BR112020010694A2 - agonista de receptor de glicocorticoides e imunoconjugados do mesmo - Google Patents

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BR112020010694A2
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Michael J. McPherson
Wendy Waegell
Christian GOESS
Axel Hernandez Jr
Lu Wang
Christopher C. Marvin
Ling C. Santora
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Abstract

Trata-se de imunoconjugados de agonista de receptor de glicocorticoide, agonistas de receptor de glicocorticoide e métodos de uso dos mesmos.

Description

“AGONISTA DE RECEPTOR DE GLICOCORTICOIDES E IMUNOCONJUGADOS DO MESMO” PEDIDOS RELACIONADOS
[001] Este pedido reivindica a prioridade do Pedido Provisório dos EUA Número 62/593.776, depositado em 1 de dezembro de 2017, e Pedido Provisório dos EUA Número 62/595.054, depositado em 5 de dezembro de 2017, cada um dos quais é incorporado por referência na sua totalidade.
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS
[002] O presente pedido contém uma Listagem de Sequências que foi submetida eletronicamente no formato ASCII e é incorporada por referência na sua totalidade. A referida cópia ASCII, criada em 28 de novembro de 2018, é denominada A103017_1490WO_SL.txt e tem 14.758 bytes de tamanho.
CAMPO TÉCNICO
[003] O fator de necrose tumoral α (TNFα) desempenha um papel central na fisiopatologia de vários distúrbios humanos, e os agentes anti-TNFα têm utilidade terapêutica clinicamente validada no tratamento de distúrbios autoimunes e inflamatórios, como artrite reumatoide, psoríase e doença inflamatória intestinal.
Apesar de seu sucesso na clínica, os produtos biológicos anti-TNFα ainda são limitados na eficácia máxima que podem alcançar em pacientes, necessitando da identificação e desenvolvimento de agentes terapêuticos mais potentes e eficazes. Os pacientes tratados com produtos biológicos anti-TNFα também podem desenvolver uma resposta imunogênica ao agente terapêutico, limitando sua eficácia. Portanto, terapias anti-TNFα com menor imunogenicidade e alta eficácia seriam úteis para controle adicional da doença.
[004] Os agonistas sintéticos de receptores de glicocorticoides são uma classe potente de pequenas moléculas usadas no tratamento de distúrbios inflamatórios, mas sua utilidade no tratamento crônico de doença é limitada devido a efeitos colaterais graves. É necessário desenvolver agentes terapêuticos com eficácia aprimorada e maior duração de ação em comparação com anticorpos anti-TNF e com efeitos indesejados mínimos.
SUMÁRIO
[005] A presente divulgação fornece imunoconjugados de agonistas de receptor de glicocorticoide úteis no tratamento de doenças autoimunes.
[006] Em um aspecto, a presente divulgação fornece um conjugado de anticorpo-fármaco que compreende: (a) um anticorpo anti-TNFα que compreende uma cadeia pesada apresentada como SEQ ID NO: 3 e uma cadeia leve apresentada como SEQ ID NO: 4; e (b) um agonista de receptor de glicocorticoide que compreende um radical representado pela fórmula: ; e em que o anticorpo é conjugado com o agonista de receptor de glicocorticoide por meio de um ligante representado pela fórmula: .
[007] Em uma modalidade, a presente divulgação fornece um conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com a fórmula:
em que A é o anticorpo e n é um número inteiro de 1 a 10.
[008] Em um aspecto, a presente divulgação fornece um conjugado de anticorpo-fármaco que compreende: (a) um anticorpo anti-TNFα que compreende uma cadeia pesada apresentada como SEQ ID NO: 3 e uma cadeia leve apresentada como SEQ ID NO: 4; e (b) um agonista de receptor de glicocorticoide que compreende um radical representado pela fórmula: ; e em que o anticorpo é conjugado com o agonista de receptor de glicocorticoide por meio de um ligante representado pela fórmula: .
[009] Em uma modalidade, a presente divulgação fornece um conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com a fórmula:
, em que A é o anticorpo e n é um número inteiro de 1 a 10.
[010] Em uma modalidade, a presente divulgação fornece o conjugado de anticorpo-fármaco de qualquer modalidade anterior, em que a carga de fármaco é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10. Em uma modalidade, a presente divulgação fornece o conjugado de anticorpo-fármaco de qualquer modalidade anterior, em que a carga de fármaco é 4, por exemplo, n na fórmula de conjugado de anticorpo-fármaco precedente é igual a 4. Em uma modalidade, a presente divulgação fornece o conjugado de anticorpo-fármaco de qualquer modalidade anterior, em que a carga de fármaco é 2, por exemplo, n na fórmula de conjugado de anticorpo-fármaco precedente é igual a 2.
[011] Em uma modalidade, a presente divulgação fornece um método para fabricar o conjugado de anticorpo-fármaco de qualquer modalidade anterior, compreendendo a etapa de conjugar o anticorpo ao agonista de receptor de glicocorticoide. Em uma modalidade, a presente invenção fornece o método da modalidade anterior, que compreende ainda a etapa de introduzir uma porção química de PO4 no agonista de receptor de glicocorticoide antes de conjugar o anticorpo com o agonista de receptor de glicocorticoide. Em uma modalidade, a presente divulgação fornece o método de qualquer modalidade anterior, em que a conjugação compreende a redução parcial do anticorpo e a alquilação do anticorpo parcialmente reduzido com um composto de acordo com a fórmula:
.
[012] Em uma modalidade, a presente divulgação fornece uma composição farmacêutica compreendendo o conjugado de anticorpo-fármaco de qualquer modalidade anterior e um carreador farmaceuticamente aceitável. Em uma modalidade, a presente divulgação fornece a composição farmacêutica de qualquer uma das modalidades anteriores, compreendendo uma razão entre fármaco e anticorpo (DAR) de 1 a 10.
[013] Em uma modalidade preferida, a presente divulgação fornece um conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com a fórmula: , em que A é adalimumabe e n é 4.
[014] Em uma modalidade preferida, a presente divulgação fornece um conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com a fórmula: , em que A é um anticorpo anti-TNFα que compreende uma cadeia pesada definida como SEQ ID NO: 3 e uma cadeia leve definida como SEQ ID NO: 4, e n é 4.
[015] Em outra modalidade preferida, a presente divulgação fornece um conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com a fórmula: , em que A é adalimumabe e n é 2. Em outra modalidade preferida, a presente divulgação fornece um conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com a fórmula: , em que A é um anticorpo anti-TNFα que compreende uma cadeia pesada definida como SEQ ID NO: 3 e uma cadeia leve definida como SEQ ID NO: 4, e n é 2.
[016] Em uma modalidade preferida, a presente divulgação fornece a composição farmacêutica de qualquer modalidade anterior, compreendendo uma razão entre fármaco e anticorpo (DAR) de 2,0.
[017] Em uma modalidade preferida, a presente divulgação fornece a composição farmacêutica de qualquer modalidade anterior, compreendendo uma razão entre fármaco e anticorpo (DAR) de 4,0.
[018] Em uma modalidade, a presente divulgação fornece um método de tratamento de uma afecção selecionada entre artrite reumatoide, espondilite anquilosante, artrite psoriática, psoríase em placa, colite ulcerativa, doença de Crohn adulta, doença de Crohn pediátrica, uveíte, hidradenite supurativa e artrite idiopática juvenil em um sujeito, compreendendo a administração de uma quantidade eficaz do conjugado de anticorpo-fármaco de qualquer modalidade anterior ou a composição farmacêutica de qualquer modalidade anterior ao sujeito.
[019] Em uma modalidade, a presente divulgação fornece o conjugado de anticorpo-fármaco de qualquer modalidade anterior ou a composição farmacêutica de qualquer modalidade anterior para uso no tratamento de uma afecção selecionada entre artrite reumatoide, espondilite anquilosante, artrite psoriática, psoríase em placa, colite ulcerativa, doença de Crohn adulta, doença de Crohn pediátrica, uveíte, hidradenite supurativa e artrite idiopática juvenil.
[020] Em uma modalidade, a presente divulgação fornece o uso do conjugado de anticorpo-fármaco de qualquer modalidade anterior ou da composição farmacêutica de qualquer modalidade anterior para a preparação de um medicamento para o tratamento de uma afecção selecionada entre artrite reumatoide, espondilite anquilosante, artrite psoriática, psoríase em placa, colite ulcerativa, doença de Crohn adulta, doença de Crohn pediátrica, uveíte, hidradenite supurativa e artrite idiopática juvenil.
[021] Em uma modalidade, a presente divulgação fornece um kit que compreende: (a) um recipiente compreendendo o conjugado anticorpo-fármaco de qualquer modalidade anterior ou a composição farmacêutica de qualquer modalidade anterior; e (b) um rótulo ou bula em ou associada a um ou mais recipientes, em que a rótulo ou bula indica que o conjugado de anticorpo-fármaco ou composição farmacêutica é usado para tratar uma afecção selecionada entre artrite reumatoide, espondilite anquilosante, artrite psoriática, psoríase em placa, colite ulcerativa, doença de Crohn adulta, doença de Crohn pediátrica, uveíte, hidradenite supurativa e artrite idiopática juvenil.
[022] Em uma modalidade, a presente divulgação fornece um método de entrega de um agonista de receptor de glicocorticoide a uma célula que expressa TNFα, compreendendo a etapa de contato da célula com o conjugado de anticorpo- fármaco de qualquer modalidade anterior. Em uma modalidade, a presente divulgação fornece um método para determinar a atividade anti-inflamatória de um conjugado de anticorpo-fármaco que compreende: (a) colocar uma célula que expressa TNFα em contato com o conjugado de anticorpo-fármaco de qualquer modalidade anterior; e (b) determinar a liberação de citocinas pró-inflamatórias da célula em comparação com uma célula de controle.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[023] A Figura 1 fornece uma resolução cromatográfica do modulador do receptor BrAc-Gly-Glu-glicocorticoide (GRM)-PO4, como realizado e descrito no Exemplo 7. Como mostrado, o ADC é uma mistura heterogênea de ADC contendo ADCs com duas moléculas ligantes de fármacos acopladas, e ADCs com quatro moléculas ligantes de fármacos acopladas.
[024] A Figura 2 apresenta os dados de MS deconvoluídos de adalimumabe conjugado com BrAc-Gly-Glu-glicocorticosteroide-PO4. Como mostrado, a conjugação foi alcançada.
[025] A Figura 3 fornece um gráfico demonstrando a eficácia de uma dose alta e baixa de ADC1 em comparação com o mAb anti-TNFα (dose alta) ou veículo em um modelo de artrite de artrite induzida por colágeno (CIA) de camundongo, conforme realizado e descrito no Exemplo 7. Como mostrado, uma dose única de glicocorticosteroide anti-TNFa ADC1 exibiu uma duração de ação prolongada através da melhoria do inchaço da pata por ~28 dias em comparação ao mAb anti-TNFa ou veículos isolados.
[026] A Figura 4 é um gráfico de concentração (ug/ml) para ADC de anel fechado e aberto em macacos cinomolgos ao longo do tempo, conforme realizado e descrito no Exemplo 7. Como mostrado, a forma de anel fechado é suscetível à reação reversa de Michael e subsequente perda de fármaco ligante in vivo.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[027] São aqui fornecidos imunoconjugados de agonistas de receptor de glicocorticoide, agonistas de receptor de glicocorticoide e métodos de produção e utilização dos mesmos.
[028] É fornecido aqui um conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com a fórmula: ,
[029] em que A é adalumimabe e n é 4. Como demonstrado no Exemplo 7 abaixo, este ADC (isto é, ADC4 abaixo) demonstra atividade in vitro, estabilidade no plasma e agregação mínima.
[030] Também são fornecidos métodos de produção e métodos de uso de ADC4.
I.DEFINIÇÕES
[031] Para facilitar o entendimento da presente divulgação, vários termos e frases são definidos abaixo.
[032] O termo "proteína anti-TNFα" refere-se a proteínas capazes de (i) se ligar a TNFα e (ii) inibir a ligação do TNFα solúvel aos receptores de TNF da superfície celular (p55 e/ou p75) e/ou lisar a superfície de células que expressam receptor de TNFα ou TNFα in vitro na presença de complemento. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-TNF, pode se ligar ao TNF alfa na superfície de uma célula e tornar-se internalizado. Por exemplo, o documento US 2014/0294813, que é aqui incorporado por referência na sua totalidade, divulga anticorpos anti-TNF que exibem internalização celular após ligação a TNF humano de superfície celular. As proteínas anti-TNFα incluem, por exemplo, anticorpos anti-TNFα (por exemplo, adalimumabe, infliximabe e golimumabe). Os anticorpos anti-TNFα são ativamente internalizados após a ligação ao TNF transmembranar em DCs derivadas de monócitos e entram rapidamente nos lisossomos onde são degradados. (Deora et.al. MABS, 2017, vol. 9, n° 4, 680 a 694).
[033] O termo "anticorpo", como aqui utilizado, pretende se referir a moléculas de imunoglobulina compostas por quatro cadeias polipeptídicas, duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) interconectadas por ligações dissulfeto. Cada cadeia pesada é composta por uma região variável de cadeia pesada (aqui abreviada como HCVR ou VH) e uma região constante de cadeia pesada. A região constante de cadeia pesada é composta por três domínios, CH1, CH2 e CH3. Cada cadeia leve é composta por uma região variável de cadeia leve (aqui abreviada como LCVR ou VL) e uma região constante de cadeia leve. A região constante de cadeia leve é composta por um domínio, CL. As regiões VH e VL podem ser subdivididas em regiões de hipervariabilidade, denominadas regiões determinantes de complementaridade (CDR), intercaladas com regiões mais conservadas, denominadas regiões estruturais (FR). Cada VH e VL é composto por três CDRs e quatro FRs, dispostos do terminal amino ao terminal carbóxi na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.
[034] O termo "anticorpo anti-TNFα" ou "um anticorpo que se liga a TNFα" refere-se a um anticorpo que é capaz de se ligar a TNFα, por exemplo, com afinidade suficiente para que o anticorpo seja útil como agente terapêutico no direcionamento a TNFα. A extensão de ligação de um anticorpo anti-TNFα a uma proteína não relacionada não TNFα pode ser inferior a cerca de 10% da ligação do anticorpo a
TNFα conforme medido, por exemplo, por um radioimunoensaio (RIA). Em certas modalidades, um anticorpo que se liga a TNFα tem uma constante de dissociação (Kd) de ≤1 μM, ≤100 nM, ≤10 nM, ≤1 nM ou ≤0,1 nM.
[035] O termo "imunoconjugado", "conjugado", "conjugado de anticorpo- fármaco" ou "ADC", conforme aqui utilizado, refere-se a um composto ou um derivado do mesmo que é conjugado a uma proteína como um agente de ligação celular (por exemplo, um anticorpo anti-TNFα). Esses imunoconjugados podem ser definidos por uma fórmula genérica: (SM-LQ)n-A, em que SM = radical derivado de um agonista de receptor de glicocorticoide de molécula pequena, por exemplo, um glicocorticosteroide, L = ligante, Q = grupo heterobifuncional ou está ausente e A = uma proteína (por exemplo, um anticorpo) e n = 1 a 10. Os imunoconjugados também podem ser definidos pela fórmula genérica na ordem inversa: A-(Q-L-SM)n.
[036] Na presente divulgação, o termo "ligante" refere-se a uma porção química capaz de ligar a proteína anti-TNFα (por exemplo, anticorpo) a um glicocorticosteroide. Os ligantes podem ser suscetíveis à clivagem (um "ligante clivável"), facilitando assim a liberação do glicocorticosteroide. Por exemplo, esses ligantes cliváveis podem ser suscetíveis à clivagem induzida por peptidase, em condições nas quais o glicocorticosteroide e/ou o anticorpo permanecem ativos.
[037] Em particular, o componente ligante clivável aqui divulgado compreende um peptídeo compreendendo dois a três resíduos de aminoácidos (um dipeptídeo ou tripeptídeo) e especificamente os dipeptídeos e tripeptídeos selecionados do grupo que consiste em alanina-alanina (Ala-Ala), glicina-ácido glutâmico (Gly-Glu), ácido glutâmico-alanina-alanina (Glu-Ala-Ala) e glicina-lisina (Gly-Lys). O peptídeo permite a clivagem do ligante por uma protease, facilitando assim a liberação do glicocorticosteroide após exposição a proteases intracelulares, como enzimas lisossômicas (Doronina et al. (2003) Nat. Biotechnol. 21: 778 a 784).
