CN103146754A - 多基因修饰iPS细胞分化为胰岛素分泌细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种多基因修饰iPS细胞分化为胰岛素分泌细胞的方法，包括含目的基因PDX-1，NeuroD，MafA腺病毒包装、小鼠胚胎成纤维细胞的分离培养及饲养细胞的制备、MEFs受染重编程为小鼠iPS细胞、小鼠iPS细胞受染分化为胰岛素分泌细胞。本发明方法简便、易操作、效果好。

Description

多基因修饰iPS细胞分化为胰岛素分泌细胞的方法

技术领域

本发明涉及一种多基因修饰iPS细胞分化为胰岛素分泌细胞的方法。

背景技术

诱导多能干细胞（Induced Pluripotent Stem Cells，iPSCs）是将成体细胞重编程为具有多分化潜能的干细胞，它在形态学、表观遗传学、全基因表达谱及分化潜能方面与胚胎干细胞（ESCs）极其相似，其优点是个体特异来源的iPS细胞能避免免疫排斥问题。同时iPS细胞生成技术不涉及胚胎毁损等伦理学问题。科学研究等工作中需要多基因修饰iPS细胞分化为胰岛素分泌细胞。

发明内容

本发明的目的在于提供一种方法简便、易操作、效果好的多基因修饰iPS细胞分化为胰岛素分泌细胞的方法。

本发明的技术解决方案是：

一种多基因修饰iPS细胞分化为胰岛素分泌细胞的方法，其特征是：包括下列步骤：

（一）含目的基因PDX-1，NeuroD，MafA腺病毒包装

（1）转染前质粒的准备

1.1重组质粒Pac I单酶切，37℃酶切2h；

1.2采用经典酚氯仿抽提法对单酶切质粒进行纯化，用紫外分光光度计测定纯化质粒浓度；

（2）转染

2.1取处于对数生长期的293A细胞，用0.05%胰酶消化，细胞计数后，按照每孔4.5×105个细胞，种于6孔板，37℃，5%CO₂的培养箱中培养过夜；

2.2第二天转染前移去培养液，换2ml Opti-MEM培养液；

2.3取2μg线性化的质粒加入250μl经37℃预热的Opti-MEM中，混匀；

2.4取5μllipofectamine2000加入250μl Opti-MEM中，混匀，室温放置5min；

2.5将500μl复合物加入到细胞孔中，摇动培养板，混匀；在37℃，5％的CO₂的培养箱中培养5-6小时后，换上完全培养液，继续置培养箱中培养；

2.6转染后48小时，用0.05%胰酶消化细胞，并转移至10cm培养皿中，加入10ml完全培养基；

2.7每2-3天换入新鲜培养基，观察是否有病变效应出现；

2.8让感染继续发生，直至80%细胞出现病变效应；收集细胞及上清液至灭菌的15ml离心管，-80℃保存；

（3）用反复冻融法使病毒从细胞中释放出来，离心收集初级病毒液；

（4）初级病毒液的扩增

4.1病毒感染前一天对293A细胞进行计数，在10cm培养皿中以3×10⁶细胞种板，以保证转导时细胞密度达到90%；

4.2感染时在10cm皿中加入100μl初级病毒液，混匀；

4.3在37℃，5％的CO₂的培养箱中培养至80-90%细胞变圆并漂浮；

4.4收集细胞至灭菌的15ml离心管；

4.5将收集的细胞置于-80℃，30分钟，随后置于37℃15分钟；反复冻融3次使病毒从细胞中释放出来；

4.6室温下3000rpm离心15分钟，除去细胞碎片；

4.7将病毒原液在50000g下超速离心2小时，去除上清，重悬于1.5ml DMEM培养液中，分装小管，放置于-80℃保存备用；

（二）小鼠胚胎成纤维细胞的分离培养及饲养细胞的制备

（1）性成熟C57BL/6J小鼠按1公：2母比例合笼；

（2）每天早上观察母小鼠阴道口，有阴道栓确定为怀孕，见栓当天上午定为怀孕的0.5天；

（3）取怀孕12.5～13.5天母鼠，断颈处死，取出胎鼠，将胎鼠躯干部分置于一盛有PBS的平皿内，用PBS至少洗涤3次，充分弃除红细胞；

（7）用显微剪将鼠胚躯干剪成1mm3以下的碎块，吸置于离心管内；

