CN107460201A - 编码gpc‑3嵌合抗原受体蛋白的核酸及表达gpc‑3嵌合抗原受体蛋白的t淋巴细胞 - Google Patents

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Abstract

编码表达于人T淋巴细胞表面的嵌合抗原受体蛋白的核酸，所述嵌合抗原受体蛋白包含顺序连接的胞外结合区，跨膜区和胞内信号区，其中所述胞外结合区包含特异性识别GPC3的C末端表位的单链抗体scFv(GPC3)。

Description

编码GPC-3嵌合抗原受体蛋白的核酸及表达GPC-3嵌合抗原受 体蛋白的T淋巴细胞
本申请是申请日为2013年05月08日、申请号为CN201310164725.X、发明名称为“编码GPC-3嵌合抗原受体蛋白的核酸及表达GPC-3嵌合抗原受体蛋白的T淋巴细胞”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及肿瘤细胞治疗领域，更具体地，涉及对特异性表达GPC3的上皮来源的肿瘤的转基因T淋巴细胞治疗领域。
背景技术
磷脂酰肌醇蛋白多糖-3(Glypican-3，GPC3，又称DGSX,GTR2-2,MXR7,OCI-5,SDYS,SGB,SGBS或SGBS1)是一种细胞表面蛋白，属于硫酸乙酰肝素蛋白多糖家族。GPC3基因编码产生70-kDa左右的前体核心蛋白，该前体蛋白能够被弗林蛋白酶(furin)剪切产生40-kDa左右的可溶性的能够进入血液的氨基端(N末端)肽和30-kDa左右含有2个硫酸乙酰肝素(HS)糖链的膜结合的羧基端(C末端)肽。GPC3蛋白通过糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚依附在细胞膜上。
GPC3高度表达于胎儿肝脏，而不表达于正常成年人的肝组织，但在肝细胞肝癌中恢复表达，与肝癌的发生发展有十分密切的关系，不仅在肝癌发生的早期检出率较高，而且随着肝癌的发展，其检出率也随之增高。而GPC3的表达在肝腺癌，胆管细胞癌，肝转移癌和12种常见实体瘤和21种非肝癌细胞系中均未检测出。此外，GPC3也在例如黑色素瘤，卵巢透明细胞癌、卵黄囊瘤、神经母细胞瘤等肿瘤中表达。考虑到GPC3在肝细胞肝癌，黑色素瘤等肿瘤中特异性的高表达，其被认为是肿瘤免疫治疗的一个候选靶标。
利用抗GPC3抗体进行肝癌检测和利用抗GPC3抗体的抗体依赖的(ADCC)或补体依赖的(CDC)细胞毒性研究方案已有报道。一般用于治疗的抗体识别的是GPC3蛋白的C末端。然而，抗体治疗存在着抗体在体内血液循环中半衰期的限制，一般来说，半衰期大多在23天以内。因此，持续给药和/或增大给药剂量是肿瘤抗体治疗所要求的，这导致患者治疗成本的增加，以及某些情况下，甚至不得已终结治疗。另外，治疗性抗体作为异源蛋白，还有可能在体内产生过敏反应及针对该治疗性抗体的中和性抗抗体的风险。
T淋巴细胞在肿瘤免疫应答中的作用日益受到重视。基于T淋巴细胞的过继性免疫治疗在部分肿瘤中取得了一定的效果，并且该种免疫治疗方法可以克服抗体治疗的上述缺陷，但在大多数肿瘤的疗效仍不能令人满意[Grupp SA,et al.Adoptive cellulartherapy.Curr Top Microbiol Immunol.,.2011；344:149-72.]。近年来，根据CTL对靶细胞的识别特异性依赖于T淋巴细胞受体(T Cell Receptor,TCR)的发现，将针对肿瘤细胞相关抗原的抗体的scFv与T淋巴细胞受体的CD3ζ或FcεRIγ等胞内信号激活基序融合成嵌合抗原受体(Chimeric antigen receptor，CAR)，并将其通过如慢病毒感染等方式基因修饰在T淋巴细胞表面。这种CAR T淋巴细胞能够以主要组织相容性复合物(MajorHistocompatibility Complex,MHC)非限制性方式选择性地将T淋巴细胞定向到肿瘤细胞并特异性地杀伤肿瘤。CAR T淋巴细胞是肿瘤免疫治疗领域的一个新的免疫治疗策略[Schmitz M,et al.Chimeric antigen receptor-engineered T cells forimmunotherapy of Cancer.J Biomed Biotechnol,2010,doi:10.1155/2010/956304.]。
嵌合抗原受体包括胞外结合区，跨膜区和胞内信号区。通常胞外区包含能够识别肿瘤相关抗原的scFv，跨膜区采用CD8，CD28等分子的跨膜区，胞内信号区采用免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)CD3ζ或FcεRIγ及共刺激信号分子CD28、CD137、CD134等的胞内信号区。
胞内信号区仅包含ITAM的为第一代CAR T淋巴细胞，其中嵌合抗原受体各部分按如下形式连接：scFv-TM-ITAM。该种CAR T可以激发抗肿瘤的细胞毒性效应，但是细胞因子分泌比较少，并且在体内不能激发持久的抗肿瘤效应[Zhang T.et al.Chimeric NKG2D-modified T cells inhibit systemic T-cell lymphoma growth in a mannerinvolving multiple cytokines and cytotoxic pathways,Can Res 2007,67(22):11029–11036.]。
随后发展的第二代CAR T淋巴细胞加入了CD28或CD137(又名4-1BB)的胞内信号区，其中嵌合抗原受体各部分按如下形式连接：scFv-TM-CD28-ITAM或scFv-TM-/CD137-ITAM。胞内信号区发生的B7/CD28或4-1BBL/CD137共刺激作用引起T淋巴细胞的持续增殖，并能够提高T淋巴细胞分泌IL-2和IFN-γ等细胞因子的水平，同时提高CAR T在体内的存活周期和抗肿瘤效果[Dotti G.et al.CD28costimulation improves expansion andpersistence of chimeric antigen receptor modified T cells in lymphomapatients.J Clin Invest,2011,121(5):1822-1826.]。
近些年发展的第三代CAR T淋巴细胞，其中嵌合抗原受体各部分按如下形式连接：scFv-TM-CD28-CD137-ITAM或scFv-TM-CD28-CD134-ITAM，进一步提高了CAR T在体内的存活周期和其抗肿瘤效果[Carpenito C.,et al.Control of large established tumorxenografts with genetically retargeted human T cells containing CD28andCD137domains.PNAS,2009,106(9):3360–3365.]。
尽管CAR T淋巴细胞在肿瘤免疫治疗中具有诱人的前景，但一些潜在的风险亦需要考虑。比如，由于某些/种正常组织低表达CAR所能识别的特异性抗原可能造成CAR T淋巴细胞对表达相应抗原的正常组织的损伤。如，针对肾细胞癌患者肿瘤细胞上表达的抗原碳酸酐酶IX(CAIX)是第一个用于临床的CAR T淋巴细胞过继治疗的案例，也是第一个报道含CAR细胞的脱靶效应的案例。病人在多次输入CAR T淋巴细胞后出现2-4级肝毒性。分析原因为肝胆管上皮细胞低表达CAIX，原临床试验被迫中断同时排除了病人治疗效果的任何评价[Stoter G.et al.Treatment of metastatic renal cell carcinoma with autologousT-lymphocytes genetically retargeted against carbonic anhydrase IX:firstclinical experience.J clin oncol,2006,24(13):e20-e22.；Ngo MC.,et al.Ex vivogene transfer for improved adoptive immunotherapy of cancer.Human MolecularGenetics,2011,R1–R7]。另外，CAR中过多的共刺激信号会降低效应细胞激活所需的阈值，使得基因修饰的T淋巴细胞在低水平抗原或没有抗原触发的条件下也可能会被活化，导致大量细胞因子的释放以致可能引发所谓的“细胞因子风暴”。这种信号外漏(singnalleakage)会导致脱靶细胞毒性，从而产生非特异性的组织损伤。例如，在采用针对Her2的第三代CAR临床治疗一个具有肝和肺转移的晚期结肠癌患者的过程中由于正常肺组织中低表达Her2而引发所谓的“细胞因子风暴”致病人猝死[Morgan RA.,et al.Report of aserious adverse event following the administration of T cells transduced witha chimeric antigen receptor recognizing Erbb2.Molecular Therapy,2010,18(4):843–851.]。
因此，本领域存在着对克服上述缺陷的编码GPC3嵌合抗原受体蛋白的淋巴细胞肿瘤治疗方案的强烈需求。
发明内容
本发明的第一方面涉及编码一种表达于T淋巴细胞表面的GPC3嵌合抗原受体蛋白的核酸，其表达的嵌合抗原受体蛋白使得表达该受体的T淋巴细胞针对高表达GPC3的肿瘤细胞具有高度特异性的细胞毒性作用。所述抗GPC3嵌合抗原受体蛋白包含顺序连接的胞外结合区，跨膜区和胞内信号区，其中所述胞外结合区包含特异性识别GPC3的C末端表位的单链抗体scFv(GPC3)。上述嵌合抗原受体蛋白的胞外结合区通过CD8铰链区与CD8或者CD28的跨膜区相连接，跨膜区后紧接胞内信号区。
本发明的核酸序列可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。本发明的编码嵌合抗原受体蛋白氨基酸序列的核酸密码子可以是简并的，即编码同一氨基酸序列的多种简并核酸序列都包含在本发明的范围之中。编码对应氨基酸的简并核酸密码子是本领域公知的。本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％，最佳地至少90％或至少95％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上,更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO:22-25之一所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
特异性识别人GPC3的C末端表位的单克隆抗体已被公开在例如，中国专利文献CN101186650A(中外制药株式会社)，此外据文献Advances in Liver Cancer AntibodyTherapies:A Focus on Glypican-3and Mesothelin，BioDrugs.2011October 1；25(5):275–284其他已知特异性识别C末端表位的单克隆抗体包括GC33和hGC33也分别被报道，其针对GPC3的抗原决定簇位于C端524-563位氨基酸残基，同时被报道的还包括GPC3-C02和1G12等单克隆抗体。这些被公开的单克隆抗体可以用于制备本发明的核酸所编码的嵌合抗原受体中的单链抗体部分。其他识别GPC3的C末端表位的单克隆抗体也可以合适的方式运用于本发明。
单链抗体scFv(GPC3)可以根据上述公开的GPC3单克隆抗体的序列通过基因工程方法或化学合成方法制备。本发明中使用的术语“单链抗体(scFv)片段”指的是通过如下定义的抗体片段，其是包含通过接头(linker)连接的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的重组蛋白，接头使得这两个结构域相关联，以最终形成抗原结合位点。scFv的大小一般是一个完整抗体的1/6。单链抗体优选是由一条核苷酸链编码的一条氨基酸链序列。本发明使用的单链抗体可单独或联合使用本领域已知的常规技术，例如氨基酸缺失、插入、取代、增加、和/或重组以及/或其他修饰方法作进一步修饰。根据一种抗体的氨基酸序列在其DNA序列中引入这种修饰的方法对本领域技术人员来说是众所周知的；见例如，Sambrook，分子克隆：实验手册，Cold Spring Harbor Laboratory(1989)N.Y.。所指的修饰优选在核酸水平上进行。上述单链抗体还可以包括其衍生物。本发明中“抗体的衍生物”包括例如当通过噬菌体展示技术获得所述抗体的衍生物时，可使用如BIAcore系统中使用的表面等离子共振技术来增加与GPC3抗原表位结合的噬菌体抗体的效率(Schier，人抗体杂交瘤7(1996)，97-105；Malmborg,免疫学方法杂志183(1995)，7-13)。还包括，例如WO 89/09622中描述的嵌合抗体的产生的方法，EP-A10239400和WO90/07861中描述的人源化抗体产生的方法，WO91/10741,WO94/02602和WO96/33735中有描述的产生异种抗体例如小鼠中的人抗体的方法所产生的抗体的衍生物。
本发明的术语“特异性识别”的意思是本发明的抗体不与或基本上不与目标抗原以外的任意多肽交叉反应。其特异性的程度可以通过免疫学技术来判断，包括但不限于免疫印迹，免疫亲和层析，流式细胞分析等。在本发明中，特异性识别优选通过流式细胞技术来确定，而具体情况下特异性识别的标准可由本领域一般技术人员根据其掌握的本领域常识来判断。
嵌合抗原受体的跨膜区可以选自CD8或CD28等蛋白的跨膜区。CD8或CD28是T淋巴细胞表面的天然标记物。人CD8蛋白是个异二聚体，由αβ或者γδ两条链组成。在本发明的一个实施方案中，跨膜区选自CD8α或者CD28的跨膜区。此外，CD8α铰链区(hinge)是一个柔性区域，因此，CD8或CD28和跨膜区加上铰链区被用于将嵌合抗原受体CAR的靶点识别结构域scFv和胞内信号区连接起来。
胞内信号区可以选自CD3ζ，FcεRIγ，CD28，CD137，CD134蛋白的胞内信号区，及其组合。CD3分子由五个亚单位组成，其中CD3ζ亚单位(又称CD3zeta，简称Z)含有3个ITAM基序，该基序是TCR-CD3复合体中重要的信号转导区。CD3δZ是截短的不具有ITAM基序的CD3ζ序列，在本发明实践中一般作为阴性对照的构建。FcεRIγ主要分布在肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面，其含有一个ITAM基序，在结构、分布及功能上与CD3ζ类似。此外如前所述，CD28，CD137，CD134是共刺激信号分子，在与各自配体结合后其胞内信号区段产生的共刺激作用引起T淋巴细胞的持续增殖，并能够提高T淋巴细胞分泌IL-2和IFN-γ等细胞因子的水平，同时提高CAR T淋巴细胞在体内的存活周期和抗肿瘤效果。
本发明的核酸所编码的GPC3嵌合抗原受体蛋白可以选自按如下方式顺序连接的嵌合抗原受体蛋白：
scFv(GPC3)-CD8-CD3ζ，
scFv(GPC3)-CD8-CD137-CD3ζ，
scFv(GPC3)-CD28a-CD28b-CD3ζ，
scFv(GPC3)-CD28a-CD28b-CD137-CD3ζ，
及其组合，其中相关嵌合抗原受体蛋白中CD28a代表CD28分子的跨膜区，CD28b代表CD28分子的胞内信号区。上述各种抗GPC3嵌合抗原受体统称为scFv(GPC3)-CAR。
在本发明的一个实施方案中，本发明的核酸具有如SEQ ID NO:18～21所述的序列。在本发明的另一个实施方案中，本发明的核酸是编码具有如SEQ ID NO:22-25之一的嵌合抗原受体蛋白的核酸。
本发明的第二方面包括包含上述编码表达于T淋巴细胞表面的嵌合抗原受体蛋白的核酸的载体。在一个具体实施方案中，本发明使用的载体是一种慢病毒质粒载体pPWT-eGFP。该质粒属于第三代自灭活慢病毒载体系统，该系统共有三个质粒即编码蛋白Gag/Pol、编码Rev蛋白的包装质粒psPAX2；编码VSV-G蛋白的包膜质粒PMD2.G；及空载体pPWT-eGFP，其可以用于重组引入目的核酸序列，即编码CAR的核酸序列。空载体pPWT-eGFP(其本身为后续试验中的mock)中由延长因子-1α(elongation factor-1α，EF-1α)启动子调控增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein，eGFP)的表达。而包含编码CAR的目的核酸序列的重组表达载体pWPT-eGFP-F2A-CAR是通过由来自口蹄疫病毒(food-and-mouth disease virus，FMDV)的核糖体跳跃序列(ribosomal skipping sequence 2A)(简称F2A)实现eGFP与CAR的共表达的。在一个具体实施方案中，本发明的载体具有如SEQ IDNO:27-30之一的核酸序列。
本发明的第三方面包括包含上述载体的病毒。本发明的病毒包括包装后的具有感染力的病毒，也包括包含包装为具有感染力的病毒所必需成分的待包装的病毒。本领域内已知的其他转导T淋巴细胞的病毒及其对应的质粒载体也可用于本发明。
在本发明的一个实施方案中，所述病毒是包含上述pWPT-eGFP-F2A-CAR重组载体(即含有scFv(GPC3)-CAR)的慢病毒。
