CZ298775B6 - Způsob in vitro modulace funkce serin/threonin protein kinázy, sloučeniny na bázi 5-azachinoxalinu, způsob jejich výroby a farmaceutické kompozice - Google Patents

Abstract

Způsob in vitro identifikace sloučenin, které modulují funkci serin/threonin protein kinázy zahrnující následující stupně: a) kontaktování buněk exprimujících tuto serin/threonin protein kinázu se sloučeninou na bázi 5-azachinoxalinu a b) monitorování účinku na takto zpracované buňky. Sloučeniny na bázi 5-azachinoxalinu obecného vzorce I, kde obecné symboly mají význam uvedený v popisu. Způsob jejich výroby zahrnující následující stupně: a) reakci prvního reaktantu s druhým reaktantem v rozpouštědle a za přítomnosti zásady, kde prvním reaktantemje 2-amino-6-chloro-3-nitropyridin a druhým reaktantem je alkohol nebo amin, za vzniku prvního meziproduktu; b) reakci prvního meziproduktu s třetím reaktantem za přítomnosti katalyzátoru a redukčního činidla, kde třetím reaktantem je 1,2-dion; a c) purifikaci výsledné sloučeniny. Farmaceutická kompozice s jejich obsahem. Sloučeniny obecného vzorce I se hodí pro léčení abnormálních stavů tvořených rakovinou a fibrotickými poruchami a abnormálních stavů spojenýchs aberací v dráze signální transdukce charakterizované interakcí mezi serin/threonin protein kinázou a přirozeným vazebným partnerem.

Description

Způsob in vitro modulace funkce serin/threonin protein kinázy, sloučeniny na bázi 5-azachinoxalinu, způsob jejich výroby a farmaceutické kompozice

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu in vitro modulace funkce serin/threonin protein kinázy, sloučenin na bázi 5-azachinoxalinu, způsobu jejich výroby a farmaceutických kompozic na jejich bázi.

Dosavadní stav techniky

Dosavadní stav techniky, který je dále popsán není v žádném ohledu na újmu novosti a inventivnosti řešení podle vynálezu a je uveden pouze pro bližší porozumění vynálezu. Trans15 dukce buněčného signálu je základní mechanismus, jehož prostřednictvím jsou externí stimuly regulující rozličné buněčné procesy přenášeny do nitra buněk. Jeden z klíčových biochemických mechanizmů signálové transdukce zahrnuje reverzibilní fosforylaci proteinů, která reguluje aktivitu vyzrálých bílkovin změnou jejich struktury a funkce.

Nejlépe charakterizované protein kinázy u eukaryot fosforylují bílkoviny na alkoholové skupině serinových, threoninových a tyrosinových reziduí. Tyto kinázy se rozpadají do dvou skupin, do skupiny kináz specifických pro fosforylaci šeřinu a threoninu a do skupiny kináz specifických pro fosforylaci tyrosinu. Některé kinázy mají tzv. „duální specifitu“, což znamená, že jsou schopny fosforylovat rezidua tyrosinu stejně tak jako serinu/threoninu.

Protein kinázy mohou být také charakterizovány jejich umístěním v buňce. Některé kinázy jsou transmembránové receptorové bílkoviny schopné vázat ligandy vně buněčné membrány. Navázání ligandů narušuje kinázovou katalytickou aktivitu receptorové bílkoviny. Jiné kinázy jsou nereceptorové bílkoviny postrádající transmembránovou doménu. Ne-receptorové proteinové kinázy se nacházejí v celé řadě buněčných částí, od vnitřního povrchu buněčné membrány až k jádru.

Mnoho kináz hraje roli v regulačních kaskádách, kde jejich substráty mohou zahrnovat jiné kinázy, jejichž aktivity jsou regulovány jejich stavem fosforylace. Nakonec je efektorová aktivita modulována fosforylaci rezultující z aktivace celé metabolické dráhy.

Rodina serin/threonin protein kináz zahrnuje kinázy regulující mnoho kroků v signálních kaskádách, včetně kaskád kontrolujících buněčný růst, migraci, diferenciaci, genovou expresi, kontrakci svalů, metabolismus glukózy, syntézu buněčných proteinů a regulaci buněčného cyklu.

Příkladem non-receptorové protein kinázy, která fosforyluje cílové bílkoviny na reziduích šeřinu a threoninu, je RAF. RAF moduluje katalytickou aktivitu dalších protein kináz, jako je například protein kináza, která fosforyluje a tím aktivuje mitogenem aktivovanou protein kinázu (MAPK). RAF sama o sobě je aktivována v membráně ukotveným proteinem RAS, který je sám aktivován ligandem aktivovanou tyrosin receptorovou protein kinázou, jako je například receptor pro epidermální růstový faktor (EGFR) a receptor pro růstový faktor derivovaný z krevních destiček (PDGFR). Biologická významnost kinázy RAF je zdůrazněna faktem, že pozměněné formy kinázy RAF mohou způsobit rozvoj rakoviny. Důkazem poukazujícím na důležitost kinázy RAF u malignit je práce autorů Monia et al., 1996, Nátuře Medicine 2:668, která je tímto v celém svém rozsahu včetně všech obrázků a tabulek začleněna do předkládaného vynálezu jako reference.

Ve snaze objevit nové terapeutické postupy pro léčbu nádorových a jiných onemocnění biomedicínští chemici a výzkumní pracovníci navrhli, syntetizovali a testovali molekuly, které inhibují

-1 CZ 298775 B6 funkci protein kináz. Některé malé organické molekuly vytvářejí třídu sloučenin, které modulují funkci protein kináz.

Byly popsány příklady molekul, které inhibují funkci protein kináz. Jedná se o bis monocyklické, bicyklické nebo heterocyklické arylové sloučeniny (PCT WO 92/20 642), deriváty vinylen-azaindolu (PCT WO 94/14 808), l-cyklopropyl-4-pyridyl-chinolony (patent US 5 330 992), styrylové sloučeniny (Levitzki et al., US patent 5 217 999, nazvaný „Styrylové sloučeniny, které inhibují EGF receptorovou protein tyrosin kinázu“, Lyon a Lyon spis 208/050), styrylem substituované pyridylové sloučeniny (patent US 5 302 606), určité chinazolinové deriváty (přihláška EP č. ío 0 566 266 Al), selenoindoly a selenidy (PCT WO 94/03 427), tricyklické polyhydroxylové sloučeniny (PCT WO 92/21 660) a sloučeniny na bázi benzylfosfonové kyseliny (PCT

WO 91/15 495).

Sloučeniny, které mohou překonat buněčnou membránu a jsou rezistentní vůči kyselé hydrolýze jsou potencionálně výhodnými terapeutiky pro svoji biodostupnost po perorálním podání pacientům. Avšak mnoho z těchto inhibitorů protein kináz inhibuje pouze slabě jejich funkci. Navíc mnoho z nich inhibuje celou řadu protein kináz a způsobuje proto významné vedlejší účinky při terapeutickém použití.

Navzdory významnému pokroku, kterého bylo dosaženo ve vývoji sloučenin určených k léčbě nádorových onemocnění, trvá stále potřeba identifikovat molekuly a substituční varianty, které by mohly tvořit sloučeniny schopné modulace funkce konkrétních protein kináz.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je v základním provedení způsob in vitro identifikace sloučenin, které modulují funkci serin/threonin protein kinázy, jehož podstata spočívá v tom, že zahrnuje následující stupně:

a) kontaktování buněk exprimujících tuto serin/threonin protein kinázu se sloučeninou na bázi 5-azachinoxalinu a

b) monitorování účinku na takto zpracované buňky.

Účinkem přitom může být změna nebo absence změny buněčného fenotypu, jako změna nebo absence změny buněčné proliferace, změna nebo absence změny katalytické aktivity serin/threonin protein kinázy nebo změna nebo absence změny interakce mezi serin/threonin protein kinázou a přirozeným vazebným partnerem.

Způsob podle základního provedení s výhodou zahrnuje následující kroky:

a) lýzu buněk za účelem získání lyzátu obsahujícího serin/threonin protein kinázu;

b) adsorpcí serin/threonin protein kinázy na protilátku;

c) inkubaci adsorbované serin/threonin protein kinázy se substrátem nebo substráty; a

d) adsorpcí substrátu nebo substrátů na pevný nosič nebo protilátku, přičemž krok monitorování účinku na buňky zahrnuje měření koncentrace fosfátu v substrátu nebo substrátech.

-2CZ 298775 B6

Serin/threonin protein kinázou je přednostně RAF a přednostní způsob potom zahrnuje následující kroky:

a) lýzu buněk pro získání lyzátu obsahujícího RAF;

b) adsorpci RAF na protilátku;

c) inkubaci adsorbované RAF s MEK a MAPK; a

d) adsorpci MEK a MAPK na pevný nosič nebo protilátku či protilátky, přičemž krok monitorování účinku na buňky zahrnuje měření koncentrace fosfátu v MEK a MAPK.

Předmětem vynálezu je dále také sloučenina na bázi 5-azachinoxalinu obecného vzorce I

(I) /

kde

Ri, R₂ a Ré jsou nezávisle vybrány ze skupiny tvořené (i) vodíkem;

(ii) nasyceným nebo nenasyceným alkylem popřípadě substituovaným pěti- nebo šestičlenným arylovým nebo heteroarylovým cyklickým zbytkem, přičemž tento cyklický zbytek je popří25 pádě substituovaný jedním, dvěma nebo třemi substituenty nezávisle vybranými ze skupiny tvořené alkylem, halogenem, trihalogenmethylem, karboxylátem, nitroskupinou a esterovou skupinou;

(iii) aminem vzorce NX₂X₃, kde X₂ a X₃ jsou nezávisle vybrány ze skupiny tvořené vodíkem, nasyceným nebo nenasyceným alkylem a pěti- nebo šestičlenným arylovým nebo heteroaiylovým cyklickým zbytkem;

(iv) halogenem nebo trihalogenmethylovou skupinou;

(v) ketonem vzorce -CO-X4, kde X₄ je vybrán ze skupiny tvořené vodíkem, alkylem a pěti— nebo šestičlenným arylovým nebo heteroarylovým zbytkem;

(vi) karboxylovou kyselinou vzorce -(X₅)_n-COOH, nebo esterem vzorce -(X₆)_n-COO-X₇, kde X₅, X₆ a X₇ jsou nezávisle vybrány ze skupiny tvořené alkylem a pěti- nebo šesti- členným arylovým nebo heteroarylovým zbytkem, a n je 0 nebo 1;

(vii) alkoholem vzorce -(X₈)_n-OH, nebo alkoxyskupinou vzorce -(X₈)_n-O-X₉, kde X₈ a X₉ jsou nezávisle vybrány ze skupiny tvořené vodíkem, nasyceným nebo nenasyceným alkylem a pěti- nebo šestičlenným arylovým nebo heteroarylovým cyklickým zbytkem, přičemž cyklický zbytek je popřípadě substituovaný jedním nebo více substituenty nezávisle vybranými ze skupiny tvořené alkylem, halogenem, trihalogenmethylem, karboxylátem, nitroskupinou a esterovou skupinou a n je 0 nebo 1;

-3CZ 298775 B6 (viii) amidem vzorce -NHCOXio, kde Xj₀ je vybrán ze skupiny tvořené alkylem, hydroxylem a pěti- nebo šestičlenným arylovým nebo heteroarylovým cyklickým zbytkem, kde cyklický zbytek je popřípadě substituovaný jedním nebo dvěma substituenty nezávisle vybranými ze skupiny tvořené alkylem, halogenem, trihalogenmethylem, karboxylátem, nitroskupinou a esterovou skupinou;

(ix) -SO₂NXhXi2, kde Xn a X_J2 jsou nezávisle vybrány ze skupiny tvořené vodíkem, alkylem a pěti- nebo šestičlenným arylovým nebo heteroarylovým cyklickým zbytkem;

(x) pěti- nebo šestičlenným arylovým nebo heteroarylovým cyklickým zbytkem popřípadě substituovaným jedním, dvěma nebo třemi substituenty nezávisle vybranými ze skupiny tvořené alkylem, halogenem, trihalogenmethylem, karboxylátem, nitroskupinou a esterovou skupinou;

(xi) aldehydem vzorce -CO-H; a (xii) sulfonem vzorce -SO₂Xi3, kde X_]3 je vybrán ze skupiny tvořené nasyceným nebo nenasyceným alkylem a pěti- nebo šestičlenným arylovým nebo heteroarylovým cyklickým zbytkem;

R₃ a R4 jsou nezávisle vybrány ze souboru tvořeného vodíkem a nasyceným nebo nenasyceným alkylem; a

Xi je nezávisle vybrán ze souboru tvořeného skupinou NH, sírou a kyslíkem;

pro použití jako léčivo.

Přednostní sloučeninou na bázi 5-azachinoxalinu obecného vzorce I pro použití jako léčivo je sloučenina, kde

R], R₂ a Ró jsou nezávisle vybrány ze skupiny tvořené (i) vodíkem;

(ii) nasyceným nebo nenasyceným alkylem popřípadě substituovaným pěti- nebo šestičlenným arylovým nebo heteroaiylovým cyklickým zbytkem, kde cyklický zbytek je popřípadě substituovaný jedním, dvěma nebo třemi substituenty nezávisle vybranými ze skupiny tvořené alkylem, halogenem, trihalogenmethylem, hydroxyskupinou, alkoxyskupinou, karboxylátem, nitroskupinou a esterovou skupinou; a (iii) pěti- nebo šestičlenným arylovým nebo heteroarylovým cyklickým zbytkem popřípadě substituovaným jedním, dvěma nebo třemi substituenty nezávisle vybranými ze skupiny tvořené alkylem, halogenem, trihalogenmethylem, hydroxyskupinou, alkoxyskupinou, karboxylátem, nitroskupinou a esterovou skupinou; a

R₃ a R4 jsou nezávisle vybrány ze souboru tvořeného vodíkem a nasyceným nebo nenasyceným alkylem.

Ve sloučenin obecného vzorce I jsou R| a R₂ přednostně nezávisle vybrány ze skupiny tvořené (i) methylem popřípadě substituovaným fenylem, kteiý je popřípadě substituovaný substituenty nezávisle vybranými ze skupiny tvořené alkylem, halogenem, hydroxyskupinou a alkoxyskupinou; a (ii) fenylem popřípadě substituovaným substituenty nezávisle vybranými ze skupiny tvořené alkylem, halogenem, hydroxyskupinou a alkoxyskupinou;

-4CZ 298775 B6 a Xi je zvláště výhodně skupina NH nebo kyslík.

Zbytek RňXi může být přitom přednostně vybrán ze souboru sestávajícího ze substituentů uvede 5 ných v následující tabulce

RsXr

Fenylamino

Benzylamino

Metoxy

Metoxy

4 -fluorbenzyl amino

4 - íluorbenzy lamino

fenyiamino

2-karboxybenzylamino

3-karboxybenzylamino

4-karboxybenzylamino

2-nitrobenzylamino

3-nitrobenzylamino

4-nitrobenzylamino

2-metylbenzylamino

3-me tylbenzylami.no

4-metylbenzylamino

2—chlorbenzylamino

3-chlorbenzylamino

4-chlorbenzylamino

2- íluorbenzy 1 amino

3- fluorbenzyl amino

4-fluorbenzylamino

2- (trifluormetyl)benzylamino

-5 CZ 298775 B6

R8X!

3- (trifluormetyl)benzylamino

4- (triíluormetyl)benzylamino

Fenetyl-i-amino

2-karboxyfenylamino

3-karboxyfenylamino

4-karboxyfenylamino

2-nit rofenylartd.no

3-nitrofenylamino

4-r.it rof enylamino

2-met y1f eny1amino

3-metylfenylamino

4-mety1fsny1 amino

2-chlorfenylamino

3-chlorfenylamino

4-chlorfenylamino

2-fluor f enyl amino

3-fluor f enyl amino

4 -fluor fenyl amino

2- (trifluormetyl)fenylamino

3- (trifluormetyl)- fenylamino

4- (trifluormetyl)fenylamino

Pyrid-2-amino

Pyríd-3-amino

?yrid-4-amino

Pyríd-2-metylamino

2-karboxybenzyl amino

3-karboxybenzylamino

4-karboxybenzylamino

2-nitrobenzylamino

3-ní t roben zy1amino

4-nitrobenzylamino

2-metylbenzylamin.c

-6CZ 298775 B6

ReXi

3-metylbehzylamino

4-metylbenzylamino

2-chlorbenzylamino

3-chlorbenzylamino

4-chlorbenzylamino

2 -fluorben zy 1 am i no

3 -fluorbenzylamino

4 -fluorbenzylamino

2- (trifluormetyl)benzylamino

3- (trifluormetyl)benzylamino

4- (tr ifluorme tyl )benzylamino

Fenetyl-l-amino

2-karboxyfenylamino

3-karboxyfenylamino

4-karboxyfenylamino

2-nitrofenylamino

3-nitrofenylamino

4-nitrofenylamino

2-metylfenylamino

3-metylfenylamino

4-mstylfenylamino

2-chlorfenylamino

3-chlorfenylamino

4-chlorfenylamino

2-fluor fenyl amino

3-fluor f enyl amino

4-fluor f enyl amino

2 - (tr ifluorme ty 1 )fenyl amino

3- (tr ifluorme tyl )fenylamino

4- (trifluormetyl)fenyl amino

Pyrid-2-amino

Pyrid-3-amino

R₆X_x

Pyrid-4-amino

Pyrid-2-metylamino

Fenylaiuino

Zvláště výhodnou sloučeninou na bázi 5-azachinoxalinu obecného vzorce I pro použití jako léčivo je sloučenina vybraná ze sloučenin obecného vzorce I A-l až A-90, jejichž substituenty jsou definovány v následující tabulce

