PL192039B1

PL192039B1 - Związek oparty na 5-azachinoksalinie, środek farmaceutyczny zawierający ten związek oraz zastosowanie tego związku

Info

Publication number: PL192039B1
Application number: PL339860A
Authority: PL
Inventors: Gerald Mcmahon; Bernhard Kutscher; Eckhard Gunther; Harald App
Original assignee: Zentaris Gmbh
Priority date: 1997-10-06
Filing date: 1998-10-05
Publication date: 2006-08-31
Also published as: IL135103A; MXPA03011007A; ES2268791T3; WO1999017759A2; PT1028729E; AR013542A1; HK1031836A1; CA2306257A1; CA2306257C; ZA988961B; NO20001748D0; SK4722000A3; US6727252B1; KR100633270B1; TR200000906T2; RU2223753C2; EP1028729A2; DE69835612T2; IL135103A0; ATE336250T1

Abstract

1. Zwiazek oparty na 5-azachinoksalinie, o strukturze okreslonej wzorem I: w którym (a) R 1, R 2 sa niezaleznie wybrane z grupy obejmujacej atom wodoru, metyl, fenyl oraz 4-hydroksyfenyl (b) R 3 i R 4 sa atomem wodoru a (c) R 6 i X 1 tworza razem grupe wybrana zgrupy obejmujacej grupy metoksy, benzyloamino, 4-fluorobenzyloamino, 2-karboksybenzyloamino, 3-karboksybenzyloamino, 4-karboksybenzyloamino, 2-nitro- benzyloamino, 3-nitrobenzyloamino, 4-nitrobenzyloamino, 2-metylobenzyloamino, 3-metylobenzyloamino, 4-me- tylobenzyloamino, 2-chlorobenzyloamino, 3-chlorobenzyloamino, 4-chlorobenzyloamino, 2-fluorobenzyloamino, 3-flu- orobenzyloamino, 4-fluorobenzyloamino, 2-(trifluorometylo)benzyloamino, 3-(trifluorometylo)benzyloamino, 4-(tri- fluorometylo)benzyloamino, fenetyl-1-amino-fenyloamino, 2-karboksyfenyloamino, 3-karboksyfenyloamino, 4-kar- boksyfenyloamino, 2-nitrofenyloamino, 3-nitrofenyloamino, 4-nitrofenyloamino, 2-metylofenyloamino, 3-me- tylofenyloamino, 4-metylofenyloamino, 2-chlorofenyloamino, 3-chlorofenyloamino, 4-chlorofenyloamino, 2-flu- orofenyloamino, 3-fluorofenyloamino, 4-fluorofenyloamino, 2-(trifluorometylo)fenyloamino, 3-(trifluorometylo)- fenyloamino, 4-(trifluorometylo)fenyloamino, pirydo-2-amino, pirydo-3-amino, pirydo-4-amino i pirydo-2-metyloamino. 5. Zastosowanie zwiazku opartego na 5-azachinoksalinie okreslonego w zastrz. 1 do badania in vitro modu- lacji funkcji serynowo/treoninozwej kinazy bialkowej. 7. Zastosowanie zwiazku opartego na 5-azachinoksalinie okreslonego w zastrz. 1 do wytwarzania leku do leczenia raka lub zaburzenia zwlóknienia. PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest związek oparty na 5-azachinoksalinie, środek farmaceutyczny zawierający ten związek oraz zastosowanie tego związku.

Przekazywanie sygnału w komórce jest podstawowym mechanizmem wiążącym zewnętrzne bodźce regulujące różne procesy komórkowe z wnętrzem komórki. Jednym z kluczowych biochemicznych mechanizmów przekazywania sygnału jest odwracalna fosforylacja białek umożliwiająca regulację aktywności dojrzałych białek przez zmianę ich struktury i działania.

Najlepiej scharakteryzowane eukariotyczne kinazy białkowe fosforylują grupy alkoholowe seryny, treoniny i tyrozyny białek. Kinazy te przeważnie dzieli się na dwie grupy z których kinazy należące do pierwszej grupy specyficznie fosforylują reszty seryny i treoniny, a należące do drugiej specyficznie fosforylują tyrozynę. Niektóre kinazy, określane mianem kinaz „o podwójnej aktywności”, fosforylują tyrozynę oraz serynę/treoninę.

Kinazy białkowe można także scharakteryzować przez ich umiejscowienie w komórce. Niektóre kinazy są transbłonowymi białkami receptorowymi wiążącymi ligandy na zewnątrz błony komórkowej. Związanie ligandu zmienia aktywność katalityczną receptorowej kinazy białkowej. Inne kinazy są białkami niereceptorowymi nie posiadającymi domeny transbłonowej. Niereceptorowe kinazy białkowe można znaleźć w różnych przedziałach komórkowych od wewnętrznej strony błony komórkowej do jądra.

Wiele kinaz uczestniczy w kaskadach regulacyjnych, gdzie ich substratami mogą być inne kinazy, których aktywność jest regulowana przez ich stan ufosforylowania. Ostatecznie aktywność docelowego efektora jest modulowana przez fosoforylację wynikającą z aktywacji takiej ścieżki.

Rodzina kinaz serynowo/treoninowych obejmuje białka regulujące wiele etapów kaskad sygnałowych, włącznie z kaskadami regulującymi wzrost komórki, migrację, różnicowanie, ekspresję genów, skurcz mięśnia, metabolizm glukozy, syntezę białek komórkowych oraz regulację cyklu komórkowego.

Przykładem niereceptorowej kinazy białkowej docelowo fosforylującej reszty seryny i treoniny białek jest RAF. RAF moduluje aktywność katalityczną innych kinaz białkowych, takich jak kinaza białkowa fosforylująca i tym samym aktywująca kinazę aktywowaną mitogenem (MAPK). Samą RAF jest aktywowana przez zakotwiczone w błonie białko RAS, które z kolei jest aktywowane w odpowiedzi na aktywowane ligandem receptorowe tyrozynowe kinazy białkowe, takie jak receptor nabłonkowego czynnika wzrostu (EGFR) oraz receptor pochodzącego z płytek czynnika wzrostu (PDGFR). Biologiczne znaczenie RAF w regulowaniu działania komórki podkreśla odkrycie, że zmienione formy RAF mogą powodować raka. Dowody na znaczenie RAF w złośliwości przedstawiono w artykule Monia i inni, 1996, Nature Medicine 2: 668 przytoczonym tutaj w całości jako pozycja literaturowa włącznie ze wszystkimi zawartymi tam rysunkami i tabelami.

W celu wynalezienia nowych metod leczenia raka i innych chorób, wynalazcy biomedyczni i chemicy zaprojektowali, zsyntetyzowali i przebadali cząsteczki hamujące działanie kinaz białkowych. Niektóre małe cząsteczki organiczne tworzą klasę związków modulujących działanie kinaz białkowych. Przykładami cząsteczek co do których stwierdzono, że hamują działanie kinaz białkowych są bis monocykliczne, bicykliczne lub heterocykliczne związki arylowe (PCT WO 92/20642), pochodne winylenoazaindolu (PCT WO 94/14808), 1-cyklopropylo-4-pirydylochinolony (patent USA nr 5330992), związki styrylowe (Levitzki i inni, patent USA nr 5217999 zatytułowany „Styryl Compounds which Inhibit EGF receptor Protein Tyrosine Kinase”, Lyon & Lyon numer rejestracyjny 208/050), styrylopodstawione związki pirydylowe (patent USA nr 5302606), pewne pochodne chinazoliny (zgłoszenie EP nr 0566266 A1), selenoindole i selenidy (PCT WO 94/03427), tricykliczne związki polihydroksylowe (PCT WO 92/21660) oraz pochodne kwasu benzylofosforylowego (PCT WO 91/15495).

Potencjalnie korzystnymi lekami są związki, które mogą przechodzić przez błony komórkowe isą odporne na hydrolizę kwasową, ze względu na to, że mogą się one stać szeroko biodostępne po doustnym podaniu pacjentom. Jednakże, wiele z tych inhibitorów kinaz białkowych tylko w niewielkim stopniu hamuje działanie kinaz białkowych. Ponadto, wiele znich hamuje różne kinazy białkowe, a zatem może wywołać w leczeniu chorób wiele różnych skutków ubocznych.

Pomimo znaczącego postępu w wykrywaniu związków do leczenia raka nadal istnieje potrzeba zidentyfikowania konkretnych struktur i układów podstawienia tworzących związki potrafiące modulować działanie konkretnych kinaz białkowych.

Wynalazek dotyczy związku opartego na 5-azachinoksalinie, o strukturze określonej wzorem I:

PL 192 039 B1

w którym (a) R1, R2 są niezależnie wybrane z grupy obejmującej atom wodoru, metyl, fenyl oraz 4-hydroksyfenyl (b) R3 i R4 są atomem wodoru a (c) R6 i X1 tworzą razem grupę wybraną z grupy obejmującej grupy metoksy, benzyloamino, 4-fluorobenzyloamino, 2-karboksybenzyloamino, 3-karboksybenzyloamino, 4-karboksybenzyloamino,

2-nitrobenzyloamino, 3-nitrobenzyloamino, 4-nitrobenzyloamino, 2-metylobenzyloamino, 3-metylobenzyloamino, 4-metylobenzyloamino, 2-chlorobenzyloamino, 3-chlorobenzyloamino, 4-chlorobenzyloamino, 2-fluorobenzyloamino, 3-fluorobenzyloamino, 4-fluorobenzyloamino, 2-(trifluorometylo)benzyloamino, 3-(trifluorometylo)benzyloamino, 4-(trifluorometylo)benzyloamino, fenetyl-1-amino, fenyloamino, 2-karboksyfenyloamino, 3-karboksyfenyloamino, 4-karboksyfenyloamino, 2-nitrofenyloamino, 3-nitrofenyloamino, 4-nitrofenyloamino, 2-metylofenyloamino, 3-metylofenyloamino, 4-metylofenyloamino, 2-chlorofenyloamino, 3-chlorofenyloamino, 4-chlorofenyloamino, 2-fluorofenyloamino,

3-fluorofenyloamino, 4-fluorofenyloamino, 2-(trifluorometylo)fenyloamino, 3-(trifluorometylo)fenyloamino, 4-(trifluorometylo)fenyloamino, pirydo-2-amino, pirydo-3-amino, pirydo-4-amino i pirydo-2-metyloamino

Korzystnie, R1, R2, R3 oraz R4 są atomami wodoru.

Korzystnie, X1 oznacza atom azotu.

W innym aspekcie, wynalazek dotyczy środka farmaceutycznego zawierającego związek oparty na 5-azachinoksalinie o strukturze określonej wzorem I lub jego sól i fizjologicznie dopuszczalny nośnik lub rozcieńczalnik.

W innym aspekcie wynalazek, dotyczy zastosowanie związku opartego na 5-azachinoksalinie o strukturze określonej wzorem I do badania in vitro modulacji funkcji serynowo/treoninozwej kinazy białkowej.

Korzystnie, serynowo/treoninową kinazą białkową jest kinaza RAF.

Kolejny aspekt wynalazku, dotyczy zastosowania związku opartego na 5-azachinoksalinie o strukturze określonej wzorem I do wytwarzania leku do leczenia raka lub zaburzenia zwłóknienia.

Korzystnie, lek służy do leczenia raka wybranego z grupy obejmującej rak płuca, rak jajnika, rak piersi, rak mózgu, wewnątrzosiowy rak mózgu, rak okrężnicy, rak gruczołu krokowego, mięsak, mięsak Kaposiego, czerniak oraz glejak.

Korzystnie, lek służy do leczenia stanów związanych zaburzeniami na drodze przekazywania sygnału, charakteryzujących się występowaniem oddziaływania serynowo-treoninowej kinazy białkowej z naturalnie wiązaną do niej cząsteczką, gdzie stanem tym jest rak, w szczególności rak płuca, rak jajnika, rak piersi, rak mózgu, wewnątrzosiowy rak mózgu, rak okrężnicy, rak gruczołu krokowego, mięsak, mięsak Kaposiego, czerniak oraz glejak.

Korzystnie, serynowo/treoninową kinazą białkową jest kinaza RAF.

Użyte wcześniej określenie „nasycony alkil” odnosi się do grupy alkilowej, która nie zawiera jakichkolwiek grup alkenowych lub alkinowych. Grupa alkilowa może być rozgałęziona lub nierozgałęziona.

Określenie „nienasycony alkil” odnosi się do grupy alkilowej, która zawiera co najmniej jedną grupę alkenową lub alkinową. Grupa alkilowa może być rozgałęziona lub nierozgałęziona.

Określenie „grupa aminowa” odnosi się do grupy chemicznej o wzorze NR1R2, w którym R1 i R2 są niezależnie wybrane z grupy obejmującej atom wodoru, nasycony i nienasycony alkil oraz pięcioczłonowy lub sześcioczłonowy pierścień arylowy lub heteroarylowy, który to pierścień jest ewentualnie podstawiony jednym lub większą liczbą podstawników niezależnie wybranych z grupy obejmującej alkil, atom chlorowca, trichlorowcometyl, grupę karboksylanową, grupę nitrową i grupę estrową.

Określenie „aryl” odnosi się do grupy aromatycznej, która zawiera co najmniej jeden pierścień ze sprzężonym układem elektronów p i obejmuje zarówno karbocykliczne grupy arylowe (np. fenyl) i heterocykliczne grupy arylowe (np. pirydynę). Określenie „karbocykliczny” odnosi się do związku,

PL 192 039 B1 który zawiera jeden lub większą liczbę kowalencyjnie połączonych struktur pierścieniowych, przy czym wszystkie atomy tworzące szkielet pierścienia stanowią atomy węgla. Określenie to odróżnia pierścienie karbocykliczne od heterocyklicznych, których szkielet zawiera co najmniej jeden atom różniący się od atomu węgla. Określenie „heteroaryl” odnosi się do grupy arylowej, która zawiera co najmniej jeden pierścień heterocykliczny.

Określenie „atom chlorowca” odnosi się do atomu wybranego z grupy obejmującej atom fluoru, chloru, bromu i jodu.

