KR20110128301A - 인간 ｏｘ４０에 대한 특이성을 갖는 항체 분자 - Google Patents

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앤드류 조지 팝플웰
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Abstract

본 발명은 인간 OX40의 항원 결정부위에 대한 특이성을 가진 항체 분자, 항체 분자의 치료 용도, 및 상기 항체 분자의 생성 방법에 관한 것이다.

Description

인간 ＯＸ４０에 대한 특이성을 갖는 항체 분자{ANTIBODY MOLECULES HAVING SPECIFICITY FOR HUMAN OX40}
본 발명은 OX40의 항원 결정부위에 대한 특이성을 가진 항체 분자 및 그를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 항체 분자의 치료 용도, 상기 항체 분자의 조성물 및 제조 방법에 관한 것이다.
OX40 (CD134, TNFRSF4, ACT35 또는 TXGP1L로서도 공지됨)은 4-1BB, CD27, CD30 및 CD40을 포함하는 TNF 수용체 수퍼패밀리의 구성원이다. OX40의 세포외 리간드 결합 도메인은 3개의 완전 시스테인-풍부 도메인 (CRD) 및 부분적인 제4 C-말단 CRD로 구성된다 (Bodmer et al., 2002, Trends Biochem Sci, 27, 19-26).
OX40에 대한 리간드는 OX40L이고, OX40의 3개 카피가 삼량체성 리간드에 결합하여 OX40-OX40L 복합체를 형성한다 (Compaan and Hymowitz, 2006, Structure, 14, 1321-1330). OX40은 막-결합형 수용체이지만; 가용형 이소형이 또한 검출되었다 (Taylor and Schwarz, 2001, J. Immunol. Methods, 255, 67-72). 가용형 형태의 기능적 유의성은 현재 알려져 있지 않다. OX40은 휴지기 T 세포 상에서 발현되는 것이 아니라, T 세포 수용체 (TCR)의 라이게이션 (ligation) 후에 활성화된 T 세포 상에서 일시적으로 발현된다. OX40에 대한 리간드인 OX40L은 TNF 패밀리의 구성원이고, B 세포, 대식세포, 내피 세포 및 수지상 세포 (DC)를 비롯한 활성화된 항원 제시 세포 (APC) 상에서 발현된다.
OX40은 주요 동시자극 수용체이고, 여기서 최적 T 세포 증식 및 생존을 위해 CD28 및 OX40의 순차적인 연결이 요구된다. 활성화된 T 세포 상에서 OX40의 라이게이션은 CD4+ 및 CD8+ T 세포 모두의 향상된 시토카인 생성 및 증식을 일으키고 ([Gramaglia et al., 2000, J. Immunol., 165, 3043-3050], [Bansal-Pakala et al., 2004, J. Immunol., 172, 4821-425]), 진행 중의 Th1 및 Th2 반응 모두에 기여할 수 있다 ([Gramaglia et al., 1998, J. Immuno, 161, 6510-6517], [Arestides et al., 2002, Eur. J. Immunol 32, 2874-2880]). OX40 동시자극은 면역 반응의 초기 효과기 상을 넘어 T 세포 생존을 연장시키고, 효과기 T 세포 사멸의 억제를 통해 기억 T 세포의 수를 증가시킨다.
면역 활성화가 과도하거나 제어되지 않을 때, 병리학적 알레르기, 천식, 염증, 자가면역 및 다른 관련 질환이 일어날 수 있다. OX40은 면역 반응을 향상시키는 기능을 하기 때문에, 자가면역 및 염증성 질환을 악화시킬 수 있다.
질환 모델에서 OX40/OX40L 상호작용의 역할이 OX40 낙아웃 (knockout) 마우스에서 입증되었다. 다발 경화증의 모델인 실험적 알레르기 뇌척수염 (EAE)에서, 질환의 덜 심한 임상 징후 및 CNS 내에 감소된 염증성 침윤물이 OX40 낙아웃 마우스에서 보였다 (Carboni et al., 2003, J. Neuroimmunology, 145, 1-11). 또한, 난알부민으로 프라이밍하고 추가접종한 OX40 낙아웃 마우스는 감소된 폐 염증 (호산구증가증의 80 - 90% 감소), 감소된 점액 생성, 및 유의하게 약화된 기도 과다반응성을 보인다 (Jember et al., 2001, J. Exp. Med., 193, 387-392). 뮤린 OX40 리간드에 대한 모노클로날 항체는 류마티스 관절염의 콜라겐-유도된 관절염 모델 (Yoshioka et al., 2000, Eur. J. Immunol., 30, 2815-2823), EAE (Nohara et al., 2001, J. Immunol., 166, 2108-2115), 비-비만 당뇨 (NOD) 마우스 (Pakala et al., 2004, Eur. J. Immunol., 34, 3039-3046), T 세포 회복된 마우스에서 대장염 ([Malmstrom et al., 2001, J. Immunol., 166, 6972-6981], [Totsuka et al., 2003, Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol., 284, G595-G603]) 및 폐 염증의 모델 (Salek-Ardakani et al., 2003, J. Exp. Med., 198, 315-324], [Hoshino et al., 2003, Eur. J. Immunol., 33, 861-869])에서 유익한 효과를 보였다. 인간 OX40L에 대한 항체는 붉은털 (rhesus) 원숭이에서 폐 염증 모델에서 프로파일링되었고, 알레르기원 추가접종 후에 기관지폐포 세척액 내에서 IL-5, IL-13 및 효과기 기억 T 세포의 수준이 감소되었다 (Seshasayee et al., 2007, J. Clin. Invest, 117, 3868-3878).
OX40 발현의 증가가 몇몇 자가면역 및 염증성 질환에서 인지되었다. 이것은 류마티스 관절염 환자의 윤활액으로부터 단리된 T 세포 상에서 OX40 발현의 증가를 포함한다 ([Brugnoni D et al., 1998, Br. J. Rheum., 37, 584-585], [Yoshioka et al., 2000, Eur. J. Immunol., 30, 2815-2823], [Giacomelli R et al., 2001, Clin. Exp. Rheumatol., 19, 317-320]). 이와 유사하게, OX40 발현의 증가가 궤양 대장염 및 크론 (Crohn) 병이 있는 환자로부터의 위장관 조직 ([Souza et al., 1999, Gut, 45, 856-863]; [Stuber et al., 2000, Eur. J. Clin. Invest., 30, 594-599]) 및 다발 경화증 환자의 활성 병변 (Carboni et al., 2003, J. Neuroimmunology, 145, 1-11)에서 인지되었다. OX40L은 또한 인간 기도 평활근 (ASM) 및 천식 환자에서 검출될 수 있다. ASM 세포는 OX40L 라이게이션에 대해 건강한 공여자보다 더 큰 염증성 반응을 보이고, 이는 천식에서 OX40/OX40L 경로에 대한 역할을 나타낸다 ([Burgess et al., 2004, J. Allergy Clin. Immunol., 113, 683-689]; [Burgess et al., 2005, J. Allergy Clin. Immunol., 115, 302-308]). 전신 홍반성 루푸스 (SLE) 환자의 말초 혈액으로부터 단리된 CD4+ T 세포가 질환 활성과 연관된 상승된 수준의 OX40을 발현하는 것이 또한 보고되었다 (Patschan et al., 2006, Clin. Exp. Immunol., 145, 235-242).
알레르기, 천식 및 자가면역 및 염증과 연관된 질환에서 OX40의 역할이 알려져 있으므로, 이들 질환에서 치료를 위한 하나의 방법은 항-OX40L 항체 또는 길항성 항-OX40 항체의 사용을 통해 OX40-OX40L 신호전달을 차단하는 것이다.
항-OX40L 항체는 문헌에 설명되었다 (예를 들어 WO2006/029879 참조). 수많은 길항성 항-OX40 항체가 설명되었지만, 매우 적은 길항성 항-OX40 항체가 알려져 있다. OX40 및 OX40L 사이의 상호작용을 차단하는 토끼 폴리클로날 항-마우스 OX40 항체는 문헌 [Stuber et al., 1996, J. Exp. Med., 183, 979-989]에 의해 생산되었다. 인간 OX40에 결합하는 마우스 모노클로날 항체, 131 및 315는 문헌 [Imura et al., 1996, J. Exp. Med., 2185-2195]에 기재된 바와 같이 생성하였다.
완전 인간 길항성 항체는 WO2007/062245에 설명되었고, 이들 항체의 최고 친화도는 11 nM의 세포 표면 발현된 OX40 (활성화된 T 세포)에 대한 친화도를 가졌다.
인간화 길항성 항체는 WO2008/106116에 설명되었고, OX40에 대한 최상의 친화도를 갖는 항체는 0.94 nM의 친화도를 가졌다.
뮤린 L106 (미국 특허 6,277,962) 및 뮤린 ACT35 (이바이오사이언스 (eBioscience)로부터 상업상 이용가능함)를 포함한 다른 항-OX40 항체가 설명되었다.
따라서, 당업계에서 환자를 치료하기 위해 적합한 개선된 항-OX40 항체가 여전히 필요하다.
본 발명자들은 본 발명에서 OX40에 의해 매개되거나 증가된 수준의 OX40과 연관된 병리학적 장애의 치료 또는 예방에 사용하기에 적합한 고친화도 길항성 항-OX40 항체를 확인하였다.
도 1은 본원에 따른 항체에 관한 특정 아미노산 또는 DNA 서열을 보여준다.
도 2는 A26 Fab'-PEG 포맷의 항체의 개략도이다.
도 3은 세포 표면 OX40에 대한 A26 Fab'-PEG 항체의 세포-기반 친화도를 보여준다.
도 4는 A26 Fab'-PEG 항체에 의한 활성화된 T 세포에 대한 OX40L 결합의 억제 %를 보여준다.
도 5는 인간 MLR에서 A26 Fab'-PEG 항체에 의한 T 세포 증식의 억제 %를 보여준다.
도 6은 파상풍 톡소이드 (Tetanus Toxoid)에 노출된 PBMC의 증식의 A26 Fab'-PEG 억제를 보여준다.
도 7은 더마토파고이데스 테로니시누스 (Dermatophagoides pteronyssinus: 세로무늬먼지진드기) 알레르기원 추출물에 노출된 PBMC로부터 IL-13 생성의 A26 Fab'-PEG 억제 %를 보여준다.
도 8은 더마토파고이데스 테로니시누스 알레르기원 추출물에 노출된 PBMC로부터 시토카인 생성의 A26 Fab'-PEG 억제 %를 보여준다.
도 9는 A26 Fab'-PEG가 Hu-SCID 모델에서 CD4+ 및 CD8+ T 세포 증식을 억제함을 보여준다.
도 10은 생체내 모델에서 A26 Fab'-PEG에 의한 관절염 스코어 (score) (곡선하 면적으로서)의 억제를 보여준다.
도 11은 관절염에 대한 생체내 모델에서 총 조직학 스코어를 보여준다.
그로부터 인간화 항체가 유래하는 원래의 래트 항체를 본원에서 CA044_00026로서 칭한다.
일반적으로 Fab 단편 또는 다른 단편의 형태로 존재하는 인간화 CA044_00026은 A26으로서 칭한다.
도 2에 제시된 포맷의 PEG화 항체 "A26"은 본원에서 A26Fab'-PEG로서 칭한다.
항체 가변 도메인 내의 잔기는 통상적으로 문헌 [Kabat et al.]에 고안된 시스템에 따라 넘버링하였다. 상기 시스템은 문헌 [Kabat et al., 1987, in Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, USA (이하 "Kabat et al. (상기 문헌)")]에 제시되어 있다. 상기 넘버링 시스템을 달리 지시하는 경우를 제외하고 본 명세서에서 사용한다.
카바트 잔기 명칭이 아미노산 잔기의 선형 넘버링과 항상 직접적으로 일치하지는 않는다. 실제 선형 아미노산 서열은 염기성 가변 도메인 구조의 프레임워크이든지 상보성 결정 영역 (CDR)이든지, 구조적 성분의 단축 또는 그 안으로의 삽입에 상응하는 엄격한 카바트 넘버링에서보다 더 적은 또는 추가의 아미노산을 함유할 수 있다. 잔기의 정확한 카바트 넘버링은 "표준" 카바트 넘버링된 서열을 갖는 항체의 서열에서 상동성 잔기의 정렬에 의해 주어진 항체에 대해 결정할 수 있다.
중쇄 가변 도메인의 CDR은 카바트 넘버링 시스템에 따라 잔기 31-35 (CDR-H1), 잔기 50-65 (CDR-H2) 및 잔기 95-102 (CDR-H3)에 위치한다. 그러나, 코티아 (Chothia, C. and Lesk, A.M., J. Mol. Biol., 196, 901-917 (1987))에 따라, CDR-H1에 동등한 루프 (loop)는 잔기 26에서 잔기 32로 연장한다. 따라서, 달리 지시하지 않으면, 'CDR-H1'은 본원에서 사용될 때, 카바트 넘버링 시스템 및 코티아의 위상학적 루프 정의의 조합에 의해 설명되는 바와 같이 잔기 26 내지 35를 나타내도록 의도된다.
경쇄 가변 도메인의 CDR은 카바트 넘버링 시스템에 따라 잔기 24-34 (CDR-L1), 잔기 50-56 (CDR-L2) 및 잔기 89-97 (CDR-L3)에 위치한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 '길항성 항체'는 예를 들어 OX40 리간드에 대한 OX40의 결합을 차단하거나 그 결합을 실질적으로 감소시킴으로써 및 따라서 OX40의 활성화를 억제함으로써, OX40의 생물학적 신호전달 활성을 억제 및/또는 중화할 수 있는 항체를 설명한다.
본 발명에 사용하기 위한 항체는 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법을 이용하여 얻을 수 있다. OX40 폴리펩티드/단백질 포함 융합 단백질, 예를 들어 OX40-Fc 융합 단백질, 또는 (재조합 방식으로 또는 자연적으로) 폴리펩티드를 발현하는 세포 (예를 들어, 활성화된 T 세포)는 OX40을 특이적으로 인식하는 항체를 생성하기 위해 사용될 수 있다. OX40 폴리펩티드는 '성숙' 폴리펩티드 또는 그의 생물학적 활성 단편 또는 유도체일 수 있다. 적합하게는, OX40 폴리펩티드는 성숙 인간 폴리펩티드 또는 그의 세포외 도메인 또는 단편이다. 세포외 도메인은 일반적으로 OX40 단백질 (SWISS PROT 엔트리 P43489)의 아미노산 29-214를 포함한다. OX40 폴리펩티드는 발현 시스템을 포함하는 유전공학으로 처리된 숙주 세포로부터 당업계에 잘 공지된 공정에 의해 제조할 수 있거나, 천연 생물학적 공급원으로부터 회수할 수 있다. 본원에서, 용어 "폴리펩티드"는 펩티드, 폴리펩티드 및 단백질을 포함한다. 이들은 달리 지시하지 않으면 상호교환가능하게 사용된다. OX40 폴리펩티드는 일부 경우에 예를 들어 친화도 태그에 융합된 융합 단백질과 같은 보다 큰 단백질의 일부일 수 있다. OX40 폴리펩티드에 대해 생성된 항체는 동물의 면역화가 필요한 경우에, 잘 공지되고 일상적인 프로토콜을 이용하여 폴리펩티드를 동물, 바람직하게는 비-인간 동물에 투여함으로써 얻을 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Handbook of Experimental Immunology, D. M. Weir (ed), Vol 4, Blackwell Scientific Publishers, Oxford, England, 1986] 참조). 많은 온혈 동물, 예를 들어 토끼, 마우스, 래트, 양, 소, 낙타 또는 돼지가 면역화될 수 있다. 그러나, 마우스, 토끼, 돼지 및 래트가 일반적으로 가장 적합하다.
본 발명에 사용하기 위한 항체는 전체 항체 및 그의 기능상 활성 단편 또는 유도체를 포함하고, 모노클로날, 인간화, 완전 인간 또는 키메라 (chimeric) 항체일 수 있지만 그로 제한되지 않는다.
모노클로날 항체는 당업계에 공지된 임의의 방법, 예를 들어 하이브리도마 기술 (Kohler & Milstein, 1975, Nature, 256:495-497), 트리오마 (trioma) 기술, 인간 B-세포 하이브리도마 기술 (Kozbor et al., 1983, Immunology Today, 4:72) 및 EBV-하이브리도마 기술 (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, pp77-96, Alan R Liss, Inc., 1985)에 의해 제조할 수 있다.
본 발명에 사용하기 위한 항체는 또한, 예를 들어 문헌 [Babcook, J. et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(15):7843-78481]; WO92/02551; WO2004/051268 및 국제 특허 출원 WO2004/106377에 기재된 방법에 의해 특이적 항체의 생성을 위해 선택된 단일 림프구로부터 생성된 면역글로불린 가변 영역 cDNA를 클로닝하고 발현시킴으로써 단일 림프구 항체 방법을 이용하여 생성할 수 있다.
항체에 대한 스크리닝은 인간 OX40에 대한 결합을 측정하는 분석 및/또는 그의 리간드, OX40L에 대한 OX40의 결합을 차단하는 능력을 측정하는 분석을 이용하여 수행할 수 있다. 결합 분석의 예는 특히, 플레이트 상에 고정된 인간 OX40 및 인간 Fc의 융합 단백질을 이용하고, 융합 단백질에 결합된 항-OX40 항체를 검출하기 위해 접합된 2차 항체를 사용하는 ELISA이다. 차단 분석의 예는 인간 CD4 세포 상의 OX40에 결합하는 OX40 리간드 융합 단백질의 차단을 측정하는 유동 세포측정 (flow cytometry) 기반 분석이다. 형광 표지된 2차 항체는 세포에 대한 OX40 리간드 융합 단백질 결합의 양을 검출하기 위해 사용된다. 상기 분석은 상등액 내의 항체가 OX40에 대한 리간드 융합 단백질의 결합을 차단할 때 신호의 감소를 찾는다. 차단 분석의 추가의 예는 플레이트에 코팅된 OX40 리간드 융합 단백질에 의해 매개된 나이브 (naive) 인간 T 세포의 동시자극의 차단이 삼중수소화 티미딘 혼입을 측정함으로써 측정되는 분석이다.
인간화 항체 (이는 CDR-그라프팅된 (grafted) 항체 포함)는 비-인간 종으로부터 하나 이상의 상보성 결정 영역 (CDR) 및 인간 면역글로불린 분자로부터 프레임워크 영역을 갖는 항체 분자이다 (예를 들어, US 5,585,089; WO91/09967 참조). 전체 CDR보다는 단지 CDR의 특이성 결정 잔기를 전달하는 것이 필요할 수 있음이 이해될 것이다 (예를 들어, [Kashmiri et al., 2005, Methods, 36, 25-34] 참조). 인간화 항체는 임의로 그로부터 CDR이 유래되는 비-인간 종으로부터 유래된 하나 이상의 프레임워크 잔기를 추가로 포함할 수 있다.
키메라 항체는 요소가 그가 유래하는 종의 특징을 보유하도록 2개의 상이한 종으로부터 유래된 요소들로 구성된다. 일반적으로, 키메라 항체는 하나의 종, 예를 들어 마우스, 래트, 토끼 등으로부터의 가변 영역 및 또 다른 종, 예를 들어 인간으로부터의 불변 영역을 포함할 것이다.
또한, 본 발명에 사용하기 위한 항체는 당업계에 공지된 다양한 파지 디스플레이 방법을 사용하여 생성시킬 수 있고, 문헌 ([Brinkman et al., J. Immunol. Methods, 1995, 182:41-50], [Ames et al., J. Immunol. Methods, 1995, 184:177-186], [Kettleborough et al., Eur. J. Immunol. 1994, 24:952-958], [Persic et al., Gene, 1997, 187:9-18)], [Burton et al., Advances in Immunology, 1994, 57:191-280]) 및 WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; 및 US 5,698,426, 5,223,409, 5,403,484, 5,580,717, 5,427,908, 5,750,753, 5,821,047, 5,571,698, 5,427,908, 5,516,637, 5,780,225, 5,658,727, 5,733,743 및 5,969,108에 개시된 것을 포함한다.