本发明的第四方面包括一种转基因T淋巴细胞，其被转导有本发明的核酸或被转导有本发明的上述包含所述含有该核酸的重组质粒，或包含该质粒的病毒。本领域常规的核酸转导方法，包括非病毒和病毒的转导方法都可以用于本发明。基于非病毒的转导方法包括电穿孔法和转座子法。近期Amaxa公司研发的nucleofector核转染仪能够直接将外源基因导入细胞核获得目的基因的高效转导。另外，基于睡美人转座子(Sleeping Beautysystem)或PiggyBac转座子等转座子系统的转导效率较普通电穿孔有较大提高，将nucleofector转染仪与睡美人转座子系统联合应用已有报道[Davies JK.,etal.Combining CD19redirection and alloanergization to generate tumor-specifichuman T cells for allogeneic cell therapy of B-cell malignancies.Cancer Res,2010,70(10):OF1-10.]，该方法既具有较高的转导效率又能够实现目的基因的定点整合。在本发明的一个实施方案中，实现嵌合抗原受体基因修饰的T淋巴细胞的转导方法是基于病毒如逆转录病毒或慢病毒的转导方法。该方法具有转导效率高，外源基因能够稳定表达，且可以缩短体外培养T淋巴细胞到达临床级数量的时间等优点。在该转基因T淋巴细胞表面，转导的核酸通过转录、翻译表达在其表面。通过对各种不同的培养的肿瘤细胞进行体外细胞毒实验证明，本发明的表达嵌合抗原受体的转基因T淋巴细胞具有高度特异性的肿瘤细胞杀伤效果(亦称细胞毒性)。因此本发明的编码嵌合抗原受体蛋白的核酸，包含该核酸的质粒，包含该质粒的病毒和转导有上述核酸，质粒或病毒的转基因T淋巴细胞可以有效地用于肿瘤的免疫治疗。
在一个实施方案中，本发明的T淋巴细胞，其表面表达一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体由SEQ ID NO:18-21之一的核酸编码表达。在另一个实施方案中，本发明的转基因T淋巴细胞表面表达一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列选自SEQ IDNO:22-25之一。
附图说明
图1显示的是作为示例的本发明的包含编码CAR序列的慢病毒载体pWPT-eGFP-F2A-CAR的结构示意图。
图2显示的是作为示例的包含在慢病毒载体中的本发明的CAR的不同区之间连接关系的示意图,其中由核糖体跳跃序列F2A连接的eGFP和scFv(GPC3)特异性嵌合抗原受体。
图3显示的是MluI和SalI双酶切鉴定实施例1的慢病毒质粒的核酸电泳图。其中M1是DS2000分子量标记物(广州东盛生物科技有限公司)；M2是Hind III标记物(广州东盛生物科技有限公司)。泳道1-5分别是
1:pWPT-eGFP-F2A-GPC3-δZ；
2:pWPT-eGFP-F2A-GPC3-Z；
3:pWPT-eGFP-F2A-GPC3-BBZ；
4:pWPT-eGFP-F2A-GPC3-28Z；
5:pWPT-eGFP-F2A-GPC3-28BBZ。
图4显示的是本发明实施例2的病毒感染CTL(细胞毒性T淋巴细胞)后细胞表达的eGFP的流式细胞技术检测结果。
图5显示的是本发明实施例2的表达不同嵌合抗原受体(CAR+)的CTL细胞的体外生长情况。图中显示在病毒感染后第9天，表达不同嵌合抗原受体的CTL细胞体外扩增20～40倍。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不能理解为用于限制本发明的范围。下面实施例中如未注明具体条件的实验方法，则按照常规条件如Sambrook等，“分子克隆：实验手册(New York：Cold Spring Harborlaboratory Press，1989)”中所述的条件，而在实施例中明确说明有试剂公司说明书时，则按照说明书所建议的条件进行。
实施例1.表达本发明核酸编码的嵌合抗原受体蛋白的慢病毒质粒的构建及病毒包装
下表1解释了本发明示例的嵌合抗原受体各部分的连接顺序，该连接还可参见图2中所示。
表1
1.核酸片段的扩增
(1)scFv(GPC3)序列的扩增
scFv(GPC3)序列的扩增以本实验室构建的单链双功能抗体核苷酸GPC3/CD3为模板，模板的序列参见中国专利申请201210480326.x中的SEQ ID NO：9。扩增所采用的引物对为上游引物5’-gatgttgtgatgactcagtctc-3’(SEQ ID NO:1)和下游引物5’-gcgctggcgtcgtggttgaggagacggtgaccag-3’(SEQ ID NO:2)用于扩增scFv(GPC3)；目的扩增条带大小均为746bp。PCR扩增条件为预变性：94℃，4min；变性：94℃，40s；退火：58℃，40s；延伸：68℃，40s；进行25个循环，然后总延伸68℃，10min。PCR扩增条带通过琼脂糖凝胶电泳确认符合预计的片段大小。
(2)嵌合抗原受体其他部分的核酸序列
GPC3嵌合抗原受体蛋白的除scFv(GPC3)外其他部分的核酸序列分别以专利申请号为201310108532.2中公开的序列SEQ ID NO:1～4为模板通过PCR方式获得。具体地，其中如下各种GPC3嵌合抗原受体蛋白除scFv(GPC3)外的CAR部分，其中CD8-CD3ζ(Z)和CD28a-CD28b-CD137-CD3ζ(28BBZ)，分别以scFv(EFGR)-CD8-CD3ζ(专利申请201310108532.2中SEQID NO:1)和scFv(EFGR)-CD28a-CD28b-CD137-CD3ζ(专利申请201310108532.2中SEQ IDNO:2)为模板，采用上游引物5’-accacgacgccagcgccgcgaccac-3’(SEQ ID NO:3)和下游引物5’-gaggtcgacctagcgagggggcagggcctgcatgtgaag-3’(SEQ ID NO:4)扩增，PCR扩增条件为预变性：94℃，4min；变性：94℃，40s；退火：60℃，40s；延伸：68℃，40s；进行25个循环，然后总延伸68℃，10min。目的条带分别为549bp和816bp，PCR扩增条带通过琼脂糖凝胶电泳确认符合预计的片段大小。
另外，CD8-CD3deltaζ(delta Z)，CD8-CD137-CD3ζ(BBZ)和CD28a-CD28b-CD3ζ(28Z)分别通过如下方式获得：
A)加1ml Trizol(Invitrogen公司)于1×107健康人外周血单个核细胞(上海市血液中心提供)中裂解细胞后，采用酚-氯仿法抽提总RNA，采用ImProm-IITM逆转录试剂盒(promaga公司)逆转录制备cDNA。以上述制备的cDNA为模板，分别：
(i)以上游引物5’-gtcaccgtctcctcaaccacgacgccagcg-3’(SEQ ID NO:5)和下游引物5’-ggtgataaccagtgacaggag-3’(SEQ ID NO:6)扩增获得CD8α铰链区-跨膜区，PCR扩增条件为预变性：94℃，4min；变性：94℃，30s；退火：58℃，30s；延伸：68℃，30s；进行25个循环，然后总延伸68℃，10min。条带理论大小为198bp，扩增产物经琼脂糖电泳确认与理论大小一致。
(ii)以上游引物5’-gtcaccgtctcctcaaccacgacgccagcg-3’(SEQ ID NO:5)和下游引物5’-gaggtcgacctacgcgggggcgtctgcgctcctgctgaacttcactctggtgataaccagtg-3’(SEQID NO:7)扩增获得CD8α铰链区-跨膜区-delta Z(即CD8-CD3deltaζ)，PCR扩增条件同上。条带理论大小为261bp，扩增产物经琼脂糖电泳确认与理论大小一致。
(iii)以上游引物5’-ttttgggtgctggtggtggttgg-3’(SEQ ID NO:8)和下游引物5’-gctgaacttcactctggagcgataggctgcgaag-3’(SEQ ID NO:9)扩增获得CD28跨膜区-胞内信号区片段，PCR扩增条件同上，条带理论大小为219bp，扩增产物经琼脂糖电泳确认与理论大小一致。
(iiii)以上游引物5’-aaacggggcagaaagaaactc-3’(SEQ ID NO:10)和下游引物5’-cagttcacatcctccttc-3’(SEQ ID NO:11)扩增获得CD137胞内区，PCR扩增条件同上,条带理论大小为126bp，扩增产物经琼脂糖电泳确认与理论大小一致。
(iiiii)以上游引物5’-cactggttatcaccagagtgaagttcagcaggagc-3’(SEQ ID NO:12)和下游引物5’-gaggtcgacctagcgagggggcagggcctgcatg-3’(SEQ ID NO:13)扩增获得CD3zeta信号区，PCR扩增条件同上，条带理论大小为339bp，扩增产物经琼脂糖电泳确认与理论大小一致。
B)核酸片段的拼接
(i)以上游引物5’-accacgacgccagcgccg-3’(SEQ ID NO:14)和下游引物5’-cacccagaaaataataaag-3’(SEQ ID NO:15)拼接获得CD8α铰链区-CD28跨膜区，拼接条件：CD8α铰链区(50ng)+CD28跨膜区(50ng)预变性：94℃，4min；变性：94℃，30s；退火：60℃，30s；延伸：68℃，30s，进行5个循环，然后总延伸68℃，10min，补充DNA聚合酶及上下游引物后PCR扩增25个循环，扩增条件为预变性：94℃，4min；变性：94℃，30s；退火：60℃，30s；延伸：68℃，30s，进行25个循环，然后总延伸68℃，10min。理论大小为216bp。扩增产物经琼脂糖电泳确认与理论大小一致。
(ii)以上游引物5’-aaacggggcagaaagaaactc-3’(SEQ ID NO:10)和下游引物5’-gaggtcgacctagcgagggggcagggcctgcatg-3’(SEQ ID NO:13)拼接扩增获得CD137-CD3ζ，即为BBZ，拼接和PCR扩增条件同上。条带理论大小为478bp，扩增产物经琼脂糖电泳确认与理论大小一致。
(iii)以上游引物5’-gtcaccgtctcctcaaccacgacgccagcg-3’(SEQ ID NO:5)和下游引物5’-gaggtcgacctagcgagggggcagggcctgcatg-3’(SEQ ID NO:13)将CD8α铰链区-跨膜区与BBZ拼接及PCR获得目的片段：CD8α铰链区-跨膜区-BBZ胞内区，即CD8-CD137-CD3ζ，拼接和PCR扩增条件同上。理论大小为691bp。扩增产物经琼脂糖电泳确认与理论大小一致。
(iiii)以上游引物5’-gtcaccgtctcctcaaccacgacgccagcg-3’(SEQ ID NO:5)和下游引物5’-gaggtcgacctagcgagggggcagggcctgcatg-3’(SEQ ID NO:13)将CD8α铰链区-CD28跨膜区-胞内区与Z采用同上的拼接和PCR扩增获得目的片段：CD8α铰链区-CD28跨膜区-28Z胞内区，即CD28a-CD28b-CD3ζ，拼接和PCR扩增条件同上。条带理论大小为706bp，扩增产物经琼脂糖电泳确认与理论大小一致。
(3)3’端带有F2A及CD8α信号肽的eGFP核酸片段的获得
以上游引物5’-cttacgcgtcctagcgctaccggtcgccaccatggtgagcaagggcgaggag-3’(SEQ ID NO:16)和下游引物5’-cggcctggcggcgtggagcag-3’(SEQ ID NO:17)扩增慢病毒载体中3’端带有F2A及CD8α信号肽的eGFP核酸片段，以专利申请201310108532.2中公开的pWPT-eGFP-F2A-806-Z为模板，PCR扩增条件为预变性：94℃，4min；变性：94℃，40s；退火：56℃，40s；延伸：68℃，50s，进行25个循环，然后总延伸68℃，10min，理论大小为883bp，扩增产物经琼脂糖电泳确认与理论大小一致。
2.核酸片段的拼接
分别将如前述段落“(2)嵌合抗原受体其他部分的核酸序列”中扩增获得的片段CD8-CD3ζ，CD8-CD137-CD3ζ，CD28a-CD28b-CD3ζ，CD28a-CD28b-CD137-CD3ζ与等摩尔的前述段落“(3)嵌合抗原受体其他部分的核酸序列”中扩增获得的3’端带有F2A及CD8α信号肽的eGFP核酸片段(质量约为50ng)及等摩尔的scFv(GPC3)(质量约为50ng)三片段按图2所示模式拼接并PCR，拼接条件为：预变性：94℃，4min；变性：94℃，40s；退火：60℃，40s；延伸：68℃，140s，进行5个循环，然后总延伸68℃，10min，补充DNA聚合酶及上游引物5’-cttacgcgtcctagcgctaccggtcgccaccatggtgagcaagggcgaggag-3’(SEQ ID NO:16)和下游引物5’-gaggtcgacctagcgagggggcagggcctgcatg-3’(SEQ ID NO:13)后PCR扩增25个循环，扩增条件为预变性：94℃，4min；变性：94℃，40s；退火：60℃，40s；延伸：68℃，140s，进行25个循环，然后总延伸68℃，10min。扩增获得eGFP-GPC3-Z、eGFP-GPC3-BBZ、eGFP-GPC3-28Z及eGFP-GPC3-28BBZ理论大小分别为2161bp，2278bp，2302bp和2428bp。扩增产物经琼脂糖电泳确认与理论大小一致。
在与同上相同的实验条件下，采用上游引物5’-gatgttgtgatgactcagtctc-3’(SEQID NO:1)和下游引物5’-gaggtcgacctagcgagggggcagggcctgcatg-3’(SEQ ID NO:13)，在不添加3’端带有F2A及CD8α信号肽的eGFP核酸片段(质量约为50ng)，可以获得编码GPC3嵌合抗原受体蛋白的核酸GPC3-Z(SEQ ID NO:18)、GPC3-BBZ(SEQ ID NO:19)、GPC3-28Z(SEQ IDNO:20)及GPC3-28BBZ(SEQ ID NO:21)序列，上述各核酸序列分别编码具有如下氨基酸序列的GPC3嵌合抗原受体蛋白，GPC3-Z(SEQ ID NO:22)、GPC3-BBZ(SEQ ID NO:23)、GPC3-28Z(SEQ ID NO:24)及GPC3-28BBZ(SEQ ID NO:25)。
此外，分别将如前述段落“(2)嵌合抗原受体其他部分的核酸序列”中扩增获得的片段CD8-CD3deltaζ片段与等摩尔的前述段落“(3)嵌合抗原受体其他部分的核酸序列”中扩增获得的片段及等摩尔的scFv(GPC3)采用上游引物5’-cttacgcgtcctagcgctaccggtcgccaccatggtgagcaagggcgaggag-3’(SEQ ID NO:16)和下游引物5’-gaggtcgacctacgcgggggcgtctgcgctcctgctgaacttcactctggtgataaccagtg-3’(SEQ IDNO:7)同上条件进行拼接并PCR，扩增获得eGFP-GPC3-δZ(SEQ ID NO:31)，理论大小为1858bp，扩增产物经琼脂糖电泳确认与理论大小一。
3.慢病毒质粒载体的构建
作为示例的构建本发明的慢病毒质粒载体使用的载体系统属于第三代自灭活慢病毒载体系统，该系统共有三个质粒即编码蛋白Gag/Pol、编码Rev蛋白的包装质粒psPAX2；编码VSV-G蛋白的包膜质粒PMD2.G及基于空载体pPWT-eGFP的编码目的基因CAR的重组表达载体。
在空载体pPWT-eGFP中，延长因子-1α(elongation factor-1α，EF-1α)的启动子调控增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein，eGFP)的表达，而在编码目的基因CAR的重组表达载体中通过来自口蹄疫病毒的核糖体跳跃序列(food and mouthdisease virus，FMDV,ribosomal skipping sequence,F2A)实现eGFP与目的基因CAR的共表达。F2A是来自口蹄疫病毒的2A(或称为“自剪切多肽2A”)的一段核心序列，具备2A的“自剪切”功能，可以实现上游和下游基因共表达。2A由于其剪切效率高、上下游基因表达平衡性高及自身序列短小的优点为构建基因治疗多顺反子载体提供了一种有效的可行策略。尤其在基于嵌合抗原受体基因修饰T淋巴细胞的免疫治疗中多应用该序列实现目的基因与GFP或者eGFP的共表达，通过检测GFP或者eGFP即可间接检测CAR的表达。
本实施例构建了由F2A相连的eGFP与特异性CAR共表达的慢病毒表达载体，统称为pWPT-eGFP-F2A-CAR。上述步骤2中获得的目的基因eGFP-F2A-CAR通过MluI和SalI限制性内切酶双酶切，连入同样双酶切的pWPT载体中，从而构建表达各嵌合抗原受体的慢病毒载体。构建成功的载体经MluI和SalI酶切鉴定(图3)及序列测定正确后，可以准备用于慢病毒包装。如前所述，eGFP-F2A-CAR转录为一条mRNA，但最终翻译为eGFP和抗GPC3嵌合抗原受体两条肽链，其中在CD8α信号肽的引导下抗GPC3嵌合抗原受体将定位在细胞膜上。用作阴性对照的eGFP-GPC3-δZ在插入到慢病毒质粒载体后在细胞膜表面表达含有截短的δZ的GPC3嵌合抗原受体(GPC3-δZ)，其氨基酸序列为SEQ ID NO:32。
得到的含有各目的CAR的载体的核酸全序列如下：pWPT-eGFP-F2A-GPC3-δZ(SEQID NO:26)；pWPT-eGFP-F2A-GPC3-Z(SEQ ID NO:27)；pWPT-eGFP-F2A-GPC3-BBZ(SEQ IDNO:28)；pWPT-eGFP-F2A-GPC3-28Z(SEQ ID NO:29)；pWPT-eGFP-F2A-GPC3-28BBZ(SEQ IDNO:30)。
4.质粒转染293T包装慢病毒
以6×106的密度接种培养至第6～10代的293T细胞(ATCC：CRL-11268)于10cm培养皿中，37℃，5％CO2培养过夜准备用于转染。培养基为含10％胎牛血清(PAA公司)的DMEM(PAA公司)，次日，在转染前约2小时更换培养液为无血清DMEM。
转染的步骤如下：
4.1将20μg空质粒pWPT-eGFP(mock对照)或20μg的各目的基因质粒pWPT-eGFP-F2A-CAR，分别与15μg包装质粒PAX2：和6μg包膜质粒pMD2.G：，溶入500μL MillQ水中，混匀，
4.2逐滴加入62μL 2.5M CaCl2(Sigma公司)，以1200rpm/min vortex混匀，
