JP2021054845A - グルココルチコイド受容体作動薬及びそのイムノコンジュゲート - Google Patents

Abstract

【課題】免疫原性が低く且つ効力の高い抗ＴＮＦα治療薬を提供する。【解決手段】グルココルチコイド受容体作動薬イムノコンジュゲート、グルココルチコイド受容体作動薬及びその使用方法を提供する。【選択図】なし

Description

腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）は数種のヒト疾患の病態生理において中心的な役割を果たしており、抗ＴＮＦα剤は関節リウマチ、乾癬及び炎症性腸疾患等の自己免疫疾患及び炎症性疾患の治療における治療効用を臨床的に検証されている。抗ＴＮＦαバイオ医薬品は臨床で成功しているが、患者で達成可能な最大効力がまだ限られており、より強力で有効な治療薬の同定と開発が必要である。抗ＴＮＦαバイオ医薬品を投与した患者が治療薬に対して免疫応答を生じる可能性もあるため、その有効性が制限されている。従って、疾患を更に防除するためには、免疫原性が低く且つ効力の高い抗ＴＮＦα治療薬が有用であろう。

合成グルココルチコイド受容体作動薬は炎症性疾患の治療に使用される強力な類の低分子であるが、疾患の慢性治療におけるその効用は強い副作用により制限されている。抗ＴＮＦ抗体に比較して効力が強く、作用時間が長く、望ましくない作用を最小限に抑えた治療薬を開発する必要がある。

本開示は自己免疫疾患の治療に有用なグルココルチコイド受容体作動薬イムノコンジュゲートを提供する。

１態様において、本開示は、
（ａ）配列番号３に記載の重鎖と配列番号４に記載の軽鎖とを含む抗ＴＮＦα抗体；及び（ｂ）式：

により表される基を含むグルココルチコイド受容体作動薬を含む抗体薬物複合体を提供するものであり、前記抗体は式：

により表されるリンカーを介して前記グルココルチコイド受容体作動薬と連結されている。

１実施形態において、本開示は式：

の抗体薬物複合体を提供し、式中、Ａは前記抗体であり、ｎは１〜１０の整数である。

１態様において、本開示は、
（ａ）配列番号３に記載の重鎖と配列番号４に記載の軽鎖とを含む抗ＴＮＦα抗体；及び（ｂ）式：

により表される基を含むグルココルチコイド受容体作動薬を含む抗体薬物複合体を提供するものであり、前記抗体は式：

により表されるリンカーを介して前記グルココルチコイド受容体作動薬と連結されている。

１実施形態において、本開示は式：

の抗体薬物複合体を提供し、式中、Ａは前記抗体であり、ｎは１〜１０の整数である。

１実施形態において、本開示は上記実施形態のいずれかの抗体薬物複合体であって、薬物負荷が１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０であるものを提供する。１実施形態において、本開示は上記実施形態のいずれかの抗体薬物複合体であって、薬物負荷が４であるもの、例えば上記抗体薬物複合体の式中のｎが４であるものを提供する。１実施形態において、本開示は上記実施形態のいずれかの抗体薬物複合体であって、薬物負荷が２であるもの、例えば上記抗体薬物複合体の式中のｎが２であるものを提供する。

１実施形態において、本開示は上記実施形態のいずれかの抗体薬物複合体の製造方法として、前記抗体を前記グルココルチコイド受容体作動薬と連結する工程を含む方法を提供する。１実施形態において、本開示は上記実施形態の方法であって、前記抗体を前記グルココルチコイド受容体作動薬と連結する前に、前記グルココルチコイド受容体作動薬にＰＯ_４部分を導入する工程を更に含む方法を提供する。１実施形態において、本開示は上記実施形態のいずれかの方法であって、前記連結工程が前記抗体を部分的に還元する工程、及び前記部分的に還元した抗体を式：

の化合物でアルキル化する工程を含む方法を提供する。

１実施形態において、本開示は上記実施形態のいずれかの抗体薬物複合体、及び薬学的に許容される基剤を含有する医薬組成物を提供する。１実施形態において、本開示は上記実施形態のいずれかの医薬組成物であって、薬物抗体比（ＤＡＲ）が１〜１０であるものを提供する。

好ましい１実施形態において、本開示は式：

の抗体薬物複合体を提供し、式中、Ａはアダリムマブであり、ｎは４である。

好ましい１実施形態において、本開示は式：

の抗体薬物複合体を提供し、式中、Ａは配列番号３に記載の重鎖と配列番号４に記載の軽鎖を含む抗ＴＮＦα抗体であり、ｎは４である。

別の好ましい実施形態において、本開示は式：

の抗体薬物複合体を提供し、式中、Ａはアダリムマブであり、ｎは２である。別の好ましい実施形態において、本開示は式：

の抗体薬物複合体を提供し、式中、Ａは配列番号３に記載の重鎖と配列番号４に記載の軽鎖とを含む抗ＴＮＦα抗体であり、ｎは２である。

好ましい１実施形態において、本開示は上記実施形態のいずれかの医薬組成物であって、薬物抗体比（ＤＡＲ）が２．０であるものを提供する。

好ましい１実施形態において、本開示は上記実施形態のいずれかの医薬組成物であって、薬物抗体比（ＤＡＲ）が４．０であるものを提供する。

１実施形態において、本開示は対象における関節リウマチ、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、局面型乾癬、潰瘍性大腸炎、成人クローン病、小児クローン病、ぶどう膜炎、化膿性汗腺炎及び若年性特発性関節炎から選択される疾病の治療方法として、有効量の上記実施形態のいずれかの抗体薬物複合体又は上記実施形態のいずれかの医薬組成物を前記対象に投与することを含む方法を提供する。

１実施形態において、本開示は関節リウマチ、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、局面型乾癬、潰瘍性大腸炎、成人クローン病、小児クローン病、ぶどう膜炎、化膿性汗腺炎及び若年性特発性関節炎から選択される疾病の治療用としての、上記実施形態のいずれかの抗体薬物複合体又は上記実施形態のいずれかの医薬組成物を提供する。

１実施形態において、本開示は関節リウマチ、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、局面型乾癬、潰瘍性大腸炎、成人クローン病、小児クローン病、ぶどう膜炎、化膿性汗腺炎及び若年性特発性関節炎から選択される疾病の治療用医薬の製造用としての、上記実施形態のいずれかの抗体薬物複合体又は上記実施形態のいずれかの医薬組成物の使用を提供する。

１実施形態において、本開示は（ａ）上記実施形態のいずれかの抗体薬物複合体又は上記実施形態のいずれかの医薬組成物を収容した容器；及び（ｂ）前記１個以上の容器に添付又は付属されたラベル又は添付文書を含むキットを提供し、前記ラベル又は添付文書は前記抗体薬物複合体又は医薬組成物が関節リウマチ、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、局面型乾癬、潰瘍性大腸炎、成人クローン病、小児クローン病、ぶどう膜炎、化膿性汗腺炎及び若年性特発性関節炎から選択される疾病の治療用であることを指示している。

１実施形態において、本開示はＴＮＦα発現細胞へのグルココルチコイド受容体作動薬の送達方法として、前記細胞を上記実施形態のいずれかの抗体薬物複合体と接触させる段階を含む方法を提供する。１実施形態において、本開示は抗体薬物複合体の抗炎症活性の測定方法として、（ａ）ＴＮＦα発現細胞を上記実施形態のいずれかの抗体薬物複合体と接触させる段階；及び（ｂ）対照細胞と比較して前記細胞からの炎症性サイトカインの放出を測定する段階を含む方法を提供する。

実施例７で実施・記載するＢｒＡｃ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−グルココルチコイド受容体モジュレーター（ＧＲＭ）−ＰＯ_４のクロマトグラフィー分離を示す。図面から明らかなように、このＡＤＣは薬物リンカー分子２個が結合したＡＤＣと、薬物リンカー分子４個が結合したＡＤＣとを含む異種ＡＤＣ混合物である。 アダリムマブをＢｒＡｃ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−グルココルチコステロイド−ＰＯ_４と連結した場合のデコンボリューションＭＳデータを示す。図面から明らかなように、連結が達せられた。 実施例７で実施・記載するマウスコラーゲン誘発性関節炎（ＣＩＡ）の関節炎モデルにおける高用量及び低用量のＡＤＣ１の効力を抗ＴＮＦαｍＡｂ（高用量）又は溶媒と比較して実証するグラフである。図面から明らかなように、抗ＴＮＦａグルココルチコステロイドＡＤＣ１を単回投与すると、抗ＴＮＦａｍＡｂ又は溶媒単独に比較して約２８日間の足腫脹の改善により作用時間が延長した。 実施例７で実施・記載するカニクイザルにおける閉環体及び開環体ＡＤＣの濃度（μｇ／ｍｌ）の経時変化を示すグラフである。図面から明らかなように、閉環体はインビボで逆マイケル反応とそれに伴うリンカー−薬物の減少を起こし易い。

本願ではグルココルチコイド受容体作動薬イムノコンジュゲート、グルココルチコイド受容体作動薬並びにその製造方法及び使用方法を提供する。

本願では式：

の抗体薬物複合体を提供し、式中、Ａはアダリムマブであり、ｎは４である。下記実施例７で実証するように、このＡＤＣ（即ち下記ＡＤＣ４）はインビトロ活性、血漿中安定性を示し、凝集を最小限に抑えられることが明らかである。

ＡＤＣ４の製造方法と使用方法も提供する。

Ｉ．定義
本開示を理解し易くするために、多数の用語と語句について以下に定義する。

「抗ＴＮＦαタンパク質」なる用語は、（ｉ）ＴＮＦαと結合し、（ｉｉ）可溶性ＴＮＦαと細胞表面ＴＮＦ受容体（ｐ５５及び／又はｐ７５）の結合を阻害すること及び／又は補体の存在下に表面ＴＮＦα若しくはＴＮＦα受容体発現細胞をインビトロで溶解させることが可能なタンパク質を意味する。ある実施形態において、抗ＴＮＦ抗体は細胞の表面のＴＮＦαと結合し、内在化することができる。例えば、その開示内容全体を本願に援用するＵＳ２０１４／０２９４８１３は、細胞表面ヒトＴＮＦと結合すると、細胞内在化を示す抗ＴＮＦ抗体を開示している。抗ＴＮＦαタンパク質としては、例えば抗ＴＮＦα抗体（例えばアダリムマブ、インフリキシマブ及びゴリムマブ）が挙げられる。抗ＴＮＦα抗体は単球由来ＤＣ上の膜貫通型ＴＮＦと結合すると、活発に内在化され、迅速にリソソームに取り込まれ、分解される（Ｄｅｏｒａ ｅｔ．ａｌ．ＭＡＢＳ，２０１７，Ｖｏｌ．９，Ｎｏ．４，６８０−６９４）。

本願で使用する「抗体」なる用語は、ジスルフィド結合により相互に結合した２本の重（Ｈ）鎖と２本の軽（Ｌ）鎖の４本のポリペプチド鎖から成る免疫グロブリン分子を意味する。各重鎖は重鎖可変領域（本願ではＨＣＶＲ又はＶＨと略称する。）と重鎖定常領域とから構成される。重鎖定常領域はＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３の３個のドメインから構成される。各軽鎖は軽鎖可変領域（本願ではＬＣＶＲ又はＶＬと略称する。）と軽鎖定常領域とから構成される。軽鎖定常領域は１個のドメインＣＬから構成される。ＶＨ領域とＶＬ領域は相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域とその間に配置されたフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる保存度の高い領域に更に分けることができる。各ＶＨ及びＶＬはアミノ末端からカルボキシ末端に向かってＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順に配置された３個のＣＤＲと４個のＦＲから構成される。

「抗ＴＮＦα抗体」又は「ＴＮＦαと結合する抗体」なる用語は、例えばＴＮＦαを標的とする治療剤として有用であるために十分な親和性でＴＮＦαと結合することが可能な抗体を意味する。抗ＴＮＦα抗体が無関係の非ＴＮＦαタンパク質と結合する程度は、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）により測定した場合に前記抗体とＴＮＦαの結合の約１０％未満に抑えることができる。所定の実施形態において、ＴＮＦαと結合する抗体は解離定数（Ｋｄ）が≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、又は≦０．１ｎＭである。

本願で使用する「イムノコンジュゲート」、「コンジュゲート」、「抗体薬物複合体」、又は「ＡＤＣ」なる用語は、細胞結合性物質（例えば抗ＴＮＦα抗体）等のタンパク質と連結された化合物又はその誘導体を意味する。このようなイムノコンジュゲートは一般式（ＳＭ−Ｌ−Ｑ）_ｎ−Ａにより表すことができ、式中、ＳＭ＝低分子グルココルチコイド受容体作動薬から誘導される基、例えばグルココルチコステロイド、Ｌ＝リンカー、Ｑ＝ヘテロ二官能基又は不在、Ａ＝タンパク質（例えば抗体）、ｎ＝１〜１０である。イムノコンジュゲートは順序を逆にした一般式Ａ−（Ｑ−Ｌ−ＳＭ）_ｎにより表すこともできる。

本開示において、「リンカー」なる用語は抗ＴＮＦαタンパク質（例えば抗体）をグルココルチコステロイドと連結することが可能な化学部分を意味する。リンカーはグルココルチコステロイドを放出し易くするように、切断し易いものとすることができる（「切断可能なリンカー」）。例えば、このような切断可能なリンカーはグルココルチコステロイド及び／又は抗体が活性状態に保たれる条件下でペプチダーゼにより切断され易いものとすることができる。

特に、本願に開示する切断可能なリンカー成分はアミノ酸残基数が２〜３個のペプチド（ジペプチド又はトリペプチド）を含み、具体的には、アラニン−アラニン（Ａｌａ−Ａｌａ）、グリシン−グルタミン酸（Ｇｌｙ−Ｇｌｕ）、グルタミン酸−アラニン−アラニン（Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｌａ）及びグリシン−リジン（Ｇｌｙ−Ｌｙｓ）から成る群から選択されるジペプチド及びトリペプチドである。このようなペプチドはプロテアーゼによりリンカーを切断できるため、リソソーム酵素等の細胞内プロテアーゼに暴露されると、グルココルチコステロイドを放出し易い（Ｄｏｒｏｎｉｎａ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１：７７８−７８４）。

本開示において、「グルココルチコステロイド」なる用語はグルココルチコイド受容体と相互作用する天然又は合成ステロイドホルモンを意味し、本願では特定のグルココルチコステロイドについて詳細に開示する。「グルココルチコステロイド基」は親グルココルチコステロイドから１個以上の水素原子を取り除くことにより誘導される。水素原子を取り除くと、親グルココルチコステロイドをリンカーに結合し易くなる。本開示では、親グルココルチコステロイドのいずれかの適切な−ＮＨ_２基から水素原子を取り除く。特に、「グルココルチコステロイド基」は親グルココルチコステロイドから水素原子１個を取り除くことにより誘導される一価基である。

本開示において、「ヘテロ二官能基」なる用語はリンカーと抗ＴＮＦαタンパク質（例えば抗体）を連結する化学部分を意味する。ヘテロ二官能基はこの化学部分の両端に異なる反応性基をもつことを特徴とする。

「薬物抗体比」又は「ＤＡＲ」なる用語はＡ（例えば抗体）と連結されたＳＭ（例えば低分子グルココルチコイド受容体作動薬から誘導される基、例えばグルココルチコステロイド）の数を意味する。従って、一般式（ＳＭ−Ｌ−Ｑ）_ｎ−Ａを有するイムノコンジュゲートにおいて、ＤＡＲは抗体薬物複合体１分子当たりの薬物負荷、例えば、「ｎ」により表される。

個々のイムノコンジュゲートを表すものとしての式（ＳＭ−Ｌ−Ｑ）_ｎ−Ａを有する化合物について言う場合、「化合物ＤＡＲ」なる用語は個々のＡと連結されたＳＭの数（例えば１〜１０の整数としての薬物負荷又はｎ）を意味する。

イムノコンジュゲートの集合体を表すものとしての式（ＳＭ−Ｌ−Ｑ）_ｎ−Ａを有する化合物について言う場合、「集合体ＤＡＲ」なる用語はＡと連結されたＳＭの平均数（例えば１〜１０±０．５、±０．４、±０．３、±０．２、±０．１の整数又は分数としての薬物負荷又はｎ）を意味する。

「対象」なる用語は特定の治療を受けるヒト、非ヒト霊長類等を意味する。一般的に、「対象」及び「患者」なる用語は本願ではヒト対象について同義に使用する。

「医薬製剤」なる用語は有効成分の生物学的活性を有効に発揮できるような形態であり、製剤を投与する対象に対して許容できないほど毒性となる他の成分を含有していない製剤を意味する。製剤は無菌とすることができる。

