TWI245765B

TWI245765B - In vitro methods of modulating serine/threonine protein kinase function with 5-azaquinoxaline-based compounds

Info

Publication number: TWI245765B
Application number: TW087116559A
Authority: TW
Inventors: Gerald Mcmahon; Harald App; Bernhard Kutscher; Eckhard Gunther
Original assignee: Zentaris Ag
Priority date: 1997-10-06
Filing date: 1998-10-06
Publication date: 2005-12-21
Also published as: IL135103A; MXPA03011007A; ES2268791T3; WO1999017759A2; PT1028729E; AR013542A1; HK1031836A1; PL192039B1; CA2306257A1; CA2306257C; ZA988961B; NO20001748D0; SK4722000A3; US6727252B1; KR100633270B1; TR200000906T2; RU2223753C2; EP1028729A2; DE69835612T2; IL135103A0

Description

12切65 A7 -s…—— ____________________ B7 五、發明説明（1 ) ~ 曼i背景 (謂先閱讀背面之注意事項再瑣寫本頁) 以下I本發明背景説明是爲了幫助瞭本發明而提供，並非本發明之先前技藝。細胞的仏號傳遞是一種基本的機制，藉此外來用以調節各種不同細胞過程的刺激得以接轉到細胞内部。信號傳遞的项王要化學機制涉及了可逆的蛋白質磷酸化反應，藉由改笑蛋白質的結構與功能使成熟的蛋白質活性得以被調節。在眞核生物中被鑑識得最深入的蛋白質激酶會在蛋白質的絲胺酸、蘇胺酸和酪胺酸等胺基酸之醇基上進行磷酸化反應。這些激酹大致分爲兩組：一組是特於絲胺酸和蘇胺酸的磷酸化，另一組則是特定於酪胺酸的磷酸化。某些激酶被稱作”雙重特足性”的激酶，則能夠使酪胺酸和絲胺酸/蘇胺酸殘基都被磷酸化。蛋白質激酶亦可藉其在細胞中的位置予以特徵化。某些激酉學疋旎與細胞膜外邵之配體結合的穿透膜受體蛋白質。與配體結合會改變受體蛋白質激酶的催化活性。其他則是缺少一段穿透膜區位的非受體蛋白質。非受體蛋白質可以在各種細胞區域内被發現，從細胞膜的内層表面到細胞核都有。有許多激酶涉及調節級聯，其中的基質可能包括其他激酶，而這些激酶的活性是由它們的磷酸化狀態調節的。最後下游作用子的活性則由活化此一路徑所產生的磷酸化反應所i周節。絲胺酸/蘇胺酸激酶家族包括調節許多信號傳遞級聯之步本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨0X297公釐） 1245765 A7 B7 五、發明説明（2 ) (讀先閲讀背面之注意事項再镇寫本頁) 驟的成員。而這些級聯包括了控制細胞生長、遷移、分化、基因表現、肌肉收縮、葡萄糖代謝、細胞之蛋白質合成和調節細胞週期的級聯。 RAF就是會使蛋白質目標物上的絲胺酸和蘇胺酸殘基磷酸化之非受體蛋白質激酶的一個實例。RAF會調節其他蛋白質激酶的催化活性，比如會磷酸化且從而活化被有絲分裂原活化之蛋白質激酶（MAPK)的蛋白質激酶。RAF本身會受固定在膜上的蛋白質RAS激活，RAS則受配體活化之酪胺酸受體蛋白質激酶，如：上皮細胞生長因子受體（EGFR)和血小板衍生之生長因子受體（PDGFR)的激活。RAF在控制細胞中事件的生物重要性被低估，乃是由於發現RAF的形式改變會引起生物體内癌變。RAF在惡性病症上的重要性之證據由 Monia等人在1996年出版的（自然醫學）（Nature Medicine)第2 期：668頁中提出，而以其完整篇幅併入本説明書的參考文獻，包括所有的圖表。生物醫學的研究者在致力發現癌症和其他疾病的新穎治療法的過程當中，已經設計、合成和測試過能抑制蛋白質激酶功能的分子。某些少的有機分子會構成一類能調節蛋白質激酶功能的化合物，已被報告出來能抑制蛋白質激酶功能的分子實例有雙-一元環，二元環或雜環的芳基化合物 (PCT WO 92/20642)，乙烯氮吲哚衍生物（PCT WO 94/14808， 1-環丙基_4·吡啶基一氫醌酮（美國專利案第5,33〇,992號），苯乙烯基化合物（Levitzki等人，美國專利案第5,217,999號，和標題爲”能抑制EGF受體蛋白質酪胺酸激酶的苯乙烯基化 -5- ^^紙張尺度適州中國國家標準（CNS)A4規格（ 210X 297公釐） 1245765 A7 B7 五、發明説明（3 合物，Lyon & Lyon Docket案號208/050)，苯乙烯基取代之 12比淀基化合物（美國專利案號5，3 0 2，6 0 6 )’某些峻嗅琳衍生物 (歐洲申請案第0 566 266 A1號），石西吲嗓和磁化物（pcT WO 94/03427)，三環聚羥基酸化合物（PCT WO 92/21660),和；基膦酸化合物（PCT WO 91/15495)。能夠橫越細胞膜且能對抗酸水解的化合物是相當有利的治療劑，因爲它們在病人口服後能變得十分被生物體吸收。然而這些蛋白質激酶的抑制劑之中有許多只能微弱的抑制蛋白質激酶的功能。此外，有許多是會抑制各種蛋白質激酶，因而在做爲疾病治療劑會導致多重的副作用。 "im官在發展癌症治療之化合物上已有顯著的進步，對於那些能調節特定蛋白質激酶之化合物的結構和取代形式的鐘 S忍技術上仍有其需求。發明摘要本發明一部份係有關以5 -氮”奎喏淋爲主化合物調節絲胺酸/蘇胺酸蛋白質激酶功能的方法。本方法併入了一種能表現絲胺酸/蘇胺酸蛋白質激酶如RAF的細胞。此外，本發明還説明了如何利用本發明鑑認之化合物以預防及治療生物體中和絲胺酸/蘇胺酸蛋白質激酶有關之異常病症。並且，本發明係關包含由本發明之方所鑑定化合物的藥物組合物。 L- 邀胺酸/蘇胺酸蛋白質激酶之化^法本發明的方法供調節受體上和細胞質中絲胺酸/蘇胺酸蛋白貝激陶:功能的方法。這些方法提供了在體外和體内調節酵素的方法。對於體外應用而言，本發明方法部分相關= (誚先閱讀背面之注意事項再镇寫本頁}

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1245765 A7 -一一一‘一.…一 _ _ ^37五、發明説明（4 ) 為節絲胺版/蘇胺酸蛋白質激酶之化合物的鑑認方法。因此，首先本發明特別提出一種用氮苯咪唑爲主化合物調節絲胺酸/蘇胺酸蛋白質激酶功能之方法。該氮苯咪峻化合物可視需要用有機的基團取代。本方法包括使表現絲胺酸/ 蘇胺酸蛋白質激酶的細胞與該化合物接觸。 ••功能”一詞係指絲胺酸/蘇胺酸蛋白質激酶在細胞中的角色。絲胺酸/蘇胺酸蛋白質激酶家族包括調控許多信號傳遞級聯步驟的成員，這些級聯包括控制細胞生長、遷移、分化、基因素現、肌肉收縮、葡萄糖代謝，細胞蛋白之合成’以及調節細胞週期的級聯。 /，催化活性”一詞在本發明之上下文中，定義爲蛋白質激酶使其基質磷酸化的速率，催化活性可被測量，例如藉由測足基質轉變成產物的量相對於時間的函數。基質的磷酸化反應發生在蛋白質激酶的活性位置。而此活性位置一般而T是基質與蛋白質激酶結合且被磷酸化的一個小洞。基貝一凋用於本説明書係指一種能被絲胺酸/蘇胺酸蛋白質激酶磷酸化的分子。該基質較好是一段肽，而蛋白質更佳。以蛋白質激酶RAF而言，較佳的基質是ΜΕκ和mek 的基質ΜΑΡΚ。激活”一詞是指增進蛋白質激酶的細胞功能。蛋白質激酶功能較好是與天然的結合對象作用，而最好是催化的活性。 ”調節” 一詞是指藉由增進或減低蛋白質激酶與天然結合對象構成複合物的機會改變蛋白質激酶的功能。一種調節本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

1245765 五、發明説明（5 劑較好是能增進此種蛋白質激酶 :物的機率^更好是能依化合物暴：：：二二構成複濃度而定，增進或、貝教酶中的 $人t 咸低蛋白質激酶及其天钬牡人斛多# 4 =物的機率；最好是降低蛋白質激酶和二：：= =合物的機率。一種調節劑較好白更好是能視化合物暴露在蛋白質激酶； …敦活或抑制蛋白質激酶的催化活性，或最：是:= 蛋白質激酶的催化活性。把抑制 ”複合物詞係指至少兩種分子相互結合的結合物。作唬傳遞 < 複合物經常包含至少兩種相互結合的$白質分子。例如，资白質赂胺酸受體蛋白質激酶、咖2，s〇s， RAF和RAS會結合在—起形成_種信號傳遞複合物有絲分裂原配體。 ’’天然的結合對象”係指在細胞中與蛋白質激酶結合的肽。天然結合對象可在蛋白質激酶信號傳遞過程中扮演擴大仏號的角色。蛋白質和天然結合對象之間的交互作用改變會顯示出來，而呈現交互作用形成機率增加或降低的情形’或是蛋白質激酶/天然結合象之複合物濃度的增減。蛋白質激酶的天然結合的對象會與蛋白質激酶上位於細胞内的區位以高度親合力結合。高親合力表示結合的平衡係數在1〇_ό Μ或少於此之範圍。此外，天然的結合對象也會暫時地與蛋白質激酶的細胞内區位作用，而將激酶予以化學修飾。蛋白質激酶的天然結合對象係選自包含（但不限於）SRC類似物2(SH2)或3(SH3)的區段，其他磷酸化的酪胺 8- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐）請閱讀背 © 5 意項舊填寫本頁裝訂 1245765 A7 B7 五、發明説明（6 酸結合（PTB)區段，鳥嘌呤核替酸交換因子、蛋白質磷酸酶和其他蛋白質激酶的組群。測定蛋白質激酶及其天然結合對象之間作用變化的方法在本技藝中已有現成可用的。 "絲胺酸/蘇胺酸蛋白質激酶” 一詞係指一段至少有1〇%胺基酸和其他能使蛋白質上的絲胺酸和蘇胺酸殘基磷酸化的醇素完全相同的胺基酸序列。.絲胺酸/蘇胺酸蛋白質激酶會催化使嶙酸根加到蛋白質之絲胺酸和蘇胺酸殘基上的反應。絲胺酸/蘇胺酸蛋白質激酶可以膜結合的蛋白質或細胞質中的蛋白質形式存在。 ·*接觸"一詞在本説明書中係指將含有本發明之氮喹喏林化合物的溶液和培養本方法之細胞的液體培養基混合。含有該化合物之溶液亦可包含其他成份，如二甲亞砜 (DMSO)，其可協助5 -氮p奎喏琳化合物吸收進本方法的細胞之中。含有5 -氮喹喏啉化合物的溶液可利用遞送裝置添加到培養細胞的培養基之中，比如用以滴管爲主的裝置或以針筒爲主的裝置。 ”5-氮喹喏啉爲主的化合物” 一詞係指以化學取代基取代之5-氮喹喏啉有機化合物。5_氮喹喏啉化合物的一般結構如下：誚先閱讀背 ιδ 意事項4 再，填寫本頁裝訂

/經取代的，，一詞按本發明係指以任何數目的化學取代基衍生而得的5 _氮喹喏啉化合物。 -9- 本紙張尺度適用中國( -- 1245765 A7 B7 五、發明説明（7 ) 具體而言，本發明係關調節絲胺酸/蘇胺酸蛋白質激酶功能之方法，其中的蛋白質激酶是RAF。 (讀先閱讀背面之注意事項再瑣寫本頁) RAF蛋白質激酶使蛋白質磷酸化的目標物是蛋白質上的絲胺酸或蘇胺酸殘基。有一種這樣的蛋白質目標物是蛋白質激酶（MEK)，其磷酸化且最終激活有絲分裂原活化之蛋白質激酶（MAPK)。RAF本身是由膜結合之鳥嘌呤核甞三磷酸水解酶RAS應有絲分裂原刺激之受體蛋白質酪胺酸激酶之反應而被激活，該酪胺酸激酶如上皮細胞生長因子受體（EGFR) 血小板衍生之生長因子受體（PDGFR)。本發明的方法能測到細胞中調節RAF蛋白質激酶功能之化合物。RAF先磷酸化一種蛋白質激酶（MEK)，MEK再磷酸化有絲分裂原激活之蛋白質激酶（MPAK)。只用RAF偵測MEK 之磷酸化的檢驗並不靈敏，因爲MEK的磷酸化程度並不顯著。爲了要克服這項靈敏度的兩難問題，本發明的檢驗方法是繼續將MEK和MAPK二者予以磷酸化。MAPK磷酸化的信號會放大MEK磷酸化的信號，而使依賴RAF的磷酸化反應得以在檢檢中繼續進行，比如酵素連結的免疫吸附檢驗。此外，本發明的檢驗以一種高速通過放置（high throughput) 的形式進行，這樣能使許多化合物在短時間裡被迅速偵測到。另一方面，本發明説明一種鑑認能調節絲胺酸/蘇胺酸蛋白質激酶功能的化合物之方法，其包括讓表現絲胺酸/蘇胺酸蛋白質激酶的細胞與化合物接觸，並偵測細胞效應的步驟0 -10- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1245765 A7 B7 五、發明説明（β) — ^ 七、词係彳曰觀察化合物添加到本方法之細胞的效應。孩效應可由細胞表現型之改變，細胞增殖、蛋白質激 s母的催化活性，或是在蛋白質激酶與一種天然結合對象之間的交互作用表現出來。 ”效應” 一詞是説明在細胞的表現型或細胞增殖上的變化或沒有變化。”效應”亦可説明蛋白質激酶之催化活性的改變或不改變。"效應”亦可説明蛋白質激酶和天然結合對象之間交互作用的變與不變。本發明之較佳具體實例係關調節絲胺酸/蘇胺酸蛋白質激酶功能之化合物的鑑認方法，其中的效應是細胞表現型之變或不變。 ’·細胞表現型” 一詞係指細胞或組織的外表或細胞或組織的功能。細胞表現型的實例有細胞的大小（縮小或放大），細胞的增殖（增加或減少細胞的數目），細胞的分化（細胞形狀的變與不變），細胞的生存（細胞死亡），或是代謝營養劑的利用情形（例如：葡萄糖的吸收）。細胞表現型的變與不變可以很容易地經由本技藝中已知的技術加以測量。就另一較佳之具體實例而言，本發明係關調節絲胺酸/蘇胺fe蛋白負激酶功能之化合物的鑑認方法，其中的效應是細胞增殖上的變或不變。 •’細胞增殖”一詞係指一群細胞的分裂速率。在容器中生長的細胞數目可由熟習本技藝者加以定量，其中定量的人利用一般光學顯微鏡目測計算一定體積中的細胞數目。或者’細胞增殖速率可由實驗室裝置以光學的或電導的方式 -11 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝·