[038] Na presente divulgação, o termo "glicocorticosteroide" refere-se a um hormônio esteroide natural ou sintético que interage com os receptores de glicocorticoides, e glicocorticosteroides específicos são divulgados em detalhes aqui.
Um "radical de um glicocorticosteroide" é derivado pela remoção de um ou mais átomos de hidrogênio de um glicocorticosteroide parental. A remoção do átomo (ou átomos) de hidrogênio facilita a ligação do glicocorticosteroide parental a um ligante.
Na presente divulgação, o átomo de hidrogênio é removido de qualquer grupo -NH 2 adequado do glicocorticosteroide parental. Em particular, o "radical de um glicocorticosteroide" é um radical monovalente derivado da remoção de um átomo de hidrogênio de um glicocorticosteroide parental.
[039] Na presente divulgação, o termo "grupo heterobifuncional" refere-se a uma porção química que conecta o ligante e a proteína anti-TNFα (por exemplo, anticorpo). Grupos heterobifuncionais são caracterizados como tendo diferentes grupos reativos em cada extremidade da porção química.
[040] O termo “razão anticorpo-fármaco" ou "DAR" refere-se ao número de SMs (por exemplo, radical derivado de um agonista de receptor de glicocorticoide de molécula pequena, por exemplo, um glicocorticosteroide) ligado a A (por exemplo, um anticorpo). Assim, no imunoconjugado com a fórmula genérica (SM-L-Q) n-A, o DAR é definido pela carga de fármaco por conjugado de anticorpo-fármaco, por exemplo, "n".
[041] Ao se referir a um composto com a fórmula (SM-L-Q)n-A representando um imunoconjugado individual, o termo "DAR de composto" refere-se ao número de SMs vinculados ao indivíduo A (por exemplo, carga de fármaco ou n como um número inteiro de 1 a 10).
[042] Ao se referir a um composto com a fórmula (SM-L-Q)n-A representando uma população de imunoconjugados, o termo "DAR de população" refere-se ao número médio de SMs vinculadas ao As (por exemplo, carga de fármaco ou n como número inteiro ou fração de 1 a 10 + 0,5, + 0,4, + 0,3, + 0,2, + 0,1).
[043] O termo "sujeito" refere-se a humanos, primatas não humanos e similares, que deve ser o destinatário de um tratamento específico. Tipicamente, os termos "sujeito" e "paciente" são aqui usados intercambiavelmente em referência a um sujeito humano.
[044] O termo "formulação farmacêutica" refere-se a uma preparação que está de forma a permitir que a atividade biológica do ingrediente ativo seja eficaz e que não contém componentes adicionais que sejam inaceitavelmente tóxicos para um sujeito ao qual a formulação seria administrada. A formulação pode ser estéril.
[045] Uma "quantidade eficaz" de um imunoconjugado, como aqui divulgado, é uma quantidade suficiente para realizar um propósito especificamente declarado.
Um "valor eficaz" pode ser determinado em relação ao objetivo declarado.
[046] O termo "quantidade terapeuticamente eficaz" refere-se a uma quantidade de um imunoconjugado eficaz para "tratar" uma doença ou distúrbio em um sujeito ou mamífero. Uma "quantidade profilaticamente eficaz" refere-se a uma quantidade eficaz para alcançar o resultado profilático desejado.
[047] Termos como "tratar" ou “tratamento" ou “para tratar" ou "aliviar" ou “para aliviar" referem-se a medidas terapêuticas que curam, desaceleram, diminuem um ou mais sintomas e/ou retardam ou interrompem a progressão de uma doença, afecção ou distúrbio patológico diagnosticado (“tratamento terapêutico”). Assim, aqueles que precisam de tratamento terapêutico incluem aqueles já diagnosticados ou com suspeita de ter o distúrbio. Medidas profiláticas ou preventivas referem-se a medidas que impedem o desenvolvimento de uma afecção ou distúrbio patológico alvejado ("tratamento profilático"). Assim, aqueles que precisam de tratamento profilático incluem aqueles propensos a ter o distúrbio e aqueles em quem o distúrbio deve ser prevenido.
II.PROTEÍNAS PARA LIGAÇÃO A AGONISTAS DE RECEPTOR DE GLICOCORTICOIDE
[048] A presente divulgação fornece imunoconjugados contendo agonistas de receptor de glicocorticoide ligados a proteínas, por exemplo, anticorpos. Em algumas modalidades, o anticorpo é humano, humanizado, quimérico ou murino. Em algumas modalidades, a proteína, por exemplo, anticorpo, pode se ligar a um alvo na superfície de uma célula e tornar-se internalizada.
[049] A presente divulgação também fornece imunoconjugados que contêm agonistas de receptor de glicocorticoide ligados a proteínas anti-TNFα. Em certas modalidades, as proteínas anti-TNFα são anticorpos. Em certas modalidades, as proteínas anti-TNFα são anticorpos que se ligam a TNFα (por exemplo, TNFα solúvel e/ou TNFα ligado à membrana). Em certas modalidades, as proteínas anti-TNFα são proteínas receptoras de TNF solúveis, por exemplo, proteínas receptoras de TNF solúveis fundidas a uma constante de cadeia pesada. Em algumas modalidades, a proteína anti-TNFα, por exemplo, anticorpo anti-TNFα, liga-se a TNFα na superfície de uma célula e torna-se internalizada. Por exemplo, a publicação do pedido de patente no 2014/0294813, aqui incorporado por referência, divulga proteínas anti- TNFα que exibem internalização celular após ligação a TNFα humano da superfície celular.
[050] Em certas modalidades, os anticorpos se ligam a TNFα humano e/ou de camundongo.
[051] A sequência completa de aminoácidos para o TNFα humano ligado à membrana é:
[052] MSTESMIRDVELAEEALPKKTGGPQGSRRCLFLSLFSFLIVAGATTLF
CLLHFGVIGPQREEFPRDLSLISPLAQAVRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQW LNRRANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVS
YQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLD FAESGQVYFGIIAL (SEQ ID NO: 1). O TNFα humano solúvel contém os aminoácidos 77 a 233 da SEQ ID NO: 1. A sequência completa de aminoácidos para o TNFα murino ligado à membrana é:
[053] MSTESMIRDVELAEEALPQKMGGFQNSRRCLCLSLFSFLLVAGATTLF
CLLNFGVIGPQRDEKFPNGLPLISSMAQTLTLRSSSQNSSDKPVAHVVANHQVEEQ LEWLSQRANALLANGMDLKDNQLVVPADGLYLVYSQVLFKGQGCPDYVLLTHTVS
RFAISYQEKVNLLSAVKSPCPKDTPEGAELKPWYEPIYLGGVFQLEKGDQLSAEVNL PKYLDFAESGQVYFGVIAL (SEQ ID NO: 2). O TNFα murino solúvel contém os aminoácidos 80 a 235 da SEQ ID NO: 2.
[054] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-TNFα se liga a TNFα humano.
[055] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-TNFα se liga a TNFα murino.
[056] Em certas modalidades, o anticorpo anti-TNFα tem um ou mais dos seguintes efeitos: neutraliza a citotoxicidade de TNFα humano em um ensaio in vitro L929 com um IC50 de 1X10-7 M ou menos; bloqueia a interação de TNFα com os receptores de superfície celular p55 e p75; e/ou lisam células expressando TNF de superfície in vitro na presença de complemento.
[057] Em certas modalidades, o anticorpo anti-TNFα não se liga a TNF-beta.
[058] Os anticorpos anti-TNFα incluem, por exemplo, adalimumabe, que é um anticorpo humano recombinante. As sequências de aminoácidos correspondentes à CDR e às regiões variáveis do adalimumabe são descritas na Patente U.S. n o
6.258.562 em referência ao anticorpo D2E7, isto é, SEQ ID Nos: 1 a 8.
[059] O nome internacional não proprietário (DCI) adalimumabe é fornecido no site de listagem da DCI da OMS: Ano 2000, Lista 44 (WHO Drug Information (2000) Vol. 14 (3)).
[060] Em certas modalidades, um anticorpo anti-TNFα compreende sequências de adalimumabe, por exemplo, as regiões determinantes de complementaridade (CDRs), o domínio pesado variável (VH) e/ou o domínio leve variável (VL). Sequências exemplificativas são fornecidas na Tabela 1.
TABELA 1: SEQUÊNCIAS EXEMPLIFICATIVAS DE REGIÃO DE
ANTICORPO ADALIMUMABE Região de Anticorpo Sequência de Aminoácidos
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHW VRQAPGKGLEWVSAITWNSGHIDYADSVEGRFTISRD NAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVSYLSTASSLDY WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALG CLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLY
SLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK Corrente pesada SCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT
PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAL PAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLT CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS
FFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK SLSLSPGK (SEQ ID NO: 3)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNYLAWYQ QKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTI
SSLQPEDVATYYCQRYNRAPYTFGQGTKVEIKRTVAA Cadeia leve PSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWK
VDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADY EKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 4)
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHW Região variável de VRQAPGKGLEWVSAITWNSGHIDYADSVEGRFTISRD cadeia pesada NAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVSYLSTASSLDY WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO: 5)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNYLAWYQ Região variável de QKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTI cadeia leve SSLQPEDVATYYCQRYNRAPYTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 6) DYAMH (SEQ ID NO: 7) ou GFTFDDYAMH (SEQ ID NO: VH-CDR1 8) VH-CDR2 AITWNSGHIDYADSVEG (SEQ ID NO: 9) VSYLSTASS (SEQ ID NO: 10) ou VSYLSTASSLDY VH-CDR3 (SEQ ID NO: 11) VL-CDR1 RASQGIRNYLA (SEQ ID NO: 12) VL-CDR2 AASTLQS (SEQ ID NO: 13) VL-CDR3 QRYNRAPYT (SEQ ID NO: 14)
[061] Em certas modalidades, o anticorpo anti-TNFα compreende as CDRs das SEQ ID NOs: 3 e 4. Em algumas modalidades, as CDRs compreendem SEQ ID NOs: 7 ou 8, 9, 10 ou 11, 12, 13 e 14. Em certas modalidades, o anticorpo anti-TNFα compreende a cadeia pesada da SEQ ID NO: 3 e/ou a cadeia leve da SEQ ID NO: 4.
[062] A presente divulgação abrange ainda variantes e equivalentes que são substancialmente homólogos aos anticorpos anti-TNFα aqui apresentados. Esses podem conter, por exemplo, mutações de substituição conservativas, isto é, a substituição de um ou mais aminoácidos por aminoácidos semelhantes. Por exemplo, substituição conservativa refere-se à substituição de um aminoácido por outro da mesma classe geral, como, por exemplo, um aminoácido ácido com outro aminoácido ácido, um aminoácido básico com outro aminoácido básico ou um aminoácido neutro por outro aminoácido neutro. O significado de uma substituição conservativa de aminoácidos é bem conhecido na técnica.
[063] Os anticorpos anti-TNFα isolados aqui descritos podem ser produzidos por qualquer método adequado conhecido na técnica. Tais métodos variam de métodos sintéticos de proteínas diretas à construção de uma sequência de DNA que codifica sequências polipeptídicas isoladas e que expressa essas sequências em um hospedeiro transformado adequado. Em algumas modalidades, uma sequência de DNA é construída usando a tecnologia recombinante, isolando ou sintetizando uma sequência de DNA que codifica uma proteína do tipo selvagem de interesse.
Opcionalmente, a sequência pode ser mutagenizada por mutagênese específica do local para fornecer seus análogos funcionais. Ver, por exemplo, Zoeller et al., Proc.
Nat'l. Acad. Sci. USA 81: 5.662 a 5.066 (1984) e Pat. U.S. no 4.588.585.
[064] Em algumas modalidades, uma sequência de DNA que codifica um anticorpo de interesse seria construída por síntese química usando um sintetizador de oligonucleotídeo. Tais oligonucleotídeos podem ser projetados com base na sequência de aminoácidos do polipeptídeo desejado e na seleção dos códons que são favorecidos na célula hospedeira na qual o polipeptídeo recombinante de interesse será produzido. Os métodos padrão podem ser aplicados para sintetizar uma sequência polinucleotídica isolada que codifica um polipeptídeo isolado de interesse.
[065] Em certas modalidades, os vetores de expressão recombinantes são utilizados para amplificar e expressar DNA que codifica anticorpos anti-TNFα. Uma ampla variedade de combinações de vetor/hospedeiro de expressão pode ser empregada. Os vetores de expressão úteis para hospedeiros eucarióticos incluem, por exemplo, vetores compreendendo sequências de controle de expressão de SV40, vírus do papiloma bovino, adenovírus e citomegalovírus. Os vetores de expressão úteis para hospedeiros bacterianos incluem plasmídeos bacterianos conhecidos, como plasmídeos de Escherichia coli, incluindo pCR1, pBR322, pMB9 e seus derivados, plasmídeos de maior variedade de hospedeiros, como M13 e fagos filamentosos de DNA de fita única.
[066] Células hospedeiras adequadas para expressão de anticorpos anti- TNFα incluem células de procariotos, leveduras, insetos ou células eucarióticas superiores sob o controle de promotores apropriados. Os procariotos incluem organismos gram-negativos ou gram-positivos, por exemplo E. coli ou bacilos. As células eucarióticas superiores incluem linhagens celulares estabelecidas de origem em mamíferos. Sistemas de tradução sem células também podem ser empregados.
Os vetores de clonagem e expressão apropriados para uso com hospedeiros celulares de bactérias, fungos, leveduras e mamíferos são descritos por Pouwels et al. (Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, NY, 1985). Informações adicionais sobre métodos de produção de proteínas, incluindo produção de anticorpos, podem ser encontradas, por exemplo, na Publicação de Patente US no 2008/0187954, Patentes US nos 6.413.746 e 6.660.501, e Publicação Internacional de Patente n o WO
04009823.
III.IMUNOCONJUGADOS CONTENDO AGONISTAS DE RECEPTOR DE GLICOCORTICOIDE
[067] Também são fornecidos imunoconjugados contendo agonistas de receptor de glicocorticoide. Em algumas modalidades, um imunoconjugado se liga ao receptor gama Fc. Em algumas modalidades, um imunoconjugado é ativo no ensaio repórter TNFα transmembranar GRE (como aqui utilizado, o "ensaio repórter TNFα transmembranar GRE" refere-se ao ensaio usado abaixo no Exemplo 7 abaixo). Em algumas modalidades, um imunoconjugado mostra imunogenicidade reduzida (resposta imune antifármacos reduzida (ADA)) em comparação com a proteína no imunoconjugado (por exemplo, o anticorpo) sozinho.
[068] Em uma modalidade, é divulgado aqui um composto com a Fórmula I-a: (SM-L-Q)n-AI-a, em que: A é um anticorpo antifator de necrose tumoral (TNF) α, um anticorpo monoclonal anti-TNFα ou adalimumabe; L é um ligante; Q é um grupo heterobifuncional; ou Q está ausente; n é 1 a 10; e SM é um radical monovalente de um glicocorticosteroide com qualquer um dos seguintes: (1)Fórmula II-a:
O OH P O OH H O N HO O H O
H H O II-a; (2)Fórmula II-b:
OH H O N HO O H O
H H O II-b; (3)Fórmula II-c:
OH H O N HO O H O F H
O F II-c; ou (4)Fórmula II-d:
O OH P O OH H O N HO O H O F H
O F II-d.
[069] Em outra modalidade, é divulgado aqui um composto com a Fórmula I- a, em que SM é um radical monovalente de um glicocorticosteroide com qualquer uma das Fórmulas II-a, II-b, II-c ou II-d, em que L é um ligante clivável que compreende um dipeptídeo ou tripeptídeo, Q é um grupo heterobifuncional ou Q está ausente e n é 1 a 10. Em particular, L compreende um dipeptídeo ou tripeptídeo selecionado a partir do grupo que consiste em alanina-alanina (Ala-Ala), glicina-ácido glutâmico (Gly-Glu), ácido glutâmico-alanina-alanina (Glu-Ala-Ala) e glicina-lisina (Gly-Lys).
[070] Em outra modalidade, é divulgado aqui um composto com a Fórmula I- a, em que SM é um radical monovalente de um glicocorticosteroide com qualquer uma das Fórmulas II-a, II-b, II-c e II-d, em que Q é um grupo heterobifuncional representado por: Q-1 em que m é 0 ou 1.
