CN111417410A - 糖皮质激素受体激动剂及其免疫缀合物 - Google Patents

糖皮质激素受体激动剂及其免疫缀合物 Download PDF

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Abstract

本文提供糖皮质激素受体激动剂免疫缀合物、糖皮质激素受体激动剂及其使用方法。

Description

糖皮质激素受体激动剂及其免疫缀合物
相关申请
本申请要求2017年12月1日提交的美国临时申请第62/593,776号和2017年12月5日提交的美国临时申请第62/595,054号的优先权，其中的每一个都通过引用以其整体并入本文。
序列表
本申请含有序列表，所述序列表已经以ASCII格式以电子方式提交，并且在此通过引用以其整体并入。创建于2018年11月28日的所述ASCII副本被命名为A103017_1490WO_SL.txt，并且大小为14,758字节。
技术领域
肿瘤坏死因子α(TNFα)在若干种人类病症的病理生理学中起核心作用，并且抗TNFα药剂具有在临床上得到验证的在治疗自身免疫性和炎性病症，例如类风湿性关节炎、银屑病和炎性肠病中的治疗效用。尽管抗TNFα生物制剂在临床上取得成功，但它们在患者中可以获得的最大功效方面仍然受到限制，有必要鉴定和开发更强有力和有效的治疗剂。用抗TNFα生物制剂治疗的患者也可能对疗法产生免疫原性应答，从而限制其有效性。因此，具有较低的免疫原性和高功效的抗TNFα疗法对进一步控制疾病将是有用的。
合成的糖皮质激素受体激动剂是一类强效的用于治疗炎性病症的小分子，但是由于严重的副作用，它们在疾病的慢性治疗中的效用是有限的。需要开发与抗TNF抗体相比具有增强的功效和更长的作用持续时间并且具有最小的不良作用的治疗剂。
发明内容
本公开提供可用于治疗自身免疫性疾病的糖皮质激素受体激动剂免疫缀合物。
在一个方面，本公开提供一种抗体药物缀合物，其包含：
(a)抗TNFα抗体，所述抗TNFα抗体包含如SEQ ID NO：3所示的重链和如SEQ ID NO：4所示的轻链；以及(b)糖皮质激素受体激动剂，所述糖皮质激素受体激动剂包含由下式表示的基团：
Figure BDA0002515266650000021
并且其中抗体通过由下式表示的连接基团与糖皮质激素受体激动剂缀合：
Figure BDA0002515266650000022
在一个实施例中，本公开提供一种根据下式的抗体药物缀合物：
Figure BDA0002515266650000023
其中A是抗体，并且n是1至10的整数。
在一个方面，本公开提供一种抗体药物缀合物，其包含：
(a)抗TNFα抗体，所述抗TNFα抗体包含如SEQ ID NO：3所示的重链和如SEQ ID NO：4所示的轻链；以及(b)糖皮质激素受体激动剂，所述糖皮质激素受体激动剂包含由下式表示的基团：
Figure BDA0002515266650000031
并且其中抗体通过由下式表示的连接基团与糖皮质激素受体激动剂缀合：
Figure BDA0002515266650000032
在一个实施例中，本公开提供一种根据下式的抗体药物缀合物：
Figure BDA0002515266650000033
其中A是抗体，并且n是1至10的整数。
在一个实施例中，本公开提供任一前述实施例的抗体药物缀合物，其中载药量为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一个实施例中，本公开提供任一前述实施例的抗体药物缀合物，其中载药量为4，例如，前述抗体药物缀合物式中的n等于4。在一个实施例中，本公开提供任一前述实施例的抗体药物缀合物，其中载药量为2，例如，前述抗体药物缀合物式中的n等于2。
在一个实施例中，本公开提供一种制备任一前述实施例的抗体药物缀合物的方法，其包含将抗体与糖皮质激素受体激动剂缀合的步骤。在一个实施例中，本公开提供前述实施例的方法，进一步包含在将抗体与糖皮质激素受体激动剂缀合之前在糖皮质激素受体激动剂上引入PO4部分的步骤。在一个实施例中，本公开提供任一前述实施例的方法，其中缀合包含部分地还原抗体，并用根据下式的化合物将部分还原的抗体烷基化：
Figure BDA0002515266650000041
在一个实施例中，本公开提供一种药物组合物，其包含任一前述实施例的抗体药物缀合物和药学上可接受的载体。在一个实施例中，本公开提供前述实施例中任一个的药物组合物，其包含1至10的药物/抗体比率(DAR)。
在一个优选的实施例中，本公开提供一种根据下式的抗体药物缀合物：
Figure BDA0002515266650000042
其中，A是阿达木单抗(adalimumab)，并且n是4。
在一个优选的实施例中，本公开提供一种根据下式的抗体药物缀合物：
Figure BDA0002515266650000043
其中，A是抗TNFα抗体，其包含如SEQ ID NO：3所示的重链和如SEQ ID NO：4所示的轻链，并且n是4。
在另一个优选的实施例中，本公开提供一种根据下式的抗体药物缀合物：
Figure BDA0002515266650000051
其中，A是阿达木单抗，并且n是2。在另一个优选的实施例中，本公开提供一种根据下式的抗体药物缀合物：
Figure BDA0002515266650000052
其中，A是抗TNFα抗体，其包含如SEQ ID NO：3所示的重链和如SEQ ID NO：4所示的轻链，并且n是2。
在一个优选的实施例中，本公开提供任一前述实施例的药物组合物，其包含2.0的药物/抗体比率(DAR)。
在一个优选的实施例中，本公开提供任一前述实施例的药物组合物，其包含4.0的药物/抗体比率(DAR)。
在一个实施例中，本公开提供一种在受试者中治疗选自类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、银屑病关节炎、斑块型银屑病、溃疡性结肠炎、成人克罗恩病、小儿克罗恩病、葡萄膜炎、化脓性汗腺炎和幼年特发性关节炎的病状的方法，其包含向受试者施用有效量的任一前述实施例的抗体药物缀合物或任一前述实施例的药物组合物。
在一个实施例中，本公开提供任一前述实施例的抗体药物缀合物或任一前述实施例的药物组合物，用于治疗选自类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、银屑病关节炎、斑块型银屑病、溃疡性结肠炎、成人克罗恩病、小儿克罗恩病、葡萄膜炎、化脓性汗腺炎和幼年特发性关节炎的病状。
在一个实施例中，本公开提供任一前述实施例的抗体药物缀合物或任一前述实施例的药物组合物在制备用于治疗选自类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、银屑病关节炎、斑块型银屑病、溃疡性结肠炎、成人克罗恩病、小儿克罗恩病、葡萄膜炎、化脓性汗腺炎和幼年特发性关节炎的病状的药物中的用途。
在一个实施例中，本公开提供一种试剂盒，其包含：(a)包含任一前述实施例的抗体药物缀合物或任一前述实施例的药物组合物的容器；以及(b)位于一个或多个容器上或与一个或多个容器相关联的标签或包装插页，其中所述标签或包装插页指示所述抗体药物缀合物或药物组合物用于治疗选自类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、银屑病关节炎、斑块型银屑病、溃疡性结肠炎、成人克罗恩病、小儿克罗恩病、葡萄膜炎、化脓性汗腺炎和幼年特发性关节炎的病状。
在一个实施例中，本公开提供一种将糖皮质激素受体激动剂递送至表达TNFα的细胞的方法，其包含将细胞与任一前述实施例的抗体药物缀合物接触的步骤。在一个实施例中，本公开提供一种确定抗体药物缀合物的抗炎活性的方法，其包含：(a)使表达TNFα的细胞与任一前述实施例的抗体药物缀合物接触；以及(b)与对照细胞相比，确定促炎细胞因子从细胞中的释放。
附图说明
图1提供如在实例7中进行和描述的BrAc-Gly-Glu-糖皮质激素受体调节剂(GRM)-PO4的色谱分辨率。如所示出的，ADC是一种异质ADC混合物，其含有连接有两个药物连接基团分子的ADC和连接有四个药物连接基团分子的ADC。
图2阐述与BrAc-Gly-Glu-糖皮质激素-PO4缀合的阿达木单抗的解卷积MS数据。如所示出的，实现缀合。
图3提供如在实例7中进行和描述的在关节炎的小鼠胶原诱导的关节炎(CIA)模型中，与抗TNFαmAb(高剂量)或媒剂相比，高和低剂量的ADCl的功效的图。如所示出的，与单独的抗TNFαmAb或媒剂相比，单剂量的抗TNFα糖皮质激素ADC1通过改善足爪肿胀表现出约28天的延长的作用持续时间。
图4是如在实例7中进行和描述的在食蟹猴中闭环和开环ADC的浓度(ug/ml)随时间变化的图。如所示出的，闭环形式易受反向迈克尔反应以及随后体内连接基团药物的损失的影响。
具体实施方式
本文提供糖皮质激素受体激动剂免疫缀合物、糖皮质激素受体激动剂及其制备和使用方法。
本文提供一种根据下式的抗体药物缀合物：
Figure BDA0002515266650000071
其中，A是阿达木单抗，并且n是4。如下面的实例7所示，该ADC(即下面的ADC4)显示出体外活性、在血浆中的稳定性和最小聚集。
还提供制造ADC4的方法和使用ADC4的方法。
I.定义
为了便于理解本公开，下面定义了多个术语和短语。
术语“抗TNFα蛋白”是指能够(i)结合至TNFα和(ii)抑制可溶性TNFα与细胞表面TNFα受体(p55和/或p75)的结合和/或在补体的存在下体外裂解表达表面TNFα或TNFα受体的细胞的蛋白。在一些实施例中，抗TNF抗体可以与细胞的表面上的TNFα结合并且变得被内化。例如，US 2014/0294813(其通过引用以其整体并入本文)公开了抗TNF抗体，所述抗TNF抗体在与细胞表面人TNF结合时表现出细胞内化。抗TNFα蛋白包括例如抗TNFα抗体(例如，阿达木单抗、英夫利昔单抗和戈利木单抗)。抗TNFα抗体在与单核细胞来源的DC上的跨膜TNF结合时主动内化，并迅速进入溶酶体，并在溶酶体中降解。(Deora等人，MABS，2017，第9卷，第4期，680-694)。
如本文所使用的术语“抗体”旨在是指由通过二硫键相互连接的四条多肽链，两条重(H)链和两条轻(L)链组成的免疫球蛋白分子。每条重链由重链可变区(本文中缩写为HCVR或VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3组成。每条轻链由轻链可变区(本文中缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH和VL区可以进一步细分为高变区(被称为互补决定区(CDR))，其间散布有更加保守的区域(被称为框架区(FR))。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，其从氨基末端到羧基末端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
术语“抗TNFα抗体”或“与TNFα结合的抗体”是指能够例如以足够的亲和力结合TNFα的抗体，使得该抗体可用作靶向TNFα的治疗剂。抗TNFα抗体与不相关的非TNFα蛋白的结合程度可以小于如，例如，通过放射免疫测定(RIA)所测量的抗体与TNFα的结合的约10％。在某些实施例中，与TNFα结合的抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM或≤0.1nM的解离常数(Kd)。
如本文所使用的术语“免疫缀合物”、“缀合物”、“抗体药物缀合物”或“ADC”是指与蛋白质如细胞结合剂(例如抗TNFα抗体)缀合的化合物或其衍生物。此类免疫缀合物可以由通式定义：(SM-L-Q)n-A，其中SM＝衍生自小分子糖皮质激素受体激动剂的基团，例如糖皮质激素，L＝连接基团，Q＝异双功能基团或不存在，并且A＝蛋白质(例如抗体)，并且n＝1至10。免疫缀合物也可以由通式以相反的顺序定义：A-(Q-L-SM)n。
在本公开中，术语“连接基团”是指能够将抗TNFα蛋白(例如抗体)连接至糖皮质激素的化学部分。连接基团可能易于裂解(“可裂解的连接基团”)，从而促进糖皮质激素的释放。例如，在糖皮质激素和/或抗体保持活性的条件下，此类可裂解的连接基团可能易受肽酶诱导的裂解的影响。
特别地，本文公开的可裂解的连接基团组分包含肽，所述肽包含2至3个氨基酸残基(二肽或三肽)，并且具体而言是选自由丙氨酸-丙氨酸(Ala-Ala)、甘氨酸-谷氨酸(Gly-Glu)、谷氨酸-丙氨酸-丙氨酸(Glu-Ala-Ala)和甘氨酸-赖氨酸(Gly-Lys)组成的组的二肽和三肽。所述肽允许通过蛋白酶切割连接基团，从而在暴露于细胞内蛋白酶如溶酶体酶时促进糖皮质激素的释放(Doronina等人(2003)《自然生物技术(Nat.Biotechnol)》21：778-784)。
在本公开中，术语“糖皮质激素”是指与糖皮质激素受体相互作用的天然存在的或合成的类固醇激素，并且本文详细地公开了具体的糖皮质激素。“糖皮质激素的基团”是通过从母体糖皮质激素中去除一个或多个氢原子而得到的。氢原子的去除促进了母体糖皮质激素与连接基团的连接。在本公开中，从母体糖皮质激素的任何合适的-NH2基团中除去氢原子。特别地，“糖皮质激素的基团”是从母体糖皮质激素中去除一个氢原子而得到的一价基团。
在本公开中，术语“异双功能基团”是指连接连接基团和抗TNFα蛋白(例如抗体)的化学部分。异双官能基团被表征为在化学部分的任一端具有不同的反应性基团。