완전 인간 항체는 중쇄 및 경쇄 모두의 가변 영역 및 불변 영역 (존재하는 경우에)이 모두 인간 기원의 것이거나, 반드시 동일한 항체로부터의 것은 아니지만 인간 기원의 서열에 실질적으로 동일한 항체이다. 완전 인간 항체의 예는 예를 들어 상기한 파지 디스플레이 방법에 의해 생성된 항체, 및 EP0546073 B1, US 5,545,806, US 5,569,825, US 5,625,126, US 5,633,425, US 5,661,016, US5,770,429, EP 0438474 및 EP0463151에 일반적인 용어로 설명되어 있는 바와 같이, 뮤린 면역글로불린 가변 영역 및 임의로 불변 영역 유전자가 그들의 인간 상대물에 의해 교체된 마우스에 의해 생성된 항체를 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명은 중쇄를 포함하는, 인간 OX40에 대한 특이성을 갖는 길항성 항체를 제공하고, 여기서 중쇄의 가변 도메인은 CDR-H1에 대해 도 1(c) 서열 1에 제시된 서열을 갖는 CDR, CDR-H2에 대해 도 1(c) 서열 2 또는 서열 20에 제시된 서열을 갖는 CDR, 및 CDR-H3에 대해 도 1(c) 서열 3에 제시된 서열을 갖는 CDR 중 적어도 하나를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 중쇄의 가변 도메인의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3 중 적어도 2개가 CDR-H1에 대해 서열 1에 제시된 서열, CDR-H2에 대해 서열 2에 제시된 서열 및 CDR-H3에 대해 서열 3에 제시된 서열 중에서 선택되는 중쇄를 포함하는, 인간 OX40에 대한 특이성을 갖는 길항성 항체를 제공한다. 예를 들어, 항체는 CDR-H1은 서열 1에 제시된 서열을 갖고 CDR-H2는 서열 2에 제시된 서열을 갖는 중쇄를 포함할 수 있다. 별법으로, 항체는 CDR-H1은 서열 1에 제시된 서열을 갖고 CDR-H3은 서열 3에 제시된 서열을 갖는 중쇄를 포함할 수 있거나, 항체는 CDR-H2는 서열 2에 제시된 서열을 갖고 CDR-H3은 서열 3에 제시된 서열을 갖는 중쇄를 포함할 수 있다. 의심의 여지 없이, 모든 과다돌연변이가 포함되는 것이 이해된다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 중쇄를 포함하고, 중쇄의 가변 도메인이 CDR-H1에 대해 서열 1에 제시된 서열, CDR-H2에 대해 서열 2에 제시된 서열 및 CDR-H3에 대해 서열 3에 제시된 서열을 포함하는 것인, 인간 OX40에 대한 특이성을 갖는 길항성 항체를 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 중쇄를 포함하고, 중쇄의 가변 도메인이 CDR-H1에 대해 서열 1에 제시된 서열, CDR-H2에 대해 서열 20에 제시된 서열 및 CDR-H3에 대해 서열 3에 제시된 서열을 포함하는 것인, 인간 OX40에 대한 특이성을 갖는 길항성 항체를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 경쇄를 포함하고, 경쇄의 가변 도메인이 CDR-L1에 대해 도 1(c) 서열 4 또는 서열 21에 제시된 서열을 갖는 CDR, CDR-L2에 대해 도 1(c) 서열 5에 제시된 서열을 갖는 CDR, 및 CDR-L3에 대해 도 1(c) 서열 6에 제시된 서열을 갖는 CDR 중 적어도 하나를 포함하는 것인, 인간 OX40에 대한 특이성을 갖는 길항성 항체를 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 경쇄를 포함하고, 경쇄의 가변 도메인의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3 중 적어도 2개가 CDR-L1에 대해 서열 4에 제시된 서열, CDR-L2에 대해 서열 5에 제시된 서열 및 CDR-L3에 대해 서열 6에 제시된 서열 중에서 선택되는 것인, 인간 OX40에 대한 특이성을 갖는 길항성 항체를 제공한다. 예를 들어, 항체는 CDR-L1은 서열 4에 제시된 서열을 갖고 CDR-L2는 서열 5에 제시된 서열을 갖는 경쇄를 포함할 수 있다. 별법으로, 항체는 CDR-L1은 서열 4에 제시된 서열을 갖고 CDR-L3은 서열 6에 제시된 서열을 갖는 경쇄를 포함할 수 있거나, 항체는 CDR-L2는 서열 5에 제시된 서열을 갖고 CDR-L3은 서열 6에 제시된 서열을 갖는 경쇄를 포함할 수 있다. 의심의 여지 없이, 모든 과다돌연변이가 포함되는 것이 이해된다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 경쇄를 포함하고, 가변 도메인이 CDR-L1에 대해 서열 4에 제시된 서열, CDR-L2에 대해 서열 5에 제시된 서열 및 CDR-L3에 대해 서열 6에 제시된 서열을 포함하는 것인, 인간 OX40에 대한 특이성을 갖는 길항성 항체를 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 경쇄를 포함하고, 가변 도메인이 CDR-L1에 대해 서열 21에 제시된 서열, CDR-L2에 대해 서열 5에 제시된 서열 및 CDR-L3에 대해 서열 6에 제시된 서열을 포함하는 것인, 인간 OX40에 대한 특이성을 갖는 길항성 항체를 제공한다.
본 발명의 항체 분자는 적합하게는 각각 상보성 경쇄 또는 상보성 중쇄를 포함한다.
따라서, 한 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체는 중쇄의 가변 도메인이 CDR-H1에 대해 서열 1에 제시된 서열, CDR-H2에 대해 서열 2 또는 서열 20에 제시된 서열 및 CDR-H3에 대해 서열 3에 제시된 서열을 포함하는 중쇄, 및 경쇄의 가변 도메인이 CDR-L1에 대해 서열 4 또는 서열 21에 제시된 서열, CDR-L2에 대해 서열 5에 제시된 서열 및 CDR-L3에 대해 서열 6에 제시된 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
OX40에 결합하고 OX40 활성을 중화하는 항체의 능력을 유의하게 변경시키지 않으면서, 본 발명에서 제공되는 CDR에 대해 하나 이상의 아미노산 치환, 부가 및/또는 결실이 이루어질 수 있음이 이해될 것이다. 임의의 아미노산 치환, 부가 및/또는 결실의 효과는 OX40 결합 및 OX40/OX40L 상호작용의 억제를 결정하기 위해, 예를 들어 본원, 특히 실시예에 기재된 방법을 사용함으로써 당업자가 쉽게 시험할 수 있다. 따라서, 본 발명은 CDRH-1 (서열 1), CDRH-2 (서열 2 또는 서열 20), CDRH-3 (서열 3), CDRL-1 (서열 4 또는 서열 21), CDRL-2 (서열 5) 및 CDRL-3 (서열 6) 중에서 선택되는 하나 이상의 CDR을 포함하는, 인간 OX40에 대한 특이성을 갖는 항체를 제공하고, 여기서 하나 이상의 CDR 내의 하나 이상의 아미노산은 또 다른 아미노산, 적합하게는 아래 규정된 바와 같이 유사한 아미노산으로 치환되었다. 한 실시양태에서, 본 발명은 도 1(c)에 제시된 바와 같이 CDRH-1 (서열 1), CDRH-2 (서열 2 또는 서열 20), CDRH-3 (서열 3), CDRL-1 (서열 4 또는 서열 21), CDRL-2 (서열 5) 및 CDRL-3 (서열 6)을 포함하는, 인간 OX40에 대한 특이성을 갖는 항체를 제공하고, 예를 들어 여기서 하나 이상의 CDR의 하나 이상의 아미노산은 또 다른 아미노산, 예를 들어 아래 규정된 바와 같이 유사한 아미노산으로 치환되었다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 중쇄의 가변 도메인이 3개의 CDR을 포함하는 중쇄를 포함하고, 여기서 CDRH-1의 서열은 서열 1에 제시된 서열에 적어도 60%의 동일성 또는 유사성을 갖고/갖거나, CDRH-2는 서열 2에 제시된 서열에 적어도 60%의 동일성 또는 유사성을 갖고/갖거나 CDRH-3은 서열 3에 제시된 서열에 적어도 60%의 동일성 또는 유사성을 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는 중쇄의 가변 도메인이 3개의 CDR을 포함하는 중쇄를 포함하고, 여기서 CDRH-1의 서열은 서열 1에 제시된 서열에 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98%의 동일성 또는 유사성을 갖고/갖거나, CDRH-2는 서열 2에 제시된 서열에 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98%의 동일성 또는 유사성을 갖고/갖거나, CDRH-3은 서열 3에 제시된 서열에 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98%의 동일성 또는 유사성을 갖는다.
"동일성"은 본원에서 사용되는 바와 같이, 정렬된 서열 내의 임의의 특정 위치에서 아미노산 잔기가 서열들 사이에서 동일함을 나타낸다. "유사성"은 본원에서 사용되는 바와 같이, 정렬된 서열 내의 임의의 특정 위치에서, 아미노산 잔기가 서열들 사이에서 유사한 종류의 것임을 나타낸다. 예를 들어, 류신이 이소류신 또는 발린을 치환할 수 있다. 종종 서로 치환될 수 있는 다른 아미노산은 다음을 것들을 포함하고 이로 제한되지 않는다:
- 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판 (방향족 측쇄를 갖는 아미노산),
- 리신, 아르기닌 및 히스티딘 (염기성 측쇄를 갖는 아미노산),
- 아스파르테이트 및 글루타메이트 (산성 측쇄를 갖는 아미노산),
- 아스파라긴 및 글루타민 (아미드 측쇄를 갖는 아미노산), 및
- 시스테인 및 메티오닌 (황-함유 측쇄를 갖는 아미노산). 동일성 및 유사성의 정도는 쉽게 계산할 수 있다 ([Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988]; [Biocomputing Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993]; [Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994]; [Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987], [Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991]), NCBI로부터 이용가능한 BLAST™ 소프트웨어 ([Altschul, S.F. et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410]; [Gish, W. & States, D.J. 1993, Nature Genet. 3:266-272], [Madden, T.L. et al., 1996, Meth. Enzymol. 266:131-141]; [Altschul, S.F. et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402]; [Zhang, J. & Madden, T.L. 1997, Genome Res. 7:649-656]).
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는 경쇄의 가변 도메인이 3개의 CDR을 포함하는 경쇄를 포함하고, 여기서 CDRL-1의 서열은 서열 4에 제시된 서열에 적어도 60%의 동일성 또는 유사성을 갖고/갖거나, CDRL-2는 서열 5에 제시된 서열에 적어도 60%의 동일성 또는 유사성을 갖고/갖거나, CDRL-3은 서열 6에 제시된 서열에 적어도 60%의 동일성 또는 유사성을 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는 경쇄의 가변 도메인이 3개의 CDR을 포함하는 경쇄를 포함하고, 여기서 CDRL-1의 서열은 서열 4에 제시된 서열에 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98%의 동일성 또는 유사성을 갖고/갖거나, CDRL-2는 서열 5에 제시된 서열에 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98%의 동일성 또는 유사성을 갖고/갖거나, CDRL-3은 서열 6에 제시된 서열에 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98%의 동일성 또는 유사성을 갖는다.
한 실시양태에서, 본원에서 제공되는 항체는 모노클로날 항체이다.
한 실시양태에서, 본원에서 제공되는 항체는 키메라 항체이다.
한 실시양태에서, 본 발명에서 제공되는 항체는 서열 1, 2, 3, 4, 5, 6, 20 및/또는 21 (도 1(c))에 제공된 하나 이상의 CDR을 포함하는 CDR-그라프팅된 항체 분자 또는 그의 변이체이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 'CDR-그라프팅된 항체 분자'는 중쇄 및/또는 경쇄가 수여자 항체 (예를 들어, 인간 항체)의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역 프레임워크 내로 그라프팅된 공여자 항체 (예를 들어, 뮤린 모노클로날 항체)로부터의 하나 이상의 CDR (바람직한 경우에 하나 이상의 변형된 CDR 포함)을 함유하는 항체 분자를 나타낸다. 검토를 위해 문헌 [Vaughan et al., Nature Biotechnology, 16, 535-539, 1998]을 참조한다. 한 실시양태에서, 전체 CDR이 전달되기보다는, 본원에서 상기 기재된 임의의 하나의 CDR로부터의 하나 이상의 특이성 결정 잔기만이 인간 항체 프레임워크에 전달된다 (예를 들어, 문헌 [Kashmiri et al., 2005, Methods, 36, 25-34] 참조). 한 실시양태에서, 본원에 상기 기재된 하나 이상의 CDR로부터의 특이성 결정 잔기만이 인간 항체 프레임워크에 전달된다. 또 다른 실시양태에서, 본원에서 상기 기재된 각각의 CDR로부터의 특이성 결정 잔기만이 인간 항체 프레임워크에 전달된다.
CDR 또는 특이성 결정 잔기가 그라프팅될 때, 마우스, 영장류 및 인간 프레임워크 영역을 비롯한, 그로부터 CDR이 유래하는 공여자 항체의 클래스/종류에 유념하여 임의의 적절한 수여자 가변 영역 프레임워크 서열을 사용할 수 있다. 적합하게는, 본 발명에 따른 CDR-그라프팅된 항체는 인간 수여자 프레임워크 영역뿐만 아니라 상기 기재된 하나 이상의 CDR 또는 특이성 결정 잔기를 포함하는 가변 도메인을 갖는다. 따라서, 한 실시양태에서, 가변 도메인이 인간 수여자 프레임워크 영역 및 비-인간 공여자 CDR을 포함하는 중화 CDR-그라프팅 항체를 제공한다.
본 발명에서 사용할 수 있는 인간 프레임워크의 예는 KOL, NEWM, REI, EU, TUR, TEI, LAY 및 POM이다 (Kabat et al., 상기 문헌). 예를 들어, KOL 및 NEWM은 중쇄에 대해 사용될 수 있고, REI는 경쇄에 대해 사용될 수 있고, EU, LAY 및 POM은 중쇄 및 경쇄 모두에 대해 사용될 수 있다. 별법으로, 인간 생식계열 서열을 사용할 수 있고, 이들은 http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/에서 이용가능하다.
본 발명의 CDR-그라프팅 항체에서, 수여자 중쇄 및 경쇄는 반드시 동일한 항체로부터 유래될 필요가 있는 것은 아니고, 바람직한 경우에 상이한 사슬로부터 유래되는 프레임워크 영역을 갖는 복합체 사슬을 포함할 수 있다.
본 발명의 CDR-그라프팅된 항체의 중쇄에 대한 적합한 프레임워크 영역은 JH4와 함께 인간 하위군 VH3 서열 1-3 3-07로부터 유래한다. 따라서, 중쇄 프레임워크 영역이 JH4와 함께 인간 하위군 VH3 서열 1-3 3-07로부터 유래하는, 적어도 하나의 비-인간 공여자 CDR을 포함하는 중화 CDR-그라프팅된 항체를 제공한다. 인간 JH4의 서열은 다음과 같다 (YFDY)WGQGTLVTVSS (서열 22). YFDY 모티프 (motif)는 CDR-H3의 일부이고, 프레임워크 4의 일부는 아니다 (Ravetch, J.V. et al., 1981, Cell, 27, 583-591).
본 발명의 CDR-그라프팅된 항체의 경쇄에 대한 적합한 프레임워크 영역은 JK4와 함께 인간 생식계열 하위군 VK1 서열 2-1 1-02으로부터 유래한다. 따라서, 경쇄 프레임워크 영역이 JK4와 함께 인간 하위군 서열 2-1 1-02로부터 유래하는, 적어도 하나의 비-인간 공여자 CDR을 포함하는 중화 CDR-그라프팅된 항체를 제공한다. JK1 서열은 다음과 같다 (WT)FGQGTKVEIK (서열 23). WT 모티프는 CDR-L3의 일부이고, 프레임워크 4의 일부는 아니다 (Hieter, P.A., et al., 1982, J. Biol. Chem., 257, 1516-1522).
또한, 본 발명의 CDR-그라프팅된 항체에서, 프레임워크 영역은 수여자 항체의 것과 정확하게 동일한 서열을 가질 필요는 없다. 예를 들어, 비통상 (unusual) 잔기는 수여자 사슬 클래스 또는 종류에 대해 보다 빈번하게 발생하는 잔기로 변화될 수 있다. 별법으로, 수여자 프레임워크 영역 내의 선택된 잔기는 공여자 항체 내의 동일한 위치에서 발견된 잔기에 상응하도록 변화될 수 있다 ([Reichmann et al., 1998, Nature, 332, 323-324] 참조). 그러한 변화는 공여자 항체의 친화도를 회복하기 위해 필요한 최소로 유지되어야 한다. 변화될 필요가 있을 수 있는 수여자 프레임워크 영역 내의 잔기를 선택하기 위한 프로토콜은 WO 91/09967에 제시되어 있다.
적합하게는, 본 발명의 CDR-그라프팅된 항체 분자에서, 수여자 중쇄가 JH4와 함께 인간 VH3 서열 1-3 3-07을 가지면, 중쇄의 수여자 프레임워크 영역은 하나 이상의 공여자 CDR에 추가로, 위치 37, 73, 78 또는 94 중 적어도 하나에서 공여자 잔기를 포함한다 (문헌 [Kabat et al., (상기 문헌)]에 따라). 따라서, 적어도 중쇄의 가변 도메인의 위치 37, 73, 78 및 94의 잔기가 공여자 잔기인 CDR-그라프팅된 항체를 제공한다.
적합하게는, 본 발명에 따른 CDR-그라프팅된 항체 분자에서, 수여자 경쇄가 JK4와 함께 인간 하위군 VK1 서열 2-1 1-02을 가지면, 경쇄의 수여자 프레임워크 영역은 하나 이상의 공여자 CDR에 추가로, 위치 64 또는 71 중 적어도 하나에서 공여자 잔기를 포함한다. 따라서, 경쇄의 가변 도메인의 적어도 위치 64 및 71의 잔기가 공여자 잔기인 CDR-그라프팅된 항체를 제공한다.
공여자 잔기는 공여자 항체, 즉, 그로부터 CDR이 원래 유래되는 항체로부터의 잔기이다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 중쇄의 가변 도메인이 도 1(b) 서열 9에 제시된 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다.
OX40에 결합하고 OX40 활성을 중화하는 항체의 능력을 유의하게 변경시키지 않으면서, 본 발명에서 제공되는 항체 가변 도메인에 하나 이상의 아미노산 치환, 부가 및/또는 결실이 이루어질 수 있음이 이해될 것이다. 임의의 아미노산 치환, 부가 및/또는 결실의 효과는 OX40 결합 및 리간드 차단을 결정하기 위해, 예를 들어 본원, 특히 실시예에 기재된 방법을 이용함으로써 당업자가 쉽게 시험할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는 중쇄의 가변 도메인이 서열 9에 제시된 서열에 적어도 60%의 동일성 또는 유사성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 중쇄의 가변 도메인이 서열 9에 제시된 서열에 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98%의 동일성 또는 유사성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 경쇄의 가변 도메인이 도 1(a) 서열 7에 제시된 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는 경쇄의 가변 도메인이 서열 7에 제시된 서열에 적어도 60%의 동일성 또는 유사성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 경쇄의 가변 도메인이 서열 7에 제시된 서열에 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98%의 동일성 또는 유사성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 중쇄의 가변 도메인이 서열 9에 제시된 서열을 포함하는 중쇄, 및 경쇄의 가변 도메인이 서열 7에 제시된 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 항체는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 여기서 중쇄의 가변 도메인은 서열 9에 제시된 서열에 적어도 60%의 동일성 또는 유사성을 갖는 서열을 포함하고, 경쇄의 가변 도메인은 서열 7에 제시된 서열에 적어도 60%의 동일성 또는 유사성을 갖는 서열을 포함한다. 적합하게는, 항체는 중쇄의 가변 도메인이 서열 9에 제시된 서열에 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98%의 동일성 또는 유사성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄, 및 경쇄의 가변 도메인이 서열 7에 제시된 서열에 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98%의 동일성 또는 유사성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
본 발명의 항체 분자는 전장 중쇄 및 경쇄를 갖는 완전 항체 분자 또는 그의 단편을 포함할 수 있고, Fab, 변형된 Fab, Fab', 변형된 Fab', F(ab')2, Fv, 단일 도메인 항체 (예를 들어, VH 또는 VL 또는 VHH), scFv, 2가, 3가 또는 4가 항체, 비스-scFv, 디아바디 (diabody), 트리아바디 (triabody), 테트라바디 (tetrabody) 및 상기한 임의의 것의 에피토프-결합 단편일 수 있지만 그로 제한되지 않는다 (예를 들어 문헌 ([Holliger and Hudson, 2005, Nature Biotech. 23(9) 1126-1136]; [Adair and Lawson, 2005, Drug Design Reviews - Online 2(3), 209-217]) 참조). 이들 항체 단편을 생성하고 제조하는 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Verma et al., 1998, Journal of Immunological Methods, 216, 165-181] 참조). 본 발명에서 사용하기 위한 다른 항체 단편은 국제 특허 출원 WO2005/003169, WO2005/003170 및 WO2005/003171에 기재된 Fab 및 Fab' 단편을 포함한다. 다가 항체는 다중 특이성을 포함할 수 있거나 단일특이적일 수 있다 (예를 들어 WO 92/22853 및 WO05/113605 참조).
한 실시양태에서, 본원에 따른 항체를 예를 들어 WO2009/040562에 기재된 바와 같이, 면역글로불린 모이어티, 예를 들어 Fab 또는 Fab' 단편, 및 직접적으로 또는 간접적으로 그에 연결된 1 또는 2개의 단일 도메인 항체 (dAb)를 포함하는 OX40 결합 항체 융합 단백질로서 제공한다.
한 실시양태에서, 융합 단백질은 2개의 도메인 항체를 예를 들어, 임의로 디술피드 결합에 의해 연결된 가변 중쇄 (VH) 및 가변 경쇄 (VL) 쌍으로서 포함한다.
한 실시양태에서, 융합 단백질의 Fab' 요소의 Fab는 단일 도메인 항체(들)과 동일한 또는 유사한 특이성을 가진다. 한 실시양태에서, Fab 또는 Fab'는 단일 도메인 항체(들)과 상이한 특이성을 갖고, 즉, 융합 단백질은 다가이다. 한 실시양태에서, 본 발명에 따른 다가 융합 단백질은 알부민 결합 부위를 갖고, 예를 들어 그 내부의 VH/VL 쌍은 알부민 결합 부위를 제공한다.
