CN111875674A - 表皮干细胞向胰腺细胞分化的改进方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种表皮干细胞向胰腺细胞分化的改进方法,基于表皮干细胞作为基础,通过添加活性诱导肽,使得细胞分化成为胰腺细胞,并且分化时间较短,表皮干细胞来源宽泛,成本低廉,制备简便,具有极好的市场应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及非胚胎多能干细胞领域,具体地涉及非胚胎多能干细胞提供胰腺细胞的用途以及产生和使用它们的方法。
背景技术
胚胎干细胞是一种全能干细胞,在适当的条件下它可分化为体内任何组织的体细胞。Lumelsky等人报道,通过体外五步诱导的方法,可将胚胎干细胞诱导分化为胰岛β细胞,而Shi等在他们的研究中报道,他们通过三步法可将胚胎干细胞诱导成为胰岛β细胞,并且这些细胞移植入糖尿病老鼠体内后可使动物的体重增加,存活时间延长,血糖下降。但是,由于胚胎干细胞存在目前尚无法解决的致瘤性问题,因此目前离临床运用还有一定的距离。
对于胰腺腺管来源的干细胞,Bonner-Weir等在他们的研究报告中报道,在胰腺的腺管中存在一种CK19阳性的干细胞,此种细胞在有KGF和Matrigel存在的情况下,可大量扩增并分化为胰岛β细胞。对于胰岛来源的干细胞,Zulewski等报道,他们从正常胰腺的胰岛团中分离培养出了一种表达神经干细胞标志nestin蛋白(巢蛋白)的细胞,此种细胞可在体外大量扩增,并且可在exendin-4、activinA、HGF、Betacellulin和nicotiamide的作用下分化为胰腺内分泌细胞。
Huang&;Tang,2003;Zulewski et al.,2001文章中披露的胰腺干细胞为胰岛来源的成体干细胞。Zulewski等所用的组织为正常的人或鼠的胰腺组织。由于在实践中难以获得足够数量的正常的人胰腺组织,所以将该技术应用于临床时仍会面临来源不足的问题。
在现有技术中,还有其他的方式来获得胰腺细胞。比如CN101310012A中提供将非胚胎多能干细胞向胰腺谱系分化的方法。本发明进一步提供非胚胎多能干细胞及其衍生的子代,从而为受试者提供胰腺细胞。所述方法包含将表达Ngn3的细胞与烟酰胺或exendiM两者中的一种或与这两者相接触以产生表达胰岛素的细胞,所述表达Ngn3的细胞已经通过下述过程制备:(1)将表达Oct-4和端粒酶且可以分化成外胚层、内胚层和中胚层细胞类型的非胚胎干、非生殖、非胚胎生殖细胞与一种第一试剂和一种第二试剂相接触以产生Pdx-I表达升高的细胞,其中所述第一试剂是激活素A,所述第二试剂抑制音猬因子(SHH)活性;以及(2)将Pdx-I表达升高的细胞与EGF和/或HGF相接触,以产生Ngn3表达升高的细胞。但是该方法制备复杂,成功率还有待进一步的提高。
CN1847394A中公开了一种诱导胚胎干细胞向胰腺细胞分化的方法,该方法是依次利用Activin A和顺式视黄酸处理由胚胎干细胞形成的胚胎小体,使其分化得到胰腺细胞。但是该方法中使用了胚胎干细胞,由于胚胎干细胞来源有限,并不适应大规模推广使用,市场应用价值不高。
因此,需要解决胰岛移植中胰腺组织来源不足的问题,还需要寻找一种来源广泛的干细胞,并且采用简单诱导方式即可获得胰腺细胞来满足社会的需求,从而造福人类。
发明内容
本发明提供了与现有技术方案相比,将来源更为简便的表皮干细胞以更短的时间量(7天)和显著增加的产率(高达97%产率)分化成确定的胰腺细胞的改进方法。
本文提供了使表皮干细胞分化为的胰腺细胞的方法,该方法包括步骤:
第一步,将表皮干细胞放至1%Matrigel铺被的培养皿中按照如下方法用活性刺激肽诱导:
两小时后,表皮干细胞开始铺展,此时将培养基换为含有10%胎牛血清和100ng/ml activin A(Sigma)的DMEM培养基中培养24小时,然后表皮干细胞转为用含10%胎牛血清以及1-10mg/L活性刺激肽的DMEM培养6-8小时使表皮干细胞分化。之后,分化表皮干细胞接着用含有10%胎牛血清和1×10-6mol/L RA(Sigma)的DMEM培养基继续诱导24小时,得到胰腺前体细胞。
第二步,胰岛前体细胞的扩增。
分化的表皮干细胞用含有10%胎牛血清和10ng/ml bFGF(Sigma)的DMEM培养3-5天,诱导来源于表皮干细胞的胰腺前体细胞的扩增。在此期间,大部分贴壁的细胞呈现上皮样结构。
