CN113891897A - 组合物 - Google Patents

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吴姿娴
李文心
黄庆文
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Abstract

我们描述了一种抗体或其抗原结合片段，其包含选自以下的克隆的重链可变区(VH)序列和轻链可变区(VL)序列：5C4、4H1、1D2、1C4、2B5、1F1、1H1、4A5、1D8、1D3、2F1、3C6、3D12、3A9、1F4、1H10、3C12、4G11、4A12、1A12、3G12、4F9、4G4和1E1，所述抗体或其抗原结合片段能够特异性结合磷脂酰肌醇蛋白聚糖‑3(GPC‑3)(Genbank登录号：NP_004475.1)，或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。

Description

组合物
技术领域
本发明涉及医药、细胞生物学、分子生物学和遗传学领域。本发明涉及医药领域。
背景技术
肝细胞癌(HCC)的新治疗策略的未满足的需求
肝细胞癌(HCC)是全球第六大最常见癌症，据报告2015年全球发病率为854,000。
由于流行的慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染，全球半数以上的HCC病例发生在发展中国家。HCC也是癌症相关死亡率的第四大原因。
绝大多数患者在确诊后通常由于他们处于疾病的晚期而不适合接受治愈性治疗，并且HCC的全身性治疗结果令人失望。
HCC的主要靶向治疗药物是Nexavar(Sorafenib，Bayer)，一种用于多种蛋白激酶的小分子抑制剂。然而，即使在HCC治疗中大量使用，Sorafenib也仅显示出微不足道的临床益处和低应答率，并且对总生存率的改善非常有限。自Sorafenib于2007年推出以来，没有新药进入市场，这表明为HCC开发新的治疗方法非常困难。
因此，医学上仍然迫切需要为HCC发现新的治疗策略。
发明内容
根据本发明的第一方面，我们提供了一种抗体或其抗原结合片段，其包含选自以下的克隆的重链可变区(VH)序列和轻链可变区(VL)序列：5C4、4H1、1D2、1C4、2B5、1F1、1H1、4A5、1D8、1D3、2F1、3C6、3D12、3A9、1F4、1H10、3C12、4G11、4A12、1A12、3G12、4F9、4G4和1E1。所述抗体或其抗原结合片段能够特异性结合磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC-3)(Genbank登录号：NP_004475.1)。其可以是与这种序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。
所述抗体或抗原结合片段可以是使得VH和VL序列选自：SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2；SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4；SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6；SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8；SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10；SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12；SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14；SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16；SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18；SEQ ID NO:19和SEQ IDNO:20；SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22；SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24；SEQ ID NO:25和SEQID NO:26；SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28；SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30；SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32；SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34；SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36；SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38；SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:40；SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:42；SEQ IDNO:43和SEQ ID NO:44；SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:46；以及SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:48。
所述抗体或抗原结合片段能够以55nM或更小、50nM或更小、45nM或更小、40nM或更小、35nM或更小、30nM或更小、25nM或更小、20nM或更小、15nM或更小、10nM或更小、5nM或更小、1nM或更小、0.9nM或更小、0.8nM或更小、0.7nM或更小、0.6nM或更小、0.5nM或更小、0.4nM或更小、0.3nM或更小、0.2nM或更小或0.1nM或更小的亲和力结合人磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC-3)的表位。所述亲和力可以通过ELISA测定的EC50来计量。
所述抗体或抗原结合片段能够结合选自由HepG2(GPC-3高)和Hep3B(GPC-3中)组成的组的细胞系。
所述抗体或抗原结合片段能够在自然杀伤(NK)细胞的存在下诱导GPC-3表达细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。
所述抗体或抗原结合片段可以是包含人恒定区的人源化抗体。
所述抗体或抗原结合片段可以包括单克隆抗体、人源化单克隆抗体、Fv、F(ab’)、F(ab’)2或单链Fv(scFv)片段。它可以包含单链Fv片段，该片段包含VH序列和VL序列。
所述抗体或抗原结合片段可以是选自由以下组成的组的单克隆抗体：5C4、4H1、1D2、1C4、2B5、1F1、1H1、4A5、1D8、1D3、2F1、3C6、3D12、3A9、1F4、1H10、3C12、4G11、4A12、1A12、3G12、4F9、4G4和1E1。
所述抗体或抗原结合片段还包含能够结合CD3(Genbank登录号：NM_000733.4)的重链可变区(VH)序列和轻链可变区(VL)序列。
所述抗体或抗原结合片段还能够特异性结合CD-3或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。
所述抗体或抗原结合片段可以是能够结合CD3的重链可变区(VH)序列和轻链可变区(VL)序列，其包含SEQ ID NO:97和SEQ ID NO:98所示的序列。
所述抗体或抗原结合片段能够活化T细胞。
根据本发明的第二方面，提供了一种嵌合抗原受体(CAR)，其包含：(a)如上所述的抗原结合片段；(b)跨膜结构域；和(c)共刺激胞内信号传导结构域。我们还提供了表达这种嵌合抗原受体的嵌合抗原受体T细胞(CAR T)。
根据本发明的第三方面，我们提供了能够编码如上所述的抗体或抗原结合片段的核酸。所述核酸可以包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:50；SEQID NO:51和SEQ ID NO:52；SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:54；SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:56；SEQ ID NO:57和SEQ ID NO:58；SEQ ID NO:59和SEQ ID NO:60；SEQ ID NO:61和SEQ IDNO:62；SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:64；SEQ ID NO:65和SEQ ID NO:66；SEQ ID NO:67和SEQID NO:68；SEQ ID NO:69和SEQ ID NO:70；SEQ ID NO:71和SEQ ID NO:72；SEQ ID NO:73和SEQ ID NO:74；SEQ ID NO:75和SEQ ID NO:76；SEQ ID NO:77和SEQ ID NO:78；SEQ ID NO:79和SEQ ID NO:80；SEQ ID NO:81和SEQ ID NO:82；SEQ ID NO:83和SEQ ID NO:84；SEQ IDNO:85和SEQ ID NO:86；SEQ ID NO:87和SEQ ID NO:88；SEQ ID NO:89和SEQ ID NO:90；SEQID NO:91和SEQ ID NO:92；SEQ ID NO:93和SEQ ID NO:94；以及SEQ ID NO:95和SEQ IDNO:96。所述核酸可以包含在表达载体中。
作为本发明的第四方面，提供了包含这种核酸的宿主细胞。所述宿主细胞可以包括中国仓鼠卵巢(CHO)或HEK293细胞。
根据本发明的第五方面，我们提供了一种药物组合物，其包含：如上所述的抗体或抗原结合片段、CAR、CAR T、核酸或宿主细胞，以及药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载剂(carrier)。
本发明的第六方面提供了一种化合物，其包含如上所述的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段与细胞毒性剂连接。所述连接可以通过可切割的接头。
所述化合物可以包括抗体-药物缀合物。
在本发明的第七方面，提供了如上所述的抗体、抗原结合片段、CAR、CAR T、核酸、宿主细胞、药物组合物、化合物或抗体-药物缀合物，用于治疗、预防或缓解癌症如肝细胞癌(HCC)的方法中。
根据本发明的第八方面，我们提供了一种制备抗体或抗原结合片段的方法，所述方法包括在宿主细胞(例如如上所述的宿主细胞)中表达如上所述的核酸，并任选地分离经表达的抗体或抗原结合片段。
根据本发明的第九方面，我们提供了这类抗体、抗原结合片段、CAR、CAR T、核酸、药物组合物、化合物或抗体-药物缀合物在制备用于治疗、预防或缓解癌症如肝细胞癌(HCC)的药物中的用途。
根据本发明的第十方面，提供了一种检测肝细胞癌(HCC)细胞的方法，所述方法包括用如上所述的抗体或抗原结合片段检测所述细胞中的或所述细胞的磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC-3)的表达、量或活性的调节。
作为本发明的第十一方面，我们提供了一种诊断个体的肝细胞癌(HCC)的方法，其中所述方法包括：通过使个体中的细胞与如上所述的抗体或抗原结合片段接触来检测所述细胞中经调节的磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC-3)的表达水平；与已知并未患有肝细胞癌(HCC)的个体的细胞中的磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3的表达水平相比较；其中，所述磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3的表达水平增加表明所述个体患有或可能患有肝细胞癌(HCC)。
根据本发明的第十二方面，我们提供了用于肝细胞癌(HCC)的诊断试剂盒，所述试剂盒包含如上所述的抗体或抗原结合片段或核酸以及使用说明书。
除非另有说明，本发明的实施将采用化学、分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，这些技术都在本领域普通技术人员的能力范围内。此类技术在文献中有所解释。参见，例如J.Sambrook,E.F.Fritsch,and T.Maniatis,1989,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Second Edition,Books 1-3,Cold Spring Harbor LaboratoryPress；Ausubel,F.M.et al.(1995and periodic supplements；Current Protocols inMolecular Biology,ch.9,13,and 16,John Wiley&Sons,New York,N.Y.)；B.Roe,J.Crabtree,and A.Kahn,1996,DNA Isolation and Sequencing:Essential Techniques,John Wiley&Sons；J.M.Polak and James O’D.McGee,1990,In Situ Hybridization:Principles and Practice；Oxford University Press；M.J.Gait(Editor),1984,Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach,Irl Press；D.M.J.Lilley andJ.E.Dahlberg,1992,Methods of Enzymology:DNA Structure Part A:Synthesis andPhysical Analysis of DNA Methods in Enzymology,Academic Press；UsingAntibodies:A Laboratory Manual:Portable Protocol NO.I by Edward Harlow,DavidLane,Ed Harlow(1999,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ISBN 0-87969-544-7)；Antibodies:A Laboratory Manual by Ed Harlow(Editor),David Lane(Editor)(1988,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ISBN 0-87969-314-2),1855.Handbook of DrugScreening,edited by Ramakrishna Seethala,Prabhavathi B.Fernandes(2001,NewYork,NY,Marcel Dekker,ISBN 0-8247-0562-9)；and Lab Ref:A Handbook of Recipes,Reagents,and Other Reference Tools for Use at the Bench,Edited Jane Roskamsand Linda Rodgers,2002,Cold Spring Harbor Laboratory,ISBN 0-87969-630-3。这些常规文本中的每一个都通过引用纳入本文。
附图说明
图1A至图1D是显示24个抗GPC-3 IgG1克隆的结合ELISA的图。结合ELISA实验以3个批次进行(图1A、图1B、图1C)，人源化GC33IgG1作为参考对照。计算出的EC50值显示于表中(图1D)。
图2A至图2D是显示24个抗GPC-3克隆以不同抗体浓度结合于GPC-3高HepG2细胞、GPC-3中Hep3B细胞和GPC-3阴性SK-Hep1细胞上的曲线图。流式细胞术分析以4个批次进行(图2A、图2B、图2C、图2D)，以人源化GC33 IgG1作为参考对照。
图3是显示抗GPC-3 IgG1克隆与人GPC-3重组蛋白、食蟹猴GPC-3重组蛋白和小鼠GPC-3重组蛋白的交叉反应性结合ELISA的图。人源化GC33 IgG1用作绘图对照。
图4A和图4B是显示24个抗GPC-3克隆以20nM的抗体浓度与小鼠GPC-3转导的Hepa1-6细胞(Hepa1-6-mGPC-3)和亲代Hepa1-6细胞结合的图，以人源化GC33 IgG1作为参考对照。
图4A是荧光强度的直方图，显示Hepa1-6-mGPC-3细胞和亲代Hepa1-6细胞上的mGPC-3表达水平。
图4B是用不同抗GPC-3抗体阳性染色的细胞被门控(gated)并计算百分比(％)的图。
图5是显示在不同抗GPC-3 IgG1克隆的存在下，在ADCC检测中GPC-3高HepG2细胞的特异性杀伤图。所示为三次重复的平均细胞毒性±SD。人源化GC33 IgG1用作参考对照。
图6A至图6C是显示抗GPC-3 CAR-T细胞对GPC-3高HepG2细胞和GPC-3阴性SK-Hep1细胞的特异性细胞溶解的图，使用xCelligence阻抗检测进行了48小时的时程测量。使用由不同供体产生的CAR-T细胞以3个批次进行检测(图6A、图6B、图6C)。所示为三次重复的平均细胞溶解％±SD。使用小鼠GC33克隆从scFv序列产生的抗GPC-3 CAR-T细胞用作参考对照。
图7A至图7C是显示在与GPC-3高HepG2细胞或GPC-3阴性SK-Hep1细胞共培养24小时和48小时后由抗GPC-3 CAR-T细胞分泌的干扰素-γ和IL-2的ELISA测量图。使用从不同供体产生的CAR-T细胞以3个批次进行检测(图7A、图7B、图7C)。使用小鼠GC33克隆由scFv序列产生的抗GPC-3 CAR-T细胞用作参考对照。
图8A至图8C是显示5种抗GPC-3双特异性T细胞接合抗体以不同的抗体浓度与(图8A)GPC-3阳性HepG2细胞、(图8B)GPC-3阴性SK-Hep1细胞和(图8C)CD3阳性人T细胞结合的曲线图。顶部子图显示了抗GPC-3双特异性T细胞接合抗体与不同细胞结合的平均荧光强度，而底部子图显示了抗GPC-3双特异性T细胞接合抗体阳性染色的细胞百分比。
图9A至图9H是显示当与GPC-3阳性HepG2细胞共培养时，抗GPC-3双特异性T细胞接合抗体活化人T细胞的图。在不同抗GPC-3双特异性T细胞接合抗体以3种不同浓度存在的情况下，将初始人T细胞与(图9A)HepG2细胞或(图9B)SK-Hep1细胞共培养24小时后，收获T细胞并用抗T细胞活化标志物CD25和CD69的抗体染色，用于流式细胞术分析。用T细胞活化剂TransActTM(Miltenyi Biotec)处理的T细胞作为阳性对照。
图9C和图9D是显示在与(图9C)GPC-3阳性HepG2细胞或(图9D)GPC-3阴性SK-Hep1细胞共培养后，由不同抗GPC-3双特异性T细胞接合抗体以3种不同浓度活化的T细胞百分比的图，计算并表示为CD25+CD69-细胞、CD25-CD69+细胞和CD25+CD69+细胞的总百分比。
图9E和图9F是显示在与(图9E)GPC-3阳性HepG2细胞或(图9F)GPC-3阴性SK-Hep1细胞共培养24小时，并加入3种不同浓度的不同抗GPC-3双特异性T细胞接合抗体后，由人T细胞分泌干扰素-γ的ELISA测量图。
图9G和图9H是显示在与(图9G)GPC-3阳性HepG2细胞或(图9H)GPC-3阴性SK-Hep1细胞共培养24小时，并加入3种不同浓度的不同抗GPC-3双特异性T细胞接合抗体后，由人T细胞分泌IL-2的ELISA测量图。
图10A和图10B是显示通过抗GPC-3双特异性T细胞接合抗体对GPC-3阳性HepG2细胞进行T细胞介导的细胞毒性的图。
图10A是显示在用5种不同的抗GPC-3双特异性T细胞接合抗体(克隆1C4、1D2、2B5、4H1和5C4)处理后，由活化的人T细胞介导的GPC-3阳性HepG2细胞的细胞溶解百分比的图，使用xCelligence阻抗检测进行长达72小时的时程测量。所示为两个孔中细胞溶解的平均％±SD。
图10B是显示在检测终点(72小时)不同浓度的5种不同抗GPC-3双特异性T细胞接合抗体的细胞溶解百分比的图。
图11A至图11C是显示在异种移植模型中抗GPC-3 CAR T细胞阻止GPC-3阳性HCC肿瘤形成的图。将200万个GPC-3阳性Hep3B细胞经皮下注射到NSG小鼠的右侧胁腹。四天后，将小鼠随机分组(每组4-5只小鼠)，并经尾静脉向这些小鼠静脉注射1000万个抗GPC-3 CAR T细胞(克隆5C4 scFv)或模拟(Mock)T细胞。初始肿瘤接种84天后，经皮下注射用100万个Hep3B细胞再次攻击来自CAR T组的所有无肿瘤小鼠。每隔3-7天测量并记录每只小鼠的肿瘤大小(图11A)和体重(图11B)。(图11C)注射CAR T细胞6天后，使用Luminex检测法分析了模拟T组和CAR T组小鼠的血清，并显示了代表性细胞因子的水平。
图12A至图12D是显示抗GPC-3 CAR T细胞在体内抑制Hep3B异种移植物生长的图。
图12A是显示通过流式细胞术分析检测到的不同抗GPC-3 CAR T细胞上的CAR表达百分比的图。
图12B是显示由抗GPC-3 CAR T细胞介导的GPC-3阳性Hep3B细胞和GPC-3阴性SK-Hep1细胞的细胞溶解百分比的图，采用xCelligence阻抗检测进行了长达72小时的时程测量。
图12C和图12D是显示将200万GPC-3阳性Hep3B细胞经皮下注射到NSG小鼠的右侧胁腹的图。26天后，根据肿瘤大小将小鼠分组(每组3-4只小鼠)。将1000万个不同的抗GPC-3CAR T细胞(克隆1D2、克隆4H1和克隆5C4)或模拟T细胞经尾静脉注射到这些小鼠中。每隔3-4天测量并记录每只小鼠的肿瘤大小(图12C)和体重(图12D)。
图13A至图13F是显示抗GPC-3 CAR T细胞在体内与抗PD1抗体的组合使用根除大型Hep3B异种移植物的图。
在第0天，将200万个GPC-3阳性Hep3B细胞经皮下注射到NSG小鼠的右侧胁腹。24天后，根据可测量的肿瘤大小对小鼠进行分组(每组4只小鼠)。经尾静脉将1000万个抗GPC-3CAR T细胞(克隆5C4)或模拟T细胞静脉注射到这些小鼠中。CAR T细胞注射10天后(第34天)，向所有小鼠经腹腔注射抗PD1 IgG4抗体，共注射5次，每次间隔3-5天。每隔3-4天测量并记录每只小鼠的肿瘤大小(图13A)和体重(图13B)。
图13C是显示来自模拟T组(虚线)和CAR T组的小鼠的存活曲线图。当观察到小鼠自主死亡或小鼠荷瘤大小超过2000mm3时定义为死亡。
图13D是显示在CAR T细胞注射后16天，通过流式细胞术分析法分析外周免疫细胞并且将人T细胞的群体用方框框起来的图。
图13E是计算外周总T细胞(CD3+)、外周CAR T细胞(CAR+CD3+)、外周CD4 T细胞(CD4+CD3+)和外周CD8 T细胞(CD8+CD3+)的循环浓度并比较模拟T组小鼠和CAR T组小鼠的图。
图13F是显示通过Luminex检测法分析来自模拟T组和CAR T组小鼠的血清并显示代表性细胞因子水平的图。
图14A至图14K是显示抗GPC-3 CAR T细胞在体内并未诱导毒性的图。使用9个不同的抗GPC-3抗体scFv序列产生抗GPC-3 CAR T细胞。在第0天，向混合性别的NSG小鼠(M：雄性，F：雌性)经静脉注射1000万个模拟T细胞(图14B)或不同的抗GPC-3 CAR T细胞(图14C至图14K)。还包括一组未接受任何处理的小鼠(图14A)作为健康对照。每隔3-7天测量并记录每只小鼠的体重。