、1T !245765 A7 B7 、發明説明（9 估算適當培養基中的細胞密度而予定量。就另一項較佳的具體實例而言，本發明係關能調節絲胺酸 /蘇胺酸蛋白質激酶功能之化合物的鑑認方法，其中該效應是絲胺酸/蘇胺酸蛋白質激酶與一種天然結合對象之間交互作用的變或不變。 π交互作用”一詞在本發明的上下文中係説明蛋白質激酶的細胞内區域和一種天然結合對象或化合物之間所形成之複合物。”交互作用"一詞亦可延伸其義爲本發明之化合物與待研究之蛋白質激酶之細胞内區域或細胞外區域形成之複合物。雖然細胞質的蛋白質激酶不具有細胞外區域，但是受體蛋白質激酶卻懷藏有胞外和胞内的區域。 ••細胞内區域” 一詞在此係指存在於細胞内部之蛋白質激酶的部份。本説明書用”細胞外區域” 一詞則是指蛋白質激酶上存在於細胞外的部份。具體而言，本發明係關調節絲胺酸/蘇胺酸蛋白質激酶功能的化合物鑑認方法，其尚包括下列步驟：（a)使細胞溶解產生含有絲胺酸/蘇胺酸蛋白質激酶的溶解物；（b)將絲胺酸 /·綦禾胺蛋白質激酶吸附到一種抗體上；（c)使吸附之絲胺酸厂蘇胺酸蛋白質激酶與受質共同培養；（d)使受質吸附到固體擔體或抗體上去。偵測細胞效應的步驟包括：測量受質的磷酸根濃度。 ”溶解” 一詞在本説明書中係指破壞細胞之完整性而使其内容物釋出的方法。細胞溶解是由許多熟習本技藝者已知的技術所完成的。此方法較好是藉由超音波振動或細胞剪 -12- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (讀先閲讀背面之注意事項再填寫本頁}

1245765 A7 B7 五、發明説明（1〇力技術完成9而較好是藉由清潔劑的技術完成。閱讀背面 * 事項再填寫本頁 ”抗體” 一詞在本説明書中係指一種特定蛋白質激酶結合的蛋白質分子。一種抗體較好是與一類蛋白質激酶結合，而更好是特定地與RAF蛋白質激酶結合。 ’’特定地結合”在本説明書中係指一種抗體，其與一種蛋白質激酶結合之親和力要高過其他蛋白質激酶或細胞的蛋白質。特定與一種蛋白質激酶結合的抗體會與較高濃度的特定蛋白質激酶結合，此濃度高過其他蛋白質激酶或細胞蛋白質的結合濃度。 ”吸附” 一詞在本説明書中是指將一種分子結合到抗體或固體擔體的表面。固體擔體的實例有經化學修飾過的纖維素，如磷酸纖維素和尼龍。抗體可利用具普通技藝者已知的技術連接到固體擔體上。可參考例如：Harlo和Lane，在 (抗體-實驗室手册），1989年，冷泉港實驗室出版。 ”測量磷酸根濃度”在本説明書中是指具一般技藝者普遍知道的技術。這些技術可能涉及定量受質中的磷酸根濃度或測定受質中磷酸根的相對含量。這些技術包括將受質吸附到膜上，然後用放射測量法偵測受質中的嶙酸根含量。就另一項較佳的具體實例而言，本發明係關能調節絲胺酸 /蘇胺酸蛋白質激酶之化合物功能的方法，其尚包括以下步驟：（a)使細胞溶解產生含有RAF的溶解物；（b)將RAF吸附到抗體上；（c)將已吸附的RAF與MEK和MAPK共同培養；（d) 將MEK和MAPK吸附到固體擔體或一種以上（包括一種）的抗體上。測量細胞效應的步驟包括偵測該MEK和MAPK的磷酸 -13- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1245765 部中 •央 i?. 率

A7 B7 五、發明説明（11 根濃度。具而α本發明係關能調節絲胺酸/蘇胺酸蛋白質激酶力此之化θ物的方法，丨中5氮♦心林爲主的化合物具有先前本説明書中定義之式】的結構，或任何先前在本説明書中陳述過的從屬基團。，，化合物"一詞係指化合物或其藥物學上可接受的鹽、酉旨類，醯胺類、先驅藥物、異構物或代謝物。 "藥物學上可接受的鹽"-詞是指-種不會廢止該化合物之生物活性和性質之化合物的調配物。藥物用的鹽類可由 f發明的化合物與無機或有機酸反應製得，後者如：鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、甲磺酸、乙磺酸、對-甲基苯橫酸、水楊酸等等。 π先驅藥物”是指一種會在體内轉變成原型藥物的製劑。在某些情況下，先驅藥物可能要比原型藥物容易施用。例如，先驅藥物也許藉口服而具生物可利用性，但原型藥物則不能，或是先驅藥物能促進溶解度而使靜脈内注射可行。就另一項較佳的具體實例而言，本發明係關能調節絲胺酸 /蘇胺酸蛋白質激酶功能之化合物的鑑認方法，其中$ _氮喹嗔淋爲主的化合物具有先前的結構，其中5_氮峻嗓I化合物係選自包含S AQ AR化合物的組群： ·’ S AQ AR化合物’’係指一群以5 -氮峻喏琳爲主的化合物，其具有式I所陳示的結構，且編號A1至A90於下表中： (謂先閱讀背面之注意事項再填寫本頁}

5 m 五 A7 、〜 B7 •一 — " " _ 1_ ' 發明説明（12) '^^_ 物編號 r2 Ri R6Xi H 4 -經基苯基苯基胺基 _ H 4-羥基苯基宇基胺基 A^3 — __ 甲基苯基甲氧基 A-4 苯基苯基甲氧基 A-5_ 甲基苯基 4 -氟爷基胺基 Αχ 苯基苯基 4 -氟爷基胺基 A-7_ Η 苯基苯基胺基 A^8 Η 4-羥基苯基 2-羥基苄基胺基 A-9 ~~·—·— Η 4 -經基苯基 3-羥基芊基胺基 A-j^O Η 4 -經基苯基 4-羥基芊基胺基 A^U Η 4 -經基苯基 2-硝基芊基胺基 A^12 Η 4-羥基苯基 3 -硝基爷基胺基 Α·13 —>— Η 4 -經基苯基 4 -硝基爷基胺基 A-14 ----^ Η 4 -羥基苯基 2 -甲基爷基胺基 A_15 — Η 4 ·羥基苯基 3-甲基苄基胺基 A^le Η 4-羥基苯基 4-甲基苄基胺基 A_17 ----- Η 4 -羥基苯基 2-氣苄基胺基 A-18 ----- Η 4-羥基苯基 3-氯芊基胺基 A_19 ----- Η 4 -超基苯基 4-氣苄基胺基 ^20 Η 4 -超基苯基 2 -氟亨基胺基 A-21 Η 4 - #至基苯基 3 -氟*爷基胺基 A-22 Η 4-羥基苯基 4 -氟罕基胺基 A-23 Η 4 -超基苯基 2-(三氟甲基）苄基胺基 A-24 Η 4-羥基苯基 3_(三氟甲基）苄基胺基 A-25 Η 4 -藉基苯基 4-(三氟甲基）苄基胺基 A-26 Η 4-羥基苯基苯乙基_1_胺基 A-27 Η 4-羥基苯基 2-羧基苯基胺基 (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁 -15- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1245765 A7 B7 五、發明説明（13) 化合物編號 Ri RaXi A-28 Η 4 -經基苯基 3 -羧基苯基胺基 A-29 Η 4-羥基苯基 4-羧基苯基胺基 A-30 Η 4 _經基苯基 2-硝基苯基胺基 A-31 Η 4 -經基苯基 3-硝基苯基胺基 A-32 Η 4-羥基苯基 4 -硝基苯基胺基 A-33 Η 4-羥基苯基 2 -甲基苯基胺基 A-34 Η 4 -幾基苯基 3-甲基苯基胺基 A-35 Η 4 -經基苯基 4 -甲基苯基胺基 A-36 Η 4_羥基苯基 2 -氯苯基胺基 A-37 Η 4 -經基苯基 3-氯苯基胺基 A-38 Η 4-羥基苯基 4-氯苯基胺基 A-39 Η 4 -羥基苯基 2-氟苯基胺基 A-40 Η 4 -經基苯基 3 -氣苯基胺基 A-41 Η 4 -經基苯基 4 -鼠苯基胺基 A-42 Η 4 -羥基苯基 2-(三氟甲基）苯基胺基 A-43 Η 4 -經基苯基 3-(三氟甲基）苯基胺基 Α·44 Η 4 _羥基苯基 4-(二氣甲基）苯基胺基 Α-45 Η 4 -幾基苯基 p比淀-2 -胺基 Α-46 Η 4 - #至基苯基 p比淀-3 -胺基 Α-47 Η 4 -羥基苯基外匕淀-4-胺基 Α-48 Η 4 -羥基苯基外匕淀-2-甲胺基 Α-49 Η 苯基 2-羧基芊基胺基 Α-50 Η 苯基 3-羧基苄基胺基 Α-51 Η 苯基 4-羧基苄基胺基 Α-52 Η 苯基 2 -硝基卞基胺基 Α-53 Η 苯基 3 -硝基爷基胺基 Α-54 Η 苯基 4 硝基卞基胺基 (讀先閱讀背面之注意事項再瑣寫本頁) -16· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 1245765 A7 B7 五、發明説明（14) 化合物編號 R2 Ri R6Xi A-55 Η 苯基 2-甲基苄基胺基 A-56 Η 苯基 3-甲基芊基胺基 A-57 Η 苯基 4·甲基苄基胺基 A-58 Η 苯基 2 -氯爷基胺基 A-59 Η 苯基 3 -氯爷基胺基 A-60 Η 苯基 4 -氯爷基胺基 A-61 Η 苯基 2-氟芊基胺基 A-62 Η 苯基 3 -氣爷基胺基 A-63 Η 苯基 4-氟芊基胺基 A-64 Η 苯基 2_(三氟甲基）苄基胺基 A-65 Η 苯基 3-(二氣甲基）卞基胺基 A-66 Η 苯基 4-（三氟甲基）苄基胺基 A-67 Η 苯基苯乙基-1-胺基 A-68 Η 苯基 2-羧基苯基胺基 A-69 Η 苯基 3-羧基苯基胺基 A-70 Η 苯基 4-羧基苯基胺基 A-71 Η 苯基 2 -硝基苯基胺基 A-72 Η 苯基 3 -硝基苯基胺基 A - 73 Η 苯基 4 -硝基苯基胺基 A-74 Η 苯基 2_甲基苯基胺基 A-75 Η 苯基 3 -甲基苯基胺基 A-76 Η 苯基 4甲基苯基胺基 A-77 Η 苯基 2 -氯苯基胺基 A-78 Η 苯基 3 -氯苯基胺基 A-79 Η 苯基 4-氯苯基胺基 A-80 Η 苯基 2 -氣苯基胺基 A-81 Η 苯基 3-氟苯基胺基 (讀先閱讀背面之注意事項再瑣寫本頁) -17- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1245765 B7 五、發明説明（15) 化合物編號 Ri R6Xi A-82 Η 苯基 4-氟苯基胺基 A-83 ----------------- Η_ 苯基 2-(三氟甲基）苯基胺基 A-84 Η 苯基 3-(三氟甲基）苯基胺基 A-85 Η 苯基 4_(三氟甲基）苯基胺基 A-86 Η 苯基 p比淀-2 -胺基 A-87 Η 苯基吡啶-3-胺基 A-88 Η_ 苯基叶匕淀-4-胺基 A-89 — Η ----- 苯基吡啶-2-甲胺基 A-90 Η 4-甲氧基苯基苯基胺基 ^預厘i渔的方法另一方面’本發明提出一種預防或治療生物體内異常病症的方法。藏方法包括以下步驟：（a)將本發明之化合物施用於生物體’該化合物如式j特定指出者，其具有任何本説明書所提出的限制；（b)促進或破壞不正常的交互作用。生物m 巧係關任何包含至少一個細胞的活體。一個生物體可以簡單到一個眞核細胞或複雜到一個哺乳動物。就較佳的具體實例而言，一個生物體是指人類或哺乳動物。 ’’預防” 一詞係指本發明用以降低或減除一個生物體染患或發展出異常病症之機率的方法。好浐部中呔i?準而，m消贽合竹i卬-象 (謂先閱讀背面之注意事項再镇寫本頁) 丁 ’’治療’’ 一詞係指本發明具有治療效果並且至少部份減輕或廢除生物體内異常病症的方法。二 ❶療效果一碉係指抑制會引起或造成異常病症（例如： =症）、〈、、，田胞生長。”治療效果，，一詞亦指抑制引起或造成異吊病症（生長因子。治療效果使-種或更多異常病症之症 -18- 1245765 A7 一一 ____ B7 五、發明説明（16) ^ f謂先閱讀背面之注意事項再镇寫本頁} 狀減輕到某種程度。關於癌症的治療方面，治療效果係指下列一項或更多項：（a)使腫瘤減少；抑制（亦即減緩或遏止）腫瘤的轉移；（c)抑制腫瘤生長；和（d)減輕與異常病症有關的一項或更多項症狀至某種程度。用本發明説明的方法可以鑑認顯示具有對抗血癌效果之化合物，不過該化合物可能是減緩或減少細胞增殖或細胞生長，而不是抑制細胞轉移。 ··異常病症”一詞是指一種由生物體的正常功能所衍生之該生物體細胞或組織的功能。一種異常病症可能是關於細胞的增殖、細胞的分化，或細胞的存活。失常的細胞增殖狀況包括癌症如纖維的和腎小球的疾病、不正常的血管形成、傷口癒合、牛皮癬、糖尿病和炎症。失系的分化狀況包括但不限於神經退化疾病、緩慢的傷口癒合速率和組織移植技術。失系的細胞存活狀況係關計畫性的細胞死亡途徑被活化或遏止的情形。有些蛋白質激酶就和計畫性的細胞死亡途徑有關。任一種蛋白質激酶功能的失控會導制細胞永久不死或未成熟的細胞死亡。細胞增殖、分化和存活是可由本技藝之方法簡單量測到的現象。這些方法涉及觀察顯微鏡下的細胞數目或細胞外形相對於時間（例如：多少天）的關係。 ’’施加” 一詞係廣泛地關於提供給生物體，或更特定而言是關於將一種化合物併入生物體細胞或組織的方法。當生物體細胞或組織存在於生物體内或體外時，不正常的狀態 - - - I - I - · -19- 本纸張尺度適/种國國家標準（CNS ) A4規格（21()χ297公幻 1245765 ΑΊ Β7 五、發明説明（18 ) 癌、乳癌、腦癌、軸内腦癌、結腸癌、攝護腺癌、肉瘤、卡普希氏（Kaposi)肉瘤、黑色素畸瘤和神經膠質瘤。遂有另一項較佳的具體實例中，本發明係關預防或治療一種生物體内異常病症的方法，其中該方法被應用在一種與信號傳遞途徑失常有關的異常病症下，該途徑的特性在於絲胺酸/蘇胺酸蛋白質激酶和天然結合對象之間的交互作用。，，信號傳遞途徑，，一詞係指信號的傳播。一般而言，細胞外的信號會透過細胞膜傳送而成爲細胞内的信號。然後這個信號能刺激細胞的反應。此一名詞亦涵蓋了細胞内全部的傳播信號。涉及信號傳遞過程的多肽分子典型上是受體和非受體蛋白質激酶，受體和非受體蛋白質磷酸酶，核甞酸交換因子和轉錄因子。 *與信號傳遞過程有關的”失常”一詞係指生物體内的蛋白質激酶過度表現或表現不足，其經過突變而使催化活性低万、或回於S7生型的蛋白質激酶活性，其經突變使得該酶不再與天然結合對象交互作用，不再被其他蛋白質嶙酸酶修飾，或是不再與天然的結合對象交互作用戈蛋 ”促進或斷絕不正常作用，，一詞是指一種可藉由施加本發明化合物到-種生物體的細胞或組織來達成的方法。該化合物能藉由在複合物介面和許多原子形成有利的交互作用而促進蛋白質激酶和天然結合對象之間的交互作用。或者’该化合物能藉由調解複合物介面原子間形成的有利交互作用來抑制蛋白質激酶和天然結合對象之間的交互作 (讀先閱讀背面之注意事項再镇寫本頁 •裝· 、-口