Sloučenina č.	r2	Ri	R6Xi
A-l	H	4-hydroxyfenyl	Fenylamino
A-2	H	4-hydroxyfenyl	Benzylamino
A-3	Metyl	Fenyl	Metoxy
A-4	Fenyl	Fenyl	Metoxy
A-5	Metyl	Fenyl	4 -fluorbenzylamino
A-6	Fenyl	Fenyl	4 -fluorbenzylamino
A-7	H	Fenyl	fenylamino
A-8	H	4-hydroxyfenyl	2-karboxybenzylamino
A-9	H	4-hydroxyfenyl	3-karboxybenzylamino
A-10	H	4-hydroxyfenyl	4-karboxybenzylamino
A-ll	H	4-hydroxyfenyl	2-nitrobenzylamino
A-12	H	4-hydroxyfenyl	3-nitrobenzylamino
A-13	H	4-hydroxyf enyl	4-nitrobenzylamino
A-14	H	4-hydroxyfenyl	2-metylbenzylamino
A-15	H	4-hydroxyfenyl	3-metylbenzylamino
A-16	H	4-hydroxyfenyl	4-metylbenzylamino
A-17	H	4-hydroxyfenyl	2-chlorbenzylamino
A-18	H	4-hydroxyfenyl	3-chlorbenzylamino
A-l 9	H	4-hydroxyfenyl	4-chlorbenzylamino
A-20	H	4-hydroxyfenyl	2-fluorbenzylamino
A-21	H	4-hydroxyfenyl	3-fluorbenzylamino
A-22	H	4-hydroxyfenyl	4 -fluorbenzylamino
A-2 3 - — 1	H	4-hydroxyfenyl	2- (trifluormetyl)- benzylamíno

-8CZ 298775 B6

Sloučenina č.	r2	Ri	R«Xi
A-2 4	H	4-hydroxyfenyl	3-(trifluormetylibelky lamino
A-2 5	H	4-hydroxyfenyl	4- (trifluormetyl)benzylamino
A-2 6	H	4-hydroxyfenyl	Fenetyl-l-amino
A-27	H	4-hydroxyfenyl	2-karboxyfenylamino
A-2S	H	4-hydroxyfenyl	3-karboxyfenylamino
A-29	H	4-hydroxyfenyl	4-karboxyfenylamino
A-30	H	4-hydroxyfenyl	2 -nitrof enylamino
A-31	H	4-hydroxyfenyl	3-nítrofenylamino
A-32	H	4-hydroxyfenyl	4-nitrofenylamino
A-33	H	4-hydroxyfenyl	2-metylfenylamino
A-34	K	4-hydroxyfenyl	3-metylfenyl amino
A-35	H	4-hydroxyfenyl	4-me tylfenylamino
Á-36	H	4-hydroxyfenyl	2-chlorfenylamino
A-37	H	4-hydroxyfenyl	3-chlorfenylamino
A-38	H	4-hydroxyfenyl	4-chlorfenylamino
A-39	H	4-hydroxyfenyl	2-fluorf enylamino
A-40	H	4-hydroxyfenyl	3 - fluor fenyl amino
A-41	H	4-hydroxyfenyl	4-fluor feny lamí no
A-42	H	4-hydroxyfenyl	2- (trifluormetyl)fenylamino
A-43	H	4-hydroxyfenyl	3- (trifluormetyl)fenylamino
A-44	H	4-hydroxyfenyl	4- (triíluormetyl)fenylamino
A-45	H	4-hydroxyfenyl	Pyrid-2-amino
A-46	H	4-hydroxyfenyl	Pyrid-3-amino
A-47	H	4-hydroxyfenyl	Pyrid-4-amino
A-48	H	4-hydroxyfenyl	Pyrid-2-metylamino
A-49	. H	Fenyl	2-karboxybenzylamino
A-50	H	Fenyl	3-karboxybenzylamino
A-51	H	Fenyl	4-ka rboxybenzy1 amino
A-52	H	Fenyl	2-nitrobenzylamino
A-5 3	H	Fenyl	3-nitrobenzylamino
A-54	H	Fenyl	4-nitrobenzylamino
A-55	H	Fenyl	2-metylbenzylamin.o

-9CZ 298775 B6

Sloučenina č.	r2	Ri	R6Xi
A-56	H	Fenyl	3-metylbenzylamino
A-57	H	Fenyl	4-metylbenzylamino
A-58	H	Fenyl	2-chlorbenzylamino
A-59	H	Fenyl	3-chlorbenzylamino
A-60	H	Fenyl	4-chlorbenzylamino
A-61	H	Fenyl	2-fluorbenzy lamino
A-62	H	Fenyl	3-fl.uorbenzylamino
A-63	H	Fenyl	4-fluorbenzylamino
A-64	H	Fenyl	2- {trífluormetyl)benzylamino
A-65	H	Fenyl	3- (trífluormetyl )benzylanu.no
A-66	H	Fenyl	4- (trífluormetyl)benzylamino
A-67	H	Fenyl	Fenety 1-1 - axnino
A-68	H	Fenyl	2-karboxyfenyl amino
A-69	H	Fenyl	3-karboxyfenylamino
A-70	H	Fenyl	4-karboxyfenylamino
A-71	H	Fenyl	2-nitrofenylamino
A-72	H	Fenyl	3-nitrofenylamino
A-73	H	Fenyl	4-nitrofenylanu.no
A-7 4	H	Fenyl	2-metylfenylamino
A-75	H	Fenyl	3-metylfenylamino
A-7 6	H	Fenyl	4-metylfenylamino
A-77	H	Fenyl	2-chlorfenylamino
A-78	H	Fenyl	3-chlorfenylamino
A-79	H	Fenyl	4-chlorfenylamino
A-80	H	Fenyl	2-fluorfenylamino
A-81	H	Fenyl	3-fluorfenylamino
A-82	K	Fenyl	4 -fluorf enylamino
A-8 3	H	Fenyl	2- (trífluormetyl)fenylamino
A-84	H	Fenyl	3 - (t r ifluorme tyl )— fenylamino
A-8 5	H	Fenyl	4 - (trífluormetyl )fenylamino
A-86	H	Fenyl	Pyrid-2-amino
A-87	H	Fenyl	Pyrid-3-amino

- 10CZ 298775 B6

Sloučenina č.	r2	Ri	R«Xi
A-88	H	Fenyl	Pyrid-4-amino
A-3 9	H	Fenyl	Pyrid-2-metylamino
A-90	H	4 -metoxy fenyl	Fenylamino

Výše uvedené sloučeniny se podle vynálezu hodí pro použití jako léčivo pro léčení savců, zejména pro léčení abnormálních stavů tvořených rakovinou a fíbrotickými poruchami, přičemž abnormálním stavem je zejména nádorové onemocnění ze skupiny tvořené plicními nádory, nádory vaječníků, nádory prsu, nádory mozku, intraaxiálními mozkovými nádory, nádory tlustého střeva, nádory prostaty, sarkomy, Kaposiho sarkomy, melanomy a gliomy.

Abnormální stav může být také je spojen s aberací v dráze signální transdukce charakterizované interakcí mezi serin/threonin protein kinázou, jako RAF a přirozeným vazebným partnerem.

Předmětem vynálezu je dále, sloučenina na bázi 5-azachinoxalinu obecného vzorce Γ, jako taková,

kde

Ri představuje fenylskupinu, která je popřípadě substituována hydroxyskupinou nebo alkoxyskupinou s 1 až 6 atomy uhlíku;

R₂ představuje atom vodíku, alkylskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku nebo fenylskupinu;

R_(l představuje alkylskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku nebo fenyl-(Co-C4)alkylskupinu, popřípadě substituovanou halogenem, karboxyskupinou, nitroskupinou, alkylskupinou s 1 až 6 atomy uhlíku nebo trifluormethylskupinou, nebo pyridylskupinu; a

X] představuje skupinu NH, kyslík nebo síru.

Přitom ve sloučenině na bázi 5-azachinoxalinu obecného vzorce Γ přednostně Ri představuje fenylskupinu nebo 4-hydroxyfenylskupinu a R₂ představuje fenylskupinu, methylskupinu nebo atom vodíku. Navíc s výhodou Xj představuje skupinu NH.

V dalším výhodném provedení sloučenin obecného vzorce Γ substituenty R_f, a X| tvoří dohromady zbytek vybraný ze skupiny sestávající z methoxy, benzylamino, 4-fluorbenzylamino, 2karboxybenzylamino, 3-karboxybenzylamino, 4-karboxybenzylamino, 2-nitrobenzylamino, 3nitrobenzylamino, 4-nitrobenzylamino, 2-methylbenzylamino, 3-methylbenzylamino, 4-methyl35 benzylamino, 2-chlorbenzylamino, 3-chlorbenzylamino, 4-chlorbenzylamino, 2-fluorbenzylamino, 3-fluorbenzylamino, 4-fluorbenzylamino, 2-(trifluormethyl)benzylamino, 3-(trifluormethyl)benzylamino, 4-(trifluormethyl)benzylamino, fenethyl-l-amino, fenylamino, 2-karboxyfenylamino, 3-karboxyfenylamino, 4-karboxyfenylamino, 2-nitrofenylamino, 3-nitrofenylamino, 4-nitrofenylamino, 2-methylfenylamino, 3-methylfenylamino, 4-methylfenylamino, 240 chlorfenylamino, 3-chlorfenylamino, 4-chlorfenylamino, 2-fluorfenylamino, 3-fluorfenylamino, 4-fluorfenylamino, 2-(trifluormethyl)fenylamino, 3-(trifluormethyl)fenylamino, 4-(trifluormethyl)fenylamino, pyrid-2-amino, pyrid-3-amino, pyrid-4-amino a pyrid-2-methylamino.

- 11 CZ 298775 B6

Nejvýhodněji se pak jedná o sloučeniny A-1 až A-90 definované výše.

Předmětem vynálezu je dále také farmaceutická kompozice, která obsahuje 5-azachinoxalinovou sloučeninu obecného vzorce I definovanou výše nebo její sůl a fyziologicky přijatelný nosič nebo ředidlo.

Konečně je předmětem vynálezu také způsob výroby sloučeniny na bázi 5-azachinoxalinu obecného vzorce Γ definované výše, který zahrnuje následující stupně:

a) reakci prvního reaktantu s druhým reaktantem v rozpouštědle a za přítomnosti zásady, kde prvním reaktantem je 2-amino-6-chloro-3-nitropyridin a druhým reaktantem je alkohol nebo amin, za vzniku prvního meziproduktu;

b) reakci prvního meziproduktu s třetím reaktantem za přítomnosti katalyzátoru a redukčního činidla, kde třetím reaktantem je 1,2-dion; a

c) purifikaci výsledné sloučeniny.

Ve výhodném provedení je druhý reaktant vybrán ze sloučenin obsahujících SAQAR substituenty zvolené ze souboru sestávajícího z methoxy, benzylamino, 2-karboxybenzylamino, 3-karboxybenzylamino, 4-karboxybenzylamino, 2-nitrobenzylamino, 3-nitrobenzylamino, 4-nitrobenzylamino, 2-methylbenzylamino, 3-methylbenzylamino, 4-methylbenzylamino, 2-chlorbenzylamino, 3-chlorbenzylamino, 4-chlorbenzylamino, 2-fluorbenzylamino, 3-fluor25 benzylamino, 4-fluorbenzylamino, 2-(trifluormethyl)benzylamino, 3-(trifluormethyl)benzylamino, 4-(trifluormethyl)benzylamino, fenethyl-1-amino, fenylamino, 2-karboxyfenylamino, 3karboxyfenylamino, 4-karboxyfenylamino, 2-nitrofenylamino, 3-nitrofenylamino, 4-nitrofenylamino, 2-methylfenylamino, 3-methylfenylamino, 4-methylfenylamino, 2-chlorfenylamino, 3chlorfenylamino, 4-chlorfenylamino, 2-fluorfenylamino, 3-fluorfenylamino, 4-fluorfenylamino,

2-(trifluormethyl)fenylamino, 3-(trifluormethyl)fenylamino, 4-(trifluormethyl)fenylamino, pyrid-2-amino, pyrid-3-amino, pyrid-4-amino a pyrid-2-methylamino.

V jiném výhodném provedení je třetí reaktant je vybrán ze skupiny tvořené 4-hydroxyfenylglyoxalem, l-fenyl-l,2-propandionem a benzylem.

Jako redukčního činidla se přednostně používá vodíku a jako katalyzátoru Raneyova niklu.

Část předkládaného vynálezu je zaměřena na metody modulace funkce serin/threonin protein kináz pomocí sloučenin na bázi 5-azachinoxalinu. Metody zahrnují buňky, které exprimují serin/threonin protein kinázu, jako je například RAF. Vynález navíc popisuje metody prevence a léčby abnormálních stavů se vztahem k serin/threonin protein kinázám pomocí sloučeniny identifikované v předkládaném vynálezu. Vynález se dále týká farmaceutických preparátů obsahujících sloučeniny identifikované pomocí metod předkládaného vynálezu.

I. Metody detekce sloučenin, které modulují funkci serin/threonin protein kinázy

Metody předkládaného vynálezu představují prostředek pro modulaci funkce jak receptorových, tak i cytosolických serin/threonin protein kináz. Tyto metody představují prostředek pro modulaci enzymů za podmínek in vitro i in vivo. Pro in vitro podání se metody předkládaného vyná50 lezu týkají částečně metody identifikace sloučenin, které modulují funkci serin/threonin kináz.

Z tohoto důvodu vynález zaprvé uvádí metodu modulace funkce serin/threonin protein kinázy pomocí 5-azachinoxalinové sloučeniny. 5-azachinoxalinová sloučenina je volitelně substituovaná organickými skupinami. Metoda je tvořena kontaktem buněk exprimujících serin/threonin pro55 tein kinázu se sloučeninou, který je předmětem předkládaného vynálezu.

- 12CZ 298775 B6

Termín „funkce“ se týká buněčné role serin/threonin protein kinázy. Rodina serin/threonin protein kináz zahrnuje kinázy, které regulují mnoho kroků v signálních kaskádách, včetně kaskád kontrolujících buněčný růst, migraci, diferenciaci, genovou expresi, kontrakci svalů, metabolis5 mus glukózy, syntézu buněčných proteinů a regulaci buněčného cyklu.

Termín „moduluje“ se týká schopnosti sloučeniny narušit funkci protein kinázy. Modulující látka aktivuje katalytickou aktivitu protein kinázy, nejlépe aktivuje nebo inhibuje katalytickou aktivitu protein kinázy v závislosti na koncentraci sloučeniny vystavené protein kináze a zcela nejlépe inhibuje katalytickou aktivitu protein kinázy.

Termín „katalytická aktivita“ v kontextu předkládaného vynálezu definuje stupeň fosforylace substrátu protein kinázou. Katalytická aktivita může být měřena například určením množství substrátu přeměněného na produkt v čase. Fosforylace substrátu probíhá na aktivním místě pro15 tein kinázy. Aktivní místo je za normálních okolností dutina, v které je substrát navázán na protein kinázu aje fosforylován.

Zde používaný termín „substrát“ se týká molekuly fosforylované serin/threonin protein kinázou. Substrátem je nejlépe peptid a zcela nejlépe protein. Ve vztahu k protein kináze RAF jsou prefe20 rovanými substráty MEK a substrát pro MEK MAPK.

Termín „aktivuje“ se týká zvyšování buněčné funkce protein kinázy. Funkcí protein kinázy je nejlépe interakce s přirozeným vazebným partnerem a zcela nejlépe katalytická aktivita.

Termín „inhibuje“ se týká snižování buněčné funkce protein kinázy. Funkcí protein kinázy je nejlépe interakce s přirozeným vazebným partnerem a zcela nejlépe katalytická aktivita.

Termín „moduluje“ se také týká změny funkce protein kinázy zvýšením nebo snížením pravděpodobnosti tvorby komplexu mezi protein kinázou a přirozeným vazebným partnerem. Modu30 lační látka preferovaně zvyšuje pravděpodobnost tvorby takového komplexu mezi protein kinázou a přirozeným vazebným partnerem, více preferovaně zvyšuje nebo snižuje pravděpodobnost tvorby takového komplexu mezi protein kinázou a přirozeným vazebným partnerem v závislosti na koncentraci sloučeniny vystavené protein kináze, a nejvíce preferovaně snižuje pravděpodobnost tvorby takového komplexu mezi protein kinázou a přirozeným vazebným partnerem.

Modulátor preferovaně aktivuje katalytickou aktivitu protein kinázy v závislosti na koncentraci sloučeniny vystavené protein kináze, nebo zcela nejlépe inhibuje katalytickou aktivitu protein kinázy.

Termín „komplex“ se týká spojení alespoň dvou molekul navázaných k sobě. Komplexy signá40 lové transdukce často obsahují alespoň dvě proteinové molekuly navázané na sebe. Například u protein tyrosinové receptorové protein kinázy se spojují složky GRB2, SOS, RAF a RAS za vzniku signálního transdukčního komplexu v závislosti na mitogenním ligandu.

Termín „přirozený vazebný partner“ se týká polypeptidů, které se váží na protein kinázu v buň45 kách. Přirození vazební partneři hrají roli v šíření signálu v procesu protein kinázové signální transdukce. Změna v interakci mezi protein kinázou a přirozeným vazebným partnerem se může sama manifestovat ve zvýšení nebo snížení pravděpodobnosti tvorby interakce, nebo ve zvýšení nebo snížení pravděpodobnosti koncentrace komplexu protein kináza/přirozený vazebný partner. Přirozený vazebný partner protein kinázy se může s vysokou afinitou vázat na intracelulámí oblast protein kinázy. Vysoká afinita představuje rovnovážnou vazebnou konstantu v řádu 10 ⁶ M nebo méně. Navíc může přirozený vazebný partner přechodně interagovat s intracelulámí oblastí protein kinázy a chemicky ji modifikovat. Přirození vazební partneři protein kinázy jsou vybrány ze skupiny, která obsahuje, ale není omezena na SRC homologní 2 (SH2) nebo 3 (SH3) domény, jiné fosforyl tyrosin vazebné (PTB) domény, guaninové nukleotidové výměnné faktory, protein

- 13 CZ 298775 B6 fosfatázy a další kinázy. Metody určení změn interakcí mezi protein kinázami a jejich přirozenými vazebnými partnery jsou snadno dostupné v oboru.

Termín „serin/threonin protein kináza“ se týká enzymu s aminokyselinovou sekvencí s alespoň

10% aminokyselinou identitou s jinými enzymy, které fosforylují proteiny na serinových nebo threoninových reziduích. Serin/threonin protein kináza katalyzuje vazbu fosfátu na proteiny přes serinová nebo threoninová rezidua. Serin/threonin protein kinázy mohou existovat jako membránové vazebné nebo cytosolické proteiny.

