JP2001518496A - ５−アザキノキサリンをベースとする化合物によりセリン／トレオニンプロテインキナーゼの機能を調整する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、部分的にセリン／トレオニンプロテインキナーゼの機能を５−アザキノキサリンをベースとする化合物によって調整する方法に関する。該方法はセリン／トレオニンプロテインキナーゼ、例えばＲＡＦを発現する細胞を導入している。更に、本発明は生物におけるセリン／トレオニンプロテインキナーゼ関連の異常状態を本発明により同定された化合物を使用して予防および治療する方法を記載している。更に、本発明は５−アザキノキサリン化合物および該化合物を含有する医薬品組成物に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】従来の技術 本発明の背景の以下の記載は本発明の理解を助けるが、本発明に対する直接の
先行技術であるとは認められない。

【０００２】 細胞のシグナル伝達は、細胞プロセスを調節する外部の刺激を細胞の内部に中
継する種々の必須の機構である。シグナル伝達の重要な生化学的機構の１つはタ
ンパク質の可逆的なリン酸化に関連し、これはその構造および機能の変化によっ
て成熟タンパク質の活性を調節することを可能にする。

【０００３】 真核生物で最も特徴的なプロテインキナーゼはタンパク質をセリン、トレオニ
ンおよびチロシン残基のアルコール部でリン酸化する。これらのキナーゼは殆ど
が、セリンおよびトレオニンのリン酸化に特異的およびチロシンのリン酸化に特
異的な２つのグループに含まれる。“二者特異性（dual specificity）”キナー
ゼと呼ばれる幾つかのキナーゼはチロシンならびにセリン／トレオニン残基での
リン酸化が可能である。

【０００４】 またプロテインキナーゼは細胞中のその所在によって分類することができる。
幾つかのキナーゼは細胞膜外のリガンドを結合できる膜内外レセプターである。
リガンドの結合はレセプタープロテインキナーゼの触媒活性を変化させる。その
他は、膜内外ドメインを欠損する非レセプタータンパク質である。非レセプター
のプロテインキナーゼは、細胞膜の内表面から細胞核までの種々の細胞の区画で
見いだすことができる。

【０００５】 多くのキナーゼは調節カスケードに関連し、その基質は活性がリン酸化状態に
よって調節されている他のキナーゼを含んでよい。最終的には、下流のエフェク
ターの活性は前記の経路の活性化に起因するリン酸化によって調整される。

【０００６】 セリン／トレオニンキナーゼファミリーは、細胞増殖、細胞移行、細胞分化、
遺伝子発現、筋収縮、グルコース代謝、細胞タンパク質合成および細胞周期の調
節をコントロールするカスケードを含むシグナルカスケードの多くの段階を調節
するメンバーを含む。

【０００７】 セリンおよびトレオニン残基を標的にタンパク質をリン酸化する非レセプター
プロテインキナーゼの例はＲＡＦである。ＲＡＦは他のプロテインキナーゼ、例
えばリン酸化ひいてはマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）の活
性化をもたらす他のプロテインキナーゼの触媒活性を調整する。ＲＡＦそれ自体
は、膜に連結しているタンパク質ＲＡＳによって活性化され、またＲＡＳはリガ
ンド活性化チロシンレセプタープロテインキナーゼ、例えば上皮細胞成長因子レ
セプター（ＥＧＦＲ）および血小板由来成長因子レセプター（ＰＤＧＦＲ）に応
じて活性化される。細胞イベントの制御におけるＲＡＦの生物学的な重要性は、
ＲＡＦの変化形が生物に癌をもたらす可能性が見いだされたことによって強調さ
れている。悪性腫瘍におけるＲＡＦの重要性に関する証拠はＭｏｎｉａ他．，１
９９６，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ２：６６８に提供されており、全ての 図面および表を含む全内容において引用することにより本明細書に記載されたも
のとする。

【０００８】 癌および他の病気のための新規の治療を開発するために、生物医学の研究者お
よび化学者はプロテインキナーゼの機能を阻害する分子を設計し、合成し、かつ
試験している。幾つかの小さな有機分子はプロテインキナーゼの機能を調整する
化合物のクラスを形成する。プロテインキナーゼの機能を阻害すると報告されて
いる分子の例はビス単環式、二環式もしくは複素環式アリール化合物（ＰＣＴ ＷＯ９２／２０６４２号）、ビニレン−アザインドール誘導体（ＰＣＴ ＷＯ９ ４／１４８０８号）、１−シクロプロピル−４−ピリジルキノロン（米国特許第
５３３０９９２号明細書）、スチリル化合物（Ｌｅｖｉｔｚｋｉ他による、米国
特許第５２１７９９９号、表題“ＥＧＦレセプタープロテインチロシンキナーゼ
を阻害するスチリル化合物”Ｌｙｏｎ＆Ｌｙｏｎ Ｄｏｃｋｅｔ Ｎｏ．２０８／
０５０）、スチリル置換ピリジル化合物（米国特許第５３０２６０６号明細書）
、一定のキナゾリン誘導体（ＥＰ出願第０５６６２６６号（Ａ１））、セレオイ
ンドールおよびセレニド（ＰＣＴ ＷＯ９４／０３４２７号）、三環式ポリヒド ロキシル化合物（polyhydroxylic compound）（ＰＣＴ ＷＯ９２／２１６６０号
）およびベンジルホスホン酸化合物（ＰＣＴ ＷＯ９１／１５４９５号）である 。

【０００９】 細胞膜を透過することができ、かつ酸加水分解に耐性である化合物は、患者に
経口で適用した後に高度に生物学的利用能があるので潜在的に有利である。しか
しながら、これらのプロテインキナーゼインヒビターの多くはプロテインキナー
ゼの機能を僅かに弱く阻害するだけである。更に、多くは種々のプロテインキナ
ーゼを阻害し、従って疾患のための治療剤のように多様な副作用をもたらす。

【００１０】 癌の治療のための化合物の開発における多大な進歩に拘わらず、該分野におい
ては特定のプロテインキナーゼの機能を調整することが可能な特定の構造および
置換パターンの同定が必要とされている。

【００１１】本発明の概略 本発明は、セリン／トレオニンプロテインキナーゼの機能を５−アザキノキサ
リンをベースとする化合物によって調整する方法に部分的に向けられている。該
方法はＲＡＦのようなセリン／トレオニンプロテインキナーゼを発現する細胞を
導入している。更に、本発明は、本明細書に記載されるような方法で同定された
化合物によって、セリン／トレオニンプロテインキナーゼに関連する生物の異常
状態を予防および治療する方法を記載している。更に、本発明は、本発明の方法
によって同定された化合物を含有する医薬品組成物に関する。

【００１２】Ｉ．セリン／トレオニンプロテインキナーゼ機能を調整する化合物のスクリーニ ング方法 本発明の方法は、レセプターおよびサイトゾルのセリン／トレオニンプロテイ
ンキナーゼの両者の機能を調整するための手段を提供している。前記方法は、イ
ンビトロおよびインビボの両者で酵素を調整する手段を提供している。インビト
ロでの適用のためには、本発明の方法は部分的にセリン／トレオニンプロテイン
キナーゼの機能を調整する化合物の同定方法に関する。

【００１３】 従って第１の態様において、本発明はアザベンズイミダゾールをベースとする
化合物によって、セリン／トレオニンプロテインキナーゼの機能を調整する方法
を特徴とする。場合によりアザベンズイミダゾール化合物は有機基で置換されて
いる。該方法はセリン／トレオニンプロテインキナーゼを発現する細胞と前記化
合物とを接触させることからなる。

【００１４】 用語“機能”はセリン／トレオニンプロテインキナーゼの細胞での役割を示し
ている。セリン／トレオニンプロテインキナーゼファミリーは細胞増殖、細胞移
行、細胞分化、遺伝子発現、筋収縮、グルコース代謝、細胞タンパク質合成、な
らびに細胞周期の調節をコントロールするカスケードを含むシグナル伝達カスケ
ードにおける多くの段階を調節するメンバーを含む。

【００１５】 用語“触媒活性”は、本発明に関してはプロテインキナーゼが基質をリン酸化
する速度を定義している。触媒活性は、例えば生成物に変換された基質の量を時
間の関数として決定することによって測定できる。基質のリン酸化はプロテイン
キナーゼの活性部位で生じる。活性部位は通常、基質がプロテインキナーゼに結
合しかつリン酸化される空隙である。

【００１６】 本明細書で使用されるような用語“基質”はセリン／トレオニンプロテインキ
ナーゼによってリン酸化される分子を示している。有利には基質はペプチドであ
り、より有利にはタンパク質である。プロテインキナーゼＲＡＦに関して、有利
な基質はＭＥＫであり、かつＭＥＫの基質はＭＡＰＫである。

【００１７】 用語“活性化する”はプロテインキナーゼの細胞での機能を増大させることを
意味する。有利にはプロテインキナーゼ機能は本来の結合パートナーとの相互作
用であり、より有利には触媒活性である。

【００１８】 用語“阻害する”はプロテインキナーゼの細胞での機能を低下させることを意
味する。有利にはプロテインキナーゼ機能は本来の結合パートナーとの相互作用
であり、より有利には触媒活性である。

【００１９】 用語“調整する”は、複合体がプロテインキナーゼおよび本来の結合パートナ
ー間で形成する確率を増大または減少させることによってプロテインキナーゼの
機能を変化させることを意味する。有利には調整物質は、複合体がプロテインキ
ナーゼと本来の結合パートナーとの間で形成する確率を増大させ、より有利には
複合体がプロテインキナーゼと本来の結合パートナーとの間で形成する確率をプ
ロテインキナーゼに作用する化合物の濃度に依存して増大または減少させ、最も
有利には複合体がプロテインキナーゼと本来の結合パートナーとの間で形成する
確率を減少させる。有利には調整物質はプロテインキナーゼの触媒活性を活性化
するか、より有利にはプロテインキナーゼの触媒活性を該プロテインキナーゼに
作用する化合物の濃度に依存して活性化もしくは阻害するか、または最も有利に
はプロテインキナーゼの触媒活性を阻害する。

【００２０】 用語“複合体”は互いに結合した少なくとも２つの分子の集合を示す。しばし
ばシグナル伝達複合体は互いに結合した少なくとも２つの分子を有する。例えば
プロテインチロシンレセプタープロテインキナーゼ、ＧＲＢ２、ＳＯＳ、ＲＡＦ
およびＲＡＳは会合し、マイトジェンリガンドに応じてシグナル伝達複合体を形
成する。

【００２１】 用語“本来の結合パートナー”は細胞中でプロテインキナーゼに結合するポリ
ペプチドを示す。本来の結合パートナーは、プロテインキナーゼシグナル伝達プ
ロセスにおいてシグナルを伝える役割を果たす。プロテインキナーゼと本来の結
合パートナー間での相互作用の変化は、相互作用を形成する確率の増大または減
少としてか、またはプロテインキナーゼ／本来の結合パートナー複合体の濃度の
増大または減少として明らかにすることができる。

【００２２】 プロテインキナーゼの本来の結合パートナーはプロテインキナーゼの細胞内領
域に高い親和性で結合することができる。高い親和性は１０^-6Ｍ以下のオーダー
の平衡結合定数を表す。更にまた、本来の結合パートナーは過渡的にプロテイン
キナーゼの細胞内領域と相互作用し、これを化学的に修飾する。プロテインキナ
ーゼの本来の結合パートナーは、限定されないがＳＲＣホモロジー２（ＳＨ２）
または３（ＳＨ３）ドメイン、他のホスホリルチロシン結合（ＰＴＢ）ドメイン
、グアニンヌクレオチド変換因子、プロテインホスファターゼならびに他のプロ
テインキナーゼを含む群から選択される。プロテインキナーゼとその本来の結合
パートナー間での相互作用における変化を決定する方法は、この分野では容易に
実用可能である。

【００２３】 用語“セリン／トレオニンプロテインキナーゼ”は、セリンおよびトレオニン
残基でタンパク質をリン酸化する他の酵素に対して少なくとも１０％のアミノ酸
同一性を有するアミノ酸配列の酵素を示している。セリン／トレオニンプロテイ
ンキナーゼは、タンパク質におけるセリンおよびトレオニン残基へのホスフェー
トの付加を触媒する。セリン／トレオニンプロテインキナーゼは膜結合タンパク
質またはサイトゾルのタンパク質として存在してよい。

【００２４】 本明細書で使用されるような用語“接触する”は、本発明の５−アザキノキサ
リン化合物を含有する溶液を、方法の細胞を浸している液体培地と混合すること
を示す。該化合物を含有する溶液は別の成分、例えばジメチルスルホキシド（Ｄ
ＭＳＯ）を含有していてよく、これは１種以上の５−アザキノキサリン化合物を
方法の細胞中に取り込むことを容易にする。５−アザキノキサリンを含有する溶
液を細胞を浸している培地へと導出装置、例えばピペット系の装置またはシリン
ジベースの装置を使用して添加してよい。

【００２５】 用語“５−アザキノキサリンをベースとする化合物”は化学的置換基によって
置換された５−アザキノキサリン有機化合物を示す。５−アザキノキサリン化合
物は一般的構造：

【００２６】

【化４】

【００２７】 の５−アザキノキサリン化合物を示す。

【００２８】 用語“置換された”は、本発明に関しては任意の数の化学的置換基で誘導体化
された５−アザキノキサリン化合物を示す。

【００２９】 有利な態様においては、本発明はセリン／トレオニンプロテインキナーゼＲＡ
Ｆの機能を調整する方法に関する。

【００３０】 ＲＡＦプロテインキナーゼはタンパク質標的をセリンまたはトレオニン残基に
おいてリン酸化する。１種のかかるタンパク質標的はマイトジェン活性化プロテ
インキナーゼ（ＭＡＲＫ）をリン酸化し、引き続き活性化するプロテインキナー
ゼ（ＭＥＫ）である。ＲＡＦ自体は、マイトジェン誘発レセプタープロテインチ
ロシンキナーゼ、例えば上皮成長因子レセプター（ＥＧＦＲ）および血小板由来
成長因子レセプター（ＰＤＧＦＲ）に応じて膜結合グアニン三リン酸加水分解酵
素ＲＡＳによって活性化される。

【００３１】 本発明の方法は、細胞におけるＲＡＦプロテインキナーゼの機能を調整する化
合物を検出することができる。ＲＡＦは、マイトジェンで活性化されるプロテイ
ンキナーゼ（ＭＡＰＫ）もリン酸化するプロテインキナーゼ（ＭＥＫ）をリン酸
化する。ＲＡＦによるＭＥＫのリン酸化だけをモニターするアッセイは高感度で
はない。それというのもＭＥＫのリン酸化レベルは重要でないからである。この
感度のジレンマを克服するために、本発明のアッセイにおいてＭＥＫおよびＭＡ
ＰＫの両者のリン酸化を実施する。ＭＡＰＫリン酸化シグナルはＭＥＫリン酸化
シグナルを増幅させ、かつＲＡＦ依存性リン酸化をアッセイ、例えば酵素結合イ
ムノソルベントアッセイで実施することができる。更に、本発明のアッセイは、
短時間で多くの化合物を迅速にモニターできる高いスループット方式で実施され
る。

【００３２】 別の態様においては、本発明はセリン／トレオニンプロテインキナーゼの機能
を調整する化合物を同定するための、セリン／トレオニンプトレインキナーゼを
発現する細胞と該化合物とを接触させてかつ細胞での効果をモニターする工程を
有する方法を記載している。

【００３３】 用語“モニターする”は方法の細胞への前記化合物の添加の効果を観察するこ
とを意味する。該効果は細胞表現型、細胞増殖、プロテインキナーゼの触媒活性
での変化またはプロテインキナーゼと本来の結合パートナーとの間での相互作用
における変化において明らかにすることが可能である。

【００３４】 用語“効果”は、細胞表現型または細胞増殖での変化の有無を記載している。
“効果”はまたプロテインキナーゼの触媒活性での変化の有無を記載している。
“効果”はまたプロテインキナーゼおよび本来の結合パートナー間の相互作用の
変化の有無を記載している。

【００３５】 本発明の有利な実施態様はセリン／トレオニンプロテインキナーゼの機能を調
整する化合物の同定方法に関し、その際、効果は細胞表現型での変化の有無であ
る。