术语“药物/抗体比率”或“DAR”是指与A(例如抗体)连接的SM(例如衍生自小分子糖皮质激素受体激动剂的基团例如糖皮质激素)的数目。因此，在具有通式(SM-L-Q)n-A的免疫缀合物中，DAR由每抗体药物缀合物的载药量定义，例如“n”。
当提及具有代表个体免疫缀合物的式(SM-L-Q)n-A的化合物时，术语“化合物DAR”是指与个体A连接的SM的数目(例如，载药量或n为1至10的整数)。
当提及具有代表免疫缀合物的群体的式(SM-L-Q)n-A的化合物时，术语“群体DAR”是指与A连接的SM的平均数目(例如，载药量或n为1至10±0.5、+0.4、+0.3、+0.2、+0.1的整数或分数)。
术语“受试者”是指人类、非人灵长类动物等，它们将成为特定治疗的接受者。通常，术语“受试者”和“患者”在本文中参考人类受试者可互换使用。
术语“药物制剂”是指以此类形式使得允许活性成分的生物活性有效，并且不含有对将被施用该制剂的受试者具有不可接受毒性的额外组分的制剂。所述制剂可以是无菌的。
如本文所公开的免疫缀合物的“有效量”是足以实现明确描述的目的的量。“有效量”可以相对于所述目的来确定。
术语“治疗有效量”是指有效“治疗”受试者或哺乳动物中的疾病或病症的免疫缀合物的量。“预防有效量”是指有效达到期望的预防结果的量。
诸如“治疗(treating、treatment或to treat)”或“缓解(alleviating或toalleviate)”的术语是指治愈、减缓、减轻所诊断的病理状况或病症的一种或多种症状和/或减缓或停止所诊断的病理状况或病症的进展的治疗措施(“治疗性治疗”)。因此，需要治疗性治疗的受试者包括已经被诊断患有或怀疑患有所述病症的受试者。预防或防止措施是指预防目标病理状况或病症的发展的措施(“预防性治疗”)。因此，需要预防性治疗的受试者包括易于患有病症的受试者和要防止所述病症的受试者。
II.用于与糖皮质激素受体激动剂连接的蛋白质
本公开提供含有与蛋白质例如抗体连接的糖皮质激素受体激动剂的免疫缀合物。在一些实施例中，抗体是人的、人源化的、嵌合的或鼠的。在一些实施例中，蛋白质例如抗体可以结合至细胞的表面上的靶并且变得被内化。
本公开还提供含有与抗TNFα蛋白连接的糖皮质激素受体激动剂的免疫缀合物。在某些实施例中，抗TNFα蛋白是抗体。在某些实施例中，抗TNFα蛋白是与TNFα(例如，可溶性TNFα和/或膜结合的TNFα)结合的抗体。在某些实施例中，抗TNFα蛋白是可溶性TNF受体蛋白，例如与重链常数融合的可溶性TNF受体蛋白。在一些实施例中，抗TNFα蛋白，例如抗TNFα抗体，与细胞的表面上的TNFα结合并且变得被内化。例如，美国专利申请公开第2014/0294813号(其通过引用并入本文)公开了抗TNFα蛋白，所述抗TNFα蛋白在与细胞表面人TNFα结合后表现出细胞内在化。
在某些实施例中，抗体结合至人和/或小鼠TNFα。
用于膜结合的人TNFα的全长氨基酸序列是：
Figure BDA0002515266650000111
Figure BDA0002515266650000112
可溶性人TNFα含有SEQ IDNO：1的氨基酸77-233。用于膜结合的鼠TNFα的全长氨基酸序列为：
Figure BDA0002515266650000113
Figure BDA0002515266650000114
可溶性鼠TNFα含有SEQ ID NO：2的氨基酸80-235。
在一些实施例中，抗TNFα抗体结合至人TNFα。
在一些实施例中，抗TNFα抗体结合至鼠TNFα。
在某些实施例中，抗TNFα抗体具有一种或多种以下效果：在体外L929测定中以1X10-7M或更小的IC50中和人TNFα的细胞毒性；阻断TNFα与p55和p75细胞表面受体的相互作用；和/或在补体的存在下体外裂解表达表面TNF的细胞。
在某些实施例中，抗TNFα抗体不结合至TNF-β。
抗TNFα抗体包括例如阿达木单抗，其是重组人抗体。对应于阿达木单抗的CDR和可变区的氨基酸序列在美国专利第6,258,562号中参考抗体D2E7进行了描述，即SEQ ID No：1至8。
国际非专利名称(INN)阿达木单抗在WHO INN列表网站中提供：2000年，列表44(《WHO药品信息(WHO Drug Information)》(2000)第14(3)卷)。
在某些实施例中，抗TNFα抗体包含阿达木单抗的序列，例如，互补决定区(CDR)、可变重域(VH)和/或可变轻域(VL)。在表1中提供了示例性的序列。
表1：示例性的阿达木单抗抗体区序列
Figure BDA0002515266650000131
在某些实施例中，抗TNFα抗体包含SEQ ID NO：3和4的CDR。在一些实施例中，CDR包括SEQ ID NO：7或8、9、10或11、12、13和14。在某些实施例中，抗TNFα抗体包含SEQ ID NO：3的重链和/或SEQ ID NO：4的轻链。
本公开进一步包括与本文阐述的抗TNFα抗体基本上同源的变体和等同物。这些可以含有例如保守取代突变，即一个或多个氨基酸被相似的氨基酸取代。例如，保守取代指的是一种氨基酸被同一大类中的另一种氨基酸取代，例如一种酸性氨基酸被另一种酸性氨基酸取代，一种碱性氨基酸被另一种碱性氨基酸取代，或者一种中性氨基酸被另一种中性氨基酸取代。保守氨基酸取代的意图在本领域中是众所周知的。
本文描述的分离的抗TNFα抗体可以通过本领域中已知的任何合适的方法产生。此类方法的范围从直接蛋白质合成方法到构建编码分离的多肽序列的DNA序列和在合适的转化宿主中表达这些序列。在一些实施例中，通过分离或合成编码目标野生型蛋白质的DNA序列，使用重组技术来构建DNA序列。任选地，可以通过位点特异性诱变来诱变所述序列，以提供其功能类似物。参见，例如，Zoeller等人，《美国国家科学院学报(Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA)》81：5662-5066(1984)和美国专利第4,588,585号。
在一些实施例中，将使用寡核苷酸合成器通过化学合成来构建编码目标抗体的DNA序列。此类寡核苷酸可以基于所需多肽的氨基酸序列并且选择在宿主细胞中有利的那些密码子来设计，在宿主细胞中将产生目标重组多肽。标准方法可以用于合成编码目标分离的多肽的分离的多核苷酸序列。
在某些实施例中，重组表达载体用于扩增和表达编码抗TNFα抗体的DNA。可以使用多种表达宿主/载体组合。对于真核宿主有用的表达载体包括例如包含来自SV40、牛乳头瘤病毒、腺病毒和巨细胞病毒的表达控制序列的载体。用于细菌宿主的有用的表达载体包括已知的细菌质粒(例如来自大肠杆菌的质粒)，包括pCR 1、pBR322、pMB9及其衍生物，更宽的宿主范围质粒(例如M13和丝状单链DNA噬菌体)。
用于表达抗TNFα抗体的合适的宿主细胞包括在合适的启动子的控制下的原核生物、酵母、昆虫或更高等的真核细胞。原核生物包括革兰氏阴性生物或革兰氏阳性生物，例如大肠杆菌或杆菌。更高等的真核细胞包括建立的哺乳动物来源的细胞系。也可以采用无细胞翻译系统。与细菌、真菌、酵母和哺乳动物细胞宿主一起使用的合适的克隆和表达载体由Pouwels等人(《克隆载体：实验手册(Cloning Vectors：A Laboratory Manual)》，纽约州爱思唯尔，1985)描述。关于蛋白质产生(包括抗体产生)的方法的另外的信息可以例如在美国专利公开第2008/0187954号、美国专利第6,413,746号和第6,660,501号以及国际专利公开第WO 04009823号中找到。
III.含有糖皮质激素受体激动剂的免疫缀合物
还提供含有糖皮质激素受体激动剂的免疫缀合物。在一些实施例中，免疫缀合物结合至Fcγ受体。在一些实施例中，免疫缀合物在GRE跨膜TNFα报告物测定中是有活性的(如本文所使用的，“GRE跨膜TNFα报告物测定”是指下文实例7中使用的测定)。在一些实施例中，与单独的免疫缀合物中的蛋白质(例如抗体)相比，免疫缀合物显示出降低的免疫原性(降低的抗药物免疫反应(ADA))。
在一个实施例中，本文公开一种具有式I-a的化合物：
(SM-L-Q)n-A I-a，
其中：
A是抗肿瘤坏死因子(TNF)α抗体、抗TNFα单克隆抗体或阿达木单抗；
L是连接基团；
Q是异双官能基团；或者
Q不存在；
n为1至10；以及
SM是糖皮质激素的单价基团，其具有以下中的任一种：
(1)式II-a：
Figure BDA0002515266650000151
(2)式II-b：
Figure BDA0002515266650000161
(3)式II-c：
Figure BDA0002515266650000162
(4)式II-d：
Figure BDA0002515266650000163
在另一个实施例中，本文公开一种具有式I-a的化合物，其中SM是具有式II-a、式II-b、式II-c或式II-d中任一个的糖皮质激素的单价基团，其中L是包含二肽或三肽的可裂解连接基团，Q是异双官能基团，或者Q不存在，并且n是1至10。特别地，L包含选自由丙氨酸-丙氨酸(Ala-Ala)、甘氨酸-谷氨酸(Gly-Glu)、谷氨酸-丙氨酸-丙氨酸(Glu-Ala-Ala)和甘氨酸-赖氨酸(Gly-Lys)组成的组的二肽或三肽。
在另一个实施例中，本文公开一种具有式I-a的化合物，其中SM是具有式II-a、式II-b、式II-c和式II-d中任一个的糖皮质激素的单价基团，其中Q是由下式表示的异双官能基团：
Figure BDA0002515266650000164
其中m是0或1。
在另一个实施例中，m是0，并且Q由下式表示：
Figure BDA0002515266650000171
在另一个实施例中，m是1，并且Q由下式表示：
Figure BDA0002515266650000172
在另一个实施例中，本文公开一种具有式I-a的化合物，其中SM是具有式II-a、式II-b、式II-c和式II-d中任一个的糖皮质激素的单价基团，其中-L-Q-是表2的化学结构中的任一种：
表2
Figure BDA0002515266650000173
在另一个实施例中，本文公开一种具有式I-a的化合物，例如，具有式I-a的化合物，其中SM是具有式II-a、式II-b、式II-c和式II-d中任一个的糖皮质激素的单价基团，其中n是2至8。在另一个实施例中，n是1至5。在另一个实施例中，n是2至5。在另一个实施例中，n是1。在另一个实施例中，n是2。在另一个实施例中，n是3。在另一个实施例中，n是4。在另一个实施例中，n是5。在另一个实施例中，n是6。在另一个实施例中，n是7。在另一个实施例中，n是8。
在另一个实施例中，本文公开一种具有式I-a的化合物，例如，具有式I-a的化合物，其中SM是具有式II-a、式II-b、式II-c和式II-d中任一个的糖皮质激素的单价基团，其中A是抗体。
在另一个实施例中，本文公开一种具有式I-a的化合物，例如，具有式I-a的化合物，其中SM是具有式II-a、式II-b、式II-c和式II-d中任一个的糖皮质激素的单价基团，其中抗体是鼠的、嵌合的、人源化的或人的。
在另一个实施例中，本文公开一种具有式I-a的化合物，例如，具有式I-a的化合物，其中SM是具有式II-a、式II-b、式II-c和式II-d中任一个的糖皮质激素的单价基团，其中A竞争性地抑制选自由阿达木单抗、英夫利昔单抗、赛妥珠单抗(certolizumab pegol)和戈利木单抗组成的组的抗体与TNFα的结合。
在另一个实施例中，本文公开一种具有式I-a的化合物，例如，具有式I-a的化合物，其中SM是具有式II-a、式II-b、式II-c和式II-d中任一个的糖皮质激素的单价基团，其中A结合至与选自由阿达木单抗、英夫利昔单抗、塞妥珠单抗、阿非利莫单抗、奈利莫单抗、奥佐利珠单抗、普拉库单抗和戈利木单抗组成的组的抗体相同的TNFα表位。
在另一个实施例中，本文公开一种具有式I-a的化合物，例如，具有式I-a的化合物，其中SM是具有式II-a、式II-b、式II-c和式II-d中任一个的糖皮质激素的单价基团，其中A分别包含SEQ ID NO：7或8、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10或11的可变重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14的可变轻链CDR1、CDR2和CDR3序列。
在另一个实施例中，本文公开一种具有式I-a的化合物，例如，具有式I-a的化合物，其中SM是具有式II-a、式II-b、式II-c和式II-d中任一个的糖皮质激素的单价基团，其中A是抗TNFα抗体，其包含如SEQ ID NO：5所示的重链可变区和如SEQ ID NO：6所示的轻链可变区。
在另一个实施例中，本文公开一种具有式I-a的化合物，例如，具有式I-a的化合物，其中SM是具有式II-a、式II-b、式II-c和式II-d中任一个的糖皮质激素的单价基团，其中A是抗TNFα抗体，其包含如SEQ ID NO：3所示的重链和如SEQ ID NO：4所示的轻链。
在另一个实施例中，本文公开一种具有式I-a的化合物，例如，具有式I-a的化合物，其中SM是具有式II-a、式II-b、式II-c和式II-d中任一个的糖皮质激素的单价基团，其中A阻断TNFα与p55和p75细胞表面受体的相互作用。
在另一个实施例中，本文公开一种具有式I-a的化合物，例如，具有式I-a的化合物，其中SM是具有式II-a、式II-b、式II-c和式II-d中任一个的糖皮质激素的单价基团，其中A在补体的存在下体外裂解表达表面TNF的细胞。