本願に開示するイムノコンジュゲートの「有効量」は具体的に明記する目的を達成するために十分な量である。「有効量」は明記する目的に応じて決定することができる。

「治療有効量」なる用語は対象又は哺乳動物における疾患又は障害を「治療する」ために有効なイムノコンジュゲートの量を意味する。「予防有効量」とは所望の予防結果を達成するために有効な量を意味する。

「治療する」又は「治療」又は「治療すること」又は「緩和する」又は「緩和すること」等の用語は、診断後の病態又は障害の１種以上の症状を治癒、緩和、軽減、及び／又はその進行を遅延若しくは阻止する治療手段を意味する（「治療処置」）。従って、治療処置を必要とする者としては、既に障害をもつと診断された者又はその疑いのある者が挙げられる。予防又は防止手段とは、標的病態又は障害の発症を防ぐ手段を意味する（「予防処置」）。従って、予防処置を必要とする者としては、障害に冒され易い者や、障害を予防すべき者が挙げられる。

ＩＩ．グルココルチコイド受容体作動薬と連結するためのタンパク質
本開示はグルココルチコイド受容体作動薬をタンパク質（例えば抗体）と連結したイムノコンジュゲートを提供する。ある実施形態において、前記抗体はヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体又はマウス抗体である。ある実施形態において、前記タンパク質（例えば抗体）は細胞の表面の標的と結合して内在化することができる。

本開示はグルココルチコイド受容体作動薬を抗ＴＮＦαタンパク質と連結したイムノコンジュゲートも提供する。所定の実施形態において、前記抗ＴＮＦαタンパク質は抗体である。所定の実施形態において、前記抗ＴＮＦαタンパク質はＴＮＦα（例えば可溶性ＴＮＦα及び／又は膜結合型ＴＮＦα）と結合する抗体である。所定の実施形態において、前記抗ＴＮＦαタンパク質は可溶性ＴＮＦ受容体タンパク質（例えば重鎖定常領域と融合させた可溶性ＴＮＦ受容体タンパク質）である。ある実施形態において、前記抗ＴＮＦαタンパク質（例えば抗ＴＮＦα抗体）は細胞の表面でＴＮＦαと結合して内在化する。例えば、本願に援用する米国特許出願公開第２０１４／０２９４８１３号は細胞表面ヒトＴＮＦαと結合すると、細胞内在化を示す抗ＴＮＦαタンパク質を開示している。

所定の実施形態において、前記抗体はヒト及び／又はマウスＴＮＦαと結合する。

膜結合型ヒトＴＮＦαの全長アミノ酸配列は、

である。可溶性ヒトＴＮＦαは配列番号１のアミノ酸７７〜２３３を含む。膜結合型マウスＴＮＦαの全長アミノ酸配列は、

である。可溶性マウスＴＮＦαは配列番号２のアミノ酸８０〜２３５を含む。

ある実施形態において、前記抗ＴＮＦα抗体はヒトＴＮＦαと結合する。

ある実施形態において、前記抗ＴＮＦα抗体はマウスＴＮＦαと結合する。

所定の実施形態において、前記抗ＴＮＦα抗体は以下の効果の１種以上をもつ：インビトロＬ９２９アッセイにおいて１×１０^−７Ｍ以下のＩＣ５０でヒトＴＮＦα細胞毒性を中和する；ＴＮＦαとｐ５５及びｐ７５細胞表面受容体の相互作用を阻止する；並びに／又は補体の存在下に表面ＴＮＦ発現細胞をインビトロで溶解させる。

所定の実施形態において、前記抗ＴＮＦα抗体はＴＮＦβと結合しない。

抗ＴＮＦα抗体としては、例えば、組換えヒト抗体であるアダリムマブが挙げられる。アダリムマブのＣＤＲと可変領域に対応するアミノ酸配列は米国特許第６，２５８，５６２号に抗体Ｄ２Ｅ７について記載されている（即ち配列番号１〜８）。

医薬品の国際一般名（ＩＮＮ）であるアダリムマブはＷＨＯ ＩＮＮ収載場所であるＹｅａｒ ２０００，Ｌｉｓｔ ４４（ＷＨＯ Ｄｒｕｇ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（２０００）Ｖｏｌ．１４（３））に収載されている。

所定の実施形態において、抗ＴＮＦα抗体はアダリムマブの配列、例えば相補性決定領域（ＣＤＲ）、重鎖可変領域（ＶＨ）、及び／又は軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。代表的な配列を表１に示す。

所定の実施形態において、前記抗ＴＮＦα抗体は配列番号３及び４のＣＤＲを含む。ある実施形態において、前記ＣＤＲは配列番号７又は８、９、１０又は１１、１２、１３及び１４を含む。所定の実施形態において、前記抗ＴＮＦα抗体は配列番号３の重鎖及び／又は配列番号４の軽鎖を含む。

本開示は更に本願に記載する抗ＴＮＦα抗体に実質的に対応する変異体及び等価物も包含する。これらは例えば保存置換突然変異、即ち１個以上のアミノ酸を類似アミノ酸で置換したものを含むことができる。例えば、保存置換とは、あるアミノ酸を同一の一般分類内の別のアミノ酸で置換すること、例えば１個の酸性アミノ酸を別の酸性アミノ酸で置換すること、１個の塩基性アミノ酸を別の塩基性アミノ酸で置換すること、又は１個の中性アミノ酸を別の中性アミノ酸で置換することを意味する。保存アミノ酸置換が意味することは当技術分野で周知である。

本願に記載する単離抗ＴＮＦα抗体は当技術分野で公知のあらゆる適切な方法により生産することができる。このような方法は直接タンパク質合成法に始まり、単離ポリペプチド配列をコードするＤＮＡ配列を作製してこれらの配列を適切な形質転換宿主で発現させる方法までに至る。ある実施形態では、目的の野生型タンパク質をコードするＤＮＡ配列を単離又は合成することにより組換え技術を使用してＤＮＡ配列を作製する。任意に、部位特異的突然変異導入法により前記配列に突然変異を導入し、その機能的類似体とすることもできる。例えば、Ｚｏｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：５６６２−５０６６（１９８４）及び米国特許第４，５８８，５８５号参照。

ある実施形態では、オリゴヌクレオチド合成装置を使用して化学合成法により目的の抗体をコードするＤＮＡ配列を作製する。このようなオリゴヌクレオチドは目的とするポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて設計することができ、目的の組換えポリペプチドが産生される宿主細胞で優先されるコドンを選択する。標準方法を適用し、目的の単離ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド配列を合成することができる。

所定の実施形態では、組換え発現ベクターを使用して抗ＴＮＦα抗体をコードするＤＮＡを増幅・発現させる。多様な発現宿主／ベクター組合せを利用することができる。真核宿主に有用な発現ベクターとしては、例えばＳＶ４０、ウシパピローマウイルス、アデノウイルス及びサイトメガロウイルスに由来する発現制御配列を含むベクターが挙げられる。細菌宿主に有用な発現ベクターとしては、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９及びそれらの誘導体を含む大腸菌に由来するプラスミド等の公知細菌プラスミドと、Ｍ１３や繊維状一本鎖ＤＮＡファージ等のより広範な宿主範囲のプラスミドが挙げられる。

抗ＴＮＦα抗体の発現に適した宿主細胞としては、適切なプロモーターの存在下の原核生物、酵母、昆虫又は高等真核細胞が挙げられる。原核生物としては、グラム陰性生物又はグラム陽性生物、例えば大腸菌やバシラス属細菌が挙げられる。高等真核細胞としては、哺乳動物由来の樹立細胞株が挙げられる。無細胞翻訳システムも利用できる。細菌、真菌、酵母及び哺乳動物細胞宿主で使用するのに適切なクローニング・発現ベクターはＰｏｕｗｅｌｓらにより記載されている（Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８５）。抗体生産を含むタンパク質生産方法に関するその他の情報については、例えば米国特許公開第２００８／０１８７９５４号、米国特許第６，４１３，７４６号及び６，６６０，５０１号、並びに国際特許公開第ＷＯ０４００９８２３号を参照されたい。

ＩＩＩ．グルココルチコイド受容体作動薬を含むイムノコンジュゲート
グルココルチコイド受容体作動薬を含むイムノコンジュゲートも提供する。ある実施形態において、イムノコンジュゲートはＦｃγ受容体と結合する。ある実施形態において、イムノコンジュゲートはＧＲＥ膜貫通型ＴＮＦαレポーターアッセイにおいて活性である（本願で使用する「ＧＲＥ膜貫通型ＴＮＦαレポーターアッセイ」とは下記実施例７で使用するアッセイを意味する。）。ある実施形態において、イムノコンジュゲートはこのイムノコンジュゲートにおけるタンパク質（例えば抗体）単独と比較した場合に免疫原性の低下（抗薬物免疫応答（ＡＤＡ）の低下）を示す。

１実施形態において、本願では式Ｉ−ａ：
（ＳＭ−Ｌ−Ｑ）_ｎ−Ａ Ｉ−ａ
を有する化合物を開示し、式中、
Ａは抗腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）α抗体、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体又はアダリムマブであり；
Ｌはリンカーであり；
Ｑはヘテロ二官能基であり；又は
Ｑは不在であり；
ｎは１〜１０であり；
ＳＭは下式：
（１）式ＩＩ−ａ：

（２）式ＩＩ−ｂ：

（３）式ＩＩ−ｃ：

（４）式ＩＩ−ｄ：

のいずれか１種を有するグルココルチコステロイドの一価基である。

別の実施形態において、本願に開示するのは式Ｉ−ａを有する化合物であって、式中、ＳＭが式ＩＩ−ａ、ＩＩ−ｂ、ＩＩ−ｃ又はＩＩ−ｄのいずれか１種を有するグルココルチコステロイドの一価基であり、Ｌがジペプチド又はトリペプチドを含む切断可能なリンカーであり、Ｑがヘテロ二官能基であるか又はＱが不在であり、ｎが１〜１０である化合物である。特に、Ｌはアラニン−アラニン（Ａｌａ−Ａｌａ）、グリシン−グルタミン酸（Ｇｌｙ−Ｇｌｕ）、グルタミン酸−アラニン−アラニン（Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｌａ）及びグリシン−リジン（Ｇｌｙ−Ｌｙｓ）から成る群から選択されるジペプチド及びトリペプチドを含む。

別の実施形態において、本願に開示するのは式Ｉ−ａを有する化合物であって、式中、ＳＭが式ＩＩ−ａ、ＩＩ−ｂ、ＩＩ−ｃ及びＩＩ−ｄのいずれか１種を有するグルココルチコステロイドの一価基であり、Ｑが式：

（式中、ｍは０又は１である。）により表されるヘテロ二官能基である化合物である。

別の実施形態において、ｍは０であり、Ｑは式：

により表される。

別の実施形態において、ｍは１であり、Ｑは式：

により表される。

別の実施形態において、本願に開示するのは式Ｉ−ａを有する化合物であって、式中、ＳＭが式ＩＩ−ａ、ＩＩ−ｂ、ＩＩ−ｃ及びＩＩ−ｄのいずれか１種を有するグルココルチコステロイドの一価基であり、−Ｌ−Ｑ−が表２の化学構造のいずれか１種である化合物である。

別の実施形態において、本願に開示するのは式Ｉ−ａを有する化合物であり、例えば、式Ｉ−ａを有する化合物であって、式中、ＳＭが式ＩＩ−ａ、ＩＩ−ｂ、ＩＩ−ｃ及びＩＩ−ｄのいずれか１種を有するグルココルチコステロイドの一価基であり、ｎが２〜８である化合物である。別の実施形態において、ｎは１〜５である。別の実施形態において、ｎは２〜５である。別の実施形態において、ｎは１である。別の実施形態において、ｎは２である。別の実施形態において、ｎは３である。別の実施形態において、ｎは４である。別の実施形態において、ｎは５である。別の実施形態において、ｎは６である。別の実施形態において、ｎは７である。別の実施形態において、ｎは８である。

別の実施形態において、本願に開示するのは式Ｉ−ａを有する化合物であり、例えば、式Ｉ−ａを有する化合物であって、式中、ＳＭが式ＩＩ−ａ、ＩＩ−ｂ、ＩＩ−ｃ及びＩＩ−ｄのいずれか１種を有するグルココルチコステロイドの一価基であり、Ａが抗体である化合物である。

別の実施形態において、本願に開示するのは式Ｉ−ａを有する化合物であり、例えば、式Ｉ−ａを有する化合物であって、式中、ＳＭが式ＩＩ−ａ、ＩＩ−ｂ、ＩＩ−ｃ及びＩＩ−ｄのいずれか１種を有するグルココルチコステロイドの一価基であり、前記抗体がマウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体である化合物である。

別の実施形態において、本願に開示するのは式Ｉ−ａを有する化合物であり、例えば、式Ｉ−ａを有する化合物であって、式中、ＳＭが式ＩＩ−ａ、ＩＩ−ｂ、ＩＩ−ｃ及びＩＩ−ｄのいずれか１種を有するグルココルチコステロイドの一価基であり、Ａがアダリムマブ、インフリキシマブ、セルトリズマブペゴル及びゴリムマブから成る群から選択される抗体とＴＮＦαの結合を競合的に阻害する化合物である。

別の実施形態において、本願に開示するのは式Ｉ−ａを有する化合物であり、例えば、式Ｉ−ａを有する化合物であって、式中、ＳＭが式ＩＩ−ａ、ＩＩ−ｂ、ＩＩ−ｃ及びＩＩ−ｄのいずれか１種を有するグルココルチコステロイドの一価基であり、Ａがアダリムマブ、インフリキシマブ、セルトリズマブペゴル、アフェリモマブ、ネレリモマブ、オゾラリズマブ、プラクルマブ及びゴリムマブから成る群から選択される抗体と同一のＴＮＦαエピトープと結合する化合物である。

別の実施形態において、本願に開示するのは式Ｉ−ａを有する化合物であり、例えば、式Ｉ−ａを有する化合物であって、式中、ＳＭが式ＩＩ−ａ、ＩＩ−ｂ、ＩＩ−ｃ及びＩＩ−ｄのいずれか１種を有するグルココルチコステロイドの一価基であり、Ａが夫々配列番号７又は８、配列番号９、及び配列番号１０又は１１の重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列と、夫々配列番号１２、配列番号１３及び配列番号１４の軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を含む化合物である。

別の実施形態において、本願に開示するのは式Ｉ−ａを有する化合物であり、例えば、式Ｉ−ａを有する化合物であって、式中、ＳＭが式ＩＩ−ａ、ＩＩ−ｂ、ＩＩ−ｃ及びＩＩ−ｄのいずれか１種を有するグルココルチコステロイドの一価基であり、Ａが配列番号５に記載の重鎖可変領域と配列番号６に記載の軽鎖可変領域を含む抗ＴＮＦα抗体である化合物である。

別の実施形態において、本願に開示するのは式Ｉ−ａを有する化合物であり、例えば、式Ｉ−ａを有する化合物であって、式中、ＳＭが式ＩＩ−ａ、ＩＩ−ｂ、ＩＩ−ｃ及びＩＩ−ｄのいずれか１種を有するグルココルチコステロイドの一価基であり、Ａが配列番号３に記載の重鎖と配列番号４に記載の軽鎖を含む抗ＴＮＦα抗体である化合物である。

別の実施形態において、本願に開示するのは式Ｉ−ａを有する化合物であり、例えば、式Ｉ−ａを有する化合物であって、式中、ＳＭが式ＩＩ−ａ、ＩＩ−ｂ、ＩＩ−ｃ及びＩＩ−ｄのいずれか１種を有するグルココルチコステロイドの一価基であり、ＡがＴＮＦαとｐ５５及びｐ７５細胞表面受容体との相互作用を阻止する化合物である。

別の実施形態において、本願に開示するのは式Ｉ−ａを有する化合物であり、例えば、式Ｉ−ａを有する化合物であって、式中、ＳＭが式ＩＩ−ａ、ＩＩ−ｂ、ＩＩ−ｃ及びＩＩ−ｄのいずれか１種を有するグルココルチコステロイドの一価基であり、Ａが補体の存在下に表面ＴＮＦ発現細胞をインビトロで溶解させる化合物である。

別の実施形態において、本願に開示するのは式Ｉ−ａを有する化合物であり、例えば、式Ｉ−ａを有する化合物であって、式中、ＳＭが式ＩＩ−ａ、ＩＩ−ｂ、ＩＩ−ｃ及びＩＩ−ｄのいずれか１種を有するグルココルチコステロイドの一価基であり、Ａがエタネルセプトである化合物である。