ío Zde užívaný termín „kontakt“ se týká smíšení roztoku tvořeného 5-azachinoxalinovou sloučeninou, kteráje předmětem předkládaného vynálezu, s tekutým médiem pro inkubaci buněk. Roztok obsahující sloučeninu může být také tvořen další komponentou, jako je například dimethylsulfoxid (DMSO), která usnadňuje vychytání 5-azachinoxalinové sloučeniny nebo sloučenin do buněk, které jsou předmětem předkládaných metod. Roztok obsahující 5-azachinoxalinovou sloučeninu může být přidán k buněčnému inkubačnímu médiu za použití transportního zařízení, jako je například zařízení s použitím pipety či injekční stříkačky.

Termín „5-azachinoxalinová sloučenina“ se týká 5-azachinoxalinové organické sloučeniny substituované chemickými substituenty. 5-azachinoxalinové sloučeniny mají obecný vzorec:

Termín „substituovaný“ mající vztah k předkládanému vynálezu se týká 5-azachinoxalinové sloučeniny, kteráje derivatizovánajakýmkoli množstvím chemických substituentů.

V preferované formě předkládaného vynálezu se vynález týká metody modulace funkce serin/25 threonin protein kinázy, kde protein kinázou je RAF.

RAF protein kináza fosforyluje cílové proteiny na serinových nebo threoninových reziduích. Jedním takovým cílovým proteinem je protein kináza (MEK), která fosforyluje a následně aktivuje mitogenem aktivovanou protein kinázu (MAPK). RAF sama o sobě je aktivována membrá30 nově vázaným guanin trifosfát hydrolyzujícím enzymem RAS v odpovědi na mitogenem stimulované receptorové protein tyrosin kinázy, jako jsou například receptor pro epidermální růstový faktor (EGFR) a receptor pro z krevních destiček derivovaný růstový faktor (PDGFR).

Pomocí metod, které jsou předmětem předkládaného vynálezu, lze detekovat sloučeniny, které modulují funkci protein kinázy RAF v buňkách. RAF fosforyluje protein kinázu (MEK), která dále fosfoiyluje mitogenem aktivovanou protein kinázu (MAPK). Analýzy, které monitorují pouze fosforylaci MEK prostřednictvím RAF nejsou citlivé, protože stupeň fosforylace MEK není významný. Aby se překonal tento problém senzitivity, je v předkládaném vynálezu sledována fosforylace MEK i MAPK. MAPK fosforylační signál násobí MEK fosforylační signál a umožňuje sledovat RAF dependentní fosforylaci, například pomocí enzymově vázané imunosorpční analýzy (ELISA). Analýza, kteráje předmětem předkládaného vynálezu je navíc prováděna vysokokapacitně, což umožňuje rychlou monitoraci mnoha sloučenin v krátkém časovém úseku.

V dalším aspektu popisuje vynález metodu identifikace sloučenin, které modulují funkci serin/threonin protein kináz. Tato metoda je tvořena kroky kontaktu buněk exprimujících serin/threonin protein kinázu se sloučeninou a monitoraci efektu na buňkách.

Termín „monitorace“ se týká pozorování účinku po přidání sloučeniny k buňkám, které jsou předmětem předkládané metody. Účinek se může manifestovat změnou buněčného fenotypu,

-14CL 298775 B6 buněčné proliferace, katalytické aktivity protein kinázy, nebo změnou interakce mezi protein kinázou a přirozeným vazebným partnerem.

Termín „efekt“ popisuje změnu nebo chybění změny v buněčném fenotypu nebo buněčné prolife5 raci. „Efekt“ může také popisovat změnu nebo chybění změny katalytické aktivity protein kinázy. „Efekt“ může také popisovat změnu nebo chybění změny interakce mezi protein kinázou a přirozeným vazebným partnerem.

Preferovaná forma předkládaného vynálezu se týká metody identifikace sloučenin, které modu10 lují funkci serin/threonin protein kinázy, kde efektem je změna nebo absence změny v buněčném fenotypu.

Termín „buněčný fenotyp“ se týká vnějšího vzhledu buňky nebo tkáně, nebo funkce buňky nebo tkáně. Příkladem buněčného fenotypu jsou velikost buňky (zmenšení nebo zvětšení), buněčná proliferace (zvýšení nebo snížení počtu buněk), buněčná diferenciace (změna nebo absence změny ve tvaru buňky), přežití buňky, apoptóza (buněčná smrt), nebo utilizace metabolických živin (např. vychytávání glukózy). Změny nebo absence změn v buněčném fenotypu jsou snadno měřitelné pomocí technik známých v oboru.

V další preferované formě předkládaného vynálezu se vynález týká metody identifikace sloučenin, které modulují funkci serin/threonin protein kinázy, kde efektem je změna nebo absence změn v buněčné proliferaci.

Termín „buněčná proliferace“ se týká stupně buněčného dělení skupiny buněk. Počet buněk ros25 toucích v nádobce může být kvantifikován osobou znalou oboru, kdy tato osoba vizuálně odečítá počet buněk v definovaném objemu za použití běžného světelného mikroskopu. Alternativně může být stupeň buněčné proliferace kvantifikován laboratorním zařízením, které opticky nebo kondukčně měří denzitu buněk v příslušném médiu.

V další preferované formě předkládaného vynálezu se vynález týká metody identifikace sloučenin, které modulují funkci serin/threonin protein kinázy, kde efektem je změna nebo absence změny interakce mezi serin/threonin protein kinázou a přirozeným vazebným partnerem.

Termín „interakce“ v kontextu předkládaného vynálezu, popisuje komplex vytvořený mezi intra35 celulámí oblastí protein kinázy a přirozeným vazebným partnerem nebo sloučeninou. Termín „interakce“ může být také rozšířen na komplex vytvořený mezi sloučeninou, která je předmětem předkládaného vynálezu, a intracelulámími a extracelulámími oblastmi studované protein kinázy. Ačkoli cytosolická protein kináza nemá extracelulámí oblast, receptorová protein kináza obsahuje oblast extracelulámí i intracelulámí.

Zde používaný termín „intracelulámí oblast“ se týká části protein kinázy, která existuje uvnitř buňky. Zde používaný termín „extracelulámí oblast“ se týká části protein kinázy, která existuje vně buňky.

V preferované formě předkládaného vynálezu se vynález týká metody identifikace sloučenin, které modulují funkci serin/threonin protein kinázy. Tato metoda se dále skládá z následujících kroků: a) lýzy buněk za účelem získání lyzátu obsahujícího serin/threonin protein kinázu; b) adsorpce serin/threonin protein kinázy na protilátku; c) inkubace adsorbované serin/threonin protein kinázy se substrátem nebo substráty; a d) adsorpce substrátu nebo substrátů na pevnou matrici nebo protilátku. Krok monitorace efektu na buňky se skládá z měření koncentrace fosfátu v substrátu nebo substrátech.

Zde používaný termín „lýza“ se týká metody disrupce integrity buňky, čímž dochází k uvolnění vnitřního prostředí. Buněčné lýzy je možno dosáhnout mnoha způsoby známými osobám zkuše- 15CZ 298775 B6 ným v oboru. Jedná se nejlépe o sonikaci nebo o jiné techniky určené k rozbíjení buněk a zcela nejlépe o detergentní techniky.

Zde používaný termín „protilátka“ se týká bílkovinné molekuly, která se specificky váže na pro5 tein kinázu. Protilátka se preferovaně váže na jednu třídu protein kinázy a zcela preferovaně se váže k RAF protein kináze.

Zde používaný termín „specificky se váže“ se týká protilátky, která se váže na protein kinázu s vyšší afinitou než jiná protein kináza nebo buněčná bílkovina. Protilátka, která se specificky váže na protein kinázu, váže větší množství specifické protein kinázy než jakákoli jiná protein kináza nebo buněčné bílkovina.

Zde používaný termín „adsorpce“ se týká vazby molekuly k povrchu protilátky nebo pevné matrice. Příkladem pevných matric je chemicky modifikované celulóza, jako je například fosfocelu15 lóza a nylon. Protilátky mohou být navázány na pevné matrice za použití technik dobře známým osobám znalým oboru. Viz např. Harlo a Lané, Antibodies, A Laboratory Manual, 1989, Cold Spring Harbor Laboratories.

Zde používaný termín „měření koncentrace fosfátu“ se týká technik běžně známým osobám zna20 lým oboru. Tyto techniky zahrnují kvantifikaci koncentrace fosfátu v substrátu nebo určení relativních množství fosfátu v substrátu. Tyto techniky mohou zahrnovat adsorpci substrátu na membránu a detekci množství fosfátu v substrátu pomocí měření radioaktivity.

V další preferované formě předkládaného vynálezu se vynález týká metody identifikace slouče25 nin, které modulují funkci serin/threonin protein kinázy. Tato metoda se dále skládá z následujících kroků: a) lýzy buněk za účelem získání lyzátu obsahujícího RAF; b) adsorpce RAF na protilátku; c) inkubace adsorbované RAF s MEK a MAPK; a d) adsorpce MEK a MAPK na pevnou matrici nebo protilátku. Krok měření efektu na buňky se skládá z monitorace koncentrace fosfátu v MEK a MAPK.

V preferované formě předkládaného vynálezu se vynález týká metody identifikace sloučenin, které modulují funkci serin/threonin protein kinázy. V této metodě má 5-azachinoxalinová sloučenina strukturu definovanou v předkládaném vynálezu vzorci I, II nebo III, nebo v jakékoli podskupině sloučenin definovaných vzorci I, II nebo III.

Termín „sloučenina“ se týká sloučeniny nebo její farmaceuticky přijatelné soli, esteru, amidu, proléku, izomerů nebo metabolitu.

Termín „farmaceuticky přijatelná sůl“ se týká formulace sloučeniny, která nenarušuje biologic40 kou aktivitu a vlastnosti výchozí sloučeniny. Farmaceutické soli mohou být získány reakcí sloučeniny, která je předmětem předkládaného vynálezu s anorganickými nebo organickými kyselinami, jako je například kyselina chlorovodíková, bromovodíková, sírová, dusičná, fosforečná, metansulfonovoá, etansulfonová, />-toluensulfonová, salicylová a podobně.

Termín „prolék“ se týká látky, která je přeměněna na vlastní účinný lék za podmínek in vivo. Proléky mohou být v některých situacích aplikovány snadněji než vlastní účinné léky. Prolék může být například biodostupný po perorálním podání, zatímco vlastní účinný lék biodostupný není, nebo může lék ve formě proléku být lépe rozpustný a může být tak aplikován intravenózní cestou.

V další preferované formě předkládaného vynálezu se vynález týká metody identifikace sloučenin, které modulují funkci serin/threonin protein kinázy a kde 5-azachinoxalinová sloučenina má strukturu definovanou v předkládaném vynálezu vzorci I, II nebo III, kde 5-azachinoxalinová sloučenina je vybrána ze skupiny tvořené SAQAR sloučeninami.

- 16CZ 298775 B6

Termín „SAQAR sloučeniny“ se týká skupiny 5-azachinoxalinových sloučenin majících strukturu definovanou v předkládaném vynálezu vzorcem I, a číslování A-1 až A-90 podle následující tabulky:

(I)

R

Sloučenina č.	R2	Ri	RsXt
A-1	H	4-hydroxyfenyl	Fenylamino
A-2	H	4-hydroxyfenyl	Benzylamino
A-3	Metyl	Fenyl	Metoxy
A-4	Fenyl	Fenyl	Metoxy
A-5	Metyl	Fenyl	4 -fluorbenzylamino
A-6	Fenyl	Fenyl	4 -fluorbenzylamino
A-7	H	Fenyl	fenylamino
A-8	H	4-hydroxyfenyl	2-karboxybenzylamino
A-9	H	4-hydroxyfenyl	3-karboxybenzylamino
A-10	H	4-hydroxyfenyl	4-karboxybenzylamino
A-ll	H	4-hydroxyfenyl	2-nitrobenzylamino
A-12	H	4-hydroxyfenýl	3-nitrobenzylamino
A-13	H	4-hydroxyfenyl	4-nitrobenzylamino
A-14	H	4-hydroxyfenyl	2-metylbenzylamino
A-15	H	4-hydroxyfenyl	3-metylbenzylamino
A-16	H	4-hydroxyfenyl	4-metylbenzylamino
A-17	H	4-hydroxyfenyl	2-chlorbenzylamino
A-18	H	4-hydroxyfenyl	3-chlorbenzylamino
A-19	H	4-hydroxyfenyl	4 -chlorbenzylamino
A-20	H	4-hydroxyfenyl	2-fluorbenzylamino
A-21	H	4-hydroxyfenyl	3 -fluorbenzylamino
A-22	H	4-hydroxyfenyl	4 -fluorbenzylamino
A-23	H	4-hydroxyfenyl	2- (trifluormetyl)benzylamino

- 17CZ 298775 B6

Sloučenina č.	r2	Ri	R«Xi
A-24	H	4-hydroxyfenyl	3- (trifluormetyl)benzylamino
A-25	H	4-hydroxyfenyl	4- (trifluormetyl )benzylamino
A-26	H	4-hydroxyfenyl	Fenetyl-1-amino
A-27	H	4-hydroxyfenyl	2-karboxyfenylamino
A-28	H	4-hydroxyfenyl	3-karboxyfenylamino
A-29	H	4-hydroxyfenyl	4-karboxyfenylamino
A-30	H	4-hydroxyfenyl	2-nitrofenylamino
A-31	H	4-hydroxyfenyl	3-nitrofenylamino
A-32	H	4-hydroxyfenyl	4-nitrofenylamino
A-33	H	4-hydroxyfenyl	2-metylfenylamino
A-34	H	4-hydroxyfenyl	3-metylfenylamino
A-35	H	4-hydroxyfenyl	4-metylfenylamino
A-36	H	4-hydroxyfenyl	2-chlorfenylamino
A-37	H	4-hydroxyfenyl	3-chlorfenylamino
A-38	H	4-hydroxyfenyl	4-chlorfenylamino
A-39	H	4-hydroxyfenyl	2-fluor fenylamino
A-40	H	4-hydroxyfenyl	3-fluorfenylamino
A-41	H	4-hydroxyfenyl	4-fluorf enylamino
A-42	H	4-hydroxyfenyl	2- (trifluormetyl )fenylamino
A-43	H	4-hydroxyfenyl	3- {trifluormetyl )fenylamino
A-4 4	H	4-hydroxyfenyl	4 - (trifluormetyl )- fenylamino
A-4 5	H	4-hydroxyfenyl	Pyrid-2-amino
A-4 6	H	4-hydroxyfenyl	Pyrid-3-amino
A-47	H	4-hydroxyfenyl	Pyrid-4-amino
A-4 8	H	4-hydroxyfenyl	Pyrid-2-metylamí no
A-49	H	Fenyl	2-ka rboxyben z y1amino
A-50	H	Fenyl	3-karboxybenzylamino
A-51	H	Fenyl	4-karboxybenzylamino
A-52	H	Fenyl	2-nitrobenzylamino
A-53	H	Fenyl	3-nitrobenzylamino
A-54	H	Fenyl	4-nitrobenzylamino
A-55	H	Fenyl	2-metylbenzylamino

- 18CZ 298775 B6

Sloučenina č.	r2	Ri	R«X:
A-5 6	H	Fenyl	3-metylbenzylamino
A-57	H	Fenyl	4-metylbenzylamino
A-58	H	Fenyl	2-chlorbenzylamino
A-59	H	Fenyl	3-chlorbenzy1amino
A-60	H	Fenyl	4-chlorbenzylamino
A-61	H	Fenyl	2-fluorbenzylamino
A-62	H	Fenyl	3-fluorbenzylamino
A-63	H	Fenyl	4-fluorbenzylamino
A-64	H	Fenyl	2-(trifluormetyl)benzylamino
A-65	H	Fenyl	3-(trifluormetyl)benzylamino
A-66	H	Fenyl	4-(trifluormety1)benzylamino
A-67	H	Fenyl	Fenetyl-1-amino
A-68	H	Fenyl	2-karboxyfenylamino
A-69	H	Fenyl	3-karboxyfenylamino
A-70	H	Fenyl	4-karboxyfenylamino
A-71	H	Fenyl	2-nitrofenylamino
A-72	H	Fenyl	3-nitrofenylamino
A-73	H	Fenyl·	4-nitrofenylamino
A-74	H	Fenyl	2-metylfenylamino
A-75	H	Fenyl	3-metylfenylamino
A-76	H	Fenyl	4-metylfenylamino
A-77	H	Fenyl	2-chlorfenylamino
A-78	H	Fenyl	3-chlorfenylamino
A-7 9	H	Fenyl	4-chlorfenylamino
A-80	H	Fenyl	2-fluor feny1amino
A-81	H	Fenyl	3-fluorfenylamino
A-82	H	Fenyl	4-fluorfenylamino
A-83	H	Fenyl	2 - (tr ifluorme ty 1 )fenylamino
A-84	H	Fenyl	3-(trifluormetyl)fenylamino
A-85	H	Fenyl	4- (tr ifluorme ty 1)fenylamino
A-86	H	Fenyl	Pyrid-2-amino
A-87	H	Fenyl	Pyrid-3-amino

-19CZ 298775 B6

Sloučenina č.	r2	Ri	R6Xi
A-88	H	Fenyl	Pyrid-4-amino
A-89	H	Fenyl	Pyrid-2-metylainino
A-90	H	4-metoxyfenyl	Fenylamino

II. Metody prevence nebo léčby abnormálních stavů

V dalším aspektu se vynález týká metody prevence nebo léčby abnormálních stavů u organismů.

Tato metoda je tvořena následujícími kroky: a) podáním sloučeniny, která je předmětem předkládaného vynálezu a která je zde specifikována vzorcem I se všemi omezeními zde uvedenými; b) podnícením nebo narušením abnormální interakce.

Termín „organismus“ se týká jakékoli entity tvořené alespoň jednou buňkou. Organismus může být jednoduchá eukaryotická buňka nebo komplexní organismus jako je například savec. V preferovaných formách předkládaného vynálezu se organismus vztahuje na člověka nebo savce.

Termín „prevence“ se týká metody, která je předmětem předkládaného vynálezu, a která vede ke snížení pravděpodobnosti nebo k eliminaci možnosti rozvoje abnormálního stavu u organismu.