（8）室温下静置5分钟，弃上层液，留下胚胎组织碎块；

（9）向装有鼠胚组织碎块的离心管内加入2ml0.05%胰蛋白酶，轻轻吹吸30秒，静置5分钟后吸出上清于MEF培养基中，反复多次以上操作直至组织块消失；

（10）离心后重悬细胞于MEF培养基中，待细胞80%-90%融合时传代或冻存；

（11）在第3～5代MEFs的培养上清中加入丝裂霉素C，使丝裂霉素C的终浓度为10μg/ml，放回培养箱处理2.5小时；

（12）将0.1%明胶水溶液吸入培养瓶内，覆盖培养瓶底面，室温下静置2小时后吸弃明胶水溶液，用PBS洗涤一次；

（13）弃含有丝裂霉素C的MEFs培养上清，PBS洗涤5遍；

（14）消化经丝裂霉素C处理的MEFs，种植到预先用明胶处理过的培养瓶内，种植的细胞数为6×10⁴个/cm₂；

（15）待细胞贴壁后进行观察，如细胞过稀则补加细胞，保证细胞能连成一片而没有间隙，为饲养层细胞；

（16）将制备好的饲养层细胞放置在培养箱内备用；在5天内使用，使用前要更换培养基为胚胎干细胞培养基；

（三）MEFs受染重编程为小鼠iPS细胞

（1）先用0.1%明胶预包被一个T25瓶，包被时间为10分钟；

（2）用0.25%trypsin/EDTA消化第三代MEFs，收集到一个15ml离心管中，用血小板计数板计数，取出1×10⁵个细胞用于感染实验所需的细胞量；

（3）将所需的含有目的基因Oct4、Sox2、Klf4、cMyc的慢病毒及表达rtTA的慢病毒加入一个15ml离心管中，混匀后，用0.45μm过滤器过滤以去除其中的细胞碎片等杂质；

（4）将1×10⁵的细胞加入已经过滤好的病毒溶液中，溶液体积最后补足至5ml，最后加入5μl助转剂polybrene，助转剂polybrene使用浓度为10μg/ml，将整个体系混匀后，转移到已经预包被好的T25瓶中，摇匀后放入37°C培养箱中，10小时后去病毒；

（5）将上述慢病毒感染后的细胞用0.25%trypsin/EDTA消化下来，按六孔板每孔1×10⁴的细胞量铺到事先准备好的饲养层细胞上；

（6）第2天，将MEF培养基换成mESC培养基，继续培养，以后每2天换液一次；

（7）细胞长至第13天左右，挑克隆，将mESC样的克隆挑至新的饲养层细胞上，用mESC培养基继续培养，扩增；得到小鼠iPS细胞；

（四）小鼠iPS细胞受染分化为胰岛素分泌细胞

（1）小鼠iPS细胞用0.25%trypsin/EDTA消化后用mESC培养基重悬于100mm细胞培养皿中，50分钟后吸出上清，用细胞计数板计数；

（2）将所需的分别含目的基因PDX-1，NeuroD，MafA的腺病毒载体Ad-mPDX-1-IRES-GFP、Ad–mNeuroD-IRES-GFP及Ad-mMafA-IRES-GFP加入一个15ml离心管中，混匀后，用0.45μm过滤器过滤以去除其中的细胞碎片等杂质；

（3）将小鼠iPS细胞加入已经过滤好的病毒溶液中，加入MEF培养基后重悬于超低吸附六孔板中，2ml/孔，让病毒维持在MEF培养基中2天，第4天重复转导胚体一次；

（4）6天后收集胚体，用MEF培养基重悬于普通六孔板中；

（5）待大量细胞自胚体爬出时消化传代。

本发明方法简便、易操作、效果好。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

图1小鼠iPS细胞克隆在显微镜下的形态（×200）图。

图2（A）第16代小鼠iPS细胞克隆的碱性磷酸酶染色（×200）（B）第16代小鼠iPS细胞克隆的干细胞表面标记Nanog、Rex-1及SSEA-1的免疫荧光染色（×400）（C）小鼠iPS细胞干细胞内源基因的RT-PCR检测结果（D）小鼠iPS细胞的核型图。

图3A）小鼠iPS细胞来源的胚体在体视显微镜下的形态（×60）（B）小鼠iPS细胞来源的胚体三胚层基因的RT-PCR检测结果（C）小鼠iPS细胞形成畸胎瘤的HE染色。

