BRPI1008692B1 - anticorpo antagonista tendo especificidade para ox40 humano, sequência de dna isolado, vetor de clonagem ou de expressão, célula hospedeira, processo para a produção do referido anticorpo, composição farmacêutica, uso do 5 referido anticorpo e proteína de fusão - Google Patents

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Andrew George Popplewell
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Abstract

MOLÉCULAS DE ANTICORPOS TENDO ESPECIFICIDADE PARA 0X40 HUMANO. A invenção relaciona-se a moléculas de anticorpo que têm especificidade para determinantes antigênicos de 0X40 humano, usos terapêuticos das moléculas de anticorpo e método para a produção das referidas moléculas de anticorpo.

Description

A presente invenção relaciona-se a moléculas de anticorpo que têm especificidade para determinantes antigênicos de 0X40 e composições que compreendem os mesmos. A presente invenção também se relaciona aos usos terapêuticos das moléculas de anticorpo, composições e métodos para a produção das referidas moléculas de anticorpo. 0X40 (também conhecido como CD134, TNFRSF4, ACT35 ou TXGP1L) é um membro da superfamilia de receptor de TNF, que inclui 4-1BB, CD27, CD30 e CD40. O dominio de ligação de ligante extracelular de 0X40 é composto por 3 domínios ricos em cisteina completos (CRDs) e um quarto CRD C-terminal parcial (Bodmer e cols., 2002, Trends Biochem Sei, 27, 19- 26) .
O ligante para 0X40 é OX40L, e 3 cópias de 0X40 se ligam ao ligante trimérico para formar o complexo OX40-OX40L (Compaan and Hymowitz, 2006, Structure, 14, 1.321-1.330). 0X40 é um receptor ligado à membrana; no entanto, uma isoforma solúvel também foi detectada (Taylor and Schwarz, 2001, J.Immunol. Métodos, 255, 67-72) . A significância funcional da forma solúvel é atualmente desconhecida. 0X40 não é expresso em células T em repouso, mas é transitoriamente expresso em células T ativadas depois de ligação do receptor de célula T (TCR). O ligante para 0X40, OX40L, é um membro da familia de TNF e é expresso em células que apresentam antigeno ativadas (APC), incluindo células B, macrófagos, células endoteliais e células dendriticas (DC). 0X40 é um receptor coestimulante principal com encaixe sequencial de CD28 e 0X40 sendo necessário para proliferação e sobrevivência ótimas de célula T. A ligação de 0X40 em células T ativadas leva a melhor produção de citocina e proliferação de células T CD4+ e CD8+ (Gramaglia e cols., 2000, J. Immunol, 165, 3.043-3.050, Bansal-Pakala e cols., 2004, J. Immunol, 172, 4.821-425) e pode contribuir para respostas de Thl e Th2 progressivas (Gramaglia e cols., 1998, J. Immunol., 161, 6.510-6.517, Arestides e cols., 2002, Eur. J. Immunol. 32, 2874-2880) . A co-estimulação de 0X40 prolonga a sobrevivência da célula T além da fase efetora inicial da resposta imune e aumenta o número de células T de memória através da inibição de morte da célula T efetora.
Quando a ativação imune é excessiva ou não descontrolada, alergia patológica, asma, inflamação, doenças autoimunes e outras doenças relacionadas podem ocorrer. Pelo fato de 0X40 funcionar para melhorar as respostas imunes, ele pode exacerbar doenças autoimunes e inflamatórias.
O papel das interações de OX40/OX40L em modelos de doença foi demostrado em camundongo knockout de 0X40. Em encefalomielite alérgica experimental (EAE), um modelo de esclerose múltipla, sinais clínicos menos severos de doença e infiltrado inflamatório reduzido no SNC foram observados em camundongos knockout 0X40 (Carboni e cols., 2003, J.Neuroimmunology, 145, 1-11). Os camundongos knockout 0X40 que também receberam uma primeira dose de ovalbumina exibem inflamação pulmonar diminuída (80-90% de redução da eosinofilia), produção reduzida de muco, e hiper-reatividade das vias aéreas significativamente atenuada (Jember e cols., 2001, J. Exp. Med., 193, 387-392) . Anticorpos monoclonais para ligante de 0X40 de murideo mostraram efeitos benéficos no modelo de artrite induzida por colágeno de artrite reumatóide (Yoshioka e cols., 2000, Eur. J. Immunol., 30, 2815-2823), EAE (Nohara e cols., 2001, J. Immunol., 166, 2108-2115), camundongos diabéticos não obesos (NOD) (Pakala e cols., 2004, Eur. J. Immunol., 34, 3.039-3.046), colite em camundongos com célula T restaurada (Malmstrom e cols., 2001, J. Immunol., 166, 6.972-6.981, Totsuka e cols., 2003, Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol., 284, G595-G603) e modelos de inflamação pulmonar (Salek-Ardakani e cols., 2003, J. Exp. Med. , 198, 315-324, Hoshino e cols., 2003, Eur. J. Immunol, 33, 861-869) . Um anticorpo para OX40L humano foi investigado em um modelo de inflamação pulmonar em macacos rhesus e resultou em niveis reduzidos de IL-5, IL- 13 e células T de memória efetoras em fluido de lavagem bronquiolar depois de dose de alérgeno Seshasayee e cols., 2007, J. Clin.Invest, 117, 3.868-3.878).
Um aumento na expressão de 0X40 foi observado em várias doenças autoimunes e inflamatórias. Isso inclui um aumento na expressão de 0X40 em células T isoladas do fluido sinovial de pacientes com artrite reumatóide (Brugnoni D e cols., 1998, Br.J. Rheum., 37, 584-585; Yoshioka e cols., 2000, Eur. J. Immunol., 30, 2.815-2.823; Giacomelli R e cols., 2001, Clin. Exp. Rheumatol., 19, 317-320). De modo similar, um aumento na expressão de 0X40 foi observado no tecido gastrointestinal de pacientes com colite ulcerativa e doença de Crohn (Souza e cols., 1999, Gut, 45, 856-863; Stuber e cols., 2000, Eur. J.Clin.Invest., 30, 594-599) e em lesões ativas de pacientes com esclerose múltipla (Carboni e cols., 2003, J. Neuroimmunology, 145, 1-11) . OX40L também pode ser detectado em músculo liso das vias aéreas humanas (ASM) e pacientes com asma. As células de ASM mostram maiores respostas inflamatórias à ligação de OX40L que doadores saudáveis, indicando um papel para a via de OX40/0X4OL em asma (Burgess e cols., 2004, J. Alergia Clin Immunol., 113, 683-689; Burgess e cols., 2005, J. Alergia Clin Immunol., 115, 302-308) . Também foi relatado que as células T CD4 + isoladas do sangue periférico de pacientes com lúpus eritematoso sistêmico (LES) expressam niveis elevados de 0X40 que estão associados com atividade de doença (Patschan e cols., 2006, Clin. Exp. Immunol.r 145, 235-242).
Dado o papel de 0X40 em alergia, asma e doenças associadas com autoimunidade e inflamação, uma abordagem para terapia nessas doenças é o bloqueio da sinalização de OX40-OX4OL através do uso de anticorpos anti-OX40L ou anticorpos antagonistas anti-OX40.
Anticorpos anti-OX40L foram descritos; veja, por exemplo, W02006/029879. Numerosos anticorpos anti-OX40 agonistas foram descritos, mas muito poucos anticorpos antagonistas anti-OX40 são conhecidos. Um anticorpo policlonal anti-OX40 de camundongo de Coelho foi produzido por Stuber e cols., 1996, J.Exp.Med, 183, 979-989, que bloqueia a interação entre 0X40 e OX40L. Anticorpos monoclonais de camundongo, 131 e 315, que se ligam a 0X40 humano foram gerados por Imura e cols., 1996, J.Exp.Med, 2.185-2.195.
Anticorpos antagonistas totalmente humanos foram descritos em W02007/062245, e a maior afinidade desses anticorpos tinha uma afinidade por 0X40 expresso em superfície celular (células T ativadas) de llnM.
Anticorpos antagonistas humanizados foram descritos em WO2008/106116, e o anticorpo com a melhor afinidade por 0X40 tinha uma afinidade de 0,94nM.
Outros anticorpos anti-OX40 foram descritos, incluindo L106 de murídeo (Patente US número 6.277.962) e ACT35 de murídeo, comercialmente disponíveis por eBioscience. Portanto, ainda existe uma necessidade na técnica por um melhor anticorpo anti-OX40 adequado para tratamento de pacientes.
Nós identificamos um anticorpo anti-OX40 antagonista de alta afinidade adequado para uso no tratamento ou profilaxia de distúrbios patológicos mediados por 0X40 ou associados a um nível aumentado de 0X40.
Breve descrição dos desenhos
A Figura 1 mostra certas sequências de aminoácidos ou de DNA com relação a um anticorpo de acordo com a revelação.
A Figura 2 mostra uma representação em diagrama de um anticorpo do formato A26 Fab'-PEG.
A Figura 3 mostra a afinidade baseada em célula do anticorpo A26 Fab'-PEG para 0X40 de superfície celular.
A Figura 4 mostra o percentual de inibição de ligação de OX40L a células T ativadas por anticorpo A26 Fab'-PEG.
A Figura 5 mostra o percentual de inibição de proliferação da célula T por anticorpo A26 Fab'-PEG no MLR humano.
A Figura 6 mostra a inibição por A26 Fab'-PEG de proliferação de PBMC exposto a toxóide tetânico.
A Figura 7 mostra o percentual de inibição por A26 Fab'- PEG da produção de IL-13 de PBMCs expostas a extrato alergênico de Dermatophagoides pteronyssinus.
A Figura 8 mostra o percentual de inibição por A26 Fab' - PEG de produção de citocina a partir de PBMCs expostas a extrato alergênico de Dermatophagoides pteronyssinus.
A Figura 9 mostra que A26 Fab'-PEG inibe a proliferação de célula T CD4+ e CD8+ em um modelo de Hu-SCID.
A Figura 10 mostra a inibição da pontuação de artrite (como área sob a curva) por A26 Fab'-PEG em um modelo in vivo.
A Figura 11 mostra pontuações histológicas totais em um modelo in vivo para artrite.
O anticorpo de rato original do qual os anticorpos humanizados são derivados é referido aqui como CA044 00026. CA044 00026 humanizado geralmente na forma de um fragmento Fab ou outros fragmentos é referido como A26.
Anticorpo PEGuilado "A26" no formato mostrado na Figura 2 é aqui referido como A26Fab'-PEG.
Os resíduos em dominios variáveis de anticorpo são convencionalmente numerados de acordo com um sistema desenvolvido por Kabat e cols. Esse sistema é apresentado em Kabat e cols., 1987, em Sequence of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, USA (hereafter "Kabat e cols, (supra)"). Este sistema de numeração é usado na presente especificação, exceto onde indicado em contrário.
As designações de residuo de Kabat nem sempre correspondem diretamente com a numeração linear dos residuos de aminoácido. A sequência de aminoácidos linear real pode conter menos ou aminoácidos adicionais em comparação com a numeração estrita de Kabat que corresponde a um encurtamento, ou inserção em, um componente estrutural, seja região de estrutura ou de determinação de complementaridade (CDR), da estrutura de dominio variável básico. A numeração correta de Rabat de resíduos pode ser determinada para um dado anticorpo por alinhamento de residuos de homologia na sequência do anticorpo com uma sequência numerada "padrão" de Kabat.
As CDRs do dominio variável de cadeia pesada são localizadas em residuos 31-35 (CDR-H1), residuos 50-65 (CDR- H2) e residuos 95-102 (CDR-H3) de acordo com o sistema de numeração de Kabat. No entanto, de acordo com Chothia (Chothia, C. and Lesk, A.M. J. Mol. Biol., 196, 901-917 (1987)), o equivalente da alça para CDR-HI se estende do residuo 26 ao residue 32. Portanto, a menos que indicado em contrário, "CDR-HI" como aqui empregado deve se referir aos residuos 26 a 35, como descrito por uma combinação do sistema de numeração de Kabat e definição topológica de alça de Chothia.
As CDRs do dominio variável de cadeia leve são localizadas nos residuos 24-34 (CDR-L1), residuos 50-56 (CDR-L2) e residuos 89-97 (CDR-L3), de acordo com o sistema de numeração de Kabat.
Como aqui usado, o termo "anticorpo antagonista" descreve um anticorpo que é capaz de inibir e/ou neutralizar a atividade de sinalização biológica de 0X40, por exemplo, por bloqueio da ligação ou redução substancial da ligação de 0X40 ao ligante de 0X40, e assim inibindo a ativação de 0X40.
Anticorpos para uso na presente invenção podem ser obtidos com o uso de qualquer método adequado conhecido na técnica. O polipeptideo/proteina 0X40 que inclui proteínas de fusão, por exemplo, proteínas de fusão OX40-FC ou células que expressam (de modo recombinante ou natural) o polipeptideo (como células T ativadas), podem ser usados para produzir anticorpos que reconhecem especificamente 0X40. 0 polipeptideo 0X40 pode ser o polipeptideo "maduro" ou um fragmento biologicamente ativo ou derivado deste. Adequadamente, o polipeptideo 0X40 é o polipeptideo humano maduro ou o dominio extracelular ou fragmento deste. 0 dominio extracelular compreende tipicamente aminoácidos 29- 214 da proteína 0X40 (SWISS PROT entrada P43489) . Os polipeptideos 0X40 podem ser preparados por processos bem conhecidos na técnica a partir de células hospedeiras geneticamente construídas que compreendem sistemas de expressão, ou eles podem ser recuperados de fontes biológicas naturais. No presente pedido, o termo "polipeptideos" inclui peptideos, polipeptideos e proteínas. Estes são usados de modo intercambiável, a menos que especificado em contrário. 0 polipeptideo 0X40 pode, em alguns casos, ser parte de uma proteina maior como uma proteína de fusão, por exemplo, fundida a um marcador de afinidade.
Os anticorpos gerados contra o polipeptideo 0X40 podem ser obtidos, quando é necessária a imunização de um animal, por administração dos polipeptideos a um animal, preferivelmente um animal não humano, com o uso de protocolos bem conhecidos e rotineiros; veja, por exemplo, Handbook of Experimental Immunology, D. M. Weir (ed.), Vol 4, Blackwell Scientific Publishers, Oxford, England, 1986). Vários animais de sangue quente, como coelhos, camundongos, ratos, carneiro, vacas, camelos ou porcos, podem ser imunizados. No entanto, camundongos, coelhos, porcos e ratos são geralmente mais adequados.
Anticorpos para uso na presente invenção incluem anticorpos inteiros e fragmentos funcionalmente ativos ou derivados destes e podem ser, sem limitação, anticorpos monoclonais, humanizados, totalmente humanos ou quiméricos.
Anticorpos monoclonais podem ser preparados por qualquer método conhecido na técnica, como a técnica de hibridoma (Kohler & Milstein, 1975, Nature, 256:495-497), a técnica de trioma, a técnica de hibridoma de célula B humana (Kozbor e cols., 1983, Immunology Today, 4:72) e a técnica de EBV-hibridoma (Cole e cols., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, pp77-96, Alan R Liss, Inc., 1985).
Anticorpos para uso na invenção também podem ser gerados com o uso de métodos de anticorpo de linfócito único por clonagem e expressão de cDNAs de região variável de imunoglobulina gerados de linfócitos únicos selecionados para a produção de anticorpos específicos, por exemplo, pelos métodos descritos por Babcook, J. e cols., 1996, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93(15) :7.843-7.8481; WO92/02551; W02004/051268 e Pedido de Patente Internacional número W02004/106377.
A escolha de anticorpos pode ser realizada com o uso de ensaios para medir a ligação a 0X40 humano e/ou ensaios para medir a capacidade de bloquear a ligação de 0X40 a seu ligante, OX40L. Um exemplo de um ensaio de ligação é um ELISA, em particular, com o uso de uma proteína de fusão de 0X40 humano e Fc humano, que é imobilizado em placas, e que emprega um anticorpo secundário conjugado para detectar anticorpo anti-OX40 ligado à proteína de fusão. Um exemplo de um ensaio de bloqueio é um ensaio baseado em citometria de fluxo que mede o bloqueio da ligação de proteína de fusão de ligante de 0X40 a 0X40 em células humanas CD4. Um anticorpo secundário fluorescentemente rotulado é usado para detectar a quantidade de ligação da proteina de fusão de ligante de 0X40 à célula. Esse ensaio procura uma redução no sinal uma vez que o anticorpo no sobrenadante bloqueia a ligação de proteina de fusão de ligante a 0X40. Um exemplo adicional de um ensaio de bloqueio é um ensaio em que o bloqueio da co-estimulação de células T humanas naive mediado por proteina de fusão de ligante de 0X40 revestidas em uma placa é medido por medição da incorporação de timidina tritiada.
Anticorpos humanizados (que incluem anticorpos enxertados em CDR) são moléculas de anticorpo que têm uma ou mais regiões de determinação de complementaridade (CDRs) de uma espécie não humana e uma região de estrutura de uma molécula de imunoglobulina humana (veja, por exemplo, US 5.585.089; WO91/09967). Deve-se observar que pode ser necessário apenas transferir os residuos de determinação de especificidade das CDRs em vez da CDR inteira (veja, por exemplo, Kashmiri e cols., 2005, Methods, 36, 25-34). Anticorpos humanizados podem também compreender opcionalmente um ou mais residuos de estrutura derivados das espécies não humanas das quais as CDRs foram derivadas.
Anticorpos quiméricos são compostos de elementos derivados de duas espécies diferentes de modo que os elementos retêm as características das espécies das quais eles são derivados. Geralmente, um anticorpo quimérico compreenderá uma região variável de uma espécie, por exemplo, um camundongo, rato, coelho ou similar, e região constante de outra espécie, como um ser humano.
Os anticorpos para uso na presente invenção também podem ser gerados com o uso de vários métodos de apresentação de fago conhecidos na técnica e incluem aqueles revelados por Brinkman e cols. (em J. Immunol. Methods, 1995, 182: 41-50), Ames e cols. (J. Immunol. Methods, 1995, 184:177-186), Kettleborough e cols. (Eur. J. Immunol. 1994, 24:952-958), Persic e cols. (Gene, 1997 187 9-18), Burton e cols. (Advances in Immunology, 1994, 57:191-280) e WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; e US 5.698.426; 5.223.409; 5.403.484; 5.580.717; 5.427.908; 5.750.753; 5.821.047; 5.571.698; 5.427.908; 5.516.637; 5.780.225; 5.658.727; 5.733.743 e 5.969.108 .
Os anticorpos totalmente humanos são aqueles anticorpos em que as regiões variáveis e as regiões constantes (quando presentes) da cadeia leve e cadeia pesada são todas de origem humana, ou substancialmente idênticas às sequências de origem humana, não necessariamente do mesmo anticorpo. Exemplos de anticorpos totalmente humanos podem incluir anticorpos produzidos, por exemplo, pelos métodos de apresentação de fago acima descritos e anticorpos produzidos por camundongos em que os genes da região variável de imunoglobulina de murideo e opcionalmente os genes da região constante foram substituídos por suas contrapartes humanas, por exemplo, como descrito em termos gerais em EP0546073 B 1, US 5.545.806, US 5.569.825, US 5.625.126, US 5.633.425, US 5.661.016, US 5.770.429, EP 0438474 e EPO463151.
Em uma modalidade, a presente invenção fornece um anticorpo antagonista que tem especificidade para 0X40 humano, que compreende uma cadeia pesada, em que o dominio variável da cadeia pesada compreende pelo menos uma CDR que tem a sequência dada na Figura 1 (c) Id. de Seq. N°: 1 para CDR-H1, uma CDR que tem a sequência dada na Figura 1(c) Id. de Seq. N°: 2 ou Id. de Seq. N°: 20 para CDR-H2, e uma CDR que tem a sequência dada na Figura 1(c) Id. de Seq. N° : 3 para CDR-H3.
Em outra modalidade, a presente invenção fornece um anticorpo antagonista que tem especificidade para 0X40 humano, que compreende uma cadeia pesada, em que pelo menos duas das CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 do dominio variável da cadeia pesada são selecionadas das seguintes: a sequência apresentada em Id. de Seq. N°: 1 para CDR-H 1, a sequência apresentada em Id. de Seq. N°: 2 para CDR-H2, e a sequência apresentada em Id. de Seq. N°: 3 para CDR-H3. Por exemplo, o anticorpo pode compreender uma cadeia pesada em que a CDR- H1 tem a sequência apresentada em Id. de Seq. N° : 1 e CDR- H2 tem a sequência apresentada em Id. de Seq. N° : 2. Alternativamente, o anticorpo pode compreender uma cadeia pesada em que CDR-H1 tem a sequência apresentada em Id. de Seq. N° : 1 e CDR-H3 tem a sequência apresentada em Id. de Seq. N° : 3, ou o anticorpo pode compreender uma cadeia pesada em que CDR-H2 tem a sequência apresentada em Id. de Seq. N° : 2 e CDR-H3 tem a sequência apresentada em Id. de Seq. N° : 3. Para evitar dúvidas, entende-se que todas as permutas são incluídas.
