CN102695790A - 多能干细胞 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了从成体细胞制备多能干细胞的方法。具体地讲，本发明提供了在不使用饲养细胞层或可增加逆转录病毒转染效率的试剂的情况下从体细胞制备多能干细胞的方法。

Description

多能干细胞
本专利申请要求于2009年10月29日提交的美国临时申请No.61/256,149的优先权，将该临时申请全文以引用方式并入本文。
技术领域
本发明提供了从成体细胞制备多能干细胞的方法。具体地讲，本发明提供了在不使用饲养细胞层或可增加逆转录病毒转染效率的试剂的情况下从体细胞制备多能干细胞的方法。
背景技术
用于I型糖尿病的细胞替代疗法的进展以及可移植胰岛的缺乏已使得注意力集中在开发适于移植物移入的胰岛素生成细胞或β细胞的来源上。一种方法是从多能干细胞(例如胚胎干细胞或从成体细胞产生的多能干细胞)产生功能性β细胞。
从成体细胞产生的多能干细胞或“诱导型多能干细胞”或“IPS细胞”是通过诱导某些基因的“强制”表达而以人为方式来源于非多能细胞(例如成体体细胞)的多能干细胞类型。据信，诱导型多能干细胞与天然多能干细胞(如胚胎干细胞)在很多方面都相同，如某些干细胞基因和蛋白质的表达、染色质甲基化模式、倍增时间、胚状体形成、畸胎瘤形成、有活力的嵌合体形成以及潜能和分化能力。
在一个例子中，Takahashi等人声称：“我们证明了通过在ES细胞培养条件下引入四个因子Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4，可从小鼠胚胎或成体成纤维细胞诱导多能干细胞”(Cell 126：663-676，2006)。
又如，Li等人声称：“我们揭示了基因重编程和化学条件相结合可产生和维持大鼠iPSC(riPSC)，从而产生畸胎瘤并且大大有助于产生嵌合体大鼠。采用相同的策略也足以产生非典型人iPSC(hiPSCs)，所述非典型人iPSC表现出与mESC类似的集落形态和自我更新要求/信号转导响应。”(Cell Stem Cell 4：16-19，2009)。
又如，Maherali等人声称：“四个转录因子Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4的异位表达足以将多能状态赋予成纤维细胞基因组，从而产生诱导型多能干(iPS)细胞。仍然未知的是，这四个因子诱导的细胞核重编程是否整体重置分化的细胞和多能细胞之间的表观遗传差异。在这里，我们使用新选择方法从成纤维细胞产生iPS细胞，以表征它们的表观遗传状态。雌性iPS细胞显示出体细胞沉默的X染色体的重新激活，并且在分化时经历了随机X失活。两个关键组蛋白修饰的全基因组分析表明iPS细胞与ES细胞高度类似。与这些观察相符的是，iPS细胞可产生有活力的高度嵌合体，并影响生殖细胞系。这些数据表明转录因子诱导的重编程可使体细胞表观基因组整体逆转为类ES状态。”(Cell Stem Cell 1：55-70，2007)。
又如，Stadtfeld等人声称：“我们构建了强力霉素诱导的慢病毒系统，用于在成纤维细胞中瞬时表达四个重编程因子c-Myc、Klf4、Oct4和Sox2。”(Cell Stem Cell 2：230-240)。
又如，Nakagawa等人声称：“我们在此描述了不需要Myc逆转录病毒的iPS细胞产生的改进方案。我们使用该方案获得的非iPS背景细胞显著减少，并且产生的iPS细胞始终具有高质量。在研究期间，Myc-iPS细胞来源小鼠不形成肿瘤。该方案也能够有效分离iPS细胞而无需药物选择。此外，我们在无MYC的情况下从成体表皮成纤维细胞产生了人iPS细胞。”(Nature Biotechnology 26：101-106，2008)。
又如，Takahashi等人声称：“我们证明了利用同样的四个因子：Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc，可以从成人表皮成纤维细胞产生iPS细胞。”(Cell 131：861-872，2007)。
又如，Okita等人声称：“我们之前的研究显示通过逆转录病毒引入Oct3/4(也称为Pou5f1)、Sox2、c-Myc和Klf4，并随后对Fbx15(也称为Fbxo15)表达进行选择，可从小鼠成纤维细胞诱导多能干细胞。这些诱导型多能干(iPS)细胞(在下文中称为Fbx15 iPS细胞)在形态、增殖和畸胎瘤形成方面与胚胎干(ES)细胞类似；然而，就基因表达和DNA甲基化模式而言它们则不同，而且不能制备成体嵌合体。这里我们得出结论，对Nanog表达进行选择可得到具有生殖系嵌合能力的iPS细胞，与Fbx15 iPS细胞相比，该iPS细胞具有增强的类ES细胞基因表达和DNA甲基化模式。”(Nature 448：313-317，2007)。
又如，Wemig等人声称：“成纤维细胞可在缺少c-Myc的情况下通过Oct4、Sox2和Klf4重编程为多能状态。”(Cell Stem Cell 2：10-12，2008)。
又如，Park等人声称：“我们从胎儿、新生儿和成人原代细胞(包括从健康研究受试者的皮肤活检组织分离的表皮成纤维细胞)得到了iPS细胞。”(Nature 451：141-146，2008)。
又如，Yu等人声称：“我们的研究表明，四个因子(OCT4、SOX2、NANOG和LIN28)足以将人体细胞重编程为表现出胚胎干(ES)细胞的基本特性的多能干细胞。”(Science 318：1917-1920，2007)。
然而，所述前景并未充分展现，部分由于常规衍生、传代和维持多能状态的源于体细胞的多能干细胞存在困难。体细胞来源多能干细胞的稳定和持续长期培养的一个特殊限制是多能干细胞需要在细胞饲养层上衍生。饲养细胞(通常为有丝分裂失活的成纤维细胞)提供未完全确定的培养组分的来源，所述组分可支持体细胞来源多能干细胞的贴壁、生长和传代。然而，由于饲养细胞中固有的可变因素，饲养层培养物阻碍了培养条件标准化以及体细胞来源多能干细胞的定向分化。因此，通常将体细胞来源多能干细胞从基于饲养层的培养物转换为由细胞外基质蛋白构成的贴附层上的无饲养层培养物，以为了进行充分表征了的和受控制的培养和分化。遗憾的是，在饲养细胞上培养得到的体细胞来源多能干细胞转换为无饲养层体系的过程会使细胞产生应激反应，并且可导致自发分化和/或核型不稳定性。
因此，仍然明显地需要产生足够质量的且可扩增以满足当前临床需要的诱导型多能干细胞。本发明利用替代方法来产生诱导型多能干细胞，其中多能干细胞由体细胞形成，而无需使用饲养细胞层。
发明内容
在一个实施例中，本发明提供了在不使用饲养细胞层或可增加病毒转染效率的试剂的情况下从体细胞产生多能干细胞的方法。
在备选实施例中，本发明提供从羊水来源细胞衍生的多能干细胞群，所用方法不需要使用饲养细胞层或可增加病毒转染效率的试剂。
附图说明
图1示出了人胚胎干细胞系H1的细胞和CRL2522细胞系来源多能干细胞的多能性相关基因的表达。
图2示出了多能干细胞集落的形态。图A和B示出了衍生自羊水来源细胞的多能干细胞集落的代表性显微图。图C和D示出了衍生自羊水来源细胞(AFD1)、传代五次后的多能干细胞。图E示出了未转导的羊水来源细胞。
图3示出了衍生自羊水来源细胞的多能干细胞的多能性相关基因的表达。
图4示出了衍生自羊水来源细胞(AFD1)的多能干细胞的多能性相关基因的表达，其在指定的传代次数通过流式细胞术检测。
图5示出了衍生自羊水来源细胞(AFD1)的多能干细胞的多能性相关基因的表达，其在第5次传代时通过免疫荧光检测。
图6示出了CRL2522细胞系来源的多种多能干细胞的多能性相关基因的表达。
图7示出了衍生自羊水来源细胞的两个多能干细胞群中定形内胚层谱系特征性标志物的表达。
图8示出了CRL2522细胞系来源的多能干细胞群中定形内胚层谱系特征性标志物的表达。
图9示出了衍生自羊水来源细胞的多能干细胞群中胰腺内分泌谱系特征性标志物的表达。
图10示出了使用衍生自羊水来源细胞、CRL2522细胞和人胚胎干细胞系H1的细胞的多能干细胞形成的胚状体。也示出了多种胚状体的基因表达谱比较。
图11示出了衍生自羊水来源细胞的多能干细胞在缺乏饲养细胞层和贴附层的表面上的生长和贴附。
图12示出了衍生自羊水来源细胞的多能干细胞在缺乏饲养细胞层和贴附层的表面上培养时的多能性相关基因的表达。
图13示出了衍生自羊水来源细胞的多能干细胞群在缺乏饲养细胞层和贴附层的表面上培养时定形内胚层谱系特征性标志物的表达。
具体实施方式
为了以不受限制的方式清晰说明本公开，将本发明的具体实施方式分成下列描述或阐明本发明某些特征、实施例或应用的小节。
定义
干细胞是由它们在单细胞水平上既自我更新又分化产生子代细胞的能力来定义的未分化细胞，包括自我更新祖细胞、非更新祖细胞和末端分化细胞。干细胞的特征还在于：其具有在体外由多种胚层(内胚层、中胚层和外胚层)分化成各种细胞谱系的功能细胞以及移植后产生多种胚层的组织和注入胚泡后基本上有助于大部分(如果不是所有的话)组织形成的能力。