[071] Em outra modalidade, m é 0 e Q é representado por: Q-1a.
[072] Em outra modalidade, m é 1 e Q é representado por:
Q-1b.
[073] Em outra modalidade, é divulgado aqui um composto com a Fórmula I- a, em que SM é um radical monovalente de um glicocorticosteroide com qualquer uma das Fórmulas II-a, II-b, II-c e II-d, em que -L-Q- é qualquer uma das estruturas químicas da Tabela 2: TABELA 2 ; ; ; ; ;e .
[074] Em outra modalidade, é divulgado aqui um composto com a Fórmula I- a, por exemplo, um composto com a Fórmula I-a em que SM é um radical monovalente de um glicocorticosteroide com qualquer uma das Fórmulas II-a, II-b, II-c e II-d, em que n é 2 a 8. Em outra modalidade, n é 1 a 5. Em outra modalidade, n é 2 a 5. Em outra modalidade, n é 1. Em outra modalidade, n é 2. Em outra modalidade, n é 3. Em outra modalidade, n é 4. Em outra modalidade, n é 5. Em outra modalidade, n é 6. Em outra modalidade, n é 7. Em outra modalidade, n é 8.
[075] Em outra modalidade, é divulgado aqui um composto com a Fórmula I- a, por exemplo, um composto com a Fórmula I-a, em que SM é um radical monovalente de um glicocorticosteroide com qualquer uma das Fórmulas II-a, II-b, II- c e II-d, em que A é um anticorpo.
[076] Em outra modalidade, é divulgado aqui um composto com a Fórmula I- a, por exemplo, um composto com a Fórmula I-a, em que SM é um radical monovalente de um glicocorticosteroide com qualquer uma das Fórmulas II-a, II-b, II- c e II-d, em que o anticorpo é murino, quimérico, humanizado ou humano.
[077] Em outra modalidade, é divulgado aqui um composto com a Fórmula I- a, por exemplo, um composto com a Fórmula I-a, em que SM é um radical monovalente de um glicocorticosteroide com qualquer uma das Fórmulas II-a, II-b, II- c e II-d, em que A inibe competitivamente a ligação de um anticorpo selecionado a partir do grupo que consiste em adalimumabe, infliximabe, certolizumabe pegol e golimumabe a TNFα.
[078] Em outra modalidade, é divulgado aqui um composto com a Fórmula I- a, por exemplo, um composto com a Fórmula I-a, em que SM é um radical monovalente de um glicocorticosteroide com qualquer uma das Fórmulas II-a, II-b, II- c e II-d, em que A se liga ao mesmo epítopo TNFα que um anticorpo selecionado a partir do grupo que consiste em adalimumabe, infliximabe, certolizumabe pegol, afelimomabe, nerelimomabe, ozoralizumabe, placulumabe e golimumabe.
[079] Em outra modalidade, é divulgado aqui um composto com a Fórmula I- a, por exemplo, um composto com a Fórmula I-a, em que SM é um radical monovalente de um glicocorticosteroide com qualquer uma das Fórmulas II-a, II-b, II- c e II-d, em que A compreende as sequências de cadeia pesada variáveis CDR1, CDR2 e CDR3 de SEQ ID NO: 7 ou 8, SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 10 ou 11,
respectivamente, e as sequências de cadeia leve variável CDR1, CDR2 e CDR3 de SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 e SEQ ID NO: 14, respectivamente.
[080] Em outra modalidade, é divulgado aqui um composto com a Fórmula Ia, por exemplo, um composto com a Fórmula I-a, em que SM é um radical monovalente de um glicocorticosteroide com qualquer uma das Fórmulas II-a, II-b, II-c e II-d, em que A é um anticorpo anti-TNFα que compreende uma região variável de cadeia pesada apresentada como SEQ ID NO: 5 e uma região variável de cadeia leve apresentada como SEQ ID NO: 6.
[081] Em outra modalidade, é divulgado aqui um composto com a Fórmula I- a, por exemplo, um composto com a Fórmula I-a, em que SM é um radical monovalente de um glicocorticosteroide com qualquer uma das Fórmulas II-a, II-b, II- c e II-d, em que A é um anticorpo anti-TNFα compreendendo uma cadeia pesada apresentada como SEQ ID NO: 3 e uma cadeia leve apresentada como SEQ ID NO:
4.
[082] Em outra modalidade, é divulgado aqui um composto com a Fórmula I- a, por exemplo, um composto com a Fórmula I-a, em que SM é um radical monovalente de um glicocorticosteroide com qualquer uma das Fórmulas II-a, II-b, II- c e II-d, em que A bloqueia a interação de TNFα com os receptores de superfície celular p55 e p75.
[083] Em outra modalidade, é divulgado aqui um composto com a Fórmula I- a, por exemplo, um composto com a Fórmula I-a, em que SM é um radical monovalente de um glicocorticosteroide com qualquer uma das fórmulas II-a, II-b, II-c e II-d, em que A lisa células que expressam TNF de superfície in vitro na presença de complemento.
[084] Em outra modalidade, é divulgado aqui um composto com a Fórmula I- a, por exemplo, um composto com a Fórmula I-a, em que SM é um radical monovalente de um glicocorticosteroide com qualquer uma das Fórmulas II-a, II-b, II-
c e II-d, em que A é etanercept.
[085] Em outra modalidade, é divulgado aqui um composto com a Fórmula I- a, por exemplo, um composto com a Fórmula I-a, em que SM é um radical monovalente de um glicocorticosteroide com qualquer uma das Fórmulas II-a, II-b, II- c e II-d, em que A é adalimumabe.
[086] Em outra modalidade, é divulgado aqui um composto com a Fórmula Ia, que é qualquer uma das estruturas químicas da Tabela 3: TABELA 3
O H H O H O OH O O H A N O N N OH H H
O n
HO O F O H F O H O OH O H H N N O A N N OH H H
O O n
F O H F H O OH O O O O A H O N N N N H H H OH
O n
F O H F H O OH O O O O A H O N N N N H H H O O O P
HO O n em que n é 1 a 5 e A é adalimumabe.
[087] Em outra modalidade, é divulgado aqui um conjugado de anticorpo- fármaco de acordo com a fórmula: , em que A é adalumimabe e n é 4. Como demonstrado no Exemplo 7 abaixo, este ADC (isto é, ADC4 abaixo) demonstra atividade in vitro, estabilidade no plasma e agregação mínima.
IV.MÉTODOS PARA PRODUZIR IMUNOCONJUGADOS E INTERMEDIÁRIOS SINTÉTICOS
[088] A síntese geral de vários imunoconjugados da presente descrição envolve reagir uma molécula pequena funcionalizada com NH2 (SM) de qualquer uma das Fórmulas III-A, III-b, III-c ou III-d abaixo, com uma porção ligante, e funcionalizar o composto resultante para dar um intermediário funcionalizado com bromoacetamida.
O intermediário funcionalizado com bromoacetamida é então reagido com HS-A, em que HS-A é um anticorpo, por exemplo, adilumimabe, que tem um número limitado de ligações dissulfeto intercadeia reduzidas.
(1)Fórmula III-a:
O OH P O OH O HO O H O
H H O III-a;
[089] (2)Fórmula III-b:
OH O HO O H O
H H O III-b; (3)Fórmula III-c:
OH O HO O H O F H
O F III-c; ou (4)Fórmula III-d:
O OH P O OH O HO O H O F H
O F III-d.
[090] Em outra modalidade, é divulgado aqui um método de produção de um composto com a Fórmula IV-a: IV-a, em que: A é adalimumabe; L é um ligante; n é 1 a 10; e SM é um radical de um glicocorticosteroide com qualquer uma das Fórmulas III-a a IIId; sendo que o método compreende: a) conjugar um composto com a Fórmula V:
V com uma proteína α de antifator de necrose antitumoral (TNF) ou uma proteína; e b) isolar o composto de Fórmula IV-a.
[091] Em algumas modalidades, o método divulgado compreende ainda a purificação do composto de Fórmula IV-a. Em certas modalidades, é usada a cromatografia de troca aniônica (AEC), que (devido a porções químicas carregadas na porção peptídica do ligante em algumas modalidades e/ou o grupo fosfato no SM em algumas modalidades) pode fornecer separação eficiente de diferentes espécies de DAR.
[092] Em algumas modalidades, o método divulgado requer menos etapas sintéticas do que os métodos que se baseiam em química padrão de ligante à base de maleimida. Em particular, métodos baseados em química padrão de ligante à base de maleimida podem exigir uma etapa subsequente de hidrólise de abertura de anel de succinimida que é realizada após a purificação das espécies de DAR apropriadas.
Como tal, em certas modalidades, o método divulgado reduz significativamente o protocolo de conjugação em relação a química padrão de ligante à base de maleimida.
[093] Em outra modalidade, é divulgado aqui um método de produção de um composto com a Fórmula VI-a: VI-a em que: A é adalimumabe; e n é 1 a 10, sendo que o método compreende: a) conjugar um composto de Fórmula VII-a: VII-a, com adalimumabe parcialmente reduzido; e b) isolar, por exemplo, por cromatografia, o composto com a Fórmula VI-a.
[094] Em outra modalidade, é divulgado aqui um método de produção de um composto com a Fórmula IV-a ou Fórmula VI-a, em que n é 1 a 7. Em outra modalidade, n é 1 a 5. Em outra modalidade, n é 2 a 4. Em outra modalidade, n é 1.
Em outra modalidade, n é 2. Em outra modalidade, n é 3. Em outra modalidade, n é
4. Em outra modalidade, n é 5. Em outra modalidade, n é 6. Em outra modalidade, n é 7. Em outra modalidade, n é 8.
[095] Em outra modalidade, é divulgado aqui um composto com a Fórmula IV- a ou VI-a, em que: A é adalimumabe; e n é 1 a 10.
[096] Em outra modalidade, é divulgado aqui um composto com a Fórmula IV- a ou VI-a, em que n é 1 a 7. Em outra modalidade, n é 1 a 5. Em outra modalidade, n é 2 a 4. Em outra modalidade, n é 1. Em outra modalidade, n é 2. Em outra modalidade, n é 3. Em outra modalidade, n é 4. Em outra modalidade, n é 5. Em outra modalidade, n é 6. Em outra modalidade, n é 7. Em outra modalidade, n é 8.
[097] Também são aqui fornecidos intermediários sintéticos que são úteis para a preparação de imunoconjugados.
[098] Em uma modalidade, o intermediário sintético divulgado aqui é um composto que tem qualquer uma das Fórmulas V ou VII-a.
VI.MÉTODOS DE USO E COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS
[099] São aqui fornecidos conjugados com a Fórmula I-a (por exemplo, com as fórmulas mostradas na Tabela 3) que podem ser usados in vitro ou in vivo. Por conseguinte, também são fornecidas composições, por exemplo, composições farmacêuticas para certos usos in vivo, que compreendem um conjugado ou um agonista de receptor de glicocorticoide com o grau de pureza desejado em um carreador, excipiente ou estabilizador fisiologicamente aceitável (Remington's
Pharmaceutical Sciences (1990) Mack Publishing Co., Easton, PA). Carreadores, excipientes ou estabilizadores aceitáveis não são tóxicos para os receptores nas dosagens e concentrações empregadas.
[0100]As composições (por exemplo, composições farmacêuticas) a serem usadas para administração in vivo podem ser estéreis, o que pode ser realizado por filtração através, por exemplo, de membranas de filtração estéreis. As composições (por exemplo, composições farmacêuticas) a serem usadas para administração in vivo podem compreender um conservante.
[0101]Conjugados e/ou composições de anticorpo-fármaco farmacêuticas que compreendem conjugados de anticorpo-fármaco aqui descritos podem ser úteis na lise de uma célula que expressa TNFα de superfície (in vitro ou in vivo) e/ou no tratamento de doenças ou distúrbios caracterizados pelo aumento de TNFα (por exemplo, aumento de TNFα no líquido sinovial). Em algumas modalidades, os conjugados e/ou composições de anticorpo-fármaco são úteis na inibição da liberação de citocinas (in vitro ou in vivo) e/ou no tratamento de doenças autoimunes ou inflamatórias. Em algumas modalidades, os conjugados e/ou composições de anticorpo-fármaco são utilizados para o tratamento da doença de Crohn (por exemplo, doença de Crohn moderada a severamente ativa envolvendo o íleo e/ou o cólon ascendente e/ou a manutenção da remissão clínica de doença de Crohn moderada a gravemente ativa envolvendo o íleo e/ou o cólon ascendente por até 3 meses). Em algumas modalidades, os conjugados e/ou composições de anticorpo-fármaco são utilizados para o tratamento de colite ulcerativa (por exemplo, para indução de remissão em pacientes com colite ulcerativa ativa, moderada a grave). Em algumas modalidades, os conjugados e/ou composições de anticorpo-fármaco são utilizados para o tratamento da artrite reumatoide (RA). Em algumas modalidades, os conjugados e/ou composições de anticorpo-fármaco são utilizados para o tratamento da artrite idiopática juvenil (JA). Em algumas modalidades, os conjugados e/ou composições de anticorpo-fármaco são utilizados para o tratamento da artrite psoriática (PsA). Em algumas modalidades, os conjugados e/ou composições de anticorpo-fármaco são utilizados para o tratamento de uma espondiloartropatia, como espondilite anquilosante (AS) ou espondiloartrite axial (axSpA). Em algumas modalidades, os conjugados e/ou composições de anticorpo-fármaco são utilizados para o tratamento da doença de Crohn (CD) adulta. Em algumas modalidades, os conjugados e/ou composições de anticorpo-fármaco são utilizados para o tratamento da doença de Crohn pediátrica. Em algumas modalidades, os conjugados e/ou composições de anticorpo-fármaco são utilizados para o tratamento de colite ulcerativa (UC). Em algumas modalidades, os conjugados e/ou composições de anticorpo-fármaco são utilizados para o tratamento da psoríase em placa (Ps). Em algumas modalidades, os conjugados e/ou composições de anticorpo-fármaco são utilizados para o tratamento de hidradenite supurativa (HS). Em algumas modalidades, os conjugados e/ou composições de anticorpo-fármaco são utilizados para o tratamento de uveíte. Em algumas modalidades, os conjugados e/ou composições de anticorpo-fármaco são utilizados para o tratamento da doença de Behcets. Em algumas modalidades, os conjugados e/ou composições de anticorpo- fármaco são utilizados para o tratamento da psoríase, incluindo a psoríase em placa.
Algumas modalidades compreendem o uso de conjugados de fármacos e/ou composições farmacêuticas para a preparação de um medicamento para o tratamento das doenças ou distúrbios descritos neste documento.
[0102]Algumas modalidades compreendem métodos de entrega de um agonista de receptor de glicocorticoide a uma célula que expressa TNFα. Tais métodos podem incluir uma etapa de contatar uma célula que expressa TNFα com um conjugado de anticorpo-fármaco, como aqui descrito. Algumas modalidades compreendem um método in vitro de entrega de um agonista de receptor de glicocorticoide a uma célula que expressa TNFα.
[0103]Também são fornecidos métodos para determinar a atividade anti- inflamatória de um conjugado de anticorpo-fármaco. Tais métodos podem incluir uma etapa de contatar uma célula que expressa TNFα com um conjugado de anticorpo- fármaco, como aqui descrito. Algumas modalidades compreendem contatar uma célula que expressa TNFα com um conjugado de anticorpo-fármaco, como descrito aqui, e determinar a liberação reduzida de citocinas pró-inflamatórias da célula em comparação com uma célula de controle. Algumas modalidades compreendem um método in vitro para determinar a atividade anti-inflamatória de um conjugado de anticorpo-fármaco.
[0104]Algumas modalidades compreendem métodos de triagem (por exemplo, métodos in vitro) que incluem contatar, direta ou indiretamente, células (por exemplo, células que expressam TNFα) com um conjugado de anticorpo-fármaco e determinar se o conjugado de anticorpo-fármaco modula uma atividade ou função das células, como refletido, por exemplo, por alterações na morfologia ou viabilidade celular, expressão de um marcador, diferenciação ou desdiferenciação, respiração celular, atividade mitocondrial, integridade da membrana, maturação, proliferação, viabilidade, apoptose ou morte celular. Um exemplo de interação direta é a interação física, enquanto uma interação indireta inclui, por exemplo, a ação de uma composição sobre uma molécula intermediária que, por sua vez, atua sobre a entidade referenciada (por exemplo, célula ou cultura de células).
