CN105229148B9 - α-淀粉酶组合变体 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了与α-淀粉酶变体相关的组合物和方法。所述α-淀粉酶变体可用于例如淀粉液化和糖化，用于在衣物洗涤、餐具洗涤和其它应用中清洁含淀粉的污渍，用于纺织物加工(例如退浆)，用于动物饲料中以改善消化率，以及用于烘培和酿造。

Description

α-淀粉酶组合变体
相关专利申请的交叉引用
本专利申请要求2013年3月11日提交的美国临时申请案USSN 61/776,699、2013年11月20日提交的USSN 61/906,617和2013年11 月21日提交的USSN 61/907,131的优先权，其全文以引用方式并入本 文中。
技术领域
本发明公开了与包含多种可组合突变的α-淀粉酶变体相关的组合 物和方法。该α-淀粉酶变体可用于例如淀粉液化和糖化、清洁含淀粉 的污渍、纺织物退浆、烘培、和酿造。
背景技术
淀粉由直链淀粉(15-30％w/w)和支链淀粉(70-85％w/w)的混 合物组成。直链淀粉由α-1,4-键连接的葡萄糖单元的直链组成，其分子 量(MW)为约60,000至约800,000。支链淀粉是每24-30个葡萄糖单 元包含α-1,6分支点的支链聚合物；其分子量(MW)可高达1亿。
当前通过酶催化方法由淀粉制备浓缩右旋糖糖浆形式的糖，该方法 包括：(1)用α-淀粉酶液化固体淀粉成平均聚合度为约7-10的糊精 (降低粘度)，以及(2)将所得的液化淀粉(即淀粉水解产物)用淀 粉葡糖苷酶(也称为葡糖淀粉酶或GA)糖化。所得的糖浆具有高葡萄 糖含量。随后将商业化生产的葡萄糖浆用酶促方法同分异构成右旋糖/ 果糖混合物(被称为异糖浆)。所得的糖浆也可用微生物(诸如酵母) 发酵以制备商业产品，例如包括乙醇、柠檬酸、乳酸、琥珀酸、衣康 酸、谷氨酸一钠、葡糖酸盐、赖氨酸、其它有机酸、其它氨基酸、以及 其它生化物品。发酵与糖化可同时进行(即SSF处理)以实现更经济 和更高效。
α-淀粉酶通过随机剪切内部α-1,4-糖苷键来水解淀粉、糖元和相关 的多糖。α-淀粉酶，特别是来自杆菌(Bacilli)的α-淀粉酶，已被用于 多种不同的目的，包括淀粉液化和糖化、纺织物退浆、在造纸和纸浆工 业中的淀粉改性、酿造、烘培、制备用于食品工业的糖浆、制备用于发 酵过程的原料以及在动物饲料中增加消化率。这些酶也可用于在餐具洗 涤和衣物洗涤方法中去除含淀粉的污垢和污渍。
多个出版物已经描述了α-淀粉酶中的突变。然而，并非所有突变 在不同分子中产生相同的效应，并且并非所有突变都能组合。此外，许 多突变产生的具有某些期望的特性的分子是以其它性能为代价的。对稳 健工程化的α-淀粉酶分子的需求仍然存在。
发明内容
本发明的组合物和方法涉及多种淀粉酶变体多肽及其使用方法。本发明 的组合物和方法的方面和实施例方案汇总在下列单独编号的段落中：
1.在一个方面，提供了亲本α-淀粉酶的重组变体，其包含：在对应 于E187或S241的氨基酸残基处的突变；以及在对应于选自N126、Y150、 F153、L171、T180、和I203的氨基酸残基的氨基酸残基处的至少一个突 变；其中所述α-淀粉酶变体或亲本α-淀粉酶相对于SEQ ID NO:1(其用于 编号)具有至少60％的氨基酸序列同一性；并且其中所述变体与亲本α-淀 粉酶或参考α-淀粉酶(与α-淀粉酶变体差别仅为不存在所述突变)相比具有 增强的热稳定性、洗涤剂稳定性、淀粉液化活性、和/或清洁性能。
2.在一些实施方案中，根据段落1所述的α-淀粉酶变体包含在对应 于N126、Y150、F153、L171、和I203的氨基酸残基处的至少两个突变，使 用SEQ ID NO:1来编号。
3.在一些实施方案中，根据前述段落中任一个所述的α-淀粉酶变体 还包含在对应于R178、G179、T180、和G181的至少一个氨基酸残基处的 缺失，使用SEQ ID NO:1来编号。
4.在一些实施方案中，根据前述段落中任一个所述的α-淀粉酶变体 还包含对应于R178和G179、或者T180和G181的氨基酸残基的缺失。
5.在一些实施方案中，根据前述段落中任一个所述的α-淀粉酶变体 还包含在对应于G476和/或G477的氨基酸残基处的突变，使用SEQ ID NO: 1来编号。
6.在一些实施方案中，根据前述前述段落中任一个所述的α-淀粉酶 变体还包含在对应于选自E132、Q167、T180、和A277的氨基酸残基的氨 基酸残基中的突变，使用SEQ ID NO:1来编号。
7.在一些实施方案中，根据前述段落中任一个所述的α-淀粉酶变体 还包含在对应于选自R458、T459、和D460的氨基酸残基的氨基酸残基中 的突变，使用SEQ ID NO:1来编号。
8.在一些实施方案中，根据前述段落中任一个所述的α-淀粉酶变体 还包含在对应于T180的氨基酸残基中的突变，使用SEQ ID NO:1来编号。
9.在一些实施方案中，根据前述段落中任一个所述的α-淀粉酶变体 还包含在对应于N205的氨基酸残基中的突变，使用SEQ ID NO:3来编 号。
10.在一些实施方案中，根据前述段落中任一个所述的α-淀粉酶变体 还包含在对应于选自T333G、A335S、和Q337E的氨基酸残基的氨基酸残 基中的突变，使用SEQ ID NO:3来编号。
11.在一些实施方案中，根据前述段落中任一个所述的α-淀粉酶变体 还包含在对应于选自下列的氨基酸残基位置的氨基酸残基中的突变，使用 SEQ ID NO:1来编号：6，7，8，11，14，15，20，L1，23，26，27，28，37，38， 39，40，42，45，46，48，49，50，51，52，53，54，58，61，62，68，70，71，72，73，79，80，81，82，84，85， 87，88，89，92，93，94，95，96，97，98，101，108，111，112，113，114，115，116，117，118，120，122， 123，124，126，127，129，130，131，132，133，134，136，137，138，140，142，143，144，147，148， 149，150，151，152，153，154，155，156，158，159，165，167，168，170，171，172，175，176，177， 180，181，182，187，190，191，193，199，200，201，203，206，208，210，211，212，214，215，216， 219，221，223，225，226，227，235，238，239，240，241，242，243，245，246，247，248，249，250， 252，253，254，256，257，258，260，261，262，266，267，268，269，270，271，273，276，277，279， 280，282，284，285，286，288，296，299，300，301，302，303，304，307，308，310，311，312，313， 316，317，318，320，321，325，327，335，338，342，348，349，352，356，357，360，362，363，368， 369，377，381，382，383，384，385，388，390，392，394，395，396，397，398，400，401，402，403， 404，405，407，408，410，414，415，416，418，419，420，421，422，423，424，426，428，429，430， 431，434，435，436，439，441，442，444，445，446，447，448，449，450，451，454，455，457，460， 461，462，463，464，465，466，467，469，470，471，473，474，475，476，477，479，480，481，482， 483，和484。