干细胞根据其发育潜能分为：(1)全能，指能够产生所有的胚胎和胚胎外细胞类型；(2)多能，指能够产生所有的胚胎细胞类型；(3)专能，指能够产生细胞谱系的亚群，但所有细胞谱系都只分布于特定组织、器官或生理系统内(例如造血干细胞(HSC)可产生的后代细胞包括：HSC(自我更新)、局限于血细胞的寡能祖细胞以及作为血液正常组分的所有细胞类型和成分(如血小板))；(4)寡能，指能够产生比专能干细胞更有限的细胞谱系亚群；以及(5)单能，指能够产生单一细胞谱系(如生精干细胞)。
分化是未特化的(“未定向的”)或特化不足的细胞获得特化细胞(如神经细胞或肌肉细胞)的特征的过程。分化的细胞或诱导分化的细胞是已经在细胞谱系中占据更特化的(“定向的”)位置的细胞。术语“定向的”当应用到分化的过程时，指在分化途径中已经进行到这么一种程度的细胞：在正常环境下，它会继续分化成特定的细胞类型或细胞类型子集，且在正常环境下不能分化成另一细胞类型或回复到分化不足的细胞类型。去分化指细胞回复到细胞的谱系当中特化(或定向)不足的地位的过程。本文所用的“细胞的谱系”限定细胞的遗传关系，即它来自哪些细胞和它能产生什么细胞。细胞谱系将细胞定位于发育和分化的遗传计划内。谱系特异性标志物指与所关注谱系的细胞的表型明确相关的特征，可用来评估未定向细胞向所关注谱系的分化。
如本文所用，“表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞”或“第1阶段细胞”或“第1阶段”是指表达至少一种下列标志物的细胞：SOX17、GATA4、HNF3β、GSC、CER1、Nodal、FGF8、Brachyury、Mix样同源盒蛋白、FGF4CD48、脱中胚蛋白(eomesodermin，EOMES)、DKK4、FGF17、GATA6、CXCR4、C-Kit、CD99或OTX2。表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞包括原条前体细胞、原条细胞、中内胚层细胞和定形内胚层细胞。
本文所用的“表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞”指表达至少一种下列标志物的细胞：PDX1、HNF1β、PTF1α、HNF6、NKX6.1或HB9。表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞包括胰腺内胚层细胞、原肠管细胞和后前肠细胞。
如本文所用，“定形内胚层”指具有在原肠胚形成过程中从上胚层产生的细胞的特性并形成胃肠道及其衍生物的细胞。定形内胚层细胞表达下列标志物：HNF3β、GATA4、SOX17、Cerberus、OTX2、goosecoid、C-Kit、CD99和MIXL1。
如本文所用，“标志物”是在所关注细胞中差异表达的核酸或多肽分子。关于这一点，差异表达意指阳性标志物的水平增加，而阴性标志物的水平降低。标志物核酸或多肽的可检测水平，在所关注细胞中充分地高于或低于在其他细胞中，使得可使用多种本领域公知的方法中的任何一种将所关注细胞与其他细胞鉴别和区分开来。
如本文所用，“胰腺内分泌细胞”或“胰腺激素表达细胞”指能够表达下列激素中的至少一种的细胞：胰岛素、胰高血糖素、生长抑素和胰多肽。
本发明的诱导型多能干细胞的产生
在一个实施例中，本发明的多能干细胞通过引入至少一个选自SOX2、OCT4、LIN28和NANOG的基因从体细胞衍生，而无需使用饲养细胞层。所述至少一个基因可通过任何合适的手段引入体细胞，例如核酸转染、病毒转导或直接引入所述至少一个基因编码的蛋白质。
在所述至少一个基因通过病毒转导引入的情况下，体细胞可以使用逆转录病毒转导。任何能够将所述至少一个基因引入体细胞的逆转录病毒都适用于本发明。在一个实施例中，逆转录病毒是慢病毒。
在备选实施例中，体细胞可以使用病毒转导。任何能够将所述至少一个基因引入体细胞的病毒都适用于本发明。例如，用于本发明方法的病毒可以是腺病毒。作为另外一种选择，用于本发明方法的病毒可以是杆状病毒。
可增加病毒或逆转录病毒转染效率的试剂通过中和病毒粒子与体细胞的细胞膜上的唾液酸之间的电荷相斥来发挥作用。此类试剂包括(例如)聚凝胺(polybrene)。
在一个实施例中，多能干细胞衍生自体细胞，而无需使用饲养细胞层或可增加逆转录病毒转染效率的试剂，其包括以下步骤：
a.在组织培养基质上接种体细胞，
b.用至少一个逆转录病毒转导接种的体细胞，该逆转录病毒含有编码至少一种选自以下的基因的核酸：SOX2、OCT4、LIN28和NANOG，
c.将转导的细胞培养三天，然后将转导的细胞转移到包被有细胞外基质蛋白的组织培养板上，并且在补充有可抑制Rho激酶活性的试剂和bFGF的培养基中培养转移的细胞一周，以及
d.将培养的细胞传代至包被有细胞外基质蛋白的组织培养板上，并且在补充有bFGF的调理培养基中培养传代细胞。
所述至少一种逆转录病毒可以含有编码所述至少一种基因中的一种或不止一种的核酸。在一个实施例中，体细胞使用含有单独编码所述至少一种基因的核酸的逆转录病毒转导。
在一个实施例中，调理培养基使用小鼠胚胎成纤维细胞调理。
在一个实施例中，接种的体细胞用慢病毒转导，该慢病毒含有编码至少一种选自以下的基因的核酸：SOX2、OCT4、LIN28和NANOG。在备选实施例中，接种的体细胞用含有编码SOX2、OCT4、LIN28和NANOG的核酸的慢病毒转导。在备选实施例中，接种的体细胞用至少一个含有单独编码SOX2、OCT4、LIN28和NANOG的核酸的慢病毒转导。
在一个实施例中，抑制Rho激酶活性的试剂选自：Y-27632、法舒地尔、(S)-(+)-4-甘氨酰基-2-甲基-1-[(4-甲基-5-异喹啉基)磺酰基]-六氢-1H-1，4-二氮杂卓二盐酸盐(本文称为H1152-甘氨酰)和羟基法舒地尔。
细胞外基质可以是(例如)纤连蛋白、玻连蛋白、层粘连蛋白、胶原、明胶、血小板反应蛋白等等。在一个实施例中，细胞外基质是MATRIGEL。
在一个实施例中，体细胞可以是转让给LifeScan，Inc.的美国专利申请11/420,895中公开的羊水来源细胞。
在备选实施例中，体细胞可以是WO2003/042405中公开的羊水来源细胞。
在备选实施例中，体细胞可以是美国公布的专利申请US 2005/0054093中公开的羊水来源细胞。
在备选实施例中，体细胞可以是Int’Anker等人，Blood 102：1548-1549，2003中公开的羊水来源细胞。
在备选实施例中，体细胞可以是Tsai等人，Human Reproduction 19，1450-1456，2004中公开的羊水来源细胞。
在备选实施例中，体细胞可以是转让给LifeScan，Inc.的美国专利申请11/762,714中公开的绒毛膜绒毛来源细胞。
在备选实施例中，体细胞可以是Chang&Jones，Prenatal Diagnosis 8：367-378，1988中公开的绒毛膜绒毛来源细胞。
在备选实施例中，体细胞可以是Rong-Hao等人，Human Reproduction11：1328-1333，1996中公开的绒毛膜绒毛来源细胞。
在备选实施例中，体细胞可以是WO2003/042405中公开的绒毛膜绒毛来源细胞。
在备选实施例中，体细胞可以是转让给LifeScan，Inc.的WO2006/094286中公开的胰腺来源细胞。
在备选实施例中，多能干细胞可以由转让给LifeScan，Inc.的美国专利申请12/108,872中公开的细胞形成。
适于支持从体细胞产生多能干细胞的任何培养基均可用于本发明的方法。然而，已经认识到，其他类型的细胞也可得益于在该培养基中培养，因此本发明的组合物可无限制地用于这些目的。
在本发明的一个方面，通过基本上涉及以下步骤的方法产生调理培养基：
a.培养供应调理因子的细胞，
b.将基础培养基添加至该细胞，
c.使该基础培养基暴露于该细胞持续足够调理该培养基的一段时间，以及
d.移出该调理培养基。
在本发明的一个方面，通过基本上涉及以下步骤的方法制成产生培养基：
a.培养供应调理因子的细胞，
b.使细胞失活，
c.重新接种该供应调理因子的细胞，
d.将基础培养基添加至该细胞，
e.使该基础培养基暴露于该细胞持续足够调理该培养基的一段时间，
f.移出调理培养基，以及
g.移出调理培养基。
如本文所用，“基础培养基”是指能够有效支持培养物中的非多能细胞生长的盐和营养物质的溶液。
如本文所用，“调理培养基”是指进一步补充有源自饲养细胞的可溶性因子的基础培养基。
如本文所用，“饲养细胞”是指多能干细胞接种于其上的非多能干细胞。非多能干细胞提供有利于接种的多能干细胞生长的环境。
