladaného vynálezu, na inhibíciu nádorových buniek vaječníkov, melanómu, prostaty, plúc a prsníka sa môžu použiť xenotransplantátové štúdie. Protokol metódy je opísaný v PCT publikácii WO9640116, zaregistrovanej 5. júna 1996 autormi Táng et al., ktorá je nazvaná „Indolinone Compounds for the Treatment of Disease a ktorá je v predkladanom vynáleze začlenená ako referencia v celom svojom rozsahu vrátane vyobrazení.

Tu ilustratívne opísaný predkladaný vynález sa môže použiť v neprítomnosti akýchkoľvek limitácií, ktoré tu nie sú špecificky uvedené. Uvedené termíny a výrazy sa používajú ako termíny opisné a nie obmedzujúce. Rozličné modifikácie týchto termínov a výrazov sú možné a sú zahrnuté do rozsahu predkladaného vynálezu. Preto by sa malo chápať, že aj keď predkladaný vynález bol špecificky uvedený preferovanými formami predkladaného vynálezu, sú možné aj zmeny a modifikácie konceptov tu uvedených, ktoré by mohli použiť osoby vyznajúce sa v odbore, patriace do rozsahu tohto vynálezu, ako sa definuje v pripojených patentových nárokoch.

Referencie, ktoré neboli v predkladanom vynáleze začlenené ako referencie, vrátane patentových aj nepatentových referencií, sú výslovne začlenené ako referencie na všetky účely. Ďalšie formy predkladaného vynálezu sú uvedené v nasledovných patentových nárokoch.

Claims (40)

1. Spôsob in vitro modulácie funkcie serínovej/treonínovej proteínkinázy, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa stupeň kontaktovania buniek exprimujúcich túto serínovú/treonínovú proteínkinázu so zlúčeninou na báze 5-azachinoxalínu.

2. Spôsob podlá nároku 1,vyznačujúci sa tým, že serínovou/treonínovou proteínkinázou je RAF.

3. Spôsob in vitro identifikácie zlúčenín, ktoré modulujú funkciu serínovej/treonínovej proteínkinázy, vyznačuj úc i sa t ý m , že zahŕňa nasledovné stupne:

a) kontaktovanie buniek exprimujúcich túto serínovú/treonínovú proteínkinázu so zlúčeninou na báze 5-azachinoxalínu a

b) monitorovanie účinku na takto spracované bunky.

4. Spôsob podlá nároku 3, vyznačujúci sa tým, že účinkom je zmena alebo absencia zmeny bunkového fenotypu.

5. Spôsob podlá nároku 3, vyznačujúci sa tým, že účinkom je zmena alebo absencia zmeny bunkovej proliferácie.

6. Spôsob podlá nároku 3, vyznačujúci sa tým, že účinkom je zmena alebo absencia zmeny katalytickej aktivity serínovej/treonínovej proteínkinázy.

7. Spôsob podľa nároku 3, vyznačujúci sa tým, že účinkom je zmena alebo absencia zmeny interakcie medzi serínovou/treonínovou proteínkinázou a prirodzeným väzbovým partnerom, ako je to uvedené v opise.

8. Spôsob podlá nároku 3, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa nasledovné kroky:

a) lýzu buniek na získanie lyzátu obsahujúceho serínovú/treonínovú proteínkinázu;

b) absorpciu serínovej/treonínovej proteínkinázy na protilátku;

c) inkubáciu adsorbovanej serínovej/treonínovej proteínkinázy so substrátom alebo substrátmi; a

d) adsorpciu substrátu alebo substrátov na pevný nosič alebo protilátku, pričom krok monitorovania účinku na bunky zahŕňa meranie koncentrácie fosfátu v substráte alebo substrátoch.

9. Spôsob podľa nároku 3, vyznačujúci sa t ý m , že serínovou/treonínovou proteínkinázou je RAF a spôsob zahŕňa nasledovné kroky:

a) lýzu buniek na získanie lyzátu obsahujúceho RAF;

b) adsorpciu RAF na protilátku;

c) inkubáciu adsorbovanej RAF s MEK a MAPK; a

d) adsorpciu MEK a MAPK na pevný nosič alebo protilátku alebo protilátky, pričom krok monitorovania účinku na bunky zahŕňa meranie koncentrácie fosfátu v MEK a MAPK.

10. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že ako zlúčenina na báze 5-azachinoxalínu sa použije zlúčenina všeobecného vzorca I kde

a) R¹, R², R³, R⁴ a R⁶ sú nezávisle vybrané zo skupiny tvorenej (i) vodíkom;

(ii) nasýteným alebo nenasýteným alkylom poprípade substituovaným päť- alebo šesťčlenným arylovým alebo heteroarylovým cyklickým zvyškom, pričom tento cyklický zvyšok je poprípade substituovaný jedným, dvoma alebo tromi substituentmi nezávisle vybranými zo skupiny tvorenej alkylom, halogénom, trihalogénmetylom, karboxylátom, nitroskupinou a esterovou skupinou;

(iii) amínom vzorca NX²X³, kde X² a X³ sú nezávisle vybrané zo skupiny tvorenej vodíkom, nasýteným alebo nenasýteným alkylom a päť- alebo šesťčlenným arylovým alebo heteroarylovým cyklickým zvyškom;

• f c * r r

72 ^: (iv) halogénom alebo trihalogénmetylovou skupinou;

(v) ketónom vzorca -CO-X⁴, kde X⁴ je vybraný zo skupiny tvorenej vodíkom, alkylom a päť- alebo šesťčlenným arylovým alebo heteroarylovým zvyškom;

(vi) karboxylovou kyselinou vzorca -(X⁵)n-COOH, alebo esterom vzorca - (X⁶) n-COO-X⁷, kde X⁵, X⁶ a X⁷ sú nezávisle vybrané zo skupiny tvorenej alkylom a päť- alebo šesťčlenným arylovým alebo heteroarylovým zvyškom, a kde n je 0 alebo 1;

(vii) alkoholom vzorca -(X⁸)n^_OH alebo alkoxyskupinou vzorca - (X⁸) n-0-X⁹, kde X⁸ a X⁹ sú nezávisle vybrané zo skupiny tvorenej vodíkom, nasýteným alebo nenasýteným alkylom a päťalebo šesťčlenným arylovým alebo heteroarylovým cyklickým zvyškom, pričom cyklický zvyšok je poprípade substituovaný jedným alebo viacerými substituentmi nezávisle vybranými zo skupiny tvorenej alkylom, halogénom, trihalogénmetylom, karboxylátom, nitroskupinou a esterovou skupinou a kde n je 0 alebo 1;

(viii) amidom vzorca -NHCOX¹⁰, kde X¹⁰ je vybraný zo skupiny tvorenej alkylom, hydroxylom a päť- alebo šesťčlenným arylovým alebo heteroarylovým cyklickým zvyškom, kde cyklický zvyšok je poprípade substituovaný jedným alebo dvoma substituentmi nezávisle vybranými zo skupiny tvorenej alkylom, halogénom, trihalogénmetylom, karboxylátom, nitroskupinou a esterovou skupinou;

(ix) -SO₂NX¹¹X¹², kde X¹¹ a X¹² sú nezávisle vybrané zo skupiny tvorenej vodíkom, alkylom a päť- alebo šesťčlenným arylovým alebo heteroarylovým cyklickým zvyškom;

(x) päť- alebo šesťčlenným arylovým alebo heteroarylovým cyklickým zvyškom poprípade substituovaným jedným, dvoma alebo tromi substituentmi nezávisle vybranými zo skupiny tvorenej alkylom, halogénom, trihalogénmetylom, karboxylátom, nitroskupinou a esterovou skupinou;

(xi) aldehydom vzorca -CO-H; a (xii) sulfónom vzorca -SO2X¹³, kde X¹³ je vybraný zo skupiny tvorenej nasýteným alebo nenasýteným alkylom a päť- alebo šesťčlenným arylovým alebo heteroarylovým cyklickým zvyškom; a

b) X¹ je nezávisle vybraný zo skupiny tvorenej dusíkom, sírou a kyslíkom.