【００３６】 用語“細胞表現型”は細胞もしくは組織の外観または細胞もしくは組織の機能
を示している。細胞表現型の例は細胞サイズ（縮小または拡大）、細胞増殖（細
胞数の減少もしくは増加）、細胞分化（細胞の形状の変化の有無）、細胞生存、
アポトーシス（細胞死）または代謝栄養の利用（例えばグルコース摂取）である
。細胞表現型での変化の有無は従来公知の技術によって容易に測定される。

【００３７】 別の有利な態様において、本発明はセリン／トレオニンプロテインキナーゼの
機能を調整する化合物の同定方法に関し、その際、該効果は細胞増殖における変
化の有無である。

【００３８】 用語“細胞増殖”は、細胞の群が分割する速度を示している。容器中で成長す
る細胞の数は、定義された容量での細胞の数を一般的な光学顕微鏡を使用して視
覚的に計数する場合に当業者によって定量することができる。選択的に、細胞増
殖速度は、適当な培地中の細胞密度を光学的または導電的に測定する研究室規模
の装置によって定量する事ができる。

【００３９】 別の有利な態様において、本発明は、効果がセリン／トレオニンプロテインキ
ナーゼと本来の結合パートナーとの間の相互作用の変化の有無である、セリン／
トレオニンプロテインキナーゼの機能を調整する化合物の同定方法に関する。

【００４０】 本明細書中での用語“相互作用”は、プロテインキナーゼの細胞内領域と本来
の結合パートナーまたは化合物間で形成される複合体を記載している。また用語
“相互作用”は本発明の化合物と研究中のプロテインキナーゼの細胞内領域なら
びに細胞外領域との間に形成される複合体に拡張できる。サイトゾルのプロテイ
ンキナーゼは細胞外領域を有していないが、レセプタープロテインキナーゼは細
胞外および細胞内領域の両者を有している。

【００４１】 本明細書中で使用されるような用語“細胞内領域”は細胞内に存在するプロテ
インキナーゼの部分を示している。本明細書で使用されるような用語“細胞外領
域”は細胞の外側に存在するプロテインキナーゼの部分を示している。

【００４２】 有利な態様において、本発明はセリン／トレオニンプロテインキナーゼの機能
を調整する化合物の同定方法に関し、該方法は以下の工程を含んでいる： （ａ）細胞を溶解させ、セリン／トレオニンプロテインキナーゼを含有する細胞
溶解産物にし、 （ｂ）セリン／トレオニンプロテインキナーゼと抗体とを吸着させ、 （ｃ）吸着させたセリン／トレオニンプロテインキナーゼを１種以上の基質とイ
ンキュベートし、 （ｄ）１種以上の基質を固体担体もしくは抗体に吸着させる。細胞の効果をモニ
ターする工程は、１種以上の基質のホスフェート濃度の測定を含む。

【００４３】 本明細書で使用されるような用語“溶解”は細胞の内容物が遊離するように細
胞の外被を破壊する方法を示している。細胞溶解は当業者に公知の多数の方法に
よって実施される。有利には該方法はソニケーションまたは細胞シェアリング技
術（cell sheering technique）によって、より有利には界面活性剤技術によっ て実施される。

【００４４】 本明細書で使用されるような用語“抗体”はプロテインキナーゼに特異的に結
合するタンパク質分子を示している。有利には抗体は１種類のプロテインキナー
ゼに結合し、かつより有利にはＲＡＦプロテインキナーゼに特異的に結合する。

【００４５】 本明細書で使用されるような用語“特異的に結合する”は別のプロテインキナ
ーゼまたは細胞タンパク質より高い親和性でタンパク質に結合する抗体を示して
いる。プロテインキナーゼに特異的に結合する抗体は、任意の他のプロテインキ
ナーゼまたは細胞タンパク質より高い濃度の特異的プロテインキナーゼに結合す
る。

【００４６】 本明細書で使用されるような用語“吸着”は分子と抗体または固体担体の表面
との結合を示している。固体担体の例は化学修飾セルロース、例えばホスホセル
ロース、およびナイロンである。抗体は一般的な当業者個人によく知られている
技術を使用して固体担体に結合させることができる。例えばＨａｒｌｏ＆Ｌａｎ
ｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，１９８９
，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ参照。

【００４７】 本明細書で使用されるような用語“ホスフェート濃度を測定する”は一般的な
当業者に通常知られている技術を示している。これらの技術は基質中のホスフェ
ート濃度の定量または基質中のホスフェートの相対量の測定を含む。これらの技
術は膜への基質の吸着ならびに放射性測定による基質中のホスフェート量の検出
を含んでもよい。

【００４８】 別の有利な態様において、本発明はセリン／トレオニンプロテインキナーゼの
機能を調整する化合物の同定方法に関し、該方法は以下の工程を更に含んでいる
： （ａ）細胞を溶解させ、ＲＡＦを含有する溶解産物にし、 （ｂ）ＲＡＦと抗体とを吸着させ、 （ｃ）吸着したＲＡＦをＭＥＫおよびＭＡＰＫと一緒にインキュベートし、 （ｄ）固体担体または１種以上の抗体にＭＥＫおよびＭＡＰＫを吸着させる。細
胞における効果の測定の工程は前記のＭＥＫおよびＭＡＰＫのホスフェート濃度
をモニターすることを含む。

【００４９】 有利な態様において、本発明はセリン／トレオニンプロテインキナーゼの機能
を調整する化合物の同定方法に関し、その際、５−アザキノキサリンをベースと
する化合物は本明細書で定義されるような式Ｉまたは本明細書に示されるその任
意の組で示される構造を有している。

【００５０】 用語“化合物”は化合物、またはその製薬学的に認容性の塩、エステル、アミ
ド、プロドラッグ、異性体または代謝物を示している。

【００５１】 用語“製薬学的に認容性の塩”は化合物の生物学的活性および特性が排除され
ていない化合物の製剤を示している。製薬学的塩は本発明の化合物と無機酸もし
くは有機酸、例えば塩化水素酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、メタンスル
ホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸およびその類
似物との反応によって得ることができる。

【００５２】 用語“プロドラッグ”はインビボで親ドラッグに変換される薬剤を示している
。プロドラッグは、幾つかの場合においては親ドラッグよりも投与が容易である
。例えばプロドラッグが経口投与によって生物学的に利用可能であるが、親ドラ
ッグは利用できないか、またはプロドラッグは溶解度を改善し、静脈内投与を可
能にすることもできる。

【００５３】 別の有利な態様においては、本発明はセリン／トレオニンプロテインキナーゼ
の機能を調整する化合物の同定方法に関し、その際、５−アザキノキサリンをベ
ースとする化合物は式Ｉに示される構造を有し、ＳＡＱＡＲ化合物からなる群か
ら選択される。

【００５４】 用語“ＳＡＱＡＲ化合物”は式Ｉおよび以下の表に番号Ａ−１からＡ−９０を
通して示される構造を有している５−アザキノキサリンをベースとする化合物を
示している：

【００５５】

【化５】

【００５６】

【表１】

【００５７】

【表２】

【００５８】

【表３】

【００５９】ＩＩ．異常状態の予防または治療の方法 別の態様においては、本発明は生物における異常状態の予防または治療の方法
を特徴としている。該方法は以下の工程を有している： （ａ）本明細書で提供される任意の制約を有する式Ｉによって本明細書中で規定
される、本発明の化合物を生物に投与し、 （ｂ）異常状態を促進または途絶させる。

【００６０】 用語“生物”は少なくとも１つの細胞を有する生命体に関する。生物は１つの
真核細胞と同様に単純であってよいか、またはほ乳類と同様に複雑であってよい
。

【００６１】 用語“予防”は、生物が異常状態を生ずるかまたは進行する可能性の減少また
はその可能性の排除の本発明の方法を示している。

【００６２】 用語“治療”は、治療効果を有しかつ生物における異常状態を少なくとも部分
的に緩和もしくは排除する、本発明の方法を示している。

【００６３】 用語“治療効果”は異常状態（例えば癌）を惹起するかまたは貢献する細胞増
殖の阻害を示している。また用語“治療効果”は異常状態を惹起するかまたは貢
献する成長因子の阻害を示している。治療効果は異常状態の１つ以上の症状をあ
る程度まで緩和する。癌の治療に関しては、治療効果は１つ以上の以下のことを
示している： （ａ）腫瘍サイズの縮小、（ｂ）腫瘍の転移の阻害（すなわち緩和または停止）
、（ｃ）腫瘍の成長の阻害ならびに（ｄ）異常状態に関連する１つ以上の症状を
ある程度まで緩和する。白血病に対する効力を示す化合物は本明細書に記載され
るように同定できるが、但しむしろ転移を阻害するよりも、その代わりに該化合
物は細胞増殖もしくは細胞成長を遅延または低下させる。

【００６４】 用語“異常状態”は、生物におけるその通常の機能から逸脱した、該生物の細
胞または組織での機能を示している。異常状態は細胞増殖、細胞分化または細胞
生存に関してもよい。

【００６５】 異常型の細胞増殖状態は癌、例えば線維症性疾患およびメサンギウム疾患、異
常な血管形成および脈管形成、創傷治癒、乾癬、糖尿病および炎症を含む。

【００６６】 異常型の分化状態は、神経変性疾患に限定されず、遅い創傷治癒速度および組
織移植技術を含む。

【００６７】 異常型の細胞生存状態はプログラムされた細胞死（アポトーシス）経路を活性
化するかまたは排除する状態に関する。幾つかのプロテインキナーゼはアポトー
シス経路に関連している。任意の１つのプロテインキナーゼの機能における異常
型は細胞の不死化または早期の細胞死をもたらすことがある。

【００６８】 細胞の増殖、分化および生存は従来の方法で容易に測定できる現象である。該
方法は細胞数の観察または時間（例えば日）に関する顕微鏡下での細胞の外観を
含んでよい。

【００６９】 用語“投与”は広範に生物への措置に関し、殊に化合物を生物の細胞または組
織への導入方法に関する。異常状態は、生物の細胞または組織が生物の内部また
は外部に存在する場合に回避または治療することができる。生物の外部に存在す
る細胞は細胞培養皿中で保持するかまたは生育させることができる。生物内に存
在する細胞に関しては、多くの技術が化合物を投与するための、（限定されない
が）経口、非経口、経皮、注入およびエーロゾル投与を含む技術において存在す
る。生物の外部の細胞のために、多数の技術は化合物を投与するための、（限定
されないが）マイクロインジェクション技術、形質転換技術および賦形剤技術を
含む技術に存在する。

【００７０】 有利な態様において、本発明は生物における異常状態の予防または治療の方法
に関し、その際、５−アザキノキサリンをベースとする化合物は明細書中で定義
されるような式Ｉまたは明細書に示されるその任意の組に示される構造を有して
いる。

【００７１】 他の有利な態様において、本発明は生物における異常状態の予防または治療の
方法に関し、その際、５−アザキノキサリンをベースとする式Ｉに示される構造
を有する化合物はＳＡＱＡＲ化合物からなる群から選択される。

【００７２】 別の有利な態様において、本発明は生物における異常状態の予防または治療の
方法に関し、その際、生物はほ乳類である。

【００７３】 用語“ほ乳類”は有利にはマウス、ラット、ウサギ、モルモットおよびヤギ、
より有利にはサルおよび類人猿、最も有利にはヒトのような生物を示している。

【００７４】 更に別の有利な態様において、本発明は生物の異常状態の予防または治療の方
法に関し、その際、異常状態は癌もしくは線維症性疾患である。

【００７５】 別の有利な態様において、本発明は生物の異常状態の予防または治療の方法に
関し、その際、癌は肺癌、卵巣癌、乳癌、脳癌、軸性脳内癌（intra-axial brai
n cancer）、結腸癌、前立腺癌、肉腫、カポジ肉腫、黒色腫および神経膠腫から
なる群から選択される。

【００７６】 更に別の有利な態様において、本発明は生物の異常状態の予防または治療の方
法に関し、その際、該方法は、セリン／トレオニンプロテインキナーゼと本来の
結合パートナー間の相互作用を特徴とするシグナル伝達経路の異常型に関連する
異常状態に適用する。

【００７７】 用語“シグナル伝達経路”はシグナルの伝達を示している。一般に細胞外シグ
ナルは細胞膜を通って伝達されて細胞内シグナルになる。このシグナルは細胞応
答を刺激することができる。またこの用語は細胞内全体に伝達されるシグナルを
含む。シグナル伝達プロセスに関連するポリペプチド分子は一般に、レセプター
および非レセプタープロテインキナーゼ、レセプターおよび非レセプタープロテ
インホスファターゼ、ヌクレオチド変換因子および転写因子である。

【００７８】 シグナル伝達プロセスに関する用語“異常型”は、生物において過剰に発現す
るかまたは過少に発現し、触媒活性が野生型のプロテインキナーゼ活性より低い
かまたは高いように変異させ、最早本来の結合パートナーと相互作用できないか
、最早別のプロテインキナーゼもしくはプロテインホスファターゼによって修飾
されないか、または最早本来の結合パートナーと相互作用しないように変異した
プロテインキナーゼを示している。

【００７９】 用語“異常な相互作用の促進または中断”は、本発明の化合物を生物の細胞ま
たは組織に投与することによって達成できる方法を示している。化合物はプロテ
インキナーゼと本来の結合パートナー間の相互作用を複雑な界面での多数の原子
との有利な相互作用の形成によって促進する事ができる。選択的に、化合物はプ
ロテインキナーゼと本来の結合パートナー間の相互作用を複合体の境界面の原子
間で形成する有利な相互作用を損なわせることによって阻害することができる。
別の有利な態様において、本発明は生物の異常状態の予防または治療の方法に関
し、その際、セリン／トレオニンプロテインキナーゼはＲＡＦである。

【００８０】ＩＩＩ．本発明の化合物および医薬品組成物 別の態様においては、本発明は式Ｉ：

【００８１】

【化６】

【００８２】 ［式中、 （ａ）Ｒ₁、Ｒ₂およびＲ₆は独立して、 （ｉ）水素、 （ｉｉ）飽和もしくは不飽和のアルキル、 （ｉｉｉ）Ｘ₂およびＸ₃が独立して水素、飽和もしくは不飽和のアルキル、５員
もしくは６員のアリール環部またはヘテロアリール環部からなる群から選択され
る、式：ＮＸ₂Ｘ₃のアミン、 （ｉｖ）ハロゲンもしくはトリハロメチル、 （ｖ）Ｘ₄が水素、アルキルおよび５員もしくは６員のアリール環部またはヘテ ロアリール環部からなる群から選択される、式：−ＣＯ−Ｘ₄のケトン、 （ｖｉ）Ｘ₅、Ｘ₆およびＸ₇が独立してアルキルおよび５員もしくは６員のアリ ール環部またはヘテロアリール環部からなる群から選択され、かつｎが０または
１である、式：−（Ｘ₅）_n−ＣＯＯＨのカルボン酸または式：−（Ｘ₆）_n−ＣＯ
Ｏ−Ｘ₇のエステル、 （ｖｉｉ）Ｘ₈およびＸ₉が独立して水素、飽和もしくは不飽和のアルキル、およ
びアルキル、ハロゲン、トリハロメチル、カルボキシレート、ニトロおよびエス
テルからなる群から独立に選択される１個以上の置換基で場合により置換されて
いる５員もしくは６員のアリール環部またはヘテロアリール環部からなる群から
選択され、ｎが０または１である、式：（Ｘ₈）_n−ＯＨのアルコールまたは式：
−（Ｘ₈）_n−Ｏ−Ｘ₉のアルコキシ部、 （ｖｉｉｉ）Ｘ₁₀がアルキル、ヒドロキシル、および場合によりアルキル、ハロ
ゲン、トリハロメチル、カルボキシレート、ニトロもしくはエステルからなる群
から独立に選択される１個以上の置換基で置換されている５員もしくは６員のア
リール環部またはヘテロアリール環部からなる群から選択される、式：−ＮＨＣ
ＯＸ₁₀のアミド、 （ｉｘ）Ｘ₁₁およびＸ₁₂が水素、アルキル、および５員もしくは６員のアリール
環部またはヘテロアリール環部からなる群から選択される、−ＳＯ₂ＮＸ₁₁Ｘ₁₂ 、 （ｘ）アルキル、ハロゲン、トリハロメチル、カルボキシレート、ニトロおよび
エステル部からなる群から独立に選択される１個、２個または３個の置換基で場
合により置換されている５員もしくは６員のアリール環部またはヘテロアリール
環部、 （ｘｉ）式：−ＣＯ−Ｈのアルデヒド、 （ｘｉｉ）Ｘ₁₃が飽和もしくは不飽和のアルキルおよび５員もしくは６員のアリ
ール環部またはヘテロアリール環部からなる群から選択される、式：−ＳＯ₂− Ｘ₁₃のスルホン、 からなる群から選択され、 （ｂ）Ｘ₁は窒素、硫黄および酸素からなる群から選択される］に示される構造 を有する５−アザキノキサリン化合物を特徴とする。