본 발명의 항체 분자의 불변 영역 도메인은 존재하는 경우에, 항체 분자의 제안된 기능 및 특히 요구될 수 있는 효과기 기능에 유념하여 선택될 수 있다. 예를 들어, 불변 영역 도메인은 인간 IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM 도메인일 수 있다. 특히, 항체 분자가 치료 용도를 위해 의도되고 항체 효과기 기능이 요구될 때 인간 IgG 불변 영역 도메인, 특히 IgG1 및 IgG3 이소형의 불변 영역 도메인을 사용할 수 있다. 별법으로, 항체 분자가 치료 목적을 위해 의도되고 항체 효과기 기능이 요구되지 않을 때, 예를 들어 단순히 OX40 활성을 차단하기 위해 IgG2 및 IgG4 이소형을 사용할 수 있다. 이들 불변 영역 도메인의 서열 변이체를 또한 사용할 수 있음이 이해될 것이다. 예를 들어, 문헌 [Angal et al., Molecular Immunology, 1993, 30(1), 105-108]에 기재된 바와 같이 위치 241에서 세린이 프롤린으로 변화된 IgG4 분자를 사용할 수 있다. 또한, 당업자는 항체가 다양한 번역후 변형을 거칠 수 있음을 이해할 것이다. 이들 변형의 종류 및 정도는 종종 항체를 발현하기 위해 사용된 숙주 세포주 및 배양 조건에 따라 결정된다. 그러한 변형은 글리코실화, 메티오닌 산화, 디케토피페라진 형성, 아스파르테이트 이성체화 및 아스파라긴 탈아미드화에서의 변이를 포함할 수 있다. 빈번한 변형은 카르복시펩티다제의 작용으로 인한 카르복시-말단 염기성 잔기 (예를 들어, 리신 또는 아르기닌)의 손실이다 (문헌 [Harris, R.J. Journal of Chromatography 705:129-134, 1995]에 기재된 바와 같이). 따라서, 도 1(f), 서열 15에 제시된 항체 중쇄의 C-말단 리신은 부재할 수 있다.
한 실시양태에서, 항체 중쇄는 CH1 도메인을 포함하고, 항체 경쇄는 카파 또는 람다의 CL 도메인을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명에서 제공되는 항체는 중쇄 불변 영역이 변형된 힌지 영역을 포함하는, 인간 OX40에 대한 특이성을 갖는 길항성 항체이다. 따라서, 본 발명은 중쇄가 도 1(f), 서열 15에 제시된 서열을 포함하거나 그로 이루어지는 항체를 제공한다.
OX40에 결합하고 OX40 활성을 중화하는 항체의 능력을 유의하게 변경하지 않으면서, 하나 이상의 아미노산 치환, 부가 및/또는 결실이 본 발명에서 제공되는 항체 가변 및/또는 불변 도메인에 대해 이루어질 수 있음이 이해될 것이다. 임의의 아미노산 치환, 부가 및/또는 결실의 효과는 OX40 결합 및 OX40/OX40L 상호작용의 차단을 결정하기 위해, 예를 들어 본원, 특히 실시예에 기재된 방법을 사용함으로써 당업자가 쉽게 시험할 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, 항체는 서열 15에 제시된 서열에 적어도 60%의 동일성 또는 유사성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 적합하게는, 항체는 서열 15에 제시된 서열에 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98%의 동일성 또는 유사성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체 분자는 도 1(d), 서열 11에 제시된 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 항체는 서열 11에 제시된 서열에 적어도 60%의 동일성 또는 유사성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 예를 들어, 항체는 서열 11에 제시된 서열에 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98%의 동일성 또는 유사성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 중쇄는 서열 15에 제시된 서열을 포함하거나 그로 이루어지고 경쇄는 서열 11에 제시된 서열을 포함하거나 그로 이루어지는 항체를 제공한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 항체는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 여기서 중쇄는 서열 15에 제시된 서열에 적어도 60%의 동일성 또는 유사성을 갖는 서열을 포함하고, 경쇄는 서열 11에 제시된 서열에 적어도 60%의 동일성 또는 유사성을 갖는 서열을 포함한다. 일반적으로, 항체는 서열 15에 제시된 서열에 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98%의 동일성 또는 유사성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열 11에 제시된 서열에 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98%의 동일성 또는 유사성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
생물학적 분자, 예를 들어 항체 또는 단편은 산성 및/또는 염기성 관능기를 함유하여, 분자에 순수 양전하 또는 음전하를 제공한다. 전체 "관찰된" 전하의 양은 엔티티 (entity)의 절대적인 아미노산 서열, 3D 구조에서 하전된 기의 국소 환경, 및 분자의 환경적 조건에 의존할 것이다. 등전점 (pI)은 특정 분자 또는 그의 용매 접근가능한 표면이 순수 전하를 보유하지 않는 pH이다. 한 실시양태에서, 본원에 따른 항체 또는 단편의 등전점 (pI)은 적어도 7이다. 한 실시양태에서, 항체 또는 단편의 등전점은 적어도 8, 예를 들어 8.5, 8.6, 8.7, 8.8 또는 9이다.
본 발명의 OX40 항체 및 단편은 적절한 등전점을 갖도록 조작된다. 그에 의해 항체 및/또는 단편은 보다 강건한 특성, 특히 적합한 용해도 및/또는 안정성 프로필 및/또는 개선된 정제 특징을 가질 수 있다.
따라서, 한 측면에서, 본 발명은 원래 확인된 항체 CA044__00026와 상이한 등전점을 갖도록 조작된 인간화 OX40 항체를 제공한다. 항체는 예를 들어 아미노산 잔기를 교체함으로써, 예를 들어 산성 아미노산 잔기를 하나 이상의 염기성 아미노산 잔기로 교체함으로써 조작될 수 있다. 별법으로, 염기성 아미노산 잔기가 도입될 수 있거나, 산성 아미노산 잔기가 제거될 수 있다. 별법으로, 분자가 허용가능하지 않게 높은 pI 값을 가지면, 요구되는 바와 같이 pI를 낮추기 위해 산성 잔기가 도입될 수 있다. 조작된 항체 또는 단편의 표적 pI는 바람직하게는 예를 들어 8 이상, 예를 들어 8.5 또는 9일 수 있다. pI를 조작할 때, 항체 또는 단편의 바람직한 활성을 보유하기 위해 주의를 기울여야 하는 것이 중요하다. 따라서, 한 실시양태에서, 조작된 항체 또는 단편은 "변형되지 않은" 항체 또는 단편과 동일한 또는 실질적으로 동일한 활성을 가진다.
항체 또는 단편의 등전점을 예측하기 위해 ** ExPASY (http://www.expasy.ch/tools/pi_tool.html, 및 http://www.iut-arles.up.univ-mrs.fr/w3bb/d_abim/compo-p.html)과 같은 프로그램을 사용할 수 있다.
본 발명에서 제공되는 항체, 특히, 중쇄 서열 gH2 (서열 9) 및/또는 경쇄 서열 gL8 (서열 7)을 포함하는 항체가 결합하는 인간 OX40의 특이적 영역 또는 에피토프를 또한 본 발명에서 제공한다.
인간 OX40 폴리펩티드의 상기 특이적 영역 또는 에피토프는 본 발명에서 제공되는 항체 중 임의의 하나와 조합으로 당업계에 공지된 임의의 적합한 에피토프 매핑 (mapping) 방법에 의해 확인할 수 있다. 그러한 방법의 예는 OX40으로부터 유래되는 가변 길이의 펩티드를, 항체가 인식하는 에피토프의 서열을 함유하는 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 최소 단편을 갖는 본 발명의 항체에 대한 결합에 대해 스크리닝하는 것을 포함한다. OX40 펩티드는 합성 방식으로 또는 OX40 폴리펩티드의 단백분해적 소화에 의해 생성할 수 있다. 항체에 결합하는 펩티드는 예를 들어 질량 분광계 분석에 의해 확인할 수 있다. 또 다른 예에서, 본 발명의 항체가 결합하는 에피토프를 확인하기 위해 NMR 분광법 또는 X-선 결정학을 사용할 수 있다. 일단 확인되면, 본 발명의 항체에 결합하는 에피토프 단편을 요구되는 경우에 동일한 에피토프에 결합하는 추가의 길항성 항체를 얻기 위해 면역원으로서 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 항체, 특히 중쇄 서열 gH2 (서열 9) 및 경쇄 서열 gL8 (서열 7)을 포함하는 항체의 결합을 교차-차단하는 항체는 OX40 활성을 길항하는데 유사하게 유용할 수 있다. 따라서, 본 발명은 인간 OX40에 대한 상기한 항체 중 임의의 하나의 결합을 교차-차단하고/하거나 이들 항체 중 임의의 하나에 의해 OX40에 결합하는 것이 교차-차단되는, 인간 OX40에 대한 특이성을 갖는 길항성 항체를 또한 제공한다. 한 실시양태에서, 그러한 항체는 본원에서 상기 기재된 항체와 동일한 에피토프에 결합한다. 또 다른 실시양태에서, 교차-차단 중화 항체는 본원에서 상기 기재된 항체에 의해 결합된 에피토프와 접하고/하거나 겹치는 에피토프에 결합한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 상기 측면의 교차-차단 중화 항체는 본 발명의 항체와 동일한 에피토프 또는 상기 에피토프와 접하고/하거나 겹치는 에피토프에 결합하지 않는다.
교차-차단 항체는 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법을 이용하여, 예를 들어 인간 OX40에 대한 교차-차단 항체의 결합이 본 발명의 항체의 결합을 방해하거나 그 반대인 경쟁 ELISA 또는 BIAcore 분석을 이용함으로써 확인할 수 있다.
한 실시양태에서, 그의 중쇄가 서열 gH2 (서열 9)를 포함하고 그의 경쇄가 서열 gL8 (서열 7)을 포함하는 항체의 인간 OX40에 대한 결합을 교차-차단하는, 인간 OX40에 대한 특이성을 갖는 길항성 항체를 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명에서 제공되는 교차-차단 항체는 중쇄 서열 gH2 (서열 9) 및 경쇄 서열 gL8 (서열 7)을 포함하는 항체의 결합을 80% 초과로, 예를 들어 85% 초과로, 예를 들어 90% 초과로, 특히 95% 초과로 억제한다.
별법으로 또는 추가로, 본 발명의 상기 측면에 따른 길항성 항체는 중쇄 서열 gH2 (서열 9) 및 경쇄 서열 gL8 (서열 7)을 포함하는 항체에 의해 인간 OX40에 대한 결합으로부터 교차-차단될 수 있다. 따라서, 중쇄 서열 gH2 (서열 9) 및 경쇄 서열 gL8 (서열 7)을 포함하는 항체에 의해 인간 OX40에 대한 결합으로부터 교차-차단되는, 인간 OX40에 대한 특이성을 갖는 길항성 항체를 또한 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 상기 측면에서 제공되는 길항성 항체는 중쇄 서열 gH2 (서열 9) 및 경쇄 서열 gL8 (서열 7)을 포함하는 항체에 의해 인간 OX40에 대한 결합으로부터 80% 초과로, 예를 들어 85% 초과로, 예를 들어 90% 초과로, 특히 95% 초과로 억제된다.
한 실시양태에서, 본 발명에서 제공되는 교차-차단 항체는 완전 인간 항체이다. 한 실시양태에서, 본 발명에서 제공되는 교차-차단 항체는 인간화 항체이다. 한 실시양태에서, 본 발명에서 제공되는 교차-차단 항체는 인간 OX40에 대한 친화도가 100 pM이거나 그보다 우수하다. 한 실시양태에서, 본 발명에서 제공되는 교차-차단 항체는 인간 OX40에 대한 친화도가 50 pM이거나 그보다 우수하다.
한 실시양태에서, 교차-차단 항체의 등전점은 적어도 7, 예를 들어 적어도 8, 예를 들어 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9 또는 9.0이다.
본 발명의 항체 분자는 적합하게는 특히 피코몰 (picomolar)의 높은 결합 친화도를 갖는다. 친화도는 단리된 천연 또는 재조합 OX40 또는 적합한 융합 단백질/폴리펩티드를 사용하여 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법, 예를 들어 본원의 실시예에 기재된 바와 같은 BIAcore를 이용하여 측정할 수 있다. 한 예에서, 친화도는 본원의 실시예에 기재된 바와 같이 재조합 인간 OX40 세포외 도메인을 이용하여 측정한다. 한 예에서, 사용된 재조합 인간 OX40 세포외 도메인은 이량체, 예를 들어 Fc 융합 이량체이다. 적합하게는, 본 발명의 항체 분자는 단리된 인간 OX40에 대한 결합 친화도가 약 200 pM이거나 그보다 우수하다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체 분자는 결합 친화도가 약 100 pM이거나 그보다 우수하다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체 분자는 결합 친화도가 약 50 pM이거나 그보다 우수하다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체 분자는 결합 친화도가 약 40 pM이거나 그보다 우수하다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체 분자는 결합 친화도가 약 30 pM이거나 그보다 우수하다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체 분자는 완전 인간 또는 인간화 항체이고, 결합 친화도가 약 100 pM이거나 그보다 우수하다.
본 발명의 항체 분자는 적합하게는 활성화된 T 세포의 표면 상에 발현된 인간 OX40에 대해 높은 결합 친화도, 예를 들어 나노몰 (nanomolar) 또는 피코몰의 친화도를 갖는다. 친화도는 활성화된 CD4+ OX40+ 인간 T 세포를 이용하는 본원의 실시예에 기재된 방법을 비롯한 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법을 이용하여 측정할 수 있다. 특히 본 발명의 항체 분자는 세포 표면 발현된 인간 OX40에 대한 결합 친화도가 약 2 nM이거나 그보다 우수하다. 한 예에서, 본 발명의 항체 분자는 세포 표면 발현된 인간 OX40에 대한 결합 친화도가 약 1.5 nM이거나 그보다 우수하다. 또 다른 예에서, 본 발명의 항체 분자는 세포 표면 발현된 인간 OX40에 대한 결합 친화도가 약 1.2 nM이거나 그보다 우수하다. 한 실시양태에서, 인간 세포 표면 발현된 OX40에 대한 결합 친화도가 약 2 nM이거나 그보다 우수한 것인 완전 인간 또는 인간화 항체 분자를 제공한다.
본 발명에서 제공되는 항체의 친화도는 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법을 이용하여 변경될 수 있음이 이해될 것이다. 따라서, 본 발명은 또한 OX40에 대한 친화도가 개선된 본 발명의 항체 분자의 변이체에 관한 것이다. 그러한 변이체는 CDR을 돌연변이시키고 (Yang et al., J. Mol. Biol, 254, 392-403, 1995), 사슬 셔플링 (shuffling) (Marks et al., Bio/Technology, 10, 779-783, 1992), 이. 콜라이 (E. coli)의 변이유발 (mutator) 균주의 사용 (Low et al., J. Mol. Biol, 250, 359-368, 1996), DNA 셔플링 (Patten et al., Curr. Opin. Biotechnol., 8, 724-733, 1997), 파지 디스플레이 (Thompson et al., J. Mol. Biol, 256, 77-88, 1996) 및 섹슈얼 (sexual) PCR (Crameri et al., Nature, 391, 288-291, 1998)을 비롯한, 많은 친화도 증진 (maturation) 프로토콜에 의해 얻을 수 있다. 보간 (Vaughan) 등 (상기 문헌)은 이들 친화도 증진 방법을 논의한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항체 분자는 OX40 및 OX40L 사이의 상호작용을 차단한다. 상기 상호작용을 차단하는 항체의 능력을 결정하기 위해 적합한 수많은 분석이 본원의 실시예에 기재되어 있다. 한 실시양태에서, 본 발명은 5 nM 미만의 농도에서 활성화된 인간 CD4+OX40+ T 세포에 대한 인간 OX40L (2 ㎍/ml의 최종 농도에서 시험됨)의 결합을 50% 억제할 수 있는, 인간 OX40에 대한 특이성을 갖는 중화 항체를 제공한다. 한 실시양태에서, 분석에서 사용된 인간 OX40L은 천연 인간 OX40이다. 한 실시양태에서, 분석에서 사용된 인간 OX40은 재조합 인간 OX40이다. 한 실시양태에서, 중화 항체는 인간화 또는 완전 인간 항체이다.
원하는 경우에, 본 발명에서 사용하기 위한 항체는 하나 이상의 효과기 분자(들)에 접합될 수 있다. 효과기 분자는 단일 효과기 분자, 또는 본 발명의 항체에 부착될 수 있는 단일 모이어티를 형성하도록 연결된 2개 이상의 그러한 분자를 포함할 수 있음이 이해될 것이다. 효과기 분자에 연결된 항체 단편을 얻는 것이 요망되는 경우에, 이를 항체 단편이 직접적으로 또는 커플링제를 통해 효과기 분자에 연결되는 표준 화학적 또는 재조합 DNA 절차에 의해 제조할 수 있다. 그러한 효과기 분자를 항체에 접합시키는 기술은 당업계에 잘 공지되어 있다 ([Hellstrom et al., Controlled Drug Delivery, 2nd Ed., Robinson et al., eds., 1987, pp 623-53]; [Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev., 62:119-58] 및 [Dubowchik et al., 1999, Pharmacology and Therapeutics, 83, 67-123] 참조). 특정 화학적 절차는 예를 들어 WO 93/06231, WO 92/22583, WO 89/00195, WO 89/01476 및 WO 03/031581에 기재된 것을 포함한다. 별법으로, 효과기 분자가 단백질 또는 폴리펩티드인 경우에, 연결은 예를 들어 WO 86/01533 및 EP0392745에 기재된 바와 같이 재조합 DNA 절차를 이용하여 달성할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 효과기 분자는 예를 들어, 항신생물제, 약물, 독소, 생물학적 활성 단백질, 예를 들어 효소, 다른 항체 또는 항체 단편, 합성 또는 자연 발생하는 중합체, 핵산 및 그의 단편, 예를 들어 DNA, RNA 및 그의 단편, 방사성 핵종, 특히 방사성 요오드, 방사성 동위원소, 킬레이팅된 금속, 나노입자 및 리포터기, 예를 들어 형광 화합물 또는 NMR 또는 ESR 분광법에 의해 검출할 수 있는 화합물을 포함한다.
효과기 분자의 예는 세포에 유해한 (예를 들어, 치사시키는) 임의의 물질을 비롯한 세포독소 또는 세포독성제를 포함할 수 있다. 그 예는 콤브레스타틴, 돌라스타틴, 에포틸론, 스타우로스포린, 메이탄시노이드, 스폰기스타틴, 리족신, 할리콘드린, 로리딘, 헤미아스테린, 탁솔, 시토칼라신 B, 그라미시딘 D, 에티듐 브로마이드, 에메틴, 미토마이신, 에토포시드, 테노포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜히친, 독소루비신, 다우노루비신, 디히드록시 안트라신 디온, 미톡산트론, 미트라마이신, 악티노마이신 D, 1-데히드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀올 및 푸로마이신 및 그의 유사체 또는 상동체를 포함한다.
효과기 분자는 또한 항대사산물 (예를 들어, 메토트렉세이트, 6-머캅토퓨린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 5-플루오로우라실 데카르바진), 알킬화제 (예를 들어, 메클로레타민, 티오에파 클로람부실, 멜팔란, 카르무스틴 (BSNU) 및 로무스틴 (CCNU), 시클로포스파미드, 부술판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 미토마이신 C, 및 시스-디클로로디아민 백금 (II) (DDP) 시스플라틴), 안트라시이클린 (예를 들어, 다우노루비신 (이전에 다우노마이신) 및 독소루비신), 항생제 (예를 들어, 닥티노마이신 (이전에 악티노마이신), 블레오마이신, 미트라마이신, 안트라마이신 (AMC), 칼리케아미신 또는 두오카르마이신), 및 항-유사분열제 (예를 들어, 빈크리스틴 및 빈블라스틴)를 포함하고 이로 제한되지 않는다.
다른 효과기 분자는 킬레이팅된 방사성 핵종, 예를 들어 111In 및 90Y, Lu177, 비스무스2 13, 칼리포르뮴252, 인듐192 및 텅스텐188/레늄188 ; 또는 약물, 예를 들어 비제한적으로 알킬포스포콜린, 토포이소머라제 I 억제제, 탁소이드 및 수라민을 포함할 수 있다. 다른 효과기 분자는 단백질, 펩티드 및 효소를 포함한다. 관심있는 효소는 단백분해 효소, 히드롤라제, 리아제, 이소머라제, 트랜스퍼라제를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 관심있는 단백질, 폴리펩티드 및 펩티드는 면역글로불린; 독소, 예를 들어 아브린, 리신 A, 슈도모나스 외독소 또는 디프테리아 독소; 단백질, 예를 들어 인슐린, 종양 괴사 인자, α-인터페론, β-인터페론, 신경 성장 인자, 혈소판 유래 성장 인자 또는 조직 플라스미노겐 활성화제; 혈전제 또는 항-혈관신생제, 예를 들어 안지오스타틴 또는 엔도스타틴; 또는 생물학적 반응 변형제, 예를 들어 림포킨, 인터류킨-1 (IL-1), 인터류킨-2 (IL-2), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF), 과립구 콜로니 자극 인자 (G-CSF), 신경 성장 인자 (NGF) 또는 다른 성장 인자 및 면역글로불린을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
다른 효과기 분자는 예를 들어, 진단에 유용한 검출가능한 물질을 포함할 수 있다. 검출가능 물질의 예는 다양한 효소, 보결분자단 (prosthetic group), 형광 물질, 발광 물질, 생물발광 물질, 방사성 핵종, 양전자 방출 금속 (양전자 방출 단층촬영에서 사용하기 위한), 및 비방사성 상자성 금속 이온을 포함한다. 진단제로서 사용하기 위한 항체에 접합될 수 있는 금속 이온에 대해서는 일반적으로 미국 특허 4,741,900을 참조한다. 적합한 효소는 양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, 베타-갈락토시다제, 또는 아세틸콜린에스테라제를 포함하고; 적합한 보결분자단는 스트렙타비딘, 아비딘 및 비오틴을 포함하고; 적합한 형광 물질은 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 및 피코에리트린을 포함하고; 적합한 발광 물질은 루미놀을 포함하고; 적합한 생물발광 물질은 루시퍼라제, 루시페린, 및 애쿠오린을 포함하고; 적합한 방사성 핵종은 125I, 131I, 111In 및 99Tc를 포함한다.