图4是PDX-1、NeuroD和MafA转染的小鼠iPS在荧光显微镜下同一视野的明视野及荧光图（×100）。

图5是定向诱导分化的小鼠iPS细胞外源性转录因子及胰岛细胞功能基因的RT-PCR检测结果使用图。

图6是胰岛素分泌细胞胰岛素蛋白的表达（×400）示意图。

图7是定向诱导分化的小鼠iPS细胞在不同浓度葡萄糖刺激下的胰岛素分泌量对比示意图。

图8是细胞移植区胰岛素表达的免疫组化检测结果（A）正常胰岛（×100）(B)链脲霉素破坏后的胰岛（×100）(C)糖尿病小鼠肝脏注射区（×40）(D)图C局部放大图（×100）。

图9是移植组和未移植组糖尿病小鼠7周的空腹血糖值示意图。

具体实施方式

材料：

健康C57BL/6J小鼠（南通大学实验动物中心），LV-ef1a-Hygromicin-TRE-Oct4/Sox2/Klf4/cMyc及表达rtTA的慢病毒载体（上海Sidansai公司），293T细胞（Invitrogen），pVSVG，delta8.91（Invitrogen），HIVp24ELISA（Cell Biolabs），转染试剂Fugene（Roche），polybrene（Sigma），Opti-MEM培养液(Invitrogen)，0.25%Trypsin/EDTA（Sigma），DMEM低糖培养基（Hyclone），胎牛血清（Gibco），谷氨酰胺（Sigma），PBS缓冲液（Hyclone），必需氨基酸（Sigma），丝裂霉素C（Sigma），LIF（Prospec），DEPC（Sigma），微量RNA提取试剂盒（OMEGA），RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit（Fermentas），琼脂糖(Takara)，Goldenview（上海赛百盛），碱性磷酸酶染色试剂盒（Millipore），DNAMarker DL2000（TaKaRa），PCR试剂盒（Fermantas），兔抗小鼠胰岛素多克隆抗体（Santa Cruz），Cy3羊抗兔荧光抗体（Proteintech），小鼠超敏胰岛素ELISA试剂盒（Mercodia），Triton X-100（Sigma），牛血清白蛋白（Sigma），Hochest（Sigma），链脲霉素（Sigma），明胶（Sigma），knockout DMEM（Gibco），β-巯基乙醇（Sigma），抗荧光淬灭封片液（碧云天公司），羊抗小鼠Rex-1IgG抗体（Santa Cruz SC-50668），兔抗小鼠Nanog IgG抗体（Santa CruzSC-33760），小鼠抗小鼠SSEA-1IgM抗体（Abcam ab16285），FITC驴抗羊荧光抗体（Proteintech），Texas Red羊抗兔荧光抗体（Proteintech），Cy3羊抗小鼠荧光抗体（Proteintech），CO2细胞培养箱（美国NUAIRE公司），生物安全柜（美国Thermo公司），正置、倒置荧光显微镜（日本Olympus公司），电泳仪（美国BIO-RAD公司），PCR扩增仪（美国BIO-RAD公司），生物分光光度计（美国IMPLEN公司），凝胶成像系统（美国BIO-RAD公司），倒置相差显微镜（日本Olympus公司），体视显微镜（日本Olympus公司）

1、含目的基因PDX-1，NeuroD，MafA腺病毒载体

由英潍捷基（上海）贸易有限公司提供。

2、含目的基因PDX-1，NeuroD，MafA腺病毒包装

（1）转染前质粒的准备

1.1重组质粒Pac I单酶切，37℃酶切2h。

1.2采用经典酚氯仿抽提法对单酶切质粒进行纯化，用紫外分光光度计测定纯化质粒浓度。

（2）转染

2.1取细胞状态良好，处于对数生长期的293A细胞，用0.05%胰酶消化，细胞计数后，按照每孔4.5×105个细胞，种于6孔板，37℃，5%CO₂的培养箱中培养过夜；