Określenie „grupa ketonowa” odnosi się do grupy chemicznej o wzorze -(R)n-CO-R', w którym R i R' są wybrane z grupy obejmującej nasycony i nienasycony alkil oraz pięcioczłonowy lub sześcioczłonowy pierścień arylowy lub heteroarylowy, oraz n oznacza 0 lub 1.

Określenie „grupa kwasu karboksylowego” odnosi się do grupy chemicznej o wzorze -(R)n-COOH, w której R jest wybrany z grupy obejmującej nasycony i nienasycony alkil oraz pięcioczłonowy lub sześcioczłonowy pierścień arylowy lub heteroarylowy, oraz n oznacza 0lub 1.

Określenie „grupa estrowa” odnosi się do grupy chemicznej o wzorze -(R)n-COOR', w którym R i R' są niezależnie wybrane z grupy obejmującej nasycony i nienasycony alkil oraz pięcioczłonowy lub sześcioczłonowy pierścień arylowy lub heteroarylowy i gdzie n oznacza 0lub 1.

Określenie „grupa alkoholowa odnosi się do podstawnika chemicznego o wzorze -ROH, wktórym R jest wybrany z grupy obejmującej atom wodoru, nasycony i nienasycony alkil oraz pięcioczłonowy lub sześcioczłonowy pierścień arylowy lub heteroarylowy, która to grupa pierścieniowa jest ewentualnie podstawiona jednym lub większą liczbą podstawników niezależnie wybranych z grupy obejmującej alkil, atom chlorowca, trichlorowcometyl, grupę karboksylanową, grupę nitrową i grupę estrową.

Określenie „grupa amidowa” odnosi się do podstawnika chemicznego o wzorze -NHCOR, wktórym R jest wybrany z grupy obejmującej atom wodoru, alkil, hydroksyl oraz pięcioczłonowy lub sześcioczłonowy pierścień arylowy lub heteroarylowy, który to pierścień jest ewentualnie podstawiony jednym lub większą liczbą podstawników niezależnie wybranych z grupy obejmującej alkil, atom chlorowca, trichlorowcometyl, grupę karboksylanową, grupę nitrową i grupę estrową.

Określenie „alkoksyl” odnosi się do podstawnika chemicznego o wzorze -OR, w którym R oznacza atom wodoru lub nasycony albo nienasycony alkil.

Określenie „grupa aldehydowa” odnosi się do grupy chemicznej o wzorze -(R)n-CHO, w którym R jest wybrany z grupy obejmującej nasycony i nienasycony alkil oraz pięcioczłonowy lub sześcioczłonowy pierścień arylowy lub heteroarylowy, oraz n oznacza 0lub 1.

Określenie „grupa sulfonowa” odnosi się do grupy chemicznej o wzorze -SO2-R, w którym R jest wybrany z grupy obejmującej nasycony i nienasycony alkil oraz pięcioczłonowy lub sześcioczłonowy pierścień arylowy lub heteroarylowy.

Określenie „grupa benzyloamino” odnosi się do grupy o strukturze przedstawionej następującym wzorem:

w której pierścień arylowy może być ewentualnie podstawiony w pozycji 2,3lub4.

Określenie „grupa fenyloamino” odnosi się do grupy o strukturze przedstawionej następującym wzorem:

Określenie „grupa fenetylo-1-amino” odnosi się do grupy o strukturze przedstawionej następującym wzorem:

PL 192 039 B1

Określenie „grupa piryd-2-amino” odnosi się do pierścienia pirydyny, który jest podstawiony grupą NH w pozycji 2. Podobnie określenia „grupa piryd-3-amino” i „grupa piryd-4-amino” odnoszą się do pierścienia pirydyny, który jest podstawiony grupą NH odpowiednio w pozycji 3i 4.

Określenie „środek farmaceutyczny” dotyczy mieszaniny związku opartego na 5-azachinoksalinie, według wynalazku, z innymi składnikami chemicznymi, takimi jak rozcieńczalniki lub nośniki. Środek farmaceutyczny ułatwia podawanie związku do organizmu. Znanych jest wiele sposobów podawania związku, obejmujących, ale nie wyłącznie, podawanie doustne, przez iniekcję, wpostaci aerozolu, pozajelitowo i miejscowo. Środki farmaceutyczne można również otrzymać przez poddanie związków reakcji z kwasami nieorganicznymi, takimi jak chlorowodorowy, kwas bromowodorowy, kwas siarkowy, kwas azotowy, kwas fosforowy, kwas metanosulfonowy, kwas etanosulfonowy, kwas p-toluenosulfonowy, kwas salicylowy itp.

Określenie „fizjologicznie dopuszczalny” odnosi się do nośnika lub rozcieńczalnika, który nie wpływa niekorzystnie na działanie biologiczne lub właściwości związku.

Określenie „nośnik” dotyczy związku chemicznego, który ułatwia wprowadzanie związku do komórek lub tkanek. Tak np. dimetylosulfotlenek (DMSO) jest powszechnie stosowanym nośnikiem, gdyż ułatwia on wchłanianie wielu związków organicznych przez komórki lub tkanki organizmu.

Określenie „rozcieńczalnik” dotyczy związków organicznych rozcieńczalnych wodą, które będą rozpuszczać interesujący związek, a także stabilizować biologicznie czynną postać związku. Jako rozcieńczalniki powszechnie stosuje się sole rozpuszczone w buforowanych roztworach. Jednym z powszechnie stosowanych roztworów jest roztwór soli buforowany fosforanem, który imituje warunki solne w ludzkiej krwi. Z uwagi na to, że sole buforowe mogą regulować pH roztworu w niskich stężeniach, buforowany rozcieńczalnik rzadko modyfikuje działanie biologiczne związku.

I. Sposoby syntezy związku opartego na 5-azachinoksalinie, o strukturze określonej wzorem I.

Synteza związku opartego na 5-azachinoksalinie, o strukturze określonej wzorem I obejmuje następujące etapy:

(a) reakcję 2-amino-6-chloro-3-nitropirydyny z drugim reagentem w rozpuszczalniku i w obecności zasady, z wytworzeniem pierwszego produktu pośredniego, przy czym drugi reagent jest wybranyz grupy obejmującej alkohol i aminę;

(b) reakcję pierwszego produktu pośredniego z 1,2-dionem w obecności katalizatora i środka redukującego; i (c) oczyszczania związku według wynalazku.

Określenie „1,2-dion” dotyczy grupy chemicznej o wzorze R1-C(O)-C(O)-R2, w którym każdy z R1 i R2 jest niezależnie wybrany z grupy obejmującej atom wodoru; nasycony i nienasycony alkil ewentualnie podstawiony pięcioczłonowym lub sześcioczłonowym pierścieniem arylowym lub heteroarylowym, ewentualnie podstawionym jednym, dwoma lub trzema podstawnikami niezależnie wybranych z grupy obejmującej alkil, atom chlorowca, trichlorowcometyl, hydroksyl, alkoksyl, grupę karboksylanową, grupę nitrową i grupę estrową; oraz pięcioczłonowy lub sześcioczłonowy pierścień arylowy lub heteroarylowy, ewentualnie podstawiony jednym, dwoma lub trzema podstawnikami niezależnie wybranych z grupy obejmującej alkil, atom chlorowca, trichlorowcometyl, hydroksyl, alkoksyl, grupę karboksylanową, grupę nitrową i grupę estrową.

Do wytwarzania związku według wynalazku, jako rozpuszczalnik stosuje się n-butanol.

Do wytwarzania związku według wynalazku, jako zasadę stosuje się sproszkowany węglan potasu.

W procesie syntezy związku według wynalazku drugi reagent jest wybrany z grupy obejmującej benzyloaminę, 4-fluorobenzyloaminę, 2-karboksybenzyloaminę, 3-karboksybenzyloaminę, 4-karboksybenzyloaminę, 2-nitrobenzyloaminę, 3-nitrobenzyloaminę, 4-nitrobenzyloaminę, 2-metylobenzyloaminę, 3-metylobenzyloaminę, 4-metylobenzyloaminę, 2-chlorobenzyloaminę, 3-chlorobenzyloaminę,

4-chlorobenzyloaminę, 2-fluorobenzyloaminę, 3-fluorobenzyloaminę, 4-fluorobenzyloaminę, 2-(trifluorometylo)benzyloaminę, 3-(trifluorometylo)benzyloaminę, 4-(trifluorometylo)benzyloaminę, fenetylo-1-aminę, anilinę, 2-karboksyanilinę, 3-karboksynilinę, 4-karboksyanilinę, 2-nitroanilinę, 3-nitro6

PL 192 039 B1 anilinę, 4-nitroanilinę, 2-toluidynę, 3-toluidynę, 4-toluidynę, 2- chloroanilinę, 3-chloroanilinę, 4-chloroanilinę, 2-fluoroanilinę, 3-fluoroanilinę, 4-fluoroanilinę, 2-(trifluorometylo)anilinę, 3-(trifluorometylo)anilinę, 4-(trifluorometylo)anilinę, 2-aminopirydynę, 3-aminopirydynę, 4-aminopirydynę i 2-metyloaminopirydynę.

Trzeci reagent jest wybrany z grupy obejmującej 4-hydroksypenyloglioksal, 1-fenylo-1,2-propanodion i benzil.

Użyte w opisie określenie „katalizator” dotyczy cząsteczki chemicznej, która po dodaniu do grupy reagentów może zwiększyć szybkość, z jaką reagenty reagują z wytworzeniem produktu. Wiele typów katalizatorów jest znanych specjalistom.

W procesie syntezy związku według wynalazku, jako środek redukujący stosuje się wodór, a jako katalizator stosuje się nikiel Raney'a.

II. Właściwości związku według wynalazku

Związek według wynalazku moduluje działanie serynowo/treoninowych kinaz białkowych. Działanie tego związku dotyczy komórek eksprymujących kinazy serynowo/treoninowe, takie jak RAF. Ponadto, związek według wynalazku służy do zapobiegania i leczenia nienormalnych stanów związanych z serynowo/treoninowymi kinazami białkowymi występujących w organizmie.

Przy pomocy związków opartych na 5-azachinoksalinie moduluje się działanie serynowo/treoninowej kinazy białkowej. Związek oparty na 5-azachinoksalinie może być ponadto podstawiony grupami organicznymi. Wskazaną powyżej modulację osiąga się przez wystawienie komórek eksprymujących serynowo/treoninową kinazę białkową na działanie związku.

W użytym znaczeniu określenie „działanie” oznacza komórkową rolę serynowo/treoninowej kinazy białkowej. Rodzina serynowo/treoninowych kinaz białkowych obejmuje enzymy regulujące wiele etapów kaskad sygnałowych, włącznie z kaskadami regulującymi wzrost komórki, migrację, różnicowanie, ekspresję genów, skurcz mięśnia, metabolizm glukozy, syntezę białek komórkowych oraz regulację cyklu komórkowego.

W użytym znaczeniu określenie „aktywność katalityczna” określa stopień w jakim kinaza białkowa fosforyluje substrat. Aktywność katalityczną można zmierzyć, na przykład, oznaczając ilość substratu przetworzonego w produkt w funkcji czasu. Fosforylacja substratu zachodzi w miejscu aktywnym kinazy białkowej. Miejscem aktywnym jest zazwyczaj kieszeń w której substrat wiąże się z kinazą białkową i jest fosforylowany.

W użytym znaczeniu określenie „substrat” oznacza cząsteczkę fosforylowaną przez serynowo/treoninową kinazę białkową. Substrat jest korzystnie peptydem lub korzystniej białkiem. W odniesieniu do kinazy białkowej RAF, korzystnymi substratami są MEKi MEK substrat MAPK.

W użytym znaczeniu określenie „aktywuje” oznacza zwiększenie komórkowego działania kinazy białkowej. Działaniem kinazy białkowej jest korzystnie oddziaływanie z naturalnie wiązaną do niej cząsteczką oraz korzystniej aktywność katalityczna.

W użytym znaczeniu określenie „moduluje” oznacza zmianę działania kinazy białkowej przez zwiększenie lub obniżenie możliwości, że utworzy się kompleks pomiędzy kinazą białkową, a naturalnie wiązaną do niej cząsteczką. Modulator korzystnie zwiększa prawdopodobieństwo, że taki kompleks utworzy się pomiędzy kinazą białkową i naturalnie wiązaną przez nią cząsteczką, korzystniej zwiększa lub zmniejsza prawdopodobieństwo, że utworzy się kompleks pomiędzy kinazą białkową i naturalnie wiązaną przez nią cząsteczką zależnie od stężenia związku, na którego działanie wystawiono kinazę białkową, a najkorzystniej obniża prawdopodobieństwo, że utworzy się kompleks pomiędzy kinazą białkową i naturalnie wiązaną przez nią cząsteczką.

W użytym znaczeniu określenie „kompleks” oznacza złożenie przynajmniej dwóch cząsteczek związanych ze sobą nawzajem. Kompleksy przekazywania sygnału często obejmują przynajmniej dwie cząsteczki białek powiązane ze sobą. Na przykład białko receptora tyrozynowej kinazy białkowej, GRB2, SOS, RAF i RAS składają się tworząc kompleks przekazywania sygnału w odpowiedzi na ligand mitogenny.

W użytym znaczeniu określenie „naturalnie wiązana cząsteczka” oznacza polipeptydy wiążące się w komórkach z kinazą białkową. Naturalnie wiązane cząsteczki mogą odgrywać rolę w rozprzestrzenianiu się sygnału w procesach przekazywania sygnału przez kinazy białkowe. Zmiana oddziaływania pomiędzy kinazą białkową a naturalnie wiązaną przez nią cząsteczką może ujawnić się sama w sobie przez zwiększenie lub zmniejszenie prawdopodobieństwa, że wytworzy się to oddziaływanie lub zwiększenie lub zmniejszenie stężenia kompleksu kinaza białkowa/naturalnie wiązana cząsteczka.

