PT1028729E - Método de modulação da função da proteína cinase de serina/treonina a um composto de base azaquinoxalina - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "MÉTODOS DE MODULAÇÃO DA FUNÇÃO DA PROTEÍNA CINASE DE SERINA/TREONINA A UM COMPOSTO DE BASE 5-AZAQUINOXALINA"

Antecedentes da invenção A seguinte descrição dos antecedentes da invenção destina-se a auxiliar a compreensão da invenção, mas não é para ser considerada técnica anterior à invenção. 0 sinal de transdução celular é um mecanismo fundamental pelo qual os estímulos externos que regulam os diversos processos celulares são comunicados para o interior das células. Um dos mecanismos bioquímicos chave de transdução de sinal envolve a fosforilação reversível de proteínas, que permite o regulamento da actividade das proteínas maduras por alteração da sua estrutura e função.

As proteínas cinase melhor caracterizadas nos eucariotas fosforilam as proteínas na unidade álcool em resíduos de serina, treonina ou tirosina. Estas cinases dividem-se de um modo geral em dois grupos, sendo um deles específico para a fosforilação da serina e treonina, e o outro específico para a fosforilação da tirosina. Algumas cinases, referidas como cinases de "especificidade dupla", podem fosforilar resíduos de tirosina e serina/treonina. 1

As proteínas cinase podem também ser caracterizadas pela sua localização dentro da célula. Algumas cinases são proteínas receptoras transmembranares com a capacidade de ligar ligandos externos à membrana celular. A ligação dos ligandos ao receptor de proteína altera a actividade catalítica da cinase. Outras são proteínas não-receptoras às quais falta um domínio transmembranar. As proteínas cinase não-receptoras podem ser encontradas numa variedade de compartimentos celulares, desde a superfície interna da membrana celular até ao núcleo.

Muitas cinases estão envolvidas em cascatas regulatórias onde os seus substratos podem incluir outras cinases cujas actividades são reguladas pelo seu estado de fosforilação. Por fim, a actividade de um efector a jusante é modulada pela fosforilação resultante da activação de tal via metabólica. A família de cinases de serina/treonina inclui membros que regulam muitas etapas de cascatas de sinalização, incluindo as cascatas que controlam o crescimento celular, migração, diferenciação, expressão génica, contracção do músculo, metabolismo da glucose, síntese de proteína celular e regulação do ciclo celular.

Um exemplo de uma proteína cinase não-receptora que fosforila proteínas alvo nos resíduos de serina e treonina é a RAF. A RAF modula a actividade catalítica de outras proteínas cinase, tal como a proteína cinase que fosforila e assim activa a proteína cinase activada por mitogénio (MAPK). A RAF por si própria é activada pela proteína RAS ancorada na membrana, pela ligação de ligandos a receptores de tirosina de proteínas cinase, tais como o receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR) e o receptor do factor de crescimento derivado de 2 plaquetas (PDGFR). A importância biológica da RAF no controlo de eventos celulares é sublinhada pela descoberta de que formas alteradas de RAF podem causar cancro em organismos. A prova da importância da RAF em condições malignas é fornecida em Monia et al., 1996, Nature Medicine 2:668, incorporado aqui por referência na sua totalidade, incluindo todas as figuras e tabelas.

Num esforço para descobrir novos tratamentos para o cancro e outras doenças, investigadores biomédicos e quimicos têm desenhado, sintetizado e testado moléculas que inibem a função das proteínas cinase. Algumas pequenas moléculas orgânicas formam uma classe de compostos que modulam a função das proteínas cinase. Exemplos de moléculas que foram relatadas como inibidoras da função das proteínas cinase, são os compostos arilo bis- monociclicos, biciclicos ou heterociclicos (documento PCT WO 92/20642), derivados do vinileno-azaindole (documento PCT WO 94/14808), l-ciclopropil-4-piridil-quinolonas (Patente U.S. N° 5330992), compostos de estirilo (por Levitzki, et al., patente U.S. N° 5217999, e intitulado "Styril Compounds Which Inhibit EGF Receptor Protein Tyrosine Kinase", Lyon & Lyon N° de processo 208/050, compostos piridilo estirilo-substituidos (Patente U.S. N°. 5302606), determinados derivados da quinazolina (Pedido PE N° 0566266 Al), seleoindoles e selenidos (documento PCT WO 94/03427), compostos poli-hidroxilicos tricíclicos (documento PCT WO 92/21660), e compostos de ácidos benzilfosfónicos (documento PCT WO 91/15495).

Os compostos que podem atravessar membranas celulares e são resistentes a hidrólise ácida têm um potencial terapêutico vantajoso, já que podem tornar-se altamente biodisponiveis após administração oral a doentes. No entanto, muitos destes 3 inibidores de proteínas cinase apenas inibem de um modo fraco a função das proteínas cinase. Além do mais, muitos inibem uma variedade das proteínas cinase e irão, por isso causar múltiplos efeitos secundários se utilizados como terapia para doenças.

Apesar do progresso significativo que tem sido feito no desenvolvimento de compostos para o tratamento de cancro, permanece uma necessidade na técnica para identificar as estruturas particulares e padrões de substituição que formam os compostos capazes de modular a função de certas proteínas cinase.

Sumário da Invenção A presente invenção é dirigida em parte para métodos de modular a função das proteínas cinase de serina/treonina a um composto de base 5-azaquinoxalina. Os métodos incorporam células que expressam proteínas cinase de serina/treonina, tal como a RAF. Além do mais, a invenção descreve métodos de prevenção e tratamento de estados anormais em organismos, derivados das proteínas cinase de serina/treonina, com um composto identificado pelos métodos aqui descritos. Além disso, a invenção engloba as composições farmacêuticas que compreendem os compostos identificados pelos métodos da invenção. 4 I. Métodos para Rastreio de Compostos que Modulam a Função da Proteína Cinase de Serina/Treonina

Os métodos da presente invenção fornecem meios para a modulação da função de proteínas cinase de serina/treonina, quer receptoras, quer citosólicas. Estes métodos proporcionam meios de modulação das enzimas in vitro e in vivo. No que respeita a aplicações in vitro, os métodos da invenção relacionam-se em parte com o método de identificação dos compostos que modulam a função das proteínas cinase de serina/treonina.

Assim, num primeiro aspecto, a invenção caracteriza um método de modulação da função de uma proteína cinase de serina/treonina com um composto de base azabenzimidazole. 0 composto de azabenzimidazole é opcionalmente com grupos orgânicos. 0 método compreende o contacto de células que expressam a proteína cinase de serina/treonina com o composto. 0 termo "função" refere-se ao papel na célula de uma proteína cinase de serina/treonina. A família das proteínas cinase de serina/treonina incluem membros que regulam muitas etapas nas cascatas de sinalização, incluindo as cascatas que controlam o crescimento celular, migração, diferenciação, expressão genética, contracção do músculo, metabolismo da glucose, síntese de proteínas celulares e regulação do ciclo celular. 0 termo "actividade catalítica", no contexto da invenção, define a velocidade a que uma proteína cinase fosforila um substrato. A actividade catalítica pode ser medida, por exemplo, pela determinação da quantidade de um substrato convertida num produto, com uma função do tempo. A fosforilação de um substrato 5 ocorre no local activo de uma proteína cinase. 0 local activo é normalmente uma cavidade na qual o substrato se liga à proteína cinase e é fosforilado. 0 termo "substrato", como aqui utilizado, refere-se a uma molécula fosforilada por uma proteína cinase de serina/treonina. 0 substrato é, de um modo preferido, um péptido e, de um modo mais preferido, uma proteína. Em relação à proteína cinase RAF, os substratos preferidos são as MEK e o substrato MAPK de MEK. 0 termo "activa" refere-se ao aumento da função celular de uma proteína cinase. A função da proteína cinase é, de um modo preferido, a interacção com o parceiro ligante natural, de um modo muito preferido, a actividade catalítica. 0 termo "inibe" refere-se ao diminuir da função celular de uma proteína cinase. A função da proteína cinase é, de um modo preferido, a interacção com o parceiro ligante natural, de um modo muito preferido, a actividade catalítica. 0 termo "modula" refere-se ao alterar da função de uma proteína cinase, pelo aumento ou decréscimo da probabilidade de formação de um complexo entre uma proteína cinase e o parceiro ligante natural. De um modo preferido, um modulador aumenta a probabilidade de formação de um tal complexo entre uma proteína cinase e o parceiro ligante natural, de um modo mais preferido, aumenta ou diminui a probabilidade de formação de um complexo entre uma proteína cinase e o parceiro ligante natural, dependendo da concentração do composto exposto à proteína cinase ou, ainda, de modo muito preferido, diminui a probabilidade de formação de um complexo entre uma proteína cinase e o parceiro ligante natural. Um modulador activa, de um modo preferido, a 6 actividade catalítica de uma proteína cinase, de um modo mais preferido, activa ou inibe a actividade catalítica de uma proteína cinase, dependendo da concentração do composto exposto à proteína cinase, ou de modo muito preferido, inibe a actividade catalítica de uma proteína cinase. 0 termo "complexo" refere-se a um conjunto de, pelo menos, duas moléculas ligadas uma à outra. Complexos de transdução de sinal contêm, pelo menos, duas moléculas de proteínas ligadas uma à outra. Por exemplo, uma proteína cinase com receptor de tirosina, GRB2, SOS, RAF e RAS, agrupam-se para formar a um complexo de transdução de sinal em resposta a um ligando mitogénico. 0 termo "parceiro ligante natural" refere-se a polipéptidos que se ligam a uma proteína cinase nas células. Os parceiros de ligação de origem natural podem ter um papel na propagação de um sinal num processo de transdução de sinal de uma proteína cinase. Uma mudança na interacção entre uma proteína cinase e o parceiro ligante natural pode manifestar-se como um aumento ou decréscimo de probabilidade de formação da interacção, ou um aumento ou diminuição da concentração do complexo proteína cinase/parceiros de ligação de origem natural. 0 parceiro ligante natural de uma proteína cinase pode-se ligar com elevada afinidade a uma região intracelular de uma proteína cinase. Elevada afinidade representa uma constante de equilíbrio de ligação na ordem de 10“6 M ou menos. Além do mais, o parceiro ligante natural pode, também, transientemente interagir com uma região intracelular da proteína cinase e modificá-la quimicamente. Os parceiros de ligação natural das proteína cinase são escolhidos de um grupo que inclui, mas não 7 está limitado aos domínios de homologia SRC 2 (SH2), ou 3 (SH3) , outros domínios de ligação fosforiltirosina (PTB), factores de troca de nucleótidos de guanina, fosfatases de proteína e outras proteínas cinase. Os métodos para determinar mudanças nas interacções entre proteínas cinase e os seus parceiros de ligação de origem natural estão prontamente disponíveis na técnica. 0 termo "proteína cinase de serina/treonina" refere-se a uma enzima com uma sequência de aminoácidos com, pelo menos, 10% de identidade de aminoácidos relativamente a outras enzimas que fosforilam os resíduos serina e treonina em proteínas. Uma proteína cinase de serina/treonina cataliza a adição de fosfato nos resíduos de serina e treonina em proteínas. As proteínas cinase de serina/treonina podem existir como proteínas ligadas na membrana ou proteínas citosólicas. O termo "contacto", tal como aqui utilizado, refere-se a misturar uma solução compreendendo um composto de 5-azaquinoxalina da invenção com um meio líquido de cultura que banha as células dos métodos. A solução compreendendo o composto pode também compreender um outro componente, tal como o dimetilsulfóxido (DMSO), o qual facilita a adsorção do composto ou compostos de 5-azaquinoxalina nas células descritas nos métodos. A solução compreendendo o composto de 5-azaquinoxalina pode ser adicionada ao meio de cultura que banha as células utilizando um dispositivo de distribuição tal como um sistema baseado em pipetas ou um sistema baseado em seringas. O termo "composto de base 5-azaquinoxalina" refere-se a um composto orgânico de 5-azaquinoxalina substituído com grupos substituintes químicos. Os compostos de 5-azaquinoxalina têm a estrutura geral:

O termo "substituído" em referência à invenção, refere-se a um composto de 5-azaquinoxalina que é derivado com qualquer número de substituintes químicos.

Numa forma de realização preferida, a invenção refere-se ao método de modular a função de uma proteína cinase de serina/treonina, sendo que a proteína cinase é RAF. A proteína cinase RAF fosforila os resíduos de treonina ou serina nos alvos proteicos. Um desses alvos proteicos é a proteína cinase (MEK), a qual fosforila e, consequentemente, activa a proteína cinase activada pelo mitogénio (MAPK). A RAF propriamente dita é activada pela proteína RAS que está ligada à membrana e que hidrolisa guanina trifosfato, em resposta a proteínas cinase de tirosina, nas quais o receptor é estimulado por um mitogénio, tal como o receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR) e o receptor do factor de crescimento derivado de plaquetas (PDGFR).

Os métodos da presente invenção podem detectar compostos que modulam a função da proteína cinase RAF nas células. A RAF fosforila uma proteína cinase (MEK) que, por sua vez, fosforila a proteína cinase activada por um mitogénio (MAPK). Os testes que monitorizam somente a fosforilação da MEK pela RAF não são sensíveis porque os níveis da fosforilação da MEK não são 9 significativos. Para superar este dilema de sensibilidade, a fosforilação de ambas MEK e MAPK são seguidas nos ensaios da presente invenção. 0 sinal da fosforilação da MAPK amplifica o sinal da fosforilação da MEK e permite que a fosforilação dependente da RAF seja seguida nos ensaios, tais como nos ensaios imunoenzimáticos de adsorção. Além do mais, o teste da invenção é executado num formato de rápida selecção, para que muitos compostos possam rapidamente ser monitorizados num curto espaço de tempo.

Noutro aspecto, a invenção descreve um método de identificação de compostos que modulam a função da proteína cinase de serina/treonina, compreendendo as etapas de contacto do composto com as células que expressam a proteína cinase de serina/treonina e monitorização de um efeito nas células. 0 termo "monitorização" refere-se à observação do efeito da adição do composto às células do método. 0 efeito pode ser manifestado numa mudança do fenótipo celular, proliferação celular, actividade catalítica da proteína cinase ou na interacção entre uma proteína cinase e o parceiro ligante natural. 0 termo "efeito" descreve uma mudança ou uma ausência de uma mudança no fenótipo celular ou na proliferação celular. "Efeito" pode também descrever uma mudança ou uma ausência de uma mudança na actividade catalítica da proteína cinase. "Efeito" pode também descrever uma mudança ou uma ausência de uma mudança numa interacção entre a proteína cinase e o parceiro ligante natural. 10

Uma forma de realização preferida da invenção refere-se ao método de identificação dos compostos que modulam a função da proteína cinase de serina/treonina, onde o efeito é uma mudança ou uma ausência de uma mudança no fenótipo celular. 0 termo "fenótipo celular" refere-se à aparência externa de uma célula ou tecido, ou à função celular ou tecido. Exemplos de fenótipo celular são o tamanho da célula, (redução ou ampliação), proliferação celular (número de células aumentado ou diminuído), diferenciação celular (uma mudança ou uma ausência de uma mudança na forma da célula), sobrevivência celular, apoptose (morte celular), ou a utilização de um nutriente metabólico (e. g., incorporação de glucose). As mudanças ou a ausência de mudanças no fenótipo celular são medidas prontamente pelas técnicas conhecidas na matéria.