在另一个实施例中，本文公开一种具有式I-a的化合物，例如，具有式I-a的化合物，其中SM是具有式II-a、式II-b、式II-c和式II-d中任一个的糖皮质激素的单价基团，其中A是依那西普。
在另一个实施例中，本文公开一种具有式I-a的化合物，例如，具有式I-a的化合物，其中SM是具有式II-a、式II-b、式II-c和式II-d中任一个的糖皮质激素的单价基团，其中A是阿达木单抗。
在另一个实施例中，本文公开一种具有式I-a的化合物，其为表3的化学结构中的任何一种：
表3
Figure BDA0002515266650000201
Figure BDA0002515266650000211
Figure BDA0002515266650000221
Figure BDA0002515266650000231
Figure BDA0002515266650000241
其中n为1至5，并且A为阿达木单抗。
在另一个实施例中，本文公开根据下式的抗体药物缀合物：
Figure BDA0002515266650000242
其中，A是阿达木单抗，并且n是4。如下面的实例7所示，该ADC(即下面的ADC4)显示出体外活性、在血浆中的稳定性和最小聚集。
IV.制备免疫缀合物和合成中间体的方法
本公开的各种免疫缀合物的一般合成包括使以下式III-a、III-b、III-c或III-d中任一个的NH2-官能化的小分子(SM)与连接基团部分反应并且将所得到的化合物官能化以得到溴乙酰胺官能化的中间体。然后使溴乙酰胺官能化的中间体与HS-A反应，其中HS-A是具有有限数量的还原的链间二硫键的抗体，例如阿达木单抗。
(1)式III-a：
Figure BDA0002515266650000251
(2)式III-b：
Figure BDA0002515266650000252
(3)式III-c：
Figure BDA0002515266650000253
(4)式III-d：
Figure BDA0002515266650000261
在另一个实施例中，本文公开一种制备具有式IV-a的化合物的方法：
Figure BDA0002515266650000262
其中：
A是阿达木单抗；
L是连接基团；
n为1至10；以及
SM是具有式III-a至IIId中任一个的糖皮质激素的基团；
所述方法包含：
a)使具有式V的化合物：
Figure BDA0002515266650000263
与抗肿瘤坏死因子(TNF)α蛋白或蛋白缀合；以及
b)分离具有式IV-a的化合物。
在一些实施例中，所公开的方法进一步包含纯化式IV-a的化合物。在某些实施例中，使用阴离子交换色谱法(AEC)，其(由于在一些实施例中连接基团的肽部分上的带电部分和/或在一些实施例中SM上的磷酸酯基团)可以提供不同DAR物质的有效分离。
在一些实施例中，所公开的方法比依赖基于马来酰亚胺的标准连接基团化学的方法需要更少的合成步骤。特别地，依赖于基于马来酰亚胺的标准连接基团化学的方法可能需要后续的琥珀酰亚胺开环水解步骤，所述步骤在合适的DAR物质的纯化后进行。因此，在某些实施例中，所公开的方法相对于基于马来酰亚胺的标准连接基团化学显著缩短了缀合方案。
在另一个实施例中，本文公开一种制备具有式VI-a的化合物的方法：
Figure BDA0002515266650000271
其中：
A是阿达木单抗；并且
n是1至10，
所述方法包含：
a)使式VII-a的化合物：
Figure BDA0002515266650000272
与部分还原的阿达木单抗缀合；以及
b)例如通过色谱法分离具有式VI-a的化合物。
在另一个实施例中，本文公开一种制备具有式IV-a或式VI-a的化合物的方法，其中n是1至7。在另一个实施例中，n是1至5。在另一个实施例中，n是2至4。在另一个实施例中，n是1。在另一个实施例中，n是2。在另一个实施例中，n是3。在另一个实施例中，n是4。在另一个实施例中，n是5。在另一个实施例中，n是6。在另一个实施例中，n是7。在另一个实施例中，n是8。
在另一个实施例中，本文公开一种具有式IV-a或式VI-a的化合物，其中：
A是阿达木单抗；并且
n是1至10。
在另一个实施例中，本文公开一种具有式IV-a或式VI-a的化合物，其中n是1至7。在另一个实施例中，n是1至5。在另一个实施例中，n是2至4。在另一个实施例中，n是1。在另一个实施例中，n是2。在另一个实施例中，n是3。在另一个实施例中，n是4。在另一个实施例中，n是5。在另一个实施例中，n是6。在另一个实施例中，n是7。在另一个实施例中，n是8。
本文还提供可用于制备免疫缀合物的合成中间体。
在一个实施例中，本文公开的合成中间体是具有式V或式VII-a中任一种的化合物。
VI.使用方法和药物组合物
本文提供可以在体外或体内使用的具有式I-a(例如，具有表3所示的式)的缀合物。相应地，还提供组合物，例如用于某些体内用途的药物组合物，其包含在生理学可接受的载体、赋形剂或稳定剂中具有所需程度的纯度的缀合物或糖皮质激素受体激动剂(《雷明顿制药科学(Remington′s Pharmaceutical Sciences)》(1990)麦克出版公司(MackPublishing Co)，宾夕法尼亚州伊斯顿)。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所用的剂量和浓度下对受体是无毒的。
待用于体内给药的组合物(例如药物组合物)可以是无菌的，这可以通过经由例如无菌过滤膜的过滤来实现。待用于体内给药的组合物(例如，药物组合物)可以包含防腐剂。
本文所描述的抗体药物缀合物和/或包含抗体药物缀合物的药物组合物可用于裂解表达表面TNFα的细胞(体外或体内)和/或用于治疗以增加的TNFα(例如，滑液中增加的TNFα)为特征的疾病或病症。在一些实施例中，抗体药物缀合物和/或组合物可用于抑制细胞因子释放(体外或体内)和/或用于治疗自身免疫性或炎性疾病。在一些实施例中，抗体药物缀合物和/或组合物用于治疗克罗恩病(例如，涉及回肠和/或升结肠的中度至重度活动性克罗恩病和/或涉及回肠和/或升结肠的中度至重度活动性克罗恩病的临床缓解的维持多达3个月)。在一些实施例中，抗体药物缀合物和/或组合物用于治疗溃疡性结肠炎(例如，用于诱导患有活动性、中度至重度溃疡性结肠炎的患者的缓解)。在一些实施例中，抗体药物缀合物和/或组合物用于治疗类风湿性关节炎(RA)。在一些实施例中，抗体药物缀合物和/或组合物用于治疗幼年特发性关节炎(JA)。在一些实施例中，抗体药物缀合物和/或组合物用于治疗银屑病关节炎(PsA)。在一些实施例中，抗体药物缀合物和/或组合物用于治疗脊椎关节病，例如强直性脊柱炎(AS)或轴型脊椎关节炎(axSpA)。在一些实施例中，抗体药物缀合物和/或组合物用于治疗成人克罗恩病(CD)。在一些实施例中，抗体药物缀合物和/或组合物用于治疗小儿克罗恩病。在一些实施例中，抗体药物缀合物和/或组合物用于治疗溃疡性结肠炎(UC)。在一些实施例中，抗体药物缀合物和/或组合物用于治疗斑块型银屑病(Ps)。在一些实施例中，抗体药物缀合物和/或组合物用于治疗化脓性汗腺炎(HS)。在一些实施例中，抗体药物缀合物和/或组合物用于治疗葡萄膜炎。在一些实施例中，抗体药物缀合物和/或组合物用于治疗白塞斯病。在一些实施例中，抗体药物缀合物和/或组合物用于治疗银屑病，包括斑块型银屑病。一些实施例包含药物缀合物和/或药物组合物用于制备用于治疗本文所描述的疾病或病症的药物的用途。
一些实施例包含向表达TNFα的细胞递送糖皮质激素受体激动剂的方法。此类方法可以包括使表达TNFα的细胞与如本文所描述的抗体药物缀合物接触的步骤。一些实施例包含向表达TNFα的细胞递送糖皮质激素受体激动剂的体外方法。
还提供确定抗体药物缀合物的抗炎活性的方法。此类方法可以包括使表达TNFα的细胞与如本文所描述的抗体药物缀合物接触的步骤。一些实施例包含使表达TNFα的细胞与如本文所描述的抗体药物缀合物接触，并确定与对照细胞相比，促炎细胞因子从细胞中的减少的释放。一些实施例包含确定抗体药物缀合物的抗炎活性的体外方法。
一些实施例包含筛选方法(例如体外方法)，其包括使细胞(例如，表达TNFα的细胞)直接地或间接地与抗体药物缀合物接触，并且确定抗体药物缀合物是否调节细胞的活性或功能，如例如通过细胞形态或生存力、标记物的表达、分化或去分化、细胞呼吸、线粒体活性、膜完整性、成熟、增殖、生存力、凋亡或细胞死亡的变化所反映的。直接相互作用的一个示例是物理相互作用，而间接相互作用包括例如组合物对中间分子的作用，所述中间分子反过来作用于参考实体(例如，细胞或细胞培养物)。
VII.制造制品
本公开还包括包含一个或多个容器的药物包装和试剂盒，其中容器可以包含一个或多个剂量的如本文所描述的抗体药物缀合物或组合物。在某些实施例中，包装或试剂盒含有单位剂量，这意味着预定量的组合物或抗体药物缀合物，含有或不含有一种或多种附加试剂。
所述试剂盒可以包含一个或多个容器以及位于所述容器中、位于所述容器上或与所述容器相关的标签或包装插页，表明所包封的组合物用于治疗所选择的疾病病状。合适的容器包括例如瓶、小瓶、注射器等。容器可以由多种材料例如玻璃或塑料形成。所述容器可以包含无菌进入端口，例如，所述容器可以是静脉内溶液袋或具有可以被皮下注射针刺穿的塞子的小瓶。
在一些实施例中，试剂盒可以含有通过其向患者施用抗体和任何任选的组分的装置(means)，例如一个或多个针或注射器(预填充的或空的)、滴管、移液管或其它此类设备，可以从这些装置将制剂注射到或引入到受试者中或施加于身体的患病区域。本公开的试剂盒通常还将包括用于容纳小瓶等的装置以及用于商业销售的密闭的其它部件，例如吹塑成型的塑料容器，将所需的小瓶和其它设备放置和保持在所述塑料容器中。
实例
应当理解，本文所描述的实例和实施例仅用于说明目的，并且根据这些实例和实施例的各种修改或改变将被建议给本领域技术人员，并且将被包括在本公开的精神和范围内。
起始原料是可商购的，可以通过本文所描述的程序、通过文献程序或通过有机化学领域的技术人员将熟知的程序来制备。给定的试剂/反应物名称是如在商品瓶上所命名的，或者是如由IUPAC惯例、
Figure BDA0002515266650000315
化学绘图超12.0(
Figure BDA0002515266650000312
ChemDrawUltra 12.0)、
Figure BDA0002515266650000316
化学电子笔记本11(
Figure BDA0002515266650000314
Chemistry E-Notebook11)或自动命名2000(AutoNom 2000)生成。应当理解，本文所描述的实例和实施例仅用于说明的目的，并且根据这些实例和实施例的各种修改或变化将被建议给本领域技术人员，并且将被包括在本公开的精神和范围内。
用于化合物合成和表征的分析方法
分析数据被包括在以下程序、一般程序的图解或实例的表中。除非另有说明，否则所有1H和13C NMR数据都是在Varian Mercury Plus 400MHz或Bruker AVIII 300MHz仪器上收集的；化学位移以百万分率(ppm)表示。HPLC分析数据使用表4中提供的方法在实验中进行详细说明，或者参考LC/MS和HPLC条件的表。
表4
Figure BDA0002515266650000321
在以下实例中使用的缩写为：
ACTH 促肾上腺皮质激素 HIC 疏水相互作用色谱法
BrAc 溴乙酰胺 HPLC 高效液相色谱法
CV 柱体积 LCMS 液相色谱质谱法
DAD 二极管阵列 MeCN 乙腈
DAR 药物/抗体比率 MEM 最少必须介质
DBP 邻苯二甲酸二丁酯 MeOH 甲醇
DCM 二氯甲烷 MS 质谱法
DMA 二甲基乙酰胺 NEAA 非必需氨基酸
DMF 二甲基甲酰胺 NMR 核磁共振
DMSO 二甲基亚砜 PBS 磷酸盐缓冲液
DTT 二硫苏糖醇 PE 石油醚
EEDQ 2-乙氧基-1-乙氧羰基-1，2-二氢喹啉 P1NP 前胶原1型氨基末端前肽
ELSD 蒸发光散射检测器 rt 室温
Eq 当量 RPMI 洛斯维·帕克纪念研究所
EtOAc 乙酸乙酯 SEC 尺寸排阻色谱法
FBS 胎牛血清 TCEP (三(2-羧乙基)膦)
Fmoc 9-芴基甲氧基羰基 TFA 三氟乙酸
实例1：(2S，6aS，6bR，7S，8aS，8bS，10S，11aR，12aS，12bS)-10-(4-(3-氨基苄基)苯基)-2，6b-二氟-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a，8a-二甲基-1，2，6a，6b，7，8，8a，8b，11a，12，12a，12b-十二氢-4H-萘并[2′，1′：4，5]茚并[1，2-d][1，3]二氧杂环戊二烯-4-酮的合成
步骤1：4-(溴甲基)苯甲醛的合成
Figure BDA0002515266650000322
在1小时内，将二异丁基氢化铝(153mL，153mmol，甲苯中1M)逐滴添加到甲苯(400mL)中的(4-溴甲基)苄腈(20g，102mmol)的0℃溶液中。如上所述，设置两个额外的小瓶。合并所有三种反应混合物。向混合物中添加10％HCl水溶液(1.5L)。将混合物用DCM(3×500mL)萃取。有机层经Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩。残余物通过硅胶柱色谱法纯化(用PE∶EtOAc＝10∶1洗脱)，以获得呈白色固体的标题化合物(50g，产率82％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ10.02(s，1H)，7.91-7.82(m，2H)，7.56(d，J＝7.9Hz，2H)，4.55-4.45(m，2H)。