또 다른 예에서, 효과기 분자는 항체의 생체내 반감기를 증가시키고/시키거나 항체의 면역원성을 감소시키고/시키거나 상피 장벽을 가로질러 면역계로의 항체 전달을 향상시킬 수 있다. 상기 종류의 적합한 효과기 분자의 예는 중합체, 알부민, 알부민 결합 단백질 또는 알부민 결합 화합물, 예를 들어 WO05/117984에 기재된 것을 포함한다.
효과기 분자가 중합체인 경우에, 일반적으로 합성 또는 천연 발생 중합체, 예를 들어 임의로 치환된 직쇄 또는 분지쇄 폴리알킬렌, 폴리알케닐렌 또는 폴리옥시알킬렌 중합체 또는 분지 또는 비분지형 폴리사카라이드, 예를 들어 동종- 또는 이종-폴리사카라이드일 수 있다.
상기 언급된 합성 중합체 상에 존재할 수 있는 구체적인 선택적인 치환기는 하나 이상의 히드록시, 메틸 또는 메톡시기를 포함한다.
합성 중합체의 구체적인 예는 임의로 치환된 직쇄 또는 분지쇄 폴리(에틸렌글리콜), 폴리(프로필렌글리콜), 폴리(비닐알콜) 또는 그의 유도체, 특히 임의로 치환된 폴리(에틸렌글리콜), 예를 들어 메톡시폴리(에틸렌글리콜) 또는 그의 유도체를 포함한다.
구체적인 자연 발생 중합체는 락토스, 아밀로스, 덱스트란, 글리코겐 또는 그의 유도체를 포함한다.
"유도체"는 본원에서 사용될 때 반응성 유도체, 예를 들어 티올-선택적 반응성 기, 예를 들어 말레이미드 등을 포함하는 것으로 의도된다. 반응성 기는 직접적으로 또는 링커 세그먼트를 통해 중합체에 연결될 수 있다. 그러한 기의 잔기는 일부 경우에 항체 단편 및 중합체 사이의 연결기로서 생성물의 일부를 형성할 것임이 이해될 것이다.
중합체의 크기는 원하는 대로 변화될 수 있지만, 일반적으로 평균 분자량이 500 Da 내지 50000 Da, 예를 들어 5000 내지 40000 Da, 예를 들어 20000 내지 40000 Da일 것이다. 중합체 크기는 특히 생성물의 의도된 용도, 예를 들어 종양과 같은 특정 조직에 국재화하거나 순환 반감기를 연장시키는 능력에 기초하여 선택될 수 있다 (검토를 위해 문헌 [Chapman, 2002, Advanced Drug Delivery Reviews, 54, 531-545] 참조). 따라서, 예를 들어, 생성물이 예를 들어, 종양 치료에 사용하기 위해 혈류를 떠나 조직으로 관통하도록 의도되는 경우에, 예를 들어 분자량이 약 5000 Da인 소분자량 중합체를 사용하는 것이 유리할 수 있다. 생성물이 혈류 내에 남는 용도의 경우에는, 예를 들어 분자량이 20000 Da 내지 40000 Da인 보다 고분자량 중합체를 사용하는 것이 유리할 수 있다.
적합한 중합체는 폴리알킬렌 중합체, 예를 들어 폴리(에틸렌글리콜) 또는 특히 메톡시폴리(에틸렌글리콜) 또는 그의 유도체, 특히 분자량이 약 15000 Da 내지 약 40000 Da인 것을 포함한다.
한 예에서, 본 발명에서 사용하기 위한 항체는 폴리(에틸렌글리콜) (PEG) 모이어티에 부착된다. 하나의 특정 예에서, 항체는 항체 단편이고, PEG 분자는 항체 단편 내에 위치하는 임의의 이용가능한 아미노산 측쇄 또는 말단 아미노산 관능기, 예를 들어 임의의 유리 아미노, 이미노, 티올, 히드록실 또는 카르복실기를 통해 부착될 수 있다. 그러한 아미노산은 항체 단편 내에서 자연 발생할 수 있거나, 재조합 DNA 방법을 이용하여 단편 내로 조작될 수 있다 (예를 들어 US 5,219,996, US 5,667,425, WO98/25971 참조). 한 예에서, 본 발명의 항체 분자는 변형된 Fab 단편이고, 여기서 변형은 효과기 분자의 부착을 허용하기 위해 그의 중쇄의 C-말단 단부에 하나 이상의 아미노산의 부가이다. 적합하게는, 추가의 아미노산은 효과기 분자가 부착할 수 있는 하나 이상의 시스테인 잔기를 함유하는 변형된 힌지 영역을 형성한다. 2개 이상의 PEG 분자를 부착하기 위해 다수 부위를 이용할 수 있다.
적합하게는, PEG 분자는 항체 단편 내에 위치하는 적어도 하나의 시스테인 잔기의 티올기를 통해 공유 연결된다. 변형된 항체 단편에 부착된 각각의 중합체 분자는 단편 내에 위치하는 시스테인 잔기의 황 원자에 공유 연결될 수 있다. 공유 연결은 일반적으로 디술피드 결합 또는 특히 항-탄소 결합일 것이다. 티올기가 부착 지점으로서 사용되는 경우에, 적절하게 활성화된 효과기 분자, 예를 들어 티올 선택적 유도체, 예를 들어 말레이미드 및 시스테인 유도체를 사용할 수 있다. 활성화된 중합체는 상기 기재된 중합체-변형된 항체 단편의 제조에서 출발 물질로서 사용할 수 있다. 활성화된 중합체는 티올 반응성 기, 예를 들어 α-할로카르복실산 또는 에스테르, 예를 들어 요오도아세타미드, 이미드, 예를 들어 말레이미드, 비닐 술폰 또는 디술피드를 함유하는 임의의 중합체일 수 있다. 그러한 출발 물질은 상업적으로 얻을 수 있거나 (예를 들어 넥타르 (Nektar) (이전의 쉬어워터 폴리머즈 인크. (Shearwater Polymers Inc, 미국 앨라배마주 헌츠빌))로부터), 통상적인 화학 절차를 사용하여 상업상 이용가능한 출발 물질로부터 제조할 수 있다. 특정 PEG 분자는 20 K 메톡시-PEG-아민 (넥타르 (이전의 쉬어워터); 래프 폴리미어 (Rapp Polymere); 및 선바이오 (SunBio)로부터 입수가능함) 및 M-PEG-SPA (넥타르 (이전의 쉬어워터)로부터 입수가능함)를 포함한다.
한 실시양태에서, 항체는 예를 들어 EP 0948544 또는 EP 1090037에 개시된 방법에 따라 PEG화된, 즉, 그에 공유 부착된 PEG (폴리(에틸렌글리콜))을 갖는 변형된 Fab 단편 또는 diFab이다 (또한, 문헌 (["Poly(ethyleneglycol) Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications", 1992, J. Milton Harris (ed), Plenum Press, New York], ["Poly(ethyleneglycol) Chemistry and Biological Applications", 1997, J. Milton Harris and S. Zalipsky (eds), American Chemical Society, Washington DC] 및 ["Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences", 1998, M. Aslam and A. Dent, Grove Publishers, New York], [Chapman, A. 2002, Advanced Drug Delivery Reviews 2002, 54 531-545]) 참조). 한 예에서, PEG는 힌지 영역 내의 시스테인에 부착된다. 한 예에서, PEG 변형된 Fab 단편은 변형된 힌지 영역 내의 단일 티올기에 공유 연결된 말레이미드 기를 갖는다. 리신 잔기는 말레이미드 기에 공유 연결될 수 있고, 리신 잔기 상의 각각의 아민기에는 분자량이 대략 20,000 Da인 메톡시폴리(에틸렌글리콜) 중합체가 부착될 수 있다. 따라서, Fab 단편에 부착된 PEG의 총 분자량은 대략 40,000 Da일 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열 9에 제시된 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 7에 제시된 서열을 포함하는 경쇄를 갖고, 그의 중쇄의 C-말단 단부에 효과기 분자가 그에 부착되는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 함유하는 변형된 힌지 영역을 갖는 변형된 Fab 단편인, 인간 OX40에 대한 특이성을 갖는 길항성 항체 분자를 제공한다. 적합하게는, 효과기 분자는 PEG이고, WO98/25971 및 WO2004072116에 또는 WO2007/003898에 기재된 방법을 이용하여 부착된다. 적합하게는, 효과기 분자는 리실-말레이미드 기가 중쇄의 C-말단 단부에서 시스테인 잔기에 부착되는 방식으로 부착되고, 리실 잔기의 각각의 아미노 기는 그에 공유 연결된, 분자량이 약 20,000 Da인 메톡시폴리(에틸렌글리콜) 잔기를 갖는다. 따라서, 항체에 부착된 PEG의 총 분자량은 대략 40,000 Da이다. 특정 PEG 분자는 PEG2MAL40K (넥타르 (이전의 쉬어워터)로부터 입수가능함)로서도 공지된 N,N'-비스(메톡시폴리(에틸렌 글리콜) MW 20,000) 변형된 리신의 2-[3-(N-말레이미도)프로피온아미도]에틸 아미드를 포함한다.
PEG 링커의 다른 공급원은 GL2-400MA2 (여기서, 아래 구조에서 m은 5이다) 및 GL2-400MA (여기서 m은 2이다)를 공급하는 NOF를 포함하고, n은 약 450이다:
Figure pct00001
m은 2 또는 5이다.
즉, 각각의 PEG는 약 20,000 Da이다. 다음 종류의 추가의 다른 PEG 효과기 분자가 닥터 레디 (Dr Reddy), NOF 및 젠켐 (Jenkem)으로부터 이용가능하다.
Figure pct00002
한 실시양태에서, 사슬 내의 아미노산 226에서 또는 그 부위에서, 예를 들어 중쇄의 아미노산 226 (순차적인 넘버링에 의해)에서 시스테인 아미노산 잔기를 통해 부착된 PEG화된 (예를 들어, 본원에 기재된 PEG로) 항체를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열 15에 제시된 서열을 포함하거나 그로 이루어지는 중쇄 및 서열 11에 제시된 서열을 포함하거나 그로 이루어지는 경쇄를 갖고 중쇄의 위치 226 (서열 15의 선형 넘버링)에서 시스테인에 부착된 효과기 분자를 갖는 변형된 Fab 단편인, 인간 OX40에 대해 특이성을 갖는 길항성 항체 분자를 제공한다. 적합하게는, 효과기 분자는 PEG이고, WO98/25971 및 WO2004072116 또는 WO2007/003898에 기재된 방법을 이용하여 부착되고, 리실-말레이미드 기는 중쇄 (서열 15)의 위치 226에서 시스테인 잔기에 부착되고, 리실 잔기의 각각의 아미노 기는 그에 공유 연결된, 분자량이 약 20,000 Da인 메톡시폴리(에틸렌글리콜) 잔기를 갖는다. 따라서, 항체에 부착된 PEG의 총 분자량은 대략 40,000 Da이다. 특정 PEG 분자는 PEG2MAL40K (넥타르 (이전의 쉬어워터)로부터 입수가능함)로서도 공지된 N,N'-비스(메톡시폴리(에틸렌 글리콜) MW 20,000) 변형된 리신의 2-[3-(N-말레이미도)프로피온아미도]에틸 아미드를 포함한다. 적합하게는, 본 발명의 항체 분자는 도 2에 제시된 PEG화된 변형된 Fab' 단편이다. 상기 PEG화 분자는 본원에서 A26Fab'-PEG로서 칭한다.
또 다른 예에서, 효과기 분자는 특허 출원 WO2005/003169, WO2005/003170 및 WO2005/003171에 기재된 방법을 이용하여 항체 단편에 부착될 수 있다.
본 발명은 본 발명의 항체 분자의 중쇄 및/또는 경쇄(들)을 코딩하는 단리된 DNA 서열을 또한 제공한다. 적합하게는, DNA 서열은 본 발명의 항체 분자의 중쇄 또는 경쇄를 코딩한다. 본 발명의 DNA 서열은 예를 들어, 화학적 처리에 의해 생성된 합성 DNA, cDNA, 게놈 DNA 또는 그의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 본 발명의 항체 분자를 코딩하는 DNA 서열은 당업자에게 잘 공지된 방법에 의해 얻을 수 있다. 예를 들어, 항체 중쇄 및 경쇄의 일부 또는 전부를 코딩하는 DNA 서열은 결정된 DNA 서열로부터 또는 상응하는 아미노산 서열에 기초하여 원하는 대로 합성할 수 있다.
수여자 프레임워크 서열을 코딩하는 DNA는 당업자에게 널리 이용가능하고, 그들의 공지된 아미노산 서열에 기초하여 쉽게 합성할 수 있다.
본 발명의 항체 분자를 코딩하는 DNA 서열을 제조하기 위해 분자 생물학의 표준 기술을 이용할 수 있다. 목적하는 DNA 서열은 올리고뉴클레오티드 합성 기술을 이용하여 완전히 또는 부분적으로 합성할 수 있다. 부위-지정 돌연변이 유발 및 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 기술을 적절하게 이용할 수 있다.
적합한 서열의 예를 도 1(h) 서열 8; 도 1(i) 서열 10; 도 1(j) 서열 13; 도 1(k) 서열 14; 도 1(l) 서열 17; 및 도 1(m) 서열 18에 제시한다. 서열 18의 뉴클레오티드 1-63 및 서열 14의 뉴클레오티드 1-63은 신호 펩티드 서열 OmpA를 코딩하고, 이는 절단되어 본 발명의 길항성 항체 분자를 제공한다 (신호 펩티드는 각각 도 1(g) 서열 16의 아미노산 잔기 1-21 및 도 1(e) 서열 12의 아미노산 잔기 1-21에 상응한다). 본 발명은 서열 17 또는 서열 18을 포함하는 본 발명의 항체의 중쇄를 코딩하는 단리된 DNA 서열을 또한 제공한다. 본 발명은 서열 13 또는 서열 14를 포함하는 본 발명의 항체의 경쇄를 코딩하는 단리된 DNA 서열을 또한 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 하나 이상의 DNA 서열을 포함하는 클로닝 또는 발현 벡터에 관한 것이다. 따라서, 본 발명의 항체를 코딩하는 하나 이상의 DNA 서열을 포함하는 클로닝 또는 발현 벡터를 제공한다. 적합하게는, 클로닝 또는 발현 벡터는 각각 본 발명의 항체 분자의 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 2개의 DNA 서열을 포함한다. 적합하게는, 본 발명에 따른 벡터는 서열 14 및 서열 18에 제시된 서열을 포함한다. 서열 18 내의 뉴클레오티드 1-63 및 서열 14의 뉴클레오티드 1-63은 OmpA로부터의 신호 펩티드 서열 (각각 서열 16의 잔기 1-21 및 서열 12의 잔기 1-21)을 코딩하고, 이는 가장 적합하게 절단되어 본 발명의 중화 항체 분자를 제공한다. 한 예에서, 벡터는 중쇄 및 경쇄 사이에 유전자간 (intergenic) 서열, 예를 들어 IGS2를 포함한다 (WO03/048208 참조). 따라서 한 실시양태에서, 본 발명의 벡터는 도 1(n) (서열 19)에 제시된 서열을 포함한다.
벡터를 제작할 수 있는 일반적인 방법, 형질감염 방법 및 배양 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 이와 관련하여, 문헌 ["Current Protocols in Molecular Biology", 1999, F.M. Ausubel (ed), Wiley Interscience, New York and the Maniatis Manual produced by Cold Spring Harbor Publishing]을 참조한다.
본 발명의 항체를 코딩하는 하나 이상의 DNA 서열을 포함하는 하나 이상의 클로닝 또는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 또한 제공한다. 본 발명의 항체 분자를 코딩하는 DNA 서열의 발현을 위해 임의의 적합한 숙주 세포/벡터 시스템을 사용할 수 있다. 세균, 예를 들어 이. 콜라이 및 다른 미생물 시스템을 사용할 수 있거나, 진핵 (예를 들어, 포유동물) 숙주 세포 발현 시스템을 또한 사용할 수 있다. 적합한 포유동물 숙주 세포는 CHO, 골수종 또는 하이브리도마 세포를 포함한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 벡터를 함유하는 숙주 세포를, 본 발명의 항체 분자를 코딩하는 DNA로부터 단백질 발현을 일으키기에 적합한 조건 하에 배양하고, 항체 분자를 단리하는 것을 포함하는, 본 발명에 따른 항체 분자의 생성 공정을 제공한다.
항체 분자는 중쇄 또는 경쇄 폴리펩티드만을 포함할 수 있고, 이 경우에 중쇄 또는 경쇄 폴리펩티드 코딩 서열만이 숙주 세포를 형질감염시키기 위해 사용될 필요가 있다. 중쇄 및 경쇄를 모두 포함하는 생성물의 생성을 위해, 세포주를 경쇄 폴리펩티드를 코딩하는 제1 벡터 및 중쇄 폴리펩티드를 코딩하는 제2 벡터를 포함하는 2개의 벡터로 형질감염시킬 수 있다. 별법으로, 경쇄 및 중쇄 폴리펩티드를 코딩하는 서열들을 포함하는 단일 벡터를 사용할 수 있다.
본원에 따른 항체 및 단편은 숙주 세포로부터 우수한 수준으로 발현된다. 따라서, 항체 및/또는 단편의 특성은 상업적인 처리를 위해 최적화되고 도움이 된다.
본 발명의 항체는 병리학적 상태의 치료 및/또는 예방에서 유용하므로, 본 발명은 또한 본 발명의 항체 분자를 하나 이상의 제약상 허용되는 부형제, 희석제 또는 담체와 조합으로 포함하는 제약 또는 진단 조성물을 제공한다. 따라서, 의약의 제조를 위한 본 발명의 항체의 용도를 제공한다. 대체로 조성물은 보통 제약상 허용되는 담체를 포함할 멸균 제약 조성물의 일부로서 공급될 것이다. 본 발명의 제약 조성물은 제약상 허용되는 보조제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 본 발명의 항체 분자를 첨가하고 하나 이상의 제약상 허용되는 부형제, 희석제 또는 담체와 함께 혼합하는 것을 포함하는, 제약 또는 진단 조성물의 제조 공정을 또한 제공한다.
항체 분자는 제약 또는 진단 조성물 내의 유일한 활성 성분일 수 있거나, 다른 항체 성분, 예를 들어 항-TNF, 항-IL-1β, 항-T 세포, 항-IFNγ 또는 항-LPS 항체, 또는 비-항체 성분, 예를 들어 잔틴을 포함한 다른 활성 성분을 동반할 수 있다. 다른 적합한 활성 성분은 내성을 유도할 수 있는 항체, 예를 들어, 항-CD3 또는 항-CD4 항체를 포함한다.
추가의 실시양태에서, 본원에 따른 항체, 단편 또는 조성물은 추가의 제약상 활성 물질, 예를 들어 코티코스테로이드 (예를 들어, 플루티카손 프로피오네이트) 및/또는 베타-2-효능제 (예를 들어, 살부타몰, 살메테롤 또는 포르모테롤) 또는 세포 성장 및 증식의 억제제 (예를 들어, 라파마이신, 시클로포스파미드, 메토트렉세이트) 또는 다른 CD28 및/또는 CD40 억제제와 조합으로 사용된다. 한 실시양태에서, 억제제는 소분자이다. 또 다른 실시양태에서, 억제제는 표적에 특이적인 항체이다.
제약 조성물은 적합하게는 치료 유효량의 본 발명의 항체를 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "치료 유효량"은 표적화된 질환 또는 상태의 치료, 개선 또는 억제를 위해, 또는 검출가능한 치료 또는 예방 효과를 보이기 위해 필요한 치료제의 양을 나타낸다. 임의의 항체에 대해, 치료 유효량은 초기에 세포 배양액 분석에서 또는 동물 모델에서, 대체로 설치류, 토끼, 개, 돼지 또는 영장류에서 추정할 수 있다. 적절한 농도 범위 및 투여 경로를 결정하기 위해 동물 모델을 또한 사용할 수 있다. 이어서, 인간에서 유용한 용량 및 투여 경로를 결정하기 위해 그러한 정보를 이용할 수 있다.
인간 대상체에 대한 정확한 치료 유효량은 질환 상태의 중증도, 대상체의 전반적인 건강, 대상체의 연령, 체중 빛 성별, 식이, 투여 시간 및 빈도, 약물 조합(들), 반응 감수성 및 치료에 대한 내성/반응에 따라 결정될 것이다. 상기 양은 일상적인 실험에 의해 결정할 수 있고, 임상의의 판단 범위 내에 있다. 일반적으로, 치료 유효량은 0.01 mg/kg 내지 50 mg/kg, 예를 들어 0.1 mg/kg 내지 20 mg/kg일 것이다. 제약 조성물은 편리하게는 투여 당 소정량의 본 발명의 활성 물질을 함유하는 단위 투여 형태로 제공될 수 있다.