Noutra forma de realização preferida, a invenção refere-se ao método de identificação dos compostos que modulam a função da proteína cinase de serina/treonina, onde o efeito é uma mudança ou uma ausência de uma mudança na proliferação celular. 0 termo "proliferação celular" refere-se à velocidade a que um grupo de células se divide. 0 número de células que crescem num recipiente pode ser quantificado por especialistas na técnica quando esse especialista conta visualmente o número de células num volume definido utilizando um microscópio de luz comum. Alternativamente, as velocidades de proliferação celular podem ser quantificadas por dispositivos de laboratório que por medição óptica ou de condutividade medem a densidade das células num meio apropriado. 11

Noutra forma de realização preferida, a invenção refere-se ao método de identificação dos compostos que modulam a função proteína da cinase de serina/treonina, onde o efeito é uma mudança ou uma ausência de uma mudança na interacção entre a proteína cinase de serina/treonina com o parceiro ligante natural. 0 termo "interacção", no contexto da invenção, descreve um complexo formado entre uma região intracelular da proteína cinase e o parceiro ligante natural ou composto. 0 termo "interacção" pode também ser estendido a um complexo formado entre um composto da invenção com regiões intracelulares ou extracelulares da proteína cinase em estudo. Embora uma proteína cinase citosólica não tenha região extracelular, um receptor da proteína cinase abrigará a região intracelular e extracelular. 0 termo "região intracelular" como aqui utilizado refere-se à parcela de uma proteína cinase que existe dentro de uma célula. 0 termo "região extracelular" como aqui utilizado refere-se a uma parcela de uma proteína cinase que existe fora da célula.

Numa forma de realização preferida, a invenção refere-se ao método de identificação de compostos que modulam a função da proteína cinase de serina/treonina, que compreende ainda as seguintes etapas: (a) lise das células para obtenção de um lisado compreendendo a proteína cinase de serina/treonina; (b) adsorção da proteína cinase de serina/treonina a um anticorpo; (c) incubação da proteína cinase de serina/treonina adsorvida, com um substrato ou substratos; e (d) adsorção do substrato ou substratos num suporte sólido ou anticorpo. A etapa 12 de monitorização do efeito nas células compreende a medição da concentração de fosfato no substrato ou substratos. 0 termo "lisado", como aqui utilizado, refere-se a um método de quebrar a integridade de uma célula para que o seu conteúdo seja libertado. A lise celular é conseguida por muitas técnicas conhecidas pelos especialistas na técnica. 0 método é realizado, de modo preferido, por técnicas de pressão celular ou sonicação, e, de um modo mais preferido, por técnicas detergentes. 0 termo "anticorpo" como aqui utilizado refere-se a uma molécula de proteína que se liga especificamente a uma proteína cinase. Um anticorpo liga-se, de modo preferido, a uma classe de proteína cinase e liga-se, de um modo mais preferido, especificamente à proteína cinase RAF. 0 termo "liga-se especificamente" como aqui utilizado refere-se a um anticorpo que se liga a uma proteína cinase com afinidade mais elevada do que a outra proteína cinase ou proteína celular. Um anticorpo se que liga especificamente a uma proteína cinase ligará a uma concentração mais elevada especificamente dessa proteína cinase do que qualquer outra proteína cinase ou proteína celular. 0 termo "adsorção" como aqui utilizado refere-se à ligação de uma molécula à superfície de um anticorpo ou suporte sólido. Exemplos de suportes sólidos são a celulose quimicamente modificada, tal como fosfocelulose, e nylon. Os anticorpos podem ser ligados aos suportes sólidos utilizando técnicas bem conhecidas dos especialistas da matéria. Ver, e. g., 13

Harlo & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, 1989, Cold Spring Harbor Laboratories. 0 termo "medição da concentração de fosfato" como aqui utilizada, refere-se às técnicas geralmente conhecidas pelos especialistas na matéria. Estas técnicas podem envolver quantificação das concentrações de fosfato num substrato, ou determinar quantidades relativas de fosfato num substrato. Estas técnicas podem incluir adsorver o substrato numa membrana e detectar a quantidade de fosfato dentro do substrato por medições radioactivas.

Noutra forma de realização preferida, a invenção refere-se ao método de identificação de compostos que modulam a função da proteína cinase de serina/treonina, que compreende ainda as seguintes etapas: (a) lise das células para obtenção de um lisado que contém a RAF; (b) adsorção da RAF a um anticorpo; (c) incubação da RAF adsorvida, com MEK e MAPK; e (d) adsorção da MEK e MAPK a um suporte sólido ou anticorpo ou anticorpos. A etapa de determinar o efeito nas células compreende a medição da concentração de fosfato das referidas MEK e MAPK.

Numa forma de realização preferida, a invenção refere-se ao método de identificação de compostos que modulam a função da proteina cinase de serina/treonina, onde os compostos de base 5-azaquinoxalina têm uma estrutura determinada na fórmula I, tal como aqui definido ou noutros seus subgrupos determinados a partir daqui. 0 termo "composto" refere-se ao composto ou um seu sal farmacêuticamente aceitável, éster, amido, pró-fármaco, isómero ou metabolito. 14 0 termo "sal farmacêuticamente aceitável" refere-se a uma formulação de um composto que não perca a actividade biológica e as propriedades do composto. Os sais farmacêuticos podem ser obtidos fazendo reagir um composto da invenção com ácidos inorgânicos ou orgânicos, tais como ácido cloridrico, ácido bromidrico, ácido sulfúrico, ácido nitrico, ácido fosfórico, ácido metanossulfónico, ácido etanossulfónico, ácido p-toluenossulfónico, ácido salicilico e semelhantes. 0 termo "pró-fármaco" refere-se a um agente que é convertido no fármaco parental in vivo. Os pró-fármacos podem ser, em algumas situações, mais fáceis de administrar do que o fármaco parental. Por exemplo, o pró-fármaco pode ser biodisponivel por administração oral mas o parental não, ou o pró-fármaco pode melhorar a solubilidade de forma a permitir a administração intravenosa.

Noutra forma de realização preferida, a invenção refere-se ao método de identificação de compostos que modulam a função da proteína cinase de serina/treonina, onde o composto de base 5-azaquinoxalina tem a estrutura indicada na fórmula I, onde o composto de base 5-azaquinoxalina é seleccionado do grupo consistindo em compostos SAQAR. 0 termo "compostos SAQAR" refere-se ao grupo de compostos de base 5-azaquinoxalina que têm a estrutura indicada na fórmula I e numerados A-l a A-90 na seguinte tabela: 15 ti) R r-v.

Composto n° r2 Ri R6Xi A-l. H 4-hidroxifenilo fenilamino A-2 . H 4-hidroxifenilo benzilamino A-5. metilo fenilo 4-fluorobenzilamino A- 6 . fenilo fenilo 4-fluorobenzilamino A-7 . H fenilo fenilamino A-8 . H 4-hidroxifenilo 2-carboxibenzilamino A- 9 . H 4-hidroxifenilo 3-carboxibenzilamino A-10 . H 4-hidroxifenilo 4-carboxibenzilamino A-11 . H 4-hidroxifenilo 2-nitrobenzilamino A-12 . H 4-hidroxifenilo 3-nitrobenzilamino A-13 . H 4-hidroxifenilo 4-nitrobenzilamino A-14 . H 4-hidroxifenilo 2-metilbenzilamino LO τ—1 1 < H 4-hidroxifenilo 3-metilbenzilamino A-l 6. H 4-hidroxifenilo 4-metilbenzilamino A-17 . H 4-hidroxifenilo 2-clorobenzilamino A-18 . H 4-hidroxifenilo 3-clorobenzilamino A-1 9 . H 4-hidroxifenilo 4-clorobenzilamino A-20 . H 4-hidroxifenilo 2-fluorobenzilamino A-21 . H 4-hidroxifenilo 3-fluorobenzilamino A-22 . H 4-hidroxifenilo 4-fluorobenzilamino A-23 . H 4-hidroxifenilo 2- (trifluorometil) benzilamino A-24 . H 4-hidroxifenilo 3- (trifluorometil) benzilamino 16 (Continuação)

Composto n° r2 Ri R6Xi A-25 . H 4-hidroxifenilo 4- (trifluorometil) benzilamino A-26. H 4-hidroxifenilo fenetil-l-amino A-27 . H 4-hidroxifenilo 2-carboxifenilamino A-28 . H 4-hidroxifenilo 3-carboxifenilamino A-2 9 . H 4-hidroxifenilo 4-carboxifenilamino A-30 . H 4-hidroxifenilo 2-nitrofenilamino A-31 . H 4-hidroxifenilo 3-nitrofenilamino A-32 . H 4-hidroxifenilo 4-nitrofenilamino A-3 3 . H 4-hidroxifenilo 2-metilfenilamino A-3 4 . H 4-hidroxifenilo 3-metilfenilamino A-3 5 . H 4-hidroxifenilo 4-metilfenilamino A-3 6 . H 4-hidroxifenilo 2-clorofenilamino A-3 7 . H 4-hidroxifenilo 3-clorofenilamino A-3 8 . H 4-hidroxifenilo 4-clorofenilamino A-3 9. H 4-hidroxifenilo 2-fluorofenilamino A-4 0 . H 4-hidroxifenilo 3-fluorofenilamino A-41 . H 4-hidroxifenilo 4-fluorofenilamino A-4 2 . H 4-hidroxifenilo 2- (trifluorometil) fenilamino A-4 3 . H 4-hidroxifenilo 3-(trifluorometil) fenilamino A-4 4 . H 4-hidroxifenilo 4- (trifluorometil) fenilamino A-4 5 . H 4-hidroxifenilo pirid-2-amino A-4 6 . H 4-hidroxifenilo pirid-3-amino A-4 7 . H 4-hidroxifenilo pirid-4-amino A-48 . H 4-hidroxifenilo pirido-2-metilamino A-4 9 . H fenilo 2-carboxibenzilamino A-50 . H fenilo 3-carboxibenzilamino 17 (Continuação)

Composto n° r2 Ri R6Xi A-51. H fenilo 4-carboxibenzilamino A-52 . H fenilo 2-nitrobenzilamino A-5 3 . H fenilo 3-nitrobenzilamino A-5 4 . H fenilo 4-nitrobenzilamino A-5 5 . H fenilo 2-metilbenzilamino A-5 6 . H Fenilo 3-metilbenzilamino A-5 7 . H fenilo 4-metilbenzilamino A-5 8 . H fenilo 2-clorobenzilamino A-5 9 . H fenilo 3-clorobenzilamino A- 6 0 . H fenilo 4-clorobenzilamino A- 61. H fenilo 2-fluorobenzilamino A- 62 . H fenilo 3-fluorobenzilamino A- 63 . H fenilo 4-fluorobenzilamino A-64 . H fenilo 2- (trifluorometil) benzilamino A- 65 . H fenilo 3- (trifluorometil) benzilamino A- 6 6. H fenilo 4- (trifluorometil) benzilamino A-67 . H fenilo fenetil-l-amino A- 6 8 . H fenilo 2-carboxifenilamino A- 6 9. H fenilo 3-carboxifenilamino A-7 0 . H fenilo 4-carboxifenilamino A-71 . H fenilo 2-nitrofenilamino A-7 2 . H fenilo 3-nitrofenilamino A-7 3 . H fenilo 4-nitrofenilamino A-7 4 . H fenilo 2-metilfenilamino A-7 5 . H fenilo 3-metilfenilamino A-7 6 . H fenilo 4-metilfenilamino A-7 7 . H fenilo 2-clorofenilamino 18 (Continuação)

Composto n° r2 Ri ReXi A-7 8. H fenilo 3-clorofenilamino A-7 9. H fenilo 4-clorofenilamino A-80. H fenilo 2-fluorofenilamino A-81. H fenilo 3-fluorofenilamino A-82. H fenilo 4-fluorofenilamino cn 00 1 < H fenilo 2- (trifluorometil) fenilamino A-8 4 . H fenilo 3- (trifluorometil) fenilamino A-85. H fenilo 4- (trifluorometil) fenilamino A-86. H fenilo pirid-2-amino A-8 7 . H fenilo pirid-3-amino A-88 . H fenilo pirid-4-amino 00 1 < H fenilo pirido-2-metilamino A- 90 . H 4-metoxifenilo fenilamino II. Métodos para Prevenção ou Tratamento de Estados Anormais

Noutro aspecto, a invenção caracteriza um método para a prevenção ou tratamento de um estado anormal num organismo. 0 método compreende as seguintes etapas: (a) administração de um composto da invenção, como aqui especificado pela fórmula I, com qualquer das restrições aqui fornecidas, a um organismo; e (b) promoção ou quebra da interacção anormal. 0 termo "organismo" refere-se a toda a entidade viva compreendendo, pelo menos, uma célula. Um organismo pode ser tão 19 simples quanto uma célula eucariótica ou tão complexo quanto um mamífero. Nas formas de realização preferidas, um organismo refere-se a humanos ou mamíferos. 0 termo "prevenção" refere-se ao método da invenção diminuindo a probabilidade ou eliminando a possibilidade de um organismo contrair ou desenvolver o estado anormal. 0 termo "tratamento" refere-se ao método da invenção tendo um efeito terapêutico e, pelo menos, alívio parcial, ou eliminação do estado anormal no organismo. 0 termo "efeito terapêutico" refere-se à inibição do crescimento celular que causa ou contribui para um estado anormal (e. g., cancro). 0 termo "efeito terapêutico" refere-se também à inibição dos factores de crescimento que causam ou que contribuem para o estado anormal. Um efeito terapêutico alivia em alguma extensão um ou mais dos sintomas do estado anormal. Na referência ao tratamento de um cancro, um efeito terapêutico refere-se a um ou mais dos seguintes: (a) uma redução no tamanho do tumor; (b) inibição (í. e., abrandar ou parar) das metástases do tumor; (c) inibição do crescimento do tumor; e (d) aliviando nalguma extensão um ou mais sintomas associados ao estado anormal. Os compostos que demonstram a eficácia contra leucemias podem ser identificados como aqui descrito, com a excepção de que em vez de inibir a metástase, os compostos podem, em vez disso, retardar ou diminuir a proliferação celular ou crescimento celular. 0 termo "estado anormal" refere-se a uma função nas células ou tecidos de um organismo que se desvia das funções normais nesse organismo. Um estado anormal pode estar relacionado com a 20 proliferação celular, diferenciação celular ou sobrevivência celular.