用于调理的基础培养基可具有任何若干不同配方。培养基必须能够支持至少用于培养基调理的细胞系的增殖。便利的是，调理后培养基还能支持多能干细胞的增殖。然而，作为替代方案，调理后可将培养基补充其他因子或者以别的方式处理以使其适应于增殖多能干细胞。
为了使多能干细胞在无饲养培养基中增殖，合适的基础培养基也可以由下列组分制成，例如，达尔伯克氏改良伊格尔培养基(DMEM)，Gibco货号11965-092；Knockout达尔伯克氏改良伊格尔培养基(KO DMEM)，Gibco货号10829-018；Ham′s F12/50％DMEM基础培养基；200mM L-谷氨酰胺，Gibco货号15039-027；非必需氨基酸溶液，Gibco 11140-050；b-巯基乙醇，Sigma货号M7522；人重组碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，Gibco货号13256-029。
基础培养基与用于对培养基进行调理的细胞组合，所述调理的环境允许细胞将可使多能干细胞增殖的组分释放到培养基中。任选地，用于调理培养基的细胞可通过例如辐射、用化学失活剂(如丝裂霉素c)处理或者通过任何其他有效方法来失活(也就是使其不能够实质复制)。在用于支持多能干细胞培养前使培养基与调理细胞分离的情况下，细胞的失活不是必须的。
将用于调理培养基的细胞在培养基中培养足够的时间，以允许释放因子达到足够浓度(或消耗培养基组分)，从而产生可支持多能干细胞增殖而不分化的培养基。通常，通过在37℃下培养24h来调理的培养基可产生能够支持多能干细胞培养物24小时的培养基。然而，可上调或下调培养期，根据经验(或通过测定必需因子的浓度)确定适当的培养期。在收集一批调理培养基后，可将细胞用于在另一培养期内调理另一批培养基，可根据需要循环多次，只要细胞能够保持充分调理培养基的能力。
本发明的诱导型多能干细胞的扩增和培养
多能干细胞可表达阶段特征性胚胎抗原(SSEA)3和4以及可用称为Tra-1-60和Tra-1-81的抗体检测的标志物中的一种或多种(Thomson等人，Science 282：1145，1998)。多能干细胞体外分化导致丧失SSEA-4、Tra 1-60和Tra 1-81的表达(如果存在的话)，并增加SSEA-1的表达。未分化的多能干细胞通常具有碱性磷酸酶活性，该酶可通过用4％多聚甲醛固定细胞，然后用Vector Red作为底物显影来检测，如生产商所描述的(VectorLaboratories，Burlingame Calif)。未分化的多能干细胞通常也表达OCT4和TERT，这可通过RT-PCR检测。
增殖的多能干细胞的另一理想表型是分化成所有三个胚层即内胚层、中胚层和外胚层组织的细胞的潜能。多能干细胞的多能性可例如通过这样来证实：将细胞注射进重症联合免疫缺陷(SCID)小鼠中，用4％多聚甲醛固定所形成的畸胎瘤，然后对它们进行组织学检验以确定是否存在来自三个胚层的细胞类型。作为另外一种选择，可以通过产生胚状体并评估胚状体中三个胚层相关的标志物的存在来确定多能性。
可以使用标准G带技术并与已公布的相应灵长类物种的核型相比较来分析增殖的多能干细胞系的核型。希望获得具有“正常核型”的细胞，其意指细胞为整倍体，其中所有人染色体都存在并且没有明显的改变。
本发明的方法形成的多能干细胞的培养
在一个实施例中，将本发明的方法形成的多能干细胞在以多种方式支持多能干细胞的饲养细胞层上培养。作为另外一种选择，将本发明方法形成的多能干细胞在基本上不含饲养细胞、但支持多能干细胞增殖而不经历实质分化的培养体系中培养。使用通过预先用另一细胞类型培养而调理的培养基支持通过本发明方法形成的多能干细胞在无饲养细胞的培养物中的生长而不分化。作为另外一种选择，使用化学成分确定的培养基支持本发明方法形成的多能干细胞在无饲养细胞的培养物中的生长而不分化。
例如，Reubinoff等人(Nature Biotechnology 18：399-404(2000))和Thompson等人(Science 6 November 1998：Vol.282.no.5391，pp.1145-1147)公开了用小鼠胚胎成纤维细胞饲养细胞层来培养来自人胚泡的多能干细胞系。
Richards等人(Stem Cells 21：546-556，2003)评价了一组11种不同的成人、胎儿和新生儿饲养细胞层在支持人多能干细胞培养方面的能力。Richards等人声称：“在成人皮肤成纤维细胞饲养层上培养的人胚胎干细胞系保持了人胚胎干细胞形态并保持了多能性”。
US20020072117公开了可产生支持灵长类多能干细胞在无饲养细胞的培养物中生长的培养基的细胞系。所采用的细胞系是从胚胎组织获得或从胚胎干细胞分化而来的间质细胞系和成纤维细胞样细胞系。US20020072117还公开了所述细胞系作为原代饲养细胞层的用途。
又如，Wang等人(Stem Cells 23：1221-1227，2005)公开了用于人多能干细胞在衍生自人胚胎干细胞的饲养细胞层上长期生长的方法。
又如，Stojkovic等人(Stem Cells 2005 23：306-314，2005)公开了从自发分化的人胚胎干细胞获取的饲养细胞体系。
在其他例子中，Miyamoto等人(Stem Cells 22：433-440，2004)公开了得自人胎盘的饲养细胞来源。
Amit等人(Biol.Reprod 68：2150-2156，2003)公开了衍生自人包皮的饲养细胞层。
又如，Inzunza等人(Stem Cells 23：544-549，2005)公开了来自人出生后包皮成纤维细胞的饲养细胞层。
US6642048公开了可支持灵长类多能干(pPS)细胞在无饲养细胞的培养物中生长的培养基以及可用于产生这种培养基的细胞系。US6642048声称：“本发明包括从胚胎组织获得或从胚胎干细胞分化而来的间质细胞系和成纤维细胞样细胞系。在本公开中描述并阐明了用于衍生这种细胞系、处理培养基以及用该调理培养基培养干细胞的方法”。
又如，WO2005014799公开了用于哺乳动物细胞维持、增殖和分化的调理培养基。WO2005014799声称：“通过鼠细胞(特别是分化并永生化的转基因肝细胞，称为MMH(Met鼠肝细胞))的细胞分泌活性对根据本发明制备的培养基进行调理”。
又如，Xu等人(Stem Cells 22：972-980，2004)公开了得自人胚胎干细胞衍生物的调理培养基，所述干细胞衍生物已经过基因修饰而过表达人端粒酶逆转录酶。
又如，US20070010011公开了一种用于维持多能干细胞的化学成分确定的培养基。
一种备选的培养体系采用补充有能促进胚胎干细胞增殖的生长因子的无血清培养基。例如，Cheon等人(BioReprod DOI：10.1095/biolreprod.105.046870，2005年10月19日)公开了一种无饲养细胞的无血清培养体系，其中胚胎干细胞维持在补充有能引发胚胎干细胞自我更新的不同生长因子的未经调理的血清替代(SR)培养基中。
又如，Levenstein等人(Stem Cells 24：568-574，2006)公开了使用补充有bFGF的培养基，在不存在成纤维细胞或调理培养基的情况下长期培养人胚胎干细胞的方法。
又如，US20050148070公开了一种在无血清且无成纤维细胞饲养细胞的成分确定的培养基中培养人胚胎干细胞的方法，该方法包括：在含有白蛋白、氨基酸、维生素、矿物质、至少一种转铁蛋白或转铁蛋白替代品、至少一种胰岛素或胰岛素替代品的培养基中培养干细胞，该培养基基本上无哺乳动物胎儿血清且含有至少约100ng/ml能激活成纤维细胞生长因子信号转导受体的成纤维细胞生长因子，其中该生长因子的供给来源不是仅为成纤细胞饲养层，该培养基支持干细胞在无饲养细胞或调理培养基的情况下以未分化状态增殖。
又如，US20050233446公开了一种用于培养干细胞，包括未分化的灵长类原始干细胞的限定培养基。在溶液中，此培养基与培养中的干细胞相比基本上是等渗的。在给定的培养物中，特定的培养基包含基础培养基和各为一定量的bFGF、胰岛素和抗坏血酸，所述一定量的bFGF、胰岛素和抗坏血酸为支持原始干细胞进行实质上非分化性生长所必需的。
又如，US6800480声称：“在一个实施例中，提供了用于以基本上未分化状态培养灵长类来源的原始干细胞的细胞培养基，其包括低渗透压、低内毒素基础培养基，此培养基对于支持灵长类来源的原始干细胞的生长是有效的。该基础培养基混合了有效支持灵长类来源的原始干细胞生长的营养血清和选自饲养细胞和衍生自饲养细胞的胞外基质组分的基质。该培养基还包含非必需氨基酸、抗氧化剂和选自核苷和丙酮酸盐的第一生长因子”。
又如，US20050244962描述：“在一个方面，本发明提供了一种培养灵长类胚胎干细胞的方法。在基本上不含哺乳动物胎血清(优选也基本上不含任何动物血清)的培养物中，并在存在由不只是成纤维细胞饲养层的来源提供的成纤维细胞生长因子情况下培养干细胞。在优选的形式中，通过添加足量的成纤维细胞生长因子，使得之前为维持干细胞培养物所需的成纤维细胞饲养层变为非必需的”。