11. Spôsob podlá nároku 10, vyznačujúci sa tým, že R¹, R², R³, R⁴ a R⁶ sú nezávisle vybrané zo skupiny tvorenej (i) vodíkom;

(ii) nasýteným alebo nenasýteným alkylom poprípade substituovaným päť- alebo šesťčlenným arylovým alebo heteroarylovým cyklickým zvyškom, kde cyklický zvyšok je poprípade substituovaný jedným, dvoma alebo tromi substituentmi nezávisle vybranými zo skupiny tvorenej alkylom, halogénom, trihalogénmetylom, hydroxyskupinou, alkoxyskupinou, karboxylátom, nitroskupinou a esterovou skupinou; a (iii) päť- alebo šesťčlenným arylovým alebo heteroarylovým cyklickým zvyškom poprípade substituovaným jedným, dvoma alebo tromi substituentmi nezávisle vybranými zo skupiny tvorenej alkylom, halogénom, trihalogénmetylom., hydroxyskupinou, alkoxyskupinou, karboxylátom, nitroskupinou a esterovou skupinou.

12. Spôsob podlá nároku 11, vyznačujúci sa t ý m , že R¹ a R² sú nezávisle vybrané zo skupiny tvorenej (i) vodíkom; a (ii) fenylom poprípade substituovaným substituentom nezávisle vybraným zo skupiny tvorenej alkylom, halogénom, trihalogénmetylom, nitroskupinou, karboxylátom, hydroxyskupinou a alkoxyskupinou.

13. Spôsob podlá nároku 12, vyznačujúci sa t ý m , že X¹ je dusík alebo kyslík.

14. Spôsob podlá nároku 13, vyznačujúci sa tým, že substituenty R⁶ a X¹ tvoria dohromady zvyšok vybraný zo skupiny tvorenej substituentmi SAQAR definovanými v opise.

15. Spôsob podľa nároku 14, vyznačujúci sa tým, že zlúčenina na báze 5-azachinoxalínu je vybraná zo skupiny tvorenej zlúčeninami SAQAR definovanými v opise.

16. Zlúčeniny na báze 5-azachinoxalínu všeobecného vzorca kde r r

a) R¹, R², R³, R⁴ a R⁶ sú nezávisle vybrané zo skupiny tvorenej (i) vodíkom;

(ii) nasýteným alebo nenasýteným alkylom poprípade substituovaným päť- alebo šesťčlenným arylovým alebo heteroarylovým cyklickým zvyškom, pričom tento cyklický zvyšok je poprípade substituovaný jedným, dvoma alebo tromisubstituentmi nezávisle vybranými zo skupiny tvorenej alkylom, halogénom, trihalogénmetylom, karboxylátom, nitroskupinou a esterovou skupinou;

(iii) amínom vzorca NX²X³, kde X² a X³ sú nezávisle vybrané zo skupiny tvorenej vodíkom, nasýteným alebo nenasýteným alkylom a päť- alebo šesťčlenným arylovým alebo heteroarylovým cyklickým zvyškom;

(iv) halogénom alebo trihalogénmetylovou skupinou;

(v) ketónom vzorca -CO-X⁴, kde X⁴ je vybraný zo skupiny tvorenej vodíkom, alkylom a päť- alebo šesťčlenným arylovým alebo heteroarylovým zvyškom;

(vi) karboxylovou kyselinou vzorca -(X⁵)n-COOH, alebo esterom vzorca - (X⁶) n-COO-X⁷, kde X⁵, X⁶ a X⁷ sú nezávisle vybrané zo skupiny tvorenej alkylom a päť- alebo šesťčlenným arylovým alebo heteroarylovým, a n je 0 alebo 1;

(vii) alkoholom vzorca -(X⁸)_n-OH alebo alkoxyskupinou vzorca - (X⁸) n^-O-X⁹, kde X⁸ a X⁹ sú nezávisle vybrané zo skupiny tvorenej vodíkom, nasýteným alebo nenasýteným alkylom a pätalebo šesťčlenným arylovým alebo heteroarylovým cyklickým zvyškom, pričom cyklický zvyšok je poprípade substituovaný jedným alebo viacerými substituentmi nezávisle vybranými zo e e skupiny tvorenej alkylom, halogénom, trihalogénmetylom, karboxylátom, nitroskupinou a esterovou skupinou a n je 0 alebo 1;