VII. ARTIGOS DE FABRICAÇÃO
[0105]A divulgação também inclui embalagens e kits farmacêuticos compreendendo um ou mais recipientes, em que um recipiente pode compreender uma ou mais doses de um conjugado ou composição de anticorpo-fármaco, como aqui descrito. Em certas modalidades, a embalagem ou kit contém uma dosagem unitária, significando uma quantidade predeterminada de uma composição ou conjugado de anticorpo-fármaco, com ou sem um ou mais agentes adicionais.
[0106]O kit pode compreender um ou vários recipientes e um rótulo ou bula acima, dentro ou associado ao recipiente (ou recipientes), indicando que a composição fechada é usada para tratar a afecção de doença de escolha. Recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos, seringas, etc. Os recipientes podem ser formados a partir de uma variedade de materiais, como vidro ou plástico.
O recipiente (ou recipientes) pode compreender uma porta de acesso estéril, por exemplo, o recipiente pode ser uma bolsa de solução intravenosa ou um frasco com uma rolha que pode ser perfurada por uma agulha de injeção hipodérmica.
[0107]Em algumas modalidades, o kit pode conter um meio pelo qual administrar o anticorpo e quaisquer componentes opcionais a um paciente, por exemplo, uma ou mais agulhas ou seringas (pré-cheias ou vazias), um conta-gotas, pipeta ou outro aparelho similar, a partir do qual a formulação pode ser injetada ou introduzida no sujeito ou aplicada a uma área doente do corpo. Os kits da divulgação também incluem tipicamente um meio para conter os frascos, ou similares, e outros componentes em confinamento próximo para venda comercial, como, por exemplo, recipientes de plástico moldados por sopro nos quais os frascos e outros aparelhos desejados são colocados e retidos.
EXEMPLOS
[0108]Entende-se que os exemplos e modalidades descritos neste documento são apenas para fins ilustrativos e que várias modificações ou alterações à luz dos mesmos serão sugeridas a pessoas versadas na técnica e serão incluídas no espírito e alcance desta divulgação.
[0109]Os materiais de partida estão comercialmente disponíveis, podem ser preparados pelos procedimentos descritos no presente documento, por procedimentos da literatura, ou por procedimentos que seriam bem conhecidos por um versado na técnica da química orgânica. Os nomes de reagente/reativo fornecidos são indicados no frasco comercial ou gerados pelas convenções da IUPAC,
CambridgeSoft® ChemDraw Ultra 12.0, CambridgeSoft® Chemistry E-Notebook 11 ou AutoNom 2000. Entende-se que os exemplos e modalidades descritos neste documento são apenas para fins ilustrativos e que várias modificações ou alterações à luz dos mesmos serão sugeridas a pessoas versadas na técnica e devem ser incluídas dentro do espírito e alcance desta divulgação.
MÉTODOS ANALÍTICOS PARA SÍNTESE E CARACTERIZAÇÃO DE COMPOSTOS
[0110]Os dados analíticos estão incluídos nos procedimentos abaixo, nas ilustrações dos procedimentos gerais ou nas tabelas de exemplos. A menos que indicado de outra forma, todos os dados de RMN de 1H e 13C foram recolhidos em um instrumento Varian Mercury Plus 400 MHz ou Bruker AVIII 300 MHz; os desvios químicos são estabelecidos em partes por milhão (ppm). Os dados analíticos por HPLC são detalhados no experimental ou referenciados à tabela de condições de LC/MS e HPLC, usando o método fornecido na Tabela 4.
TABELA 4 Método Condições O gradiente foi de 1 a 90% de B em 3,4 min, 90 a 100% de B em 0,45 min, 100 a 1% de B em 0,01 min e depois mantido em 1% de B durante 0,65 min (taxa de fluxo de 0,8 ml/min). A fase móvel A foi de 0,0375% de TFA a em H2O, a fase móvel B foi de 0,018% de TFA em MeCN. A coluna utilizada para a cromatografia foi uma coluna Phenomenex Luna-C18 de 2,0 X de 50 mm (partículas de 5 µm). Os métodos de detecção são DAD e ELSD, bem como ionização por eletropulverização positiva.
Abreviaturas utilizadas nos exemplos que se seguem são: ACTH Hormônio HIC Cromatografia de interação adrenocorticotrópico hidrofóbica BrAc Bromo acetamida HPLC Cromatografia líquida de alta performance CV Volumes da coluna LCMS Espectrometria de massa de cromatografia líquida DAD Matriz de diodo MeCN Acetonitrila DAR Razão fármaco/anticorpo MEM Meio essencial mínimo DBP Ftalato de dibutila MeOH Metanol DCM Diclorometano MS Espectrometria de massa
DMA Dimetil acetamida NEAA Aminoácidos não essenciais DMF Dimetil formamida RMN Ressonância magnética nuclear DMSO Dimetilsulfóxido PBS Solução salina de tampão fosfato DTT Ditiotreitol PE Éter de petróleo EEDQ 2-etoxi-1-etoxicarbonil-1,2- P1NP Propeptídeo Amino Terminal do di-hidroquinolina Procolágeno Tipo 1 ELSD Detector de dispersão de rt Temperatura ambiente luz por evaporação Eq Equivalentes RPMI Roswell Park Memorial Institute EtOAc Acetato de etila SEC Cromatografia de exclusão de tamanho FBS Soro fetal bovino TCEP (tris(2-carboxietil)fosfina) Fmoc 9-Fluorenilmetiloxicarbonila TFA Ácido trifluoroacético
[0111]Exemplo 1: Síntese de (2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10S,11aR,12aS,12bS)-10-(4-(3-aminobenzil)fenil)-2,6b- difluoro-7-hidroxi-8b-(2-hidroxiacetil)-6a,8a-dimetil- 1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-dodeca-hidro-4H-nafto[2',1':4,5]indeno[1,2- d][1,3]dioxol-4-ona
[0112]Etapa 1: Síntese de 4-(bromometil)benzaldeído
[0113]Hidreto de di-isobutilalumínio (153 ml, 153 mmol, 1 M em tolueno) foi adicionado gota a gota a uma solução a 0 °C de 4-(bromometil)benzonitrila (20 g, 102 mmol) em tolueno (400 ml) ao longo de 1 hora. Dois frascos adicionais foram configurados como descrito acima. Todas as três misturas de reação foram combinadas. À mistura foi adicionado HCl aquoso a 10% (1,5 l). A mistura foi extraída com DCM (3 x 500 ml). A camada orgânica foi seca sobre Na 2SO4, filtrada e concentrada sob pressão reduzida. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna sobre sílica gel (eluído com PE:EtOAc = 10:1) para obter o composto do título (50 g, rendimento de 82%) como um sólido branco. 1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ 10,02 (s, 1H), 7,91-7,82 (m, 2H), 7,56 (d, J = 7,9 Hz, 2H), 4,55-4,45 (m, 2H).
[0114]Etapa 2: Síntese de 3-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il)anilina
[0115]A uma solução de 3-bromoanilina (40 g, 233 mmol) em 1,4-dioxano (480 ml) foi adicionado 4,4,4',4',5,5,5',5'-tetrametil-2,2'-bi(1,3,2-dioxaborolano) (94 g, 372 mmol), acetato de potássio (45,6 g, 465 mmol), 2-diciclo-hexilfosfino-2',4',6'-tri-i-propil- 1,1’-bifenila (8,07 g, 13,95 mmol) e tris(dibenzilidenacetona)dipaládio (0) (8,52 g, 9,30 mmol). A mistura resultante foi aquecida a 80 °C durante 4 horas sob nitrogênio. Um frasco adicional foi configurado como descrito acima. As duas misturas de reação foram combinadas e concentradas e o resíduo foi purificado por cromatografia em coluna sobre sílica gel (eluído com PE:EtOAc = 10:1) para obter o composto do título (60 g, rendimento de 55,4%) como um sólido amarelo claro. 1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ 7,23-7,13 (m, 3H), 6,80 (d, J = 7,5 Hz, 1H), 3,82-3,38 (m, 2H), 1,34 (s, 12H).
[0116]Etapa 3: Síntese de (3-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2- il)fenil)carbamato de terc-butila
[0117]3-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il)anilina (Exemplo 1, Etapa 2) (30 g, 137 mmol) e dicarbonato de di-terc-butila (38,9 g, 178 mmol) foram misturados em tolueno (600 ml) a 100 °C por 24 horas. Outro frasco foi montado como descrito acima. As duas misturas de reação foram combinadas e a mistura foi evaporada, dissolvida em EtOAc (1,5 l), lavada com HCl 0,1 N (3 X 2 l) e salmoura (3 l), seca sobre Na2SO4, filtrada e concentrada sob pressão reduzida para dar o composto do título (50 g, rendimento de 57%) como um sólido vermelho. 1H RMN (400 MHz, CDCl3) 7,63 (br m, 2H), 7,48 (d, J = 7,1 Hz, 1H), 7,37-7,28 (m, 1H), 1,52 (s, 9H), 1,34 (s 12H).
[0118]Etapa 4: Síntese de (3-(4-formilbenzil)fenil)carbamato de terc-butila
[0119]Uma mistura de 4-(bromometil)benzaldeído (Exemplo 1, Etapa 1)
(24,94 g, 125 mmol), 1,1'-bis(difenilfosfino)ferrocenodicloro-paládio (II) complexo DCM (13,75 g, 18,80 mmol), (3-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il)fenil)carbamato de terc-butila (do Exemplo 1, Etapa 3) (20 g, 62,7 mmol) e carbonato de potássio (43,3 g, 313 mmol) em tetra-hidrofurano (400 ml) foi aquecida até 80 °C por 12 horas. Outro frasco foi montado como descrito acima. As duas misturas de reação foram combinadas e diluídas com água (500 ml). A mistura aquosa foi extraída com EtOAc (3 x 500 ml). As camadas orgânicas foram combinadas e secas sobre Na 2SO4, filtrada e concentrada sob pressão reduzida. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna sobre sílica gel (eluído com PE:EtOAc = 10:1) para obter o composto do título (15 g, rendimento de 38,4%) como um sólido branco. 1H RMN (400 MHz, CDCl3)  9,95 (s, 1H), 7,78 (d, J = 7,9 Hz, 2H), 7,33 (d, J = 7,9 Hz, 2H), 7,27 - 7,13 (m, 3H), 6,82 (d, J = 7,1 Hz, 1H), 6,47 (br. s., 1H), 4,00 (s, 2H), 1,48 (s, 9H).
[0120]Etapa 5: Síntese de (6S,8S,9R,10S,11S,13S,14S,16R,17S)-6,9- difluoro-11,16,17-tri-hidroxi-17-(2-hidroxiacetil)-10,13-dimetil- 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-dodeca-hidro-3H-ciclopenta[a]fenantrena-3-ona
[0121](2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-2,6b-Difluoro-7-hidroxi- 8b-(2-hidroxiacetil)-6a,8a,10,10-tetrametil-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b- dodeca-hidro-4H-nafto[2’,1':4,5]indeno[1,2-d][1,3]dioxol-4-ona (20 g, 44,2 mmol) foi suspenso em HBF4 aquoso a 40% (440 ml) e a mistura foi agitada a 25 °C por 48 horas. Após a reação estar completa, foram adicionados 2 l de água e o sólido foi recolhido por filtração. Esse sólido foi lavado com água (1 l) e depois MeOH (200 ml) para dar o composto do título (11 g, rendimento de 60,3%) como um sólido branco. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6)  7,25 (d, J = 10,1 Hz, 1H), 6,28 (d, J = 10,1 Hz, 1H), 6,10 (s, 1H), 5,73 - 5,50 (m, 1H), 5,39 (br. s., 1H), 4,85 - 4,60 (m, 2H), 4,50 (d, J = 19,4 Hz,
1H), 4,20 - 4,04 (m, 2H), 2,46 - 2,06 (m, 6H), 1,87 - 1,75 (m, 1H), 1,56 - 1,30 (m, 6H), 0,83 (s, 3H).
[0122]Etapa 6: Síntese de (2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)- 10-(4-(3-aminobenzil)fenil)-2,6b-difluoro-7-hidroxi-8b-(2-hidroxiacetil)-6a,8a-dimetil- 1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-dodeca-hidro-4H-nafto[2',1':4,5]indeno[1,2- d][1,3]dioxol-4-ona.
[0123]Uma suspensão de (6S,8S,9R,10S,11S,13S,14S,16R,17S)-6,9- difluoro-11,16,17-tri-hidroxi-17-(2-hidroxiacetil)-10,13-dimetil- 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-dodeca-hidro-3H-ciclopenta[a]fenantren-3-ona (Exemplo 1, Etapa 5) (4,4 g, 10,67 mmol) e MgSO 4 (6,42 g, 53,3 mmol) em MeCN (100 ml) foi agitada a 20 °C durante 1 hora. Uma solução de (3-(4- formilbenzil)fenil)carbamato de terc-butila (Exemplo 1, Etapa 4) (3,65 g, 11,74 mmol) em MeCN (100 ml) foi adicionado em uma porção. Foi adicionado gota a gota ácido trifluorometanossulfônico (9,01 ml, 53,3 mmol) enquanto se mantinha uma temperatura interna abaixo de 25 °C utilizando um banho de gelo. Após a adição, a mistura foi agitada a 20 °C durante 2 horas. Três frascos adicionais foram configurados como descrito acima. Todas as quatro misturas de reação foram combinadas e concentradas e o resíduo foi purificado por HPLC Prep para dar o composto do título (4,5 g, rendimento de 14,2%) como um sólido amarelo. LCMS (Método A, Tabela 4) Rt = 2,65 min; MS m/z = 606,2 (M+H)+; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6)  7,44 - 7,17 (m, 5H), 6,89 (t, J = 7,7 Hz, 1H), 6,44 - 6,25 (m, 4H), 6,13 (br. s., 1H), 5,79 - 5,52 (m, 2H), 5,44 (s, 1H), 5,17 - 4,89 (m, 3H), 4,51 (d, J = 19,4 Hz, 1H), 4,25 - 4,05 (m, 2H), 3,73 (s, 2H), 3,17 (br. S., 1H), 2,75 - 2,55 (m, 1H), 2,36 - 1,97 (m, 3H), 1,76 - 1,64 (m,
3H), 1,59 - 1,39 (m, 4H), 0,94 - 0,78 (m, 3H). Método de HPLC Prep: Instrumento: sistema de HPLC semipreparativo Gilson 281; Fase móvel: A: Ácido Fórmico/H 2O = 0,01% v/v; B: MeCN; Coluna: Luna C18 150*25 5 mícrons; Taxa de fluxo: 25 ml/min; Comprimento de onda de monitor: 220 e 254 nm.
Tempo 0,0 10,5 10,6 10,7 13,7 13,8 15,0 B% 15 35 35 100 100 10 10
[0124]Exemplo 2: Síntese de (6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)- 10-(4-(3-aminobenzil)fenil)-7-hidroxi-8b-(2-hidroxiacetil)-6a,8a-dimetil- 1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-dodeca-hidro-4H-nafto[2',1':4,5]indeno[1,2- d][1,3]dioxol-4-ona.
[0125]O Exemplo 2 foi sintetizado em um procedimento semelhante ao Exemplo 1 usando (8S,9S,10R,11S,13S,14S,16R,17S)-11,16,17-tri-hidroxi-17-(2- hidroxiacetil)-10,13-dimetil-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-dodeca-hidro-3H- ciclopenta[a]fenantren-3-ona.
[0126]1H RMN (400 MHz, DMSO-d6)  7,36 (d, J = 7,9 Hz, 2H), 7,31 (d, J = 10,1 Hz, 1H), 7,20 (d, J = 7,9 Hz, 2H), 6,89 (t, J = 7,9 Hz, 1H), 6,39 - 6,28 (m, 3H), 6,16 (dd, J = 1,5, 9,9 Hz, 1H), 5,93 (s, 1H), 5,39 (s, 1H), 5,08 (t, J = 5,7 Hz, 1H), 4,98 - 4,87 (m, 3H), 4,78 (d, J = 3,1 Hz, 1H), 4,49 (dd, J = 6,2, 19,4 Hz, 1H), 4,29 (s Ir., 1H), 4,17 (dd, J = 5,5, 19,6 Hz, 1H), 3,74 (s, 2H), 2,61 - 2,53 (m, 1H), 2,36 - 2,26 (m, 1H), 2,11 (d, J = 11,0 Hz, 1H), 2,07 (s, 1H), 2,02 (d, J = 12,8 Hz, 1H), 1,83 - 1,54 (m, 5H), 1,39 (s, 3H), 1,16 - 0,96 (m, 2H), 0,85 (s, 3H). LCMS (Método A, Tabela 4) R t = 2,365 min; m/z = 570,2 (M+H)+.