4.3最后逐滴加入500μL 2×HeBS(280mM NaCl,10mM KCl,1.5mM Na2HPO4·2H2O,12mM葡萄糖，50mM Hepes(Sigma公司)，pH7.05,0.22μM过滤除菌)，1200rpm/min vortex混匀10s，
4.4立即逐滴加入培养皿中，轻轻摇匀，37℃，5％CO2，培养4～6h后，更换为含10％胎牛血清的DMEM。
在转染次日观察转染效率(即呈绿色荧光的细胞比例)，～80％的阳性转染效率即为转染实验成功。在转染48h或72h后，使用0.45μm滤器(Millipore公司)过滤收集病毒，然后采用Beckman Optima L-100XP超速离心机28000rpm，4℃离心2小时，弃离心上清，离心所得沉淀用1/10～1/50原液体积的Quantum 007培养液(PAA公司)进行重悬，以100μL/管分装冻存于-80℃，以待病毒滴定或感染T淋巴细胞。
5.测定包装有mock或者eGFP-F2A-CAR的慢病毒滴度
第一天，以1×105/mL接种293T细胞于96孔培养板，100μL/孔，37℃，5％CO2培养，培养液为含10％胎牛血清的DMEM。第二天，弃50μL/孔培养上清，补加50μL/孔新鲜上述培养液，并含终浓度为6μg/mL的polybrene，37℃，5％CO2孵育30min。加10μL/孔的病毒原液或1μL/孔的病毒浓缩液，5倍稀释，4个梯度，两个复孔，37℃，5％CO2培养。感染48h后，流式细胞仪检测eGFP，以阳性率为5～20％的细胞数为宜，计算滴度(U/mL)＝阳性率×稀释倍数×100×104。磷酸钙转染法包装的上述包含mock即空载体对照和各eGFP-F2A-CAR的病毒的滴度均为约0.5～2×106U/mL的水平，经浓缩后所测的病毒滴度约为2×107U/mL。
实施例2.重组慢病毒感染CTL细胞
由健康人外周血通过密度梯度离心法获得人外周血单个核细胞(上海市血液中心提供)，外周血单个核细胞通过CTL细胞磁珠(Stem Cell Technologies)负性分选方法获得CTL，分选后的CTL细胞进行流式细胞检测CTL细胞的纯度，以CTL细胞的阳性率≥95％为宜进行下一步操作。以约1×106/mL密度加入Quantum 007淋巴细胞培养基液(PAA公司)培养并以细胞：磁珠比例为1:1加入同时包被有抗CD3和CD28抗体的磁珠(Invitrogen公司)和终浓度100U/mL的重组人IL-2(上海华新生物高技术有限公司)刺激培养24h。然后以MOI≈5用上述重组慢病毒感染CTL细胞。感染后的细胞每隔一天采用5×105/mL的密度进行传代，同时在淋巴细胞培养液中补加终浓度100U/mL的重组人IL-2。
感染的CTL细胞在培养第8天时通过流式细胞检测各不同嵌合抗原受体表达，由于eGFP与CAR共表达，检测eGFP的阳性细胞即为表达嵌合抗原受体的阳性细胞(图4)。以未感染的T淋巴细胞作为阴性对照，表达不同嵌合抗原受体的病毒感染CTL细胞其阳性率如下表所示。该阳性率结果表明通过慢病毒感染的方法能够获得一定阳性率的CAR+CTL细胞。
表2
转染有下列CAR的CTL细胞 CTL细胞eGFP阳性率
Mock(空载体对照) 37％
GPC3-Z 32％
GPC3-28BBZ 37％
CTL细胞在分别感染包装有不同嵌合抗原受体的病毒后，以细胞密度为5×105/ml隔天传代培养、计数、并对传代的细胞培养液补加IL-2(终浓度为100U/ml)，培养第11天约有20～40倍的扩增(见图5)，表明表达不同嵌合抗原受体的CTL细胞在体外能够进行一定数量的扩增，为后续体外毒性试验及体内试验提供了保证。
实施例3.表达嵌合抗原受体细胞的体外毒性效果实验
体外毒性实验使用的材料如下：
如下表3所示的肝细胞癌细胞系作为靶细胞，效应细胞为如实施例2所验证的体外培养12天的FACS检测嵌合抗原受体表达的阳性细胞记为嵌合抗原受体阳性(CAR+)的CTL,
表3
肿瘤类型 细胞名称 来源 性质
肝细胞瘤 PLC/PRF/5 ATCC:CRL-8024 高表达GPC3
肝细胞癌 Hep 3B2.1-7 ATCC:HB-8064 高表达GPC3
肝腺癌 SK-HEP-1 ATCC:HTB-52 GPC3阴性
效靶比视情况分别为3:1，1:1和1:3，靶细胞数量为10000/孔，根据不同效靶比对应效应细胞。各组均设5个复孔，取5个复孔的平均值。检测时间为第18h。
其中各实验组和各对照组如下：
各实验组：各靶细胞+表达不同嵌合抗原受体的CTL，
对照组1：靶细胞最大释放LDH，
对照组2：靶细胞自发释放LDH，
对照组3：效应细胞自发释放LDH。
检测方法：采用CytoTox 96非放射性细胞毒性检测试剂盒(Promega公司)进行。该方法是基于比色法的检测方法，可替代51Cr释放法。检测定量地测量乳酸脱氢酶(LDH)。LDH是一种稳定的胞质酶，在细胞裂解时会释放出来，其释放方式与51Cr在放射性分析中的释放方式基本相同。释放出的LDH培养基上清中，可通过30分钟偶联的酶反应来检测，在酶反应中LDH可使一种四唑盐(INT)转化为红色的甲臜(formazan)。生成的红色产物的量与裂解的细胞数成正比。具体参照CytoTox 96非放射性细胞毒性检测试剂盒说明书。
细胞毒性计算公式为：
实验结果表明：
具体如表4所示，本发明的表达嵌合抗原受体GPC3-Z CAR+的CTL和GPC3-28BBZCAR+的CTL对高表达GPC3的肝细胞癌细胞系PLC/PRF/5和Hep3B均表现出非常显著的特异性细胞毒性作用，并呈现效靶比梯度依赖性即效靶比越高细胞毒性作用越强，而对GPC3阴性的肝细胞癌细胞系SK-HEP-1没有特异性细胞毒性作用。其中GPC3-28BBZ在效靶比3:1时对高表达GPC3的肝癌细胞PLC/PRF/5的细胞毒性高达97％，对高表达GPC3的肝癌细胞Hep3B的细胞毒性高达81％。
效靶比依赖性的数据进一步显示本发明的表达本发明的GPC3嵌合抗原受体的CTL对高表达GPC3的肝癌细胞的特异性细胞毒性作用。
相比较而言，被含有mock质粒(不携带GPC3-CAR的空质粒载体pPWT-eGFP)的病毒转染的作为空白对照的CTL显示对上述三种细胞的细胞毒性作用均非常低，显示出对GPC3表达的不敏感，其细胞毒性与表达本发明的GPC3嵌合抗原受体的CTL的细胞毒性数据呈现出非常显著大的差异。
表4
表5本发明中的序列
所有本说明书中列出的出版物的内容都包含在本说明书中。此外，本领域技术人员可以理解，在不背离权利要求书中所述的技术范围和实质内容的情况下，对本发明进行多种不同的修饰和改变是可能的。本发明还包括上述这些修饰和改变。
序 列 表
<110> 科济生物医药（上海）有限公司
<120> 编码GPC-3嵌合抗原受体蛋白的核酸及表达GPC-3嵌合抗原受体蛋白的T淋巴
细胞
<130> GPC3 CART
<160> 32
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> primer 1
<400> 1
gatgttgtga tgactcagtc tc 22
<210> 2
<211> 34
<212> DNA
<213> aritificial
<400> 2
gcgctggcgt cgtggttgag gagacggtga ccag 34
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> primer 3
<400> 3
accacgacgc cagcgccgcg accac 25
<210> 4
<211> 39
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> primer 4
<400> 4
gaggtcgacc tagcgagggg gcagggcctg catgtgaag 39
<210> 5
<211> 62
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> primer 5
<400> 5
gaggtcgacc tacgcggggg cgtctgcgct cctgctgaac ttcactctgg tgataaccag 60
tg 62
<210> 6
<211> 52
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> primer 6
<400> 6
cttacgcgtc ctagcgctac cggtcgccac catggtgagc aagggcgagg ag 52
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> primer 7
<400> 7
cggcctggcg gcgtggagca g 21
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> primer 8
<400> 8
ttttgggtgc tggtggtggt tgg 23
<210> 9
<211> 34
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> primer 9
<400> 9
gctgaacttc actctggagc gataggctgc gaag 34
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> primer 10
<400> 10
aaacggggca gaaagaaact c 21
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> primer 11
<400> 11
cagttcacat cctccttc 18
<210> 12
<211> 35
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> primer 12
<400> 12
cactggttat caccagagtg aagttcagca ggagc 35
<210> 13
<211> 34
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> primer 13
<400> 13
gaggtcgacc tagcgagggg gcagggcctg catg 34
<210> 14
<211> 18
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> primer 14
<400> 14
accacgacgc cagcgccg 18
<210> 15
<211> 19
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> primer 15
<400> 15
cacccagaaa ataataaag 19
<210> 16
<211> 52
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> primer 16
<400> 16
cttacgcgtc ctagcgctac cggtcgccac catggtgagc aagggcgagg ag 52
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> primer 17
<400> 17
cggcctggcg gcgtggagca g 21
<210> 18
<211> 1266
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> GPC3 CAR (GPC3-Z)
<400> 18
gatgttgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gccggcctcc 60
atctcctgca gatctagtca gagccttgta cacagtaatg ccaacaccta tttacattgg 120
tacctgcaga agccagggca gtctccacag ctcctgatct ataaagtttc caaccgattt 180
tctggggtcc ctgacaggtt cagtggcagt ggatcaggca cagattttac actgaaaatc 240
agcagagtgg aggctgagga tgttggggtt tattactgct ctcaaaatac acatgttcct 300
cctacgtttg gccaggggac caagctggag atcaaacgtg gtggaggcgg ttcaggcgga 360
ggtggctctg gcggtggcgg atcgcaggtg cagctggtgc agtctggagc tgaggtgaag 420
aagcctgggg cctcagtgaa ggtctcctgc aaggcttctg gatacacctt caccgactat 480
gaaatgcact gggtgcgaca ggcccctgga caagggcttg agtggatggg agctcttgat 540
cctaaaactg gtgatactgc ctacagtcag aagttcaagg gcagagtcac gctgaccgcg 600
gacgaatcca cgagcacagc ctacatggag ctgagcagcc tgagatctga ggacacggcc 660
gtgtattact gtacaagatt ctactcctat acttactggg gccagggaac cctggtcacc 720
gtctcctcaa ccacgacgcc agcgccgcga ccaccaacac cggcgcccac catcgcgtcg 780
cagcccctgt ccctgcgccc agaggcgtgc cggccagcgg cggggggcgc agtgcacacg 840
agggggctgg acttcgcctg tgatatctac atctgggcgc ccttggccgg gacttgtggg 900
gtccttctcc tgtcactggt tatcaccaga gtgaagttca gcaggagcgc agacgccccc 960
gcgtaccagc agggccagaa ccagctctat aacgagctca atctaggacg aagagaggag 1020
tacgatgttt tggacaagag acgtggccgg gaccctgaga tggggggaaa gccgcagaga 1080
aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc 1140
tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc cggaggggca aggggcacga tggcctttac 1200
cagggtctca gtacagccac caaggacacc tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc 1260
cctcgc 1266
<210> 19
<211> 1392
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> GPC3-BBZ
<400> 19
gatgttgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gccggcctcc 60
atctcctgca gatctagtca gagccttgta cacagtaatg ccaacaccta tttacattgg 120
tacctgcaga agccagggca gtctccacag ctcctgatct ataaagtttc caaccgattt 180
tctggggtcc ctgacaggtt cagtggcagt ggatcaggca cagattttac actgaaaatc 240
agcagagtgg aggctgagga tgttggggtt tattactgct ctcaaaatac acatgttcct 300
cctacgtttg gccaggggac caagctggag atcaaacgtg gtggaggcgg ttcaggcgga 360
ggtggctctg gcggtggcgg atcgcaggtg cagctggtgc agtctggagc tgaggtgaag 420
aagcctgggg cctcagtgaa ggtctcctgc aaggcttctg gatacacctt caccgactat 480
gaaatgcact gggtgcgaca ggcccctgga caagggcttg agtggatggg agctcttgat 540
cctaaaactg gtgatactgc ctacagtcag aagttcaagg gcagagtcac gctgaccgcg 600
gacgaatcca cgagcacagc ctacatggag ctgagcagcc tgagatctga ggacacggcc 660
gtgtattact gtacaagatt ctactcctat acttactggg gccagggaac cctggtcacc 720
gtctcctcaa ccacgacgcc agcgccgcga ccaccaacac cggcgcccac catcgcgtcg 780
cagcccctgt ccctgcgccc agaggcgtgc cggccagcgg cggggggcgc agtgcacacg 840
agggggctgg acttcgcctg tgatatctac atctgggcgc ccttggccgg gacttgtggg 900
gtccttctcc tgtcactggt tatcaccaaa cggggcagaa agaaactcct gtatatattc 960