조성물은 환자에게 개별적으로 투여될 수 있거나, 다른 물질, 약물 또는 호르몬과 조합으로 (예를 들어, 동시에, 순차적으로 또는 따로) 투여될 수 있다.
본 발명의 항체 분자가 투여되는 용량은 치료할 상태의 성질, 존재하는 염증의 정도 및 항체 분자가 예방 목적으로 또는 존재하는 상태를 치료하기 위해 사용되는지의 여부에 따라 결정된다.
투여 빈도는 항체 분자의 반감기 및 효과의 지속시간에 따라 결정될 것이다. 항체 분자의 반감기가 짧으면 (예를 들어, 2 내지 10시간), 매일 1회 이상의 용량을 제공하는 것이 필요할 수 있다. 별법으로, 항체 분자의 반감기가 길면 (예를 들어, 2 내지 15일), 단지 매일 1회, 매주 1회 또는 심지어 1 또는 2개월마다 1회로 투여량을 제공하는 것이 필요할 수 있다.
제약상 허용되는 담체는 자체가 조성물을 투여받는 개체에 해로운 항체의 생성을 유도하지 않아야 하고, 독성이 아니어야 한다. 적합한 담체는 크고 느리게 대사되는 거대분자, 예를 들어 단백질, 폴리펩티드, 리포좀, 폴리사카라이드, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 중합체 아미노산, 아미노산 공중합체 및 불활성 바이러스 입자일 수 있다.
제약상 허용되는 염, 예를 들어 무기산 염, 예를 들어 염산염, 브롬화수소산염, 인산염 및 황산염, 또는 유기산의 염, 예를 들어 아세테이트, 프로피오네이트, 말로네이트 및 벤조에이트를 사용할 수 있다.
치료 조성물 내의 제약상 허용되는 담체는 액체, 예를 들어 물, 염수, 글리세롤 및 에탄올을 추가로 함유할 수 있다. 추가로, 보조 물질, 예를 들어 습윤 또는 유화제 또는 pH 완충 물질이 그러한 조성물 내에 존재할 수 있다. 그러한 담체로 인해 제약 조성물은 환자에 의한 섭취를 위해 정제, 알약, 당의정, 캡슐, 액체, 겔, 시럽, 슬러리 및 현탁액으로서 제형화될 수 있다.
투여에 적합한 형태는 예를 들어 주사 또는 주입, 예를 들어 볼러스 주사 또는 연속 주입에 의한 비경구 투여에 적합한 형태를 포함한다. 생성물이 주사 또는 주입을 위한 경우에 유성 또는 수성 비히클 내의 현탁액, 용액 또는 에멀젼의 형태를 취할 수 있고, 제형화 물질, 예를 들어 현탁제, 방부제, 안정화제 및/또는 분산제를 함유할 수 있다. 별법으로, 항체 분자는 사용 전에 적절한 멸균 액체로 재구성하기 위한 건조 형태로 존재할 수 있다.
일단 제형화되면, 본 발명은 조성물은 대상체에게 직접 투여될 수 있다. 치료할 대상체는 동물일 수 있다. 그러나, 하나 이상의 실시양태에서, 조성물은 인간 대상체에게 투여하기 위해 조정된다.
적합하게는, 본원에 따른 제형에서, 최종 제형의 pH는 항체 또는 단편의 등전점 값과 유사하지 않고, 예를 들어 제형의 pH가 7이면, 8-9 또는 그 이상의 pI가 적절할 수 있다. 이론에 매이기를 바라지 않지만, 이것은 궁극적으로 최종 제형에 개선된 안정성을 제공할 수 있는 것으로 생각되고, 예를 들어 항체 또는 단편은 용액 내에 유지된다.
한 실시양태에서, pH 4.0 내지 7.0의 제약 제형은 1 내지 200 mg/mL의 본원에 따른 항체, 1 내지 100 mM의 버퍼, 0.001 내지 1%의 계면활성제, a) 10 내지 500 mM의 안정화제, b) 10 내지 500 mM의 안정화제 및 5 내지 500 mM의 긴장성 (tonicity) 물질, 또는 c) 5 내지 500 mM의 긴장성 물질을 포함한다.
예를 들어, 대략 pH 6의 제형은 1 내지 50 mg/mL의 항체, 20 mM L-히스티딘 HCl, 240 mM 트레할로스 및 0.02% 폴리소르베이트 20을 포함할 수 있다. 별법으로, 대략 pH 5.5의 제형은 1 내지 50 mg/mL의 항체, 20 mM 시트레이트 버퍼, 240 mM 수크로스, 20 mM 아르기닌, 및 0.02% 폴리소르베이트 20을 포함할 수 있다.
본 발명의 제약 조성물은 경구, 정맥내, 근육내, 동맥내, 척수내, 경막내, 뇌실내, 경피, 경피성 (예를 들어, WO98/20734 참조), 피하, 복강내, 비내, 소화관내, 국소, 설하, 질내 또는 직장 경로를 포함하고 이로 제한되지 않는 임의의 많은 경로에 의해 투여할 수 있다. 본 발명의 제약 조성물을 투여하기 위해 하이포스프레이를 또한 사용할 수 있다. 대개, 치료 조성물은 액체 용액 또는 현탁액으로서 주사가능하도록 제조할 수 있다. 주사 전에 액체 비히클 내에 용해 또는 현탁시키기 적합한 고체형을 또한 제조할 수 있다.
조성물의 직접 전달은 일반적으로 주사, 피하, 복강내, 정맥내 또는 근육내로 달성될 것이거나, 조직의 사이질 공간 내로 전달된다. 조성물은 또한 병변 내로 투여될 수 있다. 투약 치료는 단일 투여 스케쥴 또는 다중 투여 스케쥴일 수 있다.
조성물 내의 활성 성분은 항체 분자일 것임이 이해될 것이다. 따라서, 이는 위장관 내에서 분해에 대해 감수성일 것이다. 따라서, 조성물이 위장관을 이용한 경로로 투여되어야 하는 경우에, 조성물은 분해로부터 항체를 보호하지만 항체가 위장관으로부터 흡수된 후에 항체를 방출하는 물질을 함유할 필요가 있을 것이다.
제약상 허용되는 담체에 대한 완전한 논의는 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, N.J. 1991)]에서 이용가능하다.
한 실시양태에서, 제형은 흡입을 비롯한 국소 투여용 제형으로서 제공된다.
적합한 흡입가능 제제는 흡입가능 분말, 추진제 기체를 함유하는 계량식 (metering) 에어로졸, 또는 추진제 기체가 없는 흡입가능 용액을 포함한다. 활성 물질을 함유하는 본원에 따른 흡입가능 분말은 전적으로 상기 언급된 활성 물질 또는 상기 언급된 활성 물질과 생리학상 허용되는 부형제의 혼합물로 이루어진다.
이들 흡입가능 분말은 모노사카라이드 (예를 들어, 글루코스 또는 아라비노스), 디사카라이드 (예를 들어, 락토스, 사카로스, 말토스), 올리고사카라이드 및 폴리사카라이드 (예를 들어, 덱스트란), 폴리알콜 (예를 들어, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨), 염 (예를 들어, 염화나트륨, 탄산칼슘) 또는 이들과 서로의 혼합물을 포함할 수 있다. 모노사카라이드 또는 디사카라이드가 적합하게 사용되고, 락토스 또는 글루코스가, 전적으로는 아니지만 특히 그들의 수화물 형태로 사용된다.
폐 내 침착을 위한 입자는 입자 크기가 10 마이크로미터 미만, 예를 들어 1-9 마이크로미터, 예를 들어 0.1 내지 5 ㎛, 특히 1 내지 5 ㎛일 것을 필요로 한다. 활성 성분 (예를 들어, 항체 또는 단편)의 입자 크기가 제일 중요하다.
흡입가능 에어로졸을 제조하기 위해 사용할 수 있는 추진제 기체는 당업계에 공지되어 있다. 적합한 추진제 기체는 탄화수소, 예를 들어 n-프로판, n-부탄 또는 이소부탄 및 할로탄화수소, 예를 들어 메탄, 에탄, 프로판, 부탄, 시클로프로판 또는 시클로부탄의 염화 및/또는 불화 유도체 중에서 선택된다. 상기 언급된 추진제 기체는 그 자체로 또는 그의 혼합물로 사용할 수 있다.
특히 적합한 추진제 기체는 TG 11, TG 12, TG 134a 및 TG227 중에서 선택되는 할로겐화 알칸 유도체이다. 상기 언급된 할로겐화 탄화수소 중에서, TG 134a (1,1,1,2-테트라플루오로에탄) 및 TG227 (1,1,1,2,3,3,3-헵타플루오로프로판) 및 그의 혼합물이 특히 적합하다.
또한, 추진제 기체-함유 흡입가능 에어로졸은 다른 성분, 예를 들어 공용매, 안정화제, 표면-활성제 (계면활성제), 항산화제, 윤활제 및 pH 조정 수단을 함유할 수 있다. 이들 모든 성분은 당업계에 공지되어 있다.
본 발명에 따른 추진제 기체-함유 흡입가능 에어로졸은 5 중량% 이하의 활성 성분을 함유할 수 있다. 본 발명에 따른 에어로졸은 예를 들어 0.002 내지 5 중량%, 0.01 내지 3 중량%, 0.015 내지 2 중량%, 0.1 내지 2 중량%, 0.5 내지 2 중량% 또는 0.5 내지 1 중량%의 활성 성분을 함유한다.
별법으로, 폐에 대한 국소 투여는 또한 예를 들어, 네뷸라이저 (nebulizer), 예를 들어, 압축기에 연결된 네뷸라이저 (예를 들어, 파리 레스피래토리 이큅먼트, 인크. (Pari Respiratory Equipment, Inc., 미국 버지니아주 리치먼드)에서 제조된 Pari Master(R) 압축기에 연결된 Pari LC-Jet Plus(R) 네뷸라이저)와 같은 장치를 이용하는 액체 용액 또는 현탁액 제형의 투여에 의할 수 있다.
본 발명의 항체는 용매 내에 분산되어, 예를 들어, 용액 또는 현탁액 형태로 전달될 수 있다. 항체는 적절한 생리학적 용액, 예를 들어, 염수 또는 다른 약물학상 허용되는 용매 또는 완충 용액 내에 현탁될 수 있다. 당업계에 공지된 완충 용액은 약 4.0 내지 5.0의 pH를 달성하기 위해 물 1 mL당 0.05 mg 내지 0.15 mg 에데트산이나트륨, 8.0 mg 내지 9.0 mg NaCl, 0.15 mg 내지 0.25 mg 폴리소르베이트, 0.25 mg 내지 0.30 mg 무수 시트르산, 및 0.45 mg 내지 0.55 mg 시트르산나트륨을 함유할 수 있다. 현탁액은 예를 들어, 동결건조된 항체를 사용할 수 있다.
치료 현탁액 또는 용액 제형은 또한 하나 이상의 부형제를 함유할 수 있다. 부형제는 당업계에 잘 공지되어 있고, 버퍼 (예를 들어, 시트레이트 버퍼, 포스페이트 버퍼, 아세테이트 버퍼 및 중탄산염 버퍼), 아미노산, 우레아, 알콜, 아스코르브산, 인지질, 단백질 (예를 들어, 혈청 알부민), EDTA, 염화나트륨, 리포좀, 만니톨, 소르비톨 및 글리세롤을 포함한다. 용액 또는 현탁액은 리포좀 또는 생분해성 미세구 내에 캡슐화될 수 있다. 제형은 일반적으로 멸균 제조 공정을 이용하여 실질적으로 멸균 형태로 제공될 것이다.
이것은 당업자에게 친숙한 방법에 의한 제형화에 사용된 완충된 용매/용액의 여과, 멸균 완충된 용매 용액 내에 항체의 무균 현탁, 및 멸균 용기 내로 제형의 분배에 의한 생성 및 멸균을 포함할 수 있다.
본원에 따른 분사가능 제형은 예를 들어 호일 외피 (foil envelope) 내에 충전된 단일 용량 단위 (예를 들어, 밀봉 플라스틱 용기 또는 바이알)로서 제공될 수 있다. 각각의 바이알은 일정 부피, 예를 들어, 2 mL의 용매/용액 버퍼 내에 단위 용량을 함유한다.
본원에 개시된 항체는 분사를 통한 전달에 적합할 수 있다.
본 발명의 항체는 유전자 치료를 이용하여 투여될 수 있음이 또한 고안된다. 이를 달성하기 위해, 적절한 DNA 성분의 제어 하에 항체 분자의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 DNA 서열을 환자 내로 도입시켜, 항체 사슬이 DNA 서열로부터 발현되고 계내에서 (in situ) 조립되도록 한다.
본 발명은 염증성 질환, 예를 들어 급성 또는 만성 염증성 질환의 제어에 사용하기 위한 항체 분자 (또는 그를 포함하는 조성물)를 또한 제공한다. 적합하게는, 항체 분자 (또는 그를 포함하는 조성물)를 염증 과정을 감소시키기 위해 또는 염증 과정을 예방하기 위해 사용할 수 있다. 한 실시양태에서, 활성화된 T 세포, 특히 예를 들어 부적절한 염증성 면역 반응의 위치/부근에 동원되는 부적절한 염증성 면역 반응에 관련된 것의 생체내 감소를 제공한다.
본원에서 사용되는 활성화된 T 세포의 감소는 치료 전 또는 치료가 없는 경우에 비해 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90% 이상의 감소일 수 있다. 유리하게는, 본 발명에 따른 항체, 단편 또는 조성물을 사용한 치료는 T 세포 (활성화되지 않은 T 세포)의 환자의 전반적인 수준을 감소시키지 않으면서 활성화된 T 세포의 수준 감소를 허용할 수 있다. 이것은 보다 적은 부작용을 생성시키고, 가능하게는 환자에서 T 세포 결핍을 방지한다.
본 발명은 OX40에 의해 매개되거나 증가된 수준의 OX40과 연관된 병리학적 장애의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 본 발명의 항체 분자를 또한 제공한다. 병리학적 상태는 예를 들어, 감염 (바이러스, 세균, 진균 및 기생충), 감염과 연관된 내독소 쇼크, 관절염, 류마티스 관절염, 천식, COPD, 골반 염증성 질환, 알츠하이머 (Alzheimer) 병, 염증성 장 질환, 크론병, 궤양 대장염, 페로니 (Peyronie) 병, 복강 (coeliac) 질환, 담낭 질환, 모소 (Pilonidal) 질환, 복막염, 건선, 혈관염, 수술적 유착, 뇌졸중, I형 당뇨병, 라임 (lyme) 병, 관절염, 수막뇌염, 자가면역 포도막염, 중추 및 말초 신경계의 면역 매개 염증성 질환, 예를 들어 다발 경화증, 루푸스 (예를 들어 전신 홍반성 루푸스) 및 길랑-바레 (Guillain-Barr) 증후군, 아토피 피부염, 자가면역 간염, 섬유화 폐포염, 그레이브 (Grave) 병, IgA 신장병증, 특발성 혈소판감소성 자반증, 메니에르 (Meniere) 병, 천포창, 원발 담관 간경화증, 사코이드증 (sarcoidosis), 공피증, 베게너 (Wegener) 육아종증, 다른 자가면역 질환, 췌장염, 외상 (수술), 이식편-대-숙주 질환, 이식 거부, 심장 질환, 예를 들어 허혈성 질환, 예를 들어 심근 경색 및 아테롬성경화증, 혈관내 응고, 뼈 흡수, 골다공증, 골관절염, 치주염 및 저염산증으로 이루어지는 군 중에서 선택될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체는 알레르기, COPD, 자가면역 질환 또는 류마티스 관절염의 치료에 사용된다.
본 발명은 통증, 특히 염증과 연관된 통증의 치료 또는 예방에서 사용하기 위한 본 발명에 따른 항체 분자를 또한 제공한다.
본 발명은 추가로 OX40에 의해 매개되거나 증가된 수준의 OX40과 연관되는 병리학적 장애의 치료 또는 예방용 의약의 제조에 있어서 본 발명에 따른 항체 분자, 단편 또는 조성물의 용도를 제공하고, 특히 병리학적 장애는 류마티스 관절염, 천식 또는 COPD이다.
본 발명은 추가로 본원에 기재된 하나 이상의 의학 적응증의 치료 또는 예방용 의약의 제조에 있어서 본 발명에 따른 항체 분자, 단편 또는 조성물의 용도를 제공한다.
본 발명의 항체 분자, 단편 또는 조성물은 인간 또는 동물 신체에서 OX40 효과의 감소를 원하는 임의의 치료법에서 사용할 수 있다. OX40은 체내에서 순환할 수 있거나, 신체의 특정 부위에, 예를 들어 염증의 부위에 국재화된 바람직하지 않게 높은 수준으로 존재할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항체 분자 또는 그를 포함하는 조성물은 예를 들어 본원에 기재된 염증성 질환의 제어에 사용된다.
본 발명은 또한 대상체에게 유효량의 본 발명의 항체 분자 또는 그를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, OX40에 의해 매개되는 질환에 걸린 또는 걸릴 위험이 있는 인간 또는 동물 대상체를 치료하는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 불순물이 컬럼 상에 보유되고 항체가 용출되도록 비-결합 방식으로 음이온 교환 크로마토그래피를 수행하는 단계를 포함하는, 항체 (특히, 본 발명에 따른 항체 또는 단편)의 정제 공정을 제공한다.
공정에 사용하기에 적합한 이온 교환 수지는 Q.FF 수지 (지이-헬쓰케어 (GE-Healthcare)에서 공급됨)를 포함한다. 단계는 예를 들어 약 8의 pH에서 수행할 수 있다.
공정은 예를 들어 약 4 내지 5, 예를 들어 4.5의 pH에서 수행되는 양이온 교환 크로마토그래피를 이용하는 초기 포획 단계를 추가로 포함할 수 있다. 양이온 교환 크로마토그래피에서는 예를 들어 CaptoS 수지 또는 SP 세파로스 FF (지이-헬쓰케어에서 공급됨)와 같은 수지를 사용할 수 있다. 이어서, 항체 또는 단편은 이온성 염 용액, 예를 들어 염화나트륨을 예를 들어, 200 mM의 농도에서 사용하여 수지로부터 용출될 수 있다.
따라서, 크로마토그래피 단계(들)은 적절하게 하나 이상의 세척 단계를 포함할 수 있다.
정제 공정은 또한 하나 이상의 여과 단계, 예를 들어 정용여과 단계를 포함할 수 있다.
항체 또는 단편의 8 초과, 예를 들어 8.5, 8.6, 8.7, 8.8 또는 9.0의 pI가 불순물, 예를 들어 내독소, DNA 및 숙주 세포 단백질이 "없는" 또는 "실질적으로 없는" 항체 또는 단편을 제공하도록 정제를 돕는 것으로 생각된다.
따라서, 한 실시양태에서, 내독소 및/또는 숙주 세포 단백질 또는 DNA를 실질적으로 정제한, 특히 그가 없는 또는 실질적으로 없는 정제된 OX40 항체 또는 단편, 예를 들어 인간화 항체 또는 단편, 특히 본 발명에 따른 항체 또는 단편을 제공한다.
상기 사용된 정제된 형태는 적어도 90% 순도, 예를 들어 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% w/w 이상 순수한 것을 나타내도록 의도된다.
"내독소가 실질적으로 없는"은 일반적으로 항체 생성물 1 mg당 1 EU 이하, 예를 들어 생성물 1 mg당 0.5 또는 0.1 EU의 내독소 함량을 나타내도록 의도된다.
"숙주 세포 단백질 또는 DNA가 실질적으로 없는"은 일반적으로 적절하게 항체 생성물 1 mg당 400 ㎍ 이하, 예를 들어 1 mg당 100 ㎍ 이하, 특히 1 mg당 20 ㎍의 숙주 세포 단백질 및/또는 DNA 함량을 나타내도록 의도된다.
본 발명의 항체 분자는 또한 OX40이 수반된 질환 상태의 진단, 예를 들어 생체내 진단 및 영상화에 또한 사용할 수 있다.
'구성되는'은 본 명세서의 문맥에서 '포함하는'을 의미하는 것으로 의도된다.
기술상 적절한 경우에, 본 발명의 실시양태들을 조합할 수 있다.
실시양태는 특정 특색/요소를 포함하는 것으로서 본원에 설명된다. 본원은 또한 상기 특색/요소로 이루어지거나 본질적으로 이루어지는 별개의 실시양태로 연장한다.
본 발명을 단지 예시로서 첨부 도면을 언급하는 다음 실시예에서 추가로 설명한다.