在另外的例子中，WO2005065354公开了一种基本上无饲养细胞和无血清的成分确定的等渗培养基，其包含：a.基础培养基；b.bFGF，其量足以支持实质上未分化的哺乳动物干细胞生长；c.胰岛素，其量足以支持实质上未分化的哺乳动物干细胞生长；和d.抗坏血酸，其量足以支持实质上未分化的哺乳动物干细胞生长。
又如，WO2005086845公开了一种维持未分化的干细胞的方法，所述方法包括使干细胞暴露于转化生长因子-β(TGF-β)蛋白家族的成员、成纤维细胞生长因子(FGF)蛋白家族的成员或烟酰胺(NIC)，所述成员或烟酰胺的量足以维持细胞处于未分化状态达足以实现所需结果的一段时间。
可将通过本发明方法形成的多能干细胞接种在合适的培养基质上。在一个实施例中，合适的培养基材是胞外基质组分，例如衍生自基底膜的组分，或者可形成粘附分子受体-配体偶联物的一部分的组分。在一个实施例中，合适的培养基质是MATRIGEL
Figure BPA00001546920300141
(Becton Dickenson)。MATRIGEL
Figure BPA00001546920300142
是得自Engelbreth-Holm Swarm肿瘤细胞的可溶性制剂，其在室温下胶凝而形成重构的基底膜。
其他的细胞外基质组分和组分混合物适合作为替代物。取决于所扩增的细胞类型，这可包括单独的层粘连蛋白、纤连蛋白、蛋白聚糖、巢蛋白、硫酸乙酰肝素等或者它们的各种组合。
可将通过本发明方法形成的多能干细胞以合适的分布以及在存在可促进细胞存活、增殖和保持所需特性的培养基的情况下接种到基质上。所有这些特性可得益于对接种分布的认真考虑并可容易地由本领域技术人员确定。
合适的培养基可用如下组分制备，例如达尔伯克氏改良伊格尔培养基(DMEM)，Gibco货号11965-092；Knockout达尔伯克氏改良伊格尔培养基(KO DMEM)，Gibco货号10829-018；Ham′s F12/50％DMEM基础培养基；200mM L-谷氨酰胺，Gibco货号15039-027；非必需氨基酸溶液，Gibco11140-050；β-巯基乙醇，Sigma货号M7522；人重组碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，Gibco货号13256-029。
用本发明的方法产生的多能干细胞的分化
使用本发明的方法形成的多能干细胞可通过本领域的任何合适方法分化为多种其他细胞类型。例如，可使用本发明方法形成的多能干细胞分化成神经细胞、心脏细胞、肝细胞、胰腺细胞等等。
例如，可根据WO2007030870中公开的方法，使用本发明方法形成的多能干细胞分化为神经祖细胞和心肌细胞。
又如，可根据美国专利6,458,589中公开的方法，使用本发明方法形成的多能干细胞分化成肝细胞。
用本发明方法形成的多能干细胞分化为表达定形内胚层谱系特征性标 志物的细胞
可通过本领域的任何方法，使用本发明方法形成的多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。
例如，可根据D’Amour等人，Nature Biotechnology 23，1534-1541(2005)中公开的方法，使用本发明方法形成的多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。
例如，可根据Shinozaki等人，Development 131，1651-1662(2004)中公开的方法，使用本发明方法形成的多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。
例如，可根据McLean等人，Stem Cells 25，29-38(2007)中公开的方法，使用本发明方法形成的多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。
例如，可根据D’Amour等人，Nature Biotechnology 24，1392-1401(2006)中公开的方法，使用本发明方法形成的多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。
又如，可根据转让给LifeScan，Inc.的美国专利申请No.11/736,908中公开的方法，使用本发明的方法形成的多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。
又如，可根据转让给LifeScan，Inc.的美国专利申请No.11/779,311中公开的方法，使用本发明的方法形成的多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。
又如，可根据转让给LifeScan，Inc.的美国专利申请No.12/493,741中公开的方法，使用本发明的方法形成的多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。
又如，可根据转让给LifeScan，Inc.的美国专利申请No.12/494,789中公开的方法，将使用本发明的方法形成的多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。
表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞的形成可通过在进行特定方案之前或之后检测该标志物的存在来确定。多能干细胞通常不表达这类标志物。因而，当细胞开始表达它们时即检测到多能细胞的分化。
用本发明的方法形成的多能干细胞分化为表达胰腺内胚层谱系特征性 标志物的细胞
可通过本领域的任何方法，使用本发明的方法形成的多能干细胞分化成表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞。
例如，可根据D’Amour等人，Nature Biotechnology 24，1392-1401(2006)中公开的方法，使多能干细胞分化成表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞。
例如，还通过下述方法，使根据本发明的方法得到的表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞进一步分化成表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞：用成纤维细胞生长因子和hedgehog信号转导途径抑制剂KAAD-环巴胺处理表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞，然后除去含有成纤维细胞生长因子和KAAD-环巴胺的培养基，随后将细胞在含有视黄酸、成纤维细胞生长因子和KAAD-环巴胺的培养基中进行培养。此方法的一个例子在Nature Biotechnology 24，1392-1401(2006)中进行了公开。
例如，根据转让给LifeScan，Inc.的美国专利申请No.11/736,908中公开的方法，通过用视黄酸和至少一种成纤维细胞生长因子处理表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞一段时间，来使根据本发明的方法得到的表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞进一步分化成表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞。
例如，通过用视黄酸(Sigma-Aldrich，MO)和毒蜥外泌肽4处理表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞，然后除去含有DAPT(Sigma-Aldrich，MO)和毒蜥外泌肽4的培养基，随后在含有毒蜥外泌肽1、IGF-1和HGF的培养基中培养细胞，来使根据本发明的方法得到的表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞进一步分化为表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞。此方法的一个例子在Nature Biotechnology 24，1392-1401(2006)中进行了公开。
例如，可通过将表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞在含有毒蜥外泌肽-4的培养基中进行培养，然后除去含有毒蜥外泌肽-4的培养基，并且随后将所述细胞在含有毒蜥外泌肽1、IGF-1和HGF的培养基中进行培养，来使根据本发明方法得到的表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞进一步分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞。该方法的例子在D’Amour等人，Nature Biotechnology，2006中公开。