12.在一些实施方案中，根据前述段落中任一个所述的α-淀粉酶变体 包含突变的组合，所述突变的组合对应于选自下列的突变：
E187P+I203Y+G476K，
E187P+I203Y+G476K+R458N+T459S+D460T，
T180D+E187P+I203Y+G476K，
N126Y+T180D+E187P+I203Y+G476K，
N126Y+T180D+E187P+I203Y+Y303D+G476T+G477E，
N126Y+T180D+E187P+I203Y+Y303D+N475E+G477Q，
N126Y+T180D+E187P+I203Y+Y303R+N475E+G476T+G477R，
T038N+N088H+N126Y+T129I+N134M+F153W+L171R+T180D+E187P +I203Y+G476K+G477E，
N126Y+E132H+T180D+E187P+I203Y+Y303D+G476T+G477E，
N126Y+E187P+G476K，
N126Y+F153W+E187P+G476K，
N126Y+F153W+E187P+G4726+G477R，
N126Y+E187P+I203Y，
N126Y+I203Y+S241Q，
N126Y+T180H+E187P+I203Y，
N126Y+T180H+I203Y+S241Q，
N126Y+F153W+T180H+E187P+I203Y，
N126Y+F153W+T180H+I203Y+S241Q，
N126Y+Y150H+F153W+L171N+E187P+I203Y，
N126Y+Y150H+F153W+L171N+I203Y+S241Q，
N126Y+Y150H+F153W+L171N+T180H+E187P+I203Y，
N126Y+Y150H+F153W+L171N+T180H+I203Y+S241Q，和
N126Y+F153W+T180D+I203Y+S241Q；
其中所述变体与亲本相比具有增强的热稳定性、洗涤剂稳定性、淀粉液 化活性稳定性、或清洁性能；并且其中所述变体或所述亲本相对于SEQ ID NO：1具有至少60％的氨基酸序列同一性，使用SEQ ID NO：1来编号。
13.在一些实施方案中，根据段落1至12中任一个所述的淀粉酶变 体包含对应于N126Y+F153W+T180D+I203Y+S241Q的突变的组合以及 对应于选自E132H、Q167E、A277F、和T400K的突变的一个或多个突 变。
14.在一些实施方案中，根据段落13所述的淀粉酶变体包含对应于 选自下列的突变的突变组合：
N126Y+E132H+F153W+T180D+I203Y+S241Q+A277F，
N126Y+E132H+F153W+Q167E+T180D+I203Y+S241Q+A277F，和
N126Y+E132H+F153W+Q167E+T180D+I203Y+S241Q+A277F+T400K。
15.在一些实施方案中，根据前述段落中任一个所述的淀粉酶变体来 自噬纤维菌属(Cytophaga)物种。
16.在一些实施方案中，根据前述段落中任一个所述的淀粉酶变体来 自类芽孢杆(Paenibacillus)物种。
17.在一些实施方案中，根据前述段落中任一个所述的淀粉酶变体并 非来自芽孢杆菌(Bacillus)物种。
18.在一些实施方案中，根据前述段落中任一个所述的淀粉酶变体与 SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、或SEQ ID NO：5的氨基酸序列具有至少 70％的氨基酸序列同一性。
19.在一些实施方案中，根据前述段落中任一个所述的淀粉酶变体与 SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同 一性。
20.在一些实施方案中，根据段落1至18中任一个所述的淀粉酶变 体与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、或SEQ ID NO：5的氨基酸序列具有至 少80％的氨基酸序列同一性。
21.在一些实施方案中，根据段落1至18中任一个所述的淀粉酶变 体与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、或SEQ ID NO：5的氨基酸序列具有至 少90％的氨基酸序列同一性。
22.在另一方面，提供了包含根据前述段落中任一个所述的α-淀粉酶 变体的组合物。
23.在一些实施方案中，根据段落22所述的组合物有效用于从衣 物、餐具、或纺织物中去除含淀粉的污渍。
24.在一些实施方案中，根据段落22或23所述的组合物还包含表面 活性剂。
25.在一些实施方案中，根据段落22至24中任一个所述的组合物是 洗涤剂组合物。
26.在一些实施方案中，根据段落22至24中任一个所述的组合物是 衣物洗涤剂或衣物洗涤剂添加剂。
27.在一些实施方案中，根据段落22至24中任一个所述的组合物是 手动餐具洗涤剂或自动餐具洗涤剂。
28.在一些实施方案中，根据段落22至24中任一个所述的组合物还 包含一种或多种其他的酶，所述其他的酶选自蛋白酶、半纤维素酶、纤维素 酶、过氧化物酶、脂解酶、金属脂解酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯 酶、过水解酶(perhydrolase)、角质酶、果胶酶、果胶酸裂合酶、甘露聚 糖酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂氧合酶、木质酶、支链淀 粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶(pentosanase)、麦拉宁酶(melanase)、β-葡 聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶、漆酶、金属蛋白酶、阿马 多里酶(amadoriase)、葡糖淀粉酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、植酸酶、异构 酶、转移酶、以及除根据段落1至21中任一个所述的淀粉酶之外的淀粉 酶。
29.在一些实施方案中，根据段落21所述的组合物用于液化淀粉。
30.在一些实施方案中，根据段落21所述的组合物用于糖化包含淀 粉的组合物、用于SSF后液化、或用于无在先液化的直接SSF。
31.在一些实施方案中，根据段落21所述的组合物用于制备发酵饮 料。
32.在一些实施方案中，根据段落21所述的组合物用于制备烘培的 食品产品。
33.在一些实施方案中，根据段落21所述的组合物用于纺织物退 浆。
34.在另一方面，提供了用于从表面去除含淀粉的污渍或污垢的方 法，该方法包括：在包含有效量的根据段落1至21中任一个所述的淀粉酶 变体的组合物存在下接触表面，以及使所述多肽水解含淀粉的污渍中存在的 淀粉组分以生成溶解在含水组合物中的更小的淀粉衍生分子，从而从表面去 除含淀粉的污渍。
35.在根据段落34所述的方法的一些实施方案中，所述含水组合物 还包含表面活性剂。
36.在根据段落34或35中任一个所述的方法的一些实施方案中，所 述表面是纺织物表面或餐具表面。