(viii) amidom vzorca -NHCOX¹⁰, kde X¹⁰ je vybraný zo skupiny tvorenej alkylom, hydroxylom a päť- alebo šesťčlenným arylovým alebo heteroarylovým cyklickým zvyškom, kde cyklický zvyšok je poprípade substituovaný jedným alebo dvoma substituentmi nezávisle vybranými zo skupiny tvorenej alkylom, halogénom, trihalogénmetylom, karboxylátom, nitroskupinou a esterovou skupinou;

(ix) -SO2NX^xlX¹², kde X¹¹ a X¹² sú nezávisle vybrané zo skupiny tvorenej vodíkom, alkylom a päť- alebo šesťčlenným arylovým alebo heteroarylovým cyklickým zvyškom;

(x) päť- alebo šesťčlenným arylovým alebo heteroarylovým cyklickým zvyškom poprípade substituovaným jedným, dvoma alebo tromi substituentmi nezávisle vybranými zo skupiny tvorenej alkylom, halogénom, trihalogénmetylom, karboxylátom, nitroskupinou a esterovou skupinou;

(xi) aldehydom vzorca -CO-H; a (xii) sulfónom vzorca -SO2X¹³, kde X¹³ je vybraný zo skupiny tvorenej nasýteným alebo nenasýteným alkylom a päť- alebo šesťčlenným arylovým alebo heteroarylovým cyklickým zvyškom; a

b) X¹ je nezávisle vybraný zo skupiny tvorenej dusíkom, sírou a kyslíkom;

na použitie ako liečivá.

17. Zlúčeniny na báze 5-azachinoxalínu podlá nároku 16, kde R¹, R², R³, R⁴ a R⁶ sú nezávisle vybrané zo skupiny tvorenej (i) vodíkom;

(ii) nasýteným alebo nenasýteným alkylom poprípade substituovaným päť- alebo šesťčlenným arylovým alebo heteroarylovým cyklickým zvyškom, kde cyklický zvyšok je poprípade substituovaný jedným, dvoma alebo tromi substituentmi nezávisle vybranými zo skupiny tvorenej alkylom, halogénom, trihalogénmetylom, hydroxyskupinou, alkoxyskupinou, karboxylátom, nitroskupinou a esterovou skupinou; a (iii) päť- alebo šesťčlenným arylovým alebo heteroarylovým cyklickým zvyškom poprípade substituovaným jedným, dvoma alebo tromi substituentmi nezávisle vybranými zo skupiny tvorenej alkylom, halogénom, trihalogénmetylom, hydroxyskupinou, alkoxyskupinou, karboxylátom, nitroskupinou a esterovou skupinou;

na použitie ako liečivá.

18. Zlúčeniny na báze 5-azachinoxalínu podlá nároku 17, kde R¹ a R² sú nezávisle vybrané zo skupiny tvorenej (i) metylom poprípade substituovaným fenylom, ktorý je poprípade substituovaný substituentmi nezávisle vybranými zo skupiny tvorenej alkylom, halogénom, hydroxyskupinou a alkoxyskupinou; a (ii) fenylom poprípade substituovaným substituentmi nezávisle vybranými zo skupiny tvorenej alkylom, halogénom, hydroxyskupinou a alkoxyskupinou;

na použitie ako liečivá.

19. Zlúčeniny na báze 5-azachinoxalínu podlá nároku 18, kde X¹ je dusík alebo kyslík; na použitie ako liečivá.

20. Zlúčeniny na báze 5-azachinoxalínu podlá nároku 19, kde substituenty R⁶ a X¹ tvoria dohromady zvyšok vybraný zo skupiny tvorenej substituentmi SAQAR definovanými v opise; na použitie ako liečivá.

21. Zlúčeniny na báze 5-azachinoxalínu podlá nároku 20, vybrané zo skupiny tvorenej zlúčeninami SAQAR definovanými v opise;· na použitie ako liečivá.

22. Zlúčeniny podlá nároku 16 na použitie ako liečivá na liečenie cicavcov.

23. Zlúčeniny podlá nároku 16 na použitie ako liečivá na liečenie abnormálnych stavov tvorených rakovinou a fibrotickými poruchami.

24. Zlúčeniny podlá nároku 16 na použitie ako liečivá na liečenie abnormálnych stavov cicavcov, kde abnormálnym stavom je nádorové ochorenie zo skupiny tvorenej pľúcnymi nádormi, nádormi vaječníkov, nádormi prsníka, nádormi mozgu, intraaxiálnymi mozgovými nádormi, nádormi hrubého čreva, nádormi prostaty, sarkómami, Kaposiho sarkómami, melanómami a gliómami.