aaacaaccat ttatgagacc agtacaaact actcaagagg aagatggctg tagctgccga 1020
tttccagaag aagaagaagg aggatgtgaa ctgagagtga agttcagcag gagcgcagac 1080
gcccccgcgt accagcaggg ccagaaccag ctctataacg agctcaatct aggacgaaga 1140
gaggagtacg atgttttgga caagagacgt ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg 1200
cagagaagga agaaccctca ggaaggcctg tacaatgaac tgcagaaaga taagatggcg 1260
gaggcctaca gtgagattgg gatgaaaggc gagcgccgga ggggcaaggg gcacgatggc 1320
ctttaccagg gtctcagtac agccaccaag gacacctacg acgcccttca catgcaggcc 1380
ctgccccctc gc 1392
<210> 20
<211> 1407
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> GPC3-28Z
<400> 20
gatgttgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gccggcctcc 60
atctcctgca gatctagtca gagccttgta cacagtaatg ccaacaccta tttacattgg 120
tacctgcaga agccagggca gtctccacag ctcctgatct ataaagtttc caaccgattt 180
tctggggtcc ctgacaggtt cagtggcagt ggatcaggca cagattttac actgaaaatc 240
agcagagtgg aggctgagga tgttggggtt tattactgct ctcaaaatac acatgttcct 300
cctacgtttg gccaggggac caagctggag atcaaacgtg gtggaggcgg ttcaggcgga 360
ggtggctctg gcggtggcgg atcgcaggtg cagctggtgc agtctggagc tgaggtgaag 420
aagcctgggg cctcagtgaa ggtctcctgc aaggcttctg gatacacctt caccgactat 480
gaaatgcact gggtgcgaca ggcccctgga caagggcttg agtggatggg agctcttgat 540
cctaaaactg gtgatactgc ctacagtcag aagttcaagg gcagagtcac gctgaccgcg 600
gacgaatcca cgagcacagc ctacatggag ctgagcagcc tgagatctga ggacacggcc 660
gtgtattact gtacaagatt ctactcctat acttactggg gccagggaac cctggtcacc 720
gtctcctcaa ccacgacgcc agcgccgcga ccaccaacac cggcgcccac catcgcgtcg 780
cagcccctgt ccctgcgccc agaggcgtgc cggccagcgg cggggggcgc agtgcacacg 840
agggggctgg acttcgcctg tgatttttgg gtgctggtgg tggttggtgg agtcctggct 900
tgctatagct tgctagtaac agtggccttt attattttct gggtgaggag taagaggagc 960
aggctcctgc acagtgacta catgaacatg actccccgcc gccccgggcc aacccgcaag 1020
cattaccagc cctatgcccc accacgcgac ttcgcagcct atcgctccag agtgaagttc 1080
agcaggagcg cagacgcccc cgcgtaccag cagggccaga accagctcta taacgagctc 1140
aatctaggac gaagagagga gtacgatgtt ttggacaaga gacgtggccg ggaccctgag 1200
atggggggaa agccgcagag aaggaagaac cctcaggaag gcctgtacaa tgaactgcag 1260
aaagataaga tggcggaggc ctacagtgag attgggatga aaggcgagcg ccggaggggc 1320
aaggggcacg atggccttta ccagggtctc agtacagcca ccaaggacac ctacgacgcc 1380
cttcacatgc aggccctgcc ccctcgc 1407
<210> 21
<211> 1533
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> GPC3-CAR (GPC3-28BBZ)
<400> 21
gatgttgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gccggcctcc 60
atctcctgca gatctagtca gagccttgta cacagtaatg ccaacaccta tttacattgg 120
tacctgcaga agccagggca gtctccacag ctcctgatct ataaagtttc caaccgattt 180
tctggggtcc ctgacaggtt cagtggcagt ggatcaggca cagattttac actgaaaatc 240
agcagagtgg aggctgagga tgttggggtt tattactgct ctcaaaatac acatgttcct 300
cctacgtttg gccaggggac caagctggag atcaaacgtg gtggaggcgg ttcaggcgga 360
ggtggctctg gcggtggcgg atcgcaggtg cagctggtgc agtctggagc tgaggtgaag 420
aagcctgggg cctcagtgaa ggtctcctgc aaggcttctg gatacacctt caccgactat 480
gaaatgcact gggtgcgaca ggcccctgga caagggcttg agtggatggg agctcttgat 540
cctaaaactg gtgatactgc ctacagtcag aagttcaagg gcagagtcac gctgaccgcg 600
gacgaatcca cgagcacagc ctacatggag ctgagcagcc tgagatctga ggacacggcc 660
gtgtattact gtacaagatt ctactcctat acttactggg gccagggaac cctggtcacc 720
gtctcctcaa ccacgacgcc agcgccgcga ccaccaacac cggcgcccac catcgcgtcg 780
cagcccctgt ccctgcgccc agaggcgtgc cggccagcgg cggggggcgc agtgcacacg 840
agggggctgg acttcgcctg tgatttttgg gtgctggtgg tggttggtgg agtcctggct 900
tgctatagct tgctagtaac agtggccttt attattttct gggtgaggag taagaggagc 960
aggctcctgc acagtgacta catgaacatg actccccgcc gccccgggcc aacccgcaag 1020
cattaccagc cctatgcccc accacgcgac ttcgcagcct atcgctccaa acggggcaga 1080
aagaaactcc tgtatatatt caaacaacca tttatgagac cagtacaaac tactcaagag 1140
gaagatggct gtagctgccg atttccagaa gaagaagaag gaggatgtga actgagagtg 1200
aagttcagca ggagcgcaga cgcccccgcg taccagcagg gccagaacca gctctataac 1260
gagctcaatc taggacgaag agaggagtac gatgttttgg acaagagacg tggccgggac 1320
cctgagatgg ggggaaagcc gcagagaagg aagaaccctc aggaaggcct gtacaatgaa 1380
ctgcagaaag ataagatggc ggaggcctac agtgagattg ggatgaaagg cgagcgccgg 1440
aggggcaagg ggcacgatgg cctttaccag ggtctcagta cagccaccaa ggacacctac 1500
gacgcccttc acatgcaggc cctgccccct cgc 1533
<210> 22
<211> 422
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> GPC3-CAR(GPC3-Z)
<400> 22
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Ala Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Asn
85 90 95
Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
130 135 140
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
145 150 155 160
Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
165 170 175
Gly Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe
180 185 190
Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
195 200 205
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
210 215 220
Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
225 230 235 240
Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro
245 250 255
Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro
260 265 270
Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
275 280 285
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
290 295 300
Ser Leu Val Ile Thr Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro
305 310 315 320
Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly
325 330 335
Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro
340 345 350
Glu Met Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu
355 360 365
Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile
370 375 380
Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr
385 390 395 400
Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met
405 410 415
Gln Ala Leu Pro Pro Arg
420
<210> 23
<211> 464
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> GPC3-BBZ amino acid
<400> 23
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Ala Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Asn
85 90 95
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
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gtgaattata taaatataaa gtagtaaaaa ttgaaccatt aggagtagca cccaccaagg 1260
caaagagaag agtggtgcag agagaaaaaa gagcagtggg aataggagct ttgttccttg 1320
ggttcttggg agcagcagga agcactatgg gcgcagcgtc aatgacgctg acggtacagg 1380
ccagacaatt attgtctggt atagtgcagc agcagaacaa tttgctgagg gctattgagg 1440
cgcaacagca tctgttgcaa ctcacagtct ggggcatcaa gcagctccag gcaagaatcc 1500
tggctgtgga aagataccta aaggatcaac agctcctggg gatttggggt tgctctggaa 1560
aactcatttg caccactgct gtgccttgga atgctagttg gagtaataaa tctctggaac 1620
agatttggaa tcacacgacc tggatggagt gggacagaga aattaacaat tacacaagct 1680
taatacactc cttaattgaa gaatcgcaaa accagcaaga aaagaatgaa caagaattat 1740
tggaattaga taaatgggca agtttgtgga attggtttaa cataacaaat tggctgtggt 1800
atataaaatt attcataatg atagtaggag gcttggtagg tttaagaata gtttttgctg 1860
tactttctat agtgaataga gttaggcagg gatattcacc attatcgttt cagacccacc 1920
tcccaacccc gaggggaccc gacaggcccg aaggaataga agaagaaggt ggagagagag 1980
acagagacag atccattcga ttagtgaacg gatctcgacg gtatcggtta acttttaaaa 2040
gaaaaggggg gattgggggg tacagtgcag gggaaagaat agtagacata atagcaacag 2100
acatacaaac taaagaatta caaaaacaaa ttacaaaaat tcaaaatttt ccgatcacga 2160
gactagcctc gagaagcttg atcgatggct ccggtgcccg tcagtgggca gagcgcacat 2220
cgcccacagt ccccgagaag ttggggggag gggtcggcaa ttgaaccggt gcctagagaa 2280
ggtggcgcgg ggtaaactgg gaaagtgatg tcgtgtactg gctccgcctt tttcccgagg 2340
gtgggggaga accgtatata agtgcagtag tcgccgtgaa cgttcttttt cgcaacgggt 2400
ttgccgccag aacacaggtg tcgtgacgcg gatccaggcc taagcttacg cgtcctagcg 2460
ctaccggtcg ccaccatggt gagcaagggc gaggagctgt tcaccggggt ggtgcccatc 2520
ctggtcgagc tggacggcga cgtaaacggc cacaagttca gcgtgtccgg cgagggcgag 2580
ggcgatgcca cctacggcaa gctgaccctg aagttcatct gcaccaccgg caagctgccc 2640
gtgccctggc ccaccctcgt gaccaccctg acctacggcg tgcagtgctt cagccgctac 2700
cccgaccaca tgaagcagca cgacttcttc aagtccgcca tgcccgaagg ctacgtccag 2760