Estados de proliferação celular aberrante incluem cancros tais como distúrbios fibróticos ou mesangiais, angiogénese e vasculogénese anormal, cura de feridas, psoriase, diabetes mellitus e inflamação.

Estados aberrantes de diferenciação incluem, mas não estão limitados a distúrbios neurodegenerativos, velocidades de cura lentas de uma ferid, e técnicas de enxerto de tecido.

Estados aberrantes de sobrevivência celular estão relacionados aos estados em que as vias metabólicas da morte celular programada (apoptose) são activadas ou eliminadas. Uma série de proteínas cinase estão associadas às vias metabólicas de apoptose. As aberrações na função de qualquer uma das proteínas cinase podem conduzir à imortalidade ou morte prematura celular. A proliferação, diferenciação e sobrevivência celular são fenómenos medidos de modo simples por métodos na técnica. Estes métodos podem envolver a observação do número de células ou a aparência das células ao microscópio ao longo do tempo (por exemplo dias). 0 termo "administração" refere-se num sentido geral, à provisão a um organismo e mais especificamente, a um método para incorporação de um composto em células ou em tecidos de um organismo. 0 estado anormal pode ser prevenido ou tratado quando as células ou tecidos do organismo existam dentro do organismo ou no exterior do organismo. As células existentes fora do 21 organismo podem ser mantidas ou crescidas em placas de cultura celular. Para as células abrigadas dentro do organismo, existem múltiplas técnicas na matéria com o objectivo de administrar compostos, incluindo (mas não limitado a) aplicação oral, parentérica, dérmica, injecção e aerossóis. Para células fora do organismo, existem múltiplas técnicas na matéria para administrar os compostos, incluindo (mas não limitado a) técnicas de microinjecção na célula, técnicas de transformação, e técnicas com transportador.

Numa forma de realização preferida, a invenção refere-se a um método de prevenir ou tratar um estado anormal num organismo, onde o composto de base 5-azaquinoxalina tem uma estrutura determinada na fórmula I como aqui definido, ou qualquer dos seus subgrupos aqui apresentados.

Noutras formas de realização preferidas, a invenção refere-se a um método de prevenir ou tratar um estado anormal num organismo, onde o composto de base 5-azaquinoxalina, tendo uma estrutura determinada na fórmula I, é seleccionado do grupo consistindo em compostos de SAQAR.

Noutra forma de realização preferida, a invenção refere-se a um método de prevenir ou tratar um estado anormal num organismo, onde o organismo é um mamífero. 0 termo "mamífero" refere-se, de um modo preferido, a organismos como murganhos, coelhos, cobaios e cabras e, de um modo mais preferido, a macacos, e de um modo muito preferido a humanos. 22

Ainda noutra forma de realização preferida, a invenção refere-se a um método de prevenir ou tratar um estado anormal num organismo, onde o estado anormal é cancro ou distúrbio fibrótico.

Noutra forma de realização preferida, a invenção refere-se a um método de prevenir ou tratar um estado anormal num organismo, onde o cancro é seleccionado do grupo consistindo em cancro do pulmão, cancro do ovário, cancro da mama, cancro do cérebro, cancro intra-axial do cérebro, cancro do cólon, cancro da próstata, sarcoma, sarcoma de Kaposi, melanoma e glioma.

Noutra forma de realização preferida, a invenção refere-se a um método de prevenir ou tratar um estado anormal num organismo, onde o método se aplica a um estado anormal associado a uma aberração numa via metabólica de transdução de sinal, caracterizado por uma interacção entre uma proteína cinase de serina/treonina e o parceiro ligante natural. 0 termo "via metabólica de transdução de sinal" refere-se à propagação de um sinal. Em geral, um sinal extracelular é transmitido através da membrana celular até se transformar num sinal intracelular. Este sinal pode, então, estimular uma resposta celular. 0 termo também engloba sinais que são propagados inteiramente dentro de uma célula. As moléculas de polipéptido envolvidas em processos do transdução do sinal são tipicamente proteínas cinase receptoras e não receptoras, proteínas fosfatase receptoras e não receptoras, factores de troca de nucleótidos e factores de transcrição. 0 termo "aberração", conjuntamente com um processo de transdução de sinal, refere-se a uma proteína cinase que seja 23 sub- ou sobre-expressa num organismo, de tal forma mutada que sua actividade catalítica é mais baixa ou mais alta do que a actividade da proteína cinase do tipo selvagem, mutada de tal forma que pode já não interagir com o parceiro ligante natural, não é modificado por uma outra proteína cinase ou proteína fosfatase, ou não interage com o parceiro ligante natural. 0 termo "promove ou quebra a interacção anormal" refere-se a um método que possa ser realizado pela administração de um composto da invenção às células ou tecidos num organismo. Um composto pode promover uma interacção entre uma proteína cinase e parceiros de ligação natural formando interacções favoráveis com átomos múltiplos no interface do complexo. Alternativamente, um composto pode inibir uma interacção entre uma proteína cinase e os parceiros de ligação natural, comprometendo as interacções favoráveis formadas entre átomos no interface do complexo. Noutra forma de realização preferida, a invenção refere-se a um método de prevenir ou tratar um estado anormal num organismo, onde a proteína cinase de serina/treonina é a RAF. III. Compostos e Composições Farmacêuticas da Invenção

Num outro aspecto, a invenção compreende compostos de base 5-azaquinoxalina que têm uma estrutura tal como apresentado na fórmula I:

24 onde (a) Ri, R2, R3 e R4 são independentemente seleccionados do grupo consistindo de: (i) hidrogénio; (ii) alquilo saturado ou insaturado; (iii) uma amina de fórmula NX2X3 onde X2 e X3 são independentemente seleccionados do grupo consistindo em hidrogénio, porções alquilo saturado ou insaturado, e anel arilo ou heteroarilo de cinco membros ou seis membros; (iv) halogéneo ou tri-halometilo; (v) uma cetona de fórmula -CO-X4 onde X4 é seleccionado do grupo consistindo em hidrogénio, alquilo e porções de arilo ou heteroarilo com cinco membros ou seis membros; (vi) um ácido carboxilico de fórmula (X5)n-COOH ou éster de fórmula - (X6) n-COO-X7, onde X5, Χε e X7 são independentemente seleccionados do grupo consistindo em porções alquilo e arilo ou heteroarilo com cinco membros ou seis membros e onde n é 0 ou 1; 25 (vii) um álcool de fórmula (Xs)n-OH ou uma porção alcóxido de fórmula -(X8)n-0-X9 onde Xs e X9 são independentemente seleccionados do grupo consistindo em hidrogénio, porções alquilo saturado ou insaturado e anel arilo ou heteroarilo de cinco membros ou seis membros, onde o anel é opcionalmente substituído com um, ou mais substituintes independentemente seleccionados do grupo consistindo em alquilo, halogéneo, tri-halometilo, carboxilato, nitro e éster e onde n é 0 ou 1; (viii) uma amida de fórmula -NHCOX10 onde X10 é seleccionado do grupo que consiste em porções alquilo, hidroxilo e anéis arilo ou heteroarilo de cinco membros ou seis membros, onde o anel é opcionalmente substituído com um ou mais substituintes independentemente seleccionados do grupo consistindo em alquilo, halogéneo, tri-halometilo, carboxilato, nitro e éster; (ix) -SO2NX11X12 onde Xn e Xi2 são seleccionados do grupo consistindo em hidrogénio, porções alquilo e anel arilo ou heteroarilo com cinco membros ou seis membros; (x) uma porção de anel arilo ou heteroarilo com cinco membros ou seis membros substituídos opcionalmente com um, dois ou três substituintes seleccionados independentemente do grupo consistindo em alquilo, halogéneo, tri-halometilo, carboxilato, nitro e éster; (xi) um aldeído de fórmula -CO-H; e 26 (xii) uma sulfona de fórmula -SO2-X13/ onde X13 é seleccionado do grupo consistindo em porções alquilo saturado ou insaturado, anel arilo ou heteroarilo de cinco membros ou seis membros; e (b) Xi é seleccionado do grupo consistindo em azoto e enxofre. 0 termo "alquilo saturado" refere-se a uma porção alquilo que não contém qualquer porção alceno ou alcino. A porção alquilo pode ser ramificada ou não ramificada. 0 termo "alquilo insaturado" refere-se a uma porção alquilo que contém, pelo menos, uma porção alceno ou alcino. A porção alquilo pode ser ramificada ou não ramificada. 0 termo "amina" refere-se a uma porção quimica de fórmula NR1R2, ou de o Ri e R2 são seleccionados independentemente do grupo consistindo em hidrogénio, porções alquilo saturado ou insaturado, onde porções de anel arilo ou heteroarilo de cinco membros ou seis membros, onde o anel é opcionalmente com um ou mais substituintes seleccionados independentemente do grupo consistindo em alquilo, halogéneo, tri-halometilo, carboxilato, nitro e porções éster. 0 termo "arilo" refere-se a um grupo aromático que tem, pelo menos, um anel com um sistema de electrões pi conjugados, e inclui ambos os grupos arilos carbociclicos (e. g. , fenilo) e arilos heterociclicos (e. g.f piridina). 0 termo "carbociclico" refere-se a um composto que contém uma ou mais estruturas de 27 anel covalentemente fechados e onde os átomos que dão forma ao esqueleto do anel são todos átomos de carbono. 0 termo distingue, assim, anéis carbocíclicos de anéis heterocíclicos em que o esqueleto do anel contém, pelo menos, um átomo que é diferente do carbono. 0 termo "heteroarilo" refere-se a um grupo arilo que contém, pelo menos, um anel heterocíclico. 0 termo "halogéneo" refere-se a um átomo seleccionado do grupo consistindo em flúor, cloro, bromo e iodo. 0 termo "cetona" refere-se a uma porção química com a fórmula -(R)n-CO-R', onde R e R' são seleccionados do grupo consistindo em porções alquilo saturado ou insaturado e anel arilo ou heteroarilo de cinco membros ou seis membros e onde n é 0 ou 1. 0 termo "ácido carboxílico" refere-se a uma porção química com a fórmula -(R)n-COOH, onde R é seleccionado do grupo consistindo em porções de alquilo saturado ou insaturado e anel arilo ou heteroarilo de cinco membros ou seis membros e onde n é 0 ou 1. 0 termo "éster" refere-se a uma porção química com a fórmula -(R)n-COOR', onde R e R' são seleccionados independentemente do grupo consistindo em porções alquilo saturado ou insaturado e anel arilo ou heteroarilo de cinco membros ou seis membros e onde n é 0 ou 1. 0 termo "álcool" refere-se a um substituinte químico de fórmula -ROH, onde R é seleccionado do grupo consistindo em hidrogénio, alquilo saturado ou insaturado e porções do anel arilo ou heteroarilo de cinco membros ou seis membros, onde o 28 anel é substituído opcionalmente com um ou mais substituintes seleccionados independentemente do grupo consistindo em alquilo, halogéneo, tri-halometilo, carboxilato, nitro e porções éster. 0 termo "amida" refere-se a um substituinte químico de fórmula -NHCOR, onde R é seleccionado do grupo consistindo em hidrogénio, alquilo, hidroxilo e porções de anel arilo ou heteroarilo de cinco membros ou seis membros e onde o anel é substituído opcionalmente com um ou mais substituintes seleccionados independentemente do grupo consistindo em alquilo, halogéneo, tri-halometilo, carboxilato, nitro ou éster. 0 termo "porção alcoxilo" refere-se a um substituinte químico de fórmula -0R, onde R é hidrogénio ou uma porção alquilo saturado ou insaturado. 0 termo "aldeído" refere-se a uma porção química com a fórmula -(R)n-CHO, onde R é seleccionado do grupo consistindo em alquilo saturado ou insaturado e porções de anel arilo ou heteroarilo de cinco membros ou seis membros e onde n é 0 ou 1. 0 termo "sulfona" refere-se a uma porção química com a fórmula -S02-R, onde R é seleccionado do grupo consistindo em alquilo saturado ou insaturado e porções de anel arilo ou heteroarilo de cinco membros ou seis membros.

Noutra forma de realização preferida, a invenção refere-se um composto de base 5-azaquinoxalina, com uma estrutura determinada na fórmula I, onde R3 e R4 são seleccionados independentemente do grupo consistindo em hidrogénio e alquilo saturado ou insaturado. 29

Ainda noutra forma de realização preferida, a invenção refere-se a um composto de base 5-azaquinoxalina que tem uma estrutura determinada na fórmula I, onde R3 e $ são hidrogénio.

Noutras formas de realização preferidas, a invenção refere-se a um composto de base 5-azaquinoxalina, com uma estrutura determinada na fórmula I, onde Ri e R2 são seleccionados do grupo consistindo em hidrogénio, alquilo saturado ou insaturado e porções de anel arilo ou heteroarilo de cinco membros ou seis membros, opcionalmente substituídos por um, dois ou três substituintes seleccionados independentemente do grupo consistindo em porções alquilo, halogéneo, tri-halometilo, hidroxilo, alcoxilo carboxilato, nitro ou éster.

Noutra forma de realização preferida, a invenção refere-se a um composto de base 5-azaquinoxalina, com uma estrutura determinada na fórmula I, onde Ri é fenilo, opcionalmente substituído por um, dois ou três substituintes seleccionados independentemente do grupo consistindo em porções alquilo, halogéneo, hidroxilo e alcoxilo.

Noutra forma de realização preferida, a invenção refere-se a compostos de base 5-azaquinoxalina, onde Ri é fenilo.

Noutras formas de realização preferidas, a invenção refere-se a compostos de base 5-azaquinoxalina, que tem uma estrutura determinada na fórmula I, onde Ri é 4-hidroxifenilo.

Noutras formas de realização preferidas, a invenção refere-se a compostos de base 5-azaquinoxalina, que têm uma estrutura determinada na fórmula I, onde R2 é seleccionado independentemente do grupo consistindo em hidrogénio, alquilo 30 saturado ou insaturado e fenilo opcionalmente substituído com um, dois ou três substituintes seleccionados independentemente do grupo consistindo em porções alquilo, halogéneo, hidroxilo e alcoxilo.

Numa outra forma de realização preferida, a invenção refere-se a um composto de base 5-azaquinoxalina, que tem uma estrutura determinada na fórmula I, onde R2 é hidrogénio.

Ainda noutra forma de realização preferida, a invenção refere-se a um composto de base 5-azaquinoxalina, que tem uma estrutura determinada na fórmula I, onde R2 é metilo.

Ainda Numa outra forma de realização preferida, a invenção refere-se a um composto de base 5-azaquinoxalina, que tem uma estrutura determinada na fórmula I, onde R2 é fenilo.