2.2第二天转染前移去培养液，换2ml Opti-MEM培养液；

2.3取2μg线性化的质粒加入250μl Opti-MEM（经37℃预热）中，轻轻混匀；

2.4取5μl lipofectamine2000加入250μl Opti-MEM中，轻轻混匀，室温放置5min；

2.5将500μl复合物加入到细胞孔中，摇动培养板，轻轻混匀。在37℃，5％的CO₂的培养箱中培养5-6小时后，换上完全培养液，继续置培养箱中培养；

2.6转染后48小时，用0.05%胰酶消化；并细胞转移至10cm培养皿中，加入10ml完全培养基；

2.7每2-3天换入新鲜培养基，观察是否有病变效应出现；

2.8让感染继续发生，直至80%细胞出现病变效应。收集细胞及上清液至灭菌的15ml离心管，-80℃保存。

（3）用反复冻融法使病毒从细胞中释放出来，离心收集初级病毒液。

（4）初级病毒液的扩增

4.1病毒感染前一天对293A细胞进行计数，在10cm培养皿中以3×10⁶细胞种板，以保证转导时细胞密度达到90%。

4.2感染时在10cm皿中加入100μl初级病毒液，轻轻混匀。

4.3在37℃，5％的CO₂的培养箱中培养至80-90%细胞变圆并漂浮。

4.4收集细胞至灭菌的15ml离心管。

4.5将收集的细胞置于-80℃，30分钟，随后置于37℃15分钟。反复冻融3次使病毒从细胞中释放出来。

4.6室温下3000rpm离心15分钟，除去细胞碎片。

4.7将病毒原液在50000g下超速离心2小时，去除上清，重悬于1.5ml DMEM培养液中，分装小管，放置于-80℃保存备用。

（5）腺病毒的滴度测定

采用免疫法检测腺病毒滴度，原理是通过抗腺病毒的多抗与感染了腺病毒供试样品的细胞结合，再用辣根过氧化物酶标记的二抗（辣根过氧化物酶标记的兔抗）与一抗（兔抗腺病毒多抗）结合，经显色液显色，被感染的细胞显示出明显的棕色，通过计数及计算，即可确定腺病毒的滴度。

3、含有目的基因Oct4、Sox2、Klf4、cMyc的慢病毒及表达rtTA的慢病毒由上海斯丹赛生物技术有限公司提供。

4、小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）的分离培养及饲养细胞的制备

（1）性成熟C57BL/6J小鼠按1公：2母比例合笼。

（2）每天早上观察母小鼠阴道口，有阴道栓确定为怀孕，见栓当天上午定为怀孕的0.5天。

（3）取怀孕12.5～13.5天母鼠，断颈处死，取出胎鼠，将胎鼠躯干部分置于另一盛有PBS平皿内，用PBS至少洗涤3次，充分弃除红细胞。

（7）用显微剪将鼠胚躯干剪成1mm3以下的碎块，吸置于离心管内。

（8）室温下静置5分钟，弃上层液，留下胚胎组织碎块。

（9）向装有鼠胚组织碎块的离心管内加入2ml0.05%胰蛋白酶，轻轻吹吸30秒，静置5分钟后吸出上清于MEF培养基（DMEM低糖+10%FBS+4mmol/L谷氨酰胺)中，反复多次以上操作直至组织块消失。

（10）离心后重悬细胞于MEF培养基中，待细胞80%-90%融合时传代或冻存。

（11）在第3～5代MEFs的培养上清中加入丝裂霉素C，使丝裂霉素C的终浓度为10μg/ml，放回培养箱处理2.5小时。

（12）将0.1%明胶水溶液吸入培养瓶内，覆盖培养瓶底面，室温下静置2小时后吸弃明胶水溶液，用PBS洗涤一次。

（13）弃含有丝裂霉素C的MEFs培养上清，PBS洗涤5遍。

（14）消化经丝裂霉素C处理的MEFs，种植到预先用明胶处理过的培养瓶内（种植的细胞数为6×10⁴个/cm₂）。

（15）待细胞贴壁后进行观察，如细胞过稀则补加细胞，保证细胞能连成一片而没有间隙，得饲养层细胞。

（16）将制备好的饲养层细胞放置在培养箱内备用。在5天内使用，使用前要更换培养基为胚胎干细胞培养基。

5、MEFs受染重编程为小鼠iPS细胞

（1）先用0.1%明胶预包被一个T25瓶，包被时间约为10分钟。

（2）用0.25%trypsin/EDTA消化第三代MEFs，收集到一个15ml离心管中，用血小板计数板计数，取出1×10⁵个细胞用于感染实验所需的细胞量。

（3）将所需的含有目的基因Oct4、Sox2、Klf4、cMyc的慢病毒（LV-ef1a-Hygromicin-TRE-Oct4、LV-ef1a-Hygromicin-TRE-Sox2、LV-ef1a-Hygromicin-TRE-Klf4、LV-ef1a-Hygromicin-TRE-cMyc）及表达rtTA的慢病毒加入一个15ml离心管中，混匀后，用0.45μm过滤器过滤以去除其中的细胞碎片等杂质；