I I II • I- I I-- 1- - I - -21 - 本紙張以朝中國;97公餐 1245765 A7 _______ B7 ··»·.·吟.一〜.. 一一 «·«»·. 一一，·.· 一. 一. ·· ...” Mil, 五、發明説明（20) — 及五員或六員芳基或雜芳基環部份，纟中該環視需要由一個或多個選自：烷基、鹵素、三鹵甲基、羧酸根、硝基和酉旨的取代基取代，且其中η是〇或1 ; (viU) —種式-NHCOXl〇的醯胺，其中Χι〇係選自：烷基、羥基和五員或六員芳基或雜芳基環部分，其中該環視需要由一種或多個獨立選自：烷基、_素、三卣甲基、羧酸根、硝基或酯的取代基取代； (ix) -S02NXnX12，其中Χι#Χΐ2選自：氫、烷基和五員或六員芳基或雜芳基環部分； (X) 一種五貝或穴貝芳基或雜芳基環部份，視需要由一個兩個或三個獨立選自：烷基、鹵素、三鹵甲基、羧酸根、硝基和酯部份之取代基取代； (xi) 一種式_CO-H的醛；和 (xii) —種式-SC^-Xu的颯，其中χ13選自包括飽和或不飽和烧基和五員或六員芳基或雜芳基部份； (b)Xi係選自包括氮、硫和氧。 ”飽和烷基”一詞係指一個不含任何烯基或炔基部份的烷基部份。該烷基部份可以是分枝或不分枝的。 ”未飽和燒基” 一詞係指一個含至少一個晞基或块基部份的烷基部份。該烷基部份可以是分枝或不分枝的。 ”胺’’ 一詞係指一種式NIR2的化學部份，其中RjpR2係獨立選自以下基團，包括氫、飽和或不飽和烷基，和五員或六員芳基或雜芳基環部份，其中該環視需要經一個或更多取基取代，而這些取代基獨立地選自包括烷基、卣素、三 -23- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210X297公釐） (^先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· 1245765 A7 B7 部中 A il 率消合竹印五、發明説明（21 ) 鹵甲烷、羧酸根、硝基和酯的部份。 ”芳基，，-詞係指-個芳香基團，其具有至少一個有並輛冗電子系統的環，且包括碳環芳基（例如：苯基）和雜環另基（例如：吡淀）。·，碳環"一詞係指包含一個或更多共價深合〈環結構的化合物，且形成該環之骨架的原子全部是瑞原子。此一名詞使碳環與雜環得以區分，後者的環骨架包含至少一個不同於碳的分子。"雜芳基”一詞是指包含至少一個雜環的芳基。 θ 素” 一詞是指一個選自包括氟、氣、溴、碘之組群的原子。 ••酮”一詞係指具有式-(R)n-CO-R，的化學部份，其中尺和R 係選自包括飽和或不飽和烷基和五員或六員芳基或雜芳羞部份的基團，且其中η是。 ••羧酸’’ 一詞係指具有式-(RkCOOH的化學部份，其中R你選自包括飽和或不飽和烷基和五員或六員芳基或雜芳基部份’且η是〇或1。 ”醋”一詞係指具有式-(ιιχοοίΐ，的化學部份，其中R和 R·係獨立選自包括飽和和不飽和烷基和五員或六員芳基或雜方基部份，且η是0或1。 ”醇” 一詞係指式-ROH的化學取代基，其中R係選自包括氫、飽和或不飽和烷基，和五員或六員芳基或雜芳基環部份的基團，其中該環視需要經一個或更多獨立選自包括烷基、_素、三由甲基、羧酸根、硝基和酯部份的取代基所取代。 •24- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210X297公釐）

(謂先閱讀背面之注意事項再填寫本百C 1245765 A7 _ — 一▲^ 五、發明説明（22 ) •’醯胺” 一詞係指具有式-NHCOR的化學取代基，其中r係選自包括氫、烷基、羥基環部份的基團，而其中該環又視需要經一個或更多獨立選自包括烷基、卣素、三_甲基、羧酸根、硝基或酯的基團之取代基所取代。 ••烷氧基部份”係指具有式-OR的化學取代基，其中R是氫或是飽和或不飽和的燒基部份。 ”酸”一詞係指具有式-(R)n-CHO的化學部份，其中r選自包括飽和或不飽和的烷基和五員或六員芳基或雜芳基部份之基團，且η是〇或1。 ”观”係指具有式-S〇2_R的化學部份，其中R係選自包括飽和或不飽和烷基和五員或六員芳基或雜芳基部份的基團。就另一項較佳的具體實例而言，本發明係關具有式I所示結構之5 ·氮喹喏啉爲主的化合物，其中R3和R4獨立選自包括氫和飽和或不飽和烷基的基團。就另一項較佳的具體實例而言，本發明係關具有式j所示結構之5 -氮喹喏啉爲主的化合物，其中r3*R4爲氫。在其他較佳的具體實例中，本發明係關具有式示結構之5-氮喹喏啉爲主的化合物，其中1和化係自包括氫、飽和或不飽和烷基、五員或六員芳基或雜芳基環部份的基團，而其中該環又視需要經一個、二個或三個獨立選自包括烷基卣素、二卣甲烷、羥基、烷氧基、羧酸根、硝基、和酯部份的取代基所取代。就其他尚有之較佳具體實例而言，本發明係關具有式工所示結構之5-氮喹喏啉爲主的化合物，其中&是視需要經一 (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) •裝. 訂 -25-

1245765 A7 ~ ------- --------------------” _ B 7 五、發明説明（23) ~一個、兩個或三個獨立撰自& 、龟自匕括丈元基、_素、藉基和燒氧基剖份之基團的取代基所取代的苯基。在另:項較佳的具體實例中，I發㈣關具有式j所示結構之5 -氮4喏淋爲主的化合物，其中&是苯基。在另=項較佳的具體實例中，本發明係關具有式〗所示結構之5 -氮4喏琳爲主的化合物，其中1是4_經基苯基。在其他較佳的具體實例中，本發明係關具有式j所示結構 I 5-氮喹喏啉爲王的化合物，其中&係選自包括氫、飽和或不飽和k基’以及視需要經一個、兩個或三個取代基取代之苯基的基團所取代，而其中該取代基係獨立選自包烷基、_素、經基和貌氧部份之基團。就另一項較佳的具體實例而言，本發明係關具有式I所示結構之5 -氮喹喏琳爲主的化合物，其中R2是氫。還有一項較佳的具體實例而言，本發明係關具有式I所示結構之5 -氮4喏琳爲主的化合物，其中1是甲基。還有一項較佳的具體實例而言，本發明係關具有式Ϊ所示結構之5 -氮p奎喏淋爲主的化合物，其中以2是苯基。就另一項較佳的具體實例而言，本發明係關具有式I所示結構之5-氮喹喏啉爲主的化合物，其中Χι是氮或氧。還有一項較佳的具體實例而言，本發明係關具有式I所示結構之5-氮喹喏啉爲主的化合物，其中Χι是氧。還有一項較佳的具體實例而言，本發明係關具有式I所示結構之5 -氮喹喏啉爲主的化合物，其中Xi是氮。在其他較佳的具體實例中，本發明係關具有式I所示結構 -26- 本紙張尺度適家標準（CNS ΓΧ4規格（210^297公釐） (誚先閲讀背面之注意事項再镇寫本頁) 裝· -5 -泉 1245765 部中 ik il 準乂 0 ]| ：τ 消 f: it 印 A7 B7 五、發明説明（24 之5-氮喹f啉爲主的化合物，其中&係選自包括：氫；視需要經五員或7T員芳基或雜芳基環部份取代的飽和或不飽和烷基，該環部份視需要經一個、兩個或三個獨立選自包括烷基、函素、二画甲基、羥基、烷氧基、羧酸根、硝基和酯部份之基團所取代；視需要經一個、兩個或三個獨立選自包括烷基、_素、三卣甲基、烷氧基、羧酸根、硝基和酯邵份之基團所取代的五員或六員芳基或雜芳基環部份。尚有其他較佳的具體實例中，本發明係關具有式j示結構之5 -氮喹嗔琳爲主的化合物，其中化6和Χι部份共同形成一個選自包含SAQAR取代基的組群之化合物。 "SAQAR取代基” 一到係指一群取代基，其中包括：甲氧基、苯甲胺基、4 -氟苯甲胺基、2-羧基苯甲胺基、3-羧基苯甲胺基、4-羧基苯甲胺基、2-硝基苯甲胺基、3_硝基苯甲胺基、4 -硝基苯甲胺基、2 -甲基苯甲胺基、3 -甲基苯甲胺基、4 -甲基苯甲胺基、2-氯苯甲胺基、3-氣苯甲胺基、 4-氯苯甲胺基、2·氟苯甲胺基、3-氟苯甲胺基、4·氟苯甲胺基、2-(三氟甲基）苯甲胺基、3-(三氟甲基）苯甲胺基、 4-(三氟甲基）苯甲胺基、苯乙基-1-胺基、苯胺基、2-羧基苯胺基、3 -羧基苯胺基、4-羧基苯胺基、2 -硝基苯胺基、 3 -硝基苯胺基、4 -硝基苯胺基、2 -甲基苯胺基、3_甲基苯胺基、4 -甲基苯胺基、2-氯苯胺基、3-氯苯胺基、4-氯苯胺基、2 -氟苯胺基、3·氟苯胺基、4 -氟苯胺基、2_(三氟甲基）苯胺基、3·(三氟甲基）苯胺基、4-(三氟甲基）苯胺基、 27 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (誚先閱讀背面之注意事項再瑣寫本頁)

1245765 A7 B7 五、發明説明（25) ?比淀·2·胺基、口比淀脖其、4 η;甘胺基吨哫版基、和ρ比啶_2_甲胺基0 苯甲胺基''係指一個具有下式所示結構的基團 /\ Η2 Β

其中的芳基環可視需要2，3或4的位置進行取代。 ••苯胺基”一詞係指一個具有下式所示結構的基團 νι Η

(讀先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) .裝· 其中的芳基環可視需要在2，3，或4的位置進行取代。 ••苯乙基-1-胺基”係指一個具有下式所示結構的機團：

p比淀-2-胺基”一詞係指一個在2的位置上經NH基取代的被淀環。同樣地，”吡啶_3_胺基”和”吡啶_4_胺基”係指分別在3和4的位置上經NH基取代的吡啶環。就尚有的另一項具體實例而言，本發明係關一種具式I所示結構之以5 -氮4喏琳爲主的化合物，其中該5 -氮p奎喏淋爲主的化合物係選自包括SAQAR化合物之組群。本發明的合成方法另一方面，本發明特別提出一種藥物組合物，其包含具有 -28- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1245765 Α7 B7 五、發明説明（26 本説明書定義之式〗結構所示的化合物 — 物學上可接受的载劑或稀釋劑。 ’以及-種樂 (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 物就：：=具體實例而言，本發明係關-種藥物組合物’其中5 -氮喹喏啉爲主的化合物物之組群。。物係選自包括SAQAR化合二藥物組合物"―詞係指本發明的一種5_氮喹嗔啉化合物興,、他化學成份，如稀釋劑或載劑的混合。該藥物組合物有助於將化合物施加到生物體身上。在本技藝中存在了許多施用藥物的技術，其包括但不限於口服注射、噴霧劑、非.經腸的和局部的施用方式。藥物組合物亦可由化合物與操機酏如鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、甲磺酸、乙磺酸、對-甲基苯磺酸、水楊酸等等反應而獲得。生理學上可接受的” 一詞定義作一種不會破壞化合物之生物活性和性質的載劑或稀釋劑。 ’’載劑” 一詞定義爲一種能協助化合物併入細胞或組織内部的化合物。例如二甲亞颯（DMSO)就經常被用作載劑，因爲它能協助許多有機化合物吸收進入生物體的細胞或組織中〇 ”稀釋劑” 一詞定義爲能稀釋在水中的化合物，其可溶解有興趣的化合物，並且能穩定該化合物的生物活性形式。溶在緩衝液裡的鹽即在本技藝中被用作是稀釋劑。有一種常用的緩衝液是經磷酸緩衝的鹽液，因爲它模仿人體血液中的鹽條件。因爲緩衝溶液的鹽在低濃度時能控制溶液的 p Η値，所以一種經缓衝的稀釋劑極少會修飾化合物的生物 -29 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） 1245765 A7 B7 五、發明説明（27 活性就另一万面而言，本發明特別提出一種合成本發明之化合物的万法’其包括以下步驟⑷使2_胺基冬氣_3硝基吡啶與第二種反應物在-種驗存在的條件下在溶劑中反應，其; 該第二種反應物係選自包括產生第—個中間產物的醇和胺 (組群；⑻將第-個中間產物與u二酮在—種催化劑和一種遇原劑存在下反應；和（句純化最終產物。 ” 1，2-二酮”一詞係指一種式Ri_c(〇)c(〇)_R2，其中1和1 獨立選自包含氫；視需要經一個五員或六員芳基或雜芳基環部份取代之飽和或不飽和烷基，而該環部份視需要經一個、二個或二個獨立選自包含烷基、_素、三_甲基、羥基、：fe氧基、羧酸根、硝基和酯部份的取代基所取代；和視需要經一個、兩個或三個獨立選自包含烷基、卣素、三 _甲基、經基、：fe氧基、羧酸根、硝基和酯部份的取代基所取代的五員或六員芳基或雜芳基環分子部分。在一項較佳的具體實例中，本發明係關一種本發明化合物之合成方法，其中該溶劑爲正丁醇。在另一項較佳的具體實例中，本發明係關一種本發明化合物之合成方法’其中該驗是粉末狀的碳酸抑。還有另一項較佳的具體實例中，本發明係關一種本發明化合物之合成方法，其中該第二種化合物係選自包括SAQAR 反應物的組群。 ’· SAQAR反應物”一詞係指一群反應物；包括：甲醇、苯甲胺、4 -氟苯甲胺、2 -羧基苯甲胺、3_羧基苯甲胺、4 -羧 30- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210x297公釐） (謂先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} -裂· 、v'口 1245765 A7 _____________________ — B7 I M| ,t 一 . .. ... — - I ! 1 ·Ι I |l _____ _ 五、發明説明（28) 基苯甲胺、2 -硝基苯甲胺、3 -硝基苯甲胺、4_硝基苯甲胺、2 -甲基苯甲胺、3 -甲基苯甲胺、4 -甲基苯甲胺、2 -氯苯甲胺、3 -氯苯甲胺、4 -氯苯甲胺、2 -氟苯甲胺、3 -氟苯甲胺、4-氟苯甲胺、2_(三氟甲基）苯甲胺、3_(三氟甲基）苯甲胺、4-(三氟甲基）苯甲胺、苯乙基4 _胺、苯胺、2_羧基苯胺、3 -羧基苯胺、4 -羧基苯胺、2 -甲苯胺、3 -甲苯胺、4_甲苯胺、2-氯苯胺、3-氯苯胺基、4-氯苯胺、2-氟苯胺、3_氟苯胺、4-氟苯胺、2_(三氟甲基）苯胺、3_(三氟甲基）苯胺、4-(三氟甲基）苯胺、2_胺基吡啶、3_胺基吡啶、4-胺基吡啶和2-甲基胺基吡啶。還有另一項較佳的具體實例中，本發明係關一種本發明化合物之合成方法，其中該第三種反應物係選自包括4 _護基苯基乙二酸、1-苯基·1，2_丙二酮、和二苯基乙二酸。本説明書中使用”催化劑，，一詞係指一種化學分子，當它被添加到一群反應物中時，會增加反應物反應形成產物的速率。有許多型式的催化劑對熟習此藝者而言是熟知的。就一項較佳的具體實例而言，本發明係關合成本發明之化合物的方法，其中該還原劑是氫。就另一項較佳的具體實例而言，本發明係關合成本發明之化合物的合成方法，其中該催化劑是阮來鎳 nickel)。以上説明之本發明摘要是不受限制的，並且本發明的其他特色和益處從以較佳具體實例的説明和申請專利範中將會顯而易見的。 ' -31 - ~本紙張尺度適中國國家ί票準（CNS ) A4規格（210X29：^釐) ' ----- (讀先閲讀背面之注意事項再镇寫本頁裴- 訂 1245765 A7 B7 五、發明説明（29) 本發明的較佳具體實例 (謂先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本發明一部份係有關用5 -氮喹喏啉爲主化合物調節絲胺酸/蘇胺酸蛋白質激酶功能之方法。此外，本發明部份關於調節絲胺酸/蘇胺酸蛋白質激酶之化合物的鑑定方法。該方法併入了能表現一種絲胺酸/蘇胺酸蛋白質激酶的細胞，如 RAF。 RAF是一種受體蛋白質激酶，當它結合到活化的RAS上時，就會被吸收到細胞膜内，而RAS是種鳥嘌呤核甞三磷酸的水解酶。當一種經活化的受體蛋白質酿胺酸激酶，如 EGFR或PDGFR和一種受體蛋白質GRB2和一種鳥嘌呤核苷酸交換因子SOS結合時，RAS就會被活化。SOS會將RAS上的鳥嘌呤核甞二磷酸除去，而以鳥嘌呤核甞三磷酸替換之，因此能活化RAS。然後RAS會與RAF結合且緊接著活化 RAF。然後RAF會針對絲胺酸和蘇胺酸殘基對其他蛋白質進行磷酸化，比如對磷酸化且緊接著活化以有絲分裂原活化之蛋白質激酶（MAPK)的激酶（MEK)。因此，R AF有絲分裂原活化之信號傳遞過程中是做爲中間控制因子。因爲RAF在細胞内的重要調節角色，因此修飾RAF的胺基酸序列會改變它的功能，且因而修飾細胞的表現。RAF在細胞增殖上的角色被記載下來是由於發現RAF上的胺基酸序列突變會與腫瘤和癌症相關。因爲在細胞中會致癌的 RAF突變會導致RAF分子表現出無法控制的催化活性，所以 RAF抑制劑能減輕或甚至阻斷這些細胞中造成癌症的細胞分裂。 -32 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 1245765 A7 _______________— ________________________ B7 五、發明説明（3〇 ) 本發明的方法可偵測細胞調節蛋白質激酶RAF功能的方法。RAF磷酸化一種蛋白質激酶（MEK)，這種酶隨之使被有絲分裂原激活的蛋白質激酶（MAPK)嶙酸化。單是偵測MEK 被RAF磷酸化的檢驗並不靈敏，因爲MEK的磷酸化程度並不顯著。爲了要克服這項靈敏度上的難題，MEK和MAPK二者的磷酸化便緊接於本發明的檢驗中實行。MApK嶙酸化的信唬會使MEK_酸化的信號放大，且使依賴RAF的磷酸化反應得以在酵素連接的免疫吸附檢驗之中接續進行。此外，本發明的檢驗較好是以高度通過的形式進行，如此能使許多化合物在短時段之中被偵測到。本發月的方法已鎩藏出抑制RAF蛋白質激酶功能的化合物這些化合物是以5 -氮p奎喏琳爲主的衍生物。雖然5 _氮喹喏啉已被測試到在細菌中對核甞酸合成有關的酵素具有 2制能力，但這些化合物中有許多在蛋白質激酶的抑制功能上尚未被明確的探究過。因爲RAF相對於其他絲胺酸/蘇胺酸蛋白質激酶而言，展現了顯著的胺基酸類同性，所以本發明的5 -氮喹喏啉爲主 j化口物可也除RAF以外還會抑制其他絲胺酸/蘇胺酸蛋白貝，酶。因此，本發明的方法亦關於RAF以外的絲胺酸/蘇胺酸蛋白質敫酶，包括受體和非受體的絲胺酸/蘇胺酸蛋白質激酶。本發明的方法亦適用於其他在細胞内調節RAF功能的化合因爲本發明向速通過完成這方面使廣泛的分子能在短時門内被測武出來。因此，本發明的方法能鑑認未在本發 ^— _ _ 33 - 本紙張尺度適 (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