Numa outra forma de realização preferida, a invenção refere-se a um composto de base 5-azaquinoxalina, que tem uma estrutura determinada na fórmula I, onde o Xi é azoto. Noutras formas de realização preferidas, a invenção refere-se a um composto de base 5-azaquinoxalina, que tem uma estrutura determinada na fórmula I, onde Rõ é seleccionado do grupo consistindo em hidrogénio, alquilo saturado ou insaturado, opcionalmente substituído com porções de anel arilo ou heteroarilo com cinco membros ou seis membros, opcionalmente substituídos por um, dois ou três substituintes seleccionados independentemente do grupo consistindo em porções alquilo, halogéneo, tri-halometilo, hidroxilo, alcoxilo carboxilato, nitro ou éster; uma porção de anel arilo ou heteroarilo com cinco membros ou seis membros, opcionalmente substituídos por um, dois ou três substituintes seleccionados independentemente 31 do grupo consistindo em porções alquilo, halogéneo, tri-halometilo, hidroxilo, alcoxilo carboxilato, nitro ou éster.

Em ainda outras formas de realização preferidas, a invenção refere-se a um composto de base 5-azaquinoxalina, que tem uma estrutura determinada na fórmula I, onde as porções R6 e Xi tomadas em conjunto formam um composto que é seleccionado do grupo consistindo em substituintes SAQAR. 0 termo "substituintes SAQAR" refere-se ao grupo dos substituintes que consistem em benzilamino, 4-fluorobenzilamino, 2- carboxibenzilamino, 3-carboxibenzilamino, 4-carboxibenzilamino, 2-nitrobenzilamino, 3-nitrobenzilamino, 9-nitrobenzilamino, 2-metilbenzilamino, 3-metilbenzilamino, 4-metilbenzilamino, 2-clorobenzilamino, 3-clorobenzilamino, 4-clorobenzilamino, 2-fluorobenzilamino, 3-fluorobenzilamino, 4-fluorobenzilamino, 2-(trifluorometil)benzilamino, 3- (trifluorometil)benzilamino, 4-(trifluorometil)benzilamino, fenilamino, 4-carboxifenilamino, 4-nitrofenilamino, 4-metilfenilamino, 4-clorofenilamino, 2 fenetil-l-amino, 3-carboxifenilamino, 3-nitrofenilamino, 3-metilfenilamino, 3-clorofenilamino, 3- fluorofenilamino, 2- (trifluorometil)fenilamino, 4- (trifluorometil)fenilamino, 2-carboxifenilamino, 2-nitrofenilamino, 2-metilfenilamino, 2-clorofenilamino, fluorofenilamino, 4-fluorofenilamino, 3-(trifluorometil)fenilamino, pirid-2-amino, pirid-3-amino, pirid-4-amino, pirido-2-metilamino. 0 termo "benzilamino" refere-se a um grupo que tem uma estrutura determinada na seguinte fórmula: 32

η2 1^3 ‘W1 onde o anel arilo pode ser opcionalmente substituído na posição 2, 3 ou 4. 0 termo "fenilamino" refere-se a um grupo que tem uma estrutura determinada na seguinte fórmula:

onde o anel arilo pode opcionalmente ser substituído na posição 2, 3 ou 4. 0 termo "fenetil-l-amino" refere-se a um grupo que tem uma estrutura determinada na seguinte fórmula:

0 termo "pirid-2-amino" refere-se a um anel do piridina que é substituído com um grupo NH na posição 2. Do mesmo modo, os termos pirid-3-amino e pirid-4-amino referem-se a um anel de 33 piridina que é substituído com um grupo NH nas posições 3 e 4, respectivamente.

Em ainda outra forma de realização preferida, a invenção refere-se a um composto de base 5-azaquinoxalina, que tem uma estrutura determinada na fórmula I, onde o composto de base 5-azaquinoxalina é seleccionado do grupo consistindo em compostos SAQAR. IV. Métodos Sintéticos da Invenção

Num outro aspecto, a invenção apresenta uma composição farmacêutica, compreendendo um composto que tem a estrutura descrita na fórmula I como aqui definido, ou qualquer dos subgrupos aqui definidos, ou seu sal, e um veículo fisiologicamente aceitável ou diluente.

Numa forma de realização preferida, a invenção refere-se a uma composição farmacêutica, onde o composto de base 5-azaquinoxalina é seleccionado do grupo consistindo em compostos SAQAR. 0 termo "composição farmacêutica" refere-se a uma mistura de um composto da invenção de base 5-azaquinoxalina com outros componentes químicos, tais como diluentes ou veículos. A composição farmacêutica facilita a administração do composto a um organismo. Existem múltiplas técnicas de administrar um composto na técnica, incluindo, mas não limitado a administração oral, injecção, aerossóis, parentérica e tópica. As composições farmacêuticas podem também ser obtidas pela reacção dos compostos com ácidos inorgânicos, tais como ácido clorídrico, 34 ácido bromídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico, ácido metanossulfónico, ácido etanossulfónico, ácido p-toluenossulfónico, ácido salicílico e semelhantes. 0 termo "fisiologicamente aceitável" define um veículo ou diluente que não afecta a actividade e propriedades biológicas do composto. 0 termo "veículo" define um composto químico que facilita a incorporação de um composto em células ou tecidos. Por exemplo o dimetilsulfóxido (DMSO) é um veículo geralmente utilizado porque facilita a absorção de muitos compostos orgânicos nas células ou tecidos de um organismo. 0 termo "diluente" define compostos químicos diluídos em água que irão dissolver o composto de interesse, bem como estabilizar a forma biologicamente activa do composto. Os sais dissolvidos em soluções tamponadas são utilizados como diluentes na técnica. Uma solução tamponada comum utilizada é a solução salina tamponada com fosfatos porque imita as condições salinas do sangue humano. Devido ao facto de que os sais tampão podem controlar o pH de uma solução a baixas concentrações, um diluente tamponado raramente modifica a actividade biológica de um composto.

Ainda num outro aspecto, a invenção apresenta um método para sintetizar um composto da invenção, compreendendo as etapas de: (a) faz reagir 2-amino-6-cloro-3-nitropiridina com um segundo reagente num solvente e na presença de uma base, onde o segundo reagente é seleccionado do grupo consistindo em álcool e uma amina, para se obter o primeiro intermediário; (b) fazer reagir o primeiro intermediário com uma 1,2-diona na presença de 35 um catalizador e um agente redutor; e (d) purificar o produto final. 0 termo "1,2-diona" refere-se a uma porção quimica da fórmula Ri-C (0) C (0)-R2, onde Ri e R2 são seleccionados independentemente do grupo consistindo em hidrogénio, alquilo saturado ou insaturado, opcionalmente substituído com uma porção de anel arilo ou heteroarilo com cinco membros ou seis membros, opcionalmente substituídos com um, dois ou três substituintes seleccionados independentemente do grupo consistindo em porções alquilo, halogéneo, tri-halometilo, hidroxilo, alcoxilo carboxilato, nitro ou éster; uma porção de anel arilo ou heteroarilo com cinco membros ou seis membros, opcionalmente substituído com um, dois ou três substituintes seleccionados independentemente do grupo consistindo em porções alquilo, halogéneo, tri-halometilo, hidroxilo, alcoxilo carboxilato, nitro ou éster.

Numa forma de realização preferida, a invenção refere-se ao método de sintetizar um composto da invenção onde o solvente é n-butanol.

Numa outra forma de realização preferida, a invenção refere-se ao método de sintetizar um composto da invenção onde a base é carbonato de potássio em pó.

Ainda numa outra forma de realização preferida, a invenção refere-se ao método de sintetizar um composto da invenção, onde o segundo reagente é seleccionado do grupo consistindo em reagentes de SAQAR. 36 0 termo "reagentes SAQAR" refere-se ao grupo de reagentes que consistem em benzilamina, 4-fluorobenzilamina, 2- carboxibenzilamina. 3-carboxibenzilamina, 4-carboxibenzilamina, 2-nitrobenzilamina, 3-nitrobenzilamina, 4-nitrobenzilamina, 2-metilbenzilamina, 3-metilbenzilamina, 4-metilbenzilamina, 2-clorobenzilamina, 3-clorobenzilamina, 4-clorobenzilamina, 2-fluorobenzilamina, 3-fluorobenzilamina, 4-fluorobenzilamina, 2-(trifluorometil)benzilamina, 3- (trifluorometil)benzilamina, 4-(trifluorometil)benzilamina, fenetil-l-amina, anilina, 2-carboxianilina, 3-carboxianilina, 4- carboxianilina, 2-nitroanilina, 3-nitroanilina, 4-nitroanilina, 2-toluidina, 3-toluidina, 4-toluidina, 2-cloroanilina, 3-cloroanilina, 4-cloroanilina, 4-fIuoroanilina, 3-(trifluorometil)anilina, 2-aminopiridina, 2-fluoroanilina, 3-fluoroanilina, 2- (trifluorometil)anilina, 4-(trifluorometil)anilina, 3-aminopiridina, 4-aminopiridina e 2-metilaminopiridina.

Ainda noutra forma de realização preferida, a invenção refere-se ao método de sintetizar um composto da invenção onde o terceiro reagente é seleccionado do grupo consistindo em 4-hidroxifenilglioxal, 1-fenil-l,2-propanodiona e benzilo. O termo "catalizador", como aqui utilizado, refere-se a uma molécula quimica que, quando adicionada a um grupo de reagentes, pode aumentar a velocidade em que os reagentes reagem para formar os produtos. Existem muitos tipos de catalisadores conhecidos pelos especialistas na técnica.

Noutra forma de realização preferida, a invenção refere-se aos métodos de síntese dos compostos da invenção, onde o agente redutor é hidrogénio. 37

Noutra forma de realização preferida, a invenção refere-se aos métodos de sintese compostos da invenção, onde o catalizador é níquel de Raney. O resumo da invenção descrita acima é não limitante e outras características e vantagens da invenção serão evidentes das seguintes descrições das formas de realização preferidas e das reivindicações.

Descrição das Formas de Realização Preferidas A presente invenção é direccionada em parte para métodos de modular a função da proteína cinase de serina/treonina com composto de base 5-azaquinoxalina. Além do mais, a invenção refere-se em parte a métodos para identificar os compostos que modulam a função das proteínas cinase de serina/treonina. Os métodos incorporam células que expressam proteínas cinase de serina/treonina, tal como RAF. A RAF é uma proteína cinase não receptora que é recrutada da membrana celular quando esta se liga à proteína RAS activada, uma enzima que hidrolisa guanina trifosfato. A RAS é activada quando um receptor activado da proteína tirosina cinase, tal como EGFR ou PDGFR, se liga a uma proteína adaptadora, GRB2, e um factor de troca do nucleótido de guanina, SOS. 0 SOS remove a guanina difosfato da proteína RAS, substituindo-o com guanina trifosfato, activando desta forma a RAS. RAS liga-se então à RAF e, consequentemente, activa a RAF. A RAF pode então fosforilar outros alvos de proteína em resíduos de serina e treonina, tais como a cinase (MEK) que fosforila e, consequentemente, activa a 38 proteína cinase activada por mitogénio (MAPK). Assim, a RAF serve como um factor intermediário que controla a transdução do sinal de activação do mitogénio.

Devido ao importante papel regulador da RAF nas células, modificações na sequência de aminoácidos da RAF pode alterar a sua função e, consequentemente, modificar o comportamento celular. 0 papel das RAFs na proliferação celular é sublinhado pela observação de que mutações na sequência de aminoácidos da RAF estão associadas a tumores e cancros. Porque as mutações na RAF que causam cancro nas células, levam a moléculas RAF que apresentam actividade catalítica desregulada inibidores da RAF podem aliviar ou mesmo afectar a proliferação celular que conduz estas células ao cancro.

Os métodos da presente invenção podem detectar compostos que modulam a função da proteína cinase RAF nas células. A RAF fosforila uma proteína cinase (MEK) que, por sua vez, fosforila a proteína cinase (MAPK) activada por mitogénio. Os testes que monitorizam somente a fosforilação da MEK pela RAF não são sensíveis porque os níveis de fosforilação da MEK não são significativos. Para superar este dilema na sensibilidade, a fosforilação de MEK e MAPK são seguidas nos testes da presente invenção. 0 sinal do fosforilação da MAPK amplifica o sinal de fosforilação da MEK, permitindo que a fosforilação dependente da RAF seja seguida em ensaios imunoenzimáticos de adsorção. Além do mais, o ensaio da invenção é executado, de um modo preferido, em formato de resposta em número elevado, de modo a que muitos compostos possam ser rapidamente monitorizados num curto espaço de tempo. 39

Os métodos da presente invenção identificaram compostos que inibem a função das proteínas cinase RAF. Estes compostos são derivados de base 5-azaquinolaxina. Embora estes compostos de base 5-azaquinolaxina tenham sido testados pela sua capacidade para inibir enzimas envolvidas na síntese de nucleótidos em bactérias, muitos destes compostos não foram ainda explorados significativamente no que se refere à inibição de proteínas cinase.

Devido ao facto de a RAF exibir uma significativa homologia de aminoácidos com outras proteínas de serina/treonina, os compostos da invenção de base 5-azaquinoxalina podem, provavelmente, inibir outras proteínas cinase de serina/treonina que não a RAF. Assim, os métodos da invenção referem-se também a outras proteínas cinase de serina/treonina, para além da RAF, incluindo proteínas cinase de serina/treonina receptoras e não receptoras.

Os métodos da invenção também se referem a outros compostos que modulam a função da RAF nas células, pois a característica de resposta em número elevado de compostos dos métodos permite que uma vasta quantidade de moléculas possa ser testada num curto período de tempo. Consequentemente, os métodos da invenção podem identificar moléculas existentes que modulam a função da RAF mas que não estejam divulgadas na presente invenção. I. Actividade Biológica dos Compostos de Base 5-Azaquinoxalina

Os compostos de base 5-azaquinoxalina da presente invenção foram testados para a sua capacidade em inibir a função da 40 proteína cinase RAF. Os testes e os resultados biológicos destes estudos de inibição são aqui apresentados. Os métodos utilizados para medir a modulação da função de proteína cinase dos compostos de base 5-azaquinoxalina são semelhantes aos descritos no pedido de patente US, n° de série 08/702232, por Tang et al., e intitulado "Indolinone Combinatorial Libraries and Related Products and Methods for the Treatment of Diseases," (Lyon & Lyon N° de registo 221/187), apresentado a 23 Agosto, 1996, com respeito ao aspecto de resposta em número elevado de compostos do método. O pedido 08/1702232 é aqui incorporado por referência em toda a sua totalidade, incluindo quaisquer desenhos. II. Doenças Alvo a serem Tratadas por Compostos de base 1,4,5-Triazanaftaleno

Os métodos, compostos e composições farmacêuticas aqui descritas são desenhados para a inibição de distúrbios de proliferação celular, pela modulação da função da proteína cinase RAF. Os distúrbios proliferativos resultam de proliferação celular indesejada num ou mais subsectores celulares de um organismo multicelular, resultando em dano para o organismo. Os métodos, compostos e composições farmacêuticas aqui descritos podem também ser úteis no tratamento ou prevenção de outros distúrbios em organismos, tais como distúrbios relacionados com morte celular prematura (i. e., doenças neurológicas) ou inflamação. Estes distúrbios podem ser resultado de um funcionamento impróprio das moléculas RAF ou um resultado de funcionamento impróprio de moléculas de proteínas cinase relacionadas com a RAF. 41

As alterações na função da proteína cinase RAF ou das proteínas cinase relacionadas com a RAF podem conduzir a um aumento ou decréscimo das condições proliferativas das células, evidente em certas doenças. Os estados aberrantes de proliferação celular incluem cancros, distúrbios fibróticos, distúrbios mesangiais, angiogénese e vasculogénese anormal, cura de feridas, psoriase, restenose e inflamação.