图15A至图15F是显示抗GPC-3小鼠CAR T细胞在体内抑制MC38-mGPC-3异种移植物生长的图。
图15A是显示通过用基于慢病毒的载体转导MC38亲代细胞建立稳定表达小鼠GPC-3蛋白的MC38细胞(MC38-mGPC-3)的图。通过用抗GPC-3 IgG(克隆5C4)染色，然后进行流式细胞术分析，验证小鼠GPC-3蛋白的表达。
图15B是显示通过流式细胞术分析检测的抗GPC-3小鼠CAR T细胞上小鼠CAR表达的百分比的图。
图15C是显示由抗GPC-3小鼠CAR T细胞(克隆5C4)介导的MC38-mGPC-3细胞的细胞溶解百分比的图，采用xCelligence阻抗检测进行了长达96小时的时程测量。
图15D和图15E是显示将80万MC38-mGPC-3细胞经皮下注射到WT C57BL/6小鼠的右侧胁腹的图。12天后，根据可测量的肿瘤大小对小鼠进行分组(每组4-5只小鼠)。将800万个抗GPC-3小鼠CAR T细胞(克隆5C4)或模拟T细胞经尾静脉静脉注射到这些小鼠中。每隔3-4天测量并记录每只小鼠的肿瘤大小(图15D)和体重(图15E)。
图15F是显示抗GPC-3小鼠CAR T细胞在WT小鼠中未诱导毒性的图。在第0天，向WTC57BL/6小鼠经静脉注射800万个抗GPC-3小鼠CAR T细胞(克隆5C4)或模拟T细胞。每隔3-7天测量并记录每只小鼠的体重。
序列
SEQ ID NO:1显示了单克隆抗体5C4的重链(VH)的氨基酸序列。SEQ ID NO:2显示了单克隆抗体5C4的轻链(VL)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:3显示了单克隆抗体4H1的重链(VH)的氨基酸序列。SEQ ID NO:4显示了单克隆抗体4H1的轻链(VL)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:5显示了单克隆抗体1D2的重链(VH)的氨基酸序列。SEQ ID NO:6显示了单克隆抗体1D2的轻链(VL)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:7显示了单克隆抗体1C4的重链(VH)的氨基酸序列。SEQ ID NO:8显示了单克隆抗体1C4的轻链(VL)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:9显示了单克隆抗体2B5的重链(VH)的氨基酸序列。SEQ ID NO:10显示了单克隆抗体2B5的轻链(VL)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:11显示了单克隆抗体1F1的重链(VH)的氨基酸序列。SEQ ID NO:12显示了单克隆抗体1F1的轻链(VL)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:13显示了单克隆抗体1H1的重链(VH)的氨基酸序列。SEQ ID NO:14显示了单克隆抗体1H1的轻链(VL)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:15显示了单克隆抗体4A5的重链(VH)的氨基酸序列。SEQ ID NO:16显示了单克隆抗体4A5的轻链(VL)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:17显示了单克隆抗体1D8的重链(VH)的氨基酸序列。SEQ ID NO:18显示了单克隆抗体1D8的轻链(VL)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:19显示了单克隆抗体1D3的重链(VH)的氨基酸序列。SEQ ID NO:20显示了单克隆抗体1D3的轻链(VL)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:21显示了单克隆抗体2F1的重链(VH)的氨基酸序列。SEQ ID NO:22显示了单克隆抗体2F1的轻链(VL)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:23显示了单克隆抗体3C6的重链(VH)的氨基酸序列。SEQ ID NO:24显示了单克隆抗体3C6的轻链(VL)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:25显示了单克隆抗体3D12的重链(VH)的氨基酸序列。SEQ ID NO:26显示了单克隆抗体3D12的轻链(VL)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:27显示了单克隆抗体3A9的重链(VH)的氨基酸序列。SEQ ID NO:28显示了单克隆抗体3A9的轻链(VL)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:29显示了单克隆抗体1F4的重链(VH)的氨基酸序列。SEQ ID NO:30显示了单克隆抗体1F4的轻链(VL)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:31显示了单克隆抗体1H10的重链(VH)的氨基酸序列。SEQ ID NO:32显示了单克隆抗体1H10的轻链(VL)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:33显示了单克隆抗体3C12的重链(VH)的氨基酸序列。SEQ ID NO:34显示了单克隆抗体3C12的轻链(VL)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:35显示了单克隆抗体4G11的重链(VH)的氨基酸序列。SEQ ID NO:36显示了单克隆抗体4G11的轻链(VL)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:37显示了单克隆抗体4A12的重链(VH)的氨基酸序列。SEQ ID NO:38显示了单克隆抗体4A12的轻链(VL)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:39显示了单克隆抗体1A12的重链(VH)的氨基酸序列。SEQ ID NO:40显示了单克隆抗体1A12的轻链(VL)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:41显示了单克隆抗体3G12的重链(VH)的氨基酸序列。SEQ ID NO:42显示了单克隆抗体3G12的轻链(VL)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:43显示了单克隆抗体4F9的重链(VH)的氨基酸序列。SEQ ID NO:44显示了单克隆抗体4F9的轻链(VL)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:45显示了单克隆抗体4G4的重链(VH)的氨基酸序列。SEQ ID NO:46显示了单克隆抗体4G4的轻链(VL)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:47显示了单克隆抗体1E1的重链(VH)的氨基酸序列。SEQ ID NO:48显示了单克隆抗体1E1的轻链(VL)的氨基酸序列。
具体实施方式
磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3，HCC免疫疗法的绝佳靶点
磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC-3)是硫酸乙酰肝素蛋白聚糖家族的成员，是一种通过糖基-磷脂酰肌醇(GPI)锚定物附着在细胞表面的分子。近年来，发现GPC-3是HCC诊断和进展的高度特异性的生物标志物，因为它几乎仅在HCC细胞上过表达，而不在正常成人肝细胞或其他正常组织上过表达。
此外，还证明了GPC-3可以作为多种生长因子的辅助受体，这些生长因子进而刺激致癌信号通路来促进HCC生长。
因此，作为一种特异性HCC表面标志物，GPC-3是HCC基于抗体的免疫疗法的绝佳靶点。
我们公开了在溶液中和细胞表面都特异性靶向磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3的24个抗体或其抗原结合部分的核苷酸序列和氨基酸序列。
我们描述了针对磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC-3)产生的单克隆抗体。我们将这些单克隆抗体称为5C4、4H1、1D2、1C4、2B5、1F1、1H1、4A5、1D8、1D3、2F1、3C6、3D12、3A9、1F4、1H10、3C12、4G11、4A12、1A12、3G12、4F9、4G4和1E1。
这些抗体能够特异性结合在溶液中以及在细胞表面表达的磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC-3)。所述抗体还能够与来自许多其他物种的磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC-3)发生交叉反应。所述抗体能够诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性。所述抗体可以用于构建高效杀死肿瘤细胞的抗GPC-3 CAR T细胞。
我们公开了以下每个克隆的重链可变区(VH)序列和轻链可变区(VL)序列：5C4、4H1、1D2、1C4、2B5、1F1、1H1、4A5、1D8、1D3、2F1、3C6、3D12、3A9、1F4、1H10、3C12、4G11、4A12、1A12、3G12、4F9、4G4和1E1。
我们发现包含这些可变区的Fab片段以及单链Fv片段具有相同的交叉反应性和强中和活性。
因此，我们提供包含这些可变区的多肽用于治疗和检测癌症，例如肝细胞癌。
抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC-3)抗体
实施例描述了由GPC-3蛋白产生并对其具有反应性的抗体的产生和制备。
我们公开了抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC-3)的小鼠单克隆抗体5C4、4H1、1D2、1C4、2B5、1F1、1H1、4A5、1D8、1D3、2F1、3C6、3D12、3A9、1F4、1H10、3C12、4G11、4A12、1A12、3G12、4F9、4G4和1E1的功能特征和结构特征。我们发现这些抗GPC-3抗体能够杀死肿瘤细胞。
因此，我们广泛提供了抗GPC-3抗体。抗GPC-3抗体可以包含5C4、4H1、1D2、1C4、2B5、1F1、1H1、4A5、1D8、1D3、2F1、3C6、3D12、3A9、1F4、1H10、3C12、4G11、4A12、1A12、3G12、4F9、4G4或1E1的重链可变区和轻链可变区。
所述抗GPC-3抗体可以用于靶向肝细胞癌。
所述抗肿瘤抗体可能能够结合来自许多不同物种的GPC-3多肽。
所述抗体可能具有交叉反应性，即能够结合多于一种的多肽。例如，所述抗体可能能够结合限定多肽组内特定多肽的两种或更多种变体。因此，两种或多种变体可以包含来自该组中不同类型多肽的同族多肽或同源多肽。所述抗体可能能够结合该组中特定多肽的基本上所有变体。
本文的公开内容能够制备这些抗体及其片段和变体，包括人源化抗体和嵌合抗体，它们具有与抗GPC-3抗体(例如5C4、4H1、1D2、1C4、2B5、1F1、1H1、4A5、1D8、1D3、2F1、3C6、3D12、3A9、1F4、1H10、3C12、4G11、4A12、1A12、3G12、4F9、4G4和1E1)一种或多种相似或相同的性质。
这些性质可以包括结合亲和力、结合特异性、交叉反应性、结合亲和力、中和活性等，如下文进一步详细描述的。本文中描述的特异性抗体及其变体可以由本领域技术人员根据本文中公开的信息，并采用我们也详细描述的分子生物学技术来制备。
抗GPC-3抗体
抗GPC-3抗体结合的多肽可以包含磷脂酰肌醇蛋白聚糖蛋白。我们具体公开了抗GPC-3抗体。
因此，术语“抗GPC-3抗体”应理解为包括单克隆抗体5C4、4H1、1D2、1C4、2B5、1F1、1H1、4A5、1D8、1D3、2F1、3C6、3D12、3A9、1F4、1H10、3C12、4G11、4A12、1A12、3G12、4F9、4G4和1E1中的每一个(以及它们的人源化对应物)。还包括包含抗体5C4、4H1、1D2、1C4、2B5、1F1、1H1、4A5、1D8、1D3、2F1、3C6、3D12、3A9、1F4、1H10、3C12、4G11、4A12、1A12、3G12、4F9、4G4和1E1中任一个的可变区的多肽及其变体、同源物、片段和衍生物。在上下文允许的情况下，该术语还应包括如下所述的抗GPC-3抗体的变体、同源物、片段和衍生物。
抗GPC-3抗体可以针对来自任何物种的磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3来产生，如人磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3。它们可以用于结合或靶向肿瘤细胞，如肝细胞癌细胞。
因此，抗GPC-3抗体也可以视为抗肿瘤抗体或抗肝癌抗体。
在例如实施例中公开了单克隆抗体及其变体包括Fab、scFv等、以及人源化单克隆抗体及其性质。实施例还描述了来自单克隆抗体的Fab片段以及单链Fv。还公开了包括这些抗体中每一个的人源化版本的其他变体。
我们公开了单克隆抗体5C4、4H1、1D2、1C4、2B5、1F1、1H1、4A5、1D8、1D3、2F1、3C6、3D12、3A9、1F4、1H10、3C12、4G11、4A12、1A12、3G12、4F9、4G4和1E1的可变区序列。我们还公开了这些可变区的变体、同源物、片段和衍生物。使用该序列信息，技术人员可以制备包含这些可变区或其变体、同源物、片段和衍生物的抗体。
我们还公开了用于表达这些单克隆抗体的核酸构建体的序列。这些构建体的序列能够制备与抗体5C4、4H1、1D2、1C4、2B5、1F1、1H1、4A5、1D8、1D3、2F1、3C6、3D12、3A9、1F4、1H10、3C12、4G11、4A12、1A12、3G12、4F9、4G4和1E1具有相同的序列的单克隆抗体。我们还公开了抗体5C4、4H1、1D2、1C4、2B5、1F1、1H1、4A5、1D8、1D3、2F1、3C6、3D12、3A9、1F4、1H10、3C12、4G11、4A12、1A12、3G12、4F9、4G4和1E1的变体、同源物、片段和衍生物。
我们公开了能够表达人源化单克隆抗体5C4、4H1、1D2、1C4、2B5、1F1、1H1、4A5、1D8、1D3、2F1、3C6、3D12、3A9、1F4、1H10、3C12、4G11、4A12、1A12、3G12、4F9、4G4和1E1的构建体的序列。我们描述了从用所述构建体(以及这些人源化构建体的变体、同源物、片段和衍生物)转染的细胞表达目的抗体的方法。
使用这样的序列和表达方法，技术人员可以容易地转染相关的宿主细胞并使它们表达完整的单克隆或人源化的抗GPC-3抗体，或其变体、同源物、片段和衍生物。
所述单克隆抗体及其变体可以包含抗体5C4、4H1、1D2、1C4、2B5、1F1、1H1、4A5、1D8、1D3、2F1、3C6、3D12、3A9、1F4、1H10、3C12、4G11、4A12、1A12、3G12、4F9、4G4和1E1的可变区，还包含来自本领域已知的其他抗GPC-3抗体的可变区。抗GPC-3抗体可以在单个抗体分子中包含相同或不同的可变区。它们可以包含一个可变区，或多于一个可变区。因此，我们为技术人员提供了制备任何数量的抗体的能力，所述抗体包含与抗体5C4、4H1、1D2、1C4、2B5、1F1、1H1、4A5、1D8、1D3、2F1、3C6、3D12、3A9、1F4、1H10、3C12、4G11、4A12、1A12、3G12、4F9、4G4和1E1或其他抗GPC-3抗体相同或相似的结合反应性。
此类抗体可以包含抗体的完整序列或基本完整序列(即重链和轻链)，或它们可以包含完整抗体的片段(例如Fv、F(ab’)和F(ab’)2片段或单链抗体(scFv))。抗体还可以包含如下文详细描述的包含抗体的抗原结合位点的融合蛋白或合成蛋白。
同样显而易见的是，可以对此类抗体进行工程化以获得所需性质，例如降低的宿主反应性、降低的排斥等。
所述工程化可以包括“人源化”，我们通过该术语表示在抗体序列例如小鼠抗体序列中包含(或置换有)一个或多个人类残基或序列。本文上下文中的“人源化”包括“嵌合”抗体，其中所述抗体包含小鼠序列和人类序列的离散部分，例如，其中一个或两个可变区包含小鼠序列，抗体分子的其余部分(例如恒定区)包含人类序列。在这种嵌合抗体中，例如小鼠或大鼠抗体的整个可变区可以与人类恒定区一起表达。这提供了这种具有人类效应子功能的嵌合抗体，并且还降低了由鼠Fc区引起的免疫原性(HAMA)。
5C4、4H1、1D2、1C4、2B5、1F1、1H1、4A5、1D8、1D3、2F1、3C6、3D12、3A9、1F4、1H10、3C12、4G11、4A12、1A12、3G12、4F9、4G4和1E1抗体的人源化可以通过任何合适的方式进行，例如在Hanson BJ,Boon AC,Lim AP,Webb A,Ooi EE,Webby RJ.Passiveimmunoprophylaxis and therapy with humanized monoclonal antibody specific forinfluenza A H5 hemagglutinin in mice.Respir Res 17:126,2006中描述的方法。
通常，“嵌合抗体”可以指这样的抗体：或者具有由源自鼠免疫球蛋白基因的核苷酸序列编码的重链和轻链，以及或者具有由源自人免疫球蛋白基因的核苷酸序列编码的重链和轻链。
“人源化”还包括CDR移植或重构的抗体。因此，它包括更离散水平的工程化，例如，其中小鼠可变区已被突变为包含人类残基以降低免疫原性的抗体。在此类抗体中，只有来自啮齿动物抗体V区的互补决定区可以与来自人类V区的框架区结合。与嵌合抗体相比，此类抗体应更具人源性且免疫原性更低。
为免生疑问，当本文提及特异性抗体名称时，应将其理解为包括小鼠单克隆抗体(由杂交瘤分泌)及其人源化版本，除非上下文另有说明。因此，例如，当提及抗体5C4、4H1、1D2、1C4、2B5、1F1、1H1、4A5、1D8、1D3、2F1、3C6、3D12、3A9、1F4、1H10、3C12、4G11、4A12、1A12、3G12、4F9、4G4或1E1时，这包括单克隆抗体5C4、4H1、1D2、1C4、2B5、1F1、1H1、4A5、1D8、1D3、2F1、3C6、3D12、3A9、1F4、1H10、3C12、4G11、4A12、1A12、3G12、4F9、4G4和1E1(即源自小鼠)，以及人源化单克隆抗体5C4、4H1、1D2、1C4、2B5、1F1、1H1、4A5、1D8、1D3、2F1、3C6、3D12、3A9、1F4、1H10、3C12、4G11、4A12、1A12、3G12、4F9、4G4和1E1。
GPC-3结合多肽
我们还提供了通常具有GPC-3蛋白结合活性的多肽。此类多肽包括抗GPC-3抗体。GPC-3结合多肽可以包含一种或多种与单克隆抗体5C4、4H1、1D2、1C4、2B5、1F1、1H1、4A5、1D8、1D3、2F1、3C6、3D12、3A9、1F4、1H10、3C12、4G11、4A12、1A12、3G12、4F9、4G4和1E1相同或相似的性质。为了方便起见，所述多肽可以通常被称为“抗GPC-3抗体”。
构建结合分子在读者的技术范围内，所述结合分子可以不是(或可以不被描述为)抗体或免疫球蛋白，但包含如本文所述的抗GPC-3结合活性。因此，在上下文允许的情况下，术语“抗GPC-3抗体”应理解为包括任何分子，只要其能够结合GPC-3。这样的分子可以包括多肽、小分子以及抗体和免疫球蛋白，并且可以通过本领域已知的多种方法来鉴定，例如通过筛选适合GPC-3结合活性的文库。
所述GPC-3结合多肽(包括抗GPC-3抗体)可以具有与单克隆抗体5C4、4H1、1D2、1C4、2B5、1F1、1H1、4A5、1D8、1D3、2F1、3C6、3D12、3A9、1F4、1H10、3C12、4G11、4A12、1A12、3G12、4F9、4G4和1E1相似或相同的性质。这种相似或相同的性质可以特别包括结合性质。所述GPC-3结合多肽通常能够结合GPC-3多肽，例如来自人类的GPC-3、来自小鼠的GPC-3等。
GPC-3表位
抗GPC-3抗体可以具有与抗体5C4、4H1、1D2、1C4、2B5、1F1、1H1、4A5、1D8、1D3、2F1、3C6、3D12、3A9、1F4、1H10、3C12、4G11、4A12、1A12、3G12、4F9、4G4和1E1相同或相似的结合特异性、结合亲和力和/或结合亲和力。抗GPC-3抗体可以特异性结合由抗体5C4、4H1、1D2、1C4、2B5、1F1、1H1、4A5、1D8、1D3、2F1、3C6、3D12、3A9、1F4、1H10、3C12、4G11、4A12、1A12、3G12、4F9、4G4和1E1结合的表位。
确定与特定抗体结合的表位的方法是本领域已知的。此类表位作图方法在例如Hanson et al.,(2006).Respiratory Research,7:126中有所描述。此外，技术人员将能够产生抗体并筛选它们的特定性质。
因此，技术人员将能够容易地鉴定结合与单克隆抗体5C4、4H1、1D2、1C4、2B5、1F1、1H1、4A5、1D8、1D3、2F1、3C6、3D12、3A9、1F4、1H10、3C12、4G11、4A12、1A12、3G12、4F9、4G4和1E1相同的表位的抗GPC-3抗体。
抗体结合
抗GPC-3抗体能够与来自人的磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3结合。它还能够与来自小鼠的磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3结合。
抗GPC-3抗体与其靶标之间的结合可以或多或或少，或强或弱，短暂、半永久或永久。抗体可以1μM或更低(例如100nM或更低)的EC50结合亲和力与其靶标结合。
它可以90nM或更低、80nM或更低的亲和力结合。它可以70nM或更低、60nM或更低、50nM或更低、40nM或更低、30nM或更低、20nM或更低、10nM或更低、5nM或更低、4nM或更低、3nM或更低、2nM或更低、1nM或更低的亲和力结合。它可以0.5nM或更低、0.4nM或更低、0.3nM或更低或0.2nM或更低的亲和力结合。
抗体可以μM或nM范围的Kd与其靶标结合。它可以10-7M或更低、10-7M或更低、10-8M或更低、10-9M或更低或10-10M或更低的Kd结合。
所述结合可通过本领域已知的任何方式测量，例如ELISA或表面等离子共振，这两种方法都在实施例中详细描述。
抗GPC-3抗体与GPC-3多肽的结合可发生在胞内或胞外。这种结合可使GPC-3多肽失活、抑制或降低GPC-3多肽的活性。所述结合可中和GPC-3的活性。
所述活性可包括由GPC-3多肽引起的或与GPC-3多肽相关的任何生物活性。所述活性可包括与另一种蛋白的结合，所述另一种蛋白例如受体、下游蛋白或下游因子。另一种蛋白可包括GPC-3本身。所述活性可包括多聚化活性，例如三聚化活性或同源三聚化活性。抗GPC-3抗体与GPC-3多肽的结合可使受体、下游蛋白或下游因子失活、抑制或降低它们的活性。所述活性可包括生化活性或致病活性。
所述结合可使表达GPC-3的细胞失活、抑制或降低其活性。它可以灭活或中和或杀死表达GPC-3的细胞。抗GPC-3抗体与GPC-3之间的结合可以杀死表达GPC-3的肿瘤细胞。
抗体
在上下文允许的情况下，本文中使用的术语“抗体”和“免疫球蛋白”可以互换地使用。这些术语包括抗体分子经蛋白水解切割或重组制备部分的片段，它们能够选择性地与GPC-3或其表位反应或识别GPC-3或其表位，例如与抗体5C4、4H1、1D2、1C4、2B5、1F1、1H1、4A5、1D8、1D3、2F1、3C6、3D12、3A9、1F4、1H10、3C12、4G11、4A12、1A12、3G12、4F9、4G4和1E1结合的GPC-3的表位