1245765 A7 B7 五、發明説明（Μ 明中揭示而能調節RAF功能之已存在的分子。 —!二氮峻喏淋爲主的化合物之生物活性本發明之5 -氮π奎嗔琳爲主的化合物被測試其抑制raf蛋白質激酶功能的能力。這些抑制研究的生物檢驗和結果在此報告出來。用於量度5-氮喹喏啉爲主的化合物調節蛋白質激酶功能的方法類似美國專利申請案第〇8/7〇2,232號由Tang 等人所説明者，後者標題爲” 4丨哚淋酮組合庫及其用於治療疾病相關產物與方法”（Lyon & Lyon Docket編號第221/187 號），於1996年8月23日提出，本方法在高速通過完成的方面與之類似。該08/702,232號申請案完整地併入本説明書之參考文獻中，且包含任何圖示。 1，4,5_二氮萘爲主化合物治瘙的目標病症本説明書所説明的方法，化合物和藥物組合物乃設計藉由調節RAF蛋白質激酶之功能來抑制細胞增殖的疾病。增殖的疾病會造成吾人不希望之_種或更多次系列的細胞在多細胞生物中進行細胞增殖，而對該生物體造成傷害。本説明書中敘述之方法、化合物和藥物组合物亦有用於預防和治療生物體内的其他疾病，諸如與未成熟細胞死亡有關的疾病（亦即神經的疾病）或炎症。這些疾病可能是由不正常運作之RAF分子户斤造成或不正常運作的與raf有關的蛋激酶造成。、 RAF蛋白質激酶或與RAF相關的蛋白質激酶之功能改變奋導致某些疾病中細胞顯著増加或減少的情形。失常的心增殖情形包括癌症、纖維病變、腎小球疾病、不正常的血 (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) •裝_

、1T -34 1245765 A7 —_ ___________________________________ β7 五、發明説明（32 ) ~~~~' —~~ - 官生成和水疱生成、傷口癒合、牛皮癖、再狹窄現象和炎症。纖維病變係關不正常的細胞胞外基質形成。一項纖維病變的實例就是肝硬化。肝硬化的特徵是胞外基質組成物的濃度增加，造成肝疤的形成。肝硬化會引起諸如肝臟的硬化疾病。腎小球細胞增殖疾病的發生肇因於不正常的腎小球細胞增生。腎小球性增殖疾病包括各種人類腎病，如··血管球性腎炎、糖尿性腎炎、惡性腎病化症、血栓形成性微血管病症候群、移植排斥和腎小球症。可用本發明之方法及化合物治療的較佳癌症型式是肺癌、卵巢癌、乳癌、腦癌、軸内腦癌、結腸癌、攝護腺癌、卡普希氏（Kaposi)肉瘤、黑色素肺瘤和神經膠質瘤。本發明之化合物與方法可有效地用於使癌細胞的增殖發展和逆轉的證據在本説明書中藉參考文獻提供參考。血管形成的疾病是由於過多血管增生所造成。血管增殖在各種正常的生理過程中之必要的，如：胚胎發育、黃體形成、傷口疲合和器官再生。然而，血管增殖對癌症的腫瘤發育也是必要的。其他血管增殖疾病還包括：關節炎，其中新的微血管會侵入關節且破壞軟骨。此外，血管增殖病變尚包括眼病，如糖尿病造成的視網膜炎，其中視網膜内的新微血管會侵入晶狀體，造成出血且導致眼盲。相反的，與血管縮小，收縮或閉鎖相關的病變，如再狹窄 (restenosis)也涉及蛋白質激酶的逆向調節。 -35- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (翎先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝_

、1T 1245765 if' 部中 A il 卑消竹印 f A7 五、發明説明（33 ) 甚且，血管形成尚與惡性的固態腫瘤生長與轉移有關。強力生長的癌腫瘤需要營養和氧氣充足的血液支援以持續其生長。因此有不正常的大量微血管經常與癌腫瘤同步生長，並且做爲腫瘤的供應線。埋在腫瘤内的新血管除了會把營養供應給腫瘤，還會提供腫瘤細胞進入循環的門徑，且轉移到生物體内很遠的位置。請參考Folkman，1990年， ((國家癌症中心期刊）)(J· Natl· Cancer Inst.)，第82期：4-6頁。不適當的RAF活性會刺激細胞增生的疾病。特定設計用於調節RAF蛋白質激酶功能的分子已顯示其抑制細胞增殖的功能。更特定的説，被設計成即能與編碼RAF蛋白質激酶的訊息RNA結合。又能阻斷該訊息之轉譯的互補核酸分子，能夠有效地反轉A549細胞在體外的轉型。Monia等人於 1996年發表於（（自然醫學))(Nature Medicine、第2期：688頁的論文完整地併入本説明書之參考文獻部份，包括所有圖表。A549是人的惡性細胞。這些以RAF爲目標的互補研究提供了一項證據，那就是本發明之調節RAF蛋白質激酶功能的5 -氮π奎嗜淋分子能使生物體内的惡性細胞增殖發展下去，且或許可能使其回轉。這些5 -氮喹喏啉化合物可由本説明書中以實施例提出的方法在體外測試。還有，這些5 -氮η奎嗔琳可藉由本説明書中以實施例提出的移植方法在體内測試其對腫瘤細胞的效果。至少有兩種方法能使不適當的RAF活性刺激特定型式的細胞中不希望發生的細胞增殖：（1)直接刺激該特定細胞的生長，或是（2)增加特定邵位如腫瘤組織的血管生成，從而協 -36 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公襲） (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1245765 A7 B7 、發明説明（34 部中，火消 f: 竹 $ 印 t 助该組織生長。首先鑑認細胞增殖性疾病是否由於咖驅使能使本發明的用返便利。一旦廷樣的疾病被鑑認出來，則罹患此種疾病的病患便能藉其症候群分析而被鐘察出來，其中該分析是利用具本技藝之一般技巧的醫生或獸醫師詳知的方法進行的。然後這樣的病人可如本説明書説明方法得到治療。測定細胞增殖疾病是否由RAF驅使，首先可經由測定病患體内特定部位或細胞中的RAF活性高低來達成。例如，在癌、、’田胞的^形中，可對非RAF驅使的癌症和raf驅使的癌症心一種或更多RAF的活性進行比較。若該癌細胞具有比RAF 驅使的癌症還咼之RAF活性，具較好是與尺八^^驅使的癌症相等或更高的活性程度時，它們便是利用本發明所説明之 RAF调卽方法及化合物治療的候選對象。要是細胞增殖性疾病的引發是由於不希望的非癌細胞之增殖所引起，則將該RAF活性與一般大眾體内的RAF活性做比車父（例如：和除了罹患細胞增殖性疾病之人或動物以外的一般一眾或動物群之平均RAF活性做比較）。若是該不希望的細胞增殖疾病特徵是比一般大眾要高的RAF活性，則該疾病就是利用本發明所説明之RAF調節方法和化合物治療的候選對象。喏啉爲主化合物之藥物組合物及其施用方法有關該化合物之藥物調和物的製備法，定量施用於病人之化合物的方法及將化合物施用於生物體的方式揭示於美國專利申請案第08/702,232號，由Tang等人提出，其標題爲 -37- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) •裝-

、1T 1245765 A7 ______________________________ ____B7 五、發明説明（35) ^ ’·啕哚啉酮組合庫及其用於治療疾病的相關產物與方法，， (Lyon & Lyon Docket編號第 221/187號），於 1996年 8 月 23 曰提出；由Buzzetti等人於1996年8月1日出版的國際專利公佈案號W0 96/22976號，其標題爲”做爲酪胺酸激酶抑制劑的水溶性3-亞芳基-2-氧啕哚衍生物"，這兩篇論文均以全文併入本説明書的參考文獻中，包括任何圖示。習於此藝者應會瞭解此番説明適用於本發明且能夠容易地適用於本發明。實施例以下實施例並非限制性的，而只是代表本發明的各種方面及特色。該實施例係説明合成本説明之化合物的方法以及測量一種化合物對RAF蛋白質激酶功能影響之方法。用於該方法的細胞可由市面購得。駐留在細胞内的核酸載體亦可由市面購得，且各種蛋白質激酶的基因序列可以容易地由序列資料庫獲得。因此，具有本技藝之一般技術的人可以利用普通熟習此藝者容易取得的技術很快地藉由合併市售的細胞、市售的核酸載體和蛋白質激酶的基因而及時重新創造出細胞株。實施例1 :本發明之5 ·氮喹喏啉爲主化合物的合成方法現在本發明將用以下非限制性的實例來做説明，除非另有申明： (i)蒸發係藉由在眞空中轉動蒸發的方式進行； (11)操作是在一種鈍氣如氮氣的氛圍下進行； (m)高解析液相層析法（HPLC)是以得自德國Darmstadt市之 -38- 本紙張尺度適iil7國國家標準TcNS ) A4規格（210X 297公釐） ^ --—- (讀先閱讀背面之注意事項再镇寫本頁) .裝·

、1T 1245765 A7 B7 五、發明説明（36 E. Merck公司的Merck LiChrosorb RP-18逆相的碎膠進行； (iv) 所給的產率只是用於説明，但不一定是最大可得產率； (v) 熔點未經校正且係使用HWS Mainz SG 2000數位式熔點裝置測定而得； (vi) 所有具本發明式（I)的化合物結構均在一台Bruker AMX 500-NMR光譜儀上以質子核磁共振光譜法，以及微元素分析法確認過，且在某些狀況中利用質譜法確認結構； (vii) 該結構的純度是利用石夕膠（Merck Silica Gel 60 F254) 以薄層色析法（TLC)或以HPLC進行； (viii) 中間產物一般而言並未完成特徵化，且其純度是以薄層色析法（TLC)或HPLC認定的。合成方法：化合物A-2 : 6-卞基胺基·3-(4-經基本基）-5-氮峻哈琳 4-#呈基苯基乙二酸是根據已公佈的方法（JACS，第7 1期， 104 5頁（1949年））從4-經基乙酿苯（Lancaster, Acros出品）製備而得。 2 -胺基-6-苄基胺基-3-硝基吡啶是以如下方法從2 -胺基_6_ 氯-3 -硝基p比淀製得：將2 -胺基-6 -氯-3-硝基p比淀（17.35克，〇·1〇莫耳），苯甲胺（Fluka公司出品）（10.72公克，0.10莫耳）和粉末狀的碳酸鉀（10.4公克，0.035莫耳）溶於正丁醇（10〇毫升），在迴流條件下加熱2小時。冷卻到室溫後，過濾懸浮物，而以過濾方式收集固體，用丁醇沖洗，並且在5 0°C眞空中乾燥產生2-胺基-6-苄基胺基-3-硝基吡啶（22.2克，91%，溶點 145_146°C)。 (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁}

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_________ FP 五、發明説明（37 ) 6-苄基胺基-3-(4-羥基苯基）_5_氮喹喏啉是由述方法從2_胺基-6-芊基胺基-3-硝基吡啶製得：將2_胺基-6_苄基胺基_3_硝基吡哫（25克，0.1莫耳）在1 〇公克阮來鎳（Raney_Ni)溶於4〇〇笔升之60 C環氧己坑存在的條件下，於5 5巴的H2下氫化。二小時後，將反應混合物冷卻至室溫，過濾並添加扣羥基苯基乙二醛，於氬氣的氛圍下再攪拌2小時。然後用水將懸浮液稀釋’再以過濾法收集固體，用水沖洗，在2 _丙醇中再結晶，而後在50Ό眞空中乾燥產生6_芊基胺基_3_(4_羥基苯基）-5-氮p奎喏淋（8公克，24.4%，溶點271-273°C)。含物A-1 : 6-苯基胺基-3-(4-¾基苯基）_5·氤喹喏4 在製備化合物A_2的方法中，以苯胺取代苯甲胺，由相同的過程可產生6-苯胺基-3-(4-羥基苯基）_5_氮喹喏啉。兔舍物A-3 : 6_甲氧基-2-甲基-3-苯基_5_氤4喏啦在製備化合物A_2的方法中，以苯基·•丙二酮替代私羥基苯基乙二醛，並以甲醇替代苯甲胺，則從相同的過程可製得6 -甲氧基-2-甲基_3·苯基-5·氮p奎喏琳。迅合物A_4 : 6·甲氧基_2,3-二苯基_5·氮P杏喵说在製備化合物A_2的方法中，以二苯基乙二醛替代仁護基經濟部中央標準局員工消費合作社印製苯基乙二醛，並以甲醇替代苯甲胺，則由相同的過程可製传6 -甲乳基-2，3 -»—本基-5 -氮峻嗔Τ»林。物A-5 : 6-(4-氟...苄基吃羞甲基在製備化合物A-2的方法中，以苯基•丙二_替代4_ 羥基苯基乙二醛，並以4_氟苯甲胺替代苯甲胺，則由相同的過程可製得6-(4-氟字基胺基）_2_甲基_3_苯基_5_氮喹啉嗔: -40- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 1245765