Termín „léčba“ se týká metody, která je předmětem předkládaného vynálezu, a která má terapeutický účinek a alespoň částečně zmírňuje abnormální stavy organismu.

Termín „terapeutický efekt“ se týká inhibice buněčného růstu způsobujícího nebo spolu podílící20 ho se na abnormálním stavu (např. na nádorovém onemocnění). Termín „terapeutický efekt“ se také týká inhibice růstových faktorů způsobujících nebo spolu podílících se na abnormálním stavu. Terapeutický efekt zmírňuje do určité míry jeden nebo více symptomů abnormálního stavu. S ohledem na terapii nádorových onemocnění se terapeutický efekt týká jednoho nebo více bodů z následujících: a) zmenšení velikosti nádoru; b) inhibice (tj. zpomalení nebo zastavení) metastáz nádorového onemocnění; c) inhibice nádorového růstu; a d) určitého zmírnění jednoho nebo více příznaků spojených s abnormálním stavem. V předkládaném vynálezu jsou identifikovány sloučeniny vykazující účinnost proti leukémiím, které zpomalují nebo snižují buněčnou proliferaci nebo buněčné růst, ačkoli neinhibují metastázování.

Termín „abnormální stav“ se týká funkce buněk nebo tkání organismu, která se odchyluje od jejich normální funkce v organismu. Abnormální stav se týká buněčné proliferace, buněčné diferenciace nebo přežívání buněk.

Aberantní stavy buněčné proliferace zahrnují nádory, jako například nádory fibrotického a mezangiálního původu, abnormální angiogenezi a vaskulogenezi, hojení ran, psoriázu, diabetes mellitus a záněty.

Aberantní stavy buněčné diferenciace zahrnují, ale nejsou omezeny na neurodegenerativní onemocnění, pomalé hojení ran a techniky transplantace tkání.

Aberantní stavy přežívání buněk zahrnují stavy, u kterých je aktivována nebo odstraněna metabolická cesta programované buněčné smrti (apoptóza). S apoptózou je spojena celá řada protein kináz. Aberace funkce jakékoli protein kinázy může vést k nesmrtelnosti buňky nebo k jejímu předčasnému odúmrtí.

-20CZ 298775 B6

Buněčná proliferace, diferenciace a přežívání jsou fenomény, které mohou být jednoduše měřeny pomocí metod známých v oboru. Tyto metody mohou zahrnovat pozorování počtu buněk nebo jejich vzhledu pod mikroskopem v daném čase (například dny).

Termín „podání“ se obecně týká aplikace sloučeniny do organismu a specifičtěji metody inkorporace sloučeniny do buněk nebo tkání organismu. Rozvoji abnormálního stavu může být zabráněno, nebo může být léčen za podmínky existence buněk nebo tkání v organismu i mimo něj. Buňky existující mimo organismus mohou být udržovány nebo kultivovány v miskách pro buněčné kultuře. Pro buňky existující v organismu existuje mnoho technik podání sloučenin včetně (ale neomezující se na) perorální, parenterální, dermální a injekční podání, nebo aplikaci ve formě aerosolu. Pro buňky existující vně organismu existuje mnoho technik pro podání sloučenin včetně (ale neomezující se na) techniky buněčné mikroinjekce, transformační a nosičové techniky.

V preferované formě předkládaného vynálezu se vynález týká metody prevence nebo léčby abnormálních stavů u organismu, kde 5-azachinoxalinová sloučenina má strukturu definovanou v předkládaném vynálezu vzorcem I, nebo jakoukoli jeho podskupinou.

V dalších preferovaných formách předkládaného vynálezu se vynález týká metody prevence nebo léčby abnormálních stavů u organismu, kde 5-azachinoxalinová sloučenina charakterizovaná vzorcem I je vybrána ze skupiny tvořené SAQAR sloučeninami.

V další preferované formě předkládaného vynálezu se vynález týká metody prevence nebo léčby abnormálních stavů u organismu, kde organismem je savec.

Termín „savec“ se týká preferovaně organismů jako jsou myši, krysy, morčata, a kozy, lépe však opice, a zcela nejlépe člověk.

V další preferované formě předkládaného vynálezu se vynález týká metody prevence nebo léčby abnormálních stavů u organismu, kde abnormálním stavem je nádorové nebo fibrotické onemoc30 nění.

V další preferované formě předkládaného vynálezu se vynález týká metody prevence nebo léčby abnormálních stavů u organismů, kde nádorové onemocnění patří do skupiny tvořené nádory plic, ovárií, prsu, mozku, intraaxiálními mozkovými nádory, nádory střeva, prostaty, sarkomy, Kapo35 siho sarkomy, melanomy a gliomy.

V další preferované formě předkládaného vynálezu se vynález týká metody prevence nebo léčby abnormálních stavů u organismu, kde je metoda použita u abnormálních stavů spojených s poruchou signálové transdukce charakterizované interakcí mezi serin/threonin protein kinázou a přiro40 zeným vazebným partnerem.

Termín „signálová transdukce“ se týká šíření signálu. Obecně se jedná o přenesení extracelulárního signálu přes buněčnou membránu tak, že se z něj stane signál intracelulámí. Tento signál může poté stimulovat buněčnou odpověď. Tento termín také zahrnuje signály, které jsou šířeny přímo v buňce. Peptidové molekuly, které účinkují v procesech signálové transdukce jsou typicky receptorové nebo non-receptorové protein kinázy, receptorové nebo non-receptorové protein fosfatázy, nukleotidové výměnné faktory a transkripční faktory.

Termín „aberace“ ve spojení s procesem signálové transdukce se týká protein kinázy, která je zvýšeně, nebo snížené exprimována v organismu, zmutována tak, že její katalytická aktivita je nižší nebo vyšší než aktivita přirozené protein kinázy, nebo zmutována tak, že nemůže dojít k interakci s přirozeným vazebným partnerem, nebo nemůže být modifikována jinou protein kinázou nebo protein fosfatázou.

-21 CZ 298775 B6

Termín „podpora nebo narušení abnormální interakce“ se týká metody tvořené podáním sloučeniny, kteráje předmětem předkládaného vynálezu buňkám nebo do tkání organismu. Sloučenina může podporovat interakci mezi protein kinázou a přirozenými vazebnými partnery pomocí interakcí s mnoha atomy na rozhraní komplexu. Sloučenina může alternativně inhibovat interakci mezi protein kinázou a přirozenými vazebnými partnery vytvořením vhodných interakcí mezi atomy na rozhraní komplexu. V další preferované formě předkládaného vynálezu se vynález týká metody prevence nebo léčby abnormálních stavů u organismu, kde serin/threonin kinázou je RAF.

ίο III. Sloučeniny a farmaceutické preparáty, které jsou předmětem předkládaného vynálezu

V dalším aspektu se vynález týká 5-azachinoxalinových sloučenin, které mají strukturu definovanou vzorcem I:

kde

a) R), R₂, a Re jsou nezávisle vybrány ze skupiny tvořené (i) vodíkem;

(ii) nasyceným nebo nenasyceným alkylem;

(iii) aminem charakterizovaným vzorcem NX₂X₃, kde X₂ a X₃ jsou nezávisle vybrány ze skupiny tvořené vodíkem, nasyceným nebo nenasyceným alkylem a pěti nebo šesti členným arylovým nebo heteroarylovým kruhem;

(iv) Halogenem nebo trihalometylovou skupinou;

(v) Ketonem charakterizovaným vzorcem -CO-X₄, kde X₄ je vybrán ze skupiny tvořené vodíkem, alkylem a pěti nebo šesti členným arylovým nebo heteroarylovým kruhem;

(vi) Karboxylovou kyselinou charakterizovanou vzorcem -(X₅)_n-COOH, nebo esterem charakterizovaným vzorcem -(X₆)_n-COO-X₇, kde X₅, X₆ a X₇ jsou nezávisle vybrány ze skupiny tvořené alkylem a pěti nebo šesti členným arylovým nebo heteroarylovým kruhem, a kde n je 0 nebo 1;

(vii) Alkoholem charakterizovaným vzorcem -(X₈)_n-OH, nebo alkoxy skupinou charakterizovanou vzorcem -(X₈)_n-O-X₉, kde X₈ a X₉ jsou nezávisle vybrány ze skupiny tvořené vodíkem, nasyceným nebo nenasyceným alkylem a pěti nebo šesti členným arylovým nebo heteroarylovým kruhem, a kde kruh je volitelně substituovaný jedním nebo více substituenty nezávisle vybranými ze skupiny tvořené alkylem, halogen, trihalometyl, karboxylát, nitro a esterovou skupinou, a kde n je 0 nebo 1;

(viii) Amidem charakterizovaným vzorcem -NHCOX10, kde Xi₀ je vybrán ze skupiny tvo45 řené alkylem, hydroxylem a pěti nebo šesti členným arylovým nebo heteroarylovým kruhem, a kde kruh je volitelně substituovaný jedním nebo dvěmi substituenty nezávisle vybranými ze skupiny tvořené alkylem, halogen, trihalometyl, karboxylát, nitro a esterovou skupinou;

-22CZ 298775 B6 (ix) -SO2NX11X12, kde Xn a X₁₂ jsou vybrány ze skupiny tvořené vodíkem, alkylem a pěti nebo šesti členným arylovým nebo heteroarylovým kruhem;

(x) pěti nebo šesti členným arylovým nebo heteroarylovým kruhem volitelně substituovaným jedním, dvěmi, nebo třemi substituenty nezávisle vybranými ze skupiny tvořené alkylem, halogen, trihalometyl, karboxylát, nitro a esterovou skupinou;

(xi) aldehydem charakterizovaným vzorcem -CO-H; a (xii) sulfonem charakterizovaným vzorcem -SO₂X_n, kde X13 je vybrán ze skupiny tvořené nasyceným nebo nenasyceným alkylem a pěti nebo šesti členným arylovým nebo heteroarylovým kruhem;

b) Xi je nezávisle vybráno ze skupiny tvořené dusíkem, sírou a kyslíkem.

Termín „nasycený alkyl“ se týká alkylové skupiny, která neobsahuje alkenovou ani alkynovou skupinu. Alkylová skupina může být větvená nebo nevětvená.

Termín „nenasycený alkyl“ se týká alkylové skupiny, která obsahuje alespoň jednu alkenovou nebo alkynovou skupinu. Alkylová skupina může být větvená nebo nevětvená.

Termín „amin“ se týká chemické skupiny charakterizované vzorcem NR]R₂, kde Ri a R₂ jsou nezávisle vybrány ze skupiny tvořené vodíkem, nasyceným nebo nenasyceným alkylem a pěti nebo šesti členným arylovým nebo heteroarylovým kruhem, kde kruh je volitelně substituovaný jedním nebo více substituenty nezávisle vybranými ze skupiny tvořené alkylem, halogenem, trihalometyl, karboxylát, nitro a esterovou skupinou;

Termín „aryl“ se týká aromatické skupiny, která má alespoň jeden kruh s π elektronovým systé30 mem a zahrnuje karbocyklické (např. fenyl) i heterocyklické arylové skupiny (např. pyridin). Termín karbocyklický se týká sloučeniny, která obsahuje jednu nebo více kovalentně uzavřených kruhových struktur, a kde atomy tvořící páteř kruhu jsou vždy uhlíkové atomy. Termín tímto rozlišuje karbocyklické kruhy od heterocyklických, v kterých páteř kruhu obsahuje alespoň jeden atom, který není uhlíkem. Termín „heteroaryl“ se týká arylové skupiny, která obsahuje alespoň jeden heterocyklický kruh.

Termín „halogen“ se týká atomu vybraného ze skupiny tvořené fluorem, chlorem, bromem ajodem.

Termín „keton“ se týká chemické skupiny charakterizované vzorcem -(R)n-CO-R', kde R a R' jsou nezávisle vybrány ze skupiny tvořené nasyceným nebo nenasyceným alkylem a pěti nebo šesti členným arylovým nebo heteroarylovým kruhem, kde n je 0 nebo 1.

Termín „karboxylová kyselina“ se týká chemické skupiny charakterizované vzorcem -(R)n45 COOH, kde R je vybrán ze skupiny tvořené nasyceným nebo nenasyceným alkylem a pěti nebo šesti členným arylovým nebo heteroarylovým kruhem, kde n je 0 nebo 1.

Termín „ester“ se týká chemické skupiny charakterizované vzorcem -(R)n-COOR', kde R a R' jsou nezávisle vybrány ze skupiny tvořené nasyceným nebo nenasyceným alkylem a pěti nebo šesti členným arylovým nebo heteroarylovým kruhem, kde n je 0 nebo 1.

Termín „alkohol“ se týká chemického substituentu charakterizovaného vzorcem -ROH, kde R je vybrán ze skupiny tvořené vodíkem, nasyceným nebo nenasyceným alkylem a pěti nebo šesti členným arylovým nebo heteroarylovým kruhem, kde kruh je volitelně substituovaný jedním

-23CZ 298775 B6 nebo více substituenty nezávisle vybranými ze skupiny tvořené alkylem, halogenem, trihalometyl, karboxylát, nitro a esterovou skupinou.

Termín „amid“ se týká chemického substituentu charakterizovaného vzorcem -NHCOR, kde R je 5 vybrán ze skupiny tvořené vodíkem, alkylem, hydroxylem a pěti nebo šesti členným arylovým nebo heteroarylovým kruhem, kde kruh je volitelně substituovaný jedním nebo více substituenty nezávisle vybranými ze skupiny tvořené alkylem, halogenem, trihalometyl, karboxylát, nitro a esterovou skupinou.

Termín „alkoxy skupina“ se týká chemického substituentu charakterizovaného vzorcem -OR, kde R je vodík nebo nasycený či nenasycený alkyl.

Termín „aldehyd“ se týká chemické skupiny charakterizované vzorcem -(R)n-CHO, kde R je vybrán ze skupiny tvořené nasyceným nebo nenasyceným alkylem a pěti nebo šesti členným ary15 lovým nebo heteroarylovým kruhem, a kde n je 0 nebo 1.

Termín „sulfon“ se týká chemické skupiny charakterizované vzorcem -SO₂-R, kde R je vybrán ze skupiny tvořené nasyceným nebo nenasyceným alkylem a pěti nebo šesti členným arylovým nebo heteroarylovým kruhem.

V další preferované formě předkládaného vynálezu se vynález týká 5-azachinoxalinových sloučenin, které mají strukturu charakterizovanou v předkládaném vynálezu vzorcem I, kde Ri aR₂ jsou nezávisle vybrány ze skupiny tvořené vodíkem, nasyceným nebo nenasyceným alkylem a pěti nebo šesti členným arylovým nebo heteroarylovým kruhem, kde kruh je volitelně substituo25 váný jedním, dvěmi, nebo třemi substituenty nezávisle vybranými ze skupiny tvořené alkylem, halogenem, trihalometyl, karboxylát, nitro a esterovou skupinou.

V další preferované formě předkládaného vynálezu se vynález týká 5-azachinoxalinových sloučenin, které mají strukturu charakterizovanou v předkládaném vynálezu vzorcem I, kde R, je fenyl volitelně substituovaný jedním, dvěmi, nebo třemi substituenty nezávisle vybranými ze skupiny tvořené alkylem, halogenem, hydroxy a alkoxy skupinou.

V další preferované formě předkládaného vynálezu se vynález týká 5-azachinoxalinových sloučenin, které mají strukturu charakterizovanou v předkládaném vynálezu vzorcem I, kde R] je fenyl.

V další preferované formě předkládaného vynálezu se vynález týká 5-azachinoxalinových sloučenin, které mají strukturu charakterizovanou v předkládaném vynálezu vzorcem I, kde Rije4hydroxyfenyl.

V další preferované formě předkládaného vynálezu se vynález týká 5—azachinoxalinových sloučenin, které mají strukturu charakterizovanou v předkládaném vynálezu vzorcem I, kde R₂ je nezávisle vybrán ze skupiny tvořené vodíkem, nasyceným nebo nenasyceným alkylem a fenylem volitelně substituovaným jedním, dvěmi, nebo třemi substituenty nezávisle vybranými ze skupiny tvořené alkylem, halogenem, hydroxy a alkoxy skupinou.

V další preferované formě předkládaného vynálezu se vynález týká 5-azachinoxalinových sloučenin, které mají strukturu charakterizovanou v předkládaném vynálezu vzorcem I, kde R₂ je vodík.

V další preferované formě předkládaného vynálezu se vynález týká 5-azachinoxalinových sloučenin, které mají strukturu charakterizovanou v předkládaném vynálezu vzorcem I, kde R₂ je metyl.

-24CZ 298775 B6

V další preferované formě předkládaného vynálezu se vynález týká 5-azachinoxalinových sloučenin, které mají strukturu charakterizovanou v předkládaném vynálezu vzorcem I, kde R₂ je fenyl.

V další preferované formě předkládaného vynálezu se vynález týká 5-azachinoxalinových sloučenin, které mají strukturu charakterizovanou v předkládaném vynálezu vzorcem I, kde X) je dusík nebo kyslík.

V další preferované formě předkládaného vynálezu se vynález týká 5-azachinoxalinových slou10 čenin, které mají strukturu charakterizovanou v předkládaném vynálezu vzorcem I, kde Xi je kyslík.

V další preferované formě předkládaného vynálezu se vynález týká 5-azachinoxalinových sloučenin, které mají strukturu charakterizovanou v předkládaném vynálezu vzorcem I, kde X! je dusík.

V další preferované formě předkládaného vynálezu se vynález týká 5-azachinoxalinových sloučenin, které mají strukturu charakterizovanou v předkládaném vynálezu vzorcem I, kde Ró je nezávisle vybrán ze skupiny tvořené vodíkem, nasyceným nebo nenasyceným alkylem volitelně substituovaným pěti nebo šesti členným arylovým nebo heteroarylovým kruhem, kde kruh je volitelně substituovaný jedním, dvěmi nebo třemi substituenty nezávisle vybranými ze skupiny tvořené alkylem, halogen, trihalometyl, hydroxy, alkoxy, karboxylát, nitro a esterovou skupinou, a pěti nebo šesti členným arylovým nebo heteroarylovým kruhem volitelně substituovaným jedním, dvěmi nebo třemi substituenty nezávisle vybranými ze skupiny tvořené alkylem, halogenem, trihalometyl, hydroxy, alkoxy, karboxylát, nitro a esterovou skupinou.