例如，通过将表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞在含有DAPT(Sigma-Aldrich，MO)和毒蜥外泌肽4的培养基中进行培养，来使根据本发明方法得到的表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞进一步分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞。该方法的例子在D’Amour等人，NatureBiotechnology，2006中公开。
例如，通过将表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞在含有毒蜥外泌肽4的培养基中进行培养，来使根据本发明方法得到的表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞进一步分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞。该方法的例子在D’Amour等人，Nature Biotechnology，2006中公开。
例如，根据转让给LifeScan，Inc.的美国专利申请No.11/736,908中公开的方法，通过用抑制Notch信号转导通路的因子处理表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞，使根据本发明的方法得到的表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞进一步分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞。
例如，根据转让给LifeScan，Inc.的美国专利申请No.11/779,311中公开的方法，通过用抑制Notch信号转导通路的因子处理表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞，使根据本发明的方法得到的表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞进一步分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞。
例如，根据转让给LifeScan，Inc.的美国专利申请No.60/953,178中公开的方法，通过用抑制Notch信号转导通路的因子处理表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞，使根据本发明的方法得到的表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞进一步分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞。
例如，根据转让给LifeScan，Inc.的美国专利申请No.60/990,529中公开的方法，通过用抑制Notch信号转导通路的因子处理表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞，使根据本发明的方法得到的表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞进一步分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞。
定形内胚层谱系特征性标志物选自SOX17、GATA4、HNF3β、GSC、CER1、NODAL、FGF8、Brachyury、Mix样同源盒蛋白、FGF4CD48、脱中胚蛋白(EOMES)、DKK4、FGF17、GATA6、CXCR4、C-Kit、CD99和OTX2。适用于本发明的是表达至少一种定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。在本发明的一个方面，表达定形内胚层系特征性标志物的细胞为原条前体细胞。在另一方面，表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞是中内胚层细胞。在另一方面，表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞是定形内胚层细胞。
胰腺内胚层谱系特征性标志物选自PDX1、HNF1β、PTF1α、HNF6、HB9和PROX1。适用于本发明的是表达至少一种胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞。在本发明的一个方面，表达胰腺内胚层系特征性标志物的细胞为胰腺内胚层细胞。
用本发明方法形成的多能干细胞分化为表达胰腺内分泌谱系特征性标 志物的细胞
可通过本领域的任何方法，使用本发明方法形成的多能干细胞分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞。
例如，可通过将表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞在含有毒蜥外泌肽-4的培养基中进行培养，然后除去含有毒蜥外泌肽-4的培养基，并随后将所述细胞在含有毒蜥外泌肽1、IGF-1和HGF的培养基中进行培养，来使根据本发明的方法得到的表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞进一步分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞。该方法的例子在D’Amour等人，Nature Biotechnology，2006中公开。
例如，通过在含有DAPT(Sigma-Aldrich，MO)和毒蜥外泌肽4的培养基中培养表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞，使根据本发明方法获得的表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞进一步分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞。该方法的例子在D’Amour等人，NatureBiotechnology，2006中公开。
例如，通在含有毒蜥外泌肽4的培养基中培养表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞，使根据本发明方法获得的表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞进一步分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞。该方法的例子在D’Amour等人，Nature Biotechnology，2006中公开。
例如，根据转让给LifeScan，Inc.的美国专利申请No.11/736,908中公开的方法，通过用抑制Notch信号转导通路的因子处理表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞，使根据本发明的方法得到的表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞进一步分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞。
例如，根据转让给LifeScan，Inc.的美国专利申请No.11/779,311中公开的方法，通过用抑制Notch信号转导通路的因子处理表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞，使根据本发明的方法得到的表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞进一步分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞。
例如，根据转让给LifeScan，Inc.的美国专利申请No.60/953,178中公开的方法，通过用抑制Notch信号转导通路的因子处理表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞，使根据本发明方法得到的表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞进一步分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞。