此类蛋白水解片段和/或重组片段的非限制性实例包括Fab、F(ab’)2、Fab’、Fv片段和含有通过肽接头连接的VL和VH结构域的单链抗体(scFv)。这些Fv可以共价或非共价连接，形成具有两个或多个结合位点的抗体。
“ScFv分子”是指其中VH和VL伙伴(partner)结构域通过柔性寡肽连接的分子。在Winter&Milstein(1991)Nature 349,293-299中可以找到对合成保留其特异性结合位点的抗体片段所涉及的技术的一般性综述。
完整抗体和F(ab’)2片段是“二价”的。“二价”是指所述抗体和F(ab’)片段具有两个抗原结合位点。相比之下，Fab、Fv、ScFv和dAb片段是单价的，只有一个抗原结合位点。
抗GPC-3抗体可包括结合亲和力为1μm或更低(例如100nm或更低，例如0.17nM至84nM)的高亲和力抗体。
本文中所用的术语“结合亲和力”是指本文公开的抗体(例如抗GPC-3抗体)的EC50结合亲和力。可以使用ELISA或表面等离子共振进行测量。高EC50结合亲和力是理想的，因为它反映了Fab片段对抗原的亲和力。
术语“亲和力”也可以根据抗体(例如抗GPC-3抗体)的解离速率或解离率(koff)来定义。解离率越低，抗体(例如抗GPC-3抗体)对抗原的亲和力越高。
抗GPC-3抗体可包含肽本身或形成融合蛋白的一部分。
本文所述的抗GPC-3抗体包括任何具有GPC-3结合活性的抗体，例如与GPC-3的结合能力或与抗体5C4、4H1、1D2、1C4、2B5、1F1、1H1、4A5、1D8、1D3、2F1、3C6、3D12、3A9、1F4、1H10、3C12、4G11、4A12、1A12、3G12、4F9、4G4和1E1所结合的相同表位的结合能力。
抗GPC-3抗体还包括无论是小鼠的、人源化的或人类的整个抗体或完整抗体，此类抗体的衍生物和生物活性片段。这些可以包括具有GPC-3结合活性的抗体片段，所述抗体片段具有氨基酸置换或具有连接至氨基酸官能团的糖或其他分子等。
抗GPC-3抗体可包括分离的抗体或纯化的抗体。所述抗体可从任何合适的来源获得或通过任何合适的来源产生，无论是否是天然的，或者它可以是合成的抗GPC-3抗体、半合成的抗GPC-3抗体、衍生的抗GPC-3抗体、或重组的抗GPC-3抗体。
当抗GPC-3抗体是非天然抗GPC-3抗体时，其可包括至少一部分通过重组DNA技术制备的抗体、或通过化学合成技术产生的抗GPC-3抗体、或它们的组合。
本文中所用的术语“衍生物”包括抗GPC-3抗体的化学修饰。举例来说，这种修饰可以用烷基、酰基或氨基置换氢。抗GPC-3抗体的序列可与天然存在形式的序列相同，也可以是其变体、同源物、片段或衍生物。
抗体可变区
本文中使用的术语“可变区”是指轻链(VL)和重链(VH)的可变区或结构域，其包含结合识别特异性和抗体对GPC-3(或变体、同源物、片段或衍生物)的总亲和力的决定簇(determinants)，视情况而定。
每对轻链(VL)和重链(VH)的可变区参与抗原识别并形成抗原结合位点。轻链和重链的结构域具有相同的基本结构，每个结构域具有四个框架(FR)区，其序列相对保守，通过三个互补决定区(CDR)连接。FR区保持了可变结构域的结构完整性。CDR是可变结构域内介导抗原结合的多肽片段。
本文中所用的术语“恒定区”是指提供结构稳定性和其他生物学功能但不涉及结合GPC-3表位的抗体(或变体、同源物、片段或衍生物)的轻(CL)和重(CH)链的结构域，所述其他生物学功能例如抗体链缔合、分泌、经胎盘移动性(transplacental mobility)和补体结合。恒定区基因中的氨基酸序列和相应的外显子序列取决于其来源的物种。然而，导致同种异型的氨基酸序列变异对于物种内的特定恒定区是相对有限的。“同种异型”是区分等位基因的抗原决定簇(或表位)。
每条链的可变区通过连接多肽序列与恒定区连接。所述连接序列由轻链基因中的“J”序列以及重链基因中的“D”序列和“J”序列的组合来编码。
抗体可变区序列
根据本文所述的方法和组合物，抗GPC-3抗体可通过本领域已知的方法从这些可变区序列产生。
例如，通过本领域技术人员已知的重组基因工程技术，可将重链和轻链序列重组到所选抗体的恒定序列中。
恒定区序列是本领域已知的，并且可从许多数据库中获得，例如IMGT/LIGM-DB数据库(描述于Giudicelli et al,2006,Nucleic Acids Research 34(Database Issue)：D781-D784 and LeFranc et al(1995)LIGM-DB/IMGT:An Integrated Database of Igand TcR,Part of the Immunogenetics Database.Annals of the New York Academy ofSciences 764(1),47–47doi:10.1111/j.1749-6632.1995.tb55805.x)和IMGT/GENE-DB数据库(描述于Giudicelli et al,2005,Nucleic Acids Res.2005Jan 1；33(Databaseissue)：D256-61)。IMGT/LIGM-DB和IMGT/GENE-DB是链接为www.ebi.ac.uk/imgt/的ImMunoGeneTics数据库的一部分。
将可变区与给定序列和恒定区结合以产生完整抗体的方法是本领域已知的，并在Hanson et al.,(2006).Respiratory Research,7:126中描述。
抗体单链抗体序列
可以通过本领域已知的方式产生完整抗体的片段，例如Fv、F(ab’)和F(ab’)2片段或单链抗体(scFv)。
使用公开的序列和文献中描述的方法，例如，具有本文所示序列的抗体5C4、4H1、1D2、1C4、2B5、1F1、1H1、4A5、1D8、1D3、2F1、3C6、3D12、3A9、1F4、1H10、3C12、4G11、4A12、1A12、3G12、4F9、4G4和1E1的可变区的重链和轻链可以转基因地融合到小鼠IgG恒定区序列来产生小鼠单克隆抗GPC-3抗体。抗体5C4、4H1、1D2、1C4、2B5、1F1、1H1、4A5、1D8、1D3、2F1、3C6、3D12、3A9、1F4、1H10、3C12、4G11、4A12、1A12、3G12、4F9、4G4和1E1的可变区可以用小鼠或人IgG恒定区进行工程化，以产生能够结合GPC-3多肽的小鼠单克隆抗体或人源化抗体。
多肽序列
应当理解，本文公开的多肽序列不限于本文所述的特定序列，还包括从任何来源获得的同源序列，例如相关的细胞同源物、来自其他物种的同源物及其变体或衍生物，条件是它们具有抗GPC-3抗体的至少一种生物活性(视情况而定)。
因此，本公开包括本文所述氨基酸序列的变体、同源物或衍生物，以及由本文公开的核苷酸序列编码的氨基酸序列的变体、同源物或衍生物。这类序列通常被称为“抗GPC-3抗体”序列。
生物活性
在一些实施方案中，视情况而定，所述序列包含抗GPC-3抗体的至少一种生物活性。
所述生物活性可以包括免疫活性。与抗体5C4、4H1、1D2、1C4、2B5、1F1、1H1、4A5、1D8、1D3、2F1、3C6、3D12、3A9、1F4、1H10、3C12、4G11、4A12、1A12、3G12、4F9、4G4和1E1或其人源化版本相比，抗GPC-3抗体可具有相同或相似的免疫活性。“免疫活性”是指抗GPC-3抗体与GPC-3抗原结合时，在适当的动物或细胞中诱导特异性免疫应答的能力。
所述生物活性可以包括抗原结合活性。抗GPC-3抗体可以结合GPC-3或其表位。抗GPC-3抗体可以结合到与抗体5C4、4H1、1D2、1C4、2B5、1F1、1H1、4A5、1D8、1D3、2F1、3C6、3D12、3A9、1F4、1H10、3C12、4G11、4A12、1A12、3G12、4F9、4G4或1E1结合的相同表位。
抗GPC-3抗体可以相同的、降低的或提高的亲和力或亲合力(avidity)与抗原或表位结合。例如，与同源抗体或其人源化对应物相比，抗GPC-3抗体可以至少10％、例如20％、例如30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或更高的亲和力或亲合力与抗原或表位结合，视情况而定。
所述活性可以包括对磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3活性的抑制。磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3作为生长因子(例如BMP、FGF、hedgehog)的辅助受体，据报道其与HCC的发病、发展和转移有关。
抗GPC-3抗体可以具有与同源抗体相同、降低或升高的抑制活性。例如，抗GPC-3抗体的有效性可以为同源抗体(例如抗体5C4、4H1、1D2、1C4、2B5、1F1、1H1、4A5、1D8、1D3、2F1、3C6、3D12、3A9、1F4、1H10、3C12、4G11、4A12、1A12、3G12、4F9、4G4、或1E1、或其人源化的对应物)的至少10％、例如20％、例如30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多，视情况而定。我们的意思是指，与未处理的动物或细胞相比，如果同源抗体能够将磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3活性等降低例如90％，则抗GPC-3抗体可能能够将磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3活性等降低低于90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％等。
也可以使用检测抗体事件的其他测定来代替或补充所述的测定。
同源物
所公开的抗GPC-3抗体多肽包括从任何来源获得的同源序列，例如相关的病毒蛋白/细菌蛋白、细胞同源物和合成肽及其变体或衍生物。因此，多肽还包括编码来自其他物种的抗GPC-3抗体的同源物的那些多肽，所述其他物种包括其他动物，例如哺乳动物(例如小鼠、大鼠或兔)或人。
在本文的上下文中，同源序列或同源物被认为包括与相关多肽序列在至少30个氨基酸以上(例如50个、70个、90个或100个氨基酸)的氨基酸水平上至少60％、70％、80％或90％(例如至少95％或98％)相同的氨基酸序列，例如如本文序列表所示。在本文的上下文中，同源序列被认为包括与相关多肽的序列在例如至少15个、25个、35个、50个或100个氨基酸以上(例如200个、300个、400个或500个氨基酸)的氨基酸水平上至少15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％(例如至少95％或98％)相同的氨基酸序列。虽然也可以根据相似性(即具有相似化学性质/功能的氨基酸残基)来考虑同源性，但在本文的上下文中，同源性可根据序列同一性来表达。序列同一性可相对于相关序列的整个长度(即，例如在相关基因的整个长度或全长序列上)来确定。
同源性比较可以通过肉眼进行，或更常见的是，借助于现有的序列比较程序进行。这些市售的计算机程序可以计算两个或多个序列之间的同源性％。
可以在连续序列上计算同源性％，即一个序列与另一个序列比对，并且一个序列中的每个氨基酸与另一个序列中的相应氨基酸直接比较，一次一个残基。这称为“无空位”比对。通常，这种无空位比对仅在相对少量的残基(例如，少于50个连续氨基酸)上进行。
虽然这是一种非常简单且一致的方法，但它未能考虑到，例如，在其他方面相同的序列对中，一个插入或缺失将导致后面的氨基酸残基比对失败，因此当进行全局比对时，可能导致同源性％的大幅降低。因此，大多数序列比较方法旨在产生最佳比对，其将可能的插入和缺失考虑在内，而不会过度惩罚整体同源性得分。这是通过在序列比对中插入“空位”以尝试最大化局部同源性来实现的。
然而，这些更复杂的方法将“空位罚分”分配给比对中出现的每个空位，因此，对于相同数量的相同氨基酸，具有尽可能少的空位的序列比对(反映两个比较序列之间更高的相关性)将获得比具有许多空位的序列更高的分数。“仿射空位成本(affine gap cost)”通常用于对空位的存在收取相对较高的成本，而对空位中的每个后续残基收取较小的罚分。这是最常用的空位评分系统。高空位罚分当然会产生空位更少的优化比对。大多数比对程序允许修改空位罚分。但是，在使用此类软件进行序列比较时，可能会使用默认值。例如，当使用GCG Wisconsin Bestfit软件包(见下文)时，氨基酸序列的默认空位罚分对于空位是-12和对于每个延伸是-4。
因此，计算最大同源性％首先需要产生考虑空位罚分的最佳比对。用于进行这种比对的合适计算机程序是GCG Wisconsin Bestfit软件包(University of Wisconsin,U.S.A.；Devereux et al.,1984,Nucleic Acids Research 12:387)。能够执行序列比对的其他软件的实例包括但不限于BLAST软件包(see Ausubel et al.,1999ibid–Chapter18)、FASTA(Atschul et al.,1990,J.Mol.Biol.,403-410)和GENEWORKS比较工具套件。BLAST和FASTA均可用于离线搜索和在线搜索(参见Ausubel et al.,1999ibid,pages 7-58to 7-60)。可使用GCG Bestfit程序。
尽管可以根据同一性测量最终的同源性％，但比对过程本身通常并不基于全有或全无的配对比较。相反，通常使用按比例缩放的相似性得分矩阵，该矩阵基于化学相似性或进化距离为每个成对比较分配分数。这种矩阵常用的一个实例是BLOSUM62矩阵(BLAST程序套件的默认矩阵)。GCG Wisconsin程序通常使用公共默认值或自定义符号比较表(如果提供)(更多详细信息请参见用户手册)。对于GCG软件包的公共默认值，或者在其他软件的情况下，可以使用默认矩阵，如BLOSUM62。
一旦软件产生了最佳比对，就可以计算同源性％，例如序列同一性％。软件通常将此作为序列比较的一部分，并生成一个数值结果。
变体和衍生物
与本文所述氨基酸序列相关的术语“变体”或“衍生物”包括所述序列中一个(或多个)氨基酸的任何置换、变异、修饰、替换、缺失或添加。所得到的氨基酸序列可保持与未修饰序列基本相同的活性，例如具有至少与本文中(例如序列表中)所示的抗GPC-3抗体多肽相同的活性。因此，所述序列的关键特征——即结合GPC-3多肽的能力或降低病毒传染性、同源三聚化、病毒吸收等的能力，如其他地方所述——可以得以保留。
具有实施例中所示氨基酸序列的多肽或其片段或同源物可被修饰以用于本文所述的方法和组合物。通常，进行修饰以保持所述序列的生物活性。可以进行氨基酸置换，例如进行1个、2个或3个至10个、20个或30个置换，只要经修饰的序列保留未修饰序列的生物活性。氨基酸置换可包括使用非天然存在的类似物，例如用于增加治疗性施用多肽的血浆半衰期。
抗GPC-3抗体的天然变体可以包含保守性氨基酸置换。例如，可以根据下表定义保守性置换。第二列中同一方框中的氨基酸，如第三列中同一行中的氨基酸，可以相互置换：
Figure BDA0003361436880000281
片段
本文公开的并可用作标志物的多肽还包括上述全长多肽的片段及其变体，包括序列表中列出的序列的片段。
多肽还包括任何抗GPC-3抗体多肽的全长序列的片段。片段可包含至少一个表位。鉴定表位的方法是本领域熟知的。片段通常包含至少6个氨基酸，例如至少10个、20个、30个、50个或100个或更多个氨基酸。
抗GPC-3抗体蛋白的多肽片段及其等位基因变体和物种变体可含有一个或多个(如5个、10个、15个或20个)置换、缺失或插入，包括保守性置换。当发生置换、缺失和/或插入时，例如在不同物种中，如序列表中描述的氨基酸残基的少于50％、40％或20％被改变。
抗GPC-3抗体及其片段、同源物、变体和衍生物可以通过重组方式制备。然而，它们也可以使用本领域技术人员熟知的技术通过合成方式(例如固相合成)制备。所述蛋白也可以作为融合蛋白产生，例如为了帮助提取和纯化。融合蛋白伴侣的实例包括谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、6xHis、GAL4(DNA结合和/或转录活化结构域)和β-半乳糖苷酶。在融合蛋白伴侣和目的蛋白序列之间包括蛋白水解切割位点以容许去除融合蛋白序列也可能是方便的。所述融合蛋白可以是不会阻碍目的蛋白序列功能的融合蛋白。还可以通过纯化来自动物细胞的细胞提取物来获得蛋白质。
本文公开的抗GPC-3抗体多肽、变体、同源物、片段和衍生物可以是基本上分离的形式。应当理解，此类多肽可与不会干扰蛋白质的预期目的的载剂或稀释剂混合，并且仍然被认为是基本上分离的。抗GPC-3抗体变体、同源物、片段或衍生物也可以是基本上纯化的形式，在这种情况下，它们通常包含制剂中的蛋白质，其中制剂中超过90％(例如95％、98％或99％)的蛋白质是一种蛋白质。
本文公开的抗GPC-3抗体多肽、变体、同源物、片段和衍生物可以用显示性标记物来标记。该显示性标记物可以是使得能够检测多肽等的任何合适的标记物。合适的标记物包括放射性同位素，例如125I、酶、抗体、多核苷酸和接头，例如生物素。经标记的多肽可用于诊断程序(例如免疫测定)以检测样品中多肽的量。多肽或经标记的多肽也可用于血清学或细胞介导的免疫测定，以使用标准方案检测动物和人类对所述多肽的免疫反应性。
本文公开的抗GPC-3抗体多肽、变体、同源物、片段和衍生物(任选地被标记)也可以被固定到固相，例如免疫测定孔或试纸条的表面。此类经标记的和/或固定的多肽可以与合适的试剂、对照、说明书等一起在合适容器中包装成试剂盒。此类多肽和试剂盒可用于通过免疫测定来检测针对多肽或其等位基因变体或物种变体的抗体的方法中。
免疫测定方法是本领域熟知的，并且通常包括：(a)提供一种多肽，该多肽包含可被针对所述蛋白质的抗体结合的表位；(b)在允许形成抗体-抗原复合物的条件下，将生物样品与所述多肽一起孵育；以及(c)确定是否形成包含所述多肽的抗体-抗原复合物。
本文公开的抗GPC-3抗体多肽、变体、同源物、片段和衍生物可用于体外或体内细胞培养系统，以研究其相应基因及其同源物在细胞功能中的作用，包括它们在疾病中的功能。例如，可以将截短的多肽或修饰的多肽引入细胞中以破坏细胞中发生的正常功能。可以通过来自重组表达载体的多肽的原位表达将所述多肽引入细胞中(见下文)。所述表达载体任选地携带诱导型启动子以控制所述多肽的表达。
期望使用合适的宿主细胞(如昆虫细胞或哺乳动物细胞)以提供可以赋予重组表达产物最佳生物活性所需的翻译后修饰(如肉豆蔻酰化、糖基化、截短、lapidation以及酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸的磷酸化)。表达本文公开的抗GPC-3抗体多肽、变体、同源物、片段和衍生物的此类细胞培养系统可用于测定系统以鉴定干扰或增强细胞中多肽功能的候选物质。
多核苷酸序列
可变区、单克隆抗体序列和人源化抗体序列可以包含多核苷酸。这些多核苷酸可以包括DNA或RNA。
它们可以是单链或双链的。它们也可以是多核苷酸，其中包括合成或修饰的核苷酸。对寡核苷酸的多种不同类型的修饰是本领域已知的。这些修饰包括甲基膦酸酯主链和硫代磷酸酯主链，在分子的3’端和/或5’端添加吖啶或聚赖氨酸链。为了本文的目的，应当理解，本文所述的多核苷酸可以通过本领域中可用的任何方法进行修饰。可以进行此类修饰以增强多核苷酸的体内活性或寿命。
当多核苷酸是双链时，双链体的两条链，无论单独地或组合地，都包含在本文所述的方法和组合物中。当多核苷酸是单链时，应理解为还包含该多核苷酸的互补序列。
变体、衍生物和同源物
与本文所述核苷酸序列相关的术语“变体”、“同源物”或“衍生物”包括所述序列中一个(或多个)核苷酸的任何置换、变异、修饰、替换、缺失或添加。所得到的序列能够编码具有本文其他部分所述GPC-3结合活性的多肽。
如上所述，关于序列同一性，“同源物”具有与相关序列的例如至少5％的同一性、至少10％的同一性、至少15％的同一性、至少20％的同一性、至少25％的同一性、至少30％的同一性、至少35％的同一性、至少40％的同一性、至少45％的同一性、至少50％的同一性、至少55％的同一性、至少60％的同一性、至少65％的同一性、至少70％的同一性、至少75％的同一性、至少80％的同一性、至少85％的同一性、至少90％的同一性或至少95％的同一性。
可以具有至少95％的同一性，例如至少96％的同一性，例如至少97％的同一性，例如至少98％的同一性，例如至少99％的同一性。可以进行如上所述的核苷酸同源性的比较。为此可以使用序列比较程序，例如上述GCG Wisconsin Bestfit程序。默认的评分矩阵中，每个相同核苷酸的匹配值为10，每个错配的匹配值为-9。对于每一个核苷酸，默认的空位产生罚分是-50，默认的空位延伸罚分是-3。
杂交
我们还描述了能够与本文所述任何序列选择性杂交的核苷酸序列，本文所述序列为：例如5C4、4H1、1D2、1C4、2B5、1F1、1H1、4A5、1D8、1D3、2F1、3C6、3D12、3A9、1F4、1H10、3C12、4G11、4A12、1A12、3G12、4F9、4G4和1E1可变区、抗体和人源化抗体或其任何变体、片段或衍生物、或上述任一者的互补物。核苷酸序列的长度可以为至少15个核苷酸，例如长度为至少20个、30个、40个或50个核苷酸。
本文所用的术语“杂交”应包括“核酸链通过碱基配对与互补链连接的过程”以及在聚合酶链式反应技术中进行的扩增过程。
能够与本文所述核苷酸序列或其互补序列选择性杂交的多核苷酸通常在至少20个(例如至少25个或30个，例如至少40个、60个或100个或更多个)连续核苷酸的区域上与本文所述的相应核苷酸序列至少70％(例如至少80％或90％，例如至少95％或98％)同源。
术语“可选择性杂交的”是指用作探针的多核苷酸在发现靶多核苷酸以显著高于背景的水平与探针杂交的条件下使用。背景杂交的发生可能是因为存在其他多核苷酸，例如，在正在筛选的cDNA或基因组DNA文库中。在这种情况下，背景意味着探针和文库的非特异性DNA成员之间的相互作用产生的信号水平强度低于观察到的与靶DNA的特异性相互作用的10倍，例如低于100倍。相互作用的强度可以通过例如放射性标记探针(例如，用32P)来测量。
杂交条件基于核酸结合复合物的解链温度(Tm)，如Berger and Kimmel(1987,Guide to Molecular Cloning Techniques,Methods in Enzymology,Vol 152,AcademicPress,San Diego CA)中教导的，并赋予了如下所解释的定义的“严格性”。
最大严格性通常出现在约Tm-5℃(比探针的Tm低5℃)；高严格性出现在低于Tm约5℃至10℃；中严格性出现在低于Tm约10℃至20℃；和低严格性出现在低于Tm约20℃至25℃。如本领域技术人员理解的，最大严格性杂交可用于鉴定或检测相同的多核苷酸序列，而中(或低)严格性杂交可用于鉴定或检测相似或相关的多核苷酸序列。
我们公开了能够在严格条件下(例如65℃和0.1xSSC{1xSSC＝0.15M NaCl,0.015MNa3 Citrate pH 7.0})与核酸或其片段、同源物、变体或衍生物杂交的核苷酸序列。
当多核苷酸是双链时，双链体的两条链，无论单独地或组合地，都包含在本公开中。当多核苷酸是单链时，应理解为还包含和公开了该多核苷酸的互补序列。
与本文公开的序列不是100％同源但属于本公开的多核苷酸可通过多种方式获得。本文所述序列的其他变体可以通过例如探查由一系列个体(例如来自不同群体的个体)制备的DNA文库获得。此外，可以获得其他病毒同源物/细菌同源物或细胞同源物，特别是在哺乳动物细胞(例如大鼠、小鼠、牛和灵长类细胞)中发现的细胞同源物，并且此类同源物及其片段通常能够与本文序列表中所示的序列选择性地杂交。此类序列可通过探查由其他动物物种制成的cDNA文库或来自其他动物物种的基因组DNA文库，并在中严格性至高严格性条件下用包含全部或部分公开序列的探针探查此类文库来获得。