Em outra modalidade a presente invenção fornece um anticorpo antagonista que tem especificidade para 0X40 humano, que compreende uma cadeia pesada, em que o dominio variável da cadeia pesada compreende a sequência apresentada em Id. de Seq. N°: 1 para CDR-HI, a sequência apresentada em Id. de Seq. N°: 2 para CDR-H2, e a sequência apresentada em Id. de Seq. N°: 3 para CDR-H3.
Em outra modalidade, a presente invenção fornece um anticorpo antagonista que tem especificidade para 0X40 humano, que compreende uma cadeia, em que o dominio variável da cadeia pesada compreende a sequência apresentada em Id. de Seq. N°: 1 para CDR-H1, a sequência apresentada em Id. de Seq. N° : 20 para CDR-H2, e a sequência apresentada em Id. de Seq. N° : 3 para CDR-H3. Em uma modalidade, a presente invenção fornece um anticorpo antagonista que tem especificidade para 0X40 humano, que compreende uma cadeia leve, em que o dominio variável da cadeia leve compreende pelo menos um CDR que tem a sequência dada na Figura 1 (c) Id. de Seq. N°: 4 ou Id. de Seq. N°: 21 para CDR-L1, uma CDR que tem a sequência dada na Figura 1 (c) Id. de Seq. N°: 5 para CDR-L2, e uma CDR que tem a sequência dada na Figura 1 (c) Id. de Seq. N°: 6 para CDR-L3.
Em outra modalidade, a presente invenção fornece um anticorpo antagonista que tem especificidade para 0X40 humano, que compreende uma cadeia leve, em que pelo menos duas das CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 do dominio variável da cadeia leve são selecionadas das seguintes: a sequência apresentada em Id. de Seq. N° : 4 para CDR-L1, a sequência apresentada em Id. de Seq. N° : 5 para CDR-L2, e a sequência apresentada em Id. de Seq. N° : 6 para CDR-L3. Por exemplo, o anticorpo pode compreender uma cadeia leve em que CDR-L1 tem a sequência apresentada em Id. de Seq. N° : 4 e CDR-L2 tem a sequência apresentada em Id. de Seq. N°: 5. Alternativamente, o anticorpo pode compreender uma cadeia leve em que CDR-L1 tem a sequência apresentada em Id. de Seq. N° : 4 e CDR-L3 tem a sequência apresentada em Id. de Seq. N°: 6, ou o anticorpo pode compreender a cadeia leve em que CDR-L2 tem a sequência apresentada em Id. de Seq. N°: 5 e CDR-L3 tem a sequência apresentada em Id. de Seq. N° : 6. Para evitar dúvidas, deve-se entender que todas as permutas são incluídas.
Em outra modalidade, a presente invenção fornece um anticorpo antagonista que tem especificidade para 0X40 humano, que compreende uma cadeia leve, em que o dominio variável compreende a sequência apresentada em Id. de Seq. N° : 4 para CDR-L1, a sequência apresentada em Id. de Seq. N°: 5 para CDR-L2, e a sequência apresentada em Id. de Seq. N° : 6 para CDR-L3.
Em outra modalidade, a presente invenção fornece um anticorpo antagonista que tem especificidade para 0X40 humano, que compreende uma cadeia leve, em que o dominio variável compreende a sequência apresentada em Id. de Seq. N°: 21 para CDR-L1, a sequência apresentada em Id. de Seq. N°: 5 para CDR-L2, e a sequência apresentada em Id. de Seq. N° : 6 para CDR-L3.
As moléculas de anticorpo da presente invenção compreendem adequadamente uma cadeia leve complementar ou uma cadeia pesada complementar, respectivamente.
Portanto, em uma modalidade, um anticorpo de acordo com a presente invenção compreende uma cadeia pesada, em que o dominio variável da cadeia pesada compreende a sequência apresentada em Id. de Seq. N°: 1 para CDR-H 1, a sequência apresentada em Id. de Seq. N°: 2 ou Id. de Seq. N°: 20 para CDR-H2, e a sequência apresentada em Id. de Seq. N°: 3 para CDR-H3, e uma cadeia leve em que o dominio variável da cadeia leve compreende a sequência apresentada em Id. de Seq. N°: 4 ou Id. de Seq. N°: 21 para CDR-L1, a sequência apresentada em Id. de Seq. N°: 5 para CDR-L2, e a sequência apresentada em Id. de Seq. N°: 6 para CDR-L3.
Deve-se observar que uma ou mais substituições de aminoácido, adições e/ou deleções de aminoácido podem ser feitas às CDRs fornecidas pela presente invenção sem alterar significativamente a capacidade do anticorpo de se ligar a 0X40 e para neutralizar a atividade de 0X40. O efeito de quaisquer substituições de aminoácido, adições e/ou deleções pode ser facilmente testado por uma pessoa habilitada na técnica, por exemplo, pelo uso dos métodos aqui descritos, em particular, nos Exemplos, para determinar a ligação de 0X40 e inibição da interação OX40/0X4OL. Portanto, a presente invenção fornece um anticorpo que tem especificidade para 0X40 humano que compreende uma ou mais CDRs selecionadas de CDRH-1 (Id. de Seq. N°: 1), CDRH-2 (Id. de Seq. N° : 2 ou Id. de Seq. N°: 20), CDRH-3 (Id. de Seq. N°: 3), CDRL-1 (Id. de Seq. N° : 4 ou Id. de Seq. N° : 21), CDRL-2 (Id. de Seq. N° : 5) e CDRL-3 (Id. de Seq. N° : 6), em que um ou mais aminoácidos em uma ou mais das CDRs foram substituídos com outro aminoácido, adequadamente um aminoácido similar como aqui definido. Em uma modalidade, a presente invenção fornece um anticorpo que tem especificidade para 0X40 humano que compreende CDRH-1 (Id. de Seq. N° : 1), CDRH-2 (Id. de Seq. N° : 2 ou Id. de Seq. N° : 20), CDRH-3 (Id. de Seq. N° : 3), CDRL-1 (Id. de Seq. N° : 4 ou Id. de Seq. N° : 21), CDRL-2 (Id. de Seq. N° : 5) e CDRL-3 (Id. de Seq. N° : 6), como mostrado na Figura 1 (c) , por exemplo, em que um ou mais aminoácidos em uma ou mais das CDRs foram substituídos com outro aminoácido, como um aminoácido similar como aqui definido.
Em uma modalidade, um anticorpo da presente invenção compreende uma cadeia pesada, em que o dominio variável da cadeia pesada compreende três CDRs em que a sequência de CDRH-1 tem pelo menos 60% de identidade ou similaridade à sequência apresentada em Id. de Seq. N°: 1, CDRH-2 tem pelo menos 60% de identidade ou similaridade à sequência apresentada em Id. de Seq. N°: 2, e/ou CDRH-3 tem pelo menos 60% de identidade ou similaridade à sequência apresentada em Id. de Seq. N° : 3. Em outra modalidade, um anticorpo da presente invenção compreende uma cadeia pesada, em que o dominio variável da cadeia pesada compreende três CDRs em que a sequência de CDRH-1 tem pelo menos 70%, 80%, 90%, 95% ou 98% de identidade ou similaridade à sequência apresentada em Id. de Seq. N°: 1, CDRH-2 tem pelo menos 70%, 80%, 90%, 95% ou 98% de identidade ou similaridade à sequência apresentada em Id. de Seq. N°: 2, e/ou CDRH-3 tem pelo menos 70%, 80%, 90%, 95% ou 98% de identidade ou similaridade à sequência apresentada em Id. de Seq. N°: 3.
"Identidade", como aqui usado, indica que, em qualquer posição particular nas sequências alinhadas, o residue de aminoácido é idêntico entre as sequências. "Similaridade", como aqui usado, indica que, em qualquer posição particular nas sequências alinhadas, o residue de aminoácido é de um tipo similar entre as sequências. Por exemplo, leucina pode ser substituída por isoleucina ou valina. Outros aminoácidos que podem ser frequentemente substituídos por outro incluem, sem limitação: - fenilalanina, tirosina e triptofano (aminoácidos que têm cadeias laterais aromáticas); lisina, arginina e histidina (aminoácidos que têm cadeias laterais básicas); 1- aspartato e glutamato (aminoácidos que têm cadeias laterais ácidas); - asparagina e glutamina (aminoácidos que têm cadeias laterais de amida); e - cisteina e metionina (aminoácidos que têm cadeias laterais que contêm enxofre). Os graus de identidade e similaridade podem ser facilmente calculados (Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing. Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Parte 1, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987, Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991, o programa "BLAST" disponível por NCBI (Altschul, S.F. e cols., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410; Gish, W. & States, D.J. 1993, Nature Genet. 3:266-272. Madden, T.L. e cols., 1996, Meth. Enzymol. 266:131-141; Altschul, S.F. e cols., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; Zhang, J. & Madden, T.L. 1997, Genome Res. 7:649-656,).
Em outra modalidade, um anticorpo da presente invenção compreende uma cadeia leve, em que o dominio variável da cadeia leve compreende três CDRs em que a sequência de CDRL- 1 tem pelo menos 60% de identidade ou similaridade à sequência apresentada em Id. de Seq. N°: 4, CDRL-2 tem pelo menos 60% de identidade ou similaridade à sequência apresentada em Id. de Seq. N°: 5, e/ou CDRL-3 tem pelo menos 60% de identidade ou similaridade à sequência apresentada em Id. de Seq. N° : 6. Em outra modalidade, um anticorpo da presente invenção compreende uma cadeia leve, em que o dominio variável da cadeia leve compreende três CDRs em que a sequência de CDRL-1 tem pelo menos 70%, 80%, 90%, 95% ou 98% de identidade ou similaridade à sequência apresentada em Id. de Seq. N°: 4, CDRL-2 tem pelo menos 70%, 80%, 90%, 95% ou 98% de identidade ou similaridade à sequência apresentada em Id. de Seq. N°: 5, e/ou CDRL-3 tem pelo menos 70%, 80%, 90%, 95% ou 98% de identidade ou similaridade à sequência apresentada em Id. de Seq. N° : 6.
Em uma modalidade, o anticorpo aqui fornecido é um anticorpo monoclonal.
Em uma modalidade, o anticorpo aqui fornecido é um anticorpo quimérico.
Em uma modalidade, o anticorpo fornecido pela presente invenção é uma molécula de anticorpo enxertada com CDR que compreende uma ou mais das CDRs fornecidas em Id. de Seq. Nos: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 20 e/ou 21 (Figura 1 (c) ) , ou variantes destes. Como aqui usado, o termo "molécula de anticorpo enxertada com CDR" refere-se a uma molécula de anticorpo em que a cadeia pesada e/ou cadeia leve contém uma ou mais CDRs (incluindo, se desejado, uma ou mais CDRs modificadas) de um anticorpo doador (por exemplo, um anticorpo monoclonal de murideo) enxertado em uma estrutura de região variável de cadeia pesada e/ou cadeia leve de um anticorpo receptor (por exemplo, um anticorpo humano). Para uma revisão, veja Vaughan e cols., Nature Biotechnology, 16, 535-539, 1998. Em uma modalidade, em vez de a CDR inteira ser transferida, apenas um ou mais dos residuos de determinação de especificidade de qualquer uma das CDRs aqui descritas acima são transferidos para a estrutura de anticorpo humano (veja, por exemplo, Kashmiri e cols., 2005, Methods, 36, 25-34). Em uma modalidade, apenas os resíduos de determinação de especificidade de uma ou mais das CDRs acima descritas são transferidos para a estrutura de anticorpo humano. Em outra modalidade, apenas os residuos de determinação de especificidade de cada uma das CDRs acima descritas são transferidos para a estrutura de anticorpo humano.
Quando as CDRs ou os residuos de determinação de especificidade são enxertados, qualquer sequência de estrutura de região variável receptora adequada pode ser usada que tenha relação à classe/tipo do anticorpo doador do qual as CDRs são derivadas, incluindo regiões de estrutura de camundongo, primata e humano. Adequadamente, o anticorpo enxertado com CDR de acordo com a presente invenção tem um dominio variável que compreende regiões de estrutura receptora humana bem como uma ou mais das CDRs ou residuos de determinação de especificidade acima descritos. Portanto, é fornecido em uma modalidade um anticorpo enxertado com CDR de neutralização em que o dominio variável compreende regiões de estrutura receptora humana e CDRs doadoras não humanas.
Exemplos de estruturas humanas que podem ser usadas na presente invenção são KOL, NEWM, REI, EU, TUR, TEI, LAY e POM (Kabat e cols., supra) . Por exemplo, KOL e NEWM podem ser usadas para a cadeia pesada, REI podem ser usadas para a cadeia leve, e EU, LAY e POM podem ser usadas para a cadeia pesada e cadeia leve. Alternativamente, sequências de linhagem germinativa humana podem ser usadas; estas são disponíveis em: http://vbase.tnrc-cpe.cam.ac.uk.
Em um anticorpo enxertado com CDR da presente invenção, as cadeias pesadas e cadeias leves receptoras não precisam necessariamente ser derivadas do mesmo anticorpo, e podem, se desejado, compreender cadeias compostas que têm regiões de estrutura derivadas de diferentes cadeias.
Uma região de estrutura adequada para a cadeia pesada do anticorpo enxertado com CDR da presente invenção é derivada da sequência humana de subgrupo VH3 1-3 3-07 junto com JH4. Portanto, é fornecido um anticorpo enxertado com CDR de neutralização que compreende pelo menos uma CDR doadora não humana em que a região da estrutura da cadeia pesada é derivada da sequência humana de subgrupo VH3 1-3 3- 07 junto com JH4. A sequência de JH4 humano é como se segue: (YFDY)WGQGTLVTVSS (Seq Id. No: 22). O motivo YFDY é parte de CDR-H3 e não é parte da estrutura 4 (Ravetch, JV. e cols., 1981, Cell, 27, 583-591) .
A região de estrutura adequada para a cadeia leve do anticorpo enxertado com CDR da presente invenção é derivada da sequência 2-1 1-02 de subgrupo VK1 de linhagem germinativa humana junto com JK4. Portanto, é fornecido um anticorpo enxertado com CDR de neutralização que compreende pelo menos uma CDR doadora não humana em que a cadeia leve região de estrutura é derivada da sequência 2-1 1-02 de subgrupo humano junto com JK4. A sequência JK1 é como se segue: (WT)FGQGTKVEIK (Id. de Seq. N°: 23). O motivo WT é parte de CDR-L3 e não é parte da estrutura 4 (Hieter, PA., e cols., 1982, J. Bíol. Chem., 257, 1.516-1.522).
Além disso, em um anticorpo enxertado com CDR da presente invenção, as regiões de estrutura não precisam ter exatamente a mesma sequência que aquela do anticorpo receptor. Por exemplo, resíduos incomuns podem ser alterados para resíduos de ocorrência mais frequente para aquela classe ou tipo de cadeia receptora. Alternativamente, os resíduos selecionados nas regiões de estrutura receptoras podem ser alterados de modo que eles correspondam ao resíduo encontrado na mesma posição no anticorpo doador (veja Reichinann e cols., 1998, Nature, 332, 323-324) . Tais alterações devem ser mantidas ao mínimo necessário para recuperar a afinidade do anticorpo doador. Um protocolo para a seleção de resíduos nas regiões de estrutura receptoras que podem precisar ser alteradas é apresentado em WO 91/09967.
Adequadamente, em uma molécula de anticorpo com CDR enxertada da presente invenção, se a cadeia pesada receptora tem a sequência 1-3 3-07 VH3 humana junto com JH4, então as regiões de estrutura receptoras da cadeia pesada compreendem, além de uma ou mais CDR doadoras, um resíduo doador em pelo menos uma das posições 37, 73, 78 ou 94 (de acordo com Kabat e cols., (supra)). Portanto, é fornecido um anticorpo enxertado com CDR, em que pelo menos os resíduos nas posições 37, 73, 78 e 94 do domínio variável da cadeia pesada são resíduos doadores.
Adequadamente, em uma molécula de anticorpo enxertada com CDR de acordo com a presente invenção, se a cadeia leve receptora tem a sequência 2-1 1-02 VK1 de subgrupo humano junto com JK4, então as regiões de estrutura receptoras da cadeia leve compreendem, além de uma ou mais CDR doadoras, um resíduo doador em pelo menos uma das posições 64 ou 71. Portanto, é fornecido um anticorpo enxertado com CDR, em que pelo menos os resíduos nas posições 64 e 71 do domínio variável da cadeia leve são resíduos doadores. Os resíduos doadores são residuos do anticorpo doador, ou seja, o anticorpo do qual as CDRs foram originalmente derivadas.
Em uma modalidade, um anticorpo da presente invenção compreende uma cadeia pesada, em que o dominio variável da cadeia pesada compreende a sequência dada na Figura 1 (b) Id. de Seq. N°: 9.
Deve-se observar que uma ou mais substituições de aminoácido, adições e/ou deleções podem ser feitas aos domínios variáveis de anticorpo, fornecidos pela presente invenção, sem alterar significativamente a capacidade do anticorpo de se ligar a 0X40 e de neutralizar a atividade de 0X40. O efeito de quaisquer substituições, adições e/ou deleções de aminoácido pode ser facilmente testado por pessoa habilitada na técnica, por exemplo, pelo uso dos métodos aqui descritos, em particular nos Exemplos, para determinar a ligação de 0X40 e bloqueio do ligante.
Em outra modalidade, um anticorpo da presente invenção compreende uma cadeia pesada, em que o dominio variável da cadeia pesada compreende uma sequência que tem pelo menos 60% de identidade ou similaridade à sequência apresentada em Id. de Seq. N° : 9. Em uma modalidade, um anticorpo da presente invenção compreende uma cadeia pesada, em que o domínio variável da cadeia pesada compreende uma sequência que tem pelo menos 70%, 80%, 90%, 95% ou 98% de identidade ou similaridade à sequência apresentada em Id. de Seq. N°: 9.
Em uma modalidade, um anticorpo da presente invenção compreende uma cadeia leve, em que o domínio variável da cadeia leve compreende a sequência dada na Figura 1 (a) Id. de Seq. N° : 7.
Em outra modalidade, um anticorpo da presente invenção compreende uma cadeia leve, em que o dominio variável da cadeia leve compreende uma sequência que tem pelo menos 60% de identidade ou similaridade à sequência apresentada em Id. de Seq. N° : 7. Em uma modalidade o anticorpo da presente invenção compreende uma cadeia leve, em que o dominio variável da cadeia leve compreende uma sequência que tem pelo menos 70%, 80%, 90%, 95% ou 98% de identidade ou similaridade à sequência apresentada em Id. de Seq. N° : 7.
Em uma modalidade, um anticorpo da presente invenção compreende uma cadeia pesada, em que o dominio variável da cadeia pesada compreende a sequência apresentada em Id. de Seq. N° : 9 e uma cadeia leve, em que o dominio variável da cadeia leve compreende a sequência apresentada em Id. de Seq. N°: 7.
Em outra modalidade da invenção, o anticorpo compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que o dominio variável da cadeia pesada compreende uma sequência que tem pelo menos 60% de identidade ou similaridade à sequência apresentada em Id. de Seq. N° : 9 e o dominio variável da cadeia leve compreende uma sequência que tem pelo menos 60% de identidade ou similaridade à sequência apresentada em Id. de Seq. N° : 7. Adequadamente, o anticorpo compreende uma cadeia pesada, em que o dominio variável da cadeia pesada compreende uma sequência que tem pelo menos 70%, 80%, 90%, 95% ou 98% de identidade ou similaridade à sequência apresentada em Id. de Seq. N° : 9e uma cadeia leve, em que o dominio variável da cadeia leve compreende uma sequência que tem pelo menos 70%, 80%, 90%, 95% ou 98% de identidade ou similaridade à sequência apresentada em Id. de Seq. N°: 7.
As moléculas de anticorpo da presente invenção podem compreender uma molécula de anticorpo completa que tem cadeias leves e pesadas de comprimento total ou um fragmento desta e podem ser, sem limitação, Fab, Fab modificado, Fab', Fab' modificado, F(ab')2, Fv, anticorpos de dominio único (por exemplo VH ou VL ou VHH) , scFv, anticorpos bi, tri ou tetravalentes, Bis-scFv, diabodies, tríabodies, tetrabodies e fragmentos de ligação a epitopo de qualquer um dos acima (veja, por exemplo, Holliger and Hudson, 2005, Nature Biotech. 23(9):1126-1136; Adair and Lawson, 2005, Drug Design Reviews - Online 2(3), 209-217). Os métodos para a criação de confecção desses fragmentos de anticorpo são bem conhecidos na técnica (veja, por exemplo, Verma e cols., 1998, Journal of Immunological Methods, 216, 165-181). Outros fragmentos de anticorpo para uso na presente invenção incluem os fragmentos Fab e Fab' descritos nos pedidos de Patente Internacional W02005/003169, W02005/003170 e W02005/003171. Anticorpos multivalentes podem compreender especificidades múltiplas ou podem ser mono-especificos (veja, por exemplo, WO 92/22853 e W005/113605).