第三步,胰腺β细胞(Pancreaticβcell)的成熟。
细胞转入含有N2和B27(Gibco-BRL)血清替代物(来自Gibco-BRL公司,照说明配制),1ug/ml Laminin(Sigma),10ng/ml bFGF以及10mmol/L nicotinamide(Sigma)的DMEM/F12培养基(Gibco-BRL)中继续培养3-5天,促进胰岛β细胞成熟,得到成熟胰腺β细胞。
所述Activin A的浓度可为50-300ng/ml培养基,所述顺式视黄酸的浓度为1×10-7-1×10-5mol/L培养基;所述Activin A的浓度优选为100ng/ml培养基,所述顺式视黄酸的浓度优选为1×10-6mol/L培养基。
所述Matrigel的质量百分含量为1%。
所述bFGF的浓度为8-12ng/ml;优选为10ng/ml。
将扩增得到的胰腺前体细胞用添加N2、B27血清替代物,层粘连蛋白(laminin),碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和烟酰胺(nicotinamide)的培养基培养3-5天,得到成熟的胰岛β细胞。
本发明另外一方面最重要的是提供一种活性刺激肽,所述活性刺激肽能够特异性的针对表皮干细胞中的胰岛素表达相关基因产生诱导趋势,能够显著的增加表皮干细胞的分化速度和分化能力,增强其向胰腺细胞的分化能力。
本发明中涉及的活性刺激肽,其氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1-6任一所示。
具体实施方式
实施例1表皮干细胞的制备
取(人)健康男性包皮环切术后的包皮皮肤,制备表皮细胞和成纤维细胞。
1.表皮细胞的分离:取2cm长、2mm左右宽的皮肤,以含抗菌素的PBS清洗3次;置蛋白酶液中,4℃消化16小时;取出皮肤,剥离表皮与真皮层;收集表皮皮片,置0.25%胰酶/0.02%EDTA(1∶1)混合液中,37℃消化15分钟,终止消化,稍加吹打后过滤,收集细胞悬液,离心弃上清,加入新鲜培养液,重悬细胞,调整细胞浓度至1×103/ml。
2.滋养层细胞的制备:收集上述表皮与真皮层剥离后的真皮皮片,置于625U/ml胶原酶液中,消化后收集成纤维细胞悬液,将成纤维细胞培养至铺展80%左右,加丝裂霉素C至终浓度为10-6mol/L,37℃孵育12小时取出,用0.25%胰酶37℃消化5分钟,终止消化,离心5分钟(1000r/分钟),弃上清,重悬细胞,备用。
3.细胞外基质覆盖平皿的预备:在平皿内将上述表皮细胞培养至汇合13天;表皮细胞汇合后,吸去培养液,用无菌PBS清洗;加入乙二胺四乙酸(10mmol/L)和三羟甲基氨基甲烷盐酸(25mmol/L)和曲拉通(1%(w/v))混合液,37℃孵育(30分钟)至镜下可见细胞裂解;用PBS清洗;再加入0.5mg/ml变性的牛血清白蛋白,置37℃孵育1小时,以封闭非特异性粘附;PBS清洗,加入无血清培养液,置37℃孵箱至应用。
4.表皮干细胞的筛选及培养:取预备好的覆盖有细胞外基质的平皿,加入2ml表皮细胞悬液,37℃培养10分钟取出,吸弃液体,PBS清洗至无细胞悬浮,贴壁细胞为表皮干细胞。加入滋养层细胞(4×103/cm2),用KSC培养液培养,第2天换液,后每3天换液一次。其中KSC培养液含5%胎牛血清和1ng/ml碱性成纤维生长因子。
5.传代培养:上述表皮干细胞长至汇合,以0.25%胰酶/0.02%EDTA(1∶1)混合液,37℃消化6分钟,终止消化;收集细胞悬液入离心管,离心5分钟,弃上清,加入新鲜培养液,重悬细胞,以2×105/ml的密度接种于预先铺加有滋养层细胞的培养瓶中,置37℃、5%CO2孵箱中培养,之后,经过免疫组化检测结果:细胞甩片β1整合素100%表达、角蛋白19有97%表达,角蛋白10、抗波形丝蛋白阴性,确定获得了表皮干细胞。
实施例2活性刺激肽的制备