실시예
도 1 (상세하게):
a) 항체 A26의 경쇄 V 영역 (서열 7).
b) 항체 A26의 중쇄 V 영역 (서열 9).
c) 항체 A26의 CDRH1 (서열 1), CDRH2 (서열 2), CDRH3 (서열 3), CDRL1 (서열 4), CDRL2 (서열 5), CDRL3 (서열 6), 및 항체 CA044_00026의 CDRH2 (서열 20) 및 CDRL1 (서열 21).
d) 항체 A26의 경쇄 (서열 11).
e) 신호 서열 (밑줄침)을 포함하는 항체 A26의 경쇄 (서열 12).
f) 항체 A26의 중쇄 (서열 15).
g) 신호 서열 (밑줄침)을 포함하는 항체 A26의 중쇄 (서열 16).
h) 항체 A26의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 DNA (서열 8).
i) 항체 A26의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 DNA (서열 10).
j) 항체 A26의 경쇄를 코딩하는 DNA (서열 13).
k) 신호 서열을 포함하는 항체 A26의 경쇄를 코딩하는 DNA (서열 14).
l) 항체 A26의 중쇄를 코딩하는 DNA (서열 17).
m) 신호 서열을 포함하는 항체 A26의 중쇄를 코딩하는 DNA (서열 18).
n) 신호 서열 및 유전자간 서열 IGS2를 포함하는 항체 A26의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 DNA (서열 19).
DNA 조작 및 일반적인 방법
이. 콜라이 균주 INVαF' (인비트로겐 (Invitrogen))을 형질전환 및 일상적인 배양 성장을 위해 사용하였다. DNA 제한 및 변형 효소는 로슈 다이아그노스틱스 엘티디. (Roche Diagnostics Ltd.) 및 뉴 잉글랜드 바이오랩스 (New England Biolabs)로부터 입수하였다. 플라스미드 제조는 Maxi 플라스미드 정제 키트 (퀴아겐 (QIAGEN), 카탈로그 No 12165)를 사용하여 수행하였다. DNA 서열결정 반응은 ABI Prism Big Dye 종결자 서열결정 키트 (카탈로그 No 4304149)를 사용하여 수행하고, ABI 3100 자동화 서열결정 장치 (어플라이드 바이오시스템즈 (Applied Biosystems)) 상에서 진행시켰다. 데이타는 프로그램 오토어셈블러 (AutoAssembler) (어플라이드 바이오시스템즈)를 이용하여 분석하였다. 올리고뉴클레오티드는 인비트로겐으로부터 입수하였다. 초기 V-영역 서열을 코딩하는 유전자를 엔텔레콘 게엠베하 (Entelechon GmbH)에서 자동화 합성 방법에 의해 설계하고 제작하고, 올리고뉴클레오티드 지정 돌연변이 유발에 의해 변형시켜 그라프팅된 버전을 생성하였다. Fab'의 농도는 Fab' 조립 ELISA를 이용하여 결정하였다.
실시예 1: 중화 항- OX40 항체 A26의 생성 및 인간화
암컷 스프라그 돌리 (Sprague Dawly) 래트를 인간 OX40 및 mFC의 재조합 융합 단백질로 면역화시켰다. 인간 OX-40에 결합하는 항체 CA044_00026은 WO92/02551에 기재된 방법을 이용하여 단리하였다. 항체 CA044_00026의 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 경쇄 가변 도메인 (VL)에 대한 유전자를 단리하고 역전사 PCR을 통한 클로닝 후에 서열결정하였다.
일련의 인간화 VL 및 VH 영역을 인간 V-영역 수여자 프레임워크를 사용하고, 프레임워크 영역 내의 공여자 잔기의 수를 변화시킴으로써 설계하였다. 2개의 그라프팅된 VH 영역 (gH1 및 2) 및 8개의 그라프팅된 VL 영역 (gL1-8)을 설계하고, 올리고뉴클레오티드 조립 및 PCR 돌연변이 유발에 의해 유전자를 제작하였다.
인간 Cγ1 중쇄 CH1 도메인 (G1m17 동종이형 (allotype)) 및 인간 C 카파 경쇄 불변 도메인 (K1m3 동종이형)을 코딩하는 DNA를 함유하는 이. 콜라이 발현 벡터 pTTOD 내로 서브클로닝시킨, 인간화 가변 도메인을 코딩하는 유전자를 사용하여 각각의 그라프트에 대해 항체 Fab' 단편을 제작하였다 (WO03/048208에서 이전에 설명된 바와 같이). 힌지 영역을 말단절단하고 Cys-Pro-Pro-Cys로부터 Cys-Ala-Ala로의 서열 변화로 이루어지는 변형을 수행하여, PEG 모이어티의 부위 특이적 부착을 위해 이용가능한 단일 시스테인 잔기를 갖는 힌지 영역을 생성한다 (실시예 2 참조).
OmpA 신호 펩티드를 코딩하는 서열은 중쇄 및 경쇄 모두를 코딩하는 유전자의 5' 단부에 부착되었다. 발현 시에, 신호 서열은 세균 주변질로 각각의 폴리펩티드의 이송을 표적으로 한다. 세포막을 통한 전위 후에, 신호 서열을 절단 제거하여, 성숙 Fab' 중쇄 및 경쇄를 남긴다.
각각의 그라프트를 함유하는 pTTOD 벡터를 숙주 균주 이. 콜라이 K12 W3110 내로 형질전환시키고, 항체 Fab' 단편을 표준 방법을 이용하여 높은 세포 밀도 배양에 의해 이. 콜라이 내에서 생성하였다. 표준 방법을 이용하여 양이온 교환에 이어 음이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 항체를 정제하였다 (Humphreys et al., 2002, Protein Expression and Purification, 26, 309-320).
생성된 다양한 Fab' 단편을 아래에 설명되는 결합 및 차단으로 시험하고, 각각을 이. 콜라이 내에서 그들의 발현, 모 항체에 비한 그들의 효력, 및 정제 및 하류 처리에 대한 그들의 적합성의 면에서 평가하였다. 이렇게 하여 그라프트 gL8gH2가 선택되고, A26으로 명명하였다. 상기 그라프트의 V 영역 서열을 각각 경쇄 (gL2) 및 중쇄 (gH2)에 대해 도 1(a) 및 (b)에 서열 7 및 9로 제시한다.
중쇄 수여자 프레임워크는 인간 생식계열 서열 VH3 1-3 3-07이고, 여기서 프레임워크 4는 인간 JH-영역 생식계열 JH4의 상기 부분으로부터 기인한다. 경쇄 수여자 프레임워크는 인간 생식계열 서열 VK1 2-1 1-02이고, 여기서 프레임워크 4는 인간 JK-영역 생식계열 JK4의 상기 부분으로부터 기인한다. 서열 9의 중쇄에서 위치 37, 73, 78 및 94 (카바트 넘버링)의 아미노산은 전체 효력 보유를 위해 필수적인 것으로 밝혀진 공여자 잔기 (모 항체로부터)이다. CDRH2 내의 잔기 64는 공여자 글루타메이트로부터 수여자 리신으로 전환되어 (E64K), 이온 교환 정제를 위해 보다 양호한 보다 높은 pI를 갖는 분자를 생성한다. 서열 7의 경쇄에서 위치 64 및 71 (카바트 넘버링)의 아미노산은 전체 효력 보유를 위해 필수적인 것으로 밝혀진 공여자 잔기이다. CDR-L1 내의 잔기 27 및 28은 공여자 글루타메이트 및 아스파르테이트로부터 수여자 글루타민 (E27Q) 및 세린 (D28S)으로 전환되어, 이온 교환 정제를 위해 보다 양호한 보다 높은 pI를 갖는 분자를 생성한다.
상기 항체의 CDR을 도 1(c)에 제시하고, 변형되지 않은 원래의 CDRH2 (서열 20) 및 CDRL1 (서열 21)도 또한 제시한다. 전장 경쇄 및 중쇄를 각각 도 1(d) 및 (f)에 제시한다.
gL8 및 gH2 유전자를 이. 콜라이 내의 발현을 위해 최적화된 가변 및 불변 영역 모두에 대한 코돈을 함유하는 DNA 수준에서 재설계하고, 상기 기재된 바와 같이 pTTOD(Fab') 벡터 내에서 발현시켰다. 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 DNA 서열을 각각 도 1(k) 서열 14 및 1(m) 서열 18에 제시한다.
상기 Fab' (불변 영역 포함)의 단백질 서열을 서열 11 및 12 (OmpA 신호 펩티드를 갖지 않는 및 갖는 경쇄) 및 서열 15 및 16 (OmpA 신호 펩티드를 갖지 않는 및 갖는 중쇄)에 제시한다. pTTOD (A26 IGS2) 디시스트로닉 (dicistronic) 발현 벡터는 도 1(n) 및 서열 19에 제공된 서열을 포함한다. 서열은 경쇄 및 중쇄 유전자 사이에 유전자간 서열, IGS2 (WO03/048208 참조) 및 경쇄 및 중쇄 유전자 모두의 출발점에서 OmpA 리더 서열을 함유한다.
실시예 2: A26Fab'- PEG 의 생성
이. 콜라이 내에서 생성하고 실시예 1에 기재된 바와 같이 정제한 Fab' 단편 A26을 WO2007/003898에 기재된 방법에 따라 PEG화하였다.
PEG는 리실-말레이미드 기가 중쇄 (서열 15)의 위치 226에서 시스테인 잔기에 부착되고 리실 잔기의 각각의 아미노 기가 그에 공유 연결된, 분자량 약 20,000 Da의 메톡시폴리(에틸렌글리콜) 잔기를 갖도록, 중쇄 (서열 15)의 위치 226 (선형 넘버링)에서 힌지 시스테인에 부착되었다. 따라서, 항체에 부착된 PEG의 총 분자량은 도 2에 제시된 바와 같이 대략 40,000 Da이다.
실시예 3: OX40 에 대한 A26 및 A26Fab'- PEG 의 친화도의 평가
BIAcore 기술은 생체분자들 사이의 결합을 표지를 요구하지 않으면서 실시간으로 모니터링한다. 리간드로 불리는 상호반응물 중 하나는 고정된 표면 상에 직접 고정되거나 포획되는 한편, 분석물로 불리는 다른 것은 용액 내에서 포획된 표면 위로 유동한다. 분석물은 리간드에 결합하여 표면 상에 복합체를 형성하므로, 센서는 센서 표면 상의 질량 변화를 검출한다. 이것은 회합 공정에 상응한다. 리간드로부터 분석물의 해리는 분석물을 버퍼로 교체할 때 모니터링한다. 친화도 BIAcore 분석에서, 리간드는 시험되는 항체이고, 분석물은 인간 OX40이다.
기기: Biacore ® 3000 (비아코어 에이비 (Biacore AB, 스웨덴 웁살라))
센서 칩: CM5 (연구 등급) 카탈로그 번호: BR-1001-14, 비아코어 에이비 (스웨덴 웁살라). 칩을 4℃에서 저장하였다.
아민 커플링 키트: 카탈로그 번호: BR-1000-50, 비아코어 에이비 (스웨덴 웁살라.
에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 염산염 (EDC). 증류수 내에 75 mg/mL 이하로 제조하고, 200 ㎕ 분취액으로 -70℃에서 저장하였다.
N-히드록시숙신이미드 (NHS). 증류수 내에 11.5 mg/mL 이하로 제조하고, 200 ㎕ 분취액으로 -70℃에서 저장하였다.
1 M 에탄올아민 염산염-NaOH (pH 8.5). 200 ㎕ 분취액을 -70℃에서 저장하였다.
버퍼: 진행 버퍼: HBS-EP (0.01M HEPES (pH 7.4), 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% 계면활성제 P20임). 카탈로그 번호: BR-1001-88, 비아코어 에이비 (스웨덴 웁살라). 버퍼를 4℃에서 저장하였다.
고정화 버퍼: 아세테이트 5.0 (10 mM 아세트산나트륨 (pH 5.0)임). 카탈로그 번호 BR-1003-51, 비아코어 에이비 (스웨덴 웁살라). 버퍼를 4℃에서 저장하였다.
리간드 포획: 아피니퓨어 (affinipure) F(ab')2 단편 염소 항-인간 IgG, F(ab')2 단편 특이적. 잭슨 이뮤노리서치 인크. (Jackson ImmunoResearch Inc. 미국 펜실배니아주) 카탈로그 번호: 109-006-097. 시약을 4℃에서 저장하였다.
리간드: 4℃에서 저장된 항체 A26 및 A26Fab'-PEG.
분석물: 4℃에서 저장된 뮤린 IgG2a Fc (232 aa)에 융합된 인간 OX40 세포외 (185 aa) 도메인 (0.5 mg/ml, 안셀 (Ancell) No 513-020 로트 142805).
재생 용액: 11.6 M 원액 용액 (BDH, 영국 풀. 카탈로그 번호: 101254H)으로부터 증류수로 희석하여 제조한 40 mM HCl.
50 mM 원액 용액으로부터 증류수로 희석하여 제조한 5 mM NaOH. 카탈로그 번호: BR-1003-58, 비아코어 에이비 (스웨덴 웁살라).
분석 방법: 분석 포맷은 고정된 항-인간 F(ab')2에 의한 항체의 포획, 이어서, 포획된 표면 위로 인간 세포외 도메인 OX40의 적정이었다. 절차의 예를 아래 제시한다.
BIA (비아몰레큘라 (Biamolecular) 상호작용 분석)은 BIAcore 3000 (비아코어 에이비)을 사용하여 수행하였다. 아피니퓨어 F(ab')2 단편 염소 항-인간 IgG, F(ab')2 단편 특이적 (잭슨 이뮤노리서치)을 아민 커플링 화학을 통해 CM5 센서 칩 상에 약 4000 반응 단위 (RU)의 포획 수준으로 고정시켰다. HBS-EP 버퍼 (10 mM HEPES (pH 7.4), 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% 계면활성제 P20, 비아코어 에이비)를 10 ㎕/min의 유속으로 진행 버퍼로서 사용하였다. 0.5 ㎍/mL의 Fab' 또는 50 ㎍/mL의 Fab'-PEG의 10 ㎕ 주사를 고정된 항-인간 IgG-F(ab')2에 의한 포획을 위해 사용하였다. 인간 OX40을 포획된 항체에 대해 다양한 농도 (25 nM 내지 0.78 nM)에서 30 ㎕/min의 유속으로 적정하였다. 10 ㎕/min의 유속으로 40 mM HCl의 10 ㎕ 주사, 이어서 5 mM NaOH의 5 ㎕ 주사에 의해 표면을 재생하였다.
배경 공제 결합 곡선을 표준 절차에 따라 BIAevaluation 소프트웨어 (버전 3.2)를 이용하여 분석하였다. 운동학 파라미터를 피팅 (fitting) 알고리즘으로부터 결정하였다.
A26에 대해 결정된 친화도 값은 19-45.4 pM 범위였고, A26Fab'-PEG에 대한 값은 13.7-50.3 pM 범위였다.
다음 표는 인간 OX40에 결합하는, PEG화되지 않은 인간화 Fab 단편 A26 (fab*) 및 A26 Fab'-PEG Fab 단편 (Fab-PEG**)에 대한 반복된 데이타를 보여준다.
Figure pct00003
실시예 3a: A26Fab'- PEG 의 세포-기반 친화도 및 리간드 -차단 능력
세포-기반 친화도.
세포 표면 발현된 항원에 대한 A26Fab'-PEG의 친화도를 결정하기 위해, 활성화된 CD4+OX40+ T 세포 및 FITC 표지된 항체를 사용하여 포화 결합 실험을 수행하였다. 일정 범위의 리간드 농도에 걸쳐 평형에서 수용체에 대한 항체의 특이적 결합을 사용하여 KD를 결정하였고, 이때 항체의 매우 작은 분획만이 결합 곡선 상의 임의의 지점에서 수용체에 결합된 것으로 가정하였다.
평형 결합은 다음 식을 이용하여 설명된다:
Figure pct00004
항체와 수용체의 회합율 = kon x [수용체유리] x [항체유리].
수용체-항체 복합체의 해리율 = koff x [수용체-항체]
평형에서, 회합율 및 해리율은 동일하고, 결합 등온선을 설명하는 식이 유도될 수 있고; 반-로그 (semi-log) 플롯 상에서 결합은 S자상이다. KD는 koff/kon으로 규정되고, 결합 곡선으로부터 최대값의 절반의 결합이 일어나는 농도로서 계산할 수 있다.
활성화된 인간 CD4+OX40+ T 세포에 대한 FITC 표지된 A26Fab'-PEG의 결합을 4-로그 농도 범위에 걸쳐 유동 세포측정에 의해 측정하였다. A26Fab'-PEG에 대한 대표적인 결합 곡선을 도 3에 제시한다. 3명의 상이한 공여자로부터의 활성화된 세포 상에서 얻어진 KD 값은 1.193 nM, 1.071 nM 및 1.055 nM이었다.
A26Fab'-PEG의 세포-기반 KD (평균 1.106 nM)는 BIAcore에 의해 측정된 재조합 OX40에 대한 결합 (31.3 pM)보다 유의하게 더 약하다. 이것은 많은 인자로 인한 것일 수 있다. A26Fab'-PEG는 세포막에서 비-공유 삼량체로서 회합하는 것으로 예측된, 천연 세포 표면 발현된 OX40과 상이한 3차 및 4차 구조를 갖는 이량체성 Fc 융합 단백질로서 발현된 재조합 OX40에 대한 보다 높은 친화도를 가질 수 있다 (Chan et al., 2000). 또한, 친화도는 재조합 대 천연 OX40의 차별적인 글리코실화에 의해 변경될 수 있다. 세포막의 3-차원 환경, 예를 들어 막 주름형성 (convolution) 및 동시-소재하는 단백질은 또한 입체 장해를 제공할 수 있어서, A26Fab'-PEG에 대한 OX40의 접근가능성을 제한한다. 결과적으로, 세포-기반 친화도는 아마도 생체 내에서 진정한 약물 친화도의 보다 가까운 측정치를 나타낸다.
방법 : 인간 활성화된 CD4 + OX40 + T 세포에 대한 A26Fab'- PEG 결합.
PBMC는 피콜 (Ficoll) 구배 상의 분리에 의해 단리하고, 1 ㎍/mL PHA-L로 3일 동안 37℃, 5% CO2, 100% 습도에서 활성화하였다. CD4+ T 세포는 자성 비드 (인간에 대한 CD4+ T 세포 단리 키트 II, 밀테니이 바이오텍 (Miltenyi Biotec))를 사용하는 음성 선택에 의해 단리하였다. 약 1.2 x 105개의 세포를 항체 (최종 농도 범위 10 ㎍/mL - 0.0006 ㎍/mL (111 nM - 0.0068 nM))의 존재 하에 2시간 동안 얼음 상에서 인큐베이팅하였다. 세포를 세척한 후, FACScalibur (벡톤 디킨슨 (Becton Dickinson))을 사용하는 유동 세포측정에 의해 분석하였다. 하나는 A26Fab'-PEG를 사용하여 제2의 것은 비-특이적 결합 대조군으로서 gA33 Fab'-PEG를 사용하여 2개의 적정 곡선이 생성하였다. 선형 회귀 분석을 이용하여 비-특이적 결합을 공제하고, 이렇게 생성된 특이적 결합 곡선을 비-선형 회귀 (Graphpad Prism®)에 의해 분석하여 KD를 결정하였다.
실시예 3b: 리간드 -차단 능력
세포-표면 발현된 OX40 및 재조합 OX40L 사이의 상호작용을 차단하는 A26Fab'-PEG의 능력을 유동 세포측정-기반 리간드 차단 분석을 이용하여 측정하였다. 간단히 설명하면, 활성화된 인간 CD4+OX40+ T 세포를 A26Fab'-PEG의 적정과 함께 예비-인큐베이팅하였다. 재조합 OX40L을 후속적으로 세포에 첨가하고, A26 Fab'-PEG의 존재 하에 결합시켰다. 이어서, 결합된 OX40L의 비율을 표지된 2차 시약을 사용하는 유동 세포측정에 의해 검출하였다. 도 4는 대표적인 억제 곡선을 보여주고, A26Fab'-PEG가 OX40L 결합을 완전히 차단할 수 있음을 입증한다. 재조합 OX40L 결합의 억제에 대한 평균 IC50은 4.1 nM (n = 2명의 공여자)이었다.
방법 : A26Fab'- PEG 에 의한 인간 활성화된 CD4 + OX40 + T 세포에 대한 OX40L 결합의 억제.
PBMC는 피콜 구배 상의 분리에 의해 단리하고, 1 ㎍/mL의 PHA-L로 3일 동안 37℃, 5% CO2, 100% 습도에서 활성화하였다. 2.5 x 105개의 세포를 항체 (최종 농도 범위 20 ㎍/mL - 0.0003 ㎍/mL (229 nM - 0.0035 nM))의 존재 하에 10분 동안 얼음 상에서 인큐베이팅하였다. OX40L (비오티닐화 CD252 muCD8, 안셀)을 2 ㎍/ml의 최종 농도로 첨가하고, 추가로 30분 동안 얼음 상에서 인큐베이팅하였다. 세포를 세척하고, OX40L 결합을 PE-표지된 스트렙타비딘 (잭슨 이뮤노리서치)과의 인큐베이션에 의해 검출한 후, FACScalibur (벡톤 디킨슨)을 사용하는 유동 세포측정에 의해 분석하였다. gA33 Fab'-PEG를 비-특이적 대조군으로서 사용하였다. 억제 곡선을 비-선형 회귀 (Graphpad Prism®)에 의해 분석하여 IC50을 결정하였다. 제시된 데이타는 2명의 대표적인 공여자 중 1명으로부터의 것이다.
실시예 4: 인간 기능 분석에서 A26Fab'- PEG 의 효력
세포성 상호작용 동안 내인성 OX40-OX40L 결합을 차단하는데 있어서 그의 효력을 평가하기 위해, 일정 범위의 항원-유도된 인간 T 세포 반응에서 A26 Fab'-PEG를 시험하였다.