別の実施形態において、本願に開示するのは式Ｉ−ａを有する化合物であり、例えば、式Ｉ−ａを有する化合物であって、式中、ＳＭが式ＩＩ−ａ、ＩＩ−ｂ、ＩＩ−ｃ及びＩＩ−ｄのいずれか１種を有するグルココルチコステロイドの一価基であり、Ａがアダリムマブである化合物である。

別の実施形態において、本願では表３の化学構造のいずれか１種である式Ｉ−ａを有する化合物を開示する。

別の実施形態において、本願では式：

の抗体薬物複合体を開示し、式中、Ａはアダリムマブであり、ｎは４である。下記実施例７で実証するように、このＡＤＣ（即ち下記ＡＤＣ４）はインビトロ活性、血漿中安定性を示し、凝集を最小限に抑えられることが明らかである。

ＩＶ．イムノコンジュゲート及び合成中間体の製造方法
本開示の種々のイムノコンジュゲートの一般合成法は下式ＩＩＩ−ａ、ＩＩＩ−ｂ、ＩＩＩ−ｃ又はＩＩＩ−ｄのいずれかのＮＨ_２で官能基化された低分子（ＳＭ）をリンカー部分と反応させる工程、及び得られた化合物を官能基化し、ブロモアセトアミドて官能基化された中間体とする工程を含む。その後、ブロモアセトアミドで官能基化された中間体をＨＳ−Ａと反応させる（なお、ＨＳ−Ａは還元された鎖間ジスルフィド結合数の少ない抗体、例えばアダリムマブである。）。

（１）式ＩＩＩ−ａ：

（２）式ＩＩＩ−ｂ：

（３）式ＩＩＩ−ｃ：

（４）式ＩＩＩ−ｄ：

別の実施形態において、本願では式ＩＶ−ａ：

を有する化合物の製造方法を開示し、式中、
Ａはアダリムマブであり；
Ｌはリンカーであり；
ｎは１〜１０であり；
ＳＭは式ＩＩＩ−ａ〜ＩＩＩ−ｄのいずれか１種を有するグルココルチコステロイド基であり；
前記方法は、
ａ）式Ｖ：

を有する化合物を抗腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）αタンパク質又はタンパク質と連結する工程；及び
ｂ）式ＩＶ−ａを有する化合物を単離する工程を含む。

ある実施形態において、本願に開示する方法は更に式ＩＶ−ａの化合物を精製する工程を含む。所定の実施形態では、（実施形態によってはリンカーのペプチド部分の荷電部分、及び／又は実施形態によってはＳＭのリン酸基を利用して）異なるＤＡＲ種を効率的に分離することができるアニオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＣ）を使用する。

ある実施形態において、本願に開示する方法は標準マレイミド系リンカー化学に依存する方法よりも合成工程が少なくて済む。特に、標準マレイミド系リンカー化学に依存する方法は適切なＤＡＲ種の精製後に実施する後続工程としてスクシンイミド開環加水分解工程が必要になる場合がある。従って、所定の実施形態において、本願に開示する方法は標準マレイミド系リンカー化学よりも連結プロトコールが著しく短縮される。

別の実施形態において、本願では式ＶＩ−ａ：

を有する化合物の製造方法を開示し、式中、
Ａはアダリムマブであり；
ｎは１〜１０であり、
前記方法は、
ａ）式ＶＩＩ−ａ：

の化合物を部分的に還元されたアダリムマブと連結する工程；及び
ｂ）例えばクロマトグラフィーにより、式ＶＩ−ａを有する化合物を単離する工程を含む。

別の実施形態において、本願では式ＩＶ−ａ又は式ＶＩ−ａを有する化合物であって、式中、ｎが１〜７である化合物の製造方法を開示する。別の実施形態において、ｎは１〜５である。別の実施形態において、ｎは２〜４である。別の実施形態において、ｎは１である。別の実施形態において、ｎは２である。別の実施形態において、ｎは３である。別の実施形態において、ｎは４である。別の実施形態において、ｎは５である。別の実施形態において、ｎは６である。別の実施形態において、ｎは７である。別の実施形態において、ｎは８である。

別の実施形態において、本願では式ＩＶ−ａ又はＶＩ−ａを有する化合物であって、式中、
Ａがアダリムマブであり；
ｎが１〜１０である化合物を開示する。

別の実施形態において、本願では式ＩＶ−ａ又はＶＩ−ａを有する化合物であって、式中、ｎが１〜７である化合物を開示する。別の実施形態において、ｎは１〜５である。別の実施形態において、ｎは２〜４である。別の実施形態において、ｎは１である。別の実施形態において、ｎは２である。別の実施形態において、ｎは３である。別の実施形態において、ｎは４である。別の実施形態において、ｎは５である。別の実施形態において、ｎは６である。別の実施形態において、ｎは７である。別の実施形態において、ｎは８である。

本願ではイムノコンジュゲートの製造に有用な合成中間体も提供する。

１実施形態において、本願に開示する合成中間体は式Ｖ又はＶＩＩ−ａのいずれか一方を有する化合物である。

ＶＩ．使用方法及び医薬組成物
本願ではインビトロ又はインビボで使用することができる式Ｉ−ａを有する（例えば表３に示す式を有する）コンジュゲートを提供する。従って、生理的に許容される基剤、賦形剤又は安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９９０）Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ）中に所望の純度を有するコンジュゲート又はグルココルチコイド受容体作動薬を含有する組成物、例えば所定のインビボ用途の医薬組成物も提供する。許容される基剤、賦形剤又は安定剤は利用される用量と濃度で被投与者に非毒性である。

インビボ投与用組成物（例えば医薬組成物）は無菌とすることができ、例えば滅菌濾過膜で濾過することにより実施することができる。インビボ投与用組成物（例えば医薬組成物）は防腐剤を含有することができる。

本願に記載する抗体薬物複合体及び／又は抗体薬物複合体を含有する医薬組成物は表面ＴＮＦαを発現する細胞を（インビトロ又はインビボで）溶解させるのに有用であり得、及び／又はＴＮＦα増加（例えば滑液中のＴＮＦα増加）を特徴とする疾患若しくは障害を治療するのに有用であり得る。ある実施形態において、前記抗体薬物複合体及び／又は組成物はサイトカイン放出を（インビトロ又はインビボで）抑制するのに有用であり、及び／又は自己免疫疾患若しくは炎症性疾患を治療するのに有用である。ある実施形態において、前記抗体薬物複合体及び／又は組成物はクローン病の治療（例えば回腸及び／若しくは上行結腸を病変部とする中等症から重症の活動期クローン病の治療並びに／又は回腸及び／若しくは上行結腸を病変部とする中等症から重症の活動期クローン病の３カ月間までの臨床的寛解の維持）に使用される。ある実施形態において、前記抗体薬物複合体及び／又は組成物は潰瘍性大腸炎の治療（例えば中等症から重症の活動期潰瘍性大腸炎患者における寛解の誘導）に使用される。ある実施形態において、前記抗体薬物複合体及び／又は組成物は関節リウマチ（ＲＡ）の治療に使用される。ある実施形態において、前記抗体薬物複合体及び／又は組成物は若年性特発性関節炎（ＪＡ）の治療に使用される。ある実施形態において、前記抗体薬物複合体及び／又は組成物は乾癬性関節炎（ＰｓＡ）の治療に使用される。ある実施形態において、前記抗体薬物複合体及び／又は組成物は強直性脊椎炎（ＡＳ）や体軸性脊椎関節炎（ａｘＳｐＡ）等の脊椎関節症の治療に使用される。ある実施形態において、前記抗体薬物複合体及び／又は組成物は成人クローン病（ＣＤ）の治療に使用される。ある実施形態において、前記抗体薬物複合体及び／又は組成物は小児クローン病の治療に使用される。ある実施形態において、前記抗体薬物複合体及び／又は組成物は潰瘍性大腸炎（ＵＣ）の治療に使用される。ある実施形態において、前記抗体薬物複合体及び／又は組成物は局面型乾癬（Ｐｓ）の治療に使用される。ある実施形態において、前記抗体薬物複合体及び／又は組成物は化膿性汗腺炎（ＨＳ）の治療に使用される。ある実施形態において、前記抗体薬物複合体及び／又は組成物はぶどう膜炎の治療に使用される。ある実施形態において、前記抗体薬物複合体及び／又は組成物はベーチェット病の治療に使用される。ある実施形態において、前記抗体薬物複合体及び／又は組成物は局面型乾癬を含めた乾癬の治療に使用される。ある実施形態は本願に記載する疾患又は障害の治療用医薬の製造用としての薬物コンジュゲート及び／又は医薬組成物の使用を含む

ある実施形態はＴＮＦα発現細胞へのグルココルチコイド受容体作動薬の送達方法を含む。このような方法は本願に記載する抗体薬物複合体とＴＮＦα発現細胞を接触させる段階を含むことができる。ある実施形態はＴＮＦα発現細胞へのグルココルチコイド受容体作動薬のインビトロ送達方法を含む。

抗体薬物複合体の抗炎症活性の測定方法も提供する。このような方法は本願に記載する抗体薬物複合体とＴＮＦα発現細胞を接触させる段階を含むことができる。ある実施形態は本願に記載する抗体薬物複合体とＴＮＦα発現細胞を接触させる段階と、対照細胞と比較して前記細胞からの炎症性サイトカインの放出の減少を測定する段階を含む。ある実施形態は抗体薬物複合体の抗炎症活性のインビトロ測定方法を含む。

ある実施形態は細胞（例えばＴＮＦα発現細胞）を抗体薬物複合体と直接又は間接的に接触させる段階と、例えば細胞形態若しくは生存率、マーカーの発現、分化若しくは脱分化、細胞呼吸、ミトコンドリア活性、膜完全性、成熟、増殖、生存性、アポトーシス又は細胞死の変化により判断して前記抗体薬物複合体が細胞の活性又は機能を変化させるか否かを判定する段階を含むスクリーニング法（例えばインビトロ法）を含む。直接相互作用の１例は物理的相互作用であり、間接相互作用としては、例えば、組成物が中間分子に作用し、この中間分子が指定対象物（例えば細胞又は細胞培養物）に作用する場合が挙げられる。

ＶＩＩ．製品
本開示は１個以上の容器を含む医薬パック及びキットも包含し、１個の容器に１回分以上の用量の本願に記載する抗体薬物複合体又は組成物を収容することができる。所定の実施形態において、前記パック又はキットは１種以上の他の薬剤の存在下又は不在下で単位用量即ち規定量の組成物又は抗体薬物複合体を含む。

前記キットは１個以上の容器と、前記容器に添付又は付属されており、収容した組成物が選択された病態の治療用であることを指示したラベル又は添付文書を含むことができる。適切な容器としては、例えばボトル、バイアル、シリンジ等が挙げられる。容器はガラスやプラスチック等の種々の材料から形成することができる。容器は滅菌開封口を備えることができ、例えば、容器は皮下注射針で穴を開けることができるストッパー付きの静注溶液バッグ又はバイアルとすることができる。

ある実施形態において、前記キットは前記抗体と任意に含まれる成分を患者に投与するための手段を含むことができ、例えば１本以上の針若しくは（プレフィルド又は空の）シリンジ、点眼器、ピペット又は他の同様の装置が挙げられ、これらの装置から製剤を対象に注射若しくは導入すること又は患部に塗布することができる。本開示のキットは更に一般的にはバイアル等と他のコンポーネントを市販用に密封するための手段を含み、例えば所望のバイアルと他の装置をブロー成形プラスチック容器に入れて保持する。

当然のことながら、本願に記載する実施例及び実施形態は例証のみを目的とし、それらの記載に照らして種々の改変又は変更が当業者に想到され、このような改変又は変更も本開示の趣旨と範囲に含むものとする。

出発原料は市販されており、本願に記載する手順、文献に記載されている手順又は有機化学分野の当業者に周知の手順により製造してもよい。記載する試薬／反応体の名称は市販薬瓶に表示されている名称又はＩＵＰＡＣ規則、ＣａｍｂｒｉｄｇｅＳｏｆｔ（Ｒ）ＣｈｅｍＤｒａｗ Ｕｌｔｒａ １２．０、ＣａｍｂｒｉｄｇｅＳｏｆｔ（Ｒ）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｅ−Ｎｏｔｅｂｏｏｋ １１若しくはＡｕｔｏＮｏｍ ２０００により命名された名称である。当然のことながら、本願に記載する実施例及び実施形態は例証のみを目的とし、それらの記載に照らして種々の改変又は変更が当業者に想到され、このような改変又は変更も本開示の趣旨と範囲に含むものとする。

化合物合成及び特性決定用分析法
以下の手順の詳細、一般的な手順の説明又は実施例の表には分析データが含まれている。特に指定しない限り、全ての^１Ｈ及び^１３Ｃ ＮＭＲデータはＶａｒｉａｎ Ｍｅｒｃｕｒｙ Ｐｌｕｓ ４００ＭＨｚ又はＢｒｕｋｅｒ ＡＶＩＩＩ ３００ＭＨｚ機器で取得し、化学シフトは百万分率（ｐｐｍ）で表す。ＨＰＬＣ分析データについては実験セクションに詳述するか、又は表４に示す方法を使用し、ＬＣ／ＭＳ及びＨＰＬＣ条件を箇条書きする。

以下の実施例で使用する略語は以下の通りである。

［実施例１］（２Ｓ，６ａＳ，６ｂＲ，７Ｓ，８ａＳ，８ｂＳ，１０Ｓ，１１ａＲ，１２ａＳ，１２ｂＳ）−１０−（４−（３−アミノベンジル）フェニル）−２，６ｂ−ジフルオロ−７−ヒドロキシ−８ｂ−（２−ヒドロキシアセチル）−６ａ，８ａ−ジメチル−１，２，６ａ，６ｂ，７，８，８ａ，８ｂ，１１ａ，１２，１２ａ，１２ｂ−ドデカヒドロ−４Ｈ−ナフト［２’，１’：４，５］インデノ［１，２−ｄ］［１，３］ジオキソール−４−オンの合成

工程１：４−（ブロモメチル）ベンズアルデヒドの合成

水素化ジイソブチルアルミニウム（１５３ｍＬ，１５３ｍｍｏｌ，１Ｍトルエン溶液）を４−（ブロモメチル）ベンゾニトリル（２０ｇ，１０２ｍｍｏｌ）の０℃トルエン（４００ｍＬ）溶液に１時間かけて滴下した。更にバイアル２本を上記のように準備した。全３本の反応混合液を合わせた。混合液に１０％ＨＣｌ水溶液（１．５Ｌ）を加えた。混合液をＤＣＭ（３×５００ｍＬ）で抽出した。有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥し、濾過し、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液ＰＥ：ＥｔＯＡｃ＝１０：１）により精製し、標記化合物（５０ｇ，収率８２％）を白色固体として得た。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ１０．０２（ｓ，１Ｈ），７．９１−７．８２（ｍ，２Ｈ），７．５６（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，２Ｈ），４．５５−４．４５（ｍ，２Ｈ）。

工程２：３−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）アニリンの合成

３−ブロモアニリン（４０ｇ，２３３ｍｍｏｌ）の１，４−ジオキサン（４８０ｍＬ）溶液に４，４，４’，４’，５，５，５’，５’−テトラメチル−２，２’−ビ（１，３，２−ジオキサボロラン）（９４ｇ，３７２ｍｍｏｌ）と、酢酸カリウム（４５．６ｇ，４６５ｍｍｏｌ）と、２−ジシクロヘキシルホスフィノ−２’，４’，６’−トリ−ｉ−プロピル−１，１’−ビフェニル（８．０７ｇ，１３．９５ｍｍｏｌ）と、トリス（ジベンジリデンアセトン）ジパラジウム（０）（８．５２ｇ，９．３０ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合液を窒素下で８０℃に４時間加熱した。バイアルをもう１本上記のように準備した。２本の反応混合液を合わせて濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液ＰＥ：ＥｔＯＡｃ＝１０：１）により精製し、標記化合物（６０ｇ，収率５５．４％）を薄黄色固体として得た。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ７．２３−７．１３（ｍ，３Ｈ），６．８０（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），３．８２−３．３８（ｍ，２Ｈ），１．３４（ｓ，１２Ｈ）。

工程３：（３−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）フェニル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルの合成