步骤2：3-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂环戊硼烷-2-基)苯胺的合成
Figure BDA0002515266650000331
向3-溴苯胺(40g，233mmol)于1，4-二噁烷(480mL)中的溶液中添加4，4，4′，4′，5，5，5′，5′-四甲基-2，2′-双(1，3，2-二氧杂环戊硼烷)(94g，372mmol)、乙酸钾(45.6g，465mmol)、2-二环己基膦基-2′，4′，6′-三异丙基-1，1′-联苯(8.07g，13.95mmol)和三(二亚苄基丙酮)二钯(0)(8.52g，9.30mmol)。将所得的混合物在氮气下在80℃下加热4小时。如上所述设置另外的小瓶。合并两种反应混合物并浓缩，并且残余物通过硅胶柱色谱法纯化(用PE∶EtOAc＝10∶1洗脱)，以获得呈浅黄色固体的标题化合物(60g，产率55.4％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.23-7.13(m，3H)，6.80(d，J＝7.5Hz，1H)，3.82-3.38(m，2H)，1.34(s，12H)。
步骤3：(3-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂环戊硼烷-2-基)苯基)氨基甲酸叔丁酯的合成
Figure BDA0002515266650000332
将3-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂环戊硼烷-2-基)苯胺(实例1，步骤2)(30g，137mmol)和二碳酸二叔丁酯(38.9g，178mmol)在100℃下在甲苯(600mL)中混合24小时。如上所述设置另一个小瓶。合并两种反应混合物，并将混合物蒸发，溶解在EtOAc(1.5L)中，用0.1N HCl(3×2L)和盐水(3L)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩，以得到呈红色固体的标题化合物(50g，产率57％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.63(br m，2H)，7.48(d，J＝7.1Hz，1H)，7.37-7.28(m，1H)，1.52(s，9H)，1.34(s，12H)。
步骤4：(3-(4-甲酰基苄基)苯基)氨基甲酸叔丁酯的合成
Figure BDA0002515266650000341
将四氢呋喃(400mL)中的4-(溴甲基)苯甲醛(实例1，步骤1)(24.94g，125mmol)、1，1′-双(二苯基膦基)二茂铁二氯钯(II)DCM络合物(13.75g，18.80mmol)、(3-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂环戊硼烷-2-基)苯基)氨基甲酸叔丁酯(来自实例1，步骤3)(20g，62.7mmol)和碳酸钾(43.3g，313mmol)的混合物加热至80℃持续12小时。如上所述设置另一个小瓶。合并两种反应混合物，并用水(500mL)稀释。用EtOAc(3×500mL)萃取含水混合物。合并有机层并经Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法纯化(用PE∶EtOAc＝10∶1洗脱)，以获得呈白色固体的标题化合物(15g，产率38.4％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ9.95(s，1H)，7.78(d，J＝7.9Hz，2H)，7.33(d，J＝7.9Hz，2H)，7.27-7.13(m，3H)，6.82(d，J＝7.1Hz，1H)，6.47(br.s.，1H)，4.00(s，2H)，1.48(s，9H)。
步骤5：(6S，8S，9R，10S，11S，13S，14S，16R，17S)-6，9-二氟-11，16，17--三羟基-17-(2-羟基乙酰基)-10，13-二甲基-6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17-十二氢-3H-环戊[a]菲-3-酮的合成
Figure BDA0002515266650000342
将(2S，6aS，6bR，7S，8aS，8bS，11aR，12aS，12bS)-2，6b-二氟-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a，8a，10，10-四甲基-1，2，6a，6b，7，8，8a，8b，11a，12，12a，12b-十二氢-4H-萘并[2′，1′：4，5]茚并[1，2-d][1，3]二氧杂环戊烯-4-酮(20g，44.2mmol)悬浮在40％HBF4水溶液(440mL)中，并将所述混合物在25℃下搅拌48小时。在反应完成后，添加2L的水，并通过过滤收集固体。将所述固体用水(1L)洗涤，并且然后用MeOH(200mL)洗涤，以得到呈白色固体的标题化合物(11g，产率60.3％)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ7.25(d，J＝10.1Hz，1H)，6.28(d，J＝10.1Hz，1H)，6.10(s，1H)，5.73-5.50(m，1H)，5.39(br.s.，1H)，4.85-4.60(m，2H)，4.50(d，J＝＝19.4Hz，1H)，4.20-4.04(m，2H)，2.46-2.06(m，6H)，1.87-1.75(m，1H)，1.56-1.30(m，6H)，0.83(s，3H)。
步骤6：(2S，6aS，6bR，7S，8aS，8bS，10R，11aR，12aS，12bS)-10-(4-(3-氨基苄基)苯基)-2，6b-二氟-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a，8a-二甲基-1，2，6a，6b，7，8，8a，8b，11a，12，12a，12b-十二氢-4H-萘并[2′，1′：4，5]茚并[1，2-d][1，3]二氧杂环戊烯-4-酮的合成。
Figure BDA0002515266650000351
将MeCN(100mL)中的(6S，8S，9R，10S，11S，13S，14S，16R，17S)-6，9-二氟-11，16，17-三羟基-17-(2-羟基乙酰基)-10，13-二甲基-6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17-十二氢-3H-环戊[a]菲-3-酮(实例1，步骤5)(4.4g，10.67mmol)和MgSO4(6.42g，53.3mmol)的悬浮液在20℃下搅拌1小时。一次性添加MeCN(100mL)中的(3-(4-甲酰基苄基)苯基)氨基甲酸叔丁酯(实例1，步骤4)(3.65g，11.74mmol)的溶液。滴加三氟甲磺酸(9.01mL，53.3mmol)，同时使用冰浴将内部温度保持低于25℃。在添加后，将混合物在20℃下搅拌2小时。如上所述设置三个额外的小瓶。合并所有四种反应混合物并浓缩，并且残余物通过制备型HPLC纯化，以得到呈黄色固体的标题化合物(4.5g，产率14.2％)。LCMS(方法a，表4)Rt＝2.65min；MSm/z＝606.2(M+H)+；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ7.44-7.17(m，5H)，6.89(t，J＝7.7Hz，1H)，6.44-6.25(m，4H)，6.13(br.s.，1H)，5.79-5.52(m，2H)，5.44(s，1H)，5.17-4.89(m，3H)，4.51(d，J＝19.4Hz，1H)，4.25-4.05(m，2H)，3.73(s，2H)，3.17(br.s.，1H)，2.75-2.55(m，1H)，2.36-1.97(m，3H)，1.76-1.64(m，3H)，1.59-1.39(m，4H)，0.94-0.78(m，3H).制备型HPLC方法：仪器：Gilson 281半制备型HPLC系统；流动相：A：甲酸/H2O＝0.01％v/v；B：MeCN；柱：Luna C18150*255微米；流量：25mL/min；监测器波长：220和254nm。
时间 0.0 10.5 10.6 10.7 13.7 13.8 15.0
B％ 15 35 35 100 100 10 10
实例2：(6aR，6bS，7S，8aS，8bS，10R，11aR，12aS，12bS)-10-(4-(3-氨基苄基)苯基)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a，8a-二甲基-1，2，6a，6b，7，8，8a，8b，11a，12，12a，12b-十二氢-4H-萘并[2′，1′：4，5]茚并[1，2-d][1，3]二氧杂环戊烯-4-酮的合成。
Figure BDA0002515266650000361
使用(8S，9S，10R，11S，13S，14S，16R，17S)-11，16，17-三羟基-17-(2-羟基乙酰基)-10，13-二甲基-6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17-十二氢-3H-环戊[a]菲-3-酮，以与实例1类似的程序来合成实例2
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ7.36(d，J＝7.9Hz，2H)，7.31(d，J＝10.1Hz，1H)，7.20(d，J＝7.9Hz，2H)，6.89(t，J＝7.9Hz，1H)，6.39-6.28(m，3H)，6.16(dd，J＝1.5，9.9Hz，1H)，5.93(s，1H)，5.39(s，1H)，5.08(t，J＝5.7Hz，1H)，4.98-4.87(m，3H)，4.78(d，J＝3.1Hz，1H)，4.49(dd，J＝6.2，19.4Hz，1H)，4.29(br.s.，1H)，4.17(dd，J＝5.5，19.6Hz，1H)，3.74(s，2H)，2.61-2.53(m，1H)，2.36-2.26(m，1H)，2.11(d，J＝11.0Hz，1H)，2.07(s，1H)，2.02(d，J＝12.8Hz，1H)，1.83-1.54(m，5H)，1.39(s，3H)，1.16-0.96(m，2H)，0.85(s，3H)。LCMS(方法a，表4)Rt＝2.365min；m/z＝570.2(M+H)+。
实例3：(6aS，6bR，7S，8aS，8bS，10R，11aR，12aS，12bS)-10-(4-(3-氨基苄基)苯基)-6b-氟-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a，8a-二甲基-1，2，6a，6b，7，8，8a，8b，11a，12，12a，12b-十二氢-4H-萘并[2′，1′：4，5]茚并[1，2-d][1，3]二氧杂环戊烯-4-酮的合成。
Figure BDA0002515266650000371
使用(8S，9R，10S，11S，13S，14S，16R，17S)-9-氟-11，16，17-三羟基-17-(2-羟基乙酰基)-10，13-二甲基-6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17-十二氢-3H-环戊[a]菲-3-酮，以与实例1类似的程序来合成实例3。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ7.37-7.26(m，3H)，7.21(d，J＝7.9Hz，2H)，6.89(t，J＝7.7Hz，1H)，6.43-6.30(m，3H)，6.23(d，J＝10.1Hz，1H)，6.04(s，1H)，5.75(s，1H)，5.44(s，2H)，5.09(t，J＝5.7Hz，1H)，4.93(br.s.，3H)，4.50(dd，J＝6.2，19.4Hz，1H)，4.28-4.09(m，2H)，3.74(s，2H)，2.73-2.54(m，2H)，2.35(d，J＝＝13.2Hz，1H)，2.25-2.12(m，1H)，2.05(d，J＝15.0Hz，1H)，1.92-1.77(m，1H)，1.74-1.58(m，3H)，1.50(s，3H)，1.45-1.30(m，1H)，0.87(s，3H)。LCMS(方法a，表4)Rt＝2.68min；m/z＝588.1(M+H)+
实例4：(S)-4-(2-(2-溴乙酰氨基)乙酰氨基)-5-((3-(4-((6aR，6bS，7S，8aS，8bS，10R，11aR，12aS，12bS)-7-羟基-6a，8a-二甲基-4-氧代-8b-(2-(膦酰氧基)乙酰基)-2，4，6a，6b，7，8，8a，8b，11a，12，12a，12b-十二氢-1H-萘并[2′，1′：4，5]茚并[1，2-d][1，3]二氧杂环戊烯-10-基)苄基)苯基)氨基)-5-氧代戊酸的合成
步骤1：(S)-2-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰氨基)-5-(叔丁氧基)-5-氧代戊酸的合成。
Figure BDA0002515266650000381