【００８３】 用語“飽和アルキル”はアルケン部またはアルキン部を有さないアルキル部を
示している。アルキル部は分枝鎖状または非分枝鎖状であってよい。

【００８４】 用語“不飽和アルキル”は少なくとも１つのアルケン部またはアルキン部を有
するアルキル部を示している。

【００８５】 用語“アミン”は式：ＮＲ₁Ｒ₂ ［式中、 Ｒ₁およびＲ₂は独立して水素、飽和もしくは不飽和のアルキル、およびアルキル
、ハロゲン、トリハロメチル、カルボキシレート、ニトロおよびエステル部から
なる群から独立に選択される１個以上の置換基で場合により置換されている５員
もしくは６員のアリール環部またはヘテロアリール環部からなる群から選択され
る］の化学的部分を示している。

【００８６】 用語“アリール”は共役π電子系を有する少なくとも１つの環を有し、炭素環
式アリール基（例えばフェニル）および複素環式アリール基（例えばピリジン）
の両者を包含する芳香族基を示している。用語“炭素環式”は１個以上の共有的
に閉環した環構造を有し、かつ環の骨格を形成する原子が全て炭素である化合物
を示している。従ってこの用語は炭素環式を、環骨格が炭素と異なる少なくとも
１個の原子を有する複素環式と区別する。用語“ヘテロアリール”は少なくとも
１個の複素環を有するアリール基を示している。

【００８７】 用語“ハロゲン”はフッ素、塩素、臭素およびヨウ素からなる群から選択され
る原子を示している。

【００８８】 用語“ケトン”はＲおよびＲ’が飽和もしくは不飽和のアルキルおよび５員も
しくは６員のアリール環部またはヘテロアリール環部からなる群から選択され、
かつｎが０または１である、式：−（Ｒ）_n−ＣＯ−Ｒ’を有する化学的部分を 示している。

【００８９】 用語“カルボン酸”はＲが飽和もしくは不飽和のアルキルおよび５員もしくは
６員のアリール環部またはヘテロアリール環部からなる群から選択され、かつｎ
が０または１である、式：−（Ｒ）_n−ＣＯＯＨを有する化学的部分を示してい る。

【００９０】 用語“エステル”はＲおよびＲ’が独立して飽和もしくは不飽和のアルキルお
よび５員もしくは６員のアリール環部またはヘテロアリール環部からなる群から
選択され、かつｎが０または１である、式：−（Ｒ）_n−ＣＯＯＲ’を有する化 学的部分を示している。

【００９１】 用語“アルコール”はＲが水素、飽和もしくは不飽和のアルキル、およびアル
キル、ハロゲン、トリハロメチル、カルボキシレート、ニトロおよびエステル部
から独立に選択される１個以上の置換基で場合により置換されている５員もしく
は６員のアリール環部またはヘテロアリール環部からなる群から選択される、式
：−ＲＯＨの化学的置換基を示している。

【００９２】 用語“アミド”はＲが水素、アルキル、ヒドロキシル、およびアルキル、ハロ
ゲン、トリハロメチル、カルボキシレート、ニトロまたはエステルから独立に選
択される１個以上の置換基で場合により置換されている５員もしくは６員のアリ
ール環部またはヘテロアリール環部からなる群から選択される、式：−ＮＨＣＯ
Ｒの化学的置換基を示している。

【００９３】 用語“アルコキシ部”はＲが水素または飽和もしくは不飽和のアルキル部であ
る、式：−ＯＲの化学的置換基を示している。

【００９４】 用語“アルデヒド”はＲが飽和もしくは不飽和のアルキルおよび５員もしくは
６員のアリール部またはヘテロアリール部からなる群から選択され、ｎが０また
は１である、式：−（Ｒ）_n−ＣＨＯを有する化学的部分を示している。

【００９５】 用語“スルホン”はＲが飽和もしくは不飽和のアルキルおよび５員もしくは６
員のアリール部またはヘテロアリール部からなる群から選択される、式：−ＳＯ ₂ −Ｒの化学的部分を示している。

【００９６】 別の有利な態様において、本発明はＲ₃およびＲ₄が独立して水素および飽和も
しくは不飽和のアルキルからなる群から選択される、式Ｉに示される構造を有す
る５−アザキノキサリンをベースとする化合物に関する。

【００９７】 もう１つの有利な態様においては、本発明はＲ₃およびＲ₄が水素である、式Ｉ
に示される構造を有する５−アザキノキサリンをベースとする化合物に関する。

【００９８】 他の有利な態様において、本発明はＲ₁およびＲ₂が水素、飽和もしくは不飽和
のアルキル、およびアルキル、ハロゲン、トリハロメチル、ヒドロキシ、アルコ
キシ、カルボキシレート、ニトロおよびエステル部からなる群から独立に選択さ
れる１個、２個または３個の置換基で場合により置換されている５員もしくは６
員のアリール環部またはヘテロアリール環部からなる群から選択される、式Ｉに
示される構造を有する５−アザキノキサリンをベースとする化合物に関する。

【００９９】 更に他の有利な態様において、本発明はＲ₁がアルキル、ハロゲン、ヒドロキ シおよびアルコキシ部からなる群から独立に選択される１個、２個または３個の
置換基で場合により置換されているフェニルである、式Ｉで示される構造を有す
る５−アザキノキサリンをベースとする化合物に関する。

【０１００】 別の有利な態様においては、本発明はＲ₁がフェニルである、式Ｉに示される 構造を有する５−キノキサリンをベースとする化合物に関する。

【０１０１】 更に別の有利な態様において、本発明はＲ₁が４−ヒドロキシフェニルである 、式Ｉに示される構造を有する５−アザキノキサリンをベースとする化合物に関
する。

【０１０２】 他の有利な態様において、本発明はＲ₂が水素、飽和もしくは不飽和のアルキ ル、およびアルキル、ハロゲン、ヒドロキシおよびアルコキシ部からなる群から
独立に選択される１個、２個または３個の置換基で場合により置換されているフ
ェニルからなる群から選択される、式Ｉに示される構造を有する５−アザキノキ
サリンをベースとする化合物に関する。

【０１０３】 別の有利な態様において、本発明はＲ₂が水素である、式Ｉに示される構造を 有する５−アザキノキサリンをベースとする化合物に関する。

【０１０４】 更に別の有利な態様において、本発明はＲ₂がメチルである、式Ｉに示される 構造を有する５−アザキノキサリンをベースとする化合物に関する。

【０１０５】 更に別の有利な態様において、本発明はＲ₂がフェニルである、式Ｉに示され る構造を有する５−アザキノキサリンをベースとする化合物に関する。

【０１０６】 別の有利な態様において、本発明はＸ₁が窒素または酸素である、式Ｉに示さ れる構造を有する５−アザキノキサリンをベースとする化合物に関する。

【０１０７】 更に別の有利な態様においては、本発明はＸ₁が酸素である、式Ｉに示される 構造を有する５−アザキノキサリンをベースとする化合物に関する。

【０１０８】 更に別の有利な態様においては、本発明はＸ₁が窒素である、式Ｉに示される 構造を有する５−アザキノキサリンをベースとする化合物に関する。

【０１０９】 他の有利な態様においては、本発明はＲ₆が水素；アルキル、ハロゲン、トリ ハロメチル、ヒドロキシ、アルコキシ、カルボキシレート、ニトロおよびエステ
ル部からなる群から独立に選択される１個、２個または３個の置換基で場合によ
り置換されている５員もしくは６員のアリール環部またはヘテロアリール環部で
場合により置換されている飽和もしくは不飽和のアルキル；アルキル、ハロゲン
、トリハロメチル、ヒドロキシ、アルコキシ、カルボキシレート、ニトロおよび
エステル部からなる群から独立に選択される１個、２個または３個の置換基で場
合により置換されている５員もしくは６員のアリール環部またはヘテロアリール
環部からなる群から選択される、式Ｉに示される構造を有する５−アザキノキサ
リンをベースとする化合物に関する。

【０１１０】 更に他の有利な態様において、本発明はＲ₆およびＸ₁部が一緒になってＳＡＱ
ＡＲ置換基からなる群から選択される化合物を形成する、式Ｉに示される構造を
有する５−アザキノキサリンをベースとする化合物に関する。

【０１１１】 用語“ＳＡＱＡＲ置換基”はメトキシ、ベンジルアミノ、４−フルオロベンジ
ルアミノ、２−カルボキシベンジルアミノ、３−カルボキシベンジルアミノ、４
−カルボキシベンジルアミノ、２−ニトロベンジルアミノ、３−ニトロベンジル
アミノ、４−ニトロベンジルアミノ、２−メチルベンジルアミノ、３−メチルベ
ンジルアミノ、４−メチルベンジルアミノ、２−クロロベンジルアミノ、３−ク
ロロベンジルアミノ、４−クロロベンジルアミノ、２−フルオロベンジルアミノ
、３−フルオロベンジルアミノ、４−フルオロベンジルアミノ、２−（トリフル
オロメチル）ベンジルアミノ、３−（トリフルオロメチル）ベンジルアミノ、４
−（トリフルオロメチル）ベンジルアミノ、フェネチル−１−アミノ、フェニル
アミノ、２−カルボキシフェニルアミノ、３−カルボキシフェニルアミノ、４−
カルボキシフェニルアミノ、２−ニトロフェニルアミノ、３−ニトロフェニルア
ミノ、４−ニトロフェニルアミノ、２−メチルフェニルアミノ、３−メチルフェ
ニルアミノ、４−メチルフェニルアミノ、２−クロロフェニルアミノ、３−クロ
ロフェニルアミノ、４−クロロフェニルアミノ、２−フルオロフェニルアミノ、
３−フルオロフェニルアミノ、４−フルオロフェニルアミノ、２−（トリフルオ
ロメチル）フェニルアミノ、３−（トリフルオロメチル）フェニルアミノ、４−
（トリフルオロメチル）フェニルアミノ、ピリド−２−アミノ、ピリド−３−ア
ミノ、ピリド−４−アミノおよびピリド−２−メチルアミノからなる置換基の群
を示している。

【０１１２】 用語“ベンジルアミノ”は以下の式：

【０１１３】

【化７】

【０１１４】 ［式中、 アリール環は２、３または４位で場合により置換されていてよい］に示される構
造を有する基を示している。

【０１１５】 用語“フェニルアミノ”は以下の式：

【０１１６】

【化８】

【０１１７】 ［式中、 アリール環は２、３または４位で場合により置換されていてよい］に示される構
造を有する基を示している。

【０１１８】 用語“フェネチル−１−アミノ”は、以下の式：

【０１１９】

【化９】

【０１２０】 に示される構造を有する基を示している。

【０１２１】 用語“ピリド−２−アミノ”は２位においてＮＨ基で置換されているピリジン
環を示している。同様に、用語“ピリド−３−アミノ”および“ピリド−４−ア
ミノ”は３位および４位でそれぞれＮＨ基によって置換されているピリジン環を
示している。

【０１２２】 更に別の有利な態様において、本発明は、５−アザキノキサリンをベースとす
る化合物がＳＡＱＡＲ化合物からなる群から選択される、式Ｉに示される構造を
有する５−アザキノキサリンをベースとする化合物に関する。

【０１２３】ＩＶ．本発明の合成法 別の態様において、本発明は明細書中に示されるような式Ｉの構造を有する化
合物または明細書中に示される任意の組またはその塩、および生理学的に認容性
の賦形剤または希釈剤を含有する医薬品組成物を特徴とする。

【０１２４】 有利な態様においては、本発明は５−アザキノキサリンをベースとする化合物
がＳＡＱＡＲ化合物からなる群から選択される、医薬品組成物に関する。

【０１２５】 用語“医薬品組成物”は本発明の５−アザキノキサリン化合物と他の化学的成
分、例えば希釈剤または賦形剤との混合物を示している。医薬品組成物は生物へ
の化合物の投与を容易にする。限定されるものではないが、経口、注入、エーロ
ゾル、非経口および局所適用を含む技術において、化合物を投与するための多く
の技術が存在する。また医薬品組成物は化合物と無機酸、例えば塩化水素酸、臭
化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−ト
ルエンスルホン酸、サリチル酸およびその類似体との反応によって得ることがで
きる。

【０１２６】 用語“生理学的に認容性”は化合物の生物学的活性および特性を排除しない賦
形剤または希釈剤を定義している。

【０１２７】 用語“賦形剤”は細胞または組織への化合物の導入を容易にする化学的化合物
を定義している。例えばジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）は、生物の細胞また
は組織中への多くの有機化合物の取り込みを容易にするように通常使用されてい
る賦形剤である。

【０１２８】 用語“希釈剤”は関連の化合物を溶解し、かつ化合物の生物学的に活性な形を
安定化する、水に希釈された化学的化合物を定義している。該技術においては緩
衝溶液中に溶解された塩を希釈剤として使用する。１種の通常使用される緩衝溶
液はリン酸緩衝食塩水である。それというのもヒトの血液の塩条件とよく似てい
るからである。緩衝塩は低濃度で溶液のｐＨをコントロールできるので、緩衝希
釈剤は化合物の生物学的活性をめったに変化させない。

【０１２９】 更に別の態様においては、本発明は、以下の工程を有する本発明の化合物の合
成方法を特徴としている： （ａ）２−アミノ−６−クロロ−３−ニトロピリジンと、アルコールおよびアミ
ンからなる群から選択される第２の反応物とを溶剤中および塩基の存在下で反応
させ、第１の中間物質を得、 （ｂ）第１の中間物質と１，２−ジオンとを触媒および還元剤の存在下に反応さ
せ、 （ｄ）最終生成物を精製する。

【０１３０】 用語“１，２−ジオン”は、Ｒ₁およびＲ₂が水素；アルキル、ハロゲン、トリ
ハロメチル、ヒドロキシ、アルコキシ、カルボキシレート、ニトロおよびエステ
ル部からなる群から独立に選択される１個、２個または３個の置換基で場合によ
り置換されている５員もしくは６員のアリール環部またはヘテロアリール環部で
場合により置換されている飽和もしくは不飽和のアルキル；およびアルキル、ハ
ロゲン、トリハロメチル、ヒドロキシ、アルコキシ、カルボキシレート、ニトロ
およびエステル部からなる群から独立に選択される１個、２個または３個の置換
基で場合により置換されている５員もしくは６員のアリール環部またはヘテロア
リール環部からなる群から独立に選択される、式：Ｒ₁−Ｃ（Ｏ）Ｃ（Ｏ）−Ｒ₂ の化学的部分を示している。