gagcgcacca tcttcttcaa ggacgacggc aactacaaga cccgcgccga ggtgaagttc 2820
gagggcgaca ccctggtgaa ccgcatcgag ctgaagggca tcgacttcaa ggaggacggc 2880
aacatcctgg ggcacaagct ggagtacaac tacaacagcc acaacgtcta tatcatggcc 2940
gacaagcaga agaacggcat caaggtgaac ttcaagatcc gccacaacat cgaggacggc 3000
agcgtgcagc tcgccgacca ctaccagcag aacaccccca tcggcgacgg ccccgtgctg 3060
ctgcccgaca accactacct gagcacccag tccgccctga gcaaagaccc caacgagaag 3120
cgcgatcaca tggtcctgct ggagttcgtg accgccgccg ggatcactct cggcatggac 3180
gagctgtaca agtccggagt gaaacagact ttgaattttg accttctgaa gttggcagga 3240
gacgttgagt ccaaccctgg gcccatggcc ttaccagtga ccgccttgct cctgccgctg 3300
gccttgctgc tccacgccgc caggccggat gttgtgatga ctcagtctcc actctccctg 3360
cccgtcaccc ctggagagcc ggcctccatc tcctgcagat ctagtcagag ccttgtacac 3420
agtaatgcca acacctattt acattggtac ctgcagaagc cagggcagtc tccacagctc 3480
ctgatctata aagtttccaa ccgattttct ggggtccctg acaggttcag tggcagtgga 3540
tcaggcacag attttacact gaaaatcagc agagtggagg ctgaggatgt tggggtttat 3600
tactgctctc aaaatacaca tgttcctcct acgtttggcc aggggaccaa gctggagatc 3660
aaacgtggtg gaggcggttc aggcggaggt ggctctggcg gtggcggatc gcaggtgcag 3720
ctggtgcagt ctggagctga ggtgaagaag cctggggcct cagtgaaggt ctcctgcaag 3780
gcttctggat acaccttcac cgactatgaa atgcactggg tgcgacaggc ccctggacaa 3840
gggcttgagt ggatgggagc tcttgatcct aaaactggtg atactgccta cagtcagaag 3900
ttcaagggca gagtcacgct gaccgcggac gaatccacga gcacagccta catggagctg 3960
agcagcctga gatctgagga cacggccgtg tattactgta caagattcta ctcctatact 4020
tactggggcc agggaaccct ggtcaccgtc tcctcaacca cgacgccagc gccgcgacca 4080
ccaacaccgg cgcccaccat cgcgtcgcag cccctgtccc tgcgcccaga ggcgtgccgg 4140
ccagcggcgg ggggcgcagt gcacacgagg gggctggact tcgcctgtga tatctacatc 4200
tgggcgccct tggccgggac ttgtggggtc cttctcctgt cactggttat caccaaacgg 4260
ggcagaaaga aactcctgta tatattcaaa caaccattta tgagaccagt acaaactact 4320
caagaggaag atggctgtag ctgccgattt ccagaagaag aagaaggagg atgtgaactg 4380
agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 4440
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 4500
cgggaccctg agatgggggg aaagccgcag agaaggaaga accctcagga aggcctgtac 4560
aatgaactgc agaaagataa gatggcggag gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag 4620
cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt taccagggtc tcagtacagc caccaaggac 4680
acctacgacg cccttcacat gcaggccctg ccccctcgct aggtcgacct cgagggaatt 4740
ccgataatca acctctggat tacaaaattt gtgaaagatt gactggtatt cttaactatg 4800
ttgctccttt tacgctatgt ggatacgctg ctttaatgcc tttgtatcat gctattgctt 4860
cccgtatggc tttcattttc tcctccttgt ataaatcctg gttgctgtct ctttatgagg 4920
agttgtggcc cgttgtcagg caacgtggcg tggtgtgcac tgtgtttgct gacgcaaccc 4980
ccactggttg gggcattgcc accacctgtc agctcctttc cgggactttc gctttccccc 5040
tccctattgc cacggcggaa ctcatcgccg cctgccttgc ccgctgctgg acaggggctc 5100
ggctgttggg cactgacaat tccgtggtgt tgtcggggaa gctgacgtcc tttccatggc 5160
tgctcgcctg tgttgccacc tggattctgc gcgggacgtc cttctgctac gtcccttcgg 5220
ccctcaatcc agcggacctt ccttcccgcg gcctgctgcc ggctctgcgg cctcttccgc 5280
gtcttcgcct tcgccctcag acgagtcgga tctccctttg ggccgcctcc ccgcatcggg 5340
aattcgagct cggtaccttt aagaccaatg acttacaagg cagctgtaga tcttagccac 5400
tttttaaaag aaaagggggg actggaaggg ctaattcact cccaacgaag acaagatggg 5460
atcaattcac catgggaata acttcgtata gcatacatta tacgaagtta tgctgctttt 5520
tgcttgtact gggtctctct ggttagacca gatctgagcc tgggagctct ctggctaact 5580
agggaaccca ctgcttaagc ctcaataaag cttgccttga gtgcttcaag tagtgtgtgc 5640
ccgtctgttg tgtgactctg gtaactagag atccctcaga cccttttagt cagtgtggaa 5700
aatctctagc agcatctaga attaattccg tgtattctat agtgtcacct aaatcgtatg 5760
tgtatgatac ataaggttat gtattaattg tagccgcgtt ctaacgacaa tatgtacaag 5820
cctaattgtg tagcatctgg cttactgaag cagaccctat catctctctc gtaaactgcc 5880
gtcagagtcg gtttggttgg acgaaccttc tgagtttctg gtaacgccgt cccgcacccg 5940
gaaatggtca gcgaaccaat cagcagggtc atcgctagcc agatcctcta cgccggacgc 6000
atcgtggccg gcatcaccgg cgccacaggt gcggttgctg gcgcctatat cgccgacatc 6060
accgatgggg aagatcgggc tcgccacttc gggctcatga gcgcttgttt cggcgtgggt 6120
atggtggcag gccccgtggc cgggggactg ttgggcgcca tctccttgca tgcaccattc 6180
cttgcggcgg cggtgctcaa cggcctcaac ctactactgg gctgcttcct aatgcaggag 6240
tcgcataagg gagagcgtcg aatggtgcac tctcagtaca atctgctctg atgccgcata 6300
gttaagccag ccccgacacc cgccaacacc cgctgacgcg ccctgacggg cttgtctgct 6360
cccggcatcc gcttacagac aagctgtgac cgtctccggg agctgcatgt gtcagaggtt 6420
ttcaccgtca tcaccgaaac gcgcgagacg aaagggcctc gtgatacgcc tatttttata 6480
ggttaatgtc atgataataa tggtttctta gacgtcaggt ggcacttttc ggggaaatgt 6540
gcgcggaacc cctatttgtt tatttttcta aatacattca aatatgtatc cgctcatgag 6600
acaataaccc tgataaatgc ttcaataata ttgaaaaagg aagagtatga gtattcaaca 6660
tttccgtgtc gcccttattc ccttttttgc ggcattttgc cttcctgttt ttgctcaccc 6720
agaaacgctg gtgaaagtaa aagatgctga agatcagttg ggtgcacgag tgggttacat 6780
cgaactggat ctcaacagcg gtaagatcct tgagagtttt cgccccgaag aacgttttcc 6840
aatgatgagc acttttaaag ttctgctatg tggcgcggta ttatcccgta ttgacgccgg 6900
gcaagagcaa ctcggtcgcc gcatacacta ttctcagaat gacttggttg agtactcacc 6960
agtcacagaa aagcatctta cggatggcat gacagtaaga gaattatgca gtgctgccat 7020
aaccatgagt gataacactg cggccaactt acttctgaca acgatcggag gaccgaagga 7080
gctaaccgct tttttgcaca acatggggga tcatgtaact cgccttgatc gttgggaacc 7140
ggagctgaat gaagccatac caaacgacga gcgtgacacc acgatgcctg tagcaatggc 7200
aacaacgttg cgcaaactat taactggcga actacttact ctagcttccc ggcaacaatt 7260
aatagactgg atggaggcgg ataaagttgc aggaccactt ctgcgctcgg cccttccggc 7320
tggctggttt attgctgata aatctggagc cggtgagcgt gggtctcgcg gtatcattgc 7380
agcactgggg ccagatggta agccctcccg tatcgtagtt atctacacga cggggagtca 7440
ggcaactatg gatgaacgaa atagacagat cgctgagata ggtgcctcac tgattaagca 7500
ttggtaactg tcagaccaag tttactcata tatactttag attgatttaa aacttcattt 7560
ttaatttaaa aggatctagg tgaagatcct ttttgataat ctcatgacca aaatccctta 7620
acgtgagttt tcgttccact gagcgtcaga ccccgtagaa aagatcaaag gatcttcttg 7680
agatcctttt tttctgcgcg taatctgctg cttgcaaaca aaaaaaccac cgctaccagc 7740
ggtggtttgt ttgccggatc aagagctacc aactcttttt ccgaaggtaa ctggcttcag 7800
cagagcgcag ataccaaata ctgtccttct agtgtagccg tagttaggcc accacttcaa 7860
gaactctgta gcaccgccta catacctcgc tctgctaatc ctgttaccag tggctgctgc 7920
cagtggcgat aagtcgtgtc ttaccgggtt ggactcaaga cgatagttac cggataaggc 7980
gcagcggtcg ggctgaacgg ggggttcgtg cacacagccc agcttggagc gaacgaccta 8040
caccgaactg agatacctac agcgtgagca ttgagaaagc gccacgcttc ccgaagggag 8100
aaaggcggac aggtatccgg taagcggcag ggtcggaaca ggagagcgca cgagggagct 8160
tccaggggga aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc tctgacttga 8220
gcgtcgattt ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg ccagcaacgc 8280
ggccttttta cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct cacatgttct ttcctgcgtt 8340
atcccctgat tctgtggata accgtattac cgcctttgag tgagctgata ccgctcgccg 8400
cagccgaacg accgagcgca gcgagtcagt gagcgaggaa gcggaagagc gcccaatacg 8460
caaaccgcct ctccccgcgc gttggccgat tcattaatgc agctgtggaa tgtgtgtcag 8520
ttagggtgtg gaaagtcccc aggctcccca gcaggcagaa gtatgcaaag catgcatctc 8580
aattagtcag caaccaggtg tggaaagtcc ccaggctccc cagcaggcag aagtatgcaa 8640
agcatgcatc tcaattagtc agcaaccata gtcccgcccc taactccgcc catcccgccc 8700
ctaactccgc ccagttccgc ccattctccg ccccatggct gactaatttt ttttatttat 8760
gcagaggccg aggccgcctc ggcctctgag ctattccaga agtagtgagg aggctttttt 8820
ggaggcctag gcttttgcaa aaagcttgga cacaagacag gcttgcgaga tatgtttgag 8880
aataccactt tatcccgcgt cagggagagg cagtgcgtaa aaagacgcgg actcatgtga 8940
aatactggtt tttagtgcgc cagatctcta taatctcgcg caacctattt tcccctcgaa 9000
cactttttaa gccgtagata aacaggctgg gacacttcac atgagcgaaa aatacatcgt 9060
cacctgggac atgttgcaga tccatgcacg taaactcgca agccgactga tgccttctga 9120
acaatggaaa ggcattattg ccgtaagccg tggcggtctg taccgggtgc gttactggcg 9180
cgtgaactgg gtattcgtca tgtcgatacc gtttgtattt ccagctacga tcacgacaac 9240
cagcgcgagc ttaaagtgct gaaacgcgca gaaggcgatg gcgaaggctt catcgttatt 9300