[0127]Exemplo 3: Síntese de (6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-
10-(4-(3-aminobenzil)fenil)-6b-fluoro-7-hidroxi-8b-(2-hidroxiacetil)-6a,8a-dimetil- 1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-dodeca-hidro-4H-nafto[2',1':4,5]indeno[1,2- d][1,3]dioxol-4-ona.
[0128]O Exemplo 3 foi sintetizado em um procedimento semelhante ao Exemplo 1 usando (8S,9R,10S,11S,13S,14S,16R,17S)-9-fluoro-11,16,17-tri-hidroxi- 17-(2-hidroxiacetil)-10,13-dimetil-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-dodeca-hidro-3H- ciclopenta[a]fenantren-3-ona.
[0129]1H RMN (400 MHz, DMSO-d6)  7,37 - 7,26 (m, 3H), 7,21 (d, J = 7,9 Hz, 2H), 6,89 (t, J = 7,7 Hz, 1H), 6,43 - 6,30 (m, 3H), 6,23 (d, J = 10,1 Hz, 1H), 6,04 (s, 1H), 5,75 (s, 1H), 5,44 (s, 2H), 5,09 (t, J = 5,7 Hz, 1H), 4,93 (br. s., 3H), 4,50 (dd, J = 6,2, 19,4 Hz, 1H), 4,28 - 4,09 (m, 2H), 3,74 (s, 2H), 2,73 - 2,54 (m, 2H), 2,35 (d, J = 13,2 Hz, 1H), 2,25 - 2,12 (m, 1H), 2,05 (d, J = 15,0 Hz, 1H), 1,92 - 1,77 (m, 1H), 1,74 - 1,58 (m, 3H), 1,50 (s, 3H), 1,45 - 1,30 (m, 1H), 0,87 (s, 3H). LCMS (Método A, Tabela 4) Rt = 2,68 min; m/z = 588,1 (M+H)+.
[0130]Exemplo 4: Síntese de ácido (S)-4-(2-(2-bromoacetamido)acetamido)- 5-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-hidroxi-6a,8a-dimetil-4-oxo- 8b-(2-(fosfono-oxi)acetil)-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-dodeca-hidro-1H- nafto[2',1’:4,5]indeno[1,2-d][1,3]dioxol-10-il)benzil)fenil)amino)-5-oxopentanoico
[0131]Etapa 1: Síntese de ácido (S)-2-(2-((((9H-fluoren-9- il)metoxi)carbonil)amino)acetamido)-5-(terc-butoxi)-5-oxopentanoico.
[0132]Uma mistura de resina de cloreto de 2-clorotritila (30 g, 92 mmol), trietilamina (46,4 g, 458 mmol) e ácido (S)-2-((((9H-fluoren-9- il)metoxi)carbonil)amino)-5-(terc-butoxi)-5-oxopentanoico (25,5 g, 60 mmol) em DCM seco (200 ml) foi borbulhada com N2 a 20 °C durante 8 horas. A mistura foi filtrada e a resina foi lavada com DCM (2 x 200 ml), MeOH (2 x 200 ml) e DMF (2 x 200 ml). A resina adicionou-se uma solução de piperidina:DMF (1:4, 400 ml) e a mistura foi borbulhada com N2 durante 8 minutos e, em seguida, filtrada. Essa operação foi repetida cinco vezes para dar a remoção completa do grupo protetor Fmoc. A resina foi lavada com DMF (5 x 500 ml) para proporcionar ácido (S)-2-amino-5-(terc-butoxi)- 5-oxopentanoico ligado a resina. Uma mistura de ácido 2-((((9H-fluoren-9- il)metoxi)carbonil)amino)acético (13,38 g, 45,0 mmol), N,N-di-isopropiletilamina (7,86 ml, 45 mmol), hidroxibenzotriazol (6,89 g, 45 mmol), hexafluorofosfato de 2-(6-cloro- 1H-benzo[d][1,2,3]triazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametilisourônio (V) (18,62 g, 45,0 mmol) em DMF (200 ml) foi agitada a 20 °C por 30 min. À mistura adicionou-se o ácido (S)-2- amino-5-(terc-butoxi)-5-oxopentanoico ligado a resina e a mistura resultante foi borbulhada com N2 a 25 °C durante 1,5 horas. A mistura foi filtrada e a resina foi lavada com DMF (4 x 500 ml) e DCM (2 x 500 ml). À mistura foi adicionado TFA/DCM a 1% (5 x 500 ml) e borbulhado com N2 durante 5 minutos. A mistura foi filtrada e o filtrado foi adicionado a uma solução saturada de NaHCO 3 (200 ml) diretamente. A mistura combinada foi separada e a fase orgânica foi lavada com solução saturada de água de ácido cítrico (4 x 400 ml) e salmoura (2 x 300 ml). A solução orgânica final foi seca sobre Na2SO4 (20 g), filtrada, concentrada sob pressão reduzida para proporcionar o composto do título (10 g, rendimento de 20%) como um sólido amarelo claro.
[0133]1H RMN: (CDCl3, 400 MHz) δ = 7,75 (d, J = 7,5 Hz, 2H), 7,59 (br d, J = 7,5 Hz, 2H), 7,41 - 7,36 (m, 2H), 7,30 (t, J = 7,0 Hz, 2H), 5,82 (br s, 1H), 4,57 (br d, J = 4,8 Hz, 1H), 4,38 (br d, J = 7,5 Hz, 2H), 4,27 - 4,15 (m, 1H), 4,06 - 3,83 (m, 2H), 2,50 - 2,29 (m, 2H), 2,26 - 2,13 (m, 1H), 2,06 - 2,02 (m, 1H), 1,43 (s, 9H).
[0134]Etapa 2: Síntese de (S)-4-(2-((((9H-fluoren-9- il)metoxi)carbonil)amino)acetamido)-5-((3-(4- ((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-hidroxi-8b-(2-hidroxiacetil)-6a,8a- dimetil-4-oxo-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-dodeca-hidro-1H- nafto[2',1':4,5]indeno[1,2-d][1,3]dioxol-10-il)benzil)fenil)amino)-5-oxopentanoato de terc-butila
[0135]A uma solução de ácido (S)-2-(2-((((9H-fluoren-9- il)metoxi)carbonil)amino)acetamido)-5-(terc-butoxi)-5-oxopentanoico (Exemplo 4, etapa 1) (424 mg, 0,878 mmol) em DMF (3,5 ml) foi adicionado (6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-(3-aminobenzil)fenil)-7-hidroxi- 8b-(2-hidroxiacetil)-6a,8a-dimetil-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-dodeca-hidro- 4H-nafto[2',1':4,5]indeno[1,2-d][1,3]dioxol-4-ona (Exemplo 2) (500 mg, 0,878 mmol) e trietilamina (0,3 ml, 2,63 mmol) a 25 °C. A solução foi arrefecida até 0 °C e depois foi adicionado 2,4,6-tripropil-1,3,5,2,4,6-trioxatrifosfinano 2,4,6-trióxido (1,12 g, 1,755 mmol). A mistura de reação foi agitada por 12 horas a 25 °C. LCMS mostrou que a reação estava completa. Quatorze frascos adicionais foram configurados como descrito acima. Todas as quinze misturas de reação foram combinadas. A mistura foi purificada por coluna de fase reversa para proporcionar o composto do título (5 g, rendimento de 38,4%) como um sólido amarelo. Método de coluna de fase reversa: Instrumento: HPLC preparativa de Shimadzu LC-8A; Coluna: Phenomenex Luna C18 200*40 mm*10 m; Fase móvel: A para H2O (0,05% TFA) e B para MeCN; Gradiente: B de 30% a 100% em 30 min; Taxa de fluxo: 60 ml/min; Comprimento de onda: 220 e 254 nm.
[0136]LCMS (Método A, Tabela 4) Rt = 1,34 min; m/z 1.016,6 (M+H-18)+.
[0137]Etapa 3: Síntese de (S)-4-(2-((((9H-fluoren-9- il)metoxi)carbonil)amino)acetamido)-5-((3-(4- ((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((di-terc- butoxifosforil)oxi)acetil)-7-hidroxi-6a,8a-dimetil-4-oxo- 2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-dodeca-hidro-1H-nafto[2’,1’:4,5]indeno[1,2- d][1,3]dioxol-10-il)benzil)fenil)amino)-5-oxopentanoato de terc-butila.
[0138]A uma solução de (S)-4-(2-((((9H-fluoren-9- il)metoxi)carbonil)amino)acetamido)-5-((3-(4- ((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-hidroxi-8b-(2-hidroxiacetil)-6a,8a- dimetil-4-oxo-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-dodeca-hidro-1H- nafto[2',1':4,5]indeno[1,2-d][1,3]dioxol-10-il)benzil)fenil)amino)-5-oxopentanoato de terc-butila (Exemplo 4, etapa 2) (400 mg, 0,387 mmol) em DMF (2,5 ml) foram adicionados 1H-tetrazol (271 mg, 3,87 mmol) e dietilfosforamidito de di-terc-butila (1,16 g, 4,64 mmol). A reação foi agitada à temperatura ambiente durante 2,5 horas e depois foi arrefecida até 0 °C. Foi adicionado peróxido de hidrogênio (241 mg, 2,127 mmol) à mistura resultante deixada aquecer à temperatura ambiente e agitada por 1 hora, após o que LCMS mostrou que a reação estava completa. Onze frascos adicionais foram configurados como descrito acima. Todas as doze misturas de reação foram combinadas. A mistura foi purificada por coluna de fase reversa para proporcionar o composto do título (4,4 g, rendimento de 64,2%) como um sólido amarelo. Método da coluna de fase reversa: Instrumento: HPLC preparativa de Shimadzu LC-8A; Coluna: Phenomenex Luna C18 200*40 mm*10 m; Fase móvel: A para H2O e B para MeCN; Gradiente: B de 50% a 100% em 30 min; Taxa de fluxo: 60 ml/min; Comprimento de onda: 220 e 254 nm.
[0139]LCMS (Método A, Tabela 4) Rt = 1,41 min; m/z 1.226,7 (M+H)+.
[0140]Etapa 4: Síntese de (S)-4-(2-aminoacetamido)-5-((3-(4- ((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((di-terc- butoxifosforil)oxi)acetil)-7-hidroxi-6a,8a-dimetil-4-oxo- 2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-dodeca-hidro-1H-nafto[2',1’:4,5]indeno[1,2- d][1,3]dioxol-10-il)benzil)fenil)amino)-5-oxopentanoato de terc-butila.
[0141]A uma solução de (S)-4-(2-((((9H-fluoren-9- il)metoxi)carbonil)amino)acetamido)-5-((3-(4- ((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((di-terc- butoxifosforil)oxi)acetil)-7-hidroxi-6a,8a-dimetil-4-oxo- 2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-dodeca-hidro-1H-nafto[2',1':4,5]indeno[1,2- d][1,3]dioxol-10-il)benzil)fenil)amino)-5-oxopentanoato de terc-butila (Exemplo 4, Etapa 3) (1,1 g, 0,897 mmol) em MeCN (6 ml) foi adicionada piperidina (0,75 ml, 7,58 mmol) a 25 °C. A reação foi agitada à temperatura ambiente por 20 minutos, após o que LCMS mostrou que a reação estava completa. Três frascos adicionais foram configurados como descrito acima. Todas as quatro misturas de reação foram combinadas. A mistura foi concentrada para proporcionar um resíduo, o qual foi tratado com PE (10 ml) sob agitação durante 2 horas. O sólido resultante foi recolhido por filtração e seco sob pressão reduzida para proporcionar o composto do título (3,8 g, rendimento de 90%) como um sólido amarelo.
[0142]LCMS (Método A, Tabela 4) Rt = 1,16 min; m/z 1.004,6 (M+H)+.
[0143]Etapa 5: Síntese de (S)-4-(2-(2-bromoacetamido)acetamido)-5-((3-(4-
((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((di-terc- butoxifosforil)oxi)acetil)-7-hidroxi-6a,8a-dimetil-4-oxo- 2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-dodeca-hidro-1H-nafto[2',1':4,5]indeno[1,2- d][1,3]dioxol-10-il)benzil)fenil)amino)-5-oxopentanoato de terc-butila.
[0144]A uma solução de ácido 2-bromoacético (97 mg, 0,697 mmol) em DMF (2,5 ml) foi adicionado EEDQ (172 mg, 0,697 mmol) à temperatura ambiente. A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 1 hora. (S)-4-(2-aminoacetamido)-5-((3- (4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((di-terc- butoxifosforil)oxi)acetil)-7-hidroxi-6a,8a-dimetil-4-oxo- 2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-dodeca-hidro-1H-nafto[2',1’:4,5]indeno[1,2- d][1,3]dioxol-10-il)benzil)fenil)amino)-5-oxopentanoato de terc-butila (Exemplo 4, Etapa 4) (350 mg, 0,349 mmol) foi adicionado e a solução resultante foi agitada por 2,5 horas, após o que LCMS mostrou que a reação estava completa. Sete frascos adicionais foram configurados como descrito acima. Todas as oito misturas de reação foram combinadas. A reação foi diluída com DCM (100 ml), lavada com HBr aquoso (1 M, 2 x 80 ml), NaHCO3 aquoso (60 ml) e salmoura (60 ml). A camada orgânica foi seca sobre Na2SO4, filtrada e concentrada sob pressão reduzida para proporcionar o composto do título (2 g, rendimento de 63,7%) como um óleo amarelo.
[0145]LCMS (Método A, Tabela 4) Rt = 1,30 min; m/z 1.124,2, 1.125,9 (M+H)+.
[0146]Etapa 6: Síntese de ácido (S)-4-(2-(2-bromoacetamido)acetamido)-5- ((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-hidroxi-6a,8a-dimetil-4-oxo- 8b-(2-(fosfono-oxi)acetil)-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-dodeca-hidro-1H- nafto[2',1’:4,5]indeno[1,2-d][1,3]dioxol-10-il)benzil)fenil)amino)-5-oxopentanoico
[0147]A uma solução de (S)-4-(2-(2-bromoacetamido)acetamido)-5-((3-(4- ((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((di-terc- butoxifosforil)oxi)acetil)-7-hidroxi-6a,8a-dimetil-4-oxo- 2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-dodeca-hidro-1H-nafto[2',1':4,5]indeno[1,2- d][1,3]dioxol-10-il)benzil)fenil)amino)-5-oxopentanoato de terc-butila (Exemplo 4, Etapa 5) (2 g, 1,778 mmol) em DCM (16 ml) foi adicionado TFA (8 ml, 104 mmol) e a mistura resultante foi agitada à temperatura ambiente durante 40 minutos, após o que LCMS mostrou que a reação estava completa. O solvente foi removido sob pressão reduzida. O resíduo resultante foi purificado por HPLC Prep. A fase móvel foi liofilizada diretamente para proporcionar o composto do título (640 mg, rendimento de 35,3%) como um sólido amarelo. Método de preparação para HPLC: Instrumento: HPLC preparativa de Shimadzu LC-8A; Coluna: Phenomenex Luna C18 200*40 mm*10 µm; Fase móvel: A para H2O (0,09% TFA) e B para MeCN; Gradiente: B de 30% a 40% em 20 min; Taxa de fluxo: 60 ml/min; Comprimento de onda: 220 e 254 nm.