Os distúrbios fibróticos referem-se à formação anormal da matriz extracelular. Um exemplo de um distúrbio fibrótico é a cirrose hepática. A cirrose hepática é caracterizada por um aumento da concentração de constituintes extracelulares da matriz, tendo como resultado a formação de uma cicatriz hepática. A cirrose hepática pode causar doenças, tal como a cirrose hepática.

Os distúrbios proliferativos das células mesangiais ocorrem devido à proliferação anormal de células mesangiais. Os distúrbios proliferativos mesangiais incluem várias doenças renais humanas, tais como glomerulonefrite, nefropatia diabética, nefroesclerose maligna, síndromas de microangiopatia trombótica, rejeição de transplante e glomerulopatias.

Os tipos preferidos de cancros que podem ser tratados pelos métodos e compostos da invenção são o cancro do pulmão, cancro do ovário, cancro da mama, cancro do cérebro, cancro intra-axial do cérebro, cancro do cólon, cancro da próstata, sarcoma de Kaposi, melanoma e glioma. Provas de que os compostos e métodos da invenção podem eficazmente ser utilizados para parar e inverter a proliferação de células de cancro estão aqui fornecidas por referência. 42 e vasculogénicos

Distúrbios angiogénicos e vasculogénicos resultam do excesso de proliferação de vasos sanguíneos. A proliferação de vasos sanguíneos é necessária para uma variedade de processos fisiológicos normais, tais como o desenvolvimento embrionário, formação do corpo lúteo, cura de feridas e regeneração de órgãos. No entanto, a proliferação de vasos sanguíneos é também essencial no desenvolvimento de tumor cancerígeno. Outros exemplos de distúrbios proliferativos de vasos sanguíneos incluem artrite, onde os novos vasos sanguíneos capilares invadem a junção e destroem a cartilagem. Além do mais, as doenças de proliferação de vasos sanguíneos incluem doenças oculares, tal como a retinopatia diabética, onde os novos capilares da retina invadem o vitreo, sangram e causam cegueira. Inversamente, distúrbios relacionados com o encolhimento, contracção ou fecho de vasos sanguíneos, tal como a restenose, são implicados também no regulamento adverso de proteínas cinase.

Além disso, a vasculogénese e angiogénese estão associadas ao crescimento de tumores sólidos malignos e metástases. Um tumor cancerígeno com crescimento vigoroso requer um bom fornecimento de oxigénio e nutrientes provenientes do sangue para continuar a crescer. Como uma consequência, um número anormalmente grande de vasos sanguíneos capilares cresce frequentemente em sintonia com o tumor e agem como linhas de fornecimento ao tumor. Além do fornecimento de nutrientes, os novos vasos sanguíneos embebidos num tumor fornecem uma passagem para que células do tumor se incorporem na circulação e originem metástases em locais distantes no organismo. Folkman, 1990, J. Natl. Câncer Inst 82:4-6. 43

Uma actividade imprópria da RAF pode estimular distúrbios proliferativos celulares. Moléculas especificamente desenhadas para modular a função da proteina cinase RAF revelaram inibição da proliferação celular. Especificamente, moléculas de ácido nucleico anti-sentido que foram desenhadas para ao mesmo tempo ligar ao X mensageiro que codifica a proteina cinase RAF e bloquear a transdução dessa mensagem, inverteram eficazmente a transformação de células A549 in vitro. Monia et al., 1996, Nature Medicine 2:688, aqui incorporado por referência na sua totalidade incluindo todas as figuras e tabelas. As células A549 são células malignas humanas.

Estes estudos anti-sentido para a RAF proporcionam provas de que as moléculas de 5-azaquinoxalina da invenção que modulam a função da proteina cinase da RAF, podem parar e, provavelmente, reverter a proliferação de células malignas num organismo. Estes compostos de 5-azaquinoxalina podem ser testados nos métodos in vitro aqui fornecidos como exemplo. Além do mais, os compostos de 5-azaquinoxalina podem ser testados pelo seu efeito em células tumorais in vivo pelos métodos de enxerto também aqui fornecidos como exemplo.

Existem pelo menos duas maneiras em que a actividade imprópria da RAF pode estimular a proliferação celular não desejada de um tipo particular de células: (1) estimulando directamente o crescimento celular particular, ou (2) aumento da vascularização de uma área particular, tal como tecido tumoral, facilitando, desse modo, o crescimento do tecido. A utilização da presente invenção está facilitada pela identificação inicial de que o distúrbio de proliferação celular é derivado da RAF. Uma vez tais distúrbios estarem 44 identificados, os doentes que sofrem de tal distúrbio pode ser identificados pela análise de seus sintomas utilizando processos bem conhecidos por médicos ou veterinários com conhecimentos comuns na matéria. Tais doentes podem, então, ser tratados como aqui descrito.

Determinar se o distúrbio na proliferação celular é derivado da RAF pode ser conseguido pela determinação inicial do nivel da actividade da RAF que ocorre na célula ou numa posição particular no corpo de um doente. Por exemplo, no caso das células cancerígenas, o nível de actividade de uma ou mais proteínas RAF pode ser comparada com cancros não derivados da RAF e cancros derivados da RAF. Se as células cancerígenas tiverem um nível mais elevado de actividade por parte da RAF do que estes cancros derivados da RAF, de um modo preferido igual ou maior do que os cancros derivados da RAF, então, estes são candidatos para o tratamento utilizando os métodos e os compostos de modulação da RAF da invenção.

No caso de distúrbios de proliferação celular que se criam devido à proliferação indesejada de células não-cancerígenas, o nível de actividade da RAF é comparado ao nível que ocorre na população geral (e. g., o nível médio que ocorre na população em geral de pessoas ou animais excluindo aquelas pessoas ou animais que sofrem de um distúrbio proliferativo celular). Se o distúrbio não desejado de proliferação celular for caracterizado por um nível mais elevado de actividade RAF do que a que ocorre na população geral, então o distúrbio é candidato a ser tratado utilizando os métodos de modulação da RAF e os compostos descritos na invenção. 45 III. Composições Farmacêuticas Compostos de Base 5-aAaguinoxalina e

Administração dos

Os métodos de preparação das formulações farmacêuticas dos compostos, métodos de determinação das quantidades de compostos a serem administrados a um doente e modalidades de administrar compostos a um organismo são divulgados no pedido de patente US N°. de Série 08/702232 por Tand et ai., intitulado "Indolinone Combinatorial Libraries and Related Products and Methods for the Treatment of Diseases", (Lyon & Lyon N°. de Registo 221/187), apresentado a 23 Agosto, 1996, e publicação de patente internacional número WO 96/22976 por Buzzetti et ai., e intitulado "Hydrossoluble 3-Arylene-2-Oxindole Derivatives as Tyrosine Kinase Inhibitors", apresentado a 1 Agosto, 1996, sendo ambas aqui incorporadas por referência na sua totalidade, incluindo quaisquer desenhos. Os especialistas na técnica irão reconhecer que tais descrições são aplicáveis à presente invenção e podem facilmente ser adaptados a tal.

Exemplos

Os exemplos abaixo são não limitantes e são meramente representativos de vários aspectos e caracteristicas da presente invenção. Os exemplos descrevem métodos para sintetizar compostos da invenção e métodos para medir um efeito de um composto na função da proteína cinase RAF.

As células utilizadas nos métodos estão comercialmente disponíveis. Os vectores de ácido nucleico incorporados nas células estão também comercialmente disponíveis e as sequências dos genes para as várias proteínas cinase são facilmente 46 acessíveis em bancos de dados de sequências. Assim, um especialista na técnica pode prontamente recriar as linhas celulares de maneira oportuna, combinando as células comercialmente disponíveis, os vectores comercialmente disponíveis de ácido nucleico, e os genes das proteínas cinase, utilizando técnicas prontamente disponíveis a especialistas na técnica.

Exemplo 1: Processos para Sintetizar os Compostos da Invenção De base 5-azaquinoxalina A invenção será ilustrada agora nos seguintes exemplos não limitantes, a menos que indicado de outra maneira: (i) as evaporações foram realizadas por evaporação rotativa em vácuo; (ii) as operações foram realizadas sob uma atmosfera de um gás inerte, tal como o azoto; (iii) cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) foi executada em sílica de fase reversa Merk LiChrosorb RP-18, obtida de E. Merck, Darmstadt, Alemanha; (iv) os rendimentos são dados somente para ilustração, e não são necessariamente o máximo atingível; (v) os pontos de fusão não estão corrigidos e foram determinados utilizando um instrumento digital de medição do ponto de fusão HWS Mainz SG 2000; 47 (vi) as estruturas de todos os compostos da fórmula (I) desta invenção foram confirmados por espectroscopia de ressonância magnética de protão, num espetrofotómetro Bruker AMX500-NMR, por microanálise elementar e, em determinados casos, por espectroscopia de massa; (vii) a pureza das estruturas foi determinada por cromatografia de camada fina (TLC), utilizando silica gel (Silica gel 60 F254 da Merck) ou por HPLC; e (viii) os intermediários geralmente não foram inteiramente caracterizados e a pureza foi avaliada por cromatografia de camada fina (TLC) ou por HPLC.

Processos sintéticos

Composto_A-2 :_6-Benzilamino-3- (4-Hidroxifenil) -5- azaquinoxalina 4-Hidroxifenilglioxal foi preparado a partir de 4-hidroxiacetofenona (Lancaster, Acros) de acordo com o método publicado (J. Amer. Chem. Soc., 71, 1045 (1949)). 2-Amino-6-benzilamino-3-nitropiridina foi preparado a partir de 2-amino-6-cloro-3-nitropiridina, tal como se segue: 2-Amino-6-cloro-3-nitropiridina (17,35 g, 0,10 mol), benzilamina (Fluka) (10,72 g, 0,10 mol) e carbonato de potássio em pó (10,4 g, 0,035 mol) em n-butanol (100 mL) foram aquecidos sob o refluxo por 2 horas. A suspensão foi filtrada e após arrefecer até à temperatura ambiente, o sólido foi recolhido por filtração, lavado com butanol e seco in vácuo a 50 °C para dar 48 2-amino-6-benzilamino-3-nitropiridina (22,2 g, 91%, p.f. 145-146 °C). 6-Benzilamino-3-(4-hidroxifenil)-5-azaquinoxalina foi preparado a partir de 2-amino-6-benzilamino-3-nitropiridina tal como segue: 2-Amino-6-benzilamino-3-nitropiridina (25 g, 0,10 mol) foi hidrogenado a 5,5 bar de H2, na presença de 10 g de Ni-Raney em 400 mL de dioxano a 60 °C. Após 2 horas a mistura de reacção foi arrefecida até à temperatura ambiente, filtrado, foi adicionado 4-hidroxifenilglioxal e agitada durante 2 horas sob uma atmosfera do árgon. A suspensão foi, então, diluida com água, o sólido foi recolhido por filtração, lavado com água, recristalizado a partir de 2-propanol e seco a 50 °C in vácuo, para dar 6-benzilamino-3-(4-hidroxifenil)-5-azaquinoxalina (8 g, 24.4%, p.f. 271-273 °C).

Composto_A-l:_6-Fenilamino-3- (4-hidroxifenil) -5- azaguinoxalina

Substituindo por fenilamina no lugar da benzilamina no processo para o composto A-2, o processo idêntico dá 6-fenilamino-3-(4-hidroxifenil)-5-azaquinoxalina.

Composto A-5: 6-(4-Fluorobenzilamino)-2-metil-3-fenil-5- azaquinoxalina

Substituindo por 1-fenil-l,2-propanodiona no lugar de 4-hidroxifenilglioxal e por 4-fluorobenzilamina no lugar de benzilamina no processo para o composto A-2, o processo idêntico dá 6-(4-fluorobenzilamino)-2-metil-3-fenil-5-azaquinoxalina. 49

Composto A- 6: 2,3-Difenil-6-(4 — fluorobenzilamino)-5- azaquinoxalina

Substituindo por benzilo no lugar de 4-hidroxifenilglioxal e por 4-fluorobenzilamina no lugar de benzilamina no processo para o composto A-2, o processo idêntico dá 2,3-difenil-6-(4-fluorobenzilamino)-5-azaquinoxalina.

Composto A-7; 3-Fenil-6-fenilamino-5-azaguinoxalina

Substituindo por fenilglioxal no lugar de 4-hidroxifenilglioxal e por anilina no lugar de benzilamina no processo para o composto A-2, o processo idêntico dá 3-fenil-6-fenilamino-5-azaquinoxalina.