Em uma modalidade, o anticorpo de acordo com a presente revelação é fornecido como uma proteina de fusão de anticorpo de ligação de 0X4 0 que compreende uma porção de imunoglobulina, por exemplo, um fragmento Fab ou Fab', e um ou dois anticorpos de dominio único (dAb) ligados diretamente ou indiretamente a ele, por exemplo, como descrito em W02009/040562 .
Em uma modalidade, a proteina de fusão compreende dois anticorpos de dominio, por exemplo, como um pareamento pesado variável (VH) e pareamento leve variável (VL), opcionalmente ligado por uma ligação de dissulfeto.
Em uma modalidade, o elemento Fab de Fab' da proteina de fusão tem a mesma especificidade ou similar ao anticorpo ou anticorpos de dominio único. Em uma modalidade, o Fab ou Fab' tem uma diferente especificidade ao anticorpo ou anticorpos de dominio único, ou seja, a proteina de fusão é multivalente. Em uma modalidade, uma proteina de fusão multivalente de acordo com a presente invenção tem um sitio de ligação de albumina, por exemplo, um par VH/VL fornece um sitio de ligação de albumina.
Os dominios de região constante da molécula de anticorpo da presente invenção, se presentes, podem ser selecionados com relação à função proposta da molécula de anticorpo, e em particular as funções efetoras que podem ser necessárias. Por exemplo, os dominios de região constante podem ser dominios de IgA, IgD, IgE, IgG ou IgM humana. Em particular, os dominios de região constante de IgG humana podem ser usados, especialmente dos isotipos IgGl e IgG3 quando a molécula de anticorpo é para usos terapêuticos e funções efetoras de anticorpo são necessárias. Alternativamente, os isotipos IgG2 e IgG4 podem ser usados quando a molécula de anticorpo é para objetivos terapêuticos e as funções efetoras do anticorpo não são necessárias, por exemplo, para bloqueio simples da atividade de 0X40. Deve-se observar que as variantes de sequência desses dominios de região constante também podem ser usadas. Por exemplo, moléculas de IgG4 em que a serina na posição 241 foi substituída por prolina como descrito em Angal e cols., Molecular Immunology, 1993, 30 (1), 105-108 podem ser usadas. Também será compreendido por pessoa habilitada na técnica que os anticorpos podem sofrer uma variedade de modificações pós-tradução. O tipo e a extensão dessas modificações frequentemente dependem da linhagem de célula hospedeira usada para expressar o anticorpo, bem como das condições de cultura. Tais modificações podem incluir variações na glicosilação, oxidação de metionina, formação de dicetopiperazina, isomerização de aspartato e desamidação de asparagina. Uma modificação frequente é a perda de um residuo básico de terminal carboxi (como lisina ou arginina) devido à ação de carboxipeptidases (como descrito em Harris, R J. Journal of Chromatography 705:129-134, 1995). Portanto, a lisina C- terminal da cadeia pesada do anticorpo dada na Figura 1 (f), Id. de Seq. N°: 15 pode ser ausente.
Em uma modalidade, a cadeia pesada do anticorpo compreende um dominio CHI e a cadeia leve do anticorpo compreende um dominio CL, kappa ou lambda.
Em uma modalidade, o anticorpo fornecido pela presente invenção é um anticorpo antagonista que tem especificidade para 0X40 humano em que a região constante da cadeia pesada compreende uma região de dobradiça modificada. Portanto, a presente invenção fornece um anticorpo em que a cadeia pesada compreende ou consiste na sequência dada na Figura 1 (f), Id. de Seq. N°: 15.
Deve-se observar que uma ou mais substituições, adições e/ou deleções de aminoácido podem ser feitas aos dominios variáveis e/ou constantes do anticorpo fornecidos pela presente invenção sem alterar significativamente a capacidade do anticorpo de se ligar a 0X40 e de neutralizar a atividade de 0X40. 0 efeito de quaisquer substituições, adições e/ou deleções de aminoácido pode ser facilmente testado por pessoa habilitada na técnica, por exemplo, pelo uso dos métodos aqui descritos, em particular nos Exemplos, para determinar a ligação de 0X40 e bloqueio da interação OX40/OX4OL.
Em uma modalidade da invenção, o anticorpo compreende uma cadeia pesada, em que a cadeia pesada compreende uma sequência que tem pelo menos 60% de identidade ou similaridade à sequência apresentada em Id. de Seq. N° : 15. Adequadamente, o anticorpo compreende uma cadeia pesada, em que a cadeia pesada compreende uma sequência que tem pelo menos 70%, 80%, 90%, 95% ou 98% de identidade ou similaridade à sequência apresentada em Id. de Seq. N°: 15.
Em uma modalidade, uma molécula de anticorpo de acordo com a presente invenção compreende uma cadeia leve que compreende a sequência dada na Figura 1 (d), Id. de Seq. N°: 11.
Em uma modalidade da invenção, o anticorpo compreende uma cadeia leve, em que a cadeia leve compreende uma sequência que tem pelo menos 60% de identidade ou similaridade à sequência apresentada em Id. de Seq. N°: 11. Por exemplo, o anticorpo compreende uma cadeia leve, em que a cadeia leve compreende uma sequência que tem pelo menos 70%, 80%, 90%, 95% ou 98% de identidade ou similaridade à sequência apresentada em Id. de Seq. N°: 11.
Em uma modalidade, a presente invenção fornece um anticorpo em que a cadeia pesada compreende ou consiste na sequência apresentada em Id. de Seq. N°: 15 e a cadeia leve compreende ou consiste na sequência apresentada em Id. de Seq. N°: 11.
Em uma modalidade da invenção, o anticorpo compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a cadeia pesada compreende uma sequência que tem pelo menos 60% de identidade ou similaridade à sequência apresentada em Id. de Seq. N° : 15 e a cadeia leve compreende uma sequência que tem pelo menos 60% de identidade ou similaridade à sequência apresentada em Id. de Seq. N°: 11. Geralmente, o anticorpo compreende uma cadeia pesada, em que a cadeia pesada compreende uma sequência que tem pelo menos 70%, 80%, 90%, 95% ou 98% de identidade ou similaridade à sequência apresentada em Id. de Seq. N°: 15, e uma cadeia leve, em que a cadeia leve compreende uma sequência que tem pelo menos 70%, 80%, 90%, 95% ou 98% de identidade ou similaridade à sequência apresentada em Id. de Seq. N°: 11.
As moléculas biológicas, como anticorpos ou fragmentos, contêm grupos funcionais ácidos e/ou básicos, e assim a molécula ganha uma carga positiva ou negativa. Uma quantidade de carga "observada" geral dependerá da sequência de aminoácidos absoluta da entidade, do ambiente local dos grupos carregados na estrutura 3D, e das condições ambientais da molécula. O ponto isoelétrico (pl) é o pH em que uma molécula particular ou superfície acessível por solvente desta não carrega carga elétrica. Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento de acordo com a presente revelação tem um ponto isoelétrico (pl) de pelo menos 7. Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento tem um ponto isoelétrico de pelo menos 8, como 8,5, 8,6, 8,7, 8,8 ou 9.
O anticorpo 0X40 e os fragmentos da invenção foram projetados para ter um ponto isoelétrico adequado. Isso pode levar a anticorpos e/ou fragmentos com propriedades mais robustas, em particular, perfis de solubilidade e/ou estabilidade adequados e/ou melhores características de purificação.
Portanto, em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo 0X40 humanizado projetado para ter um ponto isoelétrico diferente daquele do anticorpo CA044_00026 originalmente identificado. 0 anticorpo pode, por exemplo, ser projetado por substituição de um residue de aminoácido como substituição de um residuo de aminoácido ácido com um ou mais residuos de aminoácido básicos.
Alternativamente, residuos de aminoácido básicos podem ser introduzidos ou residuos de aminoácido ácidos podem ser removidos. Alternativamente, se a molécula tem um valor de pi inaceitavelmente alto, residuos ácidos podem ser introduzidos para diminuir o pi, como necessário. 0 pi alvo do anticorpo ou fragmento projetado pode desejavelmente, por exemplo, ser 8 ou acima, como 8,5 ou 9. É importante que, quando da manipulação do pi, deva-se tomar cuidado para reter a atividade desejável do anticorpo ou fragmento. Assim, em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento projetado tem a mesma atividade ou substancialmente a mesma atividade que o anticorpo ou fragmento "não modificado".
Programas como ** ExPASY http://www.expasy.ch/tools/pi_tool.html e http://www.iut- arles.up.univ-mrs.fr/w3bb/d_abim/compo-p.html podem ser usados para prever o ponto isoelétrico do anticorpo ou fragmento.
Também é fornecida pela presente invenção uma região ou epitopo especifico de 0X40 humano que é ligado por um anticorpo fornecido pela presente invenção, em particular, um anticorpo que compreende a sequência de cadeia pesada gH2 (Id. de Seq. N°: 9) e/ou a sequência de cadeia leve gL8 (Id. de Seq. N°: 7).
Essa região ou epitopo especifico do polipeptideo 0X40 humano pode ser identificado por qualquer método adequado de mapeamento de epitopo conhecido na técnica em combinação com qualquer um dos anticorpos fornecidos pela presente invenção. Exemplos de tais métodos incluem rastreamento de peptideos de comprimentos variáveis derivados de 0X40 para ligação ao anticorpo da presente invenção com o menor fragmento que pode se ligar especificamente ao anticorpo que contém a sequência do epitopo reconhecido pelo anticorpo. Os peptideos 0X40 podem ser produzidos sinteticamente ou por digestão proteolitica do polipeptideo 0X40. Peptideos que ligam o anticorpo podem ser identificados, por exemplo, por análise espectrométrica de massa. Em outro exemplo, a espectroscopia de RMN ou cristalografia de raios X pode ser usada para identificar o epitopo ligado por um anticorpo da presente invenção. Uma vez identificado, o fragmento de epitopo que se liga a um anticorpo da presente invenção pode ser usado, se desejado, como um imunógeno para obter anticorpos antagonistas adicionais que se ligam ao mesmo epitopo.
Anticorpos que bloqueiam de forma cruzada a ligação de um anticorpo de acordo com a presente invenção, em particular, um anticorpo que compreende a sequência de cadeia pesada gH2 (Id. de Seq. N°: 9) e a sequência de cadeia leve gL8 (Id. de Seq. N° : 7), podem ser similarmente úteis no antagonismo da atividade de 0X40. Portanto, a presente invenção também fornece um anticorpo antagonista que tem especificidade para 0X40 humano, que bloqueia de forma cruzada a ligação de qualquer um dos anticorpos acima descritos a 0X40 humano e/ou é bloqueado de forma cruzada de ligação a 0X40 por qualquer um daqueles anticorpos. Em uma modalidade, tal anticorpo se liga ao mesmo epitopo como um anticorpo aqui descrito acima. Em outra modalidade, o anticorpo de neutralização por bloqueio cruzado se liga a um epitopo que está na borda e/ou se sobrepõe ao epitopo ligado por um anticorpo aqui descrito.
Em outra modalidade, o anticorpo de neutralização por bloqueio cruzado desse aspecto da invenção não se liga ao mesmo epitopo como um anticorpo da presente invenção ou um epitopo que está na borda e/ou se sobrepõe ao referido epitopo.
Os anticorpos de bloqueio cruzado podem ser identificados com o uso de qualquer método adequado na técnica, por exemplo, pelo uso de ensaios ELISA de competição ou BIAcore em que a ligação do anticorpo de bloqueio cruzado a 0X40 humano evita a ligação de um anticorpo da presente invenção ou vice-e-versa.
Em uma modalidade, é fornecido um anticorpo antagonista que tem especificidade para 0X40 humano, que bloqueia de forma cruzada a ligação de um anticorpo cuja cadeia pesada compreende a sequência gH2 (Id. de Seq. N°: 9) e cuja cadeia leve compreende a sequência gL8 (Id. de Seq. N°: 7) a 0X40 humano. Em uma modalidade, o anticorpo de bloqueio de forma cruzada fornecido pela presente invenção inibe a ligação de um anticorpo que compreende a sequência de cadeia pesada gH2 (Id. de Seq. N°: 9) e a sequência de cadeia leve gL8 (Id. de Seq. N°: 7) em mais que 80%, por exemplo, em mais que 85%, como mais que 90%, em particular mais que 95%.
Alternativamente ou em adição, os anticorpos antagonistas de acordo com este aspecto da invenção podem ser bloqueados de modo cruzado da ligação a 0X40 humano por um anticorpo que compreende a sequência de cadeia pesada gH2 (Id. de Seq. N°: 9) e a sequência de cadeia leve gL8 (Id. de Seq. N° : 7). Também é fornecido, portanto, uma molécula de anticorpo antagonista que tem especificidade para 0X40 humano que é bloqueado de modo cruzado da ligação a 0X4 0 humano por um anticorpo que compreende a sequência de cadeia pesada gH2 (Id. de Seq. N°: 9) e a sequência de cadeia leve gL8 (Id. de Seq. N° : 7). Em uma modalidade, os anticorpos antagonistas fornecidos por este aspecto da invenção são inibidos da ligação a 0X40 humano por um anticorpo que compreende a sequência de cadeia pesada gH2 (Id. de Seq. N°: 9) e a sequência de cadeia leve gL8 (Id. de Seq. N° : 7) em mais que 80%, por exemplo em mais que 85%, como em mais que 90%, em particular em mais que 95%.
Em uma modalidade, os anticorpos de bloqueio de forma cruzada fornecidos pela presente invenção são totalmente humanos. Em uma modalidade, os anticorpos de bloqueio de forma cruzada fornecidos pela presente invenção são humanizados. Em uma modalidade, os anticorpos de bloqueio de forma cruzada fornecidos pela presente invenção têm uma afinidade por 0X40 humano de 100 pM ou melhor. Em uma modalidade, o anticorpo de bloqueio de forma cruzada fornecido pela presente invenção tem uma afinidade por 0X40 humano de 50pM ou melhor.
Em uma modalidade, o anticorpo de bloqueio cruzado tem um ponto isoelétrico de pelo menos 7, por exemplo pelo menos 8, como 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9 ou 9,0.
As moléculas de anticorpo da presente invenção têm adequadamente uma alta afinidade de ligação, em particular picomolar. A afinidade pode ser medida com o uso de qualquer método adequado conhecido na técnica, incluindo BIAcore, como descrito nos Exemplos desta especificação, com o uso de 0X40 isolado natural ou recombinante ou uma proteina de fusão/polipeptideo adequado. Em um exemplo, a afinidade é medida com o uso de dominio extracelular humano de 0X40 recombinante como descrito nos Exemplos desta especificação. Em um exemplo, o dominio extracelular humano de 0X40 recombinante usado é um dimero, por exemplo, um dimero de fusão Fc. Adequadamente, as moléculas de anticorpo da presente invenção têm uma afinidade de ligação por 0X40 humano isolado de cerca de 200 pM ou melhor. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo da presente invenção tem uma afinidade de ligação de cerca de 100 pM ou melhor. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo da presente invenção tem uma afinidade de ligação de cerca de 50 pM ou melhor.
Em uma modalidade, a molécula de anticorpo da presente invenção tem a afinidade de ligação de cerca de 40 pM ou melhor. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo da presente invenção tem a afinidade de ligação de cerca de 30 pM ou melhor. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo da presente invenção é totalmente humana ou humanizada e tem uma afinidade de ligação de cerca de 100 pM ou melhor.
As moléculas de anticorpo da presente invenção adequadamente têm uma alta afinidade de ligação por 0X40 humano expresso na superfície de células T ativadas, por exemplo, afinidade nanomolar ou picomolar. A afinidade pode ser medida com o uso de qualquer método adequado conhecido na técnica, incluindo o método como descrito nos Exemplos nesta especificação com o uso de células T ativadas CD44 0X40+ humanas. Em particular, as moléculas de anticorpo da presente invenção têm uma afinidade de ligação por 0X40 humano expresso em superfície celular de cerca de 2 nM ou melhor. Em um exemplo, as moléculas de anticorpo da presente invenção têm uma afinidade de ligação por 0X40 humano expresso em superfície celular de cerca de 1,5 n M ou melhor. Em outro exemplo, as moléculas de anticorpo da presente invenção têm uma afinidade de ligação por 0X40 humano expresso em superfície celular de cerca de 1,2 nM ou melhor. Em uma modalidade, é fornecida uma molécula de anticorpo totalmente humana ou humanizada que tem uma afinidade de ligação de cerca de 2 nM ou melhor por 0X40 expresso em superfície celular humana.
Deve-se observar que a afinidade de anticorpos fornecidos pela presente invenção pode ser alterada com o uso de qualquer método adequado conhecido na técnica. A presente invenção também se relaciona, portanto, a variantes das moléculas de anticorpo da presente invenção, que têm uma melhor afinidade por 0X40. Tais variantes podem ser obtidas por inúmeros protocolos de maturação de afinidade que incluem a mutação das CDRs (Yang e cols., J. Mol. Biol., 254, 392- 403, 1995), embaralhamento de cadeia (Marks e cols., Blo/Technology, 10, 779-783, 1992), uso de cepas de mutação de E. coll (Low e cols., J. Mol. Biol., 250, 359-368, 1996), embaralhamento de DNA (Patten e cols., Curr. Opin. Biotechnol., 8, 724-733, 1997), apresentação de fago (Thompson e cols., J. Mol. Biol., 256, 77-88, 1996) e PCR sexual (Crameri e cols., Nature, 391, 288-291, 1998) . Vaughan e cols. (supra) discutem esses métodos de maturação da afinidade.
Em uma modalidade, as moléculas de anticorpo da presente invenção bloqueiam a interação entre 0X40 e OX40L. Numerosos ensaios adequados para determinar a capacidade de um anticorpo de bloquear essa interação são descritos nos exemplos nesta especificação. Em uma modalidade, a presente invenção fornece um anticorpo de neutralização que tem especificidade para 0X40 humano que é capaz de inibir a ligação de OX40L humano (testado em uma concentração final de 2 pg/ml) para ativar células T humanas CD4+OX40+ em 50% em uma concentração de menos que 5 nM. Em uma modalidade, o OX40L humano usado no ensaio é 0X40 humano natural. Em uma modalidade, o 0X40 humano usado no ensaio é 0X40 humano recombinante. Em uma modalidade, o anticorpo de neutralização é um anticorpo humanizado ou totalmente humano.
Se desejado, um anticorpo para uso na presente invenção pode ser conjugado a uma ou mais moléculas efetoras. Deve- se observar que a molécula efetora pode compreender uma molécula efetora única ou duas ou mais de tais moléculas assim ligadas de modo a formar uma porção única que pode ser anexada aos anticorpos da presente invenção. Quando é desejado obter um fragmento de anticorpo ligado a uma molécula efetora, isso pode ser preparado por procedimentos- padrão quimicos ou de DNA recombinante em que o fragmento de anticorpo é ligado diretamente ou por meio de um agente de ligação à molécula efetora. Técnicas para a conjugação de tais moléculas efetoras aos anticorpos são bem conhecidas na técnica (veja Hellstrom e cols., Controlled Drug Delivery, 2a Ed., Robinson e cols., eds., 1987, pp. 623-53; Thorpe e cols., 1982, Immunol. Rev. , 62:119-58 e Dubowchik e cols., 1999, Pharmacology and Therapeutics, 83, 67-123)
Procedimentos químicos particulares incluem, por exemplo, aqueles descritos em WO 93/06231, WO 92/22583, WO 89/00195, WO 89/01476 e W003031581. Alternativamente, quando a molécula efetora é uma proteína ou polipeptideo, a ligação pode ser realizada com o uso de procedimentos de DNA recombinante, por exemplo, como descrito em WO 86/01533 e EP0392745.
O termo molécula efetora como aqui usado inclui, por exemplo, agentes antineoplásicos, fármacos, toxinas, proteínas biologicamente ativas, por exemplo, enzimas, outro anticorpo ou fragmentos de anticorpo, polímeros sintéticos ou de ocorrência natural, ácidos nucleicos e fragmentos destes, por exemplo, DNA, RNA e fragmentos destes, radionuclídeos, particularmente radioiodeto, radioisótopos, metais quelados, nanopartícuias e grupos repórteres como compostos fluorescentes ou compostos que podem ser detectados por espectroscopia de RMN ou ESR.
Exemplos de moléculas efetoras podem incluir citotoxinas ou agentes citotóxicos que incluem qualquer agente que seja prejudicial (por exemplo, mata) às células. Exemplos incluem combrestatinas, dolastatinas, epotilonas, estaurosporina, maitansinoides, espongistatinas, rizoxina, halicondrinas, roridinas, hemiasterlinas, taxol, citocalasina B, gramicidina D, brometo de etídio, emetina, mitomicina, etoposida, tenoposida, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxi antracina diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-desidrotestosterona, glicocorticóides, procaína, tetracaina, lidocaina, propranolol e puromicina, e análogos ou homólogos destes.
