CN101173249A - 诱导人胎肝间充质干细胞向胰岛β样细胞分化的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种诱导人胎肝间充质干细胞向胰岛β样细胞分化的方法。本发明所述的方法包括以下步骤：分离、纯化及扩增人胎肝间充质干细胞；然后取第3代以后的达到80％～90％融合之胎肝MSCs进行诱导，经诱导液培养6天后即得胰岛β样细胞团。本发明的方法在体外将人胎肝间充质干细胞诱导为能分泌胰岛素的胰岛β样细胞。所得的胰岛β样细胞可以进一步用作制备治疗糖尿病的药物，可望实现糖尿病的细胞治疗。因此，该领域的研究具有广阔的临床应用前景，能带来较大的经济效益和社会效益。

Description

诱导人胎肝间充质干细胞向胰岛β样细胞分化的方法

技术领域

本发明涉及细胞分化，具体涉及一种诱导人胎肝间充质干细胞向胰岛β样细胞分化的方法。

背景技术

我国是继印度之后的第二位糖尿病高发人群大国。以往治疗糖尿病，服用药物和注射胰岛素是常用的方法，但是服用药物和注射胰岛素不仅会带来沉重的经济负担，而且会引起严重的并发症；近年来，移植胰岛治疗糖尿病初见疗效，但面临着组织来源不足和免疫排斥反应两大难题。干细胞研究给糖尿病患者带来了新的希望，其中胚胎干细胞多向分化潜能最强，几乎可以分化为包括胰腺β细胞在内的所有成体组织细胞，但其面临着伦理学的争议，并且具有致瘤性和较强的免疫原性，这些因素限制了其临床应用；胰腺干细胞是最有潜能向β细胞分化的成体干细胞，但其难以分离、扩增并且具有较强的免疫原性。成体骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)容易进行体外分离、扩增和纯化，并且可取自患者自体，能解决细胞来源和免疫排斥问题，但其向胰腺β细胞分化的效率较低，分化细胞的胰岛素分泌量少而不稳定。

发明内容

为了克服上述现有技术的缺点和不足，本发明提供一种诱导人胎肝间充质干细胞(mesenchymal stem cells derived from human fetal liver，hFL-MSCs)向胰岛β样细胞分化的方法。本发明的诱导人胎肝间充质干细胞向胰岛β样细胞分化的方法包括以下步骤：

(1)人胎肝间充质干细胞的分离、纯化及扩增：先采用分步离心法，再用羟乙基淀粉沉降法分离出人胎肝间充质干细胞；然后将肝间充质干细胞重新悬浮于完全培养基中，反复吹打使细胞分散成单细胞悬液，然后接种培养；细胞达到70％～80％融合时，用D-PBS清洗，再用胰酶进行消化处理，然后首次按1∶2比例传代，以后按1∶3比例传代培养；

(2)诱导人胎肝间充质干细胞向胰岛β样细胞分化：取步骤(1)中第3代以后的达到80％～90％融合的hFL-MSCs，消化、接种、再用诱导液培养6天以上即得到胰岛样细胞团。

步骤(1)所述的完全培养基优选含100mL/L FCS、2mmol/L谷胺酰胺、20mmol/LHEPES的DMEM/F12培养基。

步骤(1)所述的接种培养优选如下接种培养方法：将细胞按1.5×10⁶/cm²接种于25cm²培养瓶中，在37℃、5％CO₂的培养箱中培养，培养3d后首次更换培养液，弃去未贴壁细胞；以后每2～3d换液1次。

步骤(1)所述用胰酶进行消化处理优选如下处理过程：加入质量浓度为0.25％的胰酶，浸没所有细胞后倒掉胰酶，然后再加入上述胰酶，倒去大部分，仅剩刚好覆盖细胞的胰酶，在37℃继续消化1～5min，然后加入含100mL/L FCS、2mmol/L谷胺酰胺、20mmol/LHEPES的DMEM/F12培养基终止消化；

步骤(2)所述的消化、接种、再用诱导液培养优选以下处理过程：用质量浓度为0.25％的胰酶消化细胞，按1∶2比例接种于25cm²之培养瓶中，每瓶加5mL诱导液，经诱导液培养6天以上即得到胰岛样细胞团；其中，所述的诱导液为含10ng/ml bFGF，10ng/ml EGF及3％-5％FCS的IMDM培养液。

本发明所述的人胎是指已死亡的离体胎儿，胎儿时期的MSCs因为增殖能力更强，可塑性更好，且免疫原性低，无成瘤性，因而具有显著的优越性，在体外将其初步诱导为能分泌胰岛素的胰岛β样细胞，胰岛β样细胞可进一步用于制备治疗糖尿病的药物。因此，该领域的研究具有广阔的临床应用前景，可带来较大的经济效益和社会效益。