将干燥的DCM(200mL)中的2-氯三苯甲基氯树脂(30g，92mmol)、三乙胺(46.4g，458mmol)和(S)-2-(((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-5-(叔丁氧基)-5-氧代戊酸(25.5g，60mmol)的混合物在20℃下用N2鼓泡8小时。过滤混合物，并用DCM(2×200mL)、MeOH(2×200mL)和DMF(2×200mL)洗涤树脂。向树脂中添加哌啶∶DMF(1∶4，400mL)的溶液，并将混合物用N2鼓泡8分钟，并且然后过滤。重复该操作五次以完全除去Fmoc保护基。用DMF(5×500mL)洗涤树脂，以得到树脂结合的(S)-2-氨基-5-(叔丁氧基)-5-氧代戊酸。将DMF(200mL)中的2-(((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酸(13.38g，45.0mmol)、N，N-二异丙基乙胺(7.86mL，45mmol)、羟基苯并三唑(6.89g，45mmol)、2-(6-氯-1H-苯并[d][1，2，3]三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基异铀六氟磷酸盐(V)(18.62g，45.0mmol)的混合物在20℃下搅拌30分钟。向所述混合物中添加树脂结合的(S)-2-氨基-5-(叔丁氧基)-5-氧代戊酸，并将所得的混合物在25℃下用N2鼓泡1.5小时。过滤混合物，并用DMF(4×500mL)和DCM(2×500mL)洗涤树脂。向混合物中添加1％TFA/DCM(5×500mL)，并用N2鼓泡5分钟。将混合物过滤并将滤液直接添加到NaHCO3的饱和溶液(200mL)中。分离合并的混合物，并将有机相用饱和柠檬酸水溶液(4×400mL)和盐水(2×300mL)洗涤。最终的有机溶液经Na2SO4(20g)干燥，过滤，在减压下浓缩，以得到呈浅黄色固体的标题化合物(10g，产率20％)。
1H NMR：(CDCl3，400MHz)δ＝7.75(d，J＝7.5Hz，2H)，7.59(br d，J＝7.5Hz，2H)，7.41-7.36(m，2H)，7.30(t，J＝7.0Hz，2H)，5.82(br s，1H)，4.57(br d，J＝4.8Hz，1H)，4.38(br d，J＝7.5Hz，2H)，4.27-4.15(m，1H)，4.06-3.83(m，2H)，2.50-2.29(m，2H)，2.26-2.13(m，1H)，2.06-2.02(m，1H)，1.43(s，9H)。
步骤2：(S)-4-(2-((((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰氨基)-5-((3-(4-((6aR，6bS，7S，8aS，8bS，10R，11aR，12aS，12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a，8a-二甲基-4-氧代-2，4，6a，6b，7，8，8a，8b，11a，12，12a，12b-十二氢-1H-萘并[2′，1′：4，5]茚并[1，2-d][1，3]二氧杂环戊烯-10-基)苄基)苯基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯的合成
Figure BDA0002515266650000391
在25℃下，向DMF(3.5mL)中的(S)-2-(2-(((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰氨基)-5-(叔丁氧基)-5-氧代戊酸(实例4，步骤1)(424mg，0.878mmol)的溶液中添加((6aR，6bS，7S，8aS，8bS，10R，11aR，12aS，12bS)-10-(4-(3-氨基苄基)苯基)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a，8a-二甲基-1，2，6a，6b，7，8，8a，8b，11a，12，12a，12b-十二氢-4H-萘并[2′，1′：4，5]茚并[1，2-d][1，3]二氧杂环戊烯-4-酮(实例2)(500mg，0.878mmol)和三乙胺(0.3mL，2.63mmol)。将所述溶液冷却至0℃，并且然后添加2，4，6-三丙基-1，3，5，2，4，6-三氧杂三膦烷2，4，6-三氧化物(1.12g，1.755mmol)。将反应混合物在25℃下搅拌12小时。LCMS显示反应完成。如上所述设置十四个额外的小瓶。合并所有十五种反应混合物。将混合物通过反相柱纯化，以得到呈黄色固体的标题化合物(5g，产率38.4％)。反相柱法：仪器：岛津(Shimadzu)LC-8A制备型HPLC；柱：菲罗门(Phenomenex)Luna C18200*40mm*10μm；流动相：A代表H2O(0.05％TFA)，并且B代表MeCN；梯度：B在30分钟内从30％到100％；流量：60mL/min；波长：220和254nm。
LCMS(方法a，表4)Rt＝1.34min；m/z 1016.6(M+H-18)+。
步骤3：(S)-4-(2-((((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰氨基)-5-((3-(4-((6aR，6bS，7S，8aS，8bS，10R，11aR，12aS，12bS)-8b-(2-((二叔丁氧基磷酰基)氧基)乙酰基)-7-羟基-6a，8a-二甲基-4-氧代-2，4，6a，6b，7，8，8a，8b，11a，12，12a，12b-十二氢-1H-萘并[2′，1′：4，5]茚并[1，2-d][1，3]二氧杂环戊烯-10-基)苄基)苯基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯的合成。
Figure BDA0002515266650000401
向DMF(2.5mL)中的(S)-4-(2-(((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰氨基)-5-((3-(4-((6aR，6bS，7S，8aS，8bS，10R，11aR，12aS，12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a，8a-二甲基-4-氧代-2，4，6a，6b，7，8，8a，8b，11a，12，12a，12b-十二氢-1H-萘并[2′，1′：4，5]茚并[1，2-d][1，3]二氧杂环戊烯-10-基)苄基)苯基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(实例4，步骤2)(400mg，0.387mmol)的溶液中添加1H-四唑(271mg，3.87mmol)和二叔丁基二乙基亚磷酰胺(1.16g，4.64mmol)。将反应在室温下搅拌2.5小时，然后冷却至0℃。将过氧化氢(241mg，2.127mmol)添加到所得的混合物中，允许温热至室温，并搅拌1小时，之后LCMS显示反应完成。如上所述设置十一个额外的小瓶。合并所有十二种反应混合物。将混合物通过反相柱纯化，以得到呈黄色固体的标题化合物(4.4g，产率64.2％)。反相柱法：仪器：岛津LC-8A制备型HPLC；柱：菲罗门Luna C18200*40mm*10μm；流动相：A代表H2O，并且B代表MeCN；梯度：B在30分钟内从50％到100％；流量：60mL/min；波长：220和254nm。
LCMS(方法a，表4)Rt＝1.41min；m/z 1226.7(M+H)+。
步骤4：(S)-4-(2-氨基乙酰氨基)-5-((3-(4-((6aR，6bS，7S，8aS，8bS，10R，11aR，12aS，12bS)-8b-(2-((二叔丁氧基磷酰基)氧基)乙酰基)-7-羟基-6a，8a-二甲基-4-氧代-2，4，6a，6b，7，8，8a，8b，11a，12，12a，12b-十二氢-1H-萘并[2′，1′：4，5]茚并[1，2-d][1，3]二氧杂环戊烯-10-基)苄基)苯基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯的合成。
Figure BDA0002515266650000411
在25℃下，向MeCN(6mL)中的(S)-4-(2-(((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰氨基)-5-((3-(4-((6aR，6bS，7S，8aS，8bS，10R，11aR，12aS，12bS)-8b-(2-((二叔丁氧基磷酰基)氧基)乙酰基)-7-羟基-6a，8a-二甲基-4-氧代-2，4，6a，6b，7，8，8a，8b，11a，12，12a，12b-十二氢-1H-萘并[2′，1′：4，5]茚并[1，2-d][1，3]二氧杂环戊烯-10-基)苄基)苯基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(实例4，步骤3)(1.1g，0.897mmol)的溶液中添加哌啶(0.75mL，7.58mmol)。将反应在室温下搅拌20分钟，之后时间LCMS显示反应完成。如上所述设置三个额外的小瓶。合并所有四种反应混合物。将混合物浓缩，以得到残余物，将其在搅拌下用PE(10mL)处理2小时。通过过滤收集所得的固体，并在减压下干燥，以得到呈黄色固体的标题化合物(3.8g，产率90％)。
LCMS(方法a，表4)Rt＝1.16min；m/z 1004.6(M+H)+。
步骤5：(S)-4-(2-(2-溴乙酰氨基)乙酰氨基)-5-((3-(4-((6aR，6bS，7S，8aS，8bS，10R，11aR，12aS，12bS)-8b-(2-((二叔丁氧基磷酰基)氧基)乙酰基)-7-羟基-6a，8a-二甲基-4-氧代-2，4，6a，6b，7，8，8a，8b，11a，12，12a，12b-十二氢-1H-萘并[2′，1′：4，5]茚并[1，2-d][1，3]二氧杂环戊烯-10-基)苄基)苯基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯的合成。
Figure BDA0002515266650000412
在室温下，向DMF(2.5mL)中的2-溴乙酸(97mg，0.697mmol)的溶液中添加EEDQ(172mg，0.697mmol)。将混合物在室温下搅拌1小时。添加(S)-4-(2-氨基乙酰氨基)-5-((3-(4-((6aR，6bS，7S，8aS，8bS，10R，11aR，12aS，12bS)-8b-(2-((二叔丁氧基磷酰基)氧基)乙酰基)-7-羟基-6a，8a-二甲基-4-氧代-2，4，6a，6b，7，8，8a，8b，11a，12，12a，12b-十二氢-1H-萘并[2′，1′：4，5]茚并[1，2-d][1，3]二氧杂环戊烯-10-基)苄基)苯基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(实例4，步骤4)(350mg，0.349mmol)，并且将得到的溶液搅拌2.5小时，之后时间LCMS显示反应完成。如上所述设置七个额外的小瓶。合并所有八种反应混合物。用DCM(100mL)稀释反应，用HBr水溶液(1M，2×80mL)、NaHCO3水溶液(60mL)和盐水(60mL)洗涤。有机层经Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩，以得到呈黄色油的标题化合物(2g，产率63.7％)。
LCMS(方法a，表4)Rt＝1.30min；m/z1124.2，1125.9(M+H)+。
步骤6：(S)-4-(2-(2-溴乙酰氨基)乙酰氨基)-5-((3-(4-((6aR，6bS，7S，8aS，8bS，10R，11aR，12aS，12bS)-7-羟基-6a，8a-二甲基-4-氧代-8b-(2-(膦酰氧基)乙酰基)-2，4，6a，6b，7，8，8a，8b，11a，12，12a，12b-十二氢-1H-萘并[2′，1′：4，5]茚并[1，2-d][1，3]二氧杂环戊烯-10-基)苄基)苯基)氨基)-5-氧代戊酸的合成
Figure BDA0002515266650000421
向DCM(16mL)中的(S)-4-(2-(2-溴乙酰氨基)乙酰氨基)-5-((3-(4-((6aR，6bS，7S，8aS，8bS，10R，11aR，12aS，12bS)-8b-(2-((二叔丁氧基磷酰基)氧基)乙酰基)-7-羟基-6a，8a-二甲基-4-氧代-2，4，6a，6b，7，8，8a，8b，11a，12，12a，12b-十二氢-1H-萘并[2′，1′：4，5]茚并[1，2-d][1，3]二氧杂环戊烯-10-基)苄基)苯基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯(实例4，步骤5)(2g，1.778mmol)的溶液中添加TFA(8mL，104mmol)，并将所得的混合物在室温下搅拌40分钟，之后时间LCMS显示反应完成。在减压下除去溶剂。通过制备型HPLC纯化所得的残余物。将流动相直接冻干，以得到呈黄色固体的标题化合物(640mg，产率35.3％)。制备型HPLC方法：仪器：岛津LC-8A制备型HPLC；柱：菲罗门Luna C18200*40mm*10μm；流动相：A代表H2O(0.09％TFA)，并且B代表MeCN；梯度：B在20分钟内从30％到40％；流量：60mL/min；波长：220和254nm。