３−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）アニリン（実施例１，工程２）（３０ｇ，１３７ｍｍｏｌ）と二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（３８．９ｇ，１７８ｍｍｏｌ）をトルエン（６００ｍＬ）中にて１００℃で２４時間混合した。バイアルをもう１本上記のように準備した。２本の反応混合液を合わせて混合液を蒸発させ、ＥｔＯＡｃ（１．５Ｌ）に溶解し、０．１Ｎ ＨＣｌ（３×２Ｌ）とブライン（３Ｌ）で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥し、濾過し、減圧濃縮し、標記化合物（５０ｇ，収率５７％）を赤色固体として得た。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ７．６３（ｂｒ ｍ，２Ｈ），７．４８（ｄ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，１Ｈ），７．３７−７．２８（ｍ，１Ｈ），１．５２（ｓ，９Ｈ），１．３４（ｓ，１２Ｈ）。

工程４：（３−（４−ホルミルベンジル）フェニル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルの合成

４−（ブロモメチル）ベンズアルデヒド（実施例１，工程１）（２４．９４ｇ，１２５ｍｍｏｌ）と、１，１’−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセンジクロロパラジウム（ＩＩ）ＤＣＭ錯体（１３．７５ｇ，１８．８０ｍｍｏｌ）と、（３−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）フェニル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル（実施例１，工程３）（２０ｇ，６２．７ｍｍｏｌ）と、炭酸カリウム（４３．３ｇ，３１３ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（４００ｍＬ）で調液した混合液を８０℃まで１２時間加熱した。バイアルをもう１本上記のように準備した。２本の反応混合液を合わせて水（５００ｍＬ）で希釈した。水性混合液をＥｔＯＡｃ（３×５００ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせてＮａ_２ＳＯ_４で乾燥し、濾過し、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液ＰＥ：ＥｔＯＡｃ＝１０：１）により精製し、標記化合物（１５ｇ，収率３８．４％）を白色固体として得た。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ９．９５（ｓ，１Ｈ），７．７８（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，２Ｈ），７．３３（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，２Ｈ），７．２７−７．１３（ｍ，３Ｈ），６．８２（ｄ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，１Ｈ），６．４７（ｂｒ．ｓ．，１Ｈ），４．００（ｓ，２Ｈ），１．４８（ｓ，９Ｈ）。

工程５：（６Ｓ，８Ｓ，９Ｒ，１０Ｓ，１１Ｓ，１３Ｓ，１４Ｓ，１６Ｒ，１７Ｓ）−６，９−ジフルオロ−１１，１６，１７−トリヒドロキシ−１７−（２−ヒドロキシアセチル）−１０，１３−ジメチル−６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−ドデカヒドロ−３Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−オンの合成

（２Ｓ，６ａＳ，６ｂＲ，７Ｓ，８ａＳ，８ｂＳ，１１ａＲ，１２ａＳ，１２ｂＳ）−２，６ｂ−ジフルオロ−７−ヒドロキシ−８ｂ−（２−ヒドロキシアセチル）−６ａ，８ａ，１０，１０−テトラメチル−１，２，６ａ，６ｂ，７，８，８ａ，８ｂ，１１ａ，１２，１２ａ，１２ｂ−ドデカヒドロ−４Ｈ−ナフト［２’，１’：４，５］インデノ［１，２−ｄ］［１，３］ジオキソール−４−オン（２０ｇ，４４．２ｍｍｏｌ）を４０％ＨＢＦ_４水溶液（４４０ｍＬ）に懸濁し、混合液を２５℃で４８時間攪拌した。反応の完了後、水２Ｌを加え、固形物を濾取した。この固形物を水洗（１Ｌ）した後、ＭｅＯＨ（２００ｍＬ）で洗浄し、標記化合物（１１ｇ，収率６０．３％）を白色固体として得た。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ７．２５（ｄ，Ｊ＝１０．１Ｈｚ，１Ｈ），６．２８（ｄ，Ｊ＝１０．１Ｈｚ，１Ｈ），６．１０（ｓ，１Ｈ），５．７３−５．５０（ｍ，１Ｈ），５．３９（ｂｒ．ｓ．，１Ｈ），４．８５−４．６０（ｍ，２Ｈ），４．５０（ｄ，Ｊ＝１９．４Ｈｚ，１Ｈ），４．２０−４．０４（ｍ，２Ｈ），２．４６−２．０６（ｍ，６Ｈ），１．８７−１．７５（ｍ，１Ｈ），１．５６−１．３０（ｍ，６Ｈ），０．８３（ｓ，３Ｈ）。

工程６：（２Ｓ，６ａＳ，６ｂＲ，７Ｓ，８ａＳ，８ｂＳ，１０Ｒ，１１ａＲ，１２ａＳ，１２ｂＳ）−１０−（４−（３−アミノベンジル）フェニル）−２，６ｂ−ジフルオロ−７−ヒドロキシ−８ｂ−（２−ヒドロキシアセチル）−６ａ，８ａ−ジメチル−１，２，６ａ，６ｂ，７，８，８ａ，８ｂ，１１ａ，１２，１２ａ，１２ｂ−ドデカヒドロ−４Ｈ−ナフト［２’，１’：４，５］インデノ［１，２−ｄ］［１，３］ジオキソール−４−オンの合成

（６Ｓ，８Ｓ，９Ｒ，１０Ｓ，１１Ｓ，１３Ｓ，１４Ｓ，１６Ｒ，１７Ｓ）−６，９−ジフルオロ−１１，１６，１７−トリヒドロキシ−１７−（２−ヒドロキシアセチル）−１０，１３−ジメチル−６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−ドデカヒドロ−３Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−オン（実施例１，工程５）（４．４ｇ，１０．６７ｍｍｏｌ）とＭｇＳＯ_４（６．４２ｇ，５３．３ｍｍｏｌ）のＭｅＣＮ（１００ｍＬ）懸濁液を２０℃で１時間攪拌した。（３−（４−ホルミルベンジル）フェニル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル（実施例１，工程４）（３．６５ｇ，１１．７４ｍｍｏｌ）のＭｅＣＮ（１００ｍＬ）溶液を一度に加えた。氷浴を使用して内部温度を２５℃未満に維持しながらトリフルオロメタンスルホン酸（９．０１ｍＬ，５３．３ｍｍｏｌ）を滴下した。滴下後、混合液を２０℃で２時間攪拌した。更にバイアル３本を上記のように準備した。全４本の反応混合液を合わせて濃縮し、残渣を分取ＨＰＬＣにより精製し、標記化合物（４．５ｇ，収率１４．２％）を黄色固体として得た。ＬＣＭＳ（方法ａ，表４）Ｒ_ｔ＝２．６５分；ＭＳ ｍ／ｚ＝６０６．２（Ｍ＋Ｈ）^＋；^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ７．４４−７．１７（ｍ，５Ｈ），６．８９（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，１Ｈ），６．４４−６．２５（ｍ，４Ｈ），６．１３（ｂｒ．ｓ．，１Ｈ），５．７９−５．５２（ｍ，２Ｈ），５．４４（ｓ，１Ｈ），５．１７−４．８９（ｍ，３Ｈ），４．５１（ｄ，Ｊ＝１９．４Ｈｚ，１Ｈ），４．２５−４．０５（ｍ，２Ｈ），３．７３（ｓ，２Ｈ），３．１７（ｂｒ．ｓ．，１Ｈ），２．７５−２．５５（ｍ，１Ｈ），２．３６−１．９７（ｍ，３Ｈ），１．７６−１．６４（ｍ，３Ｈ），１．５９−１．３９（ｍ，４Ｈ），０．９４−０．７８（ｍ，３Ｈ）。分取ＨＰＬＣ法：機器：Ｇｉｌｓｏｎ ２８１セミ分取ＨＰＬＣシステム；移動相：Ａ：ギ酸／Ｈ_２Ｏ＝０．０１％ｖ／ｖ；Ｂ：ＭｅＣＮ；カラム：Ｌｕｎａ Ｃ１８ １５０＊２５ ５μｍ；流速：２５ｍＬ／分；モニター波長：２２０及び２５４ｎｍ。

［実施例２］（６ａＲ，６ｂＳ，７Ｓ，８ａＳ，８ｂＳ，１０Ｒ，１１ａＲ，１２ａＳ，１２ｂＳ）−１０−（４−（３−アミノベンジル）フェニル）−７−ヒドロキシ−８ｂ−（２−ヒドロキシアセチル）−６ａ，８ａ−ジメチル−１，２，６ａ，６ｂ，７，８，８ａ，８ｂ，１１ａ，１２，１２ａ，１２ｂ−ドデカヒドロ−４Ｈ−ナフト［２’，１’：４，５］インデノ［１，２−ｄ］［１，３］ジオキソール−４−オンの合成

実施例２は（８Ｓ，９Ｓ，１０Ｒ，１１Ｓ，１３Ｓ，１４Ｓ，１６Ｒ，１７Ｓ）−１１，１６，１７−トリヒドロキシ−１７−（２−ヒドロキシアセチル）−１０，１３−ジメチル−６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−ドデカヒドロ−３Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−オンを使用して実施例１と同様の手順で合成した。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ７．３６（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，２Ｈ），７．３１（ｄ，Ｊ＝１０．１Ｈｚ，１Ｈ），７．２０（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，２Ｈ），６．８９（ｔ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ），６．３９−６．２８（ｍ，３Ｈ），６．１６（ｄｄ，Ｊ＝１．５，９．９Ｈｚ，１Ｈ），５．９３（ｓ，１Ｈ），５．３９（ｓ，１Ｈ），５．０８（ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，１Ｈ），４．９８−４．８７（ｍ，３Ｈ），４．７８（ｄ，Ｊ＝３．１Ｈｚ，１Ｈ），４．４９（ｄｄ，Ｊ＝６．２，１９．４Ｈｚ，１Ｈ），４．２９（ｂｒ．ｓ．，１Ｈ），４．１７（ｄｄ，Ｊ＝５．５，１９．６Ｈｚ，１Ｈ），３．７４（ｓ，２Ｈ），２．６１−２．５３（ｍ，１Ｈ），２．３６−２．２６（ｍ，１Ｈ），２．１１（ｄ，Ｊ＝１１．０Ｈｚ，１Ｈ），２．０７（ｓ，１Ｈ），２．０２（ｄ，Ｊ＝１２．８Ｈｚ，１Ｈ），１．８３−１．５４（ｍ，５Ｈ），１．３９（ｓ，３Ｈ），１．１６−０．９６（ｍ，２Ｈ），０．８５（ｓ，３Ｈ）。ＬＣＭＳ（方法ａ，表４）Ｒ_ｔ＝２．３６５分；ｍ／ｚ＝５７０．２（Ｍ＋Ｈ）^＋。

［実施例３］（６ａＳ，６ｂＲ，７Ｓ，８ａＳ，８ｂＳ，１０Ｒ，１１ａＲ，１２ａＳ，１２ｂＳ）−１０−（４−（３−アミノベンジル）フェニル）−６ｂ−フルオロ−７−ヒドロキシ−８ｂ−（２−ヒドロキシアセチル）−６ａ，８ａ−ジメチル−１，２，６ａ，６ｂ，７，８，８ａ，８ｂ，１１ａ，１２，１２ａ，１２ｂ−ドデカヒドロ−４Ｈ−ナフト［２’，１’：４，５］インデノ［１，２−ｄ］［１，３］ジオキソール−４−オンの合成

実施例３は（８Ｓ，９Ｒ，１０Ｓ，１１Ｓ，１３Ｓ，１４Ｓ，１６Ｒ，１７Ｓ）−９−フルオロ−１１，１６，１７−トリヒドロキシ−１７−（２−ヒドロキシアセチル）−１０，１３−ジメチル−６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−ドデカヒドロ−３Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−オンを使用して実施例１と同様の手順で合成した。

^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ７．３７−７．２６（ｍ，３Ｈ），７．２１（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，２Ｈ），６．８９（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，１Ｈ），６．４３−６．３０（ｍ，３Ｈ），６．２３（ｄ，Ｊ＝１０．１Ｈｚ，１Ｈ），６．０４（ｓ，１Ｈ），５．７５（ｓ，１Ｈ），５．４４（ｓ，２Ｈ），５．０９（ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，１Ｈ），４．９３（ｂｒ．ｓ．，３Ｈ），４．５０（ｄｄ，Ｊ＝６．２，１９．４Ｈｚ，１Ｈ），４．２８−４．０９（ｍ，２Ｈ），３．７４（ｓ，２Ｈ），２．７３−２．５４（ｍ，２Ｈ），２．３５（ｄ，Ｊ＝１３．２Ｈｚ，１Ｈ），２．２５−２．１２（ｍ，１Ｈ），２．０５（ｄ，Ｊ＝１５．０Ｈｚ，１Ｈ），１．９２−１．７７（ｍ，１Ｈ），１．７４−１．５８（ｍ，３Ｈ），１．５０（ｓ，３Ｈ），１．４５−１．３０（ｍ，１Ｈ），０．８７（ｓ，３Ｈ）。ＬＣＭＳ（方法ａ，表４）Ｒ_ｔ＝２．６８分；ｍ／ｚ＝５８８．１（Ｍ＋Ｈ）^＋。

［実施例４］（Ｓ）−４−（２−（２−ブロモアセトアミド）アセトアミド）−５−（（３−（４−（（６ａＲ，６ｂＳ，７Ｓ，８ａＳ，８ｂＳ，１０Ｒ，１１ａＲ，１２ａＳ，１２ｂＳ）−７−ヒドロキシ−６ａ，８ａ−ジメチル−４−オキソ−８ｂ−（２−（ホスホノオキシ）アセチル）−２，４，６ａ，６ｂ，７，８，８ａ，８ｂ，１１ａ，１２，１２ａ，１２ｂ−ドデカヒドロ−１Ｈ−ナフト［２’，１’：４，５］インデノ［１，２−ｄ］［１，３］ジオキソール−１０−イル）ベンジル）フェニル）アミノ）−５−オキソペンタン酸の合成

工程１：（Ｓ）−２−（２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）アセトアミド）−５−（ｔｅｒｔ−ブトキシ）−５−オキソペンタン酸の合成

２−クロロトリチルクロリド樹脂（３０ｇ，９２ｍｍｏｌ）と、トリエチルアミン（４６．４ｇ，４５８ｍｍｏｌ）と、（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−５−（ｔｅｒｔ−ブトキシ）−５−オキソペンタン酸（２５．５ｇ，６０ｍｍｏｌ）を無水ＤＣＭ（２００ｍＬ）で調液した混合液に２０℃で８時間Ｎ_２をバブリングした。混合液を濾過し、樹脂をＤＣＭ（２×２００ｍＬ）、ＭｅＯＨ（２×２００ｍＬ）及びＤＭＦ（２×２００ｍＬ）で洗浄した。樹脂をピペリジン：ＤＭＦ溶液（１：４，４００ｍＬ）に加え、混合液に８分間Ｎ_２をバブリングした後、濾過した。この操作を５回繰り返し、Ｆｍｏｃ保護基を完全に除去した。樹脂をＤＭＦ（５×５００ｍＬ）で洗浄し、樹脂に結合した（Ｓ）−２−アミノ−５−（ｔｅｒｔ−ブトキシ）−５−オキソペンタン酸を得た。２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）酢酸（１３．３８ｇ，４５．０ｍｍｏｌ）と、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（７．８６ｍＬ，４５ｍｍｏｌ）と、ヒドロキシベンゾトリアゾール（６．８９ｇ，４５ｍｍｏｌ）と、２−（６−クロロ−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，２，３］トリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルイソウロニウムヘキサフルオロホスフェート（Ｖ）（１８．６２ｇ，４５．０ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２００ｍＬ）で調液した混合液を２０℃で３０分間攪拌した。樹脂に結合した（Ｓ）−２−アミノ−５−（ｔｅｒｔ−ブトキシ）−５−オキソペンタン酸を混合液に加え、得られた混合液に２５℃で１．５時間Ｎ_２をバブリングした。混合液を濾過し、樹脂をＤＭＦ（４×５００ｍＬ）とＤＣＭ（２×５００ｍＬ）で洗浄した。混合液に１％ＴＦＡ／ＤＣＭ（５×５００ｍＬ）を加え、５分間Ｎ_２をバブリングした。混合液を濾過し、濾液をＮａＨＣＯ_３の飽和溶液（２００ｍＬ）に直接加えた。混合液を合わせて分離し、有機相を飽和クエン酸水溶液（４×４００ｍＬ）とブライン（２×３００ｍＬ）で洗浄した。最終有機溶液をＮａ_２ＳＯ_４（２０ｇ）で乾燥し、濾過し、減圧濃縮し、標記化合物（１０ｇ，収率２０％）を薄黄色固体として得た。