【０１３１】 有利な態様おいて、本発明は、溶剤がｎ−ブタノールである本発明の化合物の
合成方法に関する。

【０１３２】 別の有利な態様において、本発明は、塩基が粉末の炭酸カリウムである本発明
の化合物の合成方法に関する。

【０１３３】 更に別の有利な態様において、本発明は、第２の反応物がＳＡＱＡＲ反応物か
らなる群から選択される本発明の化合物の合成方法に関する。

【０１３４】 用語“ＳＡＱＡＲ反応物”はメタノール、ベンジルアミン、４−フルオロベン
ジルアミン、２−カルボキシベンジルアミン、３−カルボキシベンジルアミン、
４−カルボキシベンジルアミン、３−ニトロベンジルアミン、４−ニトロベンジ
ルアミン、２−ニトロベンジルアミン、２−メチルベンジルアミン、３−メチル
ベンジルアミン、４−メチルベンジルアミン、２−クロロベンジルアミン、３−
クロロベンジルアミン、４−クロロベンジルアミン、２−フルオロベンジルアミ
ン、３−フルオロベンジルアミン、４−フルオロベンジルアミン、２−（トリフ
ルオロメチル）ベンジルアミン、３−（トリフルオロメチル）ベンジルアミン、
４−（トリフルオロメチル）ベンジルアミン、フェネチル−１−アミン、アニリ
ン、２−カルボキシアニリン、３−カルボキシアニリン、４−カルボキシアニリ
ン、２−ニトロアニリン、３−ニトロアニリン、４−ニトロアニリン、２−トル
イジン、３−トルイジン、４−トルイジン、２−クロロアニリン、３−クロロア
ニリン、４−クロロアニリン、２−フルオロアニリン、３−フルオロアニリン、
４−フルオロアニリン、２−（トリフルオロメチル）アニリン、３−（トリフル
オロメチル）アニリン、４−（トリフルオロメチル）アニリン、２−アミノピリ
ジン、３−アミノピリジン、４−アミノピリジンおよび２−メチルアミノピリジ
ンからなる反応物の群を示している。

【０１３５】 更に別の有利な態様において、本発明は、第３の反応物が４−ヒドロキシフェ
ニルグリオキサール、１−フェニル−１，２−プロパンジオンおよびベンジルか
らなる群から選択される本発明の化合物の合成方法に関する。

【０１３６】 本明細書で使用されるような用語“触媒”は、反応物の群に添加した場合に反
応物が反応して生成物を形成する速度を増大させることができる化学的分子を示
している。多くの種類の触媒は当業者に公知である。

【０１３７】 有利な態様において、本発明は、還元剤が水素である本発明の化合物の合成方
法に関する。

【０１３８】 別の有利な態様において、本発明は、触媒がラネーニッケルである本発明の化
合物の合成方法に関する。

【０１３９】 前記の本発明の概略は限定するものでなく、かつ本発明の他の特徴および利点
は有利な態様の以下の記載ならびに請求の範囲から明らかである。

【０１４０】有利な態様の記載 本発明は部分的に、セリン／トレオニンプロテインキナーゼの機能を５−アザ
キノキサリンをベースとする化合物によって調整する方法に関する。更に、本発
明は部分的に、セリン／トレオニンプロテインキナーゼの機能を調整する化合物
を同定する方法に関する。該方法はセリン／トレオニンプロテインキナーゼ、例
えばＲＡＦを発現する細胞を導入している。

【０１４１】 ＲＡＦは、活性化ＲＡＳ（グアニン三リン酸加水分解酵素）に結合する場合に
細胞膜に会合される非レセプタープロテインキナーゼである。ＲＡＳは、活性化
レセプタープロテインチロシンキナーゼ、例えばＥＧＦＲまたはＰＤＧＦＲがア
ダプタータンパク質ＧＲＢ２ならびにグアニンヌクレオチド交換因子ＳＯＳに結
合する場合に活性化する。ＳＯＳはＲＡＳからグアニン二リン酸を除去し、それ
をグアニン三リン酸に置き換え、それによってＲＡＳを活性化する。次いでＲＡ
ＳはＲＡＦに結合し、引き続きＲＡＦを活性化する。次いでＲＡＦは他のタンパ
ク質標的をセリン残基およびトレオニン残基でリン酸化し、例えばキナーゼ（Ｍ
ＥＫ）はマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）をリン酸化し、引
き続き活性化する。このように、ＲＡＦはマイトジェン活性化シグナル伝達にお
いて中間制御因子の役割を果たす。

【０１４２】 細胞内でのＲＡＦの重要な制御機能のために、ＲＡＦのアミノ酸配列の改変は
その機能を変化させることがあり、従って細胞の挙動を変えることがある。細胞
増殖におけるＲＡＦの機能は、ＲＡＦのアミノ酸に対する突然変異は腫瘍および
癌に関連するという観察によって強調される。細胞に癌をもたらすＲＡＦの突然
変異は、調節された触媒活性を示さないＲＡＦ分子をもたらすので、ＲＡＦのイ
ンヒビターは該細胞において癌を惹起する細胞増殖を緩和するか、更には排除す
ることがある。

【０１４３】 本発明の方法は細胞におけるプロテインキナーゼＲＡＦの機能を調整する化合
物を検出する事ができる。ＲＡＦは、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（
ＭＡＰＫ）もリン酸化するプロテインキナーゼ（ＭＥＫ）をリン酸化する。ＲＡ
ＦによるＭＥＫのリン酸化をモニターするだけのアッセイは感度が高くない。そ
れというのも、ＭＥＫのリン酸化レベルは重要でないからである。この感度のジ
レンマを克服するために、本発明のアッセイにおいて、引き続きＭＥＫおよびＭ
ＡＰＫの両者をリン酸化させる。ＭＡＰＫリン酸化シグナルはＭＥＫリン酸化シ
グナルを増幅し、酵素結合イムノゾルバントアッセイにおいてＲＡＦ依存性リン
酸化が可能である。更に、本発明のアッセイは有利には、多くの化合物を短時間
で迅速にモニターできるような高いスループット方式で実施される。

【０１４４】 本発明の方法はＲＡＦプロテインキナーゼの機能を阻害する化合物を同定して
いる。これらの化合物は５−アザキノキサリンをベースとする誘導体である。５
−アザキノキサリンをベースとする誘導体は、細菌のヌクレオチド合成に関連す
る酵素の阻害能力に関して試験されるが、前記の化合物は依然としてプロテイン
キナーゼ阻害に関しては有意に調査されていない。

【０１４５】 ＲＡＦは他のセリン／トレオニンプロテインキナーゼに対して著しいアミノ酸
ホモロジーを示すので、同様に本発明の５−アザキノキサリンをベースとする化
合物はＲＡＦ以外のセリン／トレオニンプロテインキナーゼを阻害することがで
きる。このように本発明の方法はレセプターおよび非レセプターセリン／トレオ
ニンプロテインキナーゼを含むＲＡＦ以外のセリン／トレオニンプロテインキナ
ーゼに関する。

【０１４６】 また本発明の方法は、方法の高いスループットの側面が広範な分子を短時間で
試験することができるように細胞内のＲＡＦ機能を調整する他の化合物に関する
。従って本発明の方法は、ＲＡＦ機能を調整する本発明に開示されていない存在
する分子を同定することができる。

【０１４７】Ｉ．５−アザキノキサリンをベースとする化合物の生物学的活性 本発明の５−アザキノキサリンをベースとする化合物をＲＡＦプロテインキナ
ーゼ機能を阻害する能力に関して試験した。これらの阻害研究の生物学的アッセ
イおよび結果を以下に報告する。プロテインキナーゼの機能を調整する５−アザ
キノキサリンをベースとする化合物を測定するために使用される方法は、方法の
高いスループットの側面に関してタン他（Tang et al）によるＵ．Ｓ．Ａｐｐｌ
ｉｃａｔｉｏｎ Ｓｅｒｉａｌ Ｎｏ．０８／７０２２３２、および１９９６年８
月２３日に提出された表題“インドリノン組み合わせライブラリーならびに関連
生成物および疾患の治療のための方法”（Lyon & Lyon Docket No.221/187）に 記載の方法と類似している。前記の第０８／７０２２３２号明細書は全ての図面
を含み、引用することにより本明細書に記載されたものとする。

【０１４８】ＩＩ．１，４，５−トリアザナフタレンをベースとする化合物によって治療する ための標的の疾患 本明細書に記載される方法、化合物および医薬品組成物をＲＡＦプロテインキ
ナーゼの機能を調整することによって細胞増殖疾患を阻害するように設計する。
増殖疾患は、生物を害する、多細胞生物の１つ以上の細胞の部分集合の不所望な
細胞増殖をもたらす。本明細書に記載される方法、化合物および医薬品組成物は
生物の他の疾患、例えば早期の細胞死（すなわち神経疾患）または炎症を治療お
よび予防するために有用であることもある。これらの疾患は、不適切に機能する
ＲＡＦ分子または不適切に機能するＲＡＦ関連のプロテインキナーゼ分子に起因
する場合がある。

【０１４９】 ＲＡＦプロテインキナーゼまたはＲＡＦに関連するプロテインキナーゼの機能
における変化は、一定の疾患において明らかな細胞増殖性の状態の促進または低
下をもたらすことがある。異常型細胞増殖の状態は癌、線維症性疾患、メサンギ
ウム疾患、異常な血管形成および脈管形成、創傷治癒、乾癬、再狭窄および炎症
を含む。

【０１５０】 線維症性疾患は、細胞の細胞外マトリクスの異常な形成に関する。線維症性疾
患の例は肝硬変である。肝硬変は肝瘢痕の形成をもたらす細胞外マトリクス成分
の濃度の増大を特徴としている。肝硬変は肝臓の硬変症のような疾患を惹起する
ことがある。

【０１５１】 メサンギウム細胞増殖疾患は、メサンギウム細胞の異常な増殖のために生ずる
。メサンギウム増殖疾患は種々のヒトの腎疾患、例えば腎炎、糖尿病性腎障害、
悪性腎硬化症、血栓性細小血管症候群、移植拒絶反応および糸球体症を含む。

【０１５２】 本発明の方法および化合物によって治療できる有利な種類の癌は、肺癌、卵巣
癌、乳癌、脳癌、軸性脳内癌、結腸癌、前立腺癌、カポジ肉腫、黒色腫および神
経膠腫である。本発明の化合物および方法が癌細胞の増殖を止めかつ後退させる
という証拠は文献によって本明細書に提供されている。

【０１５３】 脈管形成および血管形成の疾患は血管の過剰な増殖に起因する。血管の増殖は
通常の生理学的プロセス、例えば胚発生、黄体形成、創傷治癒および臓器の再生
に必要である。しかしながらまた、血管の増殖は癌腫瘍発生にも必須である。血
管増殖の他の例は、新生毛細血管が関節を侵害し、かつ軟骨を破壊する関節炎を
含む。更に、血管増殖疾患は眼球の疾患、例えば網膜中の新生毛細血管がガラス
体を侵害し、出血および失明をもたらす糖尿病性網膜症を含む。反対に、血管の
収縮、狭窄または閉鎖に関連する疾患、例えば再狭窄はプロテインキナーゼの逆
の調節に関連している。

【０１５４】 更に、血管形成および脈管形成は悪性の充実性腫瘍の成長および転移に関連し
ている。著しく成長している癌腫瘍は継続的な成長のために栄養および酸素に富
んだ血液供給が必要である。その結果、異常に多くの毛細血管が腫瘍と共同して
成長し、かつ腫瘍への供給管路として作用する。腫瘍に供給する栄養の他に、腫
瘍にとどまった新生血管は腫瘍細胞のための出入口を提供し、循環が始まり、か
つ生物の離れた部位に転移する。Ｆｏｌｋｍａｎ，１９９０，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃ
ａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８２：４−６。

【０１５５】 不適当なＲＡＦ活性は細胞増殖疾患を刺激することがある。ＲＡＦプロテイン
キナーゼの機能を調整するために特別に設計された分子は細胞増殖の阻害を示す
。特にＲＡＦプロテインキナーゼをコードするメッセンジャーＲＮＡおよびこれ
からのブロック翻訳物の両者に結合するように設計されたアンチセンス核酸分子
は効果的にＡ５４９細胞の形質転換をインビトロで後退させる。Ｍｏｎｉａ ｅ ｔ ａｌ．，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２：６８８は引用する ことにより全ての図面および表を含み本明細書に記載されたものとする。Ａ５４
９細胞はヒト悪性細胞である。

【０１５６】 これらのＲＡＦ標的のアンチセンス研究は、ＲＡＦプロテインキナーゼの機能
を調整する本発明の５−アザキノキサリン分子が生物において悪性細胞の増殖を
止め、かつ大抵は後退させることができるという証拠を提供している。これらの
５−アザキノキサリン化合物は例によって本明細書中に提供されるインビトロ法
で試験することができる。更に、５−アザキノキサリン化合物も、例によって本
明細書で提供される異種移植法によって前記化合物の腫瘍細胞におけるインビボ
での効果に関して試験することができる。

【０１５７】 不適切なＲＡＦ活性が特定の種類の細胞の不所望な細胞増殖を刺激できる少な
くとも２つの方法が存在する： （１）特定の細胞の増殖を直接刺激するか、または （２）腫瘍組織のような特定の範囲の脈管形成を増大させ、それにより組織の成
長を促進する。

【０１５８】 本発明の方法は、まず細胞増殖疾患がＲＡＦ作動性（RAF driven）であるかを
同定する。かかる疾患が同定された場合、かかる疾患に悩む患者を、この技術に
熟練した医師または獣医師によく知られた方法を使用する症状の分析によって同
定することができる。次いでかかる患者を本明細書に記載のように治療すること
ができる。

【０１５９】 細胞増殖疾患がＲＡＦ作動性であるかの決定はまず、患者の体の細胞または特
定の場所に発生するＲＡＦ活性のレベルを決定することによって達成できる。例
えば癌細胞の場合には１種以上のＲＡＦ活性を非ＲＡＦ作動性癌およびＲＡＦ作
動性癌に関して比較できる。癌細胞がＲＡＦ作動性癌より高いレベルのＲＡＦ活
性を有している、有利にはＲＡＦ作動性癌と同じまたはそれより高い場合には、
これらは記載されたＲＡＦを調整する方法ならびに本発明の化合物を使用する治
療のための候補である。

【０１６０】 非癌細胞の不所望な増殖のために引き起こる細胞増殖性疾患の場合には、ＲＡ
Ｆ活性のレベルを一般的母集合で生じるレベル（例えば細胞増殖疾患に悩む人々
および動物を除く人々および動物の一般的母集合で生じる平均レベル）と比較す
る。不所望の細胞増殖疾患が一般的母集合で生じるよりも高いＲＡＦレベルを特
徴とする場合、該疾患は本発明のＲＡＦ調整方法および化合物を使用する治療の
ための候補である。

【０１６１】ＩＩＩ．５−アザキノキサリンをベースとする化合物の医薬品組成物および投与 該化合物の医薬品製剤の製造方法、患者に投与すべき化合物量の決定方法なら
びに化合物を生物への投与の方法はタン他（Tang et al）による米国特許明細書
第０８／７０２２３２号明細書および１９９６年８月２３日に提出された表題“
インドリン組み合わせライブラリーならびに疾患を治療するための生成物および
方法”（Lyon & Lyon Docket No. 221/187）ならびにブゼッティ他（Buzzetti e
t al）による国際特許文献ＷＯ９６／２２９７６号ならびに１９９６年８月１日
に公表された表題“チロシンキナーゼインヒビターとしての水溶性３−アリーリ
デン−２−オキシンドール誘導体”に開示されており、両者は全ての図面を含み
、全内容において引用することにより本明細書に記載されたものとする。かかる
記載が本発明に適用可能であり、これに容易に適応できるということは当業者に
よって理解されるものである。

【０１６２】実施例 以下の実施例は本発明の種々の態様および特徴を制限するものでなく、かつ代
表例にすぎない。実施例は本発明の化合物の合成方法およびＲＡＦプロテインキ
ナーゼにおける該化合物の効果を測定するための方法を記載している。

【０１６３】 該方法で使用される細胞は市販されている。該細胞が有する核酸ベクターも市
販されており、種々のプロテインキナーゼのための遺伝子配列は配列データバン
クで容易に入手できる。このように当業者は、市販の細胞、市販の核酸ベクター
およびプロテインキナーゼ遺伝子を組み合わせることによって当業者が容易に使
用できる技術を使用して適した方法で細胞系を容易に再形成することができる。