V další preferované formě předkládaného vynálezu se vynález týká 5-azachinoxalinových sloučenin, které mají strukturu charakterizovanou v předkládaném vynálezu vzorcem I, kde R^ a Ri tvoří sloučeninu, která je vybrána ze skupiny tvořené SAQAR substituenty.

Termín „SAQAR substituenty“ se týká skupiny substituentů obsahující metoxy, benzylamino,

2- karboxybenzylamino, 3-karboxybenzylamino, 4-karboxybenzylamino, 2-nitrobenzylamino,

3- nitrobenzylamino, 4-nitrobenzylamino, 2-metylbenzylamino, 3-metylbenzylamino, 4-metylbenzylamino, 2-chlorbenzylamino, 3-chlorbenzylamino, 4-chlorbenzylamino, 2-fluorbenzyl35 amino, 3-fluorbenzylamino, 4-fluorbenzylamino, 2-(trifluormetyl)benzylamino, (3-trifluormetyljbenzylamino, 4-(trifluormetyl)benzylamino, fenety 1-1-amino, fenylamino, 2-karboxyfenylamino, 3-karboxyfenylamino, 4-karboxyfenylamino, 2-nitrofenylamino, 3-nitrofenylamino, 4-nitrofenylamino, 2-metylfenylamino, 3-methylfenylamino, 4-metylfenylamino, 2-chlorfenylamino, 3-chlorfenylamino, 4-chlorfenylamino, 2-fluorfenylamino, 3-fluorfenyl40 amino, 4-fluorfenylamino, 2-(trifluormetyl)fenylamino, 3-(trifluormetyl)fenylamino, 4-(trifluormetyljfenylamino, pyrid-2-amino, pyrid-3-amino, pyrid-4-amino a pyrid-2-metylamino. Termín „benzylamino“ se týká skupiny charakterizované následujícím vzorcem:

kde arylový kruh může být volitelně substituován v poloze 2, 3, nebo 4.

-25CZ 298775 B6

Termín „fenylamino“ se týká skupiny charakterizované následujícím vzorcem:

kde arylový kruh může být volitelně substituován v poloze 2, 3, nebo 4.

Termín „fenetyl-1-amino“ se týká skupiny charakterizované následujícím vzorcem:

Termín „pyrid-2-amino“ se týká pyridinového kruhu, který je substituován NH skupinou v poloze 2. Podobně termíny „pyrid-3-amino“ a „pyrid-4-amino“ se týkají pyridinového kruhu, který je substituován NH skupinou v poloze 3 a 4.

V další preferované formě předkládaného vynálezu se vynález týká 5-azachinoxalinových sloučenin, které mají strukturu charakterizovanou v předkládaném vynálezu vzorcem I, kde 5-azachinoxalinová sloučenina je vybrána ze skupiny tvořené SAQAR substituenty.

IV. Syntetické metody, které jsou předmětem předkládaného vynálezu

V dalším aspektu se předkládaný vynález týká farmaceutického preparátu tvořeného sloučeninou, která je charakterizována vzorcem I, nebo jakoukoli její podskupinou, její solí a fyziologicky přijatelným nosičem či diluentem.

V dalším aspektu se předkládaný vynález týká farmaceutického preparátu, kde 5-azachinoxalinová sloučenina je vybrána ze skupiny tvořené SAQAR sloučeninami.

Termín „farmaceutický preparát“ se týká směsi 5-azachinoxalinové sloučeniny, která je před25 mětem předkládaného vynálezu, s jinými chemickými komponentami, jako jsou například diluenty nebo nosiče. Farmaceutický preparát usnadňuje podání sloučeniny do organismu. Existuje mnoho způsobů podání sloučeniny, včetně podání perorálního, injekčního, ve formě aerosolu, podání parenterálního a topického. Farmaceutické preparáty mohou být také získány reakcí sloučenin s anorganickými kyselinami jako jsou například kyselina chlorovodíková, kyselina bromo30 vodíková, kyselina sírová, kyselina dusičná, kyselina fosforečná, kyselina metansulfonová, kyselina etansulfonová, kyselina p-toluensulfonová, kyselina salicylová a podobně.

Termín „fyziologicky přijatelný“ definuje nosič nebo diluent, který nenarušuje biologickou aktivitu a vlastnosti sloučeniny.

Termín „nosič“ definuje chemickou sloučeninu, která usnadňuje inkorporaci sloučeniny do buněk nebo tkání. Běžně používaným nosičem je například dimetylsulfoxid (DMSO), protože usnadňuje vychytávání mnoha organických sloučenin do buněk nebo tkání organismu.

Termín „diluent“ definuje chemické sloučeniny rozředěné ve vodě, které rozpouštějí sloučeninu, která je předmětem zájmu, a současně stabilizují biologicky aktivní formu sloučeniny. V oboru jsou používány sole rozpuštěné v roztocích pufru. Jedním z běžně používaných roztoků pufrů je fosfátový pufr, protože napodobuje iontové podmínky v lidské krvi. Protože pufry kontrolují pH

-26CZ 298775 B6 roztoku při nízkých koncentracích, dochází jen zřídka ke změně biologické aktivity sloučeniny vlivem pufru.

V dalším aspektu se vynález týká metody syntézy sloučeniny, kteráje předmětem předkládaného vynálezu. Tato metoda je tvořena kroky: a) reakce 2-amino-6-chloro-3-nitropyridinu s druhým reaktantem v solventu a za přítomnosti zásady, kde druhý reaktant je vybrán ze skupiny tvořené alkoholem a aminem, což vede ke vzniku prvního meziproduktu; b) reakce prvního meziproduktu s 1,2-dionem za přítomnosti katalyzátoru a redukující látky, a d) purifikace finálního produktu.

Termín „1,2-dion“ se týká chemické skupiny charakterizované vzorcem Ri-C(O)C(O)-R2, kde Ri a R₂ jsou nezávisle vybrány ze skupiny tvořené vodíkem, nasyceným nebo nenasyceným alkylem volitelně substituovaným pěti nebo šesti členným arylovým nebo heteroarylovým kruhem, kde kruh je volitelně substituovaný jedním, dvěmi nebo třemi substituenty nezávisle vybranými ze skupiny tvořené alkylem, halogen, trihalometyl, hydroxy, alkoxy, karboxylát, nitro a esterovou skupinou, a pěti nebo šesti členným arylovým nebo heteroarylovým kruhem volitelně substituovaným jedním, dvěmi nebo třemi substituenty nezávisle vybranými ze skupiny tvořené alkylem, halogenem, trihalometyl, hydroxy, alkoxy, karboxylát, nitrát a esterovou skupinou.

V preferované formě předkládaného vynálezu se vynález týká metody syntézy sloučeniny, která je předmětem předkládaného vynálezu, kde solventem je n-butanol.

V další preferované formě předkládaného vynálezu se vynález týká metody syntézy sloučeniny, kteráje předmětem předkládaného vynálezu, kde zásadou je uhličitan draselný.

V další preferované formě předkládaného vynálezu se vynález týká metody syntézy sloučeniny, která je předmětem předkládaného vynálezu, kde druhý reaktant je vybrán ze skupiny tvořené SAQAR reaktanty.

Termín „SAQAR reaktanty“ se týká skupiny reaktantů obsahující metanol, benzylamin,

2-karboxybenzylamin, 3-karboxybenzylamin, 4-karboxybenzylamin, 2-nitrobenzylamin, 3-nitrobenzylamin, 4-nitrobenzylamin, 2-metylbenzylamin, 3-metylbenzylamin, 4-metylbenzylamin, 2-chlorobenzylamin, 3-chlorbenzylamin, 4-chlorbenzylamin, 2-fluorbenzylamin, 3-fluorbenzylamin, 4-fluorbenzylamin, 2-(trifluonnetyl)benzylamin, 3-(trifluormetyl)benzylamin, 4-(trifluormetyl)benzylamin, fenetyl-l-amin, anilin, 2-karboxyanilin, 3-karboxyanilin,

4-karboxyanilin, 2-nitroanilin, 3-nitroanilin, 4-nitroanilin, 2-toluidin, 3-toluidin, 4-toluidin, 2-chloroanilin, 3-chloroanilin, 4-chloroanilin, 2-fluoranilin, 3-fluoranilin, 4-fluoranilin,

2- (trifluormetyl)anilin, 3-(trifluormetyl)anilin, 4-(trifluormetyl)anilin, 2-aminopyridin,

3- aminopyridin, 4-aminopyridin a 2-metylaminopyridin.

V preferované formě předkládaného vynálezu se vynález týká metody syntézy sloučeniny, která je předmětem předkládaného vynálezu, kde třetím reaktantem je skupina tvořená 4-hydroxyfenylglyoxalem, l-fenyl-l,2-propandiolem a benzylem.

Zde používaný termín „katalyzátor“ se týká chemické molekuly, která po přidání ke skupině reaktantů reaguje za vzniku produktů. Osobám znalým oboru je známo mnoho typů katalyzátorů.

V další preferované formě předkládaného vynálezu se vynález týká metody syntézy sloučeniny, kteráje předmětem předkládaného vynálezu, kde redukující látkou je vodík.

V další preferované formě předkládaného vynálezu se vynález týká metody syntézy sloučeniny, kteráje předmětem předkládaného vynálezu, kde katalyzátorem je Raneyův nikl.

Popis předkládaného vynálezu uvedený výše není limitující a z následujícího popisu preferovaných forem předkládaného vynálezu a z patentových nároků budou patrné další rysy a výhody.

-27CZ 298775 B6

Popis preferovaných forem předkládaného vynálezu

Část předkládaného vynálezu je zaměřena na metody modulace funkce serin/threonin protein kináz pomocí 5-azachinoxalinových sloučenin, navíc se část vynálezu týká metod identifikace sloučenin, které modulují funkci serin/threonin protein kináz. Metody využívají buňky, které exprimují serin/threonin protein kinázy, jako je například RAF.

RAF je non-receptorová protein kináza, která se po navázání na RAS, enzym hydrolyzující guanintrifosfát, přemisťuje na buněčnou membránu. RAS se aktivuje po navázání aktivované receptorové protein tyrosin kinázy, jako je například EGFR nebo PDGFR, na adaptorovou bílkovinu, GRB2 a guanin nukleotidový výměnný faktor SOS. SOS odstraňuje guanin difosfát z RAS, nahrazuje ho guanintrifosfátem a tím aktivuje RAS. RAS poté váže RAF a následně ho aktivuje. RAF může poté fosforylovat další proteiny na serinových a threoninových reziduích, jako je například kináza MEK, která fosforyluje a následně aktivuje mitogenem aktivovanou protein kinázu (MAPK). RAF tedy slouží jako intermediální kontrolní faktor v mitogeny aktivované signálové transdukci.

Vzhledem k důležité regulační roli RAF v buňkách, mohou změny aminokyselinové sekvence RAF narušit její funkci a následně modifikovat chování buňky. Úloha RAF v buněčné proliferaci je zdůrazněna pozorováním asociace výskytu nádorových onemocnění s mutacemi v aminokyselinové sekvenci RAF. Protože mutace RAF, které měly za následek vznik nádorového onemocnění, vedly k tvorbě RAF molekul, které vykazovaly neregulovanou katalytickou aktivitu, mohou inhibitory RAF zmírnit nebo dokonce zamezit buněčné proliferaci, která vede k nádorovému bujení v těchto buňkách.

Pomocí metod, které jsou předmětem předkládaného vynálezu, mohou být detekovány sloučeniny, které modulují funkci protein kinázy RAF v buňkách. RAF fosforyluje protein kinázu MEK, která následně fosforyluje mitogenem aktivovanou protein kinázu MAPK. Metody, které monitorují pouze fosforylaci MEK pomocí RAF nejsou citlivé, protože stupeň fosforylace MEK není významný. Aby se překonal tento problém, je monitorována v analýzách, které jsou předmětem předkládaného vynálezu, fosforylace MEK i MAPK. MAPK fosforylační signál amplifikuje MEK fosforylační signál a umožňuje sledovat RAF dependentní fosforylaci pomocí enzymově vázané imunosorpční analýzy (ELISA). Analýza, která je předmětem předkládaného vynálezu je navíc prováděna vysokokapacitně, což umožňuje rychlou monitoraci mnoha slouče35 nin v krátkém časovém úseku.

Pomocí metod, které jsou předmětem předkládaného vynálezu, byly identifikovány sloučeniny, které inhibují funkci RAF protein kinázy. Tyto sloučeniny patří mezi 5-azachinoxalinové deriváty. Ačkoli byla testována schopnost 5-azachinoxalinových derivátů inhibovat enzymy synteti40 zující nukleotidy u bakterií, mnoho z těchto sloučenin nebylo důkladně prozkoumáno s ohledem na inhibici protein kináz.

Protože RAF vykazuje významnou aminokyselinovou homologií s jinými serin/threonin protein kinázami, mohou pravděpodobně 5-azachinoxalinové sloučeniny, které jsou předmětem předklá45 daného vynálezu, inhibovat i jiné serin/threonin protein kinázy než jen RAF, včetně receptorových a non-receptorových serin/threonin protein kináz.

Metody, které jsou předmětem předkládaného vynálezu, se také týkají dalších sloučenin, které modulují funkci RAF v buňkách, protože popsané metody umožňují testovat velké množství molekul v krátkém časovém úseku. Z tohoto důvodu mohou být pomocí metod, které jsou předmětem předkládaného vynálezu, identifikovány molekuly nepopsané v předkládaném vynálezu, které modulují funkci RAS.

-28CZ 298775 B6

I. Biologická aktivita 5-azachinoxalinových sloučenin

5-azachinoxalinové sloučeniny, které jsou předmětem předkládaného vynálezu byly testovány na svoji schopnost inhibice funkce RAF protein kinázy. Biologické analýzy a výsledky těchto inhi5 bičních studií jsou zde uváděny. Metody používané k měření modulace funkce protein kináz 5azachinoxalinovými sloučeninami jsou s ohledem na širokou použitelnost podobné těm, které jsou popsané v přihlášce WO 96/22 976 Tangem et al. nazvané „Indolinone Combinatorial Libraries and Related Products and Methods for the Treatment of Disease“, Lyon a Lyon spis č. 221/187) zaregistrované 23. srpna 1996. Přihláška WO 96/22 976 (08/702232) je v předkládalo ném vynálezu začleněna jako reference v celém svém rozsahu včetně vyobrazení,

II. Cílová onemocnění určená k léčbě 1,4,5-triazanaftalenovými sloučeninami

Zde popsané metody, sloučeniny a farmaceutické preparáty jsou navrženy k inhibici onemocnění na podkladě buněčné proliferace pomocí modulace funkce RAF protein kinázy. Proliferativní onemocnění mají za následek nežádoucí buněčnou proliferaci jedné nebo více skupin buněk v multicelulámím organismu, což vede kjeho poškození. Zde popsané metody, sloučeniny a farmaceutické preparáty mohou být také užitečné v léčbě a prevenci jiných onemocnění organismu, jako jsou například nemoci se vztahem k předčasnému buněčnému odumírání (tj. neurolo20 gická onemocnění) nebo záněty. Tato onemocnění mohou být výsledkem nevhodné funkce RAF molekul, nebo nevhodné funkce protein kinázových molekul příbuzných s RAF.

Alterace RAF protein kinázy, nebo protein kinázových molekul příbuzných s RAF může vést ke zvýšení nebo snížení buněčné proliferace, jak je patrné u určitých onemocnění. Stavy s naru25 šením buněčné proliferace zahrnují nádory, fibrotická onemocnění, mezangiální choroby, abnormální angiogenezi a vaskulogenezi, hojení ran, psoriázu, restenózy a zánět.

Fibrotická onemocnění mají vztah k abnormální tvorbě buněčné extracelulámí matrix. Příkladem fibrotického onemocnění je jatemí cirhóza. jatemí cirhózaje charakterizována zvýšenou koncent30 raci složek extracelulámí matrix vedoucí k zajizvení jatemí tkáně. Jatemí cirhóza může způsobit onemocnění, jako je například cirhózajater.

Poruchy proliferace mezangiálních buněk se vyskytují v důsledku abnormální proliferace mezangiálních buněk. Tyto poruchy zahrnují rozličné lidské choroby ledvin, jako jsou například glome35 rulonefritida, diabetická nefropatie, maligní nefroskleróza, trombotické mikroangiopatické syndromy, rejekce transplantátu a glomerulopatie.

Preferovanými typy nádoru, které mohou být léčeny pomocí metod a sloučenin, které jsou předmětem předkládaného vynálezu, jsou plicní nádory, nádory vaječníků, nádory prsu, nádory moz40 ku, intraaxiální mozkové nádory, nádory tlustého střeva, nádory prostaty, Kaposiho sarkomy, melanomy a gliomy. Důkaz, že metody a sloučeniny, které jsou předmětem předkládaného vynálezu, mohou být účinně zastavit a zvrátit proliferaci nádorových buněk, je v předkládaném vynálezu zahrnut jako reference.

Angiogenní a vaskulogenní onemocnění vznikají v důsledku nadměrné proliferace krevních cév. Proliferace krevních cév je nezbytná pro celou řadu normálních fyziologických procesů, jako jsou například embryonální vývoj, utváření corpus luteum, hojení ran a orgánová regenerace. Proliferace krevních cév je však také nezbytná pro vývoj nádorů. Další příklady proliferačních onemocnění krevních cév zahrnují artritis, kde novotvořené krevní cévy invadují do kloubu a ničí chrupavku. Proliferační onemocnění krevních cév navíc zahrnují choroby oka, jako je například diabetická retinopatie, kde novotvořené kapiláry v sítnici invadují do sklivce, krvácejí a způsobují slepotu. Na druhou stranu onemocnění charakterizovaná zúžením, kontrakcí nebo uzavřením krevních cév, jako jsou například restenózy, mají také původ v chybné regulaci protein kináz.