附图说明

图1是倒置显微镜下所见未诱导的hFL-MSCs形态图。

图2是倒置显微镜下所见诱导6天后的胰岛β样细胞团的形态图。

图3是未诱导的MSCs的胰岛素阴性表达图；其中图A是胰岛β样细胞胞浆的阳性表达图；其中图B是胰岛β样细胞胞核阳性表达图；图C为图A与图B的合图。

图4是诱导后所得的胰岛β样细胞团的胰岛素阳性表达图(石蜡切片)；其中图A是胰岛β样细胞胞浆的阳性表达图；其中图B是胰岛β样细胞胞核阳性表达图；图C为图A与图B的合图。

图5是诱导后所得的胰岛β样细胞团的胰岛素阳性表达图(细胞爬片)；其中图A是胰岛β样细胞胞浆的阳性表达图；其中图B是胰岛β样细胞胞核阳性表达图；图C为图A与图B的合图。

图6是倒置显微镜下所见的诱导后所得的胰岛β样细胞团形态图(细胞爬片)。

图7是人胎肝间充质干细胞诱导前后超微结构的变化对比图(扫描电镜)；其中，图A为诱导前的超微结构图；图B为诱导后的超微结构图。

图8是诱导后的人胎肝间充质干细胞超微结构图(透射电镜)；其中，图A为诱导前的超微结构图；图B为诱导后的超微结构图。

图9是RT-PCR鉴定诱导的胰岛β样细胞团胰岛相关基因表达的电泳图。

图10是不同溶液对正常小鼠血糖值的影响曲线图。

图11是不同溶液对糖尿病小鼠血糖值的影响曲线图。

具体实施方式

实施例1诱导人胎肝间充质干细胞向胰岛β样细胞分化

(1)人胎肝间充质干细胞的分离、纯化及扩增：无菌生理盐水冲洗胎儿，剪去脐带后置于大烧杯中，用体积分数为75％的酒精浸泡5min，超净台中无菌取出胎肝，PBS冲洗血液数次，剪除包膜，将剩余肝组织剪碎，用尖嘴吸管吸取含2％FCS的Hank液冲洗肝组织，收集肝组织悬液入50ml或15ml无菌离心管中，吸管反复吹打以离散细胞，50×g离心5min，沉淀即为肝实质细胞，取上清液转入另一离心管(去除肝实质细胞)，500×g离心5min，弃上清液，沉淀即为肝非实质细胞，重复上述步骤两次。将获得的肝非实质细胞用含2％FCS的Hank液重悬，与6％的羟乙基淀粉按照4∶1的体积比混匀，室温下静置0.5h，RBC通过叠连下沉，有核细胞浮于上清中，取上清于另一离心管中，500g离心5min，弃上清，将沉于管底的细胞用含2％FCS的Hank液重悬，1500r/min离心5min，同法再洗1次。收集细胞重悬于完全培养基(DMEM/F12，10％FCS，2mmol/L谷胺酰胺，20mmol/LHEPES)中，反复吹打使细胞分散成单细胞悬液，取20μL用于细胞计数及细胞活力测定，最后按1.5×10⁶/cm²接种于25cm²培养瓶中，在37℃、5％CO₂的培养箱中培养。3d后首次更换培养液，弃去未贴壁细胞。以后每2～3d换液1次。细胞达到70％～80％融合时，用D-PBS清洗后，加入1mL体积浓度为0.25％的胰酶，浸没所有细胞后倒掉，再加入1mL体积浓度为0.25％的胰酶，倒去大部分，仅剩少量胰酶覆盖细胞，在37℃消化1～5min，镜下观察作用程度，及时加入新鲜全培养液终止消化。首次传代按1∶2比例传代，以后按1∶3比例传代培养。定期观察，换液。传代标记为P1、P2、P3等。

(2)诱导人胎肝间充质干细胞向胰岛β样细胞分化：取第3代以后的达到80％～90％融合之胎肝MSCs，用体积浓度为0.25％的胰酶消化细胞，按1∶2比例接种于25cm²特殊处理之培养瓶中，每瓶加5mL诱导液(含10ng/ml bFGF，10ng/mlEGF及3％-5％FCS的IMDM培养液)，经诱导液培养6天以上。