37.在根据段落34至36中任一个所述的方法的一些实施方案中，所 述组合物还包含至少一种其他的酶，所述其他的酶选自蛋白酶、半纤维素 酶、纤维素酶、过氧化物酶、脂解酶、金属脂解酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷 脂酶、酯酶、过水解酶、角质酶、果胶酶、果胶酸裂合酶、甘露聚糖酶、角 蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂氧合酶、木质酶、支链淀粉酶、鞣 酸酶、戊聚糖酶、麦拉宁酶、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软 骨素酶、漆酶、金属蛋白酶、阿马多里酶、葡糖淀粉酶、阿拉伯呋喃糖苷 酶、植酸酶、异构酶、转移酶、以及除根据段落1-21中任一个所述的淀粉 酶之外的淀粉酶。
38.在另一方面，提供了用于糖化包含淀粉的组合物以制备包含葡萄 糖的组合物的方法，其中所述方法包括：
(i)使所述包含淀粉的溶液与有效量的根据段落1至21中任一个所 述的淀粉酶变体接触；以及
(ii)使所述包含淀粉的溶液糖化以制备包含葡萄糖的组合物；其中所 述淀粉酶变体催化淀粉溶液糖化为葡萄糖或其它富集的碳水化合物糖浆。
39.在根据段落38所述的方法的一些实施方案中，所述包含淀粉的 组合物包含液化的淀粉、糊化的淀粉、颗粒状的淀粉、或在低于其胶凝温度 热处理的淀粉。
40.在根据段落38或39所述的方法的一些实施方案中，所述发酵是 同步糖化发酵(SSF)反应。
41.在根据段落38至40中任一个所述的方法的一些实施方案中，所 述方法还包括使醪液和/或糖化醪与淀粉酶接触。
42.在一些实施方案中，根据段落38至41中任一个所述的方法还包 括向所述淀粉溶液添加葡糖淀粉酶、己糖激酶、木聚糖酶、葡萄糖异构酶、 木糖异构酶、磷酸酶、植酸酶、支链淀粉酶、β-淀粉酶、非所述α-淀粉酶变 体的α-淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、半纤维素酶、脂肪酶、角质酶、异淀粉 酶、氧化还原酶、酯酶、转移酶、果胶酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、或它 们的组合。
43.在根据段落38至42中任一个所述的方法的一些实施方案中，所 述淀粉酶是由宿主细胞表达和分泌的。
44.在根据段落43所述的方法的一些实施方案中，所述包含淀粉的 组合物与所述宿主细胞接触。
45.在根据段落43或44所述的方法的一些实施方案中，所述宿主细 胞还表达和分泌一种或多种选自下列的酶：葡糖淀粉酶、己糖激酶、木聚糖 酶、葡萄糖异构酶、木糖异构酶、磷酸酶、植酸酶、支链淀粉酶、β-淀粉 酶、非所述α-淀粉酶变体的α-淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、半纤维素酶、脂 肪酶、角质酶、异淀粉酶、氧化还原酶、酯酶、转移酶、果胶酶、α-葡糖苷 酶、和β-葡糖苷酶。
46.在根据段落43至45中任一个所述的方法的一些实施方案中，所 述宿主细胞还表达和分泌葡糖淀粉酶。
47.在根据段落43至46中任一个所述的方法的一些实施方案中，所 述宿主细胞能够发酵所述组合物。
48.在另一方面，提供了一种组合物，其包含通过根据段落38至47 中任一个所述的方法制备的葡萄糖。
49.在另一方面，提供了一种液化的淀粉，其通过根据段落38至47 中任一个所述的方法制备。
50.在另一方面，提供了一种发酵饮料，其通过根据段落38至47中 任一个所述的方法制备。
51.在另一方面，提供了根据段落1至21中任一个所述的淀粉酶在 制备包含葡萄糖的组合物中、在制备液化的淀粉中、在制备发酵饮料中、在 清洁含淀粉的污渍中、或在纺织物退浆中的用途。
52.在另一方面，提供了纺织物退浆的方法，该方法包括将退浆组合 物与已上浆纺织物接触足以将纺织物退浆的时间，其中所述退浆组合物包含 根据段落1至21中任一个所述的α-淀粉酶变体。
53.在另一方面，提供了编码根据段落1至21中任一个所述的多肽 的分离的多核苷酸。
54.在另一方面，提供了包含根据段落53所述的多核苷酸的表达载 体。
55.在另一方面，提供了包含根据段落54所述的表达载体的宿主细 胞。
56.在另一方面，提供了根据段落1至21中任一个所述的多肽，所 述多肽由如下多核苷酸编码，所述多核苷酸在严格条件下与互补于SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:33、或SEQ ID NO:38的全长多核苷酸的多核苷酸杂 交。
所述组合物和方法的这些和其它方面以及实施方案从本发明的说明书和 附图将显而易见。
附图说明
图1示出了使用带默认参数的Clustal W进行的CspAmy2α-淀粉 酶(SEQ ID NO:1)、PcuAmy1α-淀粉酶(SEQ ID NO:3)和BASE α-淀粉酶的氨基酸序列比对。
图2是示出了在pH 8下，不同剂量的CspAmy2-v5和CspAmy2– v6作用于CS-28稻米淀粉的清洁有益效果的图。
图3是示出了CspAmy2-v5和CspAmy2-v6在缓冲液中的热稳定性 的图。
图4是示出了CspAmy2-v5和CspAmy2-v6在含钙缓冲液中的热稳 定性的图。
图5是示出了CspAmy2-v5和CspAmy2-v6在OMOTM Color洗涤 剂中的洗涤剂稳定性的图。
图6是示出了CspAmy2-v5和CspAmy2-v6在EPSILTM Perfect洗 涤剂中的洗涤剂稳定性的图。
图7是示出了C16变体与参考分子CspAmy2-v1-E187P和 CspAmy2-v1-S241Q的相对半衰期和性能指数的表。
图8是示出了在pH 4.5和65℃下，C16变体与参考分子 CspAmy2-v1-E187P和CspAmy2-v1-S241Q的热稳定性的图。
图9是示出了在pH 5.0和70℃下，C16变体与参考分子 CspAmy2-v1-E187P和CspAmy2-v1-S241Q的热稳定性的图。
图10是示出了在pH 5.7和85℃下，C16变体与参考分子 CspAmy2-v1-E187P和CspAmy2-v1-S241Q的热稳定性的图。
图11是示出了CspAmy2-v5、CspAmy2-v171、CspAmy2-v172、 和ACE-QK的洗涤剂稳定性的图。
图12是示出了在手洗餐具洗涤应用中CspAmy2-v5和的相对清洁性能的图。
图13包括了示出了WfK B基于柠檬酸盐的洗涤剂(A)和WfK C 基于磷酸盐的洗涤剂(B)的组合物的表。
图14和图15示出了在0、1、2、4或8ppm剂量下，在WfK B洗 涤剂中，CspAmy2-v6(正方形)相比于(菱形)针对混 合淀粉污渍(图14)和面食污渍(图15)的清洁性能。
图16和图17示出了在0、1、2、4或8ppm剂量下，在WfK B洗 涤剂中，CspAmy2-v6(正方形)相比于(圆圈)针对 混合淀粉污渍(图16)和面食污渍(图17)的清洁性能。
图18和图19示出了在0、1、2、4或8ppm剂量下，在WfK C洗 涤剂中，CspAmy2-v6(正方形)相比于(菱形)针对混 合淀粉污渍(图18)和面食污渍(图19)的清洁性能。针对两种污 渍，CspAmy2-v6表现明显胜过
图20是示出了在高温下展现出具有改善的水解玉米淀粉的C18P 变体的示例的图。示出CspAmy2-C18P(N126Y+F153W+T180D+ I203Y+S241Q)作为参考。
图21是示出了展现出具有改善的水解来自玉米的支链淀粉的C18P 变体的示例的图。示出C18P作为参考。
图22是示出了展现出具有改善的从淀粉生成还原糖的变体的示例 的图。示出C18P作为参考。
图23是示出了展现出具有改善的从淀粉释放碘染色物质的C18P 变体的示例的图。示出C18P作为参考。
图24是示出了由三种C18P变体制备的玉米粉浆液的粘度减少的 图，记录为流动性(1/粘度)相对于变体的剂量(μg)。示出C18P和 C16F作为参考。
