TW201924723A - 糖皮質激素受體激動劑及其免疫軛合物 - Google Patents

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Abstract

本文提供了糖皮質激素受體激動劑免疫軛合物、糖皮質激素受體激動劑、以及使用它們之方法。

Description

糖皮質激素受體激動劑及其免疫軛合物 相關申請的交叉引用
本申請要求於2017年12月1日提交的美國臨時申請案號62/593,776和於2017年12月5日提交的美國臨時申請案號62/595,054之優先權，其各自藉由引用以全文併入。
序列表
本申請含有序列表，該序列表已以ASCII格式以電子方式提交且其全部內容藉由引用併入本文。所述ASCII副本創建於2018年11月28日，名稱為A103017_1490WO_SL.txt且大小為14,758位元組。
腫瘤壞死因子α(TNFα)在若干人類病症的病理生理學中起重要作用，並且抗TNFα劑在臨床上已證實在治療自身免疫和炎性病症(如類風濕性關節炎、牛皮癬和炎症性腸病)中具有治療效用。儘管它們在臨床上取得了成功，但抗TNFα生物製劑仍受限於它們在患者中可以實現的最大功效，因此需要鑒定和開發更強且有效的治療劑。用抗TNFα生物製劑治療的患者還可能對治療劑發展免疫原性響應，從而限制其有效性。因此，具有較低免疫原性和高效力的抗TNFα療法將可用於進一步控制疾病。
合成的糖皮質激素受體激動劑係用於治療炎性病症的一類強效小分子，但由於嚴重的副作用，它們在疾病的長期治療中的效用受到限制。需要開發與抗TNF抗體相比具有增強的功效和更長的作用持續時間並且具有最小的不良作用的治療劑。
本揭露提供了可用於治療自身免疫疾病的糖皮質激素受體激動劑免疫軛合物(conjugate)。
在一個方面，本揭露提供了一種抗體藥物軛合物，該抗體藥物軛合物包含：(a)包含如SEQ ID NO：3所示的重鏈和如SEQ ID NO：4所示的輕鏈的抗TNFα抗體；以及(b)糖皮質激素受體激動劑，該糖皮質激素受體激動劑包含由下式表示的基團： 並且其中該抗體藉由由下式表示的接頭與糖皮質激素受體激動劑軛合：
在一個實施方式中，本揭露提供了一種根據下式的抗體藥物軛合物： 其中A係抗體並且n係從1-10的整數。
在一個方面，本揭露提供了一種抗體藥物軛合物，該抗體藥物軛合物包含：(a)包含如SEQ ID NO：3所示的重鏈和如SEQ ID NO：4所示的輕鏈的抗TNFα抗體；以及(b)糖皮質激素受體激動劑，該糖皮質激素受體激動劑包含由下式表示的基團： 並且其中該抗體藉由由下式表示的接頭與糖皮質激素受體激動劑軛合：
在一個實施方式中，本揭露提供了一種根據下式的抗體藥物軛合物： 其中A係抗體並且n係從1-10的整數。
在一個實施方式中，本揭露提供了任何前述實施方式的抗體藥物軛合物，其中藥物載荷係1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10。在一個實施方式中，本揭露提供了任何前述實施方式的抗體藥物軛合物，其中藥物載荷係4，例如前述抗體藥物軛合物式中的n等於4。在一個實施方式中，本揭露提供了任何前述實施方式的抗體藥物軛合物，其中藥物載荷係2，例如前述抗體藥物軛合物式中的n等於2。
在一個實施方式中，本揭露提供了一種製備任何前述實施方式的抗體藥物軛合物之方法，該方法包括將抗體與糖皮質激素受體激動劑軛合的步驟。在一個實施方式中，本揭露提供了前述實施方式之方法，該方法進一步包括在將抗體與糖皮質激素受體激動劑軛合之前在糖皮質激素受體激動劑上引入PO4部分的步驟。在一個實施方式中，本揭露提供了任何前述實施方式之方法，其中該軛合包括部分還原該抗體，並用根據下式的化合物將該部分還原的抗體烷基化：
在一個實施方式中，本揭露提供了一種藥物組成物，該藥物組成物包含任何前述實施方式的抗體藥物軛合物和藥學上可接受的載體。在一個實施方式中，本揭露提供了任何前述實施方式的藥物組成物，該藥物組成物包含1-10的藥物與抗體比率(DAR)。
在一個較佳的實施方式中，本揭露提供了一種根據下式的抗體藥物軛合物： 其中A係阿達木單抗(adalimumab)並且n係4。
在另一個較佳的實施方式中，本揭露提供了一種根據下式的抗體藥物軛合物： 其中A係阿達木單抗並且n係2。
在一個較佳的實施方式中，本揭露提供了任何前述實施方式的藥物組成物，該藥物組成物包含2.0的藥物與抗體比率(DAR)。
在一個較佳的實施方式中，本揭露提供了任何前述實施方式的藥物組成物，該藥物組成物包含4.0的藥物與抗體比率(DAR)。
在一個實施方式中，本揭露提供了一種在受試者中治療選自以下各項的病狀之方法：類風濕性關節炎、關節黏連性脊椎炎、牛皮癬關節炎、斑塊狀牛皮癬、潰瘍性結腸炎、成人克羅恩氏病、小兒克羅恩氏病、葡萄膜炎、化膿性汗腺炎、和幼年特發性關節炎，該方法包括向受試者給予有效量的任何前述實施方式的抗體藥物軛合物或任何前述實施方式的藥物組成物。
在一個實施方式中，本揭露提供了用於治療選自以下各項的病狀的任何前述實施方式的抗體藥物軛合物或任何前述實施方式的藥物組成物：類風濕性關節炎、關節黏連性脊椎炎、牛皮癬關節炎、斑塊狀牛皮癬、潰瘍性結腸炎、成人克羅恩氏病、小兒克羅恩氏病、葡萄膜炎、化膿性汗腺炎、和幼年特發性關節炎。
在一個實施方式中，本揭露提供了任何前述實施方式的抗體藥物軛合物或任何前述實施方式的藥物組成物用於製備用於治療選自以下各項的病狀的藥物的用途：類風濕性關節炎、關節黏連性脊椎炎、牛皮癬關節炎、斑塊狀牛皮癬、潰瘍性結腸炎、成人克羅恩氏病、小兒克羅恩氏病、葡萄膜炎、化膿性汗腺炎、和幼年特發性關節炎。
在一個實施方式中，本揭露提供了一種套組(kit)，該套組包括：(a)包含任何前述實施方式的抗體藥物軛合物或任何前述實施方式的藥物組成物的容器；以及(b)在一個或多個容器上或與其相關聯的標籤或包裝插入物，其中該標籤或包裝插入物指示抗體藥物軛合物或藥物組成物用於治療選自以下各項的病狀：類風濕性關節炎、關節黏連性脊椎炎、牛皮癬關節炎、斑塊狀牛皮癬、潰瘍性結腸炎、成人克羅恩氏病、小兒克羅恩氏病、葡萄膜炎、化膿性汗腺炎、和幼年特發性關節炎。
在一個實施方式中，本揭露提供了一種將糖皮質激素受體激動劑遞送至表現TNFα的細胞之方法，該方法包括使細胞與任何前述實施方式的抗體藥物軛合物接觸的步驟。在一個實施方式中，本揭露提供了一種確定抗體藥物軛合物的抗炎活性的方法，該方法包括：(a)使表現TNFα的細胞與任何前述實施方式的抗體藥物軛合物接觸；並且(b)確定如與對照細胞相比的從該細胞釋放促炎細胞介素。
[圖1]提供了如實例7中進行和描述的BrAc-Gly-Glu-糖皮質激素受體調節劑(GRM)-PO4之層析分離。如圖所示，ADC係含有附接有兩個藥物接頭分子的ADC和附接有四個藥物接頭分子的ADC的異質ADC混合物。
[圖2]列出了如實例中進行和描述的與BrAc-Gly-Glu-糖皮質類固醇-PO4軛合的阿達木單抗之解卷積MS數據。如圖所示，實現了軛合。
[圖3]提供了證實如實例7中進行和描述的在小鼠膠原誘導的關節炎(CIA)關節炎模型中高劑量和低劑量的ADC1與抗TNFαmAb(高劑量)或媒劑相比的功效之圖。如圖所示，與抗TNFα mAb或單獨的媒劑相比，單劑量的抗TNFα糖皮質類固醇ADC1藉由改善爪腫脹約28天表現出延長的作用持續時間。
[圖4]係如實例7中進行和描述的食蟹猴中閉合和開放環ADC隨時間的濃度(ug/ml)之圖。如圖所示，閉環形式在體內易受反向邁克爾反應和隨後接頭-藥物損失的影響。
本文提供了糖皮質激素受體激動劑免疫軛合物、糖皮質激素受體激動劑、以及製備和使用它們之方法。
本文提供了一種根據下式的抗體藥物軛合物： 其中A係阿達木單抗並且n係4。如下文實例7中所證明的，該ADC(即，下文ADC4)證明了體外活性、血漿中的穩定性、和最小的聚集。
還提供了製備ADC4的方法和使用ADC4的方法。
I. 定義
為了有助於理解本揭露，在下文中定義一些術語和短語。
術語“抗TNFα蛋白”係指能夠(i)與TNFα結合和(ii)抑制可溶性TNFα與細胞表面TNF受體(p55和/或p75)結合和/或在補體存在下體外裂解表面TNFα或表現TNFα受體的細胞的蛋白質。在一些實施方式中，抗TNF抗體可以與細胞表面上的TNFα結合並變得內化。例如，藉由引用以全文併入本文的US 2014/0294813揭露了抗TNF抗體，該等抗TNF抗體在與細胞表面人TNF結合後表現出細胞內化。抗TNFα蛋白包括例如抗TNFα抗體(例如阿達木單抗、英夫利昔單抗(infliximab)、和戈利木單抗(golimumab))。抗TNFα抗體在與單核細胞衍生的DC上的跨膜TNF結合後被積極內化，並快速進入它們被降解的溶酶體。(Deora等人MABS,2017，第9卷，第4期，680-694)。
如本文所用，術語“抗體”旨在係指由四條多肽鏈(藉由二硫鍵互連的兩條重(H)鏈和兩條輕(L)鏈)構成的免疫球蛋白分子。各重鏈由重鏈可變區(本文中縮寫為HCVR或VH)和重鏈恒定區構成。重鏈恒定區由三個結構域CH1、CH2、和CH3構成。各輕鏈由輕鏈可變區(本文中縮寫為LCVR或VL)和輕鏈恒定區構成。輕鏈恒定區由一個結構域CL構成。VH和VL區可以進一步再分成高變區，稱為互補決定區(CDR)，穿插有稱為框架區(FR)的較保守區。各VH和VL由三個CDR和四個FR構成，自胺基端至羧基端按以下順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
術語“抗TNFα抗體”或“與TNFα結合的抗體”係指能夠例如以足夠的親和力結合TNFα的抗體，以使得該抗體適用於在靶向TNFα中用作治療劑。抗TNFα抗體與不相關的非TNFα蛋白的結合程度可以小於該抗體與TNFα的結合的約10%，如例如藉由放射免疫測定法(RIA)所測定。在某些實施方式中，與TNFα結合的抗體具有1μM、100nM、10nM、1nM、或0.1nM的解離常數(Kd)。
如本文所用的術語“免疫軛合物”、“軛合物”、“抗體-藥物軛合物”、或“ADC”係指與蛋白質如細胞結合劑(例如，抗TNFα抗體)軛合的化合物或其衍生物此類免疫軛合物可以由以下通式來定義：(SM-L-Q)n-A，其中SM=衍生自小分子糖皮質激素受體激動劑的基團，例如糖皮質類固醇，L=接頭，Q=異雙功能基團或不存在，並且A=蛋白質(例如抗體)，並且n=1-10。免疫軛合物還可以由以下呈相反順序的通式來定義：A-(Q-L-SM)n。
在本揭露中，術語“接頭”係指能夠將抗TNFα蛋白(例如抗體)與糖皮質類固醇連接的化學部分。接頭可能易於切割(“可切割接頭”)，從而促進糖皮質類固醇的釋放。例如，在糖皮質類固醇和/或抗體保持活性的條件下，此類可切割接頭可能對肽酶誘導的切割敏感。
具體地，本文揭露的可切割接頭組分包含含有兩個至三個胺基酸殘基的肽(二肽或三肽)，並且尤其是選自下組的二肽和三肽，該組由以下各項組成：丙胺酸-丙胺酸(Ala-Ala)、甘胺酸-麩胺酸(Gly-Glu)、麩胺酸-丙胺酸-丙胺酸(Glu-Ala-Ala)、和甘胺酸-賴胺酸(Gly-Lys)。該肽允許接頭由蛋白酶切割，從而促進在暴露於細胞內蛋白酶(如溶酶體酶)後釋放糖皮質類固醇(Doronina等人(2003)Nat.Biotechnol.[自然生物技術]21：778-784)。
在本揭露中，術語“糖皮質類固醇”係指與糖皮質激素受體相互作用的天然存在或合成的類固醇激素，並且本文詳細揭露了特定的糖皮質類固醇。“糖皮質類固醇的基團”係藉由從親本糖皮質類固醇中移除一個或多個氫原子衍生的。一個或多個氫原子的移除促進了親本糖皮質類固醇與接頭的附接。在本揭露中，從親本糖皮質類固醇的任何適合的-NH2基團移除氫原子。具體地，“糖皮質類固醇的基團”係衍生自從親本糖皮質類固醇移除一個氫原子的一價基團。
在本揭露中，術語“異雙功能基團”係指連接接頭和抗TNFα蛋白(例如抗體)的化學部分。異雙功能基團的特徵在於在化學部分的任一端處具有不同的反應基團。
術語“藥物抗體比率”或“DAR”係指與A(例如，抗體)連接的SM(例如，衍生自小分子糖皮質激素受體激動劑的基團，例如糖皮質類固醇)的數量。因此，在具有通式(SM-L-Q)n-A的免疫軛合物中，DAR由每抗體藥物軛合物的藥物載荷限定，例如“n”。
當提及具有表示個體免疫軛合物的式(SM-L-Q)n-A的化合物時，術語“化合物DAR”係指與個體A連接的SM的數量(例如，為1至10的整數的藥物載荷或n)。
當提及具有表示免疫軛合物群體的式(SM-L-Q)n-A的化合物時，術語“群體DAR”係指與A連接的SM的平均數量(例如，為1至10+0.5、+0.4、+0.3、+0.2、+0.1的整數或分數的藥物載荷或n)。
術語“受試者”係指人、非人靈長類動物等，它們係特定治療的接受者。典型地，提及人受試者時術語“受試者”和“患者”在本文可互換使用。