Moléculas efetoras também incluem, sem limitação, antimetabólitos (por exemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluoruracil decarbazina), agentes de alquilação (por exemplo, mecloretamina, tioepa clorambucil, melfalan, carmustina (BSNU) e lomustina (CCNU), ciclofosfamida, busulfan, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C e cis-diclorodiamina platina (II) (DDP) cisplatina), antraciclinas (por exemplo, daunorrubicina (anteriormente daunomicina) e doxorrubicina), antibióticos (por exemplo, dactinomicina (anteriormente actinomicina), bleomicina, mitramicina, antramicina (AMC), caliqueamicinas ou duocarmicinas), e agentes anti-mitóticos (por exemplo vincristina e vinblastina).
Outras moléculas efetoras podem incluir radionuclideos quelados como 211In e 90Y, Lu177, Bismuto213, Californio252 , Iridio192 e Tungstênio188/Rênio188; ou fármacos como, sem limitação, alquilfosfocolinas, inibidores de topoisomerase I, taxoides e suramina. Outras moléculas efetoras incluem proteínas, peptideos e enzimas. Enzimas de interesse incluem, sem limitação, enzimas proteoliticas, hidrolases, liases, isomerases, transferases. Proteínas, polipeptideos e peptideos de interesse incluem, sem limitação, imunoglobulinas, toxinas como abrina, ricinA A, exotoxina de pseudomonas, ou toxina diftérica, uma proteina como insulina, fator de necrose tumoral, α-interferon, β- interferon, fator de crescimento de nervo, fator de crescimento derivado de plaquetas ou ativador de plasminogênio tecidual, um agente trombótico ou um agente anti-angiogênico, por exemplo, angiostatina ou endostatina, ou um modificador de resposta biológica como uma linfocina, interleucina-1 (IL-1), interleucina-2 (IL-2), fator estimulante de colônia de granulócito macrófago (GM-CSF), fator estimulante de colônia de granulócito (G-CSF), fator de crescimento de nervo (NGF) ou outro fator de crescimento e imunoglobulinas.
Outras moléculas efetoras podem incluir substâncias detectáveis úteis, por exemplo, em diagnóstico. Exemplos de substâncias detectáveis incluem várias enzimas, grupos proféticos, materiais fluorescentes, materiais luminescentes, materiais bioluminescentes, nuclideos radioativos, metais que emitem positron (para uso em tomografia de emissão de positron), e ions de metal paramagnético não radioativos. Veja, geralmente, Patente U.S. No. 4.741.900, para ions de metal que podem ser conjugados a anticorpos para uso como diagnósticos. Enzimas adequadas incluem peroxidase de raiz forte, fosfatase alcalina, beta-galactosidase ou acetilcolinasterase; grupos proféticos adequados incluem estreptavidina, avidina e biotina; materiais fluorescentes adequados incluem umbeliferona, fluoresceina, isotiocianato de fluoresceina, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceina, dansil cloreto e ficoeritrina; materiais luminescentes adequados incluem luminol; materiais bioluminescentes adequados incluem luciferase, luciferina e aequorina; e nuclideos radioativos adequados incluem 125I, 131I, 211In e "Tc.
Em outro exemplo, a molécula efetora pode aumentar a meia-vida do anticorpo in vivo, e/ou reduz a imunogenicidade do anticorpo e/ou aumenta a liberação de um anticorpo através de uma barreira epitelial ao sistema imune. Exemplos de moléculas efetoras adequadas desse tipo incluem polímeros, albumina, proteínas de ligação a albumina ou compostos de ligação a albumina como aqueles descritos em WO05/117984.
Quando a molécula efetora é um polímero, ele pode, em geral, ser um polímero sintético ou de ocorrência natural, por exemplo, um polímero de polialquileno, polialquenileno ou polioxialquileno de cadeia linear ou ramificada opcionalmente substituído, ou um polissacarideo ramificado ou não ramificado, por exemplo, um homo- ou hetero- polissacarideo.
Substituintes opcionais específicos que podem estar presentes nos polímeros sintéticos acima mencionados incluem um ou mais grupos hidroxi, metil ou metoxi.
Exemplos específicos de polímeros sintéticos incluem poli(etilenoglicol), poli(propilenoglicol) poli(vinilalcohol) de cadeia linear ou ramificada opcionalmente substituído ou derivados destes, especialmente poli(etilenoglicol) opcionalmente substituído como metoxipoli(etilenoglicol) ou derivados destes. Polímeros de ocorrência natural específicos incluem lactose, amilose, dextrana, glicogênio, ou derivados destes.
"Derivados", como aqui usado, devem incluir derivados reativos, por exemplo, grupos reativos seletivos para tiol como maleimidas e outros. O grupo reativo pode ser ligado diretamente ou através de um segmento ligante ao polímero. Deve-se observar que o residuo de tal grupo formará, em alguns casos, parte do produto como o grupo de ligação entre o fragmento de anticorpo e o polímero.
O tamanho do polímero pode ser variado como desejado, mas estará geralmente em uma faixa de peso molecular médio de 500 Da a 5.0000 Da, por exemplo, de 5.000 a 40.000 Da como de 20.000 a 40.000 Da. O tamanho do polímero pode, em particular, ser selecionado com base no uso pretendido do produto, por exemplo, capacidade de se localizar em certos tecidos como tumores ou de estender a meia-vida circulante (para revisão, veja Chapman, 2002, Advanced Drug Delivery Reviews, 54, 531-545) . Portanto, por exemplo, quando se deseja que o produto deixe a circulação e penetre um tecido, por exemplo, para uso no tratamento de um tumor, pode ser vantajoso usar um polímero de baixo peso molecular, por exemplo, com um peso molecular de cerca de 5.000 Da. Para aplicações quando o produto permanece na circulação, pode ser vantajoso usar um polímero de maior peso molecular, por exemplo, que tem um peso molecular na faixa de 20.000 Da a 40.000 Da.
Os polímeros adequados incluem um polímero de polialquileno, como um poli(etilenoglicol) ou, especialmente, um metoxipoli(etilenoglicol) ou um derivado deste, e especialmente com um peso molecular na faixa de cerca de 15.000 Da a cerca de 40.000 Da.
Em um exemplo, os anticorpos para uso na presente invenção são anexados a porções de poli(etilenoglicol) (PEG). Em um exemplo particular, o anticorpo é um fragmento de anticorpo e as moléculas de PEG podem ser anexadas através de qualquer cadeia lateral de aminoácido disponível ou grupo funcional de aminoácido terminal localizado no fragmento de anticorpo, por exemplo, qualquer grupo amino, imino, tiol, hidroxil ou carboxil livre. Tais aminoácidos podem ocorrer naturalmente no fragmento de anticorpo ou podem ser 41/86 projetados no fragmento com o uso de métodos de DNA recombinante (veja, por exemplo, US 5.219.996; US 5.667.425; WO98/25971). Em um exemplo, a molécula de anticorpo da presente invenção é um fragmento Fab modificado em que a modificação é a adição à extremidade C-terminal de sua cadeia pesada de um ou mais aminoácidos para permitir a anexação de uma molécula efetora. Adequadamente, os aminoácidos adicionais formam uma região de dobradiça modificada que contém um ou mais residuos de cisteina aos quais a molécula efetora pode ser anexada. Múltiplos sitios podem ser usados para anexar duas ou mais moléculas de PEG.
As moléculas de PEG são covalentemente ligadas através de um grupo tiol de pelo menos um residue de cisteina localizado no fragmento de anticorpo. Cada molécula de polimero anexada ao fragmento de anticorpo modificado pode ser covalentemente ligada ao átomo de enxofre de um residue de cisteina localizado no fragmento. A ligação covalente será geralmente uma ligação de dissulfeto ou, em particular, uma ligação enxofre-carbono. Quando um grupo tiol é usado como o ponto de anexação, moléculas efetoras adequadamente ativadas, por exemplo, derivados seletivos de tiol como maleimidas e derivados de cisteina, podem ser usados. Um polimero ativado pode ser usado como o material de iniciação na preparação de fragmentos de anticorpo modificados por polimero como acima descrito.
O polimero ativado pode ser qualquer polimero que contenha um grupo reativo tiol como um ácido ou éster a- halocarboxilico ou, por exemplo, iodoacetamida, uma imida, por exemplo, maleimida, uma vinil sulfona ou um dissulfeto. Tais materiais de iniciação podem ser obtidos comercialmente (por exemplo, de Nektar, anteriormente Shearwater Polymers Inc., Huntsville, AL, USA) ou podem ser preparados a partir de materiais de iniciação comercialmente disponíveis com o uso de procedimentos quimicos convencionais. Moléculas de PEG particulares incluem 20K metoxi-PEG-amina (obtida de Nektar, anteriormente Shearwater; Rapp Polymers; and SunBio) e M-PEG-SPA (obtido de Nektar, anteriormente Shearwater).
Em uma modalidade, o anticorpo é um fragmento Fab ou diFab modificado que é PEGquilado, ou seja, tem PEG (poli(etilenoglicol)) covalentemente anexado a ele, por exemplo, de acordo com o método revelado em EP 0948544 ou EP1090037 [veja também, "Poly(ethyleneglycol) Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications", 1992, J. Milton Harris (ed), Plenum Press, New York, "Poly(ethyleneglycol) Chemistry and Biological Applications", 1997, J. Milton Harris and S. Zalipsky (eds), American Chemical Society, Washington DC e "Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences", 1998, M. Aslam and A. Dent, Grove Publishers, New York; Chapman, A. 2002, Advanced Drug Delivery Reviews 2002, 54:531-545]. Em um exemplo, PEG é anexado a uma cisteina na região de dobradiça. Em um exemplo, um fragmento Fab modificado por PEG tem um grupo maleimida covalentemente ligado a um grupo tiol único em uma região de dobradiça modificada. Um residuo de lisina pode ser covalentemente ligado ao grupo maleimida e a cada um dos grupos amina no residuo de lisina pode ser anexado um polimero de metoxipoli(etilenoglicol) que tern um peso molecular de aproximadamente 20.000 Da. 0 peso molecular total do PEG anexado ao fragmento Fab pode ser, portanto, de aproximadamente 40.000 Da.
Em uma modalidade, a presente invenção fornece uma molécula de anticorpo antagonista que tem especificidade para 0X40 humano, que é um fragmento Fab modificado que tem uma cadeia pesada que compreende a sequência apresentada em Id. de Seq. N°: 9 e uma cadeia leve que compreende a sequência apresentada em Id. de Seq. N° : 7, e que tem na extremidade C-terminal de sua cadeia pesada uma região de dobradiça modificada que contém menos um residuo de cisteina ao qual uma molécula efetora é anexada. Adequadamente, a molécula efetora é PEG e é anexada com o uso dos métodos descritos em (WO98/25971 e W02004072116 ou em W02007/003898) . Adequadamente, a molécula efetora é anexada de tal forma que um grupo lisil-maleimida é anexado ao residuo de cisteina na extremidade C-terminal da cadeia pesada, e cada grupo amino do residuo de lisil tem covalentemente ligado a ele um residuo de metoxipoli(etilenoglicol) que tem um peso molecular de cerca de 20.000 Da. O peso molecular total do PEG anexado ao anticorpo é, portanto, aproximadamente 40.000 Da. Moléculas particulares de PEG incluem 2-[3-(N- maleimido)propionamido]etil amida de lisina modificada com N,N'-bis(metoxipoli(etileno glicol) de peso molecular 20.000), também conhecido como PEG2MAL4OK (obtido de Nektar, anteriormente Shearwater).
Fontes alternativas de ligantes de PEG incluem NOF que suprime GL2-400MA2 (em que m na estrutura abaixo é 5) e GL2- 400MA (em que m é 2) e n é aproximadamente 450:
Figure img0001
m é 2 ou 5
Ou seja, cada PEG é de cerca de 20.000 Da.
Moléculas efetoras de PEG alternativas adicionais do seguinte tipo:
Figure img0002
são disponíveis pelo Dr Reddy, NOF e Jenkem.
Em uma modalidade, é fornecido um anticorpo que é PEGuilado (por exemplo, com um PEG aqui descrito), anexado através de um residue de aminoácido cisteina no aminoácido 226 ou por volta do aminoácido 226 na cadeia, por exemplo, aminoácido 226 da cadeia pesada (por numeração sequencial).
Em uma modalidade, a presente invenção fornece uma molécula de anticorpo antagonista que tem especificidade para 0X40 humano, que é um fragmento Fab modificado que tem uma cadeia pesada que compreende ou consiste na sequência apresentada em Id. de Seq. N° : 15 e uma cadeia leve que compreende ou consiste na sequência apresentada em Id. de Seq. N° : 11, e que tem uma molécula efetora anexada à cisteina na posição 226 da cadeia pesada (numeração linear de Id. de Seq. N° : 15). Adequadamente, a molécula efetora é PEG e é anexada com o uso dos métodos descritos em (WO98/25971 ou W02004072116 ou W02007/003898) e um qrupo lisil-maleimida é anexado ao residuo de cisteina na posição 226 da cadeia pesada (Id. de Seq. N° : 15), e cada grupo amino do residuo lisil tem covalentemente ligado a ele um residuo metoxipoli (etilenoglicol) que tem um peso molecular de cerca de 20.000 Da. O peso molecular total do PEG anexado ao anticorpo é, portanto, aproximadamente 40.000 Da. Moléculas de PEG particulares incluem 2-[3-(N- maleimido)propionamido]etil amida de lisina modificada por N, N'-bis(metoxipoli(etileno glicol) de peso molecular 20.000), também conhecido como PEG2MAL4OK (obtido de Nektar, anteriormente Shearwater). Adequadamente, a molécula de anticorpo da presente invenção é um fragmento Fab' modificado PEGuilado como mostrado na Figura 2. Essa molécula PEGuilada é aqui referida como A26Fab'-PEG.
Em outro exemplo, as moléculas efetoras podem ser anexadas aos fragmentos de anticorpo com o uso dos métodos descritos nos pedidos WG2005/003169, WG2005/003170 e W02005/003171 .
A presente invenção também fornece uma sequência de DNA isolada que codifica a cadeia pesada e/ou cadeia leve(s) de uma molécula de anticorpo da presente invenção. Adequadamente, a sequência de DNA codifica a cadeia pesada ou a cadeia leve de uma molécula de anticorpo da presente invenção. A sequência de DNA da presente invenção pode compreender DNA sintético, por exemplo, produzido por processamento quimico, cDNA, DNA genômico, ou qualquer combinação destes.
As sequências de DNA que codificam uma molécula de anticorpo da presente invenção podem ser obtidas por métodos bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica. Por exemplo, sequências de DNA que codificam para parte ou todas as cadeias pesadas e leves do anticorpo podem ser sintetizadas como desejado a partir das sequências de DNA determinadas ou com base nas sequências de aminoácidos correspondentes.
DNA que codifica para sequências de estrutura receptoras é amplamente disponível para aqueles habilitados na técnica e pode ser facilmente sintetizado com base em suas sequências de aminoácidos conhecidas.
Técnicas padrão de biologia molecular podem ser usadas para preparar as sequências de DNA que codificam para a molécula de anticorpo da presente invenção. As sequências de DNA desejadas podem ser sintetizadas completamente ou em parte com o uso de técnicas de sintese de oligonucleotideo. Técnicas de mutagênese direcionada a sitio e reação de cadeia de polimerase (PCR) podem ser usadas como adequado.
Exemplos de sequências adequadas são fornecidos na Figura 1 (h) Id. de Seq. N° : 8; Figura 1 (i) Id. de Seq. N°: 10; Figura 1 (j) Id. de Seq. N° : 13; Figura 1 (k) Id. de Seq. N° : 14; Figura 1 (1) Id. de Seq. N°: 17 e Figura 1 (m) Id. de Seq. N°: 18. Nucleotideos 1-63 em Id. de Seq. N° : 18 e 1-63 em Id. de Seq. N° : 14 codificam a sequência de peptideo de sinal OmpA que é clivada para gerar uma molécula de anticorpo antagonista da presente invenção (o peptideo de sinal corresponde aos residuos de aminoácido 1-21 na Figura 1 (g) Id. de Seq. N°: 16 e 1-21 na Figura 1 (e) Id. de Seq. N° : 12, respectivamente) . A presente invenção também fornece uma sequência de DNA isolada que codifica a cadeia pesada de um anticorpo da presente invenção que compreende Id. de Seq. N° : 17 ou Id. de Seq. N° : 18. A presente invenção também fornece uma sequência de DNA isolada que codifica a cadeia leve de um anticorpo da presente invenção que compreende Id. de Seq. N° : 13 ou Id. de Seq. N°: 14.
A presente invenção também se relaciona a um vetor de clonagem ou vetor de expressão que compreende uma ou mais sequências de DNA da presente invenção. Portanto, é fornecido um vetor de clonagem ou vetor de expressão que compreende uma ou mais sequências de DNA que codificam um anticorpo da presente invenção. Adequadamente, o vetor de clonagem ou vetor de expressão compreende duas sequências de DNA, que codificam a cadeia leve e a cadeia pesada da molécula de anticorpo da presente invenção, respectivamente. Adequadamente, um vetor de acordo com a presente invenção compreende as sequências apresentadas em Id. de Seq. N°: 14 e Id. de Seq. N° : 18. Nucleotideos 1-63 em Id. de Seq. N°: 18 e 1-63 em Id. de Seq. N° : 14 codificam a sequência de peptideo de sinal de OmpA (residuos 1-21 em Id. de Seq. N°: 16 e 1-21 em Id. de Seq. N° : 12, respectivamente) que é mais adequadamente clivada para gerar uma molécula de anticorpo de neutralização da presente invenção. Em um exemplo, o vetor compreende uma sequência intergênica entre a cadeia pesada e a cadeia leve, como IGS2 (veja W003/048208). Portanto, em uma modalidade, o vetor da presente invenção compreende a sequência dada na Figura 1 (n) (Id. de Seq. N°: 19).
Métodos gerais pelos quais os vetores podem ser construídos, métodos de transfecção e métodos de cultura são bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica. Com relação a isso, é feita referência a "Current Protocols in Molecular Biology", 1999, F. M. Ausubel (ed), Wiley Interscience, New York e ao Manual de Maniatis produzido por Cold Spring Harbor Publishing.
Também é fornecida uma célula hospedeira que compreende um ou mais vetores de clonagem ou de expressão que compreendem uma ou mais sequências de DNA que codificam um anticorpo da presente invenção. Qualquer célula hospedeira/sistema de vetor adequado pode ser usado para a expressão das sequências de DNA que codificam a molécula de anticorpo da presente invenção. Sistemas bacterianos, por exemplo, E. coli, e outros sistemas microbianos podem ser usados, ou sistemas eucarióticos, por exemplo, sistemas de expressão de célula hospedeira de mamifero, também podem ser usados. Células hospedeiras de mamifero adequadas incluem células CHO, de mieloma ou de hibridoma.
A presente invenção também fornece um processo para a produção de uma molécula de anticorpo de acordo com a presente invenção que compreende a cultura de uma célula hospedeira que contém um vetor da presente invenção sob condições adequadas para conduzir a expressão de proteina de DNA que codifica a molécula de anticorpo da presente invenção, e isolação da molécula de anticorpo.
A molécula de anticorpo pode compreender apenas um polipeptideo de cadeia pesada ou cadeia leve, em cujo caso apenas um polipeptideo de cadeia pesada ou cadeia leve que codifica a sequência precisa ser usado para transferir as células hospedeiras. Para a produção de produtos que compreendem as cadeias pesadas e cadeias leves, a linhagem de células pode ser transfectada com dois vetores, um primeiro vetor que codifica um polipeptideo de cadeia leve e um segundo vetor que codifica um polipeptideo de cadeia pesada. Alternativamente, um vetor único pode ser usado, o vetor incluindo as sequências que codificam polipeptideos de cadeia leve e cadeia pesada.
Os anticorpos e fragmentos de acordo com a presente revelação são expressos em bons niveis de células hospedeiras. Assim, as propriedades dos anticorpos e/ou fragmentos são otimizadas e conduzem ao processamento comercial.
Como os anticorpos da presente invenção são úteis no tratamento e/ou profilaxia de uma condição patológica, a presente invenção também fornece uma composição farmacêutica ou diagnóstica que compreende uma molécula de anticorpo da presente invenção em combinação com um ou mais de excipientes, diluentes ou veiculos farmaceuticamente aceitáveis. Portanto, é fornecido o uso de um anticorpo da invenção para a confecção de um medicamento. A composição será comumente suprida como parte de uma composição farmacêutica estéril que incluirá normalmente um veiculo farmaceuticamente aceitável. Uma composição farmacêutica da presente invenção pode compreender adicionalmente um adjuvante farmaceuticamente aceitável.
A presente invenção também fornece um processo para a preparação de uma composição farmacêutica ou diagnóstica que compreende a adição e mistura da molécula de anticorpo da presente invenção junto com um ou mais excipientes, diluentes ou veículos farmaceuticamente aceitáveis.
A molécula de anticorpo pode ser o único ingrediente ativo na composição farmacêutica ou diagnóstica ou pode ser acompanhada por outros ingredientes ativos que incluem outros ingredientes de anticorpo, por exemplo, ingredientes de anticorpos, ou não anticorpo anti-TNF, anti-IL-10, anti- célula T, anti-IFNy ou anti-LPS como xantinas. Outros ingredientes ativos adequados incluem anticorpos capazes de induzir tolerância, por exemplo, anticorpos anti-CD3 ou anti-CD4.