^１Ｈ ＮＭＲ：（ＣＤＣｌ_３，４００ＭＨｚ）δ＝７．７５（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），７．５９（ｂｒ ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），７．４１−７．３６（ｍ，２Ｈ），７．３０（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ），５．８２（ｂｒ ｓ，１Ｈ），４．５７（ｂｒ ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，１Ｈ），４．３８（ｂｒ ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），４．２７−４．１５（ｍ，１Ｈ），４．０６−３．８３（ｍ，２Ｈ），２．５０−２．２９（ｍ，２Ｈ），２．２６−２．１３（ｍ，１Ｈ），２．０６−２．０２（ｍ，１Ｈ），１．４３（ｓ，９Ｈ）。

工程２：（Ｓ）−４−（２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）アセトアミド）−５−（（３−（４−（（６ａＲ，６ｂＳ，７Ｓ，８ａＳ，８ｂＳ，１０Ｒ，１１ａＲ，１２ａＳ，１２ｂＳ）−７−ヒドロキシ−８ｂ−（２−ヒドロキシアセチル）−６ａ，８ａ−ジメチル−４−オキソ−２，４，６ａ，６ｂ，７，８，８ａ，８ｂ，１１ａ，１２，１２ａ，１２ｂ−ドデカヒドロ−１Ｈ−ナフト［２’，１’：４，５］インデノ［１，２−ｄ］［１，３］ジオキソール−１０−イル）ベンジル）フェニル）アミノ）−５−オキソペンタン酸ｔｅｒｔ−ブチルの合成

（Ｓ）−２−（２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）アセトアミド）−５−（ｔｅｒｔ−ブトキシ）−５−オキソペンタン酸（実施例４，工程１）（４２４ｍｇ，０．８７８ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（３．５ｍＬ）溶液に（６ａＲ，６ｂＳ，７Ｓ，８ａＳ，８ｂＳ，１０Ｒ，１１ａＲ，１２ａＳ，１２ｂＳ）−１０−（４−（３−アミノベンジル）フェニル）−７−ヒドロキシ−８ｂ−（２−ヒドロキシアセチル）−６ａ，８ａ−ジメチル−１，２，６ａ，６ｂ，７，８，８ａ，８ｂ，１１ａ，１２，１２ａ，１２ｂ−ドデカヒドロ−４Ｈ−ナフト［２’，１’：４，５］インデノ［１，２−ｄ］［１，３］ジオキソール−４−オン（実施例２）（５００ｍｇ，０．８７８ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（０．３ｍＬ，２．６３ｍｍｏｌ）を２５℃にて加えた。溶液を０℃まで冷却した後、２，４，６−トリプロピル−１，３，５，２，４，６−トリオキサトリホスフィナン２，４，６−トリオキシド（１．１２ｇ，１．７５５ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合液を２５℃で１２時間攪拌した。ＬＣＭＳにより反応が完了したことを確認した。更にバイアル１４本を上記のように準備した。全１５本の反応混合液を合わせた。混合液を逆相カラムにより精製し、標記化合物（５ｇ，収率３８．４％）を黄色固体として得た。逆相カラム法：機器：島津ＬＣ−８Ａ分取ＨＰＬＣ；カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ Ｃ１８ ２００＊４０ｍｍ＊１０μｍ；移動相：Ａ：Ｈ_２Ｏ（０．０５％ＴＦＡ）；Ｂ：ＭｅＣＮ；濃度勾配：３０分間で３０％→１００％Ｂ；流速：６０ｍＬ／分；波長：２２０及び２５４ｎｍ。

ＬＣＭＳ（方法ａ，表４）Ｒ_ｔ＝１．３４分；ｍ／ｚ１０１６．６（Ｍ＋Ｈ−１８）^＋。

工程３：（Ｓ）−４−（２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）アセトアミド）−５−（（３−（４−（（６ａＲ，６ｂＳ，７Ｓ，８ａＳ，８ｂＳ，１０Ｒ，１１ａＲ，１２ａＳ，１２ｂＳ）−８ｂ−（２−（（ジ−ｔｅｒｔ−ブトキシホスホリル）オキシ）アセチル）−７−ヒドロキシ−６ａ，８ａ−ジメチル−４−オキソ−２，４，６ａ，６ｂ，７，８，８ａ，８ｂ，１１ａ，１２，１２ａ，１２ｂ−ドデカヒドロ−１Ｈ−ナフト［２’，１’：４，５］インデノ［１，２−ｄ］［１，３］ジオキソール−１０−イル）ベンジル）フェニル）アミノ）−５−オキソペンタン酸ｔｅｒｔ−ブチルの合成

（Ｓ）−４−（２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）アセトアミド）−５−（（３−（４−（（６ａＲ，６ｂＳ，７Ｓ，８ａＳ，８ｂＳ，１０Ｒ，１１ａＲ，１２ａＳ，１２ｂＳ）−７−ヒドロキシ−８ｂ−（２−ヒドロキシアセチル）−６ａ，８ａ−ジメチル−４−オキソ−２，４，６ａ，６ｂ，７，８，８ａ，８ｂ，１１ａ，１２，１２ａ，１２ｂ−ドデカヒドロ−１Ｈ−ナフト［２’，１’：４，５］インデノ［１，２−ｄ］［１，３］ジオキソール−１０−イル）ベンジル）フェニル）アミノ）−５−オキソペンタン酸ｔｅｒｔ−ブチル（実施例４，工程２）（４００ｍｇ，０．３８７ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（２．５ｍＬ）溶液に１Ｈ−テトラゾール（２７１ｍｇ，３．８７ｍｍｏｌ）とジ−ｔｅｒｔ−ブチルジエチルホスホロアミダイト（１．１６ｇ，４．６４ｍｍｏｌ）を加えた。反応液を室温で２．５時間攪拌後、０℃まで冷却した。得られた混合液に過酸化水素（２４１ｍｇ，２．１２７ｍｍｏｌ）を加え、室温まで昇温し、１時間攪拌後、ＬＣＭＳにより反応が完了したことを確認した。更にバイアル１１本を上記のように準備した。全１２本の反応混合液を合わせた。混合液を逆相カラムにより精製し、標記化合物（４．４ｇ，収率６４．２％）を黄色固体として得た。逆相カラム法：機器：島津ＬＣ−８Ａ分取ＨＰＬＣ；カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ Ｃ１８ ２００＊４０ｍｍ＊１０μｍ；移動相：Ａ：Ｈ_２Ｏ；Ｂ：ＭｅＣＮ；濃度勾配：３０分間で５０％→１００％Ｂ；流速：６０ｍＬ／分；波長：２２０及び２５４ｎｍ。ＬＣＭＳ（方法ａ，表４）Ｒ_ｔ＝１．４１分；ｍ／ｚ１２２６．７（Ｍ＋Ｈ）^＋。

工程４：（Ｓ）−４−（２−アミノアセトアミド）−５−（（３−（４−（（６ａＲ，６ｂＳ，７Ｓ，８ａＳ，８ｂＳ，１０Ｒ，１１ａＲ，１２ａＳ，１２ｂＳ）−８ｂ−（２−（（ジ−ｔｅｒｔ−ブトキシホスホリル）オキシ）アセチル）−７−ヒドロキシ−６ａ，８ａ−ジメチル−４−オキソ−２，４，６ａ，６ｂ，７，８，８ａ，８ｂ，１１ａ，１２，１２ａ，１２ｂ−ドデカヒドロ−１Ｈ−ナフト［２’，１’：４，５］インデノ［１，２−ｄ］［１，３］ジオキソール−１０−イル）ベンジル）フェニル）アミノ）−５−オキソペンタン酸ｔｅｒｔ−ブチルの合成

（Ｓ）−４−（２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）アセトアミド）−５−（（３−（４−（（６ａＲ，６ｂＳ，７Ｓ，８ａＳ，８ｂＳ，１０Ｒ，１１ａＲ，１２ａＳ，１２ｂＳ）−８ｂ−（２−（（ジ−ｔｅｒｔ−ブトキシホスホリル）オキシ）アセチル）−７−ヒドロキシ−６ａ，８ａ−ジメチル−４−オキソ−２，４，６ａ，６ｂ，７，８，８ａ，８ｂ，１１ａ，１２，１２ａ，１２ｂ−ドデカヒドロ−１Ｈ−ナフト［２’，１’：４，５］インデノ［１，２−ｄ］［１，３］ジオキソール−１０−イル）ベンジル）フェニル）アミノ）−５−オキソペンタン酸ｔｅｒｔ−ブチル（実施例４，工程３）（１．１ｇ，０．８９７ｍｍｏｌ）のＭｅＣＮ（６ｍＬ）溶液に２５℃にてピペリジン（０．７５ｍＬ，７．５８ｍｍｏｌ）を加えた。反応液を室温で２０分間攪拌後、ＬＣＭＳにより反応が完了したことを確認した。更にバイアル３本を上記のように準備した。全４本の反応混合液を合わせた。混合液を濃縮して残渣を得、２時間攪拌下にＰＥ（１０ｍＬ）で処理した。得られた固形物を濾取し、減圧乾燥し、標記化合物（３．８ｇ，収率９０％）を黄色固体として得た。

ＬＣＭＳ（方法ａ，表４）Ｒ_ｔ＝１．１６分；ｍ／ｚ１００４．６（Ｍ＋Ｈ）^＋。

工程５：（Ｓ）−４−（２−（２−ブロモアセトアミド）アセトアミド）−５−（（３−（４−（（６ａＲ，６ｂＳ，７Ｓ，８ａＳ，８ｂＳ，１０Ｒ，１１ａＲ，１２ａＳ，１２ｂＳ）−８ｂ−（２−（（ジ−ｔｅｒｔ−ブトキシホスホリル）オキシ）アセチル）−７−ヒドロキシ−６ａ，８ａ−ジメチル−４−オキソ−２，４，６ａ，６ｂ，７，８，８ａ，８ｂ，１１ａ，１２，１２ａ，１２ｂ−ドデカヒドロ−１Ｈ−ナフト［２’，１’：４，５］インデノ［１，２−ｄ］［１，３］ジオキソール−１０−イル）ベンジル）フェニル）アミノ）−５−オキソペンタン酸ｔｅｒｔ−ブチルの合成

２−ブロモ酢酸（９７ｍｇ，０．６９７ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（２．５ｍＬ）溶液に室温にてＥＥＤＱ（１７２ｍｇ，０．６９７ｍｍｏｌ）を加えた。混合液を室温で１時間攪拌した。（Ｓ）−４−（２−アミノアセトアミド）−５−（（３−（４−（（６ａＲ，６ｂＳ，７Ｓ，８ａＳ，８ｂＳ，１０Ｒ，１１ａＲ，１２ａＳ，１２ｂＳ）−８ｂ−（２−（（ジ−ｔｅｒｔ−ブトキシホスホリル）オキシ）アセチル）−７−ヒドロキシ−６ａ，８ａ−ジメチル−４−オキソ−２，４，６ａ，６ｂ，７，８，８ａ，８ｂ，１１ａ，１２，１２ａ，１２ｂ−ドデカヒドロ−１Ｈ−ナフト［２’，１’：４，５］インデノ［１，２−ｄ］［１，３］ジオキソール−１０−イル）ベンジル）フェニル）アミノ）−５−オキソペンタン酸ｔｅｒｔ−ブチル（実施例４，工程４）（３５０ｍｇ，０．３４９ｍｍｏｌ）を加え、得られた溶液を２．５時間攪拌後、ＬＣＭＳにより反応が完了したことを確認した。更にバイアル７本を上記のように準備した。全８本の反応混合液を合わせた。反応液をＤＣＭ（１００ｍＬ）で希釈し、ＨＢｒ水溶液（１Ｍ，２×８０ｍＬ）、ＮａＨＣＯ_３水溶液（６０ｍＬ）及びブライン（６０ｍＬ）で洗浄した。有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥し、濾過し、減圧濃縮し、標記化合物（２ｇ，収率６３．７％）を黄色油状物として得た。

ＬＣＭＳ（方法ａ，表４）Ｒ_ｔ＝１．３０分；ｍ／ｚ１１２４．２，１１２５．９（Ｍ＋Ｈ）^＋。

工程６：（Ｓ）−４−（２−（２−ブロモアセトアミド）アセトアミド）−５−（（３−（４−（（６ａＲ，６ｂＳ，７Ｓ，８ａＳ，８ｂＳ，１０Ｒ，１１ａＲ，１２ａＳ，１２ｂＳ）−７−ヒドロキシ−６ａ，８ａ−ジメチル−４−オキソ−８ｂ−（２−（ホスホノオキシ）アセチル）−２，４，６ａ，６ｂ，７，８，８ａ，８ｂ，１１ａ，１２，１２ａ，１２ｂ−ドデカヒドロ−１Ｈ−ナフト［２’，１’：４，５］インデノ［１，２−ｄ］［１，３］ジオキソール−１０−イル）ベンジル）フェニル）アミノ）−５−オキソペンタン酸の合成

（Ｓ）−４−（２−（２−ブロモアセトアミド）アセトアミド）−５−（（３−（４−（（６ａＲ，６ｂＳ，７Ｓ，８ａＳ，８ｂＳ，１０Ｒ，１１ａＲ，１２ａＳ，１２ｂＳ）−８ｂ−（２−（（ジ−ｔｅｒｔ−ブトキシホスホリル）オキシ）アセチル）−７−ヒドロキシ−６ａ，８ａ−ジメチル−４−オキソ−２，４，６ａ，６ｂ，７，８，８ａ，８ｂ，１１ａ，１２，１２ａ，１２ｂ−ドデカヒドロ−１Ｈ−ナフト［２’，１’：４，５］インデノ［１，２−ｄ］［１，３］ジオキソール−１０−イル）ベンジル）フェニル）アミノ）−５−オキソペンタン酸ｔｅｒｔ−ブチル（実施例４，工程５）（２ｇ，１．７７８ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（１６ｍＬ）溶液にＴＦＡ（８ｍＬ，１０４ｍｍｏｌ）を加え、得られた混合液を室温で４０分間攪拌後、ＬＣＭＳにより反応が完了したことを確認した。溶媒を減圧除去した。得られた残渣を分取ＨＰＬＣにより精製した。移動相を直接凍結乾燥し、標記化合物（６４０ｍｇ，収率３５．３％）を黄色固体として得た。分取ＨＰＬＣ法：機器：島津ＬＣ−８Ａ分取ＨＰＬＣ；カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ Ｃ１８ ２００＊４０ｍｍ＊１０μｍ；移動相：Ａ：Ｈ_２Ｏ（０．０９％ＴＦＡ）；Ｂ：ＭｅＣＮ；濃度勾配：２０分間で３０％→４０％Ｂ；流速：６０ｍＬ／分；波長：２２０及び２５４ｎｍ。

^１Ｈ ＮＭＲ：（ＤＭＳＯ−ｄ６，４００ＭＨｚ）δ＝９．８８（ｓ，１Ｈ），８．５２（ｓ，１Ｈ），８．２４（ｂｒ ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．４６（ｂｒ ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ），７．４２（ｓ，１Ｈ），７．３６（ｂｒ ｄ，Ｊ ＝７．９Ｈｚ，２Ｈ），７．３０（ｂｒ ｄ，Ｊ＝９．７Ｈｚ，１Ｈ），７．２３−７．１７（ｍ，３Ｈ），６．９０（ｂｒ ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，１Ｈ），６．１６（ｂｒ ｄ，Ｊ＝１０．４Ｈｚ，１Ｈ），５．９３（ｓ，１Ｈ），５．４７（ｓ，１Ｈ），４．９６−４．８５（ｍ，３Ｈ），４．５８（ｂｒ ｄｄ，Ｊ＝７．９，１８．７Ｈｚ，１Ｈ），４．３８（ｂｒ ｄ，Ｊ＝５．３Ｈｚ，１Ｈ），４．２９（ｂｒ ｓ，１Ｈ），３．９３（ｓ，２Ｈ），３．８９（ｓ，２Ｈ），３．８０（ｂｒ ｓ，２Ｈ），２．３０−２．２２（ｍ，２Ｈ），２．１６−１．９１（ｍ，４Ｈ），１．８５−１．６２（ｍ，６Ｈ），１．３９（ｓ，３Ｈ），１．００（ｂｒ ｓ，２Ｈ），０．８７（ｓ，３Ｈ）。ＬＣＭＳ（方法ａ，表４）Ｒ_ｔ＝２．８６分；ｍ／ｚ９５６．０，９５８．０（Ｍ＋Ｈ）^＋。