本文所述的多核苷酸可用于产生引物(例如PCR引物、用于替代扩增反应的引物)、探针(例如通过常规的使用放射性或非放射性标记物的方法用显示性标记物进行标记)，或者可将所述多核苷酸克隆到载体中。此类引物、探针和其他片段的长度为至少15个核苷酸，如至少20个核苷酸，例如至少25个、30个或40个核苷酸，并且也包括在本文所用的术语多核苷酸中。片段长度可小于500个、200个、100个、50个或20个核苷酸。
可重组、合成或通过本领域技术人员可获得的任何方式来产生多核苷酸如DNA多核苷酸和探针。它们也可通过标准技术进行克隆。
通常，通过合成方式产生引物，包括一次一个核苷酸地逐步制备所需的核酸序列。使用自动化技术实现这一点的技术在本领域现有的。
较长的多核苷酸通常使用重组方法来产生，例如使用PCR(聚合酶链式反应)克隆技术。这涉及制备位于所需克隆的序列区域的侧翼的一对引物(例如约15至30个核苷酸)，使引物与从动物细胞或人细胞获得的mRNA或cDNA接触，在引起所需区域扩增的条件下进行聚合酶链式反应，分离扩增的片段(例如通过在琼脂糖凝胶上纯化反应混合物)并回收扩增的DNA。引物可设计成包含合适的限制性酶识别位点，以使扩增的DNA可以克隆到合适的克隆载体中。
磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3
磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3也被称为GPC3和OCI-5的大鼠同源物。其细胞遗传学位置为Xq26.2，并且其基因组坐标(GRCh38)为X:133,535,744-133,985,615。
磷脂酰肌醇蛋白聚糖家族成员，包括GPC3，是硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，其通过共价糖基磷脂酰肌醇(GPI)连接与质膜的胞质外表面结合。膜附着的磷脂酰肌醇蛋白聚糖的主要功能是调节WNT、Hedgehog、成纤维细胞生长因子和骨形态发生蛋白的信号传导(Filmuset al.,2008)。
为了鉴定Simpson-Golabi-Behmel综合征(SGBS；参见312870)，也称为Simpson畸形综合征(SDYS)的分子基础，Pilia等人(1996)采用了定位克隆方法，使用了X/常染色体易位。他们使用了于1974年保藏在NIGMS保藏中心的细胞系GM0097。该细胞系来源于一名被诊断患有Beckwith-Wiedemann综合征的女性(BWS；130650)，并显示具有de novo X；1易位的核型。该核型表明她是受X连锁SGBS而非BWS的影响，这是由11p上的突变决定的。他们绘制了跨Xq26组装的现有重叠群中的断裂点，并发现了一个被他们称为GPC3的基因，该基因被这种易位打断。该基因在另一名过度生长和X；16易位的女性患者中被打断并且在3个不同的SGBS家系中表现出缺失。2,130-bp的cDNA从序列起始的151bp开始编码580个氨基酸的推导蛋白。GPC3与GPC1基因(600395)有许多共同的特征。
Filmus等人于1988年将大鼠Gpc3分离为在肠中发育调节的转录物，并且Filmus等人于1995年表明被他们称为Oci-5的Gpc3是与GPI连接的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖。
Pilia等人(1996)确定GPC3基因包含8个外显子并且包含约500kb。
通过荧光原位杂交，Shen等人(1997)将GPC3基因定位于人Xq26和大鼠Xq36。
Sood等人(2006)利用DNA微阵列比较了正常人胎盘中的基因表达模式与其他组织中的基因表达模式，发现与其他组织相比，在胎盘的绒毛切片中参与生长和组织重构的数个基因的表达水平相对较高。这些基因包括GPC3、CDKN1C(600856)和IGF2(147470)。在患有Simpson-Golabi-Behmel综合征和Beckwith-Wiedemann综合征(130650)患者中，GPC3和CDKN1C基因分别发生突变，这两种综合征均为胎儿-胎盘过度生长综合征。相比之下，IGF2的缺失与小鼠胎儿生长受限有关。促进和抑制生长的基因相对较高的表达向Sood等人(2006)表明了对控制胎盘发育的途径进行紧密和局部的调节。
Capurro等人(2008)发现，GPC3在SHH(600725)表达小鼠胚胎成纤维细胞和IHH(600726)-表达人胚胎肾细胞的培养基中抑制可溶性hedgehog活性。GPC3与SHH相互作用，但不与SHH受体Patched(ptch 1；601309)相互作用，并且它与Patched竞争与SHH结合。此外，GPC3诱导了SHH内吞作用和降解。与SHH相互作用不需要GPC3的硫酸乙酰肝素链，但需要通过GPI锚定物进行膜附着。
Maurel等人(2013)观察到microRNA-1291(MIR1291；615487)和GPC3的表达都在肝细胞癌中上调。他们发现MIR1291并不直接与GPC3 mRNA结合，而是通过与IRE1A(ERN1；604033)(一种在内质网未折叠蛋白反应中起作用的内切核糖核酸酶)结合并引导其降解来增强GPC3 mRNA的稳定性。在缺少MIR1291的情况下，IRE1A与GPC3的3-prime UTR中的规范位点结合，并切割mRNA，通过未折叠蛋白反应使其降解。与大多数miRNA(通常与靶mRNA的3-prime UTR中的互补序列结合)不同，MIR1291与IRE1A的5-prime UTR中的互补位点结合以引导其降解。
在Pilia等人(1996)的初步研究中，检查了GPC3基因8个外显子中的6个，在6名患有SGBS的患者中的3名中发现了缺失。这表明大规模缺失可能是相当大比例的Simpson-Golabi-Behmel综合征病例的原因。考虑到GPC3基因覆盖的基因组DNA的大段区域(约500kb)，且在其他一些涉及大基因的疾病(例如在杜氏肌营养不良症(310200)患者的抗肌萎缩蛋白基因(300377)中)中发现高比例的缺失，这可能并非意外。Lindsay等人(1997)进行了研究，以确定18个患有SGBS的家系(约占报告病例的一半)中GPC3基因缺失的比例和类型。仅在5个家系中检测到缺失(其中1个先前已有报告)。使用引物对进行PCR分析，扩增了GPC3基因的8个外显子中每个的片段，并在除外显子3以外的所有基因外显子中发现缺失。结果表明，大规模缺失在SGBS可能没有最初想象的那么普遍。外显子4和5缺失的1名患者缺乏特征性面部畸形特征。这增加了GPC3基因缺陷涉及更广泛的过度生长疾病的可能性。
Simpson-Golabi-Behmel综合征，1型
Veugelers等人(2000)鉴定出GPC3外显子7缺失(300037.0002)的1名SGBS病患者。六名SGBS患者在GPC3中显示出点突变：1个移码突变、3个无义突变和1个剪接突变(300037.0004)预测了磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3蛋白的功能丧失。一个错义突变，W296R(300037.0003)改变了在当时鉴定的所有磷脂酰肌醇蛋白聚糖中发现的保守性氨基酸。复制了该突变的GPC3蛋白加工不良，且未能增加硫酸乙酰肝素的细胞表面表达，表明该错义突变也是一种功能丧失性突变。
Sakazume等人(2007)在7名患有SGBS1的日本男孩中鉴定出GPC3基因的突变。其中一个男孩有一个受影响的弟弟。预测所有突变都会导致功能完全丧失。只有1名患者有大的缺失，以及5个无义突变和1个移码突变。没有明显的基因型/表型相关性。
肾母细胞瘤，体细胞
White等人(2002)仅在肾母细胞瘤(194070)组织中鉴定出GPC3基因中的2种非保守的单碱基变化(300037.0006-300037.0007)，表明GPC3在肾母细胞瘤发病中可能具有作用。他们指出在许多患有Simpson-Golabi-Behmel综合征的患者中发现了肾母细胞瘤(Hughes-Benzie et al.,1996；Xuan et al.,1999)。
Capurro等人(2008)指出截至胚胎第12.5天，Gpc3-null小鼠胚胎表现出显著的过度生长。他们发现通过升高的Patched和Gli1(165220)mRNA水平进行测量，第10.5天和第13.5天之间的胚胎显示出增加的hedgehog信号传导。
以上文本改编自磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3的OMIM条目(https://www.omim.org/entry/300037)、编著者Patricia A.Hartz、Cassandra l.nifta fin、Victor A.McKusick、Anne M.Stumpf、Ada Hamosh、George E.Tiller和Michael J.Wright。
GPC-3多肽和核酸
GPC-3多肽同源物、变体、衍生物和片段的定义可以与前面段落所述的相似。
在上下文允许的情况下，对GPC-3多肽的引用应包括对GPC-3多肽的同源物、变体、衍生物或片段的引用。类似地，在上下文允许的情况下，对GPC-3核酸的引用应包括对GPC-3核酸同源物、变体、衍生物或片段的引用。
磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3核酸的一个实例是GenBank登录号为NM_004484.4的序列。
磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3多肽的一个例子是具有GenBank登录号NP_004475.1的序列。
抗GPC-3抗体的产生
抗GPC-3抗体可以通过本领域普通技术人员熟知的重组DNA方法或合成肽化学方法产生
例如，抗GPC-3抗体可以通过本领域熟知的技术合成，例如“Solid Phase PeptideSynthesis:A Practical Approach”，E.Atherton and R.C.Sheppard,IRL Press,OxfordEngland。类似地，可以合成多个片段，随后将这些片段连接在一起形成更大的片段。这些合成的肽片段也可以通过在特定位置进行氨基酸置换来制备，以测试体外和体内的活性。
可以在标准微量化学设备中合成抗GPC-3抗体，并用HPLC和质谱分析检查纯度。肽合成、HPLC纯化和质谱分析的方法是本领域技术人员公知的。
抗GPC-3抗体也可以在体外和体内条件下在转化的宿主细胞中表达，所述转化的宿主细胞中已掺入本文所述的DNA序列(如可变序列)或其等位基因变体，并且其可用于预防和/或治疗癌症，例如肝细胞癌。
术语“载体”包括表达载体和转化载体。术语“表达载体”是指能够在体内或体外表达的构建体。术语“转化载体”是指能够从一个物种转移到另一个物种的构建体。
可以用于表达的载体包括重组病毒载体，特别是重组逆转录病毒载体(RRV)，如包括逆转录病毒载体组合的慢病毒载体、腺病毒载体。
术语“重组逆转录病毒载体”(RRV)是指具有足够的逆转录病毒遗传信息的载体，以允许在包装组分的存在下将RNA基因组包装成能够感染靶细胞的病毒颗粒。靶细胞的感染包括逆转录和整合到靶细胞基因组中。RRV携带将通过载体递送至靶细胞的非病毒编码序列。RRV病毒不能独立复制以在最终靶细胞内产生感染性逆转录病毒颗粒。通常，RRV缺乏功能性gag pol和/或env基因和/或复制必需的其他基因。可以使用的载体包括重组痘病毒载体，例如禽痘病毒(FPV)、昆虫痘病毒、痘苗病毒(例如NYVAC)、金丝雀痘病毒、MVA、或其他非复制型病毒载体系统，例如在WO9530018中描述的那些。
痘病毒可被工程化用于重组基因表达和在双重免疫治疗方法中用作重组活疫苗。使用活减毒病毒(如病毒)作为递送媒介物(vehicle)和/或基于载体的候选疫苗的主要理由源于它们引发细胞介导的免疫应答的能力。如上所述，由于其结构蛋白的免疫原性，病毒载体能够用作递送媒介物和基于载体的候选疫苗，所述结构蛋白作为佐剂以增强免疫应答，因此使得目的核苷酸序列(NOI)如编码抗GPC-3抗体的核苷酸序列更具免疫原性。
痘病毒疫苗接种策略使用重组技术将NOI引入痘病毒基因组。如果NOI整合在病毒DNA中对病毒生命周期非必需的位点，则新产生的重组痘病毒可能具有感染性，即感染外源细胞并从而表达整合的NOI。以这种方式制备的重组痘病毒可用作预防和/或治疗疾病的活疫苗。
痘病毒载体递送系统的其他要求包括良好的免疫原性和安全性。MVA是一种复制受损的痘苗病毒株，具有良好的安全性记录。MVA在大多数细胞类型和正常人类组织中不复制。在少数转化的细胞类型如BHK21细胞中观察到MVA的有限复制。Carroll等人(1997vacine15:387-394)已经表明，重组MVA在产生保护性CD8+T细胞应答方面与传统重组痘苗病毒载体一样好，并且是更常用的可复制的痘苗病毒的有效替代物。源自MVA的痘苗病毒株，或独立开发的具有MVA特征的病毒株，使得MVA特别适合用于疫苗，也适合用作递送载体。
感兴趣的并且需要表达的核苷酸序列可以与转录单元可操作地连接。本文所述的术语“转录单位”是含有编码序列的核酸区域以及用于实现独立于任何其他编码序列的这些编码序列表达的信号。因此，每个转录单元通常至少包含启动子、任选的增强子和聚腺苷酸化信号。术语“启动子”以本领域的正常意义来使用，例如RNA聚合酶结合位点。启动子可以包含增强子元件。术语“增强子”包括与转录起始复合物的其他蛋白质组分结合并因此促进由其相关启动子指导的转录起始的DNA序列。术语“细胞”包括任何合适的生物体。所述细胞可以包括哺乳动物细胞，例如人细胞。
术语“转化细胞”是指具有修饰的遗传结构的细胞。例如，如本文所述，当将载体(如表达载体)导入细胞时，细胞具有修饰的遗传结构。术语“生物体”包括任何合适的生物体。生物体可以包括哺乳动物，例如人。
本文中术语“转基因生物”是指包含修饰的遗传结构的生物体。例如，如果将载体(如表达载体)导入生物体，则生物体可以具有修饰的遗传结构。
抗体表达
我们还描述了一种方法，包括用一种核苷酸序列或用本文中所述的核苷酸序列转化宿主细胞，所述核苷酸序列包括：例如5C4、4H1、1D2、1C4、2B5、1F1、1H1、4A5、1D8、1D3、2F1、3C6、3D12、3A9、1F4、1H10、3C12、4G11、4A12、1A12、3G12、4F9、4G4和1E1的可变区、抗体序列或人源化抗体序列。
我们还提供了一种方法，包括在适合表达由所述核苷酸序列编码的抗GPC-3抗体的条件下培养转化的宿主细胞——所述细胞已经用一种核苷酸序列或所述核苷酸序列进行了转化。
我们还提供了一种方法，包括在适合表达由所述核苷酸序列编码的抗-GPC-3抗体的条件下培养转化的宿主细胞——所述细胞已经用一种核苷酸序列或所述核苷酸序列进行了转化；然后从转化的宿主细胞培养物中回收所述抗GPC-3抗体。
因此，编码抗GPC-3抗体的编码核苷酸序列、融合蛋白或其功能等同物可以用于产生指导抗GPC-3抗体在合适的宿主细胞中表达的重组DNA分子。
例如，抗GPC-3抗体可以在重组E.coli(大肠杆菌)、酵母或哺乳动物表达系统中产生，并通过柱色谱纯化。
在某些情况下，使用抗体片段而不是完整抗体具有优势。碎片的较小尺寸允许快速清除，并可以得到改善的病毒活性中和、感染、进展等。Fab、Fv、ScFv抗体片段均可在E.coli中表达和分泌，因此能够大量产生此类片段。
编码抗GPC-3抗体的核苷酸序列可以与启动子序列可操作地连接，该启动子序列能够指导编码抗GPC-3抗体的核苷酸序列在合适的宿主细胞中的表达。当插入宿主细胞时，转化的宿主细胞可在合适的条件下培养直至得到足够水平的抗GPC-3抗体，随后可以溶解细胞并分离抗GPC-3抗体。
用编码抗GPC-3抗体的核苷酸序列转化的宿主细胞可以在适合表达和从细胞培养物中回收抗GPC-3抗体的条件下培养。由重组细胞产生的蛋白质可以被分泌或可以包含在细胞内，这取决于所用的序列和/或载体。如本领域技术人员所理解的，含有编码抗GPC-3抗体的核苷酸序列的表达载体可设计有信号序列，该信号序列指导编码抗GPC-3抗体的核苷酸序列通过特定的原核细胞膜或真核细胞膜分泌。其他重组构建体可将编码抗GPC-3抗体的核苷酸序列与编码多肽结构域的核苷酸序列结合，这有助于可溶性蛋白质的纯化(KrollDJ et al(1993)DNA Cell Biol 12:441-5 3’，也参见下文关于含有融合蛋白的载体的讨论)。
抗GPC-3抗体也可表达为重组蛋白，其添加有一个或多个额外的多肽结构域以促进蛋白纯化。此类纯化促进结构域包括但不限于金属螯合肽，例如允许在固定化金属上纯化的组氨酸-色氨酸模块(Porath J(1992)Protein Expr Purif 3-26328 1)，允许在固定化免疫球蛋白上纯化的蛋白A结构域，以及FLAGS延伸/亲和纯化系统中使用的结构域(Immunex Corp,Seattle,WA)。在纯化结构域和抗GPC-3抗体之间包含可切割的接头序列，例如XA因子(Factor XA)或肠激酶(Invitrogen,San Diego,CA)，有助于纯化。
出于多种原因，本文所述的核苷酸序列可被工程化以改变抗GPC-3抗体编码序列，包括但不限于修饰基因产物的克隆、加工和/或表达的改变。例如，可使用本领域熟知的技术引入突变，例如定点诱变以插入新的限制性位点、改变糖基化模式或改变密码子偏好。
在另一个实施方案中，编码天然的、修饰的或重组的抗GPC-3抗体的一种核苷酸序列或者所述核苷酸序列可以与异源序列连接以编码融合蛋白。例如，包含抗GPC-3抗体或其酶活性片段或衍生物的融合蛋白与亲和标签连接，所述亲和标签为例如谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、生物素、His6、ac-myc标签(参见Emrich et al 1993BiocemBiophys Res Commun197(1):21220)、血凝素(HA)(如Wilson et al 1984Cell 37 767中所述)或FLAG表位(Fordetal 1991Protein Expr Purif Apr；2(2):95-107)。
融合的重组蛋白可包含抗原性共蛋白(coprotein)，如GST、β-半乳糖苷酶或来自Haemophillls influenzae(流感嗜血杆菌)的脂蛋白D，抗原性共蛋白是相对较大的共蛋白，可溶解并促进其产生和纯化。或者，融合蛋白可包含载剂蛋白，如牛血清白蛋白(BSA)或钥孔血蓝蛋白(KLH)。在某些实施方案中，标记序列可包含6-组氨酸肽，如pQE载体(QiagenInc)中提供的和Gentz等人(1989PNAS 86:821-824)中所述的。此类融合蛋白易于在酵母培养物中表达(如Mitchell et al 1993Yeast 5:715-723中所述)，并易于通过亲和色谱纯化。还可以工程化融合蛋白以包含位于编码抗GPC-3抗体的核苷酸序列和异源蛋白序列之间的切割位点，从而使抗GPC-3抗体可从异源部分切割并纯化。在另一个实施方案中，可以使用整个结合的融合蛋白进行靶蛋白的测定。或者，共蛋白可以作为提供免疫系统的普遍刺激的意义上的佐剂。共蛋白可以连接到第一个蛋白的氨基末端或羧基末端。
尽管标记基因表达的存在/不存在表明也存在抗GPC-3抗体的核苷酸序列，但应确认其存在和表达。例如，如果将编码抗GPC-3抗体的核苷酸序列插入标记基因序列中，则可以通过缺少标记基因功能来鉴定含有抗GPC-3抗体编码区的重组细胞。或者，可以将标记基因与编码核苷酸序列的抗GPC-3抗体串联放置在单个启动子的控制下。
响应于诱导或选择的标记基因的表达通常也表明抗GPC-3抗体的表达。
定量特定分子表达的其他方法包括放射性标记(Melby PC et al 1993J ImmunolMethods 159:235-44)核苷酸或生物素化(Duplaa C et al 1993Anal Biochem 229-36)核苷酸，对照核酸的共扩增，以及将实验结果插入到其上的标准曲线法。
多个样品的定量可通过以ELISA形式进行检测来加速，其中目标抗GPC-3抗体以多种稀释度存在，并且分光光度法或量热法响应给出快速定量。
可制备或使用的改变的抗GPC-3抗体核苷酸序列，其包括不同核苷酸残基的缺失、插入或置换，导致核苷酸序列编码相同或功能等效的抗GPC-3抗体。举例来说，表达的抗GPC-3抗体也可具有氨基酸残基的缺失、插入或置换，其产生沉默变化(silent change)从而产生功能等效的抗GPC-3抗体。可根据残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性的相似性进行有意的氨基酸置换，只要保留抗GPC-3抗体的结合亲和力即可。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；以及具有类似亲水性值的不带电荷的极性头基的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。
双特异性抗体
我们公开了能够结合GPC-3和另一种抗原的双特异性抗体或双特异性抗原结合片段。
第二抗原可以包括T细胞表面抗原。T细胞表面抗原的一个实例是CD蛋白，如CD3(GenBank登录号：NM_000733.4)。
我们特别公开了一种抗GPC-3双特异性T细胞接合抗体，其能够特异性识别并结合细胞表面上的GPC-3和人CD3分子。
此类双特异性抗体可以通过用能够结合T细胞表面抗原(如CD3)的序列替换抗体一个臂的Fab区来构建。此类T细胞表面抗原结合序列可以例如包含针对T细胞表面抗原的已知抗体的VH和VL区域。例如，它们可以抗CD3 scFv片段的形式提供。
构建能够结合CD3的双特异性抗体的详细方案列于实施例中。
双特异性抗体或双特异性抗原结合片段可能能够活化初始T细胞，诱导细胞因子(如干扰素-γ和IL-2)的释放和/或诱导GPC-3表达细胞的死亡。
嵌合抗原受体(CAR)
嵌合抗原受体(CAR)也被称为嵌合T细胞受体、人工T细胞受体和嵌合免疫受体，是将任意特异性移植到免疫效应细胞上的工程化受体。
在典型的CAR中，单克隆抗体的特异性被移植到T细胞上。可以使用例如逆转录病毒载体将编码CAR的核酸转移至T细胞。这样就可以产生大量的癌特异性T细胞用于过继细胞转移。该方法的I期临床研究显示出疗效。
CAR的靶抗原结合结构域通常通过间隔结构域和跨膜结构域与信号传导胞内域(endodomain)融合。当CAR与靶抗原结合时，会导致向于其上表达该CAR的T细胞传递活化信号。
我们公开了一种CAR，其包含基于抗体5C4、4H1、1D2、1C4、2B5、1F1、1H1、4A5、1D8、1D3、2F1、3C6、3D12、3A9、1F4、1H10、3C12、4G11、4A12、1A12、3G12、4F9、4G4或1E1中任一种的磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3结合域。
所述CAR可以包含磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3结合结构域，其包含
(a)重链可变区(VH)，其具有如本文所述的任何上述抗体的互补决定区(CDR)；
(b)轻链可变区(VL)，其具有如本文所述的任何上述抗体的CDR。
可以在所述CDR或每个CDR中引入一个或多个突变(置换、添加或缺失)，而不会对磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3结合活性产生负面影响。例如，每个CDR可以有一个、两个或三个氨基酸突变。
CAR可以包含以下VH序列之一：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ IDNO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ IDNO:31、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:41、SEQ IDNO:43、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:47.
CAR可以包含以下VL序列之一：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ IDNO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42、SEQ IDNO:44、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48.