術語“藥物配製品”係指處於允許活性成分的生物活性有效的形式並且不含有對將給予該配製品的受試者具有不可接受毒性的另外組分的製劑。該配製品可以是無菌的。
如本文所揭露的免疫軛合物的“有效量”係足以執行明確說明的目的的量。可以關於闡述的目的來確定“有效量”。
術語“治療有效量”係指有效“治療”受試者或哺乳動物中的疾病或病症的免疫軛合物的量。“預防有效量”係指有效實現所希望的預防結果的量。
術語如“治療(treating)”或“治療(treatment)”或“治療(to treat)”或“緩和(alleviating)”或“緩和(to alleviate)”係指治癒、減緩、減輕所診斷的病理病狀或病症的一種或多種症狀和/或減緩或阻止其進展的治療措施(“治療性治療”)。因此，需要治療性治療的那些包括已診斷患有或疑似患有該病症的那些。預防(Prophylactic)或防止(preventative)措施係指防止所靶向的病理病狀或病症的發展的措施(“預防性治療”)。因此，需要預防性治療的那些包括易患該病症的那些和其中有待預防該病症的那些。
II. 用於連接糖皮質激素受體激動劑的蛋白質
本揭露提供了含有與蛋白質(例如抗體)連接的糖皮質激素受體激動劑的免疫軛合物。在一些實施方式中，該抗體係人、人源化、嵌合、或 鼠抗體。在一些實施方式中，蛋白質(例如抗體)可以與細胞表面上的靶標結合並變得內化。
本揭露還提供了含有與抗TNFα蛋白連接的糖皮質激素受體激動劑的免疫軛合物。在某些實施方式中，抗TNFα蛋白係抗體。在某些實施方式中，抗TNFα蛋白係與TNFα(例如可溶性TNFα和/或膜結合TNFα)結合的抗體。在某些實施方式中，抗TNFα蛋白係可溶性TNF受體蛋白，例如與重鏈恒定融合的可溶性TNF受體蛋白。在一些實施方式中，抗TNFα蛋白，例如抗TNFα抗體，與細胞表面上的TNFα結合並變得內化。例如，藉由引用併入本文的美國專利申請公佈號2014/0294813揭露了在與細胞表面人TNFα結合後表現出細胞內化的抗TNFα蛋白。
在某些實施方式中，該抗體與人和/或小鼠TNFα結合。
膜結合人TNFα的全長胺基酸序列係：MSTESMIRDVELAEEALPKKTGGPQGSRRCLFLSLFSFLIVAGATTLFCLLHFGVIGPQREEFPRDLSLISPLAQAVRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRRANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL(SEQ ID NO：1)。可溶性人TNFα含有SEQ ID NO：1的胺基酸77-233。膜結合鼠TNFα的全長胺基酸序列係：MSTESMIRDVELAEEALPQKMGGFQNSRRCLCLSLFSFLLVAGATTLFCLLNFGVIGPQRDEKFPNGLPLISSMAQTLTLRSSSQNSSDKPVAHVVANHQVEEQLEWLSQRANALLANGMDLKDNQLVVPADGLYLVYSQVLFKGQGCPDYVLLTHTVSRFAISYQEKVNLLSAVKSPCPKDTPEGAELKPWY EPIYLGGVFQLEKGDQLSAEVNLPKYLDFAESGQVYFGVIAL(SEQ ID NO：2)。可溶性鼠TNFα含有SEQ ID NO：2的胺基酸80-235。
在一些實施方式中，抗TNFα抗體與人TNFα結合。
在一些實施方式中，抗TNFα抗體與鼠TNFα結合。
在某些實施方式中，抗TNFα抗體具有以下作用中的一種或多種：以1X10-7M或更小的IC50在體外L929測定中中和人TNFα細胞毒性；阻斷TNFα與p55和p75細胞表面受體的相互作用；和/或在補體存在下體外裂解表面表現TNF的細胞。
在某些實施方式中，抗TNFα抗體不與TNF-β結合。
抗TNFα抗體包括，例如，阿達木單抗，其係重組人抗體。對應於阿達木單抗的CDR和可變區的胺基酸序列描述於美國專利案號6,258,562中，參考抗體D2E7，即SEQ ID No：1至8。
國際非專利名稱(INN)阿達木單抗在WHO INN列表網站上提供：2000年，清單44(WHO Drug Information[WHO藥物資訊](2000)第14(3)卷)。
在某些實施方式中，抗TNFα抗體包含阿達木單抗的序列，例如互補決定區(CDR)、可變重結構域(VH)、和/或可變輕結構域(VL)。示例性序列提供於表1中。
在某些實施方式中，抗TNFα抗體包含SEQ ID NO：3和4的CDR。在一些實施方式中，該等CDR包含SEQ ID NO：7或8、9、10或11、12、13、和14。在某些實施方式中，抗TNFα抗體包含SEQ ID NO：3的重鏈和/或SEQ ID NO：4的輕鏈。
本揭露進一步包括與本文所示的抗TNFα抗體基本上同源的變體和等效物。該等可以含有，例如，保守取代突變，即，一個或多個胺基酸被相似的胺基酸取代。例如，保守取代係指一種胺基酸被相同通用分類內的 另一種胺基酸取代，例如像，一種酸性胺基酸被另一種酸性胺基酸取代、一種鹼性胺基酸被另一種鹼性胺基酸取代或一種中性胺基酸被另一種中性胺基酸取代。保守胺基酸取代的目的在本領域中係熟知的。
本文所述的分離的抗TNFα抗體可以藉由本領域已知的任何適合的方法產生。此類方法的範圍從直接蛋白質合成法至構建編碼分離的多肽序列的DNA序列，並且在適合的轉化宿主中表現那些序列。在一些實施方式中，藉由分離或合成編碼感興趣的野生型蛋白質的DNA序列，使用重組技術構建DNA序列。視需要，可以藉由位點特異性誘變誘變該序列以提供其功能類似物。參見，例如，Zoeller等人，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA[美國科學院院報]81：5662-5066(1984)和美國專利案號4,588,585。
在一些實施方式中，編碼感興趣的抗體的DNA序列將使用寡核苷酸合成儀藉由化學合成來構建。可以基於所希望多肽的胺基酸序列並且選擇在宿主細胞(其中將產生感興趣的重組多肽)中偏愛的那些密碼子來設計此類寡核苷酸。標準方法可以被應用於合成編碼感興趣的分離多肽的分離多核苷酸序列。
在某些實施方式中，重組表現載體用於擴增和表現編碼抗TNFα抗體的DNA。可以採用多種多樣的表現宿主/載體組合。對於真核宿主有用的表現載體包括例如，包含來自SV40、牛乳頭瘤病毒、腺病毒以及巨細胞病毒的表現控制序列的載體。對於細菌宿主有用的表現載體包括已知的細菌質粒，如來自大腸桿菌的質粒(包括pCR 1、pBR322、pMB9及其衍生物)、廣宿主範圍質粒(如M13)和絲狀單鏈DNA噬菌體。
用於表現抗TNFα抗體的適合宿主細胞包括在適當啟動子控制下的原核生物、酵母、昆蟲或高等真核細胞。原核生物包括革蘭氏(gram)陰性或革蘭氏陽性生物體，例如大腸桿菌或桿菌。高等真核細胞包括哺乳 動物起源的已建立的細胞系。還可以採用無細胞翻譯系統。用於與細菌、真菌、酵母、和哺乳動物細胞宿主一起使用的適當選殖和表現載體由Pouwels等人(Cloning Vectors：A Laboratory Manual[克隆載體：實驗室手冊]，Elsevier[愛思唯爾出版社]，紐約，1985)描述。關於蛋白質產生(包括抗體產生)的方法的另外資訊可以在例如美國專利公佈號2008/0187954、美國專利案號6,413,746和6,660,501、以及國際專利公佈號WO 04009823中找到。
III. 含有糖皮質激素受體激動劑的免疫軛合物
還提供了含有糖皮質激素受體激動劑的免疫軛合物。在一些實施方式中，免疫軛合物與Fcγ受體結合。在一些實施方式中，免疫軛合物在GRE跨膜TNFα報告子測定中具有活性(如本文所用，“GRE跨膜TNFα報告子測定”係指下文實例7中使用的測定法)。在一些實施方式中，與單獨的免疫軛合物中的蛋白質(例如抗體)相比，免疫軛合物顯示降低的免疫原性(降低的抗藥物免疫應答(ADA))。
在一個實施方式中，本文揭露了一種具有式I-a的化合物：(SM-L-Q)n-A I-a，其中：A係抗腫瘤壞死因子(TNF)α抗體、抗TNFα單株抗體、或阿達木單抗；L係接頭；Q係異雙功能基團；或Q不存在；n係1-10；並且SM係具有下式中的任一個的糖皮質類固醇的一價基團：(1)式II-a： (2)式II-b： (3)式II-c： (4)式II-d：
在另一個實施方式中，本文揭露了一種具有式I-a的化合物，其中SM係具有式II-a、II-b、II-c、或II-d中的任一個的糖皮質類固醇的一價基團，其中L係包含二肽或三肽的可切割接頭，Q係異雙功能基團或Q不存在並且n係1-10。具體地，L包含選自下組的二肽或三肽，該組由以下各項組成：丙胺酸-丙胺酸(Ala-Ala)、甘胺酸-麩胺酸(Gly-Glu)、麩胺酸-丙胺酸-丙胺酸(Glu-Ala-Ala)、和甘胺酸-賴胺酸(Gly-Lys)。
在另一個實施方式中，本文揭露了一種具有式I-a的化合物，其中SM係具有式II-a、II-b、II-c、和II-d中的任一個的糖皮質類固醇的一價基團，其中Q係由以下表示的異雙功能基團： 其中m係0或1。
在另一個實施方式中，m係0，並且Q由以下表示：
在另一個實施方式中，m係1，並且Q由以下表示：
在另一個實施方式中，本文揭露了一種具有式I-a的化合物，其中SM係具有式II-a、II-b、II-c、和II-d中的任一個的糖皮質類固醇的一價基團，其中-L-Q-係表2的化學結構中的任一個：
在另一個實施方式中，本文揭露了一種具有式I-a的化合物，例如具有式I-a的化合物其中SM係具有式II-a、II-b、II-c、和II-d中的任一個的糖皮質類固醇的一價基團，其中n係2-8。在另一個實施方式中，n係1-5。在另一個實施方式中，n係2-5。在另一個實施方式中，n係1。在另一個實施方式中，n係2。在另一個實施方式中，n係3。在另一個實施方式中，n係4。在另一個實施方式中，n係5。在另一個實施方式中，n係6。在另一個實施方式中，n係7。在另一個實施方式中，n係8。
在另一個實施方式中，本文揭露了一種具有式I-a的化合物，例如具有式I-a的化合物，其中SM係具有式II-a、II-b、II-c、和II-d中的任一個的糖皮質類固醇的一價基團，其中A係抗體。
在另一個實施方式中，本文揭露了一種具有式I-a的化合物，例如具有式I-a的化合物，其中SM係具有式II-a、II-b、II-c、和II-d中的任一個的糖皮質類固醇的一價基團，其中該抗體係鼠、嵌合、人源化、或人抗體。
在另一個實施方式中，本文揭露了一種具有式I-a的化合物，例如具有式I-a的化合物，其中SM係具有式II-a、II-b、II-c、和II-d中的任一個的糖皮質類固醇的一價基團，其中A競爭性地抑制選自下組的抗體與TNFα的結合，該組由以下各項組成：阿達木單抗、英夫利昔單抗、賽妥珠單抗、和戈利木單抗。
在另一個實施方式中，本文揭露了一種具有式I-a的化合物，例如具有式I-a的化合物，其中SM係具有式II-a、II-b、II-c、和II-d中的任一個的糖皮質類固醇的一價基團，其中A與選自下組的抗體結合相同的TNFα表位，該組由以下各項組成：阿達木單抗、英夫利昔單抗、賽妥珠單抗、阿非莫單抗、奈瑞莫單抗、ozoralizumab、普拉庫魯單抗、和戈利木單抗。
在另一個實施方式中，本文揭露了一種具有式I-a的化合物，例如具有式I-a的化合物，其中SM係具有式II-a、II-b、II-c、和II-d中的任一個的糖皮質類固醇的一價基團，其中A分別包含SEQ ID NO：7或8、SEQ ID NO：9、和SEQ ID NO：10或11的可變重鏈CDR1、CDR2、和CDR3序列，並且分別包含SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、和SEQ ID NO：14的可變輕鏈CDR1、CDR2、和CDR3序列。
在另一個實施方式中，本文揭露了一種具有式I-a的化合物，例如具有式I-a的化合物，其中SM係具有式II-a、II-b、II-c、和II-d中的任一個的糖皮質類固醇的一價基團，其中A不與TNFβ結合
在另一個實施方式中，本文揭露了一種具有式I-a的化合物，例如具有式I-a的化合物，其中SM係具有式II-a、II-b、II-c、和II-d中的任一個的糖皮質類固醇的一價基團，其中A與TNFβ結合。
在另一個實施方式中，本文揭露了一種具有式I-a的化合物，例如具有式I-a的化合物，其中SM係具有式II-a、II-b、II-c、和II-d中的任一個 的糖皮質類固醇的一價基團，其中A阻斷TNFα與p55和p75細胞表面受體的相互作用。