[0148]1H RMN: (DMSO-d6, 400 MHz) δ = 9,88 (s, 1H), 8,52 (s, 1H), 8,24 (br d, J = 8,4 Hz, 1H), 7,46 (br d, J = 7,9 Hz, 1H), 7,42 (s, 1H), 7,36 (br d, J = 7,9 Hz, 2H), 7,30 (br d, J = 9,7 Hz, 1H), 7,23 - 7,17 (m, 3H), 6,90 (br d, J = 6,8 Hz, 1H), 6,16 (br d, J = 10,4 Hz, 1H), 5,93 (s, 1H), 5,47 (s, 1H), 4,96 - 4,85 (m, 3H), 4,58 (br dd, J = 7,9, 18,7 Hz, 1H), 4,38 (br d, J = 5,3 Hz, 1H), 4,29 (br s, 1H), 3,93 (s, 2H), 3,89 (s, 2H), 3,80 (br s, 2H), 2,30 - 2,22 (m, 2H), 2,16 - 1,91 (m, 4H), 1,85 - 1,62 (m, 6H), 1,39 (s, 3H), 1,00 (br s, 2H), 0,87 (s, 3H). LCMS (Método A, Tabela 4) Rt = 2,86 min; m/z 956,0, 958,0 (M+H)+.
[0149]Exemplo 5: Síntese de fosfato de 2- ((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-(3-((S)-6-amino-2-(2-(2-
bromoacetamido)acetamido)hexanamido)benzil)fenil)-2,6b-difluoro-7-hidroxi-6a,8a- dimetil-4-oxo-1,2,4,6a,6b,7,8,8a,11a,12,12a,12b-dodeca-hidro-8bH- nafto[2’,1’:4,5]indeno[1,2-d][1,3]dioxol-8b-il)-2-oxoetil di-hidrogênio.
[0150]Etapa 1: Síntese de ((S)-5-(2-((((9H-fluoren-9- il)metoxi)carbonil)amino)acetamido)-6-((3-(4- ((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-difluoro-7-hidroxi-8b-(2- hidroxiacetil)-6a,8a-dimetil-4-oxo-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-dodeca-hidro- 1H-nafto[2’,1’:4,5]indeno[1,2-d][1,3]dioxol-10-il)benzil)fenil)amino)-6-oxo- hexil)carbamato de terc-butila.
[0151]A uma solução de N2-((((9H-fluoren-9-il)metoxi)carbonil)glicil)-N6-(terc- butoxicarbonil)-L-lisina (5,58 g, 8,26 mmol) em DMF (60 ml) a 0 °C foi adicionado 2,4,6-tripropil-1,3,5,2,4,6-trioxatrifosfinano 2,4,6-trióxido (10,51 g, 16,51 mmol) e trietilamina (3,45 ml, 24,77 mmol). A mistura resultante foi agitada à temperatura ambiente durante 1 hora (2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-(3- aminobenzil)fenil)-2,6b-difluoro-7-hidroxi-8b-(2-hidroxiacetil)-6a,8a-dimetil- 1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-dodeca-hidro-4H-nafto[2',1':4,5]indeno[1,2- d][1,3]dioxol-4-ona (Exemplo 1, Etapa 6) foi adicionado (5 g, 8,26 mmol). A mistura resultante foi agitada durante 5 horas à temperatura ambiente, após o que LCMS mostrou que a reação estava completa. Seis frascos adicionais foram configurados como descrito acima. Todas as sete misturas de reação foram combinadas. A reação foi purificada por coluna de fase reversa para proporcionar o composto do título (24 g, rendimento de 24,62%) como um sólido branco. Método da coluna de fase reversa: Instrumento: HPLC Prep de Shimadzu LC-8A; Coluna: Phenomenex Luna C18 200*40 mm*10 m; Fase móvel: A para H2O (0,05% TFA) e B para MeCN; Gradiente: B de 30% a 100% em 30 min; Taxa de fluxo: 60 ml/min; Comprimento de onda: 220 e 254 nm.
[0152]LCMS (Método A, Tabela 4) Rt = 1,29 min; m/z 1.095,6 (M+H-18)+.
[0153]Etapa 2: Síntese de ((S)-5-(2-((((9H-fluoren-9- il)metoxi)carbonil)amino)acetamido)-6-((3-(4- ((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((di-terc- butoxifosforil)oxi)acetil)-2,6b-difluoro-7-hidroxi-6a,8a-dimetil-4-oxo- 2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-dodeca-hidro-1H-nafto[2',1':4,5]indeno[1,2- d][1,3]dioxol-10-il)benzil)fenil)amino)-6-oxo-hexil)carbamato de terc-butila.
[0154]A uma solução de ((S)-5-(2-((((9H-fluoren-9- il)metoxi)carbonil)amino)acetamido)-6-((3-(4- ((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-2,6b-difluoro-7-hidroxi-8b-(2- hidroxiacetil)-6a,8a-dimetil-4-oxo-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-dodeca-hidro- 1H-nafto[2’,1':4,5]indeno[1,2-d][1,3]dioxol-10-il)benzil)fenil)amino)-6-oxo- hexil)carbamato de terc-butila (Exemplo 5, Etapa 1) (3 g, 2,69 mmol) em DMF (30 ml) foi adicionado 1H-tetrazol (1,888 g, 26,9 mmol) e dietilfosforamidito de di-terc-butila (8,06 g, 32,3 mmol) e a reação foi agitada à temperatura ambiente durante 3,5 horas.
Foi adicionado peróxido de hidrogênio (224 mg, 1,97 mmol) à reação e agitado por 0,5 hora, após o que LCMS mostrou que a reação estava completa. Seis frascos adicionais foram configurados como descrito acima. Todas as sete misturas de reação foram combinadas. A reação foi purificada por coluna de fase reversa para proporcionar o composto do título (10 g, pureza: 78%, rendimento de 37,1%) como um sólido branco. Método da coluna de fase reversa: Instrumento: HPLC Prep de
Shimadzu LC-8A; Coluna: Phenomenex Luna C18 200*40 mm*10 m; Fase móvel: A para H2O e B para MeCN; Gradiente: B de 50% a 100% em 30 min; Taxa de fluxo: 60 ml/min; Comprimento de onda: 220 e 254 nm.
[0155]LCMS (Método A, Tabela 4) Rt = 1,42 min; m/z 1.305,7 (M+H)+.
[0156]Etapa 3: Síntese de ((S)-5-(2-aminoacetamido)-6-((3-(4- ((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((di-terc- butoxifosforil)oxi)acetil)-2,6b-difluoro-7-hidroxi-6a,8a-dimetil-4-oxo- 2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-dodeca-hidro-1H-nafto[2’,1’:4,5]indeno[1,2- d][1,3]dioxol-10-il)benzil)fenil)amino)-6-oxo-hexil)carbamato de terc-butila.
[0157]A uma solução de ((S)-5-(2-((((9H-fluoren-9- il)metoxi)carbonil)amino)acetamido)-6-((3-(4- ((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((di-terc- butoxifosforil)oxi)acetil)-2,6b-difluoro-7-hidroxi-6a,8a-dimetil-4-oxo- 2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-dodeca-hidro-1H-nafto[2',1':4,5]indeno[1,2- d][1,3]dioxol-10-il)benzil)fenil)amino)-6-oxo-hexil)carbamato de terc-butila (Exemplo 5, Etapa 2) (2,5 g, 1,969 mmol) em MeCN (10 ml) foi adicionada piperidina (2 ml, 1,969 mmol) e a reação foi agitada à temperatura ambiente por 1 hora, após o que LCMS mostrou que a reação estava completa. Três frascos adicionais foram configurados como descrito acima. Todas as quatro misturas de reação foram combinadas. A reação foi concentrada para proporcionar um produto em bruto, o qual foi agitado em PE (30 ml) por 2 horas. O sólido resultante foi recolhido por filtração e seco sob pressão reduzida para proporcionar o composto do título (7 g, pureza: 83%, rendimento de 70,4%) como um sólido amarelo.
[0158]LCMS (Método a, Tabela 4) Rt = 1,17 min; m/z 1.083,5 (M+H)+.
[0159]Etapa 4: Síntese de ((S)-5-(2-(2-bromoacetamido)acetamido)-6-((3-(4- ((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((di-terc- butoxifosforil)oxi)acetil)-2,6b-difluoro-7-hidroxi-6a,8a-dimetil-4-oxo- 2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-dodeca-hidro-1H-nafto[2',1':4,5]indeno[1,2- d][1,3]dioxol-10-il)benzil)fenil)amino)-6-oxo-hexil)carbamato de terc-butila.
[0160]A uma solução de ácido 2-bromoacético (0,929 g, 6,68 mmol) em DMF (35 ml) foi adicionada 2-etoxi-1-etoxicarbonil-1,2-di-hidroquinolina (1,653 g, 6,68 mmol) e a mistura resultante foi agitada a temperatura ambiente por 1 hora. O produto do Exemplo 5, Etapa 3 (3,5 g, 3,34 mmol) foi adicionado e a mistura resultante foi agitada à temperatura ambiente por 2 horas. LCMS mostrou que a reação foi concluída. A reação foi diluída com DCM (100 ml), lavada com HBr aquoso (1 M, 2 x 80 ml), NaHCO3 aquoso (60 ml) e salmoura (60 ml). A camada orgânica foi seca sobre Na2SO4, filtrada e concentrada sob pressão reduzida para proporcionar o composto do título (2 g, rendimento de 51,2%) como um óleo amarelo.
[0161]LCMS (Método a, Tabela 4) Rt = 1,32 min; m/z 1.205,5 (M+H)+.
[0162]Etapa 5: Síntese de fosfato de 2- ((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(4-(3-((S)-6-amino-2-(2-(2- bromoacetamido)acetamido)hexanamido)benzil)fenil)-2,6b-difluoro-7-hidroxi-6a,8a- dimetil-4-oxo-1,2,4,6a,6b,7,8,8a,11a,12,12a,12b-dodeca-hidro-8bH- nafto[2’,1’:4,5]indeno[1,2-d][1,3]dioxol-8b-il)-2-oxoetil di-hidrogênio.
[0163]A uma solução de ((S)-5-(2-aminoacetamido)-6-((3-(4-
((2S,6aS,6bR,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-8b-(2-((di-terc- butoxifosforil)oxi)acetil)-2,6b-difluoro-7-hidroxi-6a,8a-dimetil-4-oxo- 2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-dodeca-hidro-1H-nafto[2',1':4,5]indeno[1,2- d][1,3]dioxol-10-il)benzil)fenil)amino)-6-oxo-hexil)carbamato de terc-butila (Exemplo 5, Etapa 3) (2 g, 1,661 mmol) em DCM (10 ml) foi adicionado TFA (5 ml, 64,9 mmol) e a reação foi agitada à temperatura ambiente por 40 min, após o que LCMS mostrou que a reação estava completa. O solvente foi removido sob pressão reduzida e o produto em bruto purificado por HPLC Prep. A fase móvel foi liofilizada diretamente para proporcionar o composto do título (550 mg, pureza: 96,9%, rendimento de 32,3%) como um sólido esbranquiçado. Método de preparação para HPLC: Instrumento: HPLC prep de Shimadzu LC-8A; Coluna: Phenomenex Luna C18 200*40 mm*10 m; Fase móvel: A para H2O (0,09% TFA) e B para MeCN; Gradiente: B de 30% a 40% em 20 min; Taxa de fluxo: 60 ml/min; Comprimento de onda: 220 e 254 nm.
[0164]1H RMN: (DMSO-d6, 400 MHz) δ ppm 0,90 (s, 3 H) 1,19 - 1,41 (m, 2 H) 1,43 - 1,62 (m, 7 H), 1,64 - 1,77 (m, 3 H) 1,84 (br d, J = 14,55 Hz, 1 H) 1,95 - 2,07 (m, 1 H) 2,18 - 2,36 (m, 3 H) 2,65 - 2,78 (m, 3 H) 3,71 - 3,86 (m, 3 H) 3,89 (s, 2 H) 3,93 (s, 2 H) 4,20 (br d, J = 9,48 Hz, 1 H) 4,33 - 4,41 (m, 1 H) 4,59 (br dd, J = 18,41, 8,05 Hz, 1 H) 4,81 (br dd, J = 18,52, 8,60 Hz, 1 H) 4,94 (d, J = 4,63 Hz, 1 H) 5,50 (s, 1 H) 5,54 - 5,76 (m, 1 H) 6,13 (s, 1 H) 6,29 (dd, J = 10,14, 1,32 Hz, 1 H) 6,95 (d, J = 7,72 Hz, 1 H) 7,15 - 7,28 (m, 4 H) 7,30 - 7,41 (m, 3 H) 7,51 (br d, J = 7,94 Hz, 1 H) 7,72 (br s, 3 H) 8,21 (br d, J = 7,72 Hz, 1 H) 8,54 (t, J = 5,62 Hz, 1 H) 9,93 (br d, J = 2,65 Hz, 1 H) LCMS (Método a, Tabela 4) Rt = 2,31 min.
[0165]Exemplo 6: Síntese de (S)-2-((2-(2-bromoacetamido)etil)amino)-N-((S)- 1-((3-(4-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-hidroxi-8b-(2-hidroxiacetil)- 6a,8a-dimetil-4-oxo-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-dodeca-hidro-1H- nafto[2',1':4,5]indeno[1,2-d][1,3]dioxol-10-il)benzil)fenil)amino)-1-oxopropan-2- il)propanamida.
[0166]O produto do exemplo 6 pode ser sintetizado a partir do acoplamento de N-(2-((((9H-fluoren-9-il)metoxi)carbonil)amino)etil)-N-(terc-butoxicarbonil)-L-alanil- L-alanina (o produto das etapas S1 e S2 abaixo) ao produto amino do Exemplo 2, seguido pelas etapas S4 a S6: (1) desproteção de Fmoc, (2) acoplamento com ácido 2-bromoacético e (3) desproteção de Boc. Fmoc = Fluorenilmetiloxicarbonila; Boc = terc-butoxicarbonila.
PROTOCOLO GERAL DE CONJUGAÇÃO DE CISTEÍNA
[0167]Uma solução aproximada de 5 a 20 mg/ml do anticorpo desejado foi preparada em tampão PBS, pH 6 a 7,4. Um agente de redução de escolha, tal como TCEP, foi diluído ou dissolvido em solventes tais como H2O, DMSO, DMA ou DMF para dar uma solução com uma faixa de concentração entre 1 a 25 mM. Os anticorpos (hIgG1 anti-hTNF (D2E7) ou mIgG2a anti-mTNF (8C11; McRae BL et al. J Crohns Colitis 10 (1): 69 a 76 (2016)) foram então parcialmente reduzidos adicionando cerca de 2 a 3,5 equivalentes de agente redução, misturando brevemente e incubando durante a noite a 0 a 4 °C. Foi então adicionado tampão Tris, pH 8 a 8,5 (20 a 50 mM), seguido pelo medicamento ligante em DMSO ou DMA (menos de 15% do total) e a mistura foi incubada por 2 a 3 horas à temperatura ambiente. O excesso de agente ligante e solvente orgânico foi então removido por purificação. As amostras de ADC purificadas foram então analisadas por SEC, HIC e espectrometria de massa reduzida.
PROCEDIMENTOS ANALÍTICOS DE ADC
[0168]Os ADCs foram perfilados por cromatografia de troca aniônica (AEC) ou cromatografia de interação hidrofóbica (HIC) para determinar o grau de conjugação e pureza de ADC.
[0169]AEC. Aproximadamente 20 µg de ADC foram carregados em um sistema Ultimate 3000 Dual LC (Thermo Scientific) equipado com uma coluna PropacTM WAX-10 de 4 x 250 mm (Tosoh Bioscience, cat. 054999). A coluna foi equilibrada com 100% de tampão A e eluída usando um gradiente linear de 100% de tampão A a 100% de tampão B ao longo de 18 min a 1,0 ml/min, em que o tampão A é 20 mM MES, pH 6,7 e o tampão B é 20 mM MES, 500 cloreto de sódio, pH 6,7.
[0170]HIC. Aproximadamente 20 g do ADC foram carregados em um sistema Ultimate 3000 Dual LC (Thermo Scientific) equipado com uma coluna NPR butil a 4,6 x 35 mm (Tosoh Bioscience, cat. 14947). A coluna foi equilibrada em 100% de tampão A e eluída usando um gradiente linear de 100% de tampão A a 100% de tampão B durante 12 min a 0,8 ml/min, em que o tampão A é 25 mM de fosfato de sódio, 1,5 M de sulfato de amônio, pH 7,0 e o tampão B é 25 mM de fosfato de sódio, isopropanol a 25%, pH 7,0.