CAR可以包含具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％的序列同一性的任何这些序列的变体，前提是所述变体序列保留了结合磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3的能力(当与互补的VL结构域或VH结构域结合时，如果合适)。
两个多肽序列之间的百分比同一性可通过例如BLAST的程序很容易地确定，BLAST在http://blast.ncbi.nlm.nih.gov上免费提供。
跨膜结构域
CAR还可以包括横跨膜的跨膜结构域。它可以包含疏水性α螺旋。跨膜结构域可以来源于CD28，其提供了良好的受体稳定性。
胞内T细胞信号传导结构域(胞内域)
胞内域是CAR的信号传递部分。在识别抗原后，受体聚集并且将信号传递给细胞。最常用的胞内域成分是含有3个ITAM的CD3-ζ。这在抗原结合后向T细胞传递活化信号。CD3-ζ可能无法提供完全有效的活化信号，并且可能需要额外的共刺激信号。例如，嵌合的CD28和OX40可以与CD3-ζ一起使用以传递增殖/存活信号，或所有这三者可一起使用。
CAR的胞内域可以包括CD28胞内域以及OX40和CD3-ζ胞内域。
变体序列可以与此类胞内域具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％的序列同一性，前提是该序列提供有效的跨膜结构域/胞内T细胞信号传导结构域。
信号肽
CAR可以包含信号肽，使得当CAR在细胞(如T细胞)内表达时，新生蛋白被导向内质网，随后导向细胞表面并在那里表达。
信号肽的核心可以含有一长段疏水性氨基酸，这些氨基酸有形成单α-螺旋的趋势。信号肽可以一段短的带正电荷的氨基酸开始，这有助于在易位过程中加强多肽的正确拓扑结构。在信号肽的末端，通常有一段被信号肽酶识别和切割的氨基酸。信号肽酶可以在易位过程中或完成易位过程后进行切割，以产生游离信号肽和成熟蛋白质。然后由特异性蛋白酶消化游离信号肽。
信号肽可位于分子的氨基末端。
CAR可具有以下通式:
信号肽-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3结合结构域-间隔结构域-跨膜结构域-胞内T细胞信号传导结构域。
间隔区
CAR可以包含间隔序列，以连接磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3结合结构域和跨膜结构域，并在空间上将磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3结合结构域与胞内域分开。柔性间隔区使得磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3结合结构域能够在不同方向定向以实现磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3结合。
间隔序列可以例如包括IgG1 Fc区、IgG1铰链或CD8柄部、或它们的组合。间隔区可以替代地包含具有与IgG1 Fc区、IgG1铰链或CD8柄部相似的长度和/或结构域间隔性质的替代序列。
可以改变人IgG1间隔区以去除Fc结合基序。
下面给出了这些间隔区的氨基酸序列实例：人IgG1的铰链-CH2CH3、人CD8柄部、人IgG1铰链、IgG1铰链-Fc和IgG1铰链-Fc被修饰以去除Fc受体识别基序。
诊断试剂盒
我们还提供了用于检测个体中的癌症(包括肝细胞癌)或个体中对癌症的易感性的诊断试剂盒。
诊断试剂盒可包括通过本文所述的任何方式检测个体中GPC-3的表达、量或活性的工具。因此，诊断试剂盒可包含以下的任何一种或多种：抗GPC-3抗体，能够与单克隆抗体5C4、4H1、1D2、1C4、2B5、1F1、1H1、4A5、1D8、1D3、2F1、3C6、3D12、3A9、1F4、1H10、3C12、4G11、4A12、1A12、3G12、4F9、4G4或1E1结合相同表位的抗体，单克隆抗体5C4、4H1、1D2、1C4、2B5、1F1、1H1、4A5、1D8、1D3、2F1、3C6、3D12、3A9、1F4、1H10、3C12、4G11、4A12、1A12、3G12、4F9、4G4或1E1，来自的5C4、4H1、1D2、1C4、2B5、1F1、1H1、4A5、1D8、1D3、2F1、3C6、3D12、3A9、1F4、1H10、3C12、4G11、4A12、1A12、3G12、4F9、4G4或1E1的Fab，来自的5C4、4H1、1D2、1C4、2B5、1F1、1H1、4A5、1D8、1D3、2F1、3C6、3D12、3A9、1F4、1H10、3C12、4G11、4A12、1A12、3G12、4F9、4G4或1E1的scFv，包含抗体5C4、4H1、1D2、1C4、2B5、1F1、1H1、4A5、1D8、1D3、2F1、3C6、3D12、3A9、1F4、1H10、3C12、4G11、4A12、1A12、3G12、4F9、4G4或1E1的可变区的抗体，或人源化单克隆抗体5C4、4H1、1D2、1C4、2B5、1F1、1H1、4A5、1D8、1D3、2F1、3C6、3D12、3A9、1F4、1H10、3C12、4G11、4A12、1A12、3G12、4F9、4G4或1E1等
诊断试剂盒可包括使用说明书或其他标记。诊断试剂盒还可包括用于治疗或预防癌症(例如肝细胞癌)的工具，例如本文中所述的任何组合物，或本领域已知的用于治疗癌症(例如肝细胞癌)的任何工具。特别地，诊断试剂盒可包括例如通过筛选获得的所述的抗GPC-3抗体。
肝细胞癌/肝癌
本文中公开的抗GPC-3抗体和结合剂可用于治疗、预防或缓解癌症例如肝癌。
肝癌(肝细胞癌，HCC)是全球第五大最常见恶性肿瘤，也是全球癌症死亡率第三大原因(Ferley J,Bray F.Pisani P,Parkin DM.GLOBOCAN 2002:Cancer Incidence,Mortality and Prevalence Worldwide.IARC CancerBase No5 version 20.IARCPress,Lyon,France；2004)。
肝细胞癌(HCC)已取代胃癌成为新加坡男性中排名第三的癌症，占1998-2002年诊断的所有癌症的8.1％(Seow A,K.W.,Chia KS,Shi LM,Lee HP,Shanmugaratnam K(2004).“Trends in Cancer Incidence in Singapore 1968-2002.”Singapore Cancer Registry(Report no.6))。在亚洲，仅中国每年就报告约250,000例新病例，HCC是地方性流行病。在全球范围内，它是导致癌症死亡的主要原因(Bosch,F.X.,J.Ribes,et al.(2005).“Epidemiology of hepatocellular carcinoma.”Clin Liver Dis 9(2):191-211,v.)。即使在HCC患病率较低的美国和欧洲等国家，HCC的发病率也在上升(El-Serag,H.B.andA.C.Mason(1999).“Rising incidence of hepatocellular carcinoma in the UnitedStates.”N Engl J Med 340(10):745-50)。
超过90％的HCC被诊断为晚期，并且通常与肝硬化有关。HCC通常表现出高度侵袭性的临床行为，大多数患者在诊断后12个月内死亡(El-Serag HB.Hepatocellularcarcinoma:an epidemiologic view.J Clin Gastroenterol 2002；35(5Suppl 2):S72-8)。
患者通常处于无法选择手术的疾病晚期；在进行手术切除的病例中，两年的复发率仍高达50％(Nagasue N,Kohno H,Chang YC,Taniura H,Yamanoi A,Uchida M,etal.Liver resection for hepatocellular carcinoma.Results of 229consecutivepatients during 11years.Ann Surg1993；217:375-84；Yamamoto J,Kosuge T,TakayamaT,Shimada K,Yamasaki S,Ozaki H,et al.Recurrence of hepatocellular carcinomaafter surgery.Br J Surg 1996；83:1219-22)。
HCC是一种化疗相对难治的癌症。没有特别有效的单药化学疗法或多药化学疗法。阿霉素(Doxorubicin)是转移性HCC最常用的化疗药物，反应率低于20％(Johnson,P.J.,R.Williams,et al.(1978).“Induction of remission in hepatocellular carcinomawith doxorubicin.”Lancet 1(8072):1006-9)并且在生存期优势方面无显著的统计学意义。使用3种药物联合的化学疗法和干扰素的试验的最近结果显示反应率为20.9％，且中位生存期为8.67个月(Yeo,W.,T.S.Mok,et al.(2005)，“A randomized phase III study ofdoxorubicin versus cisplatin/interferon alpha-2b/doxorubicin/fluorouracil(PIAF)combination chemotherapy for unresectable hepatocellular carcinoma.”J Natl Cancer Inst 97(20):1532-8)。与仅使用阿霉素相比，该方案未显示出更好的生存期，且与更多的毒性相关。
随机临床试验的近期结果显示，标准化疗方案在延长HCC患者生存期的效果微乎其微(Yeo W,Mok TS,Zee B,Leung TW,Lai PB,Lau WY,et al.Arandomized phase IIIstudy of doxorubicin versus cisplatin/interferon alpha-2b/doxorubicin/fluorouracil(PIAF)combination chemotherapy for unresectable hepatocellularcarcinoma.J Natl Cancer Inst 2005；97:1532-38)。
除肿瘤复发和转移外，腹膜腹水是晚期HCC患者发病的另一个重要原因，通常由肝功能受损、门静脉阻塞和内皮细胞通透性增加引起。
预防和治疗方法
单克隆抗体5C4、4H1、1D2、1C4、2B5、1F1、1H1、4A5、1D8、1D3、2F1、3C6、3D12、3A9、1F4、1H10、3C12、4G11、4A12、1A12、3G12、4F9、4G4和1E1可用于治疗人或其他动物的疾病。
我们在实施例中表明这种抗GPC-3抗体具有抗肿瘤活性。具体而言，实施例表明抗GPC-3抗体可以用于治疗和预防肝细胞癌。
我们公开了治疗癌症(包括肝细胞癌)的方法。防止(即预防)癌症如肝细胞癌的方法也适于采用相同或相似的方法。
因此，我们提供了抗GPC-3抗体在治疗或预防增殖性疾病中的用途。增殖性疾病可以包括癌症。抗GPC-3抗体可以用作治疗癌症(如肝细胞癌)的药物或疗法。它们可以用于预防这种感染或疾病的进展。
一般而言，我们的方法涉及通过调节(如下调)GPC-3的表达、量或活性来操纵细胞。治疗通常可以包括使肿瘤细胞或疑似肿瘤细胞的细胞与抗GPC-3抗体接触。所述方法可以涉及使患者暴露于本文所述的抗GPC-3抗体或其变体。
可以暴露于或另外暴露于抗癌剂，例如已知在预防或治疗癌症(例如肝癌)中具有效果的抗体或其他分子。在这种情况下，所述细胞可以暴露于抗体和该抗癌剂两者，或依次暴露于单独的抗体和该抗癌剂。暴露可以重复多次。可以使用任何量或相对量的抗GPC-3抗体和其他剂抗体的任何组合以任何的暴露时间。
因此，我们提供了如上所述的抗GPC-3抗体和抗癌剂的组合在治疗癌症(如肝癌)中的用途。
细胞可以是单个细胞，或可以是细胞团。所述细胞可在生物体的体内。所述生物体可以是已知患有癌症的生物体，或者可以是疑似患有癌症的生物体，或者可以是易患癌症的生物体。所述治疗可包括对所述生物体施用所述一种或多种抗体。如上所述，可以施用单个抗体，或者可以施用抗GPC-3抗体和抗癌剂的组合。如上所述，施用可以是同时施用或依次施用。因此，所述治疗可包括将抗GPC-3抗体与抗癌剂同时或依次施用于所述个体。
为此，可指定许多反映治疗或预防或患者健康进展的标准。对于癌症病例的有用标准可包括本领域已知的TNM分期、Okuda系统、CLIP评分、BCLC分期。例如，测量肿瘤大小和肝硬化的严重程度，例如通过测量腹水量、血清白蛋白和胆红素水平，可以用于评估治疗。
肝癌的治疗详细描述于Liu et al(2015),Cold Spring Harb PerspectMed.2015Sep；5(9)。
因此，作为实例，如通过合适的检测或测试所测量的，经治疗的个体可显示出这类症状的减少。与未经治疗的个体相比，经治疗的个体可以显示出例如一种或多种症状的1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更多的减少。
例如，如果与疾病相关的病症相对于对照被显著抑制(即50％或更多)，则患者疾病可被定义为被“治疗”。所述抑制可以达到相对于对照的至少75％，如达到相对于对照的90％、95％或100％。术语“治疗”是指还包括癌症如肝癌的预防或缓解。
涉及使用抗GPC-3抗体的抗体治疗方法可与用于治疗此类疾病的其他方法(包括基于常规药物的方法)相结合。
治疗
治疗的主要方式是支持性疗法。鼓励患者持续口服，尤其是口服液体。如果患者无法维持口服，则可能需要补充静脉输液，以防止脱水和显著的血液浓缩。如果血小板水平显著下降，则表明需要输注血小板。
药物组合物
如本文所公开的，抗GPC-3抗体可以用于治疗或预防癌症例如肝癌。
抗GPC-3抗体可通过多种途径施用，包括肠内、胃肠外和局部的施用途径。例如，合适的施用方式包括口服、皮下、经皮、经粘膜、离子电渗、静脉内、肌肉内、腹膜内、鼻内、硬膜下、直肠等。
根据其他实施方案，提供了包含抗GPC-3抗体以及药学上可接受的载剂或赋形剂的组合物，用于治疗或预防癌症如肝癌。
合适的药学上可接受的赋形剂包括加工剂和药物递送改性剂和增强剂，例如磷酸钙、硬脂酸镁、滑石、单糖、二糖、淀粉、明胶、纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、葡萄糖、羟丙基-p-环糊精、聚乙烯吡咯烷酮、低熔点蜡、离子交换树脂等，以及其中任意两种或多种的组合。其他合适的药学上可接受的赋形剂参见“Remington’s PharmaceuticalSciences,”Mack Pub.Co.,New Jersey(1991)，通过引入纳入本文。
含有抗GPC-3抗体的药物组合物可以是适用于预期施用方法的任何形式，包括例如溶液、混悬剂或乳剂。液体载剂通常用于制备溶液、混悬剂和乳剂。预计在实践中使用的液体载剂包括例如水、盐水、药学上可接受的一种有机溶剂或多种有机溶剂、药学上可接受的油或脂肪等，以及它们中的两种或多种的混合物。所述液体载剂可含有其他合适的药学上可接受的添加剂，例如增溶剂、乳化剂、营养物、缓冲剂、防腐剂、助悬剂、增稠剂、粘度调节剂、稳定剂等。合适的有机溶剂包括，例如一元醇，例如乙醇，和多元醇，例如乙二醇。
合适的油包括例如大豆油、椰子油、橄榄油、红花油、棉籽油等。对于肠胃外施用，载剂也可以是油性酯，如油酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯等。组合物还可以是微粒、微胶囊、脂质体包封物等的形式，以及其中任意两种或多种的组合。
抗GPC-3抗体可以根据需要含有常规无毒药学上可接受的载剂、佐剂和媒介物的剂量单位制剂经口服、经肠胃外、经舌下、通过吸入喷雾、经直肠或局部施用。局部施用也可以涉及经皮施用的使用，如经皮贴剂或离子电渗装置。本文所用的术语肠胃外包括皮下注射，静脉、肌肉、胸骨内注射或输注技术。
可注射制剂，例如无菌可注射水性或油性混悬剂，可根据已知技术使用合适的分散剂或湿润剂和助悬剂进行配制。无菌注射制剂也可以是在无毒胃肠外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌注射溶液或混悬剂，例如1,3-丙二醇溶液。可以采用的可接受媒介物和溶剂为水、林格氏液和等渗氯化钠溶液。此外，无菌的不挥发油通常用作溶剂或助悬介质。为此，可以使用任何温和的不挥发油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。此外，发现脂肪酸(如油酸)可用于制备注射剂。
用于直肠施用药物的栓剂可以通过将药物与合适的无刺激性赋形剂(如可可脂和聚乙二醇)混合来制备，所述赋形剂在常温下为固体，但在直肠温度下为液体，因此将在直肠中融化并释放药物。
口服施用的固体剂型可以包括胶囊、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在此类固体剂型中，活性化合物可与至少一种惰性稀释剂(如蔗糖、乳糖或淀粉)混合。按照常规，这种剂型还可以包括除惰性稀释剂之外的其他物质，例如润滑剂如硬脂酸镁。在胶囊、片剂和丸剂的情况下，所述剂型还可包含缓冲剂。片剂和丸剂还可以用肠溶衣来制备。
口服施用的液体剂型可以包括含有本领域常用的惰性稀释剂(如水)的药学上可接受的乳剂、溶液、混悬剂、糖浆和酏剂。此类组合物还可以包含佐剂，如润湿剂、乳化剂和混悬剂、环糊精以及甜味剂、调味剂和香料剂。
根据其他实施方案，我们提供了抑制人或动物受试者中GPC-3的任何活性的方法，所述方法包括向受试者施用有效抑制受试者中相关活性的量的抗GPC-3抗体(或包含这种化合物的组合物)。其他实施方案提供治疗人或动物受试者的癌症如肝癌的方法，包括向所述细胞或向所述人或动物受试者施用有效抑制所述细胞或受试者中的GPC-3活性的量的如本文所述的化合物或组合物。受试者可以是人或非人动物受试者。蛋白活性的抑制包括与对照相比或与预期蛋白活性相比对相关蛋白活性的可检测压制。
抗GPC-3抗体的有效量通常包括通过本文所述的任何测定、通过本领域普通技术人员已知的其他测定、或通过检测患有癌症如肝癌的受试者中症状的缓解而可检测地足以抑制相关蛋白活性的任何量。
对受试者的成功治疗可使得患有医学疾病或生物学疾病的受试者的症状减轻或缓解，例如阻止所述疾病的进一步发展或预防所述疾病。因此，例如，治疗癌症如肝癌可使得如上所述的症状减轻。
可以与载剂材料组合以产生单一剂型的活性成分的量将根据所治疗的宿主和具体的施用方式而变化。然而，应当理解，任何具体患者的特定剂量水平将取决于多种因素，包括所采用的特定化合物的活性、年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、施用时间、施用途径、排泄率、药物组合以及接受治疗的具体疾病的严重程度。给定情况下的治疗有效量可以通过常规实验容易地确定，并且在普通临床医生的技能和判断范围内。
治疗有效剂量通常为约10μg/kg/天至100mg/kg/天的抗GPC-3抗体，例如约25μg/kg/天至约20mg/kg/天或约50μg/kg/天至约2mg/kg/天的抗GPC-3抗体，可以一剂或多剂施用。
抗GPC-3抗体也可以脂质体的形式施用。如本领域已知的，脂质体通常源自磷脂或其他脂质物质。脂质体由分散在水介质中的单层或多层水合液晶形成。可以使用能够形成脂质体的任何无毒、生理上可接受的且可代谢的脂质。除了化合物之外，脂质体形式的本发明组合物可以含有稳定剂、防腐剂、赋形剂等。可以使用的脂质包括天然和合成的磷脂和磷脂酰胆碱(卵磷脂)。形成脂质体的方法是本领域已知的。参见，例如Prescott,Ed.,Methodsin Cell Biology,Volume XIV,Academic Press,New York,N.W.,p.33et seq(1976)。
虽然抗GPC-3抗体可以作为唯一的活性药剂施用，但它们也可以与一种或多种用于治疗疾病的其他试剂组合使用。与抗GPC-3抗体组合用于治疗癌症如肝癌的代表性试剂包括，例如索拉非尼(Sorafenib)、乐伐替尼(Lenvatinib)和瑞戈非尼(Regorafenib)。
当另外的活性剂与抗GPC-3抗体组合使用时，另外的活性剂通常可以采用PHYSICIANS’DESK REFERENCE(PDR)第53版(1999)(该文献通过引入纳入本文)中所示的治疗量或本领域普通技术人员已知的治疗有效量使用。
抗GPC-3抗体和其他治疗活性剂可按推荐的最大临床剂量或较低剂量施用。组合物中活性抗GPC-3抗体的剂量水平可根据施用途径、疾病严重程度和患者反应而改变以获得所需的治疗反应。所述组合可以分开的组合物施用或以含有两种试剂的单一剂型施用。当作为组合施用时，治疗剂可配制成在相同时间或不同时间施用的分开的组合物，或者治疗剂可作为单一组合物施用。
生物利用度
在一些实施方案中，本文公开的化合物(和组合)是口服生物可利用的。口服生物可利用度是指口服药物到达体循环的比例。决定药物口服生物可利用度的因素为溶出度、膜通透性和代谢稳定性。通常，首先使用体外技术然后使用体内技术的筛选级联来确定口服生物可利用度。
溶出度，可以于适当pH进行体外溶解度实验以模拟GIT来预测胃肠道(GIT)含水内容物对药物的溶解。在一些实施方案中，抗GPC-3抗体可以具有50mg/ml的最小溶解度。可通过本领域已知的标准程序(如Adv.Drug Deliv.Rev.23,3-25,1997中所述)确定溶解度。
膜通透性是指所述化合物通过GIT的细胞的通道。亲脂性是预测膜通透性的一个关键性质，并通过使用有机溶剂和缓冲液的体外Log D7.4测量来确定。抗GPC-3抗体的LogD7.4可以为-2至+4或-1至+2。可通过本领域已知的标准程序(如J.Pharm.Pharmacol.1990,42:144中所述)来测定log D。
在存在外排性转运体(如p-糖蛋白)的情况下，细胞单层检测(如CaCO2)大幅增加了对有利的膜通透性的预测，即所谓的caco-2通量。抗GPC-3抗体的caco-2通量可以为大于2×10-6cms-1，例如大于5×10-6cms-1。所述caco通量值可以通过本领域已知的标准程序(如J.Pharm.Sci,1990,79,595-600中所述)测定。
代谢稳定性是指GIT或肝脏在吸收过程中代谢化合物的能力：首过效应。微粒体、肝细胞等检测系统预测了代谢可能性。在一些实施方案中，实施例的化合物可在检测系统中显示出与小于0.5的肝提取物相称的代谢稳定性。检测系统和数据处理的实例描述于Curr.Opin.Drug Disc.Devel.,201,4,36-44,Drug Met.Disp.,2000,28,1518-1523中。
由于上述过程的相互作用，可以通过动物的体内实验获得药物在人的口服生物可利用度的进一步支持。在这些研究中，绝对的生物可利用度是通过口服途径单独施用或混合物形式施用所述化合物来测定的。对于绝对测定(吸收％)也采用静脉途径。动物口服的生物可利用度评估的实例可在Drug Met.Disp.,2001,29,82-87；J.Med Chem.,1997,40,827-829,Drug Met.Disp.,1999,27,221-226中找到。
本文所用的术语“药学上可接受的载剂”通常是指不能与活性成分反应的有机材料或无机材料。载剂包括但不限于糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；粉状黄芪胶(tragancanth)；麦芽；明胶；滑石；硬脂酸；硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，例如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，例如丙二醇、甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；琼脂；藻酸；无热原水；等渗盐水；和磷酸盐缓冲液；脱脂奶粉；以及用于药物制剂中的其他无毒相容物质。也可以存在润湿剂和润滑剂如十二烷基硫酸钠，和着色剂、调味剂、润滑剂、赋形剂、压片剂、稳定剂、抗氧化剂以及防腐剂。
本文所用的术语“治疗有效量”通常是指当施用于需要这种治疗的受试者时足以实现本文所定义的治疗的试剂的量，例如作为活性成分的化合物的量。本发明的化合物、盐、衍生物、异构体或对映异构体的治疗有效量将取决于多种因素，包括例如受试者的年龄和体重、需要治疗的确切病况及其严重程度、制剂性质和施用途径，最终将由主治医师或兽医决定。然而，用于治疗与细菌感染或病毒感染相关的疾病，特别是细菌性脑膜炎的本发明化合物的有效量通常为每天约10mg/kg至约40mg/kg受试体(哺乳动物)体重的范围，更通常为每天约40mg/kg体重。因此，对于70kg的成年受试者，每天的实际量通常为约2,800mg，并且该量可以每天单剂量施用或更通常以每天多个(例如两个、三个、四个、五个或六个)亚剂量施用，使得总的日剂量相同。本发明的盐的有效量可确定为化合物本身的有效量的比。
本文所用的术语“治疗”是指对动物，特别是哺乳动物，更特别是人类的病症或疾病的任何治疗，并且包括：防止该病症或疾病在可能易患该疾病但尚未被诊断为患有该疾病的受试者中发生；抑制该疾病或病症，即阻止其发展；缓解该疾病或病症，即导致病症消退；或缓解由该疾病引起的病症，即该疾病的症状。
化学衍生物
本文所用的术语“衍生物”或“衍生的”包括化合物的化学修饰。这种化学修饰的示例是用卤素基团、烷基、酰基或氨基取代氢。
化学修饰
在一个实施方案中，所述化合物可以是化学修饰的化合物。
化合物的化学修饰可以增强或减弱化合物与靶标之间的氢键相互作用、电荷相互作用、疏水相互作用、范德华相互作用或偶极相互作用。
在一个方面，所鉴定的化合物可以作为开发其他化合物的模型(例如，模板)。
个体
将化合物递送至个体。如本文所用，术语“个体”是指脊椎动物，特别是哺乳动物物种的成员。该术语包括但不限于家畜、运动动物、灵长类和人。
实施例
实施例1.发现
使用噬菌体展示技术，用重组人GPC-3蛋白从由SIgN构建的Fab序列文库中分离结合物。
在筛选的570个克隆中，在ELISA中表现出对GPC-3的结合力最高的24个克隆被分离出来并克隆为IgG1型中以用于进一步表征：5C4、4H1、1D2、1C4、2B5、1F1、1H1、4A5、1D8、1D3、2F1、3C6、3D12、3A9、1F4、1H10、3C12、4G11、4A12、1A12、3G12、4F9、4G4和1E1。
实施例2.对GPC-3的结合亲和力
在ELISA中以3个批次测试了针对重组人GPC-3蛋白的24个抗体克隆，以评估对靶标的结合亲和力，使用人源化GC33克隆(Chugai pharmaceutical,Roche)作为参考对照抗体(图1A、图1B和图1C)。
除了克隆1E1和3D12之外，所有其他22个克隆都显示出对人GPC-3的中亲和力至高亲和力(图1D)。
实施例3.抗GPC-3抗体与GPC-3表达细胞的特异性结合
使用HepG2(GPC-3高)、Hep3B(GPC-3中)和SK-Hep1(GPC-3阴性)细胞测量了抗GPC-3抗体特异性识别和结合细胞表面GPC-3的能力。HepG2和Hep3B细胞持续表达GPC-3，而SK-Hep1细胞不表达GPC-3。
简而言之，将HepG2(GPC-3高)、Hep3B(GPC-3中)和SK-Hep1(GPC-3阴性)细胞以每孔50000个接种于96孔圆底板的细胞悬液中，然后与不同浓度的抗GPC-3抗体进行孵育。使用标记二抗通过流式细胞术测量结合。
在该检测中，大多数抗GPC-3抗体与表达GPC-3的HepG2和Hep3B细胞强结合，但与GPC-3阴性SK-Hep1细胞不结合或弱结合(图2)。克隆1C4、1D2、1D3、1D8、1F4、1H1、1H10、2B5、2F1、3A9、3D12、4A5、4H1和5C4显示出与GPC-3的高度特异性结合，因为它们即使在最高抗体浓度(20nM)也不与SK-Hep1细胞结合。这表明这些抗体以依赖于GPC-3表达的高度特异性方式结合到细胞表面。
实施例4.抗GPC-3抗体针对食蟹猴和小鼠GPC-3蛋白的跨物种反应性由于磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3是高度保守的基因，我们进行了交叉反应性ELISA以评估我们的抗GPC-3抗体的跨物种反应性，其中重组人、食蟹猴和小鼠的GPC-3蛋白均被生物素化，并用于结合ELISA，以测试它们与每种抗GPC-3 IgG1克隆的结合。
除了克隆1D8和人源化GC33外，所有其他抗GPC-3 IgG1克隆均表现出对食蟹猴GPC-3和小鼠GPC-3的交叉反应性(图3)，表明这些抗体识别跨越人抗原、食蟹猴抗原和小鼠抗原的GPC-3蛋白的共同表位。
随后，使用小鼠GPC-3稳定转导的Hepa1-6细胞(命名为“Hepa1-6-mGPC-3”)和亲代Hepa1-6细胞测量抗GPC-3抗体特异性识别和结合细胞表面上的小鼠GPC-3的能力。
大多数抗GPC-3抗体以20nM染色浓度与Hepa1-6-mGPC-3细胞强结合，但不与亲代Hepa1-6细胞结合(图4A)。
克隆1C4、1D2、1D3、1F1、1H1、1H10、2B5、2F1、3A9、3C6、3G12、4A12、4G11、4H1和5C4显示出与小鼠GPC-3的高度特异性结合，虽然它们与亲代Hepa1-6细胞的细胞结合比率不高(图4B)。
有趣的是，尽管克隆1F4、3D12和4F9在交叉反应性结合ELISA中显示出阳性结合信号(图3)，但它们无法对细胞表面表达的小鼠GPC-3抗原进行有效的染色(图4)。
实施例5.体外活性：抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的诱导为了评估抗GPC-3抗体诱导ADCC的能力，在存在或不存在每种不同的抗GPC-3 IgG1克隆(2.5μg/ml)情况下，将GPC-3阳性HepG2细胞与初始自然杀伤(NK)细胞按1:2.5(E:T比率＝2.5:1)的比率混合。
然后使用xCellingence RTCA系统以15分钟的间隔连续测量细胞指数值44小时。在该检测中，肿瘤细胞的细胞指数值通过肿瘤细胞粘附引起的通过晶体管板的电流阻抗来测量。计算终点细胞毒性并示于图5中。
与仅NK细胞诱导的细胞毒性相比，在半数以上的抗GPC-3抗体克隆中观察到杀伤力显著增加，其中克隆1C4、1D2和4H1表现出最高的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性。
实施例6.在嵌合抗原受体(CAR)T细胞构建体中的用途
抗体序列也可用于构建抗GPC-3 CAR T细胞。
选择15个克隆以第二代CAR形式(CD3ζ+4-1BB胞内结构域)表达为CAR。
为了评估这些抗GPC-3 CAR T细胞的功能，在IL-2(50单位/ml)存在下，由TransActTM(CD3/CD28激动剂)活化来自健康供体的T细胞24小时，并通过基于慢病毒的转导过程导入CAR基因。转导后72小时，使用xCELLigence RTCA系统对这些抗GPC-3 CAR T细胞的疗效进行T细胞介导的细胞毒性检测。
CAR T细胞被证明能高效地杀死肿瘤细胞。
虽然模拟转导的T细胞显示出10％至15％表达GPC-3的HepG2细胞的细胞溶解，但抗GPC-3 CAR T细胞能够杀死30％至100％的HepG2细胞(图6)。在共培养的48小时内，基于克隆1C4、1D3、1F1、2F1、3C6、1D2、1H1、2B5、1D8、4A5、4H1和5C4的抗GPC-3 CAR T细胞可溶解90％至100％的GPC-3高HepG2细胞。这些CAR T细胞的杀伤对抗原表达具有高度特异性，因为相同的CAR T细胞仅表现出对GPC-3阴性SK-Hep1细胞的非常轻微的背景杀伤(10％至30％)。
此外，在抗GPC-3 CAR T细胞与GPC-3高HepG2细胞或GPC-3阴性SK-Hep1细胞共培养24小时和48小时后，收集细胞培养上清液并进行ELISA，以评估抗GPC-3 CAR T细胞的细胞因子(干扰素-γ和IL-2)释放。当与GPC-3高HepG2细胞共培养时，基于克隆1C4、1D3、1F1、2F1、3C6、1D2、1H1、2B5、1D8、4A5、4H1和5C4的抗GPC-3 CAR T细胞分泌大量的干扰素-γ和IL-2。然而，当将抗GPC-3 CAR T细胞加入到GPC-3阴性SK-Hep1细胞中时，干扰素-γ和IL-2的分泌水平极低，表明这些抗GPC-3 CAR T细胞在应答和杀伤GPC-3表达细胞方面具有更高的特异性(图7)。
有趣的是，图6和图7均显示表达小鼠GC33克隆的抗GPC-3 CAR T细胞的中度的非特异性脱靶反应性。
实施例7.抗体的核苷酸序列和氨基酸序列
能够特异性结合磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3并触发对抗原表达细胞杀伤的24种全人源单克隆抗体及其衍生物的氨基酸序列和核苷酸序列如下。
所述抗体为5C4、4H1、1D2、1C4、2B5、1F1、1H1、4A5、1D8、1D3、2F1、3C6、3D12、3A9、1F4、1H10、3C12、4G11、4A12、1A12、3G12、4F9、4G4和1E1。
序列
氨基酸序列
CDR以粗体显示，并以粗体(CDR1)、斜体(CDR2)或下划线(CDR3)突出显示。
Figure BDA0003361436880000591
Figure BDA0003361436880000601
表D1.重链和轻链氨基酸序列ID号(序列如下)
人IGG1的重链可变区(VH)氨基酸序列
SEQ ID NO：1：5C4的重链可变区氨基酸序列
Figure BDA0003361436880000602
SEQ ID NO：3：4H1的重链可变区氨基酸序列
Figure BDA0003361436880000611
SEQ ID NO：5：1D2的重链可变区氨基酸序列
Figure BDA0003361436880000612
SEQ ID NO：7：1C4的重链可变区氨基酸序列
Figure BDA0003361436880000613
SEQ ID NO：9：2B5的重链可变区氨基酸序列
Figure BDA0003361436880000614
SEQ ID NO：11：1F1的重链可变区氨基酸序列
Figure BDA0003361436880000615
SEQ ID NO：13：1H1的重链可变区氨基酸序列
Figure BDA0003361436880000616
SEQ ID NO：15：4A5的重链可变区氨基酸序列
Figure BDA0003361436880000621
SEQ ID NO：17：1D8的重链可变区氨基酸序列
Figure BDA0003361436880000622
SEQ ID NO：19：1D3的重链可变区氨基酸序列
Figure BDA0003361436880000623
SEQ ID NO：21：2F1的重链可变区氨基酸序列
Figure BDA0003361436880000624
SEQ ID NO：23：3C6的重链可变区氨基酸序列
Figure BDA0003361436880000625
SEQ ID NO：25：3D12的重链可变区氨基酸序列
Figure BDA0003361436880000626
SEQ ID NO：27：3A9的重链可变区氨基酸序列
Figure BDA0003361436880000627
SEQ ID NO：29：1F4的重链可变区氨基酸序列
Figure BDA0003361436880000631
SEQ ID NO：31：1H10的重链可变区氨基酸序列
Figure BDA0003361436880000632
SEQ ID NO：33：3C12的重链可变区氨基酸序列
Figure BDA0003361436880000633
SEQ ID NO：35：4G11的重链可变区氨基酸序列
Figure BDA0003361436880000634
SEQ ID NO：37：4A12的重链可变区氨基酸序列
Figure BDA0003361436880000635
SEQ ID NO：39：1A12的重链可变区氨基酸序列
Figure BDA0003361436880000636
SEQ ID NO：41：3G12的重链可变区氨基酸序列
Figure BDA0003361436880000641
SEQ ID NO：43：4F9的重链可变区氨基酸序列
Figure BDA0003361436880000642
SEQ ID NO：45：4G4的重链可变区氨基酸序列
Figure BDA0003361436880000643
SEQ ID NO：47：1E1的重链可变区氨基酸序列
Figure BDA0003361436880000644
人IGG1的轻链可变区(VL)氨基酸序列
SEQ ID NO：2：5C4的轻链可变区氨基酸序列
Figure BDA0003361436880000645
SEQ ID NO：4：4H1的轻链可变区氨基酸序列
Figure BDA0003361436880000646
SEQ ID NO：6：1D2的轻链可变区氨基酸序列
Figure BDA0003361436880000651
SEQ ID NO：8：1C4的轻链可变区氨基酸序列
Figure BDA0003361436880000652
SEQ ID NO：10：2B5的轻链可变区氨基酸序列
Figure BDA0003361436880000653
SEQ ID NO：12：1F1的轻链可变区氨基酸序列
Figure BDA0003361436880000654
SEQ ID NO：14：1H1的轻链可变区氨基酸序列
Figure BDA0003361436880000655
SEQ ID NO：16：4A5的轻链可变区氨基酸序列
Figure BDA0003361436880000656
SEQ ID NO：18：1D8的轻链可变区氨基酸序列
Figure BDA0003361436880000657
SEQ ID NO：20：1D3的轻链可变区氨基酸序列
Figure BDA0003361436880000661
SEQ ID NO：22：2F1的轻链可变区氨基酸序列
Figure BDA0003361436880000662
SEQ ID NO：24：3C6的轻链可变区氨基酸序列
Figure BDA0003361436880000663
SEQ ID NO：26：3D12的轻链可变区氨基酸序列
Figure BDA0003361436880000664
SEQ ID NO：28：3A9的轻链可变区氨基酸序列
Figure BDA0003361436880000665
SEQ ID NO：30：1F4的轻链可变区氨基酸序列
Figure BDA0003361436880000666
SEQ ID NO：32：1H10的轻链可变区氨基酸序列
Figure BDA0003361436880000671
SEQ ID NO：34：3C12的轻链可变区氨基酸序列
Figure BDA0003361436880000672
SEQ ID NO：36：4G11的轻链可变区氨基酸序列
Figure BDA0003361436880000673
SEQ ID NO：38：4A12的轻链可变区氨基酸序列
Figure BDA0003361436880000674
SEQ ID NO：40：1A12的轻链可变区氨基酸序列
Figure BDA0003361436880000675
SEQ ID NO：42：3G12的轻链可变区氨基酸序列
Figure BDA0003361436880000676
SEQ ID NO：44：4F9的轻链可变区氨基酸序列
Figure BDA0003361436880000677
SEQ ID NO：46：4G4的轻链可变区氨基酸序列
Figure BDA0003361436880000681
SEQ ID NO：48：1E1的轻链可变区氨基酸序列
Figure BDA0003361436880000682
核苷酸序列
CDR以粗体显示，并以粗体(CDR1)、斜体(CDR2)或下划线(CDR3)突出显示。
Figure BDA0003361436880000683
Figure BDA0003361436880000691
表D2.重链和轻链核苷酸序列ID号(序列如下)人IGG1的重链可变区(VH)核苷酸序列
SEQ ID NO：49：5C4的重链可变区核苷酸序列
Figure BDA0003361436880000692
SEQ ID NO：51：4H1的重链可变区核苷酸序列
Figure BDA0003361436880000693
Figure BDA0003361436880000701
SEQ ID NO：53：1D2的重链可变区核苷酸序列
Figure BDA0003361436880000702
SEQ ID NO：55：1C4的重链可变区核苷酸序列
Figure BDA0003361436880000703
SEQ ID NO：57：2B5的重链可变区核苷酸序列
Figure BDA0003361436880000704
Figure BDA0003361436880000711
SEQ ID NO：59：1F1的重链可变区核苷酸序列
Figure BDA0003361436880000712
SEQ ID NO：61：1H1的重链可变区核苷酸序列
Figure BDA0003361436880000713
SEQ ID NO：63：4A5的重链可变区核苷酸序列
Figure BDA0003361436880000714
Figure BDA0003361436880000721
SEQ ID NO：65：1D8的重链可变区核苷酸序列
Figure BDA0003361436880000722
SEQ ID NO：67：1D3的重链可变区核苷酸序列
Figure BDA0003361436880000723
SEQ ID NO：69：2F1的重链可变区核苷酸序列
Figure BDA0003361436880000724
Figure BDA0003361436880000731
SEQ ID NO：71：3C6的重链可变区核苷酸序列
Figure BDA0003361436880000732
SEQ ID NO：73：3D12的重链可变区核苷酸序列
Figure BDA0003361436880000733
SEQ ID NO：75：3A9的重链可变区核苷酸序列
Figure BDA0003361436880000734