在另一個實施方式中，本文揭露了一種具有式I-a的化合物，例如具有式I-a的化合物，其中SM係具有式II-a、II-b、II-c、和II-d中的任一個的糖皮質類固醇的一價基團，其中A在補體存在下體外裂解表面表現TNF的細胞。
在另一個實施方式中，本文揭露了一種具有式I-a的化合物，例如具有式I-a的化合物，其中SM係具有式II-a、II-b、II-c、和II-d中的任一個的糖皮質類固醇的一價基團，其中A係依那西普(etanercept)。
在另一個實施方式中，本文揭露了一種具有式I-a的化合物，例如具有式I-a的化合物，其中SM係具有式II-a、II-b、II-c、和II-d中的任一個的糖皮質類固醇的一價基團，其中A係阿達木單抗。
在另一個實施方式中，本文揭露了一種具有式I-a的化合物，該式係表3的化學結構中的任一個： 其中n係1-5並且A係阿達木單抗。
在另一個實施方式中，本文揭露了一種根據下式的抗體藥物軛合物： 其中A係阿達木單抗並且n係4。如下文實例7中所證明的，該ADC(即，下文ADC4)證明了體外活性、血漿中的穩定性、和最小的聚集。
IV. 製備免疫軛合物和合成中間體的方法
本揭露的各種免疫軛合物的通用合成涉及使具有下式III-a、III-b、III-c、或III-d中的任一個的NH2-官能化小分子(SM)與接頭部分反應並且官能化所得化合物以得到溴乙醯胺-官能化中間體。然後使溴乙醯胺-官能化中間體與HS-A反應，其中HS-A係抗體(例如阿達木單抗)，該抗體具有有限數量的還原的鏈間二硫鍵。
(1)式III-a： (2)式III-b： (3)式III-c： (4)式III-d：
在另一個實施方式中，本文揭露了一種製備具有式IV-a的化合物的方法： 其中：A係阿達木單抗；L係接頭；n係1-10；並且SM係具有式III-a-IIId中的任一個的糖皮質類固醇的基團；該方法包括： a)用抗腫瘤壞死因子(TNF)α蛋白或蛋白質軛合具有式V的化合物： ；並且b)分離具有式IV-a的化合物。
在一些實施方式中，所揭露的方法進一步包括純化具有式IV-a的化合物。在某些實施方式中，使用陰離子交換層析法(AEC)，其(由於在一些實施方式中接頭的肽部分上的帶電部分和/或在一些實施方式中SM上的磷酸基團)可以提供不同DAR物質的有效分離。
在一些實施方式中，所揭露的方法比依賴於基於標準馬來醯亞胺的接頭化學的方法需要更少的合成步驟。具體地，依賴於基於標準馬來醯亞胺的接頭化學的方法可能需要隨後的琥珀醯亞胺開環水解步驟，該步驟在純化適當的DAR物質之後進行。因此，在某些實施方式中，所揭露的方法相對於基於標準馬來醯亞胺的接頭化學顯著縮短了軛合方案。
在另一個實施方式中，本文揭露了一種製備具有式VI-a的化合物的方法： 其中：A係阿達木單抗；並且n係1-10，該方法包括： a)用部分還原的阿達木單抗軛合具有式VII-a的化合物： ；並且b)例如藉由層析法分離具有式VI-a的化合物。
在另一個實施方式中，本文揭露了一種製備具有式IV-a或式VI-a的化合物的方法，其中n係1-7。在另一個實施方式中，n係1-5。在另一個實施方式中，n係2-4。在另一個實施方式中，n係1。在另一個實施方式中，n係2。在另一個實施方式中，n係3。在另一個實施方式中，n係4。在另一個實施方式中，n係5。在另一個實施方式中，n係6。在另一個實施方式中，n係7。在另一個實施方式中，n係8。
在另一個實施方式中，本文揭露了一種具有式IV-a或VI-a的化合物，其中：A係阿達木單抗；並且n係1-10。
在另一個實施方式中，本文揭露了一種具有式IV-a或VI-a的化合物，其中n係1-7。在另一個實施方式中，n係1-5。在另一個實施方式中，n係2-4。在另一個實施方式中，n係1。在另一個實施方式中，n係2。在另一個實施方式中，n係3。在另一個實施方式中，n係4。在另一個實施方式中，n係5。在另一個實施方式中，n係6。在另一個實施方式中，n係7。在另一個實施方式中，n係8。
本文還提供了可用於製備免疫軛合物的合成中間體。
在一個實施方式中，本文揭露的合成中間體係具有式V或VII-a中的任一個的化合物。
VI. 使用方法和藥物組成物
本文提供了可以在體外或體內使用的具有式I-a(例如，具有表3中所示的式)的軛合物。因此，還提供了組成物(例如用於某些體內用途的藥物組成物)，該組成物包含在生理學上可接受的載體、賦形劑或穩定劑中具有所希望純度的軛合物或糖皮質激素受體激動劑(Remington’s Pharmaceutical Sciences[雷明頓製藥科學](1990)Mack Publishing Co.,Easton,PA[賓夕法尼亞州伊斯頓的麥克出版公司])。可接受的載體、賦形劑、或穩定劑在所採用劑量和濃度下對接受者無毒。
用於體內給予的組成物(例如藥物組成物)可以是無菌的，這可以由藉由例如無菌過濾膜過濾來完成。用於體內給予的組成物(例如藥物組成物)可以包含防腐劑。
抗體藥物軛合物和/或包含本文所述抗體藥物軛合物的藥物組成物可以用於裂解表現表面TNFα的細胞(體外或體內)和/或用於治療特徵在於TNFα增加(例如滑液中TNFα增加)的疾病或病症。在一些實施方式中，抗體藥物軛合物和/或組成物可用於抑制細胞介素釋放(體外或體內)和/或用於治療自身免疫疾病或炎性疾病。在一些實施方式中，抗體藥物軛合物和/或組成物用於治療克羅恩氏病(例如，涉及迴腸和/或升結腸的中度至重度活動性克羅恩氏病和/或維持涉及迴腸和/或升結腸的中度至重度活動性克羅恩氏病的臨床緩解長達3個月)。在一些實施方式中，抗體藥物軛合物和/或組成物用於治療潰瘍性結腸炎(例如，用於誘導患有活動性、中度至重度潰瘍性結腸炎的患者的緩解)。在一些實施方式中，抗體藥物軛合物和/或組成物用於治療類風濕性關節炎(RA)。在一些實施方式中，抗體藥 物軛合物和/或組成物用於治療幼年特發性關節炎(JA)。在一些實施方式中，抗體藥物軛合物和/或組成物用於治療牛皮癬關節炎(PsA)。在一些實施方式中，抗體藥物軛合物和/或組成物用於治療脊椎關節病，如關節黏連性脊椎炎(AS)或軸性脊柱關節炎(axSpA)。在一些實施方式中，抗體藥物軛合物和/或組成物用於治療成人克羅恩氏病(CD)。在一些實施方式中，抗體藥物軛合物和/或組成物用於治療小兒克羅恩氏病。在一些實施方式中，抗體藥物軛合物和/或組成物用於治療潰瘍性結腸炎(UC)在一些實施方式中，抗體藥物軛合物和/或組成物用於治療斑塊狀牛皮癬(Ps)。在一些實施方式中，抗體藥物軛合物和/或組成物用於治療化膿性汗腺炎(HS)。在一些實施方式中，抗體藥物軛合物和/或組成物用於治療葡萄膜炎。在一些實施方式中，抗體藥物軛合物和/或組成物用於治療白塞氏病。在一些實施方式中，抗體藥物軛合物和/或組成物用於治療牛皮癬，包括斑塊狀牛皮癬。一些實施方式包括使用藥物軛合物和/或藥物組成物來製備用於治療本文所述疾病或病症的藥物。
一些實施方式包括將糖皮質激素受體激動劑遞送至表現TNFα的細胞之方法。此類方法可以包括使表現TNFα的細胞與如本文所述抗體藥物軛合物接觸的步驟。一些實施方式包括將糖皮質激素受體激動劑遞送至表現TNFα的細胞之體外方法。
還提供了確定抗體藥物軛合物的抗炎活性之方法。此類方法可以包括使表現TNFα的細胞與如本文所述抗體藥物軛合物接觸的步驟。一些實施方式包括使表現TNFα的細胞與如本文所述的抗體藥物軛合物接觸，並確定如與對照細胞相比的從該細胞釋放促炎細胞介素的減少。一些實施方式包括一種確定抗體藥物軛合物的抗炎活性的體外方法。
一些實施方式包括篩選方法(例如體外方法)，該等方法包括使細胞(例如，表現TNFα的細胞)直接或間接地與抗體藥物軛合物接觸並且確定該等抗體藥物軛合物是否調節該等細胞的活性或功能，如例如藉由以下各項的變化來反映：細胞形態或活力、標記物的表現、分化或去分化、細胞呼吸、線粒體活性、膜完整性、成熟、增殖、活力、細胞凋亡或細胞死亡。直接相互作用的一個實例係物理相互作用，而間接相互作用包括例如組成物對中間分子的作用，而這又作用於參比實體(例如，細胞或細胞培養物)。
VII.製品製造
本揭露還包括包含一個或多個容器的藥物包裝和套組，其中容器可以包含一個或多個劑量的如本文所述的抗體藥物軛合物或組成物。在某些實施方式中，該包裝或套組含有單位劑量，這意指預定量的組成物或抗體藥物軛合物，具有或不具有一種或多種另外的試劑。
該套組可以包含一個或多個容器以及標籤或包裝插入物，該包裝插入物位於該一個或多個容器中、上或與其相關聯，指示封閉的組成物用於治療選擇的疾病病狀。適合的容器包括例如瓶、小瓶、注射器等。該等容器可以由各種材料如玻璃或塑膠形成。該一個或多個容器可以包含無菌存取口，例如，該容器可以是靜脈輸液袋或具有可以由皮下注射針刺穿的塞子的小瓶。
在一些實施方式中，該套組可以含有藉由其將該抗體和任何視需要的組分給予患者的構件，例如，一個或多個針或注射器(預填充的或空的)、滴眼管、移液管、或其他此類裝置，由該裝置可以將配製品注射或引入到受試者中或施加到身體的患病區域。本揭露的套組還將典型地包括用 於容納小瓶等，以及緊密封閉的其他組分的構件以供商業銷售，例如像吹塑的塑膠容器，在其中放置並且保持所希望的小瓶和其他裝置。
實例
應理解，本文所描述的實例和實施方式僅是出於說明的目的，並且根據其的各種修改或變化將建議給熟悉該項技術者並且包括在本揭露的精神和範圍內。
起始材料係可商購的、可以藉由本文所述的程序、藉由文獻程序、或藉由在有機化學領域中技術人員熟知的程序來製備。給出的試劑/反應劑名稱係如在商業瓶上命名的或如由IUPAC慣例、CambridgeSoft® ChemDraw Ultra 12.0、CambridgeSoft® Chemistry E-Notebook 11、或AutoNom 2000生成的。應理解，本文所描述的實例和實施方式僅是出於說明的目的，並且根據其的各種修改或變化將建議給熟悉該項技術者並且包括在本揭露的精神和範圍內。
化合物合成與表徵的分析方法
分析數據包括在以下程序、通用程序的說明、或實例的表中。除非另有說明，否則所有1H和13C NMR數據均在Varian Mercury Plus 400MHz或Bruker AVIII 300MHz儀器上收集；化學位移以百萬分率(ppm)表示。HPLC分析數據在實驗中詳述或參考LC/MS和HPLC條件的表，使用表4中提供的方法。
以下實例中使用的縮寫詞係：
實例1：(2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10S,11aR,12aS,12bS)-10-(4-(3-胺基苄基)苯基)-2,6b-二氟-7-羥基-8b-(2-羥基乙醯基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氫-4H-萘并[2’,1’：4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧呃(dioxol)-4-酮的合成
步驟1：4-(溴甲基)苯甲醛的合成
在1小時內向4-(溴甲基)苄腈(20g，102mmol)於甲苯(400mL)中的0℃溶液中滴加二異丁基氫化鋁(153mL，153mmol，1M於甲苯中)。如上所述設置兩個另外的小瓶。合併所有三個反應混合物。向混合物中加入10%含水HCl(1.5L)。用DCM(3 X 500mL)萃取該混合物。用Na2SO4乾燥有機層，將其過濾並且在減壓下濃縮。將殘餘物藉由矽膠柱層析法(用PE：EtOAc=10：1洗脫)純化，以獲得為白色固體的標題化合物(50g，產率82%)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ 10.02(s,1H),7.91-7.82(m,2H),7.56(d,J=7.9Hz,2H),4.55-4.45(m,2H)。
步驟2：3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜硼雜環戊烷-2-基)苯胺的合成
向3-溴苯胺(40g，233mmol)於1,4-二(480mL)中的溶液中加入4,4,4’,4’,5,5,5’,5’-四甲基-2,2’-雙(1,3,2-二氧雜硼雜環戊烷(dioxaborolane))(94g，372mmol)、乙酸鉀(45.6g，465mmol)、2-二環己基膦基-2’,4’,6’-三異丙基-1,1’-聯苯(8.07g，13.95mmol)、和三(二亞苄基丙酮)二鈀(0)(8.52g，9.30mmol)。在氮氣下將所得混合物在80℃下加熱4小時。如上所述設置一個另外的小瓶。合併兩個反應混合物並濃縮，並且將殘餘物藉由矽膠柱層析法(用PE：EtOAc=10：1洗脫)純化，以獲得為淺黃色固體的標題化合物(60g，產率55.4%)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ 7.23-7.13(m,3H),6.80(d,J=7.5Hz,1H),3.82-3.38(m,2H),1.34(s,12H)。