PL 192 039 B1

Cząsteczka naturalnie wiązana przez kinazę białkową może związać się z wewnątrzkomórkowym regionem kinazy białkowej o wysokim powinowactwie. Wysokie powinowactwo odpowiada stałej równowagi wiązania rzędu 10^-6 M lub mniejszej. Ponadto naturalnie wiązana cząsteczka może także przejściowo oddziaływać z wewnątrzkomórkowym regionem kinazy białkowej i modyfikować go chemicznie. Naturalnie wiązane cząsteczki można wybrać z grupy obejmującej, ale nie tylko, domeny homologii SRC 2 (SH2) lub 3 (SH3), inne domeny wiążące ufosforylowaną tyrozynę (PTB), czynniki wymieniające nukleotydy guaninowe, fosfatazy białkowe oraz inne kinazy białkowe. Sposoby oznaczania zmian w oddziaływaniach pomiędzy kinazami białkowymi, a cząsteczkami naturalnie przez nie wiązanymi są łatwo dostępne.

W użytym znaczeniu określenie „serynowo/treoninowa kinaza białkowa” oznacza enzym o sekwencji aminokwasowej przynajmniej w10% identycznej z innymi enzymami fosforylującymi reszty seryny i treoniny białek. Serynowo/treoninowa kinaza białkowa katalizuje dodanie fosforanu do reszty seryny lub treoniny białka. Serynowo/treoninowe kinazy białkowe mogą występować jako białka związane z błoną lub cytozolowe.

W użytym znaczeniu określenie „wystawienie na działanie” oznacza zmieszanie roztworu zawierającego związek oparty na 5-azachinoksalinie według wynalazku z płynną pożywką zawierającą komórki stosowane w badaniach. Roztwór zawierający związek może także zawierać inne składniki, takie jak dimetylosulfotlenek (DMSO), służące do wychwytu związku lub związków opartych na 5-azachinoksalinie w komórkach stosowanych w badaniach. Roztwór zawierający związek oparty na

5-azachinoksalinie można dodać do pożywki z komórkami przy użyciu aparatu dostarczającego, takiego jak urządzenie typu pipety lub urządzenie typu strzykawki.

W użytym znaczeniu określenie „związek oparty na 5-azachinoksalinie” oznacza 5-azachinoksalinowy związek organiczny podstawiony podstawnikami chemicznymi. 5-Azachinoksaliny mają następującą strukturę ogólną:

W użytym znaczeniu określenie „podstawiony”, w odniesieniu do wynalazku, oznacza związek oparty na 5-azochinoksalinie podstawiony dowolną liczbą podstawników chemicznych.

W opisanym powyżej sposobie modulowania działania serynowo/treoninowych kinaz białkowych, kinazę białkową stanowi RAF.

Kinaza białkowa RAF fosforyluje reszty seryny lub treoniny docelowych białek. Jednym z takich białek docelowych jest kinaza białkowa (MEK) fosforylująca i w konsekwencji aktywująca kinazę białkową aktywowaną mitogenem (MAPK). RAF sama w sobie jest aktywowana przez związany z błoną enzym RAS hydrolizujący trifosforan guaniny w odpowiedzi na stymulowane mitogenem białka receptorowe kinaz tyrozynowych, takie jak receptor nabłonkowego czynnika wzrostu (EGFR) oraz receptor pochodzącego z płytek czynnika wzrostu (PDGFR).

III. Sposoby wyszukiwania związków modulujących działanie serynowo/treoninowych kinaz białkowych.

RAF fosforyluje kinazę białkową (MEK), która z kolei fosforyluje aktywowaną mitogenem kinazę białkową (MAPK). Testy monitorujące tylko fosforylację MEK przez RAF nie są czułe, ponieważ poziom fosforylacji MEK nie jest znaczący. Aby ominąć problem związany z czułością śledzi się poziom fosforylacji zarówno MEK, jak i MAPK. Sygnał fosforylacji MAPK wzmacnia sygnał fosforylacji MEK i pozwala śledzić fosforylację zależną od RAF w testach typu enzymatycznego testu immunoadsorbcyjnego. Ponadto test według wynalazku przeprowadza się w sposób wysokosprawny, tak że wiele związków może być natychmiastowo monitorowanych w krótkim okresie czasu.

Sposób identyfikowania związków modulujących działanie serynowo/treoninowej kinazy białkowej obejmuje etapy wystawienia komórek eksprymujących serynowo/treoninową kinazę białkową na działanie związku i monitorowania skutków wywołanych w komórkach.

W użytym znaczeniu określenie „monitorowanie” oznacza obserwację skutków dodania związku do komórek, przy użyciu metod wskazanych w niniejszym zgłoszeniu. Skutek może ujawnić się w zmianie fenotypu komórki, proliferacji komórki, aktywności katalitycznej kinazy białkowej lub oddziaływania pomiędzy kinazą białkową a naturalnie wiązaną do niej cząsteczką.

PL 192 039 B1

W użytym znaczeniu określenie „skutek” opisuje zmianę lub brak zmiany w fenotypie lub proliferacji komórki. „Skutek” może także opisywać zmianę lub brak zmiany w katalitycznej aktywności kinazy białkowej. „Skutek” może także opisywać zmianę lub brak zmiany oddziaływania pomiędzy kinazą białkową a naturalnie wiązaną przez nią cząsteczką.

W przypadku identyfikacji związków modulujących działanie serynowo/treoninowej kinazy białkowej, skutkiem jest zmiana lub brak zmiany w fenotypie komórki.

W użytym znaczeniu określenie „fenotyp komórki” dotyczy zewnętrznego wyglądu komórki lub tkanki lub działania komórki lub tkanki. Przykładami fenotypu komórki są rozmiar komórki (zmniejszenie lub zwiększenie), proliferacja komórki (zwiększona lub zmniejszona liczba komórek), różnicowanie komórki (zmiana lub brak zmiany w kształcie komórki), przeżycie komórki, apoptoza (śmierć komórki) lub użytkowanie metabolicznego środka odżywczego (np. wychwytu glukozy). Zmiany lub brak zmian w fenotypie komórki można łatwo zmierzyć znanymi technikami.

Ponadto, w przypadku identyfikacji związków modulujących działanie serynowo/treoninowej kinazy białkowej, skutkiem jest zmiana lub brak zmiany w proliferacji komórki.

W użytym znaczeniu określenie „proliferacja komórki” oznacza tempo w jakim grupa komórek ulega podziałom. Liczbę komórek rosnących w naczyniu może oznaczyć fachowiec licząc komórki w określonej objętości pod mikroskopem świetlnym. Ponadto tempo proliferacji komórek można oznaczyć przy pomocy urządzeń laboratoryjnych mierzących gęstość komórek w odpowiedniej pożywce optycznie lub przez pomiar przewodnictwa.

Innym sposobem identyfikacji związków modulujących działanie serynowo/treoninowej kinazy białkowej, jest stwierdzenie zmiany lub braku zmiany oddziaływania pomiędzy serynowo/treoninową kinazą białkową a naturalnie wiązaną przez nią cząsteczką.

W użytym znaczeniu określenie „oddziaływanie” oznacza kompleks tworzony pomiędzy wewnątrzkomórkowym regionem kinazy białkowej a naturalnie wiązaną przez niego cząsteczką lub związkiem. Termin „oddziaływanie” można także rozszerzyć do kompleksu tworzonego pomiędzy związkiem według wynalazku a wewnątrzkomórkowymi lub zewnątrzkomórkowymi regionami badanej kinazy białkowej. Chociaż cytozolowa kinaza białkowa nie będzie posiadać regionu zewnątrzkomórkowego, to receptorowa kinaza białkowa będzie posiadać zarówno region zewnątrzkomórkowy jak i wewnątrzkomórkowy.

W użytym znaczeniu określenie „region wewnątrzkomórkowy” odnosi się do części kinazy białkowej występującej wewnątrz komórki. W użytym znaczeniu określenie „region zewnątrzkomórkowy” oznacza część kinazy białkowej występujący na zewnątrz komórki.

Ponadto identyfikację związków modulujących działanie serynowo/treoninowej kinazy białkowej można przeprowadzić w sposób obejmujący następujące etapy: (a) zlizowanie komórek wcelu uzyskania lizatu zawierającego serynowo/treoninową kinazę białkową; (b) adsorbcję serynowo/treoninowej kinazy białkowej do przeciwciała; (c) inkubację zaadsorbowanej serynowo/treoninowej kinazy białkowej z substratem lub substratami; oraz (d) adsorbcję substratu lub substratów do stałego złoża lub przeciwciała. Etap monitorowania skutków wywartych na komórkach obejmuje pomiar stężenia fosforanów substratu lub substratów.

W użytym znaczeniu określenie „zlizowanie” oznacza metodę rozbicia całości komórki, tak że zostaje uwolnione jej wnętrze. Lizę komórki można przeprowadzić różnymi metodami znanymi fachowcom. Korzystnie można to przeprowadzić technikami rozbijania komórek ultradźwiękami lub pod wpływem sił ścinających oraz, korzystniej, przy pomocy detergentów.

W użytym znaczeniu określenie „przeciwciało” oznacza cząsteczkę białka specyficznie wiążącą kinazę białkową. Przeciwciało korzystnie wiąże jedną klasę kinaz białkowych oraz korzystniej specyficznie wiąże kinazę białkową RAF.

W użytym znaczeniu określenie „specyficznie wiąże” odnosi się do przeciwciała wiążącego kinazę białkową z powinowactwem wyższym niż inną kinazę białkową lub białko komórkowe. Przeciwciało specyficznie wiążące kinazę białkową wiąże stężenie specyficznej kinazy białkowej wyższe niż innej kinazy białkowej lub białka komórkowego.

W użytym znaczeniu określenie „adsorpcja” oznacza związanie cząsteczki na powierzchni przeciwciała lub stałego podłoża. Przykładami stałych podłóż są modyfikowana chemicznie celuloza, taka jak fosfoceluloza, oraz nylon. Przeciwciała mogą być przyłączone do stałych podłóż technikami dobrze znanymi fachowcom. Patrz, np. Harlo i Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, 1989, Cold Spring Harbor Laboratories.

PL 192 039 B1

W użytym znaczeniu określenie „pomiar stężenia fosforanów” oznacza techniki powszechnie znane fachowcom. Pomiary te mogą obejmować ilościowe oznaczenie stężeń fosforanów w substracie lub wyznaczenie względnego stosunku ilości fosforanów w substracie. Techniki te mogą obejmować adsorbcję substratu do błon i wyznaczenie ilości fosforanów w substracie przez pomiary radioaktywności.

Identyfikację związków modulujących działanie serynowo/treoninowej kinazy białkowej można przeprowadzić także sposobem obejmującym następujące etapy: (a) zlizowanie komórek w celu uzyskania lizatu zawierającego RAF; (b) adsorbcję RAF do przeciwciała; (c) inkubację zaadsorbowanego RAF z MEK i MAPK; oraz (d) adsorbcję MEK i MAPK do stałego podłoża lub przeciwciała lub przeciwciał. Etap pomiaru skutków wywartych na komórkach obejmuje monitorowanie stężeń fosforanów wymienionych MEK i MAPK.

Przy użyciu opisanego powyżej sposobu zidentyfikowano związek oparty na 5-azachinoksalinie określony jest wzorem I, lub związki stanowiące dowolną z jego podgrup wymienionych w opisie.

Określenie „związek” dotyczy związku lub jego farmaceutycznie dopuszczalnej soli, estru, amidu, proleku, izomeru lub metabolitu.

Określenie „farmaceutycznie dopuszczalne sole” dotyczy postaci związku, która nie wpływa niekorzystnie na działanie biologiczne lub właściwości związku. Sole farmaceutyczne można otrzymać przez poddanie związku według wynalazku reakcji z kwasami nieorganicznymi lub organicznymi, takimi jak kwas chlorowodorowy, kwas bromowodorowy, kwas siarkowy, kwas azotowy, kwas fosforowy, kwas metanosulfonowy, kwas etanosulfonowy, kwas p-toluenosulfonowy, kwas salicylowy itp.

Określenie „prolek” odnosi się do środka, który przekształca się in vivo wlek macierzysty. W pewnych sytuacjach proleki mogą być łatwiejsze do podawania niż lek macierzysty. Tak np. w przeciwieństwie do związku macierzystego prolek może być biodostępny po podaniu doustnym, albo też prolek może wykazywać lepszą rozpuszczalność, umożliwiającą podawanie dożylne.

Ponadto przy użyciu opisanego powyżej sposobu zidentyfikowano, związki oparte na 5-azachinoksalinie określone wzorem I, wybrane z grupy obejmującej związki SAQAR.