A 五、發明説明（38 ) 一些 Α·6 : 2,3-二苯基-6：^：1^苄基胺基>>^^^^ 在製備化合物Α-2的方法中，以二苯基乙二趑替代4_輕基苯基乙二醛，並以4-氟苯甲胺替代苯甲胺，則由相同=過程可製得2,3_二苯基-6·(4 -氟苄基胺基）_5_氮喹喏啉。也合物Α-7 : 3 -苯基-6 -苯胺某-5-氮峰嗤啦在製備化合物Α-2的方法中，以苯基乙二醛替代4_經基苯基乙二醛，並以苯胺替代苯甲胺，則由相同的過程可製得 3_苯基-6-苯胺基-5-氮峻嗔琳。化合物Α-8至Α-26 在製備化合物A - 2的方法中’以經過適當取代的苯甲胺替代苯甲胺，則由相同的過程可製得以下化合物：經濟部中央標準局員工消費合作社印製化合物A-8 : 6-(2-羧基苄基胺基）_3_(；4_羥基苯基>5_氮喹喏啉化合物A-9 : 6-(3-羧基芊基胺基）-3-(4-羥基苯基）_5_氮喹喏啉化合物A-10 : 6-(4-羧基爷基胺基）-3-(4-羥基苯基)_5_氮峻哈淋化合物A-11 : 3_(4_羥基苯基）_6_(2-硝基苄基胺基氮喹喏啉化合物A-12 : 3-(4_羥基苯基）_6_(3-硝基苄基胺基)_%氮喹喏啉化合物A_13 : 3-(4-羥基苯基）-6-(4_硝基苄基胺基^-氮。奎唾琳化合物A-14 : 3·(4-羥基苯基）-6-(2-甲基苄基胺基)_5_氮喹唾琳化合物A-15 : 3_(4_羥基苯基）-6-(3-甲基苄基胺基)_5_氮喹嗔琳化合物A-16 : 3-(4-羥基苯基）-6-(4-甲基苄基胺基)_5_氮喹喏啉化合物A-17 : 6_(2•氯苄基胺基）_3-(4_幾基苯基)_5_氮p奎嗔啦化合物Α·18 : 6-(3-氯苄基胺基）-3-(4-¾基苯基)_5_氮p奎嗔琳化合物A-19 : 6-(4-氯苄基胺基）-3-(4-羥基苯基)_5_氮喹嗔啦化合物A_2〇 : 6-(2-氟芊基胺基）_3_(4-羥基苯基)4-氮喹喏琳 -41 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 1245765 Λ*

W 五、發明説明（39 ) 化合物A-21 : 6-(3-氟芊基胺基）-3-(4-羥基苯基)-5-氮喹喏啉化合物A-22 : 6-(4-氟芊基胺基）-3-(4-羥基苯基)-5-氮喹喏啉化合物A_23 : 3-(4-羥基苯基）-6-[2-(三氟甲基）苄基胺基]·5_ 氮4喏淋化合物Α-24 : 3-(4·羥基苯基）-6-[3-(三氟甲基）芊基胺基]-5- 氮Ρ奎喏淋化合物Α-25 : 3_(4_羥基苯基）-6·[4-(三氟甲基）芊基胺基]-5- 氮ρ奎喏4木化合物Α-26 ·· 3-(4-羥基苯基）-6-(苯乙基-1-胺基）·5-氮喹喏啉化合物Α-27至Α-48 在製備化合物Α-2的方法中，以經過適當取代的苯胺替代苯甲胺，則由相同的過程可製得以下化合物：經濟部中央標準局員工消費合作社印製化合物Α-27 : 6-(2-羧基苯基胺基)-3-(4-羥苯苯基)-5-氮喹喏啉化合物A-28 : 6-(3-羧基苯基胺基)·3-(4·羥苯苯基)-5-氮喹喏琳化合物A-29 : 6-(4-羧基苯基胺基)-3-(4-羥苯苯基)-5-氮喹喏琳化合物A-30 · 3-(4_無基苯基）-6-(2-硝基苯基胺基)-5-氮p奎嗔琳化合物A-31 : 3-(4-¾基苯基）-6-(3-硝基苯基胺基)-5-氮η奎嗔4木化合物A-32 : 3-(4-羥基苯基）-6-(4-硝基苯基胺基)-5-氮p奎嗔琳化合物A-33 : 3_(4_經基苯基）_6_(2_甲基苯基胺基)_5_氮峻嗔琳化合物A-34 : 3-(4-羥基苯基）-6-(3-甲基苯基胺基)-5-氮4唾琳化合物A-35 : 3-(4_羥基苯基）-6-(4-甲基苯基胺基)_5-氮4嗔琳化合物A-36 ·· 6-(2-氯苯基胺基)-3-(4-¾基苯基）-5-氮p奎嗓琳化合物A-37 : 6-(3-氯苯基胺基)-3-(4-¾基苯基）-5-氮峻嗓琳化合物A-38 : 6_(4_氯苯基胺基)-3-(4-¾基苯基）-5-氮n奎ττ若琳 -42- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇x 297公釐） 1245765 hr' Βη 五、發明説明（4〇 ) 化合物A-39 : 6-(2-氟苯基胺基)-3-(4-羥基苯基）-5-氮喹喏啉化合物A-40 : 6-(3-氟苯基胺基)-3-(4-羥基苯基）-5-氮喹喏啉化合物A-41 : 6-(4-氟苯基胺基)-3-(4-羥基苯基）-5-氮喹喏啉化合物A-42 ·· 3-(4•羥基苯基）-6-[2·(三氟甲基）苯基胺基]_5_ 氮T2奎嗜4 化合物A-43 : 3-(4-羥基苯基）-6-[3·(三氟甲基）苯基胺基]·5· 氮n奎喏琳化合物Α-44 · 3-(4-¾基苯基）_6-[4-(二氣甲基）苯基胺基]_5_ 氮4:喏琳化合物A_45 · 3-(4-經基苯基）-6-(0比淀_2-胺基）-5-氮峻嗔淋化合物A-46 : 3_(4_#i基苯基）-6·(ρ比淀_3·胺基）_5_氮4喏淋化合物A-47 : 3-(4-羥基苯基）-6-(吡啶-4-胺基）-5-氮喹喏琳化合物A·48 : 3-(4-羥基苯基）_6_(吡啶·2_甲胺基）-5_氮邊嗔淋化合物Α-49至Α-67 : 在製備化合物Α-2的方法中，以經過適當取代的苯甲胺替代苯甲胺，並以苯基乙二醛替代4 -羥基苯基乙二醛，則由相同的過程可製得以下化合物：經濟部中央標準局員工消費合作社印製化合物Α-49 : 6_(2-叛基爷基胺基）-3 -苯基-5-氮唆嗓琳化合物A-50 : 6-(3-叛基爷基胺基）-3•苯基-5-氮唉嗔淋化合物A_51 : 6-(4_叛基辛基胺基）_3_苯基_5_氮ρ奎唾^林化合物A_52 ·· 6-(2·硝基宇基胺基）-3 -苯基_5_氮n奎嗓贫林化合物A-5 3 ·· 6-(3-硝基爷基胺基）-3-苯基-5-氮p奎嗓嘛化合物A·54 : 6_(4_硝基+基胺基）·3_苯基-5_氮^!奎唉淋化合物Α-55 : 6-(2-甲基宇基胺基）-3-苯基-5-氮嗜嗓淋 -43- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公f )

}V 1245765 五、發明説明（41 ) 化合物A-56 : 6-(3-甲基芊基胺基）-3-苯基-5-氮喹喏啉化合物A-57 : 6-(4-甲基芊基胺基）-3-苯基·5-氮喹喏啉化合物Α-58 : 6-(2-氯苄基胺基）-3-苯基-5-氮喹喏啉化合物A-59 : 6-(3-氣苄基胺基）-3-苯基-5-氮喹喏啉化合物A_6〇 : 6-(4·氣节基胺基）-3 -参基-5-氮峻嗜淋化合物A-66-(2_氣爷基胺基）_3_本基-5·氮p奎嗔p林化合物Α-62 ·· 6-(3_氣爷基胺基）·3·苯基-5-氮峻嗔琳化合物Α·63 : 6-(4·氣午基胺基）_3·本基-5-氮ρ奎唾ρ林化合物A_64 : 3-豕基- 6·[2_(二氣甲基）卞基胺基]-5 -氮p奎嗔琳化合物Α_65 : 3-琴基-6_[3-(二氣甲基）卞基胺基]-5-氮π奎嗜琳化合物Α-66 : 3-苯基-6_[4-(三氟甲基）苄基胺基]-5-氮嗜嗓琳化合物Α_67 ·· 3-苯基·6_(苯乙基-1-胺基）_5_氮喹喏琳化合物Α-68至Α-89 : 在製備化合物A - 2的方法中，以經過適當取代的苯胺替代苯甲胺，並以苯基乙二輕替代4 - #呈基苯基乙二齡，則由相同的過程可製得以下化合物：經濟部中央標準局員工消費合作社印製化合物A-6 8 : 6-(2-竣基苯基胺基）-3-苯基-5-氮p奎嗔淋化合物A-69 : 6-(3-叛基苯基胺基）-3-苯基-5·氮p奎嗔ττ林化合物A-70 ·· 6-(4-叛基苯基胺基）-3-苯基-5-氮峻嗜淋化合物A_71 : 6-(2 -硝基苯基胺基）-3 -苯基-5-氮峻u若淋化合物A-72 : 6-(3-硝基苯基胺基）-3-苯基-5-氮u奎嗔p林化合物A-73 : 6-(4-硝基苯基胺基）-3-苯基-5-氮峻嗔ττ林化合物A-74 : 6-(2 _甲基苯基胺基）-3-苯基-5-氮峻嗔ττ林化合物A_75 : 6-(3-甲基苯基胺基）-3-苯基-5-氮峻p若淋 -44- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 1245765 Λ? 五、發明説明（42 ) 化合物A-76 : 6-(4-甲基苯基胺基）-3-苯基-5-氮峻嗔琳化合物A_77 : 6·(2·氯苯基胺基）_3_苯基_5_氮p奎唾琳化合物Α·78 : 6_(3·氯苯基胺基）-3-苯基-5_氮峻唾琳化合物A·79 : 6-(4-氣苯基胺基）_3 -苯基_5_氮峻嗔琳化合物A_8〇 : 6-(2-氣苯基胺基）-3-苯基"氮ρ奎嗔淋化合物A·81 : 6-(3·氣苯基胺基）-3_苯基氮咬嗔p林化合物A·82 ·· 6-(4-氣苯基胺基）-3-苯基_5_氮p奎唾琳化合物A-83 ·· 3-苯基·6-[(2-三氟甲基）苯基胺基卜5_氮峻嗜琳化合物Α-84 : 3-苯基-6-[(3-三氟甲基）苯基胺基]_5_氮4嗔琳化合物Α-85 : 3-苯基-6-[(4-三氟甲基）苯基胺基]_5_氮峻嗔琳化合物Α·86 : 3_冬基_6_(ρ比淀_2 -胺基）-5-氮ρ奎嗤Τ»林化合物Α-δ7 : 3•豕基_6_(ρ比淀-3-胺基）_5_氮ρ奎嗅琳化合物Α-8 8 · 3 ·豕基-6 -( ρ比淀-4-胺基）-5 -氮ρ奎唾琳化合物A·»89 : 3·豕基- 6_(p比淀_2 -甲胺基）_5_氮峻嗔淋化合物A-90 : 6-苯胺基-3-(4-甲氧基苯基V5-氡喹喏啦在製備化合物A-1的方法中，將4-甲氧基苯基替代4_藉基苯基，則以相同的過程能產生6-苯胺基-3-(4-甲氧基苯基）-5-氮4:喏琳。實施例2 :量測之RAF之磷酸化功能的檢驗經濟部中央標準局員工消費合作社印製以下檢驗報告了 RAF催化其目標蛋白質MEK以及MEK之目標物MAPK之磷酸化的量。RAF基因序列説明於Bonner等人，1985年，（（分子細胞生物學）)(Molec. Cell. Biol.)，第5 期：1400-1407頁，且該序列很容易在許多基因序列的資料庫裡找到。用在本發明之此部份的核酸載體和細胞株完整 -45- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 1245765 hr' w 五、發明説明（43 地説明於Morrison等人，1988年，PN AS，第85期，8855-8859頁）。請先閲讀背 I& 冬意事項再填寫本頁材料與試劑 1 . Sf9草地黏蟲（Spodoptera frugiperda)細胞；馬里蘭蓋司博格市的GIBCO-BRL公司出品。 2.RIPA緩衝液：20 mM Tris/HQ，pH 7.4，137 mM NaQ， 10%甘油，1 mM PMSF，5 毫克/ 升 Aprotenin，0.5% Triton X· 100 ； 3·硫氧化還原蛋白-MEK融合蛋白（T-MEK) : T-MEK的表現及利用親和性層析法進行純化是根據製造商提供的方法進行的。 4 . His-MAPK(ERK2) ; His標記的 MAPK是以編碼 His-MAPK 的pUC載體在XL1 Blue細胞中進行轉型。His-MAPK是用Ni· 親和層析法純化的。其由加州Alameda市的Pharmacia公司出品，目錄編號27-4949-01，如本説明書敘述者。 5 ·羊的抗氣 IgG :賓州 West Grove 市的 Jackson Laboratories 公司出品，目錄編號515-006-008，批號28563。 6. RAF-1蛋白質激酶的專一性抗體：URP2653，UBI出品。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 7. 覆蓋用的緩衝液：PBS ;以磷酸鹽做緩衝劑的鹽液，馬里蘭州蓋司博格市的GIBC0-BRL公司出品。 8. 沖洗用的緩衝液：TBST-50 mM Tris/HCl，pH 7.2，150 mM Naa，0.1% Triton X_100 0 9·封阻用的緩衝液：TBST，0.1%乙醇胺，pH 7.4。 10·DMSO，密蘇里州聖路易市Sigma公司出品。 -46- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 1245765 Λ? Β*7 五、發明説明（44 ) 11·激酶緩衝液（KB) : 20 mM Hepes/Ηα，pH 7·2，150 mM NaCl，0.1% Triton Χ-100，1 mM PMSF，5 毫克/ 升 Aprotenin， 75#M正釩酸鈉，0.5 MM DTT和 10 mM MgCl2。 12. ATP 混合液：100 mM MgCl2，300 # M ATP，10 /i Ci r-33PATP(Dupont-NEN)/毫升。 13. 終止反應的溶液：1%磷酸；賓州匹茲堡市Fisher公司出品。 14·瓦拉克纖維素磷酸酯濾墊；芬蘭Turku市的瓦拉克 (Wallac)公司出品。 15·濾器沖洗液：1 %磷酸，賓州匹茲堡市的Fisher公司出品° 16. Tomtec平盤收穫器，芬蘭Turku市的瓦拉克（Wallac)公司出品。 17. 瓦拉克貝他平盤讀數器#1205，芬蘭Turku市的瓦拉克 (Wallac)公司出品。 18. NUNC 96槽的V型底面聚丙烯化合物平盤，Applied Scientific 目錄編號 AS-72092。方法所有以下步驟都是在室溫下進行，除非有特別指示。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 1. ELISA平盤覆蓋：在4°C用100 "L羊抗鼠的親和法純化抗血清（1微克/100微升包覆用緩衝液）至隔夜。ELISA平盤在4 °C下保存，可使用兩週。 2 ·把平盤翻面且去除液體。添加1〇〇微升封阻用溶液並培養30分鐘。 -47- 本紙張又度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1245765 五、發明説明（45 ) 3 .除去封阻用溶液並且用沖洗用的溶液沖洗四次。在紙巾上拍打平盤以去除過量液體。 4。在每個槽中添加1微克特足於RAF -1的抗體。如步驟3説明的方式沖洗之。 5. 將RAS/RAF感染的Sf9細胞溶解物溶化並以TBST稀釋成 1〇微克/100微升。在槽中添加1 0微克稀釋的溶解物，再培養1小時。在培養期間搖晃該平盤。負對照組不加任何溶解物。RAS/RFA感染之Sf9昆蟲細胞溶解物的製備是對每種病毒以重組的巴氏病毒感染細胞後（MOI値爲5)，於48小時之後收穫細胞。用PBS沖洗細胞一次，在RIPA緩衝液中溶解細胞。用離心法除去不溶物（在l〇〇〇〇Xg下離心5分鐘）。將溶解物分成小部份以乾冰/乙醇結象，並且在-80°C下保存至取出使用。 6 ·將未結合的物質去除，如以上列出（步驟3 )的方法沖洗之。 7 ·在每槽中添加2微克T-MEK和2微克His-MAEPK，並且用激酶緩衝液將體積調整爲4 〇微升。至於從細胞抽取液中純化T-MEK和MAPK的方法以實例在本説明書中提出。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 8. 將化合物（1〇毫克/毫升DMSO)或抽取物預先以TBST添加1% DMSO之溶劑稀釋20倍。將5微升預先稀釋過的化合物/抽取物添加劑到步驟6所説明的槽中，浸浴2 0分鐘。對照组不添加任何藥品。 9. 添加5微升ATP混合液使激酶反應開始，在ELISA平盤搖動益上於培養期間搖動該盤。 _ -48- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐）經濟部中央標準局員工消費合作社印製 1245765 Η1 五、發明説明（48 ) 則可用熟習此技藝者目前可得的技巧在短時間内完成。將MEK和MAPK從細胞抽取物中純化則可藉由以下取材自 Robbins等人，1993年，於（（生物學期刊）)(J· Biol· Chem)第 268期：5097-5106頁所提出的方法完成之： 1 .用超音波振盪、滲透壓或法國擠壓技術把細胞溶解掉，這些都是熟習此藝者很容易獲得的技術。適當的超音波振盪緩衝液提供如下。 2.用以下揭示的平衡用缓衝液沖洗和鎳或鈷結合之固態擔體。聚組織胺酸標記會特定地與固態擔體上的鎳和鈷原子結合。管柱平衡可用體積等於十倍固態擔體之體積的平衡用溶液沖洗樹脂三次來達成。該擔體對普通習於此藝者而言，很容易取得。 3 .把細胞溶解物添加到固態擔體上，並且在一容器中平衡浸浴一段時間。或者可將固態擔體填到一根蛋白質層析管柱中，並將溶解物流過該固態擔體。 4 .用下面揭示緩衝液沖洗固態擔體。 5·用一定量之溶離用緩衝液（提供如下）MEK或MAPK蛋白質從固態擔體上溶離下來，這樣可去除大部份固態擔體上的蛋白質。超音波缓衝液 50 mM磷酸納，pH 8.0 0.3 Μ氯化鈉 10 mM /?-羝基乙醇 1% NP40 -51 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