1H NMR：(DMSO-d6，400MHz)δ＝9.88(s，1H)，8.52(s，1H)，8.24(br d，J＝8.4Hz，1H)，7.46(br d，J＝7.9Hz，1H)，7.42(s，1H)，7.36(br d，J＝7.9Hz，2H)，7.30(br d，J＝9.7Hz，1H)，7.23-7.17(m，3H)，6.90(br d，J＝6.8Hz，1H)，6.16(brd，J＝10.4Hz，1H)，5.93(s，1H)，5.47(s，1H)，4.96-4.85(m，3H)，4.58(br dd，J＝7.9，18.7Hz，1H)，4.38(br d，J＝5.3Hz，1H)，4.29(br s，1H)，3.93(s，2H)，3.89(s，2H)，3.80(br s，2H)，2.30-2.22(m，2H)，2.16-1.91(m，4H)，1.85-1.62(m，6H)，1.39(s，3H)，1.00(br s，2H)，0.87(s，3H)。LCMS(方法a，表4)Rt＝2.86min；m/z956.0，958.0(M+H)+。
实例5：2-((2S，6aS，6bR，7S，8aS，8bS，10R，11aR，12aS，12bS)-10-(4-(3-((S)-6-氨基-2-(2-(2-溴乙酰氨基)乙酰氨基)六酰氨基)苄基)苯基)-2，6b-二氟-7-羟基-6a，8a-二甲基-4-氧代-1，2，4，6a，6b，7，8，8a，11a，12，12a，12b-十二氢-8bH-萘并[2′，1′：4，5]茚并[1，2-d][1，3]二氧杂环戊烯-8b-基)-2-磷酸氧代乙二氢酯的合成。
步骤1：((S)-5-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰氨基)-6-((3-(4-((2S，6aS，6bR，7S，8aS，8bS，10R，11aR，12aS，12bS)-2，6b-二氟-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a，8a-二甲基-4-氧代-2，4，6a，6b，7，8，8a，8b，11a，12，12a，12b-十二氢-1H-萘并[2′，1′：4，5]茚并[1，2-d][1，3]二氧杂环戊烯-10-基)苄基)苯基)氨基)-6-氧代己基)氨基甲酸叔丁酯的合成。
Figure BDA0002515266650000431
在0℃下，向DMF(60ml)中的N2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)甘氨酰基)-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸(5.58g，8.26mmol)的溶液中添加2，4，6-三丙基-1，3，5，2，4，6-三氧杂三膦烷2，4，6-三氧化物(10.51g，16.51mmol)和三乙胺(3.45mL，24.77mmol)。将所得的混合物在室温下搅拌1小时。添加(2S，6aS，6bR，7S，8aS，8bS，10R，11aR，12aS，12bS)-10-(4-(3-氨基苄基)苯基)-2，6b-二氟-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a，8a-二甲基-1，2，6a，6b，7，8，8a，8b，11a，12，12a，12b-十二氢-4H-萘并[2′，1′：4，5]茚并[1，2-d][1，3]二氧杂环戊烯-4-酮(实例1，步骤6)(5g，8.26mmol)。将所得的混合物在室温下搅拌5小时，之后时间LCMS显示反应完成。如上所述设置六个额外的小瓶。合并所有七种反应混合物。通过反相柱纯化反应，以得到呈白色固体的标题化合物(24g，产率24.62％)。反相柱法：仪器：岛津LC-8A制备型HPLC；柱：菲罗门Luna C18200*40mm*10μm；流动相：A代表H2O(0.05％TFA)，并且B代表MeCN；梯度：B在30分钟内从30％到100％；流量：60mL/min；波长：220和254nm。
LCMS(方法a，表4)Rt＝1.29min；m/z1095.6(M+H-18)+。
步骤2：((S)-5-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰氨基)-6-((3-(4-((2S，6aS，6bR，7S，8aS，8bS，10R，11aR，12aS，12bS)-8b-(2-((二叔丁氧基磷酰基)氧基)乙酰基)-2，6b-二氟-7-羟基-6a，8a-二甲基-4-氧代-2，4，6a，6b，7，8，8a，8b，11a，12，12a，12b-十二氢-1H-萘并[2′，1′：4，5]茚并[1，2-d][1，3]二氧杂环戊烯-10-基)苄基)苯基)氨基)-6-氧代己基)氨基甲酸叔丁酯的合成。
Figure BDA0002515266650000441
向DMF(30mL)中的((S)-5-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰氨基)-6-((3-(4-((2S，6aS，6bR，7S，8aS，8bS，10R，11aR，12aS，12bS)-2，6b-二氟-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a，8a-二甲基-4-氧代-2，4，6a，6b，7，8，8a，8b，11a，12，12a，12b-十二氢-1H-萘并[2′，1′：4，5]茚并[1，2-d][1，3]二氧杂环戊烯-10-基)苄基)苯基)氨基)-6-氧代己基)氨基甲酸叔丁酯(实例5，步骤1)(3g，2.69mmol)的溶液中添加1H-四唑(1.888g，26.9mmol)和二叔丁基二乙基亚磷酰胺(8.06g，32.3mmol)，并且将反应在室温下搅拌3.5小时。将过氧化氢(224mg，1.97mmol)添加到反应中，并搅拌0.5小时，之后时间LCMS显示反应完成。如上所述设置六个额外的小瓶。合并所有七种反应混合物。通过反相柱纯化反应，以得到呈白色固体的标题化合物(10g，纯度：78％，产率37.1％)。反相柱法：仪器：岛津LC-8A制备型HPLC；柱：菲罗门Luna C18200*40mm*10μm；流动相：A代表H2O，并且B代表MeCN；梯度：B在30分钟内从50％到100％；流量：60mL/min；波长：220和254nm。
LCMS(方法a，表4)Rt＝1.42min；m/z 1305.7(M+H)+。
步骤3：((S)-5-(2-氨基乙酰氨基)-6-((3-(4-((2S，6aS，6bR，7S，8aS，8bS，10R，11aR，12aS，12bS)-8b-(2-((二叔丁氧基磷酰基)氧基)乙酰基)-2，6b-二氟-7-羟基-6a，8a-二甲基-4-氧代-2，4，6a，6b，7，8，8a，8b，11a，12，12a，12b-十二氢-1H-萘并[2′，1′：4，5]茚并[1，2-d][1，3]二氧杂环戊烯-10-基)苄基)苯基)氨基)-6-氧代己基)氨基甲酸叔丁酯的合成。
Figure BDA0002515266650000451
向MeCN(10mL)中的((S)-5-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙酰氨基)-6-((3-(4-((2S，6aS，6bR，7S，8aS，8bS，10R，11aR，12aS，12bS)-8b-(2-((二叔丁氧基磷酰基)氧基)乙酰基)-2，6b-二氟-7-羟基-6a，8a-二甲基-4-氧代-2，4，6a，6b，7，8，8a，8b，11a，12，12a，12b-十二氢-1H-萘并[2′，1′：4，5]茚并[1，2-d][1，3]二氧杂环戊烯-10-基)苄基)苯基)氨基)-6-氧代己基)氨基甲酸叔丁酯(实例5，步骤2)(2.5g，1.969mmol)的溶液中添加哌啶(2mL，1.969mmol)，并且反应在室温下搅拌1小时，之后时间LCMS显示反应完成。如上所述设置三个额外的小瓶。合并所有四种反应混合物。将反应浓缩，以得到粗产物，将其在PE(30mL)中搅拌2小时。通过过滤收集所得的固体，并在减压下干燥，以得到呈黄色固体的标题化合物(7g，纯度：83％，产率70.4％)。
LCMS(方法a，表4)Rt＝1.17min；m/z 1083.5(M+H)+。
步骤4：((S)-5-(2-(2-溴乙酰氨基)乙酰氨基)-6-((3-(4-((2S，6aS，6bR，7S，8aS，8bS，10R，11aR，12aS，12bS)-8b-(2-((二叔丁氧基磷酰基)氧基)乙酰基)-2，6b-二氟-7-羟基-6a，8a-二甲基-4-氧代-2，4，6a，6b，7，8，8a，8b，11a，12，12a，12b-十二氢-1H-萘并[2′，1′：4，5]茚并[1，2-d][1，3]二氧杂环戊烯-10-基)苄基)苯基)氨基)-6-氧代己基)氨基甲酸叔丁酯的合成。
Figure BDA0002515266650000461
向DMF(35mL)中的2-溴乙酸(0.929g，6.68mmol)的溶液中添加2-乙氧基-1-乙氧基羰基-1，2-二氢喹啉(1.653g，6.68mmol)，并且将所得的混合物在室温下搅拌1小时。添加来自实例5，步骤3的产物(3.5g，3.34mmol)，并将所得的混合物在室温下搅拌2小时。LCMS显示反应完成。将反应用DCM(100mL)稀释，用HBr水溶液(1M，2×80mL)、NaHCO3水溶液(60mL)和盐水(60mL)洗涤。有机层经Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩，以得到呈黄色油的标题化合物(2g，产率51.2％)。
LCMS(方法a，表4)Rt＝1.32min；m/z 1205.5(M+H)+。
步骤5：2-((2S，6aS，6bR，7S，8aS，8bS，10R，11aR，12aS，12bS)-10-(4-(3-((S)-6-氨基-2-(2-(2-溴乙酰氨基)乙酰氨基)六酰氨基)苄基)苯基)-2，6b-二氟-7-羟基-6a，8a-二甲基-4-氧代-1，2，4，6a，6b，7，8，8a，11a，12，12a，12b-十二氢-8bH-萘并[2′，1′：4，5]茚并[1，2-d][1，3]二氧杂环戊烯-8b-基)-2-磷酸氧代乙二氢酯的合成。
Figure BDA0002515266650000471
向DCM(10mL)中的((S)-5-(2--氨基乙酰氨基)-6-((3-(4-((2S，6aS，6bR，7S，8aS，8bS，10R，11aR，12aS，12bS)-8b-(2-((二叔丁氧基磷酰基)氧基)乙酰基)-2，6b-二氟-7-羟基-6a，8a-二甲基-4-氧代-2，4，6a，6b，7，8，8a，8b，11a，12，12a，12b-十二氢-1H-萘并[2′，1′：4，5]茚并[1，2-d][1，3]二氧杂环戊烯-10-基)苄基)苯基)氨基)-6-氧代己基)氨基甲酸叔丁酯(实例5，步骤3)(2g，1.661mmol)的溶液中添加TFA(5mL，64.9mmol)，并且将反应在室温下搅拌40分钟，之后时间LCMS显示反应完成。在减压下除去溶剂，并将粗产物通过制备型HPLC纯化。将流动相直接冻干，以得到呈灰白色固体的标题化合物(550mg，纯度：96.9％，产率32.3％)。制备型HPLC方法：仪器：岛津LC-8A制备型HPLC；柱：菲罗门Luna C18200*40mm*10μm；流动相：A代表H2O(0.09％TFA)，并且B代表MeCN；梯度：B在20分钟内从30％到40％；流量：60mL/min；波长：220和254nm。
1H NMR：(DMSO-d6，400MHz)δppm 0.90(s，3H)1.19-1.41(m，2H)1.43-1.62(m，7H)1.64-1.77(m，3H)1.84(br d，J＝14.55Hz，1H)1.95-2.07(m，1H)2.18-2.36(m，3H)2.65-2.78(m，3H)3.71-3.86(m，3H)3.89(s，2H)3.93(s，2H)4.20(br d，J＝＝9.48Hz，1H)4.33-4.41(m，1H)4.59(br dd，J＝＝18.41，8.05Hz，1H)4.81(br dd，J＝18.52，8.60Hz，1H)4.94(d，J＝4.63Hz，1H)5.50(s，1H)5.54-5.76(m，1H)6.13(s，1H)6.29(dd，J＝10.14，1.32Hz，1H)6.95(d，J＝7.72Hz，1H)7.15-7.28(m，4H)7.30-7.41(m，3H)7.51(br d，J＝7.94Hz，1H)7.72(br s，3H)8.21(br d，J＝7.72Hz，1H)8.54(t，J＝5.62Hz，1H)9.93(br d，J＝2.65Hz，1H)LCMS(方法a，表4)Rt＝2.31min。
实例6：(S)-2-((2-(2-溴乙酰氨基)乙基)氨基)-N-((S)-1-((3-(4-((6aR，6bS，7S，8aS，8bS，10R，11aR，12aS，12bS)-7-羟基-8b-(2-羟基乙酰基)-6a，8a-二甲基-4-氧代-2，4，6a，6b，7，8，8a，8b，11a，12，12a，12b-十二氢-1H-萘并[2′，1′：4，5]茚并[1，2-d][1，3]二氧杂环戊烯-10-基)苄基)苯基)氨基)-1-氧代丙烷-2-基)丙酰胺的合成。
实例6的产物可以由以下来合成：将N-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙基)-N-(叔丁氧基羰基)-L-丙氨酰基-L-丙氨酸(以下步骤S1和S2的产物)与实例2的氨基产物偶联，随后进行步骤S4-S6：(1)Fmoc脱保护，(2)与2-溴乙酸偶联，以及(3)Boc脱保护。Fmoc＝芴基甲氧基羰基；Boc＝叔丁氧基羰基。