Określenie „związki SAQAR odnosi się do grupy związków opartych na 5-azachinoksalinie o budowie określonej wzorem I, o numerach od A-1do A-90 w poniższej tabeli:

R₆

Związek nr	R2	R1	R6X1
1	2	3	4
A-1	H	4-hydroksyfenyl	Fenyloamino
A-2	H	4-hydroksyfenyl	Benzyloamino
A-5	metyl	fenyl	4-fluorobenzyloamino
A-6	fenyl	fenyl	4-fluorobenzyloamino
A-7	H	fenyl	fenyloamino
A-8	H	4-hydroksyfenyl	2-karboksybenzyloamino
A-9	H	4-hydroksyfenyl	3-karboksybenzyloamino
A-10	H	4-hydroksyfenyl	4-karboksybenzyloamino
A-11	H	4-hydroksyfenyl	2-nitrobenzyloamino
A-12	H	4-hydroksyfenyl	3-nitrobenzyloamino

PL 192 039 B1 cd. tabeli

1	2	3	4
A-13	H	4-hydroksyfenyl	4-nitrobenzyloamino
A-14	H	4-hydroksyfenyl	2-metylobenzyloamino
A-15	H	4-hydroksyfenyl	3-metylobenzyloamino
A-16	H	4-hydroksyfenyl	4-metylobenzyloamino
A-17	H	4-hydroksyfenyl	2-chlorobenzyloamino
A-18	H	4-hydroksyfenyl	3-chlorobenzyloamino
A-19	H	4-hydroksyfenyl	4-chlorobenzyloamino
A-20	H	4-hydroksyfenyl	2-fluorobenzyloamino
A-21	H	4-hydroksyfenyl	3-fluorobenzyloamino
A-22	H	4-hydroksyfenyl	4-fluorobenzyloamino
A-23	H	4-hydroksyfenyl	2-(trifluorometylo)benzyloamino
A-24	H	4-hydroksyfenyl	3-(trifluorometylo)benzyloamino
A-25	H	4-hydroksyfenyl	4-(trifluorometylo)benzyloamino
A-26	H	4-hydroksyfenyl	fenetylo-1-amino
A-27	H	4-hydroksyfenyl	2-karboksyfenyloamino
A-28	H	4-hydroksyfenyl	3-karboksyfenyloamino
A-29	H	4-hydroksyfenyl	4-karboksyfenyloamino
A-30	H	4-hydroksyfenyl	2-nitrofenyloamino
A-31	H	4-hydroksyfenyl	3-nitrofenyloamino
A-32	H	4-hydroksyfenyl	4-nitrofenyloamino
A-33	H	4-hydroksyfenyl	2-metylofenyloamino
A-34	H	4-hydroksyfenyl	3-metylofenyloamino
A-35	H	4-hydroksyfenyl	4-metylofenyloamino
A-36	H	4-hydroksyfenyl	2-chlorofenyloamino
A-37	H	4-hydroksyfenyl	3-chlorofenyloamino
A-38	H	4-hydroksyfenyl	4-chlorofenyloamino
A-39	H	4-hydroksyfenyl	2-fluorofenyloamino
A-40	H	4-hydroksyfenyl	3-fluorofenyloamino
A-41	H	4-hydroksyfenyl	4-fluorofenyloamino
A-42	H	4-hydroksyfenyl	2-(trifluoromety(trifluorometylo)fenyloamino
A-43	H	4-hydroksyfenyl	3-(trifluorometylo)fenyloamino
A-44	H	4-hydroksyfenyl	4-(trifluorometylo)fenyloamino
A-45	H	4-hydroksyfenyl	piryd-2-amino

PL 192 039 B1 cd. tabeli

1	2	3	4
A-46	H	4-hydroksyfenyl	piryd-3-amino
A-47	H	4-hydroksyfenyl	piryd-4-amino
A-48	H	4-hydroksyfenyl	Pirydo-2-metyloamino
A-49	H	fenyl	2-karboksybenzyloamino
A-50	H	fenyl	3-karboksybenzyloamino
A-51	H	fenyl	4-karboksybenzyloamino
A-52	H	fenyl	2-nitrobenzyloamino
A-53	H	fenyl	3-nitrobenzyloamino
A-54	H	fenyl	4-nitrobenzyloamino
A-55	H	fenyl	2-metylobenzyloamino
A-56	H	fenyl	3-metylobenzyloamino
A-57	H	fenyl	4-metylobenzyloamino
A-58	H	fenyl	2-chlorobenzyloamino
A-59	H	fenyl	3-chlorobenzyloamino
A-60	H	fenyl	4-chlorobenzyloamino
A-61	H	fenyl	2-fluorobenzyloamino
A-62	H	fenyl	3-fluorobenzyloamino
A-63	H	fenyl	4-fluorobenzyloamino
A-64	H	fenyl	2-(trifluorometylo)benzyloamino
A-65	H	fenyl	3-(trifluorometylo)benzyloamino
A-66	H	fenyl	4-(trifluorometylo)benzyloamino
A-67	H	fenyl	Fenetylo-1-amino
A-68	H	fenyl	2-karboksyfenyloamino
A-69	H	fenyl	3-karboksyfenyloamino
A-70	H	fenyl	4-karboksyfenyloamino
A-71	H	fenyl	2-nitrofenyloamino
A-72	H	fenyl	3-nitrofenyloamino
A-73	H	fenyl	4-nitrofenyloamino
A-74	H	fenyl	2-metylofenyloamino
A-75	H	fenyl	3-metylofenyloamino
A-76	H	fenyl	4-metylofenyloamino
A-77	H	fenyl	2-chlorofenyloamino
A-78	H	fenyl	3-chlorofenyloamino

PL 192 039 B1 cd. tabeli

1	2	3	4
A-79	H	fenyl	4-chlorofenyloamino
A-80	H	fenyl	2-fluorofenyloamino
A-81	H	fenyl	3-fluorofenyloamino
A-82	H	fenyl	4-fluorofenyloamino
A-83	H	fenyl	2-(trifluorometylo)fenyloamino
A-84	H	fenyl	3-(trifluorometylo)fenyloamino
A-85	H	fenyl	4-(trifluorometylo)fenyloamino
A-86	H	fenyl	piryd-2-amino
A-87	H	fenyl	piryd-3-amino
A-88	H	fenyl	piryd-4-amino
A-89	H	fenyl	pirydo-2-metyloamino
A-90	H	9-metoksyfenyl	fenyloamino

IV. Sposoby zapobiegania lub leczenia nienormalnych stanów

Związek oparty na 5-azachinoksalinie, według wynalazku, służy do zapobiegania lub leczenia nienormalnego stanu w organizmie. Terapia ta obejmuje następujące etapy: (a) podawanie organizmowi związku według wynalazku o wzorze I z jakimikolwiek ograniczeniami tutaj przedstawionymi oraz (b) pobudzenie lub przerwanie nienormalnego oddziaływania.

W użytym znaczeniu określenie „organizm” oznacza jakąkolwiek żyjącą istotę zawierającą przynajmniej jedną komórkę. Organizm ten może być tak prosty jak pojedyncza komórka eukariotyczna lub tak złożony jak ssak. W korzystnych rozwiązaniach, organizm oznacza ludzi lub ssaki.

W użytym znaczeniu określenie „zapobieganie” oznacza metodę obniżania prawdopodobieństwa lub eliminację możliwości, że organizm nabawi się nienormalnego stanu lub rozwinie się w nim nienormalny stan.

W użytym znaczeniu określenie „leczenie” oznacza sposób według wynalazku o leczniczym skutku oraz przynajmniej częściowo łagodzący lub znoszący nienormalny stan organizmu.

W użytym znaczeniu określenie „skutek leczniczy” oznacza zahamowanie wzrostu komórki powodującego lub prowadzącego do nienormalnego stanu. W użytym znaczeniu określenie „skutek leczniczy” oznacza także zahamowanie czynników wzrostowych powodujących lub których działanie prowadzi do nienormalnego stanu (np. raka). Skutek leczniczy łagodzi jeden lub więcej symptomów nienormalnego stanu. W odniesieniu do leczenia nowotworów skutek leczniczy oznacza jedno lub więcej z następujących: (a) zmniejszenie rozmiaru nowotworu; (b) zahamowanie (tj. spowolnienie lub zatrzymanie) przerzutów nowotworowych; (c) zahamowanie wzrostu nowotworu oraz (d) złagodzenie w pewnym stopniu jednego lub więcej z symptomów związanych z nienormalnym stanem. Związki wykazujące skuteczność wobec białaczek można zidentyfikować w sposób tutaj opisany, z tym wyjątkiem, że zamiast hamowania przerzutów będą one spowalniać lub zmniejszać proliferację lub wzrost komórek.

W użytym znaczeniu określenie „nienormalny stan” oznacza takie działanie komórek lub tkanek organizmu, które różni się od ich normalnego działania w organizmie. Nienormalny stan może dotyczyć proliferacji komórek, różnicowania komórek lub przeżycia komórek.

Stany zaburzonej proliferacji komórek obejmują raki, zaburzenia zwłóknienia i mezangialne, nienormalną angiogenezę i rozwój naczyń, gojenie się ran, łuszczycę, cukrzycę oraz zapalenia.

Stany zaburzonego różnicowania komórek dotyczą, ale nie tylko, zaburzeń neurozwyrodnieniowych, spowalnionego gojenia się ran oraz technik przeszczepów tkanek.

Stany zaburzonego przeżycia komórek dotyczą stanów, w których szlaki programowanej śmierci komórek (apoptozy) są zaktywowane lub wyłączone. Wiele kinaz białkowych jest związanych ze

PL 192 039 B1 szlakami apoptozy. Zaburzenia działania którejkolwiek z kinaz białkowych mogą prowadzić do nieśmiertelności komórki lub przedwczesnej śmierci komórki.

Proliferacja, różnicowanie i przeżycie komórek są łatwe do zmierzenia sposobami znanymi fachowcom. Sposoby te mogą obejmować obserwację liczby lub wyglądu komórek pod mikroskopem w odniesieniu do czasu (np. dni).

W użytym znaczeniu określenie „podawanie” szeroko odnosi się do dostarczania organizmowi lub bardziej szczegółowo sposobu włączania związku do komórek lub tkanek organizmu. Nienormalnemu stanowi można zapobiegać lub leczyć go kiedy komórki lub tkanki organizmu występują w organizmie lub poza jego obrębem. Komórki poza obrębem organizmu można utrzymywać lub hodować w naczyniach hodowlanych. Dla komórek występujących w organizmie istnieje wiele technik podawania związków, włącznie z (ale nie tylko) podawaniem doustnym, pozajelitowym, skórnym, przez zastrzyki lub w aerozolu. Dla komórek występujących poza organizmem istnieje wiele technik podawania związków, włącznie z (ale nie tylko) technikami mikroiniekcji, transformacji lub nośnikowymi.

We wskazanych powyżej sposobach zapobiegania lub leczenia nienormalnych stanów organizmu, mogą być szczególnie wykorzystane związki oparte na 5-azachinoksalinie wybrane z grupy obejmującej związki SAQAR.

Wskazane powyżej sposoby zapobiegania lub leczenia nienormalnych stanów organizmu mogą być stosowane w odniesieniu do ssaków.

W użytym znaczeniu określenie „ssak” oznacza korzystnie taki organizm jak mysz, szczur, królik, świnka morska oraz koza, korzystniej małpa oraz małpa człekokształtna, a najkorzystniej człowiek.

Związek oparty na 5-azachinoksalinie, według wynalazku, stosuje się do zapobiegania lub leczenia nienormalnych stanów w organizmie, takich jak rak lub zaburzenie zwłóknienia. Przy czym rak jest wybrany z grupy obejmującej rak płuca, rak jajnika, rak sutka, rak mózgu, wewnątrzosiowy rak mózgu, rak okrężnicy, rak gruczołu krokowego, mięsak, mięsak Kaposiego, czerniak oraz glejak.

Ponadto związek oparty na 5-azachinoksalinie, według wynalazku, stosuje się do zapobiegania lub leczenia nienormalnych stanów w organizmie związanych z zaburzeniami szlaku przekazywania sygnału, charakteryzującymi się oddziaływaniami serynowo/treoninowej kinazy białkowej z naturalnie wiązaną przez nią cząsteczką.

W użytym znaczeniu określenie „szlak przekazywania sygnału” oznacza rozprzestrzenianie się sygnału. Ogólnie zewnątrzkomórkowy sygnał jest przekazywany przez błonę komórkową i staje się sygnałem wewnątrzkomórkowym. Następnie sygnał ten może stymulować odpowiedź komórkową. Termin ten także obejmuje sygnały w całości przekazywane w obrębie komórki. Cząsteczki polipeptydów związane z procesami przekazywania sygnału są to zazwyczaj receptorowe i niereceptorowe kinazy białkowe, receptorowe i niereceptorowe fosfatazy białkowe, czynniki wymiany nukleotydów oraz czynniki transkrypcyjne.

W użytym znaczeniu określenie „zaburzenie” dotyczy procesów przekazywania sygnałów dotyczy kinazy białkowej, która jest nad lub niedoeksprymowana w organizmie, zmutowana, tak że jej aktywność katalityczna jest mniejsza lub większa niż aktywność katalityczna kinazy białkowej typu dzikiego, zmutowana, tak, że nie może oddziaływać z naturalnie wiązaną przez siebie cząsteczką, nie jest modyfikowana przez inną kinazę białkową lub fosfatazę białkową lub nie oddziaływuje z naturalnie wiązaną przez siebie cząsteczką.

W użytym znaczeniu określenie „pobudzający lub przerywający nienormalne oddziaływania” oznacza sposób, który można osiągnąć podając związek według wynalazku komórkom lub tkankom organizmu. Związek może pobudzać oddziaływanie pomiędzy kinazą białkową, a naturalnie wiązanymi przez nią cząsteczkami przez utworzenie korzystnych oddziaływań z wieloma atomami na powierzchni rozdzielającej kompleksu. Ponadto, związek może hamować oddziaływania pomiędzy kinazą białkową, a naturalnie wiązanymi przez nią cząsteczkami przez przeciwdziałanie korzystnym oddziaływaniom utworzonym pomiędzy atomami na powierzchni rozdzielającej kompleksu. W innym korzystnym rozwiązaniu wynalazek dotyczy sposobu zapobiegania lub leczenia nienormalnych stanów w organizmie, gdzie serynowo/treoninową kinazą białkową jest RAF.

Wskazana powyżej istota wynalazku nie stanowi ograniczenia, a inne cechy i zalety wynalazku staną się oczywiste po zapoznaniu się z poniższym opisem korzystnych rozwiązań.

RAF jest niereceptorową kinazą białkową rekrutowaną do błony komórkowej przez wiązanie z aktywowanym RAS, enzymem hydrolizującym trifosforan guaniny. RAS jest aktywowany pod wpływem zaktywowanej receptorowej tyrozynowej kinazy białkowej, takiej jak EGFR lub PDGFR, związanej z białkiem adaptorowym, GRB2 oraz czynnikiem wymiany nukleotydów guaninowych, SOS. SOS

PL 192 039 B1 usuwa difosforan guaniny z RAS i zastępuje go trifosoforanem guaniny w ten sposób aktywując RAS.

Następnie RAS wiąże i w konsekwencji aktywuje RAF. Następnie RAF może ufosofrylować resztę seryny lub treoniny innych białek docelowych, takich jak kinaza (MEK) fosforylująca i w konsekwencji aktywująca kinazę białkową aktywowaną mitogenem (MAPK). Zatem, RAF służy za pośredniczący czynnik regulujący w aktywowanym mitogenem przekazywaniu sygnału.