（4）将1×10⁵的细胞加入已经过滤好的病毒溶液中，溶液体积最后补足至5ml，最后加入5μl助转剂polybrene（使用浓度为10μg/ml），将整个体系混匀后，转移到已经预包被好的T25瓶中，摇匀后放入37°C培养箱中，10小时后去病毒。

（5）将慢病毒感染后的细胞用0.25%trypsin/EDTA消化下来，按六孔板每孔1×10⁴的细胞量铺到事先准备好的饲养层细胞上。

（6）第2天，将MEF培养基换成mESC培养基（knockout DMEM+15%FBS+1×必需氨基酸+1×L-G+0.1mMβ-巯基乙醇+LIF1000U/ml），继续培养，以后每2天换液一次。

（7）细胞长至第13天左右，可以挑克隆，将mESC样的克隆挑至新的饲养层细胞上，用mESC培养基继续培养，扩增。

6、碱性磷酸酶染色

（1）吸出细胞培养液，用PBS润洗2-3次，用多聚甲醛固定1-2分钟。

（2）吸出固定液，用PBS洗2次。

（3）吸出PBS，用TBST润洗一次。

（4）准备碱性磷酸酶试剂（上海斯丹赛生物技术有限公司）：溶液A：溶液B：溶液C=50μl：50μl：400μl。

加足量的染色试剂使染色液能足够覆盖孔底，室温避光放置15分钟。

吸出染色液，用PBS缓冲液润洗一次，最后保持于PBS中，显微镜下观察结果。

7、核型分析

（1）40μg/ml秋水仙素处理3小时，终止培养，PBS洗一次。

（2）低渗氯化钾（0.075mol/L）处理30分钟。

（3）滴加少量固定液（冰醋酸：甲醇为1：3）预固定1分钟，离心1500rpm×5分钟。

（4）去上清液，保留1ml，轻轻吹打悬起，缓慢加入5ml固定液，30分钟后离心1500rpm×5分钟。

（5）重复步骤（4）两遍。

（6）滴片（载玻片要事先放在冰水浴中，取出玻片后不要等玻片温度上升及干燥就从高处滴片）。

（7）80℃烤片3小时后取出置室温，胰酶消化后吉姆萨染色10分钟显带。

（8）镜检。

8、拟胚体形成

小鼠iPS细胞扩增培养后，按正常传代步骤消化下来，洗涤去除饲养细胞，吹打成单细胞后悬浮培养在MEF培养基中。3天后换第一次液，之后每2-3天换液一次。收集拟胚体后用Trizol裂解，抽提RNA，-80℃保存待检测。

9、畸胎瘤形成实验

将得到的小鼠iPS细胞系传代培养至10代以上后，消化洗涤，去除饲养细胞后悬浮在小于400μl的培养液中，无菌注射入NOD-SCID小鼠的后腿根部肌肉中，每个注射点的细胞量约为2-3×10⁶。8周后取出畸胎瘤进行HE染色，观察分化为三胚层情况。

10、RT-PCR

10.1细胞总RNA的提取

（1）将细胞培养基去掉，用DEPC水洗一遍，加1ml Trizol裂解约5分钟。

（2）每使用1ml Trizol加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15秒，静置约2-3分钟。

（3）4℃12000×g离心15分钟。样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。

（4）把水相转移到新管中，用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1m Trizol加入0.5ml异丙醇，静置10分钟。