【０１６４】例１：本発明の５−アザキノキサリンをベースとする化合物の合成方法 本発明を以下の制限するものでない例において説明するが、例中で特に記載が
ない場合は： （ｉ）蒸発は真空中で回転蒸発器によって実施した； （ｉｉ）作業は窒素のような不活性ガス雰囲気下で実施した； （ｉｉｉ）高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）はメルク（E. Merck, Da
rmstadt, Germany）社のＭｅｒｃｋ ＬｉＣｈｒｏｓｏｒｂ ＲＰ−１８逆相シリ
カ上で実施した； （ｉｖ）収率は例としてのみ与えたものであり、必ずしも得られる最大値ではな
い； （ｖ）融点は逆修正し、ＨＷＳマインツＳＧ２０００デジタル融点装置（MWS Ma
inz SG 2000 digital melting point aparatus）を使用して測定した； （ｖｉ）本発明の式（Ｉ）の全ての化合物の構造をＢｒｕｋｅｒ ＡＭＸ５００ −ＮＭＲ分光光度計上でのプロトン磁気共鳴分光法によって、元素微量分析、お
よび一定の場合には質量分光法によって確認した； （ｖｉｉ）構造の純度をシリカゲル（Merck Silica Gel 60 F254）を使用する薄
層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）またはＨＰＬＣによって実施した； （ｖｉｉｉ）中間体は一般に十分に特徴付けておらず、純度は薄層クロマトグラ
フィー（ＴＬＣ）またはＨＰＬＣによって評価した。

【０１６５】合成方法 化合物Ａ−２：６−ベンジルアミノ−３−（４−ヒドロキシフェニル）−５−ア ザキノキサリン ４−ヒドロキシフェニルグリオキサールを公表されている方法（J. Amer. Che
m. Soc., 71, 1045(1949)）によって４−ヒドロキシアセトフェノン（Lancaster
, Acros）から製造した。

【０１６６】 ２−アミノ−６−ベンジルアミノ−３−ニトロピリジンを以下のように２−ア
ミノ−６−クロロ−３−ニトロピリジンから製造した：ｎ−ブタノール（１００
ｍｌ）中の２−アミノ−６−クロロ−３−ニトロピリジン（１７．３５ｇ、０．
０１モル）、ベンジルアミン（Fluka）（１０．７２ｇ、０．１０モル）ならび に粉末の炭酸カリウム（１０．４ｇ、０．０３５モル）を還流下に２時間加熱し
た。懸濁液を濾過し、室温に冷却した後に固体を濾過により回収し、ブタノール
で洗浄し、真空中で５０℃で乾燥させ、２−アミノ−６−ベンジルアミノ−３−
ニトロピリジン（２２．２ｇ、９１％、融点１４５〜１４６℃）を得た。

【０１６７】 ６−ベンジル−３−（４−ヒドロキシフェニル）−５−アザキノキサリンを以
下のように２−アミノ−６−ベンジルアミノ−３−ニトロピリジンから製造した
：２−アミノ−６−ベンジルアミノ−３−ニトロピリジン（２５ｇ、０．１０モ
ル）をＨ₂の５．５バール下にラネーニッケル１０ｇの存在下でジオキサン４０ ０ｍｌ中で６０℃で水素添加した。２時間後に、反応混合物を室温に冷却し、濾
過し、かつ４−ヒドロキシフェニルグリオキサールを添加し、アルゴン雰囲気下
で２時間撹拌した。次いで懸濁液を水で希釈し、固体を濾過によって回収し、水
で洗浄し、２−プロパノールから再晶出させ、５０℃で真空中に乾燥させ、６−
ベンジルアミノ−３−（４−ヒドロキシフェニル）−５−アザキノキサリン（８
ｇ、２４．４％、融点２７１〜２７３℃）を得た。

【０１６８】化合物Ａ−１：６−フェニルアミノ−３−（４−ヒドロキシフェニル）−５−ア ザキノキサリン 化合物Ａ−２の方法でベンジルアミンの代わりにフェニルアミンに置き換えて
、同様の方法で６−フェニルアミノ−３−（４−ヒドロキシフェニル）−５−ア
ザキノキサリンが得られた。

【０１６９】化合物Ａ−３：６−メトキシ−２−メチル−３−フェニル−５−アザキノキサリ ン 化合物Ａ−２の方法で４−ヒドロキシフェニルグリオキサールの代わりに１−
フェニル−１，２−プロパンジオンと置き換え、ベンジルアミンの代わりにメタ
ノールと置き換え、同様の方法で６−メトキシ−２−メチル−３−フェニル−５
−アザキノキサリンが得られた。

【０１７０】化合物Ａ−４：６−メトキシ−２，３−ジフェニル−５−アザキノキサリン 化合物Ａ−２のための方法で４−ヒドロキシフェニルグリオキサールの代わり
にベンジルに置き換え、ベンジルアミンの代わりにメタノールに置き換え、同様
の方法で６−メトキシ−２，３−ジフェニル−５−アザキノキサリンが得られた
。

【０１７１】化合物Ａ−５：６−（４−フルオロベンジルアミノ）−２−メチル−３−フェニ ル−５−アザキノキサリン 化合物Ａ−２のための方法で４−ヒドロキシフェニルグリオキサールの代わり
に１−フェニル−１，２−プロパンジオンと置き換え、ベンジルアミンの代わり
に４−フルオロベンジルアミンに置き換え、同様の方法で６−（４−フルオロベ
ンジルアミノ）−２−メチル−３−フェニル−５−アザキノキサリンが得られた
。

【０１７２】化合物Ａ−６：２，３−ジフェニル−６−（４−フルオロベンジルアミノ）−５ −アザキノキサリン 化合物Ａ−２のための方法において、４−ヒドロキシフェニルグリオキサール
の代わりにベンジルで置き換え、ベンジルアミンの代わりに４−フルオロベンジ
ルアミンで置き換え、同様の方法で２，３−ジフェニル−６−（４−フルオロベ
ンジルアミノ）−５−アザキノキサリンが得られた。

【０１７３】化合物Ａ−７：３−フェニル−６−フェニルアミノ−５−アザキノキサリン 化合物Ａ−２の方法において、４−ヒドロキシフェニルグリオキサールの代わ
りにフェニルグリオキサールで置き換え、ベンジルアミンの代わりにアニリンで
置き換え、同様の方法で３−フェニル−６−フェニルアミノ−５−アザキノキサ
リンが得られた。

【０１７４】化合物Ａ−８〜化合物Ａ−２６ 化合物Ａ−２の方法において、ベンジルアミンの代わりに適当な置換ベンジル
アミンで置き換え、同様の方法で以下の化合物が得られた： 化合物Ａ−８：６−（２−カルボキシベンジルアミノ）−３−（４−ヒドロキシ
フェニル）−５−アザキノキサリン 化合物Ａ−９：６−（３−カルボキシベンジルアミノ）−３−（４−ヒドロキシ
フェニル）−５−アザキノキサリン 化合物Ａ−１０：６−（４−カルボキシベンジルアミノ）−３−（４−ヒドロキ
シフェニル）−５−アザキノキサリン 化合物Ａ−１１：３−（４−ヒドロキシフェニル）−６−（２−ニトロベンジル
アミノ）−５−アザキノキサリン 化合物Ａ−１２：３−（４−ヒドロキシフェニル）−６−（３−ニトロベンジル
アミノ）−５−アザキノキサリン 化合物Ａ−１３：３−（４−ヒドロキシフェニル）−６−（４−ニトロベンジル
アミノ）−５−アザキノキサリン 化合物Ａ−１４：３−（４−ヒドロキシフェニル）−６−（２−メチルベンジル
アミノ）−５−アザキノキサリン 化合物Ａ−１５：３−（４−ヒドロキシフェニル）−６−（３−メチルベンジル
アミノ）−５−アザキノキサリン 化合物Ａ−１６：３−（４−ヒドロキシフェニル）−６−（４−メチルベンジル
アミノ）−５−アザキノキサリン 化合物Ａ−１７：６−（２−クロロベンジルアミノ）−３−（４−ヒドロキシフ
ェニル）−５−アザキノキサリン 化合物Ａ−１８：６−（３−クロロベンジルアミノ）−３−（４−ヒドロキシフ
ェニル）−５−アザキノキサリン 化合物Ａ−１９：６−（４−クロロベンジルアミノ）−３−（４−ヒドロキシフ
ェニル）−５−アザキノキサリン 化合物Ａ−２０：６−（２−フルオロベンジルアミノ）−３−（４−ヒドロキシ
フェニル）−５−アザキノキサリン 化合物Ａ−２１：６−（３−フルオロベンジルアミノ）−３−（４−ヒドロキシ
フェニル）−５−アザキノキサリン 化合物Ａ−２２：６−（４−フルオロベンジルアミノ）−３−（４−ヒドロキシ
フェニル）−５−アザキノキサリン 化合物Ａ−２３：３−（４−ヒドロキシフェニル）−６−［２−（トリフルオロ
メチル）ベンジルアミノ］−５−アザキノキサリン 化合物Ａ−２４：３−（４−ヒドロキシフェニル）−６−［３−（トリフルオロ
メチル）ベンジルアミノ］−５−アザキノキサリン 化合物Ａ−２５：３−（４−ヒドロキシフェニル）−６−［４−（トリフルオロ
メチル）ベンジルアミノ］−５−アザキノキサリン 化合物Ａ−２６：３−（４−ヒドロキシフェニル）−６−（フェネチル−１−ア
ミノ）−５−アザキノキサリン化合物Ａ−２７〜化合物Ａ−４８ 化合物Ａ−２のための方法において、ベンジルアミンの代わりに適当な置換ア
ニリンに置き換えて、同様の方法で以下の化合物が得られた： 化合物Ａ−２７：６−（２−カルボキシフェニルアミノ）−３−（４−ヒドロキ
シフェニル）−５−アザキノキサリン 化合物Ａ−２８：６−（３−カルボキシフェニルアミノ）−３−（４−ヒドロキ
シフェニル）−５−アザキノキサリン 化合物Ａ−２９：６−（４−カルボキシフェニルアミノ）−３−（４−ヒドロキ
シフェニル）−５−アザキノキサリン 化合物Ａ−３０：３−（４−ヒドロキシフェニル）−６−（２−ニトロフェニル
アミノ）−５−アザキノキサリン 化合物Ａ−３１：３−（４−ヒドロキシフェニル）−６−（３−ニトロフェニル
アミノ）−５−アザキノキサリン 化合物Ａ−３２：３−（４−ヒドロキシフェニル）−６−（４−ニトロフェニル
アミノ）−５−アザキノキサリン 化合物Ａ−３３：３−（４−ヒドロキシフェニル）−６−（２−メチルフェニル
アミノ）−５−アザキノキサリン 化合物Ａ−３４：３−（４−ヒドロキシフェニル）−６−（３−メチルフェニル
アミノ）−５−アザキノキサリン 化合物Ａ−３５：３−（４−ヒドロキシフェニル）−６−（４−メチルフェニル
アミノ）−５−アザキノキサリン 化合物Ａ−３６：６−（２−クロロフェニルアミノ）−３−（４−ヒドロキシフ
ェニル）−５−アザキノキサリン 化合物Ａ−３７：６−（３−クロロフェニルアミノ）−３−（４−ヒドロキシフ
ェニル）−５−アザキノキサリン 化合物Ａ−３８：６−（４−クロロフェニルアミノ）−３−（４−ヒドロキシフ
ェニル）−５−アザキノキサリン 化合物Ａ−３９：６−（２−フルオロフェニルアミノ）−３−（４−ヒドロキシ
フェニル）−５−アザキノキサリン 化合物Ａ−４０：６−（３−フルオロフェニルアミノ）−３−（４−ヒドロキシ
フェニル）−５−アザキノキサリン 化合物Ａ−４１：６−（４−フルオロフェニルアミノ）−３−（４−ヒドロキシ
フェニル）−５−アザキノキサリン 化合物Ａ−４２：３−（４−ヒドロキシフェニル）−６−［（２−トリフルオロ
メチル）フェニルアミノ］−５−アザキノキサリン 化合物Ａ−４３：３−（４−ヒドロキシフェニル）−６−［（３−トリフルオロ
メチル）フェニルアミノ］−５−アザキノキサリン 化合物Ａ−４４：３−（４−ヒドロキシフェニル）−６−［（４−トリフルオロ
メチル）フェニルアミノ］−５−アザキノキサリン 化合物Ａ−４５：３−（４−ヒドロキシフェニル）−６−（ピリド−２−アミノ
）−５−アザキノキサリン 化合物Ａ−４６：３−（４−ヒドロキシフェニル）−６−（ピリド−３−アミノ
）−５−アザキノキサリン 化合物Ａ−４７：３−（４−ヒドロキシフェニル）−６−（ピリド−４−アミノ
）−５−アザキノキサリン 化合物Ａ−４８：３−（４−ヒドロキシフェニル）−６−（ピリド−２−メチル
アミノ）−５−アザキノキサリン化合物Ａ−４９〜化合物Ａ−６７ 化合物Ａ−２のための方法において、ベンジルアミンの代わりに適当な置換ベ
ンジルアミンと置き換え、４−ヒドロキシフェニルグリオキサールの代わりにフ
ェニルグリオキサールと置き換えて、同様の方法で以下の化合物が得られた： 化合物Ａ−４９：６−（２−カルボキシベンジルアミノ）−３−フェニル−５−
アザキノキサリン 化合物Ａ−５０：６−（３−カルボキシベンジルアミノ）−３−フェニル−５−
アザキノキサリン 化合物Ａ−５１：６−（４−カルボキシベンジルアミノ）−３−フェニル−５−
アザキノキサリン 化合物Ａ−５２：６−（２−ニトロベンジルアミノ−３−フェニル）−５−アザ
キノキサリン 化合物Ａ−５３：６−（３−ニトロベンジルアミノ）−３−フェニル−５−アザ
キノキサリン 化合物Ａ−５４：６−（４−ニトロベンジルアミノ）−３−フェニル−５−アザ
キノキサリン 化合物Ａ−５５：６−（２−メチルベンジルアミノ）−３−フェニル−５−アザ
キノキサリン 化合物Ａ−５６：６−（３−メチルベンジルアミノ）−３−フェニル−５−アザ
キノキサリン 化合物Ａ−５７：６−（４−メチルベンジルアミノ）−３−フェニル−５−アザ
キノキサリン 化合物Ａ−５８：６−（２−クロロベンジルアミノ）−３−フェニル−５−アザ
キノキサリン 化合物Ａ−５９：６−（３−クロロベンジルアミノ）−３−フェニル−５−アザ
キノキサリン 化合物Ａ−６０：６−（４−クロロベンジルアミノ）−３−フェニル−５−アザ
キノキサリン 化合物Ａ−６１：６−（２−フルオロベンジルアミノ）−３−フェニル−５−ア
ザキノキサリン 化合物Ａ−６２：６−（３−フルオロベンジルアミノ）−３−フェニル−５−ア
ザキノキサリン 化合物Ａ−６３：６−（４−フルオロベンジルアミノ）−３−フェニル−５−ア
ザキノキサリン 化合物Ａ−６４：３−フェニル−６−［２−（トリフルオロメチル）ベンジルア
ミノ］−５−アザキノキサリン 化合物Ａ−６５：３−フェニル−６−［３−（トリフルオロメチル）ベンジルア
ミノ］−５−アザキノキサリン 化合物Ａ−６６：３−フェニル−６−［４−（トリフルオロメチル）ベンジルア
ミノ］−５−アザキノキサリン 化合物Ａ−６７：３−フェニル−６−（フェネチル−１−アミノ）−５−アザキ
ノキサリン化合物Ａ−６８〜化合物Ａ−８９ 化合物Ａ−２のための方法において、ベンジルアミンの代わりに適当な置換ア
ニリンと置き換え、４−ヒドロキシフェニルグリオキサールの代わりにフェネチ
ルグリオキサールに置き換え、同様の方法で以下の化合物が得られた： 化合物Ａ−６８：６−（２−カルボキシフェニルアミノ）−３−フェニル−５−
アザキノキサリン 化合物Ａ−６９：６−（３−カルボキシフェニルアミノ）−３−フェニル−５−
アザキノキサリン 化合物Ａ−７０：６−（４−カルボキシフェニルアミノ）−３−フェニル−５−
アザキノキサリン 化合物Ａ−７１：６−（２−ニトロフェニルアミノ）−３−フェニル−５−アザ
キノキサリン 化合物Ａ−７２：６−（３−ニトロフェニルアミノ）−３−フェニル−５−アザ
キノキサリン 化合物Ａ−７３：６−（４−ニトロフェニルアミノ）−３−フェニル−５−アザ
キノキサリン 化合物Ａ−７４：６−（２−メチルフェニルアミノ）−３−フェニル−５−アザ
キノキサリン 化合物Ａ−７５：６−（３−メチルフェニルアミノ）−３−フェニル−５−アザ
キノキサリン 化合物Ａ−７６：６−（４−メチルフェニルアミノ）−３−フェニル−５−アザ
キノキサリン 化合物Ａ−７７：６−（２−クロロフェニルアミノ）−３−フェニル−５−アザ
キノキサリン 化合物Ａ−７８：６−（３−クロロフェニルアミノ）−３−フェニル−５−アザ
キノキサリン 化合物Ａ−７９：６−（４−クロロフェニルアミノ）−３−フェニル−５−アザ
キノキサリン 化合物Ａ−８０：６−（２−フルオロフェニルアミノ）−３−フェニル−５−ア
ザキノキサリン 化合物Ａ−８１：６−（３−フルオロフェニルアミノ）−３−フェニル−５−ア
ザキノキサリン 化合物Ａ−８２：６−（４−フルオロフェニルアミノ）−３−フェニル−５−ア
ザキノキサリン 化合物Ａ−８３：３−フェニル−６−［（２−トリフルオロメチル）フェニルア
ミノ］−５−アザキノキサリン 化合物Ａ−８４：３−フェニル−６−［（３−トリフルオロメチル）フェニルア
ミノ］−５−アザキノキサリン 化合物Ａ−８５：３−フェニル−６−［（４−トリフルオロメチル）フェニルア
ミノ］−５−アザキノキサリン 化合物Ａ−８６：３−フェニル−６−（ピリド−２−アミノ）−５−アザキノキ
サリン 化合物Ａ−８７：３−フェニル−６−（ピリド−３−アミノ）−５−アザキノキ
サリン 化合物Ａ−８８：３−フェニル−６−（ピリド−４−アミノ）−５−アザキノキ
サリン 化合物Ａ−８９：３−フェニル−６−（ピリド−２−メチルアミノ）−５−アザ
キノキサリン化合物Ａ−９０：６−フェニルアミノ−３−（４−メトキシフェニル）−５−ア ザキノキサリン 化合物Ａ−１のための方法において、４−ヒドロキシフェニルの代わりに置換
４−メトキシフェニルに置き換えて、同様の方法で６−フェニルアミノ−３−（
４−メトキシフェニル）−５−アザキノキサリンが得られた。