Compostos A-8 - A-26

Substituindo pelo apropriado substituinte benzilamina no lugar da benzilamina no processo para o composto A-2 o processo idêntico dá os seguintes compostos:

Composto A-8: 6-(2-Carboxibenzilamino)-3-(4-hidroxifenil)- 5-azaquinoxalina

Composto A-9: 6-(3-Carboxibenzilamino)-3-(4-hidroxifenil)- 5-azaquinoxalina

Composto A-10: 6-(4-Carboxibenzilamino)-3-(4-hidroxifenil)- 5-azaquinoxalina 50

Composto A-ll: 3-(4-Hidroxifenil)-6-(2-nitrobenzilamino)-5-azaquinoxalina

Composto A-12: 3-(4-Hidroxifenil)-6-(3-nitrobenzilamino)-5- azaquinoxalina

Composto A-13: 3-(4-Hidroxifenil)-6-(4-nitrobenzilamino)-5- azaquinoxalina

Composto A-14: 3-(4-Hidroxifenil)-6-(2-metilbenzilamino)-5- azaquinoxalina

Composto A-15: 3-(4-Hidroxifenil)-6-(3-metilbenzilamino)-5- azaquinoxalina

Composto A-16: 3-(4-Hidroxifenil)-6-(4-metilbenzilamino)-5- azaquinoxalina

Composto A-17: 6-(2-Clorobenzilamino)-3-(4-hidroxifenil)-5- azaquinoxalina

Composto A-18: 6-(3-Clorobenzilamino)-3-(4-hidroxifenil)-5- azaquinoxalina

Composto A-19: 6-(4-Clorobenzilamino)-3-(4-hidroxifenil)-5- azaquinoxalina

Composto A-20: 6-(2-Fluorobenzilamino)-3-(4-hidroxifenil)-5-azaquinoxalina

Composto A-21: 6-(3-Fluorobenzilamino)-3-(4-hidroxifenil)-5-azaquinoxalina 51

Composto A-22: 6-(4-Fluorobenzilamino)-3-(4-hidroxifenil)- 5-azaquinoxalina

Composto A-23: 3-(4-Hidroxifenil)-6-[2-(trifluorometil) benzilamino]-5-azaquinoxalina

Composto A-24: 3-(4-Hidroxifenil)-6-[3-(trifluorometil) benzilamino]-5-azaquinoxalina

Composto A-25: 3-(4-Hidroxifenil)-6-[4-(trifluorometil) benzilamino]-5-azaquinoxalina

Composto A-26: 3-(4-Hidroxifenil)-6-(fenetil-l-amino)-5- azaquinoxalina

Compostos A-27 - A-48

Substituindo pelo apropriado substituinte anilina no lugar da benzilamina no processo para o composto A-2, o processo idêntico dá os seguintes compostos:

Composto A-27: 6-(2-carboxifenilamino)-3-(4-hidroxifenil)- 5-azaquinoxalina

Composto A-28: 6-(3-Carboxifenilamino)-3-(4-hidroxifenil)- 5-azaquinoxalina

Composto A-29: 6-(4-Carboxifenilamino)-3-(4-hidroxifenil)- 5-azaquinoxalina 52

Composto A-30: azaquinoxalina 3-(4-Hidroxifenil)-6-(2-nitrofenilamino)-5 Composto A-31: azaquinoxalina 3-(4-Hidroxifenil)-6-(3-nitrofenilamino)-5 Composto A-32: azaquinoxalina 3-(4-Hidroxifenil)-6-(4-nitrofenilamino)-5 Composto A-33: azaquinoxalina 3-(4-Hidroxifenil)-6-(2-metilfenilamino)-5 Composto A-34: azaquinoxalina 3-(4-Hidroxifenil)-6-(3-metilfenilamino)-5 Composto A-35: azaquinoxalina 3-(4-Hidroxifenil)-6-(4-metilfenilamino)-5 Composto A-36: azaquinoxalina 6- (2-Clorofenilamino)-3-(4-hidroxifenil)-5 Composto A-37: azaquinoxalina 6- (3-Clorofenilamino)-3-(4-hidroxifenil) -5 Composto A-3B: azaquinoxalina 6- (4-Clorofenilamino)-3-(4-hidroxifenil) -5 Composto A-39: azaquinoxalina 6-(2-Fluorofenilamino)-3-(4-hidroxifenil)-5 Composto A-40: azaquinoxalina 6- (3-Fluorofenilamino)-3-(4-hidroxifenil) -5 53

Composto A-41: 6-(4-Fluorofenilamino)-3-(4-hidroxifenil)-5- azaquinoxalina

Composto A-42: 3-(4-Hidroxifenil)-6-[(2-trifluorometil) fenilamino]-5-azaquinoxalina

Composto A-43: 3-(4-Hidroxifenil)-6-[(3-trifluorometil) fenilamino]-5-azaquinoxalina

Composto A-44: 3-(4-Hidroxifenil)-6-[(4-trifluorometil) fenilamino]-5-azaquinoxalina

Composto A-45: 3-(4-Hidroxifenil)-6-(pirid-2-amino)-5- azaquinoxalina

Composto A-46: 3-(4-Hidroxifenil)-6-(pirid-3-amino)-5- azaquinoxalina

Composto A-47: 3-(4-Hidroxifenil)-6-(pirid-4-amino)-5- azaquinoxalina

Composto A-48: 3-(4-Hidroxifenil)-6-(pirido-2-metilamino)- 5-azaquinoxalina

Compostos A-49 - A-67

Substituindo pelo apropriado substituinte benzilamina no lugar da benzilamina e por fenilglioxal no lugar de 4-hidroxifenilglioxal no processo para o composto A-2, o processo idêntico dá os seguintes compostos: 54

Composto A-49: 6-(2-Carboxibenzilamino)-3-fenil-5- azaquinoxalina

Composto A-50: 6-(3-Carboxibenzilamino)-3-fenil-5- azaquinoxalina

Composto A-51: 6-(4-Carboxibenzilamino)-3-fenil-5- azaquinoxalina

Composto A-52: 6-(2-Nitrobenzilamino)-3-fenil-5- azaquinoxalina

Composto A-53: 6-(3-Nitrobenzilamino)-3-fenil-5- azaquinoxalina

Composto A-54: 6-(4-Nitrobenzilamino)-3-fenil-5- azaquinoxalina

Composto A-55: 6-(2-Metilbenzilamino)-3-fenil-5- azaquinoxalina

Composto A-56: 6-(3-Metilbenzilamino)-3-fenil-5- azaquinoxalina

Composto A-57: 6-(4-Metilbenzilamino)-3-fenil-5- azaquinoxalina

Composto A-58: 6-(2-Clorobenzilamino)-3-fenil-5- azaquinoxalina 55

Composto A-59: 6-(3-Clorobenzilamino)-3-fenil-5- azaquinoxalina

Composto A-60: 6-(4-Clorobenzilamino)-3-fenil-5- azaquinoxalina

Composto A-61: 6-(2-Fluorobenzilamino)-3-fenil-5- azaquinoxalina

Composto A-62: 6-(3-Fluorobenzilamino)-3-fenil-5- azaquinoxalina

Composto A-63: 6-(4-Fluorobenzilamino)-3-fenil-5- azaquinoxalina

Composto A-64: 3-Fenil-6-[2-(trifluorometil)benzilamino]-5-azaquinoxalina

Composto A-65: 3-Fenil-6-[3-(trifluorometil)benzilamino]-5-azaquinoxalina

Composto A-66: 3-Fenil-6-[4-(trifluorometil)benzilamino]-5-azaquinoxalina

Composto A-67: 3-Fenil-6-(fenetil-l-amino)-5-azaquinoxalina

Compostos A-68 - A-89 da

Substituindo pelo benzilamina e apropriado substituinte anilina no lugar por fenilglioxal no lugar de 56 4-hidroxifenilglioxal no processo para o composto A-2, o processo idêntico dá os seguintes compostos:

Composto A-68: azaquinoxalina 6-(2-Carboxifenilamino)-3-fenil-5- Composto A-69: azaquinoxalina 6-(3-Carboxifenilamino)-3-fenil-5- Composto A-70: azaquinoxalina 6-(4-Carboxifenilamino)-3-fenil-5- Composto A-71: azaquinoxalina 6-(2-Nitrofenilamino)-3-fenil-5-

Composto A-72: azaquinoxalina 6-(3-Nitrofenilamino)-3-fenil-5- Composto A-73: azaquinoxalina 6-(4-Nitrofenilamino)-3-fenil-5- Composto A-74: azaquinoxafina 6-(2-Metilfenilamino)-3-fenil-5- Composto A-75: azaquinoxalina 6-(3-Metilfenilamino)-3-fenil-5- Composto A-76: azaquinoxalina 6-(4-Metilfenilamino)-3-fenil-5- 57

Composto A-77: 6-(2-Clorofenilamino)-3-fenil-5- azaquinoxalina

Composto A-78: 6-(3-Clorofenilamino)-3-fenil-5- azaquinoxalina

Composto A-79: 6-(4-Clorofenilamino)-3-fenil-5- azaquinoxalina

Composto A-80: 6-(2-Fluorofenilamino)-3-fenil-5- azaquinoxalina

Composto A-81: 6-(3-Fluorofenilamino)-3-fenil-5- azaquinoxalina

Composto A-82: 6-(4-Fluorofenilamino)-3-fenil-5- azaquinoxalina

Composto A-83: 3-Fenil-6-[(2-trifluorometil)fenilamino]-5-azaquinoxalina

Composto A-84: 3-Fenil-6-[(3-trifluorometil)fenilamino]-5-azaquinoxalina

Composto A-85: 3-Fenil-6-[(4-trifluorometil)fenilamino]-5-azaquinoxalina

Composto A-86: 3-Fenil-6-(pirid-2-amino)-5-azaquinoxalina Composto A-87: 3-Fenil-6-(pirid-3-amino)-5-azaquinoxalina Composto A-88: 3-Fenil-6-(pirid-4-amino)-5-azaquinoxalina 58 3-Fenil-6-(pirido-2-metilamino)-5-

Composto A-89: azaquinoxalina

Composto_A-90 :_6-Fenilamino-3- (4-methoxifenil) -5- azaquinoxalina

Substituindo 4-metoxifenilo no lugar de 4-hidroxifenilo no processo para o composto A-l, o processo idêntico dá 6-fenilamino-3-(4-metoxifenil)-5-azaquinoxalina.

Exemplo 2: Teste de medição da função fosforilante da RAF O seguinte teste determina a quantidade de fosforilação catalizada pela RAF na sua proteina alvo MEK bem como da ΜΆΡΚ, alvo da proteina MEK. A sequência do gene RAF é descrita em Bonner et al., 1985, Molec. Cell Biol. 5:1400-1407, e está prontamente acessível em múltiplas bases de dados de sequências de genes. A construção das linhas do vector de ácidos nucleicos e linhas celulares utilizadas para esta parcela da invenção está inteiramente descrita em Morrison et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85: 8855-8859.

Materiais e Reagentes 1. Células de Sf9 (Spodoptera Frugiperda); GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD. 59 2. Solução tamponada RIPA: 20 mM Tris/HCI pH 7,4, 137 mM de NaCl, 10% glicerol, 1 mM PMSF, 5 mg/L Aprotenina, 0,5% Triton X-100. 3. Proteína de fusão Thioredoxin-MEK (T-MEK): a expressão e a purificação da T-MEK por cromatografia de afinidade foram efectuadas de acordo com os processos do fabricante. N° de Catálogo K 350-01 e R 350-40, Invitrogen Corp., San Diego, CA. 4. His-MAPK (ERK 2); MAPK com marcador HIS foi expressa em células XL1 Blue transformadas com o vector pUC18 que codifica His-MAPK. A His-MAPK foi purificada por cromatografia de afinidade Ni. N° do Cat 27-4949-01, Pharmacia, Alameda, CA, como aqui descrito. 5. IgG de ovelha anti-rato: Laboratórios Jackson, West Grove, PA. N° de Catálogo, 515-006-008, N° de Lote 28563. 6. Anticorpo específico contra proteína cinase RAF-1: URP2653 de UBI.

7. Tampão de Revestimento: PBS; tampão fosfato em solução salina, GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD 8. Tampão de lavagem: TBST - 50 mM Tris/HCL pH 7,2, 150 mM NaCl, Triton X-100 a 0,1% 9. Tampão de bloqueio: TBST, etanolamina a 0,1% a pH 7,4

10. DMSO, Sigma, St. Louis, MO 60 11. Tampão da cinase (KB) : 20 mM Hepes/HCl pH 7,2,

150 mM de NaCl, Triton X-100 a 0,1%, 1 mM PMSF, 5 mg/L

Aprotenina, 75μΜ ortovanadato de sódio, 0,5 mM DTT e 10 mM MgCl2 12. Mistura de ATP: 100 mM MgCl2, 300 μΜ ATP, 10 pCi γ-33Ρ ATP (Dupont-NEN)/mL . 13. Solução de paragem: ácido fosfórico a 1%; Fisher, Pittsburgh, PA. 14. Tapetes de filtros de Fosfato de Celulose Wallac; Wallac, Turku, Finlândia. 15. Solução de lavagem dos filtros: ácido fosfórico a 1%; Fisher, Pittsburgh, PA. 16. Colector de placas Tomtec, Wallac, Turku, Finlândia. 17. Leitor de placas beta Wallac N° 1205, Wallac, Turku, Finlândia. 18. Placas com fundo em V de polipropileno NUNC de 96 poços para compostos, N° de Catálogo Applied Scientific AS-72092. 61

Processo

Todas as seguintes etapas foram conduzidas à temperatura ambiente exepto se especificamente indicado. 1. Revestimento da placa ELISA: Os poços de ELISA são

revestidos com 100 yL de antisoro purificado de afinidade anti-ratinho ovelha. (1 yg/100 yL de tampão de revestimento) durante a noite a 4 °C. As placas ELISA podem ser utilizadas por duas semanas guando armazenados a 4 °C. 2. Inverter a placa e remover o liguido. Adicionar 100 yL de solução de blogueio e incubar por 30 min. 3. Remover a solução de blogueio e lavar guatro vezes com tampão de limpeza. Bater a placa numa toalha de papel para remover o excesso de líquido. 4. Adicionar 1 yg de anticorpo especifico contra RAF-1 a cada poço e incubar por 1 hora. Lavar como descrito no passo 3. 5. Descongelar os lisados das células Sf9 infectadas com RAS/RAF e diluir com TBST até 10 yg/100 yL. Adicionar 10 yg de lisado diluído aos poços e incubar durante 1 hora. Agitar a placa durante a incubação. Os controlos negativos não recebem nenhum lisado. Os lisados de células de insecto Sf9 infectadas com RAS/RAF são preparados depois das células serem infectadas com baculovirus recombinante a uma MOI de 5 para cada virus, e recolhidas 48 horas mais tarde. As células são lavadas 62 uma vez com PBS e lisadas em tampão RIPA. O material insolúvel é removido por centrifugação (5 min a 10000 x g) . Aliquotas do lisado são congeladas em gelo seco/etanol e armazenadas a - 80 °C até utilização. 6. Remover material não ligado e lavar como descrito acima (etapa 3). 7. Adicionar 2 yg da T-MEK e 2 yg de His-MAEPK por poço e ajustar o volume a 40 yL com tampão para cinase. Os métodos para purificar T-MEK e MAPK dos extractos celulares são proporcionados aqui como exemplo. 8. Pré-diluir os compostos (solução de armazenamento a 10 mg/mL DMSO) ou os extratos 20 vezes em TBST mais DMSO a 1%. Adicionar 5 yL dos compostos/extratos pré-diluídos aos poços descritos na etapa 6. Incubar durante 20 min. Os controlos não recebem qualquer fármaco. 9. Começar a reacção da cinase com a adição de 5 yL de mistura de ATP; durante a incubação agitar as placas num agitador de placas de ELISA. 10. Parar a reacção de cinase após 60 min por adição de 30 yL de solução de paragem a cada poço. 11. Colocar o tapete de fosfocelulose e a placa de ELISA colheita de placas Tomtec. Recolher e lavar o filtro com a solução de lavagem do filtro de acordo com a recomendação dos fabricantes. Secar os tapetes filtro. Selar os tapetes filtro e colocá-los no suporte. Introduzir o suporte no aparelho de detecção de 63 radioactividade e quantificar o fósforo radioactivo nos tapetes filtro.