［実施例５］リン酸二水素２−（（２Ｓ，６ａＳ，６ｂＲ，７Ｓ，８ａＳ，８ｂＳ，１０Ｒ，１１ａＲ，１２ａＳ，１２ｂＳ）−１０−（４−（３−（（Ｓ）−６−アミノ−２−（２−（２−ブロモアセトアミド）アセトアミド）ヘキサンアミド）ベンジル）フェニル）−２，６ｂ−ジフルオロ−７−ヒドロキシ−６ａ，８ａ−ジメチル−４−オキソ−１，２，４，６ａ，６ｂ，７，８，８ａ，１１ａ，１２，１２ａ，１２ｂ−ドデカヒドロ−８ｂＨ−ナフト［２’，１’：４，５］インデノ［１，２−ｄ］［１，３］ジオキソール−８ｂ−イル）−２−オキソエチルの合成

工程１：（（Ｓ）−５−（２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）アセトアミド）−６−（（３−（４−（（２Ｓ，６ａＳ，６ｂＲ，７Ｓ，８ａＳ，８ｂＳ，１０Ｒ，１１ａＲ，１２ａＳ，１２ｂＳ）−２，６ｂ−ジフルオロ−７−ヒドロキシ−８ｂ−（２−ヒドロキシアセチル）−６ａ，８ａ−ジメチル−４−オキソ−２，４，６ａ，６ｂ，７，８，８ａ，８ｂ，１１ａ，１２，１２ａ，１２ｂ−ドデカヒドロ−１Ｈ−ナフト［２’，１’：４，５］インデノ［１，２−ｄ］［１，３］ジオキソール−１０−イル）ベンジル）フェニル）アミノ）−６−オキソヘキシル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルの合成

Ｎ^２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）グリシル）−Ｎ６−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−リジン（５．５８ｇ，８．２６ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（６０ｍＬ）溶液に０℃にて２，４，６−トリプロピル−１，３，５，２，４，６−トリオキサトリホスフィナン２，４，６−トリオキシド（１０．５１ｇ，１６．５１ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（３．４５ｍＬ，２４．７７ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合液を室温で１時間攪拌し、（２Ｓ，６ａＳ，６ｂＲ，７Ｓ，８ａＳ，８ｂＳ，１０Ｒ，１１ａＲ，１２ａＳ，１２ｂＳ）−１０−（４−（３−アミノベンジル）フェニル）−２，６ｂ−ジフルオロ−７−ヒドロキシ−８ｂ−（２−ヒドロキシアセチル）−６ａ，８ａ−ジメチル−１，２，６ａ，６ｂ，７，８，８ａ，８ｂ，１１ａ，１２，１２ａ，１２ｂ−ドデカヒドロ−４Ｈ−ナフト［２’，１’：４，５］インデノ［１，２−ｄ］［１，３］ジオキソール−４−オン（実施例１，工程６）（５ｇ，８．２６ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合液を室温で５時間攪拌後、ＬＣＭＳにより反応が完了したことを確認した。更にバイアル６本を上記のように準備した。全７本の反応混合液を合わせた。反応液を逆相カラムにより精製し、標記化合物（２４ｇ，収率２４．６２％）を白色固体として得た。逆相カラム法：機器：島津ＬＣ−８Ａ分取ＨＰＬＣ；カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ Ｃ１８ ２００＊４０ｍｍ＊１０μｍ；移動相：Ａ：Ｈ_２Ｏ（０．０５％ＴＦＡ）；Ｂ：ＭｅＣＮ；濃度勾配：３０分間で３０％→１００％Ｂ；流速：６０ｍＬ／分；波長：２２０及び２５４ｎｍ。

ＬＣＭＳ（方法ａ，表４）Ｒ_ｔ＝１．２９分；ｍ／ｚ１０９５．６（Ｍ＋Ｈ−１８）^＋。

工程２：（（Ｓ）−５−（２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）アセトアミド）−６−（（３−（４−（（２Ｓ，６ａＳ，６ｂＲ，７Ｓ，８ａＳ，８ｂＳ，１０Ｒ，１１ａＲ，１２ａＳ，１２ｂＳ）−８ｂ−（２−（（ジ−ｔｅｒｔ−ブトキシホスホリル）オキシ）アセチル）−２，６ｂ−ジフルオロ−７−ヒドロキシ−６ａ，８ａ−ジメチル−４−オキソ−２，４，６ａ，６ｂ，７，８，８ａ，８ｂ，１１ａ，１２，１２ａ，１２ｂ−ドデカヒドロ−１Ｈ−ナフト［２’，１’：４，５］インデノ［１，２−ｄ］［１，３］ジオキソール−１０−イル）ベンジル）フェニル）アミノ）−６−オキソヘキシル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルの合成

（（Ｓ）−５−（２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）アセトアミド）−６−（（３−（４−（（２Ｓ，６ａＳ，６ｂＲ，７Ｓ，８ａＳ，８ｂＳ，１０Ｒ，１１ａＲ，１２ａＳ，１２ｂＳ）−２，６ｂ−ジフルオロ−７−ヒドロキシ−８ｂ−（２−ヒドロキシアセチル）−６ａ，８ａ−ジメチル−４−オキソ−２，４，６ａ，６ｂ，７，８，８ａ，８ｂ，１１ａ，１２，１２ａ，１２ｂ−ドデカヒドロ−１Ｈ−ナフト［２’，１’：４，５］インデノ［１，２−ｄ］［１，３］ジオキソール−１０−イル）ベンジル）フェニル）アミノ）−６−オキソヘキシル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル（実施例５，工程１）（３ｇ，２．６９ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（３０ｍＬ）溶液に１Ｈ−テトラゾール（１．８８８ｇ，２６．９ｍｍｏｌ）とジ−ｔｅｒｔ−ブチルジエチルホスホロアミダイト（８．０６ｇ，３２．３ｍｍｏｌ）を加え、反応液を室温で３．５時間攪拌した。過酸化水素（２２４ｍｇ，１．９７ｍｍｏｌ）を反応液に加え、０．５時間攪拌後、ＬＣＭＳにより反応が完了したことを確認した。更にバイアル６本を上記のように準備した。全７本の反応混合液を合わせた。反応液を逆相カラムにより精製し、標記化合物（１０ｇ，純度７８％，収率３７．１％）を白色固体として得た。逆相カラム法：機器：島津ＬＣ−８Ａ分取ＨＰＬＣ；カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ Ｃ１８ ２００＊４０ｍｍ＊１０μｍ；移動相：Ａ：Ｈ_２Ｏ；Ｂ：ＭｅＣＮ；濃度勾配：３０分間で５０％→１００％Ｂ；流速：６０ｍＬ／分；波長：２２０及び２５４ｎｍ。

ＬＣＭＳ（方法ａ，表４）Ｒ_ｔ＝１．４２分；ｍ／ｚ１３０５．７（Ｍ＋Ｈ）^＋。

工程３：（（Ｓ）−５−（２−アミノアセトアミド）−６−（（３−（４−（（２Ｓ，６ａＳ，６ｂＲ，７Ｓ，８ａＳ，８ｂＳ，１０Ｒ，１１ａＲ，１２ａＳ，１２ｂＳ）−８ｂ−（２−（（ジ−ｔｅｒｔ−ブトキシホスホリル）オキシ）アセチル）−２，６ｂ−ジフルオロ−７−ヒドロキシ−６ａ，８ａ−ジメチル−４−オキソ−２，４，６ａ，６ｂ，７，８，８ａ，８ｂ，１１ａ，１２，１２ａ，１２ｂ−ドデカヒドロ−１Ｈ−ナフト［２’，１’：４，５］インデノ［１，２−ｄ］［１，３］ジオキソール−１０−イル）ベンジル）フェニル）アミノ）−６−オキソヘキシル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルの合成

（（Ｓ）−５−（２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）アセトアミド）−６−（（３−（４−（（２Ｓ，６ａＳ，６ｂＲ，７Ｓ，８ａＳ，８ｂＳ，１０Ｒ，１１ａＲ，１２ａＳ，１２ｂＳ）−８ｂ−（２−（（ジ−ｔｅｒｔ−ブトキシホスホリル）オキシ）アセチル）−２，６ｂ−ジフルオロ−７−ヒドロキシ−６ａ，８ａ−ジメチル−４−オキソ−２，４，６ａ，６ｂ，７，８，８ａ，８ｂ，１１ａ，１２，１２ａ，１２ｂ−ドデカヒドロ−１Ｈ−ナフト［２’，１’：４，５］インデノ［１，２−ｄ］［１，３］ジオキソール−１０−イル）ベンジル）フェニル）アミノ）−６−オキソヘキシル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル（実施例５，工程２）（２．５ｇ，１．９６９ｍｍｏｌ）のＭｅＣＮ（１０ｍＬ）溶液にピペリジン（２ｍＬ，１．９６９ｍｍｏｌ）を加え、反応液を室温で１時間攪拌後、ＬＣＭＳにより反応が完了したことを確認した。更にバイアル３本を上記のように準備した。全４本の反応混合液を合わせた。反応液を濃縮して粗生成物を得、ＰＥ（３０ｍＬ）中にて２時間攪拌した。得られた固形物を濾取し、減圧乾燥し、標記化合物（７ｇ，純度８３％，収率７０．４％）を黄色固体として得た。

ＬＣＭＳ（方法ａ，表４）Ｒ_ｔ＝１．１７分；ｍ／ｚ１０８３．５（Ｍ＋Ｈ）^＋。

工程４：（（Ｓ）−５−（２−（２−ブロモアセトアミド）アセトアミド）−６−（（３−（４−（（２Ｓ，６ａＳ，６ｂＲ，７Ｓ，８ａＳ，８ｂＳ，１０Ｒ，１１ａＲ，１２ａＳ，１２ｂＳ）−８ｂ−（２−（（ジ−ｔｅｒｔ−ブトキシホスホリル）オキシ）アセチル）−２，６ｂ−ジフルオロ−７−ヒドロキシ−６ａ，８ａ−ジメチル−４−オキソ−２，４，６ａ，６ｂ，７，８，８ａ，８ｂ，１１ａ，１２，１２ａ，１２ｂ−ドデカヒドロ−１Ｈ−ナフト［２’，１’：４，５］インデノ［１，２−ｄ］［１，３］ジオキソール−１０−イル）ベンジル）フェニル）アミノ）−６−オキソヘキシル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルの合成

２−ブロモ酢酸（０．９２９ｇ，６．６８ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（３５ｍＬ）溶液に２−エトキシ−１−エトキシカルボニル−１，２−ジヒドロキノリン（１．６５３ｇ，６．６８ｍｍｏｌ）を加え、得られた混合液を室温で１時間攪拌した。実施例５，工程３の生成物（３．５ｇ，３．３４ｍｍｏｌ）を加え、得られた混合液を室温で２時間攪拌した。ＬＣＭＳにより反応が完了したことを確認した。反応液をＤＣＭ（１００ｍＬ）で希釈し、ＨＢｒ水溶液（１Ｍ，２×８０ｍＬ）、ＮａＨＣＯ_３水溶液（６０ｍＬ）及びブライン（６０ｍＬ）で洗浄した。有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥し、濾過し、減圧濃縮し、標記化合物（２ｇ，収率５１．２％）を黄色油状物として得た。

ＬＣＭＳ（方法ａ，表４）Ｒ_ｔ＝１．３２分；ｍ／ｚ１２０５．５（Ｍ＋Ｈ）^＋。

工程５：リン酸二水素２−（（２Ｓ，６ａＳ，６ｂＲ，７Ｓ，８ａＳ，８ｂＳ，１０Ｒ，１１ａＲ，１２ａＳ，１２ｂＳ）−１０−（４−（３−（（Ｓ）−６−アミノ−２−（２−（２−ブロモアセトアミド）アセトアミド）ヘキサンアミド）ベンジル）フェニル）−２，６ｂ−ジフルオロ−７−ヒドロキシ−６ａ，８ａ−ジメチル−４−オキソ−１，２，４，６ａ，６ｂ，７，８，８ａ，１１ａ，１２，１２ａ，１２ｂ−ドデカヒドロ−８ｂＨ−ナフト［２’，１’：４，５］インデノ［１，２−ｄ］［１，３］ジオキソール−８ｂ−イル）−２−オキソエチルの合成

（（Ｓ）−５−（２−アミノアセトアミド）−６−（（３−（４−（（２Ｓ，６ａＳ，６ｂＲ，７Ｓ，８ａＳ，８ｂＳ，１０Ｒ，１１ａＲ，１２ａＳ，１２ｂＳ）−８ｂ−（２−（（ジ−ｔｅｒｔ−ブトキシホスホリル）オキシ）アセチル）−２，６ｂ−ジフルオロ−７−ヒドロキシ−６ａ，８ａ−ジメチル−４−オキソ−２，４，６ａ，６ｂ，７，８，８ａ，８ｂ，１１ａ，１２，１２ａ，１２ｂ−ドデカヒドロ−１Ｈ−ナフト［２’，１’：４，５］インデノ［１，２−ｄ］［１，３］ジオキソール−１０−イル）ベンジル）フェニル）アミノ）−６−オキソヘキシル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル（実施例５，工程３）（２ｇ，１．６６１ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（１０ｍＬ）溶液にＴＦＡ（５ｍＬ，６４．９ｍｍｏｌ）を加え、反応液を室温で４０分間攪拌後、ＬＣＭＳにより反応が完了したことを確認した。溶媒を減圧除去し、粗生成物を分取ＨＰＬＣにより精製した。移動相を直接凍結乾燥し、標記化合物（５５０ｍｇ，純度９６．９％，収率３２．３％）をオフホワイト固体として得た。分取ＨＰＬＣ法：機器：島津ＬＣ−８Ａ分取ＨＰＬＣ；カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ Ｃ１８ ２００＊４０ｍｍ＊１０μｍ；移動相：Ａ：Ｈ_２Ｏ（０．０９％ＴＦＡ）；Ｂ：ＭｅＣＮ；濃度勾配：２０分間で３０％→４０％Ｂ；流速：６０ｍＬ／分；波長：２２０及び２５４ｎｍ。

^１Ｈ ＮＭＲ：（ＤＭＳＯ−ｄ６，４００ＭＨｚ）δｐｐｍ ０．９０（ｓ，３Ｈ）１．１９−１．４１（ｍ，２Ｈ）１．４３−１．６２（ｍ，７Ｈ）１．６４−１．７７（ｍ，３Ｈ）１．８４（ｂｒ ｄ，Ｊ＝１４．５５Ｈｚ，１Ｈ）１．９５−２．０７（ｍ，１Ｈ）２．１８−２．３６（ｍ，３Ｈ）２．６５−２．７８（ｍ，３Ｈ）３．７１−３．８６（ｍ，３Ｈ）３．８９（ｓ，２Ｈ）３．９３（ｓ，２Ｈ）４．２０（ｂｒ ｄ，Ｊ＝９．４８Ｈｚ，１Ｈ）４．３３−４．４１（ｍ，１Ｈ）４．５９（ｂｒ ｄｄ，Ｊ＝１８．４１，８．０５Ｈｚ，１Ｈ）４．８１（ｂｒ ｄｄ，Ｊ＝１８．５２，８．６０Ｈｚ，１Ｈ）４．９４（ｄ，Ｊ＝４．６３Ｈｚ，１Ｈ）５．５０（ｓ，１Ｈ）５．５４−５．７６（ｍ，１Ｈ）６．１３（ｓ，１Ｈ）６．２９（ｄｄ，Ｊ＝１０．１４，１．３２Ｈｚ，１Ｈ）６．９５（ｄ，Ｊ＝７．７２Ｈｚ，１Ｈ）７．１５−７．２８（ｍ，４Ｈ）７．３０−７．４１（ｍ，３Ｈ）７．５１（ｂｒ ｄ，Ｊ＝７．９４Ｈｚ，１Ｈ）７．７２（ｂｒ ｓ，３Ｈ）８．２１（ｂｒ ｄ，Ｊ＝７．７２Ｈｚ，１Ｈ）８．５４（ｔ，Ｊ＝５．６２Ｈｚ，１Ｈ）９．９３（ｂｒ ｄ，Ｊ＝２．６５Ｈｚ，１Ｈ）。ＬＣＭＳ（方法ａ，表４）Ｒ_ｔ＝２．３１分。