【０１７５】例２：ＲＡＦのリン酸化機能を測定するアッセイ 以下のアッセイは標的タンパク質ＭＥＫならびにＭＥＫの標的のＭＡＰＫのＲ
ＡＦに触媒されるリン酸化の量を報告する。ＲＡＦ遺伝子配列はＢｏｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：１４００−１ ４０７に記載されており、かつ多様な遺伝子配列データバンクで容易に入手でき
る。本発明のこの部分で使用される核酸ベクターおよび細胞系の構築はＭｏｒｒ
ｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ ８５：８８５５−８８５９に完全に記載されている。

【０１７６】材料および試薬 １．Ｓｆ９（スポドプテラ フルギペルダ）細胞；ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ、Ｇａ ｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ ２．ＲＩＰＡバッファー：２０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１３
７ｍＭのＮａＣｌ、１０％のグリセロール、１ｍＭのＰＭＳＦ、５ｍｇ／Ｌのア
プロテニン（Aprotenin）、０．５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００； ３．チオレドキシン−ＭＥＫ融合タンパク質（Ｔ−ＭＥＫ）：Ｔ−ＭＥＫ発現
およびアフィニティークロマトグラフィーによる精製は製造者の手順に従って実
施した。カタログ# Ｋ ３５０−０１およびＲ ３５０−４０、インビトロゲン社
、サンディエゴ、ＣＡ ４．Ｈｉｓ−ＭＡＰＫ（ＥＲＫ２）；Ｈｉｓタグを有するＭＡＰＫを、Ｈｉｓ
−ＭＡＰＫをコードするｐＵＣ１８ベクターで形質転換したＸＬ１ Ｂｌｕｅ細 胞で発現させた。Ｈｉｓ−ＭＡＰＫを本明細書に記載のようにＮｉアフィニティ
ークロマトグラフィーで精製した。カタログ# ２７−４９４９−０１、ファルマ
シア、アラミダ、ＣＡ。

【０１７７】 ５．ヒツジ抗マウスＩｇＧ：ジャクソン研究所、ウエストグローヴ、ＰＡ．カ
タログ# ５１５−００６−００８、ロット# ２８５６３ ６．ＲＡＦ−１プロテインキナーゼ特異抗体：ＵＢＩのＵＲＰ２６５３。

【０１７８】 ７．コーティングバッファー：ＰＢＳ；リン酸緩衝食塩水、ＧＩＢＣＯ−ＢＲ
Ｌ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ ８．ウォッシュバッファー：ＴＢＳＴ−５０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７
．２）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ ９．ブロックバッファー：ＴＢＳＴ、０．１％のエタノールアミン（ｐＨ７．
４） １０．ＤＭＳＯ、シグマ、セントルイス、ＭＯ １１．キナーゼバッファー（ＫＢ）：２０ｍＭのＨｅｐｅｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７
．２）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１ｍＭ のＰＭＳＦ、５ｍｇ／Ｌのアプロテニン、７５μＭのオルトバナジン酸ナトリウ
ム、０．５ｍＭのＤＴＴおよび１０ｍＭのＭｇＣｌ₂ １２．ＡＴＰミックス：１００ｍＭのＭｇＣｌ₂、３００μＭのＡＴＰ、１０ μＣｉのγ−³³ＰのＡＴＰ（デュポン−ＮＥＮ）／ｍｌ １３．停止溶液：１％のリン酸；フィッシャー、ピッツバーグ、ＰＡ １４．ワラックのリン酸セルロースフィルターマット（Wallac Cellulose Pho
sphate Filter mats）；ワラック、トゥルク、フィンランド １５．フィルター洗浄溶液：１％のリン酸、フィッシャー、ピッツバーグ、Ｐ
Ａ １６．Ｔｏｍｔｅｃプレートハーベスター、ワラック、トゥルク、フィンラン
ド １７．ワラックベータプレートリーダー（Wallac beta plate reader）# １２
０５、ワラック、トゥルク、フィンランド １８．化合物のためのＮＵＮＣ ９６ウェルＶ底ポリプロピレンプレート、応 用科学カタログ# ＡＳ−７２０９２手順 以下の工程の全ては特に記載がない限り室温で実施した。

【０１７９】 １．ＥＬＩＳＡプレートコーティング：ＥＬＩＳＡウェルをヒツジ抗マウスア
フィニティー精製血清（１μｇ／コーティングバッファー１００μｌ）１００μ
Ｌで一晩４℃で被覆した。ＥＬＩＳＡプレートは４℃で保存する場合は２週間使
用することができる。

【０１８０】 ２．プレートを反転し、液体を除去した。ブロッキング溶液１００μＬを添加
し、３０分間インキュベートした。

【０１８１】 ３．ブロッキング溶液を除去し、ウォッシュバッファーで４回洗浄した。ペー
パータオル上でプレートを拭き、過剰な液体を除去した。

【０１８２】 ４．各ウェルにＲＡＦ−１に特異的な抗体１μｇを添加し、１時間インキュベ
ートした。工程３に記載のように洗浄した。

【０１８３】 ５．ＲＡＳ／ＲＡＦを有する感染させたＳｆ９細胞からの溶解産物を溶かし、
ＴＢＳＴで１０μｇ／１００μｌに希釈した。ウェルに希釈した溶解産物１０μ
ｇを添加し、１時間インキュベートした。インキュベーションの間にプレートを
振盪した。ネガティブコントロールは溶解産物を受容しなかった。ＲＡＳ／ＲＡ
Ｆを有する感染させたＳｆ９昆虫細胞からの溶解産物を、各ウイルスに関して感
染多重度５で組み換えバキュウロウイルスで細胞を感染させた後に調製し、４８
時間後に収穫した。細胞をＰＢＳで１回洗浄し、ＲＩＰＡバッファー中で溶解さ
せた。不溶性の材料を遠心分離（１００００×ｇで５分間）で除去した。溶解物
のアリコートをドライアイス／エタノール中で凍結させ、使用するまで−８０℃
で保管した。

【０１８４】 ６．非結合材料を除去し、前記（工程３）で概説したように洗浄した。

【０１８５】 ７．ウェルあたり２μｇのＴ−ＭＥＫおよび２μｇのＨｉｓ−ＭＡＥＰＫを添
加し、容量をキナーゼバッファーで４０μｌに調整した。細胞抽出物からのＴ−
ＭＥＫおよびＭＡＰＫの精製方法は明細書中に例によって提供した。

【０１８６】 ８．化合物（ストック溶液１０ｍｇ／ｍｌ ＤＭＳＯ）または抽出物をＴＢＳ Ｔ＋１％のＤＭＳＯ中２０倍に予備希釈した。予備希釈した化合物／抽出物５μ
ｌを工程６に記載のウェルに添加した。２０分間インキュベートした。コントロ
ールは薬剤を受容しなかった。

【０１８７】 ９．５μｌのＡＴＰミックスの添加によってキナーゼ反応を開始させ、インキ
ュベーション中にＥＬＩＳＡプレート振盪器上でプレートを振盪した。

【０１８８】 １０．各ウェルに３０μｌの停止溶液を添加することによって６０分後にキナ
ーゼ反応を停止させた。

【０１８９】 １１．ホスホセルロースマットおよびＥＬＩＳＡプレートをＴｏｍｔｅｃプレ
ートハーベスター中に配置した。収穫し、かつ製造者の推奨するようにフィルタ
ーウォッシュ溶液で洗浄した。フィルターマットを乾燥させた。フィルターマッ
トをシールし、これをホルダ中に配置した。ホルダを放射線検出装置中に挿入し
、フィルターマット上の放射性リンを定量した。

【０１９０】 選択的に、アッセイプレートの個々のウェルからの４０μｌのアリコートをホ
スホセルロースフィルターマット上の相応の位置に移してもよい。フィルターを
空気乾燥した後に、フィルターをトレイ中に置いた。トレイを緩慢に振盪し、１
５分の間隔で１時間ウォッシュ溶液を交換した。フィルターマットを空気乾燥さ
せた。フィルターマットをシールし、これを試料中の放射性リンの測定に適当な
ホルダ中に配置した。ホルダを検出装置中に挿入し、フィルターマット上の放射
性リンを定量した。

【０１９１】 ＩＣ₅₀値をＲＡＦ−１ ＥＬＩＳＡアッセイにおいてプロトコールに従って以 下の５−アザキノキサリンをベースとする化合物に関して測定した：

【０１９２】

【化１０】

【０１９３】 ＩＣ₅₀値は、リン酸化された標的タンパク質の最大量または細胞成長を５０％
ずつ低下させるのに必要な５−アザキノキサリンをベースとするインヒビターの
濃度である。ＲＡＦ−１のリン酸化アッセイで測定したＩＣ₅₀値を第１表に記載
した：

【０１９４】

【表４】

【０１９５】例３：ＭＡＰＫおよびＭＥＫの精製 ＭＡＰＫおよびＭＥＫタンパク質を、該タンパク質をコードする遺伝子をポリ
ヒスチジンタグを有するタンパク質を発現する市販のベクター中にサブクローニ
ングすることによって細胞中で容易に発現させた。前記タンパク質をコードする
遺伝子は、該タンパク質を使用して通常に作業している研究所からか、またはｃ
ＤＮＡライブラリーを有する細胞からこれらの遺伝子をクローニングすることに
よって容易に得ることができる。該ライブラリーは容易に商業的に得ることがで
き、当業者は多数の遺伝子データベース、例えばＧｅｎｂａｎｋで得られるＭＥ
ＫおよびＭＡＰＫの核酸配列から、ＭＥＫまたはＭＡＰＫをコードするｃＤＮＡ
分子に相同な核酸プローブを容易に設計することができる。遺伝子のクローニン
グは当業者に現在使用される技術を使用して短時間で達成することができる。

【０１９６】 細胞抽出物からのＭＥＫおよびＭＡＰＫタンパク質の精製はＲｏｂｂｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：５０９７−５１０ ６を応用した以下のプロトコールを使用して達成できる： １．当業者に容易に使用されるソニケーション、浸透圧ストレスまたはフレン
チプレス技術によって細胞を溶解した。適当なソニケーションバッファーを以下
に規定した。

【０１９７】 ２．以下に開示した平衡バッファーを使用して、ニッケルまたはコバルトと結
合させた固体担体を平衡化した。ポリヒスチジンタグを特異的に固体担体上のニ
ッケルおよびコバルト原子に結合させた。平衡化は樹脂を固体担体の容量の１０
倍に等しい平衡バッファーの量で３回洗浄することによって達成できる。固体担
体は当業者が容易に入手できる。

【０１９８】 ３．細胞溶解産物を固体担体に添加し、ある期間容器中で平衡化させた。選択
的に固体担体をタンパク質クロマトグラフィーカラム内に充填してよく、溶解物
を固体担体中に流動させてもよい。

【０１９９】 ４．固体担体を以下に開示されるウォッシュバッファーで洗浄した。

【０２００】 ５．固体担体から大部分のタンパク質を除去する溶出バッファーの量（以下に
規定する）で固体担体からＭＥＫまたはＭＡＰＫタンパク質を溶出した。

【０２０１】ソニケーションバッファー ５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ８．０） ０．３Ｍの塩化ナトリウム １０ｍＭのβ−メルカプトエタノール １％ＮＰ４０ １０ｍＭのＮａＦ ０．５ｍＭのＰｅｆａｂｌｏｃｋ平衡バッファー ５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ８．０） ０．３Ｍの塩化ナトリウム １０ｍＭのβ−メルカプトエタノール １％のＮＰ４０ １０ｍＭのＮａＦ １ｍＭのイミダゾールウォッシュバッファー ５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ８．０） ０．３Ｍの塩化ナトリウム １０ｍＭのβ−メルカプトエタノール １％のＮＰ４０ １０ｍＭのＮａＦ １０ｍＭのイミダゾール溶出バッファー ５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ８．０） ０．３Ｍの塩化ナトリウム １０ｍＭのβ−メルカプトエタノール １％のＮＰ４０ １０ｍＭのＮａＦ １０〜５００ｍＭのイミダゾール例４：ＥＧＦレセプターのリン酸化機能を測定するアッセイ 全細胞におけるＥＧＦレセプターキナーゼ活性（ＥＧＦＲ−ＮＩＨ３Ｔ３アッ
セイ）をタン他によって１９９６年６月５日に出願されたＰＣＴ出願ＷＯ９６４
０１１６号および全ての図面を含み、全内容において引用することにより本明細
書に記載されたものとする表題“疾患の治療のためのインドリン化合物”に詳細
に記載されるように測定した。

【０２０２】 ＥＧＦレセプターリン酸化アッセイで測定したＩＣ₅₀値を第２表に記載した：

【０２０３】

【表５】

【０２０４】例５：ＲＡＳを発現する細胞の成長における５−アザキノキサリンをベースとす る化合物の効果を測定するアッセイ 以下のアッセイはＲＡＳを発現するＮＩＨ−３Ｔ３細胞の成長速度を測定する
。該アッセイの目的はＨ−Ｒａｓを過剰に発現するＮＩＴ３Ｔ３細胞の成長にお
ける化合物の効果を測定することである。

【０２０５】材料 ９６ウェルの平底滅菌プレート ９６ウェルの丸底滅菌プレート 滅菌した２５ｍｌまたは１００ｍｌの容器（reservoir） ピペット、マルチチャンネルピペットマン 滅菌ピペットチップ 滅菌１５ｍｌおよび５０ｍｌ試験管試薬 １％の酢酸中の０．４％のＳＲＢ １０ｍＭトリス塩基 １０％のＴＣＡ １％の酢酸 滅菌ＤＭＳＯ（シグマ） ＤＭＳＯ中の化合物（１００ｍＭ未満のストック溶液） トリプシン−ＥＤＴＡ（GIBCO BRL）細胞系 ３Ｔ３／Ｈ−Ｒａｓ（発癌性Ｈ−Ｒａｓのゲノム断片を発現するＮＩＴ３Ｔ３ク
ローン７細胞） 該細胞を以下のプロトコールを使用して作成することができる： １．Ｒａｓをコードする遺伝子断片をＮＩＴ−３Ｔ３細胞に安定にトランスフ
ェクトする市販のベクター中にサブクローニングする。該断片はｃＨａ−ｒａｓ
のゲノムの形質転換対立遺伝子由来である。