Alternativamente, aliquotas de 40 pL dos poços individuais da placa de teste podem ser transferidos para as posições correspondentes no tapete filtro de fosfocelulose. Após a secagem com ar dos filtros, colocar os filtros num tabuleiro. Balançar delicadamente o tabuleiro, mudando a solução de lavagem em intervalos de 15 min durante 1 hora. Secagem com ar dos tapetes filtro. Selar os tapetes filtro e colocá-los no suporte adequado para a medição do fósforo radioactivo nas amostras. Introduzir o suporte no dispositivo de detecção e quantificar o fósforo radioactivo nos tapetes filtro.

Os valores de IC50 foram medidos de acordo com o protocolo para os seguintes compostos de base 5-azaquinoxalina, no teste ELISA para RAF-1: (A-l) (A-2)

64 (Α-77) (Α-90)

Um valor de IC50 é a concentração do inibidor de base 5-azaquinolina necessário para reduzir a quantidade máxima de proteína alvo fosforilada ou crescimento celular de 50%. Os valores de IC50 medidos no teste de fosforilação RAF-1 estão descritos na Tabela 1: TABELA 1

Composto IC50 (μΜ) A-1 11,5 A-2 7,8 A-7 33 A-3 6 45, 6 A-7 7 20,3 A- 90 98,0

Exemplo 3: Purificação da MAPK e MEK

As proteínas MAPK e MEK são expressas facilmente em células, por subclonação de um gene que codifica estas proteínas num vector disponível comercialmente que expressa proteínas com um marcador de poli-Histidina. Os genes que codificam estas 65 proteínas estão facilmente disponíveis em laboratórios que trabalham normalmente com estas proteínas, ou por clonagem destes genes a partir de células que contêm bibliotecas de ADNc. As bibliotecas estão facilmente disponíveis comercialmente e um especialista na técnica pode prontamente desenhar sondas de ácidos nucleicos homólogos ao ADNc que codificam a MEK ou a MAPK das sequência de ácidos nucleicos de MEK ou MAPK, disponíveis em múltiplas bases de dados de genes tais como o Genbank. A clonagem de um gene pode ser realizado num curto período de tempo utilizando as técnicas actualmente disponíveis a especialistas na matéria. A purificação das proteínas MEK e MAPK a partir de extratos celulares pode ser realizado utilizando o seguinte protocolo, o qual é adaptado de Robbins et al., 1993, J. Biol. Chem. 268:5097-5106: 1. Lisar as células por sonicação, pressão osmótica, ou por técnicas de Prensa Francesa, facilmente disponíveis a especialistas na técnica. Um tampão apropriado para sonicação é fornecido abaixo. 2. Equilibrar um suporte sólido que está conjugado com níquel ou cobalto com o tampão de equilíbrio revelado abaixo. A marcação de poli-Histidina liga especificamente aos átomos de níquel e cobalto no suporte sólido. O equilíbrio pode ser conseguido lavando a resina três vezes com volume do tampão de equilíbrio igual a dez vezes o volume do suporte sólido. O suporte sólido está facilmente disponível aos especialistas na técnica. 66 3. Adicionar o lisado celular ao suporte sólido e equilibrar num recipiente durante um período de tempo. Alternativamente, o suporte sólido pode ser inserido numa coluna do cromatografia de proteínas e o lisado pode passar pelo suporte sólido. 4. Lavar o suporte sólido com o tampão de lavagem revelado abaixo. 5. Eluir a proteína MEK ou MAPK do suporte sólido com uma quantidade de tampão de eluição (fornecido abaixo) que remove uma parcela significativa da proteína do suporte sólido.

Tampão de sonicação 50 mM de fosfato de sódio a pH 8,0 0,3 M de cloreto de sódio 10 mM de β-mercaptoetanol NP4 0 a 1%

10 mM de NaF 0,5 mM de Pefablock

Tampão de equilíbrio 50 mM de fosfato de sódio a pH 8,0 0,3 M de cloreto de sódio 10 mM β-mercaptoetanol NP4 0 a 1% 10 mM de NaF 1 mM de Imidazole 67

Tampão de lavagem 50 mM de fosfato de sódio a pH 8,0 0,3 M de cloreto de sódio 10 mM β-mercaptoetanol NP4 0 a 1% 10 mM de NaF 1 mM de Imidazole

Tampão de Eluiçao 50 mM de fosfato de sódio a pH 8,0 0,3 M de cloreto de sódio 10 mM β-mercaptoetanol NP4 0 a 1%

10 mM de NaF 10 - 500 mM de Imidazole

Exemplo 4: Teste para Medição da Função Fosforilante do Receptor EGF A actividade do receptor EGF de cinase (teste EGFR-NIH3T3) em células inteiras foi medida como descrito em detalhe na publicação PCT W09640116, apresentada a 5 Junho, 1996, por Tang et ai., e intitulado "Indolinone Combinatorial Libraries and Related Products and Methods for the Treatment of Diseases", aqui incorporado por referência na sua totalidade, incluindo todos os desenhos. 68

Os valores de IC50 medidos nos testes de fosforilação do receptor EGF são descritos na Tabela 2: TABELA 2

Composto IC50 (μΜ) A-2 > 50 A-5 > 100 A- 6 > 100 A-7 > 50

Exemplo 5: Teste para Medição do Efeito dos Compostos de base 5-Azaguinoxalina no Crescimento das Células que Expressam RAS 0 seguinte teste determina as velocidades de crescimento para as células NIH-3T3 que expressam RAS. A finalidade do teste é determinar os efeitos dos compostos no crescimento de células de NIH 3T3 que sobre-expressam H-Ras.

Materiais

Placas estéreis de fundo plano de 96 poços Placas estéreis de fundo redondo de 96 poços Reservatórios estéreis de 25 mL ou 100 mL Pipetas estéreis pipetman multicanal Pontas de pipetas estéreis Tubos de 15 mL e 50 mL esterilizados 69

Reagentes 0,4% SRS em ácido acético a 1% 10 mM de base Tris TCA a 10% ácido acético a 1% DMSO estéril (Sigma)

Composto em DMSO (100 mM ou menos de solução de armazenamento)

Tripsina-EDTA (GIBCO BRL)

Linhas celulares: 3T3IH-Ras (células do clone 7 de NIH 3T3, que expressam o fragmento genómico de H-Ras oncogénico).

As células podem ser construídas utilizando o seguinte protocolo: 1. Subclonar um fragmento do gene que codifica a Ras num vector comercialmente disponível que transfecte estavelmente células NIH-3T3. O fragmento provém do alelo de transformação genómica de cHa-ras. 2. Transfectar as células NIH-3T3 com vector subclonado por um método de fosfato de cálcio. Seleccionar células que expressem a construção Ras em soro a 2% em DMEM. Os focos visíveis são observados após 2 semanas. Misturar as células transformadas para gerar uma linha celular transformada estável. 70

Meio de crescimento soro de vitelo a 2% /DMEM + 2 mM glutamina, Pen/Strep

Protocolo:

Dia 0: Plaqueamento celular:

Esta parte do teste é realizada numa câmara de fluxo laminar. 1. Tripsinizar as células. Transferir 200 pL da suspensão de células para 10 mL de isótonico. Contar as células com um contador Coulter. 2. Diluir as células no meio de crescimento até 60000 células/mL. Transferir 100 pL das células para cada poço numa placa de fundo raso de 96 poços para se obter 6000 células/poço. 3. Usar metade da placa (4 filas) para cada composto e quadruplicar os poços para cada concentração do composto, e uma série de 4 poços para meio de controlo. 4. Agitar delicadamente as placas de modo a permitir a ligação uniforme das células. 5. Incubar as placas a 37 °C numa incubadora de CO2 a 10%. 71

Dia 1: Adição do composto:

Esta parte do teste é realizada numa câmara de fluxo laminar. 1. Numa placa de fundo redondo de 96 poços, adicionar 120 pL de meio do crescimento, contendo 2X a % final de DMSO correspondente ao nivel mais alto de concentração do rastreio de selecção do composto, para as colunas 1 a 11. Por exemplo, se a concentração mais elevada for 100 pL, e se esta for feita a partir de uma solução de armazenamento de 100 mM, IX DMSO é 0,1%, de modo que 2X DMSO é 0,2%. Esta placa é utilizada para titular o composto, 4 filas por composto. 2. Num tubo esterilizado de 15 mL, fazer uma solução 2X da concentração rastreada mais elevada do composto no meio de crescimento, mais 2X DMSO. É necessário 1 mL por linha celular. A concentração inicial do composto é usualmente 100 pM mas esta concentração pode variar dependendo da solubilidade do composto. 3. Transferir 240 pL da solução 2X do composto inicial para quadruplicar os poços na coluna 12 da placa de fundo redondo com 96 poços. Fazer diluições em série de 1:2 ao longo da placa da direita para a esquerda, transferindo 12 pL da coluna 12 para a coluna 11, de coluna 11 para a 10 e assim por diante até à coluna 2. Transferir 100 pL de diluições do composto, e 100 pL de meio na coluna 1, em 100 pL de meio em células nos correspondentes poços de placas de 96 poços com fundo raso. O volume total por cada poço deve ser 200 pL. 72 4. Recolocar a placa na incubadora e incubar por mais 3 dias.

Dia 4: Desenvolvimento do Teste

Esta parte do teste é realizada na bancada. 1. Aspirar ou retirar o meio. Adicionar 200 pL de TCA a 10%, frio, a cada poço de modo a fixar as células. Incubar a placa, no minimo, 60 minutos a 4 °C. 2. Retirar o TCA e enxaguar os poços 5 vezes com água da torneira. Secar as placas de cabeça para baixo em toalhas de papel. 3. Corar as células com 100 pL SRB a 0,4%/poço durante 10 minutos. 4. Retirar o SRB e enxaguar os poços 5 vezes com ácido acético a 1%. Secar as placas por completo, de cabeça para baixo, em toalhas de papel. 5. Solubilizar o corante com 100 pL de 10 mM base Tris/poço durante 5-10 min. num agitador. 6. Ler as placas num Leitor de Placas de ELISA Dynatech a 570 nm com referência a 630 nm.

Os compostos seleccionados inibiram a taxa de velocidade de células sobre-expressando RAS como ilustrado na Tabela 3. 73 TABELA 3

Composto IC50 (μΜ) RAS/NIH3T3 A-l 1,04 A-2 7, 6 A-7 13,5 A-3 6 0,18 A-7 7 0,7

Exemplo 6: Teste para Medição do Efeito de Compostos De Base 5-azaquinoxalina no Crescimento das Células A549 0 seguinte teste mede velocidades de crescimento das células A549. A finalidade do teste é determinar os efeitos dos compostos no crescimento de células de carcinoma A549 do pulmão humano. As células A549 estão facilmente acessíveis em fontes comerciais, tais como a ATCC (CCL185).

Materiais:

Placas esterilizadas de fundo raso de 96 poços Placas esterilizadas de fundo redondo de 96 poços Reservatórios esterilizados de 25 mL ou 100 mL Pipetas, pipetman multicanal Pontas de pipetas esterilizadas Tubos de 15 mL e 50 mL esterilizados

Reagentes SRS a 0,4% em ácido acético a 1% 10 mM de base Tris TCA a 10% ácido acético a 1% DMSO esterilizado (Sigma)

Composto em DMSO (100 mM ou menos de solução de armazenamento)

Tripsina-EDTA (GIBCO BRL)

Linhas celulares e meio: Células humanas de carcinoma do pulmão A549 (ATCC CCL185) soro fetal de vitelo a 10% em Ham's F12-K.

Protocolo:

Dia 0: colocação das células nas placas:

Esta parte do teste é realizada numa câmara de fluxo laminar. 1. Tripsinizar as células. Transferir 200 pL da suspensão de células para 10 mL do isotónica. Contar as células com um contador Coulter. 2. Diluir as células no meio de crescimento até 20000 células/mL. Transferir 100 pL das células para 75 cada poço numa placa de fundo raso de 96 poços para se obter 2000 células/poço. 3. Usar metade da placa (4 filas) para cada composto e quadruplicar os poços para cada concentração do composto, e uma série de 4 poços para o controlo do meio. 4. Agitar delicadamente as placas de modo a permitir a ligação uniforme das células. 5. Incubar as placas a 37 °C numa incubadora de CO2 a 10%.

Dia 1; Adição do composto:

Esta parte do teste é realizada numa câmara de fluxo laminar. 1. Numa placa de 96 poços com fundo redondo, adicionar 120 pL de meio do crescimento contendo 2X a % final de DMSO correspondente ao nivel mais alto de concentração no rastreio do composto para as colunas 1 a 11. Por exemplo, se a concentração de rastreio mais elevada for 100 pL, e se esta for feita a partir de uma solução de armazenamento de 100 mM, IX DMSO é 0,1%, de modo que 2X DMSO é 0,2%. Esta placa é utilizada para titular os compostos, 4 filas por composto. 2. Em tubos esterilizados de 15 mL, fazer uma solução 2X da concentração de rastreio mais elevada do composto em 76 meio de crescimento, mais 2X DMSO. É necessário 1 mL por linha celular. A concentração inicial do composto é usualmente 100 μΜ mas esta concentração pode variar dependendo da solubilidade do composto. 3. Transferir 240 pL da solução 2X do composto inicial para quadruplicar os poços na coluna 12 da placa de 96 poços com fundo redondo. Fazer diluições em série de 1:2 ao longo da placa da direita para a esquerda, transferindo 12 pL da coluna 12 para a coluna 11, de coluna 11 para a 10 e assim por diante até à coluna 2. Transferir 100 pL de diluições do composto, e 100 pL de meio na coluna 1, em 100 pL de meio em células nos poços correspondentes de placas de 96 poços com fundo raso. O volume total por poço deve ser de 200 pL. 4. Recolocar a placa na incubadora e incubar por mais 3 dias.

Dia 4: Desenvolvimento do Teste

Esta parte do teste é realizada na bancada. 1. Aspirar ou retirar o meio. Adicionar 200 pL de TCA a 10%, frio, a cada poço de modo a fixar as células. Incubar a placa no mínimo 60 minutos a 4 °C. 2. Retirar o TCA e enxaguar os poços 5 vezes com água da torneira. Secar as placas de cabeça para baixo em toalhas de papel. 77 3. Corar células com 100 yL SRB a 0,4%/poço durante 10 min. 4. Retirar o SRB e enxaguar os poços 5 vezes com ácido acético a 1%. Secar as placas por completo de cabeça para baixo, em toalhas de papel. 5. Solubilizar o corante com 100 yL de 10 mM base Tris/poço durante 5-10 min num agitador. 6. Ler as placas num Leitor de Placas ELISA Dynatech a 570 nm com referência a 630 nm.