步驟3：(3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜硼雜環戊烷-2-基)苯基)胺基甲酸三級丁酯的合成
在100℃下將3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜硼雜環戊烷-2-基)苯胺(實例1，步驟2)(30g，137mmol)和二碳酸二三級丁酯(38.9g，178mmol)在甲苯(600mL)中混合24小時。如上所述設置另一個小瓶。合併兩個反應混合物並蒸發混合物，將其溶於EtOAc(1.5L)中，用0.1N HCl(3 X 2L)和鹽水(3L)洗滌，用Na2SO4乾燥，過濾並在減壓下濃縮，以得到為紅色固體的標題化合物(50g，產率57%)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ 7.63(br m,2H),7.48(d,J=7.1Hz,1H),7.37-7.28(m,1H),1.52(s,9H),1.34(s,12H)。
步驟4：(3-(4-甲醯基苄基)苯基)胺基甲酸三級丁酯的合成
將4-(溴甲基)苯甲醛(實例1，步驟1)(24.94g，125mmol)、1,1’-雙(二苯基膦)二茂鐵二氯化鈀(II)DCM錯合物(13.75g，18.80mmol)、(3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜硼雜環戊烷-2-基)苯基)胺基甲酸三級丁酯(來自實例1，步驟3)(20g，62.7mmol)和碳酸鉀(43.3g，313mmol)於四氫呋喃(400mL)中的混合物加熱至80℃持續12小時。如上所述設置另一個小瓶。合併兩個反應混合物並用水(500mL)稀釋。將含水混合物用EtOAc(3 X 500mL)萃取。合併有機層並用Na2SO4乾燥，將其過濾並且在減壓下濃縮。將殘餘物藉由矽膠柱層析法(用PE：EtOAc=10：1洗脫)純化，以獲得為白色固體的標題化合物(15g，產率38.4%)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ 9.95(s,1H),7.78(d,J=7.9Hz,2H),7.33(d,J=7.9Hz,2H), 7.27-7.13(m,3H),6.82(d,J=7.1Hz,1H),6.47(br.s.,1H),4.00(s,2H),1.48(s,9H)。
步驟5：(6S,8S,9R,10S,11S,13S,14S,16R,17S)-6,9-二氟-11,16,17-三羥基-17-(2-羥基乙醯基)-10,13-二甲基-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十二氫-3H-環戊二烯并[a]菲-3-酮的合成
將(2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-2,6b-二氟-7-羥基-8b-(2-羥基乙醯基)-6a,8a,10,10-四甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氫-4H-萘并[2’,1’：4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧呃-4-酮(20g，44.2mmol)懸浮於40%含水HBF4(440mL)中，並將混合物在25℃下攪拌48小時。在反應完成後，加入2L水並藉由過濾收集固體。用水(1L)並且然後用MeOH(200mL)洗滌該固體，以得到為白色固體的標題化合物(11g，產率60.3%)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 7.25(d,J=10.1Hz,1H),6.28(d,J=10.1Hz,1H),6.10(s,1H),5.73-5.50(m,1H),5.39(br.s.,1H),4.85-4.60(m,2H),4.50(d,J=19.4Hz,1H),4.20-4.04(m,2H),2.46-2.06(m,6H),1.87-1.75(m,1H),1.56-1.30(m,6H),0.83(s,3H)。
步驟6：(2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-(3-胺基苄基)苯基)-2,6b-二氟-7-羥基-8b-(2-羥基乙醯基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氫-4H-萘并[2’,1’：4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧呃-4-酮的合成。
將(6S,8S,9R,10S,11S,13S,14S,16R,17S)-6,9-二氟-11,16,17-三羥基-17-(2-羥基乙醯基)-10,13-二甲基-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十二氫-3H-環戊二烯并[a]菲-3-酮(實例1，步驟5)(4.4g，10.67mmol)和MgSO4(6.42g，53.3mmol)於MeCN(100mL)中的懸浮液在20℃下攪拌1小時一批次加入(3-(4-甲醯基苄基)苯基)胺基甲酸三級丁酯(實例1，步驟4)(3.65g，11.74mmol)於MeCN(100mL)中的溶液。滴加三氟甲磺酸(9.01mL，53.3mmol)，同時使用冰浴保持內部溫度低於25℃。在添加後，將混合物在20℃下攪拌2小時。如上所述設置三個另外的小瓶。合併所有四個反應混合物並濃縮，並且將殘餘物藉由製備型HPLC純化，以得到為黃色固體的標題化合物(4.5g，產率14.2%)。LCMS(方法a，表4)Rt=2.65min；MS m/z=606.2(M+H)+；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 7.44-7.17(m,5H),6.89(t,J=7.7Hz,1H),6.44-6.25(m,4H),6.13(br.s.,1H),5.79-5.52(m,2H),5.44(s,1H),5.17-4.89(m,3H),4.51(d,J=19.4Hz,1H),4.25-4.05(m,2H),3.73(s,2H),3.17(br.s.,1H),2.75-2.55(m,1H),2.36-1.97(m,3H),1.76-1.64(m,3H),1.59-1.39(m,4H),0.94-0.78(m,3H)。製備型HPLC方法：儀器：Gilson 281半製備型HPLC系統；流動相：A：甲酸/H2O=0.01% v/v；B：MeCN；柱：Luna C18 150*25 5微米；流速：25mL/min；監測波長：220和254nm。
實例2：(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-(3-胺基苄基)苯基)-7-羥基-8b-(2-羥基乙醯基)-6a,8a-二甲基- 1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氫-4H-萘并[2’,1’：4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧呃-4-酮的合成。
使用(8S,9S,10R,11S,13S,14S,16R,17S)-11,16,17-三羥基-17-(2-羥基乙醯基)-10,13-二甲基-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十二氫-3H-環戊二烯并[a]菲-3-酮以與實例1類似的程序合成實例2。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 7.36(d,J=7.9Hz,2H),7.31(d,J=10.1Hz,1H),7.20(d,J=7.9Hz,2H),6.89(t,J=7.9Hz,1H),6.39-6.28(m,3H),6.16(dd,J=1.5,9.9Hz,1H),5.93(s,1H),5.39(s,1H),5.08(t,J=5.7Hz,1H),4.98-4.87(m,3H),4.78(d,J=3.1Hz,1H),4.49(dd,J=6.2,19.4Hz,1H),4.29(br.s.,1H),4.17(dd,J=5.5,19.6Hz,1H),3.74(s,2H),2.61-2.53(m,1H),2.36-2.26(m,1H),2.11(d,J=11.0Hz,1H),2.07(s,1H),2.02(d,J=12.8Hz,1H),1.83-1.54(m,5H),1.39(s,3H),1.16-0.96(m,2H),0.85(s,3H)。LCMS(方法a，表4)Rt=2.365min；m/z=570.2(M+H)+。
實例3：(6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-(3-胺基苄基)苯基)-6b-氟-7-羥基-8b-(2-羥基乙醯基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氫-4H-萘并[2’,1’：4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧呃-4-酮的合成。
使用(8S,9R,10S,11S,13S,14S,16R,17S)-9-氟-11,16,17-三羥基-17-(2-羥基乙醯基)-10,13-二甲基-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十二氫-3H-環戊二烯并[a]菲-3-酮以與實例1類似的程序合成實例3。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 7.37-7.26(m,3H),7.21(d,J=7.9Hz,2H),6.89(t,J=7.7Hz,1H),6.43-6.30(m,3H),6.23(d,J=10.1Hz,1H),6.04(s,1H),5.75(s,1H),5.44(s,2H),5.09(t,J=5.7Hz,1H),4.93(br.s.,3H),4.50(dd,J=6.2,19.4Hz,1H),4.28-4.09(m,2H),3.74(s,2H),2.73-2.54(m,2H),2.35(d,J=13.2Hz,1H),2.25-2.12(m,1H),2.05(d,J=15.0Hz,1H),1.92-1.77(m,1H),1.74-1.58(m,3H),1.50(s,3H),1.45-1.30(m,1H),0.87(s,3H)。LCMS(方法a，表4)Rt=2.68min；m/z=588.1(M+H)+
實例4：(S)-4-(2-(2-溴乙醯胺基)乙醯胺基)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羥基-6a,8a-二甲基-4-側氧基-8b-(2-(膦醯氧基)乙醯基)-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氫-1H-萘并[2’,1’：4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧呃-10-基)苄基)苯基)胺基)-5-側氧基戊酸的合成
步驟1：(S)-2-(2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)乙醯胺基)-5-(三級丁氧基)-5-側氧基戊酸的合成。