（5）4℃12000×g离心10分钟，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀，移去上清。

（6）用75%乙醇洗涤RNA沉淀，加1ml75%乙醇，4℃7500g离心5分钟，弃上清。

（7）室温放置干燥RNA沉淀，大约晾5-10分钟，加入50-100μl无RNase的水，用枪头吸打几次溶解RNA，紫外分光光度计测RNA浓度后-80℃保存。

10.2第一链cDNA合成

（1）取出逆转录试剂盒置于冰上融化，混匀。

（2）取各组模板RNA0.1ng-5μg，oligo（dT）18primer1μl，再加nuclease-freewater至12μl。

（3）按以下组份继续添加至无菌的nuclease-free的离心管中。

（4）混匀并离心，42°C孵育60分钟。

（5）70°C孵育5分钟终止反应。

10.3PCR扩增

反应条件：94℃预变性5分钟，后经过35个循环的94℃变性30秒、55-60℃退火30秒、72℃延伸30秒，最后72℃总延伸10分钟。

10.4PCR产物琼脂糖凝胶电泳

PCR结束后，每管加入6×loading buffer4μl（如为Dream TaqTM Green PCRMaster Mix(2×)则不需加6×loading buffer），混匀后取10μl上样，行1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，凝胶成像系统检测电泳结果。

11、细胞免疫荧光

（1）首先把细胞固定在4%多聚甲醛中，室温放置30分钟。

（2）在无水乙醇中浸泡3次，每次10分钟（限于核蛋白）。

（3）吸干上述溶液，先用1×PBS洗涤一次，再用抗体稀释液（0.2%牛血清白蛋白和0.1%Triton×100溶于PBS）洗涤2次。

（4）用封闭液（含6%牛血清白蛋白+0.3%Triton×100的PBS溶液）封闭细胞。

（5）将一抗稀释在抗体稀释液中，加到样品上，4℃放置过夜。

（6）用PBT（0.1%Triton×100）洗涤细胞3－5次。

（7）将二抗稀释在抗体稀释液中，并加到细胞样品上，室温放置1小时（从步骤7开始，样品要注意避光）。

（8）用PBT洗涤3次。

（9）将hochest（1mg/ml）母液以1：1000用PBS稀释，室温放置30分钟。

（10）用PBS洗涤3次，每次5分钟。

12、小鼠iPS细胞受染分化为胰岛素分泌细胞

（1）小鼠iPS细胞用0.25%trypsin/EDTA消化后用mESC培养基重悬于100mm细胞培养皿中，50分钟后吸出上清，用细胞计数板计数。

（2）测定病毒感染靶细胞的最适病毒滴度，将所需的Ad-mPDX-1-IRES-GFP、Ad–mNeuroD-IRES-GFP及Ad-mMafA-IRES-GFP加入一个15ml离心管中，混匀后，用0.45μm过滤器过滤以去除其中的细胞碎片等杂质。

（3）将小鼠iPS细胞加入已经过滤好的病毒溶液中，加入MEF培养基后重悬于超低吸附六孔板中（2ml/孔），让病毒维持在MEF培养基中2天，第4天重复转导胚体一次（24小时）。

（4）6天后收集胚体，用MEF培养基重悬于普通六孔板中。

（5）待大量细胞自胚体爬出时消化传代，备下一步实验用。

13、ELISA

13.1标本收集

（1）取受染11天的分化细胞，吸去培养液，加入KRB缓冲液预培养1小时。

（2）吸去缓冲液，再加入不同葡萄糖浓度的KRB缓冲液继续培养1小时。

（3）将缓冲液收集-80℃保存待检测。

13.2操作步骤

（1）提前20分钟从冰箱中取出试剂盒及标本，平衡至室温。

（2）以酶结合物稀释液稀释酶结合物（1：10），临用前15分钟配好。

（3）以双蒸水稀释洗涤液（1：20），临用前15分钟配好。

（4）取出板条，吸出10μl标准品和标本加入相应的孔中。

（5）每孔加入100μl酶结合物稀释液。

（6）封板胶纸封住反应孔，室温下在摇床上反应2小时。

（7）每孔加入350μl洗涤液，洗板6次。

（8）每孔加入200μl显色液，室温避光孵育15分钟。

（9）每孔加入50μl终止液，充分混匀。

（10）多功能酶标仪（450nm吸光度）测量结果。

14、细胞移植

14.1糖尿病动物模型的建立

（1）12-16周的C57BL/6J小鼠共18只，雌雄各半，随机分为3组（n=6），第一组为糖尿病小鼠未移植组（糖尿病未移植组），第二组为糖尿病小鼠肝脏注射转PDX-1+NeuroD+MafA iPSCs组（糖尿病移植组），第3组为无糖尿病正常小鼠组（健康对照组）。