Os compostos seleccionados inibiram as velocidades de crescimento das células A549, como ilustrado na Tabela 4. TABELA 4

Composto IC50 (yM) A54 9 A-2 25,1 > (2% FBS) A-6 23,8 > 10 (2% FBS)

Exemplo 7: Método para Determinar a Actividade Biológica de Moduladores da RAF in vivo

Os estudos de enxerto de tecidos podem ser utilizados para monitorizar o efeito dos compostos da invenção durante a inibição dos cancros do ovário, melanoma, próstata, células tumorais do pulmão e mamárias. O protocolo para o teste está descrito em detalhe na publicação PCT W09640116, publicada a 78 5 Junho, 1996, por Tang et al. e intitulada "Indolinone Combinatorial Libraries and Related Products and Methods for the Treatment of Diseases", aqui incorporado por referência na sua totalidade, incluindo quaisquer desenhos. A invenção, aqui descrita ilustrativamente, pode ser praticada na ausência de qualquer elemento ou elementos, limitação ou limitações que não são divulgadas aqui especificamente. Os termos e expressões que têm sido empregues são utilizados como termos para descrição e não para limitação, e não há nenhuma intenção de que, ao se utilizar tais termos e expressões, de excluir alguns equivalentes das caracteristicas mostradas e descritas ou parcelas destas, mas reconhece-se que são possíveis várias modificações dentro do âmbito da invenção reivindicada. Assim, deve-se compreender que embora a presente invenção esteja divulgada pelas formas de realização preferidas e caracteristicas adicionais, modificações e variações dos conceitos aqui divulgados podem ser efectuadas por especialistas na matéria, e que tais modificações e variações são consideradas estar dentro do âmbito desta invenção como definidas pelas reivindicações em anexo.

Essas referências não previamente incorporadas aqui como referência, incluindo referências tanto de patentes como não, estão expressamente incorporadas aqui por referência para todos os propósitos. Outras formas preferidas de realização estão dentro das reivindicações seguintes.

Lisboa, 20 de Outubro de 2006 79

Claims (18)

1. REIVINDICAÇÕES Compostos de base 5-azaquinoxalina tendo uma estrutura tal como determinado na fórmula I:

   m em que (a) Ri, R2, R3 e R4 são independentemente seleccionados do grupo constituído por: (i) hidrogénio; (ii) alquilo saturado ou insaturado opcionalmente substituídos por porções de anel arilo ou heteroarilo de cinco membros ou seis membros, onde a referida porção de anel é opcionalmente substituído por um, dois ou três substituintes independentemente seleccionados do grupo consistindo em porções alquilo, halogéneo, tri-halometilo, carboxilato, nitro e éster; (iii) uma amina de fórmula NX2X3 onde X2 e X3 são independentemente seleccionados do grupo consistindo em hidrogénio, porções alquilo saturado ou insaturado, e anel arilo ou heteroarilo de cinco membros ou seis membros; (iv) halogéneo ou tri-halometilo; (v) uma cetona de fórmula -CO-X4 onde X4 é seleccionado do grupo consistindo em hidrogénio, porções alquilo, arilo ou heteroarilo com cinco membros ou seis membros; (vi) um ácido carboxílico de fórmula -(Χ5)η-ΟΟΟΗ ou éster de fórmula - (Xe) n-COO-Xj, onde X5, Xe e X7 são independentemente seleccionados do grupo consistindo em porções alquilo e arilo ou heteroarilo com cinco membros ou seis membros e onde n é 0 ou 1; (vii) um álcool de fórmula (X6)n-OH ou um substituinte alcóxido de fórmula -(X8)n-0-X9 onde Xs e X9 são independentemente seleccionados do grupo consistindo em porções alquilo saturado ou insaturado, anel arilo ou heteroarilo de cinco membros ou seis membros, em que o referido anel é opcionalmente substituído com um, dois ou três substituintes independentemente seleccionados do grupo consistindo em porções alquilo, halogéneo, tri-halometilo, carboxilato, nitro ou éster e onde n é o ou 1; (viii) um amida de fórmula -NHCOX10 onde X10 é seleccionado do grupo consistindo em porções alquilo, hidroxilo e anéis arilo ou heteroarilo de cinco membros ou seis membros, onde o referido anel é opcionalmente substituído com um ou mais substituintes independentemente seleccionados do grupo consistindo em porções alquilo, halogéneo, tri-halometilo, carboxilato, nitro e éster; 2 (ix) -SO2NX11X12 onde Xn e X12 são independentemente seleccionados do grupo consistindo em hidrogénio, porções alquilo e anel arilo ou heteroarilo com cinco membros ou seis membros; (x) uma porção de anel arilo ou heteroarilo com cinco membros ou seis membros opcionalmente substituído com um, dois ou três substituintes independentemente seleccionados do grupo consistindo em porções alquilo, halogéneo, tri-halometilo, carboxilato, nitro ou éster; (xi) um aldeído de fórmula -CO-H; (xii) uma sulfona de fórmula -SO2-X13, onde X13 é seleccionado do grupo consistindo em porções alquilo saturado ou insaturado e anel arilo ou heteroarilo de cinco membros ou seis membros; e (b) R6 é seleccionado do grupo consistindo de: (i) uma amina de fórmula NX2X3, onde X2 e X3 são independentemente seleccionados do grupo consistindo em hidrogénio, porções alquilo saturado ou insaturado e anel arilo ou heteroarilo de cinco membros ou seis membros; (ii) halogéneo ou tri-halometilo; (iii) cetona de fórmula -CO-X4, onde X4 é seleccionado do grupo consistindo em hidrogénio, porções alquilo e arilo ou heteroarilo de cinco membros ou seis membros; 3 (iv) um ácido carboxílico de fórmula -(X5)n-C00H ou éster de fórmula - (Xe) -COO-X7, onde X5, Xe e X7 são independentemente seleccionados do grupo consistindo em porções alquilo e arilo ou heteroarilo de cinco membros ou seis membros e onde n é 0 ou 1; (v) um álcool de fórmula (X8)n_OH ou uma porção alcoxilo ou fórmula -(XsJnO-Xg onde o X8 e X9 são independentemente seleccionados do grupo consistindo em porções alquilo saturado ou insaturado e anel arilo ou heteroarilo de cinco membros ou seis membros, em que o referido anel é opcionalmente substituído com um ou mais substituintes independentemente seleccionados do grupo consistindo em alquilo, halogéneo, tri-halometilo, carboxilato, nitro e éster e onde n é 0 ou 1/ (vi) uma amida de fórmula -NHCOX10 onde X10 é seleccionado do grupo consistindo em porções alquilo, hidroxilo e de anel arilo ou heteroarilo de cinco membros ou seis membros, em que o referido anel substituinte é opcionalmente substituído com um ou mais substituintes independentemente seleccionados do grupo consistindo em alquilo, halogéneo, tri-halometilo, carboxilato, nitro ou éster; (vii) -SO2NX11X12, onde Xn e X12 são independentemente seleccionados do grupo consistindo em hidrogénio, alquilo e porções de anel arilo ou heteroarilo de cinco membros ou seis membros; (viii) uma porção de anel arilo ou heteroarilo de cinco membros ou seis membros opcionalmente substituído com um 4 dois ou três substituintes independentemente seleccionados do grupo consistindo em porções alquilo, halogéneo, tri-halometilo, carboxilato, nitro ou éster; (ix) um aldeido de fórmula -CO-H; (x) uma sulfona de fórmula -SO2-X13 onde X13 é seleccionado do grupo consistindo em porções alquilo saturado ou insaturado e anel arilo ou heteroarilo de cinco membros ou seis membros; (xi) alquilo saturado ou insaturado opcionalmente substituído com porções de anel arilo ou heteroarilo de cinco membros ou seis membros, em que a referida porção de anel é opcionalmente substituída com um, dois ou três substituintes independentemente seleccionados do grupo consistindo de porções alquilo, halogéneo, tri- halometilo, carboxilato, nitro e éster; (c) Xi é seleccionado do grupo consistindo nos substituintes azoto e enxofre.
2. 2. Composto da reivindicação 1, em que Ri, R2, R3 e R4 são independentemente seleccionados do grupo consistindo em: (i) hidrogénio; (ii) alquilo saturado ou insaturado opcionalmente substituído com uma porção de anel arilo ou heteroarilo de cinco membros ou seis membros, opcionalmente substituído com um, dois ou três substituintes independentemente seleccionados do grupo consistindo em 5 porções alquilo, halogéneo, tri-halometilo, carboxilato, nitro e éster; (iii) anel arilo ou heteroarilo de cinco membros ou seis membros, opcionalmente substituído com um, dois ou três substituintes independentemente seleccionados do grupo consistindo em porções alquilo, halogéneo, tri-halometilo, carboxilato, nitro ou éster, em que R6 é seleccionado de (i) uma porção de anel arilo ou heteroarilo de cinco membros ou seis membros, opcionalmente substituído com um, dois ou três substituintes independentemente seleccionados do grupo consistindo em porções alquilo, halogéneo, tri-halometilo, carboxilato, nitro ou éster; (ii) alquilo saturado ou insaturado opcionalmente substituído com uma porção de anel arilo ou heteroarilo de cinco membros ou seis membros, opcionalmente substituído com um, dois ou três substituintes independentemente seleccionados do grupo consistindo em porções alquilo, halogéneo, tri-halometilo, carboxilato, nitro e éster.
3. 3. Compostos da reivindicação 2, em que os referidos R3 e R4 são hidrogénio.
4. 4. Composto da reivindicação 3, em que os referidos Ri e R2 são independentemente seleccionados do grupo consistindo em: 6 (i) metilo opcionalmente substituído com fenilo opcionalmente substituído com substituintes seleccionados do grupo consistindo em porções alquilo e halogéneo; e (ii) fenilo opcionalmente com substituintes seleccionados do grupo consistindo em porções alquilo e halogéneo.
5. 5. Composto da reivindicação 4, em que os referidos Ri e R2 são independentemente seleccionados do grupo consistindo em hidrogénio, porções de metilo, fenilo e 4-hidroxifenilo.
6. 6. Compostos da reivindicação 4, em que o referido Xi é o azoto.
7. 7. Compostos da reivindicação 6, em que os referidos substituontes R6 e Xi tomados em conjunto formam uma porção seleccionada do grupo consistindo em benzilamino, 4-fluorobenzilamino, 2-carboxibenzilamino, 3- carboxibenzilamino, 4-carboxibenzilamino, 2- nitrobenzilamino, 3-nitrobenzilamino, 4- nitrobenzilamino, 2-metilbenzilamino, 3- metilbenzilamino, 4-metilbenzilamino, 2- clorobenzilamino, 3-clorobenzilamino, 4- clorobenzilamino, 2-fluorobenzilamino, 3- fluorobenzilamino, 4-fluorobenzilamino, 2-(trifluorometil)benzilamino, 3-(trifluorometil)benzilamino, 4- (trifluorometil)benzilamino, fenetil-l-amino, fenilamino, 2- carboxifenilamino, 3-carboxifenilamino, 4-carboxifenilamino, 2-nitrofenilamino, 3- nitrofenilamino, 4-nitrofenilamino, 4-metilfenilamino 2-metilfenilamino, 3-metilfenilamino, 7 2-clorofenilamino, 3-clorofenilamino, 4-clorofenilamino, 2- fluorofenilamino, 3-fluorofenilamino, 4-fluorofenilamino, 2-(trifluorometil)fenilamino, 3- (trifluorometil)fenilamino, 4- (trifluorometil)fenilamino, pirid-2-amino, pirid-3-amino, pirid-4-amino e pirido-2-metilamino.
8. 8. Composição farmacêutica que compreende compostos de base 5-azaquinoxalina, como reivindicado nas reivindicações 1 a 7, ou um seu sal e um veiculo ou diluente f isiologicamente aceitável.
9. 9. Composto de base 5-azaquinoxalina como reivindicado nas reivindicações 1 a 7 ou um seu sal para a utilização em terapia.
10. 10. Utilização de um composto de base 5-azaquinoxalina como reivindicado em qualquer das reivindicações 1 a 7 para a manufactura de um medicamento para o tratamento de uma doença modulada pela expressão celular de uma proteina cinase de serina/treonina, em que a doença é um cancro, em particular cancro do pulmão, cancro do ovário, cancro da mama, cancro do cérebro, cancro intra-axial do cérebro, cancro do cólon, cancro da próstata, sarcoma, sarcoma de Kaposi, melanoma e glioma, ou um distúrbio fibrótico.
11. 11. Utilização de um composto de base 5-azaquinoxalina como reivindicado em qualquer das reivindicações 1 a 7 para o tratamento in vitro de modulação da função de uma proteina cinase de serina/treonina. 8
12. 12. Utilização de acordo com as reivindicações 10 e 11, em que a proteína cinase de serina/treonina é RAF.
13. 13. Utilização de um composto de base 5-azaquinoxalina como reivindicado em qualquer das reivindicações 1 a 7 para a manufactura de um medicamento para o tratamento de cancro ou de um distúrbio fibrótico.
14. 14. Utilização de acordo com a reivindicação 13, em que o referido medicamento é para o tratamento de um cancro seleccionado do grupo consistindo em cancro do pulmão, cancro do ovário, cancro da mama, cancro do cérebro, cancro intra-axial do cérebro, cancro do cólon, cancro da próstata, sarcoma, sarcoma de Kaposi, melanoma e glioma.
15. 15. Utilização de acordo com a reivindicação 13 ou 14, em que o referido medicamento é para o tratamento de um estado associado a uma aberração numa via de transdução de sinal caracterizada por uma interacção entre uma proteína cinase de serina/treonina e o parceiro ligante natural, onde o estado é um cancro, em particular cancro do pulmão, cancro do ovário, cancro da mama, cancro do cérebro, cancro intra-axial do cérebro, cancro do cólon, cancro da próstata, sarcoma, sarcoma de Kaposi, melanoma e glioma, ou um distúrbio fibrótico.
16. 16. Utilização de acordo com a reivindicação 15, em que a proteína cinase de serina/treonina é a RAF.
17. 17. Método de modulação in vitro da função de uma proteína cinase de serina/treonina que compreende fazer contactar as células que expressam a referida proteína cinase de serina/treonina 9 com um composto de base 5-azaquinoxalina como reivindicado em qualquer das reivindicações 1 a 7.
18. 18. Método de acordo com a reivindicação 17, em que a proteina cinase de serina/treonina é a RAF. Lisboa, 20 de Outubro de 2006 10