首先构建随机多肽库,其中,发明所述的随机多肽是一段含三十个以下(包括三十)的随机氨基酸序列。本发明所述多肽随机文库是由相应的DNA文库(用于筛选CPP的DNA文库)翻译转化得到。本发明所述多肽随机文库转化方法是本领域常用的转化方法。例如化学转化法和电穿孔转化法,见J.萨姆布鲁克等编著的《分子克隆(中文第二版)》。将随机多肽与表皮干细胞混合培养,此时基础培养基为含有10%胎牛血清和100ng/ml activin A(Sigma)的DMEM培养基,依据表皮干细胞分化指数能力的不同,获得了42个具有较强刺激表皮干细胞向胰腺细胞分化能力的刺激肽,其中较强能力的为SEQ ID NO:1-6所示的多肽,采用化学合成的方法进行合成,进行后续实验。
实施例3表皮干细胞向胰腺细胞的分化诱导
将实施例1制备得到的表皮干细胞放至1%Matrigel铺被的培养皿中按照如下方法用活性刺激肽诱导:
两小时后,表皮干细胞开始铺展,此时将培养基换为含有10%胎牛血清和100ng/ml activin A(Sigma)的DMEM培养基中培养24小时,然后表皮干细胞转为用含10%胎牛血清以及10mg/L活性刺激肽(以SEQ ID NO:1-6的6种不同的活性肽分别单独进行实验,以不加该活性肽作为空白对照)的DMEM培养6小时使表皮干细胞进行分化。之后,分化表皮干细胞接着用含有10%胎牛血清和1×10-6mol/L RA(Sigma)的DMEM培养基继续诱导24小时,得到胰腺前体细胞。
前述得到的初步分化的表皮干细胞用含有10%胎牛血清和10ng/ml bFGF(Sigma)的DMEM培养5天,诱导来源于表皮干细胞的胰腺前体细胞的扩增。在此期间,大部分贴壁的细胞呈现上皮样结构。
将前述得到的贴壁的细胞转入含有N2和B27血清替代物,1ug/ml Laminin(Sigma),10ng/ml bFGF以及10mmol/L nicotinamide(Sigma)的DMEM/F12培养基中继续培养5天,促进胰岛β细胞成熟,得到成熟胰腺β细胞。
实施例4分化的成熟胰腺β细胞的检测
一、用RT-PCR检测分化的细胞基因的表达情况
为了检测胰腺内分泌细胞的情况,用RT-PCR检测胰腺内分泌细胞的标记基因的表达情况,具体方法和结果如下:
用RNA提取试剂盒提取分化细胞和对照细胞的总RNA。分化细胞为成熟胰腺β细胞。对照细胞未添加活性刺激肽的细胞和没有添加活性刺激肽也没有采用activin A和RA两种小分子其中之一诱导的第三步得到的细胞。RNA用MMLV逆转录酶逆转录为cDNA。PCR用ExTaq聚合酶体系完成。PCR引物如下:
Insulin1:TAGTGACCAGCTATAATCAGAG和ACGCCAAGGTCTGAAGGTCC(288bp);
hnf3β:ACCTGAGTCCGAGTCTGACC和GGCACCTTGAGAAAGCAGTC(345bp);
pdx-1:CTTAGCGTGTCGCCACAGCCCTCCA和TCCAACAGCCGCCTTTCGTTATTCT(472bp);
glut2:GGATAAATTCGCCTGGATGA和TTCCTTTGGTTTCTGGAACT(299bp);
isl1:ATTTGCCACCTAGCCACAGCACC和CGCATTTGATCCCGTACAACCTG(335bp);
β-actin:CCTGAACCCTAAGGCCAACCGTGAA
和ATACCCAAGAAGGAAGGCTGGAAAA(480bp)。
结果如下表所示:以β-actin的表达量作为基准量。
表1分化细胞各基因的表达量
从上表可以看出,采用本发明活性刺激肽与activin A和RA一起,能够很好的促进表皮干细胞向胰腺细胞的分化,而仅仅使用activin A和RA,只能像现有技术一样,促进胚胎干细胞像胰腺细胞分化,并不能促进表皮干细胞向胰腺细胞分化。而且分化得到的胰腺细胞其基因表达量与正常人胰腺细胞相比,差别不大,基本一致,推断能够基本行驶相同功能。
二、ELISA检测胰岛素的分泌量
将2X104分化得到的胰腺细胞分别用20和5mmol/L葡萄糖的PBS溶液刺激1h,检测胰岛素分泌量,结果如下:
从上述结果可以看出,胰腺细胞在胰岛素的分泌量上均极显著高于对照组,且不同浓度葡萄糖刺激引起的胰岛素分泌量差异极显著,证明胰岛样细胞对葡萄糖浓度变化有反应。同时从结果可以看出,本发明诱导得到的胰腺细胞,在低葡萄糖浓度时诱导产生的胰岛素较正常胰腺细胞分泌量稍少,但是,在高浓度葡萄糖时,却可以产生比正常胰腺细胞更高的胰岛素分泌量,说明,该分化得到的细胞,具有更好的高血糖刺激反应性和产生能力。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述,本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导,可以对那些细节进行各种修改和替换,这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