图25是示出在玉米淀粉微量测定中，具有位置G476和G477处突 变的不同成对组合的C16F变体相对于C16F对照的PI值的表。对于回 复突变(即，G476G和G477G)的PI值根据经验确定。
图26是示出在玉米直链淀粉水解测定中，具有位置G476和G477 处突变的不同成对组合的C16F变体相对于C16F对照的PI值的表。对 于回复突变(即，G476G和G477G)的PI值根据经验确定。
图27是示出了CspAmy2-C25F、B、和A相比于C16F的相对液 化性能的图。
图28是示出了在0.015ppm下，CspAmy2-v179、v186和v191相 比于和ACE-QK的清洁测定性能结果的图。
图29是示出了在77℃至97℃的温度范围内，CspAmy2变体v5、 v179、v186、和v191相比于和ACE-QK的相对热稳定 性的图。
图30是示出了在常规HDL中，CspAmy2变体v5和v179 相比于和ACE-QK的相对洗涤剂中贮存稳定性的图。
图31是示出了在美国PODSTM中，CspAmy2变体v5和 v179相比于和ACE-QK的相对洗涤剂中贮存稳定性的 图。
图32是示出了在欧洲ARIELTM HDL中，CspAmy2变体v5和 v179相比于和ACE-QK的相对洗涤剂中贮存稳定性的 图。
图33是示出了在欧洲OMOTM Color HDL中，CspAmy2变体v5和 v179相比于和ACE-QK的相对洗涤剂中贮存稳定性的 图。
图34是示出了在中国OMOTM Color HDL中，CspAmy2变体v5和 v179相比于和ACE-QK的相对洗涤剂中贮存稳定性的 图。
图35是示出了在中国LIBYTM HDL中，CspAmy2变体v5和v179 相比于和ACE-QK的相对洗涤剂中贮存稳定性的图。
图36是示出了在pH 8.0的缓冲液中，PcuAmy1变体v1、v6、v8 和v16相比于和ACE-QK的相对清洁性能的图。酶的 剂量标注在X轴上。
图37是示出了在标示温度下的缓冲液中，PcuAmy1变体v1、v6、 v8、和v16相比于的相对热稳定性的图(使用了5ppm 的PcuAmy1变体和10ppm的)。
图38是示出了在95℃下孵育标示时间量后ΔRG BASE变体的相对 热稳定性的图。
图39示出了CspAmy2-v1的三维结构的一部分，突出显示了在位 置132处的谷氨酸和在位置180处的苏氨酸之间相互作用的可能性。
图40示出了CspAmy2-v1的三维结构的一部分，突出显示了在位 置132处的谷氨酸和在位置180处的组氨酸之间相互作用的可能性。
图41示出了CspAmy2-v1的三维结构的一部分，突出显示了在位 置132处的谷氨酸和在位置180处的天冬氨酸之间相互作用的可能性。
图42示出了CspAmy2-v1的三维结构的一部分，突出显示了在位 置132处的组氨酸和在位置180处的天冬氨酸之间相互作用的可能性。
图43是SDS/PAGE凝胶的图像，示出了在增大量的GG36蛋白酶 存在下PcuAmy1-v1的剪切。凝胶右侧的字母表示(A)完整的全长 PcuAmy1-v1，(B)PcuAmy1-v1的第一剪切产物，(C)GG36蛋白 酶，(D)在GG36蛋白制品中的污染物，和(E)PcuAmy1-v1的第 二剪切产物。
图44是示出了在与GG36蛋白酶孵育后，PcuAmy1和若干工程化 的变体的残余α-淀粉酶活性的图。
图45是SDS/PAGE凝胶的图像，示出了在与GG36蛋白酶孵育 后，PcuAmy1和若干工程化的变体的蛋白酶剪切。
图46是示出了在37℃下，在MIFA Total洗涤剂中与GG36蛋白 酶孵育至多14天后，PcuAmy1-v1和若干工程化的变体的稳定性的 图。
图47是示出了在37℃下，在MIFA Total洗涤剂中与GG36蛋白 酶孵育3或14天后，PcuAmy1-v1和若干工程化的变体的稳定性的 图。
图48是示出了在37℃下，在Unilever Omo洗涤剂中与GG36蛋 白酶孵育至多14天后，PcuAmy1-v1和若干工程化的变体的稳定性的 图。
图49是示出了在37℃下，在Unilever Omo洗涤剂中与GG36蛋 白酶孵育3或14天后，PcuAmy1-v1和若干工程化的变体的稳定性的 图。
图50是示出了相比于两个商业基准测试，PcuAmy1-3B和 PcuAmy1-3L在pH 8.0的缓冲液中的剂量依赖性的清洁性能的图。
图51是示出了相比于两个商业基准测试，PcuAmy1-3B和 PcuAmy1-3L在Persil Universal Gel Gold洗涤剂中的稳定性的图。
图52是示出了在37℃下，在MIFA Total洗涤剂中与GG36蛋白 酶孵育3或14天后，PcuAmy1-v1和若干工程化的变体的稳定性的 图。
具体实施方式
描述了与淀粉酶变体相关的组合物和方法。该变体是通过实验方法 的组合发现的，如所附实施例中详述。方法包括使用位点评估文库 (site evaluation libraries，SELs)和基于结构的分析。针对淀粉酶变 体的示例性应用是用于淀粉液化和糖化、用于在衣物洗涤、餐具洗涤和 其它应用中清洁含淀粉的污渍、用于纺织物处理(例如退浆)、用于动 物饲料中增加消化率、以及用于烘培和酿造。下面是对所述组合物和方 法的这些和其它方面的详述。
在描述本发明的组合物和方法的各个方面和实施方案之前，先说明 下列定义和缩写。
1.定义和缩写
根据该详细描述，下面的缩写和定义适用。需要注意的是，单数形 式“一种”，“一个”和“该”包括复数对象，除非上下文另有明确说 明。因此，例如，“酶”的涵义包括多个此类酶，并且“该剂量”的涵 义包括一个或多个剂量的涵义及其本领域的技术人员已知的等同物，等 等。
为便于阅读，本发明的文档被组织成若干章节；然而，读者将会理 解，在一个章节作出的陈述可能适用于其它章节。在这种方式中，用于 本公开的不同章节的标题不应理解为限制性的。
除非另外指明，本文所用的所有技术和科学术语具有与本领域普通 技术人员通常所理解相同的含义。下文提供了以下术语。
1.1.缩写和缩略语
下列缩写/缩略语具有下列含义，除非另外指明：
ABTS 2,2-连氮基-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸
AE或AEO 醇乙氧基化物
AES或AEOS 醇乙氧基硫酸化物
AkAA 白曲霉(Aspergillus kawachii)α-淀粉酶
AnGA 黑曲霉(Aspergillus niger)葡糖淀粉酶
AOS α-烯基磺酸盐
AS 烷基硫酸盐
cDNA 互补DNA
ct/kg 美分/公斤(美国流通)
CMC 羧甲基纤维素
DE 右旋糖当量
DNA 脱氧核糖核酸
DPn 具有n个子单元的糖类聚合度
ds或DS 干固体
DTMPA 二亚乙基三胺五乙酸
EC 酶学委员会
EDTA 乙二胺四乙酸
EO 环氧乙烷(聚合物片段)
EOF 发酵结束
FH 法国硬度
GA 葡糖淀粉酶
GAU/g ds 葡糖淀粉酶活性单位/克干固体
GH 通用硬度
HDL 高浓度液体洗涤剂
HDD 高效粉末洗涤剂
HSG 高泡颗粒状洗涤剂
HFCS 高果糖玉米糖浆
HgGA 灰腐质霉(Humicola grisea)葡糖淀粉酶
IPTG 异丙基β-D-硫代半乳糖苷
IRS 不溶解的残余淀粉
kDa 千道尔顿
LAS 直链烷基苯磺酸盐
LAT，BLA 地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)淀粉酶
MW 分子量
MWU 改性的Wohlgemuth单位；1.6x10-5mg/MWU＝
单位活性
NCBI 美国国家生物技术信息中心
NOBS 壬酰氧基苯磺酸盐
NTA 次氮基乙酸
OxAm Purastar HPAM 5000L(Danisco US Inc.)