例如，根据转让给LifeScan，Inc.的美国专利申请No.60/990,529中公开的方法，通过用抑制Notch信号转导通路的因子处理表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞，使根据本发明的方法得到的表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞进一步分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞。
胰腺内分泌谱系特征性标志物选自NGN3、NEUROD、ISL1、PDX1、NKX6.1、PAX4、NGN3和PTF-1α。在一个实施例中，胰腺内分泌细胞能够表达以下激素中的至少一种：胰岛素、胰高血糖素、生长抑素和胰多肽。适用于本发明的是表达至少一种胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞。在本发明的一个方面，表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞为胰腺内分泌细胞。胰腺内分泌细胞可为表达胰激素的细胞。作为另外一种选择，胰腺内分泌细胞可为分泌胰激素的细胞。
在本发明的一个方面，胰腺内分泌细胞为表达β细胞谱系特征性标志物的细胞。表达β细胞谱系特征性标志物的细胞可表达PDX1和至少一种下列转录因子：NGN3、NKX2.2、NKX6.1、NEUROD、ISL1、HNF3β、MAFA、PAX4和PAX6。在本发明的一个方面，表达β细胞谱系特征性标志物的细胞是β细胞。
疗法
在一个方面，本发明提供了一种用于治疗患有1型糖尿病，或有发展1型糖尿病风险的患者的方法。在一个实施例中，本方法涉及从体细胞产生多能干细胞，对该多能干细胞进行培养，使该多能干细胞体外分化成β-细胞谱系，以及将该β-细胞谱系的细胞移植到患者体内。
如果合适，可用有利于该植入细胞存活和功能的药剂或生物活性剂对患者进行进一步处理。这些试剂可包括(例如)胰岛素、TGF-β家族的成员(包括TGF-β1、2和3)、骨形态发生蛋白(BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、BMP-11、BMP-12和BMP-13)、成纤维细胞生长因子-1和-2、血小板衍生生长因子-AA和-BB、血小板富集血浆、胰岛素生长因子(IGF-I、II)、生长分化因子(GDF-5、GDF-6、GDF-7、GDF-8、GDF-10、GDF-15)、血管内皮细胞衍生生长因子(VEGF)、多效蛋白(pleiotrophin)、内皮素等等。其他药物化合物可包括(例如)烟酰胺、高血糖素样肽-I(GLP-1)和高血糖素样肽-II、GLP-1和2模拟体、毒蜥外泌肽-4、视黄酸、甲状旁腺激素、MAPK抑制剂例如美国已公布的专利申请2004/0209901和美国已公布的专利申请2004/0132729中所公开的化合物。
可在移植进接受者前，使从体细胞产生的多能干细胞分化成胰岛素生成细胞。在具体实施例中，可在移植进接受者前，使从体细胞产生的多能干细胞完全分化成β-细胞。作为另一种选择，可将多能干细胞以未分化状态或部分分化的状态移植进接受者中。可在该接受者中发生进一步分化。
可将定形内胚层细胞或，作为另一选择，胰腺内胚层细胞，或作为另一种选择，β细胞作为分散细胞进行移植，或可使这些细胞形成簇，可将这些细胞簇输注进肝门静脉内。作为另一种选择，可将细胞设置在生物相容性的可降解聚合物型支持物中、多孔的非可降解性装置中或可进行封装以保护其免受宿主免疫应答的破坏。可将细胞移植进接受者中的合适位置内。植入位点包括(例如)肝脏、天然的胰腺、肾包膜下空间、网膜、腹膜、浆膜下空间、肠、胃或皮下袋。
为了增强植入细胞的进一步分化、存活率或活性，可在施用细胞之前、与之同时或之后施用额外的因子，例如生长因子、抗氧化剂或抗炎剂。在某些实施例中，生长因子用于使施用的细胞体内分化。这些因子可以由内源细胞分泌并就地暴露于施用的细胞。可通过本领域已知的内源生长因子或外源施用的生长因子的任意组合来诱导植入细胞进行分化。
移植中所用的量取决于多种因素，包括患者的状况和对该疗法的响应，并且可由本领域技术人员确定。
在一个方面，本发明提供了一种用于治疗患有糖尿病，或有发展糖尿病风险的患者的方法。该方法涉及培养多能干细胞，使培养的细胞体外分化成β-细胞谱系，以及将该细胞掺入三维支持物中。在移植进患者前，可使细胞在该支持物上体外维持。作为另一种选择，可将容纳有该细胞的支持物直接移植进患者中而无需进行额外的体外培养。可任选将至少一种有利于植入细胞的存活和功能的药剂掺入该支持物中。
适用于本发明目的的支持材料包括可用于组织修复的组织模板、导管、屏障物和贮器。具体地讲，已经在体外和体内用于生物组织重建或再生，以及用于递送趋化剂来诱导组织生长的泡沫、海绵、凝胶、水凝胶、纺织物和非织造结构形式的合成材料和天然材料适用于实践本发明的方法。参见，例如在美国专利5,770,417、美国专利6,022,743、美国专利5,567,612、美国专利5,759,830、美国专利6,626,950、美国专利6,534,084、美国专利6,306,424、美国专利6,365,149、美国专利6,599,323、美国专利6,656,488、美国已公布的专利申请2004/0062753A1、美国专利4,557,264和美国专利6,333,029中所公开的材料。
为了形成掺有药剂的支持物，可在形成支持物前将药剂与聚合物溶液混合。作为另一种选择，可将药剂涂覆于制好的支持物上，优选在存在药物载体的情况下进行。药物可以液体、细分固体或任何其他合适的物理形式存在。作为另一种选择，可将赋形剂添加至支持物中以改变药剂的释放速率。在一个备选实施例中，将至少一种为抗炎化合物的药物化合物(例如在美国专利6,509,369中所公开的化合物)掺入支持物中。
可将至少一种为抗凋亡化合物的药物化合物(例如在美国专利6,793,945中所公开的化合物)掺入支持物中。
可将至少一种为纤维变性抑制剂的药物化合物(例如在美国专利6,331,298中所公开的化合物)掺入支持物中。
支持物还可掺有至少一种能够增强血管生成的药物化合物，例如美国已公布的专利申请2004/0220393和美国已公布的专利申请2004/0209901中所公开的化合物。
支持物还可掺有至少一种为免疫抑制化合物的药物化合物，例如美国已公布的专利申请2004/0171623中所公开的化合物。
支持物还可掺有至少一种为生长因子的药物化合物，例如TGF-β家族的成员(包括TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3)、骨形态发生蛋白(BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、BMP-11、BMP-12和BMP-13)、成纤维细胞生长因子-1和-2、血小板衍生生长因子-AA和-BB、血小板富集血浆、胰岛素生长因子(IGF-I、IGF-II)、生长分化因子(GDF-5、GDF-6、GDF-8、GDF-10、GDF-15)、血管内皮细胞衍生生长因子(VEGF)、多效蛋白、内皮素等等。其他药物化合物可包括(例如)烟酰胺、缺氧诱导因子1-α、高血糖素样肽-I(GLP-1)、GLP-1和GLP-2模拟体、毒蜥外泌肽-4、nodal、成头蛋白、NGF、视黄酸、甲状旁腺激素、腱生蛋白-C、弹性蛋白原、凝血酶衍生的肽、凯萨林菌素(cathelicidin)、防御素(defensin)、层粘连蛋白、含有粘附性细胞外基质蛋白例如纤连蛋白和玻连蛋白的细胞结合结构域和肝素结合结构域的生物肽、MAPK抑制剂(例如在美国已公布的专利申请2004/0209901和美国已公布的专利申请2004/0132729中所公开的化合物)。
可通过将细胞简单地沉积在该支架上来实现将本发明细胞掺入支架中。细胞可通过简单扩散进入支架中(J.Pediatr.Surg.23(1 Pt 2)：3-9(1988))。已经发展了若干其他方法来增强细胞接种的效率。例如，已经将转瓶用于将软骨细胞接种于聚乙醇酸支架上(Biotechnol.Prog.14(2)：193-202(1998))。用于细胞接种的另一种方法是利用离心，这种离心产生最小的应力给接种的细胞并增强接种效率。例如，Yang等人开发了一种细胞接种方法(J.Biomed.Mater.Res.55(3)：379-86(2001))，称为离心细胞固定(Centrifugational Cell Immobilization，CCI)。