[0171]SEC. As distribuições de tamanho dos ADCs foram perfiladas por SEC de exclusão de tamanho usando um sistema Ultimate 3000 Dual LC (Thermo Scientific) equipado com uma coluna TSK-gel 3000SWXL de 7,8 X 300 mm (Tosoh Bioscience, cat. 08541). Aproximadamente 20 µg de ADC foram carregados na coluna e eluídos ao longo de 17 min usando um gradiente isocrático de 100 mM de sulfato de sódio, 100 mM de fosfato de sódio, pH 6,8 a uma taxa de fluxo de 1,0 ml/min.
[0172]MS. Amostras reduzidas (10 µl) foram injetadas em um sistema Agilent 6550 QTof LC/MS através de um amostrador automático CTC com temperatura controlada (5 C). A eluição da amostra foi obtida em Waters C-4, 3,5 µm, 300 Å, 2,1 x 50 mm i.d. Coluna HPLC. As fases móveis foram: A: ácido fórmico a 0,1% em água e B: ácido fórmico a 0,1% em MeCN; a taxa de fluxo foi de 0,45 ml/min e o compartimento da coluna foi mantido a 40 °C.
[0173]O gradiente de HPLC é como apresentado na Tabela 5: TABELA 5 Tempo (min) % de A % de B 0 95 5 0,6 95 5 1,1 10 90 2,2 10 90 2,4 95 5 3,5 95 5
[0174]Exemplo 7: Preparação de adalimumabe conjugado com um glicocorticosteroide para fornecer um conjugado de anticorpo-fármaco.
[0175]O ADC de Adalimumab BrAc-Gly-Glu-Esteroide-PO 4 com uma DAR de população 4.0 foi preparado por um processo químico em duas etapas: redução dissulfeto de adalimumabe seguida de alquilação (conjugação) com esteroide do ácido bromoacetamido glicina-glutâmico Exemplo 4.
[0176]100 mg de adalimumabe na concentração de 20 mg/ml foram reduzidos com ácido difenilfosfinoacético (2,9 a 3,0 eq) a 0 °C durante a noite. O adalimumabe parcialmente reduzido foi então conjugado ao Exemplo 4 (10 eq) em DMSO por 3 horas à temperatura ambiente. A mistura de conjugação foi primeiro submetida a troca de tampão a tampão Tris 20 mM, NaCl 50 mM, pH 7,8 usando várias colunas de dessalinização NAP 25. A solução dessalinizada de ADC foi purificada pela AEC para proporcionar os componentes DAR4 do ADC. Método de cromatografia AEC: Instrumento: Akta puro; Coluna: 2X Hitrap Q HP 5 ml; Fase móvel: A para Tampão de Tris 20 mM, pH 7,8; B para tampão de Tris 20 mM, NaCl 1 M, pH 7,8; Gradiente: B de 0% a 25% em 60 min; Taxa de fluxo: 5 ml/min; Comprimento de onda: 280 e 214 nm.
[0177]Referindo-se à Figura 1, que mostra uma resolução cromatográfica da preparação de ADC resultante, o ADC é uma mistura heterogênea contendo anticorpos com duas moléculas ligante de fármaco ligadas (pico "DAR2"), quatro moléculas ligante de fármaco ligadas (pico de "DAR4"), dependendo do número de ligações dissulfeto intercadeia reduzidas. As condições de AEC usadas na Figura 1 foram como se segue:
[0178]A coluna era PropacTM WAX-10, 4 X 250 mm (Thermo Fisher Scientific, cat. 054999) e a temperatura da coluna foi de 37 C. O comprimento de onda foi de 280 nm, o tempo de execução foi de 18 minutos, a quantidade de injeção foi de 20 μg e a vazão foi de 1,0 ml/minuto. Fase móvel A: MES 20 mM, pH 6,7, Fase Móvel B: MES 20 mM, NaCl 500 mM, pH 6,7. Perfil de gradiente (Tabela 6): TABELA 6 Tempo (min) Fase móvel A (%) Fase móvel B (%) 0 75 25 14 5 95 16 0 100 18 0 100
[0179]A Figura 2 mostra um espectro de massa deconvoluído do ADC purificado. Esse ADC tem 4 moléculas ligantes de fármacos conjugadas a cada anticorpo. O pico à esquerda tem um peso molecular de 24.284,74 Da, que é o resultado de um ligante de fármaco ligado a uma única cadeia leve. O pico à direita tem um peso molecular de 51.513,96 Da, que é o resultado de um ligante de fármaco ligado a uma única cadeia pesada. Os ADCs da Tabela 7 e 8 foram preparados de acordo com o procedimento descrito acima. TABELA 7: CONJUGADOS DE ANTICORPO-FÁRMACO TNFa ANTICAMUNDONGO. X refere-se ao anticorpo TNFa antimurino 8C11
NO DE Estrutura DAR
ID ADC1 4 ADC2 4 ADC3 4 TABELA 8: CONJUGADOS DE ANTICORPO-FÁRMACO TNFa ANTI- HUMANO. X refere-se ao anticorpo TNFa anti-humano adalimumabe ID da Estrutura DAR empresa
ADC4 4 ADC5 2 ADC6 4 GERAÇÃO DE LINHAGENS DE CÉLULAS REPÓRTERES TNF-ALFA GRE
TRANSMEMBRANARES HUMANAS E DE CAMUNDONGOS
[0180]Para criar uma linhagem de células parental, as células K562 foram semeadas em uma placa de 6 cavidades (Costar: 3516) com 2 ml de meio de crescimento completo (RPMI, 10% de FBS, 1% de L-glutamina, 1% de piruvato de Na e 1% MEM NEAA) a 500.000 células por cavidade durante 24 horas a 37 °, 5% de CO2. No dia seguinte, 1,5 g de pGL4.36 [Luc2P/MMTV/Hygro] (Promega: E316), 1,5 µg de pGl4.75 [hRLuc/CMV] (Promega: E639A) e 3 µl de reagente PLUS (Invitrogen: 10964 -021) foram diluídos em 244 l de Opti-MEM (Gibco: 31985-070) e incubados à temperatura ambiente durante 15 minutos. O vetor pGL4.36 [luc2P/MMTV/Hygro]
contém MMTV LTR (Repetição Longa do Terminal do Vírus do Tumor Mamário Murino) que aciona a transcrição do gene repórter luciferase luc2P em resposta à ativação de vários receptores nucleares, como o receptor glicocorticoide e o receptor androgênico. O vetor pGL4.75 [hRluc/CMV] codifica o gene repórter luciferase hRluc (Renilla reniformis) e foi concebido para expressão elevada e reduzida transcrição anômala.
[0181]Após a incubação, a solução diluída de DNA foi pré-incubada com solução 1:1 de lipofectamina LTX (Invitogen: 94756) (13,2 l + 256,8 l Opti-MEM) e incubada à temperatura ambiente por 25 minutos para formar complexos de DNA- lipofectamina LTX. Após a incubação, 500 l de complexos de DNA-Lipofectamina foram adicionados diretamente às células contendo a cavidade. Células K562 foram transfectadas durante 24 horas a 37 °C, 5% de CO2. Após a incubação, as células foram lavadas com 3 ml de PBS e selecionadas com meio de crescimento completo contendo 125 g/ml de higromicina B (Invitrogen: 10687-010) por duas semanas.
Foram produzidas células "K562 pGL4.36 [Luc2P/MMTV/Hygro]_pGL4.75 [hRLuc/CMV]".
[0182]Para criar uma linhagem celular repórter GRE TNF-alfa transmembrana murina, as células parentais, K562 pGL4.36 [Luc2P/MMTV/Hygro]_pGL4.75 [hRLuc/CMV], foram semeadas em placa de 6 cavidades (Costar: 3516) com 2 ml de meio de crescimento completo (meio RPMI, 10% de FBS, 1% de L-glutamina, 1% de Piruvato de Na e 1% de NEAA MEM) a 500.000 células por cavidade, durante 24 h a 37 °, 5% de CO2. No dia seguinte, 3 g de DNA mFL_TNFa (Origene: MC208048), que codifica TNF de camundongo não marcado, e 3 l de reagente PLUS (Invitogen: 10964-021) foram diluídos em 244 l de Opti-MEM (Gibco: 31985-070) e incubados à temperatura ambiente por 15 minutos. Após a incubação, a solução diluída de DNA foi pré-incubada com solução 1:1 de lipofectamina LTX (Invitogen: 94756) (13,2 l + 256,8 l Opti-MEM) e incubada à temperatura ambiente por 25 minutos para formar complexos de DNA-lipofectamina LTX. Após a incubação, 500 l de complexos de DNA-Lipofectamina foram adicionados diretamente às células contendo a cavidade.
As células parentais K562 pGL4.36[Luc2P/MMTV/Hygro]_pGL4.75 [hRLuc/CMV] foram transfectadas durante 24 horas a 37 °C, 5% de CO 2. Após a incubação, as células foram lavadas com 3 ml de PBS e selecionadas com meio de crescimento completo contendo 125 g/ml de higromicina B (Invitrogen: 10687-010) e 250 g/ml de G418 (Gibco: 10131-027) por duas semanas. Foram produzidas células "FL-TNFa GRE de camundongo K562 (pGL4.36[luc2P/MMTV/Hygro])".
[0183]Para criar uma linhagem celular repórter TNF-alfa GRE transmembranar humana, as células parentais, K562 pGL4.36 [Luc2P/MMTV/Hygro]_pGL4.75 [hRLuc/CMV], foram transfectadas com o construto de plasmídeo de plasmídeo hTNF delta 1-12 C-Myc pcDNA3.1 (-). Este plasmídeo é o pcDNA 3.1 (Thermofisher cat # V79020) que codifica o TNF transmembranar resistente a tace (isto é, SEQ ID NO: 1 sem os aminoácidos 77 a 88). (Consultar Perez C et al. Cell 63 (2): 251 a 258 (1990) discutindo TNF transmembranar resistente a tace). Essas linhagens celulares foram então usadas nos ensaios repórter TNF-alfa descritos nos exemplos subsequentes.
ATIVIDADE DE IMUNOCONJUGADOS ANTI-TNF-ALFA EM ENSAIOS COM REPÓRTERES TNF-ALFA TRANSMEMBRANARES GRE
[0184]As células K562 parentais GRE (pGL4.36 [luc2P/MMTV/Hygro]) e as células K562 mFL-TNF-a ou hTNF delta 1-12 células GRE (pGL4.36 [luc2P/MMTV/Hygro]) foram plaqueadas em placas brancas tratadas de cultura de tecidos de 96 cavidades (Costar: 3917) a 50.000 células por cavidade em 50 µl de meio de ensaio (RPMI, 1% CSFBS, 1% de L-glutamina, 1% de Piruvato de Na e 1% de MEAA). As células foram tratadas com 25 ml de conjugados de anticorpo-fármaco anti-TNF-a murinos ou humanos diluídos 3X em série ou em meio de ensaio, composto esteroide, ou meio sozinho e incubadas durante 48 horas a 37 °C, 5% de
CO2. Após 48 horas de incubação, as células foram tratadas com 75 µl de Sistema de Ensaio de Luciferase Dual Glo (Promega-E2920) por 10 min e analisadas quanto à luminescência usando o Microbeta (PerkinElmer). Os dados foram analisados usando uma curva de quatro parâmetros ajustada para gerar valores de EC50. A % de ativação máxima foi normalizada para 100 nM de dexametasona. Os resultados usando a linhagem celular de TNF-alfa murino estão apresentados na Tabela 9, abaixo, e os resultados usando a linhagem celular de TNF-alfa humano são apresentados na Tabela 10 abaixo. Na Tabela 9, abaixo, o anticorpo no ADC é o anticorpo anti-TNFα murino 8C11. Na Tabela 10 abaixo, o anticorpo no ADC é o anticorpo anti-TNFα humano adalimumabe. A porcentagem (%) de monômero foi determinada por SEC como descrito anteriormente (consulte os procedimentos analíticos da ADC).
TABELA 9: ATIVIDADE IN VITRO DO CONJUGADO DE ANTICORPO- FÁRMACO ANTI-TNFa MURINO NO ENSAIO DE REPÓRTER GRE TNFa
TRANSMEMBRANAR DE CAMUNDONGO mTNFa mTNFa K562 GRE % de K562 GRE ADC GRE EC50 GRE EC50 monômero (% de máx) (µg/ml) (% de máx) (µg/ml) ADC1 99,9 0,06 150 > 50 63 ADC2 99,3 0,39 164 > 50 72 ADC3 100 0,04 104 3,9 84 TABELA 10: ATIVIDADE IN VITRO DO CONJUGADO DE ANTICORPO- FÁRMACO ANTI-TNFa ANTI-HUMANO NO ENSAIO DE REPÓRTER GRE DE TNFa
TRANSMEMBRANAR HUMANO hTNFa hTNFa K562 GRE % de K562 GRE ADC GRE EC50 GRE EC50 Monômero (% de máx) (µg/ml) (% de máx) (µg/ml) ADC4 99,9 0,03 118 > 50 63 ADC5 100 0,03 126 > 50 28 ADC6 100 0,05 97 > 50 83 ATIVIDADE DE IMUNOCONJUGADOS ANTI-hTNF ALFA EM ENSAIO DE
LIBERAÇÃO DE CITOCINA PBMC HUMANA ESTIMULADA POR LIPOPOLISSACARÍDEO
[0185]As células mononucleares do sangue periférico humano primário (PBMCs) foram adquiridas da Biological Specialty Corporation (cat # 214-00-10), lavadas em 50 ml de PBS, ressuspensas em FBS com 5% de DMSO, aliquotadas e criopreservadas em nitrogênio líquido até o uso. As PBMCs foram descongeladas, ressuspensas em meio RPMI suplementado com 2% de FBS e 1% de penicilina- estreptomicina e plaqueadas em uma placa de ensaio celular (Costar # 3799). Em seguida, as células foram incubadas em concentrações variando de anti-TNF ADC a 37 °C e 5% de CO2 durante 4 horas. As células foram então estimuladas com 100 ng/ml de LPS durante a noite. No dia seguinte, a placa foi centrifugada por cinco minutos a 1.000 rpm e 100 µl de meio sobrenadante foram transferidos diretamente para uma placa adicional de 96 cavidades e analisados para concentrações de IL-6 (MSD, # K151AKB) e de IL-1 beta (MSD, # K151AGB). Os dados de resposta de dosagem foram ajustados a uma curva sigmoidal usando regressão não linear, e os valores de IC50 calculados com o auxílio de GraphPad 5.0 (GraphPad Software, Inc.).
Os resultados mostrados na Tabela 11 demonstram que o ADC anti-TNF tem atividade potente na inibição da liberação de citocinas pró-inflamatórias IL-6 e IL-1beta a partir de células imunes primárias ativadas.
TABELA 11. ATIVIDADE IN VITRO DE ADC ESTEROIDE ANTI-TNF EM
ENSAIO DE LIBERAÇÃO DE CITOCINA ESTIMULADA POR PBMC IC50 (ng/ml) ADC IC50 de IL-1 beta (ng/ml) de IL-6 ADC4 44 265 ATIVIDADE DO IMUNOCONJUGADO ANTI-mTNF-ALFA EM MODELO DE
HIPERSENSIBILIDADE DE CONTATO
[0186]ADC esteroide anti-TNF foi avaliado em um modelo de hipersensibilidade de contato agudo, uma elicitação de inflamação aguda da pele usando resposta de hipersensibilidade de tipo retardado (DTH) (acionada por células
T) através da aplicação de um agente sensibilizante (isotiocianato de fluoresceína (FITC)). A eficácia dos ADCs esteroides anti-TNFa foi medida pela capacidade de reduzir o inchaço da orelha. Os biomarcadores esteroides corticosterona e procolágeno tipo 1 do terminal N (P1NP) foram incluídos como leituras para avaliar o impacto putativo do tratamento com ADC esteroide anti-TNFa no eixo Hipotálamo- Hipófise-Adrenal (HPA) e regeneração óssea, respectivamente.
INCHAÇO DA ORELHA
[0187]No dia 0, os camundongos foram colocados sob anestesia geral e o abdômen foi raspado. Usando uma micropipeta, os camundongos foram sensibilizados por aplicação epicutânea de 400 µl de solução de FITC (solução a 1,5% em 1:1 de acetona:DBP) sobre o abdome. Seis dias depois, os camundongos foram dosados com veículo ou agente terapêutico 1 hora antes do desafio da orelha com FITC. Para o desafio da orelha, os camundongos foram colocados sob anestesia geral e foram desafiados com 20 μl de FITC aplicado na orelha direita. Vinte e quatro horas após o desafio, os camundongos foram colocados sob anestesia geral e a espessura da orelha é medida por paquímetro. A diferença entre orelhas desafiadas e não desafiadas foi calculada. Setenta e duas horas após o estímulo auditivo, os camundongos foram injetados com ACTH a 1 mpk IP e sangrados terminalmente 30 minutos após o ACTH. O plasma foi coletado e analisados os níveis de P1NP, corticosterona, esteroide livre e grandes moléculas.