將2-氯三苯甲基氯樹脂(30g，92mmol)、三乙胺(46.4g，458mmol)和(S)-2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-5-(三級丁氧基)-5-側氧基戊酸(25.5g，60mmol)於乾燥DCM(200mL)中的混合物在20℃下用N2鼓泡8小時。過濾混合物，並且用DCM(2 X 200mL)、MeOH(2 X 200mL)、和DMF(2 X 200mL)洗滌樹脂。向樹脂中加入哌啶：DMF溶液(1：4，400mL)，並將混合物用N2鼓泡8分鐘，並且然後過濾。重複該操作五次，以完全移除Fmoc保護基團。用DMF(5 X 500mL)洗滌樹脂以提供樹脂結合的(S)-2-胺基-5-(三級丁氧基)-5-側氧基戊酸。將2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)乙酸(13.38g，45.0mmol)、N,N-二異丙基乙胺(7.86mL，45mmol)、羥基苯并三唑(6.89g，45mmol)、2-(6-氯-1H-苯并[d][1,2,3]三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基異脲六氟磷酸鹽(V)(18.62g，45.0mmol)於DMF(200mL)中的混合物在20℃下攪拌30min。向該混合物中加入樹脂結合的(S)-2-胺基-5-(三級丁氧基)-5-側氧基戊酸，並將所得混合物在25℃下用N2鼓泡1.5小時。過濾混合物，並且用DMF(4 X 500mL)、和DCM(2 X 500mL)洗滌樹脂。向該混合物中加入1% TFA/DCM(5 X 500mL)並用N2鼓泡5分鐘。過濾混合物，並且將濾液直接加入到飽和的NaHCO3溶液(200mL)中。分離合併的混合物，並且將有機相用飽和檸檬酸水溶液(4 X 400mL)和鹽水(2 X 300mL)洗滌。將最終的有機溶液用Na2SO4(20g)乾燥，過濾，在減壓下濃縮，以提供為淺黃色固體的標題化合物(10g，產率20%)。
1H NMR：(CDCl3,400MHz)δ=7.75(d,J=7.5Hz,2H),7.59(br d,J=7.5Hz,2H),7.41-7.36(m,2H),7.30(t,J=7.0Hz,2H),5.82(br s,1H),4.57(br d,J=4.8Hz,1H),4.38(br d,J=7.5Hz,2H),4.27-4.15(m,1H),4.06-3.83(m,2H),2.50-2.29(m,2H),2.26-2.13(m,1H),2.06-2.02(m,1H),1.43(s,9H)。
步驟2：(S)-4-(2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)乙醯胺基)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羥基-8b-(2-羥基乙醯基)-6a,8a-二甲基-4-側氧基-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氫-1H-萘并[2’,1’：4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧呃-10-基)苄基)苯基)胺基)-5-側氧基戊酸三級丁酯的合成
在25℃下向(S)-2-(2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)乙醯胺基)-5-(三級丁氧基)-5-側氧基戊酸(實例4，步驟1)(424mg，0.878mmol)於DMF(3.5mL)中的溶液中加入(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-(3-胺基苄基)苯基)-7-羥基-8b-(2-羥基乙醯基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氫-4H-萘并[2’,1’：4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧呃-4-酮(實例2)(500mg，0.878mmol)和三乙胺(0.3mL，2.63mmol)。將該溶液冷卻至0℃並且然後加入2,4,6-三丙基-1,3,5,2,4,6-三氧雜三膦2,4,6-三氧化物(1.12g，1.755mmol)。將反應混合物在25℃下攪拌12小時。LCMS顯示反應完成。如上所述設置四個另外的小瓶。合併所有五個反應混合物。藉由反相柱純化混合物，以提供為黃色固體的標題化合物(5g，產率38.4%)。反相柱方法：儀器：Shimadzu LC-8A製備型HPLC；柱：Phenomenex Luna C18 200*40mm*10μm；流動相：A為H2O(0.05% TFA)且B為MeCN；梯度：B在30min內從30%至100%；流速：60mL/min；波長：220和254nm。
LCMS(方法a，表4)Rt=1.34min；m/z 1016.6(M+H-18)+。
步驟3：(S)-4-(2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)乙醯胺基)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((二-三級丁氧基磷醯基)氧基)乙醯基)-7-羥基-6a,8a-二甲基-4-側氧基-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氫-1H-萘并[2’,1’：4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧呃-10-基)苄基)苯基)胺基)-5-側氧基戊酸三級丁酯的和合成。
向(S)-4-(2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)乙醯胺基)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羥基-8b-(2-羥基乙醯基)-6a,8a-二甲基-4-側氧基-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氫-1H-萘并[2’,1’：4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧呃-10-基)苄基)苯基)胺基)-5-側氧基戊酸三級丁酯(實例4，步驟2)(400mg，0.387mmol)於DMF(2.5mL)中的溶液中加入1H-四唑(271mg，3.87mmol)和二三級丁基二乙基亞磷醯胺(1.16g，4.64mmol)。將反應物在室溫下攪拌2.5小時，然後冷卻至0℃。向所得混合物中加入過氧化氫(241mg，2.127mmol)，使其溫熱至室溫並攪拌1小時，此後LCMS顯示反應完成。如上所述設置十一個另外的小瓶。合併所有十二個反應混合物。藉由反相柱純化混合物，以提供為黃色固體的標題化合物(4.4g，產率64.2%)。反相柱方法：儀器：Shimadzu LC-8A製備型HPLC；柱：Phenomenex Luna C18 200*40mm*10μm；流動相：A為H2O且B為MeCN；梯度：B在30min內從50%至100%；流速：60mL/min；波長：220和254nm。
LCMS(方法a，表4)Rt=1.41min；m/z 1226.7(M+H)+。
步驟4：(S)-4-(2-胺基乙醯胺基)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((二-三級丁氧基磷醯基)氧基)乙醯基)-7-羥基-6a,8a-二甲基-4-側氧基-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氫-1H-萘并[2’,1’：4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧呃-10-基)苄基)苯基)胺基)-5-側氧基戊酸三級丁酯的合成。
在25℃下向(S)-4-(2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)乙醯胺基)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((二三級丁氧基磷醯基)氧基)乙醯基)-7-羥基-6a,8a-二甲基-4-側氧基-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氫-1H-萘并[2’,1’：4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧呃-10-基)苄基)苯基)胺基)-5-側氧基戊酸三級丁酯(實例4，步驟3)(1.1g，0.897mmol)於MeCN(6mL)中的溶液中加入哌啶(0.75mL，7.58mmol)。將該反應在室溫下攪拌20分鐘，此後LCMS顯示反應完成。如上所述設置三個另外的小瓶。合併所有四個反應混合物。濃縮混合物，以提供殘餘物，將其在攪拌下用PE(10mL)處理2小時。藉由過濾收集所得固體，並且在減壓下乾燥以提供為黃色固體的標題化合物(3.8g，產率90%)。
LCMS(方法a，表4)Rt=1.16min；m/z 1004.6(M+H)+。
步驟5：(S)-4-(2-(2-溴乙醯胺基)乙醯胺基)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((二-三級丁氧基磷醯基)氧基)乙醯基)-7-羥基-6a,8a-二甲基-4-側氧基- 2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氫-1H-萘并[2’,1’：4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧呃-10-基)苄基)苯基)胺基)-5-側氧基戊酸三級丁酯的合成。
在室溫下向2-溴乙酸(97mg，0.697mmol)於DMF(2.5mL)中的溶液中加入EEDQ(172mg，0.697mmol)。將混合物在室溫下攪拌1小時。加入(S)-4-(2-胺基乙醯胺基)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((二三級丁氧基磷醯基)氧基)乙醯基)-7-羥基-6a,8a-二甲基-4-側氧基-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氫-1H-萘并[2’,1’：4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧呃-10-基)苄基)苯基)胺基)-5-側氧基戊酸三級丁酯(實例4，步驟4)(350mg，0.349mmol)，並且將所得溶液攪拌2.5小時，此後LCMS顯示反應完成。如上所述設置七個另外的小瓶。合併所有八個反應混合物。將反應用DCM(100mL)稀釋，用含水HBr(1M，2 X 80mL)，含水NaHCO3(60mL)、和鹽水(60mL)洗滌。將有機層用Na2SO4乾燥，過濾並且在減壓下濃縮，以提供為黃色油狀物的標題化合物(2g，產率63.7%)。
LCMS(方法a，表4)Rt=1.30min；m/z 1124.2,1125.9(M+H)+。
步驟6：(S)-4-(2-(2-溴乙醯胺基)乙醯胺基)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羥基-6a,8a-二甲基-4-側氧基-8b-(2-(膦醯氧基)乙醯基)-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氫-1H-萘并[2’,1’：4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧呃-10-基)苄基)苯基)胺基)-5-側氧基戊酸的合成
向(S)-4-(2-(2-溴乙醯胺基)乙醯胺基)-5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((二三級丁氧基磷醯基)氧基)乙醯基)-7-羥基-6a,8a-二甲基-4-側氧基-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氫-1H-萘并[2’,1’：4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧呃-10-基)苄基)苯基)胺基)-5-側氧基戊酸三級丁酯(實例4，步驟5)(2g，1.778mmol)於DCM(16mL)中的溶液中加入TFA(8mL，104mmol)並且將所得混合物在室溫下攪拌40分鐘，此後LCMS顯示反應完成。將溶劑在減壓下除去。將所得殘餘物藉由製備型HPLC純化。將流動相直接凍乾，以提供為黃色固體的標題化合物(640mg，產率35.3%)。製備型HPLC方法：儀器：Shimadzu LC-8A製備型HPLC；柱：Phenomenex Luna C18 200*40mm*10μm；流動相：A為H2O(0.09% TFA)且B為MeCN；梯度：B在20min內從30%至40%；流速：60mL/min；波長：220和254nm。