【０２０６】 ２．ＮＩＴ−３Ｔ３細胞にサブクローニングしたベクターをリン酸カルシウム
法によってトランスフェクトさせる。Ｒａｓ構築物を発現する細胞をＤＭＥＭ中
の２％の血清中で選択した。２週間後に明白なフォーカスが確認された。形質転
換した細胞をプールし、安定に形質転換した細胞系が生じた。

【０２０７】成長培地 ２％の子ウシ血清／ＤＭＥＭ＋２ｍＭのグルタミン（Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）プロトコール ０日目：細胞のプレーティング アッセイのこの部分は層流フード（laminar flow hood）中で実施した。

【０２０８】 １．細胞をトリプシン処理した。細胞懸濁液２００μｌを同中性子体１０ｍｌ
に移す。クールター計数器で細胞を計数した。

【０２０９】 ２．細胞を成長培地中で６００００細胞／ｍｌに希釈した。細胞１００μｌを
９６ウェルの平底プレートの各ウェルに移し、６０００細胞／ウェルにした。

【０２１０】 ３．各化合物のためにプレートの半分（４行）を、各化合物濃度のために４通
りのウェルを、かつ培地コントロールのために一連の４ウェルを使用した。

【０２１１】 ４．プレートを緩慢に振盪し、細胞に均一に付着させた。

【０２１２】 ５．プレートを１０％のＣＯ₂インキュベーター中で３７℃でインキュベート した。

【０２１３】１日目：化合物の添加 アッセイのこの部分は層流フード中で実施した。

【０２１４】 １．９６ウェルの平底プレートにおいて、化合物の最高スクリーニング濃度を
提供する２×最終％ＤＭＳＯを含有する成長培地１２０μｌを列１〜列１１に添
加した。例えば最高濃度が１００μｌであり、これが１００ｍＭのストックから
製造され、１×ＤＭＳＯが０．１％である場合、２×ＤＭＳＯは０．２％である
。該プレートを使用して、１個の化合物につき４行で化合物を滴定した。

【０２１５】 ２．滅菌１５ｍｌ試験管で、成長培地中で化合物の最高濃度の２×溶液を作成
し、２×ＤＭＳＯを添加した。細胞あたり１ｍｌが必要である。通常、化合物の
出発濃度は１００μＭであるが、該濃度は化合物の溶解度に依存して変わること
がある。

【０２１６】 ３．２×の出発化合物溶液２４０μｌを９６ウェルの丸底プレートの列１２中
の４通りのウェルに移した。１２μｌを列１２から列１１へ、列１１から列１０
へ、かつ同様にして列２を経て移すことによってプレートにわたり右から左へ１
：２の連続的希釈を実施した。化合物希釈溶液１００μｌおよび列１の培地１０
０μｌを９６ウェルの平底プレートの相応のウェル中の細胞の培地１００μｌに
移した。ウェルあたりの全容量は２００μｌにすべきである。

【０２１７】 ４．プレートをインキュベーターに戻し、３日間インキュベートした。

【０２１８】４日目：アッセイの展開 アッセイのこの部分はベンチ上で実施した。

【０２１９】 １．培地を吸引または流し去った。各ウェルに１０％の冷ＴＣＡ２００μｌを
添加し、細胞を固定した。プレートを４℃で少なくとも６０分間インキュベート
した。

【０２２０】 ２．ＴＣＡを捨て、ウェルを水道水で５回すすいだ。プレートをペーパータオ
ル上で逆さにして乾燥させた。

【０２２１】 ３．１ウェルあたり１００μｌの０．４％ＳＲＢで１０分間細胞を染色した。

【０２２２】 ４．ＳＲＢを流し、１％の酢酸でプレートを５回洗浄した。ペーパータオル上
で逆さにしてプレートを完全に乾燥させた。

【０２２３】 ５．１ウェルあたり１００μｌの１０ｍＭトリス塩基を使用して振盪器上で５
〜１０分間染料を可溶化させた。

【０２２４】 ６．６３０ｎｍを基準として５７０ｎｍでＤｙｎａｔｅｃｈ ＥＬＩＳＡプレ ートリーダー上でプレートを読んだ。

【０２２５】 ＲＡＳを過剰に発現する細胞の成長速度を第３表に記載のように阻害する化合
物を選択した。

【０２２６】

【表６】

【０２２７】例６：Ａ５４９細胞の成長における５−アザキノキサリンをベースとする化合物 の効果を測定するアッセイ 以下のアッセイはＡ５４９細胞に関する成長速度を測定する。該アッセイの目
的はＡ５４９ヒト肺癌細胞の成長における化合物の効果を決定することである。
Ａ５４９細胞は商業的由来、例えばＡＴＣＣ（ＣＣＬ１８５）から容易に入手す
ることができる。

【０２２８】材料 ９６ウェルの平底滅菌プレート ９６ウェルの丸底滅菌プレート 滅菌の２５ｍｌまたは１００ｍｌの容器 ピペット、マルチチャンネルピペットマン 滅菌ピペットチップ 滅菌の１５ｍｌおよび５０ｍｌの試験管試薬 １％の酢酸中０．４％のＳＲＢ １０ｍＭのトリス塩基 １０％のＴＣＡ １％の酢酸 滅菌ＤＭＳＯ（シグマ） ＤＭＳＯ中の化合物（１００ｍＭ未満のストック溶液） トリプシン−ＥＤＴＡ（GIBCO BRL）細胞系および成長培地 Ａ５４９ヒト肺癌細胞（ATCC CCL185） ＨａｍのＦ１２−Ｋにおける１０％胎児の子ウシ血清プロトコール ０日目：細胞プレーティング アッセイのこの部分は層流フード中で実施した。

【０２２９】 １．細胞をトリプシン処理した。細胞懸濁液２００μｌを同中性子体１０ｍｌ
に移した。クールター計数器を使用して細胞を計数した。

【０２３０】 ２．細胞を成長培地中で２００００細胞／ｍｌに希釈した。細胞１００μｌを
９６ウェルの平底プレートの各ウェルに移し、２０００細胞／ウェルにした。

【０２３１】 ３．各化合物のためにプレートの半分（４行）を、各化合物濃度のために４通
りのウェルを、かつ培地コントロールのために一連の４ウェルを使用した。

【０２３２】 ４．プレートを緩慢に振盪し、細胞を均一に付着させた。

【０２３３】 ５．１０％ＣＯ₂インキュベーター中で３７℃でプレートをインキュベートし た。

【０２３４】１日目：化合物の添加 アッセイのこの部分は層流フード中で実施した。

【０２３５】 １．９６ウェルの丸底プレートにおいて、化合物の最高スクリーニング濃度を
提供する２×最終％ＤＭＳＯを含有する成長培地１２０μｌを列１〜列１１に添
加した。例えば最高のスクリーニング濃度が１００μＭであり、これが１００ｍ
Ｍストックから製造される場合に、１×ＤＭＳＯは０．１％であり、２×ＤＭＳ
Ｏは０．２％である。このプレートを使用して化合物を、化合物あたり４列で滴
定した。

【０２３６】 ２．滅菌１５ｍｌ試験管において、成長培地＋２×ＤＭＳＯ中の化合物の最高
のスクリーニング濃度の２×溶液を製造した。細胞系あたり１ｍｌが必要である
。通常、化合物の出発濃度は１００μＭであるが、この濃度は化合物の溶解度に
依存して変化することがある。

【０２３７】 ３．２×の出発化合物溶液２４０μｌを９６ウェルの丸底プレートの列１２中
の４通りのウェルに移した。１２μｌを列１２から列１１へ、列１１から列１０
へ、かつ同様にして列２を通して移すことによってプレートにわたり右から左に
１：２の連続的希釈を実施した。化合物希釈溶液１００μｌおよび列１の培地１
００μｌを９６ウェルの平底プレートの相応のウェル中の細胞の培地１００μｌ
に移した。ウェルあたりの全容量は２００μｌにすべきである。

【０２３８】 ４．プレートをインキュベーターに戻し、３日間インキュベートした。

【０２３９】５日目：アッセイの展開 アッセイのこの部分はベンチ上で実施した。

【０２４０】 １．培地を吸引または流し去った。各ウェルに冷１０％ＴＣＡ２００μｌを添
加し、細胞を固定した。プレートを４℃で少なくとも６０分間インキュベートし
た。

【０２４１】 ２．ＴＣＡを捨て、ウェルを水道水で５回すすいだ。プレートをペーパータオ
ル上で逆さにして乾燥させた。

【０２４２】 ３．１ウェルあたり１００μｌの０．４％ＳＲＢで１０分間細胞を染色した。

【０２４３】 ４．ＳＲＢを流し、１％の酢酸でウェルを５回洗浄した。ペーパータオル上で
逆さにしてプレートを完全に乾燥させた。

【０２４４】 ５．１ウェルあたり１００μｌの１０ｍＭトリス塩基を使用して振盪器上で５
〜１０分間染料を可溶化させた。

【０２４５】 ６．６３０ｎｍを基準として５７０ｎｍでＤｙｎａｔｅｃｈ ＥＬＩＳＡプレ ートリーダー上でプレートを読んだ。

【０２４６】 Ａ５４９細胞の成長速度を第４表に記載のように阻害する化合物を選択した。

【０２４７】

【表７】

【０２４８】例７：ＲＡＦ調整物質の生物学的活性をインビボで測定するための方法 異種移植研究を使用して、卵巣、黒色腫、前立腺、肺および乳房の腫瘍細胞に
おける本発明の化合物の効果をモニターする事ができる。該アッセイのためのプ
ロトコールはタン他によって１９９６年６月５日に出願されたＰＣＴ出願ＷＯ９
６４０１１６号ならびに全ての図面を含み、全内容において引用することにより
本明細書に記載されたものとする表題“疾患の治療のためのインドリン化合物”
に詳細に記載されている。

【０２４９】 本明細書に概略的に記載された発明を全ての要素、本明細書に特に開示されて
いない全ての制限なしに実施してよい。使用されている用語および表現は記載の
用語として使用されるものであり、制限の用語としては使用されず、示されかつ
記載された特徴もしくはその部分に相当する全て以外の用語および表現が使用さ
れるという意図はないが、請求される発明の範囲内で様々な変更が可能である。
従って、本発明は特に有利な態様および任意の特徴によって開示されているが、
本明細書中に開示される概念の変更および変量は当業者に慣例的であり、変量は
従属請求項に定義されるような本発明の範囲内であるべきと考慮されることを理
解するべきである。

【０２５０】 特許および非特許の文献の両者を含み、先に引用することにより本明細書に記
載されたものとされていない引用文献は、明白に全ての目的のために引用するこ
とによって本明細書に記載されたものとする。他の態様は本願の請求の範囲内で
ある。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ， ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，Ｌ Ｕ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ， ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，Ｕ Ｇ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ベルンハルト クッチャー ドイツ連邦共和国 マインタール シュト レーゼンマンシュトラーセ ９ (72)発明者 エックハルト グンター ドイツ連邦共和国 マインタール ヴィン ゲルトシュトラーセ 176 (72)発明者 ハーラルト アップ アメリカ合衆国 カリフォルニア サンフ ランシスコ トゥエンティセブンスストリ ート 630 Ｆターム(参考） 4C065 AA04 BB10 CC01 DD03 EE02 HH01 JJ07 KK02 KK04 LL01 PP03 PP12 QQ02 QQ03 4C086 AA01 AA02 AA03 AA04 CB09 MA01 MA02 MA03 MA04 MA05 NA14 ZA02 ZA59 ZA66 ZA81 ZB26 ZC02