［実施例６］（Ｓ）−２−（（２−（２−ブロモアセトアミド）エチル）アミノ）−Ｎ−（（Ｓ）−１−（（３−（４−（（６ａＲ，６ｂＳ，７Ｓ，８ａＳ，８ｂＳ，１０Ｒ，１１ａＲ，１２ａＳ，１２ｂＳ）−７−ヒドロキシ−８ｂ−（２−ヒドロキシアセチル）−６ａ，８ａ−ジメチル−４−オキソ−２，４，６ａ，６ｂ，７，８，８ａ，８ｂ，１１ａ，１２，１２ａ，１２ｂ−ドデカヒドロ−１Ｈ−ナフト［２’，１’：４，５］インデノ［１，２−ｄ］［１，３］ジオキソール−１０−イル）ベンジル）フェニル）アミノ）−１−オキソプロパン−２−イル）プロパンアミドの合成
実施例６の生成物はＮ−（２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）エチル）−Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニン（下記工程Ｓ１及びＳ２の生成物）を実施例２のアミノ生成物とカップリングした後に工程Ｓ４〜Ｓ６：（１）Ｆｍｏｃ脱保護、（２）２−ブロモ酢酸とのカップリング、及び（３）Ｂｏｃ脱保護を行うことにより合成することができる。Ｆｍｏｃ＝フルオレニルメチルオキシカルボニル；Ｂｏｃ＝ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル。

一般的なシステイン連結プロトコール
ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ６〜７．４）で目的とする抗体の約５〜２０ｍｇ／ｍＬ溶液を調製した。ＴＣＥＰ等の選択した還元剤をＨ_２Ｏ、ＤＭＳＯ、ＤＭＡ又はＤＭＦ等の溶媒で希釈又は溶解し、濃度範囲１〜２５ｍＭの溶液とした。還元剤約２〜３．５当量を加えて短時間混合し、０〜４℃で一晩インキュベートすることにより抗体（抗ｈＴＮＦ ｈＩｇＧ１（Ｄ２Ｅ７）又は抗ｍＴＮＦ ｍＩｇＧ２ａ（８Ｃ１１；ＭｃＲａｅ ＢＬ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｒｏｈｎｓ Ｃｏｌｉｔｉｓ １０（１）：６９−７６（２０１６））を部分的に還元した。次にトリス緩衝液（ｐＨ８〜８．５）（２０〜５０ｍＭ）を加えた後、リンカー−薬物のＤＭＳＯ又はＤＭＡ溶液（合計１５％未満）を加え、混合液を室温で２〜３時間インキュベートした。次に、過剰のリンカー−薬物と有機溶媒を精製により除去した。その後、精製したＡＤＣ試料をＳＥＣ、ＨＩＣ及び還元条件下の質量分析法により分析した。

ＡＤＣ分析手順
アニオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＣ）又は疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）によりＡＤＣをプロファイリングし、ＡＤＣの連結度と純度を求めた。

ＡＥＣ。４×２５０ｍｍ Ｐｒｏｐａｃ（ＴＭ）ＷＡＸ−１０カラム（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，カタログ番号０５４９９９）を取付けたＵｌｔｉｍａｔｅ ３０００デュアルＬＣシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にＡＤＣ約２０μｇをロードした。２０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．７）を緩衝液Ａとし、２０ｍＭ ＭＥＳ，５００ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ６．７）を緩衝液Ｂとし、カラムを１００％緩衝液Ａで平衡化し、流速１．０ｍＬ／分で１８分間かけて１００％緩衝液Ａから１００％緩衝液Ｂに変化させる直線濃度勾配を使用して溶出させた。

ＨＩＣ。４．６×３５ｍｍブチル−ＮＰＲカラム（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，カタログ番号１４９４７）を取付けたＵｌｔｉｍａｔｅ ３０００デュアルＬＣシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にＡＤＣ約２０μｇをロードした。２５ｍＭリン酸ナトリウム、１．５Ｍ硫酸アンモニウム（ｐＨ７．０）を緩衝液Ａとし、２５ｍＭリン酸ナトリウム、２５％イソプロパノール（ｐＨ７．０）を緩衝液Ｂとし、カラムを１００％緩衝液Ａで平衡化し、流速０．８ｍＬ／分で１２分間かけて１００％緩衝液Ａから１００％緩衝液Ｂに変化させる直線濃度勾配を使用して溶出させた。

ＳＥＣ。７．８×３００ｍｍ ＴＳＫ−ｇｅｌ ３０００ＳＷ_ＸＬカラム（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，カタログ番号０８５４１）を取付けたＵｌｔｉｍａｔｅ ３０００デュアルＬＣシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してサイズ排除ＳＥＣによりＡＤＣのサイズ分布をプロファイリングした。ＡＤＣ約２０μｇをカラムにロードし、１００ｍＭ硫酸ナトリウム、１００ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）のアイソクラティック濃度勾配を使用して流速１．０ｍＬ／分で１７分間かけて溶出させた。

ＭＳ。還元した試料（１０μＬ）を温度調節機能付き（５℃）ＣＴＣオートサンプラーによりＡｇｉｌｅｎｔ ６５５０ Ｑ−ＴＯＦ ＬＣ／ＭＳシステムに注入した。Ｗａｔｅｒｓ Ｃ−４，３．５μｍ，３００Å，内径２．１×５０ｍｍ ＨＰＬＣカラムで試料溶出を行った。移動相はＡ：０．１％ギ酸水溶液、Ｂ：０．１％ギ酸ＭｅＣＮ溶液とし、流速は０．４５ｍＬ／分とし、カラムコンパートメントを４０℃に維持した。

ＨＰＬＣ濃度勾配は表５に示す通りである。

［実施例７］アダリムマブをグルココルチコステロイドと連結した抗体薬物複合体の作製
アダリムマブのジスルフィド還元後にブロモアセトアミドグリシン−グルタミン酸ステロイド（実施例４）でアルキル化（連結）する２段階化学反応プロセスにより、集合体ＤＡＲが４．０であるアダリムマブとＢｒＡｃ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−ステロイド−ＰＯ_４のＡＤＣを作製した。

濃度２０ｍｇ／ｍＬのアダリムマブ１００ｍｇをジフェニルホスフィノ酢酸（２．９〜３．０当量）で０℃にて一晩還元した。部分的に還元したアダリムマブを次にＤＭＳＯ中にて実施例４（１０当量）と室温で３時間連結させた。複数のＮＡＰ−２５脱塩カラムを使用して連結混合物を先ず２０ｍＭトリス緩衝液，５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．８）に緩衝液交換した。脱塩したＡＤＣ溶液をＡＥＣにより精製し、ＡＤＣのＤＡＲ４成分を得た。ＡＥＣクロマトグラフィー法：機器：Ａｋｔａ ｐｕｒｅ；カラム：Ｈｉｔｒａｐ Ｑ ＨＰ ５ｍＬ×２本；移動相：Ａ：２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．８）；Ｂ：２０ｍＭトリス緩衝液，１Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ７．８）；濃度勾配：６０分間で０％→２５％Ｂ；流速：５ｍＬ／分；波長：２８０及び２１４ｎｍ。

得られたＡＤＣ製剤のクロマトグラフィー分離を図１に示すが、同図によると、ＡＤＣは還元された鎖間ジスルフィド結合数に応じて抗体に薬物リンカー分子２個が結合したもの（「ＤＡＲ２」ピーク）と、薬物リンカー分子４個が結合したもの（「ＤＡＲ４」ピーク）の異種混合物である。図１で使用したＡＥＣ条件は以下の通りであった。カラムはＰｒｏｐａｃ（ＴＭ）ＷＡＸ−１０，４×２５０ｍｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，カタログ番号０５４９９９）とし、カラム温度は３７℃とした。波長は２８０ｎｍとし、ランタイムは１８分とし、注入量は２０μｇとし、流速は１．０ｍＬ／分とした。移動相Ａ：２０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．７）、移動相Ｂ：２０ｍＭ ＭＥＳ，５００ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ６．７）。濃度勾配プロファイルは以下の通りである（表６）。

図２は精製したＡＤＣのデコンボリューション質量スペクトルを示す。このＡＤＣは抗体１分子に薬物リンカー分子４個を連結したものである。左側のピークは分子量２４２８４．７４Ｄａであり、薬物リンカー１個が軽鎖１本に結合した結果である。右側のピークは分子量５１５１３．９６Ｄａであり、薬物リンカー１個が重鎖１本に結合した結果である。上記手順に従って表７及び８のＡＤＣを作製した。

ヒト及びマウス膜貫通型ＴＮＦαＧＲＥレポーター細胞株の作製
親細胞株を作製するために、完全増殖培地（ＲＰＭＩ，１０％ＦＢＳ，１％Ｌ−グルタミン，１％ピルビン酸Ｎａ及び１％ＭＥＭ ＮＥＡＡ）２ｍＬを加えた６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ：３５１６）にＫ５６２細胞をウェル当たり５００，０００個の割合で３７℃、５％ＣＯ_２下に２４時間播種した。翌日、ｐＧＬ４．３６［Ｌｕｃ２Ｐ／ＭＭＴＶ／Ｈｙｇｒｏ］（Ｐｒｏｍｅｇａ：Ｅ３１６）１．５μｇと、ｐＧｌ４．７５［ｈＲＬｕｃ／ＣＭＶ］（Ｐｒｏｍｅｇａ：Ｅ６３９Ａ）１．５μｇと、ＰＬＵＳ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ：１０９６４−０２１）３μＬをＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ：３１９８５−０７０）２４４μＬで希釈し、室温で１５分間インキュベートした。ｐＧＬ４．３６［ｌｕｃ２Ｐ／ＭＭＴＶ／Ｈｙｇｒｏ］ベクターはグルココルチコイド受容体やアンドロゲン受容体等の数種の核内受容体の活性化に応答してルシフェラーゼレポーター遺伝子ｌｕｃ２Ｐの転写を誘導するＭＭＴＶ ＬＴＲ（Ｍａｍｍａｒｙ Ｔｕｍｏｒ Ｖｉｒｕｓ Ｌｏｎｇ Ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｒｅｐｅａｔ：マウス乳がんウイルス末端反復配列）を含む。ｐＧＬ４．７５［ｈＲｌｕｃ／ＣＭＶ］ベクターはルシフェラーゼレポーター遺伝子ｈＲｌｕｃ（Ｒｅｎｉｌｌａ ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）をコードし、発現性が高く且つ異常転写が少なくなるように設計されている。

インキュベーション後、希釈ＤＮＡ溶液を１：１リポフェクタミンＬＴＸ溶液（Ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ：９４７５６）（１３．２μＬ＋Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ２５６．８μＬ）と共にプレインキュベートし、室温で２５分間インキュベートし、ＤＮＡ−リポフェクタミンＬＴＸ複合体を形成した。インキュベーション後、細胞を入れたウェルにＤＮＡ−リポフェクタミン複合体５００μＬを直接加えた。Ｋ５６２細胞に３７℃、５％ＣＯ_２下で２４時間トランスフェクトした。インキュベーション後、細胞をＰＢＳ３ｍＬで洗浄し、ハイグロマイシンＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ：１０６８７−０１０）１２５μｇ／ｍＬを添加した完全増殖培地で２週間選択した。「Ｋ５６２ｐＧＬ４．３６［Ｌｕｃ２Ｐ／ＭＭＴＶ／Ｈｙｇｒｏ］＿ｐＧＬ４．７５［ｈＲＬｕｃ／ＣＭＶ］」細胞が生成された。

マウス膜貫通型ＴＮＦαＧＲＥレポーター細胞株を作製するために、完全増殖培地（ＲＰＭＩ，１０％ＦＢＳ，１％Ｌ−グルタミン，１％ピルビン酸Ｎａ及び１％ＭＥＭ ＮＥＡＡ）２ｍＬを加えた６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ：３５１６）に親細胞であるＫ５６２ｐＧＬ４．３６［Ｌｕｃ２Ｐ／ＭＭＴＶ／Ｈｙｇｒｏ］＿ｐＧＬ４．７５［ｈＲＬｕｃ／ＣＭＶ］をウェル当たり５００，０００個の割合で３７℃、５％ＣＯ_２下に２４時間播種した。翌日、タグなしマウスＴＮＦをコードするｍＦＬ＿ＴＮＦａＤＮＡ（Ｏｒｉｇｅｎｅ：ＭＣ２０８０４８）３μｇと、ＰＬＵＳ試薬（Ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ：１０９６４−０２１）３μＬをＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ：３１９８５−０７０）２４４μＬで希釈し、室温で１５分間インキュベートした。インキュベーション後、希釈ＤＮＡ溶液を１：１リポフェクタミンＬＴＸ溶液（Ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ：９４７５６）（１３．２μＬ＋Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ２５６．８μＬ）と共にプレインキュベートし、室温で２５分間インキュベートし、ＤＮＡ−リポフェクタミンＬＴＸ複合体を形成した。インキュベーション後、細胞を入れたウェルにＤＮＡ−リポフェクタミン複合体５００μＬを直接加えた。親細胞であるＫ５６２ｐＧＬ４．３６［Ｌｕｃ２Ｐ／ＭＭＴＶ／Ｈｙｇｒｏ］＿ｐＧＬ４．７５［ｈＲＬｕｃ／ＣＭＶ］細胞に３７℃、５％ＣＯ_２下で２４時間トランスフェクトした。インキュベーション後、細胞をＰＢＳ３ｍＬで洗浄し、ハイグロマイシンＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ：１０６８７−０１０）１２５μｇ／ｍＬとＧ４１８（Ｇｉｂｃｏ：１０１３１−０２７）２５０μｇ／ｍＬを添加した完全増殖培地で２週間選択した。「Ｋ５６２マウスＦＬ−ＴＮＦａＧＲＥ（ｐＧＬ４．３６［ｌｕｃ２Ｐ／ＭＭＴＶ／Ｈｙｇｒｏ］）」細胞が生成された。

ヒト膜貫通型ＴＮＦαＧＲＥレポーター細胞株を作製するために、親細胞であるＫ５６２ｐＧＬ４．３６［Ｌｕｃ２Ｐ／ＭＭＴＶ／Ｈｙｇｒｏ］＿ｐＧＬ４．７５［ｈＲＬｕｃ／ＣＭＶ］にプラスミドとしてｈＴＮＦΔ１−１２Ｃ−Ｍｙｃ ｐｃＤＮＡ３．１（−）プラスミドコンストラクトをトランスフェクトした。このプラスミドはｔａｃｅ耐性膜貫通型ＴＮＦ（即ち配列番号１からアミノ酸７７〜８８を欠失したもの）をコードするｐｃＤＮＡ３．１（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒカタログ番号Ｖ７９０２０）である。（ｔａｃｅ耐性膜貫通型ＴＮＦについてはＰｅｒｅｚ Ｃ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ ６３（２）：２５１−８（１９９０）参照。）。その後、これらの細胞株を以下の実施例に記載するＴＮＦαレポーターアッセイで使用した。

ＧＲＥ膜貫通型ＴＮＦαレポーターアッセイにおける抗ＴＮＦαイムノコンジュゲートの活性
Ｋ５６２親ＧＲＥ（ｐＧＬ４．３６［ｌｕｃ２Ｐ／ＭＭＴＶ／Ｈｙｇｒｏ］）細胞と、Ｋ５６２ｍＦＬ−ＴＮＦ−ａ又はｈＴＮＦΔ１−１２ＧＲＥ（ｐＧＬ４．３６［ｌｕｃ２Ｐ／ＭＭＴＶ／Ｈｙｇｒｏ］）細胞を組織培養処理済み９６ウェル白プレート（Ｃｏｓｔａｒ：３９１７）でアッセイ培地（ＲＰＭＩ，１％ＣＳＦＢＳ，１％Ｌ−グルタミン，１％ピルビン酸Ｎａ及び１％ＭＥＡＡ）５０μＬにウェル当たり５０，０００個の割合で播種した。細胞をアッセイ培地で３倍ずつ段階希釈したマウス若しくはヒト抗ＴＮＦａ抗体薬物複合体、ステロイド化合物又は培地単独２５μＬで処理し、３７℃、５％ＣＯ_２下に４８時間インキュベートした。４８時間インキュベーション後に細胞をＤｕａｌ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ−Ｅ２９２０）７５μＬで１０分間処理し、Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して発光を測定した。４パラメータ曲線当てはめを使用してデータを解析し、ＥＣ_５０値を推定した。１００ｎＭデキサメタゾンを基準にして最大活性化率％を正規化した。マウスＴＮＦα細胞株を使用した結果を下表９に示し、ヒトＴＮＦα細胞株を使用した結果を下表１０に示す。下表９中、ＡＤＣにおける抗体は抗マウスＴＮＦα抗体８Ｃ１１である。下表１０中、ＡＤＣにおける抗体は抗ヒトＴＮＦα抗体アダリムマブである。モノマー百分率（％）は上述したようにＳＥＣにより求めた（ＡＤＣ分析手順参照）。