25. Zlúčeniny podľa nároku 16 na použitie ako liečivá na liečenie abnormálnych stavov, kde uvedený abnormálny stav je spojený s aberáciou v dráhe signálovej transdukcie charakterizovanej interakciou medzi serínovou/treonínovou proteínkinázou a prirodzeným väzbovým partnerom.

26. Spôsob podľa nároku 25, kde serínovou/treonínovou proteínkinázou je RAF.

27. Zlúčeniny na báze 5-azachinoxalínu všeobecného vzorca kde

a) R¹, R², R³, R⁴ a R⁶ sú nezávisle vybrané zo skupiny tvorenej (i) vodíkom;

(ii) nasýteným alebo nenasýteným alkylom poprípade substituovaným päť- alebo šesťčlenným arylovým alebo heteroarylovým cyklickým zvyškom, pričom tento cyklický zvyšok je poprípade substituovaný jedným, dvoma alebo tromi substituentmi nezávisle vybranými zo skupiny tvorenej alkylom, halogénom, trihalogénmetylom, karboxylátom, nitroskupinou a esterovou skupinou; a (iii) amínom vzorca NX²X³, kde X² a X³ sú nezávisle vybrané zo skupiny tvorenej vodíkom, nasýteným alebo nenasýteným alkylom a päť- alebo šesťčlenným arylovým alebo heteroarylovým cyklickým zvyškom;

Γ r (iv) halogénom alebo trihalogénmetylovou skupinou;

(v) ketónom vzorca -CO-X⁴, kde X⁴ je vybraný zo skupiny tvorenej vodíkom, alkylom a päť- alebo šesťčlenným arylovým alebo heteroarylovým zvyškom;

(vi) karboxylovou kyselinou vzorca -(X⁵)n-COOH alebo esterom vzorca - (X⁶) n-COO-X⁷, kde X⁵, X⁶ a X⁷ sú nezávisle vybrané zo skupiny tvorenej alkylom a päť- alebo šesťčlenným arylovým alebo heteroarylovým zvyškom, a n je 0 alebo 1;

(vii) alkoholom vzorca -(X⁸)n-OH alebo alkoxyskupinou vzorca - (X⁸) n-O-X⁹, kde X⁸ a X⁹ sú nezávisle vybrané zo skupiny tvorenej vodíkom, nasýteným alebo nenasýteným alkylom a päťalebo šesťčlenným arylovým alebo heteroarylovým cyklickým zvyškom, pričom cyklický zvyšok je poprípade substituovaný jedným alebo viacerými substituentmi nezávisle vybranými zo skupiny tvorenej alkylom, halogénom, trihalogénmetylom, karboxylátom, nitroskupinou a esterovou skupinou a n je 0 alebo 1;

(viii) amidom vzorca -NHCOX¹⁰, kde X¹⁰ je vybraný zo skupiny tvorenej alkylom, hydroxylom a päť- alebo šesťčlenným arylovým alebo heteroarylovým cyklickým zvyškom, kde cyklický zvyšok je poprípade substituovaný jedným alebo dvoma substituentmi nezávisle vybranými zo skupiny tvorenej alkylom, halogénom, trihalogénmetylom, karboxylátom, nitroskupinou a esterovou skupinou;

(ix) -SO2NX^i:lX¹², kde X¹¹ a X¹² sú nezávisle vybrané zo skupiny tvorenej vodíkom, alkylom a päť- alebo šesťčlenným arylovým alebo heteroarylovým cyklickým zvyškom;

r r (x) päť- alebo šesťčlenným arylovým alebo heteroarylovým cyklickým zvyškom poprípade substituovaným jedným, dvoma alebo tromi substituentmi nezávisle vybranými zo skupiny tvorenej alkylom, halogénom, trihalogénmetylom, karboxylátom, nitroskupinou a esterovou skupinou;

(xi) aldehydom vzorca -CO-H; a (xii) sulfónom vzorca -SO2X¹³, kde X¹³ je vybraný zo skupiny tvorenej nasýteným alebo nenasýteným alkylom a päť- alebo šesťčlenným arylovým alebo heteroarylovým cyklickým zvyškom; a

b) X¹ je nezávisle vybraný zo skupiny tvorenej dusíkom, sírou a kyslíkom.