1245765 Λ Η*7 五、發明説明（49)

10 mM NaF 0.5 mM Peablock 平衡用緩衝液 50 mM磷酸鋼，pH 8.0 0.3 Μ氯化鈉 10 mM θ -羧基乙醇 1% ΝΡ40

10 mM NaF 1 mM脒唑沖洗用緩衝液 50 mM磷酸鈉，pH 8.0 0.3 Μ氯化鈉 10 mM θ ·羧基乙醇 1% ΝΡ40

10 mM NaF 1 mM脒唑溶離用緩衝液 5 0 mM磷酸納，pH 8.0 0。3 Μ氯化鈉經濟部中央標準局員工消費合作社印製 10 mM _羧基乙醇 1% NP40

10 mM NaF 10-500 mM腺唑實施例4 :量測EGF受體之磷酸化功能之檢驗 -52- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） 1245765 五、發明説明（51 ) 無菌滴管尖頭請閱讀背意事項填寫本頁無菌之15毫升或50毫升試管試劑 0.4% SRB溶於1%醋酸 10 mM Tris 驗 10% TCA 1%醋酸無菌DMSO(Sigma出品）溶於DMSO的化合物（100 mM或較稀之儲備溶液）胰蛋白酶-EDTA(GIBCO BRL出品）細月包株 3T3/H-Ras(能表現致癌H-Ras之基因組片段的NIH-3T3純種系 7的細胞）該細胞可利用以下方法予以建立： 1。使編碼Ras的基因片段插入能穩定轉移感染NIH-3T3細胞的市售載體進行無性繁殖。該片段係得自cHa-ras的基因組轉型對偶基因。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 2 .用磷酸鈣法以經傳代無性繁殖的載體轉移感染NIH-3T3 細胞。挑選能在2 %血清溶於DMEM中表現Ras建構體的細胞。兩週之後觀察可見到的細胞。把經轉型的細胞匯聚以產生一個穩定轉型的細胞株。生長培養基： 2% 牛血清/DEEM + 2mM麩醯胺，（Pen/Strep) 方法： -54- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1245765 A7 B7 五、發明説明（S2 ) 第零天：細胞之平盤處理：這部份檢驗是在通風櫥裡進行的。 1. 用胰蛋白酶消化細胞。將200微升細胞懸浮液添加到1〇毫升等張溶液用。利用庫爾特計數器（c〇ulter c〇unter)計算細胞的數目。 2. 把生長培養基裡的細胞稀釋成6〇〇〇〇個細胞/毫升。然後在96槽的平底盤巾每槽添w⑼微升細胞，使成爲麵個細胞/每槽。 3·每種化合物用半個平盤（4排）進行試驗，並對每一化合物/辰度重4在四個槽内試驗，再用四個槽做培養基對照組0 4 ·輕搖平盤使細胞均勻接觸。 5·將平盤置入37°C，含1〇% C〇2的培養箱中培養。第1天：添加化合物這邵份檢驗是在通風櫥内進行的。 1.在％槽的圓底平盤中，把120微升生長用培養基加到第 1行至第1 1行，孩培養基含有在最高化合物篩選濃度中被發現的最終DMSO%的兩倍濃度。例如，若最高濃度是議微升，且這是由100毫莫耳濃度的儲備溶液配製的，則ιχ DMSO是0·】％，而2Χ麵〇是〇.2%。此盤是用來滴定化合物的，每一種化合物佔其中4排。 2·在無菌的15毫升試管中，製備2χ最高化合物篩選濃度溶於生長基加上2XDMS0的溶液。每個細胞株需要有1毫升。該化合物的起始濃度通常是100//訄，但是這個濃度可 -55- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

1245765 I” 五、發明説明（53 ) 能視該化合物的溶解度而有所變化。 3.把240微升2X起始化合物溶液加到96槽圓底平盤内第 12行的四個重覆試驗槽中。將平盤由右至左做！： 2的連續 $釋，即將第12行中的12微升轉到第"行，第"行再轉至第1 0仃等等，直到轉至第2行。把1〇〇微升化合物稀釋液和 100微升第1行内的生長基加到9 6槽平底盤之對應槽中細胞上的100微升培養基内。每個槽的總體積應爲2〇〇微升。 4 ·把平盤放回培養箱，再培養3天。第4天：進行檢驗這邵份檢驗是在實驗桌上進行的。 1. 興it抽除或倒掉培養基。把200微升冷的1〇% TCA加到每個槽中使細胞固定。將平盤在4X培養至少60分鐘。 2. 倒掉TCA並且用自來水潤洗5次。把平盤翻轉向下在紙巾上乾燥。 3. 用100微升/槽〇·4% SRB將細胞染色1〇分鐘。 4·倒掉SRB，且用1%醋酸潤洗各槽5次。把平盤翻轉向下方在純巾上完全乾燥。 5·用100微升/槽1〇 mM Tris鹼溶離染劑5到分鐘，在搖盪器上進行。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 6 ·以Dynatec公司出品的ELISA piate以以以讀取各盤在57〇毫微米波長下參照63〇毫微米波長所得的讀數。如表3所；^，揀選出能夠抑制過度表現ras之細胞生長速率的化合物。 -56- 本紙張尺度適财關家辟（CNS ) A4規格（210X297^^7 1245765 Η*7 五、發明説明（54) 表3 化合物 IC5〇(mM) RAS/NIH3T3 A-1 1.04 A-2 7.6 A-6 13.5 A-36 0。18 A-77 0。7 實施例6 :量測5-氮喹喏啉爲主化合物對A549細胞生長的影響之檢驗以下檢驗係量測A549細胞的生長速率。該檢驗的目的是測定化合物對A549人體肺癌細胞生長的影響。A549很容易從商業來源獲得，如ATCC(CCL185)。材料 96槽平底無菌盤 96槽圓底無菌盤無菌之25毫升或100毫升容器滴管，多管道滴管幫浦無菌滴管尖頭經濟部中央標準局員工消費合作社印製無菌之15毫升或50毫升試管試劑

0.4% SRB溶於1%醋酸 10 mM Tris驗 10% TCA -57- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 1245765 A7 B7 --- —— — - - — · I "*·，-_ ............. - 五、發明説明（55) 1%醋酸無菌DMSO(Sigma出品）化合物溶於DMSO( 1 〇〇 mM或較稀的儲備溶液）胰蛋白酶-EDTA(GIBCO BRL出品）細胞株和生長培養基 A549人體肺癌細胞（ATCC，CCL185) 10%胎牛血清溶於漢姆氏（Ham，s)F12-K 方法：第0天：細胞裝盤這部份檢驗是在通風櫥内進行的。 1。用胰蛋白酶消化細胞。將200微升細胞懸浮液添加到i 〇毫升等張溶液用。利用庫爾特計數器（c〇ulter c〇unter)計算細胞的數目。 2 .把生長培養基裡的細胞稀釋成2 〇，〇〇〇個細胞/毫升。然後在96槽的平底盤中每槽添加1〇〇微升細胞，使成爲2〇〇〇個細胞/每槽。 3 ·每種化合物用半個平盤（4排）進行試驗，並對每一化合物濃度重覆在四個槽内試，再用四個槽做培養基對照組。 4 .輕搖平盤使細胞均勻接觸。 5。將平盤置入37°C，含10% c〇2的培養箱中培養。弟1天：添加化合物這部份檢驗是在通風櫥内進行的。 /·在^6槽的圓底平盤中，把12〇微升生長用培養基加到第行至第1 1行，該培養基含有在最鬲化合物篩選濃度中被發 (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -裳· 、1Τ

I . - I I. I ___ - 58 · 1245765 A7 B7 部中 lk ii. 率消合竹印 f 五、發明説明（56 現的最終DMSO%的兩倍濃度。例如，若最高濃度是1〇〇微升，且這是由100毫莫耳濃度的儲備溶液配製的，則ιχ DMSO是0.1%，而2Χ DMSO是0.2%。此盤是用來滴定化合物的，每一種化合物佔其中4排。 2.在無菌的15毫升試管中，製備2χ最高化合物篩選濃度溶於生長基加上2Χ DMSO的溶液。每個細胞株需要有j毫升。該化合物的起始濃度通常是〗〇〇 ^ Μ，但是這個濃度可能視該化合物的溶解度而有所變化。 3 ·把240微升2 X起始化合物溶液加到9 6槽圓底平盤内第 1 2行的四個重覆试驗槽中。將平盤由右至左做1 : 2的連續稀釋，即將第1 2行中的1 2微升轉到第1 1行，第j j行再轉至第1 0行等等，直到轉至第2行。把1〇〇微升化合物稀釋液和 100微升第1行内的生長基加到9 6槽平底盤之對應槽中細胞上的100微升培養基内。每個槽的總體積應爲2〇〇微升。 4·把平盤放回培養箱，再培養3天。第5天：進行檢驗這部份檢驗是在實驗桌上進行的。 1 ·眞空抽除或倒掉培養基。把200微升冷的1〇% tcΑ加到每個槽中使細胞固定。將平盤在4°C培養至少60分鐘。 2。倒掉TCA並且用自來水潤洗5次。把平盤翻轉向下在紙巾上乾燥。 ' 3. 用100微升/槽0.4% SRB將細胞染色10分鐘。 4 ·倒掉SRB，且用1 %醋酸潤洗各槽5次。把平盤翻轉向下方在紙巾上完全乾燥。 -59- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐）讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1245765

A* }V 經濟部中央標準局員工消費合作社印裂五、發明説明（57 5.用100微升/槽i〇 mM Tris鹼溶離染劑5到10分鐘，在搖蓋器上進行。 6·以Dynatec公司出品的ELISA Plate Reader讀取各盤在570 毫微米波長下參照63〇毫微米波長所得的讀數。如表4所示，揀選出能夠抑制A549細胞之生長速率的化合物。表4 化合物 IC50〇 M) A549 A-2 2.51 >10(2% FBS) A- 6 23.8 >10(2% FBS) -- -二·? π，卜明：q < 土；^ 生的万法異種移植研究可用於偵測本發明之化合物在抑制卵巢瘤、黑色素瘤、攝護腺瘤、肺腫瘤和乳房腫瘤細胞上的效果。孩檢驗的方法詳述於PCT專利公佈案號第觸96彻μ號，由Tang等人在1996年6月5日提出，其標題爲"用於的令朵_化合物"，本説明書將之完整獻包括任何圖示。爹芩又獻中在本説明書中所闡述之發定揭示的任何要素或限制不存二名阔和表示法係用於説明的目而丁木用（意用這此名…本一、土“的而非限制。本説明書無 1和表7"法排除任何與説明書中所顯示和説明 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁 •裝· 訂 60 -

1245765 A7 — ^ —---------------- -------- 五、發明説明（58) ~^ 的特性相當的事物或其部份，但是吾人承認在本發明之申 ^專利範圍内有許多修改是可行的。因此，必須瞭解的是：本發明雖然藉較佳之具體實例和可選擇之特性予以特足揭示出來，但是習於本技藝者或可對於本説明書所揭示的概念進行修飾和改變，而這種修飾和改變如所附申請專利範圍之定義，亦視爲本發明的範疇。至於那些先前未併入本説明書之參考文獻的參考資料，包括專利及非專利之參考資料，由於各種目的所以均併入本説明書。其他具體實例則在以下申請專利範園之範疇内。p (誚先閲讀背面之注意事項再填寫本頁j -¾衣·

-'1T

-61 - 本纸张尺度適州中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1245765 r/ 申請曰期 87.10.06 案號 087116559 類別 (以上各欄由本局填註） Α4 C4 中文說明書替換頁(93年4月）雪還專利説明書 -、SI名稱中文用5-氮p奎喏p林為主化合物調節絲胺酸/蘇胺酸蛋功能之體外方法英文 tfIN VITRO METHODS OF MODULATING SERINE/THREONINE PROTEIN KINASE FUNCTION WITH 5-AZAQUINOXALINE-BASED COMPOUNDS" 姓名 1吉洛德麥克馬翰 3·伯哈德咖次克 2.哈洛德艾皮 4.艾克哈德剛塞國籍 1.美國 2.3.4.均4急國人住、居所 1·美國加州三藩市綠威屈街1414號 2·美國加州三藩市第27街630號 3·德國曼陀市史翠曼街9號 4·德國曼陀市威格街176號姓名 (名稱）國籍德商善特里斯公司德國三、申請人