Claims (40)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ５−アザキノキサリンをベースとする化合物によりセリン／
   トレオニンプロテインキナーゼの機能を調整する方法において、セリン／トレオ
   ニンプロテインキナーゼを発現する細胞と前記化合物とを接触させる工程を有す
   ることを特徴とするセリン／トレオニンプロテインキナーゼの機能を調整する方
   法。
2. 【請求項２】 セリン／トレオニンプロテインキナーゼがＲＡＦである、請
   求項１記載の方法。
3. 【請求項３】 セリン／トレオニンプロテインキナーゼの機能を調整する化
   合物の同定方法において、以下の工程： （ａ）セリン／トレオニンプロテインキナーゼを発現する細胞と前記化合物とを
   接触させ、かつ （ｂ）細胞における効果をモニターする を有することを特徴とする方法。
4. 【請求項４】 効果が細胞の表現型の変化の有無である、請求項３記載の方
   法。
5. 【請求項５】 効果が細胞の増殖の変化の有無である、請求項３記載の方法
   。
6. 【請求項６】 効果がセリン／トレオニンプロテインキナーゼの触媒活性の
   変化の有無である、請求項３記載の方法。
7. 【請求項７】 該効果がセリン／トレオニンプロテインキナーゼと明細書に
   記載されるような本来の結合パートナーとの間の相互作用の変化の有無である、
   請求項３記載の方法。
8. 【請求項８】 以下の工程： （ａ）細胞を溶解させ、セリン／トレオニンプロテインキナーゼを含有する溶解
   産物にし、 （ｂ）該セリン／トレオニンプロテインキナーゼを抗体に吸着させ、 （ｃ）吸着させたセリン／トレオニンプロテインキナーゼを１つまたは複数の基
   質と一緒にインキュベートし、 （ｄ）１つまたは複数の前記基質を固体担体に吸着させる からなり、その際、細胞における効果をモニターする工程が１つまたは複数の基
   質のホスフェート濃度の測定からなる、請求項３記載の方法。
9. 【請求項９】 セリン／トレオニンプロテインキナーゼがＲＡＦであり、か
   つ以下の工程： （ａ）細胞を溶解させ、ＲＡＦを含有する溶解産物にし、 （ｂ）ＲＡＦを抗体に吸着させ、 （ｃ）吸着させたＲＡＦをＭＥＫおよびＭＡＰＫと一緒にインキュベートし、 （ｄ）ＭＥＫおよびＭＡＰＫを固体担体または１つもしくは複数の抗体に吸着さ
   せる を有し、その際、細胞における効果を測定する工程がＭＥＫおよびＭＡＰＫのホ
   スフェート濃度をモニターすることを含む、請求項３記載の方法。
10. 【請求項１０】 ５−アザキノキサリンをベースとする化合物が構造Ｉ： 【化１】 ［式中、 （ａ）Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄およびＲ₆は、独立して （ｉ）水素、 （ｉｉ）アルキル、ハロゲン、トリハロメチル、カルボキシレート、ニトロおよ
    びエステル部からなる群から独立に選択される１個、２個もしくは３個の置換基
    で置換されていてよい５員もしくは６員のアリール環部もしくはヘテロアリール
    環部で置換されていてよい、飽和もしくは不飽和のアルキル、 （ｉｉｉ）Ｘ₂およびＸ₃が水素、飽和もしくは不飽和のアルキルならびに５員も
    しくは６員のアリール環部またはヘテロアリール環部からなる群から独立に選択
    される、式：ＮＸ₂Ｘ₃のアミン、 （ｉｖ）ハロゲンまたはトリハロメチル、 （ｖ）Ｘ₄が水素、アルキルおよび５員もしくは６員のアリール環部またはヘテ ロアリール環部からなる群から選択される、式：−ＣＯ−Ｘ₄のケトン、 （ｖｉ）Ｘ₅、Ｘ₆およびＸ₇がアルキルおよび５員もしくは６員のアリール環部 またはヘテロアリール環部から独立に選択され、かつｎが０または１である、式
    ：−（Ｘ₅）_n−ＣＯＯＨのカルボン酸または式：−（Ｘ₆）_n−ＣＯＯ−Ｘ₇のエ ステル、 （ｖｉｉ）Ｘ₈およびＸ₉が水素、飽和もしくは不飽和のアルキル、ならびにアル
    キル、ハロゲン、トリハロメチル、カルボキシレート、ニトロおよびエステルか
    らなる群から独立に選択される１個以上の置換基で置換されていてよい５員もし
    くは６員のアリール環部またはヘテロアリール環部からなる群から独立に選択さ
    れ、かつｎが０または１である、式：（Ｘ₈）_n−ＯＨのアルコールまたは式：−
    （Ｘ₈）_n−Ｏ−Ｘ₉のアルコキシ部、 （ｖｉｉｉ）Ｘ₁₀がアルキル、ヒドロキシル、ならびにアルキル、ハロゲン、ト
    リハロメチル、カルボキシレート、ニトロもしくはエステルから独立に選択され
    る１個以上の置換基によって置換されていてよい５員もしくは６員のアリール環
    部またはヘテロアリール環部からなる群から選択される、式：−ＮＨＣＯＸ₁₀の
    アミド、 （ｉｘ）Ｘ₁₁およびＸ₁₂が水素、アルキル、ならびに５員もしくは６員のアリー
    ル環部またはヘテロアリール環部からなる群から独立に選択される、−ＳＯ₂Ｎ Ｘ₁₁Ｘ₁₂、 （ｘ）アルキル、ハロゲン、トリハロメチル、カルボキシレート、ニトロならび
    にエステル部からなる群から独立に選択される１個、２個または３個の置換基で
    置換されていてよい５員もしくは６員のアリール環部またはヘテロアリール環部
    、 （ｘｉ）式：−ＣＯ−Ｈのアルデヒド、 （ｘｉｉ）Ｘ₁₃が飽和もしくは不飽和のアルキルおよび５員もしくは６員のアリ
    ール環部またはヘテロアリール環部から選択される、式：−ＳＯ₂−Ｘ₁₃のスル ホン、 からなる群から独立に選択され、 （ｂ）Ｘ₁は窒素、硫黄および酸素からなる群から選択される］で示される式を 有する、請求項１記載の方法。
11. 【請求項１１】 前記のＲ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄およびＲ₆が、独立して （ｉ）水素、 （ｉｉ）アルキル、ハロゲン、トリハロメチル、ヒドロキシ、アルコキシ、カル
    ボキシレート、ニトロならびにエステル部からなる群から独立に選択される１個
    、２個または３個の置換基によって置換されていてよい５員もしくは６員のアリ
    ール環部またはヘテロアリール環部で置換されていてよい飽和または不飽和のア
    ルキル、 （ｉｉｉ）アルキル、ハロゲン、トリハロメチル、ヒドロキシ、アルコキシ、カ
    ルボキシレート、ニトロならびにエステル部からなる群から独立に選択される１
    個、２個または３個の置換基で置換されていてよい５員もしくは６員のアリール
    環部またはヘテロアリール環部、 からなる群から選択される、請求項１０記載の方法。
12. 【請求項１２】 Ｒ₁およびＲ₂が、独立して （ｉ）水素、 （ｉｉ）アルキル、ハロゲン、トリハロメチル、ニトロ、カルボキシレート、ヒ
    ドロキシならびにアルコキシ部からなる群から選択される置換基で置換されてい
    てよいフェニル、 からなる群から独立に選択される、請求項１１記載の方法。
13. 【請求項１３】 Ｘ₁が窒素または酸素である、請求項１２記載の方法。
14. 【請求項１４】 Ｒ₆およびＸ₁の置換基が一緒になって、明細書に記載され
    ているようなＳＡＱＡＲ置換基からなる群から選択される部を形成する、請求項
    １３記載の方法。
15. 【請求項１５】 ５−アザキノキサリンをベースとする化合物を、明細書に
    記載されているようなＳＡＱＡＲ化合物からなる群から選択する、請求項１４記
    載の方法。
16. 【請求項１６】 生物における異常状態を予防または治療するための方法に
    おいて、該生物に式Ｉ： 【化２】 ［式中、 （ａ）Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄およびＲ₆は、独立して （ｉ）水素、 （ｉｉ）アルキル、ハロゲン、トリハロメチル、カルボキシレート、ニトロなら
    びにエステル部からなる群から独立に選択される１個、２個または３個の置換基
    で置換されていてよい５員もしくは６員のアリール環部またはヘテロアリール環
    部で置換されていてよい飽和もしくは不飽和のアルキル、 （ｉｉｉ）Ｘ₂およびＸ₃が水素、飽和もしくは不飽和のアルキル、ならびに５員
    もしくは６員のアリール環部またはヘテロアリール環部からなる群から独立に選
    択される、式：ＮＸ₂Ｘ₃のアミン、 （ｉｖ）ハロゲンまたはトリハロメチル、 （ｖ）Ｘ₄が水素、アルキルならびに５員もしくは６員のアリール環部またはヘ テロアリール環部からなる群から選択される、式：−ＣＯ−Ｘ₄のケトン、 （ｖｉ）Ｘ₅、Ｘ₆およびＸ₇がアルキルおよび５員もしくは６員のアリール環部 またはヘテロアリール環部からなる群から独立に選択され、かつｎは０または１
    である、式：−（Ｘ₅）_n−ＣＯＯＨのカルボン酸または式：−（Ｘ₆）_n−ＣＯＯ
    −Ｘ₇のエステル、 （ｖｉｉ）Ｘ₈およびＸ₉が水素、飽和もしくは不飽和のアルキル、ならびにアル
    キル、ハロゲン、トリハロメチル、カルボキシレート、ニトロおよびエステルか
    らなる群から独立に選択される１個以上の置換基で置換されていてよい５員もし
    くは６員のアリール環部またはヘテロアリール環部からなる群から独立に選択さ
    れ、かつｎは０または１である、式：（Ｘ₈）_n−ＯＨのアルコールまたは式：−
    （Ｘ₈）_n−Ｏ−Ｘ₉のアルコキシ部、 （ｖｉｉｉ）Ｘ₁₀がアルキル、ヒドロキシル、ならびにアルキル、ハロゲン、ト
    リハロメチル、カルボキシレート、ニトロまたはエステルからなる群から独立に
    選択される１個以上の置換基で置換されていてよい５員もしくは６員のアリール
    環部またはヘテロアリール環部からなる群から選択される、式：−ＮＨＣＯＸ₁₀ のアミド、 （ｉｘ）Ｘ₁₁およびＸ₁₂が水素、アルキルおよび５員もしくは６員のアリール環
    部またはヘテロアリール環部からなる群から独立に選択される、−ＳＯ₂ＮＸ₁₁ Ｘ₁₂、 （ｘ）アルキル、ハロゲン、トリハロメチル、カルボキシレート、ニトロおよび
    エステル部からなる群から独立に選択される１個、２個または３個の置換基で置
    換されていてよい５員もしくは６員のアリール環部またはヘテロアリール環部、
    （ｘｉ）式：−ＣＯ−Ｈのアルデヒド、 （ｘｉｉ）Ｘ₁₃が飽和もしくは不飽和のアルキルおよび５員もしくは６員のアリ
    ール環部またはヘテロアリール環部からなる群から選択される式：−ＳＯ₂−Ｘ_{1 3} のスルホン からなる群から選択され、 （ｂ）Ｘ₁は窒素、硫黄および酸素からなる群から選択される］の５−アザキノ キサリンをベースとする化合物を投与する工程を含む方法。
17. 【請求項１７】 Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄およびＲ₆が、独立して、 （ｉ）水素、 （ｉｉ）アルキル、ハロゲン、トリハロメチル、ヒドロキシ、アルコキシ、カル
    ボキシレート、ニトロおよびエステル部からなる群から独立に選択される１個、
    ２個または３個の置換基で置換されていてよい５員もしくは６員のアリール環部
    またはヘテロアリール環部で置換されていてよい飽和または不飽和のアルキル、
    （ｉｉｉ）アルキル、ハロゲン、トリハロメチル、ヒドロキシ、アルコキシ、カ
    ルボキシレート、ニトロおよびエステル部からなる群から独立に選択される１個
    、２個または３個の置換基で置換されていてよい５員もしくは６員のアリール環
    部またはヘテロアリール環部 からなる群から選択される、請求項１６記載の方法。
18. 【請求項１８】 Ｒ₁およびＲ₂は、独立して （ｉ）アルキル、ハロゲン、ヒドロキシおよびアルコキシ部からなる群から選択
    される置換基で置換されていてよいフェニルで置換されていてよいメチル、 （ｉｉ）アルキル、ハロゲン、ヒドロキシおよびアルコキシ部からなる群から選
    択される置換基で置換されていてよいフェニル からなる群から選択される、請求項１７記載の方法。
19. 【請求項１９】 Ｘ₁が窒素または酸素である、請求項１８記載の方法。
20. 【請求項２０】 Ｒ₆とＸ₁置換基が一緒になって、明細書中に記載されるよ
    うなＳＡＱＡＲ置換基からなる群から選択される部を形成する、請求項１９記載
    の方法。
21. 【請求項２１】 ５−アザキノキサリンをベースとする化合物が明細書中に
    記載されるようなＳＡＱＡＲ化合物からなる群から選択される、請求項２０記載
    の方法。
22. 【請求項２２】 生物がほ乳類である、請求項１６記載の方法。
23. 【請求項２３】 異常状態が癌または線維症性疾患である、請求項１６記載
    の方法。
24. 【請求項２４】 異常状態が、肺癌、卵巣癌、乳癌、脳癌、軸性脳内癌、結
    腸癌、前立腺癌、肉腫、カポジ肉腫、黒色腫および神経膠腫から選択される癌で
    ある、請求項２３記載の方法。
25. 【請求項２５】 異常状態が、セリン／トレオニンプロテインキナーゼと本
    来の結合パートナーとの間の相互作用を特徴とするシグナル伝達経路の異常に関
    連する、請求項１６記載の方法。
26. 【請求項２６】 セリン／トレオニンプロテインキナーゼがＲＡＦである、
    請求項２５記載の方法。
27. 【請求項２７】 式Ｉ： 【化３】 ［式中、 （ａ）Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄およびＲ₆が、独立して （ｉ）水素、 （ｉｉ）アルキル、ハロゲン、トリハロメチル、カルボキシレート、ニトロおよ
    びエステル部からなる群から独立に選択される１個、２個または３個の置換基で
    置換されていてよい５員もしくは６員のアリール環部またはヘテロアリール環部
    で置換されていてよい飽和または不飽和のアルキル、 （ｉｉｉ）Ｘ₂およびＸ₃が水素、飽和もしくは不飽和のアルキル、ならびに５員
    もしくは６員のアリール環部またはヘテロアリール環部からなる群から独立に選
    択される、式：ＮＸ₂Ｘ₃のアミン、 （ｉｖ）ハロゲンまたはトリハロメチル、 （ｖ）Ｘ₄が水素、アルキルおよび５員もしくは６員のアリール環部またはヘテ ロアリール環部からなる群から選択される、式：−ＣＯ−Ｘ₄のケトン、 （ｖｉ）Ｘ₅、Ｘ₆およびＸ₇がアルキルおよび５員もしくは６員のアリール環部 またはヘテロアリール環部からなる群から独立に選択され、ｎが０または１であ
    る、式：−（Ｘ₅）_n−ＣＯＯＨのカルボン酸または式：−（Ｘ₆）_n−ＣＯＯ−Ｘ ₇ のエステル、 （ｖｉｉ）Ｘ₈およびＸ₉が水素、飽和もしくは不飽和のアルキル、ならびにアル
    キル、ハロゲン、トリハロメチル、カルボキシレート、ニトロおよびエステルか
    らなる群から独立に選択される１個以上の置換基で置換されていてよい５員もし
    くは６員のアリール環部またはヘテロアリール環部からなる群から独立に選択さ
    れ、かつｎが０または１である、式：（Ｘ₈）_n−ＯＨのアルコールまたは式：−
    （Ｘ₈）_n−Ｏ−Ｘ₉のアルコキシ部、 （ｖｉｉｉ）Ｘ₁₀がアルキル、ヒドロキシル、ならびにアルキル、ハロゲン、ト
    リハロメチル、カルボキシレート、ニトロまたはエステルからなる群から独立に
    選択される１個以上の置換基で置換されていてよい５員もしくは６員のアリール
    環部またはヘテロアリール環部からなる群から選択される、式：−ＮＨＣＯＸ₁₀ のアミド、 （ｉｘ）Ｘ₁₁およびＸ₁₂が水素、アルキルおよび５員もしくは６員のアリール環
    部またはヘテロアリール環部からなる群から独立に選択される、−ＳＯ₂ＮＸ₁₁ Ｘ₁₂、 （ｘ）アルキル、ハロゲン、トリハロメチル、カルボキシレート、ニトロおよび
    エステル部からなる群から独立に選択される１個、２個または３個の置換基で置
    換されていてよい５員もしくは６員のアリール環部またはヘテロアリール環部、
    （ｘｉ）式：−ＣＯ−Ｈのアルデヒド、 （ｘｉｉ）Ｘ₁₃が飽和もしくは不飽和のアルキルおよび５員もしくは６員のアリ
    ール環部またはヘテロアリール環部からなる群から選択される、式：−ＳＯ₂− Ｘ₁₃のスルホン からなる群から独立に選択され、 （ｂ）Ｘ₁は窒素、硫黄および酸素からなる群から選択される］で示される構造 を有する５−アザキノキサリンをベースとする化合物。
28. 【請求項２８】 Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄およびＲ₆が、独立して （ｉ）水素、 （ｉｉ）アルキル、ハロゲン、トリハロメチル、ヒドロキシ、アルコキシ、カル
    ボキシレート、ニトロおよびエステル部からなる群から独立に選択される１個、
    ２個または３個の置換基で置換されていてよい５員もしくは６員のアルキル環部
    またはヘテロアルキル環部で置換されていてよい飽和もしくは不飽和のアルキル
    、 （ｉｉｉ）アルキル、ハロゲン、トリハロメチル、ヒドロキシ、アルコキシ、カ
    ルボキシレート、ニトロおよびエステル部からなる群から独立に選択される１個
    、２個または３個の置換基で置換されていてよい５員もしくは６員のアリール環
    部またはヘテロアリール環部 からなる群から選択される、請求項２７記載の化合物。
29. 【請求項２９】 Ｒ₃およびＲ₄が水素である、請求項２８記載の化合物。
30. 【請求項３０】 Ｒ₁およびＲ₂が、独立して （ｉ）アルキル、ハロゲン、ヒドロキシおよびアルコキシ部からなる群から選択
    される置換基で置換されていてよいフェニルで置換されていてよいメチル、 （ｉｉ）アルキル、ハロゲン、ヒドロキシおよびアルコキシ部からなる群から選
    択される置換基で置換されていてよいフェニル からなる群から選択される、請求項２９記載の化合物。
31. 【請求項３１】 Ｒ₁およびＲ₂が水素、メチル、フェニルおよび４−ヒドロ
    キシフェニルからなる群から独立に選択される、請求項２９記載の化合物。
32. 【請求項３２】 Ｘ₁が窒素または酸素である、請求項３０記載の化合物。
33. 【請求項３３】 Ｒ₆およびＸ₁の置換基とが一緒になって、明細書に記載さ
    れるようなＳＡＱＡＲ置換基からなる群から選択される部を形成する、請求項３
    ２記載の化合物。
34. 【請求項３４】 ５−アザキノキサリンをベースとする化合物を明細書に記
    載されるようなＳＡＱＡＲ化合物からなる基から選択する、請求項３３記載の方
    法。
35. 【請求項３５】 請求項２６から３３までのいずれか１項記載の５−アザキ
    ノキサリン化合物またはその塩、および生理学的に認容性の賦形剤もしくは希釈
    剤を含有する医薬品組成物。
36. 【請求項３６】 工程： （ａ）第１の反応物と第２の反応物とを溶剤中および塩基の存在下に反応させ、
    その際、第１の反応物は２−アミノ−６−クロロ−３−ニトロピリジンであり、
    第２の反応物はアルコールまたはアミンであり、これにより第１の中間物質を得
    、 （ｂ）第１の中間物質と第３の反応物とを触媒および還元剤の存在下に反応させ
    、その際、第３の反応物は１，２−ジオンであり、 （ｃ）請求項２７記載の化合物を精製する からなる、請求項２７記載の化合物の合成方法。
37. 【請求項３７】 第２の化合物を明細書に記載されるようなＳＡＱＡＲ反応
    物からなる群から選択する、請求項３６記載の方法。
38. 【請求項３８】 第３の反応物が４−ヒドロキシフェニルグリオキサール、
    １−フェニル−１，２−プロパンジオンおよびベンジルからなる群から選択され
    る、請求項３６記載の方法。
39. 【請求項３９】 還元剤が水素である、請求項３６記載の方法。
40. 【請求項４０】 触媒がラネーニッケルである、請求項３６記載の方法。