Ze względu na istotną rolę regulatorową RAF w komórkach modyfikacje sekwencji aminokwasowej RAF mogą zmienić jej działanie i w konsekwencji zmodyfikować zachowanie komórki. Rolę RAF w proliferacji komórki podkreśliły obserwacje, że mutacje sekwencji aminokwasowej RAF związane są z nowotworami i rakami. Ze względu na to, że mutacje RAF powodujące raka w komórkach powodują powstanie cząsteczek RAF wykazujących nieregulowaną aktywność katalityczną, inhibitory RAF mogą łagodzić lub nawet znosić proliferację prowadzącą do raka w tych komórkach.

Opisane powyżej metody pozwalają wykryć związki modulujące działanie kinazy białkowej RAF w komórkach. RAF fosforyluje kinazę białkową (MEK), która z kolei fosforyluje kinazę białkową aktywowaną mitogenem (MAPK). Testy monitorujące tylko fosforylację MEK przez RAF nie są czułe, ponieważ poziom fosforylacji MEK nie jest znaczący. Aby ominąć problem związany z czułością, wopisanych powyżej metodach, śledzi się poziom fosforylacji zarówno MEK, jak i MAPK. Sygnał fosforylacji MAPK wzmacnia sygnał fosforylacji MEK i pozwala śledzić fosforylację zależną od RAF w testach typu enzymatycznego testu immunoadsorbcyjnego. Ponadto test przeprowadza się w sposób wysokosprawny, tak że wiele związków może być natychmiastowo monitorowanych w krótkim okresie czasu.

W wyniku zastosowania wskazanych powyżej metod wykrywania związków modulujących działanie kinazy białkowej RAF w komórkach zidentyfikowano związki hamujące działanie kinazy białkowej RAF. Związki te to pochodne oparte na 5-azachinaksolinie. Pomimo, że pochodne oparte na 5-azachinazolinie były badane pod względem ich zdolności do hamowania enzymów uczestniczących w syntezie nukleotydów u bakterii, wiele z tych związków nie przebadano jeszcze w znaczący sposób pod względem ich zdolności do hamowania kinaz białkowych.

Ze względu na to, że RAF wykazuje znaczącą homologię sekwencji aminokwasowej z innymi serynowo/treoninowymi kinazami białkowymi istnieje duże prawdopodobieństwo, że związki oparte na 5-azachinaksolinie będą także hamować serynowo/treoninowe kinazy białkowe inne niż RAF. Zatem związki oparte na 5-azachinaksolinie oddziaływają także na serynowo/treoninowe kinazy białkowe inne niż RAF, włącznie z receptorowymi i niereceptorowymi kinazami białkowymi.

Przy użyciu wskazanych powyżej sposobów można zidentyfikować także związki modulujące działanie RAF w komórkach, ze względu na to, że wysokosprawność tych sposobów pozwala przetestować duży szereg cząsteczek w krótkim okresie czasu. Zatem sposoby te pozwalają zidentyfikować istniejące związki, nie ujawnione w wynalazku, modulujące działanie RAF.

I. Biologiczna aktywność związków opartych na 5-azachinazolinie.

Związki oparte na 5-azachinazolinie według wynalazku przebadano pod względem ich zdolności do hamowania działania kinazy białkowej RAF. Testy biologiczne oraz wyniki tych badań hamowania zamieszczono poniżej. Sposoby, zastosowane do zmierzenia modulowania działania kinazy białkowej przez związki oparte na 5-azachinazolinie, były podobne, do ujawnionych w zgłoszeniu patentowym USA nr 08/702232 Tanga i innych zatytułowanym „Indolinone Combinatorial Libraries and Related Products and Methods for Treatment of Disease” (Lyon & Lyon, nr rejestracyjny 221/187) z23 sierpnia 1996, w odniesieniu do wysokosprawności sposobów. Zgłoszenie 08/702232 jest przytoczone tutaj jako pozycja literaturowa w całości, włącznie z rysunkami.

II. Choroby docelowe dla leczenia związkami opartymi na 1,4,5-triazanaftalenie.

Sposoby, związki oraz środki farmaceutyczne opisane tutaj zaprojektowano tak, by hamowały zaburzenia proliferacyjne komórki przez modulację działania kinazy białkowej RAF. Zaburzenia proliferacyjne wywołują niepożądaną proliferację komórki w jednym lub więcej podzbiorach komórek organizmu wielokomórkowego powodując szkodę dla organizmu. Sposoby, związki oraz środki farmaceutyczne tutaj opisane mogą być także użyteczne do leczenia oraz zapobiegania innym zaburzeniom w organizmach, takim jak zaburzenia związane z przedwczesną śmiercią komórek (tj. zaburzenia neurologiczne) oraz zapalenia. Zaburzenia te mogą wynikać z nieprawidłowego działania cząsteczek RAF lub mogą nieprawidłowego działania cząsteczek kinazy białkowej pokrewnej RAF.

Zmiany działania kinazy białkowej RAF lub kinazy białkowej pokrewnej RAF mogą prowadzić do stanów wzmożonej lub obniżonej proliferacji widocznych w pewnych chorobach. Stany niewłaściwej proliferacji komórek obejmują raki, zaburzenia zwłóknienia, zaburzenia mezangialne, nienormalna angiogeneza i rozwój naczyń, gojenie się ran, łuszczyca, nawrót zwężenia naczynia oraz zapalenia.

PL 192 039 B1

Zaburzenia zwłóknienia dotyczą nienormalnego tworzenia komórkowej macierzy zewnątrzkomórkowej. Przykładem zaburzenia zwłóknienia jest marskość wątrobowa. Marskość wątrobowa charakteryzuje się zwiększonym stężeniem składników macierzy zewnątrzkomórkowej powodującym powstanie blizny wątrobowej. Marskość wątrobowa może spowodować powstanie takich chorób jak marskość wątroby.

Zaburzenia proliferacyjne komórek mezangialnych pojawiają się wskutek nienormalnej proliferacji komórek mezangialnych. Proliferacyjne zaburzenia mezangialne obejmują różne choroby nerek u ludzi, takie jak zapalenie kłębuszków nerkowych, cukrzycowa choroba nerek, złośliwa marskość nerki, zespoły zakrzepowej choroby włośniczek, odrzucenie przeszczepu oraz choroby kłębuszków nerkowych.

Korzystnymi rodzajami raków, które można leczyć związkami według wynalazku są rak płuca, rak jajnika, rak sutka, rak mózgu, wewnątrz-osiowego rak mózgu, rak okrężnicy, rak gruczołu krokowego, mięsak, mięsak Kaposiego, czerniak oraz glejak. Dowody na to, że związki i sposoby według wynalazku mogą skutecznie być użyte do powstrzymania lub odwrócenia proliferacji komórek rakowych zacytowano tutaj jako pozycje literaturowe.

Zaburzenia angigenezy i rozwoju naczyń wywołują nadmierną proliferację naczyń krwionośnych. Proliferacja naczyń krwionośnych jest niezbędna w różnych normalnych procesach fizjologicznych takich jak rozwój embrionalny, tworzenie ciałka żółtego, gojenie się ran oraz regeneracja organów. Jednakże proliferacja naczyń krwionośnych jest także podstawowym procesem w rozwoju guzów nowotworowych. Inne przykłady zaburzeń proliferacyjnych naczyń krwionośnych obejmują zapalenie stawów, gdzie nowe włosowate naczynia krwionośne dokonują inwazji na staw i niszczą chrząstkę. Ponadto, choroby proliferacyjne naczyń krwionośnych obejmują choroby oczu, takie jak retynopatia cukrzycowa, gdzie nowe włośniczki w siatkówce dokonują inwazji na ciało szkliste, wywołują krwawienia i ślepotę. Na odwrót, zaburzenia związane z kurczeniem się, skurczem lub zamknięciem naczyń krwionośnych, takie jak nawrót zwężenia, są także związane z nieprawidłową regulacją kinaz białkowych.

Ponadto tworzenie naczyń i angiogeneza są związane ze wzrostem złośliwych guzów litych oraz przerzutów. Szybko rosnący guz raka wymaga dostarczenia krwi bogatej w składniki odżywcze oraz tlen, aby mógł on kontynuować wzrost. W konsekwencji wspólnie z guzem rośnie nienormalnie duża liczba włosowatych naczyń krwionośnych zaopatrująca guz w składniki niezbędne do jego wzrostu. Nowe naczynia krwionośne umieszczone w guzie dodatkowo, oprócz dostarczania guzowi składników odżywczych, zapewniają drogę wyjścia dla komórek nowotworowych, które w ten sposób wchodzą do krążenia i tworzą przerzuty w odległych miejscach organizmu. Folkman, 1990, J. Natl. Cancer Inst. 82:4-6.

Nieprawidłowe działanie RAF może stymulować komórki do zaburzeń proliferacyjnych. Wykazano, że cząsteczki specyficznie zaprojektowane do modulowania działania kinazy białkowej RAF hamują proliferację komórek. Specyficznie, anty-sensowne cząsteczki kwasów nukleinowych, zaprojektowane tak, aby zarówno wiązały się do RNA matrycowego kodującego kinazę białkową RAF, jak i blokowały translację tej matrycy, skutecznie odwróciły transformację komórek A549 in vitro. Monia i inni, 1996 Nature Medicine 2: 688, zacytowane tutaj jako pozycja literaturowa w całości łącznie ze wszystkimi tabelkami i rysunkami. A549 są to ludzkie komórki złośliwe.

Badania z antysensownym kwasem nukleinowym skierowanym do RAF dostarczają dowodów, że związki oparte na 5-azachinoksalinie, według wynalazku, modulujące działanie kinazy białkowej RAF mogą powstrzymać, a także prawdopodobnie odwrócić, proliferację złośliwych komórek w organizmie. Te związki oparte na 5-azachinoksalinie można przebadać metodami in vitro przytoczonymi tutaj jako przykłady. Ponadto, związki oparte na 5-azachinoksalinie można przebadać pod względem ich działania na komórki nowotworowe in vivo metodami heteroprzeszczepów, także przytoczonymi tutaj jako przykłady.

Istnieją przynajmniej dwa sposoby na drodze których nieodpowiednia aktywność RAF może stymulować niepożądaną proliferacje komórki konkretnego typu komórek: (1) bezpośrednia stymulacja wzrostu konkretnej komórki, lub (2) wzrost unaczynienia konkretnego regionu, takiego jak tkanka nowotworowa, który będzie służyć wzrostowi tej tkanki.

W pierwszym rzędzie należy zidentyfikować, czy zaburzenie proliferacji komórki jest napędzane przez RAF. Kiedy zidentyfikuje się takie zaburzenia, można zidentyfikować pacjenta cierpiącego na takie zaburzenie przy pomocy analizy objawów procedurami dobrze znanymi lekarzom lub weterynarzom. Pacjentów takich można leczyć w sposób tutaj opisany.

PL 192 039 B1

To czy zaburzenie proliferacji komórki jest napędzane przez RAF można oznaczyć w pierwszym rzędzie wyznaczając poziom aktywności RAF występującej w komórce lub w konkretnym miejscu ciała pacjenta. Na przykład, w przypadku komórek rakowych poziom jednej lub więcej aktywności RAF można porównać z rakami nie napędzanymi przez RAF oraz rakami napędzanymi przez RAF. Jeżeli komórki rakowe mają wyższy poziom aktywności RAF niż raki napędzane przez RAF, korzystnie równy lub większy niż raki napędzane przez RAF, są one kandydatami do leczenia przy pomocy opisanych sposobów i związków według wynalazku modulujących RAF.

W przypadku zaburzeń proliferacyjnych komórki wynikających z niepożądanej proliferacji komórek nienowotworowych poziom aktywności RAF porównuje się z poziomem występującym ogólnie w populacji (np., średnim poziomem występującym ogólnie w populacji ludzi lub zwierząt, z wyjątkiem ludzi lub zwierząt cierpiących na zaburzenia proliferacyjne komórek). Jeżeli niepożądana proliferacja komórki charakteryzuje się wyższym poziomem RAF niż występujący ogólnie w populacji, wtedy zaburzenie jest kandydatem do leczenia przy pomocy opisanych sposobów i związków według wynalazku modulujących RAF.

III. Środki farmaceutyczne i podawanie związków opartych na 5-azachinaksolinie.

Sposoby przygotowywania środków farmaceutycznych zawierających związki oparte na 5-azachinaksolinie, sposoby oznaczania ilości związków podawanych pacjentowi oraz sposoby podawania związków organizmowi ujawniono w zgłoszeniu patentowym USA nr 08/702232 Tanga i innych, zatytułowanym „Indolinone Combinatorial Libraries and Related Products and Methods for Treatment of Disease” (Lyon & Lyon, nr rejestracyjny 221/187) z 23 sierpnia 1996, oraz międzynarodowej publikacji patentowej nr WO 96/22976 Buzzettiego i innych, zatytułowanym „Hydrosoluble 3-Arylidene-2-Oxindole Derivatives as Tyrosine Kinase Inhibitors” z1 sierpnia 1996, z których oba są zacytowane tutaj jako pozycje literaturowe w całości, łącznie z rysunkami. Specjaliści potrafią ocenić, że takie opisy dadzą się łatwo zastosować w wynalazku i mogą być do niego łatwo zaadaptowane.

Poniższe przykłady nie ograniczają zakresu wynalazku i jedynie przedstawiają różne jego aspekty i cechy. Przykłady opisują sposoby syntezy związków według wynalazku i sposoby pomiaru wpływu związku na działanie kinazy białkowej RAF.

Komórki stosowane wtych sposobach są dostępne w handlu. Wektory kwasów nukleinowych zakotwiczone przez komórki są również dostępne w handlu, a sekwencje genów dla różnych kinaz białkowych są łatwo dostępne z banków danych dotyczących sekwencji. W związku z tym fachowiec może łatwo odtworzyć linie komórek w określony sposób, przez połączenie dostępnych w handlu komórek, dostępnych w handlu wektorów kwasów nukleinowych i genów kinaz białkowych, z użyciem technik łatwo dostępnych fachowcom.