Em uma modalidade adicional, o anticorpo, fragmento ou composição de acordo com a revelação é empregado em combinação com um agente farmaceuticamente ativo adicional, por exemplo, um corticosteróide (como propionato de fluticasona) e/ou um beta-2-agonista (como salbutamol, salmeterol ou formoterol) ou inibidores de crescimento e proliferação celular (como rapamicina, ciclofosfamida, metotrexato) ou alternativamente um inibidor de CD28 e/ou CD40. Em uma modalidade, o inibidor é uma molécula pequena. Em outra modalidade, o inibidor é um anticorpo específico para o alvo.
As composições farmacêuticas compreendem uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo da invenção. O termo "quantidade terapeuticamente eficaz" como aqui usado refere- se a uma quantidade de um agente terapêutico necessário para tratar, melhorar ou prevenir uma doença ou condição visada, ou para exibir um efeito terapêutico ou preventivo detectável. Para qualquer anticorpo, a quantidade terapeuticamente eficaz pode ser estimada inicialmente em ensaios de cultura de células ou em modelos animais, comumente em roedores, coelhos, cachorros, porcos ou primatas. O modelo animal também pode ser usado para determinar a faixa de concentração e a via de administração adequadas. Tal informação pode ser então usada para determinar doses úteis e vias para a administração em humanos.
A quantidade terapeuticamente eficaz precisa para um ser humano dependerá da severidade do estado de doença, da saúde geral do indivíduo, da idade, peso e gênero do indivíduo, dieta, tempo e frequência de administração, combinação medicamentosa, sensibilidades de reação e tolerância/resposta à terapia. Essa quantidade pode ser determinada por experimentação rotineira e está dentro da capacidade de julgamento do clinico. Geralmente, uma quantidade terapeuticamente eficaz será de 0,01 mg/kg a 50 mg/kg, por exemplo 0,1 mg/kg a 20 mg/kg. As composições farmacêuticas podem ser convenientemente apresentadas em formas de dose unitária que contêm uma quantidade predeterminada de um agente ativo da invenção por dose.
As composições podem ser administradas individualmente a um paciente ou podem ser administradas em combinação (por exemplo, simultânea, sequencialmente ou separadamente) com outros agentes, fármacos ou hormônios.
A dose em que a molécula de anticorpo da presente invenção é administrada depende da natureza da condição a ser tratada, da extensão da inflamação presente e de se a molécula de anticorpo está sendo usada profilaticamente ou para tratar uma condição existente.
A frequência da dose dependerá da meia-vida da molécula de anticorpo e da duração de seu efeito. Se a molécula de anticorpo tem uma meia-vida curta (por exemplo, 2 a 10 horas) , pode ser necessário administrar uma ou mais doses por dia. Alternativamente, se a molécula de anticorpo tem uma meia-vida longa (por exemplo, 2 a 15 dias) , pode ser necessário apenas administrar uma dosagem uma vez ao dia, uma vez por semana ou ainda uma vez a cada 1 ou 2 meses.
O veiculo farmaceuticamente aceitável não deve induzir a produção de anticorpos danosos ao indivíduo que recebe a composição e não deve ser tóxico. Veiculos adequados podem ser macromoléculas grandes, lentamente metabolizadas como proteínas, polipeptideos, lipossomos, polissacarideos, ácidos poliláticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolimeros de aminoácido e partículas virais inativas.
Sais farmaceuticamente aceitáveis podem ser usados, por exemplo, sais de ácido mineral, como cloridratos, hidrobrometos, fosfatos e sulfatos, ou sais de ácidos orgânicos, como acetatos, propionatos, malonatos e benzoatos.
Veiculos farmaceuticamente aceitáveis em composições terapêuticas podem conter adicionalmente líquidos como água, solução salina, glicerol e etanol. Adicionalmente, substâncias auxiliares, como agentes umectantes ou emulsificantes ou substâncias de tamponamento de pH, podem estar presentes em tais composições. Tais veiculos permitem que as composições farmacêuticas sejam formuladas como comprimidos, pilulas, drágeas, cápsulas, líquidos, géis, xaropes, caldos e suspensões, para ingestão pelo paciente.
Formas adequadas para administração incluem formas adequadas para administração parenteral, por exemplo, por injeção ou infusão, por exemplo, por injeção em bolo ou infusão continua. Quando o produto é para injeção ou infusão, ele pode ter a forma de uma suspensão, solução ou emulsão em um veiculo aquoso ou oleoso, e ele pode conter agentes de formulação, como agentes de suspensão, conservante, estabilizante e/ou de dispersão. Alternativamente, a molécula de anticorpo pode estar em forma seca, para reconstituição antes do uso com um liquido estéril adequado.
Uma vez formulada, as composições da invenção podem ser administradas diretamente ao indivíduo. Os indivíduos a serem tratados podem ser animais. No entanto, em uma ou mais modalidades as composições são adaptadas para administração a seres humanos.
Adequadamente em formulações de acordo com a presente revelação, o pH da formulação final não é similar ao valor do ponto isoelétrico do anticorpo ou fragmento, por exemplo, se o pH da formulação é 7, então um pl de 8-9 ou acima pode ser adequado. Embora não desejando estar atado por teoria, acredita-se que isso possa fornecer finalmente uma formulação final com melhor estabilidade, por exemplo, o anticorpo ou fragmento permanece em solução.
Em uma modalidade, a formulação farmacêutica em um pH na faixa de 4,0 a 7,0 compreende: 1 a 200 mg/mL de um anticorpo de acordo com a presente revelação, 1 a 100 mM de um tampão, 0,001 a 1% de um tensoativo, a) 10 a 500 mM de um estabilizante, b) 10 a 500 mM de um estabilizante e 5 a 500 mM de um agente de tonicidade, ou c) 5a 500 mM de um agente de tonicidade.
Por exemplo, a formulação em pH de aproximadamente 6 pode compreender 1 a 50 mg/mL de anticorpo, 20 mM L-histidina HC1, 240 mM trehalose e 0,02% polissorbato 20. Alternativamente, a formulação em pH de aproximadamente 5,5 pode compreender 1 a 50 mg/mL de anticorpo, 20 mM tampão de citrato, 240 mM sacarose, 20 mM arginina e 0,02% polissorbato 20 .
As composições farmacêuticas desta invenção podem ser administradas por qualquer via, incluindo, sem limitação, as vias oral, intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intramedular, intratecal, intraventricular, transdérmica, transcutânea (por exemplo, veja, WO98/20734), subcutânea, intraperitoneal, intranasal, enteral, tópica, sublingual, intravaginal ou retal. Hiposprays também podem ser usados para administrar as composições farmacêuticas da invenção. Tipicamente, as composições terapêuticas podem ser preparadas como injetáveis, como soluções ou suspensões liquidas. Formas sólidas adequadas para solução, ou suspensão, em veículos líquidos antes da injeção também podem ser preparadas.
A liberação direta das composições será geralmente realizada por injeção, por via subcutânea, intraperitoneal, intravenosa ou intramuscular, ou liberada ao espaço intersticial de um tecido. As composições também podem ser administradas em uma lesão. A dosagem do tratamento pode ser um esquema de dose única ou um esquema de dose múltipla.
Deve-se observar que o ingrediente ativo na composição será uma molécula de anticorpo. Como tal, ele deve ser suscetível à degradação no trato gastrointestinal. Portanto, se a composição está para ser administrada por uma via que usa o trato gastrointestinal, a composição precisará conter agentes que protejam o anticorpo da degradação, mas que liberem o anticorpo uma vez que ele tenha sido absorvido do trato gastrointestinal.
Uma discussão completa de veiculos farmaceuticamente aceitáveis é disponível em "Remington's Pharmaceutical Sciences" (Mack Publishing Company, N.J. 1991).
Em uma modalidade, a formulação é fornecida como uma formulação para administrações tópicas que incluem inalação.
Preparações inaláveis adequadas incluem pós inaláveis, aerossóis que contêm gases propelentes ou soluções inaláveis livres de gases propelentes. Pós inaláveis de acordo com a revelação que contêm a substância ativa podem consistir apenas nas substâncias ativas acima mencionadas ou em uma mistura das substâncias ativas acima mencionadas com excipiente fisiologicamente aceitável.
Esses pós inaláveis podem incluir monossacarideos (por exemplo, glicose ou arabinose), dissacarideos (por exemplo, lactose, sacarose, maltose), oligo- e polissacarideos (por exemplo, dextranas), polialcoóis (por exemplo sorbitol, manitol, xilitol), sais (por exemplo, cloreto de sódio, carbonato de cálcio), ou misturas destes. Mono- ou dissacarideos são adequadamente usados, sendo o uso de lactose ou glicose particularmente, mas não exclusivamente, na forma de seus hidratos.
Partículas para deposição no pulmão requerem um tamanho de partícula de menos que 10 microns, como 1-9 microns, por exemplo, de 0,1 a 5 pm, em particular de 1 a 5 pm. O tamanho de partícula do ingrediente ativo (como o anticorpo ou fragmento) é de importância primária.
Os gases propelentes que podem ser usados para preparar os aerossóis inaláveis são conhecidos na técnica. Gases propelentes adequados são selecionados dentre hidrocarbonetos como n-propano, n-butano ou isobutanol, e halohidrocarbonetos como derivados clorinados e/ou fluorinados de metano, etano, propano, butano, ciclopropano ou ciclobutano. Os gases propelentes acima mencionados podem ser usados isoladamente ou em misturas destes.
Gases propelentes particularmente adequados são derivados halogenados de alcano selecionados de TG 11, TG 12, TG 134a e TG227. Dos hidrocarbonetos halogenados acima mencionados, TG134a (1,1,1,2-tetrafluoretano) e TG227 (1,1,1,2,3,3,3-heptafluorpropano) e misturas destes são particularmente adequados.
Os aerossóis inaláveis que contêm gás propelente também podem conter outros ingredientes como co-solventes, estabilizantes, agentes ativos de superfície (tensoativos), antioxidantes, lubrificantes e meios para o ajuste do pH. Todos esses ingredientes são conhecidos na técnica.
Os aerossóis inaláveis que contêm gás propelente de acordo com a invenção podem conter até 5% por peso de substância ativa. Aerossóis de acordo com a invenção contêm, por exemplo, 0,002 a 5% por peso, 0,01 a 3% por peso, 0,015 a 2% por peso, 0,1 a 2% por peso, 0,5 a 2% por peso ou 0,5 a 1% por peso de ingrediente ativo.
Alternativamente, as administrações tópicas ao pulmão também podem ser por administração de uma formulação em solução ou suspensão liquida, por exemplo, com o emprego de um dispositivo como um nebulizador, por exemplo, um nebulizador conectado a um compressor (por exemplo, o nebulizador Pari LC-Jet Plus(R) conectado a um compressor Pari Master(R) fabricado por Pari Respiratory Equipment, Inc., Richmond, Va.).
O anticorpo da invenção pode ser liberado disperso em um solvente, por exemplo, na forma de uma solução ou uma suspensão. Ele pode ser suspenso em uma solução fisiológica adequada, por exemplo, solução salina ou outro solvente farmacologicamente aceitável ou uma solução tamponada. As soluções tamponadas conhecidas na técnica podem conter 0,05 mg a 0,15 mg de edetato dissódico, 8,0 mg a 9,0 mg de NaCl, 0,15 mg a 0,25 mg de polissorbato, 0,25 mg a 0,30 mg de ácido cítrico anidro, e 0,45 mg a 0,55 mg de citrato de sódio por 1 ml de água de modo a atingir um pH de cerca de 4,0 a 5,0. Uma suspensão pode empregar, por exemplo, anticorpo liofilizado.
As formulações em suspensões ou solução terapêuticas também podem conter um ou mais excipientes. Excipientes são bem conhecidos na técnica e incluem tampões (por exemplo, tampão de citrato, tampão de fosfato, tampão de acetato e tampão de bicarbonato), aminoácidos, uréia, alcoóis, ácido ascórbico, fosfolipideos, proteínas (por exemplo, albumina sérica), EDTA, cloreto de sódio, lipossomos, manitol, sorbitol e glicerol. As soluções ou suspensões podem ser encapsuladas em lipossomos ou microesferas biodegradáveis. A formulação será geralmente fornecida em uma forma substancialmente estéril que emprega processos estéreis de manufatura.
Isso pode incluir a produção e esterilização por filtração do solvente/solução tamponados usados para a formulação, suspensão asséptica do anticorpo na solução de solvente tamponada estéril, e distribuição da formulação em receptáculos estéreis por métodos familiares para aqueles de habilidade comum na técnica.
A formulação nebulizável de acordo com a presente revelação pode ser fornecida, por exemplo, como unidades de dose única (por exemplo, recipientes plásticos selados ou frascos) embalados em envelopes de folha de alumínio. Cada frasco contém uma dose unitária em um volume, por exemplo, de 2 mL, de tampão de solvente/solução.
Os anticorpos aqui revelados podem ser adequados para liberação por meio de nebulização.
Também é contemplado que o anticorpo da presente invenção pode ser administrado pelo uso de terapia gênica. Para realizar isso, as sequências de DNA que codificam as cadeias pesadas e cadeias leves da molécula de anticorpo sob o controle de componentes de DNA adequados são introduzidas em um paciente de tal modo que as cadeias do anticorpo são expressas a partir das sequências de DNA e montadas in situ.
A presente invenção também fornece uma molécula de anticorpo (ou composições que compreendem a mesma) para uso no controle de doenças inflamatórias, por exemplo, doenças inflamatórias agudas ou crônicas. Adequadamente, a molécula de anticorpo (ou composições que compreendem a mesma) pode ser usada para reduzir o processo inflamatório ou para prevenir o processo inflamatório. Em uma modalidade é fornecida uma redução in vivo de células T ativadas, em particular aquelas envolvidas em respostas imunes inflamatórias inadequadas, por exemplo, recrutadas à vizinhança/localização de tal resposta.
A redução de células T ativadas, como aqui empregada, pode ser uma redução de, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou mais por cento em comparação a antes do tratamento ou sem tratamento. Vantajosamente, o tratamento com um anticorpo, fragmento ou composição de acordo com a presente invenção pode permitir a redução no nivel de células T ativadas, sem reduzir o nivel geral de células T dos pacientes (células T não ativadas) . Isso pode resultar em menos efeitos colaterais, e possivelmente prevenir a depleção de células T no paciente.
A presente invenção também fornece a molécula de anticorpo da presente invenção para uso no tratamento ou profilaxia de um distúrbio patológico que é mediado por 0X40 ou associado a um nivel aumentado de 0X40. A condição patológica pode, por exemplo, ser selecionada do grupo que consiste em infecções (virai, bacteriana, fúngica e parasitica), choque endotóxico associado a infecção, artrite, artrite reumatóide, asma, DPOC, doença inflamatória pélvica, doença de Alzheimer, doença inflamatória intestinal, doença de Crohn, colite ulcerativa, doença Peyronie, doença celiaca, doença da vesícula biliar, doença Pilonidal, peritonite, psoriase, vasculite, adesões cirúrgicas, AVC, Diabetes tipo I, doença de Lyme, artrite, meningoencefalite, uveite autoimune, distúrbios inflamatórios imune-mediados do sistema nervoso central e periférico como esclerose múltipla, lúpus (como lúpus eritematoso sistêmico) e sindrome de Guillain-Barré, dermatite Atópica, hepatite autoimune, alveolite fibrosante, doença de Grave, nefropatia por IgA, púrpura trombocitopênica idiopática, doença de Meniere, pênfigo, cirrose biliar primária, sarcoidose, escleroderma, granulomatose de Wegener, outros distúrbios autoimunes, pancreatite, trauma (cirurgia), doença enxerto-versus- hospedeiro, rejeição a transplantes, doença cardiaca incluindo doenças isquêmicas como infarto do miocárdio bem como aterosclerose, coagulação intravascular, reabsorção óssea, osteoporose, osteoartrite, periodontite e hipocloridia.
Em uma modalidade, o anticorpo de acordo com a invenção é empregado no tratamento de alergia, DPOC, doença autoimune ou artrite reumatóide.
A presente invenção também fornece uma molécula de anticorpo de acordo com a presente invenção para uso no tratamento ou profilaxia de dor, particularmente dor associada à inflamação.
A presente invenção também fornece o uso de uma molécula de anticorpo, fragmento ou composição de acordo com a presente invenção na fabricação de um medicamento para o tratamento ou profilaxia de um distúrbio patológico que é mediado por 0X40 ou associado a um nivel aumentado de 0X40; em particular, o distúrbio patológico é artrite reumatóide, asma ou DPOC.
A presente invenção também fornece o uso de uma molécula de anticorpo, fragmento ou composição de acordo com a presente invenção na fabricação de um medicamento para o tratamento ou profilaxia de uma ou mais indicações médicas aqui descritas.
Uma molécula de anticorpo, fragmento ou composição da presente invenção pode ser utilizada em qualquer terapia em que seja desejado reduzir os efeitos de 0X40 no corpo humano ou animal. 0X40 pode ser circulante no corpo ou pode estar presente em um nivel indesejavelmente alto localizado em um sitio particular no corpo, por exemplo, um local de inflamação.
Em uma modalidade, a molécula de anticorpo da presente invenção ou uma composição que compreende a mesma é usada para o controle de doença inflamatória, por exemplo, como aqui descrito.
A presente invenção também fornece um método de tratamento de um ser humano ou animal que sofre ou está em risco de desenvolver um distúrbio mediado por 0X40, o método compreende a administração ao individuo de uma quantidade eficaz da molécula de anticorpo da presente invenção, ou uma composição que compreende a mesma.
Em uma modalidade, é fornecido um processo para a purificação de um anticorpo (em particular um anticorpo ou fragmento de acordo com a invenção) que compreende as etapas de: realização de cromatografia de troca aniônica em modo de não ligação de modo que as impurezas sejam retidas na coluna e o anticorpo seja eluido.
As resinas de troca iônica adequadas para uso no processo incluem resina Q.FF (suprida por GE-Healthcare) . A etapa pode, por exemplo, ser realizada em um pH cerca de 8.
O processo também pode compreender uma etapa de captura inicial que emprega cromatografia de troca catiônica, realizada, por exemplo, em um pH de cerca de 4 a 5, como 4,5. A cromatografia de troca catiônica pode empregar, por exemplo, uma resina como resina CaptoS ou SP sefarose FF (suprida por GE-Healthcare) . O anticorpo ou fragmento pode ser então eluido da resina com o emprego de uma solução salina iônica como cloreto de sódio, por exemplo, em uma concentração de 200 mM.
Portanto, a etapa de cromatografia ou etapas podem incluir uma ou mais etapas de lavagem, como adequado.
O processo de purificação também pode compreender uma ou mais etapas de filtração, como uma etapa de diafiltração.
Um pl acima de 8, como 8,5, 8,6, 8,7, 8,8 ou 9,0, do anticorpo ou fragmento deve ajudar na purificação para fornecer o anticorpo ou fragmento "livre" ou "substancialmente livre" de impurezas, como endotoxina, DNA e proteínas de célula hospedeira.
Assim, em uma modalidade é fornecido um anticorpo ou fragmento de 0X40 purificado, por exemplo, um anticorpo ou fragmento humanizado, em particular, um anticorpo ou fragmento de acordo com a invenção, em forma substancialmente purificadas, em particular, livre ou substancialmente livre de endotoxina e/ou proteina ou DNA de célula hospedeira.
A forma purificada como usado supra deve referir-se a pelo menos 90% de pureza, como 91, 92, 25 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% w/w ou mais pura.
Substancialmente livre de endotoxina deve referir-se geralmente a um teor de endotoxina de 1 EU por mg de produto de anticorpo ou menos que 0,5 ou 0,1 EU por mg de produto.
Substancialmente livre de proteina ou DNA de célula hospedeira deve referir-se geralmente ao teor de proteina e/ou DNA de célula hospedeira de 400 pg por mg de produto de anticorpo ou menos, como 100 pg por mg ou menos, em particular, 20 pg por mg, como adequado.
A molécula de anticorpo da presente invenção também pode ser usada em diagnóstico, por exemplo, no diagnóstico in vivo e imagem de estados de doença que envolvem 0X40.
"Que compreende" no contexto da presente especificação significa "que inclui".
Em que as modalidades tecnicamente adequadas da invenção podem ser combinadas.
As modalidades são aqui descrita como compreendendo certas caracteristicas/elementos. A revelação também se estende a modalidades separadas que consistem ou consistem essencialmente nas referidas caracteristicas/elementos.