실시예 4a: 혼합 림프구 반응
1964년에 처음 개발된 (Bach et al. 1964, Science 143, 813-814), 동종이형 혼합 림프구 반응 (MLR)은 2명의 비관련 공여자로부터의 전체 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 사용하는, 이형반응성 (alloreactive) T 세포 활성화 및 증식의 시험관내 모델이다 (O'Flaherty et al., 2000, Immunology, 100, 289-299). 공여자 T 세포를 비관련 공여자 자극자 (stimulator) PBMC 상의 동종이형 주요 조직적합 복합체 (MHC) 항원의 인식을 통해 활성화하여, 세포 증식 및 시토카인 생성을 일으켰다 (Lukacs et al., 1993, Am. J. Pathology, 143, 1179-1188). T 림프구 이형반응은 동종이형 MHC 항원 및 결합된 펩티드 모두에 의해 유도되는 것으로 나타났고 (Sherman et al., 1993, Annu. Rev. Immunol., 11, 385-402), 이것은 MLR 반응이 자극자 동종이형 MHC 항원 및 결합된 펩티드 모두에 대한 것일 수 있음을 제안한다. MLR 반응의 크기는 응답자 (responder)-자극자 쌍 사이의 MHC 미스-매칭 (mis-matching) 정도와 상호관련된다 (Forrester et al., 2004, Corneal Transplantation: An Immunological Guide to the Clinical Problem, Imperial College Press, 66-67). MLR 반응은 응답하는 공여자로부터의 세포의 증식, 및 TH1 (IL-2, IFN-γ 및 TNF-α) 및 TH2 (IL-4, IL-5, IL-10 및 IL-13) T 세포 유래된 시토카인 모두의 생성을 일으킨다. MLR에서 정확한 시토카인 프로필은 응답자-자극자 쌍형성에 특이적인 것으로 생각된다 (Jordan et al., 2002, J. Immunol Methods, 260, 1-14). MLR 분석은 T 세포 활성화 경로를 연구하고 면역억제 약물을 스크리닝하기 위해 연구에서, 및 후천성 면역 결핍 증후군 (AIDS) 환자에서 면역 기능을 평가하고 이식물 수여자에서 가능한 공여자 장기 거부를 예측하기 위해 임상 상황에서 널리 사용되었다 (Bromelow et al., 2001, J. Immunol. Methods, 247, 1-8).
시험관내 인간 이형반응성 T 세포 활성화 및 증식에 대한 A26Fab'-PEG의 효과를 본질적으로 문헌 [O'Flaherty et al., 2000]에 설명된 바와 같이 MLR 분석을 이용하여 조사하였다. 2명의 비관련 공여자로부터의 PBMC를 A26Fab'-PEG의 존재 및 부재 하에 동시-배양하고, 세포 증식을 3H-티미딘 혼입에 의해 측정하였다. 도 5에 제시된 바와 같이, A26 Fab'-PEG는 T 세포 증식을 용량 의존 방식으로 억제하였고, 이때 IC50 값은 2.149 nM (0.1877 ㎍/mL)이고 최대 억제는 57%이었다. 시토카인 생성에 대한 A26 Fab'-PEG의 효과를 조사하기 위해 인간 MLR로부터의 상등액을 Meso Scale Discovery (MSD) 인간 시토카인 분석으로 분석하였다. A26Fab'-PEG는 MLR (데이타를 제시하지 않음)에서 IFN-γ (55% 억제), IL-13 (50% 억제) 및 IL-5 (80% 억제)의 생성을 부분적으로 억제하였다.
방법 : A26Fab'- PEG 에 의한 인간 동종이형 일방 ( one - way ) 전체 PBMC MLR 증식 반응의 억제.
2명의 비관련 공여자로부터 인간 PBMC를 전체 혈액으로부터 단리하였다. 1명의 공여자로부터의 세포를 γ-방사선조사에 의해 불활성화하여 자극자 집단을 생성하였다. 나머지 공여자로부터의 세포는 응답자 집단을 형성하였다. 자극자 및 응답자 집단을 1:1 비 (1x105 세포/공여자)로 혼합하고, A26Fab'-PEG (1 ng - 100 ㎍/mL)의 존재 하에 6일 동안 배양하였다. A33 Fab'-PEG (사내 (in-house) 시약)를 대조 시약으로서 사용하였다. 세포 증식을 제6일에 3H-티미딘 혼입에 의해 측정하였다 (0.5 μCi/웰). 데이타는 생물학 시약의 부재 하에 응답자 + 자극자 반응에 비한 억제 %로서 표시하고, 10명의 상이한 공여자 쌍형성으로부터 조합 데이타이다 (평균±SEM). IC50 값은 Graphpad Prism® 소프트웨어를 이용하여 계산하였다. 결과를 도 5에 제시한다.
실시예 4b: 파상풍 톡소이드 반응
파상풍 톡소이드 (TT)는 백신 접종 개체에서 강한 T 세포 특이적 면역 반응을 유도한다. TT 추가접종에 대한 시험관내 항원-특이적 회상 (recall) 반응은 PBMC로부터 증식 및 시토카인 생성 (TH1 및 TH2)을 모니터링함으로써 검출할 수 있다 (Bishop et al. 2005). A26Fab'-PEG는 증식 및 IL-5, IL-13, IFN-γ 및 TNF-α 생성 (데이타를 제시하지 않음)을 용량-의존 방식으로 억제하였고, 여기서 증식의 최대 억제는 38%이었다. 2명의 공여자에 대해 계산된 증식 억제에 대한 IC50 값은 0.58 nM (0.051 ㎍/mL) 및 1.11 nM (0.097 ㎍/mL)이었다. 도 6은 1명의 공여자에 대한 A26Fab'-PEG 증식 억제 곡선을 보여준다.
방법 : A26 Fab' - PEG 는 파상풍 톡소이드에 노출된 PBMC 의 증식을 억제한다.
PBMC를 피콜 구배 상의 분리에 의해 단리하고, 96-웰 환저 플레이트에서 200 ㎕/웰의 최종 부피에서 A26Fab'-PEG (농도 범위 5 ㎍/mL 내지 0.001 ㎍/mL)의 존재 하에 1 ㎍/mL 파상풍 톡소이드 (칼비오켐 (Calbiochem))에 노출시켰다. 37℃, 5% CO2, 100% 습도에서 5일 인큐베이션 후에, 세포 증식을 활발하게 분할하는 세포 내로 3H 티미딘 (0.5 μCi/웰)의 혼입에 의해 측정하였다. 1명의 대표적인 공여자로부터의 결과를 제시한다. IC50 값은 Graphpad Prism® 소프트웨어를 이용하여 계산하였다.
실시예 4c: 집먼지 진드기 반응
중증 급성 천식은 더마토파고이데스 테로니시누스 속의 종을 비롯한 집먼지 진드기와 같은 흡입된 항원에 의해 촉발될 수 있다 (Tillie-Leblond et al., 2005, Allergy, 60(1), 23-29). 그러한 알레르기원은 아토피 환자에서 말초 혈액 세포에 의한 증식 반응 및 TH2 편형된 시토카인 생성을 유도하지만, 비-아토피 환자에서는 그렇지 않다 (Ling et al., 2004, Lancet, 363, 608-615). 시험관내 분석은 항원 추가접종에 반응한 TH2 시토카인 IL-13의 생성에 대한 OX40 차단의 효과를 결정하기 위해 설정하였다. PBMC를 알레르기원-특이적 IgE (RAST) 스코어가 3 내지 5 (스케일 0 내지 6)인 아토피 환자로부터 취하고, A26Fab'-PEG 또는 대조군 항체의 존재 하에 더마토파고이데스 테로니시누스 항원으로 자극하였다. A26Fab'-PEG는 IL-13 생성을 최대 60%로 억제하였고, 이때 IC50 값은 1.23 nM이었다 (도 7). 또한, A26 Fab'-PEG는 또한 조절 시토카인 IL-10의 수준을 향상시키면서 본 분석에서 시토카인 IL-4, IL-5 및 TNF-α의 생성을 강력하게 억제하였다 (도 8).
방법 도 7: A26Fab'- PEG 는 더마토파고이데스 테로니시누스 알레르기원 추출물에 노출된 PBMC 로부터 IL -13 생성을 억제한다.
PBMC는 피콜 구배 상의 분리에 의해 알레르기 지원자로부터 단리하였다. 정제된 PBMC를 96-웰 환저 플레이트에서 200 ㎕/웰의 최종 부피에서 시험 항체 (농도 범위 10 ㎍/mL 내지 0.0005 ㎍/mL)의 존재 하에 25 ㎍/mL 더마토파고이데스 테로니시누스 알레르기원 추출물 (그리어 (Greer))에 노출시켰다. 37℃, 5% CO2, 100% 습도에서 6일 인큐베이션 후에, 상등액을 수거하고 ELISA (바이오소스 (Biosource))에 의해 IL-13 함량에 대해 분석하였다. 그래프는 3명의 공여자로부터 모은 (pooled) 데이타를 나타낸다 (평균±SEM). IC50 값은 Graphpad Prism® 소프트웨어를 이용하여 계산하였다.
방법 도 8: A26Fab'- PEG 는 더마토파고이데스 테로니시누스 알레르기원 추출물에 노출된 PBMC 로부터 시토카인 생성을 조정한다.
PBMC는 피콜 구배 상의 분리에 의해 알레르기 지원자로부터 단리하였다. 정제된 PBMC를 96-웰 환저 플레이트에서 200 ㎕/웰의 최종 부피에서 10 ㎍/mL A26Fab'-PEG (114 nM) 또는 대조군 (TN3 Fab'-PEG)의 존재 하에 25 ㎍/mL 더마토파고이데스 테로니시누스 알레르기원 추출물 (그리어)에 노출시켰다. 37℃, 5% CO2, 100% 습도에서 6일 인큐베이션 후에, 상등액을 수거하고 멀티-스폿 분석 (MSD)을 이용하여 시토카인 함량에 대해 분석하였다. 그래프는 3명의 공여자로부터 모은 데이타를 나타낸다 (평균±SEM).
요약
인간 기능적 분석에서 A26Fab'-PEG에 대한 IC50 값을 표 2에 요약한다. A26Fab-PEG의 효력은 3개의 모든 분석에 걸쳐 유사하고, 1.106 nM의 세포-기반 친화도 측정치와 잘 상호관련된다. 이들 분석에서, 다수 염증성 시토카인의 세포성 증식 및/또는 생성은 유의하게 억제되었고, 이것은 A26Fab'-PEG가 T 세포 활성화를 현저하게 억제함을 입증한다. 파상풍 톡소이드 및 집먼지 진드기 분석은 모두 기억 T 세포에 의한 회상 반응을 측정하고, 이것은 A26Fab'-PEG가 다양한 항원에 대한 확립된 T 세포 반응을 억제할 수 있음을 시사한다.
Figure pct00005
집먼지 진드기 항원에 대한 아토피 기억 TH2 반응은 알레르기 천식에 대한 관련 시험관내 검정을 제공하고, 데이타는 A26Fab'-PEG가 상기 적응증에서 효과적인 치료제일 수 있음을 제안한다. OX40 동시-자극은 이전에 폐 염증에 연관되었고, 여기서 염증성 TH2 세포로의 알레르기원-특이적 나이브 CD4+ T 세포의 분화 및 기억 TH2 세포의 회상 반응 모두에서 중요한 역할을 하는 것으로 제안된다 (Wang & Liu, 2007, J. Clin. Invest, 117 (12), 3655-3657). 알레르기 염증 동안, 스트레스를 받은 상피 세포에 의해 생성된 선천적 시토카인 흉선 기질 리포포이에틴 (TSLP)이 인간 수지상 세포의 성숙을 유도하고, OX40L의 발현을 유도한다. OX40L은 향상된 TNF-α의 염증 표현형을 갖지만 IL-10을 생성하지 않는 CD4+ T 세포의 TH2 편향화를 촉진하는 기능을 한다 (Ito et al., 2005, J. Exp. Med., 202(9), 1213-1223). HDM 반응에서, A26 Fab'-PEG는 고전적인 TH2 시토카인 IL-13, IL-5 및 IL-4뿐만 아니라 TNF-α를 강력하게 억제하였다. 또한, 4명의 알레르기 공여자 중 2명에서, A26Fab'-PEG는 IL-10 생성을 향상시켰다. 따라서, A26Fab'-PEG는 알레르기 반응을 억제하는 것뿐만 아니라 또한 이들을 조절 표현형을 향해 조정하는 능력을 가질 수 있다.
실시예 5:
A26Fab'- PEG 는 Hu - SCID 모델에서 CD4 + 및 CD8 + T 세포 증식을 억제한다.
Hu-SCID 모델은 이후에 숙주 마우스에 대한 강한 이종 반응을 유발하는 인간 PBMC를 사용한 SCID 마우스의 재구성을 수반한다. 상기 반응은 마우스에서 인간 T 세포의 증식에 의해 추적된다. A26Fab'-PEG의 PK에 대해 실험에 의해 결정된 데이타를 이용하여, 8, 23 및 34 ㎍/ml A26Fab'-PEG의 항정 상태 (steady state) 혈장 농도를 생성시키는 투약 용법을 설계하였다. 도 9의 데이타는 A26Fab'-PEG의 항정 상태 혈장 수준을 8, 23 및 34 ㎍/ml로 유지함으로써 CD4+ 및 CD8+ T 세포가 현저하게 억제되었음을 입증한다.
방법: A26Fab'- PEG 는 Hu - SCID 모델에서 CD4 + 및 CD8 + T 세포 증식을 억제한다.
마우스에게 제-2일에 0.825, 2.475 또는 8.25 mg/kg의 s.c. 로딩 용량, 이어서 각각 0.25, 0.75 또는 2.5 mg/kg의 일일 s.c. 유지 용량을 제공하였다. 제0일에 복강 내로 8백만 개의 인간 PBMC의 전달 1일 전에 TMβ1을 투약함으로써 마우스를 NK 세포 결핍시켰다. 이어서, 실험을 제14일에 종료하고, 혈액, 복강 세척액 및 비장 균질물을 CD4+ 및 CD8+ 세포에 대해 분석하였다. 제14일 마우스는 경추 탈구에 의해 치사시키고, 심장 천공에 의해 출혈시켰다. 이어서, 인간 CD4+ 및 CD8+ 세포의 수를 FACS 분석에 의해 결정하였다. 데이타 (n=10)를 평균±SEM으로서 표현한다. A26Fab'-PEG의 투여 후 혈액 내에서 CD4+ 및 CD8+ 세포의 감소를 도 9에 제시한다.
실시예 6: A26Fab'- PEG 의 비-인간 영장류 OX40 과의 교차-반응성
비-인간 영장류 (NHP) 질환 모델 및 전임상 독성학에서 A26Fab'-PEG의 사용을 검증하기 위해, 그의 상대적인 친화도 및 기능적 효력을 인간 및 NHP 세포 상에서 비교하였다.
NHP 세포에 대한 세포-기반 친화도
시노몰구스 (cynomolgus) 또는 붉은털 원숭이 CD4+ T 세포를 말초 혈액으로부터 단리하고, 고수준의 OX40을 발현하도록 활성화하였다. A26Fab'-PEG의 친화도는 도 3에 제시된 바와 같은 평형 결합 곡선의 비-선형 회귀 분석에 의해 측정하였다. A26Fab'-PEG는 인간에 비해 시노몰구스 또는 붉은털 원숭이 CD4+ T 세포에 대한 친화도의 2배 미만의 강하를 보여주었고, 이것은 고도로 교차-반응성임을 나타낸다 (표 3).
Figure pct00006
NHP PBMC를 림포라이트 (Lympholyte) (VH 바이오 (VH Bio)) 구배 상에서 분리하고, 37℃, 5% CO2, 100% 습도에서 3일 동안 1 ㎍/mL PHA-L로 활성화시키고, CD4+ T 세포를 자성 비드 (비-인간 영장류에 대한 CD4+ T 세포 단리 키트 II; 밀테니이 바이오텍)를 사용하는 음성 선택에 의해 단리하였다. 친화도는 실시예 3a에 설명된 바와 같이 측정하였다 (도 3).
실시예 7: 시노몰구스 원숭이 CIA 모델에서 효능 연구
연구 및 연구 설계에 대한 근거.
시노몰구스 콜라겐-유도된 관절염은 인간 실험 전에 잠재적인 항-관절염약을 프로파일링하기 위해 사용된 표준 모델이다. 본 발명에서, 상기 모델은 TNFα 및 IL-6에 대한 치료에 응답한다. 이들 데이타는 동등한 항-인간 치료제를 사용한 임상 RA 발견과 일치한다.
시노몰구스 원숭이에서 관절염의 유도는 3주 기간으로 나뉘는 콜라겐 II를 사용한 2회의 면역화 단계를 필요로 한다. 관절염 증상 (하나 이상의 관절의 부기 및 압통)은 제2 면역화 후 임의의 시간에 나타날 수 있고, 관절염 스코어를 이용하여 매주 평가하였다. 실험을 총 11주 동안 실행하였다. OX40은 동시-자극 분자이고, 따라서 기능 간섭은 모델의 면역화 상에 효과를 갖는 것으로 예상될 것이다. A26 Fab'-PEG를 사용한 3가지 투약 용법을 평가하였다. 하나의 군에는 A26Fab'-PEG (100 mg/kg)를 제1 면역화 전일에 1회만 투여하였다. 제2 군에는 A26 Fab'-PEG (100 mg/kg)를 제2 면역화 전일에 1회만 투여하고, 제3 군에는 A26 Fab'-PEG (100 mg/kg)를 제1 및 제2 면역화 1일 전에 투여하였다. 대조군의 동물에는 아세테이트 버퍼 비히클을 투여하였다. 비히클 처리군 내에서 질환 발병을 급성상 단백질 C-반응성 단백질 (CRP) 및 합토글로빈 (haptoglobin) (RA 시험에서 임상적으로 측정되는 생체마커)의 혈청 상승에 의해 특성 결정하였다. 관절 통합성을 x-선에 의해 및 조직학적 검사에 의해 평가하였다.
결과 및 결론
제1 면역화 전일에 A26Fab'-PEG로 치료한 동물에서, 관절염 심도는 비히클 처리군에서보다 일반적으로 더 낮았다. 관절염 스코어의 이들 차이는 제49일, 제63일 및 제76일에 통계상 유의하였다. 도 10은 임상 스코어에 대한 곡선하 면적으로서 표현한, 개별 동물에 대한 데이타의 전체 요약을 보여준다. 관절에 대한 뼈 부식의 X 선 평가가 또한 감소하였고 (표 4), 조직병리학적 변화도 그러하였다 (도 11). CRP 및 합토글로빈의 농도는 대조군에서보다 더 낮은 경향이 있었다. 제1 면역화 1일 전에 및 제2 면역화 1일 전에 A26Fab'-PEG를 투약한 동물의 군에 대해 유사한 결과를 얻었다. 그러나, A26Fab'-PEG를 제2 면역화 전일에 1회만 투여한 동물에서 설득력있는 항-관절염 효과가 관찰되지 않았다. 이들 데이타는 시노몰구스 CIA에서 항OX40 치료의 항-관절염 효과를 보여주고, 병원성 면역 반응의 개시에 있어서 OX40의 중요성을 입증한다.
도 10: 시노몰구스 CIA 에서 A26 Fab' - PEG 에 의한 관절염 스코어의 억제. 데이타는 제1 및 제2 면역화 전에 아세테이트 버퍼를 투여한 대조군 동물 (Ac Ac), 제1 면역화 전에 투여한 동물 (A26 Ac), 제2 면역화 전에 A26 Fab'-PEG를 투여한 동물 (Ac A26), 및 제1 및 제2 면역화 전에 A26 Fab'-PEG를 투여한 동물 (A26 A26)에 대한 임상 스코어 데이타에 대한 개별 동물 곡선하면적 (AUC)을 보여준다. 막대는 중간값이다.
Figure pct00007
Ac Ac 동물에게 아세테이트 버퍼 비히클을 투여하고, A26 Ac 동물에게 제1 면역화 전에 A26Fab'-PEG를 투여하고, Ac A26 동물에게 제2 면역화 전에 A26 Fab'-PEG를 투여하고, A26 A26 동물에게 제1 및 제2 면역화 전에 A26 Fab'-PEG를 투여하였다. 평균±s.e.m., *p<0.05, **p<0.01 윌콕신 (Wilcoxin) 검정.
방법 도 11: A26Fab'- PEG 에 의한 시노몰구스 CIA 에서 총 조직학 스코어의 감소.
데이타는 연구의 종료 시에 개별 동물에 대한 총 조직학 스코어 (연골 및 뼈의 변성, 섬유증, 과립화 조직 및 증식증 포함)를 보여준다. Ac Ac 동물에게 아세테이트 버퍼 비히클을 투여하고, A26 Ac 동물에게 제1 면역화 전에 A26 Fab'-PEG를 투여하고, Ac A26 동물에게 제2 면역화 전에 A26 Fab'-PEG를 투여하고, A26 A26 동물에게 제1 및 제2 면역화 전에 A26 Fab'-PEG를 투여하였다. 막대는 중간값이다.