リポ多糖刺激によるヒトＰＢＭＣサイトカイン放出アッセイにおける抗ｈＴＮＦαイムノコンジュゲートの活性
ヒト初代末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（カタログ番号２１４−００−１０）から購入し、ＰＢＳ５０ｍＬで洗浄し、５％ＤＭＳＯを添加したＦＢＳに再懸濁し、分取し、使用時まで液体窒素で凍結保存した。ＰＢＭＣを解凍し、２％ＦＢＳと１％ペニシリン−ストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ培地に再懸濁し、細胞アッセイプレート（Ｃｏｓｔａｒ ＃３７９９）に播種した。次に種々の濃度の抗ＴＮＦ ＡＤＣを加えて３７℃、５％ＣＯ_２下に４時間インキュベートした。その後、ＬＰＳ１００ｎｇ／ｍＬで細胞を一晩刺激した。翌日、プレートを１０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清培地１００μＬを別の９６ウェルプレートに直接移し、ＩＬ−６（ＭＳＤ，＃Ｋ１５１ＡＫＢ）とＩＬ−１β（ＭＳＤ，＃Ｋ１５１ＡＧＢ）の濃度を測定した。非線形回帰を使用して用量反応データをシグモイド曲線に当てはめ、ＧｒａｐｈＰａｄ ５．０（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．）によりＩＣ_５０値を計算した。表１１に示す結果から明らかなように、抗ＴＮＦ ＡＤＣは活性化させた初代免疫細胞からの炎症性サイトカインＩＬ−６及びＩＬ−１βの放出を抑制する強力な活性をもつ。

接触過敏モデルにおける抗ｍＴＮＦαイムノコンジュゲートの活性
感作物質（フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ））の塗布により（Ｔ細胞により誘導される）遅延型過敏（ＤＴＨ）反応を使用して急性皮膚炎症を誘発する急性接触過敏モデルで抗ＴＮＦαステロイドＡＤＣを評価した。耳介腫脹抑制能により抗ＴＮＦａステロイドＡＤＣの効力を測定した。ステロイドバイオマーカーであるコルチコステロンと１型プロコラーゲンＮ末端プロペプチド（Ｐ１ＮＰ）も読み取りデータに加え、夫々視床下部−下垂体−副腎（ＨＰＡ）軸と骨代謝に及ぼす抗ＴＮＦａステロイドＡＤＣ投与の推定影響を評価した。

耳介腫脹
０日目にマウスに全身麻酔し、腹部を剃毛した。マイクロピペッターを使用し、ＦＩＴＣ溶液（１．５％１：１アセトン：ＤＢＰ溶液）４００μＬを腹部に皮膚塗布することによりマウスを感作した。６日後に、ＦＩＴＣによる耳介チャレンジの１時間前にマウスに溶媒又は治療剤を投与した。耳介チャレンジでは、マウスに全身麻酔し、ＦＩＴＣ２０μＬを右耳介に塗布してチャレンジした。チャレンジから２４時間後にマウスに全身麻酔し、その耳介厚をキャリパーで測定した。チャレンジした耳介とチャレンジしていない耳介の差を計算した。耳介チャレンジから７２時間後に、マウスにＡＣＴＨを１ｍｐｋの用量でＩＰ注射し、ＡＣＴＨの３０分後に放血致死させた。血漿を採取し、Ｐ１ＮＰ、コルチコステロン、遊離ステロイド及び大分子の濃度を測定した。

遊離ステロイドと内因性コルチコステロンの放出量の定量
最終濃度が８種類の異なる濃度値で０．０３ｎＭ〜０．１μＭとなるようにマウス血漿でステロイドの較正曲線を作成した。ＰＢＳ緩衝液で調液した７０ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン溶液で最終コルチコステロン濃度が０．３ｎＭ〜１μＭとなるようにコルチコステロン較正曲線を作成した。０．１％ギ酸を添加したＭｅＣＮ溶液１６０μＬを試験血漿試料又は較正標準４０μＬに加えた。上清を蒸留水で希釈し、最終試料溶液３０μＬをＬＣ／ＭＳ分析用に注入した。

正イオンモードで動作するエレクトロスプレーイオン源とインターフェースで接続した島津ＡＣ２０ ＨＰＬＣシステムにＡＢ Ｓｃｉｅｘ ５５００トリプル四重極質量分析計を接続し、遊離ステロイドとコルチコステロンの放出量の定量を行った。Ｗａｔｅｒｓ ＸＢｒｉｄｇｅ ＢＥＨ Ｃ１８，２．１×３０ｍｍ，３．５μｍカラムをクロマトグラフィー分離に使用した。移動相Ａは０．１％ギ酸Ｍｉｌｌｉ Ｑ ＨＰＬＣ用水溶液とし、移動相Ｂは０．１％ギ酸ＭｅＣＮ溶液とした。２％移動相Ｂから９８％移動相Ｂに変化させる直線濃度勾配を０．６〜１．２分間適用した。合計ランタイムは流速０．８ｍＬ／分で２．６分とした。質量分析計はイオン源温度７００℃にて正イオンＭＲＭモードで運転させた。

血漿中Ｐ１ＮＰの定量
タンパク質トリプシン消化に基づくＬＣＭＳプラットフォームで血漿中Ｐ１ＮＰの定量を行った。血漿試料を部分的に沈降させ、ＭｅＣＮ／０．１Ｍ重炭酸アンモニウム／ＤＴＴ混合液を加えることにより完全に還元させた。上清を採取し、ヨード酢酸を加えることによりアルキル化した。アルキル化したタンパク質をトリプシンにより消化し、得られたトリプシンペプチドをＬＣＭＳにより分析した。ウマ血清（非干渉性代替マトリックス）にスパイクした合成トリプシンペプチドを使用することにより較正曲線を作成した。ＭｅＣＮ／ＤＴＴタンパク質沈降混合液に加える内部標準として、安定同位体で標識したフランキングペプチド（トリプシンペプチドの両末端の３〜６アミノ酸延長部分）を使用し、消化効率とＬＣＭＳ注入量を正規化した。

Ｃｏｌｕｍｎｅｘ Ｃｈｒｏｍｅｎｔａ ＢＢ−Ｃ１８，２．１×１５０ｍｍ，５μｍカラムをクロマトグラフィー分離に使用した。移動相Ａは０．１％ギ酸Ｍｉｌｌｉ Ｑ ＨＰＬＣ用水溶液とし、移動相Ｂは０．１％ギ酸ＭｅＣＮ溶液とした。２％移動相Ｂから６５％移動相Ｂに変化させる直線濃度勾配を０．６〜３分間適用した。合計ランタイムは流速０．４５ｍＬ／分で８分とした。ＡＢ Ｓｃｉｅｘ ４０００Ｑトラップ型質量分析計をイオン源温度７００℃にて正イオンＭＲＭモードで使用し、Ｐ１ＮＰペプチドを定量した。

結果
結果を下表１２に示す。

コラーゲン誘発性関節炎における抗ｍＴＮＦαイムノコンジュゲートの活性
抗ｍＴＮＦａステロイドＡＤＣ（ＡＤＣ１）が疾患に作用する能力をコラーゲン誘発性関節炎（ＣＩＡ）の関節炎モデルで評価した。

これらの実験では、雄性ＤＢＡ／１ＪマウスをＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）から入手した。マウスを６〜８週齢で使用した。温度と湿度を一定に保ちながら全動物を１２時間明暗サイクル下で飼育し、げっ歯類飼料チャウ（Ｌａｂ Ｄｉｅｔ ５０１０ ＰｈａｒｍａＳｅｒｖ，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ）と水を自由に摂取させた。アッヴィ社（ＡｂｂＶｉｅ）はＡＡＡＬＡＣ（Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ａｎｄ Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ：実験動物ケア評価認証協会）から認証を取得しており、全手順は動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ：ＩＡＣＵＣ）により承認され、主治獣医師の監督下に行われた。体重と健康状態をチェックし、＞２０％体重減少を示す場合には動物を安楽死させた。

０．１Ｎ酢酸に溶解したＩＩ型ウシコラーゲン（ＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）１００μｇと加熱死菌結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）Ｈ３７Ｒａ（完全フロイントアジュバント，Ｄｉｆｃｏ，Ｌａｕｒｅｎｃｅ，ＫＳ）２００μｇを含有するエマルジョン１００μＬを雄性ＤＢＡ／Ｊマウスの尾基部に皮内（ｉ．ｄ．）投与により免疫した。コラーゲン免疫から２１日後にチモサンＡ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）１ｍｇをＰＢＳで調液してマウスに腹腔内投与することによりブーストした。ブースト後、マウスを関節炎について週３〜５回チェックした。Ｄｙｅｒスプリングキャリパー（Ｄｙｅｒ ３１０−１１５）を使用して後肢の足腫脹を評価した。

最初に疾患の臨床徴候が現れた２４〜２８日目にマウスをリストに登録し、関節炎重症度が同等のグループに分けた。登録時に早期治療処置を開始した。

抗ｍＴＮＦｍＡｂ（高用量）又は抗ｍＴＮＦステロイドＡＤＣ（高用量及び低用量ｍｐｋ）を０．９％生理食塩水で調液し、動物に１回腹腔内（ｉ．ｐ．）投与した。投与から２４時間後と７２時間後にテールニック法により抗体暴露用に採血した。終末時点で病理組織試験用に足を採取した。終末時点で心臓穿刺により全血球計数（Ｓｙｓｍｅｘ ＸＴ−２０００ｉＶ）用に採血した。ＡＮＯＶＡにより統計的有意差を判定した。

結果を図３に示すが、抗ＴＮＦａステロイドＡＤＣを単回投与すると、抗ＴＮＦａｍＡｂ又は溶媒単独に比較して約２８日間の足腫脹の改善により作用時間を延長できることが明らかである。

血漿中のＡＤＣ安定性
マレイミド系リンカーのインビボ安定性を高めるために加水分解が利用されているが、一般に塩基性ｐＨに暴露する必要があるため、抗体の変性（例えば脱アミド化）、不均一性増加、収率低下等に繋がる恐れがある（Ｓｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３０：１８４-１８９（２０１２）（マレイミドを加水分解して薬物の早期放出と薬物全身暴露を避ける）；Ｓｔｒｏｐ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０（２）：１６１−１６７（２０１３）（同様の報告）；Ｔｕｍｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ ２５（１０）：１８７１−１８８０（２０１４）（塩基性条件下の環加水分解を可能にするために近位ＰＥＧ鎖を使用する）；Ｌｙｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３２：１０５９−１０６２（２０１４）（スクシンイミド加水分解物の生成を助長する方法）；Ｃｈｒｉｓｔｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ ２２０（ＰｔＢ）：６６０−７０（２８ Ｄｅｃ ２０１５）（塩基性条件下のスクシンイミド環加水分解を助長するためにＮ−アリールマレイミドを使用する）；Ｄｏｖｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ６：１（２０１６）（長期間にわたって弱塩基性条件下の環加水分解を助長するために２−（マレイミドメチル）−１，３−ジオキサンを使用する）；及びＪ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ ２０１３：１０２（６）１７１２−１７２３（アスパラギンの脱アミド化は緩衝液種、ｐＨ及び温度に依存する））。一方、マレイミド（連結とその後の塩基性ｐＨでの環加水分解）では数日間を要するが、ブロモアセトアミドを使用した典型的な連結条件は数時間以内で完了する。更に、システインとブロモアセトアミドの反応中に形成される２−メルカプトアセトアミドは逆マイケル反応を生じにくく、下表１３でＡＤＣ４について実証するように、リンカーと抗体の安定した結合が得られる。

溶液中のＡＤＣ安定性
長期安定性を評価するために、バイオ医薬品で加速ストレス試験を実施した。この試験のプロトコールは４０℃の１５ｍＭヒスチジン中で１００ｍｇ／ｍＬのバイオ医薬品を２１日間保温する。ＡＤＣ４でこの試験を行った処、凝集増加率は＜５％であったが、これに対して米国特許出願公開第２０１８／０１２６０００号（公開日２０１８年５月１０日）のＡＤＣ２０３の凝集増加率は１８％であった（表１４）。これは、Ｇｌｙ−Ｇｌｕリンカーとペイロードのリン酸プロドラッグによりＡＤＣ４の性質が改善されたことを実証するものである。米国特許出願公開第２０１８／０１２６０００号のＡＤＣ２０３は以下の通りである。

式中、ｎ＝４であり、Ａは抗ヒトＴＮＦａ抗体アダリムマブを表す。

リン酸プロドラッグには、ＤＡＲに基づく精製にアニオン交換クロマトグラフィーを使用できるという利点もある。その結果、疎水性相互作用クロマトグラフィーに比較してピーク分離が改善され、ＤＡＲに基づいて精製されたＡＤＣの収率が高くなる。

製剤化用緩衝液中で、ＡＤＣ２０３の加水分解されたスクシンイミド環は閉環体と平衡状態にある。閉環体はカニクイザルにおいてインビボで逆マイケル反応とそれに伴うリンカー−薬物の減少を起こし易い（図４）。

標準液体保存条件下で開環形のコンフォメーションにおけるスクシンイミド結合は６ヶ月後に閉環形のコンフォメーションに比較して５℃で５％超、２５℃で１５％超改善されるであろう（表１５）。

当然のことながら、発明を実施するための形態のセクションは特許請求の範囲を解釈するために使用するものであるが、発明の概要と要約のセクションはそうではない。発明の概要と要約のセクションは本発明者らが想定する本開示の代表的な実施形態の全部ではなく、１例以上を明示するものであり、従って、如何なる点においても本開示と以下の特許請求の範囲を制限するものではない。

以上、特定機能の実施と機能間の関係を具体的に示す機能的構成要素により本開示について説明した。これらの機能的構成要素の適用範囲については説明の便宜のために本願中で任意に定義した。特定機能とその関係が適切に達成される限り、別の適用範囲を定義することもできる。

特定の実施形態に関する上記記載から本開示の一般的な特性が完全に明らかになり、第三者は本開示の一般概念から逸脱しない限り、当業者の技能の範囲内の知識を適用することにより、過度の実験を必要とせずにこのような特定の実施形態を種々の用途に合わせて容易に改変及び／又は応用することができる。従って、このような応用及び改変も、本願に提示する教示と手引きに基づき、本願に開示する実施形態の等価物の意味と範囲に含むものとする。当然のことながら、本願における術語及び用語は説明を目的としており、制限を目的とするものではなく、本明細書の用語及び術語は本願の教示と手引きに照らして当業者により解釈されるべきである。

本開示の領域及び範囲は上記の代表的な実施形態のいずれにも制限されるべきではなく、以下の特許請求の範囲とその等価物によってのみ限定されるべきである。

資料援用
特許及び出願公開を含めて発明の詳細な説明で引用した全刊行物はその開示内容全体を本願に援用する。

Claims (11)

1. （ａ）配列番号３に記載の重鎖と配列番号４に記載の軽鎖とを含む抗ＴＮＦα抗体；及び
   （ｂ）式：
   

   

   により表される基を含むグルココルチコイド受容体作動薬
   を含む抗体薬物複合体であって、前記抗体が式：
   

   

   により表されるリンカーを介して前記グルココルチコイド受容体作動薬と連結されている、前記抗体薬物複合体。
2. 式：
   

   

   （式中、Ａは前記抗体であり、ｎは１〜１０の整数である。）の請求項１に記載の抗体薬物複合体。
3. ｎが１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０である、請求項２に記載の抗体薬物複合体。
4. ｎが４である、請求項２に記載の抗体薬物複合体。
5. ｎが２である、請求項２に記載の抗体薬物複合体。
6. 請求項４に記載の抗体薬物複合体及び薬学的に許容される基剤を含有する医薬組成物。
7. 対象における関節リウマチ、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、局面型乾癬、潰瘍性大腸炎、成人クローン病、小児クローン病、ぶどう膜炎、化膿性汗腺炎及び若年性特発性関節炎から選択される疾病の治療方法であって、有効量の請求項４に記載の抗体薬物複合体を前記対象に投与することを含む、前記方法。
8. （ａ）請求項４に記載の抗体薬物複合体又は請求項６に記載の医薬組成物を収容した容器；及び
   （ｂ）前記１個以上の容器に添付又は付属されており、前記抗体薬物複合体又は医薬組成物が関節リウマチ、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、局面型乾癬、潰瘍性大腸炎、成人クローン病、小児クローン病、ぶどう膜炎、化膿性汗腺炎及び若年性特発性関節炎から選択される疾病の治療用であることを指示したラベル又は添付文書
   を含むキット。
9. ＴＮＦα発現細胞へのグルココルチコイド受容体作動薬の送達方法であって、前記細胞を請求項４に記載の抗体薬物複合体と接触させる段階を含む、前記方法。
10. 式：
    

    

    （式中、Ａはアダリムマブであり、ｎは４である。）の抗体薬物複合体。
11. 式：
    

    

    （式中、Ａはアダリムマブであり、ｎは２である。）の抗体薬物複合体。

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