A presente invenção é também descrita por via de ilustração apenas nos exemplos a seguir, que fazem referência às Figuras em anexo, em que:
EXEMPLOS Figura 1 em detalhe:
a) Região V de cadeia leve de anticorpo A26 (Id. de Seq. N° : 7) b) Região V de cadeia pesada de anticorpo A26 (Id. de Seq. N° : 9) c) CDRH1 (Id. de Seq. N°: 1), CDRH2 (Id. de Seq. N°: 2), CDRH3 (Id. de Seq. N°: 3), CDRL1 (Id. de Seq. N°: 4), CDRL2 (Id. de Seq. N°: 5), CDRL3 (Id. de Seq. N°: 6) de anticorpo A26) e CDRH2 5 (Id. de Seq. N°: 20) e CDRL1 (Id. de Seq. N°: 21) de anticorpo CA04400026. d) Cadeia leve de anticorpo A26 (Id. de Seq. N° : H) e) Cadeia leve de anticorpo A26 que inclui sequência de sinal (sublinhada) (Id. de Seq. N°: 12) f) Cadeia pesada de anticorpo A26 (Id. de Seq. N°: 15) g) Cadeia pesada de anticorpo A26 que inclui sequência de sinal (sublinhada) (Id. de Seq. N° : 16) h) DNA que codifica a região variável da cadeia leve de anticorpo A26 (Id. de Seq. N°: 8) i) DNA que codifica a região variável da cadeia pesada de anticorpo A26 (Id. de Seq. N° : 10) j) DNA que codifica cadeia leve de anticorpo A26 (Id. de Seq. N°: 13) k) DNA que codifica cadeia leve de anticorpo A26 que inclui sequência de sinal (Id. de Seq. N°: 14) l) DNA que codifica cadeia pesada de anticorpo A26 (Id. de Seq. N°: 17) m) DNA que codifica cadeia pesada de anticorpo A26 que inclui sequência de sinal (Id. de Seq. N°: 18) n) DNA que codifica cadeia pesada e leve de anticorpo A26 que inclui sequências de sinal e sequência intergênica IGS2 (Id. de Seq. N° : 19).
Manipulações de DNA e métodos gerais
Cepa de E. colí INVaF (Invitrogen) foi usada para transformação e crescimento rotineiro de cultura. Enzimas de restrição de DNA e de modificação foram obtidas de Roche Diagnostics Ltd. E New England Biolabs. As preparações de plasmideo foram realizadas com o uso de kits de purificação "Maxi Plasmid" (QIAGEN, catálogo No. 12165). As reações de sequenciamento de DNA foram realizadas com o uso do kit de sequenciamento "ABI Prism Big Dye terminator" (catálogo No. 4304149) e foram colocadas em um sequenciador automatizado ABI 3100 (Applied Biosystems). Os dados foram analisados com o uso do programa AutoAssembler (Applied Biosystems). Oligonucleotideos foram obtidos de Invitrogen. Genes que codificam sequências iniciais de região V foram desenhados e construídos por uma abordagem automatizada de sintese por Entelechon GmbH, e modificados para gerar as versões enxertadas por mutagênese direcionada a oligonucleotideo. A concentração de Fab' foi determinada com o uso de ELISa de montagem de Fab'.
Exemplo 1: Produção e humanização de um anticorpo A26 anti- 0X40 de neutralização
Fêmeas de ratos Sprague Dawly foram imunizadas com proteina de fusão recombinante de 0X4 0 humano e mFC. Anticorpo CA04400026 que se liga a OX-40 humano foi isolado com o uso dos métodos descritos em WO92/02551. Genes para o dominio variável da cadeia pesada (VH) e dominio variável de cadeia leve (VL) de anticorpo CA044_00026 foram isolados e sequenciados após clonagem via PCR de transcrição reversa.
Uma série de regiões de VL e VH humanizadas foi desenhada com o uso de estruturas receptoras de região V- humana e por variação do número de residuos doadores nas regiões de estrutura.
Duas regiões VH enxertadas (gHl e 2) e 8 regiões VL enxertadas (gLl-8) foram desenhadas e os genes foram construídos por montagem de oligonucleotideo e mutagênese de PCR.
Fragmentos Fab' de anticorpo foram construídos para cada enxerto com o uso dos genes que codificam os dominios variáveis humanizados que foram sub-clonados em vetor de expressão de E. coli pTTOD, que contém DNA que codifica o dominio DHI de cadeia pesada humana Cyl (Glml7 alotipo) e o dominio constante de cadeia leve humana C kappa (Klm3 alotipo) (como previamente descrito em W003/048208). A região de dobradiça é truncada e modificada, consiste na troca da sequência de Cys-Pro-Pro-Cys para Cys-Ala-Ala para gerar uma região de dobradiça com um residue de cisteina único disponível para anexação especifica para sitio de uma porção PEG (veja Exemplo 2).
As sequências que codificam o peptideo de sinal OmpA foram anexadas à extremidade 5' dos genes que codificam as cadeias pesadas e cadeias leves. Em expressão, as sequências de sinal visam o transporte de cada polipeptideo ao periplasma bacteriano. Após a translocação através da membrana celular, a sequência de sinal é clivada, produzindo a cadeia pesada e leve de Fab maduro.
O vetor pTTOD que contém cada enxerto foi transformado na cepa hospedeira de E. coll K12 W3110 e os fragmentos Fab' de anticorpo produzidos em E.coli por cultivo de alta densidade celular com o uso de métodos padrão. Os anticorpos foram purificados com o uso de troca catiônica seguido por cromatografia de troca aniônica com o uso de métodos padrão (Humphreys e cols., 2002, Protein Expression and Purification, 26, 309-320) .
Os vários fragmentos Fab' produzidos foram testados na ligação e no bloqueio aqui descritos e cada um foi avaliado em termos de sua expressão em E. coli, sua potência relativa ao anticorpo parente, e sua adequação para purificação e processamento. Isso leva à seleção de enxerto gL8gH2 que foi nomeado A26. As sequências da região V desse enxerto são mostradas na Figura 1 (a) e (b) e em Id. de Seq. Nos: 7 e 9 para a cadeia leve (gL2) e cadeia pesada (gH2), respectivamente.
A estrutura receptora da cadeia pesada é a sequência de linhagem germinativa humana VH3 1-3 3-07 com estrutura 4 vindo dessa porção da região JH humana de linhagem germinativa JH4. A estrutura receptora da cadeia leve é a sequência de linhagem germinativa humana VK1 2-1 1-02, com estrutura 4 vindo dessa porção da região JK humana de linhagem germinativa JK4. Os aminoácidos nas posições 25 37, 73, 78 e 94 (numeração de Rabat) na cadeia pesada de Id. de Seq. N°: 9 são residuos doadores (do anticorpo parente) que são essenciais para a retenção de potência total. O residuo 64 em CDRH2 foi convertido a partir do glutamato doador para a lisina receptora (E64K) para criar uma molécula com um pi maior, mais favorável à purificação de troca iônica. Os aminoácidos nas posições 64 e 71 (numeração de Rabat) na cadeia leve de Id. de Seq. N° : 7 são residuos doadores que são essenciais para a retenção de potência total. Os residuos 27 e 28 em CDR-L1 foram convertidos a partir do glutamato doador e aspartato para a glutamina receptora (E27Q) e serina (D28S) para criar uma molécula com um pi maior, mais favorável à purificação de troca iônica.
As CDRs desse anticorpo são mostradas na Figura 1 (c) , como são as CDRH2 originais (Id. de Seq. N° : 20) e CDRLI (Id. de Seq. N° : 21) que não são modificadas. A cadeia leve e a cadeia pesada de comprimento total são mostradas nas Figuras 1(d) e (f) respectivamente.
Os genes gL8 e gH2 foram redesenhados no nivel de DNA que contém códons para regiões variáveis e constantes otimizados para expressão em E.colí e expressos no vetor pTTOD(Fab') como acima descrito. As sequências de DNA que codificam uma cadeia leve e cadeia pesada são mostradas nas Figuras l(k), Id. de Seq. N°: 14 e (m) Id. de Seq. N°: 18, respectivamente.
A sequência de proteina desse Fab' (incluindo as regiões constantes) é fornecida em Id. de Seq. Nos: 11 e 12 (cadeia leve sem e com peptideo de sinal OmpA) e Id. de Seq. Nos: 15 e 16 (cadeia pesada sem e com peptideo de sinal OmpA). O vetor de expressão dicistrônico pTTOD (A26 IGS2) inclui a sequência fornecida na Figura 1 (n) e Id. de Seq. N°: 19. A sequência contém uma sequência intergênica, IGS2, entre os genes de cadeia leve e cadeia pesada (veja, W003/048208) e a sequência lider de OmpA no inicio de ambos os genes de cadeia leve e pesada.
Exemplo 2: Produção de A26Fab’-PEG
O fragmento Fab' A26 produzdo em E. colí e purificado como descrito no Exemplo 1 foi PEGquilado de acordo com os métodos descritos em WG2007/003898.
O PEG foi anexado à cisteina de dobradiça na posição 226 (numeração linear) da cadeia pesada (Id. de Seq. N°: 15) de modo que um grupo lisil-maleimida foi anexado ao residue de cisteina na posição 226 da cadeia pesada (Id. de Seq. N°: 15), e cada grupo amino do residue lisil tem covalentemente ligado a ele um residue de metoxipoli(etilenoglicol) que tem um peso molecular de cerca de 20.000 Da. O peso molecular total do PEG anexado ao anticorpo foi, portanto, de aproximadamente 40.000 Da, como mostrado na Figura 2.
Exemplo 3: Avaliação da afinidade de A26 e A26Fab'-PEG por 0X40
A tecnologia BIAcore monitora a ligação entre as biomoléculas em tempo real e sem a necessidade por rotulagem. Um dos elementos que interagem, denominado o ligante, é imobilizado diretamente ou capturado na superfície imobilizada, enquanto o outro, denominado o analito, flui em solução pela superfície capturada. O sensor detecta a alteração na massa na superfície sensora à medida que o analito se liga ao ligante para formar um complexo na superfície. Isso corresponde ao processo de associação. A dissociação do analito a partir do ligante é monitorada quando o analito é substituído por tampão. No ensaio de afinidade BIAcore, o ligante é o anticorpo sendo testado e o analito é 0X40 humano.
Instrumento: Biacore ® 3000, Biacore AB, Uppsala, Suécia.
Chip Sensor: CMS (grau de pesquisa) Número do catálogo: BR- 1001-14, Biacore AB, Uppsala, Suécia. Os chips foram estocados a 4°C.
Kit de ligação de amina: Número do catálogo: BR-1000-50, Biacore AB, Uppsala, Suécia Cloridrato de Etil-3-(3- dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC). Feito até 75 mg/mL em água destilada e estocado em alíquotas de 200 pL a -70°C. N-Hidroxissuccinimida (NHS). Feita até 11,5 mg/mL em água destilada e estocada em alíquotas de 200 pL a -70 °C.
1 M cloridrato de etanolamin -NaOH pH 8,5. Estocado em alíquotas de 200 pL a -70°C. tampões: tampão de passagem: HBS-EP (sendo 0,01 M HEPES pH 7,4, 0,15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0,005% tensoativo P20). Número do catálogo: BR-1001-88, Biacore AB, Uppsala, Suécia. Tampão estocado a 4°C.
Tampão de imobilização: Acetato 5,0 (sendo 10 mM acetato de sódio pH 5,0). Número do catálogo: BR-1003-51, Biacore AB, Uppsala, Suécia. Tampão estocado a 4 °C.
Captura de ligante: IgG anti-humana de cabra de fragmento Affinipure F(ab')2, fragmento F(ab')2 especifico. Jackson ImmunoResearch Inc (Pennsylvania, USA) Número do catálogo: 109-006-097. Reagente estocado a 4°C.
Ligante: Anticorpos A26 e A26Fab'-PEG, estocados a 4°C.
Analito: 0X40 humano extracelular (185 aa) dominio fundido ao Fc de IgG2a de murideo (232 aa). (0,5 mg/ml, Ancell No 513-020 lote 142805), estocado a 4°C.
Solução de regeneração: 40 mM HC1 preparado por diluição com água destilada de uma solução de estoque a 11,6 M (BDH, Poole, Inglaterra. Número do catálogo: 101254H).
5 mM NaOH preparado por diluição com água destilada de uma solução de estoque a 50 mM. Número do catálogo: BR-1003-58, Biacore AB, Uppsala, Suécia.
Método de ensaio: O formato do ensaio foi captura do anticorpo por F(ab')2 anti-humano imobilizado, então titulação do dominio extracelular de 0X40 humano pela superfície capturada. Um exemplo do procedimento é dado abaixo:
BIA (Análise de Interação Biamolecular) foi realizado com o uso de BIAcore 3000 (BIAcore AB). IgG anti-humana de cabra de fragmento Affinipure F(ab')2, fragmento F(ab')2 especifico (Jackson ImmunoResearch) foi imobilizado em um Chip Sensor CM5 por meio de quimica de ligação de amina a um nivel de captura de 24.000 unidades de resposta (RUs). Tampão HBS-EP (10 mM HEPES pH 7,4, 0,15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0,005 % Surfactante P20, BIAcore AB) foi usado como o tampão de passagem com uma taxa de fluxo de 10 pl/minuto. Uma injeção de 10 pl de Fab' a 0,5 pg/ml ou Fab'-PEG a 50 pg/ml foi usada para captura pelo IgG-F(ab')2 anti-humano imobilizado. 0X40 humano foi titulado no anticorpo capturado em várias concentrações (25 nM a 0,78 nM) em uma taxa de fluxo de 30 pl/min. A superfície foi regenerada por uma injeção de 10 pl de 40 mM HC1, seguido por uma injeção de 5 pl de 5 mM NaOH em uma taxa de fluxo de 10 pl/min.
Curvas de subtração de ligação de fundo foram analisadas com o uso do programa BIAevaluation (versão 3.2) seguindo procedimentos padrão. Parâmetros cinéticos foram determinados a partir do algoritmo de ajuste.
O valor de afinidade determinado para A26 foi na faixa de 19-45,4 pM e A26Fab'-PEG foi na faixa de 13,7-50,3 pM.
A tabela a seguir mostra dados em réplica para fragmento Fab A26 humanizado não PEGuilado (fab*) e fragmento Fab A26 Fab'-PEG (Fab-PEG**), que se liga a 0X40 humano: Tabela 1
Figure img0003
* média de 5 determinações, ** média de 4 determinações
Exemplo 3a: afinidade baseada em célula e capacidade de bloqueio de ligante de A26Fab'-PEG Afinidade baseadas em célula
Para determinar a afinidade de A26Fab'-PEG por antigeno expresso em superfície celular, experimentos de saturação de ligação foram realizados com o uso de células T ativadas CD4+OX40+, e anticorpo rotulado com FITC. A ligação especifica de anticorpo ao receptor em equilíbrio por uma escala de concentrações de ligante foi usada para determinar KD, assumindo que apenas uma fração muito pequena de anticorpo foi ligada ao receptor em qualquer ponto na curva de ligação.
O equilíbrio de ligação é descrito com o uso da seguinte equação: Receptoriivre + Anticorpouvre *
Figure img0004
Receptor-Anticorpo
A taxa de associação de anticorpo com receptor = kon x [Receptoriivre] x [Anticorpouvre]
A taxa de associação de complexo receptor-anticorpo = KoffX [Receptor-Anticorpo ]
Em equilíbrio, as taxas de associação e dissociação são iguais e podem ser derivadas de uma equação que descreve o isotermo de ligação; em um lote de semi-log, a ligação é sigmoidal. A KD é definida por kOff/kOn e pode ser calculada a partir da curva de ligação como a concentração em que ocorre a meia ligação máxima.
A ligação de A26Fab'-PEG rotulado com FITC a células T ativadas CD4+OX404 humanas foi medida por citometria de fluxo em uma faixa de concentração de 4-log. Uma curva de ligação representativa para A26Fab'-PEG é mostrada na Figura 3. Os valores de KD obtidos em células ativadas de 3 diferentes doadores foram 1,193 nM, 1,071 nM e 1,055 nM.
A KD baseada em célula de A26Fab'-PEG (media 1,106 nM) é significativamente mais fraca que a ligação a 0X40 recombinante medida por BIAcore (31,3 pM) . Isso pode ser devido a inúmeros fatores. A26Fab'-PEG pode ter maior afinidade por 0X40 recombinante expresso como uma proteina de fusão dimérica de Fc, que tem uma estrutura terciária e quaternária diferente que a de 0X40 expresso em superfície celular nativa, previsto para associar como um trimero não covalente na membrana celular (Chan e cols., 2000) . Além disso, a afinidade pode ser alterada por glicosilação diferencial de 0X40 recombinante versus nativo. 0 ambiente tridimensional da membrana celular como convoluções de membrana e proteínas co-localizadas também pode fornecer impedimento estérico, limitando a acessibilidade de 0X40 a A26Fab'-PEG. Consequentemente, a afinidade baseada em célula provavelmente representa uma medição mais próxima da verdadeira afinidade do fármaco in vivo.
Métodos: Ligação de A26Fab’-PEG a células T ativadas CD4+OX40+ humanas.
PBMC foram isoladas por separação em um gradiente Ficoll e ativadas com 1 pg/ml PHA-L por 3 dias a 37°C, 5% CO2, 100% de umidade. As células T CD4+ foram isoladas por seleção negativa com o uso de glóbulos magnéticos (Kit de Isolação de células T CD4+ II para Humanos; Miltenyi Biotec). Aproximadamente 1,2 x 105 células foram incubadas na presença de anticorpo (faixa de concentração final de 10 pg/ml—0,0006 pg/ml (111 nM — 0,0068 nM)) por 2 horas em gelo. As células foram lavadas antes da análise por citometria de fluxo com o uso de um FACScalibur (Becton Dickinson). Duas curvas de titulação foram produzidas, uma com A26Fab'-PEG e uma segunda com gA33 Fab'-PEG como um controle de ligação não especifico. A análise de regressão linear foi usada para subtrair ligação não especifica e a curva de ligação especifica assim gerada foi analisada por regressão não linear (Graphpad Prism®) para determinar KD.
Exemplo 3b: Capacidade de bloqueio do ligante
A capacidade de A26Fab'-PEG de bloquear a interação entre 0X40 expresso em superfície celular e OX40L recombinante foi medida com o uso de um ensaio de bloqueio de ligante baseado em citometria de fluxo.
Resumidamente, células T ativadas CD4+OX40+ humanas foram pré-incubadas com uma titulação de A26Fab'-PEG. OX40L recombinante foi subsequentemente adicionado às células e se ligaram na presença de A26 Fab'-PEG. A proporção de OX40L ligado foi então detectada por citometria de fluxo com o uso de um reagente secundário rotulado. A Figura 4 mostra uma curva de inibição representativa e demonstra que A26Fab'-PEG é capaz de bloquear completamente a ligação de OX40L. A IC50 média para inibição da ligação de OX40L recombinante foi 4,1 nM (n = 2 doadores).
Métodos: Inibição da ligação de OX40L a células T ativadas CD4+OX40+ humanas por A26Fab'-PEG.
PBMCs foram isoladas por separação em um gradiente Ficoll e ativadas com 1 pg/ml PHA-L por 3 dias a 37°C, 5% CO2, 100% de umidade. 2,5 x 105 células foram incubadas na presença de anticorpo (faixa de concentração final de 20 pg/ml — 0,0003 pg/ml (229 nM — 0,0035 nM)) por 10 minutos em gelo. OX40L (biotinylatado CD252 muCD8, Ancell) foi adicionado em uma concentração final de 2 pg/ml e incubado por mais 30 minutes em gelo. As células foram lavadas e a ligação de OX40L detectada por incubação com estreptavadina rotulada com PE (Jackson Immunoresearch) antes da análise por citometria de fluxo com o uso de um FACScalibur (Becton Dickinson). gA33 Fab'-PEG foi usado como um controle não especifico. A curva de inibição foi analisada por regressão não linear (Graphpad Prism(D) para determinar a IC50. Os dados mostrados são de um doador representativo dos dois.
Exemplo 4: Potência de A26Fab'-PEG em ensaios funcionais humanos
Para avaliar sua potência no bloqueio de ligação de OX40-OX40L endógeno durante interações celulares, A26 Fab'- PEG foi testado em uma escala de respostas de célula T humana dirigida por antigeno.
Exemplo 4a: Reação mista de linfócito
Primeiramente desenvolvida em 1964 (Bach e cols., 1964, Science 143, 813-814), a reação mista de linfócito alogênico (MLR) é um modelo in vitro de ativação e proliferação de célula T alo-reativa (O'Flaherty e cols., 2000, Immunology, 100, 289-299) , com o uso de células mononucleares de sangue periférico total (PBMCs) de dois doadores não relacionados. As células T doadoras são ativadas através do reconhecimento de antigenos de complexo de histocompatibilidade alogênicos principais (MHC) em PBMCs estimuladoras doadoras não relacionadas, resultando em proliferação celular e produção de citocina (Lukacs e cols., 1993, Am J Pathology, 143, 1179- 1188) . Foi mostrado que a alo-reação de linfócito T é dirigida pelo antigeno de MHC alogênico e peptideo ligado (Sherman e cols., 1993, Annu. Rev. Immunol, 11, 385-402), sugerindo que uma resposta de MLR pode ser contra antigenos de MHC alogênicos estimuladores e peptideos ligados. A magnitude de uma resposta de MLR está correlacionada com o grau de descombinação de MHC entre o par responsivo- estimulador (Forrester e cols., 2004, Corneai Transplantation: An Immunological Guide to the Clinical Problem, Imperial College Press, 66-67) . Uma resposta de MLR resulta na proliferação de células a partir do doador que responde e a produção de citocinas derivadas de célula T TH1 (IL-2, IFN-y e TNF-α) e TH2 (IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13). Acredita-se que o perfil exato da citocina em um MLR é especifico para o pareamento responsivo-estimulador (Jordan e cols., 2002, J. Immunol. Methods, 260, 1-14). Os ensaios de MLR foram usados amplamente em pesquisa para estudar as vias de ativação de célula T θ rastrear fármacos imunossupressores, e em ambientes clínicos para avaliar a função imune em pacientes com síndrome de imunodeficiência adquirida (AIDS) e possível rejeição a órgão de doador e receptores de transplante (Bromelow e cols., 2001, J. Immunol. Methods, 247, 1-8) .