C 住、居所 (事務所) 代表人姓名 :\55\55132-9304：德國法蘭克福市魏斯穆勒街四十五號 J ·安吉爾 K ·提瑪恩 l.doc 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格（210 X 297公釐） Α7 Β7 I2457給 16559 號專利申請案中文說明書修正頁(89年11月）五、發明説明（17) 均可被預防或治療。存在於生物體外的細胞可被保留或養在細胞培養皿中。對於駐留在生物體内的細胞而言，本技藝中存在許多技術可用於施用化合物，其包括（但不限於）口月良、非經腸的、皮膚的、注射以及噴霧劑的施·用方式。對於生物體外的細胞而言，本技藝有許多技術可用於施加化合物’其包括(但不限於)細胞微注射技術、轉型技術和載體技術。就一項較佳的具體實例而言，本發明係關預防或治療一種生物組内異常病症的方法’其中5 -氮p套淋為主的化合物具有本說明書定義之式ί所示的結構或本說明書中所示之任何其所具有的次基因。就其他較佳的具體實例而言，本發明係關預防或治療一種生物體内異常病症的方法，其中具有式j所示結構的5 _氮喳嗓琳為主的化合物係選自包括SAQAR化合物的組群。就另一項較佳的具體實例而言，本發明係關預防或治療一種生物體内異常病症的方法，其中該生物體是一種哺乳動物。 ”哺乳動物” 一詞較好是指諸如鼠、家鼠、兔、豚鼠和羊的生物體’更好是指猴和猿，而最好是指人。還有另一項較佳的具體實例是，本發明關預防或治療一種生物體内異常病症的方法，其中該異常病症是指癌症或纖維病變。，、就另項較佳的具體實例而Τ，本發明係關預防或治療一種生物體内異常病症的方法，其中的癌症選自肺癌、=巢 -20- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇χ 297公釐） Κ---------9¾衣------1T----- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製

12457会各116559號專利申請案中文說明書修正頁(89年丨丨月） -————___ 五、發明説明（19) 用在另項較佳的具體實例中，本發明係關預防或治生物體内異常病症的方法，叾中該絲胺酸/蘇胺酸蛋白質激酶是RAF。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) —藥物組另一方面，本發明特別提出具有式I所示結構的5-氮如若 11林化合物：

其中 (a)Ri ’ R2和R0係獨立選自包括以下部份的基團： ⑴氫； (ii)飽和或不飽和的燒基； (出）—種式nhzX3的胺，其中又2和又3獨立選自氫、飽和或不飽和燒基，和五員或六員芳基或雜芳基環部份； (iv)自素或二函甲基； V)式-CO-X4的酮，其中X4選自：氫、烷基和五員或 κ貝务基或雜芳基環部份；經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (vi) 式-(X5)n-COOH 的羧酸或式-(x6)n-C〇〇_X7 的酯，其中X5，X6和X7獨立選自：烷基和五員環或六員環芳基或雜芳基且其中η是〇或1; (vii) —種式-(Χ8)η_〇Η的醇或_種式的烷氧基部份，其中&和X9獨立選自：氫、飽和或不飽和烷基，以 -22- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS )八4規格（21〇χ 297公釐）；\ν^ 16559號專利申請案中文說明書修正頁(89年11月） &

發明説明（46) 10.6 0刀1里將3 0微升終止落液加到每個槽中使該激酶反應終止。 11·把磷酸纖維素滤板和£1^18八平盤放在T〇mtec公司出品的平盤收穫态上。根據製造商的建議收穫細胞且將濾器用濾器沖洗液沖洗過。使濾板乾燥。將濾板密封並且放置在一個接盛器裡，把接盛器插到放射偵測裝置中，定量濾、板上的放射磷含量。或者，從檢驗平盤上的每個槽中取4 0微升的小部份，把它們轉送到磷酸纖維素濾板上的對應位置。在濾器被風乾後，把它放在一個盤中。輕輕地搖動該盤沖洗液更換一次，共歷一小時。把濾板風乾且放在適用於量測樣品中放射磷之接盛器中偵測器之中並且定量濾板上的放射磷。 ICw的值則是根據用於以下5 -氮p奎喏淋為主化合物的方法以1^?_1£1^3八檢驗測量到的： (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝. 每1 5分鐘就將 ^使濾板密閉並 >把接盛器插到訂經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (A_U .. · (A-2)

-49- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 12457餘 16559號專利申請案中文說明書修正頁(89年11月） A7 B7 五、發明説明（47)

5 (λ-77) (A-90)

(請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) IC5〇是指使磷酸化蛋白質或細胞生長的最大數量減少50% 所需之以5 -氮喳喏啉為主之抑制劑濃度。RAF磷酸化檢驗中所測到的IC5〇敘述於表1之中：表1 化合物 IC5〇(//M) A-1 11.5 A-2 7.8 A-7 33 A-36 45.6 A-77 20.3 A-90 98.0 實施例3 : Mapk和Mek的純化經濟部中央標準局員工消費合作社印製 MAPK和MEK蛋白質很容易在細胞中表現出來，其乃將編碼這些蛋白質的基因插入一種市售的載體進無性傳代繁殖，而該載體能將帶有聚組織胺酸標記之該蛋白質表現出來。編碼這些蛋白質的基因很容易從一般研究這些蛋白質的實驗室裡取得，或將這些基因從含有cDNA基因庫的細胞中轉殖獲得。該基因庫可以很容易購得，而熟習此技藝者很容易就能從MEK和MAPK的核酸序列設計出與編碼MEK 或MAPK的cDNA分子同源的核酸探針來，MEK和MAPK的核酸序列可得自許多基因資料庫，如Genbank。基因的轉殖 -50- 本纸浪尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 12457^71 16559號專利申請案中文說明書修正頁(89年11月） A7 B7 五、發明説明（50) EGF受體激酶在整個細胞内的活性（EGFR-NIH3T3檢驗）是由詳述於Tang等人於1996年6月5日提出的PCT專利公告案號 WO 96401 16號的方法測量的，該專利標題為π治療疾病用的啕哚啉酮化合物π，本說明書將之完整地併入參考文獻内，包括任何圖示。在EGF受體磷酸化檢驗中測得的IC5〇之值記述於表2之中：表2 化合物 IC50(/zM) A-2 >50 A-3 >100 A-4 >100 A-5 >100 A-6 >100 A-7 >50 實施例5 ··量測5 -氮4喏啉為主之化合物對表現RAS的細胞生長影響之檢驗以下檢驗測量能表現RAS之NIH-3T3細胞生長速率。該檢驗的目的是要測定化合物對於過度表現Η-RAS之NIH-3T3細胞生長的影響。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 材料 96槽平底無菌盤 96槽圓底無菌盤 ^ 無菌的25毫升或100毫升容器滴管，多管道滴管幫浦（pipetman) -53- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐）

Claims

12457赢

務‘. 弟而116559號專利申嗜宏上青專^£^“15月) 、申請奇對範霜一種用 $ € Jr |5|fH 用5 -虱喹喏啉為主化合物調節蘇白激酶功能#古、i_ # 万法，其包括讓表現該絲胺酸/蘇胺酸蛋白質 s母的細胞與該化合物在體外接觸；其中該5 _氮喹如下結構式（I):

(I) PM Rex >q 、n，\r 其中 1 (a) Ri，R2，R3，114和R6係獨立選自： ⑴氫； (11)視需要經五員或六員_芳基環部分，或 (Ci-C^)·雜芳基環部分取代的具丨_2〇個碳原子（較佳為1 · 6個碳原子）之飽和或不飽和烷基，其中該環部分係未經取代或經一個、兩個或三個獨立選自：具1-20個碳原子 (較佳為1_6個碳原子）之烷基、鹵素、三鹵曱基、羧酸根、硝基和酯部份之取代基取代； (ui) —種式NHA3的胺，其中又2和χ3獨立選自：氯、飽和或不飽和的具卜2〇個碳原子（較佳為丨_ 6個碟原子）之烷基，和五員或六員芳基或（Ci_C2士雜芳基環部份； (iv) 鹵素或三鹵曱基； (v) 式~CO-X4的酮，其中X4選自：氫、具卜扣個碳原子（較佳為1 - 6個碳原子）之烷基和五員或六員（C5_ 55132-940531.doc _ 1 _ 本紙張尺度適用中國國家標準(CNg) A4規格(210X297公釐) 1245765 A8 B8 C8 D8 申請專利範園 C20)-芳基或（CVC2Q)-雜芳基部份； (vi) 式-(X5)n-COOH 的羧酸或式-(X6)n-COO-X7 的酯’其中Xs，Χό和獨立選自：具1 _ 20個碳原子（較佳為 1 - 6個碳原子）之烷基和五員環或六員（C5-C2()) _芳基或（a一 C2〇)-雜芳基部份，且其中η是0或1 ; (vii) 式-(Χ8)η-〇Η的醇或式-(χ8)η_〇_χ9的烷氧基部伤其中Xg和X9獨立選自·氮、飽和或不飽和的具1 _ 2 〇個碳原子（較佳為1 _ 6個碳原子）之烷基，及五員或六員 (Cs-c^)-芳基或（Cl-C2G)-雜芳基環部份，其中該環係未經取代或由一個或多個選自：具丨_ 2〇個碳原子（較佳為丨_ 6 個碳原子）之烷基、鹵素、三鹵甲基、羧酸根、硝基和酯的取代基取代，且其中n是〇或1 ; (viii) 式-NHCOX10的醯胺，其中χ1〇係選自：具^加個碳原子（較佳為1 - 6個碳原子）之烷基、羥基和五員或丄員（Q-Cm)-芳基或（CrQo)-雜芳基環部分，其中該環係未經取代或由一個或多個獨立選自：具2〇個碳原子（較俨為1 - 6個碳原子）之烷基、鹵素、三鹵曱基、羧酸根、硝基或酯的取代基取代； (ix) -S02NXnX12 ’其中xyuXp獨立選自：氣、具 1-20個碳原子（較佳為丨_6個碳原子）之烷基和五員或六員 (C5-C2〇)-芳基或（CVC20)-雜芳基環部分；、 (X)五員或六員（Ci-C2〇)雜芳環部份，五員咬六員 (C5-c2〇)芳基-(Ci-c^)-院基環部分或五員或六員（c^c )难芳-(Q-C6)-烷基環部分（其中雜芳環部份包括一或多個選 -2- 55132-940531.doc 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) I245765 A8 B8 C8 ---------_ 六、申請專利範圍 --一^ 自N，0及S之雜原子），其係未經取代或由一個、雨個或二個獨立選自：具1-20個碳原子（較佳為1-6個碳原子）之烷基、鹵素、三鹵甲基、羧酸根、硝基和酯部份之取代基取代； (xi) 式-CO-H的醛；和 (xii) 式-S〇2-Xn的砜，其中χ13選自包括飽和或不飽和的具1 - 20個碳原子（較佳為^ 6個碳原子）之烷基和五員或六員（c5-c2〇)-芳基或（Cl-C2G) _雜芳基部份； (b) X1係選自包括氮、硫和氧。 2 ·根據申請專利範圍第丨項的方法，其中該絲胺酸/蘇胺酸蛋白質激酶是RAF。 3·根據申請專利範圍第1項的方法，其中該，&，& 和116獨立選自： (i)氫； (11)未經取代或經五員或六員（C5_C2〇)_芳基或（C「C20)_ 雜芳基環部分取代之飽和或不飽和的具1 - 20個碳原子（較佳為1 - 6個碳原子）之烷基，其中該環部份係未經取代或經一個、兩個或三個獨立選自：具1-2〇個碳原子（較佳為 1 - 6個碳原子）之烷基、鹵素、三鹵曱基、羥基、烷氧基、魏酸根、硝基和酯部分的取代基取代；及 (in)五員或六員（C5_C2G) _芳基或（Ci_C2G) _雜芳基環部分’其係未經取代或經一個、兩個或三個獨立選自：具 1 - 20個碳原子（較佳為1 - 6個碳原子）之烷基、鹵素、三鹵甲基、Μ基、烷氧基、羧酸根、硝基和酯部分的取代基 -3 - 55132-940531.doc 本紙張尺度適财_家鲜(CNS) Μ規格(21()χ挪公爱) 1245765

取代。 4·根據申凊專利範圍第3項之方法，其中該Ri和R2獨立選自： (i) 氫；和 (π)苯基，其視需要經選自：具丨_20個碳原子（較佳為1 - 6個碳原子）之烧基、鹵素、三鹵甲基、硝基、叛酸根、經基和烷氧基部分的取代基取代。 5·根據申請專利範圍第4項的方法，其中該&是氮或氧。 6·根據申請專利範圍第5項的方法，其中該&和&取代基共同形成一個選自S.AQAR取代基所組成之群；其中Saqar 取代基係選自下列所組成之群：甲氧基、苯甲胺基、4_ 氟苯甲胺基、2-羧基苯甲胺基、3 -羧基苯甲胺基、4 -羧基苯曱胺基、2 -硝基苯曱胺基、3 -硝基苯甲胺基、4 -硝基苯甲胺基、2 -甲基苯甲胺基、3 -曱基苯甲胺基、4 -曱基苯甲胺基、2-氯苯曱胺基、3-氯苯甲胺基、4_氯苯曱胺基、2 -氟苯甲胺基、3 -氟苯曱胺基、4 -氟苯曱胺基、 2-(二氟曱基）苯曱胺基、3-(三氟i曱基）苯甲胺基、4-(三氟曱基）苯甲胺基、苯乙基-1_胺基、苯胺基、2_羧基苯胺基、3-羧基苯胺基、4-羧基苯胺基、2-硝基苯胺基、 3 -硝基苯胺基、4 -硝基苯胺基、2 -甲基苯胺基、3 _甲基苯胺基、4-甲基苯胺基、2-氯苯胺基、3-氯苯胺基、4-氣苯胺基、2 -氟苯胺基、3 -氣苯胺基、4 -氟苯胺基、2_ (三氟曱基）苯胺基、3-(三氟甲基）苯胺基、4-(三氟甲基）苯胺基、p比咬-2-胺基、说咬-3-胺基、峨。定_4_胺基、和p比 -4- 55132-940531.doc 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) A B c D 1245765 六、申請專利範圍啶-2-曱胺基。 7. 根據申请專利範圍第6項的方法，其中該5 _氮p奎喏p林為主的化合物係選自SAqAR化合物所組成之群，其中saqar 化合物係選自下列所組成之群：甲氧基、苯甲胺基、4 _ 氟苯曱胺基、2-羧基苯甲胺基、3-羧基苯甲胺基、4-羧基笨甲胺基、2-硝基苯甲胺基、3_硝基苯甲胺基、4_硝基苯甲胺基、2 -甲基苯甲胺基、3_甲基苯甲胺基、4_曱基苯甲胺基、2 -氯苯甲胺基、3_氯苯曱胺基、4 -氯苯甲胺基、2 -氟苯甲胺基、3 -氟苯曱胺基、4_氟苯甲胺基、 2-(二氟甲基）苯甲胺基、3-(三氟曱基）苯甲胺基、(三氟甲基）苯甲胺基、苯乙基-；^胺基、苯胺基、2 -羧基苯胺基、3 -羧基苯胺基、4 -羧基苯胺基、2 -硝基苯胺基、 3 -硝基苯胺基、4 -硝基苯胺基、2 -甲基苯胺基、3 -甲基苯胺基、4 -曱基苯胺基、2 -氯苯胺基、3 -氣苯胺基、4_ 氯笨胺基、2 -氟苯胺基、3 -氟苯胺基、4 -氟苯胺基、2_ (二氟曱基）苯胺基、3-(三氟甲基）苯胺基、4_(三氟甲基）苯胺基、吡啶-2-胺基、吡啶胺基、吡啶胺基、和吡啶-2-甲胺基。 8. 根據申请專利範圍第1項之方法，其中該5 _氮喹喏琳為主化合物係選自下列之群組： (A-2J

8 8 8 8 A B c D 1245765 々、申請專利範圍

B - 1 3 -苯基-6 - (4 -氟苯基硫）吡啶并〔2 · 3 - b〕吡口井， B - 2 3-(4 -經苯基）-6-(4 -氣苯基硫）^比σ定弁〔2.3 _ b〕ρ比17井， B - 3 3-(4 -甲氧苯基）-6-(4 -亂苯基硫）？比σ定弁〔2.3 _ b〕口比ρ井， B-4 3-(4 -輕本基）-6-(2-異丙苯基硫）？比σ定弁〔2 · 3 · b〕口比口井， Β-5 3·(4-羥苯基）-6-(3-溴苯基硫）吡啶并〔2.3- b〕口比p井， B-6 3-(4-羥苯基）-6-甲氧吡啶并〔2.3-b〕吡畊， B - 7 3 -笨基· 6 -本基硫咏σ定弁〔2.3 - b〕p比啡’ 55132-940531.doc - 6 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) A8 B8 C8