1H NMR：(DMSO-d6,400MHz)δ=9.88(s,1H),8.52(s,1H),8.24(br d,J=8.4Hz,1H),7.46(br d,J=7.9Hz,1H),7.42(s,1H),7.36(br d,J=7.9Hz,2H),7.30(br d,J=9.7Hz,1H),7.23-7.17(m,3H),6.90(br d,J=6.8Hz,1H),6.16(br d,J=10.4Hz,1H),5.93(s,1H),5.47(s,1H),4.96-4.85(m,3H),4.58(br dd,J=7.9,18.7Hz,1H),4.38(br d,J=5.3Hz,1H),4.29(br s,1H),3.93(s,2H),3.89(s,2H),3.80(br s,2H),2.30-2.22(m,2H),2.16-1.91(m,4H),1.85-1.62(m,6H),1.39(s,3H),1.00(br s,2H),0.87(s,3H)。LCMS(方法a，表4)Rt=2.86min；m/z 956.0,958.0(M+H)+。
實例5：2-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-(3-((S)-6-胺基-2-(2-(2-溴乙醯胺基)乙醯胺基)己醯胺基)苄基)苯基)-2,6b-二氟-7-羥基-6a,8a-二甲基-4-側氧基-1,2,4,6a,6b,7,8,8a,11a,12,12a,12b-十二氫-8bH-萘并[2’,1’：4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧呃-8b-基)-2-側氧基乙基磷酸二氫鹽的合成。
步驟1：((S)-5-(2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)乙醯胺基)-6-((3-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-二氟-7-羥基-8b-(2-羥基乙醯基)-6a,8a-二甲基-4-側氧基-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氫-1H-萘并[2’,1’：4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧呃-10-基)苄基)苯基)胺基)-6-側氧基己基)胺基甲酸三級丁酯的合成。
在0℃下向N2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)甘胺醯基)-N6-(三級丁氧基羰基)-L-賴胺酸(5.58g，8.26mmol)於DMF(60mL)中的溶液中加入2,4,6-三丙基-1,3,5,2,4,6-三氧雜三膦2,4,6-三氧化物(10.51g，16.51mmol)和三乙胺(3.45mL，24.77mmol)。將所得混合物在室溫下攪拌1小時，加入(2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-(3-胺基苄基)苯基)-2,6b-二氟-7-羥基-8b-(2-羥基乙醯基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氫-4H-萘并[2’,1’：4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧呃-4-酮(實例1，步驟6)(5g，8.26mmol)。將所得混合物在室溫下攪拌5小時，此後LCMS顯示反應完成。如上所述設置六個另外的小瓶。合併所有七個反應混合物。藉由反相柱純化反應，以提供為白色固體的標題 化合物(24g，產率24.62%)。反相柱方法：儀器：Shimadzu LC-8A製備型HPLC；柱：Phenomenex Luna C18 200*40mm*10μm；流動相：A為H2O(0.05% TFA)且B為MeCN；梯度：B在30min內從30%至100%；流速：60mL/min；波長：220和254nm。
LCMS(方法a，表4)Rt=1.29min；m/z 1095.6(M+H-18)+。
步驟2：((S)-5-(2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)乙醯胺基)-6-((3-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((二-三級丁氧基磷醯基)氧基)乙醯基)-2,6b-二氟-7-羥基-6a,8a-二甲基-4-側氧基-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氫-1H-萘并[2’,1’：4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧呃-10-基)苄基)苯基)胺基)-6-側氧基己基)胺基甲酸三級丁酯的合成。
向((S)-5-(2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)乙醯胺基)-6-((3-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-二氟-7-羥基-8b-(2-羥基乙醯基)-6a,8a-二甲基-4-側氧基-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氫-1H-萘并[2’,1’：4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧呃-10-基)苄基)苯基)胺基)-6-側氧基己基)胺基甲酸三級丁酯(實例5，步驟1)(3g，2.69mmol)於DMF(30mL)中的溶液中加入1H-四唑(1.888g，26.9mmol)和二三級丁基二乙基亞磷醯胺(8.06g，32.3mmol)，並且將該反應在室溫下攪拌3.5小時。向該反應中加入過氧化氫(224mg，1.97mmol)，並攪拌0.5小時，此後LCMS顯示反應完成。如上所述設置六個另外的小瓶。合併所有七個反應混合物。藉由反相柱純化反應，以提供為白色固體的標題化合物(10g，純度：78%，產率37.1%)。反相柱方法：儀器：Shimadzu LC-8A製備型HPLC；柱： Phenomenex Luna C18 200*40mm*10μm；流動相：A為H2O且B為MeCN；梯度：B在30min內從50%至100%；流速：60mL/min；波長：220和254nm。
LCMS(方法a，表4)Rt=1.42min；m/z 1305.7(M+H)+。
步驟3：((S)-5-(2-胺基乙醯胺基)-6-((3-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((二-三級丁氧基磷醯基)氧基)乙醯基)-2,6b-二氟-7-羥基-6a,8a-二甲基-4-側氧基-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氫-1H-萘并[2’,1’：4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧呃-10-基)苄基)苯基)胺基)-6-側氧基己基)胺基甲酸三級丁酯的合成。
向((S)-5-(2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)乙醯胺基)-6-((3-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((二三級丁氧基磷醯基)氧基)乙醯基)-2,6b-二氟-7-羥基-6a,8a-二甲基-4-側氧基-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氫-1H-萘并[2’,1’：4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧呃-10-基)苄基)苯基)胺基)-6-側氧基己基)胺基甲酸三級丁酯(實例5，步驟2)(2.5g，1.969mmol)於MeCN(10mL)中的溶液中加入哌啶(2mL，1.969mmol)，並且將該反應在室溫下攪拌1小時，此後LCMS顯示反應完成。如上所述設置三個另外的小瓶。合併所有四個反應混合物。濃縮該反應，以提供粗產物，將其在PE(30mL)中攪拌2小時。藉由過濾收集所得固體，並且在減壓下乾燥以提供為黃色固體的標題化合物(7g，純度：83%，產率70.4%)。
LCMS(方法a，表4)Rt=1.17min；m/z 1083.5(M+H)+。
步驟4：((S)-5-(2-(2-溴乙醯胺基)乙醯胺基)-6-((3-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((二-三級丁氧基磷醯基)氧基)乙醯基)-2,6b-二氟-7-羥基-6a,8a-二甲基-4-側氧基-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氫-1H-萘并[2’,1’：4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧呃-10-基)苄基)苯基)胺基)-6-側氧基己基)胺基甲酸三級丁酯的合成。
向2-溴乙酸(0.929g，6.68mmol)於DMF(35mL)中的溶液中加入2-乙氧基-1-乙氧基羰基-1,2-二氫喹啉(1.653g，6.68mmol)，並且將所得混合物在室溫下攪拌1小時。加入來自實例5，步驟3的產物(3.5g，3.34mmol)，並且將所得混合物在室溫下攪拌2小時。LCMS顯示反應完成。將反應用DCM(100mL)稀釋，用含水HBr(1M，2 X 80mL)，含水NaHCO3(60mL)和鹽水(60mL)洗滌。將有機層用Na2SO4乾燥，過濾並且在減壓下濃縮，以提供為黃色油狀物的標題化合物(2g，產率51.2%)。
LCMS(方法a，表4)Rt=1.32min；m/z 1205.5(M+H)+。
步驟5：2-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-(3-((S)-6-胺基-2-(2-(2-溴乙醯胺基)乙醯胺基)己醯胺基)苄基)苯基)-2,6b-二氟-7-羥基-6a,8a-二甲基-4-側氧基-1,2,4,6a,6b,7,8,8a,11a,12,12a,12b-十二氫-8bH-萘并[2’,1’：4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧呃-8b-基)-2-側氧基乙基磷酸二氫鹽的合成。
向((S)-5-(2-胺基乙醯胺基)-6-((3-(4-((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((二三級丁氧基磷醯基)氧基)乙醯基)-2,6b-二氟-7-羥基-6a,8a-二甲基-4-側氧基-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氫-1H-萘并[2’,1’：4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧呃-10-基)苄基)苯基)胺基)-6-側氧基己基)胺基甲酸三級丁酯(實例5，步驟3)(2g，1.661mmol)於DCM(10mL)中的溶液中加入TFA(5mL，64.9mmol)，並且將該反應在室溫下攪拌40min，此後LCMS顯示反應完成。將溶劑在減壓下除去，並且藉由製備型HPLC純化粗產物。將流動相直接凍乾，以提供為灰白色固體的標題化合物(550mg，純度：96.9%，產率32.3%)。製備型HPLC方法：儀器：Shimadzu LC-8A製備型HPLC；柱：Phenomenex Luna C18 200*40mm*10μm；流動相：A為H2O(0.09% TFA)且B為MeCN；梯度：B在20min內從30%至40%；流速：60mL/min；波長：220和254nm。
1H NMR：(DMSO-d6,400MHz)δ ppm 0.90(s,3 H)1.19-1.41(m,2 H)1.43-1.62(m,7 H)1.64-1.77(m,3 H)1.84(br d,J=14.55Hz,1 H)1.95-2.07(m,1 H)2.18-2.36(m,3 H)2.65-2.78(m,3 H)3.71-3.86(m,3 H)3.89(s,2 H)3.93(s,2 H)4.20(br d,J=9.48Hz,1 H)4.33-4.41(m,1 H)4.59(br dd,J=18.41,8.05Hz,1 H)4.81(br dd,J=18.52,8.60Hz,1 H)4.94(d,J=4.63Hz,1 H)5.50(s,1 H)5.54-5.76(m,1 H)6.13(s,1 H)6.29(dd,J=10.14,1.32Hz,1 H)6.95(d,J=7.72Hz,1 H)7.15-7.28(m,4 H)7.30-7.41(m,3 H)7.51(br d,J=7.94Hz,1 H)7.72(br s,3 H)8.21(br d,J=7.72Hz,1 H)8.54(t,J=5.62Hz,1 H)9.93(br d,J=2.65Hz,1 H)LCMS(方法a，表4)Rt=2.31min。