序列表
<110> 洛阳轩智生物科技有限公司
<120> 表皮干细胞向胰腺细胞分化的改进方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 1
Trp Ile Met Ile His Asp Ile Tyr His Trp Asn Glu Ile Ile Glu Asn
1 5 10 15
Asn Thr Ser Phe Met Asp Leu Pro Ser Arg
20 25
<210> 2
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 2
His Ile Pro Pro Trp Trp Cys Met Thr Thr Trp Pro Met Gly Gly Ala
1 5 10 15
Asp Asn Ser Cys Lys Gly Arg Gln Arg Met
20 25
<210> 3
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 3
Ser Asp His Phe Gly Arg Gln Glu Ser Asp Met Ala Asp Lys Pro Val
1 5 10 15
Thr Gly Thr Asn Ala Lys Ile Ser Asp Gln
20 25
<210> 4
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 4
Pro Pro Leu Ala Thr Ser Ser Phe Thr Glu Trp Phe Pro Met Leu Trp
1 5 10 15
Cys Gln Asn Trp Ser Gln Ser Glu Val Tyr
20 25
<210> 5
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 5
Ser Gln Asn Pro Gly Asp Pro Thr Trp Ile Pro Leu Ser Ala Pro Gln
1 5 10 15
Thr Cys Ser Ser His Trp Arg Met Val Ile
20 25
<210> 6
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 6
Tyr Pro Asn His Trp Leu Gln Ser His Ser Gln Ala Leu Met Glu Thr
1 5 10 15
Arg Arg His Trp Thr Ile Glu His Ser Met
20 25
Claims (5)
1.一种活性刺激肽,其用于刺激细胞分化。
2.一种活性刺激肽,其序列如SEQ ID NO:2所示。
3.权利要求1-2任一项所述的活性刺激肽在用于促进表皮干细胞向胰腺细胞分化中的应用。
4.一种表皮干细胞向胰腺细胞分化的方法,具体包括以下步骤:
第一步,将表皮干细胞放至1%Matrigel铺被的培养皿中按照如下方法用活性刺激肽诱导:
两小时后,表皮干细胞开始铺展,此时将培养基换为含有10%胎牛血清和100ng/mlactivin A的DMEM培养基中培养24小时,然后表皮干细胞转为用含10%胎牛血清以及1-10mg/L如权利要求1-2任一项所述的活性刺激肽的DMEM培养6-8小时使表皮干细胞分化,之后,分化表皮干细胞接着用含有10%胎牛血清和1×10-6mol/L RA的DMEM培养基继续诱导24小时,得到胰腺前体细胞;
第二步,胰岛前体细胞的扩增;
分化的表皮干细胞用含有10%胎牛血清和8-12ng/ml bFGF的DMEM培养3-5天,诱导来源于表皮干细胞的胰腺前体细胞的扩增,在此期间,大部分贴壁的细胞呈现上皮样结构;
第三步,胰腺β细胞(Pancreatic β cell)的成熟。
5.如权利要求4所述的方法,其中所述bFGF的浓度为10ng/ml。
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