P r zyk ł a d 1.

Procedury w syntezie związków opartych na 5-azachinoksalinie, według wynalazku

Wynalazek zostanie poniżej zilustrowany następującymi przykładami nie ograniczającymi jego zakresu, w których, o ile nie zaznaczono tego inaczej:

(i) odparowanie prowadzono w wyparce rotacyjnej pod próżnią;

(ii) czynności wykonywano w atmosferze gazu obojętnego, takiego jak azot;

(iii) wysokosprawną chromatografię cieczową (HPLC) przeprowadzano na krzemionce Merck LiChrosorb RP-18 do analizy z odwróceniem faz, otrzymanej zE. Merck, Darmstadt, Niemcy;

(iv) wydajności podano jedynie przykładowo, tak że nie muszą to być wydajności maksymalne;

(v) temperatury topnienia nie zostały skorygowane; mierzono je w cyfrowym aparacie do pomiaru temperatury topnienia HWS Mainz SG 2000;

(vi) struktury wszystkich związków o wzorze (I) według wynalazku, potwierdzono w oparciu o spektroskopię protonowego rezonansu magnetycznego z użyciem spektrofotometru Bruker AMX500-NMR, w oparciu o mikroanalizę elementarną oraz, w pewnych przypadkach, na podstawie spektroskopii masowej;

(vii) czystość oceniano metodą chromatografii cienkowarstwowej (TLC) na żelu krzemionkowym (Merck Silica Gel 60 F254) lub metodą HPLC; oraz (viii) związków pośrednich nie charakteryzowano dokładnie, a ich czystość oceniano metodą chromatografii cienkowarstwowej (TLC) na żelu krzemionkowym (Merck Silica Gel 60 F254) lub metodą HPLC.

Procedury syntezy

Związek A-2: 6-Benzyloamino-3-(4-hydroksyfenylo)-5-azachinoksalina

PL 192 039 B1

Hydroksyfenyloglioksal otrzymano z 4-hydroksyacetofenonu (Lancaster, Acros) zgodnie z opublikowanym sposobem (J. Amer. Chem. Soc., 71, 1045 (1949)).

2-Amino-6-benzyloamino-3-nitropirydynę otrzymano z 2-amino-6-chloro-3-nitropirydyny wnastępujący sposób: 2-Amino-6-chloro-3-nitropirydynę (17,35 g, 0,10 mola), benzyloaminę (Fluka) (10,72 g, 0,10 mol) i sproszkowany węglan potasu (10,4 g, 0,035 mol) w n-butanolu (100 ml) ogrzewano w temperaturze wrzenia pod chłodnicą zwrotną przez 2 godziny. Zawiesinę przesączono i po ostygnięciu do temperatury pokojowej substancję stałą odsączono, przemyto butanolem i wysuszono w50°C pod próżnią, otrzymując 2-amino-6-benzyloamino-3-nitropirydynę (22,2 g, 91%, t.t. 145-146°C).

6-Benzyloamino-3-(4-hydroksyfenylo)-5-azachinoksalinę otrzymano z 2-amino-6-benzyloamino3- nitropirydyny w następujący sposób: 2-Amino-6-benzyloamino-3-nitropirydynę (25 g, 0,10 mol) uwodorniano pod ciśnieniem wodoru 5,5 bar w obecności 10 g Raney-Ni w 400 ml dioksanu w 60°C. Po 2 godzinach mieszaninę reakcyjną ochłodzono do temperatury pokojowej, przesączono, dodano

4- hydroksyfenyloglioksal i całość mieszano przez 2 godziny w atmosferze argonu. Zawiesinę rozcieńczono następnie wodą, substancję stałą odsączono, przemyto wodą, poddano rekrystalizacji z 2-propanolu i wysuszono w 50°C pod próżnią, otrzymując 6-benzyloamino-3-(4-hydroksyfenylo)-5-azachinoksalinę (8 g, 24,4%, t.t. 271-273°C).

Związek A-1: 6-Fenyloamino-3-(4-hydroksyfenylo)-5-azachinoksalina

Stosując fenyloaminę zamiast benzyloaminy w procedurze wytwarzania związku A-2, w identyczny sposób otrzymano 6-fenyloamino-3-(4-hydroksyfenylo)-5-azachinoksalinę.

Związek A-5: 6-(4-Fluorobenzyloamino)-2-metylo-3-fenylo-5-azachinoksalina.

Stosując 1-fenylo-1,2-propanodion zamiast 4-hydroksyfenyloglioksalu oraz 4-fluorobenzyloaminę zamiast benzyloaminy w procedurze wytwarzania związku A-2, w identyczny sposób otrzymano 6-(4-fluorobenzyloamino)-2-metylo-3-fenylo-5-azachinoksalinę.

Związek A-6: 2,3-Difenylo-6-(4-fluorobenzyloamino)-5-azachinoksalina.

Stosując benzil zamiast 4-hydroksyfenyloglioksalu oraz 4-fluorobenzyloaminę zamiast benzyloaminy w procedurze wytwarzania związku A-2, w identyczny sposób otrzymano 2,3-difenylo-6-(4-fluorobenzyloamino)-5-azachinoksalinę.

Związek A7: 3-Fenylo-6-fenyloamino-5-azachinoksalina.

Stosując fenyloglioksal zamiast 4-hydroksyfenyloglioksalu i anilinę zamiast benzyloaminy w procedurze wytwarzania związku A-2, w identyczny sposób otrzymano 3-fenylo-6-fenyloamino-5-azachinoksalinę.

Związki A-8 -A-26

Stosując odpowiednio podstawioną benzyloaminę zamiast benzyloaminy w procedurze wytwarzania związku A-2, w identyczny sposób otrzymano następujące związki:

Związek A-8: 6-(2-Karboksybenzyloamino)-3-(4-hydroksyfenylo)-5-azachinoksalina

Związek A-9: 6-(3-Karboksybenzyloamino)-3-(4-hydroksyfenylo)-5-azachinoksalina

Związek A-10: 6-(4-Karboksybenzyloamino)-3-(4-hydroksyfenylo)-5-azachinoksalina

Związek A-11: 3-(4-Hydroksyfenylo)-6-(2-nitrobenzyloamino)-5-azachinoksalina

Związek A-12: 3-(4-Hydroksyfenylo)-6-(3-nitrobenzyloamino)-5-azachinoksalina

Związek A-13: 3-(4-Hydroksyfenylo)-6-(4-nitrobenzyloamino)-5-azachinoksalina

Związek A-14: 3-(4-Hydroksyfenylo)-6-(2-metylobenzy-loamino)-5-azachinoksalina

Związek A-15: 3-(4-Hydroksyfenylo)-6-(3-metylobenzyloamino)-5-azachinoksalina

Związek A-16: 3-(4-Hydroksyfenylo)-6-(4-metylobenzyloamino)-5-azachinoksalina

Związek A-17: 6-(2-Chlorobenzyloamino)-3-(4-hydroksyfenylo)-5-azachinoksalina

Związek A-18: 6-(3-Chlorobenzyloamino)-3-(4-hydroksyfenylo)-5-azachinoksalina

Związek A-19: 6-(4-Chlorobenzyloamimo)-3-(4-hydroksyfenylo)-5-azachinoksalina

Związek A-20: 6-(2-Fluorobenzyloamino)-3-(4-hydroksyfenylo)-5-azachinoksalina

Związek A-21: 6-(3-Fluorobenzyloamino)-3-(4-hydroksyfenylo)-5-azachinoksalina

Związek A-22: 6-(4-Fluorobenzyloamino)-3-(4-hydroksyfenylo)-5-azachinoksalina

Związek A-23: 3-(4-Hydroksyfenylo)-6-[2-(trifluorometylo)benzyloamino]-5-azachinoksalina

Związek A-24: 3-(4-Hydroksyfenylo)-6-[3-(trifluorometylo)benzyloamino]-5-azachinoksalina

Związek A-25: 3-(4-Hydroksyfenylo)-6-[4-(trifluorometylo)benzyloamino]-5-azachinoksalina

Związek A-26: 3-(4-Hydroksyfenylo)-6-(fenetylo-1-amino)-5-azachinoksalina

Związki A-27 -A-48

Stosując odpowiednio podstawioną anilinę zamiast benzyloaminy w procedurze wytwarzania związku A-2, w identyczny sposób otrzymano następujące związki:

PL 192 039 B1

Związek A-27 Związek A-28 Związek A-29 Związek A-30 Związek A-31 Związek A-32 Związek A-33 Związek A-34 Związek A-35 Związek A-36 Związek A-37 Związek A-38 Związek A-39 Związek A-40 Związek A-41 Związek A-42 Związek A-43 Związek A-44 Związek A-45 Związek A-46 Związek A-47

6-(2-Karboksyfenyloamino)-3-(4-hydroksyfenylo)-5-azachinoksalina

6-(3-Karboksyfenyloamino)-3-(4-hydroksyfenylo)-5-azachinoksalina

6-(4-Karboksyfenyloamino)-3-(4-hydroksyfenylo)-5-azachinoksalina

3-(4-Hydroksyfenylo)-6-(2-nitrofenyloamino)-5-azachinoksalina

3-(4-Hydroksyfenylo)-6-(3-nitrofenyloamino)-5-azachinoksalina

3-(4-Hydroksyfenylo)-6-(4-nitrofenyloamino)-5-azachinoksalina

3-(4-Hydroksyfenylo)-6-(2-metylofenyloamino)-5-azachinoksalina

3-(4-Hydroksyfenylo)-6-(3-metylofenyloamino)-5-azachinoksalina

3-(4-Hydroksyfenylo)-6-(4-metylofenyloamino)-5-azachinoksalina

6-(2-Chlorofenyloamino)-3-(4-hydroksyfenylo)-5-azachinoksalina

6-(3-Chlorofenyloamino)-3-(4-hydroksyfenylo)-5-azachinoksalina

6-(4-Chlorofenyloamino)-3-(4-hydroksyfenylo)-5-azachinoksalina

6-(2-Fluorofenyloamino)-3-(4-hydroksyfenylo)-5-azachinoksalina

6-(3-Fluorofenyloamino)-3-(4-hydroksyfenylo)-5-azachinoksalina

6-(4-Fluorofenyloamino)-3-(4-hydroksyfenylo)-5-azachinoksalina

3-(4-Hydroksyfenylo)-6-[(2-trifluorometylo)fenyloamino]-5-azachinoksalina

3-(4-Hydroksyfenylo)-6-[(3-trifluorometylo)fenyloamino]-5-azachinoksalina

3-(4-Hydroksyfenylo)-6-((4-trifluorometylo)fenyloamino]-5-azachinoksalina

3-(4-Hydroksyfenylo)-6-(piryd-2-amino]-5-azachinoksalina

3-(4-Hydroksyfenylo)-6-(piryd-3-amino]-5-azachinoksalina

3-(4-Hydroksyfenylo)-6-(piryd-4-amino]-5-azachinoksalina

3-(4-Hydroksyfenylo)-6-(piryd-2-metyloamino]-5-azachinoksalina

Związek A-48:

Związki A-49 - A-67

Stosując odpowiednio podstawioną benzyloaminę zamiast benzyloaminy i fenyloglioksal zamiast 4-hydroksyfenyloglioksalu w procedurze wytwarzania związku A-2, w identyczny sposób otrzymano następujące związki:

Związek A-49: 6-(2-Karboksybenzyloamino)-3-fenylo-5-azachinoksalina

Związek A-50: 6-(3-Karboksybenzyloamino)-3-fenylo-5-azachinoksalina

Związek A-51: 6-(4-Karboksybenzyloamino)-3-fenylo-5-azachinoksalina

Związek A-52: 6-(2-Nitrobenzyloamino-3-fenylo)-5-azachinoksalina

Związek A-53: 6-(3-Nitrobenzyloamino)-3-fenylo-5-azachinoksalina

Związek A-54: 6-(4-Nitrobenzyloamino)-3-fenylo-5-azachinoksalina

Związek A-55: 6-(2-Metylobenzyloamino)-3-fenylo-5-azachinoksalina

Związek A-56: 6-(3-Metylobenzyloamino)-3-fenylo-5-azachinoksalina

Związek A-57: 6-(4-Metylobenzyloamino)-3-fenylo-5-azachinoksalina

Związek A-58: 6-(2-Chlorobenzyloamino)-3-fenylo-5-azachinoksalina

Związek A-59: 6-(3-Chlorobenzyloamino)-3-fenylo-5-azachinoksalina

Związek A-60: 6-(4-Chlorobenzyloamino)-3-fenylo-5-azachinoksalina

Związek A-61: 6-(2-Fluorobenzyloamino)-3-fenylo-5-azachinoksalina

Związek A-62: 6-(3-Fluorobenzyloamino)-3-fenylo-5-azachinoksalina

Związek A-63: 6-(4-Fluorobenzyloamino)-3-fenylo-5-azachinoksalina

Związek A-64: 3-Fenylo-6-[2-(trifluorometylo)benzyloamino]-5-azachinoksalina

Związek A-65: 3-Fenylo-6-[3-(trifluorometylo)benzyloamino]-5-azachinoksalina

Związek A-66: 3-Fenylo-6-[4-(trifluorometylo)benzyloamino]-5-azachinoksalina

Związek A-67: 3-Fenylo-6-(fenetylo-1-amino)-5-azachinoksalina

Związki A-68 - A-89

Stosując odpowiednio podstawioną anilinę zamiast benzyloaminy i fenyloglioksal zamiast 4-hydroksyfenyloglioksalu w procedurze wytwarzania związku A-2, w identyczny sposób otrzymano następujące związki:

Związek A-68: 6-(2-Karboksyfenyloamino)-3-fenylo-5-azachinoksalina

Związek A-69: 6-(3-Karboksyfenyloamino)-3-fenylo-5-azachinoksalina

Związek A-70: 6-(4-Karboksyfenyloamino)-3-fenylo-5-azachinoksalina

Związek A-71: 6-(2-Nitrofenyloamino)-3-fenylo-5-azachinoksalina

Związek A-72: 6-(3-Nitrofenyloamino)-3-fenylo-5-azachinoksalina

Związek A-73: 6-(4-Nitrofenyloamino)-3-fenylo-5-azachinoksalina

Związek A-74: 6-(2-Metylofenyloamino)-3-fenylo-5-azachinoksalina

PL 192 039 B1

Związek A-75: 6-(3-Metylofenyloamino)-3-fenylo-5-azachinoksalina

Związek A-76: 6-(4-Metylofenyloamino)-3-fenylo-5-azachinoksalina

Związek A-77: 6-(2-Chlorofenyloamino)-3-fenylo-5-azachinoksalina

Związek A-78: 6-(3-Chlorofenyloamino)-3-fenylo-5-azachinoksalina

Związek A-79: 6-(4-Chlorofenyloamino)-3-fenylo-5-azachinoksalina

Związek A-80: 6-(2-Fluorofenyloamino)-3-fenylo-5-azachinoksalina

Związek A-81: 6-(3-Fluorofenyloamino)-3-fenylo-5-azachinoksalina

Związek A-82: 6-(4-Fluorofenyloamino)-3-fenylo-5-azachinoksalina

Związek A-83: 3-Fenylo-6-[(2-trifluorometylo)fenyloamino]-5-azachinoksalina

Związek A-84: 3-Fenylo-6-[(3-trifluorometylo)fenyloamino]-5-azachinoksalina

Związek A-85: 3-Fenylo-6-((4-trifluorometylo)fenyloamino]-5-azachinoksalina

Związek A-86: 3-Fenylo-6-(piryd-2-amino)-5-azachinoksalina

Związek A-87: 3-Fenylo-6-(piryd-3-amino)-5-azachinoksalina

Związek A-88: 3-Fenylo-6-(piryd-4-amino)-5-azachinoksalina

Związek A-89: 3-Fenylo-6- (piryd-2-metyloamino)-5-azachinoksalina

Związek A-90: 6-Fenyloamino-3-(4-metoksyfenylo)-5-azachinoksalina

Stosując związek z podstawnikiem 4-metoksyfenylowym zamiast związku 4-hydroksyfenylowego przy wytwarzaniu związku A-1 w identyczny sposób otrzymano 6-fenyloamino-3-(4-metoksyfenylo)-5-azachinoksalinę.

Przykład 2:

Test mierzący fosforylujące działanie RAF.

Niniejszy test pozwala wykryć poziom fosforylacji katalizowanej przez RAF docelowego białka MEK, a także fosforylacji MAPK przez MEK. Sekwencję genu RAF opisano w Bonner i inni, 1985, Molec. Cell. Biol. 5: 1400-1407 i można ją łatwo uzyskać z banków danych sekwencji genów. Konstrukcję wektorowego kwasu nukleinowego oraz linii komórkowych użytych w tej części wynalazku w pełni opisał Morrison i inni., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 8855-8859.

Materiały i odczynniki

1. Komórki Sf9 (Spodoptera frugiperda); GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD.

2. bufor RIPA: 20 mM Tris/HCl pH 7,4, 137 mM NaCl, 10% gliceryna, 1 mM PMSF, 5 mg/l Aproteniny, 0,5% Triton X-100;

3. Białko fuzyjne Tioredoksyna-MEK (T-MEK): ekspresję i oczyszczanie T-MEK przy pomocy chromatografii powinowactwa przeprowadzono zgodnie z zaleceniami producenta. Numer katalogowy K 350-01 i R 350-40, Invitrogen Corp., San Diego, CA.

4. His-MAPK (ERK 2): MAPK ze znacznikiem His eksprymowano w komórkach XL1 Blue transformowanych wektorem pUC18 kodującym His-MAPK. His-MAPK oczyszczono przy pomocy chromatografii powinowactwa Ni. Nr katalogowy 27-4949-01, Pharmacia, Alameda, CA, w sposób tutaj opisany.

5. Surowica owcza przeciwko mysim IgG: Jackson laboratories, West Grove, PA. Nr katalogowy 515-006-008, Nr Lot 28563

6. Specyficzne przeciwciała przeciwko kinazie białkowej RAF-1: URP2653 z UBI.

7. Bufor do opłaszczania: PBS; sól buforowana fosforanem, GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD

8. Bufor do przemywania: TBST - 50 mM Tris/HCl pH 7,2, 150 mM NaCl, 0,1% Triton X-100

9. Bufor blokujący: TBST, 0,1% etanolamina pH 7,4

10. DMSO, Sigma, St. Louis, MO

11. Bufor do kinazy (KB): 20 mM Hepes/HCl pH 7,2, 150 mM NaCl, 0,1% Triton X-100, 1 mM PMSF, 5 mg/l Aproteniny, 75 mM ortowanadan sodu, 0,5 MM DTT oraz 10 mM MgCl2.

12. Mieszanina ATP: 100 mM MgCl2, 300 mM ATP, 10 mCi g-³³P ATP (Dupont-NEN)/ml.

13. Roztwór do zatrzymywania reakcji: 1% kwas fosforowy; Fisher, Pittsburgh, PA.

14. Maty Wallac Cellulose Phosphate Filter; Wallac, Turku, Finlandia.

15. Roztwór do przemywania filtrów: 1% kwas fosforowy, Fisher, Pittsburgh, PA.

16. Harvester Tomtec do płytek, Wallac, Turku, Finlandia.

17. Licznik Wallac beta do płytek Nr 1205, Wallac, Turku, Finlandia.

18. 96-studzienkowe płytki NUNC polipropylenowe o dnie V-kształtnym do związków Applied Scientific Nr katalogowy AS-72092.

PL 192 039 B1

Procedura

Wszystkie z następujących etapów przeprowadzono w temperaturze pokojowej, z wyjątkiem przypadków w których w tekście zaznaczono co innego.

1. Powlekanie płytek ELISA: Płytki ELISA powlekano 100 ml owczej surowicy przeciw-mysiej oczyszczonej przez powinowactwo (1 mg/100 ml buforu do powlekania) przez noc w 4°C. Płytki ELISA przechowywane w 4°C można używać przez dwa tygodnie.

2. Odwrócono płytki i usunięto płyn. Dodano 100 ml roztworu blokującego i inkubowano przez 30 minut.

3. Usunięto roztwór blokujący i czterokrotnie przemyto buforem do przemywania. Otrzepano płytkę na ręczniku papierowym celem usunięcia nadmiaru płynu.

4. Do każdej studzienki dodano 1 m g specyficznego przeciwciała przeciwko RAF-1 i inkubowano przez 1 godzinę. Przemyto w sposób opisany w punkcie 3.

5. Rozmrożono lizaty komórek Sf9 zakażonych RAS/RAF i rozcieńczono je TBST do 10 mg/100 ml. Dodano po 10 mg rozcieńczonego lizatu do studzienek i inkubowano przez 1 godzinę. Płytki wytrząsano podczas inkubacji. Do kontroli negatywnych nie dodano lizatów. Lizaty z owadzich komórek Sf9 zakażonych RAS/RAF przygotowano po zakażeniu komórek zrekombinowanymi bakulowirusami przy MOI 5 dla każdego z wirusów i zbierano 48 godzin później. Komórki przemyto jeden raz w PBS i zlizowano w buforze RIPA. Nierozpuszczalny materiał usunięto przez odwirowanie (5 minut przy 10000 x g). Równe części lizatów zamrożono w suchym lodzie/etanolu i przechowywano do czasu użycia w -80°C.

6. Usunięto niezwiązany materiał i przemyto w sposób opisany powyżej (punkt 3).

7. Dodano 2 m g T-MEK i 2 m g His-MAEPK na studzienkę i ustawiono objętość na 40 m l przy pomocy buforu do kinazy. Sposoby oczyszczania T-MEK i MAPK z ekstraktów komórkowych przytoczono tutaj jako przykłady.

8. Wstępnie rozcieńczono związki (roztwór bazowy 10 mg/ml DMSO) lub ekstrakty 20 razy w TBST plus 1% DMSO. Do studzienek z punktu 6 dodano 5 ml wstępnie rozcieńczonych związków/ekstraktów. Inkubowano przez 20 min. Do kontroli nie dodano leków.

9. Rozpoczęto reakcję kinazowania dodając 5 m l mieszaniny ATP. Podczas inkubacji płytki wytrząsano na wytrząsarce do płytek ELISA.

10. Zatrzymano reakcję kinazowania po 60 minutach dodając do każdej studzienki 30 ml roztworu do zatrzymywania reakcji.

11. Na płytkach ELISA umieszczono maty fosfocelulozowe w harwesterze Tomtec do płytek. Zebrano materiał ze studzienek i przepłukano filtr roztworem do przemywania filtrów zgodnie z zaleceniami producenta. Maty filtrowe wysuszono. Oznakowano filtrowe maty i umieszczono je w urządzeniu trzymającym. Umieszczono urządzenie trzymające w aparacie służącym do detekcji radioaktywności i oznaczono na matach filtrowych fosfor radioaktywny.

W inny sposób, 40 m l próbki z każdej ze studzienek płytki testowej przeniesiono na odpowiednie pozycje mat filtrów fosfocelulozowych. Po wysuszeniu filtrów na powietrzu, umieszczono filtry na tacy. Delikatnie kołysano tacą zmieniając roztwór do przepłukiwania co 15 minut przez 1 godzinę. Wysuszono maty filtrowe na powietrzu. Oznakowano maty filtrowe i umieszczono je w urządzeniu trzymającym odpowiednim do pomiarów fosforu radioaktywnego w próbkach. Umieszczono urządzenie trzymające w aparacie służącym do detekcji i oznaczono w próbkach fosfor radioaktywny na matach filtrowych.

Zmierzono wartości IC50 według protokołu dla następujących związków opartych na 5-azachinazolinie w teście ELISA dla RAF-1:

PL 192 039 B1

Wartość IC50 jest to stężenie inhibitora opartego na 5-azachinaksolinie wymaganego do obniżenia maksymalnej ilości docelowo fosforylowanych białek lub wzrostu komórki o50%. Wartości IC50 zmierzone w teście fosforylacji RAF-1 przedstawiono w tabeli 1:

PL 192 039 B1

T a b el a 1

Związek	IC50 (mm)
A-1	11,5
A-2	7,8
A-7	33
A-36	45,6
A-77	20,3
A-90	98,0

P r zyk ł a d 3:

Oczyszczanie MAPK i MEK

Białka MAPK i MEK łatwo jest wyeksprymować w komórkach przeprowadzając podklonowanie genu kodującego te białka do dostępnego w handlu wektora eksprymującego białka ze znacznikiem polihistydynowym. Geny kodujące te białka łatwo uzyskać z laboratoriów normalnie pracujących z tymi białkami albo przez klonowanie tych genów z komórek zawierających biblioteki cDNA. Biblioteki są łatwo dostępne w handlu i fachowiec bez problemu może zaprojektować sondy kwasu nukleinowego homologiczne do cząsteczek cDNA kodujących MEK lub MAPK z sekwencji nukleotydowych MEK i MAPK, dostępnych w bazach danych genetycznych takich jak Genbank. Klonowanie genu można przeprowadzić w krótkim okresie czasu przy pomocy technik obecnie dostępnych fachowcom.

Oczyszczanie białek MEK i MAPK z ekstraktów komórkowych przeprowadzono używając następującego protokołu, który jest zmienioną formą z Robbins i inni 1993, J. Biol. Chem. 268: 5097-5106:

1. Zlizowano komórki przez obróbkę ultradźwiękami, stres osmotyczny lub technikami French Press łatwo dostępnymi dla fachowców. Skład buforu do obróbki ultradźwiękami podano poniżej.

2. Równoważono stałe złoże sprzężone z niklem lub kobaltem przy pomocy buforu do równoważenia, którego skład podano poniżej. Znacznik polihistydynowy jest specyficznie wiązany przez atomy niklu lub kobaltu do stałego złoża. Równoważenie przeprowadzono trzykrotnie płucząc złoże objętością buforu do równoważenia równą dziesięciu objętości stałego złoża. Stałe złoże jest łatwo dostępne dla fachowców.

3. Dodano lizat komórkowy do stałego złoża i równoważono w naczyniu przez pewien czas. Inaczej, stałe złoże można zapakować w kolumnę do chromatografii białkowej i lizat można przepuścić przez stałe złoże.

4. Przemyto stałe złoże buforem do przemywania, którego skład podano poniżej.

5. Wymyto białko MEK lub MAPK ze stałego złoża taką ilością buforu do wymywania (skład podany poniżej), która usunęła ze złoża stałego znaczną część białka.

Bufor do obróbki ultradźwiękami mM fosforan sodu pH 8,0

0,3M chlorek sodu mM b-merkaptoetanol

1% NP40 mM NaF

0,5 mM Pefablock

Bufor do równoważenia mM fosforan sodu pH 8,0

0,3M chlorek sodu mM b-merkaptoetanol

1% NP40 mM NaF mM Imidazol

Bufor do przemywania mM fosforan sodu pH 8,0

0,3M chlorek sodu mM b-merkaptoetanol

PL 192 039 B1

1% NP40 mM NaF mM Imidazol

Bufor do wymywania mM fosforan sodu pH 8,0

0,3M chlorek sodu mM b-merkaptoetanol

1% NP40 mM NaF

- 500 mM Imidazol

P r zyk ł a d 4:

Test mierzący działanie fosforylujące receptora EGF.

Aktywność kinazową receptora EGF (test EGFR-NIH3T3) w całych komórkach zmierzono w sposób opisany szczegółowo w publikacji PCT W09640116 z 5 czerwca 1996, Tanga i innych, zatytułowanej „Indolinone Compounds for the Treatment of Disease,” zacytowanej tutaj w całości jako pozycja literaturowa, łącznie z rysunkami.

Wartości IC50 zmierzone w teście fosforylacji przez receptor EGF przedstawiono w tabeli 2.

T ab el a 2

Związek	1C50 (mM)
A-2	> 50
A-5	> 100
A-6	> 100
A-7	> 50

P r zyk ł a d 5:

Test mierzący działanie związków opartych na 5-azachinaksolinie na wzrost komórek eksprymujących Ras.