Figure BDA0003361436880000741
SEQ ID NO：77：1F4的重链可变区核苷酸序列
Figure BDA0003361436880000742
SEQ ID NO：79：1H10的重链可变区核苷酸序列
Figure BDA0003361436880000743
SEQ ID NO：81：3C12的重链可变区核苷酸序列
Figure BDA0003361436880000744
SEQ ID NO：83：4G11的重链可变区核苷酸序列
Figure BDA0003361436880000751
SEQ ID NO：85：4A12的重链可变区核苷酸序列
Figure BDA0003361436880000752
SEQ ID NO：87：1A12的重链可变区核苷酸序列
Figure BDA0003361436880000753
SEQ ID NO：89：3G12的重链可变区核苷酸序列
Figure BDA0003361436880000761
SEQ ID NO：91：4F9的重链可变区核苷酸序列
Figure BDA0003361436880000762
SEQ ID NO：93：4G4的重链可变区核苷酸序列
Figure BDA0003361436880000763
SEQ ID NO：95：1E1的重链可变区核苷酸序列
Figure BDA0003361436880000771
人IGG1的轻链可变区(VL)核苷酸序列
SEQ ID NO：50：5C4的轻链可变区核苷酸序列
Figure BDA0003361436880000772
SEQ ID NO：52：4H1的轻链可变区核苷酸序列
Figure BDA0003361436880000773
SEQ ID NO：54：1D2的轻链可变区核苷酸序列
Figure BDA0003361436880000781
SEQ ID NO：56：1C4的轻链可变区核苷酸序列
Figure BDA0003361436880000782
SEQ ID NO：58：2B5的轻链可变区核苷酸序列
Figure BDA0003361436880000783
SEQ ID NO：60：1F1的轻链可变区核苷酸序列
Figure BDA0003361436880000784
Figure BDA0003361436880000791
SEQ ID NO：62：1H1的轻链可变区核苷酸序列
Figure BDA0003361436880000792
SEQ ID NO：64：4A5的轻链可变区核苷酸序列
Figure BDA0003361436880000793
SEQ ID NO：66：1D8的轻链可变区核苷酸序列
Figure BDA0003361436880000794
Figure BDA0003361436880000801
SEQ ID NO：68：1D3的轻链可变区核苷酸序列
Figure BDA0003361436880000802
SEQ ID NO：70：2F1的轻链可变区核苷酸序列
Figure BDA0003361436880000803
SEQ ID NO：72：3C6的轻链可变区核苷酸序列
Figure BDA0003361436880000804
Figure BDA0003361436880000811
SEQ ID NO：74：3D12的轻链可变区核苷酸序列
Figure BDA0003361436880000812
SEQ ID NO：76：3A9的轻链可变区核苷酸序列
Figure BDA0003361436880000813
SEQ ID NO：78：1F4的轻链可变区核苷酸序列
Figure BDA0003361436880000814
SEQ ID NO：80：1H10的轻链可变区核苷酸序列
Figure BDA0003361436880000821
SEQ ID NO：82：3C12的轻链可变区核苷酸序列
Figure BDA0003361436880000822
SEQ ID NO：84：4G11的轻链可变区核苷酸序列
Figure BDA0003361436880000823
SEQ ID NO：86：4A12的轻链可变区核苷酸序列
Figure BDA0003361436880000824
Figure BDA0003361436880000831
SEQ ID NO：88：1A12的轻链可变区核苷酸序列
Figure BDA0003361436880000832
SEQ ID NO：90：3G12的轻链可变区核苷酸序列
Figure BDA0003361436880000833
SEQ ID NO：92：4F9的轻链可变区核苷酸序列
Figure BDA0003361436880000834
Figure BDA0003361436880000841
SEQ ID NO：94：4G4的轻链可变区核苷酸序列
Figure BDA0003361436880000842
SEQ ID NO：96：1E1的轻链可变区核苷酸序列
Figure BDA0003361436880000843
实施例8.用作抗GPC-3双特异性T细胞接合抗体
使用抗GPC-3抗体构建抗GPC-3双特异性T细胞接合抗体。在这些构建体中，来自5个抗GPC-3抗体克隆(1C4、1D2、2B5、4H1、5C4)中每个的一个臂的Fab区被抗CD3 scFv片段取代，如下所示。
克隆 重链(V<sub>H</sub>)氨基酸序列 轻链(V<sub>L</sub>)氨基酸序列
抗-CD3 SEQ ID NO:97 SEQ ID NO:98
表D3.抗CD3重链和轻链氨基酸序列ID号(序列如下)
抗CD3重链可变区(VH)氨基酸序列
SEQ ID NO:97：抗CD3重链可变区氨基酸序列
DVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRYTMHWVRQAPGQGLEWIGYINPSRGYTNYADSVKGRFTITTDKSTSTAYMELSSLRSEDTATYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTVTVSS
抗CD3轻链可变区(VL)氨基酸序列
SEQ ID NO:98:抗CD3轻链可变区氨基酸序列
DIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSYMNWYQQKPGKAPKRWIYDTSKVASGVPARFSGSGSGTDYSLTINSLEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGGGTKVEIK
克隆 重链(V<sub>H</sub>)核苷酸序列 轻链(V<sub>L</sub>)核苷酸序列
抗-CD3 SEQ ID NO:99 SEQ ID NO:100
表D4.抗CD3重链和轻链核苷酸序列ID号(序列如下)
抗CD3重链可变区(VH)核苷酸序列
SEQ ID NO:99：抗CD3重链可变区核苷酸序列
gatgtgcagctggtgcagagcggggcagaggtgaaaaagcctggggcaagcgtcaaagtcagttgtaaagcctccggctacacattcactaggtatactatgcactgggtgcgccaggcccctggccaggggctggagtggatcggctacattaacccaagcagagggtacacaaattatgctgactccgtgaaaggcaggtttactatcaccaccgataagtccacctctacagcatacatggagctgagcagcctgcgaagcgaagacactgcaacctactattgcgcccggtactatgacgatcattactgtctggattattggggacagggcactaccgtgacagtctctagt
抗CD3轻链可变区(VL)核苷酸序列
SEQ ID NO:100：抗CD3轻链可变区核苷酸序列
Gatattgtgctgacccagtctccagccacactgagtctgtcacccggcgaacgagccaccctgagctgccgggccagccagtccgtctcttacatgaactggtatcagcagaagcccggaaaagcccctaagcggtggatctacgacacaagcaaagtggcttccggcgtccccgcacgattcagtggctcagggagcggaactgactattctctgaccattaatagtctggaggctgaagatgccgctacctactattgtcagcagtggtcaagcaaccctctgacattcggggggggaactaaagtggaaatcaag
抗CD3 scFv氨基酸序列
SEQ ID NO:101：抗CD3 scFv氨基酸序列
DVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRYTMHWVRQAPGQGLEWIGYINPSRGYTNYADSVKGRFTITTDKSTSTAYMELSSLRSEDTATYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTVTVSSGEGTSTGSGGSGGSGGADDIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSYMNWYQQKPGKAPKRWIYDTSKVASGVPARFSGSGSGTDYSLTINSLEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGGGTKVEIK
抗CD3 scFv核苷酸序列
SEQ ID NO:102:抗CD3 scFv氨核苷酸序列
gatgtgcagctggtgcagagcggggcagaggtgaaaaagcctggggcaagcgtcaaagtcagttgtaaagcctccggctacacattcactaggtatactatgcactgggtgcgccaggcccctggccaggggctggagtggatcggctacattaacccaagcagagggtacacaaattatgctgactccgtgaaaggcaggtttactatcaccaccgataagtccacctctacagcatacatggagctgagcagcctgcgaagcgaagacactgcaacctactattgcgcccggtactatgacgatcattactgtctggattattggggacagggcactaccgtgacagtctctagtggggagggaacatccactgggtctggagggagtggaggctcaggaggagcagacgatattgtgctgacccagtctccagccacactgagtctgtcacccggcgaacgagccaccctgagctgccgggccagccagtccgtctcttacatgaactggtatcagcagaagcccggaaaagcccctaagcggtggatctacgacacaagcaaagtggcttccggcgtccccgcacgattcagtggctcagggagcggaactgactattctctgaccattaatagtctggaggctgaagatgccgctacctactattgtcagcagtggtcaagcaaccctctgacattcggggggggaactaaagtggaaatcaag
引入了杵臼(knob in hole)突变以促进正确的重链配对和LALA突变以去除Fcγ受体结合(图8A)。
使用HepG2(GPC-3阳性)、SK-Hep1(GPC-3阴性)和人T细胞(CD3阳性)细胞测定了这些抗GPC-3双特异性T细胞接合抗体特异性识别和结合细胞表面上的GPC-3和人CD3分子的能力。HepG2细胞和人T细胞分别持续表达高水平的GPC-3和CD3，而SK-Hep1细胞不表达GPC-3或CD3。
简而言之，将HepG2(GPC-3阳性)、SK-Hep1(GPC-3阴性)和人T细胞(CD3阳性)以每孔100000个接种到96孔圆底板的细胞悬液中，然后与不同浓度的抗GPC-3双特异性T细胞接合抗体进行孵育。使用标记二抗通过流式细胞术测量结合。在该检测中，所有5个抗GPC-3双特异性T细胞接合抗体均与表达GPC-3的细胞HepG2(图8B)以及表达CD3的人T细胞(图8D)强结合。然而，这些抗体未与GPC-3阴性SK-Hep1细胞结合(图8C)。这表明这些抗GPC-3双特异性T细胞接合抗体以依赖于GPC-3和CD3表达的高度特异性方式结合到细胞表面。
为了评估这些抗GPC-3双特异性T细胞接合抗体的功能，在3个不同浓度(2.5nM、312.5pM和39pM)的抗GPC-3双特异性T细胞接合抗体存在下，从健康供体分离出T细胞，并与HepG2(GPC-3阳性)或SK-Hep1(GPC-3阴性)细胞一起培养。24小时后，收获T细胞并通过评估T细胞活化标志物CD25和CD69的表面表达来分析T细胞的活化状态。
结果显示，所有五个抗GPC-3双特异性T细胞接合抗体在与GPC-3阳性HepG2细胞共培养时均可强烈活化人初始T细胞(图9A和图9C)，但与GPC-3阴性SK-Hep1细胞共培养时并未活化人初始T细胞(图9B和图9D)。
此外，收集细胞培养上清液并进行ELISA，以评估细胞因子(干扰素-γ和IL-2)从抗GPC-3双特异性T细胞接合抗体处理的T细胞的释放。
在抗GPC-3双特异性T细胞接合抗体(克隆1C4、1D2、2B5、4H1和5C4)的存在下，与GPC-3阳性HepG2细胞共培养时，活化的人T细胞分泌显著更高量的干扰素-γ和IL-2(图9E和图9G)。然而，当与GPC-3阴性SK-Hep1细胞共培养时，干扰素-γ和IL-2的释放仍然较低(图9F和图9H)，表明这些抗GPC-3双特异性T细胞接合抗体具有较高的特异性。
通过对这些抗GPC-3双特异性T细胞接合抗体进行抗体依赖性T细胞介导的细胞毒性检测，进一步检查了它们的疗效。
简而言之，将GPC-3阳性HepG2细胞(T：靶细胞)接种到xCelligence E-plate上并培养过夜，并且测量细胞指数值。第二天，在加入多种浓度的抗GPC-3双特异性T细胞接合抗体后，立即将从人PBMC分离的原代T细胞(E：效应细胞)以4:1的效应细胞与靶细胞的比例(E:T＝4:1)加入至靶细胞。使用xCellingence RTCA系统继续再检测72小时，以测量靶细胞指数值。
除了克隆2B5仅在10nM和1nM的高浓度时诱导靶细胞HepG2(GPC-3阳性)的深度细胞溶解之外，所有其他抗GPC-3双特异性T细胞接合抗体(克隆1C4、1D2、4H1和5C4)在低至0.1nM的浓度就能在72小时内杀死50％至70％的HepG2细胞(图10A和图10B)。
总之，上述检测的结果显示，我们的抗GPC-3抗体以双特异性T细胞接合抗体的形式在诱导GPC-3表达细胞死亡方面具有高特异性和疗效。
实施例9.在嵌合抗原受体(CAR)T细胞构建体中的用途
首先使用免疫受损NSG(NOD-scid IL2γnull)小鼠通过预防性模型评估抗GPC-3CAR T细胞的体内活性(图11)。
第0天，将200万个Hep3B细胞经皮下注射到NSG小鼠(仅雌性)的右侧胁腹。4天后，此时未观察到可测量的肿瘤，将小鼠随机分组，并注射1000万个抗GPC-3 CAR T细胞(克隆5C4)或模拟T细胞。“仅肿瘤”组(未注射T细胞)和“模拟T”组的所有小鼠均出现大肿瘤，并在第41天被处死，而“CAR T”组的所有小鼠均保持无肿瘤。初始肿瘤接种后84天，将100万个Hep3B细胞经皮下注射到右侧胁腹对CAR T组的所有无肿瘤小鼠(4只小鼠)与一组初始小鼠(5只小鼠，“仅肿瘤2”)进行攻击，并连续监测它们的肿瘤生长和体重。“仅肿瘤2”组的所有5只小鼠均长出相当大的肿瘤，但CAR T组的2只小鼠直到第165天(再次攻击后81天)仍保持无肿瘤(图11A)。
这些数据表明，5C4 CAR T细胞阻止了异种移植模型中GPC-3阳性HCC肿瘤的形成，并为NSG小鼠提供了长期保护，防止其在肿瘤再次攻击时长出GPC-3阳性HCC肿瘤。此外，抗GPC-3CAR T细胞(克隆5C4)未对NSG小鼠产生严重毒性，因为在抗GPC-3 CAR T治疗后小鼠体重未出现显著下降(图11B)。在T细胞注射6天后，与“模拟T”组检测到的基础水平相比，来自“CART”组的T细胞相关细胞因子(穿孔素、颗粒酶B、sCD137、GM-CSF)的血清水平上调也反映了抗GPC-3 CAR T细胞的疗效(图11C)。
为了测试抗GPC-3 CAR T细胞是否能够在体内抑制已有的肿瘤的生长，我们选择了3个不同的抗GPC-3抗体克隆来生成抗GPC-3 CAR构建体(克隆1D2、4H1和5C4)。不论不同的克隆，都能够通过慢病毒转导获得20％的CAR表达(图12A)。
这些抗GPC-3 CAR T细胞在体外表现出强烈而特异性的靶细胞的细胞毒性，因为它们在xCelligence细胞阻抗检测中，杀死了70％至80％的GPC-3阳性Hep3B细胞，但没有杀死GPC-3阴性SK-Hep1细胞(图12B)。在用200万GPC-3阳性Hep3B细胞经皮下接种NSG小鼠(仅雌性)26天后，根据可测量的肿瘤大小对小鼠进行分组进行CAR T细胞注射。将1000万不同的抗GPC-3 CAR T细胞(每组4只小鼠)或模拟T细胞(3只小鼠)经尾静脉静脉注射到这些小鼠中。
在第45天(CAR T细胞注射后19天)，用1D2 CAR T细胞治疗的小鼠中的肿瘤(平均大小为1749mm3)开始萎缩，在第60天达到平均643mm3。使用4H1 CAR T细胞或5C4 CAR T细胞治疗的小鼠中的肿瘤生长比使用模拟T治疗的小鼠中的肿瘤慢得多，并且从第53天开始观察到5C4 CAR T组的肿瘤大小进一步减小(图12C)。
有趣的是，当平均肿瘤大小超过2000mm3时，模拟T组小鼠的体重在肿瘤接种45天后显著下降，而所有注射了CAR T的小鼠的体重保持稳定(图12D)。
这些数据表明，我们的抗GPC-3 CAR T细胞在体内有效抑制了GPC-3阳性HCC异种移植物的生长，且不会引起严重毒性。
随后，我们旨在测试我们的抗GPC-3 CAR T细胞疗法与免疫检查点阻断抗体(如抗PD1抗体)的联合使用是否有效。
同样地，将200万个Hep3B细胞经皮下注射到NSG小鼠(仅雌性)的右侧胁腹。24天后，根据可测量的肿瘤大小对小鼠进行分组，并经尾静脉静脉注射抗GPC-3 CAR T细胞(克隆5C4)或模拟T细胞。注射CAR T细胞10天后，当两组均生长出平均大小超过1000mm3的肿瘤时，向所有小鼠经腹腔注射抗PD1 IgG4抗体，共5次，间隔3至5天。
模拟T组小鼠对抗PD1抗体无反应，因此肿瘤继续生长。相反，在第1次注射抗PD1抗体后5天内，CAR T组小鼠的肿瘤大小急剧下降，并持续缩小，直至平均肿瘤大小小于100mm3，并持续20天以上(图13A)。
尽管在CAR T组中观察到轻微波动，但模拟T和CAR T组小鼠的体重均保持稳定(图13B)。
通过联合使用抗GPC-3 CAR T和抗PD1抗体进行的有效肿瘤抑制的结果是，用抗GPC-3 CAR T细胞然后用抗PD1抗体治疗的75％小鼠存活了70天以上，而用模拟T然后用抗PD1抗体治疗的小鼠中位存活时间仅为45天(图13C)。
有趣的是，在第二次注射抗PD1抗体后的第二天(第40天，输注CAR T细胞后16天)，CAR T组小鼠的人T细胞总数显著高于用模拟T细胞治疗的小鼠的人T细胞总数(图13D)。此外，外周CAR+CD3+T细胞、外周CD4+CD3+T细胞、外周CD8+CD3+T细胞的持久性与总T细胞一致(图13E)。此外，通过抗GPC-3 CAR T细胞治疗组中T细胞相关细胞因子(穿孔素、颗粒酶B、sCD137、GM-CSF)的血清水平上调，也观察到了抗GPC-3 CAR T细胞和抗PD1抗体联合疗法的疗效(图13F)。
由于大多数抗GPC-3抗体克隆可与GPC-3蛋白的小鼠同源物发生交叉反应，我们将来源于8个不同小鼠交叉反应的抗GPC-3克隆(1C4、1D2、1F1、1H1、2B5、4A5、4H1和5C4)和1个不与小鼠GPC-3发生交叉反应的抗GPC-3克隆(1D8)的CAR T细胞注射到NSG小鼠(每组6只小鼠，混合性别)中。我们通过监测每只小鼠的体重以及其他异常生理变化或行为，检测了在不存在表达高水平GPC-3蛋白的肿瘤细胞的情况下，这些抗GPC-3 CAR T细胞对正常小鼠组织的潜在毒性。结果清楚地表明，与“未治疗”组(图14A)、模拟T组(图14B)和1D8 CAR T组(图14E)相似，可与小鼠GPC-3表达细胞结合的8个不同的抗GPC-3 CAR T细胞直至5周的时间点在体内都未引起明显毒性(图14C、图14D、图14F、图14G、图14H、图14I、图14J和图14K)，超过该时间点GvHD可能随时发生。
这表明或者小鼠GPC-3在正常小鼠组织中不表达，或者小鼠GPC-3蛋白与来自8个抗GPC-3克隆的scFv片段之间的亲和力处于最佳水平，使得小鼠GPC-3在正常小鼠组织中的低表达不会引起这些抗GPC-3 CAR T细胞的强烈活化。
最后，为了检查CAR T细胞疗法的使用是否可以扩展到小鼠系统，我们首先使用代表性的抗GPC-3 IgG克隆5C4对亲代MC38细胞和小鼠GPC-3稳定转导的MC38细胞(命名为“MC38-mGPC-3”)进行染色，然后进行流式细胞术分析(图15A)。
基于克隆5C4的小鼠CAR T构建体是通过将人T细胞活化结构域替换为其小鼠同源物的对应物而设计的，并克隆到基于逆转录病毒的载体中。通过反转录病毒转导方法从小鼠脾细胞分离出的小鼠T细胞生成抗GPC-3小鼠CAR T细胞，并通过流式细胞仪分析检测小鼠CAR表达(图15B)。这些小鼠CAR T细胞的体外活性通过使用xCelligence阻抗检测在96小时内对MC38-mGPC-3细胞的细胞毒性超过80％得到验证(图15C)。为了测试小鼠抗GPC-3CAR T细胞在体内的治疗效果，将80万个MC38-mGPC-3细胞经皮下注射到WT C57BL/6小鼠中。当肿瘤生长到可测量的大小(约100mm3)时，将小鼠重新分组并经静脉注射抗GPC-3小鼠CAR T细胞(克隆5C4)或模拟T细胞，或不进行治疗(“仅肿瘤”)。
到第33天(输注CAR T细胞后21天)，模拟T组和仅肿瘤组的所有小鼠均长出大尺寸的肿瘤，而来自抗GPC-3小鼠CAR T细胞注射组的小鼠生长出非常小的肿瘤，1只小鼠保持无肿瘤(图15D)。对小鼠体重的监测显示，无论是存在表达mGPC-3蛋白的MC38-mGPC-3肿瘤细胞(图15E)还是不存在表达mGPC-3蛋白的MC38-mGPC-3肿瘤细胞的情况(图15F)，这些小鼠CAR T细胞均未引起明显的毒性。
这些实验不仅证明了小鼠抗GPC-3 CAR T细胞在体外和体内的疗效，还阐明了抗GPC-3抗体序列以小鼠CAR T构建体形式用于在同源小鼠模型中抗GPC-3 CAR T疗法的未来研究中的扩展用途。
实施例10：抗GPC-3 IgG1抗体的结合亲和力
使用BiacoreTM T200系统，通过表面等离子共振(SPR)分析测量24个抗GPC-3 IgG1抗体的亲和力，并显示于表E3所示(如下)中。
Figure BDA0003361436880000921
Figure BDA0003361436880000931
表E3：通过SPR分析测得的24个抗GPC-3 IgG1抗体对人GPC-3蛋白的结合亲和力(KD)、缔合率(Ka)和解离率(Kd)。
所有24个抗体克隆表现出对重组GPC-3蛋白纳摩尔(nM)级的结合亲和力，范围为44.17nM的最低亲和力(克隆4H1)至4.177nM的最高亲和力(克隆1D2)。
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序列表
<110> 新加坡科技研究局
<120> 组合物
<130> P000682WO1
<150> 10201902550P
<151> 2019-03-19
<160> 102
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 117
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 1
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ala Gly Pro Phe Thr Gly Phe Asn Trp Phe Asp Pro Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu
115
<210> 2
<211> 104
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 2
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
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20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
Thr Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
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Trp Thr Phe Gly Leu Gly Thr Arg
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<210> 3
<211> 111
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 3
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
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50 55 60
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65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Pro Gly Leu Glu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
<210> 4
<211> 104
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 4
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ala Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Asp Tyr Asn Tyr Pro
85 90 95
Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys
100
<210> 5
<211> 118
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 5
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Trp Gln Gln Gln Leu Val Pro Leu Gly Tyr Met Asp Val
100 105 110
Trp Gly Lys Gly Thr Thr
115
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<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 6
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1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser His Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Arg Thr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Tyr Ser Pro
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Leu Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys
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<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 7
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Asp Tyr Gly Asp Tyr Tyr Arg Pro Tyr Gly Met Asp Val Trp
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Gly Gln Gly Thr Thr
115
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<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 8
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1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Lys Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
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Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Asn Ser Tyr Pro Leu
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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys
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<213> 小家鼠(Mus musculus)
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1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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50 55 60
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Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr
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<213> 小家鼠(Mus musculus)
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1 5 10 15
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Asp Gly Tyr Asn Phe Leu Asp Trp Tyr Val Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Arg Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Ile Arg Ala Ser Gly Val Pro
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Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
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Ser Arg Val Glu Ala Asp Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala
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<213> 小家鼠(Mus musculus)
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Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
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Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
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Gly Trp Ile Asn Ala Gly Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe
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Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Thr Val Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
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<211> 108
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<213> 小家鼠(Mus musculus)
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Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
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Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
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Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Ile Leu Ile Tyr Leu Gly Ser His Arg Ala Ser Gly Val Pro
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Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala
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<400> 13
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Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
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115
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Glu Thr Thr Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
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Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
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Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys
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Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
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Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
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Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr
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Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
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Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
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Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu
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Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Asp Gly Gly Leu Ile Ala Ala Ala Phe Gly Tyr Tyr Tyr Tyr
100 105 110
Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr
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<211> 102
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 18
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly
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65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Glu Arg Pro Pro Thr
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100
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<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 19
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
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Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
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100 105 110
Thr Thr
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<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 20
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Thr Pro Gly Gln
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Ser Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Asn Ser Asn Leu Gly Ser Asn
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Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
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Ser Gly Arg Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys
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<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 21
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
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Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
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Ala Arg Asp Ser Pro Tyr Tyr Tyr Tyr Met Asp Val Trp Gly Lys Gly
100 105 110
Thr Thr
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<211> 108
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 22