Figure BDA0002515266650000481
一般的半胱氨酸缀合方案
在pH 6至7.4的PBS缓冲液中制备所需抗体的约5至20mg/mL溶液。将所选的还原剂(例如TCEP)稀释或溶解在如H2O、DMSO、DMA或DMF的溶剂中，以得到浓度范围在1至25mM之间的溶液。然后通过添加约2至3.5当量的还原剂，短暂混合，并且在0至4℃下孵育过夜，来部分地还原抗体(抗hTNF hIgG1(D2E7)或抗mTNF mIgG2a(8C11；McRae BL等人，《克罗恩病和结肠炎杂志(J Crohns Colitis)》10(1)：69-76(2016))。然后添加pH 8至8.5(20-50mM)的Tris缓冲液，随后添加DMSO或DMA中的连接基团药物(总量少于15％)，并且将混合物在室温下孵育2至3小时。然后通过纯化除去过量的连接基团药物和有机溶剂。然后通过SEC、HIC和还原质谱法分析纯化的ADC样品。
ADC分析程序
通过阴离子交换色谱法(AEC)或疏水相互作用色谱法(HIC)对ADC进行分析，以确定ADC的缀合程度和纯度。
AEC.将约20μg的ADC装载到Ultimate 3000Dual LC系统(赛默飞世尔科技公司(Thermo Scientific))上，该系统配备有4X 250mm PropacTMWAX-10柱(东曹生命科学有限公司(Tosoh Bioscience)，目录号054999)。用100％缓冲液A平衡柱，并且使用从100％缓冲液A到100％缓冲液B的线性梯度在18分钟内以1.0mL/min洗脱，其中缓冲液A为20mM MES，pH6.7，并且缓冲液B为20mM MES，500氯化钠，pH 6.7。
HIC.将约20μg的ADC装载到Ultimate 3000Dual LC系统(赛默飞世尔科技公司)上，该系统配备有4.6X35mm丁基NPR柱(东曹生命科学有限公司，目录号14947)。柱在100％缓冲液A中平衡，并且使用从100％缓冲液A到100％缓冲液B的线性梯度在12分钟内以0.8mL/min洗脱，其中缓冲液A为25mM磷酸钠，1.5M硫酸铵，pH 7.0，并且缓冲液B是25mM磷酸钠，25％异丙醇，pH 7.0。
SEC.使用Ultimate 3000 Dual LC系统(赛默飞世尔科技公司)，通过尺寸排阻SEC分析ADC的尺寸分布，该系统配备有7.8X300mm TSK-凝胶3000SWxL柱(东曹生命科学有限公司，目录号08541)。将约20μg的ADC装载到柱上，并在17分钟内使用100mM硫酸钠，100mM磷酸钠，pH 6.8的等度梯度以1.0mL/min的流量洗脱。
MS.通过温度控制的(5C)CTC自动进样器将还原的样品(10μL)注入到安捷伦(Agilent)6550QTofLC/MS系统中。在沃特世(Waters)C-4、3.5μm，
Figure BDA0002515266650000503
2.1x50mm内径HPLC柱上实现样品洗脱。流动相为：A：在水中的0.1％甲酸，以及B：在MeCN中的0.1％甲酸；流量为0.45mL/min，并将柱室保持在40℃。
HPLC梯度如表5中所示：
表5
Figure BDA0002515266650000501
实例7：制备与糖皮质激素缀合的阿达木单抗以提供抗体药物缀合物
通过两步化学工艺来制备具有群体DAR 4.0的阿达木单抗BrAc-Gly-Glu-类固醇-PO4ADC：阿达木单抗的二硫化物还原，随后用实例4的溴乙酰胺基甘氨酸-谷氨酸类固醇进行烷基化(缀合)。
Figure BDA0002515266650000502
在0℃下用二苯基膦基乙酸(2.9至3.0当量)还原100mg的浓度为20mg/mL的阿达木单抗过夜。然后在室温下将部分还原的阿达木单抗在DMSO中与实例4(10当量)缀合3小时。首先，使用多个NAP 25脱盐柱将缀合混合物缓冲液交换为20mM Tris缓冲液，50mM NaCl，pH7.8。通过AEC纯化脱盐的ADC溶液，以提供ADC的DAR4组分。AEC色谱法：仪器：Akta纯；柱：2XHitrapQHP 5mL；流动相：A代表20mM Tris缓冲液，pH 7.8；B代表20mM Tris缓冲液，1MNaCl，pH 7.8；梯度：B在60分钟内从0％到25％；流量：5mL/min；波长：280和214nm。
参考图1，其示出了所得的ADC制剂的色谱分辨率，ADC是含有抗体的异质混合物，所述抗体连接有两个药物连接基团分子(“DAR2”峰)，连接有四个药物连接基团分子(“DAR4”)峰)，这取决于链间二硫键的减少的数量。图1中使用的AEC条件如下：
色谱柱为PropacTM WAX-10，4X250mm(赛默飞世尔科技公司(Thermo FisherScientific)，目录号054999)，并且柱温度为37℃。波长为280nm，运行时间为18分钟，进样量为20μg，并且流量为1.0mL/分钟。流动相A：20mM MES，pH 6.7，流动相B：20mM MES，500mMNaCl，pH 6.7。梯度分布(表6)：
表6
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 75 25
14 5 95
16 0 100
18 0 100
图2示出了纯化的ADC的去卷积的质谱。所述ADC具有与每种抗体缀合的4个药物连接基团分子。左边的峰具有24284.74Da的分子量，这是一个药物连接基团连接至单个轻链的结果。右边的峰具有51513.96Da的分子量，这是一个药物流落街头连接至单个重链的结果。表7和表8中的ADC是根据上面描述的程序制备的。
表7：抗小鼠TNFα抗体药物缀合物。X是指抗鼠TNFa抗体8C11
Figure BDA0002515266650000521
表8：抗人TNFα抗体药物缀合物。X是指抗人TNFa抗体阿达木单抗
Figure BDA0002515266650000531
人和小鼠跨膜TNF-αGRE报道细胞系的产生
为了产生亲本细胞系，在37℃，5％CO2下，在24小时内，将K562细胞以每孔500,000个细胞接种到具有2mL的完全生长培养基(RPMI，10％FBS，1％L-谷氨酰胺，1％丙酮酸钠和1％MEM NEAA)的6孔培养皿((柯仕达)Costar：3516)上。第二天，将1.5μg的pGL4.36[Luc2P/MMTV/Hygro](普洛麦格(Promega)：E316)、1.5ug的pGl4.75[hRLuc/CMV](普洛麦格：E639A)和3uL的PLUS试剂(英杰公司(Invitrogen)：10964-021)稀释到244μL的Opti-MEM(Gibco：31985-070)中，并在室温下孵育15分钟。pGL4.36[luc2P/MMTV/Hygro]载体含有MMTV LTR(鼠乳腺肿瘤病毒长末端重复序列)，其响应于若干种核受体(例如糖皮质激素受体和雄激素受体)的激活而驱动荧光素酶报告基因luc2P的转录。pGL4.75[hRluc/CMV]载体编码萤光素酶报道基因hRluc(海肾(Renilla reniformis))，并且被设计为用于高表达和减少异常转录。
在孵育后，将稀释的DNA溶液与1∶1脂转染胺(Lipofectamine)LTX溶液(英杰公司：94756)(13.2μL+256.8μL Opti-MEM)进行预孵育，并在室温下孵育25分钟以形成DNA-脂转染胺LTX复合物。在孵育后，将500μL的DNA-脂转染胺复合物直接添加到含有细胞的孔中。将K562细胞在37℃，5％CO2下转染24小时。在孵育后，将细胞用3mL的PBS洗涤，并用含有125μg/mL的潮霉素B(英杰公司：10687-010)的完全生长培养基选择两周。产生″K562 pGL4.36[Luc2P/MMTV/Hygro]_pGL4.75[hRLuc/CMV厂细胞。
为了产生鼠跨膜TNF-αGRE报告细胞，在37℃，5％CO2下，在24小时内，将亲本细胞K562pGL4.36[Luc2P/MMTV/Hygro]_pGL4.75[hRLuc/CMV]以每孔500,000个细胞接种到含有2mL的完全生长培养基(RPMI，10％FBS，1％L-谷氨酰胺，1％丙酮酸钠和1％MEM NEAA)的6孔培养皿(柯仕达：3516)上。第二天，将3μg的编码未标记的小鼠TNF的mFL_TNFa DNA(傲锐基因(Origene)：MC208048)和3μL的PLUS试剂(英杰公司：10964-021)稀释到244μL的Opti-MEM(Gibco：31985-070)中，并在室温下孵育15分钟。在孵育后，将稀释的DNA溶液用1∶1脂转染胺LTX溶液(英杰公司：94756)(13.2μL+256.8μL Opti-MEM)预孵育，并在室温下孵育25分钟，以形成DNA-脂转染胺LTX复合物。在孵育后，将500μL的DNA-脂转染胺复合物直接添加到含有细胞的孔中。将亲本K562pGL4.36\[Luc2P/MMTV/Hygro]_pGL4.75[hRLuc/CMV]细胞在37℃，5％CO2下转染24小时。在孵育后，将细胞用3mL的PBS洗涤，并用含有125μg/mL的潮霉素B(英杰公司：10687-010)和250μg/mL G418(Gibco：10131-027)的完全生长培养基选择两周。产生“K562小鼠FL-TNFαGRE(pGL4.36[luc2P/MMTV/Hygro])”细胞。
为了产生人跨膜TNF-αGRE报告细胞系，用质粒hTNFδ1-12 C-MycpcDNA3.1(-)质粒构建体来转染亲本细胞K562pGL4.36[Luc2P/MMTV/Hygro]_pGL4.75[hRLuc/CMV]。所述质粒是pcDNA 3.1(赛默飞世尔，目录号V79020)，其编码tace抗性跨膜TNF(即，缺少氨基酸77-88的SEQ ID NO：1)。(参见Perez C等人，《细胞(Cell)》63(2)：251-8(1990)，其讨论了tace抗性跨膜TNF。)然后将这些细胞系用于在随后的实例中描述的TNF-α报告测定中。
抗TNF-α免疫缀合物在GRE跨膜TNF-α报告测定中的活性
将K562亲本GRE(pGL4.36[luc2P/MMTV/Hygro])细胞和K562mFL-TNF-a或hTNFδ1-12GRE(pGL4.36[luc2P/MMTV/Hygro])细胞在50μL的测定培养基(RPMI，1％CSFBS，1％L-谷氨酰胺，1％丙酮酸钠和1％MEAA)中以每孔50,000个细胞接种到96孔组织培养处理的白板(柯仕达：3917)上。在测定培养基、类固醇化合物或单独的培养基中，用25μL的3X系列稀释的鼠或人抗TNF-a抗体药物缀合物处理细胞，并在37℃，5％CO2下孵育48小时。在孵育48小时后，将细胞用75μL的Dual-Glo荧光素酶测定系统(普洛麦格-E2920)处理10分钟，并使用Microbeta(珀金埃尔默仪器有限公司(PerkinElmer))分析发光。使用四参数曲线拟合分析数据以产生EC50值。将最大活化％归一化为100nM地塞米松。使用鼠TNF-α细胞系的结果示于下面的表9中，而使用人TNF-α细胞系的结果示于下面的表10中。在下面的表9中，ADC中的抗体是抗鼠TNFα抗体8C11。在下面的表10中，ADC中的抗体是抗人TNFα抗体阿达木单抗。如先前所描述的，通过SEC确定单体的百分比(％)(参见ADC分析程序)。
表9：抗鼠TNFa抗体药物缀合物在小鼠跨膜TNFa GRE报告测定中的体外活性
Figure BDA0002515266650000561
表10：抗人TNFa抗体药物缀合物在人跨膜TNFa GRE报告测定中的体外活性
Figure BDA0002515266650000562
抗hTNFα免疫缀合物在脂多糖刺激的人PBMC细胞因子释放测定中的活性
人原代外周血单核细胞(PBMC)购自生物专业公司(Biological SpecialtyCorporation)(目录号214-00-10)，在50mL PBS中洗涤，重悬于具有5％DMSO的FBS中，等分并冷冻保存在液氮中直到使用。将PBMC解冻，重悬于补充有2％FBS和1％青霉素链霉素的RPMI培养基中，并且接种到细胞测定板(柯仕达#3799)中。然后将细胞在37℃和5％CO2下用不同浓度的抗TNF ADC孵育4小时。然后细胞用100ng/mL LPS刺激过夜。第二天，将板以1000rpm旋转5分钟，并且将100μL的上清液培养基直接转移到另一个96孔板中，并分析IL-6(MSD，#K151AKB)和IL-1β(MSD，#K151AGB)浓度。使用非线性回归将剂量响应数据拟合为S形曲线，并借助GraphPad 5.0(GraphPad软件公司)计算IC50值。表11中显示的结果证明抗TNFADC在抑制促炎细胞因子IL-6和IL-1β从活化的原代免疫细胞的释放方面具有有效的活性。
表11.抗TNF类固醇ADC在刺激的PBMC细胞因子释放测定中的体外活性
Figure BDA0002515266650000571
抗mTNFα免疫缀合物在接触性超敏反应模型中的活性
在急性接触性超敏反应模型中评估抗TNFα类固醇ADC，所述模型是通过应用敏化剂(异硫氰酸荧光素(FITC)，使用迟发型超敏反应(DTH)响应(T细胞驱动)引发急性皮肤炎症。通过减少耳朵肿胀的能力来测量抗TNFα类固醇ADC的功效。包括类固醇生物标记物皮质酮和前胶原1型N-末端前肽(P1NP)作为读数，以评估抗TNFa类固醇ADC治疗分别对下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴和骨转换的推定影响。