gatgacctgg tggataccgg tggtactgcg gttgcgattc gtgaaatgta tccaaaagcg 9360
cactttgtca ccatcttcgc aaaaccggct ggtcgtccgc tggttgatga ctatgttgtt 9420
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ccaatctccg gtcgctaatc ttttcaacgc ctggcactgc cgggcgttgt tctttttaac 9540
ttcaggcggg ttacaatagt ttccagtaag tattctggag gctgcatcca tgacacaggc 9600
aaacctgagc gaaaccctgt tcaaaccccg ctttaaacat cctgaaacct cgacgctagt 9660
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ccctcactgg tatcgcatga ttaaccgtct gatgtggatc tggcgcggca ttgacccacg 9780
cgaaatcctc gacgtccagg cacgtattgt gatgagcgat gccgaacgta ccgacgatga 9840
tttatacgat acggtgattg gctaccgtgg cggcaactgg atttatgagt gggccccgga 9900
tctttgtgaa ggaaccttac ttctgtggtg tgacataatt ggacaaacta cctacagaga 9960
tttaaagctc taaggtaaat ataaaatttt taagtgtata atgtgttaaa ctactgattc 10020
taattgtttg tgtattttag attccaacct atggaactga tgaatgggag cagtggtgga 10080
atgcctttaa tgaggaaaac ctgttttgct cagaagaaat gccatctagt gatgatgagg 10140
ctactgctga ctctcaacat tctactcctc caaaaaagaa gagaaaggta gaagacccca 10200
aggactttcc ttcagaattg ctaagttttt tgagtcatgc tgtgtttagt aatagaactc 10260
ttgcttgctt tgctatttac accacaaagg aaaaagctgc actgctatac aagaaaatta 10320
tggaaaaata ttctgtaacc tttataagta ggcataacag ttataatcat aacatactgt 10380
tttttcttac tccacacagg catagagtgt ctgctattaa taactatgct caaaaattgt 10440
gtacctttag ctttttaatt tgtaaagggg ttaataagga atatttgatg tatagtgcct 10500
tgactagaga tcataatcag ccataccaca tttgtagagg ttttacttgc tttaaaaaac 10560
ctcccacacc tccccctgaa cctgaaacat aaaatgaatg caattgttgt tgttaacttg 10620
tttattgcag cttataatgg ttacaaataa agcaatagca tcacaaattt cacaaataaa 10680
gcattttttt cactgcattc tagttgtggt ttgtccaaac tcatcaatgt atcttatcat 10740
gtctggatca actggataac tcaagctaac caaaatcatc ccaaacttcc caccccatac 10800
cctattacca ctgccaatta cctagtggtt tcatttactc taaacctgtg attcctctga 10860
attattttca ttttaaagaa attgtatttg ttaaatatgt actacaaact tagtag 10916
<210> 29
<211> 10931
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> pWPT-eGFP-F2A-GPC3-28Z
<220>
<221> MluI
<222> (2448)..(2453)
<220>
<221> ORF
<222> (2476)..(4734)
<220>
<221> SalI
<222> (4738)..(4743)
<400> 29
ttggaagggc taattcactc ccaaagaaga caagatatcc ttgatctgtg gatctaccac 60
acacaaggct acttccctga ttagcagaac tacacaccag ggccaggggt cagatatcca 120
ctgacctttg gatggtgcta caagctagta ccagttgagc cagataaggt agaagaggcc 180
aataaaggag agaacaccag cttgttacac cctgtgagcc tgcatgggat ggatgacccg 240
gagagagaag tgttagagtg gaggtttgac agccgcctag catttcatca cgtggcccga 300
gagctgcatc cggagtactt caagaactgc tgatatcgag cttgctacaa gggactttcc 360
gctggggact ttccagggag gcgtggcctg ggcgggactg gggagtggcg agccctcaga 420
tcctgcatat aagcagctgc tttttgcctg tactgggtct ctctggttag accagatctg 480
agcctgggag ctctctggct aactagggaa cccactgctt aagcctcaat aaagcttgcc 540
ttgagtgctt caagtagtgt gtgcccgtct gttgtgtgac tctggtaact agagatccct 600
cagacccttt tagtcagtgt ggaaaatctc tagcagtggc gcccgaacag ggacttgaaa 660
gcgaaaggga aaccagagga gctctctcga cgcaggactc ggcttgctga agcgcgcacg 720
gcaagaggcg aggggcggcg actggtgagt acgccaaaaa ttttgactag cggaggctag 780
aaggagagag atgggtgcga gagcgtcagt attaagcggg ggagaattag atcgcgatgg 840
gaaaaaattc ggttaaggcc agggggaaag aaaaaatata aattaaaaca tatagtatgg 900
gcaagcaggg agctagaacg attcgcagtt aatcctggcc tgttagaaac atcagaaggc 960
tgtagacaaa tactgggaca gctacaacca tcccttcaga caggatcaga agaacttaga 1020
tcattatata atacagtagc aaccctctat tgtgtgcatc aaaggataga gataaaagac 1080
accaaggaag ctttagacaa gatagaggaa gagcaaaaca aaagtaagac caccgcacag 1140
caagcggccg gccgctgatc ttcagacctg gaggaggaga tatgagggac aattggagaa 1200
gtgaattata taaatataaa gtagtaaaaa ttgaaccatt aggagtagca cccaccaagg 1260
caaagagaag agtggtgcag agagaaaaaa gagcagtggg aataggagct ttgttccttg 1320
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gactagcctc gagaagcttg atcgatggct ccggtgcccg tcagtgggca gagcgcacat 2220
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gccttgctgc tccacgccgc caggccggat gttgtgatga ctcagtctcc actctccctg 3360
cccgtcaccc ctggagagcc ggcctccatc tcctgcagat ctagtcagag ccttgtacac 3420
agtaatgcca acacctattt acattggtac ctgcagaagc cagggcagtc tccacagctc 3480
ctgatctata aagtttccaa ccgattttct ggggtccctg acaggttcag tggcagtgga 3540
tcaggcacag attttacact gaaaatcagc agagtggagg ctgaggatgt tggggtttat 3600
tactgctctc aaaatacaca tgttcctcct acgtttggcc aggggaccaa gctggagatc 3660
aaacgtggtg gaggcggttc aggcggaggt ggctctggcg gtggcggatc gcaggtgcag 3720
ctggtgcagt ctggagctga ggtgaagaag cctggggcct cagtgaaggt ctcctgcaag 3780
gcttctggat acaccttcac cgactatgaa atgcactggg tgcgacaggc ccctggacaa 3840
gggcttgagt ggatgggagc tcttgatcct aaaactggtg atactgccta cagtcagaag 3900
ttcaagggca gagtcacgct gaccgcggac gaatccacga gcacagccta catggagctg 3960
agcagcctga gatctgagga cacggccgtg tattactgta caagattcta ctcctatact 4020
tactggggcc agggaaccct ggtcaccgtc tcctcaacca cgacgccagc gccgcgacca 4080
ccaacaccgg cgcccaccat cgcgtcgcag cccctgtccc tgcgcccaga ggcgtgccgg 4140
ccagcggcgg ggggcgcagt gcacacgagg gggctggact tcgcctgtga tttttgggtg 4200
ctggtggtgg ttggtggagt cctggcttgc tatagcttgc tagtaacagt ggcctttatt 4260
attttctggg tgaggagtaa gaggagcagg ctcctgcaca gtgactacat gaacatgact 4320
ccccgccgcc ccgggccaac ccgcaagcat taccagccct atgccccacc acgcgacttc 4380
gcagcctatc gctccagagt gaagttcagc aggagcgcag acgcccccgc gtaccagcag 4440
ggccagaacc agctctataa cgagctcaat ctaggacgaa gagaggagta cgatgttttg 4500
gacaagagac gtggccggga ccctgagatg gggggaaagc cgcagagaag gaagaaccct 4560
caggaaggcc tgtacaatga actgcagaaa gataagatgg cggaggccta cagtgagatt 4620
gggatgaaag gcgagcgccg gaggggcaag gggcacgatg gcctttacca gggtctcagt 4680
acagccacca aggacaccta cgacgccctt cacatgcagg ccctgccccc tcgctaggtc 4740
gacctcgagg gaattccgat aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg 4800
gtattcttaa ctatgttgct ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt 4860
atcatgctat tgcttcccgt atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc 4920
tgtctcttta tgaggagttg tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt 4980
ttgctgacgc aacccccact ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga 5040
ctttcgcttt ccccctccct attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct 5100
gctggacagg ggctcggctg ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaagctga 5160
cgtcctttcc atggctgctc gcctgtgttg ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct 5220
gctacgtccc ttcggccctc aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc 5280
tgcggcctct tccgcgtctt cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg 5340
cctccccgca tcgggaattc gagctcggta cctttaagac caatgactta caaggcagct 5400
gtagatctta gccacttttt aaaagaaaag gggggactgg aagggctaat tcactcccaa 5460
cgaagacaag atgggatcaa ttcaccatgg gaataacttc gtatagcata cattatacga 5520
agttatgctg ctttttgctt gtactgggtc tctctggtta gaccagatct gagcctggga 5580
gctctctggc taactaggga acccactgct taagcctcaa taaagcttgc cttgagtgct 5640
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ttagtcagtg tggaaaatct ctagcagcat ctagaattaa ttccgtgtat tctatagtgt 5760
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ctctcgtaaa ctgccgtcag agtcggtttg gttggacgaa ccttctgagt ttctggtaac 5940
gccgtcccgc acccggaaat ggtcagcgaa ccaatcagca gggtcatcgc tagccagatc 6000
ctctacgccg gacgcatcgt ggccggcatc accggcgcca caggtgcggt tgctggcgcc 6060
tatatcgccg acatcaccga tggggaagat cgggctcgcc acttcgggct catgagcgct 6120
tgtttcggcg tgggtatggt ggcaggcccc gtggccgggg gactgttggg cgccatctcc 6180
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ttcctaatgc aggagtcgca taagggagag cgtcgaatgg tgcactctca gtacaatctg 6300
ctctgatgcc gcatagttaa gccagccccg acacccgcca acacccgctg acgcgccctg 6360
acgggcttgt ctgctcccgg catccgctta cagacaagct gtgaccgtct ccgggagctg 6420
catgtgtcag aggttttcac cgtcatcacc gaaacgcgcg agacgaaagg gcctcgtgat 6480
acgcctattt ttataggtta atgtcatgat aataatggtt tcttagacgt caggtggcac 6540
ttttcgggga aatgtgcgcg gaacccctat ttgtttattt ttctaaatac attcaaatat 6600
gtatccgctc atgagacaat aaccctgata aatgcttcaa taatattgaa aaaggaagag 6660