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Phe Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Tyr Ser
20 25 30
Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Ser Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
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Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gly
85 90 95
Thr His Trp Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys
100 105
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<211> 115
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 23
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ala Tyr Gly Arg Tyr Asn Trp Asn Leu Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
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Gly Thr Leu
115
<210> 24
<211> 107
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 24
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1 5 10 15
Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Gly Ser Ile Ala Ser Asn
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Gly Ser Ile Asp Ser Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly
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Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Phe Asp Ser
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Ser Asn Tyr Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys
100 105
<210> 25
<211> 118
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 25
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
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115
<210> 26
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<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 26
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1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Ser Ser Tyr
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Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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<210> 27
<211> 112
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 27
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Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
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<211> 104
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 28
Glu Thr Thr Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
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<210> 29
<211> 112
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 29
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
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Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
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<211> 104
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 30
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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Thr
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<210> 31
<211> 110
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 31
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
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<210> 32
<211> 106
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 32
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
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Pro Arg Ala Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg
100 105
<210> 33
<211> 116
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 33
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
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Gly Val Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
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Gln Gly Thr Leu
115
<210> 34
<211> 102
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 34
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Val Ala Pro Gly Lys
1 5 10 15
Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val
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Phe Gly Gly Gly Thr Lys
100
<210> 35
<211> 113
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 35
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gly
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser
20 25 30
Asn Trp Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Glu Ile Tyr His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Thr Ser Gly Val Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu
<210> 36
<211> 103
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 36
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Gly Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp His Ser Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys
100
<210> 37
<211> 111
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 37
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Glu Gly Arg Ile Gln Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
<210> 38
<211> 103
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 38
Leu Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Tyr Glu Leu Gly Asp Lys Tyr Ala
20 25 30
Phe Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Gln Asp Thr Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Ser Ser Gly Asp Thr Ala Thr Leu Ile Ile Ser Gly Thr Gln Ile Leu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala Trp Asp Ser Ser Thr His Val
85 90 95
Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys
100
<210> 39
<211> 112
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 39
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ala Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Leu Tyr Lys Arg Arg Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
<210> 40
<211> 104
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 40
Glu Thr Thr Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Ile
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Arg Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Leu
85 90 95
Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys
100
<210> 41
<211> 112
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 41
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Leu Tyr Lys Arg Arg Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
<210> 42
<211> 104
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 42
Glu Thr Thr Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Arg Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Arg Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Ser Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Ser Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys
100
<210> 43
<211> 123
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 43
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Arg Asn Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Asp Ser Ser Ser Trp Tyr Val Gly Thr Tyr Tyr Tyr Tyr
100 105 110
Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr
115 120
<210> 44
<211> 108
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 44
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Gly Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Val
85 90 95
Leu Gln Thr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys
100 105
<210> 45
<211> 112
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 45
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Leu Tyr Lys Arg Arg Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
<210> 46
<211> 104
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 46
Glu Thr Thr Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asn Ala Ser Arg Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Ala Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Asp
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Gln Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys
100
<210> 47
<211> 112
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 47
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Leu Tyr Lys Arg Arg Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
<210> 48
<211> 104
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 48
Val Thr Thr Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Ser Arg
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Arg Arg Ala Thr Gly Ser Pro Glu Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Gly Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Tyr Gly Asn Ser Pro
85 90 95
Gly Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys
100
<210> 49
<211> 351
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 49
caggtgcagc tgcaggagtc ggggggaggc ctggtcaagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agctatagca tgaactgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatcatatg atggaagtaa taaatactat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag aactgaggac acggctgtgt attactgtgc gaggggcgcg 300
gggcctttta cgggattcaa ctggttcgac ccctggggcc agggaaccct g 351
<210> 50
<211> 312
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 50
gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctgtgt ctccagggga gagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttgac agctacttag cctggtacca gcagaaacct 120
ggccaggctc cccggctcct catctatagt gcgtccacga gggccactgg tatcccagcc 180
aggttcagtg gcactgggtc tgggacagag ttcactctca ccatcagcag cctgcagtct 240
gaagattttg cagtttacta ctgtcagcag tataagaggt ggcccacgtg gacgttcggt 300
ctagggacca gg 312
<210> 51
<211> 333
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 51
gaggtccagc tggtacagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agctatgcta tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatcatatg atggaagcaa taaatactac 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agctgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagcccct 300
gggttggagg actactgggg ccagggaacc ctg 333
<210> 52
<211> 312
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 52
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca 120
gggacagccc ctaagctcct gatctatgct gcatcatcca gtttacaaag tggggtccca 180
tcaaggttca gcggcagtgg atctggcaca gatttcgctc tcaccatcag cagcctgcag 240
cctgaagatt ttgcaactta ttactgtcta caagattaca attaccctct cactttcggc 300
ggagggacca ag 312
<210> 53
<211> 354
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 53
gaggtccagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatgcta tcagctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggtac agcaaactac 180
gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggaca aatccacgag cacagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagagtgg 300
cagcagcagc tggtacccct cggctacatg gacgtctggg gcaaagggac cacg 354
<210> 54
<211> 315
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 54
gaaacgacac tcacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgta gggccagtca cagtgttagc agcaacttct tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat gctgcatcca gcaggaccac tggcgtccca 180
gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ctgcagtgta ttactgtcag caatatggtt actcacccct gtacactttt 300
ggccagggga ccaag 315
<210> 55
<211> 351
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 55
caggtccagc tggtgcagtc tgggggaggc ttggtaaagc cagggcggtc cctgagactc 60
tcctgtacag cttctggatt cacctttggt gattatgcta tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatcatatg atggaagcaa taaatactat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agctgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagattac 300
ggtgattact atcggcccta cggtatggac gtctggggcc aagggaccac g 351
<210> 56
<211> 309
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 56
gacatccaga tgacccagtc tccttccacc ctgtctgcct ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgtc gggccagtca gagtattagt aagtggttgg cctggtatca gcataaacca 120
gggaaagccc ctaaagtcct gatctataag gcgtctactt tacaaagtgg ggtcccgtcg 180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca caatcagcag cctgcagcct 240
gaagattttg caacttatta ctgtcaacag cttaatagtt acccgctcac tttcggcgga 300
gggaccaag 309
<210> 57
<211> 372
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 57
caggtgcagc tgcaggagtc cgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agctatgcta tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatcatatg atggaagcaa taaatactac 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agctgaggac acggctgtgt attactgtgc gaaagaggga 300
acgtattact atgatagtag tggttattgg gactactact acggtatgga cgtctggggc 360
caagggacca cg 372
<210> 58
<211> 324
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 58
gatgttgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gccggcctcc 60
atctcctgca ggtctagcca gagcctcctg gatagtgacg gatacaactt tttggattgg 120
tatgtgcaga agccagggca gtctccacag cgcctgatct atttgggctc tattcgggcc 180
tccggggtcc ctgacaggtt cagtggcagt ggatcaggca cagattttac actgaaaatc 240
agcagagtgg aggctgacga tgttggggtt tattattgca tgcaagctct acaaactcct 300
tggacgttcg gccaagggac caag 324
<210> 59
<211> 321
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 59
caggtccagc tggtgcagtc tggagctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggtta cacctttacc agctatggta tcagctgggt gcgacaggcc 120
cccggacaaa ggcttgagtg gatgggatgg atcaacgctg gcaatggtaa cacaaaatat 180
tcacagaagt tccagggcag agtcaccatt accagggaca catccgcgag cacagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaagac acggctgtgt attactgtgc gaccgttgtc 300
tactggggcc agggcaccct g 321
<210> 60
<211> 324
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 60
gaaattgtgc tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gccggcctcc 60
atctcctgca ggtctagtca gagcctcctg catagtaatg gatacaacta tttggattgg 120
tacctgcaga agccagggca gtctccacag atcctgatct acttgggttc tcatcgggcc 180
tccggggtcc ctgacaggtt cagtggcagt gcatcaggca cagattttac actgaaaatc 240
agcagagtgg aggctgagga tgttggggtt tattactgca tgcaagctct acaaactccc 300
ctcactttcg gcggagggac caag 324
<210> 61
<211> 354
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 61
caggtgcagc tgcaggagtc cggcgcagga ctgttgaggc cttcggagac cctgtccctc 60
acttgcgctg tctatggtgg gtccttcagt ggttactact ggagctggat ccgccagccc 120
ccagggaagg ggctggagtg gcttggggaa atcagtcata gtggaagcac caactacaac 180
ccgtccctca agagtcgagt caccatatca gttgacacgt ccaagaacca gttctccctg 240
aagctgagct ctgtgaccgc cgcggacgcg gctgtatatt actgtgcgag atgggtttgg 300
agtggttatt ataacggtga ggggtacttc gatctctggg gccgtggcac cctg 354
<210> 62
<211> 312
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 62
gaaacgacac tcacgcagtc tcctggcacc ctgtctttgt ctccaggtga aagagccacc 60
ctctcctgta gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaag 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggccgtgg gtctgggaca gacttcactc tcactatcac cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag tactatggta gctcacctcg gacttttggc 300
caggggacca ag 312
<210> 63
<211> 360
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 63
gaggtccagc tggtgcagtc tggagctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggtta cacctttacc agctacggta tcagctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcagcgctt acaatggtaa cacaaactat 180
gcacagaagc tccagggcag agtcaccatg accacagaca catccacgag cacagcctac 240
atggagctga ggagcctgag atctgacgac acggccgtgt attactgtgc gagagacgga 300
ttaagcagca gctggttcta ctactactac ggtatggacg tctggggcca agggaccacg 360
<210> 64
<211> 315
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 64
gatgttgtga tgactcagtc tccactatcc ctgcccgtca cccctggaga gccggcctcc 60
atctcctgca ggtctagtca gagcctcctg catagtaatg gatacaacta tttggattgg 120
tacctgcaga agccagggca gtctccacag ctcctgatct atttgggttc taatcgggcc 180
tccggggtcc ctgacaggtt cagtggcagt ggatcaggca cagattttac actgaaaatc 240
agcagagtgg aggctgagga tgttggggtt tattactgca tgcaagctct acaaactttt 300
ggccagggga ccaag 315
<210> 65
<211> 366
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 65
caggtccagc tggtacagtc tggagctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggtta cacctttacc agctacggta tcagctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcagcgctt acaatggtaa cacaaactat 180
gcacagaagc tccagggcag agtcaccatg accacagaca catccacgag cacagcctac 240
atggagctga ggagcctgag atctgacgac acggccgtgt attactgtgc gagagatggg 300
ggacttatag cagcagcttt cggttactac tactacggta tggacgtctg gggccaaggg 360
accacg 366
<210> 66
<211> 306
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 66
gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agctacttag cctggtacca gcagaaacct 120
ggccaggctc ccaggctcct catctatggt gcatccagca gggccactgg catcccagac 180
aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag actggagcct 240
gaagattttg cagtgtacta ctgtcaacag tatgagaggc cccccacttt cggcgggggg 300
accaag 306
<210> 67
<211> 342
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 67
caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggata caccttcacc ggctactata tgcactgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcaacccta acagtggtgg cacaaactat 180
gcacagaact ttcagggcag agtcaccatt accagggaca catccgcgag cacagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gaggggatcg 300
tggcaaacgg gttcttttga tatctggggc caaggaacca cg 342
<210> 68
<211> 318
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 68
tcctatgagc tgactcagcc accctcagtg tctgggaccc ccgggcagag tgtcaccatc 60
tcttgttctg ggagcaactc caacctcgga tctaattatg tgtactggta ccaggtggtc 120
ccaggcacgg cccccaaact cgtcatctat agaaataaat atcggccccc aggggtccct 180
gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccgg 240
tccgacgatg aggctgaata ttattgttcc ggatgggatg acagcctgag tggtcgacta 300
ttcggcggag ggaccaag 318
<210> 69
<211> 342
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 69
gaggtccagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatgcta tcagctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggtac agcaaactac 180
gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggacg aatccacgag cacagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagacagc 300
ccctactact actacatgga cgtctggggc aaagggacca cg 342
<210> 70
<211> 324
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 70
gatgttgtga tgactcagtc tccgctcttc ctgcccgtca cccttggaca gccggcctcc 60
atctcctgca ggtctagtca aagcctcgta tacagtgatg gaaacaccta cttgagttgg 120
tttcagcaga ggccaggcca atctccaagg cgcctagttt ataaggtttc tagccgggac 180
tctggggtcc cagacagatt cagcggcagt gggtcaggca ctgatttcac actgaaaatc 240
agcagggtgg aggctgagga tgttggggtt tattactgca tgcaaggtac acactggcct 300
cggacgttcg gccaagggac caag 324
<210> 71
<211> 345
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 71
caggtgcagc tgcaggagtc ggggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agctatgcta tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatcatatg atggaagtaa taaatactac 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agctgaggac acggctgtgt attactgtgc gtacggtaga 300
tacaactgga atctttactt tgactactgg ggccagggaa ccctg 345
<210> 72
<211> 321
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 72