（2）链脲霉素以160mg/kg的剂量注射到第一、二组每只小鼠腹腔内，健康对照组不予处理。

（3）监测小鼠空腹血糖。

14.2体外获取的胰岛素分泌细胞移植至糖尿病小鼠肝脏

（1）待小鼠链脲霉素注射后7天，将胰岛素分泌细胞计数后用少量完培重悬。

（2）细胞移植前小鼠以3%戊巴比妥钠按50mg/kg腹腔注射麻醉。

（3）糖尿病小鼠麻醉后固定消毒，手术进腹，胰岛素分泌细胞悬液100μl注射到肝左叶。

（4）移植后每三天测定糖尿病小鼠空腹血糖。

15、免疫组化检测

（1）细胞移植后9天处死实验及正常小鼠，取出肝脏及胰腺，10%福尔马林固定48小时。

（2）行石蜡包埋切片，片厚10μm。

（3）石蜡切片常规脱蜡，PBS洗3次×3分钟。

（4）用pH6.0、0.01MCB热诱导修复（微波3档20分钟），室温自然冷却，PBS洗3次×3分钟。

（5）0.3%H₂O₂室温下抑制内源性过氧化物酶20分钟。

（6）PBS洗3次×3分钟。

（7）20%正常羊血清室温孵育30分钟，不洗。

（8）滴加一抗兔抗小鼠胰岛素多克隆抗体（1：100）37℃孵育2小时。

（9）PBS洗3次×3分钟。

（10）EnVision试剂（HRP/R）37℃30分钟。

（11）PBS洗3次×3分钟。

（12）DAB显色8-12分钟。

（13）苏木素染色，热水蓝化。

（14）吹干后，树脂封片。

（15）显微镜镜检。

16、统计学处理

每组数据来自3次独立的实验，所有数据均以

表示，用STATA7.0软件进行One-Way-ANOVA分析。结果P<0.05表示差异具有统计学意义。

Claims (1)