PAHBAH 对-羟基苯甲酸酰肼
PEG 聚乙二醇
pI 等电点
PI 性能指数
ppm 百万分之一，例如，μg蛋白质/克干固体
PVA 聚(乙烯醇)
PVP 聚(乙烯吡咯烷酮)
RCF 相对离心/向心力(即，x重力)
RNA 核糖核酸
SAS 链烷磺酸酯
SDS-PAGE 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳
SSF 同步糖化发酵
SSU/g固体 可溶淀粉单位/克干固体
sp. 种
TAED 四乙酰乙二胺
Tm 熔融温度
TrGA 里氏木霉(Trichoderma reesei)葡糖淀粉酶
w/v 重量/体积
w/w 重量/重量
v/v 体积/体积
wt％ 重量百分比
℃ 摄氏度
H2O 水
dH2O或DI 去离子水
dIH2O 去离子水，Milli-Q过滤
g或gm 克
μg 微克
mg 毫克
kg 千克
μL和μl 微升
mL和ml 毫升
mm 毫米
μm 微米
M 摩尔
mM 毫摩尔
μM 微摩尔
U 单位
sec 秒
min(s) 分钟
hr(s) 小时
DO 溶解氧
Ncm 牛顿·厘米
ETOH 乙醇
eq. 当量
N 正常
uPWA 来源于沃斯氏热球菌(Pyrococcus woesei)的α-
淀粉酶变体
PWA 来源于沃斯氏热球菌的α-淀粉酶
MWCO 截留分子量
SSRL 斯坦福同步辐射光源
PDB 蛋白质数据库
CAZy 碳水化合物-活性酶数据库
Tris-HCl 三羟甲基氨基甲烷盐酸盐
HEPES 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸
1.2.定义
术语“淀粉酶”或“淀粉分解酶”是指除其它事项外，能够催化淀 粉降解的酶。α-淀粉酶是剪切淀粉中α-D-(1→4)O-糖苷键的水解 酶。一般来讲，α-淀粉酶(EC 3.2.1.1；α-D-(1→4)-葡聚糖葡聚糖水 解酶)被定义为以随机方式剪切淀粉分子内的α-D-(1→4)O-糖苷 键、生成包含三个或更多个(1-4)-α-键连接的D-葡萄糖单元的多糖的 在内部起作用的酶。相比之下，在外部起作用的淀粉分解酶，诸如β- 淀粉酶(EC 3.2.1.2；α-D-(1→4)-葡聚糖麦芽糖水解酶)和一些产物 特异性的淀粉酶，如生麦芽糖的α-淀粉酶(EC 3.2.1.133)，从底物的 非还原端剪切多糖分子。β-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.20；α-D- 葡糖苷葡萄糖水解酶)、葡糖淀粉酶(EC 3.2.1.3；α-D-(1→4)-葡聚 糖葡萄糖水解酶)、和产物特异性的淀粉酶如麦芽四糖苷酶 (maltotetraosidases)(EC 3.2.1.60)和麦芽六糖苷酶 (maltohexaosidase)(EC 3.2.1.98)能够生成特定长度的麦芽低聚糖 或特定麦芽低聚糖的浓缩糖浆。
本文中“酶单位”是指在特定的测定条件下，每单位时间形成的产 物的量。例如，“葡糖淀粉酶活性单位”(GAU)被定义为在60℃、 pH 4.2下，每小时从可溶性淀粉底物(4％DS)产生1g葡萄糖的酶 量。“可溶性淀粉单位”(SSU)是50℃、pH 4.5下，每分钟从可溶 性淀粉底物(4％DS)产生1mg葡萄糖的酶量。DS是指“干固体”。
术语“淀粉”是指由植物的络合多糖碳水化合物组成的任何材料、 由具有通式(C6H10O5)x的直链淀粉和支链淀粉组成的任何材料，其中 x可为任何数目。该术语包括基于植物的材料，诸如谷物、谷类食物、 草、块茎和根，以及更具体地得自小麦、大麦、玉米、黑麦、稻、高 粱、麸皮、木薯(cassava)、粟、蜀黍、马铃薯、甘薯和木薯淀粉 (tapioca)的材料。术语“淀粉”包括颗粒状的淀粉。术语“颗粒状 的淀粉”是指原料，即，未烹饪过的淀粉，例如未经糊化的淀粉。
就多肽而言，术语“野生型”、“亲本的”、或“参考的”是指天 然存在的多肽，所述多肽不包括在一个或多个氨基酸位置处的人工置 换、插入或缺失。相似地，就多核苷酸而言，术语“野生型”、“亲本 的”、或“参考的”是指天然存在的多核苷酸，所述多核苷酸不包括人 工的核苷改变。然而，需注意编码野生型、亲本的或参考的多肽的多核 苷酸不限于天然存在的多核苷酸，并且涵盖编码野生型、亲本的或参考 的多肽的任何多核苷酸。
提及的野生型多肽应理解为包括所述多肽的成熟形式。“成熟的” 多肽或其变体是不存在信号序列的多肽，例如，在所述多肽的表达过程 中或之后剪切自所述多肽的未成熟形式。
就多肽而言，术语“变体”是指不同于指定的野生型、亲本的或参 考的多肽的多肽，其中包括一个或多个天然存在的或人工的氨基酸的置 换、插入或缺失。相似地，就多核苷酸而言，术语“变体”是指核苷酸 序列不同于指定的野生型、亲本的或参考的多核苷酸的多核苷酸。该野 生型、亲本的或参考的多肽或多核苷酸的鉴定在上下文中是显而易见 的。
就本发明的α-淀粉酶而言，“活性”是指α-淀粉酶活性，其能够 如本文所述进行测量。
术语“性能益处”是指在分子的期望属性上的改善。示例性的性能 益处包括但不限于增加淀粉底物的水解，增强谷物、谷类食物或其它淀 粉底物的液化性能，增强清洁性能，增强热稳定性，增强洗涤剂稳定 性，增强贮存稳定性，增加溶解度，pH曲线变化，降低钙依赖性，增 加比活性，底物特异性的改性，底物结合的改性，pH依赖性的活性的 改性，pH依赖性的稳定性的改性，增强氧化稳定性以及增加表达。在 一些情况下，所述性能益处是在相对低温度下实现的。在一些情况下， 所述性能益处是在相对高温度下实现的。