诱导分化后所得的胰岛样细胞团大多悬浮或半悬浮，可通过离心法更换培养液。

实施例2对实施例1所得胰岛样细胞团的鉴定

(1)诱导前后细胞的形态变化：图1是倒置显微镜下所见未诱导的hFL-MSCs形态图。图2是倒置显微镜下所见诱导6天后的胰岛β样细胞团的形态图。从图1可以看出未经诱导的MSCs呈长梭形，平行排列；从图2可以看出诱导6天的MSCs聚集成胰岛样细胞团。

(2)正置荧光显微镜观察胰岛素的表达：

图3是未诱导的MSCs的胰岛素阴性表达图；其中图A是胰岛β样细胞胞浆的阳性表达图；其中图B是胰岛β样细胞胞核图；免疫荧光染色结果显示：胰岛素被荧光染料Cy3染成红色，定位于细胞胞浆(图A)；胞核被特异性核染料hochest33258衬染为蓝色(图B)，图C为图A与图B的合图。

图4是诱导后所得的胰岛样细胞团的胰岛素阳性表达图(石蜡切片)；其中图A是胰岛β样细胞胞浆的阳性表达图；其中图B是胰岛β样细胞胞核阳性表达图；图C为图A与图B的合图。

图5是诱导后所得的胰岛样细胞团的胰岛素阳性表达图(细胞爬片)；其中图A是胰岛β样细胞胞浆的阳性表达图；其中图B是胰岛β样细胞胞核阳性表达图；图C为图A与图B的合图。

从图3、4、5可以看出，诱导后的细胞胰岛素呈明显阳性表达。

(3)双硫腙(Dithizone，DTZ)染色：

取实施例1所得的胰岛样细胞团，PBS洗2次后，加入5mLPBS和50μL双硫腙工作液(V/V，1％)，37℃孵育10min，在倒置显微镜下观察并拍照。

胰岛β细胞的胞浆中富含锌离子，锌离子是形成2-锌-胰岛素六聚体的必需成分，也是胰岛β细胞行使其功能的必要因素之一。DTZ能特异地与锌离子鳌合，形成紫红色的络合物，是体外鉴定胰岛β细胞的方法之一。图6是倒置显微镜下所见的诱导后所得的胰岛样细胞团形态图(细胞爬片)，图6显示诱导后的胰岛样细胞团被染成枣红色，说明细胞内富含锌离子，与胰岛β细胞具有相似之处，也说明这些细胞具备合成、分泌胰岛素的前提条件。

(4)利用扫描和透射电镜观察胰岛样细胞团的超微结构：

分泌细胞的典型特征是在细胞胞浆中存在分泌颗粒，也称分泌囊泡；分泌颗粒贮存着分泌物质，在适宜的刺激下，分泌颗粒会外排所包含的分泌物质，称为细胞排粒作用；在细胞排粒作用后，遗留在细胞膜上的不规则部分称为微绒毛。因此，分泌细胞的典型特征是具有分泌囊泡和微绒毛。图7是人胎肝间充质干细胞诱导前后超微结构的变化对比图(扫描电镜)；其中，图A为诱导前的超微结构图；图B为诱导后的超微结构图。由图A可以看出扫描电镜下的未诱导MSCs表面无囊泡状突起，而图B显示诱导的胰岛样细胞团表面分布有大小不等的囊泡样结构；图8是诱导后的人胎肝间充质干细胞超微结构的变化对比图(透射电镜)；其中，图A为诱导前的超微结构图；图B为诱导后的超微结构图。透射电镜(图8)下可观察到细胞表面有短粗的微绒毛，细胞内有大量大小不等，深浅不一的囊泡(箭头所指)。说明所诱导的细胞初步具备了分泌细胞的形态特征。

(5)利用RT-PCR鉴定胰岛素相关基因的表达

应用Primer5.0软件设计了β-actin，pdx-1，insulin，glut-2，glucagon，ngn3，nestin，isl-1等引物，由北京赛百盛公司合成，序列如下(各序列表可见SEQ No.1-16)：

基因	上游引物	下游引物	退火温度	扩增长度
					β-actinglut-2nestinngn3glucagonisl-1insulinhIns：	5’-CCAAGGCCAACCGCGAGAAGATGAC-3’5′-GCAGCTGCTCAACTAATCAC-3′5′-AGGATGTGGAGGTAGTGAGA-3′5′-AGACGACGCGAAGCTCACC-3′5′-CCCAAGATTTTGTGCAGTGGTT-3′5′-ACACATCTTTGGGGGAAAAG-3′5′-CATCAGAAGAGGCCATCA-3′5′-GCC TTT GTG AAC CAA CACCTG-3′，	5’-AGGGTACATGGTGGTGCCGCCAGAC-3’5’-TCAGCAGCACAAGTCCCACT-3′5′-TGGAGATCTCAGTGGCTCT-3′5′-AAGCCAGACTGCCTGGGCT-3′5′-GCGGCCAAGTTCTTCAACAAT-3′5′-AAAAAGCGCAGGAAGAGAG-3′5′-TGGTTCAAGGGCTTTATTCC-3′5′-GTT GCA GTA GTT CTC CAGCTG-3′	60℃57℃55℃60℃57℃55℃53℃55℃	592bp785bp251bp286bp221bp347bp444bp261bp