1.一种多基因修饰iPS细胞分化为胰岛素分泌细胞的方法，其特征是：包括下列步骤：

（一）含目的基因PDX-1，NeuroD，MafA腺病毒包装

（1）转染前质粒的准备

1.1  重组质粒Pac I单酶切，37℃酶切2h；

1.2  采用经典酚氯仿抽提法对单酶切质粒进行纯化，用紫外分光光度计测定纯化质粒浓度；

（2）转染

2.1取处于对数生长期的293A细胞，用0.05%胰酶消化，细胞计数后，按照每孔4.5×105个细胞，种于6孔板，37℃，5%CO₂ 的培养箱中培养过夜；

2.2第二天转染前移去培养液，换2ml Opti-MEM培养液；

2.3取2μg线性化的质粒加入250μl经37℃预热的Opti-MEM中，混匀；

2.4取5μl lipofectamine2000 加入250μl Opti-MEM中，混匀，室温放置5min；

2.5将500μl复合物加入到细胞孔中，摇动培养板，混匀；在37℃，5％的CO₂的培养箱中培养5-6小时后，换上完全培养液，继续置培养箱中培养；

2.6转染后48小时，用0.05%胰酶消化细胞，并转移至10cm培养皿中，加入10ml完全培养基；

2.7每2-3天换入新鲜培养基，观察是否有病变效应出现；

2.8让感染继续发生，直至80%细胞出现病变效应；收集细胞及上清液至灭菌的15ml离心管，-80℃保存；

（3）用反复冻融法使病毒从细胞中释放出来，离心收集初级病毒液；

（4）初级病毒液的扩增

4.1病毒感染前一天对293A细胞进行计数，在10cm培养皿中以3×10⁶细胞种板，以保证转导时细胞密度达到90%；

4.2感染时在10cm皿中加入100μl初级病毒液，混匀；

4.3在37℃，5％的CO₂的培养箱中培养至80-90%细胞变圆并漂浮；

4.4收集细胞至灭菌的15ml离心管； 

4.5将收集的细胞置于-80℃，30分钟，随后置于37℃ 15分钟；反复冻融3次使病毒从细胞中释放出来；

4.6室温下3000rpm离心15分钟，除去细胞碎片；

4.7将病毒原液在50000g下超速离心2小时，去除上清，重悬于1.5ml DMEM培养液中，分装小管，放置于-80℃保存备用；

（二）小鼠胚胎成纤维细胞的分离培养及饲养细胞的制备

（1）性成熟C57BL/6J小鼠按1公：2母比例合笼；

（2）每天早上观察母小鼠阴道口，有阴道栓确定为怀孕，见栓当天上午定为怀孕的0.5天；

（3）取怀孕12.5～13.5天母鼠，断颈处死，取出胎鼠，将胎鼠躯干部分置于一盛有PBS的平皿内，用PBS至少洗涤3次，充分弃除红细胞；

（4）用显微剪将鼠胚躯干剪成1mm3以下的碎块，吸置于离心管内；

（5）室温下静置5分钟，弃上层液，留下胚胎组织碎块；

（6）向装有鼠胚组织碎块的离心管内加入2ml 0.05%胰蛋白酶，轻轻吹吸30秒，静置5分钟后吸出上清于MEF培养基中，反复多次以上操作直至组织块消失；

（7）离心后重悬细胞于MEF培养基中，待细胞80%-90%融合时传代或冻存；

（8）在第3～5代MEFs的培养上清中加入丝裂霉素C，使丝裂霉素C的终浓度为10μg/ml，放回培养箱处理2.5小时；

（9）将0.1%明胶水溶液吸入培养瓶内，覆盖培养瓶底面，室温下静置2小时后吸弃明胶水溶液，用PBS洗涤一次；

（10）弃含有丝裂霉素C的MEFs培养上清，PBS洗涤5遍；

（11）消化经丝裂霉素C处理的MEFs，种植到预先用明胶处理过的培养瓶内，种植的细胞数为6×10⁴个/cm₂；

（12）待细胞贴壁后进行观察，如细胞过稀则补加细胞，保证细胞能连成一片而没有间隙，为饲养层细胞；

（13）将制备好的饲养层细胞放置在培养箱内备用；在5天内使用，使用前要更换培养基为胚胎干细胞培养基；

（三）MEFs受染重编程为小鼠iPS细胞 

（1）先用0.1%明胶预包被一个T25瓶，包被时间为10分钟；

（2）用0.25% trypsin/EDTA消化第三代MEFs，收集到一个15ml离心管中，用血小板计数板计数，取出1×10⁵个细胞用于感染实验所需的细胞量；

（3）将所需的含有目的基因Oct4、Sox2、Klf4、cMyc的慢病毒及表达rtTA的慢病毒加入一个15ml离心管中，混匀后，用0.45μm过滤器过滤以去除其中的细胞碎片等杂质；

（4）将1×10⁵的细胞加入已经过滤好的病毒溶液中，溶液体积最后补足至5ml，最后加入5μl助转剂polybrene，助转剂polybrene使用浓度为10μg/ml，将整个体系混匀后，转移到已经预包被好的T25瓶中，摇匀后放入37°C培养箱中，10小时后去病毒；

（5）将上述慢病毒感染后的细胞用0.25% trypsin/EDTA消化下来，按六孔板每孔1×10⁴的细胞量铺到事先准备好的饲养层细胞上；

（6）第2天，将MEF培养基换成mESC培养基，继续培养，以后每2天换液一次；

（7）细胞长至第13天左右，挑克隆，将mESC样的克隆挑至新的饲养层细胞上，用mESC培养基继续培养，扩增；得到小鼠iPS细胞；

（四）小鼠iPS细胞受染分化为胰岛素分泌细胞

（1）小鼠iPS细胞用0.25% trypsin/EDTA消化后用mESC培养基重悬于100mm细胞培养皿中，50分钟后吸出上清，用细胞计数板计数；

（2）将所需的分别含目的基因PDX-1，NeuroD，MafA的腺病毒载体Ad-mPDX-1-IRES-GFP、Ad–mNeuroD-IRES-GFP及Ad-mMafA-IRES-GFP加入一个15ml离心管中，混匀后，用0.45μm过滤器过滤以去除其中的细胞碎片等杂质；

（3）将小鼠iPS细胞加入已经过滤好的病毒溶液中，加入MEF培养基后重悬于超低吸附六孔板中，2ml/孔，让病毒维持在MEF培养基中2天，第4天重复转导胚体一次；

（4）6天后收集胚体，用MEF培养基重悬于普通六孔板中；

（5）待大量细胞自胚体爬出时消化传代。 

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