tatgagtatt caacatttcc gtgtcgccct tattcccttt tttgcggcat tttgccttcc 6720
tgtttttgct cacccagaaa cgctggtgaa agtaaaagat gctgaagatc agttgggtgc 6780
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cgaagaacgt tttccaatga tgagcacttt taaagttctg ctatgtggcg cggtattatc 6900
ccgtattgac gccgggcaag agcaactcgg tcgccgcata cactattctc agaatgactt 6960
ggttgagtac tcaccagtca cagaaaagca tcttacggat ggcatgacag taagagaatt 7020
atgcagtgct gccataacca tgagtgataa cactgcggcc aacttacttc tgacaacgat 7080
cggaggaccg aaggagctaa ccgctttttt gcacaacatg ggggatcatg taactcgcct 7140
tgatcgttgg gaaccggagc tgaatgaagc cataccaaac gacgagcgtg acaccacgat 7200
gcctgtagca atggcaacaa cgttgcgcaa actattaact ggcgaactac ttactctagc 7260
ttcccggcaa caattaatag actggatgga ggcggataaa gttgcaggac cacttctgcg 7320
ctcggccctt ccggctggct ggtttattgc tgataaatct ggagccggtg agcgtgggtc 7380
tcgcggtatc attgcagcac tggggccaga tggtaagccc tcccgtatcg tagttatcta 7440
cacgacgggg agtcaggcaa ctatggatga acgaaataga cagatcgctg agataggtgc 7500
ctcactgatt aagcattggt aactgtcaga ccaagtttac tcatatatac tttagattga 7560
tttaaaactt catttttaat ttaaaaggat ctaggtgaag atcctttttg ataatctcat 7620
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caaaggatct tcttgagatc ctttttttct gcgcgtaatc tgctgcttgc aaacaaaaaa 7740
accaccgcta ccagcggtgg tttgtttgcc ggatcaagag ctaccaactc tttttccgaa 7800
ggtaactggc ttcagcagag cgcagatacc aaatactgtc cttctagtgt agccgtagtt 7860
aggccaccac ttcaagaact ctgtagcacc gcctacatac ctcgctctgc taatcctgtt 7920
accagtggct gctgccagtg gcgataagtc gtgtcttacc gggttggact caagacgata 7980
gttaccggat aaggcgcagc ggtcgggctg aacggggggt tcgtgcacac agcccagctt 8040
ggagcgaacg acctacaccg aactgagata cctacagcgt gagcattgag aaagcgccac 8100
gcttcccgaa gggagaaagg cggacaggta tccggtaagc ggcagggtcg gaacaggaga 8160
gcgcacgagg gagcttccag ggggaaacgc ctggtatctt tatagtcctg tcgggtttcg 8220
ccacctctga cttgagcgtc gatttttgtg atgctcgtca ggggggcgga gcctatggaa 8280
aaacgccagc aacgcggcct ttttacggtt cctggccttt tgctggcctt ttgctcacat 8340
gttctttcct gcgttatccc ctgattctgt ggataaccgt attaccgcct ttgagtgagc 8400
tgataccgct cgccgcagcc gaacgaccga gcgcagcgag tcagtgagcg aggaagcgga 8460
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tggaatgtgt gtcagttagg gtgtggaaag tccccaggct ccccagcagg cagaagtatg 8580
caaagcatgc atctcaatta gtcagcaacc aggtgtggaa agtccccagg ctccccagca 8640
ggcagaagta tgcaaagcat gcatctcaat tagtcagcaa ccatagtccc gcccctaact 8700
ccgcccatcc cgcccctaac tccgcccagt tccgcccatt ctccgcccca tggctgacta 8760
atttttttta tttatgcaga ggccgaggcc gcctcggcct ctgagctatt ccagaagtag 8820
tgaggaggct tttttggagg cctaggcttt tgcaaaaagc ttggacacaa gacaggcttg 8880
cgagatatgt ttgagaatac cactttatcc cgcgtcaggg agaggcagtg cgtaaaaaga 8940
cgcggactca tgtgaaatac tggtttttag tgcgccagat ctctataatc tcgcgcaacc 9000
tattttcccc tcgaacactt tttaagccgt agataaacag gctgggacac ttcacatgag 9060
cgaaaaatac atcgtcacct gggacatgtt gcagatccat gcacgtaaac tcgcaagccg 9120
actgatgcct tctgaacaat ggaaaggcat tattgccgta agccgtggcg gtctgtaccg 9180
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tacgatcacg acaaccagcg cgagcttaaa gtgctgaaac gcgcagaagg cgatggcgaa 9300
ggcttcatcg ttattgatga cctggtggat accggtggta ctgcggttgc gattcgtgaa 9360
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gatgactatg ttgttgatat cccgcaagat acctggattg aacagccgtg ggatatgggc 9480
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ttaaactact gattctaatt gtttgtgtat tttagattcc aacctatgga actgatgaat 10080
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ctagtgatga tgaggctact gctgactctc aacattctac tcctccaaaa aagaagagaa 10200
aggtagaaga ccccaaggac tttccttcag aattgctaag ttttttgagt catgctgtgt 10260
ttagtaatag aactcttgct tgctttgcta tttacaccac aaaggaaaaa gctgcactgc 10320
tatacaagaa aattatggaa aaatattctg taacctttat aagtaggcat aacagttata 10380
atcataacat actgtttttt cttactccac acaggcatag agtgtctgct attaataact 10440
atgctcaaaa attgtgtacc tttagctttt taatttgtaa aggggttaat aaggaatatt 10500
tgatgtatag tgccttgact agagatcata atcagccata ccacatttgt agaggtttta 10560
cttgctttaa aaaacctccc acacctcccc ctgaacctga aacataaaat gaatgcaatt 10620
gttgttgtta acttgtttat tgcagcttat aatggttaca aataaagcaa tagcatcaca 10680
aatttcacaa ataaagcatt tttttcactg cattctagtt gtggtttgtc caaactcatc 10740
aatgtatctt atcatgtctg gatcaactgg ataactcaag ctaaccaaaa tcatcccaaa 10800
cttcccaccc cataccctat taccactgcc aattacctag tggtttcatt tactctaaac 10860
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aaacttagta g 10931
<210> 30
<211> 11057
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> pWPT-eGFP-F2A-GPC3-28BBZ
<220>
<221> MulI
<222> (2448)..(2453)
<220>
<221> ORF
<222> (2476)..(4860)
<220>
<221> SalI
<222> (4864)..(4869)
<400> 30
ttggaagggc taattcactc ccaaagaaga caagatatcc ttgatctgtg gatctaccac 60
acacaaggct acttccctga ttagcagaac tacacaccag ggccaggggt cagatatcca 120
ctgacctttg gatggtgcta caagctagta ccagttgagc cagataaggt agaagaggcc 180
aataaaggag agaacaccag cttgttacac cctgtgagcc tgcatgggat ggatgacccg 240
gagagagaag tgttagagtg gaggtttgac agccgcctag catttcatca cgtggcccga 300
gagctgcatc cggagtactt caagaactgc tgatatcgag cttgctacaa gggactttcc 360
gctggggact ttccagggag gcgtggcctg ggcgggactg gggagtggcg agccctcaga 420
tcctgcatat aagcagctgc tttttgcctg tactgggtct ctctggttag accagatctg 480
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caagcggccg gccgctgatc ttcagacctg gaggaggaga tatgagggac aattggagaa 1200
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caaagagaag agtggtgcag agagaaaaaa gagcagtggg aataggagct ttgttccttg 1320
ggttcttggg agcagcagga agcactatgg gcgcagcgtc aatgacgctg acggtacagg 1380
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taatacactc cttaattgaa gaatcgcaaa accagcaaga aaagaatgaa caagaattat 1740
tggaattaga taaatgggca agtttgtgga attggtttaa cataacaaat tggctgtggt 1800
atataaaatt attcataatg atagtaggag gcttggtagg tttaagaata gtttttgctg 1860
tactttctat agtgaataga gttaggcagg gatattcacc attatcgttt cagacccacc 1920
tcccaacccc gaggggaccc gacaggcccg aaggaataga agaagaaggt ggagagagag 1980
acagagacag atccattcga ttagtgaacg gatctcgacg gtatcggtta acttttaaaa 2040
gaaaaggggg gattgggggg tacagtgcag gggaaagaat agtagacata atagcaacag 2100
acatacaaac taaagaatta caaaaacaaa ttacaaaaat tcaaaatttt ccgatcacga 2160
gactagcctc gagaagcttg atcgatggct ccggtgcccg tcagtgggca gagcgcacat 2220
cgcccacagt ccccgagaag ttggggggag gggtcggcaa ttgaaccggt gcctagagaa 2280
ggtggcgcgg ggtaaactgg gaaagtgatg tcgtgtactg gctccgcctt tttcccgagg 2340
gtgggggaga accgtatata agtgcagtag tcgccgtgaa cgttcttttt cgcaacgggt 2400
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gacaagcaga agaacggcat caaggtgaac ttcaagatcc gccacaacat cgaggacggc 3000
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ctgcccgaca accactacct gagcacccag tccgccctga gcaaagaccc caacgagaag 3120
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ggctgcttcc taatgcagga gtcgcataag ggagagcgtc gaatggtgca ctctcagtac 6420
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gggtgcacga gtgggttaca tcgaactgga tctcaacagc ggtaagatcc ttgagagttt 6960
tcgccccgaa gaacgttttc caatgatgag cacttttaaa gttctgctat gtggcgcggt 7020
attatcccgt attgacgccg ggcaagagca actcggtcgc cgcatacact attctcagaa 7080
tgacttggtt gagtactcac cagtcacaga aaagcatctt acggatggca tgacagtaag 7140
agaattatgc agtgctgcca taaccatgag tgataacact gcggccaact tacttctgac 7200
aacgatcgga ggaccgaagg agctaaccgc ttttttgcac aacatggggg atcatgtaac 7260
tcgccttgat cgttgggaac cggagctgaa tgaagccata ccaaacgacg agcgtgacac 7320
cacgatgcct gtagcaatgg caacaacgtt gcgcaaacta ttaactggcg aactacttac 7380
tctagcttcc cggcaacaat taatagactg gatggaggcg gataaagttg caggaccact 7440
tctgcgctcg gcccttccgg ctggctggtt tattgctgat aaatctggag ccggtgagcg 7500
tgggtctcgc ggtatcattg cagcactggg gccagatggt aagccctccc gtatcgtagt 7560
tatctacacg acggggagtc aggcaactat ggatgaacga aatagacaga tcgctgagat 7620
aggtgcctca ctgattaagc attggtaact gtcagaccaa gtttactcat atatacttta 7680
gattgattta aaacttcatt tttaatttaa aaggatctag gtgaagatcc tttttgataa 7740
tctcatgacc aaaatccctt aacgtgagtt ttcgttccac tgagcgtcag accccgtaga 7800