图9是RT-PCR鉴定诱导细胞胰岛相关基因表达的电泳图，其中M：marker 1：β-actin，2：glucogan，3：hlns，4：nestin，5：ngn3，6：isl-17：insulin，8：：glut-2。RT-PCR鉴定结果显示诱导细胞表达高度表达hlns，isl-1，insulin，glut-2和glucogan，弱表达nestin和ngn3。其中hlns，isl-1，insulin是胰岛β细胞特征性表达的基因；GLUT-2是葡萄糖转运蛋白家族中的一种，在胰岛β细胞膜上表达，是胰岛β细胞调节血糖重要的功能蛋白；nestin和ngn3在胰岛前体细胞中有所表达；胰岛α细胞合成和分泌glucogan；因此，这几种基因的联合表达说明诱导的细胞已初步具备了胰岛β细胞和胰岛α细胞的分子特征。

(6)用化学发光免疫分析法检测检测培养液上清及细胞裂解液中胰岛素分泌水平

取单纯诱导液、未诱导MSCs的培养液上清、诱导6 d形成胰岛样细胞团的培养液上清，用化学发光免疫分析法检测各上清中胰岛素含量。结果未诱导的MSCs的培养上清中检测不到胰岛素；而经过诱导的胰岛样细胞团，可检测到(106.7±28.21)μU/mL的胰岛素；细胞裂解液中胰岛素与细胞总蛋白的比值为(59.81±1.68)ng/mg蛋白。诱导的细胞团在含有5.5mmol/L葡萄糖的无血清培养基作用2h后，可分泌(1.27±0.06)μU/mL的胰岛素；而在含有25mmol/L葡萄糖的无血清培养基2h后，可分泌(5.36±0.12)μU/mL胰岛素，其刺激指数为4.22(刺激指数＝高糖刺激后胰岛素分泌量/低糖刺激后胰岛素分泌量)，说明诱导后的细胞对糖刺激具有一定的反应性。

实施例3本方法所得的胰岛素的小鼠腹腔注射实验

取生理盐水，单纯诱导液，诱导6天的细胞培养液上清(化学发光法检测胰岛素水平为3U/mL)以及标准胰岛素溶液(4U/mL)各300μL，注射到正常小鼠和糖尿病小鼠腹腔内。图10是不同溶液对正常小鼠血糖值的影响曲线图。图11是不同溶液对糖尿病小鼠血糖值的影响曲线图。表一是不同溶液对正常小鼠血糖值的影响值，表二、不同溶液对糖尿病小鼠血糖值的影响值。结果表明标准胰岛素溶液对正常小鼠和糖尿病小鼠均有快速而明显的降血糖作用，而诱导6天的细胞培养液上清对正常小鼠的无降糖作用，但对糖尿病小鼠有较快速和明显的降血糖作用，其作用趋势与标准胰岛素溶液相似，而注射相同容量生理盐水及单纯诱导液对正常小鼠和糖尿病小鼠均无降糖作用。

表一、不同溶液对正常小鼠血糖值的影响(

n＝6，mmol/L)

时间

注射标准胰岛素溶液

注射诱导6天之

注射单纯诱导

注射生理盐水

		培养液	液
					0h0.5h1.0h1.5h2.5h3h3.5h4.5h5.5h6.5h	5.93.52.61.71.52.33.55.57.26.1	6.36.37.56.66.87.26.76.176.6	6.57.27.57.76.76.86.46.77.26.9	5.76.36.76.37.17.27.56.77.16.8

表二、不同溶液对糖尿病小鼠血糖值的影响(

n＝6，mmol/L)

时间	注射标准胰岛素溶液	注射诱导6天之培养液	注射单纯诱导液	注射生理盐水
					0h0.2h0.5h1h2h3h4h5h	23.512.74.53.35.513.115.827.5	24.615.310.811.213.817.815.627.6	25.724.923.824.225.424.725.326.4	24.125.626.126.926.626.127.827.3