O efeito de A26Fab'-PEG na ativação e proliferação de célula T alo-reativa humana in vitro foi investigado com o uso de um ensaio MLR essencialmente como descrito por O'Flaherty e cols., 2000. PBMCs de dois doadores não relacionados foram co-cultivadas na presença e ausência de A26Fab'-PEG e a proliferação celular medida por incorporação de 3H-timidina. Como mostrado na Figura 5, A26 Fab'-PEG inibiu a proliferação de célula T em uma maneira dose- dependente com um valor de IC50 de 2,149 nM (0,1877 pg/ml) e uma inibição máxima de 57%. Os sobrenadantes de MLR humano foram analisados em um ensaio de citocina humana "Meso Scale Discovery" (MSD) para investigar o efeito de A26 Fab'-PEG sobre a produção de citocina. A26Fab'-PEGuilado inibiu parcialmente a produção de IFN-y (55% de inibição), IL-13 (50% de inibição) e IL-5 (80% de inibição) no MLR (dados não mostrados).
Método: Inibição da resposta proliferativa de PBMC MLR de uma via alogênica humana por A26Fab’-PEG.
PBMCs humanas de dois doadores não relacionados foram isoladas de sangue total. As células de um doador foram inativadas por irradiação gama para gerar a população estimuladora. As células do doador restante formaram a população responsiva. Populações estimuladoras e responsivas foram misturadas em uma proporção de 1:1 (1 x 105 células/doador) e cultivadas na presença A26Fab'-PEG (Ing- 100 pg/ml) por 6 dias. A33 Fab'-PEG (reagente in-house) foi utilizado como um reagente de controle. A proliferação celular foi medida no 6o dia por incorporação de 3H-timidina (0,5 pCi/cavidade). Os dados são apresentados como percentagem de inibição em relação à resposta responsiva mais estimuladora na ausência de reagente biológico, e são os dados combinados de 10 diferentes pareamentos de doador (média ± SEM). Os valores de ICso foram calculados com o uso de programa Graphpad Prism®. Os resultados são mostrados na Figura 5.
Exemplo 4b: resposta de toxóide tetânico
Toxóide tetânico (TT) induz a fortes respostas imunes especificas de célula T em indivíduos vacinados. Respostas de memória especificas para antigeno, in vitro, ao desafio com TT podem ser detectadas por monitoramento da proliferação e produção de citocina (TH1 & TH2) de PBMC (Bishop e cols., 2005). A26Fab'-PEG inibiu a proliferação e a produção de IL- 5, IL-13, IFN-y e TNF-a (dados não mostrados) em uma maneira dose-dependente, com inibição máxima da proliferação atingindo 38%. Os valores de ICso para a inibição da proliferação, calculados para 2 doadores, foram de 0,58 nM (0,051 pg/ml) e 1,11 nM (0,097 pg/ml). A Figura 6 mostra a curva de inibição da proliferação de A26Fab'-PEG para 1 doador.
Método: A26 Fab'-PEG inibe a proliferação de PBMC expostas a toxóide tetânico.
PBMC foram isoladas por separação em um gradiente de Ficoll e exposta a 1 pg/ml de toxóide tetânico (Calbiochem) na presença de A26Fab'-PEG (faixa de concentração de 5 pg/ml a 0,001 pg/ml) em um volume final de 200 ul por cavidade em uma placa de fundo redondo de 96 cavidades. Depois de 5 dias de incubação a 37°C, 5% CO2, 100% umidade, a proliferação celular foi medida por incorporação de 3H timidina (0,5 pCi/cavidade) em células ativas em divisão. Os resultados de um único doador representativo são apresentados. Os valores de IC50 foram calculados com o uso de programa Graphpad Prism®.
Exemplo 4c: resposta a ácaro
Asma aguda severa pode ser despertada por antigenos inalados como ácaros (Tillie-Leblond e cols., 2005, Allergy, 60, (1), 23-29), incluindo espécies do gênero Dermatophagoides pteronyssínus. Tais alérgenos induzem respostas proliferativas por células do sangue periférico e produção de citocina polarizada de TH2, em pacientes atópicos mas não atópicos (Ling e cols., 2004, Lancet, 363, 608-615). Um ensaio in vitro foi usado para determinar o efeito do bloqueio por 0X40 sobre a produção da citocina IL-13 de TH2 em resposta ao desafio com antigeno. PBMCs foram retiradas de pessoas atópicas com uma pontuação de IgE especifica para alérgeno (BAST) entre 3 e 5 (escala de 0 a 6) e estimuladas com antigeno de Dermatophagoides pteronyssínus na presença de A26Fab'-PEG ou anticorpo de controle. A26Fab'-PEG inibiu a produção de IL-13 a um máximo de 60% com um valor de IC50 de 1,23 nM (Figura 7). Além disso, A26 Fab'-PEG também inibiu potentemente a produção das citocinas IL-4, IL-5 e TNF-a nesse ensaio enquanto aumentou os niveis da citocina IL-10 reguladora (Figura 8).
Método - Figura 7: A26Fab'-PEG inibe a produção de IL-13 de PBMC expostas a extrato alergênico de Dermatophagoides pteronyssínus.
As PBMC foram isoladas de voluntários alérgicos por separação em um gradiente de Ficoll. PBMC purificadas foram expostas a 25 pg/ml de extrato alergênico de Dermatophagoides pteronyssinus (Greer) na presença de anticorpo de teste (faixa de concentração de 10 pg/ml a 0.0005 pg/ml) em um volume final de 200 pl por cavidade em uma placa de fundo redondo de 96 cavidades. Depois de 6 dias de incubação a 37°C, 5% CO2, 100% umidade, os sobrenadantes foram coletados e analisados para teor de IL-13 por ELISA (Biosource). O gráfico representa dados agrupados de três doadores (média ± SEM) . Os valores de IC50 foram calculados com o uso de programa Graphpad Prism®.
Método - Figura 8: A26Fab’-PEG modula a produção de citocina a partir de PBMC exposta a extrato alergênico de Derma tophagoides pteronyssinus.
As PBMC foram isoladas de voluntários alérgicos por separação em um gradiente de Ficoll. PBMC purificadas foram expostas a 25 pg/ml de extrato alergênico de Dermatophagoides pteronyssinus (Greer) na presença de 10 pg/ml A26Fab'-PEG (114 nM) ou controle (TN3 Fab'-PEG) em um volume final de 200 pl por cavidade em uma placa de fundo redondo de 96 cavidades. Depois de 6 dias de incubação a 37°C, 5% CO2, 100% umidade, os sobrenadantes foram coletados e analisados para teor de citocina com o uso de um ensaio de multi-spot (MSD). Os gráficos representam dados agrupados de três doadores (média ± SEM).
Sumário
Os valores de IC50 para A2 6Fab'-PEG em ensaios funcionais humanos são sumarizados na Tabela 2. A potência de A26Fab-PEG é similar em todos os três ensaios e correlaciona bem com a medição de afinidade baseada em célula de 1,106 nM. Nesses ensaios, a proliferação celular e/ou produção de múltiplas citocinas inflamatórias foi significativamente suprimida, demonstrando que A26Fab'-PEGv 5 inibe profundamente a ativação da célula T. Os ensaios de toxóide tetânico e de ácaro medem as respostas de memória por células T de memória, significando que A26Fab'-PEG é capaz de inibir as respostas estabelecidas de célula T a uma variedade de antigenos.Tabela 2 Valores médios de ICso para A26Fab’-PEG em ensaios funcionais humanos in vitro
Figure img0005
A resposta de TH2 de memória atópica ao antigeno de acaro fornece um ensaio relevante in vitro para asma alérgica e os dados sugerem que A26Fab'-PEG pode ser uma terapia 15 eficaz nessa indicação. A co-estimulação de 0X40 foi previamente ligada à inflamação pulmonar em que é sugerido um papel critico na diferenciação de células T CD4+ naive especificas para alérgeno em células TH2 inflamatórias e as respostas de memória de células TH2 de memória (Wang & Liu, 2007, J. Clin. Invest, 117 (12), 3.655-3.657). Durante a inflamação alérgica, a linfopoietina do estroma timico de citocina inata (TSLP) produzida por células epiteliais em estresse gera a maturação de células dendriticas humanas e induz a expressão de OX40L. A função de OX40L de promover a polarização por TH2 de células T CD4+ com um fenótipo inflamatório de produção de TNF-a aumentada mas não de IL- 10 (Ito e cols., 2005, J. Exp. Med, 202 (9), 1.213-1.223). Na resposta de HDM, A26 Fab'-PEG inibiu potentemente as citocinas de TH2 clássicas IL-13, IL-5 e IL-4 bem como TNF- a. Além disso, em dois de quatro doadores alérgicos A26Fab'- PEG aumentou a produção de IL-10. Assim, A26Fab'-PEG pode ter a capacidade não apenas de inibir as respostas alérgicas, mas também de modulá-las para um fenótipo regulador.
Exemplo 5: A26Fab'-PEG inibe a proliferação de célula T CD4+ & CD8+ em um modelo de Hu-SCID.
O modelo de Hu-SCID envolve a reconstituição de camundongos SCID com PBMCs humanas que então despertam uma forte resposta xenogênica contra o camundongo hospedeiro. Essa resposta é seguida pela proliferação de células T humanas no camundongo. Com o uso de dados experimentalmente determinados no PK de A26Fab'-PEG foi desenhado um regime de dosagem que resultou nas concentrações plasmáticas em estado estável de 8, 23 e 34 pg/ml de A26Fab'-PEG. Os dados na Figura 9 demonstram que as células T CD4+ e CD8+ são profundamente inibidas pela manutenção dos niveis plasmáticos em estado estável de A26Fab'-PEG em 8, 23 e 34pg/ml.
Método: A26Fab’-PEG inibe a proliferação de célula T CD4+ e CD8+ em um modelo de Hu-SCID.
Camundongos receberam uma dose subcutânea de 0,825, 2,475 ou 8,25 mg/kg no 2o dia e então diariamente doses de manutenção por via s.c. de 0,25, 0,75 ou 2,5 mg/kg respectivamente. Os camundongos são depletados de células NK por dosagem com TMβl um dia antes da transferência de oito milhões de PBMCs humanas para a cavidade peritoneal no dia 0. O experimento é então terminado no 14° dia e o sangue, fluido de lavagem peritoneal e homogenado esplénico são analisados para células CD4+ & CD8+. No 14° dia os camundongos foram sacrificados por deslocamento cervical e o sangue retirado por punção cardíaca. O número de células CD4+ & CD8+ humanas foi então determinado por análise de FACS. Os dados (n=10) são expressos como médias ± SEM. A diminuição nas células CD4+ & CD8+ no sangue depois da administração de A26Fab'-PEG é mostrada na Figura 9.
Exemplo 6: Reatividade cruzada de A26Fab’-PEG com 0X40 de primata não humano
Para validar o uso de A26Fab'-PEG em modelos de doença de primata não humano (NHP) e toxicologia pré-clinica, sua afinidade relativa e potência funcional foram comparadas em células humanas & NHP.
Afinidade baseada em célula em células NHP
Células T CD4+ de Cynomolgus ou rhesus foram isoladas de sangue periférico e ativadas para expressar altos niveis de 0X40. A afinidade de A26Fab'-PEG foi medida por análise de regressão não linear de curvas de equilíbrio de ligação como mostrado na Figura 3. A26Fab'-PEG mostrou uma queda de menos que 2 vezes na afinidade por células T CD4+ de Cynomolgus ou rhesus quando comparado a humanos, indicando que ele é altamente reativo de forma cruzada (Tabela 3).Tabela 3 - Comparação da afinidade baseada em célula de A26Fab’-PEG em células humanas e NHP.
Figure img0006
PBMC de NHP foram separadas em um gradiente de linfócitos (VH Bio), ativadas com 14g/mL PHA-L por 3 dias a 37°C, 5% CO2, 100% de umidade e as células T CD4+ foram isoladas por seleção negativa com o uso de glóbulos magnéticos (Kit de isolação de célula T CD4+ II para primata não humano; MiltenyiBiotec). As afinidades foram medidas como descrito no Exemplo 3a (Figura 3).
Exemplo 7: Estudo de eficácia no modelo de Cia em macaco Cynomolgus Argumentação para estudo e desenho de estudo
Artrite induzida por colágeno em Cynomolgus é um modelo padrão usado para traçar o perfil de fármacos anti-artriticos potenciais antes de experimento em humanos. Em nossas mãos este modelo responde aos tratamentos direcionados contra TNFa e IL-6. Esses dados são consistentes com os achados clínicos de AR com terápicos equivalentes anti-humanos.
A indução de artrite em macacos cynomolgus requer duas etapas de imunização com colágeno II separadas por um periodo de 3 semanas. Os sintomas da artrite (edema e maciez de uma ou mais articulações) podem ser manifestados em qualquer tempo depois da segunda imunização e foram avaliados semanalmente com o uso de uma pontuação de artrite. O experimento foi feito por 11 semanas no total. 0X40 é uma molécula de co-estimulação e, portanto, deve ser esperada interferência com a função para ter efeitos sobre as fases de imunização do modelo. Três regimes de dosagem com A26 Fab'-PEG foram avaliados. Um grupo recebeu A26Fab'-PEG (100mg/kg) uma vez apenas no dia anterior à primeira imunização. Um segundo grupo recebeu A26 Fab'-PEG (100mg/kg) uma vez apenas no dia anterior à segunda imunização e o terceiro grupo recebeu A26 Fab'-PEG (100mg/kg) um dia antes da primeira e segunda imunizações. Um grupo de controle de animais recebeu um veiculo de tampão de acetato. A instalação da doença no grupo tratado com veiculo foi caracterizada por elevações séricas na proteina C-reativa de proteínas de fase aguda (CRP) e haptoglobina, (biomarcadores que são medidos clinicamente em experimentos de RA) . A integridade das articulações foi avaliada por raios X e por exame histológico.
Resultados e conclusão
Em animais tratados com A26Fab'-PEG no dia anterior à primeira imunização, a severidade da artrite foi geralmente menor que no grupo tratado com veiculo. Essas diferenças na pontuação de artrite foram estatisticamente significativas nos dias 49, 63 e 76. A Figura 10 mostra um resumo geral dos dados pata animais individuais expresso como área sob a curva para pontuações clinicas. A avaliação por raios X da erosão óssea às articulações foi também reduzida (Tabela 4) uma vez que elas eram alterações histopatológicas (Figura 11) . As concentrações de CRP e haptoglobina tenderam a serem menores que no grupo de controle, resultados similares foram obtidos para o grupo de animais que receberam dose de A26Fab'-PEG um dia antes da primeira imunização e um dia antes da segunda imunização. No entanto, não houve efeito anti-artritico convincente observado em animais que recebem A26Fab'-PEG uma vez apenas no dia anterior à segunda imunização. Esses dados mostram um efeito anti-artritico de tratamento anti-OX40 em CIA de cynomolgus e demonstram a importância de 0X40 para o inicio da resposta imune patogênica.
Figura 10: Pontuação de inibição de artrite por A26 Fab’-PEG em CIA de cynomolgus.
Os dados mostram a área sob a curva (AUG) de animal individual para dados de pontuação clinica para animais de controle que recebem tampão de acetato antes da primeira e segunda imunizações (Ac Ac) , animais que recebem antes da primeira imunização (A26 Ac), animais que recebem A26 Fab'- PEG antes da segunda imunização (Ac A26) e animaos que recebem A26 Fab'-PEG antes da primeira e segunda imunizações (A26 A26). Barras são as medias Tabela 4 Efeitos de tratamento com A26 Fab'-PEG sobre as Dontuações de raios X de erosão óssea
Figure img0007
Os animais Ac Ac receberam veiculo de tampão de acetato, Os animais A26 Ac receberam A26Fab'-PEG antes da primeira imunização, animais Ac A26 receberam A26 Fab'-PEG antes da segunda imunização e os animais A26 A26 receberam A26 Fab'- PEG antes da primeira e segunda imunizações. Médias ± s.e.m., *p<0,05, **p<0,01 teste de Wilcoxin.
Método - Figura 11: Redução na pontuação histológica total em CIA de cynomolgus por A26Fab’-PEG.
Os dados mostram as pontuações histológicas totais (incorporação de degeneração de cartilagem e osso, fibrose, tecido de granulação e hiperplasia) para animais individuais no término do estudo. Os animais Ac Ac receberam veiculo de tampão de acetato, os animais A26 Ac receberam A26 Fab'-PEG antes da primeira imunização, os animais Ac A26 receberam A26Fab'-PEG antes da segunda imunização e os animais A26A26 receberam A26 Fab'-PEG antes da primeira e segunda imunizações. Barras são médias.
Será entendido, de fato, que a presente invenção foi descrita por via de exemplo apenas, não pretende ser limitante e que modificações de detalhes podem ser feitas no escopo das reivindicações a seguir. Características preferidas de cada modalidade da invenção são como para cada uma das outras modalidades mutatis mutandis. Todas as publicações, incluindo, sem limitação, patentes e pedidos de patente, citados nesta especificação, são aqui incorporados por referência como se cada publicação individual fosse especificamente e individualmente indicada como sendo incorporada por referência nessa como se totalmente apresentada.

Claims (29)

1. Anticorpo antagonista que se liga ao 0X40 humano e reduz a ligação do 0X40 ao ligante 0X40 caracterizado por compreender: uma cadeia pesada compreendendo um dominio variável que consiste na sequência apresentada em Id. de Seq. N° : 9; e uma cadeia leve compreendendo um dominio variável que consiste na sequência apresentada em Id. de Seq. N° : 7.
2. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a cadeia pesada consiste na sequência apresentada em Id. de Seq. N° : 15.
3. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a cadeia leve consiste na sequência apresentada em Id. de Seq. N° : 11.
4. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo completo com cadeias pesadas e leves de comprimento total.
5. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um fragmento de um anticorpo completo, tal como um fragmento Fab, Fab' modificado, Fab', F(ab')2, Fv, um par VH/VL ou scFv.
6. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender: uma cadeia pesada consistindo na sequência apresentada em Id. de Seq. N°: 15; e uma cadeia leve consistindo na sequência apresentada em Id. de Seq. N°: 11.
7. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado por ter sido modificado para permitir a ligação de uma molécula efetora ou repórter ao anticorpo.
8. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a modificação é a adição à extremidade C-terminal da cadeia pesada do anticorpo de um ou mais aminoácidos para permitir a ligação de uma molécula efetora ou repórter.
9. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que os aminoácidos adicionais formam uma região de dobradiça modificada contendo um ou dois residuos de cisteina aos quais a molécula efetora ou repórter pode estar ligada.
10. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado por ter uma molécula efetora ou repórter ligada ao anticorpo.
11. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por ter uma molécula efetora ligada ao anticorpo, em que a molécula efetora compreende um ou mais polímeros.
12. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o um ou mais polímeros é opcionalmente polímero de polialquileno, polialquenileno ou polioxialquileno de cadeia linear ou ramificada opcionalmente substituído, ou um polissacarideo ramificado ou não ramificado.
13. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 11 ou 12, caracterizado pelo fato de que cada um de o um ou mais polímeros é um metoxipoli(etilenoglicol) ou poli(etilenoglicol).
14. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 13, caracterizado por ter anexado a um dos residuos de cisteina na extremidade C-terminal da cadeia pesada do anticorpo um grupo lisil-maleimida ou lisil bis-maleimida; em que cada grupo amino do residuo lisil tem covalentemente ligado a ele um residuo de metoxipoli(etilenoglicol) que tem um peso molecular de cerca de 20.000 Da.
15. Anticorpo tendo especificidade para 0X40 humano, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ser um fragmento Fab modificado que tem uma cadeia pesada consistindo na sequência apresentada em Id. de Seq. N°: 15 e uma cadeia leve consistindo na sequência apresentada em Id. de Seq. N° : 11 e que tem ligada à cisteina na posição 226 da cadeia pesada do anticorpo um grupo lisil-maleimida; em que cada grupo amino do residuo lisil tem covalentemente ligado a ele um residuo de metoxipoli(etilenoglicol) que tem um peso molecular de cerca de 20.000 Da.
16. Sequência de DNA isolado caracterizado por codificar ambas as cadeias pesada e leve de um anticorpo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, e em que sequência de DNA consiste em sequências de ácidos nucleicos apresentadas em Id. de Seq. N°; 8, 10, 13, 14, 17, 18 ou 19.