aaagatcaaa ggatcttctt gagatccttt ttttctgcgc gtaatctgct gcttgcaaac 7860
aaaaaaacca ccgctaccag cggtggtttg tttgccggat caagagctac caactctttt 7920
tccgaaggta actggcttca gcagagcgca gataccaaat actgtccttc tagtgtagcc 7980
gtagttaggc caccacttca agaactctgt agcaccgcct acatacctcg ctctgctaat 8040
cctgttacca gtggctgctg ccagtggcga taagtcgtgt cttaccgggt tggactcaag 8100
acgatagtta ccggataagg cgcagcggtc gggctgaacg gggggttcgt gcacacagcc 8160
cagcttggag cgaacgacct acaccgaact gagataccta cagcgtgagc attgagaaag 8220
cgccacgctt cccgaaggga gaaaggcgga caggtatccg gtaagcggca gggtcggaac 8280
aggagagcgc acgagggagc ttccaggggg aaacgcctgg tatctttata gtcctgtcgg 8340
gtttcgccac ctctgacttg agcgtcgatt tttgtgatgc tcgtcagggg ggcggagcct 8400
atggaaaaac gccagcaacg cggccttttt acggttcctg gccttttgct ggccttttgc 8460
tcacatgttc tttcctgcgt tatcccctga ttctgtggat aaccgtatta ccgcctttga 8520
gtgagctgat accgctcgcc gcagccgaac gaccgagcgc agcgagtcag tgagcgagga 8580
agcggaagag cgcccaatac gcaaaccgcc tctccccgcg cgttggccga ttcattaatg 8640
cagctgtgga atgtgtgtca gttagggtgt ggaaagtccc caggctcccc agcaggcaga 8700
agtatgcaaa gcatgcatct caattagtca gcaaccaggt gtggaaagtc cccaggctcc 8760
ccagcaggca gaagtatgca aagcatgcat ctcaattagt cagcaaccat agtcccgccc 8820
ctaactccgc ccatcccgcc cctaactccg cccagttccg cccattctcc gccccatggc 8880
tgactaattt tttttattta tgcagaggcc gaggccgcct cggcctctga gctattccag 8940
aagtagtgag gaggcttttt tggaggccta ggcttttgca aaaagcttgg acacaagaca 9000
ggcttgcgag atatgtttga gaataccact ttatcccgcg tcagggagag gcagtgcgta 9060
aaaagacgcg gactcatgtg aaatactggt ttttagtgcg ccagatctct ataatctcgc 9120
gcaacctatt ttcccctcga acacttttta agccgtagat aaacaggctg ggacacttca 9180
catgagcgaa aaatacatcg tcacctggga catgttgcag atccatgcac gtaaactcgc 9240
aagccgactg atgccttctg aacaatggaa aggcattatt gccgtaagcc gtggcggtct 9300
gtaccgggtg cgttactggc gcgtgaactg ggtattcgtc atgtcgatac cgtttgtatt 9360
tccagctacg atcacgacaa ccagcgcgag cttaaagtgc tgaaacgcgc agaaggcgat 9420
ggcgaaggct tcatcgttat tgatgacctg gtggataccg gtggtactgc ggttgcgatt 9480
cgtgaaatgt atccaaaagc gcactttgtc accatcttcg caaaaccggc tggtcgtccg 9540
ctggttgatg actatgttgt tgatatcccg caagatacct ggattgaaca gccgtgggat 9600
atgggcgtcg tattcgtccc gccaatctcc ggtcgctaat cttttcaacg cctggcactg 9660
ccgggcgttg ttctttttaa cttcaggcgg gttacaatag tttccagtaa gtattctgga 9720
ggctgcatcc atgacacagg caaacctgag cgaaaccctg ttcaaacccc gctttaaaca 9780
tcctgaaacc tcgacgctag tccgccgctt taatcacggc gcacaaccgc ctgtgcagtc 9840
ggcccttgat ggtaaaacca tccctcactg gtatcgcatg attaaccgtc tgatgtggat 9900
ctggcgcggc attgacccac gcgaaatcct cgacgtccag gcacgtattg tgatgagcga 9960
tgccgaacgt accgacgatg atttatacga tacggtgatt ggctaccgtg gcggcaactg 10020
gatttatgag tgggccccgg atctttgtga aggaacctta cttctgtggt gtgacataat 10080
tggacaaact acctacagag atttaaagct ctaaggtaaa tataaaattt ttaagtgtat 10140
aatgtgttaa actactgatt ctaattgttt gtgtatttta gattccaacc tatggaactg 10200
atgaatggga gcagtggtgg aatgccttta atgaggaaaa cctgttttgc tcagaagaaa 10260
tgccatctag tgatgatgag gctactgctg actctcaaca ttctactcct ccaaaaaaga 10320
agagaaaggt agaagacccc aaggactttc cttcagaatt gctaagtttt ttgagtcatg 10380
ctgtgtttag taatagaact cttgcttgct ttgctattta caccacaaag gaaaaagctg 10440
cactgctata caagaaaatt atggaaaaat attctgtaac ctttataagt aggcataaca 10500
gttataatca taacatactg ttttttctta ctccacacag gcatagagtg tctgctatta 10560
ataactatgc tcaaaaattg tgtaccttta gctttttaat ttgtaaaggg gttaataagg 10620
aatatttgat gtatagtgcc ttgactagag atcataatca gccataccac atttgtagag 10680
gttttacttg ctttaaaaaa cctcccacac ctccccctga acctgaaaca taaaatgaat 10740
gcaattgttg ttgttaactt gtttattgca gcttataatg gttacaaata aagcaatagc 10800
atcacaaatt tcacaaataa agcatttttt tcactgcatt ctagttgtgg tttgtccaaa 10860
ctcatcaatg tatcttatca tgtctggatc aactggataa ctcaagctaa ccaaaatcat 10920
cccaaacttc ccaccccata ccctattacc actgccaatt acctagtggt ttcatttact 10980
ctaaacctgt gattcctctg aattattttc attttaaaga aattgtattt gttaaatatg 11040
tactacaaac ttagtag 11057
<210> 31
<211> 1815
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> eGFP-GPC3-delta Z
<400> 31
atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60
ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120
ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180
ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240
cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300
ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360
gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420
aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480
ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540
gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600
tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660
ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtcc 720
ggagtgaaac agactttgaa ttttgacctt ctgaagttgg caggagacgt tgagtccaac 780
cctgggccca tggccttacc agtgaccgcc ttgctcctgc cgctggcctt gctgctccac 840
gccgccaggc cggatgttgt gatgactcag tctccactct ccctgcccgt cacccctgga 900
gagccggcct ccatctcctg cagatctagt cagagccttg tacacagtaa tgccaacacc 960
tatttacatt ggtacctgca gaagccaggg cagtctccac agctcctgat ctataaagtt 1020
tccaaccgat tttctggggt ccctgacagg ttcagtggca gtggatcagg cacagatttt 1080
acactgaaaa tcagcagagt ggaggctgag gatgttgggg tttattactg ctctcaaaat 1140
acacatgttc ctcctacgtt tggccagggg accaagctgg agatcaaacg tggtggaggc 1200
ggttcaggcg gaggtggctc tggcggtggc ggatcgcagg tgcagctggt gcagtctgga 1260
gctgaggtga agaagcctgg ggcctcagtg aaggtctcct gcaaggcttc tggatacacc 1320
ttcaccgact atgaaatgca ctgggtgcga caggcccctg gacaagggct tgagtggatg 1380
ggagctcttg atcctaaaac tggtgatact gcctacagtc agaagttcaa gggcagagtc 1440
acgctgaccg cggacgaatc cacgagcaca gcctacatgg agctgagcag cctgagatct 1500
gaggacacgg ccgtgtatta ctgtacaaga ttctactcct atacttactg gggccaggga 1560
accctggtca ccgtctcctc aaccacgacg ccagcgccgc gaccaccaac accggcgccc 1620
accatcgcgt cgcagcccct gtccctgcgc ccagaggcgt gccggccagc ggcggggggc 1680
gcagtgcaca cgagggggct ggacttcgcc tgtgatatct acatctgggc gcccttggcc 1740
gggacttgtg gggtccttct cctgtcactg gttatcacca gagtgaagtt cagcaggagc 1800
gcagacgccc ccgcg 1815
<210> 32
<211> 321
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> GPC3-deltaZ protein
<400> 32
DVVMTQSPLS LPVTPGEPAS ISCRSSQSLV HSNANTYLHW YLQKPGQSPQ LLIYKVSNRF 60
SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCSQNTHVP PTFGQGTKLE IKRGGGGSGG 120
GGSGGGGSQV QLVQSGAEVK KPGASVKVSC KASGYTFTDY EMHWVRQAPG QGLEWMGALD 180
PKTGDTAYSQ KFKGRVTLTA DESTSTAYME LSSLRSEDTA VYYCTRFYSY TYWGQGTLVT 240
VSSTTTPAPR PPTPAPTIAS QPLSLRPEAC RPAAGGAVHT RGLDFACDIY IWAPLAGTCG 300
VLLLSLVITR VKFSRSADAP A 321

Claims (15)

1.编码表达于人T淋巴细胞表面的抗GPC3嵌合抗原受体蛋白的核酸，所述抗GPC3嵌合抗原受体蛋白包含顺序连接的胞外结合区，跨膜区和胞内信号区，其中所述胞外结合区包含特异性识别GPC3的C末端表位的单链抗体scFv(GPC3)，所述胞外结合区的氨基酸序列具有SEQ ID NO:22～25任一序列的第1-113位所示的轻链可变区以及SEQ ID NO:22～25任一序列的第129-243位所示的重链可变区。
2.如权利要求1所述的核酸，其特征在于，所述的胞外结合区的氨基酸序列具有SEQ IDNO:22～25任一序列的第1-243位所示的单链抗体的序列。
3.如权利要求1或2所述的核酸，其特征在于，所述跨膜区选自包含CD8或CD28的跨膜区和铰链区的序列。
4.如权利要求1-3任一所述的核酸，其特征在于，所述胞内信号区选自CD3ζ，FcεRIγ，CD28，CD137，CD134的胞内信号区序列，及其组合。
5.如权利要求1-4任一所述的核酸，其特征在于，所述嵌合抗原受体蛋白是选自包含顺序连接的胞外结合区，跨膜区和胞内信号区的如下顺序连接的嵌合抗原受体蛋白：
scFv(GPC3)-CD8-CD3ζ，
scFv(GPC3)-CD8-CD137-CD3ζ，
scFv(GPC3)-CD28a-CD28b-CD3ζ，
scFv(GPC3)-CD28a-CD28b-CD137-CD3ζ，
及其组合，其中相关嵌合抗原受体蛋白中CD28a代表CD28分子的跨膜区，CD28b代表CD28分子的胞内信号区。
6.如权利要求1的核酸，其特征在于，所述核酸选自编码具有SEQ ID NO:22～25之一序列的嵌合抗原受体蛋白的核酸。
7.如权利要求6所述的核酸，其特征在于，所述核酸具有SEQ ID NO:18-21之一的序列。
8.如权利要求1所述的核酸，其特征在于，所述核酸为与权利要求7所述的核酸具有至少50％、70％、80％、90％、或95％相同性的多核苷酸。
9.如权利要求8所述的核酸，其特征在于，所述核酸编码的多肽与SEQ ID NO:22-25之一所示的成熟多肽有相当的生物学功能和活性。
10.包含权利要求1-9之一所述的核酸的载体。
11.权利要求10所述的载体，该载体来自慢病毒质粒pWPT-eGFP，并具有如SEQ ID NO:27-30之一的核酸序列。
12.包含权利要求10或11所述载体的病毒。
13.一种基因修饰的T淋巴细胞，其被转导有权利要求1-9之一的核酸或权利要求10或11所述的载体或权利要求12所述的病毒。
14.一种转基因T淋巴细胞，其表面表达一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体由SEQID NO:18-21之一的核酸编码表达。
15.一种基因修饰的T淋巴细胞，其表面表达一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列选自SEQ ID NO:22-25之一。
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