물론, 본 발명은 단지 예에 의해 설명되고, 이로 제한되지 않으며, 상세한 변형이 하기 청구의 범위 내에서 이루어질 수 있음이 이해될 것이다. 본 발명의 각각의 실시양태의 바람직한 특징은 필요한 변경을 가하여 각각의 다른 실시양태에 적용될 수 있다. 특허 및 특허 출원을 포함하여 본원 명세서에서 언급되는 모든 간행물은 각각의 개별적인 간행물이 마치 그 전체가 제시된 것처럼 본원에 참조로 포함된다고 구체적으로 및 개별적으로 나타내는 것처럼 본원에 참조로 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> UCB Pharma S.A. LAWSON, Alastair NESBITT, Andrew POPPLEWELL, Andrew SHAW, Stevan SHPEKTOR, Diana ZHANG, Yi <120> Antibody molecules having specificity for human OX40 <130> G0088-WO01 <150> US61/153038 <151> 2009-02-17 <160> 23 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDRH1 <400> 1 Asn Tyr Gly Ile His 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDRH2 <400> 2 Ser Ile Ser Pro Ser Gly Gly Leu Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDRH3 <400> 3 Gly Gly Glu Gly Ile Phe Asp Tyr 1 5 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDRL1 <400> 4 Arg Ala Thr Gln Ser Ile Tyr Asn Ala Leu Ala 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDRL2 <400> 5 Asn Ala Asn Thr Leu His Thr 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDRL3 <400> 6 Gln Gln Tyr Tyr Asp Tyr Pro Leu Thr 1 5 <210> 7 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Light Chain variable region 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gacgtactac 180 cgtgactctg tcaaaggtcg tttcaccatc tctcgtgatg acgcgaaaaa ctctccgtac 240 ctgcagatga actctctgcg tgcagaagat accgcagtgt actactgcgc tactggtggt 300 gaaggtatct tcgactactg gggtcagggt accctggtaa ctgtctcgag c 351 <210> 11 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Light chain of antibody A26 <400> 11 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Thr Gln Ser Ile Tyr Asn Ala 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asn Ala Asn Thr Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Ala 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Ser Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Asp Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 12 <211> 235 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Light chain of antibody A26 including signal sequence <400> 12 Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala 1 5 10 15 Thr Val Ala Gln Ala Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu 20 25 30 Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Thr Gln 35 40 45 Ser Ile Tyr Asn Ala Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala 50 55 60 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asn Ala Asn Thr Leu His Thr Gly Val Pro 65 70 75 80 Ser Arg Phe Ser Ala Ser Gly Ser Gly Thr Asp Ser Thr Leu Thr Ile 85 90 95 Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr 100 105 110 Tyr Asp Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 115 120 125 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 130 135 140 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 145 150 155 160 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 165 170 175 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 180 185 190 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 195 200 205 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 210 215 220 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 <210> 13 <211> 645 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> DNA encoding Light chain of antibody A26 <400> 13 gatatccaga tgacccagag tccaagcagt ctctccgcca gcgtaggcga tcgtgtgact 60 attacctgtc gtgcaaccca gagcatctac aacgctctgg cttggtatca gcagaaaccg 120 ggtaaagcgc caaaactcct gatctacaac gcgaacactc tgcataccgg tgttccgtct 180 cgtttctctg cgtctggttc tggtacggac tctactctga ccatctcctc tctgcagccg 240 gaagatttcg cgacctacta ctgccagcag tactacgatt acccactgac gtttggtggt 300 ggtaccaaag ttgagatcaa acgtacggtt gcagctccat ccgtcttcat ctttccaccg 360 tctgacgaac agctcaaatc tggtactgct tctgtcgttt gcctcctgaa caacttctat 420 ccgcgtgaag cgaaagtcca gtggaaagtc gacaacgcac tccagtctgg taactctcag 480 gaatctgtga ccgaacagga ctccaaagac tccacctact ctctgtctag caccctgact 540 ctgtccaaag cagactacga gaaacacaaa gtgtacgctt gcgaagttac ccatcagggt 600 ctgtcttctc cggttaccaa aagctttaat agaggggagt gttaa 645 <210> 14 <211> 708 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> DNA encoding Light chain of antibody A26 including signal sequence <400> 14 atgaaaaaga cagctatcgc aattgcagtg gccttggctg gtttcgctac cgtagcgcaa 60 gctgatatcc agatgaccca gagtccaagc agtctctccg ccagcgtagg cgatcgtgtg 120 actattacct gtcgtgcaac ccagagcatc tacaacgctc tggcttggta tcagcagaaa 180 ccgggtaaag cgccaaaact cctgatctac aacgcgaaca ctctgcatac cggtgttccg 240 tctcgtttct ctgcgtctgg ttctggtacg gactctactc tgaccatctc ctctctgcag 300 ccggaagatt tcgcgaccta ctactgccag cagtactacg attacccact gacgtttggt 360 ggtggtacca aagttgagat caaacgtacg gttgcagctc catccgtctt catctttcca 420 ccgtctgacg aacagctcaa atctggtact gcttctgtcg tttgcctcct gaacaacttc 480 tatccgcgtg aagcgaaagt ccagtggaaa gtcgacaacg cactccagtc tggtaactct 540 caggaatctg tgaccgaaca ggactccaaa gactccacct actctctgtc tagcaccctg 600 actctgtcca aagcagacta cgagaaacac aaagtgtacg cttgcgaagt tacccatcag 660 ggtctgtctt ctccggttac caaaagcttt aatagagggg agtgttaa 708 <210> 15 <211> 228 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Heavy chain of antibody A26 <400> 15 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Ile His Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ser Ile Ser Pro Ser Gly Gly Leu Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ala Lys Asn Ser Pro Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Thr Gly Gly Glu Gly Ile Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125 Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140 Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 155 160 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser 165 170 175 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser 180 185 190 Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn 195 200 205 Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His 210 215 220 Thr Cys Ala Ala 225 <210> 16 <211> 248 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Heavy chain of antibody A26 including signal sequence <400> 16 Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala 1 5 10 15 Thr Val Ala Gln Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu 20 25 30 Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe 35 40 45 Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Ile His Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys 50 55 60 Gly Leu Glu Trp Val Ala Ser Ile Ser Pro Ser Gly Gly Leu Thr Tyr 65 70 75 80 Tyr Arg Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ala 85 90 95 Lys Asn Ser Pro Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr 100 105 110 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Thr Gly Gly Glu Gly Ile Phe Asp Tyr Trp 115 120 125 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 130 135 140 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr 145 150 155 160 Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 165 170 175 Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 180 185 190 Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 195 200 205 Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn 210 215 220 His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser 225 230 235 240 Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Ala 245 <210> 17 <211> 687 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> DNA encoding Heavy chain of antibody A26 <400> 17 gaggttcagc tggtcgagtc tggaggcggg cttgtccagc ctggagggag cctgcgtctc 60 tcttgtgcag caagcggttt cacgttcacc aactacggta tccactggat tcgtcaggca 120 ccaggtaaag gtctggaatg ggtagcctct atctctccgt ctggtggtct gacgtactac 180 cgtgactctg tcaaaggtcg tttcaccatc tctcgtgatg acgcgaaaaa ctctccgtac 240 ctgcagatga actctctgcg tgcagaagat accgcagtgt actactgcgc tactggtggt 300 gaaggtatct tcgactactg gggtcagggt accctggtaa ctgtctcgag cgcttctacc 360 aaaggtccga gcgttttccc actggctccg agctctaaat ccacctctgg tggtacggct 420 gcactgggtt gcctggtgaa agactacttc ccagaaccag ttaccgtgtc ttggaactct 480 ggtgcactga cctctggtgt tcacaccttt ccagcagttc tgcagtcttc tggtctgtac 540 tccctgtcta gcgtggttac cgttccgtct tcttctctgg gtactcagac ctacatctgc 600 aacgtcaacc acaaaccgtc caacacgaaa gtggacaaaa aagtcgagcc gaaatcctgt 660 gacaaaaccc atacctgcgc tgcgtaa 687 <210> 18 <211> 750 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> DNA encoding Heavy chain of antibody A26 including signal sequence <400> 18 atgaagaaga ctgctatagc aattgcagtg gcgctagctg gtttcgccac cgtggcgcaa 60 gctgaggttc agctggtcga gtctggaggc gggcttgtcc agcctggagg gagcctgcgt 120 ctctcttgtg cagcaagcgg tttcacgttc accaactacg gtatccactg gattcgtcag 180 gcaccaggta aaggtctgga atgggtagcc tctatctctc cgtctggtgg tctgacgtac 240 taccgtgact ctgtcaaagg tcgtttcacc atctctcgtg atgacgcgaa aaactctccg 300 tacctgcaga tgaactctct gcgtgcagaa gataccgcag tgtactactg cgctactggt 360 ggtgaaggta tcttcgacta ctggggtcag ggtaccctgg taactgtctc gagcgcttct 420 accaaaggtc cgagcgtttt cccactggct ccgagctcta aatccacctc tggtggtacg 480 gctgcactgg gttgcctggt gaaagactac ttcccagaac cagttaccgt gtcttggaac 540 tctggtgcac tgacctctgg tgttcacacc tttccagcag ttctgcagtc ttctggtctg 600 tactccctgt ctagcgtggt taccgttccg tcttcttctc tgggtactca gacctacatc 660 tgcaacgtca accacaaacc gtccaacacg aaagtggaca aaaaagtcga gccgaaatcc 720 tgtgacaaaa cccatacctg cgctgcgtaa 750 <210> 19 <211> 1459 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> DNA encoding heavy and light chain of antibody A26 including intergenic sequence IGS2 <400> 19 atgaaaaaga cagctatcgc aattgcagtg gccttggctg gtttcgctac cgtagcgcaa 60 gctgatatcc agatgaccca gagtccaagc agtctctccg ccagcgtagg cgatcgtgtg 120 actattacct gtcgtgcaac ccagagcatc tacaacgctc tggcttggta tcagcagaaa 180 ccgggtaaag cgccaaaact cctgatctac aacgcgaaca ctctgcatac cggtgttccg 240 tctcgtttct ctgcgtctgg ttctggtacg gactctactc tgaccatctc ctctctgcag 300 ccggaagatt tcgcgaccta ctactgccag cagtactacg attacccact gacgtttggt 360 ggtggtacca aagttgagat caaacgtacg gttgcagctc catccgtctt catctttcca 420 ccgtctgacg aacagctcaa atctggtact gcttctgtcg tttgcctcct gaacaacttc 480 tatccgcgtg aagcgaaagt ccagtggaaa gtcgacaacg cactccagtc tggtaactct 540 caggaatctg tgaccgaaca ggactccaaa gactccacct actctctgtc tagcaccctg 600 actctgtcca aagcagacta cgagaaacac aaagtgtacg cttgcgaagt tacccatcag 660 ggtctgtctt ctccggttac caaaagcttt aatagagggg agtgttaaaa tgaagaagac 720 tgctatagca attgcagtgg cgctagctgg tttcgccacc gtggcgcaag ctgaggttca 780 gctggtcgag tctggaggcg ggcttgtcca gcctggaggg agcctgcgtc tctcttgtgc 840 agcaagcggt ttcacgttca ccaactacgg tatccactgg attcgtcagg caccaggtaa 900 aggtctggaa tgggtagcct ctatctctcc gtctggtggt ctgacgtact accgtgactc 960 tgtcaaaggt cgtttcacca tctctcgtga tgacgcgaaa aactctccgt acctgcagat 1020 gaactctctg cgtgcagaag ataccgcagt gtactactgc gctactggtg gtgaaggtat 1080 cttcgactac tggggtcagg gtaccctggt aactgtctcg agcgcttcta ccaaaggtcc 1140 gagcgttttc ccactggctc cgagctctaa atccacctct ggtggtacgg ctgcactggg 1200 ttgcctggtg aaagactact tcccagaacc agttaccgtg tcttggaact ctggtgcact 1260 gacctctggt gttcacacct ttccagcagt tctgcagtct tctggtctgt actccctgtc 1320 tagcgtggtt accgttccgt cttcttctct gggtactcag acctacatct gcaacgtcaa 1380 ccacaaaccg tccaacacga aagtggacaa aaaagtcgag ccgaaatcct gtgacaaaac 1440 ccatacctgc gctgcgtaa 1459 <210> 20 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDRH2 <400> 20 Ser Ile Ser Pro Ser Gly Gly Leu Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val Glu 1 5 10 15 Gly <210> 21 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDRL1 <400> 21 Arg Ala Thr Glu Asp Ile Tyr Asn Ala Leu Ala 1 5 10 <210> 22 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> human JH4 <400> 22 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 23 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> JK1 sequence <400> 23 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 1 5 10

Claims (39)

  1. 중쇄를 포함하고, 중쇄의 가변 도메인이 CDR-H1에 대해 서열 1에 제시된 서열을 갖는 CDR, CDR-H2에 대해 서열 2 또는 서열 20에 제시된 서열을 갖는 CDR, 및 CDR-H3에 대해 서열 3에 제시된 서열을 갖는 CDR 중 적어도 하나를 포함하는 것인, 인간 OX40에 결합하는 길항성 항체.
  2. 제1항에 있어서, 중쇄의 가변 도메인이 CDR-H1에 대해 서열 1에 제시된 서열, CDR-H2에 대해 서열 2 또는 서열 20에 제시된 서열, 및 CDR-H3에 대해 서열 3에 제시된 서열을 포함하는 것인 길항성 항체.
  3. 경쇄를 포함하고, 경쇄의 가변 도메인이 CDR-L1에 대해 서열 4 또는 서열 21에 제시된 서열을 갖는 CDR, CDR-L2에 대해 서열 5에 제시된 서열을 갖는 CDR, 및 CDR-L3에 대해 서열 6에 제시된 서열을 갖는 CDR 중 적어도 하나를 포함하는 것인, 인간 OX40에 결합하는 길항성 항체.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 경쇄를 추가로 포함하고, 경쇄의 가변 도메인이 CDR-L1에 대해 서열 4 또는 서열 21에 제시된 서열을 갖는 CDR, CDR-L2에 대해 서열 5에 제시된 서열을 갖는 CDR, 및 CDR-L3에 대해 서열 6에 제시된 서열을 갖는 CDR 중 적어도 하나를 포함하는 것인 길항성 항체.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서, 경쇄의 가변 도메인이 CDR-L1에 대해 서열 4 또는 서열 21에 제시된 서열, CDR-L2에 대해 서열 5에 제시된 서열 및 CDR-L3에 대해 서열 6에 제시된 서열을 포함하는 것인 길항성 항체.
  6. 중쇄의 가변 도메인이 3개의 CDR을 포함하고, CDRH-1의 서열이 서열 1에 제시된 서열에 적어도 60%의 동일성 또는 유사성을 갖고, CDRH-2의 서열이 서열 2에 제시된 서열에 적어도 60%의 동일성 또는 유사성을 갖고, CDRH-3의 서열이 서열 3에 제시된 서열에 적어도 60%의 동일성 또는 유사성을 갖는 것인, 인간 OX40에 결합하는 길항성 항체.
  7. 제6항에 있어서, 경쇄를 추가로 포함하고, 경쇄의 가변 도메인이 3개의 CDR을 포함하고, CDRL-1의 서열이 서열 4에 제시된 서열에 적어도 60%의 동일성 또는 유사성을 갖고, CDRL-2의 서열이 서열 5에 제시된 서열에 적어도 60%의 동일성 또는 유사성을 갖고, CDRL-3의 서열이 서열 6에 제시된 서열에 적어도 60%의 동일성 또는 유사성을 갖는 것인 길항성 항체.
  8. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄가 서열 9에 제시된 서열을 포함하는 것인 항체.
  9. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 경쇄가 서열 7에 제시된 서열을 포함하는 것인 항체.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 분자가 전장 중쇄 및 경쇄를 갖는 완전 항체 분자 또는 그의 단편, 예를 들어 Fab, 변형된 Fab', Fab', F(ab')2, Fv, VH, VL 또는 scFv 단편으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 것인 중화 항체 분자.
  11. 서열 9에 제시된 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 7에 제시된 서열을 포함하는 경쇄를 갖는, 인간 OX40에 결합하는 길항성 항체.
  12. 경쇄의 가변 도메인이 제11항에 따른 항체의 경쇄 가변 도메인에 적어도 80%의 동일성 또는 유사성을 갖는 서열을 포함하고, 중쇄의 가변 도메인이 제11항에 따른 항체의 중쇄 가변 도메인에 적어도 80%의 동일성 또는 유사성을 갖는 서열을 포함하는 것인, 인간 OX40에 결합하는 길항성 항체.
  13. 서열 15에 제시된 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 11에 제시된 서열을 포함하는 경쇄를 갖는, 인간 OX40에 결합하는 길항성 항체.
  14. 중쇄 및 경쇄가 제13항에 따른 항체의 상응하는 중쇄 및 경쇄에 적어도 80% 동일하거나 유사한, 인간 OX40에 결합하는 길항성 항체.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 효과기 또는 리포터 분자가 그에 대해 부착될 수 있도록 변형된 길항성 항체 분자.
  16. 제15항에 있어서, 변형이 효과기 또는 리포터 분자의 부착을 허용하는 하나 이상의 아미노산을 그의 중쇄의 C-말단 단부에 부가하는 것인 길항성 항체 분자.
  17. 제16항에 있어서, 추가의 아미노산이, 효과기 또는 리포터 분자가 그에 대해 부착될 수 있는 1 또는 2개의 시스테인 잔기를 함유하는 변형된 힌지 영역을 형성하는 것인 길항성 항체 분자.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 효과기 또는 리포터 분자가 그에 대해 부착된 길항성 항체 분자.
  19. 제18항에 있어서, 효과기 분자가 하나 이상의 중합체를 포함하는 것인 길항성 항체 분자.
  20. 제19항에 있어서, 하나 이상의 중합체가 임의로 치환된 직쇄 또는 분지쇄 폴리알킬렌, 폴리알케닐렌 또는 폴리옥시알킬렌 중합체 또는 분지 또는 비분지형 폴리사카라이드인 길항성 항체 분자.
  21. 제20항에 있어서, 하나 이상의 중합체가 메톡시폴리(에틸렌글리콜) 또는 폴리(에틸렌글리콜)인 길항성 항체 분자.
  22. 제21항에 있어서, 리실-말레이미드 또는 리실 비스-말레이미드 기가 중쇄의 C-말단 단부에서 시스테인 잔기 중의 하나에 부착되고, 리실 잔기의 각각의 아미노 기는 그에 공유 연결된, 분자량이 약 20,000 Da인 메톡시폴리(에틸렌글리콜) 잔기를 갖는 것인 길항성 항체 분자.
  23. 서열 15에 제시된 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 11에 제시된 서열을 포함하는 경쇄를 갖고, 리실-말레이미드 기가 중쇄의 위치 226에서 시스테인에 부착되고, 여기서 리실 잔기의 각각의 아미노 기가 그에 공유 연결된, 분자량이 약 20,000 Da인 메톡시폴리(에틸렌글리콜) 잔기를 갖는 변형된 Fab 단편인, 인간 OX40에 대한 특이성을 갖는 길항성 항체 분자.
  24. 단리된 인간 OX40 (예를 들어 인간 세포외 도메인)에 대한 결합 친화도가 100 pM이거나 그보다 우수한 길항성 항체.
  25. 세포 표면 발현된 인간 OX40에 대한 결합 친화도가 2 nM이거나 그보다 우수한 길항성 항체.
  26. 제11항에 따른 항체와 동일한 에피토프에 결합하는, 인간 OX40에 결합하는 길항성 항체.
  27. 단리된 인간 OX40 (예를 들어 인간 세포외 도메인)에 대한 결합 친화도가 100 pM이거나 그보다 우수하고, 인간 OX40에 대한 제11항에 따른 항체의 결합을 교차-차단하거나, 제11항에 따른 항체에 의한 인간 OX40에 대한 결합으로부터 교차-차단되는, 인간 OX40에 결합하는 길항성 항체.
  28. 5 nM 미만의 농도에서 인간 OX40L (2 ㎍/ML의 최종 농도에서)의 활성을 50% 억제할 수 있고, 상기 억제 활성이 CD4+OX40+ T 세포의 표면 상에 발현된 OX40에 대한 OX40L 결합에 대해 측정되는 것인, 인간 OX40에 결합하는 길항성 중화 항체.
  29. 제11항에 따른 항체가 결합하는 인간 OX40 상의 에피토프.
  30. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 따른 항체의 중쇄 및/또는 경쇄(들)을 코딩하는 단리된 DNA 서열.
  31. 제30항에 따른 하나 이상의 DNA 서열을 포함하는 클로닝 또는 발현 벡터.
  32. 제31항에 있어서, 벡터가 서열 14 및 서열 18에 제시된 서열을 포함하는 것인 벡터.
  33. 제31항에 있어서, 벡터가 서열 19에 제시된 서열을 포함하는 것인 벡터.
  34. 제31항 또는 제32항 또는 제33항에 따른 하나 이상의 클로닝 또는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  35. 제34항에 따른 숙주 세포를 배양하고 항체를 단리하는 것을 포함하는, 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 따른 항체의 생성 방법.
  36. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 따른 항체를 하나 이상의 제약상 허용되는 부형제, 희석제 또는 담체와 조합으로 포함하는 제약 조성물.
  37. 제36항에 있어서, 다른 활성 성분을 추가로 포함하는 제약 조성물.
  38. OX40에 의해 매개되거나 증가된 수준의 OX40과 연관된 병리학적 장애의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 제36항 또는 제37항에 따른 제약 조성물.
  39. OX40에 의해 매개되거나 증가된 수준의 OX40과 연관된 병리학적 장애의 치료 또는 예방을 위한 의약의 제조에서의, 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 따른 항체의 용도.
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