本发明通过(但不限于)以下实例进一步说明。
实例
实例1
使用STEMGENT TM 人转染因子试剂盒用饲养细胞从体细胞产生多能干 细胞
使用StemgentTM人TF慢病毒套装(产品目录号00-0005)，通过StemgentTM人转染因子试剂盒所述的方法从成人包皮成纤维细胞产生多能干细胞。将得自ATCC的CRL2522细胞(在Stemgent方案中人包皮成纤维细胞称为“BJ”细胞)以100,000个细胞/孔的密度接种到装有生长培养基的6孔板中，得到40-50％的汇合度。该生长培养基由450ml EMEM、50ml胚胎干细胞专用级FBS、5ml 10mM非必需氨基酸、5ml青霉素(10,000U/ml)-链霉素(10,000μg/ml)、5ml 200mM L-谷氨酰胺和0.9ml 55mM β-巯基乙醇构成(本文称为BJ细胞生长培养基)。细胞接种的第二天，将培养基更换为新鲜的含有聚凝胺和慢病毒的BJ细胞生长培养基，总体积为2.5ml(表1的条件#1和2)。慢病毒滴度由制造商使用p24衣壳抗原ELISA测定法确定。病毒滴度如下：SOX2-慢病毒滴度：68.80ng/ml；OCT4-慢病毒滴度：6.64ng/ml；LIN28-慢病毒滴度：68.80ng/ml；以及NANOG-慢病毒滴度：82.80ng/ml。
轻轻摇晃细胞培养皿确保培养基均匀分布，然后将细胞在37℃和5％CO2下温育过夜。转导二十四小时后，用胰蛋白酶消化细胞，以200×g离心5分钟，重悬于BJ细胞生长培养基中，并且在6孔板的3个孔中以1比3的接种比率重新接种于前一天接种的CF-1MEF饲养细胞上。将病毒转导的CRL2522细胞在饲养细胞上37℃和5％CO2下温育过夜。重新接种二十四小时后，将BJ细胞生长培养基更换为人ES/iPS细胞培养基(包含DMEM-F12培养基200ml、Knockout血清替代物50ml、200mM L-谷氨酰胺+2-巯基乙醇溶液1.25ml、非必需氨基酸100X溶液2.5ml和4ng/ml终浓度的B-FGF溶液)。在最初七天中每天更换ES/iPS细胞培养基。七天后，将培养基更换为MEF调理培养基(MEFCM)。通过将ES/iPS细胞培养基暴露于小鼠胚胎成纤维细胞来产生MEFCM。
培养三十八天后，用分散酶处理细胞，使细胞通过酶法传代至MEFCM中的MATRIGELTM上，其中MEFCM补充有10ng/ml bFGF和5μM Rho激酶抑制剂Y27632。此后，每天给细胞提供补充有10ng/ml bFGF的新鲜MEFCM。病毒转导42天后观察到第一个较小的多能细胞集落。继续传代细胞，直到显示出典型的人ES形态。产生了十二个无性系。储藏并冻存第6代细胞系，3个克隆现在已培养传代15次。克隆保持了多能形态和多能干细胞特性。此外，细胞可使用胚状体试验分化成所有三个胚层，并且它们的分化可使用限定方案专一定向形成定形内胚层。典型多能干细胞集落的显微图在图1中示出。
实例2
在不使用饲养细胞的情况下用STEMGENT TM 人转染因子试剂盒从体细 胞产生多能干细胞
将根据美国专利申请11/420,895中公开的方法分离的100,000个羊水来源细胞接种在装有AMNIOMAXTM培养基的六孔平皿的10cm2孔中。第二天根据表1中的条件#7用慢病毒转导细胞。将培养基更换为新鲜的含有慢病毒的AMNIOMAXTM培养基，总体积为2.5ml。慢病毒滴度由制造商使用p24衣壳抗原ELISA测定法确定。病毒滴度如下：SOX2-慢病毒滴度：68.80ng/ml；OCT4-慢病毒滴度：6.64ng/ml；LIN28-慢病毒滴度：68.80ng/ml；以及NANOG-慢病毒滴度：82.80ng/ml。
用于该实例的病毒转导不使用转导增强剂聚凝胺(第二天根据表1中的条件#7用慢病毒转导细胞)。第3天时，将细胞解离并且接种于涂布有与MEFCM以1∶30稀释的MATRIGELTM的表面上，其中MEFCM补充有用于0代(p0)的8ng/ml bFGF(MEFCM8)和5μM ROCK抑制剂Y27632。接种细胞并且此后每天给细胞提供新鲜的MEFCM8。
培养一周后，将细胞用分散酶传代至新鲜的1∶30MATRIGELTM涂布平板(第一代＝p1)。10天后观察到大约20个人胚胎干细胞样集落(图2，A&B)。手工选择最密集的“胚胎干细胞样”集落，并合并用于传代。将该培养物指定为细胞系AFD1(图2，C&D)。手工选择单集落用于传代，并将其指定为AFD2。
储藏并冻存第5代细胞系AFD1和2，该细胞系现在已培养传代11-12次并且保持了多能形态和多能干细胞特性。
实例3
在不使用饲养细胞的情况下用STEMGENT TM 人转染因子试剂盒从体细 胞产生多能干细胞
在饲养细胞上不使用聚凝胺的情况下，我们不能用MEF细胞饲养层衍生多能细胞(参见表1的条件#3-6)。将CRL22429细胞(包皮成纤维细胞，ATCC(Manassas VA USA))或AF细胞以100,000个细胞的浓度接种到六孔平皿的单独10cm2孔中过夜。第二天用含推荐量病毒的新鲜培养基在无聚凝胺的情况下处理细胞24小时。第三天用TrypLE处理细胞，并且传代到hESC/iPS细胞培养基中的MEF细胞上，该培养基含5mM ROCK抑制剂Y27632以促进贴壁。平行的细胞群也用三种已报道能够改善多能干细胞集落形成的化合物处理：100nM的CHIR99021、1μM的BIX01294和2μM的R(T)Bay K 8644。在14天里每天更换培养基。在含饲养细胞和AF细胞的孔中培养14天后细胞出现明显的死亡。
为了拯救细胞，用胶原酶将它们传代至不含补充化合物的hESC/iPS细胞培养基中的新饲养层上。在培养额外时间后未观察到集落。在含CRL2429和饲养细胞的孔中培养6周后细胞仍然存活。在培养6周后用胶原酶将细胞传代至1∶30matrigel上，然而未观察到集落。无论是否添加化合物，与CRL2429细胞和饲养细胞的共培养物相比，AF细胞和饲养细胞的共培养物中均观察到明显的细胞死亡。
实例4
根据本发明方法衍生的多能干细胞的表征
根据实例1和2中描述的方法衍生多能干细胞。通过qRT-PCR、免疫荧光、流式细胞术和相差显微术表征该多能干细胞，以确定多能干细胞共有的基因表达和形态。
我们使用qRT-PCR(图3)观察到第4代(p4)细胞系AFD1中多能特征性基因(OCT4、NANOG、SOX2、TERT和CRIPTO)的表达水平相当于人胚胎干细胞系H1(表达水平设定为1.0)。我们还注意到AF细胞(AFD)亲代群体，在第1代(p1)病毒转导13天后但在多能细胞集落出现前，并未显著表达SOX2、TERT和CRIPTO，而且NANOG的表达量远低于p4时的AFD1。这些结果表明在p4时观察到的SOX2和NANOG的表达是由于内源表达，而不是病毒构建体，这符合公布的观察结果，即病毒转导后体细胞完全转化为多能状态需要使病毒构建体沉默。有趣的是，AFD在p1时表达OCT4的水平相当于hESC细胞系H1，并且在p4时保持高水平，这表明OCT4的早期表达和持续表达对于多能状态的获得是必须的。
相似地，CRL2522细胞来源的多能干细胞也表达多能细胞特征性基因：OCT4、NANOG、FGF4和CDH1，并且表达水平相当于人胚胎干细胞系H1(表达水平设定为1.0)，而且表达水平显著高于亲代CRL2522细胞系中观察到的表达水平。
我们还通过相差显微术表征了细胞(图2)，证明AFD1多能干细胞集落具有密集的中心和光滑的边缘，与人胚胎干细胞集落外观相符，而且形态与AF细胞亲代群体显著不同。当通过流式细胞术测定第4、5和6代时，我们观察到AFD1细胞的多能干细胞特征性标志物(包括SSEA3、SSEA4、CD9、TRA-160和TRA-181)具有高的表面表达(图4)，而在亲代AF细胞上蛋白质未表达。我们还通过免疫荧光观察到SSEA4的表达，并且表达模式与OCT4观察到的类似(图5)。这些结果与人胚胎干细胞系H1上发现的表达模式相符，而且也为CRL2522细胞来源多能干细胞所复制(图1)。此外，细胞核密度显著高于未转导的亲代CRL2522成纤维细胞，其中亲代CRL2522成纤维细胞的SSEA4表达为阴性(图1)。
当通过流式细胞术测定第6代时，我们观察到CRL2522细胞来源多能干细胞的多能干细胞特征性标志物(包括SSEA3、SSEA4、CD9、TRA-160和TRA-181)具有高的表面表达(图6)，而在亲代CRL2522细胞上蛋白质未表达。我们还通过免疫荧光观察到SSEA4的表达，并且表达模式与OCT4观察到的类似(图1)。这些结果与hESC细胞系H1上发现的表达模式相符，而且表明我们从人包皮成纤维细胞CRL2522“BJ”细胞衍生了多能干细胞(图1)。
实例5
根据本发明方法衍生的多能干细胞的分化