17. Vetor de clonagem ou de expressão caracterizado por consistir na sequência de DNA conforme definida na reivindicação 16, e em que o vetor é vetor pTTOD.
18. Vetor, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o vetor consiste nas sequências apresentadas em Id. de Seq. N° : 14 e Id. de Seq. N°: 18.
19. Vetor, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o vetor consiste na sequência apresentada em Id. de Seq. N° : 19.
20. Célula hospedeira microbiana caracterizada por compreender um ou mais vetores de clonagem ou de expressão, conforme definidos em qualquer uma das reivindicações 17 a 19.
21. Processo para a produção de um anticorpo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado por compreender cultivar a célula hospedeira, conforme definida na reivindicação 20, e isolar o anticorpo.
22. Composição farmacêutica caracterizada por compreender um anticorpo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em combinação com um ou mais de um excipiente, diluente ou veiculo farmaceuticamente aceitável.
23. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 22, caracterizada por compreender ainda outros ingredientes ativos.
24. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, ou composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 22 ou 23, caracterizado por ser para uso no tratamento ou profilaxia de um distúrbio patológico, em que o distúrbio patológico é selecionado do grupo consistindo em alergia, doença pulmonar obstrutiva crônica, doença autoimune, artrite reumatóide, asma, doença do enxerto versus hospedeiro, doença inflamatória do intestino, doença de Crohn, colite ulcerativa, diabetes do tipo 1, esclerose múltipla, lúpus eritematoso sistêmico, doença de Graves, rejeição de transplante, granulomatose de Wegener, doença inflamatória pélvica, doença de Peyronie, doença celiaca, peritonite, psoriase, vasculite, meningoencefalite, uveite auto-imune, distúrbios inflamatórios imunomediados do sistema nervoso central e periférico, esclerose múltipla, síndrome de Guillain-Barré, dermatite atópica, hepatite auto-imune, alveolite fibrosante, nefropatia por IgA, púrpura trombocitopênica idiopática, pênfigo, cirrose biliar primária, sarcoidose, esclerodermia e pancreatite.
25. Uso de um anticorpo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado por ser na fabricação de um medicamento para o tratamento ou profilaxia de um distúrbio patológico, em que o distúrbio patológico é selecionado do grupo consistindo em alergia, doença pulmonar obstrutiva crônica, doença autoimune, artrite reumatóide, asma, doença do enxerto versus hospedeiro, doença inflamatória do intestino, doença de Crohn, colite ulcerativa, diabetes do tipo 1, esclerose múltipla, lúpus eritematoso sistêmico, doença de Graves, rejeição de transplante, granulomatose de Wegener, doença inflamatória pélvica, doença de Peyronie, doença celiaca, peritonite, psoriase, vasculite, meningoencefalite, uveite auto-imune, distúrbios inflamatórios imunomediados do sistema nervoso central e periférico, esclerose múltipla, síndrome de Guillain-Barré, dermatite atópica, hepatite auto-imune, alveolite fibrosante, nefropatia por IgA, púrpura trombocitopênica idiopática, pênfigo, cirrose biliar primária, sarcoidose, esclerodermia e pancreatite.
26. Anticorpo ou composição farmacêutica para o uso, conforme definido na reivindicação 24 ou 25, caracterizado pelo fato de que o distúrbio patológico é psoriase.
27. Anticorpo ou composição farmacêutica para o uso, conforme definido na reivindicação 24 ou 25, caracterizado pelo fato de que o distúrbio patológico é lúpus eritematoso sistêmico.
28. Proteina de fusão compreendendo um anticorpo, 10 conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4 ou 6, caracterizada por se ligar ao 0X40 e dois anticorpos de dominio único ligados ao anticorpo que se liga ao 0X40.
29. Proteina de fusão, de acordo com a reivindicação 28, caracterizada pelo fato de que os dois anticorpos de 15 dominio único são um pareamento pesado variável (VH) e pareamento leve variável (VL), e em que os pareamentos VH e VL se ligam à albumina.
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Families Citing this family (54)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5782385B2 (ja) * 2009-02-17 2015-09-24 ユーシービー ファーマ ソシエテ アノニム ヒトｏｘ４０に対する特異性を有する抗体分子
GB0920127D0 (en) 2009-11-17 2009-12-30 Ucb Pharma Sa Antibodies
PT2609118T (pt) * 2010-08-23 2017-03-22 Univ Texas Anticorpos anti-ox40 e métodos de utilização dos mesmos
EP2655409A4 (en) 2010-12-22 2015-07-01 Univ Leland Stanford Junior SUPERAGONISTS AND ANTAGONISTS OF INTERLEUKIN-2
AU2012282116B2 (en) * 2011-07-11 2016-07-07 Ichnos Sciences SA Antibodies that bind to OX40 and their uses
EP2748199B1 (en) * 2011-08-23 2019-08-28 Board of Regents, The University of Texas System Anti-ox40 antibodies and methods of using the same
GB201116092D0 (en) 2011-09-16 2011-11-02 Bioceros B V Antibodies and uses thereof
SG11201401649VA (en) 2011-11-11 2014-07-30 Ucb Pharma Sa Albumin binding antibodies and binding fragments thereof
UA112203C2 (uk) 2011-11-11 2016-08-10 Юсб Фарма С.А. Злитий білок біоспецифічного антитіла, який зв'язується з ox40 людини та сироватковим альбуміном людини
WO2013086419A1 (en) * 2011-12-09 2013-06-13 California Institute Of Technology Polymer scaffolds and their use in the treatment of vision loss
RS58528B1 (sr) 2012-12-03 2019-04-30 Bristol Myers Squibb Co Poboljšanje anti-kancerske aktivnosti imunomodulatornih fc fuzionih proteina
BR112015023862A2 (pt) 2013-03-18 2017-10-24 Biocerox Prod Bv anticorpo isolado, molécula de ácido nucléico isolada, vetor, célula hospedeira, método de realçar uma resposta imune, método de tratar câncer, composição farmacêutica, e, anticorpo agonístico isolado
WO2015042707A1 (en) 2013-09-24 2015-04-02 Medicenna Therapeutics Pte Ltd Interleukin-2 fusion proteins and uses thereof
GB201403775D0 (en) 2014-03-04 2014-04-16 Kymab Ltd Antibodies, uses & methods
WO2015140638A1 (en) * 2014-03-18 2015-09-24 Korea Advanced Institute Of Science And Technology (Kaist) Glycosylated vegf decoy receptor fusion protein
WO2015153514A1 (en) 2014-03-31 2015-10-08 Genentech, Inc. Combination therapy comprising anti-angiogenesis agents and ox40 binding agonists
WO2015164815A1 (en) 2014-04-24 2015-10-29 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Superagonists, partial agonists and antagonists of interleukin-2
KR102433464B1 (ko) 2014-05-28 2022-08-17 아게누스 인코포레이티드 항-gitr 항체 및 이의 사용 방법
TW201619200A (zh) 2014-10-10 2016-06-01 麥迪紐有限責任公司 人類化抗－ｏｘ４０抗體及其用途
CA3224830A1 (en) 2015-01-08 2016-07-14 Biontech Ag Agonistic tnf receptor binding agents
US9512229B2 (en) 2015-03-03 2016-12-06 Kymab Limited Synergistic combinations of OX40L antibodies for the treatment of GVHD
DE112016001013T5 (de) 2015-03-03 2017-12-21 Kymab Limited Antikörper, verwendungen und verfahren
WO2016145085A2 (en) 2015-03-09 2016-09-15 Celldex Therapeutics, Inc. Cd27 agonists
GB201506868D0 (en) 2015-04-22 2015-06-03 Ucb Biopharma Sprl Method for protein purification
MA42043A (fr) 2015-05-07 2018-03-14 Agenus Inc Anticorps anti-ox40 et procédés d'utilisation de ceux-ci
PE20180926A1 (es) 2015-05-29 2018-06-08 Bristol Myers Squibb Co Anticuerpos contra el miembro 4 de la superfamilia del receptor del factor de necrosis tumoral (ox40) y sus usos
EP3356403A2 (en) 2015-10-02 2018-08-08 H. Hoffnabb-La Roche Ag Bispecific antibodies specific for a costimulatory tnf receptor
CN114380908B (zh) * 2015-10-15 2023-03-17 苏州丁孚靶点生物技术有限公司 抗ox40抗体及其应用
CN116063542A (zh) 2015-12-02 2023-05-05 阿吉纳斯公司 抗体和其使用方法
AU2017207318B2 (en) 2016-01-11 2023-12-07 Inhibrx Biosciences, Inc. Multivalent and multispecific OX40-binding fusion proteins
WO2017134292A1 (en) * 2016-02-04 2017-08-10 Glenmark Pharmaceuticals S.A. Anti-ox40 antagonistic antibodies for the treatment of atopic dermatitis
EP3471754A1 (en) 2016-06-20 2019-04-24 Kymab Limited Anti-pd-l1 antibodies
CN109963871A (zh) 2016-08-05 2019-07-02 豪夫迈·罗氏有限公司 具有激动活性的多价及多表位抗体以及使用方法
PT3347379T (pt) 2016-08-17 2020-02-18 Compugen Ltd Anticorpos anti-tígitos, anticorpos anti-pvrig e as suas combinações
WO2018083248A1 (en) 2016-11-03 2018-05-11 Kymab Limited Antibodies, combinations comprising antibodies, biomarkers, uses & methods
CA3041340A1 (en) 2016-11-09 2018-05-17 Agenus Inc. Anti-ox40 antibodies, anti-gitr antibodies, and methods of use thereof
JP7348072B2 (ja) 2017-06-01 2023-09-20 コンピュジェン リミテッド 三重併用抗体療法
JP7433051B2 (ja) 2017-06-19 2024-02-19 メディシナ セラピューティクス インコーポレイテッド Ｉｌ－２スーパーアゴニスト、アゴニスト、およびそれらの融合体の使用および方法
EP3762400A4 (en) * 2018-03-08 2022-03-16 Magenta Therapeutics, Inc. ANTI-CD252 ANTIBODIES, CONJUGATES AND METHODS OF USE
US20210251994A1 (en) 2018-06-15 2021-08-19 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Increasing immune activity through modulation of postcellular signaling factors
TW202019968A (zh) 2018-08-13 2020-06-01 美商英伊布里克斯公司 Ox40結合多肽及其用途
US20210355216A1 (en) 2018-10-05 2021-11-18 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Methods and systems for controlling the agonistic properties of antibody variable domains by light
US10442866B1 (en) * 2019-01-23 2019-10-15 Beijing Mabworks Biotech Co. Ltd Antibodies binding OX40 and uses thereof
EP3962493A2 (en) 2019-05-03 2022-03-09 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Methods of modulating immune activity/level of irf or sting or of treating cancer, comprising the administration of a sting modulator and/or purinergic receptor modulator or postcellular signaling factor
EP3766481A1 (en) * 2019-07-19 2021-01-20 Ichnos Sciences SA Liquid antibody formulation
PE20221506A1 (es) 2019-12-17 2022-10-04 Amgen Inc Agonista doble de interleucina-2/receptor de tnf para uso en terapia
US20230114107A1 (en) 2019-12-17 2023-04-13 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Combination anti-cancer therapies with inducers of iron-dependent cellular disassembly
EP4172323A1 (en) 2020-06-29 2023-05-03 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Viruses engineered to promote thanotransmission and their use in treating cancer
TW202241935A (zh) 2020-12-18 2022-11-01 美商世紀治療股份有限公司 具有可調適受體專一性之嵌合抗原受體系統
US20220325287A1 (en) 2021-03-31 2022-10-13 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Thanotransmission polypeptides and their use in treating cancer
AU2022303363A1 (en) 2021-06-29 2024-01-18 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Immune cells engineered to promote thanotransmission and uses thereof
WO2023064958A1 (en) 2021-10-15 2023-04-20 Compugen Ltd. Combination therapy with anti-pvrig antibodies formulations, anti-tigit antibodies, and anti-pd-1 antibodies
WO2023198851A1 (en) 2022-04-14 2023-10-19 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Methods for controlling the tumor cell killing by light
US20240174732A1 (en) 2022-10-05 2024-05-30 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Nucleic acid molecules encoding trif and additional polypeptides and their use in treating cancer

Family Cites Families (78)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4741900A (en) 1982-11-16 1988-05-03 Cytogen Corporation Antibody-metal ion complexes
GB8422238D0 (en) 1984-09-03 1984-10-10 Neuberger M S Chimeric proteins
DK336987D0 (da) 1987-07-01 1987-07-01 Novo Industri As Immobiliseringsmetode
GB8719042D0 (en) 1987-08-12 1987-09-16 Parker D Conjugate compounds
US5677425A (en) 1987-09-04 1997-10-14 Celltech Therapeutics Limited Recombinant antibody
GB8720833D0 (en) 1987-09-04 1987-10-14 Celltech Ltd Recombinant dna product
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
ATE151110T1 (de) 1988-09-02 1997-04-15 Protein Eng Corp Herstellung und auswahl von rekombinantproteinen mit verschiedenen bindestellen
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5750373A (en) 1990-12-03 1998-05-12 Genentech, Inc. Enrichment method for variant proteins having altered binding properties, M13 phagemids, and growth hormone variants
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
GB8907617D0 (en) 1989-04-05 1989-05-17 Celltech Ltd Drug delivery system
US5859205A (en) * 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
US5780225A (en) 1990-01-12 1998-07-14 Stratagene Method for generating libaries of antibody genes comprising amplification of diverse antibody DNAs and methods for using these libraries for the production of diverse antigen combining molecules
WO1991010737A1 (en) 1990-01-11 1991-07-25 Molecular Affinities Corporation Production of antibodies using gene libraries
AU633698B2 (en) 1990-01-12 1993-02-04 Amgen Fremont Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
EP0542810A1 (en) 1990-08-02 1993-05-26 B.R. Centre Limited Methods for the production of proteins with a desired function
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
WO1992003918A1 (en) 1990-08-29 1992-03-19 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5698426A (en) 1990-09-28 1997-12-16 Ixsys, Incorporated Surface expression libraries of heteromeric receptors
JP3672306B2 (ja) 1991-04-10 2005-07-20 ザ スクリップス リサーチ インスティテュート ファージミドを使用するヘテロ二量体受容体ライブラリー
GB9112536D0 (en) 1991-06-11 1991-07-31 Celltech Ltd Chemical compounds
GB9113120D0 (en) 1991-06-18 1991-08-07 Kodak Ltd Photographic processing apparatus
GB9120467D0 (en) 1991-09-26 1991-11-06 Celltech Ltd Anti-hmfg antibodies and process for their production
ATE275198T1 (de) 1991-12-02 2004-09-15 Medical Res Council Herstellung von antikörpern auf phagenoberflächen ausgehend von antikörpersegmentbibliotheken.
US5733743A (en) 1992-03-24 1998-03-31 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
US5821332A (en) * 1993-11-03 1998-10-13 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Receptor on the surface of activated CD4+ T-cells: ACT-4
WO1995015982A2 (en) 1993-12-08 1995-06-15 Genzyme Corporation Process for generating specific antibodies
WO1995020401A1 (en) 1994-01-31 1995-08-03 Trustees Of Boston University Polyclonal antibody libraries
US6242566B1 (en) * 1994-02-10 2001-06-05 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Ligand (ACT-4-L) to a receptor on the surface of activated CD4+ T-cells
FR2716640B1 (fr) 1994-02-28 1996-05-03 Procedes Machines Speciales Dispositif de centrage et de blocage d'une pièce en vue de son rodage à l'aide d'un rodoir à expansion.
US5516637A (en) 1994-06-10 1996-05-14 Dade International Inc. Method involving display of protein binding pairs on the surface of bacterial pili and bacteriophage
JP2978435B2 (ja) 1996-01-24 1999-11-15 チッソ株式会社 アクリロキシプロピルシランの製造方法
US5980898A (en) 1996-11-14 1999-11-09 The United States Of America As Represented By The U.S. Army Medical Research & Material Command Adjuvant for transcutaneous immunization
GB9625640D0 (en) 1996-12-10 1997-01-29 Celltech Therapeutics Ltd Biological products
GB9812545D0 (en) 1998-06-10 1998-08-05 Celltech Therapeutics Ltd Biological products
GB0123276D0 (en) * 2001-09-27 2001-11-21 Imp College Innovations Ltd Uses of agents that bind immune-system components
US6908963B2 (en) 2001-10-09 2005-06-21 Nektar Therapeutics Al, Corporation Thioester polymer derivatives and method of modifying the N-terminus of a polypeptide therewith
GB0124317D0 (en) * 2001-10-10 2001-11-28 Celltech R&D Ltd Biological products
GB0129105D0 (en) 2001-12-05 2002-01-23 Celltech R&D Ltd Expression control using variable intergenic sequences
US20040009174A1 (en) 2001-12-18 2004-01-15 Arndt Gregory Martin Method of treating asthma
US7291331B1 (en) * 2002-09-11 2007-11-06 La Jolla Institute For Allergy And Immunology Methods of treating OX40 medicated recall immune responses
US20040146948A1 (en) * 2002-10-18 2004-07-29 Centenary Institute Of Cancer Medicine And Cell Biology Compositions and methods for targeting antigen-presenting cells with antibody single-chain variable region fragments
US7993864B2 (en) 2002-12-03 2011-08-09 Ucb Pharma S.A. Assay for identifying antibody producing cells
GB0303337D0 (en) 2003-02-13 2003-03-19 Celltech R&D Ltd Biological products
GB0312481D0 (en) 2003-05-30 2003-07-09 Celltech R&D Ltd Antibodies
GB0315457D0 (en) 2003-07-01 2003-08-06 Celltech R&D Ltd Biological products
GB0315450D0 (en) 2003-07-01 2003-08-06 Celltech R&D Ltd Biological products
US7989594B2 (en) 2003-07-01 2011-08-02 Celltech R & D Limited Modified antibody fab fragments
ITRM20030601A1 (it) * 2003-12-24 2005-06-25 Lay Line Genomics Spa Metodo per l'umanizzazione di anticorpi e anticorpi umanizzati con esso ottenuti.
GB0411186D0 (en) 2004-05-19 2004-06-23 Celltech R&D Ltd Biological products
GB0412181D0 (en) 2004-06-01 2004-06-30 Celltech R&D Ltd Biological products
TWI309240B (en) 2004-09-17 2009-05-01 Hoffmann La Roche Anti-ox40l antibodies
CA2528903C (en) * 2004-12-20 2008-01-15 Honda Motor Co., Ltd. Braking device for motorcycle
US7592429B2 (en) * 2005-05-03 2009-09-22 Ucb Sa Sclerostin-binding antibody
ITRM20050290A1 (it) 2005-06-07 2006-12-08 Lay Line Genomics Spa Uso di molecole in grado di inibire il legame tra ngf e il suo recettore trka come analgesici ad effetto prolungato.
GB0513852D0 (en) 2005-07-06 2005-08-10 Celltech R&D Ltd Biological products
GB0514779D0 (en) 2005-07-19 2005-08-24 Celltech R&D Ltd Biological products
TWI461436B (zh) * 2005-11-25 2014-11-21 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd 人類ｃｄ１３４（ｏｘ４０）之人類單株抗體及其製造及使用方法
JP2009518320A (ja) 2005-12-05 2009-05-07 シュムフォウエン アクティーゼルスカブ 抗オルトポックスウイルス組換えポリクローナル抗体
US20100015143A1 (en) 2006-03-22 2010-01-21 Tracy Hussell Compositions and Methods Relating to Modulation of Immune System Components
US20070224627A1 (en) * 2006-03-23 2007-09-27 Lawrence Horowitz Facilitation of translocation of molecules through the gastrointestinal tract
RU2009135824A (ru) * 2007-02-27 2011-04-10 Дженентек, Инк. (Us) Антитела-антагонисты против ох40 и их применение в лечении воспалительных и аутоиммунных заболеваний
EP2535349A1 (en) 2007-09-26 2012-12-19 UCB Pharma S.A. Dual specificity antibody fusions
EP3239178A1 (en) 2007-12-14 2017-11-01 Bristol-Myers Squibb Company Binding molecules to the human ox40 receptor
JP5782385B2 (ja) * 2009-02-17 2015-09-24 ユーシービー ファーマ ソシエテ アノニム ヒトｏｘ４０に対する特異性を有する抗体分子
EP2475682B1 (en) * 2009-09-10 2018-01-31 UCB Biopharma SPRL Multivalent antibodies
GB0920127D0 (en) * 2009-11-17 2009-12-30 Ucb Pharma Sa Antibodies
GB201000467D0 (en) * 2010-01-12 2010-02-24 Ucb Pharma Sa Antibodies
AU2012282116B2 (en) * 2011-07-11 2016-07-07 Ichnos Sciences SA Antibodies that bind to OX40 and their uses
UA112203C2 (uk) * 2011-11-11 2016-08-10 Юсб Фарма С.А. Злитий білок біоспецифічного антитіла, який зв'язується з ox40 людини та сироватковим альбуміном людини

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