耳朵肿胀
在第0天，将小鼠置于全身麻醉下并剃除腹部。使用微量移液器，通过在腹部上皮肤应用400μL的FITC溶液(1∶1丙酮∶DBP中的1.5％溶液)对小鼠进行致敏。6天后，在用FITC进行耳攻击之前1小时，用媒剂或治疗剂对小鼠进行给药。对于耳部攻击，将小鼠置于全身麻醉下，并用施加在右耳上的20μL的FITC进行攻击。攻击后二十四小时，将小鼠置于全身麻醉下，并通过卡尺测量它们的耳朵厚度。计算攻击的耳朵和未攻击的耳朵之间的差异。耳攻击后72小时，小鼠以1mpk IP注射ACTH，并在ACTH后30分钟终末放血。收集血浆并分析P1NP、皮质酮、游离类固醇和大分子水平。
释放的游离类固醇和内源性皮质酮的定量
在小鼠血浆中以8种不同浓度水平的终浓度为0.03nM至0.1μM来制备类固醇的校准曲线。在PBS缓冲液中的70mg/mL牛血清白蛋白溶液中，制备在从0.3nM至1μM最终皮质酮浓度的范围的皮质酮校准曲线。将含有0.1％甲酸的160μL MeCN的溶液添加到40μL的研究血浆样品或校准标准品中。上清液用蒸馏水稀释，并注入30μL的最终样品溶液用于LC/MS分析。
释放的游离类固醇和皮质酮的定量在连接至岛津AC20HPLC系统的AB Sciex 5500三重四极杆质谱仪上进行，所述系统与以正模式操作的电喷雾电离源连接。2.1x30mm，3.5μm的Waters XBridge BEH C18柱用于色谱分离。流动相A为在Milli Q HPLC水中的0.1％甲酸，并且流动相B为在MeCN中的0.1％甲酸。从0.6至1.2分钟，施加从2％的流动相B到98％的流动相B的线性梯度。在0.8mL/min的流量下，总运行时间为2.6min。质谱仪在700C的源温度下以正MRM模式操作。
血浆P1NP的定量
基于蛋白胰蛋白酶消化，在LCMS平台上进行血浆P1NP的定量。通过添加MeCN/0.1M碳酸氢铵/DTT混合物使血浆样品部分沉淀并完全还原。收集上清液，并通过添加碘乙酸烷基化。烷基化的蛋白质通过胰蛋白酶消化，并且通过LCMS分析所得的胰蛋白酶肽。通过使用掺入马血清(无干扰替代基质)的合成胰蛋白酶肽来生成校正曲线。稳定的同位素标记的侧翼肽(在胰蛋白酶肽的两个末端上的3至6个氨基酸的延伸)被用作内标，其被添加到MeCN/DTT蛋白沉淀混合物中，以使消化效率和LCMS注射归一化。
2.1×150mm，5μm的Columnex Chromenta BB-C18柱用于色谱分离。流动相A是在Milli Q HPLC水中的0.1％甲酸，并且流动相B是在MeCN中的0.1％甲酸。从0.6至3分钟，施加从2％的流动相B到65％的流动相B的线性梯度。在0.45mL/min的流量下，总运行时间为8分钟。在700C的源温度下，以正MRM模式使用AB Sciex 4000Q阱质谱仪来定量P1NP肽。
结果
结果显示在下面的表12中：
表12：在CHS炎症模型中耳朵肿胀和类固醇生物标志物上的抗mTNFα类固醇ADC活性的比较
Figure BDA0002515266650000591
抗mTNFα免疫缀合物在胶原诱导的关节炎中的活性
在关节炎的胶原诱导的关节炎(CIA)模型中评估抗mTNFa类固醇ADC(ADC1)影响疾病的能力。
在这些实验中，雄性DBA/1J小鼠获自杰克逊实验室(Jackson Labs)(ME，巴尔港(Bar Harbor))。小鼠在6至8周龄时使用。将所有动物在12小时的明/暗循环下保持在恒定的温度和湿度下，并以啮齿动物食物(马萨诸塞州弗雷明汉实验室饮食5010药房(Lab Diet5010 PharmaServ，Framingham，MA))喂养并随意饮水。AbbVie是AAALAC(实验室动物护理评估和鉴定协会(Association for Assessment and Accreditation of LaboratoryAnimal Care))认可的，并且所有程序均通过动物护理和使用机构委员会(InstitutionalAnimal Care and Use Committee)(IACUC)的批准，并由主治兽医进行监控。监测体重和状况，并且如果呈现出>20％的体重减轻，则对动物实施安乐死。
用100μL的含有100μg的溶解在0.1N乙酸中的II型牛胶原蛋白(MD生物学)和200μg的热灭活结核分枝杆菌H37Ra(完全弗氏佐剂，Difco，Laurence，KS)的乳剂在尾部基部皮内(i.d.)免疫雄性DBA/J小鼠。在用胶原蛋白免疫后21天，用PBS中的1mg的酵母多糖A(西格玛，圣路易斯，密苏里州(Sigma，St.Louis，MO))腹膜内对小鼠进行增强。在增强后，每周对小鼠进行3至5次关节炎监测。使用Dyer弹簧卡钳(Dyer spring caliper)(Dyer 310-115)评估后爪的爪肿胀。
在疾病的第一个临床体征在第24天与第28天之间登记小鼠，并将其分配为等效关节炎严重程度的组。入选时开始早期治疗性治疗。
对动物在腹膜内(i.p.)用在0.9％盐水中的抗mTNF mAb(高剂量)或抗mTNF类固醇ADC(高和低剂量-mpk)给药一次。在给药后24小时和72小时，通过尾部切口收集血液用于抗体暴露。在用于组织病理学的终点时间点收集爪。在终点时间点通过心脏穿刺采集血液，用于全血细胞计数(Sysmex XT-2000iV)。统计显著性由ANOVA确定。
结果显示在图3中，并证明单剂量的抗TNFα类固醇ADC通过改善爪肿胀，与单独的抗TNFα mAb或媒剂相比，可以呈现出约28天的延长的作用持续时间。
在血浆中的ADC稳定性
虽然水解已经被用于增加基于马来酰亚胺的连接基团的体内稳定性，但它通常需要暴露于碱性pH，这可能导致抗体的修饰(例如脱酰胺作用)、增加的异质性、降低的产率等。(Shen等人，《自然生物技术(Nature Biotechnology)》30：184-189(2012)(水解马来酰亚胺避免药物的过早释放和全身暴露于药物)；Strop等人，《化学与生物学(Chemistry&Biology)》20(2)：161-167(2013)(类似研究)；Tumey等人，《生物共轭化学(BioconjugateChem)》25(10)：1871-1880(2014)(使用近端PEG链使得能够在碱性条件下实现环水解)；Lyon等人，《自然生物技术》32：1059-1062(2014)(用于促进水解的琥珀酰亚胺的生成的工艺)；Christie等人，《控制释放杂志(J Control Release)》220(PtB)：660-70(2015年12月28刚(在碱性条件下使用N-芳基马来酰亚胺来促进琥珀酰亚胺环水解)；Dovgan等人，《科学报告(Scientific Reports)》6：1(2016)(使用2-(马来酰亚胺甲基)-1，3-二噁烷用于在温和碱性条件下促进环水解持续延长的时间段)；和《药物科学杂志(J Pharm Sci)》2013：102(6)1712-1723(天冬酰胺脱酰胺作用依赖于缓冲液类型、pH和温度)。相比之下，与用于马来酰亚胺的多天相比，使用溴乙酰胺的缀合的典型条件在几个小时内完成(在碱性pH下缀合和随后的环水解)。此外，在半胱氨酸与溴代乙酰胺的反应期间形成的2-巯基乙酰胺对反向迈克尔反应不敏感，并提供连接基团与抗体的稳定连接，如下面表13中对于ADC4所示出的。
表13
Figure BDA0002515266650000611
BLQ-低于定量水平(<1.0nM)
在溶液中的ADC稳定性
为了评估长期稳定性，使生物制剂经受加速压力测试。用于该测试的方案是在40℃下将100mg/mL的生物制剂置于15mM的组氨酸中21天。当ADC4经受该测试时，与2018年5月10日发布的美国专利申请公开第2018/012600号的ADC203(其显示出18％的聚集的增加)相比，聚集增加的百分比＜5％(表14)。这证明通过含有有效载荷的磷酸盐前药的Gly-Glu连接基团赋予ADC4改进的性能。US2018/0126000的ADC203为：
Figure BDA0002515266650000612
其中n＝4，并且A是指抗人TNFα抗体阿达木单抗。
表14
ADC 21天内5℃下单体损失 21天内25℃下单体损失 21天内40℃下单体损失
ADC203 1.43％ 2.26％ 17.56％
ADC4 <0.5％ <0.5％ 3.46％
磷酸盐前药的另外的益处是它使得能够使用阴离子交换色谱法进行DAR纯化。与疏水相互作用色谱法相比，这导致改善的峰分辨率，从而导致DAR纯化的ADC的更高的产率。
在制剂缓冲液中，ADC203的水解的琥珀酰亚胺环与闭环形式处于平衡。在食蟹猴体内，闭环形式易受反向迈克尔反应和随后体内连接基团药物损失的影响(图4)。
Figure BDA0002515266650000621
在标称液体储存条件下，开放构象的琥珀酰亚胺连接将在6个月后在5℃下改造大于5％的封闭构象，并且在25℃下改造大于15％的封闭构象(表15)。
表15
Figure BDA0002515266650000622
应当理解，具体实施方式部分，而不是发明内容和摘要部分，旨在用于解释权利要求。发明内容和摘要部分阐述了如发明人所设想的本公开的一个或多个但不是全部示例性的实施例，并且因此，不旨在以任何方式限制本公开和所附的权利要求。
上面已经借助于示出特定功能及其关系的实现的功能构造块描述了本公开。为了描述的方便，本文已经任意定义了这些功能构造块的边界。只要适当地执行指定的功能及其关系，就可以定义替代的边界。
对特定实施例的前述描述将如此充分地揭示本公开的一般性质，以至于其他人可以通过应用本领域技术内的知识在不脱离本公开的一般概念的情况下，容易地修改和/或适应于诸如具体实施例的各种应用，而无需过度的实验。因此，基于本文所提出的教导和指导，此类适应和修改旨在处于所公开的实施例的等同物的含义和范围内。应当理解，本文中的措词或术语是用于描述而非限制的目的，使得本说明书的术语或措辞将由技术人员根据教导和指导来解释。
本公开的广度和范围不应受任何上述示例性实施例的限制，而应仅根据所附权利要求及其等同物来限定。
引用并入
在具体实施方式中提到的所有出版物(包括专利和公开的申请)均通过引用以其整体并入本文。
Figure IDA0002515266690000011
Figure IDA0002515266690000021
Figure IDA0002515266690000031
Figure IDA0002515266690000041
Figure IDA0002515266690000051
Figure IDA0002515266690000061
Figure IDA0002515266690000071
Figure IDA0002515266690000081
Figure IDA0002515266690000091
Figure IDA0002515266690000101

Claims (11)

1.一种抗体药物缀合物，其包含：
(a)抗TNFα抗体，所述抗TNFα抗体包含如SEQ ID NO：3所示的重链和如SEQ ID NO：4所示的轻链；以及
(b)糖皮质激素受体激动剂，所述糖皮质激素受体激动剂包含由下式表示的基团：
Figure FDA0002515266640000011
其中所述抗体通过由下式表示的连接基团与所述糖皮质激素受体激动剂缀合：
Figure FDA0002515266640000012
2.根据权利要求1所述的抗体药物缀合物，其根据下式：
Figure FDA0002515266640000013
其中A是所述抗体，并且n是1至10的整数。
3.根据权利要求2所述的抗体药物缀合物，其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
4.根据权利要求2所述的抗体药物缀合物，其中n为4。
5.根据权利要求2所述的抗体药物缀合物，其中n为2。
6.一种药物组合物，其包含根据权利要求4所述的抗体药物缀合物和药学上可接受的载体。
7.一种在受试者中治疗选自类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、银屑病关节炎、斑块型银屑病、溃疡性结肠炎、成人克罗恩病、小儿克罗恩病、葡萄膜炎、化脓性汗腺炎和幼年特发性关节炎的病状的方法，其包含向所述受试者施用有效量的根据权利要求4所述的抗体药物缀合物。
8.一种试剂盒，其包含：
(a)容器，所述容器包含根据权利要求4所述的抗体药物缀合物或根据权利要求6所述的药物组合物；以及
(b)位于一个或多个容器上或与所述一个或多个容器相关的标签或包装插页，其中所述标签或包装插页指示所述抗体药物缀合物或药物组合物用于治疗选自类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、银屑病关节炎、斑块型银屑病、溃疡性结肠炎、成人克罗恩病、小儿克罗恩病、葡萄膜炎、化脓性汗腺炎和幼年特发性关节炎的病状。
9.一种将糖皮质激素受体激动剂递送至表达TNFα的细胞的方法，其包含使所述细胞与根据权利要求4所述的抗体药物缀合物接触的步骤。
10.一种根据下式的抗体药物缀合物：
Figure FDA0002515266640000021
其中A为阿达木单抗，并且n为4。
11.一种根据下式的抗体药物缀合物：
Figure FDA0002515266640000031
其中A为阿达木单抗，并且n为2。
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