1245765 3-(4_羥苯基）_6_(2|_噻吩基_2_乙基胺）吡啶并〔2.3 - b 〕 p 比 p井， B'9 3_苯基-6-(2’-吡啶基-2-乙基胺）吡啶并 b〕吡》井， 2·3' B~ 1 0 3 - ( 2 -莕基）-6 -曱氧吡啶并〔2 · 3 - b〕吨p井 B ' 1 1 3-(2 -莕基）-6 -丙基胺p比淀并〔2.3、hi , ◦」吡口井， B- 1 2 3 -苯基-6 - (4 -甲氧苯基硫）p比a定并〔2 7 •〕吡 9· 一種如式（I)結構的5-氮喹喏啉為主化合物··

其中 (a) Ri，R2，R3，R4和R6係獨立選自： ⑴氫； (ii)視需要經五員或六員（CrCw)-芳基環部分，。、 (ci-C2〇)-雜芳基環部分取代的具丨_ 2〇個碳原子（較作為7 6個碳原子）之飽和或不飽和烷基，其中該環部分係未/ 取代或經一個、兩個或三個獨立選自：具U2〇個碳原= (車父佳為1 - 6個碳原子）之院基、鹵素、三！I曱基、羧酸根、硝基和酯部份之取代基取代； 55132-940531 .doc 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) A BCD 1245765 六、申請專利範園 (iii) 一種式NHaX3的胺，其中X2和χ3獨立選自：氫、飽和或不飽和的具1 - 20個碳原子（較佳為1 _ 6個碳原子）之烧基，和五員或六員（Crew -芳基或（c广C2〇) _雜芳基環部份； (iv) 鹵素或三鹵曱基； (v) 式-CO-X4的酮，其中X4選自：氫、具1-2〇個碳原子（較佳為1 - 6個碳原子）之烷基和五員或六員 C2〇)-方基或（C1-C20)-雜芳基部份； (Vi)式-(X5)n-CO〇H 的竣酸或式-(X6)n_C00-X7 的酯，其中X5，Χό和X7獨立選自：具丨-20個碳原子（較佳為 1 - 6個碳原子）之烷基和五員環或六員（C5_C2G) -芳基或π:· Cm)-雜芳基部份，且其中^是〇或1 ; (vii) 式-(Xs)n-〇H的醇或式-(Χ8)η_0_χ9的烷氧基部份，其中Xs和X9獨立選自：氫、飽和或不飽和的具丨_2〇個碳原子（較佳為1 _ 6個碳原子）之烷基，及五員或六員 (C^C^)-芳基或（Ci-C^)-雜芳基環部份，其中該環係未經取代或由一個或多個選自：具丨_ 2〇個碳原子（較佳為i _ 6 個碳原子）之烷基、||素、三鹵甲基、羧酸根、硝基和酉旨的取代基取代，且其中n是〇或丨； (viii) 式-NHCOX10的醯胺，其中χ1〇係選自··具個碳原子（較佳為1 _ 6個碳原子）之烷基、羥基和五員或六員（C^-Cm)-芳基或（c^-C^o)-雜芳基環部分，其中該環係未經取代或由一個或多個獨立選自：具丨_ 20個碳原子（較佳為1 - 6個碳原子）之烷基、齒素、三鹵甲基、羧酸根、確 55132-940531.doc 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公董) 1245765 六、申請專利範圍基或酯的取代基取代； (IX) -S02NXuX12，其中X"和Xi2獨立選自：氫、具 1 - 20個碳原子（較佳為i __ 6個碳原子）之烷基和五員或六員 (C5-C2())-芳基或（Cl_C2G) _雜芳基環部分； (X) 五員或六員（CrC2〇)雜芳環部份，五員或六員 (CrQo)芳基-(Cl_C6)_烷基環部分或五員或六員卜雜方-(CrC6)-烷基環部分（其中雜芳環部份包括一或多個選自Ν，Ο及S之雜原子）其係未經取代或由一個、兩個或三個獨立選自··具丨-20個碳原子（較佳為個碳原子）之烷基、齒素、三鹵甲基、羧酸根、硝基和酯部份之取代基取代； (xi) 式-CO-H的醛；和 (xii) 式-SCVX"的砜，其中Χπ選自包括飽和或不飽和的具1-20個碳原子（較佳為丨_ 6個碳原子）之烷基和五員或六員（CVC^o)-芳基或（Ci-Qo)-雜芳基部份； (b) X!係選自包括氮、硫和氧。 10·根據申請專利範圍第9項的化合物，其中該Ri，R2，， R4和R6獨立選自： ⑴氫； (i〇未經取代或經五員或六員（C5_C2g)·芳基或（c广CM· 雜芳基環部分取代之飽和或不飽和的具1-2〇個碳原子（較佳為1-6個碳原子）之烷基，其中該環部份係未經取代或經一個、兩個或三個獨立選自··具K2〇個碳原子（較佳為 1-6個碳原子）之烷基、鹵素、三鹵甲基、羥基、烧氧 55132-940531.doc -9 - 2

土、羧酸根、硝基和酯部分的取代基取代；及 (111)五員或六員（c5_c2〇) -芳基或（Cl_C2G) -雜芳基環部分，其係未經取代或經一個、兩個或三個獨立選自：具 1 - 20個碳原子（較佳為丨_ 6個碳原子）之烷基、鹵素、三鹵曱基、羥基、烷氧基、羧酸根、硝基和酯部分的取代基取代。 Π·根據申請專利範圍第1〇項的化合物，其中該r3和r4是氫。 U·根據申請專利範圍第η項的化合物，其中該心和心獨立選自： (0 未經取代或經苯基取代的甲基，而該苯基未經取代或經由選自：烷基、函素、羥基和烷氧基部份的基團取代； (ii)未經取代或經選自：烷基、鹵素、羥基和烷氧基部分的取代基取代的苯基。 13·根據申請專利範圍第12項的化合物，其中該心和r2係獨立選自：氫、曱基、苯基和4 -羥基苯基。 14. 根據申請專利範圍第丨2項的化合物，其中該&是氮或氧。 15. 根據申請專利範圍第14項的化合物，其中該1^6和Xi取代基共同形成一個選自SAQAR取代基所組成之群；其中 SAQAR取代基係選自下列所組成之群：甲氧基、苯甲胺基、4 -氟苯曱胺基、2 -魏基苯曱胺基、3 -叛基苯甲胺基、4 -羧基苯甲胺基、2 -硝基苯曱胺基、3 -硝基笨曱胺 55132-940531.doc - 10 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1245765 A8 B8 C8 ___D8 六、申請專利範圍基、4 -硝基苯曱胺基、2 -曱基苯曱胺基、3 -曱基苯甲胺基、4 -甲基苯甲胺基、2 -氯苯甲胺基、3 -氯苯甲胺基、 4 -氣苯甲胺基、2 -氟苯甲胺基、3 -氟苯甲胺基、4 -氟苯甲胺基、2 -(三氟甲基）苯甲胺基、3 _(三氟甲基）苯曱胺基、4-(三氟曱基）苯曱胺基、笨乙基-1β胺基、笨胺基、 2 -羧基苯胺基、3 -羧基苯胺基、4-羧基苯胺基、2-硝基笨胺基、3 -硝基苯胺基、4 -硝基苯胺基、2 _曱基苯胺基、3 -甲基苯胺基、4 -甲基苯胺基、2 -氯苯胺基、3-氯苯胺基、4-氯苯胺基、2-氟笨胺基、3_氟苯胺基、4_氟苯胺基、2-(三氟甲基）苯胺基、3-(三氟甲基）苯胺基、 4 -(二氟曱基）苯胺基、ρ比咬-2-胺基、峨咬胺基、吨啶-4-胺基、和吡啶-2-甲胺基。 16·根據申請專範圍第9項之化合物，其中該％氮啥嗜琳為主化合物係選自下列群組： (Α-2 j

55132-940531.doc -11 -

8 8 8 8 A B c D

1245765 六、申請專利範圍

B- 1 3 -苯基-6 - (4 ·氟苯基硫）吡啶并〔2 · 3 - b〕吡口井， B - 2 3 - ( 4 -羥苯基）-6 - ( 4 -氟苯基硫）吡啶并〔2 · 3 - b〕p比p井， B-3 3-(4-甲氧苯基）-6-(4-氟苯基硫）吡啶并〔2.3- b〕p比畊， B - 4 3 - ( 4 -羥苯基）-6 - (2 -異丙苯基硫）吡啶并〔2.3 - b〕p比畊.， B-5 3-(4-羥苯基）-6-(3-溴苯基硫）吡啶并〔2.3- b〕说p井， B - 6 3 - (4 -羥苯基）-6 -甲氧吡啶并〔2 · 3 - b〕吡畊， B - 7 3 -本基_ 6 -苯基硫外匕σ定弁〔2.3 - b〕p比口井’ B - 8 3-(4-^苯基）-6-(2’-p塞吩基-2 -乙基胺）p比ϋ定弁〔2 · 3 - b〕吡畊， B - 9 3 -苯基-6 - (2 ’ -吡啶基-2 -乙基胺）吡啶并〔2.3 - b〕口比p井， B-10 3-(2-蓁基）-6 -甲氧吡啶并〔2.3-b〕吡畊， B - 1 1 3-(2-奈基）-6 -丙基胺口比σ定弁〔2 · 3 - b〕ρ比喷， 55132-940531.doc - 12 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐)

A BCD I245765 、申请專利範圍及 12 3 -本基- 6- (4 -甲氧苯基硫）p比σ定并〔2 3 b〕口比畊。 17.=種用於預防或治療在生物體中之細胞增殖疾病之醫藥 j合物，其包括根據申請專利範圍第9項至第16項=任、員的5 ·氮p奎嗓琳化合物或其鹽類及生理學上可接為的，劑或稀釋劑，其中該細胞增殖疾病與信號傳導途=失常有關，而該途徑的特性在於絲胺酸/蘇胺酸蛋白質激酶 RAF和天然結合對象之間的交互作用。 18·根據申請專利範圍第17項的醫藥組合物，其中該生物體是哺乳動物。 ^ 19·根據申請專利範圍第17項的醫藥組合物，其中該細胞增殖疾病是選自以下群組：癌症、纖維病變、腎小球疾 =、不正常的血管生成、不正常的脈管生成、傷口癒 δ、牛皮癬、血管再狹窄和炎症。 20·根據申請專利範圍第”項的醫藥組合物，其中該癌症是 =自以下群組·肺癌、卵巢癌、乳癌、腦癌、軸内腦嘈、結腸癌、攝護腺癌、肉瘤、卡波希肉瘤、黑色素畸瘤和神經膠質瘤。 21· 一種合成根據巾請專利範圍第9項化合物的方法，其包括下列步驟： Ο由第種反應物和第二種反應物在溶劑中，於驗存在下反應，其中該第一種反應物是厂胺基氯各硝基咐 55132-940531.doc L_____ _ 13_ 本錄尺度適财酬家標~--~_- 1245765 A A8 Βδ C8

咬’而其中該第二種反應物是一種醇或胺，產生醇化或胺化之2 -胺-6 -氯-3 -氮吼化合物；金屬或金屬衍生物，如雷尼（Rane Ru-Pt02、RuC12、TiCl4、CoCl ⑻由該醇化或胺化之2胺_6_氣_3_氮吡化合物在選自 y)鎳、鉑、p d - c、 2、Zn、Sn、Fe及化合物，如 FeC!3之群組之催化劑和選自氫或含氣 L1B Η 4、N a B Η 4及聯胺之還原劑存在下，與第三種反應物反應以得到如申請專利範圍第9項之化合物產物，其中該第三種反應物是一種1，2·二_ ;並且 (c)純化該申請專利範圍第9項的化合物。 22.根據申請專利範圍第21項的方法，其中該第二種反應物係選自由SAQAR反應物所組成之群；其中SAqAR反應物係選自下列所組成之群：甲氧基、苯甲胺基、氟苯甲胺基、2 -羧基苯甲胺基、3 -羧基苯甲胺基、4_羧基苯甲胺基、2 -硝基苯甲胺基、3 _硝基苯曱胺基、[硝基苯曱胺基、2 -曱基苯甲胺基、3_曱基苯甲胺基、4_曱基苯曱胺基、2 -氯苯甲胺基、3 -氯苯甲胺基、4 -氣苯甲胺基、 2-氟苯甲胺基、3-氟苯曱胺基、4_氟苯甲胺基、2气三氟甲基）苯曱胺基、3-(三氟甲基）苯甲胺基、(三氟甲基）苯曱胺基、苯乙基-1-胺基、苯胺基、2_羧基苯胺基、3_ 魏基苯胺基、4 -羧基苯胺基、2 -硝基苯胺基、3 -硝基苯胺基、4 -硝基苯胺基、2 -甲基苯胺基、3 -甲基苯胺基、 4-甲基苯胺基、2-氯苯胺基、3-氯苯胺基、4-氯苯胺基、2 -氟苯胺基、3 -氟苯胺基、4 -氟苯胺基、2-(三氟甲 -14 - 55132-940531.doc 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐)

土）本月女基、3-(三簸甲其、楚g—且一基、峨咬2 ^ )本私基、Μ三氟甲基）笨胺疋·2-月女基、吡啶胺基、咐〇定 2-甲胺基。 < 4 ^ 定， 23· = :請4專利;圍第21項的方法，其中該第三種反應物其·-經基笨基乙二醛’卜苯基]，2_丙二 ” 本基乙二醛。 1 一申請專利範圍第21項的方法，其中該還原劑是氫。 1據申料利範„21項的方法，μ該催化劑是阪來螺（Raney-nickel)。沉-種以結構式⑴表示之5_氮心若淋為主化合物的用途， ’、係用於製備預防或治療哺乳動⑯中細胞增冑疾病之藥物， ’、

其中R3和I為氫，Ri*R2係獨立選自以下基團：氫、甲基、苯基和4-羥基苯基，及R6*Xi取代基一起為一選自以下之基團：甲氧基、苄基胺基、2-羧基芊基胺基、 3 -备：基苄基胺基、4 -幾基苄基胺基、2 -硝基苄基胺基、 3-硝基苄基胺基、4-硝基芊基胺基、2_甲基苄基胺基、 3-甲基芊基胺基、4-甲基苄基胺基、2-氯苄基胺基、3_ 氯爷基胺基、4-氯芊基胺基、2_氟芊基胺基、3-氟苄基胺基、4-氟苄基胺基、2-(三氟甲基）芊基胺基、3_(三氟 -15- 55132-940531.doc 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1245765 A8 B8 C8 D8 申請專利範圍甲基）爷基胺基、4-(三氟甲基）苄基胺基、苯乙基-胺基、苯基胺基、2 -羧基苯基胺基、3 _羧基苯基胺基、4 _ 羧基苯基胺基、2 -硝基苯基胺基、3 _硝基苯基胺基、4 _ 硝基苯基胺基、2 -甲基苯基胺基、3_甲基苯基胺基、[ 甲基苯基胺基、2-氯苯基胺基、3_氯苯基胺基、[氯苯基胺基、2 -氟苯基胺基、3 -氟苯基胺基、4_氟苯基胺基、2-(三氟甲基）苯基胺基、3_(三氟甲基）苯基胺基、 4 -(二氟甲基）苯基胺基、ρ比啶-2 -胺基、批淀-3 -胺基、口比呢-4 _胺基和吡啶—2 -甲胺基，其中該細胞增殖疾病與 k號傳導途控失常有關，而該途徑的特性在於絲胺酸/蘇胺酸蛋白激酶R A F和天然結合對象間的交互作用。 27.根據申請專利範圍第2 6項的用途，其中該細胞增殖疾病係選自以下群組：癌症、纖維病變、腎小球疾病、不正常的血管生成、不正常的脈管生成、傷口癒合、牛皮癬、血管再狹窄和炎症。 28·根據申睛專利範圍第2 7項的用途，其中該癌症係選自以下群組：肺癌、卵巢癌、乳癌、腦癌、軸内腦癌、結腸癌攝5蔓腺癌、肉瘤、卡波希（K a p o s i)肉瘤、黑色素畸瘤和神經膠質瘤。 55132-940531 .doc _ 16 本紙張尺度適财® s家^準(CNS) A4規格(21G X 297公釐)