實例6：(S)-2-((2-(2-溴乙醯胺基)乙基)胺基)-N-((S)-1-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羥基-8b-(2-羥基乙醯基)- 6a,8a-二甲基-4-側氧基-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氫-1H-萘并[2’,1’：4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧呃-10-基)苄基)苯基)胺基)-1-側氧基丙基-2-基)丙醯胺的合成。
實例6的產物由以下合成：將N-(2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)乙基)-N-(三級丁氧基羰基)-L-丙胺醯-L-丙胺酸(以下步驟S1和S2的產物)與實例2的胺基產物偶合，隨後是步驟S4-S6：(1)Fmoc去保護，(2)與2-溴乙酸偶合，和(3)Boc去保護。Fmoc=茀基甲基氧羰基；Boc=三級丁氧羰基。
通用半胱胺酸軛合方案
在pH 6-7.4的PBS緩衝液中製備大約5-20mg/mL的所希望抗體溶液。將選擇的還原劑如TCEP稀釋或溶於溶劑像H2O、DMSO、DMA或DMF中，以得到濃度範圍為1至25mM的溶液。然後藉由加入約2-3.5當量的還原劑、短暫混合，並在0℃-4℃下孵育過夜來部分還原抗體(抗hTNF hIgG1(D2E7)或抗mTNF mIgG2a(8C11；McRae BL等人J Crohns Colitis[克羅恩和結腸炎雜誌]10(1)：69-76(2016))。然後加入pH8-8.5的Tris緩衝液(20- 50mM)，隨後加入於DMSO或DMA中的接頭-藥物(總量小於15%)，並將混合物在室溫下孵育2-3小時。接著藉由純化除去過量的接頭-藥物和有機溶劑。然後藉由SEC、HIC和還原質譜法分析純化的ADC樣品。
ADC分析程序
藉由陰離子交換層析法(AEC)或疏水相互作用層析法(HIC)分析ADC以確定ADC的軛合程度和純度。
AEC.將大約20μg的ADC裝載到配備有4 X 250mm PropacTM WAX-10柱(東曹生物科學(Tosoh Biosciences)，目錄號054999)的Ultimate 3000 Dual LC系統(賽默科技(thermo scientific))上。用100%緩衝液A平衡柱，並在18min內使用線性梯度以1.0mL/min從100%緩衝液A至100%緩衝液B洗脫，其中緩衝液A係20mM MES，pH 6.7，並且緩衝液B係20mM MES，500氯化鈉，pH 6.7。
HIC.將大約20μg的ADC裝載到配備有4.6 X 35mm丁基-NPR柱(東曹生物科學，目錄號14947)的Ultimate 3000 Dual LC系統(賽默科技)上。在100%緩衝液A中平衡柱，並在12min內使用線性梯度以0.8mL/min從100%緩衝液A至100%緩衝液B洗脫，其中緩衝液A係25mM磷酸鈉，1.5M硫酸銨，pH 7.0，並且緩衝液B係25mM磷酸鈉，25%異丙醇，pH 7.0。
SEC.使用配備有7.8 X 300mm TSK-凝膠3000SWXL柱(東曹生物科學，目錄號08541)的Ultimate 3000 Dual LC系統(賽默科技)藉由粒徑篩析SEC分析ADC的尺寸分佈。將大約20μg的ADC裝載到柱上並在17min內以1.0mL/min的流速使用100mM硫酸鈉，100mM磷酸鈉，pH 6.8的等度梯度洗脫。
MS.藉由溫度控制(5℃)CTC自動進樣器將還原樣品(10μL)注入Agilent 6550 QTof LC/MS系統中。在Waters C-4，3.5μm，300Å，2.1 x 50mm i.d.HPLC柱上實現樣品洗脫。流動相係：A：於水中的0.1%甲酸，和B：於MeCN中的0.1%甲酸；流速係0.45mL/min，並且柱室保持在40℃下。
HPLC梯度如表5所示：
實例7：製備與糖皮質類固醇軛合的阿達木單抗以提供抗體藥物軛合物
具有DAR 4.0群體的阿達木單抗BrAc-Gly-Glu-類固醇-PO4 ADC藉由兩步化學方法製備：阿達木單抗的二硫化物還原，隨後與實例4的溴乙醯胺基甘胺酸-麩胺酸類固醇烷基化(軛合)。
用二苯基膦基乙酸(2.9-3.0當量)將100mg濃度為20mg/mL的阿達木單抗在0℃下還原過夜。然後將部分還原的阿達木單抗與於DMSO中的實例4(10當量)在室溫下軛合3小時。首先使用多個NAP 25脫鹽柱將軛合混合物緩衝液交換到20mM Tris緩衝液，50mM NaCl，pH 7.8中。藉由AEC純化脫鹽的ADC溶液，以提供ADC的DAR4組分。AEC層析法：儀器：Akta純化；柱：2X Hitrap Q HP 5mL；流動相：A為20mM Tris緩衝液，pH 7.8； B為20mM Tris緩衝液，1M NaCl，pH 7.8；梯度：B在60min內從0%至25%；流速：5mL/min；波長：280和214nm。
參見圖1，其示出了所得ADC製劑的層析分離，取決於減少鏈間二硫鍵的數量，該ADC係含有附接有兩個藥物接頭分子(“DAR2”峰)、附接有四個藥物接頭分子(“DAR4”峰)的抗體的異質混合物。圖1中使用的AEC條件如下：該柱係PropacTM WAX-10，4 X 250mm(賽默飛世爾科技公司(Thermo Fisher Scientific)，目錄號054999)，並且柱溫度係37℃。波長係280nm，執行時間係18分鐘，注入量係20μg，並且流速係1.0mL/分鐘。流動相A：20mM MES，pH 6.7，流動相B：20mM MES，500mM NaCl，pH 6.7。梯度曲線(表6)： 圖2示出了純化的ADC的解卷積質譜。該ADC具有與每個抗體軛合的4個藥物接頭分子。左邊的峰具有24284.74Da的分子量，這係一個藥物接頭附接到單個輕鏈的結果。右邊的峰具有51513.96Da的分子量，這係一個藥物接頭附接到單個重鏈的結果。表7和8中的ADC根據上述程序製備。
人和小鼠跨膜TNF-α GRE報告子細胞系的產生
為了產生親本細胞系，在37°，5% CO2下以每孔500,000個細胞將K562細胞接種到具有2mL完全生長培養基(RPMI，10%FBS，1%L-穀胺醯胺，1%丙酮酸鈉和1% MEM NEAA)的6孔皿(科斯塔公司(Costar)：3516)上持續24小時。在第二天，將1.5μg pGL4.36[Luc2P/MMTV/Hygro](普洛麥格公司(Promega)：E316)、1.5ug pGl4.75[hRLuc/CMV](普洛麥格公司：E639A)、和3uL PLUS試劑(英傑公司(Invitrogen)：10964-021)稀釋到244μL Opti-MEM(Gibco公司：31985-070)中並在室溫下孵育15分鐘。pGL4.36[luc2P/MMTV/Hygro]載體含有驅動螢光素酶報告基因luc2P響應於幾種核受體如糖皮質激素受體和雄激素受體的活化而轉錄的MMTV LTR(鼠乳腺腫瘤病毒長末端重複序列)。pGL4.75[hRluc/CMV]載體編碼螢光素酶報告基因hRluc(海腎螢光素酶(Renilla reniformis))並且被設計用於高表現和減少異常轉錄。
在孵育後，將稀釋的DNA溶液與1：1 Lipofectamine LTX溶液(英傑公司：94756)(13.2μL+256.8μL Opti-MEM)預孵育，並且在室溫下孵育25分鐘以形成DNA-Lipofectamine LTX複合物。在孵育後，將500μL DNA-Lipofectamine複合物直接加入到含有細胞的孔中。將K562細胞在37℃，5% CO2下轉染24h。在孵育後，用3mL PBS洗滌細胞，並用含有125μg/mL潮黴素B(英傑公司：10687-010)的完全生長培養基選擇兩周。產生“K562 pGL4.36[Luc2P/MMTV/Hygro]_pGL4.75[hRLuc/CMV]”細胞。
為了產生鼠跨膜TNF-α GRE報告子細胞系，在37°，5% CO2下以每孔500,000個細胞將親本細胞K562 pGL4.36[Luc2P/MMTV/Hygro]_pGL4.75[hRLuc/CMV]接種到具有2mL完全生長培養基(RPMI，10%FBS，1%L-穀胺醯胺，1%丙酮酸鈉和1% MEM NEAA)的6孔皿(科斯塔公司：3516)上持續24h。在第二天，將3μg編碼未標記小鼠TNF的mFL_TNFα DNA(傲銳東源公司(OriGene)：MC208048)、和3μL PLUS試劑(英傑公司：10964-021)稀釋到244μL Opti-MEM(Gibco公司：31985-070)中並在室溫下孵育15分鐘。在孵育後，將稀釋的DNA溶液與1：1 Lipofectamine LTX溶液(英傑公司：94756)(13.2μL+256.8μL Opti-MEM)預孵育，並且在室溫下孵育25分鐘以形成DNA-Lipofectamine LTX複合物。在孵育後，將500μL DNA-Lipofectamine複合物直接加入到含有細胞的孔中。將親本K562 pGL4.36[Luc2P/MMTV/Hygro]_pGL4.75[hRLuc/CMV]細胞在37℃，5% CO2下轉染24h。在孵育後，用3mL PBS洗滌細胞，並用含有125μg/mL潮黴素B(英傑公司：10687-010)和250μg/mL G418(Gibco公司：10131-027)的完全生長培養基選擇兩周。產生“K562小鼠FL-TNFα GRE(pGL4.36[luc2P/MMTV/Hygro])”細胞。
為了產生人跨膜TNF-α GRE報告子細胞系，用質粒hTNF δ 1-12 C-Myc pcDNA3.1(-)質粒構建體轉染親本細胞K562 pGL4.36[Luc2P/MMTV/Hygro]_pGL4.75[hRLuc/CMV]。該質粒係編碼tace抗性跨膜TNF的pcDNA 3.1(賽默飛世爾目錄號V79020)(即缺乏胺基酸77-88的SEQ ID NO：1)。(參見Perez C等人，Cell[細胞]63(2)：251-8(1990)討論了tace抗性跨膜TNF。)然後將該等細胞系用於後續實例中描述的TNF-α報告子測定中。
抗TNF-α免疫軛合物在GRE跨膜TNF-α報告子測定中的活性
在50μL測定培養基(RPMI，1% CSFBS，1% L-穀胺醯胺，1%丙酮酸鈉和1% MEAA)中，以每孔50,000個細胞將K562親本GRE(pGL4.36[luc2P/MMTV/Hygro])細胞和K562 mFL-TNF-a或hTNF δ 1-12 GRE(pGL4.36[luc2P/MMTV/Hygro])細胞鋪板到96孔組織培養物處理的白色板(科斯塔公司：3917)上。在測定培養基、類固醇化合物、或單獨培養基中用25μL 3X系列稀釋的鼠或人抗TNF-α抗體藥物軛合物處理細胞，並在37℃，5% CO2下孵育48小時。在孵育48小時後，用75μL Dual-Glo螢光素酶測定系統(Promega-E2920)處理細胞10分鐘，並使用Microbeta(珀金埃爾默公司(PerkinElmer))分析發光。使用四參數曲線擬合分析數據以產生EC50值。將最大活化%標準化為100nM地塞米松。使用鼠TNF-α細胞系的結果在下表9中示出，並且使用人TNF-α細胞系的結果在下表10中示出。在下表9中，A係指8C11。在下表10中，A係指阿達木單抗。如前所述，藉由SEC測定單體百分比(%)(參見ADC分析程序)。
[表9]：抗鼠TNFα抗體藥物軛合物在小鼠跨膜TNFα GRE報告子測定中的體外活性
抗hTNFα免疫軛合物在脂多糖刺激的人PBMC細胞介素釋放測定中的活性