SEQUENCE LISTING

<110>暨南大学

<120>诱导人胎肝间充质干细胞向胰岛β样细胞分化的方法

<160>16

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>25

<212>DNA

<213>β-actin上游引物

<400>1

ccaaggccaa ccgcgagaag atgac                                           25

<210>2

<211>25

<212>DNA

<213>β-actin下游引物

<400>2

agggtacatg gtggtgccgc cagac                                           25

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>glut-2上游引物

<400>3

gcagctgctc aactaatcac                                                  20

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>glut-2下游引物

<400>4

tcagcagcac aagtcccact                                                  20

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>nestin上游引物

<400>5

aggatgtgga ggtagtgaga                                                 20

<210>6

<211>19

<212>DNA

<213>nestin下游引物

<400>6

tggagatctc agtggctct                                                  19

<210>7

<211>19

<212>DNA

<213>ngn3上游引物

<400>7

agacgacgcg aagctcacc                                                  19

<210>8

<211>19

<212>DNA

<213>ngn3下游引物

<400>8

aagccagact gcctgggct                                                  19

<210>9

<211>22

<212>DNA

<213>glucagon上游引物

<400>9

cccaagattt tgtgcagtgg tt                                              22

<210>10

<211>21

<212>DNA

<213>glucagon下游引物

<400>10

gcggccaagt tcttcaacaa t                                               21

<210>11

<211>20

<212>DNA

<213>isl-1上游引物

<400>11

acacatcttt gggggaaaag                                                 20

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<211>19

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<400>12

aaaaagcgca ggaagagag                                                  19

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<211>18

<212>DNA

<213>insulin上游引物

<400>13catcagaaga ggccatca                                                     18

<210>14

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<212>DNA

<213>insulin下游引物

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tggttcaagg gctttattcc                                                 20

<210>15

<211>21

<212>DNA

<213>hIns上游引物

<400>15

gcctttgtga accaacacc tg                                               21

<210>16

<211>21

<212>DNA

<213> hIns下游引物

<400>16

gttgcagtag ttctccagct g                                               21

Claims (5)

1.诱导人胎肝间充质干细胞向胰岛β样细胞分化的方法，其特征是，包括以下步骤：

(1)人胎肝间充质干细胞的分离、纯化及扩增：先采用分步离心法，再用羟乙基淀粉沉降法分离出人胎肝间充质干细胞；然后将肝间充质干细胞重新悬浮于完全培养基中，反复吹打使细胞分散成单细胞悬液，然后接种培养；细胞达到70％～80％融合时，用D-PBS清洗，再用胰酶进行消化处理，然后首次按1∶2比例传代，以后按1∶3比例传代培养；

(2)诱导人胎肝间充质干细胞向胰岛β样细胞分化：取步骤(1)中第3代以后的达到80％～90％融合的hFL-MSCs，消化、接种、再用诱导液培养6天以上即得到胰岛样细胞团。

2.根据权利要求1所述的诱导人胎肝间充质干细胞向胰岛β样细胞分化的方法，其特征是，步骤(1)所述的完全培养基为含有100ml/L FCS、2mmol/L谷胺酰胺、20mmol/L HEPES的DMEM/F12培养基。

3.根据权利要求1所述的诱导人胎肝间充质干细胞向胰岛β样细胞分化的方法，其特征是，步骤(1)所述的接种培养包括如下接种培养方法：将细胞按1.5×10⁶/cm²接种于25cm²培养瓶中，在37℃、5％CO₂的培养箱中培养，培养3d后首次更换培养液，弃去未贴壁细胞；以后每2～3d换液1次。

4.根据权利要求1所述的诱导人胎肝间充质干细胞向胰岛β样细胞分化的方法，其特征是，步骤(1)所述用胰酶进行消化处理包括如下过程：加入质量浓度为0.25％的胰酶，浸没所有细胞后倒掉胰酶，然后再加入上述胰酶，倒去大部分，仅剩刚好覆盖细胞的胰酶，在37℃继续消化1～5min，然后加入含有100ml/L FCS、2mmol/L谷胺酰胺、20mmol/L HEPES的DMEM/F12培养基终止消化。

5.根据权利要求1所述的诱导人胎肝间充质干细胞向胰岛β样细胞分化的方法，其特征是，步骤(2)所述的消化、接种、再用诱导液培养包括以下过程：用质量浓度为0.25％的胰酶消化细胞，按1∶2比例接种于25cm²之培养瓶中，每瓶加5mL诱导液，经诱导液培养6天以上即得到胰岛β样细胞团；其中，所述的诱导液为含10ng/ml bFGF，10ng/ml EGF及3％-5％FCS的IMDM培养液。

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