-29CZ 298775 B6

Vaskulogeneze a angiogeneze jsou navíc spojeny s růstem maligních solidních nádorů a metastáz. Rychle rostoucí nádory vyžadují zásobování krví bohatou na živiny a kyslík, aby mohly pokračovat v růstu. V důsledku toho dochází spolu s růstem nádoru ke vzniku abnormálně velkého množství krevních kapilár, které podporují růst nádoru. Kromě zásobování nádoru živinami, zajišťují novotvořené krevní cévy v nádorové tkáni bránu pro nádorové buňky ke vstupu do cirkulace a k metastázování do vzdálených míst v organismu. Folkman, 1990, J. Nati. Cancer Inst. 82:4-6.

Nevhodná aktivita RAF může stimulovat buněčnou proliferaci a z ní vyplývající onemocnění, ío Bylo prokázáno, že molekuly specificky navržené k modulaci funkce RAF protein kinázy inhibují buněčnou proliferaci. Konkrétně se jedná o tzv. „antisense“ molekuly nukleových kyselin, které váží mRNA kódující RAF protein kinázu a blokují tak translaci. U těchto molekul bylo prokázáno, že účinně zamezují transformaci buněk A549 za podmínek in vitro. Monia et al.,

1996, Nátuře Medicine 2:688, tato reference je tímto začleněna v celém svém rozsahu do před15 kládaného vynálezu včetně všech obrázků a tabulek. Buňky A549 jsou lidské maligní buňky.

Tyto „antisense“ studie zaměřené proti RAF předkládají důkaz, že 5-azachinoxalinové molekuly, které jsou předmětem předkládaného vynálezu, a které modulují funkci RAF protein kináz, mohou zastavit a pravděpodobně i zvrátit proliferaci maligních buněk v organismu. Tyto 520 azachinoxalinové sloučeniny mohou být testovány pomocí in vitro metod, které jsou v předkládaném vynálezu uvedeny jako příklad. 5-azachinoxalinové sloučeniny mohou být navíc testovány na efekt na nádorové buňky za podmínek in vivo pomocí xenotransplantačních metod, které jsou v předkládaném vynálezu také uvedeny jako příklad.

Existují alespoň dvě cesty nechtěné stimulace buněčné proliferace konkrétního typu buněk v důsledku nevhodné aktivity RAF: 1) přímá stimulace růstu konkrétní buňky, nebo 2) zvýšení vaskularizace konkrétní oblasti, jako je například nádorová tkáň, čímž dochází k usnadnění růstu tkáně.

Použití předkládaného vynálezu je usnadněno zaprvé identifikací, zdali je onemocnění na podkladě buněčné proliferace způsobeno aktivitou RAF. Jakmile je takové onemocnění identifikováno, mohou být pacienti postižení tímto onemocněním identifikováni pomocí analýzy jejich příznaků za pomoci postupů dobře známých lékařům nebo veterinářům znalým oboru. Tito pacienti mohou být poté léčeni, jak je popsáno v předkládaném vynálezu.

Určení, zdali je onemocnění na podkladě buněčné proliferace způsobeno aktivitou RAF, může být provedeno zaprvé určením aktivity RAF v buňkách nebo ve specifické lokalizaci v těle pacienta. Například v případě nádorových buněk může být aktivita jedné nebo více RAF porovnána mezi nádory s normální a zvýšenou aktivitou RAF. Pokud nádorové buňky mají stejnou nebo vyšší aktivitu než je aktivita u nádorových onemocnění vznikajících na podkladě zvýšené aktivity RAF, jsou vhodnými kandidáty pro léčbu za použití popsaných RAF modulujících metod a sloučenin, které jsou předmětem předkládaného vynálezu.

V případě onemocnění na podkladě buněčné proliferace, které vznikají v důsledku nechtěné pro45 liferace nenádorových buněk, je aktivita RAF porovnána s aktivitou vyskytující se v běžné populaci (např. průměrná aktivita vyskytující se v běžné populaci lidí nebo zvířat, kromě lidí nebo zvířat trpících onemocněním na podkladě buněčné proliferace). Pokud je nechtěná porucha buněčné proliferace charakterizována vyšší aktivitou RAF než je aktivita vyskytující se v běžné populaci, jedná se o poruchu, kteráje vhodným kandidátem pro léčbu za použití popsaných RAF modulujících metod a sloučenin, které jsou předmětem předkládaného vynálezu.

III Farmaceutické preparáty a aplikace 5-azachinoxalinových sloučenin

Metody přípravy farmaceutických preparátů obsahujících sloučeniny, metody určení množství sloučenin, které mají být podány pacientovi a způsoby podání sloučenin organismu jsou uvedeny

-30CZ 298775 B6 v mezinárodní patentové přihlášce WO 96/22 976, autorů Buzetti et al., o názvu „Hydrosoluble

3-Arylidine-2-oxoindole Derivatives as Tyrosine Kinase Inhibitors“, publikované 1. srpna 1996. Tento dokument je citován náhradou za přenesení jeho celého obsahu do popisu tohoto vynálezu. Odborníkovi v daném oboru je zřejmé, že popis uvedený v této citaci je aplikovatelný na předlo5 žený vynález a vynález tedy může být podle něho upraven.

Příklady provedení vynálezu ío Níže uvedené příklady nejsou nijak omezující předkládaný vynález a pouze reprezentují rozličné aspekty a rysy předkládaného vynálezu. Příklady popisují metody syntézy sloučenin, které jsou předmětem předkládaného vynálezu a metody měření efektu sloučeniny na funkci RAF protein kinázy.

Buňky používané v metodách jsou komerčně dostupné. Vektory nukleových kyselin vychytávané buňkami jsou také komerčně dostupné a sekvence genů rozličných protein kináz jsou snadno dostupné v sekvenčních bankách. Proto osoba znalá oboru může snadno vytvořit příhodným způsobem buněčné linie za pomoci komerčně dostupných buněk, komerčně dostupných vektorů nukleových kyselin a genů pro protein kinázy za použití technik snadno dostupných osobám zna20 lých oboru.

Příklad 1: Postupy syntézy 5-azachinoxalinových sloučenin, které jsou předmětem předkládaného vynálezu

Předkládaný vynález bude nyní ilustrován pomocí následujících neomezujících příkladů v kterých, ledaže je uvedeno jinak:

(i) odpaření bylo provedeno na rotačním odpařováku pod vakuem;

(ii) operace byly provedeny pod atmosférou inertního plynu, jako je například dusík;

(iii) vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) byla provedena na sorbentu Merck LiChrosorb RP-18 silika s reverzní fází, který byl získán od společnosti E. Merck,

Darmstadt, Německo;

(iv) výtěžky jsou uvedeny pouze pro ilustraci a neznamenají nezbytně nej vyšší dosažitelný výtěžek;

(v) body tání nejsou upravovány a byly získány za pomoci digitálního zařízení na určování bodu tání HWS Mainz SG 2000.

(vi) Struktury všech sloučenin, které jsou v předkládaném vynálezu charakterizovány vzorcem I, byly potvrzeny protonovou magnetickou rezonanční spektroskopií na spektrofotometru

Bruker AMX500-NMR, dále pomocí elementární mikroanalýzy a v některých případech pomocí hmotové spektroskopie;

(vii) Čistota struktur byla určena pomocí tenkovrstevné chromatografie (TLC) na silika gelu (Merck Silica Gel 60 F254) nebo pomocí HPLC; a (viii) Meziprodukty nebyly obecně plně charakterizovány a jejich čistota byla určena pomocí tenkovrstevné chromatografie (TLC) nebo pomocí HPLC.

-31 CZ 298775 B6

Syntetické postupy

Sloučenina A-2: 6-Benzylamino-3-(4-hydroxyfenyl)-5-azachinoxalin

4-Hydroxyfenylglyoxal byl připraven z 4-hydroxyacetofenonu (Lancaster, Acros) podle publikované metody (J. Amer. Chem. Soc., 71, 1045 (1949)).

2- amino-6-benzylamino-3-nitropyridin byl připraven z 2-amino-6-chlor-3-nitropyridinu ío následujícím způsobem: 2-amino-6-chlor-3-nitropyridin (17,35 g, 0,10 mol) benzylamin (Fluka) (10,72 g, 0,10 mol) a práškový uhličitan draselný (10,4 g, 0,035 mol) vn-butanolu (100 ml) bylo zahříváno pod zpětným chlazením po dobu 2 hodin. Suspenze byla zfiltrována a po ochlazení na teplotu místnosti promyta butanolem a vysušena při teplotě 50 °C ve vakuu, což vedlo ke vzniku 2-amino-6-benzylamino-3-nitropyridinu (22,2 g, 91%, teplota tání 145 ažl46°C).

6-Benzylamino-3-(4-hydroxyfenyl)-5-azachinoxalin byl připraven z 2-amino-6-benzylamino3- nitropyridinu následujícím způsobem: 2-Amino-6-benzylamino-3-nitropyridin (25 g, 0,10 mol) byl hydrogenován pod tlakem 5,5 · 10⁵ Pa (5,5 baru) H₂ za přítomnosti 10 g Raneyova niklu v 400 ml dioxanu při teplotě 60 °C. Po 2 hodinách byla reakční směs ochlazena na teplotu místnosti, zfiltrována a byl přidán 4-hydroxyfenylglyoxal a promícháván po dobu 2 hodin v argonové atmosféře. Suspenze byla poté naředěna vodou, precipitát byl sbírán filtrací, promyt vodou, rekrystalizován z 2-propanolu a vysušen při teplotě 50 °C ve vakuu, což vedlo ke vzniku 6-benzylamino-3-(4-hydroxyfenyl)-5-azachinoxalinu (8 g, 24,4%, teplota tání 271 až 273 °C.

Sloučenina A-l: 6-Fenylamino-3-(4-hydroxyfenyl)-5-azachmoxalin

Substitucí fenylaminu na místo benzylaminu v postupu pro Sloučeninu A-2 vede identický pro30 ces ke vzniku 6-fenylamino-3-(4-hydroxyfenyl)-5-azachinoxalinu.

Sloučenina A-3: 6-Metoxy-2-metyl-3-fenyl-5-azachinoxalin

Substitucí l-fenyl-l,2-propandiolu na místo 4-hydroxyfenylglyoxalu, a metanolu na místo benzylaminu v postupu pro Sloučeninu A-2 vede identický proces ke vzniku 6-metoxy-2-metyl-3fenyl-5-azachinoxalinu.

Sloučenina A—4: 6-Metoxy-2,3-difenyl-5-azachinoxalin

Substitucí benzylu na místo 4-hydroxyfenylglyoxalu, a metanolu na místo benzylaminu v postupu pro Sloučeninu A-2 vede identický proces ke vzniku 6-metoxy-2,3-difenyl-5-azachinoxalinu.

Sloučenina A-5: 6-(4-Fluorbenzylamino)-2-metyl-3-fenyl-5-azachinoxalin

Substitucí l-fenyl-l,2-propandiolu na místo 4-hydroxyfenylglyoxalu, a 4-fluorbenzylaminu na 50 místo benzylaminu v postupu pro Sloučeninu A-2 vede identický proces ke vzniku 6-(4-fluobenzylamino)-2-metyl-3-fenyl-5-azachinoxalinu.

-32CZ 298775 B6

Sloučenina A-6: 2,3-Difenyl-6-(4-fluorbenzylamino)-5-azachinoxalin

Substitucí benzylu na místo 4-hydroxyfenylglyoxalu, a 4-fluorbenzylaminu na místo benzylaminu v postupu pro Sloučeninu A-2 vede identický proces ke vzniku 2,3-difenyl-6-(4-fluor5 benzylamino)-5-azachinoxalinu.

Sloučenina A-7: 3-Fenyl-6-fenylamino-5-azachinoxalin

Substitucí fenylglyoxalu na místo 4-hydroxyfenylglyoxalu, a anilinu na místo benzylaminu v postupu pro Sloučeninu A-2 vede identický proces ke vzniku 3-fenyl-6-fenylamino-5-azachinoxalinu.

Sloučenina A-8 - A-26:

Substitucí příslušného substituovaného benzylaminu na místo benzylaminu v postupu pro Sloučeninu A-2 vede identický proces ke vzniku následujících Sloučenin:

Sloučenina A-8: 6-(2-karboxybenzylamino)-3-(4-hydroxyfenyl)-5-azachinoxalin Sloučenina A-9: 6-(3-karboxybenzylamino)-3-(4-hydroxyfenyl)-5-azachinoxalin

Sloučenina A-10 Sloučenina A-l 1 Sloučenina A-l2 Sloučenina A-l3 Sloučenina A-l4 Sloučenina A-l 5 Sloučenina A-l 6 Sloučenina A-l 7 Sloučenina A-l 8 Sloučenina A-l9 Sloučenina A-20 Sloučenina A-21 Sloučenina A-22 Sloučenina A-23 Sloučenina A-24 Sloučenina A-25 Sloučenina A-26

6-(4-karboxybenzylamino)-3-{4-hydroxyfenyl)-5-azachinoxalin

3-(4-hydroxyfenyl)-6-(2-nitrobenzylamino)-5-azachinoxalin

3-(4-hydroxyfenyl)-6-(3-nitrobenzylamino)-5-azachinoxalin

3-(4-hydroxyfenyl)-6-(4-nitrobenzylamino)-5-azachinoxalin

3-(4-hydroxyfenyl)-6-(2-metylbenzylamino)-5-azachinoxalin

3-(4-hydroxyfenyl)-6-(3-metylbenzylammo)-5-azachinoxalin

3-(4-hydroxyfenyl)-6-(4-metylbenzylamino)-5-azachinoxalin

6-(2-chlorbenzylamino)-3-(4-hydroxyfenyl)-5-azachinoxalin

6-(3-chlorbenzylamino)-3-(4-hydroxyfenyl)-5-azachinoxalin

6-(4-chlorbenzylamino)-3-(4-hydroxyfenyl)-5-azachinoxalin

6-(2-fluorbenzylamino)-3-(4-hydroxyfenyl)-5-azachinoxalin

6-(3-fluorbenzylamino)-3-(4-hydroxyfenyl)-5-azachinoxalin

6-(4-fluorbenzylamino)-3-(4-hydroxyfenyl)-5-azachinoxalin

3-(4-hydroxyfenyl)-6-[2-(trifluormetyl)benzylamino)-5-azachinoxalin

3-(4-hydroxyfenyl}-6-[3-(tiifluormetyl)benzylamino)-5-azachinoxalin

3-{4-hydroxyfenyl)-6-[4-(trifluormetyl)benzylamino)-5-azachinoxalin

3-(4-hydroxyfenyl)-6-(fenetyl-l-amino)-5-azachinoxalin

Sloučenina A-27 - A-48:

Substitucí příslušného substituovaného anilinu na místo benzylaminu v postupu pro Sloučeninu A-2 vede identický proces ke vzniku následujících Sloučenin:

Sloučenina A-27: 6-(2-karboxyfenylamino)-3-(4-hydroxyfenyl)-5-azachinoxalin

Sloučenina A-28: 6-(3-karboxyfenylamino)-3-(4-hydroxyfenyl)-5-azachinoxalin Sloučenina A-29: 6-(4-karboxyfenylamino)-3-(4-hydroxyfenyl)-5-azachinoxalin Sloučenina A-30: 3-(4-hydroxyfenyl)-6-(2-nitrofenylamino)-5-azachinoxalin Sloučenina A-31: 3-(4-hydroxyfenyl)-6-(3-nitrofenylamino)-5-azachinoxalin Sloučenina A-32: 3-(4-hydroxyfenyl)-6-(4-nitrofenylamino)-5-azachinoxalin

Sloučenina A-33: 3-(4-hydroxyfenyl}-6-(2-metylfenylamino)-5-azachinoxalin

-33CZ 298775 B6

Sloučenina A-34: 3-(4-hydroxyfenyl)-6-(3-metylfenylamino)-5-azachinoxalin Sloučenina A-35: 3-(4-hydroxyfenyl)-6-{4-metylfenylamino)-5-azachinoxalin Sloučenina A-36: 6-(2-chlorfenylamino)-3-(4-hydroxyfenyl)-5-azachinoxalin Sloučenina A-37: 6-(3-chlorfenylamino)-3-(4-hydroxyfenyl)-5-azachinoxalin

Sloučenina A-3 8: 6-(4-chlorfenylamino)-3-(4-hydroxyfenyl)-5-azachinoxalin Sloučenina A-39: 6-(2-fluorfenylamino)-3-(4-hydroxyfenyl)-5-azachinoxalin Sloučenina A-40: 6-(3-fluorfenylamino)-3-(4-liydroxyfenyl)-5-azachinoxalin Sloučenina A-41: 6-(4-fluorfenylamino)-3-(4-hydroxyfenyl)-5-azachinoxalin Sloučenina A-42: 3-(4-hydroxyfenyl)-6-[2-{trifluormetyl)fenylamino)-5-azachinoxalin io Sloučenina A-43: 3-(4-hydroxyfenyl)-6-[3-(trifluormetyl)fenylamino)-5-azachinoxalin Sloučenina A-44: 3-(4-hydroxyfenyl)-6-[4-(trifluonnetyl)fenylamino)-5-azachinoxalin Sloučenina A-45: 3-(4-hydroxyfenyl)-6-(pyrid-2-amino)-5-azachinoxalin Sloučenina A-46: 3-(4-hydroxyfenyl)-6-(pyrid-3-amino)-5-azachinoxalin Sloučenina A-47: 3-(4-hydroxyfenyl)-6-(pyrid-4-amino)-5-azachinoxalin

Sloučenina A^I8: 3-(4-hydroxyfenyl)-6--(pyrid-2-metylamino)-5-azachinoxalin

Sloučenina A-49 - A-67:

Sloučenina A-50 Sloučenina A-51 Sloučenina A-52 Sloučenina A-53 Sloučenina A-54 Sloučenina A-55 Sloučenina A-5 6 Sloučenina A-5 7 Sloučenina A-58 Sloučenina A-59 Sloučenina A-60 Sloučenina A-61 Sloučenina A-62 Sloučenina A-63 Sloučenina A-64 Sloučenina A-65 Sloučenina A-66 Sloučenina A-67

Substitucí příslušného substituovaného benzylaminu na místo benzylaminu, a fenylglyoxalu na místo 4-hydroxyfenylglyoxalu v postupu pro Sloučeninu A-2 vede identický proces ke vzniku následujících Sloučenin:

Sloučenina A-49: 6-(2-karboxybenzylamino)-3-fenyl-5-azachinoxalin 6-(3-karboxybenzylamino)-3-fenyl-5-azachinoxalin 25 Sloučenina A-51: 6-(4-karboxybenzylamino)-3-fenyl-5-azachinoxalin 6-(2-nitrobenzylamino)-3-fenyl-5-azachinoxalin 6-(3-nitrobenzylamino)-3-fenyl-5-azachinoxalin 6-(4-nitrobenzylamino)-3-fenyl-5-azachinoxalin 6-(2-metylbenzylamino)-3-fenyl-5-azachinoxalin 6-(3-metylbenzylamino)-3-fenyl-5-azachinoxalin 6-{4-mety lbenzy lamino)-3-fenyl-5-azach inoxal in 6-(2-chlorbenzylamino)-3-fenyl-5-azachinoxalin 6-(3-chlorbenzylamino)-3-fenyl-5-azachinoxalin 6-(4-chlorbenzylamino)-3-fenyl-5-azachinoxalin 6-(2-fluorbenzylamino}-3-fenyl-5-azachinoxalin 6-(3-fluorbenzylamino)-3-fenyl-5-azachinoxalin 6-(4-fluorbenzylamino)-3-fenyl-5-azachinoxalin 3-fenyl-6-[2-(trifluormetyl)benzylamino)-5-azachinoxalin 3-fenyl-6-[3-{trifluormetyl)benzylamino)-5-azachinoxalin 40 Sloučenina A-66: 3-fenyl-6-[4-(trifluormetyl)benzylamino)-5-azachinoxalin 3-fenyl-6-(fenetyl-l-amino)-5-azachinoxalin

Sloučenina A-68 - A-89:

Substitucí příslušného substituovaného anilinu na místo benzylaminu, a fenylglyoxalu na místo

4-hydroxyfenylglyoxalu v postupu pro Sloučeninu A-2 vede identický proces ke vzniku následujících Sloučenin:

Sloučenina A-68: 6-{2-karboxyfenylamino)-3-fenyl-5-azachinoxalin 50 Sloučenina A-69: 6-(3-karboxyfenylamino)-3-fenyl-5-azachinoxalin

-34CZ 298775 B6

Sloučenina A-70 Sloučenina A-71 Sloučenina A-72 Sloučenina A-73 Sloučenina A-74 Sloučenina A-75 Sloučenina A-76 Sloučenina A-77 Sloučenina A-78 Sloučenina A-79 Sloučenina A-80 Sloučenina A-81 Sloučenina A-82 Sloučenina A-83 Sloučenina A-84 Sloučenina A-85 Sloučenina A-86 Sloučenina A-87 Sloučenina A-88 Sloučenina A-89

6-(4-karboxyfenylamino)-3-fenyl-5-azachinoxalin

6-(2-nitrofenylamino)-3-fenyl-5-azachinoxalin

6-(3-nitrofenylamino)-3-fenyl-5-azachinoxalin

6-(4-nitrofenylamino)-3-fenyl-5-azachinoxalin

6-{2-metylfenylamino)-3-fenyl-5-azachinoxalin

6-(3-metylfenylamino)-3-fenyl-5-azachinoxalin

6-(4-metylfenylamino)-3-fenyl-5-azachinoxalin

6-(2-chlorfenylamino)-3-fenyl-5-azachinoxalin

6-(3-chlorfenylamino)-3-fenyl-5-azachinoxalin

6-(4-chlorfenylamino)-3-fenyl-5-azachinoxalin

6-(2-fluorfenylamino)-3-fenyl-5-azachinoxalin

6-(3-fluorfenylamino)-3-fenyl-5-azachinoxalin

6-(4-fluorfenylamino)-3-fenyl-5-azachinoxalin

3-fenyl-6-[2-(trifluormetyl)fenylamino)-5-azachinoxalin

3-fenyl-6-[3-(trifluormetyl)fenylamino)-5-azachÍnoxalin

3-fenyl-6-[4-{trifluormetyl)fenylamino)-5-azachinoxalin

3-fenyl-6-(pyrid-2-amino)-5-azachinoxalin

3-fenyl-6-(pyrid-3-amino)-5-azachinoxalin

3-fenyl-6-(pyrid-4-amino)-5-azachinoxalin

3-fenyl-6-(pyrid-2-metylamino)-5-azachinoxalin

Sloučeniny A-90: 6-fenylamino-3-(4-metoxyfenyl)-5-azachinoxalin

Substitucí 4-metoxyfenylu na místo 4-hydroxyfenylu v postupu pro Sloučeninu A-l vede identický proces ke v zniku 6-fenylamino-3-(4-metoxyfenyl)-5-azachinoxalinu.

Příklad 2: Stanovení fosforylační funkce RAF

Následující metoda zaznamenává stupeň fosforylace cílového proteinu MEK, stejně tak jako cíle proteinu MEK, proteinu MAPK, katalyzované pomocí RAF. Sekvence genu pro RAF je popsána v publikaci autorů Bonner et al., 1985, Molec. Cell. Biol. 5: 1400-1407, a je snadno dostupná v databankách genových sekvencí. Konstrukce vektoru nukleové kyseliny a použitých buněčných linií využívaných v předkládaném vynálezu je plně popsána v publikaci autorů Morrison et al.,

1988, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85: 855-8859.

Materiál a reagencie

1. Buňky Sf9 (Sppodoptera frugiperda); GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD.

2. RIPA pufr: 20 mM Tris/HCl pH 7,4, 137 mM NaCl, 10% glycerol, 1 mM PMSF, 5 mg/1 aproteninu, 0,5% Tritonu X-100;

3. Thioredoxin-MEK fúzní protein (T-MEK): Exprese T-MEK a purifikace afinitní chromatografií byly provedeny podle postupů dle výrobce. Katalogové č. K 350-01 a R 350—40,

Invitrogen Corp., San Diego, CA

4. His-MAPK (ERK 2); MAPK s histidinovou kotvou byla exprimována vXLl Blue cells transformovaných vektorem pUC18 kódujícím His-MAPK. His-MAPK byla purifikována pomocí Ni-afinitní chromatografie. Katalogové č. 27—4949—01, Farmacie, Alameda, Kalifornie, jak je popsáno v předkládaném vynálezu.

-35 CZ 298775 B6

5. Ovčí anti myší IgG: Jackson Laboratories, West Grove, PA, Katalogové č. 515-006-008, šarže 28563

6. Specifická protilátka proti RAF-1 protein kináze: URP2653 od UBI.

7. Potahovací pufr: PBS; fosfátový pufr, GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD

8. Promývací pufr: TBST - 50 mM tris/HCl pH 7,2, 150 mM NaCl, 0,1% Triton X-100

9. Blokující pufr: TBST, 0,1% etanolamin pH 7,4

10. DMSO, Sigma, St. Louis, Mo

11. Kinázový pufr (KB): 20 mM Hepes/HCl pH 7,2, 150 mM NaCl, 0,1% triton X-100, 1 mM PMSF, 5 mg/1 aproteninu, 75 mM ortovanadátu sodného, 0,5 MM DDT a 10 mM MgCl₂.

ío 12. Směs ATP: 100 mM MgCl₂, 300 μΜ ATP, 10 nCi g-³³P ATP (Dupont-NEN)/ml.

13. Zastavující roztok: 1% kyselina fosforečná; Fisher, Pitshburgh, PA.

14. Wallac celulózové filtry; Wallac, Turku, Finsko.

15. Filtrovací promývací roztok: 1% kyselina fosforečná; Fisher, Pitsburgh, PA.

16. Destičkový harverster Tomtec, Wallac, Turku, Finsko.

17. Wallac beta destičkový reader, Wallac, Turku, Finsko.

18. NUNC polypropylenové destičky s 96 jamkami s dnem ve tvaru písmene V, Applied Scientific, katalogové č. AS-72092

Postup

Všechny následující kroky byly prováděny při pokojové teplotě, ledaže je specifikováno jinak.

1. Potažení ELIS A destičky: ELISA jamky jsou potaženy přes noc při teplotě 4 °C pomocí 100 ml ovčího anti myšího afinitně purifikovaného antiséra (1 pg/100 μΐ potahovacího pufru). ELISA destičky mohou být použity po dobu 2 týdnů, pokud jsou skladovány při teplotě

4 °C.

2. Obraťte destičku a odstraňte tekutou složku. Přidejte 100 μΐ blokujícího roztoku inkubujte po dobu 30 minut.

3. Odstraňte blokující roztok a promyjte 4-krát pomocí promývacího pufru. Položte destičku na papírový ubrousek za účelem odstranění nadbytku tekutiny.

4. Přidejte do každé jamky 1 pg specifické protilátky proti RAF-1 a inkubujte po dobu hodiny. Promyjte tak, jak je popsáno v kroku 3.

5. Rozmrazte lyzáty zRAS/RAF infikovaných Sf9 buněk a nařeďte je pomocí TBST na 10 pg/100 pl. Přidejte 10 pg naředěného lyzátu do jamek a inkubujte jednu hodinu. Třepejte destičku během inkubace. Negativní kontroly neobsahují žádný lyzát. Lyzáty z RAS/RAF infikovaných Sf9 hmyzích buněk jsou připraveny po infikaci buněk rekombinantními bakuloviiy při MOI 5 pro každý virus, a sbírány o 48 hodin později. Buňky jsou jednou promyty pomocí PBS a lyžovány v RIPA pufru. Nerozpustný materiál je odstraněn centrifugací (5 minut při 10 000 g). Alikvóty lyzátů jsou zamrazeny v suchém ledu/etanolu a uskladněny při teplotě -80 °C až do použití.

6. Odstraňte nenavázaný materiál a promyjte tak, jak je popsáno výše (krok 3).

7. Přidejte 2 pg T-MEK a 2 pg His-MAEPK na jamku a upravte objem do 40 pl pomocí kinázového pufru. Metody purifikace T-MEK a MAPK z buněčných extraktů jsou zde uvedeny ve formě příkladu.

8. Předřeďte sloučeniny (zásobní roztok 10 mg/ml DMSO) nebo extrakty 20 krát v TBST plus

1% DMSO. Přidejte 5 pl předředěných sloučenin/extraktů do jamek popsaných v kroku 6.

Inkubujte po dobu 20 minut. Kontroly neobsahují žádný lék.

-36CZ 298775 B6

9. Začněte kinázovou reakci přidáním 5 μΐ směsi ATP. Promíchávejte destičky během inkubace na ELIS A destičkové třepačce.

10. Zastavte kinázovou reakci po 60 minutách přidáním 30 μΐ zastavovacího roztoku do každé jamky.

11. Umístěte fosfocelulózový filtr a ELIS A destičku do Tomtec destičkového harvesteru. Seberte a promyjte filtr promývacím roztokem podle doporučení výrobce. Vysušte filtry. Utěsněte filtry a umístěte je do držáku. Vložte držák do zařízení na detekci radioaktivity a kvantifikujte radioaktivní fosfor na filtrech.

ío Alternativně mohou být přeneseny 40 μΐ alikvóty z jednotlivých jamek destičky do korespondujících pozic na fosfocelulózovém filtru. Po vysušení filtru vzduchem položte filtry na misku. Jemně misku promíchávejte a vyměňujte promývací roztok v 15 minutových intervalech po dobu 1 hodiny. Vysušte filtry vzduchem. Utěsněte filtry a umístěte je do držáku vhodného pro měření radioaktivního fosforu ve vzorcích. Vložte držák do zařízení na detekci radioaktivity a kvantifikujte radioaktivní fosfor na filtrech.

Hodnoty IC₅₀ byly měřeny podle protokolu pro následující 5-azachinoxalinové sloučeniny v RAF-1 ELISA analýze:

(A-l) (^A“²>

Hodnota IC₅o je koncentrace 5-azachinoxalinového inhibitoru požadovaného ke snížení maximálního množství fosforylovaného cílového proteinu nebo buněčného růstu o 50%. Hodnoty IC₅₀ měřené v RAF-1 fosforylační analýze jsou zobrazeny v Tabulce 1:

-37CZ 298775 B6

Tabulka 1

Sloučenina	IC50 (jiM)
A-l	11,5
A-2	7,8
A-7	33
A-36	45, 6
A-77	20,3
A-90	98,0

Příklad 3: Purifikace MAPK a MEK

MAPK a MEK proteiny jsou snadno exprimovány v buňkách pomocí subklonování genu kódujícího tyto proteiny do komerčně dostupného vektoru, který exprimuje proteiny s polyhistidinovou ío kotvou. Geny kódující tyto proteiny jsou snadno dostupné v laboratořích, které normálně pracují s těmito proteiny, nebo pomocí klonování těchto genů z buněk obsahujících cDNA knihovny.

Knihovny jsou snadno dostupné a osoba znalá oboru může snadno připravit próby nukleových kyselin homologních k cDNA molekul kódujících MEK nebo MAPK ze sekvencí nukleových kyselin MEK a MAPK dostupných v databázích genů, jako je například Genbank. Klonování genu může být dosaženo v krátkém časovém úseku za použití technik běžně dostupných osobám zkušeným v oboru.

Purifikace MEK a MAPK proteinů z buněčných extraktů může provedena za použití následujícího protokolu, který je upraven podle Robbinse et al., 1993, J. Biol. Chem. 268: 5097-5106:

1. Proveďte lýzu buněk pomocí sonikace, osmotického stresu, nebo French presu za pomoci technik dostupných osobám znalým oboru. Vhodný sonikační pufr je uveden níže.

2. Ekvilibruje pevnou matrici, která je konjugována s niklem nebo kobaltem ekvilibračním pufrem uvedeným níže. Polyhistidinová kotva se specificky váže na atomy niklu a kobaltu na pevné matrici. Ekvilibrace může být dosaženo promytím pryskyřice třikrát ekvilibračním pufrem v objemu rovném 10 objemům pevné matrice. Pevná matrice je snadno dostupná osobám znalým oboru.

3. Přidejte buněčný lyzát k pevné matrici a ekvilibrujte v nádobě po určitou dobu. Alternativně může být pevná matrice naplněna do chromatografické kolony a lyzát může být nalit na kolonu obsahující pevnou matrici.

4. Promyjte pevnou matrici pomocí promývacího pufru uvedeného níže.

5. Proveďte eluci MEK a MAPK proteinu zpěvné matrice pomocí elučního pufru (uveden níže), kterým odstraníte významnou část proteinu z pevné matrice.

Sonikační pufr mM fosfát sodný, pH 8,0 0,3 M chlorid sodný 10 mM β-merkaptoetanol

1%NP4O ÍOmMNaF 0,5 mM Pefablock

-38CZ 298775 B6

Ekvilibrační pufr mM fosfát sodný, pH 8,0 0,3 M chlorid sodný

10 mM β-merkaptoetanol

1%NP4O lOmMNaF 1 mM imidazol ío Promývací pufr mM fosfát sodný, pH 8,0 0,3 M chlorid sodný 10 mM β-merkaptoetanol l%NP40 lOmMNaF 1 mM imidazol

Eluční pufr mM fosfát sodný, pH 8,0 0,3 M chlorid sodný 10 mM β-merkaptoetanol 1%NP4O

10 mM NaF

10-500 mM imidazol

Příklad 4: Stanovení fosforylační funkce RAF EGF receptoru

Aktivita EGF receptorové kinázy (EGFR-NIH3T3 analýza) byla měřena v celých buňkách, jak je popsáno detailně v PCT publikaci WO 96/40 116, zaregistrované 5. června 1996 autry Tang et al. nazvané „Indolinone Compounds for the Treatment of Disease“, která je v předkládaném vynálezu začleněna jako reference v celém svém rozsahu včetně vyobrazení.

Hodnoty IC50 měřené v analýze na EGF receptorovou fosfory láci jsou uvedeny v Tabulce 2:

Tabulka 2

Sloučenina	ICS0 (μΜ)
A-2	>50
A-3	>100
A-4	>100
A-5	>100
A-6	>100
A-7	>50

-39CZ 298775 B6

Příklad 5: Stanovení efektu 5-azachinoxalinových sloučenin na růst buněk exprimujících

RAS

Následující metoda měří stupeň růstu NIH-3T3 buněk exprimujících RAS. Účelem metody je určit účinky sloučenin narůstNIH-3T3 buněk exprimujících H-Ras

Materiál ío 96 jamkové sterilní destičky s plochým dnem 96 jamkové sterilní destičky s kulatým dnem sterilní 25 ml nebo 100 ml nádoba pipety, vícekanálová pipeta sterilní pipetové špičky sterilní 15 ml a 50 ml zkumavky Reagencie

0,4% SRB v 1% kyselině octové lOmMTrisbáze 10% TCA 1% kyselina octová sterilní DMSO (Sigma) sloučenina v DMSO (100 mM nebo slabší zásobní roztok)

Trypsin-EDTA (GIBCO BRL)

Buněčná linie

3T3/H-Ras (NIH 3T3 klon 7 buněk exprimujících genomický fragment onkogenního H-Ras).

Buňky mohou být připraveny za použití následujícího protokolu:

1. Subklonujte fragment genu kódující Ras do komerčně dostupného vektoru, který bude stabilně transfektovat NIH-3T3 buňky. Fragment je z genomické transformující alely cHa-ras.

2. Transfektujte NIH-3T3 buňky subklonovaným vektorem pomocí metody s kalcium fosfátem. Vyberte buňky exprimující Ras konstrukt ve 2% séru v DMEM. Po dvou týdnech jsou pozorována viditelná ložiska. Vytvořte pool transformovaných buněk, abyste získali stabilně transformovanou buněčnou linii.

Růstové médium

2% telecí sérum/DMEM + 2 mM glutamin, Pen/Strep

Protokol

Den 0: Umístění buněk:

Tato část metody je prováděna v boxu s laminámím prouděním.

1. Trypsinizujte buňky. Přeneste 200 ml buněčné suspenze k 10 ml izotonického roztoku.

Spočítejte buňky pomocí přístroje Coulter Counter.

2. Nařeďte buňky v růstovém médiu na 60 000 buněk/ml. Přeneste 100 ml buněk do každé jamky v 96-jamkové destičce s plochým dnem, aby bylo v každé jamce 6000 buněk.

-40CZ 298775 B6

3. Použijte polovinu destičky (4 řady) pro každou sloučeninu a pracujte v kvadrupletu pro každou koncentraci sloučeniny. Pro kontrolní médium použijte 4 jamky.