术语“蛋白酶(protease)”和“蛋白酶(proteinase)”是指具有 执行“蛋白质分解”或“蛋白酶剪切”的能力的酶蛋白，所述“蛋白质 分解”或“蛋白酶剪切”是指多肽或形成蛋白质的多肽链中将氨基酸连 接在一起的肽键的水解。作为蛋白质消化酶的蛋白酶的这种活性被称为 “蛋白质分解活性”。存在许多熟知的方法用于测量蛋白质分解活性 (参见例如，Kalisz，“Microbial Proteinases，”In：Fiechter(编 辑)，Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology， (1988))。例如，蛋白质分解的活性可通过对比测定探知，该对比物 测定分析了相应的蛋白酶水解商业底物的能力。在蛋白酶或蛋白质分解 的活性的分析中可用的示例性底物包括但不限于二甲基酪蛋白(Sigma C-9801)、牛胶原(Sigma C-9879)、牛弹性蛋白(Sigma E-1625)、 和牛角蛋白(ICN Biomedical 902111)。利用这些底物的比色测定是 本领域所熟知的(参见例如，WO 99/34011和美国专利6,376,450，这 些专利均以引用方式并入本文)。pNA测定(参见例如，Del Mar等 人，Anal.Biochem.99：316-320(1979))也可用于测定在梯度洗脱过 程中收集的级分的活性酶浓度。该测定测量了随着酶水解可溶性合成肽 底物(诸如琥珀酰-丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-对硝基苯胺(suc- AAPF-pNA))而释放对硝基苯胺的速率，并且剪切发生在氨基酸(苯 丙氨酸)C末端和p-NA之间，从而导致从所述水解反应中产生黄色， 所述黄色在分光光度计上在410nm处进行测量并且与活性酶浓度成正 比。所述颜色变化的测量使对所述反应速率的计算成为可能。此外，可 使用在280纳米(nm)处的吸光度测量来测定总蛋白质浓度。在使用 参考标准时，活性酶/总蛋白质比率得出了酶纯度。
术语“丝氨酸蛋白酶”是指剪切蛋白质中肽键的酶，在酶中丝氨酸 充当了酶活性位点处的亲核氨基酸。丝氨酸蛋白酶基于其结构分成两大 类：胰凝乳蛋白酶样(胰蛋白酶样)的或枯草杆菌蛋白酶样的。在衣物 洗涤剂和餐具洗涤剂中最常用的是丝氨酸蛋白酶，特别是枯草杆菌蛋白 酶。
术语“筒状结构(TIM barrel)”是指包括沿肽主链交替分布的8 个α-螺旋和8个平行的β-折叠的三维多肽结构。
就多肽中的氨基酸残基而言，术语“表面暴露的”是指在多肽完整 并且正确折叠(即非变性或片段化)时，位于多肽外表面的残基。就 α-淀粉酶而言，这种结构称之为筒状结构。
就多肽中的氨基酸残基而言，术语“非经典的”是指基于使用具有 默认参数的Clustal W的类似分子的氨基酸序列比对，通常不会在给定 位置发现的氨基酸残基。在一些情况下，特定残基存在于10个类似分 子中的仅一个的给定位置处、20个类似分子中的一个的给定位置处、 30个类似分子中的一个的给定位置处、50个类似分子中的一个的给定 位置处、或甚至100个类似分子中的一个中的给定位置处。
“组合的变体”是包含两个或更多个(例如2、3、4、5、6、7、 8、9、10或更多个)突变、置换、缺失和/或插入的变体。
“可组合的突变”是在任何可用于生成组合的变体的氨基酸位置处 的突变。可组合的突变改善了所述分子(在本案中，淀粉酶)的至少一 个期望的属性，同时没有显著降低表达、活性或稳定性。
术语诸如“钙结合环中保留的非G残基”、“在钙结合环中保留 的非G氨基酸残基”和类似术语是指在α-淀粉酶变体的钙结合环中的 氨基酸残基，其在去除了亲本α-淀粉酶的钙结合环中至少一个氨基酸 残基后保留在所述变体中，并且其不是甘氨酸残基。非G残基可为 “XG”对的一员，所述“XG”对在大多数α-淀粉酶中有两个，并且 可为在成对去除了亲本α-淀粉酶的钙结合环中两个XG残基对中的一 个后保留的非G残基。
在位置132(使用SEQ ID NO:1来编号)处的残基和 X1G/S1X2G2基序(对应于SEQ ID NO:1的位置178-181处的残基) 中保留的非G残基之间的“稳定相互作用”是指在受试氨基酸残基的 侧链间形成的氢键或盐桥。稳定性是电荷平衡相互作用的残基所引起 的，使得如果一个残基在预选pH下带正电荷，其它的带负电荷，则总 体电荷为零。
在用于提及的主题细胞、核酸、蛋白质或载体时，术语“重组的” 表明所述主题已经从其天然状态得到修改。因此，例如，重组细胞表达 在天然(非重组的)形式的细胞内不存在的基因，或以不同于天然水平 的水平或在不同于天然存在的条件下表达天然基因。重组核酸与天然序 列的区别在于一个或多个核苷酸和/或有效地连接至异源的序列，例如 在表达载体中的异源启动子。重组蛋白与天然序列的区别在于一个或多 个氨基酸和/或与异源序列融合。包含编码淀粉酶的核酸的载体是重组 载体。
术语“回收的”、“分离的”和“独立的”是指去除了天然存在的 与之天然伴随的至少一种其它材料或组分的化合物、蛋白质(多肽)、 细胞、核酸、氨基酸或其它特定材料或组分。其“分离的”多肽包括但 不限于包含异源宿主细胞中表达的分泌多肽的培养物培养液。
术语“经纯化的”是指处于相对纯净状态的材料(例如分离的多肽 或多核苷酸)，例如，至少约90％纯的、至少约95％纯的、至少约 98％纯的、或甚至至少约99％纯的。
术语“富集的”是指约50％纯的、至少约60％纯的、至少约70％ 纯的、或甚至至少约70％纯的材料(例如分离的多肽或多核苷酸)。
关于酶的术语“热稳定的”和“热稳定性”是指酶暴露于升高的温 度后保持活性的能力。通过以分钟、小时或天给出的酶半衰期(t1/2) 测量酶(诸如淀粉酶)的热稳定性，所述酶半衰期(t1/2)指期间半数 的酶活性在给定条件下损失。可通过在暴露于升高的温度(即，通过升 高的温度攻击)后测量残余的α-淀粉酶活性来计算半衰期。
关于酶的“pH范围”是指在其中酶表现出催化活性的pH值的范 围。
关于酶的术语“pH稳定的”和“pH稳定性”是指酶在跨宽泛的 pH值范围、在预定时段内(例如15分钟、30分钟、1小时)保持活性 的能力。
术语“氨基酸序列”与术语“多肽”、“蛋白质”和“肽”同义， 是互换使用的。在此类氨基酸序列表现出活性的情况下，它们可被称为 “酶”。对于氨基酸残基使用了常规的单字母或三字母代码，以标准的 氨基至羧基末端的方向(即，N→C)呈现氨基酸序列。