QUANTIFICAÇÃO DE CORTICOSTERONA ENDÓGENA E ESTEROIDE LIVRES LIBERADOS
[0188]A curva de calibração do esteroide foi preparada no plasma de camundongo com concentrações finais de 0,03 nM a 0,1 µM em 8 níveis de concentração diferentes. A curva de calibração de corticosterona variando de concentrações finais de corticosterona de 0,3 nM a 1 µM foi preparada em 70 mg/ml de solução de albumina de soro bovino em tampão PBS. Uma solução de 160 µl de
MeCN com ácido fórmico a 0,1% foi adicionada a amostras de plasma de 40 µl ou padrões de calibração do estudo. Os sobrenadantes foram diluídos com água destilada e 30 µl de solução final de amostra foram injetados para análise por LC/MS.
[0189]A quantificação de corticosterona e esteroide livre liberado foi realizada em um espectrômetro de massa triplo quádruplo AB Sciex 5500 conectado a um sistema HPLC Shimadzu AC20 em interface com uma fonte de ionização por eletropulverização, operando no modo positivo. Uma coluna Waters XBridge BEH C18, 2,1 x 30 mm, 3,5 µm foi usada para separação por cromatografia. A fase móvel A foi de ácido fórmico a 0,1% em água Milli Q HPLC e a fase móvel B foi de ácido fórmico a 0,1% em MeCN. Um gradiente linear de 2% de fase móvel B a 98% de fase móvel B foi aplicado de 0,6 a 1,2 min. O tempo total de execução foi de 2,6 minutos a uma taxa de fluxo de 0,8 ml/min. O espectrômetro de massa foi operado no modo MRM positivo à temperatura da fonte de 700 C.
QUANTIFICAÇÃO DE P1NP NO PLASMA
[0190]A quantificação do P1NP no plasma foi realizada em uma plataforma LCMS com base na digestão com proteína tripsina. As amostras de plasma foram parcialmente precipitadas e completamente reduzidas adicionando-se a mistura MeCN/bicarbonato de amônio 0,1 M/DTT. O sobrenadante foi coletado e alquilado por adição de ácido iodoacético. As proteínas alquiladas foram digeridas por tripsina e os peptídeos trípticos resultantes foram analisados por LCMS. A curva de calibração foi gerada usando peptídeo sintético tríptico adicionado a soro de cavalo (matriz substituta não interferente). O peptídeo flanqueador marcado com isótopo estável (extensão de 3 a 6 aminoácidos em ambos os terminais do peptídeo tríptico) foi usado como padrão interno adicionado à mistura de precipitação de proteínas MeCN/DTT para normalizar a eficiência da digestão e a injeção de LCMS.
[0191]Uma coluna Columnex Chromenta BB-C18, 2,1 x 150 mm, 5 µm foi usada para a separação por cromatografia. A fase móvel A foi de ácido fórmico a 0,1%
em água Milli Q HPLC e a fase móvel B foi de ácido fórmico a 0,1% em MeCN. Um gradiente linear de 2% de fase móvel B a 65% de fase móvel B foi aplicado de 0,6 a 3 min. O tempo total de execução foi de 8 minutos a uma taxa de fluxo de 0,45 ml/min.
Um espectrômetro de massa de armadilha AB Sciex 4000Q foi usado no modo MRM positivo para quantificar peptídeos P1NP, na temperatura de fonte de 700 C.
RESULTADOS
[0192]Os resultados são dados na Tabela 12 abaixo: TABELA 12: COMPARAÇÃO DA ATIVIDADE DE ADC ESTEROIDE ANTI- mTNF ALFA NO INCHAÇO DA ORELHA E BIOMARCADORES ESTEROIDES NO
MODELO DE INFLAMAÇÃO CHS Inchaço da orelha P1NP Corticosterona ADC (% de inibição a 10 (% de inib. a 10 (% de inibição a 10 mpk ± SEM) mpk ± SEM) mpk ± SEM) ADC1 82,8 ± 2,3 32,6 ± 3,8 4,7 ± 10,5 ATIVIDADE DE IMUNOCONJUGADOS ANTI-mTNF-ALFA NA ARTRITE
INDUZIDA POR COLÁGENO
[0193]A capacidade do ADC esteroide anti-mTNFa (ADC1) de impactar a doença foi avaliada no modelo de artrite induzida por colágeno (CIA).
[0194]Nestes experimentos, os camundongos machos DBA/1J foram obtidos da Jackson Labs (Bar Harbor, ME). Os camundongos foram utilizados com 6 a 8 semanas de idade. Todos os animais foram mantidos em temperatura e umidade constantes sob um ciclo claro/escuro de 12 horas e alimentados com ração para roedores (Lab Diet 5010 PharmaServ, Framingham, MA) e água ad libitum. A AbbVie é credenciada pela AAALAC (Associação para Avaliação e Acreditação de Cuidados com Animais de Laboratório) e todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Uso e Cuidados com Animais (IACUC) e monitorados por um veterinário assistente. O peso e a condição corporal foram monitorados e os animais foram sacrificados se exibissem > 20% de perda de peso.
[0195]Os camundongos machos DBA/J foram imunizados por via intradérmica (i.d.) na base da cauda com 100 µl de emulsão contendo 100 µg de colágeno bovino tipo II (MD Biosciences) dissolvido em ácido acético 0,1 N e 200 µg de H37Ra Mycobacterium tuberculosis inativado pelo calor (Adjuvante completo de Freund, Disco, Laurence, KS). Vinte e um dias após a imunização com colágeno, os camundongos receberam IP aumentado com 1 mg de Zymosan A (Sigma, St. Louis, MO) em PBS. Após o aumento, os camundongos foram monitorados 3 a 5 vezes por semana em busca de artrite. As patas traseiras foram avaliadas quanto ao inchaço das patas usando pinças de mola Dyer (Dyer 310-115).
[0196]Os camundongos foram inscritos entre os dias 24 e 28 nos primeiros sinais clínicos da doença e distribuídos em grupos de gravidade artrítica equivalente.
O tratamento terapêutico precoce começou no momento da inscrição.
[0197]Os animais receberam dosagem uma vez intraperitoneal (ip) com mAb anti-mTNF (alta dose) ou ADC esteroide anti-mTNF (alta e baixa dose - mpk) em solução salina a 0,9%. O sangue foi coletado para a exposição do anticorpo por corte na cauda às 24 e 72 horas após a dose. As patas foram coletadas no momento terminal para a histopatologia. O sangue foi coletado no momento terminal por punção cardíaca para hemogramas completos (Sysmex XT-2000iV). A significância estatística foi determinada pela ANOVA.
[0198]Os resultados são mostrados na Figura 3 e demonstram que uma dose única de ADC esteroide anti-TNFa pode exibir uma duração de ação prolongada através da melhoria do inchaço da pata por ~28 dias em comparação com o mAb anti- TNFa ou veículo sozinho.
ESTABILIDADE DE ADC NO PLASMA
[0199] Embora a hidrólise tenha sido empregada para aumentar a estabilidade in vivo de ligantes à base de maleimida, geralmente requer exposição ao pH básico, o que pode levar a modificações no anticorpo (por exemplo, desamidação), aumento da heterogeneidade, diminuição do rendimento e similares. (Shen et al., Nature Biotechnology 30: 184 a 189 (2012) (a hidrólise de maleimidas evita a liberação prematura do medicamento e a exposição sistêmica ao medicamento); Strop et al., Chemistry & Biology 20 (2): 161 a 167 (2013) (um estudo semelhante); Tumey et al., Bioconjugate Chem 25 (10): 1.871 a 1.880 (2014) (uso de uma cadeia PEG proximal para permitir a hidrólise do anel em condições básicas); Lyon et al., Nature Biotechnology 32: 1.059 a 1.062 (2014) (processos para facilitar a criação de succinimida hidrolisada); Christie et al., J Control Release 220 (PtB): 660 a 670 (28 dez 2015) (uso de N-aril maleimidas para facilitar hidrólise de anel de succinimida em condições básicas); Dovgan et al., Scientific Reports 6: 1 (2016) (uso de 2- (maleimidometil)-1,3-dioxano para facilitar a hidrólise do anel em condições levemente básicas por um período prolongado); e J Pharm Sci 2013: 102 (6) 1.712 a 1.723 (dependência de desamidação por asparagina no tipo de tampão, pH e temperatura).
Em contraste, as condições típicas para a conjugação usando bromo acetamida estão completas dentro de algumas horas, em comparação com vários dias para a maleimida (conjugação e subsequente hidrólise do anel em pH básico). Além disso, a 2-mercaptoacetamida formada durante a reação de cisteína com a bromo acetamida não é suscetível à reação reversa de Michael e proporciona uma ligação estável do ligante ao anticorpo, conforme demonstrado na Tabela 13 abaixo para o ADC4.
TABELA 13 % de SM liberado do ADC no plasma após 4d a 37 °C Tampão PBS1X Camundongo Rato Cyno Humano
BLQ BLQ BLQ BLQ BLQ BLQ- Abaixo do nível de quantificação (<1,0nM)
ESTABILIDADE DE ADC NA SOLUÇÃO
[0200]Para avaliar a estabilidade a longo prazo, um produto biológico é submetido a um teste de estresse acelerado. O protocolo para este teste é 100 mg/ml do produto biológico em 15 mM de histidina a 40 °C por 21 dias. Quando o ADC4 foi submetido a esse teste, o aumento percentual do agregado foi <5% em comparação com o ADC203 da Publicação de Pedido de Patente dos EUA no 2018/012600, publicada em 10 de maio de 2018, que observou um aumento na agregação de 18% (Tabela 14). Isso demonstra as propriedades aprimoradas conferidas ao ADC4 pelo ligante Gly-Glu com o profármaco de fosfato da carga útil. ADC203 do US2018/0126000 é: onde n = 4 e A refere-se ao anticorpo anti-TNFa humano adalimumabe.
TABELA 14 ADC Perda de monômero a Perda de monômero Perda de monômero 5 °C por 21 dias a 25 °C por 21 dias a 40 °C por 21 dias ADC203 1,43% 2,26% 17,56% ADC4 <0,5% <0,5% 3,46%
[0201]Um benefício adicional do profármaco de fosfato é que ele permite o uso de cromatografia de troca aniônica para a purificação de DAR. Isso resulta em uma resolução de pico aprimorada em comparação com a cromatografia de interação hidrofóbica, resultando em maiores rendimentos de ADC purificado por DAR.
[0202]No tampão de formulação, o anel de succinimida hidrolisado do ADC203 está em equilíbrio com a forma fechada do anel. A forma de anel fechado é suscetível à reação reversa de Michael e subsequente perda de ligante-fármaco in vivo em macacos cinomolgos (Figura 4).
[0203]Sob condições nominais de armazenamento de líquidos, a ligação da succinimida na conformação aberta irá reformar a conformação fechada superior a 5% a 5 °C e superior a 15% a 25 °C após 6 meses (Tabela 15).
TABELA 15 % de anel de succinimida fechado Tempo/Temp Cadeia leve Cadeia pesada 3 Meses/5 °C 2,2 4,6 6 Meses/5 °C 3,2 6,9 3 Meses/25 °C 10,1 13,3 6 Meses/25 °C 16,6 24,1 3 Meses/40 °C 26,2 33,7 3 Meses/40 °C 26,8 39,0
[0204]Deve ser apreciado que a seção Descrição Detalhada, e não as seções Sumário e Resumo, se destina a ser usada para interpretar as reivindicações. As seções Sumário e Resumo estabelecem uma ou mais, mas não todas, as modalidades exemplificativas da presente divulgação, conforme contempladas pelo inventor (ou inventores), e, portanto, não se destinam a limitar a presente divulgação e as reivindicações anexas de nenhuma maneira.
[0205]A presente divulgação foi descrita acima com a ajuda de blocos de construção funcionais que ilustram a implementação de funções especificadas e seus relacionamentos. Os limites desses blocos de construção funcionais foram aqui arbitrariamente definidos para a conveniência da descrição. Limites alternativos podem ser definidos desde que as funções e os relacionamentos especificados sejam executados adequadamente.
[0206]A descrição anterior das variantes específicas irá, portanto, revelar completamente a natureza geral da descrição que outros podem, por aplicação do conhecimento dentro da especialidade da técnica, prontamente modificar e/ou adaptar para várias aplicações tais modalidades específicas, sem experimentação indevida, sem se afastar do conceito geral da presente divulgação. Portanto, tais adaptações e modificações devem estar dentro do significado e da faixa de equivalentes das modalidades divulgadas, com base no ensino e orientação aqui apresentados. Deve ser entendido que a fraseologia ou terminologia aqui contida é para fins de descrição e não de limitação, de modo que a terminologia ou fraseologia da presente especificação seja interpretada pelo versado na técnica à luz dos ensinamentos e orientações.
[0207]A amplitude e o escopo da presente divulgação não devem ser limitados por nenhuma das modalidades exemplificativas descritas acima, mas devem ser definidos apenas de acordo com as reivindicações a seguir e seus equivalentes.
INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA
[0208]Todas as publicações, incluindo patentes e pedidos publicados, mencionados na Descrição Detalhada, são incorporados por referência aqui na íntegra.

Claims (11)

REIVINDICAÇÕES
1.Conjugado de anticorpo-fármaco CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: (a) um anticorpo anti-TNFα que compreende uma cadeia pesada apresentada como SEQ ID NO: 3 e uma cadeia leve apresentada como SEQ ID NO: 4; e (b) um agonista de receptor de glicocorticoide que compreende um radical representado pela fórmula: em que o anticorpo é conjugado com o agonista de receptor de glicocorticoide por meio de um ligante representado pela fórmula: .
2. Conjugado de anticorpo-fármaco, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que é de acordo com a fórmula: em que A é o anticorpo e n é um número inteiro de 1 a 10.
3.Conjugado de anticorpo-fármaco, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que n é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10.
4.Conjugado de anticorpo-fármaco, de acordo com a reivindicação 2,
CARACTERIZADO pelo fato de que n é 4.
5.Conjugado de anticorpo-fármaco, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que n é 2.
6.Composição farmacêutica CARACTERIZADA pelo fato de que compreende o conjugado de anticorpo-fármaco, de acordo com a reivindicação 4, e um carreador farmaceuticamente aceitável.
7.Método CARACTERIZADO pelo fato de que é para tratar uma afecção selecionada entre artrite reumatoide, espondilite anquilosante, artrite psoriática, psoríase em placa, colite ulcerativa, doença de Crohn adulta, doença de Crohn pediátrica, uveíte, hidradenite supurativa e artrite idiopática juvenil em um sujeito que compreende administrar uma quantidade eficaz do conjugado de anticorpo-fármaco, de acordo com a reivindicação 4, ao sujeito.
8.Kit CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: (a)um recipiente que compreende o conjugado de anticorpo-fármaco, de acordo com a reivindicação 4, ou a composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 6; e (b)um rótulo ou bula dentro de ou associado a um ou mais recipientes, em que o rótulo ou bula indica que o conjugado de anticorpo-fármaco ou composição farmacêutica é usado para o tratamento de uma afecção selecionada entre artrite reumatoide, espondilite anquilosante, artrite psoriática, psoríase em placa, colite ulcerativa, doença de Crohn adulta, doença de Crohn pediátrica, uveíte, hidradenite supurativa e artrite idiopática juvenil.
9.Método de entrega de um agonista de receptor de glicocorticoide para uma célula que expressa TNFα CARACTERIZADO pelo fato de que compreende a etapa de contatar a célula com o conjugado de anticorpo-fármaco, de acordo com a reivindicação 4.
10.Conjugado de anticorpo-fármaco CARACTERIZADO pelo fato de que é de acordo com a fórmula: em que A é adalimumabe e n é 4.
11.Conjugado de anticorpo-fármaco CARACTERIZADO pelo fato de que é de acordo com a fórmula: em que A é adalimumabe e n é 2.
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