4. Destičky jemně promíchejte, aby došlo k jednotnému přichycení buněk.

5. Inkubujte destičky při teplotě 37 °C v inkubátoru s 10% CO₂.

Den 1: Přidání sloučeniny:

Tato část metody je prováděna v boxu s laminámím prouděním.

ίο 1. Do 96-jamkové destičky s kulatými dny přidejte 120 μΐ růstového média obsahujícího 2x nejvyšší finální koncentraci DMSO, která byla nalezena při skríninku koncentrací sloučenin ve sloupcích 1 až 11. Například pokud je nejvyšší koncentrace 100 μΐ a taje připravena ze 100 mM zásobního roztoku, lx DMSO je 0,1% a 2x DMSO je 0,2%. Tato destička je použita k vytitrování sloučeniny, 4 řady na jednu sloučeninu.

2. Ve sterilní 15 ml zkumavce připravte 2x roztok nejvyšší skríninkové koncentrace sloučeniny v růstovém médiu plus 2x DMSO. Je potřeba 1 ml na buněčnou linii. Výchozí koncentrace sloučeniny je obvykle 100 μΜ, ale tato koncentrace se může lišit v závislosti na solubilitě sloučeniny.

3. Přeneste v kvadrupletu 240 μΐ 2x roztoku výchozí sloučeniny do jamek ve sloupci 12 v 96-jamkové destičce s kulatými dny. Proveďte sérii ředění 1:2 v celé destičce zprava doleva přenesením 12 μΐ ze sloupce 12 do sloupce 11, ze sloupce 11 do sloupce 10 atd. až ke sloupci 2. Přeneste 100 μΐ sloučeniny a 100μ1 média do sloupce 1, na 100 μΐ média na buňky v korespondujících jamkách 96-jamkové destičky s plochými dny. Celkový objem na jamku by měl být 200 μΐ.

4. Vraťte destičku do inkubátoru a inkubujte po dobu 3 dnů.

Den 4: Vyvinutí analýzy:

Tato část metody je prováděna na laboratorním stole.

1. Aspirujte nebo vylijte médium. Přidejte 200 ml studené 10% TCA do každé jamky, abyste zafixovali buňky. Inkubujte destičku po dobu alespoň 60 minut při teplotě 4 °C.

2. Odstraňte TCA a promyjte jamky 5-krát tekoucí vodou. Vysušte destičky hlavou vzhůru na papírových ubrouscích.

3. Barvěte buňky pomocí 100 μΐ 0,4% SRB na jamku po dobu 10 minut.

4. Vylijte SRB a promyjte jamky 5-krát pomocí 1% kyseliny octové. Vysušte kompletně destičky hlavou vzhůru na papírových ubrouscích.

5. Solubilizujte barvivo pomocí 100 μΐ 10 mM Tris báze po dobu 5-10 minut na třepačce.

6. Odečtěte destičky na zařízení Dynatech ELISA Plate Reader při vlnové délce 570 nm s referencí při 630 nm.

Vybrané sloučeniny inhibovaly růst buněk overexprimujících RAS, jak je ilustrováno v Tabulce 3.

-41 CZ 298775 B6

Tabulka 3

Sloučenina	ICS0 ψΜ) RAS/NIH3T3
A-l	1,04
A-2	7,6
A-6	13,5
A-36	0,18
A-77	0,7

Příklad 6: Stanovení efektu 5-azachinoxalinových sloučenin na růst buněk A549

Následující metoda měří stupeň růstu buněk A549. Účelem metody je určit účinky sloučenin na růst A549 buněk lidského karcinomu plic. Buňky A549 jsou snadno dostupné z komerčních zdrojů, jako je například ATCC (CCL185).

Materiál jamkové sterilní destičky s plochým dnem

96 jamkové sterilní destičky s kulatým dnem sterilní 25 ml nebo 100 ml nádoba pipety, vícekanálová pipeta sterilní pipetové špičky sterilní 15 ml a 50 ml zkumavky

Reagencie

0,4% SRB v 1 % kyselině octové 10 mM Tris báze

10% TCA % kyselina octová sterilní DMSO (Sigma) sloučenina v DMSO (100 mM nebo slabší zásobní roztok)

Trypsin-EDTA (GIBCO BRL)

Buněčná linie

A549 buňky lidského karcinomu plic (ATCC CCL185)

10% fetální telecí sérum v Ham F12-K

Protokol

Den 0: Umístění buněk:

Tato část metody je prováděna v boxu s laminámím prouděním.

1. Trypsinizujte buňky. Přeneste 200 ml buněčné suspenze k 10 ml izotonického roztoku. Spočítejte buňky pomocí přístroje Coulter Counter.

2. Nařeďte buňky v růstovém médiu na 20 000 buněk/ml. Přeneste 100 μΐ buněk do každé jamky v 96-jamkové destičce s plochým dnem, aby bylo v každé jamce 2000 buněk.

-42CZ 298775 B6

3. Použijte polovinu destičky (4 řady) pro každou sloučeninu a pracujte v kvadrupletu pro každou koncentraci sloučeniny. Pro kontrolní médium použijte 4 jamky.

4. Destičky jemně promíchejte, aby došlo k jednotnému přichycení buněk.

5. Inkubujte destičky při teplotě 37 °C v inkubátoru s 10% CO₂.

Den 1: Přidání sloučeniny:

Tato část metody je prováděna v boxu s laminámím prouděním.

ίο 1. Do 96-jamkové destičky s kulatými dny přidejte 120 μΐ růstového média obsahujícího 2x nejvyšší finální koncentraci DMSO, která byla nalezena při skríninku koncentrací sloučenin ve sloupcích 1 až 11. Například pokud je nejvyšší koncentrace 100 μΜ a tak je připravena ze 100 mM zásobního roztoku, lx DMSO je 0,1% a 2x DMSO je 0,2%. Tato destička je použita k vytitrování sloučeniny, 4 řady na jednu sloučeninu.

2. Ve sterilní 15 ml zkumavce připravte 2x roztok nejvyšší skríninkové koncentrace sloučeniny v růstovém médiu plus 2x DMSO. Je potřeba 1 ml na buněčnou linii. Výchozí koncentrace sloučeniny je obvykle 100 μΜ, ale tato koncentrace se může lišit v závislosti na solubilitě sloučeniny.

3. Přeneste v kvadrupletu 240 μΐ 2x roztoku výchozí sloučeniny do jamek ve sloupci 12 v 96-jamkové destičce s kulatými dny. Proveďte sérii ředění 1:2 v celé destičce zprava doleva přenesením 12 ml ze sloupce 12 do sloupce 11, ze sloupce 11 do sloupce 10 atd. až ke sloupci 2. Přeneste 100 ml sloučeniny a 100 ml média do sloupce 1, na 100 ml média a buňkách v korespondujících jamkách 96-jamkové destičky s plochými dny. Celkový objem na jamku by měl být 200 ml.

4. Vraťte destičku do inkubátoru a inkubujte po dobu 3 dnů.

Den 5: Vyvinutí analýza:

Tato část metody je prováděna na laboratorním stole.

1. Aspirujte nebo vylijte médium. Přidejte 200 ml studené 10% TCA do každé jamky, abyste zafixovali buňky. Inkubujte destičku po dobu alespoň 60 minut při teplotě 4 °C.

2. Odstraňte TCA a promyjte jamky 5-krát tekoucí vodou. Vysušte destičky hlavou vzhůru na papírových ubrouscích.

3. Barvěte buňky pomocí 100 ml 0,4% SRB na jamku po dobu 10 minut.

4. Vylijte SRB a promyjte jamky 5-krát pomocí 1% kyseliny octové. Vysušte kompletně destičky hlavou vzhůru na papírových ubrouscích.

5. Solubilizujte barvivo pomocí 100 ml 10 mM Tris báze po dobu 5-10 minut na třepačce.

6. Odečtěte destičky na zařízení Dynatech ELISA Plate Reader při vlnové délce 570 nm s referencí při 630 nm.

Vybrané sloučeniny inhibovaly růst buněk A549, jak je ilustrováno v Tabulce 4.

Tabulka 4

Sloučenina	ICso (JUM) A549
A-2	25,1 >10 (2% FBS)
A-6	23,8 >10 (2% FBS)

-43 CZ 298775 B6

Příklad 7: Metoda určení biologické aktivity RAF modulátorů in vivo

K monitoraci účinku sloučenin, které jsou předmětem předkládaného vynálezu, na inhibici nádo5 rových buněk vaječníků, melanomu, prostaty, plic a prsu mohou být použity xenotransplantátové studie. Protokol metody je popsán v PCT publikaci WO 96/40 116, zaregistrované 5. června 1996 autory Tang et al. nazvané „Indolinone Compounds for the Treatment of Disease“, která je v předkládaném vynálezu začleněna jako reference v celém svém rozsahu včetně vyobrazení.

ío Zde ilustrativně popsaný předkládaný vynález může být použit v nepřítomnosti jakýchkoli limitací, které zde nejsou specificky uvedeny. Uváděné termíny a výrazy jsou použity jako termíny popisné a nikoli omezující. Rozličné modifikace těchto termínů a výrazů jsou možné a jsou zahrnuty do rozsahu předkládaného vynálezu. Proto by mělo být rozuměno, že ačkoli předkládaný vynález byl specificky uveden preferovanými formami předkládaného vynálezu, jsou možné změny a modifikace konceptů zde uvedených, které by mohli být použity osobami znalými oboru, považovány za patřící do rozsahu tohoto vynálezu, jak je definováno v připojených patentových nárocích.

Reference, které nebyly v předkládaném vynálezu začleněny jako reference, včetně patentových i nepatentových referencí, jsou zde výslovně začleněny jako reference pro všechny účely. Další formy předkládaného vynálezu jsou uvedeny v následujících patentových nárocích.

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (12)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Způsob in vitro identifikace sloučenin, které modulují funkci serin/threonin protein kinázy, 30 vyznačující se t í m , že zahrnuje následující stupně:

   a) kontaktování buněk exprimujících tuto serin/threonin protein kinázu se sloučeninou na bázi 5-azachinoxalinu a

   b) monitorování účinku na takto zpracované buňky.

   35
2. 2. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že účinkem je změna nebo absence změny buněčného fenotypu.
3. 3. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že účinkem je změna nebo absence změny buněčné proliferace.
4. 4. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že účinkem je změna nebo absence změny katalytické aktivity serin/threonin protein kinázy.
5. 5. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že účinkem je změna nebo absence 45 změny interakce mezi serin/threonin protein kinázou a přirozeným vazebným partnerem.
6. 6. Způsob podle nároku 1,vyznačuj ící se tím, že zahrnuje následuj ící kroky:

   a) lýzu buněk za účelem získání lyzátu obsahujícího serin/threonin protein kinázu;

   b) adsorpci serin/threonin protein kinázy na protilátku;

   50 c) inkubaci adsorbované serin/threonin protein kinázy se substrátem nebo substráty; a d) adsorpci substrátu nebo substrátů na pevný nosič nebo protilátku,

   -44CZ 298775 B6 přičemž krok monitorování účinku na buňky zahrnuje měření koncentrace fosfátu v substrátu nebo substrátech.
7. 7. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že serin/threonin protein kinázou je 5 RAF a způsob zahrnuje následující kroky:

   a) lýzu buněk pro získání lyzátu obsahujícího RAF;

   b) adsorpci RAF na protilátku;

   c) inkubaci adsorbované RAF s MEK a MAPK; a

   d) adsorpci MEK a MAPK na pevný nosič nebo protilátku či protilátky, přičemž krok monitorování účinku na buňky zahrnuje měření koncentrace fosfátu v MEK a MAPK.
8. 8. Sloučenina na bázi 5-azachinoxalinu obecného vzorce I kde

   Ri, R₂ a Ré jsou nezávisle vybrány ze skupiny tvořené 20 (i) vodíkem;

   (ii) nasyceným nebo nenasyceným alkylem popřípadě substituovaným pěti- nebo šestičlenným arylovým nebo heteroarylovým cyklickým zbytkem, přičemž tento cyklický zbytek je popřípadě substituovaný jedním, dvěma nebo třemi substituenty nezávisle vybranými ze skupiny

   25 tvořené alkylem, halogenem, trihalogenmethylem, karboxylátem, nitroskupinou a esterovou skupinou;

   (iii) aminem vzorce NX₂X₃, kde X₂ a X₃ jsou nezávisle vybrány ze skupiny tvořené vodíkem, nasyceným nebo nenasyceným alkylem a pěti- nebo šestičlenným arylovým nebo hetero30 arylovým cyklickým zbytkem;

   (iv) halogenem nebo trihalogenmethylovou skupinou;

   (v) ketonem vzorce -CO-X₄, kde X₄ je vybrán ze skupiny tvořené vodíkem, alkylem

   35 a pěti- nebo šestičlenným arylovým nebo heteroarylovým zbytkem;

   (vi) karboxylovou kyselinou vzorce -(X₅)_n-COOH, nebo esterem vzorce -(X₆)_n-COO-X₇, kde X₅, X₆ a X₇ jsou nezávisle vybrány ze skupiny tvořené alkylem a pěti- nebo šesti- členným arylovým nebo heteroarylovým zbytkem, a n je 0 nebo 1;

   (vii) alkoholem vzorce -(X₈)_n-OH, nebo alkoxyskupinou vzorce -(X₈)_n-O-X₉, kde X₈ a X₉ jsou nezávisle vybrány ze skupiny tvořené vodíkem, nasyceným nebo nenasyceným alkylem a pěti- nebo šestičlenným arylovým nebo heteroarylovým cyklickým zbytkem, přičemž cyklický zbytek je popřípadě substituovaný jedním nebo více substituenty nezávisle vybra45 nými ze skupiny tvořené alkylem, halogenem, trihalogenmethylem, karboxylátem, nitroskupinou a esterovou skupinou a n je 0 nebo 1;

   -45CZ 298775 B6 (viii) amidem vzorce -NHCOXio, kde Χ_[0 je vybrán ze skupiny tvořené alkylem, hydroxylem a pěti- nebo šestičlenným arylovým nebo heteroarylovým cyklickým zbytkem, kde cyklický zbytek je popřípadě substituovaný jedním nebo dvěma substituenty nezávisle vybranými ze skupiny tvořené alkylem, halogenem, trihalogenmethylem, karboxylátem, nitroskupinou

   5 a esterovou skupinou;

   (ix) -SO₂NXhXi2, kde X_n a X_[2 jsou nezávisle vybrány ze skupiny tvořené vodíkem, alkylem a pěti- nebo šestičlenným arylovým nebo heteroarylovým cyklickým zbytkem;

   10 (x) pěti- nebo šestičlenným arylovým nebo heteroarylovým cyklickým zbytkem popřípadě substituovaným jedním, dvěma nebo třemi substituenty nezávisle vybranými ze skupiny tvořené alkylem, halogenem, trihalogenmethylem, karboxylátem, nitroskupinou a esterovou skupinou;

   15 (xi) aldehydem vzorce-CO-H; a (xii) sulfonem vzorce -SO₂X|₃, kde Χ_η je vybrán ze skupiny tvořené nasyceným nebo nenasyceným alkylem a pěti- nebo šestičlenným arylovým nebo heteroarylovým cyklickým zbytkem;

   20 R₃ a R4 jsou nezávisle vybrány ze souboru tvořeného vodíkem a nasyceným nebo nenasyceným alkylem; a

   Xi je nezávisle vybrán ze souboru tvořeného skupinou NH, sírou a kyslíkem;

   25 pro použití jako léčivo.
9. 9. Sloučenina na bázi 5-azachinoxalinu podle nároku 8, kde R|, R₂ a R_fi jsou nezávisle vybrány ze skupiny tvořené

   30 (i) vodíkem;

   (ii) nasyceným nebo nenasyceným alkylem popřípadě substituovaným pěti- nebo šestičlenným arylovým nebo heteroarylovým cyklickým zbytkem, kde cyklický zbytek je popřípadě substituovaný jedním, dvěma nebo třemi substituenty nezávisle vybranými ze skupiny tvořené

   35 alkylem, halogenem, trihalogenmethylem, hydroxyskupinou, alkoxyskupinou, karboxylátem, nitroskupinou a esterovou skupinou; a (iii) pěti- nebo šestičlenným arylovým nebo heteroarylovým cyklickým zbytkem popřípadě substituovaným jedním, dvěma nebo třemi substituenty nezávisle vybranými ze skupiny tvo40 řené alkylem, halogenem, trihalogenmethylem, hydroxyskupinou, alkoxyskupinou, karboxylátem, nitroskupinou a esterovou skupinou; a

   R₃ a R4 jsou nezávisle vybrány ze souboru tvořeného vodíkem a nasyceným nebo nenasyceným alkylem;

   pro použití jako léčivo.
10. 10. Sloučenina na bázi 5-azachinoxalinu podle nároku 9. kde R] a R₂ jsou nezávisle vybrány ze skupiny tvořené (i) methylem popřípadě substituovaným fenylem, který je popřípadě substituovaný substituenty nezávisle vybranými ze skupiny tvořené alkylem, halogenem, hydroxyskupinou a alkoxyskupinou; a

    -46CZ 298775 B6 (ii) fenylem popřípadě substituovaným substituenty nezávisle vybranými ze skupiny tvořené alkylem, halogenem, hydroxyskupinou a alkoxyskupinou;

    pro použití jako léčivo.
11. 11. Sloučenina na bázi 5-azachinoxalinu podle nároku 10, kde Xj je skupina NH nebo kyslík; pro použití jako léčivo.
12. 12. Sloučenina na bázi 5-azachinoxalinu podle nároku 11, kde substituenty a X] tvoří dohro10 mady zbytek R₆Xj vybraný ze skupiny uvedené následující tabulce

    Fenylamino 2-metyibenzylaird.no Benzylaiair.o 3-metylbenzylamino Ketoxy 4-metylbenzyiamino Metoxy 2-chlorbenzylamino 4 -fluorbenzylamino 3-chlorbenzylamino 4 -fluorbenzy lamino 4-chlorbenzylamino fenylamino 2-fluorbenzylamino 2-karboxybeazylamino 3 -fluorbenzylamino 3-karboxybenzylaraino 4-fluorbenzylamino 4-karboxybenzylamino 2 - (trifluormetyl)- 2-nitrobenzylamino benzylaiair.o 3-nitrobenzyiamino i 4-nitrobenzylaraino j