术语“核酸”涵盖了DNA、RNA、异源双链核酸分子以及能够编 码多肽的合成分子。核酸可为单链或双链的，并且可被化学修饰。术语 “核酸”和“多核苷酸”是互换使用的。因为遗传密码是简并的，可使 用一种以上的密码子来编码特定氨基酸，本发明的组合物和方法涵盖编 码特定氨基酸序列的核苷酸序列。除非另外指明，核酸序列以5′至3′方 向呈现。
“杂交”是指在印迹杂交技术和聚合酶链反应(PCR)技术中发生 的一条核酸链与互补链形成双链(即与互补链碱基配对)的过程。严格 杂交条件通过在下列条件下的杂交举例说明：65℃和0.1X SSC(其中 1X SSC＝0.15M NaCl，0.015M柠檬酸三钠，pH 7.0)。杂交的双链 核酸通过熔融温度(Tm)来表征，在所述温度下杂交的核酸的一半与 互补链未配对。在双链内错配的核苷酸降低了Tm。与在SEQ ID NO: 2的核苷酸和其相同互补序列间形成的双链相比，编码α-淀粉酶变体的 核酸的Tm可降低1℃-3℃或更多。
“合成的”分子是通过体外化学合成或酶法合成而非通过生物体制 备的。
关于细胞使用的术语“转化的”、“稳定转化的”和“转基因的” 是指细胞包含非天然的(例如异源的)核酸序列，所述非天然核酸序列 整合进细胞基因组中或作为在多个世代中保留的附加体携带。
在将核酸序列插入细胞中的上下文中，术语“导入的”是指本领域 已知的“转染”、“转化”或“转导”。
“宿主菌株”或“宿主细胞”是已经导入了表达载体、噬菌体、病 毒或其它DNA构建体，包括编码感兴趣的多肽(例如淀粉酶)的多核 苷酸的生物体。示例性的宿主菌株是能够表达感兴趣的多肽和/或发酵 糖类的微生物细胞(例如，细菌、丝状真菌、和酵母)。术语“宿主细 胞”包括从细胞创建的原生质体。
关于多核苷酸或蛋白质的术语“异源性的”是指在宿主细胞中不是 天然存在的多核苷酸或蛋白质。
关于多核苷酸或蛋白质的术语“内源性的”是指在宿主细胞中天然 存在的多核苷酸或蛋白质。
术语“表达”是指基于核酸序列产生多肽的过程。该过程包括转录 和翻译两者。
“选择标记”或“可选择标记”是指能够在宿主细胞中表达以有利 于选择带有所述基因的宿主细胞的基因。可选择标记的示例包括但不限 于抗微生物物质(例如，潮霉素、博莱霉素、或氯霉素)和/或赋予代 谢优势(诸如对宿主细胞的营养优势)的基因。
“载体”是指被设计以将核酸导入一种或多种细胞类型的多核苷酸 序列。载体包括克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、噬菌体颗粒、 盒等等。
“表达载体”是指包含编码感兴趣的多肽的DNA序列的DNA构 建体，其中编码序列有效地连接至合适的能够影响DNA在合适的宿主 中表达的控制序列。此类控制序列可包括影响转录的启动子、控制转录 的任选的操纵子序列、编码合适的在mRNA上的核糖体结合位点的序 列，增强子以及控制转录和翻译终止的序列。
术语“有效地连接”是指指定的组分处于一种(包括但不限于邻 接)允许它们以预期方式发挥功能的关系。例如，调控序列有效地连接 至编码序列使得所述编码序列的表达处于所述调控序列的控制之下。
“信号序列”是连接至蛋白质的N末端部分的氨基酸序列，其有 利于蛋白质分泌至细胞外。细胞外蛋白质的成熟形式不含信号序列，它 在分泌过程中被剪切了。
“生物活性”是指序列具有特定的生物活性，诸如酶活性。
术语“比活性”是指在指定条件下，每单位时间能通过酶或酶制剂 转化为产物的底物摩尔数。比活性通常表示为单位(U)/mg蛋白质。
如本文所用，“水硬度”是水中存在的矿物质(例如钙和镁)的量 度。
“样本”是一块具有施加于其上的污渍的材料(诸如织物)。该材 料可为，例如，由棉花、聚酯、或天然纤维和合成纤维的混合物制成的 织物。样本还可为纸，诸如滤纸或硝化纤维素、或一块硬的材料，诸如 陶瓷、金属或玻璃。对于淀粉酶，所述污渍是基于淀粉的，但可包括血 液、乳、墨、草、茶、酒、菠菜、肉汁、巧克力、鸡蛋、奶酪、粘土、 颜料、油、或这些化合物的混合物。
“较小的样本”是已被单孔打孔装置切割下来的或已被定制生产的 96孔打孔装置切割下来的样本的部分(其中多孔打孔的模式与标准96 孔微孔板相匹配)或该部分已以其它方式从样本中脱离下来。样本可为 纺织物、纸、金属、或其它合适的材料。在将较小的样本置于24孔、 48孔或96孔微孔板之前或之后可将污渍附连于其上。也可通过在小块 材料上施加污渍以生成较小的样本。例如，较小的样本可为具有5/8” 或0.25”直径的脏污织物块。定制生产的打孔器被设计成此类方式使得 其同时递送96个样本至96孔板的所有小孔中。该装置允许通过简单填 充同一96孔板多次来在每孔递送一个以上的样品。可想到多重打孔装 置同时递送样本至任何格式的板，包括但不限于24孔板、48孔板和96 孔板。在另一个可想到的方法中，污垢测试平台可为涂覆有污垢基底 的、由金属、塑料、玻璃、陶瓷或其它合适的材料制成的小珠。然后将 一个或多个经涂覆的小珠置于96孔板、48孔板或24孔板或更大格式 的孔中，其中包含合适的缓冲液和酶。
“包含淀粉酶的培养的细胞材料”或类似的语言是指包含淀粉酶作 为组分的细胞裂解液或上清液(包括培养基)。所述细胞材料可来源于 出于制备淀粉酶的目的生长在培养基中的异源的宿主。
“百分比序列同一性”是指在使用具有默认参数的CLUSTAL W 算法进行比对时，特定序列具有至少一定百分比的氨基酸残基与指定的 参考序列的那些氨基酸残基相同。参见Thompson等人(1994) Nucleic Acids Res.22：4673-4680。对于CLUSTAL W算法的默认参数 为：
与参考序列相比较，将缺失作为非相同残基计数。发生在两个末端 的缺失也包括在内。例如，SEQ ID NO:1的成熟CspAmy2多肽的C 末端5个氨基酸缺失的变体相对于所述成熟多肽将具有99％的百分比 序列同一性(612/617的相同残基×100，四舍五入到最接近的整数)。 此类变体将被与成熟淀粉酶多肽具有“至少99％的序列同一性”的变 体所涵盖。