原代人外周血單核細胞(PBMC)購自生物專業公司(Biological Specialty Corporation)(目錄號214-00-10)，在50mL PBS中洗滌，重懸於具有5% DMSO的FBS中，等分並在液氮中冷凍保存直至使用。將PBMC解凍，重懸於補充有2% FBS、和1%青黴素-鏈黴素的RPMI培養基中，並鋪板到細胞測定板(科斯塔公司編號3799)中。然後將細胞在37℃和5% CO2下孵育不同濃度的抗TNF ADC 4小時。然後用100ng/mL LPS刺激細胞過夜。在第二天，將板以1000rpm旋轉5分鐘，並將100μL上清液培養基直接轉移到另外的96孔板中並分析IL-6(MSD，#K151AKB)和IL-1 β(MSD，#K151AGB)濃度。使用非線性回歸將劑量響應數據擬合成S形曲線，並借助GraphPad 5.0(GraphPad軟體公司)計算IC50值。表11中示出的結果表明， 抗TNF ADC在抑制促炎細胞介素IL-6和IL-1β從活化原代免疫細胞中的釋放方面具有強效活性。
抗mTNF-α免疫軛合物在接觸性超敏反應模型中的活性
在急性接觸性超敏反應模型中評估抗TNFα類固醇ADC，藉由應用敏化劑(異硫氰酸螢光素(FITC))使用遲髮型超敏反應(DTH)響應(T細胞驅動)引發急性皮膚炎症。藉由減少耳腫脹的能力來測量抗TNFα類固醇ADC的功效。包括類固醇生物標誌物皮質酮和前膠原1型N-末端前肽(P1NP)作為讀出結果，以分別評估抗TNFα類固醇ADC治療對下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸和骨轉換的推定影響。
耳腫脹
在第0天，將小鼠置於全身麻醉下並將腹部剃毛。使用微量移液器，在腹部上藉由表皮應用400μL FITC溶液(於1：1丙酮：DBP中的1.5%溶液)使小鼠致敏。六天後，在用FITC進行耳攻擊前1小時對小鼠給藥媒劑或治療劑。對於耳攻擊，將小鼠置於全身麻醉下並用施加到右耳上的20μL FITC攻擊。在攻擊後24小時，將小鼠置於全身麻醉下，並藉由卡尺測量其耳厚度。計算受攻擊與未受攻擊的耳之間的差異。在耳攻擊後72小時，以1mpk IP用ACTH注射小鼠，並在ACTH後30min進行末端采血。收集血漿並分析P1NP、皮質酮、游離類固醇、和大分子的水平。
釋放的游離類固醇和內源性皮質酮的定量
在小鼠血漿中製備類固醇的校準曲線，該等小鼠血漿在8個不同濃度水平下具有從0.03nM至0.1μM的最終濃度。在於PBS緩衝液中的70mg/mL牛血清白蛋白溶液中製備範圍為從0.3nM至1μM最終皮質酮濃度的皮質酮校準曲線。向40μL研究血漿樣品或校準標樣中加入160μL具有0.1%甲酸的MeCN溶液。用蒸餾水稀釋上清液，並且注入30μL最終樣品溶液用於LC/MS分析。
釋放的游離類固醇和皮質酮的定量在連接到與以正模式操作的電噴霧電離源連接的Shimadzu AC20 HPLC系統的AB Sciex 5500三重四極質譜儀上進行。將Waters XBridge BEH C18，2.1x30mm，3.5μm柱用於層析法分離。流動相A係於Milli Q HPLC水中的0.1%甲酸，並且流動相B係於MeCN中的0.1%甲酸。從0.6至1.2min施加從2%流動相B至98%流動相B的線性梯度。在0.8mL/min的流速下的總執行時間係2.6min。在700℃的源溫度下以正MRM模式操作質譜儀。
血漿P1NP的定量
基於蛋白質胰蛋白酶消化在LCMS平臺上進行血漿P1NP的定量。藉由加入MeCN/0.1M碳酸氫銨/DTT混合物，部分沈澱並完全還原血漿樣品。收集上清液並藉由加入碘乙酸進行烷基化。藉由胰蛋白酶消化烷基化蛋白質，並藉由LCMS分析所得胰蛋白酶肽。藉由使用摻入到馬血清(非干擾替代基質)中的合成胰蛋白酶肽產生校準曲線。將穩定同位素標記的側翼肽(胰蛋白酶肽的兩個末端上3-6個胺基酸延伸)用作MeCN/DTT蛋白沈澱混合物中添加的內標，以標準化消化效率和LCMS注射兩者。
將Columnex Chromenta BB-C18，2.1x150mm，5μm柱用於層析法分離。流動相A係於Milli Q HPLC水中的0.1%甲酸，並且流動相B係於MeCN中的0.1%甲酸。從0.6至3min施加從2%流動相B至65%流動相B的線 性梯度。在0.45mL/min的流速下的總執行時間係8min。在700℃的源溫度下，以正MRM模式將AB Sciex 4000Q捕集質譜儀用於定量P1NP肽。
結果
結果在下表12中示出：
抗mTNF-α免疫軛合物在膠原誘導的關節炎中的活性
在關節炎的膠原誘導的關節炎(CIA)模型中評估了抗mTNFα類固醇ADC(ADC1)影響疾病的能力。
在該等實驗中，雄性DBA/1J小鼠獲自Jackson實驗室(緬因州巴港(Bar Harbor,ME))。小鼠在6至8周齡時使用。將所有動物在12小時光照/黑暗循環下保持在恒定溫度和濕度下，並隨意餵食齧齒動物食物(麻塞諸塞州弗雷明漢的Lab Diet 5010 PharmaServ公司(Lab Diet 5010 PharmaServ,Framingham,MA)和水。艾伯維(AbbVie)係AAALAC(實驗動物護理評估和認證協會)認可的，並且所有程序均由機構動物護理和使用委員會(IACUC)批準並由主治獸醫監督。監測體重和病狀兩者，並且如果表現出>20%體重減輕，則對動物實施安樂死。
用100μL含有100μg溶於0.1N乙酸中的II型牛膠原(MD生物科學公司)和200μg熱滅活的結核分枝桿菌H37Ra(完全弗氏佐劑，堪薩斯州勞倫斯的Difco公司(Difco,Laurence,KS))的乳液在尾根部處皮內(i.d.) 免疫雄性DBA/J小鼠。用膠原免疫後21天，用1mg於PBS中的酵母聚糖A(密蘇里州聖路易斯的西格瑪公司(Sigma,St.Louis,MO))對小鼠進行強化IP。在強化後，每週3至5次監測小鼠的關節炎。使用Dyer彈簧卡尺(Dyer 310-115)評估後爪的爪腫脹
在第24天與第28天之間，在疾病的第一臨床體征中招募小鼠，並將其分成具有等同關節炎嚴重程度的組。在招募時開始早期治療性治療。
用於0.9%鹽水中的抗mTNF mAb(高劑量)或抗mTNF類固醇ADC(高和低劑量-mpk)腹膜內(i.p.)對動物給藥一次。在給藥後24和72小時，藉由尾部切口收集血液用於抗體暴露。在終末時間點收集爪用於組織病理學檢查。藉由心臟穿刺在終末時間點收集血液用於完全血液計數(Sysmex XT-2000iV)。藉由ANOVA確定統計學顯著性。
結果在圖3中示出，並證明與抗TNFα mAb或單獨的媒劑相比，單劑量的抗TNFα類固醇ADC可以藉由改善爪腫脹約28天表現出延長的作用持續時間。
血漿中的ADC穩定性
雖然已採用水解來增加基於馬來醯亞胺的接頭的體內穩定性，但它通常需要暴露於鹼性pH，這可能導致抗體的改變(例如脫醯胺作用)、異質性增加、產率降低等。(Shen等人，Nature Biotechnology[自然生物技術]30：184-189(2012)(水解馬來醯亞胺避免了藥物的過早釋放和全身暴露於藥物)；Strop等人，Chemistry & Biology[化學和生物學]20(2)：161-167(2013)(類似的研究)；Tumey等人，Bioconjugate Chem[生物共軛化學]25(10)：1871-1880(2014)(使用近端PEG鏈以使得在鹼性條件下能夠進行環水解)；Lyon等人，Nature Biotechnology[自然生物技術]32：1059-1062(2014)(用於促進水解琥珀醯亞胺產生的方法)；Christie等人，J Control Release [控制釋放雜誌]220(PtB)：660-70(2015年12月28日)(使用N-芳基馬來醯亞胺促進琥珀醯亞胺環在鹼性條件下水解)；Dovgan等人，Scientific Reports[科學報告]6：1(2016)(使用2-(馬來醯亞胺基甲基)-1,3-二在溫和鹼性條件下長時間促進環水解)；以及J Pharm Sci[藥物科學雜誌]2013：102(6)1712-1723(天冬醯胺脫醯胺作用依賴於緩衝液類型、pH和溫度)。相比之下，與馬來醯亞胺的多天(在鹼性pH下軛合和隨後的環水解)相比，使用溴乙醯胺的軛合的典型條件在幾小時內完成。此外，在半胱胺酸與溴乙醯胺反應過程中形成的2-巰基乙醯胺對反向邁克爾反應不敏感，並且提供接頭與抗體的穩定附接，如下表13中對ADC4所示。
溶液中的ADC穩定性
為了評估長期穩定性，使生物製劑經受加速應力測試。該測試的方案係在40℃下100mg/mL生物製劑在15mM組胺酸中21天。當ADC4經受該測試時，與看到其聚集增加18%的2018年5月10日公佈的美國專利申請公佈號2018/012600的ADC203相比，聚集體的增加百分比<5%(表14)。這證明了由Gly-Glu接頭與有效載荷的磷酸酯前藥賦予ADC4的改善特性。US2018/0126000的ADC203係： 其中n=4並且A係指抗人TNFα抗體阿達木單抗。
磷酸酯前藥的另外的益處係它能夠使用陰離子交換層析法進行DAR純化。與疏水相互作用層析法相比，這導致改善的峰分離，從而導致DAR純化ADC的更高產率。
在配製品緩衝液中，ADC203的水解琥珀醯亞胺環與閉環形式平衡。閉環形式在食蟹猴體內易受反向邁克爾反應和隨後接頭-藥物損失的影響(圖4)。
在標稱液體儲存條件下，開放構象中的琥珀醯亞胺附接將在5℃下重構閉合構象大於5%並且在6個月後在25℃下大於15%(表15)。
應瞭解，具體實施方式部分而非概述以及摘要部分旨在用於解釋申請專利範圍。概述和摘要部分闡明如一個或多個發明人所構想的本揭露的一個或多個但非所有的示例性實施方式，並且因此，並不旨在以任何方式對本揭露和所附申請專利範圍進行限制。
已借助於說明特定功能的實施和其關係的功能性結構單元在上文描述了本揭露。為了描述的方便，本文已將該等功能性結構單元的邊界任意地進行限定。只要適當地執行特定功能和其關係，就可以界定替代邊界。
特定實施方式的前文描述將充分地揭露本揭露的一般性質，以使得其他人藉由應用本領域中的知識，在無不當實驗且不背離本揭露的一般概念的情況下，可以容易地針對各種應用對此類特定實施方式進行修改和/或改編。因此，基於本文提出的傳授和指導，此類改編和修改旨在處於所揭露實施方式的含義和等效範圍內。應理解，本文的措辭或術語係出於描述而非限制的目的，以使得本說明書的術語或措辭應由熟悉該項技術者根據傳授和指導進行解釋。
本揭露的廣度和範圍不應受任何上述示例性實施方式限制，而應僅根據以下申請專利範圍和其等效物定義。
藉由引用併入
具體實施方式中提及的所有出版物，包括專利和公佈的申請，均藉由引用以全文併入本文。
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Claims (11)

  1. 一種抗體藥物軛合物，該抗體藥物軛合物包含：(a)包含如SEQ ID NO：3所示的重鏈和如SEQ ID NO：4所示的輕鏈的抗TNFα抗體；以及(b)糖皮質激素受體激動劑，該糖皮質激素受體激動劑包含由下式表示的基團： 其中該抗體藉由由下式表示的接頭與該糖皮質激素受體激動劑軛合：
  2. 如申請專利範圍第1項所述之抗體藥物軛合物，該抗體藥物軛合物係根據下式： 其中A係抗體並且n係從1-10的整數。
  3. 如申請專利範圍第2項所述之抗體藥物軛合物，其中n係1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10。
  4. 如申請專利範圍第2項所述之抗體藥物軛合物，其中n係4。
  5. 如申請專利範圍第2項所述之抗體藥物軛合物，其中n係2。
  6. 一種藥物組成物，該藥物組成物包含如申請專利範圍第4項所述之抗體藥物軛合物和藥學上可接受的載體。
  7. 一種在受試者中治療選自以下各項的病狀的方法：類風濕性關節炎、關節黏連性脊椎炎、牛皮癬關節炎、斑塊狀牛皮癬、潰瘍性結腸炎、成人克羅恩氏病、小兒克羅恩氏病、葡萄膜炎、化膿性汗腺炎、和幼年特發性關節炎，該方法包括向該受試者給予有效量的如申請專利範圍第4項所述之抗體藥物軛合物。
  8. 一種套組，該套組包含：(a)包含如申請專利範圍第4項所述之抗體藥物軛合物或如申請專利範圍第6項所述之藥物組成物的容器；以及(b)在該一個或多個容器上或與該一個或多個容器相關聯的標籤或包裝插入物，其中該標籤或包裝插入物指示該抗體藥物軛合物或藥物組成物用於治療選自以下各項的病狀：類風濕性關節炎、關節黏連性脊椎炎、牛皮癬關節炎、斑塊狀牛皮癬、潰瘍性結腸炎、成人克羅恩氏病、小兒克羅恩氏病、葡萄膜炎、化膿性汗腺炎、和幼年特發性關節炎。
  9. 一種將糖皮質激素受體激動劑遞送至表現TNFα的細胞之方法，該方法包括使該細胞與如申請專利範圍第4項所述之抗體藥物軛合物接觸的步驟。
  10. 一種根據下式的抗體藥物軛合物： 其中A係阿達木單抗並且n係4。
  11. 一種根據下式的抗體藥物軛合物： 其中A係阿達木單抗並且n係2。
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