Poniższy test służy do zmierzenia stopnia wzrostu komórek NIH-3T3 eksprymujących RAS. Celem testu jest oznaczenie działania związków na wzrost komórek NIH 3T3 nadeksprymujących H-Ras.

Materiały

96-studzienkowe jałowe płytki o płaskim dnie 96-studzienkowe jałowe płytki o okrągłym dnie jałowy 25 ml lub 100 ml zbiornik pipety, pipety wielo-kanałowe jałowe końcówki do pipet jałowe 15 mli 50ml probówki Odczynniki

0,4% SRB w 1% kwasie octowym 10 mM zasadowy Tris 10% TCA

1% kwas octowy jałowy DMSO (Sigma) związek w DMSO (100 mM lub mniej stężony roztwór bazowy)

Trypsin-EDTA (GIBCO BRL)

Linia komórkowa:

3T3/H-Ras (komórki NIH 3T3 klon 7 eksprymujące genomowy fragment onkogenu H-Ras). Komórki otrzymano w następujący sposób:

1. Podklonowano fragment genu kodujący Rasdo dostępnego w handlu wektora stabilnie transfekującego komórki NIH-3T3. Fragment pochodził z genomowego allelu transformującego cHa-ras.

2. Stransfekowano komórki NIH-3T3 podklonowanym wektorem z użyciem fosforanu wapnia. Wyselekcjonowano komórki eksprymujące konstrukt Ras w 2% surowicy w DMEM. Widoczne ogniska

PL 192 039 B1 obserwowano po dwóch tygodniach. Zebrano stransformowane komórki i utworzono stabilnie stransformowaną linię komórkową.

Pożywka wzrostowa

2% surowica cielęca/DMEM + 2 mM glutamina, Pen/Strep

Protokół:

Dzień 0: Wysiewanie komórek:

Tą część testu przeprowadzono w komorze z przepływem laminarnym.

1. Trypsynizacja komórek. Przeniesiono 200 ml zawiesiny komórek do 10 ml izotonu. Policzono komórki Coulter Counter.

2. Rozcieńczono komórki w pożywce wzrostowej do 60000 komórek/ml. Przeniesiono po 100 ml komórek do każdej ze studzienek 96-studzienkowej płytki z płaskim dnem dodając po 6000 komórek/studzienkę.

3. Połowę płytki (4 rzędy) użyto dla każdego ze związków w czterech powtórzeniach dla każdego stężenia związku oraz zestawu 4 studzienek do kontroli z pożywką.

4. Delikatnie wytrząsano płytki, aby pozwolić na równomierne przyczepienie się komórek.

5. Inkubowano płytki w inkubatorze w 31°C w 10% CO2.

Dzień 1: Dodanie związku:

Tą część testu przeprowadzono w komorze z przepływem laminarnym.

1. Do 96-studzienkowych płytek z okrągłym dnem do kolumn 1 do 11 dodano 120 ml pożywki wzrostowej zawierającej 2X końcowego % DMSO wyznaczonego z poszukiwania najwyższego stężenia związku. Na przykład, jeżeli najwyższe stężenie wynosiło 100 ml roztworu przygotowanego z 100 mM roztworu bazowego, 1X DMSO wynosiło 0,1%, a więc 2X DMSO wynosiło 0,2%. Płytkę tę użyto do oznaczenia miana związku, 4 rzędy na związek.

2. W jałowej 15 ml probówce przygotowano 2X roztwór najwyższego stężenia znalezionego dla związku w pożywce wzrostowej plus 2X DMSO. Potrzebny był 1 ml na linię komórkową. Stężenie początkowe związku zazwyczaj wynosiło 100 mM, ale mogło się ono różnić w zależności od rozpuszczalności związku.

3. Przeniesiono 240 ml 2X początkowego roztworu związku w czterech powtórzeniach do 12 kolumny 96-studzienkowych płytek o okrągłym dnie. Wykonano kolejne rozcieńczenia 1:2 wzdłuż płytki od prawej do lewej przenosząc 12 ml z kolumny 12 do kolumny 11, z kolumny 11 do 10 itd. aż do kolumny 2. Przeniesiono 100 ml rozcieńczonych związków i 100 ml pożywki do kolumny 1, na 100 ml pożywki w odpowiadających im studzienkach 96-studzienkowej płytki z płaskim dnem. Całkowita objętość na studzienkę powinna wynosić 200 ml.

4. Płytkę ponownie umieszczono w inkubatorze i inkubowano przez 3 dni.

Dzień 4: Wywołanie testu:

Ten etap testu przeprowadzono na stole.

1. Odessano lub odlano pożywkę. Dodano 200 ml zimnego 10% TCA do każdej ze studzienek, aby utrwalić komórki. Inkubowano płytki przez co najmniej 60 minut w 4°C.

2. Odrzucono TCAi 5-krotnie przepłukano studzienki woda z kranu. Wysuszono płytki odwracającjedo góry dnem na ręcznikach papierowych.

3. Barwiono komórki 100 ml/studzienkę 0,4% SRB przez 10 minut.

4. Odlano SRB i przepłukano studzienki 5-krotnie 1% kwasem octowym. Całkowicie wysuszono płytki odwracając jedo góry dnem na ręcznikach papierowych.

5. Rozpuszczano barwnik w 100 ml/studzienkę 10 mM zasady Tris przez 5-10 minut w wytrząsarce.

6. Odczytano płytki w Dynatech ELISA Plate REader przy 570 nm w odniesieniu do 630 nm.

Wybrane związki hamujące stopień wzrostu komórek nadeksprymujących RAS przedstawiono w tabeli 3.

PL 192 039 B1

Tabel a 3

Związek	IC50 (mM) RAS/NIH3T3
A-1	1,04
A-2	7,6
A-6	13,5
A-36	0,18
A-77	0,7

P r zyk ł a d 6:

Test mierzący działanie związków opartych na 5-azachinaksolinie na wzrost komórek A549.

Poniższy test służy do zmierzenia stopnia wzrostu komórek A549. Celem testu jest oznaczenie działania związków na wzrost komórek ludzkiego raka płuca A549. Komórki A549 można łatwo uzyskać ze źródeł komercyjnych, takich jak ATCC (CCL185).

Materiały

96-studzienkowe jałowe płytki o płaskim dnie

96-studzienkowe jałowe płytki o okrągłym dnie jałowy 25 ml lub 100 ml zbiornik pipety, pipety wielo-kanałowe jałowe końcówki do pipet jałowe 15 mli 50 ml probówki Odczynniki

0,4% SRB w 1% kwasie octowym mM zasadowy Tris

10% TCA

Trypsin-EDTA (GIBCO BRL)

Linia komórkowa i pożywka wzrostowa komórki ludzkiego raka płuca A549 (ATTC CCL185)

10% surowica cielęca w Ham F12-K

Protokół:

Dzień 0: Wysiewanie komórek:

Tą część testu przeprowadzono w komorze z przepływem laminarnym.

2. Rozcieńczono komórki w pożywce wzrostowej do 20000 komórek/ml. Przeniesiono po 100 ml komórek do każdej ze studzienek w 96-studzienkowej płytce z płaskim dnem dodając po 2000 komórek/studzienkę.

4. Delikatnie wytrząsano płytki aby pozwolić na równomierne przyczepienie się komórek.

5. Inkubowano płytki w inkunbatorze w 37°C w 10% CO2.

Dzień 1: Dodanie związku:

Tą część testu przeprowadzono w komorze z przepływem laminarnym.

1. Do 96-studzienkowych płytek z okrągłym dnem do kolumn 1 do 11 dodano 120 ml pożywki wzrostowej zawierającej 2X końcowego % DMSO wyznaczonego z poszukiwania najwyższego stężenia związku. Na przykład, jeżeli najwyższe stężenie wynosiło 100 mM roztworu przygotowanego ze 100 mM roztworu bazowego, 1X DMSO wynosiło 0,1%, a więc 2X DMSO wynosiło 0,2%. Płytkę tę użyto do oznaczenia miana związku, 4 rzędy na związek.

2. W jałowej 15 ml probówce przygotowano 2X roztwór najwyższego stężenia znalezionego dla związku w pożywce wzrostowej plus 2X DMSO. Potrzebny był 1 ml na linię komórkową. Stężenie po26

PL 192 039 B1 czątkowe związku zazwyczaj wynosiło 100 mM, ale mogło się ono różnić w zależności od rozpuszczalności związku.

3. Przeniesiono 240 ml 2X początkowego roztworu związku w czterech powtórzeniach do 12 kolumny 96-studzienkowych płytek o okrągłym dnie. Wykonano kolejne rozcieńczenia 1:2 wzdłuż płytki od prawej do lewej przenosząc 120 ml z kolumny 12 do kolumny 11, z kolumny 11 do 10 itd. aż do kolumny 2. Przeniesiono 100 ml rozcieńczonych związków i 100 ml pożywki do kolumny 1, na 100 ml pożywki w odpowiadających im studzienkach 96-studzienkowej płytki z płaskim dnem. Całkowita objętość na studzienkę powinna wynosić 200 ml.

4. Płytkę ponownie umieszczono w inkubatorze i inkubowano przez 3 dni.

Dzień 4: Wywołanie testu:

Ten etap testu przeprowadzono na stole.

2. Odrzucono TCAi 5-krotnie przepłukano studzienki wodą z kranu. Wysuszono płytki odwracającjedo góry dnem na ręcznikach papierowych.

3. Barwiono komórki 100 ml/studzienkę 0,4% SRB przez 10 minut.

Wybrane związki hamujące stopień wzrostu komórek A549 przedstawiono w tabeli 4.

T a b el a 4

Związek	IC50 (mM) A549
A-2	25,1 > 10 (2% FBS)
A-6	23,8 > 10 (2% FBS)

P r zyk ł a d 7:

Sposób wyznaczania aktywności biologicznej modulatorów Raf in vivo W celu monitorowania hamującego działania związków według wynalazku na komórki nowotworowe jajników, czerniaka, prostaty, płuc oraz sutka można zastosować heteroprzeszczepy. Protokół testu opisano szczegółowo w publikacji PCT W09640116, z czerwca 5 1996 Tanga i innych, zatytułowanej „Indolinone Compounds for the Treatment of Disease”, cytowanej tutaj jako pozycja literaturowa w całości, łącznie z rysunkami.

Claims

1. Związek oparty na 5-azachinoksalinie, o strukturze określonej wzorem I:

w którym (a) R1,R2 są niezależnie wybrane z grupy obejmującej atom wodoru, metyl, fenyl oraz 4-hydroksyfenyl (b) R3 i R4 są atomem wodoru a (c) R6 i X1 tworzą razem grupę wybraną z grupy obejmującej grupy metoksy, benzyloamino, 4-fluorobenzyloamino, 2-karboksybenzyloamino, 3-karboksybenzyloamino, 4-karboksybenzyloamino,

PL 192 039 B1

2- nitrobenzyloamino, 3-nitrobenzyloamino, 4-nitrobenzyloamino, 2-metylobenzyloamino, 3-metylobenzyloamino, 4-metylobenzyloamino, 2-chlorobenzyloamino, 3-chlorobenzyloamino, 4-chlorobenzyloamino, 2-fluorobenzyloamino, 3-fluorobenzyloamino, 4-fluorobenzyloamino, 2-(trifluorometylo)benzyloamino, 3-(trifluorometylo)benzyloamino, 4-(trifluorometylo)benzyloamino, fenetyl-1-aminofenyloamino, 2-karboksyfenyloamino, 3-karboksyfenyloamino, 4-karboksyfenyloamino, 2-nitrofenyloamino, 3-nitrofenyloamino, 4-nitrofenyloamino, 2-metylofenyloamino, 3-metylofenyloamino, 4-metylofenyloamino, 2-chlorofenyloamino, 3-chlorofenyloamino, 4-chlorofenyloamino, 2-fluorofenyloamino,

3- fluorofenyloamino, 4-fluorofenyloamino, 2-(trifluorometylo)fenyloamino, 3-(trifluorometylo)fenyloamino, 4-(trifluorometylo)fenyloamino, pirydo-2-amino, pirydo-3-amino, pirydo-4-amino i pirydo-2-metyloamino.

2. Związek według zastrz. 1, w którym R1, R2, R3 oraz R4 są atomami wodoru.

3. Związek według zastrz. 1, w którym X1 oznacza atom azotu.

4. Środek farmaceutyczny zawierający związek oparty na 5-azachinoksalinie określony wzastrz. 1 lub jego sól i fizjologicznie dopuszczalny nośnik lub rozcieńczalnik.

5. Zastosowanie związku opartego na 5-azachinoksalinie określonego w zastrz. 1 do badania in vitro modulacji funkcji serynowo/treoninozwej kinazy białkowej.

6. Zastosowanie według zastrz. 5, znamienne tym, że serynowo/treoninową kinazą białkową jest kinaza RAF.

7. Zastosowanie związku opartego na 5-azachinoksalinie określonego w zastrz. 1 do wytwarzania leku do leczenia raka lub zaburzenia zwłóknienia.

8. Zastosowanie według zastrz. 7, znamienne tym, że lek służy do leczenia raka wybranego z grupy obejmującej raka płuca, raka jajnika, raka piersi, raka mózgu, wewnątrzosiowego raka mózgu, raka okrężnicy, raka gruczołu krokowego, mięsaka, mięsaka Kaposiego, czerniaka oraz glejaka.

9. Zastosowanie, według zastrz. 7 albo 8, znamienne tym, że lek służy do leczenia stanów związanych z zaburzeniami na drodze przekazywania sygnału, charakteryzujących się występowaniem oddziaływania serynowo/treoninowej kinazy białkowej z naturalnie wiązaną do niej cząsteczką, gdzie stanem tym jest rak, w szczególności rak płuca, rak jajnika, rak piersi, rak mózgu, wewnątrzosiowy rak mózgu, rak okrężnicy, rak gruczołu krokowego, mięsak, mięsak Kaposiego, czerniak oraz glejak.

10. Zastosowanie według zastrz. 9, gdzie serynowo/treoninową kinazą białkową jest kinaza RAF.