aattttatgc tgactcagcc ccactctgtg tcggagtctc cggggaagac ggttaccatc 60
tcctgcaccg gcagcagtgg cagcattgcc agcaactatg tgcagtggta ccagcagcgc 120
ccgggcagtg tccccaccac tgtgatctat gaggataacc aaagaccctc tggggtccct 180
gatcggttct ctggctccat cgacagctcc tccaactctg cctccctcac catctctgga 240
ctgaagactg aggacgaggc tgactactac tgtcagtctt ttgatagcag caattattgg 300
gtgttcggcg gagggaccaa g 321
<210> 73
<211> 354
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 73
gaagtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatgcta tcagctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggtac agcaaactac 180
gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggaca aatccacgag cacagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagaggcata 300
gcagctcgtc cgagctacta ctactacatg gacgtctggg gcaaagggac cacg 354
<210> 74
<211> 309
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 74
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggcaagtca gaacattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg agtcccatca 180
aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcattctca ccatcagcag tctgcaacct 240
gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacagta ccccccccac cttcggccaa 300
gggacacga 309
<210> 75
<211> 336
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 75
caggtgcagc tacagcagtg gggcgcagga ctgttgaagc cttcggagac cctgtccctc 60
acctgcgctg tctatggtgg gtccttcagt ggttactact ggagctggat ccgccagccc 120
ccagggaagg ggctggagtg gattggggaa atcaatcata gtggaagcac caactacaac 180
ccgtccctca agagtcgagt caccatatca gtagacacgt ccaagaacca gttctccctg 240
aagctgagct ctgtgaccgc cgcggacacg gctgtgtatt actgtgcgag actttataaa 300
aggaggccct ttgactactg gggccagggc accctg 336
<210> 76
<211> 312
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 76
gaaacgacac tcacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gaagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gcggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcaccgat caccttcggc 300
caagggacac ga 312
<210> 77
<211> 336
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 77
caggtgcagc tacagcagtg gggcgcagga ctgttgaagc cttcggagac cctgtccctc 60
acctgcgctg tctatggtgg gtccttcagt ggttactact ggagctggat ccgccagccc 120
ccagggaagg ggctggagtg gattggggaa atcaatcata gtggaagcac caactacaac 180
ccgtccctca agagtcgagt caccatatca gtagacacgt ccaagaacca gttctccctg 240
aagctgagct ctgtgaccgt cgcggacacg gctgtgtatt actgtgcgag actttataaa 300
aggaggccct ttgactactg gggccaggga accctg 336
<210> 78
<211> 312
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 78
gaaacgacac tcacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcacctact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatttac ggtgcatcca ggcgggccac tggctcccca 180
gagaggttca gtggcggtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag tagactggag 240
cccgaagatt tcgcagtcta ttactgtcaa cattatggta actcaccggg gacgttcggc 300
caagggacca ag 312
<210> 79
<211> 330
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 79
cagctgcagc tgcaggagtc cgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgtca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcaact atcagtggta gtggtgggag cacatactac 180
gcagactccg tgaagggcag attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
cttcaaatga gcagtctgag agctgaggac acggctgtgt attattgtgt gatgggctgg 300
tacttcgatc tctggggccg tggaaccctg 330
<210> 80
<211> 318
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 80
gaaattgtgc tgactcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat gatgcatcca acagggccac tggcatccca 180
gccaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagcctagag 240
cctgaagatt ttgcagttta ttactgtcag cagcgtagca actggccccc gagggccacc 300
ttcggccaag ggacacga 318
<210> 81
<211> 348
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 81
caggtcacct tgaaggagtc tggtcctacg ctggtgaaac ccacacagac cctcacgctg 60
acctgcacct tctctgggtt ctcactcagc actagtggag tgggtgtggg ctggatccgt 120
cagcccccag gaaaggccct ggagtggctt gcactcattt attggaatga tgataagcgc 180
tacagcccat ctctgaagag caggctcacc atcaccaagg acacctccaa aaaccaggtg 240
gtccttacaa tgaccaacat ggaccctgtg gacacagcca catattactg tgcacacagc 300
cgtatagcag ctcgtcgggt gcttgactac tggggccagg gaaccctg 348
<210> 82
<211> 306
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 82
cagtctgtgc tgactcagcc accctcggcg tcagtggccc caggaaagac ggccaggatt 60
acctgtgggg gaaacaacat tggaagtaaa agtgtgcact ggtaccagca gaagccaggc 120
cagtcccctg tgctggtcat ctatcaagat accaagcggc cctcagggat ccctgagcga 180
ttctctggct ccaactctgg gaacacagcc actctgacca tcagcggagc ccagcctatg 240
gatgaggctg actattactg tcaggcgtgg tacagcacca ttatggtatt tggcggaggg 300
accaag 306
<210> 83
<211> 339
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 83
caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggggac cctgtccctc 60
acctgcgctg tctctggtgg ctccatcagc agtagtaact ggtggagttg ggtccgccag 120
cccccaggga aggggctgga gtggattggg gaaatctatc atagtgggag caccaactac 180
aacccgtccc tcaagagtcg agtcaccata tcagtagaca agtccaagaa ccagttctcc 240
ctgaagctga gctctgtgac cgccgcggac acggccgtgt attactgtgc gagagatact 300
tctggggttg cttttgacta ctggggccag ggcaccctg 339
<210> 84
<211> 309
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 84
gaaattgtgc tgactcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcggtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ctgcagtgta ttactgtcag caatatgatc attcacccac ttttggccag 300
gggaccaag 309
<210> 85
<211> 333
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 85
gacgtgcagc tcgtggagtc tggaggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc ggaggggagg 300
atacagcttg actactgggg ccagggaacc ctg 333
<210> 86
<211> 309
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 86
ctgcctgtgc tgactcagcc cccctcagtg tccgtgtccc caggacagac agccaggatc 60
acctgctctg gatatgaatt gggggataaa tatgctttct ggtatcagca gaagccaggc 120
cagtcccctg ttctggtcat ttatcaagat accaagcggc cctcagggat ccctgagcga 180
ttctctggct ccagctctgg ggacacagcc actctgatca tcagcgggac ccaaattttg 240
gatgaggctg actattactg tcaggcgtgg gacagcagca cccatgtggt attcggcgga 300
gggaccaag 309
<210> 87
<211> 336
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 87
caggtgcagc tacagcagtg gggcgcagga ctgttgaagc cttcggagac cctgtccctc 60
acctgcgctg cctatggtgg gtccttcagt ggttactact ggagctggat ccgccagccc 120
ccagggaagg ggctggagtg gattggggaa atcaatcata gtggaagcac caactacaac 180
ccgtccctca agagtcgagt caccatatca gtagacacgt ccaagaacca gttctccctg 240
aagctgagct ctgtgaccgc cgcggacacg gctgtgtatt actgtgcgag actttataaa 300
aggaggccct ttgactactg gggccaggga accctg 336
<210> 88
<211> 312
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 88
gaaacgacac tcacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtattagc agcatctact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatttat ggtgcatcca ggagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcacttcg gacgttcggc 300
caagggacca ag 312
<210> 89
<211> 336
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 89
caggtgcagc tacagcagtg gggcgcagga ctgttgaagc cttcggagac cctgtccctc 60
acctgcgctg tctatggtgg gtccttcagt ggttactact ggagctggat ccgccagccc 120
ccagggaagg ggctggagtg gattggggaa atcaatcata gtggaagcac caactacaac 180
ccgtccctca agagtcgagt caccatatca gtagacacgt ccaagaacca gttctccctg 240
aagctgagct ctgtgaccgc cgcggacacg gctgtgtatt actgtgcgag actttataaa 300
aggaggccct ttgactactg gggccagggc accctg 336
<210> 90
<211> 312
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 90
gaaacgacac tcacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120
cgtggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatccc gcagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg gtctgggtca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcaccctc gacgttcggc 300
caagggacca ag 312
<210> 91
<211> 369
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 91
gaggtccagc tggtgcagtc tggagctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaagtc 60
tcctgcaagg cttctggtta cacctttcgt aactatggta tcagttgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcagcgctt acaatggtaa cacaaactat 180
gcacagaagc tccagggcag agtcaccatg accacagaca catccacgag cacagcctac 240
atggagctga ggagcctgag atctgacgac acggccgtgt attactgtgc gagagcggat 300
agcagcagct ggtacgtcgg gacttactac tactactacg gtatggacgt ctggggccaa 360
gggaccacg 369
<210> 92
<211> 324
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 92
gatgttgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gtcggcctcc 60
atctcctgca ggtctagtca gagcctcctg catagtaatg gatacaacta tttggattgg 120
tacctgcaga agccagggca gtctccacag ctcctgatct atttgggttc taatcgggcc 180
tccggggtcc ctgacaggtt cagtggcagt ggatcaggca cagattttac actgaaaatc 240
agcagagtgg gggctgagga tgttggggtt tattactgta tgcaagttct acaaactccc 300
tggacgttcg gccaagggac caaa 324
<210> 93
<211> 336
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 93
caggtgcagc tacagcagtg gggcgcagga ctgttgaagc cttcggagac cctgtccctc 60
acctgcgctg tctatggtgg gtccttcagt ggttactact ggagctggat ccgccagccc 120
ccagggaagg ggctggagtg gattggggaa atcaatcata gtggaagcac caactacaac 180
ccgtccctca agagtcgagt caccatatca gtagacacgt ccaagaacca gttctccctg 240
aagctgagct ctgtgaccgc cgcggacacg gctgtgtatt actgtgcgag actttataaa 300
aggaggccct ttgactactg gggccagggc accctg 336
<210> 94
<211> 312
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 94
gaaacgacac tcacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta tcaacaaaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat aatgcgtcca ggagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg gtctggggca gacttcactc tcaccatcag cagactggat 240
cctgaagatt ttgcagtgta tttctgtcag cagtatggta gctcacctca gacgttcggc 300
caagggacca ag 312
<210> 95
<211> 336
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 95
caggtgcagc tacagcagtg gggcgcagga ctgttgaagc cttcggagac cctgtccctc 60
acctgcgctg tctatggtgg gtccttcagt ggttactact ggagctggat ccgccagccc 120
ccagggaagg ggctggagtg gattggggaa atcaatcata gtggaagcac caactacaac 180
ccgtccctca agagtcgagt caccatatca gtagacacgt ccaagaacca gttctccctg 240
aagctgagct ctgtgaccgc cgcggacacg gctgtgtatt actgtgcgag actttataaa 300
aggaggccct ttgactactg gggccagggc accctg 336
<210> 96
<211> 312
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 96
gtaacgacac tcacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtga gagtgttagc agcaggtact tagcctggta ccagcagaga 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatttac ggtgcatcca ggcgggccac tggctcccca 180
gagaggttca gtggcggtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag tagactggag 240
cccgaagatt tcgcagtcta ttactgtcaa cattatggta actcaccggg gacgttcggc 300
caagggacca ag 312
<210> 97
<211> 119
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 97
Asp Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Thr Thr Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 98
<211> 106
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 98
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 99
<211> 357
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 99
gatgtgcagc tggtgcagag cggggcagag gtgaaaaagc ctggggcaag cgtcaaagtc 60
agttgtaaag cctccggcta cacattcact aggtatacta tgcactgggt gcgccaggcc 120
cctggccagg ggctggagtg gatcggctac attaacccaa gcagagggta cacaaattat 180
gctgactccg tgaaaggcag gtttactatc accaccgata agtccacctc tacagcatac 240
atggagctga gcagcctgcg aagcgaagac actgcaacct actattgcgc ccggtactat 300
gacgatcatt actgtctgga ttattgggga cagggcacta ccgtgacagt ctctagt 357
<210> 100
<211> 318
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 100
gatattgtgc tgacccagtc tccagccaca ctgagtctgt cacccggcga acgagccacc 60
ctgagctgcc gggccagcca gtccgtctct tacatgaact ggtatcagca gaagcccgga 120
aaagccccta agcggtggat ctacgacaca agcaaagtgg cttccggcgt ccccgcacga 180
ttcagtggct cagggagcgg aactgactat tctctgacca ttaatagtct ggaggctgaa 240
gatgccgcta cctactattg tcagcagtgg tcaagcaacc ctctgacatt cgggggggga 300
actaaagtgg aaatcaag 318
<210> 101
<211> 243
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 101
Asp Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Thr Thr Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Glu Gly Thr Ser Thr Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala Asp Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser
130 135 140
Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys
145 150 155 160
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
165 170 175
Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser
180 185 190
Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser
195 200 205
Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys
210 215 220
Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val
225 230 235 240
Glu Ile Lys
<210> 102
<211> 729
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 102
gatgtgcagc tggtgcagag cggggcagag gtgaaaaagc ctggggcaag cgtcaaagtc 60
agttgtaaag cctccggcta cacattcact aggtatacta tgcactgggt gcgccaggcc 120
cctggccagg ggctggagtg gatcggctac attaacccaa gcagagggta cacaaattat 180
gctgactccg tgaaaggcag gtttactatc accaccgata agtccacctc tacagcatac 240
atggagctga gcagcctgcg aagcgaagac actgcaacct actattgcgc ccggtactat 300
gacgatcatt actgtctgga ttattgggga cagggcacta ccgtgacagt ctctagtggg 360
gagggaacat ccactgggtc tggagggagt ggaggctcag gaggagcaga cgatattgtg 420
ctgacccagt ctccagccac actgagtctg tcacccggcg aacgagccac cctgagctgc 480
cgggccagcc agtccgtctc ttacatgaac tggtatcagc agaagcccgg aaaagcccct 540
aagcggtgga tctacgacac aagcaaagtg gcttccggcg tccccgcacg attcagtggc 600
tcagggagcg gaactgacta ttctctgacc attaatagtc tggaggctga agatgccgct 660
acctactatt gtcagcagtg gtcaagcaac cctctgacat tcgggggggg aactaaagtg 720
gaaatcaag 729

Claims (25)

1.一种抗体或其抗原结合片段，其包含选自以下克隆的重链可变区(VH)序列和轻链可变区(VL)序列：5C4、4H1、1D2、1C4、2B5、1F1、1H1、4A5、1D8、1D3、2F1、3C6、3D12、3A9、1F4、1H10、3C12、4G11、4A12、1A12、3G12、4F9、4G4和1E1，并且能够特异性结合磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC-3)(Genbank登录号：NP_004475.1)，或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。
2.根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其中所述VH和VL序列选自：SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2；SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4；SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6；SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8；SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10；SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12；SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14；SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16；SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18；SEQ IDNO:19和SEQ ID NO:20；SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22；SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24；SEQID NO:25和SEQ ID NO:26；SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28；SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30；SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32；SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34；SEQ ID NO:35和SEQ IDNO:36；SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38；SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:40；SEQ ID NO:41和SEQID NO:42；SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:44；SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:46；以及SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:48。
3.根据权利要求1或2所述的抗体或抗原结合片段，其能够以通过ELISA测定的EC50来计量的55nM或更小、50nM或更小、45nM或更小、40nM或更小、35nM或更小、30nM或更小、25nM或更小、20nM或更小、15nM或更小、10nM或更小、5nM或更小、1nM或更小、0.9nM或更小、0.8nM或更小、0.7nM或更小、0.6nM或更小、0.5nM或更小、0.4nM或更小、0.3nM或更小、0.2nM或更小或0.1nM或更小的亲和力结合人磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC-3)的表位。
4.根据权利要求1、2或3所述的抗体或抗原结合片段，其能够结合选自由HepG2(GPC-3高)和Hep3B(GPC-3中)组成的组的细胞系。
5.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其能够在自然杀伤(NK)细胞的存在下诱导GPC-3表达细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。
6.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其是包含人恒定区的人源化抗体。
7.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其包括单克隆抗体、人源化单克隆抗体、Fv、F(ab’)、F(ab’)2或单链Fv(scFv)片段，优选为单链Fv片段。
8.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其为选自由以下组成的组的单克隆抗体：5C4、4H1、1D2、1C4、2B5、1F1、1H1、4A5、1D8、1D3、2F1、3C6、3D12、3A9、1F4、1H10、3C12、4G11、4A12、1A12、3G12、4F9、4G4和1E1。
9.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其还包含能够结合CD3(Genbank登录号：NM_000733.4)的重链可变区(VH)序列和轻链可变区(VL)序列。
10.根据权利要求9所述的抗体或抗原结合片段，其还能够特异性结合CD-3或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。
11.根据权利要求9或10所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述能够结合CD3的重链可变区(VH)序列和轻链可变区(VL)序列包含SEQ ID NO:97和SEQ ID NO:98所示的序列。
12.根据权利要求9、10或11所述的抗体或抗原结合片段，其能够活化T细胞。
13.一种嵌合抗原受体(CAR)或表达所述嵌合抗原受体的嵌合抗原受体T细胞(CAR T)，所述嵌合抗原受体(CAR)包含：(a)根据前述权利要求中任一项所述的抗原结合片段；(b)跨膜结构域；和(c)共刺激胞内信号传导结构域。
14.一种能够编码根据前述权利要求中任一项所述的抗体或抗原结合片段的核酸，所述核酸优选地包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:50；SEQ IDNO:51和SEQ ID NO:52；SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:54；SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:56；SEQID NO:57和SEQ ID NO:58；SEQ ID NO:59和SEQ ID NO:60；SEQ ID NO:61和SEQ ID NO:62；SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:64；SEQ ID NO:65和SEQ ID NO:66；SEQ ID NO:67和SEQ IDNO:68；SEQ ID NO:69和SEQ ID NO:70；SEQ ID NO:71和SEQ ID NO:72；SEQ ID NO:73和SEQID NO:74；SEQ ID NO:75和SEQ ID NO:76；SEQ ID NO:77和SEQ ID NO:78；SEQ ID NO:79和SEQ ID NO:80；SEQ ID NO:81和SEQ ID NO:82；SEQ ID NO:83和SEQ ID NO:84；SEQ ID NO:85和SEQ ID NO:86；SEQ ID NO:87和SEQ ID NO:88；SEQ ID NO:89和SEQ ID NO:90；SEQ IDNO:91和SEQ ID NO:92；SEQ ID NO:93和SEQ ID NO:94；以及SEQ ID NO:95和SEQ ID NO:96，例如包含在表达载体中的核酸。
15.一种宿主细胞，其包含根据权利要求14所述的核酸，其中，所述宿主细胞优选地包括中国仓鼠卵巢(CHO)或HEK293细胞。
16.一种药物组合物，其包含：根据前述权利要求中任一项所述的抗体或抗原结合片段、CAR、CAR T、核酸或宿主细胞，以及药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载剂。
17.一种化合物，其包含根据权利要求1至12中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段与细胞毒性剂连接，例如用可切割的接头与细胞毒性剂连接。
18.根据权利要求17所述的化合物，其中，所述化合物包括抗体-药物缀合物。
19.根据任何前述权利要求中任一项所述的抗体、抗原结合片段、CAR、CAR T、核酸、宿主细胞、药物组合物、化合物或抗体-药物缀合物，用于治疗、预防或缓解癌症如肝细胞癌(HCC)的方法中之用途。
20.一种制备抗体或抗原结合片段的方法，所述方法包括在宿主细胞中，优选在根据权利要求15所述的宿主细胞中，表达根据权利要求14所述的核酸，并任选地分离经表达的抗体或抗原结合片段。
21.根据权利要求1至19中任一项所述的抗体、抗原结合片段、CAR、CAR T、核酸、药物组合物、化合物或抗体-药物缀合物在制备用于治疗、预防或缓解癌症如肝细胞癌(HCC)的药物中的用途。
22.一种检测肝细胞癌(HCC)细胞的方法，所述方法包括用根据权利要求1至12中任一项所述的抗体或抗原结合片段检测所述细胞中的或所述细胞的磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC-3)的表达、量或活性的调节。
23.一种诊断个体的肝细胞癌(HCC)的方法，其中所述方法包括：通过使所述个体的细胞与根据权利要求1至12中任一项所述的抗体或抗原结合片段接触来检测所述细胞中经调节的磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC-3)的表达水平；
与已知并未患有肝细胞癌(HCC)的个体的细胞中的磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3的表达水平相比较；
其中，所述磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3的表达水平增加表明所述个体患有或可能患有肝细胞癌(HCC)。
24.一种用于肝细胞癌(HCC)的诊断试剂盒，所述试剂盒包含根据权利要求1至12所述的抗体或抗原结合片段或根据权利要求14所述的核酸以及使用说明书。
25.如上文参照附图的图1至图15所述的以及如附图的图1至图15所示的抗体、抗原结合片段、核酸、药物组合物、化合物、抗体-药物缀合物、用途、方法或诊断试剂盒。
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