28. Zlúčeniny na báze 5-azachinoxalínu podlá nároku 27, kde R¹·, R², R³, R⁴ a R⁶ sú nezávisle vybrané zo skupiny tvorenej (i) vodíkom;

(ii) nasýteným alebo nenasýteným alkylom poprípade substituovaným päť- alebo šesťčlenným arylovým alebo heteroarylovým cyklickým zvyškom, kde cyklický zvyšok je poprípade substituovaný jedným, dvoma alebo tromi substituentmi nezávisle vybranými zo skupiny tvorenej alkylom, halogénom, trihalogénmetylom, hydroxyskupinou, alkoxyskupinou, karboxylátom, nitroskupinou a esterovou skupinou; a (iii) päť- alebo šesťčlenným arylovým alebo heteroarylovým cyklickým zvyškom poprípade substituovaným jedným, dvoma alebo tromi substituentmi nezávisle vybranými zo skupiny tvorenej alkylom, halogénom, trihalogénmetylom, hydroxysku82 pinou, alkoxyskupinou, karboxylátom, nitroskupinou a esterovou skupinou.

29. Zlúčenina podlá nároku 28, kde R³ a R⁴ sú atómy vodíka.

30. Zlúčenina podlá nároku 29, kde R¹ a R² sú nezávisle vybrané zo skupiny tvorenej (i) metylom poprípade substituovaným fenylom, ktorý je poprípade substituovaný substituentmi nezávisle vybranými zo skupiny tvorenej alkylom, halogénom, hydroxyskupinou a alkoxyskupinou; a (ii) fenylom poprípade substituovaným substituentmi nezávisle vybranými zo skupiny tvorenej alkylom, halogénom, hydroxyskupinou a alkoxyskupinou.

31. Zlúčenina podľa nároku 30, kde R¹ a R² sú nezávisle vybrané zo skupiny tvorenej vodíkom, metylom, fenylom a

4- hydroxyfenylom.

32. Zlúčenina podlá nároku 30, kde X¹ je dusík alebo kyslík.

33. Zlúčeniny podľa nároku 32, kde substituenty R⁶ a X¹ tvoria dohromady zvyšok vybraný zo skupiny tvorenej substituentmi SAQAR definovanými v opise.

34. Zlúčeniny podľa nároku 32, kde zlúčenina na báze

5- azachinoxalínu je vybraná zo skupiny tvorenej zlúčeninami SAQAR definovanými v opise.

Γ β

35. Farmaceutická kompozícia, vyznačujúca sa tým, že obsahuje 5-azachinoxalínovú zlúčeninu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 26 až 33 alebo jej soľ a fyziologicky prijateľný nosič alebo riedidlo.

36. Spôsob výroby zlúčeniny na báze 5-azachinoxalínu podľa nároku 27,vyznačujúci sa tým, že zahŕňa nasledovné stupne:

a) reakciu prvého reaktantu s druhým reaktantom v rozpúšťadle a v prítomnosti zásady, kde prvým reaktantom je 2-amino-6-chlór-3-nitropyridín a druhým reaktantom je alkohol alebo amín, za vzniku prvého medziproduktu;

b) reakciu prvého medziproduktu s tretím reaktantom v prítomnosti katalyzátora a redukčného činidla, kde tretím reaktantom je 1,2-dión; a

c) purifikáciu zlúčeniny definovanej v nároku 27.

37. Spôsob podľa nároku 36, vyznačujúci sa tým, že druhý reaktant je vybraný zo skupiny tvorenej reaktantmi SAQAR definovanými v opise.

38. Spôsob podľa nároku 36, vyznačujúci sa tým, že tretí reaktant je vybraný zo skupiny tvorenej 4-hydroxyfenylglyoxálom, 1-fenyl-l,2-propándiónom a benzilom.

39. Spôsob podľa nároku 36, vyznačuj úci tým, že ako redukčné činidlo sa použije vodík.

40. Spôsob podľa nároku 36, vyznačujúci tým, že ako katalyzátor sa použije Raneyho nikel.