使用几种方法使根据本发明方法从人包皮成纤维细胞或羊水细胞产生的多能干细胞分化，以确定它们的多能性。使多能干细胞分化为表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞，以及表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞。另外，当置于非贴壁悬浮培养物中时，通过本发明方法制备的多能干细胞显示出能形成胚状体。
通过用DE培养基处理多能干细胞，使本发明的多能干细胞分化为表达定形内胚层谱系(DE)特征性标志物的细胞，其中DE培养基包括含有2％无脂肪酸牛血清白蛋白(FAFBSA)、20ng/ml Wnt3a、8ng/ml bFGF和100ng/ml激活素A的RPMI 1640培养基。在分化的第2天和第3天，从DE培养基移除Wnt3a。培养3天后通过TrypLETM处理解离样品，并且通过流式细胞术测定标志物CD184(CXCR4蛋白)的表达，该标志物与定形内胚层的形成相关。当定向分化为定形内胚层时，羊水来源多能干细胞1和2(AFD1和AFD2)的CXCR4和CD99表达水平与H1人胚胎干细胞相似。通过qRT-PCR确定这些结果，该结果显示DE特征性基因(CXCR4、SOX17、GSC、CER1和FOXA2)的诱导与人ES细胞系H1相比显著相似(图7)。
人包皮成纤维细胞CRL2522来源多能干细胞也观察到相似的结果。使CRL2522来源多能干细胞的8个克隆分化为定形内胚层，并且每个克隆的DE标志物CXCR4表达水平都得到提高，与H1hES细胞对照组CXCR4的60％阳性相比，其表达水平在23.4％至58.3％阳性的范围内(表2)。如免疫荧光所检测，向DE分化的CRL2522来源多能干细胞样品也观察到SOX17的高水平表达，SOX17是定形内胚层特征性转录因子，并且是定形内胚层所需的(图8)。这些结果表明，如通过流式细胞术、qRT-PCR和免疫荧光所测量的，AF和CRL2522来源多能干细胞形成定形内胚层的比率与人胚胎干细胞系H1的DE形成相符。
在正常发育中，定形内胚层可形成多个谱系，包括肺、肠、肝、胰腺、胸腺和甲状腺。我们使用显示出可促进H1人胚胎干细胞中的胰腺命运的方案，使DE定向分化为表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞。除DE形成第一阶段之外的附加分化阶段包括：第2阶段：在含2％FAFBSA、0.25mM Sant-1和50ng/ml FGF-7的RPMI 1640培养基中培养两天；第3阶段：在含0.5X ITS、0.1％BSA、0.25μM Sant-1、50ng/ml FGF-7、100ng/ml成头蛋白、20ng/ml激活素A和2μM RA的DMEM高葡萄糖培养基中培养四天；第3.5阶段：在含0.5X ITS、0.1％BSA、10ng/ml FGF-7和100ng/ml成头蛋白的DMEM高葡萄糖培养基中培养3天；第4阶段：在含0.5X ITS、0.1％BSA、10ng/ml FGF-7、100ng/ml成头蛋白和1μM ALK5抑制剂的DMEM高葡萄糖中培养3天；以及第5阶段：在含0.5X ITS、0.1％BSA、100ng/ml成头蛋白和1μM ALK5抑制剂的DMEM高葡萄糖培养基中培养7天。
我们使用该方法观察到胰腺激素：胰岛素、胰高血糖素和生长抑素表达的显著增加，以及胰岛β细胞共有的转录因子(包括NKX6.1、PDX1和NEUROD)的增加，如通过qRT-PCR在羊水和CRL2522细胞来源PSC中所测量(表3)。我们还观察到通过第5阶段分化的羊水来源多能干细胞的NKX6.1表达和PDX1表达，如免疫荧光所测量(图9)。这些结果表明AF或CRL2522细胞来源多能干细胞能够形成内胚层，并且可向胰腺命运分化。
除了通过定向分化确定AF和CRL2522来源多能干细胞的多能性之外，我们还使用胚状体形成试验测试了细胞是否能够形成所有三个胚层。AF或CRL2522细胞来源多能干细胞在涂布matrigel的培养物表面上生长，并且通过以下方式剥离表面：用0.1％分散酶溶液温育细胞，用补充有10％FBS的DMEM培养基洗涤细胞，用橡胶刮刀剥离细胞，然后将DMEM培养基(补充有10％FBS)中的细胞转移到低结合培养皿，进行非贴壁悬浮培养。在含高血清的培养基中悬浮培养生长的多能干细胞将自发形成胚状体；球形多细胞结构由所有三个胚层谱系组成。谱系的形成通过qRT-PCR测试每个谱系(中胚层、内胚层和外胚层)共有的基因表达确定。AF或CRL2522细胞来源多能干细胞形成胚状体，并且基因表达模式表明存在所有三个胚层(图10)。
神经元/外胚层谱系标志物(CDH2和OTX)的水平升高，而中内胚层(T)和定形内胚层的早期标志物(SOX17、AFP、FOXA2和CXCR4)的水平也升高，正如中胚层和定形内胚层共有的标志物(GSC、CER1、GATA4和MIXL1)以及存在于运动神经元和β胰岛细胞的标志物(MNX)(图10)。这些结果表明从AF或CRL2522细胞产生的多能干细胞的确是多能的，并且能够从三个胚层中的每个产生组织。
实例6
当细胞在无饲养细胞或细胞外基质蛋白的情况下培养时，Rho激酶对本 发明的多能干细胞培养物的抑制效果
将多能干细胞系AFD1维持在Nunclon DeltaTM平板上的MEF调理培养基中，该平板在研究前用低生长因子MATRIGELTM的1∶30稀释液处理。通过1mg/ml分散酶分离，将细胞从表面分离以进行传代。然后将AFD1细胞接种于表面改性平板4(6孔格式)的未处理孔上。平行地，将AFD1细胞也接种在Nunclon DeltaTM平板上，该平板用低生长因子MATRIGELTM的1∶30稀释液处理，以提供阳性对照。在所有处理中，细胞均维持于MEF条件培养基中。
接种于表面改性平板4的AFD1细胞会贴壁，然而贴壁效率大大低于对照平板(图11)。向培养基中添加Rho激酶抑制剂后，贴壁效率大大增加。在培养的最初24小时内添加10μM浓度的Y-27632或3μM浓度的H1152-甘氨酰，会使细胞的接种效率显著增加到类似于对照平板所观察到的速率(图11)。此后将细胞分别维持在10μM恒定浓度的Y-27632或1μM低浓度的H1152-甘氨酰中，每天更换培养基。
在存在Y-27632或H1152-甘氨酰的情况下，将细胞在表面改性平板4上传代两次，并且通过qRT-PCR测试多能性相关基因的表达(图12)。与对照平板上生长的细胞相比，多能性相关和必需的基因(OCT4、NANOG、SOX2、TERT和CRIPTO/TDGF)的表达在改性表面4上生长的AFD1细胞中得到保持。我们还观察到与自发分化相关的若干基因(AFP、HAND2和GATA2)向胚外外胚层或滋养层命运的相对表达显著降低。这可能是由于NANOG表达量增加，NANOG通过抑制胚外外胚层或滋养层相关基因的表达抑制分化。另外，与对照平板相比，在改性表面4上通过差速贴壁和增殖多能性更高且分化程度更小的细胞，可出现胚外外胚层或滋养层相关基因表达的降低。
改性表面4上生长的细胞的多能性也通过测试它们分化为定形内胚层的能力确定。我们观察到，在改性表面4上、补充有Rho激酶抑制剂的MEF调理培养基中生长数代后分化为DE的细胞，显示出DE分化相关基因的强效表达，相当于H1hES分化为DE观察到的表达水平和模式(图13)。另外，当通过流式细胞术测试时，用Rho激酶抑制剂培养两代且在改性表面4上分化的AFD1细胞具有63％的CXCR4(一种定形内胚层形成相关表面蛋白)阳性表达，并且该表达水平与分化为DE的H1hES细胞中观察到的表达水平相符(60％CXCR4阳性；表2)。
表1：本发明使用的转导条件汇总
Figure BPA00001546920300301
表2：CRL2522细胞来源多能干细胞分化后，定形内胚层谱系特征性 标志物的表达
 #克隆  阳性CXCR4％   H1的归一化％
 CL-2  40.2   67.00
 CL-3  23.4   39.00
 CL-4  39.1   65.17
 CL-5  32.2   53.67
 CL-6  55.9   93.17
  CL-7   48.2   80.33
  CL-10   58.3   97.17
  CL-12   53.6   89.33
  H1 hES   60   100.00
表3：衍生自CRL2522和羊水来源细胞的多能干细胞分化后，胰内分 泌谱系特征性标志物的表达
在整篇文档中引用的出版物据此全文以引用方式并入。尽管上文已结合实例和优选实施例描述了本发明的各个方面，但应当理解本发明的范围不受上述具体实施方式的限定，而受以下在专利法原则下恰当理解的权利要求书的限定。

Claims (2)

1.一种在不使用饲养细胞层或增加逆转录病毒转染效率的试剂的情况下从体细胞制备多能干细胞的方法。
2.一种多能干细胞群体，所述多能干细胞群体通过以下方法从羊水来源细胞衍生：所述方法不需要使用饲养细胞层或增加逆转录病毒转染效率的试剂。
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