“融合的”多肽序列通过两个目标多肽序列之间的肽键连接，即， 有效地连接。
术语“丝状真菌”是指真菌亚门的所有丝状形式，特别是盘菌亚门 (Pezizomycotina)物种。
术语“聚合度”(DP)是指在给定糖类中无水吡喃型葡萄糖单元 的数目(n)。聚合度1(DP1)的示例是单糖葡萄糖和果糖。聚合度2 (DP2)的示例是二糖麦芽糖和蔗糖。术语“DE”或“右旋糖当量” 被定义为在糖浆中作为总碳水化合物一部分的还原糖(即，D-葡萄糖) 的百分比。
术语“干固体含量”(ds)是指以干重百分数计的浆液的总固体。 术语“浆液”是指包含不溶性固体的含水混合物。
短语“同步糖化发酵(SSF)”是指一种制备生化物品的方法，其 中在同一方法步骤期间有微生物体(诸如产乙醇微生物)和至少一种酶 (诸如淀粉酶)存在。SSF包括在同一反应容器中同时水解淀粉底物 (颗粒状的、液化的或溶解的)成糖类(包括葡萄糖)并且将所述糖类 发酵成乙醇或其它生化物品或生物材料。
“产乙醇微生物”是指具有将糖或低聚糖转化为乙醇的能力的微生 物。
术语“发酵饮料”是指通过包括发酵过程(诸如微生物发酵，例如 细菌和/或真菌发酵)的方法制备的任何饮料。“啤酒”是此类发酵饮 料的示例，并且术语“啤酒”意在包括通过含淀粉植物材料的发酵/酿 造制备的任何发酵糖化醪。通常，啤酒是专门由麦芽或助剂、或者麦芽 和助剂的任何组合制备的。啤酒的示例包括：全麦啤酒、根据“纯净 法”(Reinheitsgebot)酿造的啤酒、爱尔啤酒(ale)、印度淡色爱尔 啤酒(India pale ale)，窖藏啤酒(lager)、比尔森啤酒(pilsner)、 苦味啤酒(bitter)、低麦芽啤酒(Happoshu)(第二啤酒)、第三啤 酒、干啤酒(dry beer)、淡啤酒(near beer)、轻淡啤酒(light beer)、低醇啤酒、低热量啤酒、波特啤酒(porter)、博克啤酒 (bock)、浓色巴克黑啤酒(dopplebock)、烈性黑啤酒(stout)、波 特啤酒(porter)、麦芽酒(malt liquor)、无酒精啤酒、无酒精麦芽酒 (non-alcoholic malt liquor)等等，但也包括替代谷物和麦芽饮料，诸如 水果味麦芽饮料(例如柑橘味的)、诸如柠檬味的、橙味的、酸橙味 的、或浆果味的麦芽饮料、酒味的麦芽饮料(例如伏特加味的、朗姆酒 味的、或龙舌兰酒味的麦芽酒、或咖啡味的麦芽饮料，诸如咖啡因味的 麦芽酒等等。
术语“麦芽”是指任何发芽的谷物，诸如发芽的大麦或小麦。
术语“助剂”是指任何非麦芽(诸如大麦麦芽或小麦麦芽)的含淀 粉和/或糖类的植物材料。助剂的示例包括常见的粗磨玉米糁、精制玉 米糁、研磨过的啤酒酵母(brewer’s milled yeast)、稻、高粱、精制 玉米淀粉、大麦，大麦淀粉、脱壳大麦、小麦、小麦淀粉、烘烤过的谷 物、谷物薄片、黑麦、燕麦、马铃薯、木薯淀粉、木薯和糖浆，诸如玉 米糖浆、甘蔗糖浆、转化糖糖浆、大麦和/或小麦糖浆等等。
术语“醪液”是指任何含淀粉和/或糖的植物材料的含水浆液，与 水混合之后分离成糖化醪和废麦糟，所述植物材料诸如粗麦芽粉，例 如，包括压碎的大麦麦芽、压碎的大麦和/或其它助剂或它们的组合。
术语“糖化醪”是指在制糖化醪过程中提取粗麦芽粉后流失的未发 酵的液体。
“碘试验阳性淀粉”或“IPS”是指(1)在液化和糖化过程后未水 解的直链淀粉，或(2)老化淀粉聚合物。当用碘测试经糖化的淀粉或 糖液时，高DPn的直链淀粉或老化淀粉聚合物与碘结合并生成特征性 的蓝色。因此该糖液被称为“碘试验阳性糖”、“蓝色糖类”或“蓝 糖”。
术语“老化淀粉”或“淀粉老化”是指在老化过程中淀粉糊或凝胶 自发产生的变化。
术语“约”是指在参考值基础上±15％。
2.α-淀粉酶变体
本发明的组合物和方法的一个方面是包括多种突变组合的淀粉酶变 体，所述突变改善了淀粉酶变体在工业应用中的性能。在使用来自噬纤 维菌属(Cytophaga sp.)的α-淀粉酶(本文中的“CspAmy2淀粉 酶”)时首先发现了所述组合的变体，所述α-淀粉酶由Jeang，C-L等 人((2002)Applied and Environmental Microbiology，68：3651-54) 先前描述过。下面示出了作为SEQ ID NO:1的CspAmy2α-淀粉酶多 肽的成熟形式的氨基酸序列：
在SEQ ID NO:1中，R178和G179带有下划线。同时具有R178 和G179的缺失的噬纤维菌属(Cytophaga sp.)α-淀粉酶的一种变体 (本文中的“CspAmy2-v1”)也有过描述(Shiau，R-J.等人(2003) Applied and Environmental Microbiology，69：2383-85)。下面示出了 作为SEQ ID NO:2的成熟CspAmy2-v1a-淀粉酶多肽的氨基酸序列：
使用SEQ ID NO:2作为起点，如实施例章节所述首先制备和测试 多个组合的CspAmy2变体。性能最佳的变体通常包括在对应于E187 或S241但不同时对应于这两者的氨基酸位置处的稳定突变，和在选自 N126、Y150、F153、L171、T180、和I203的氨基酸位置处的至少一 种另外的增强性能的突变(使用SEQ ID NO:1来编号)。
已知许多细菌(和其它)α-淀粉酶共享相同的折叠方式，经常共享 显著的氨基酸序列同一性，以及有时得益于相同的突变。在这种情况 下，通过对来自解菌多糖类芽孢杆菌(Paenibacillus curdlanolyticus) 的α-淀粉酶(即，PcuAmy1；SEQ ID NO:3)和芽孢杆菌属(Bacillus sp.)TS-23α-淀粉酶的C末端截短型式(即，“BASE”；SEQ ID NO: 5；参见，例如，US20120045817和WO2010/115028)的氨基酸序列比 对鉴定出对应的氨基酸位置。
下面示出了作为SEQ ID NO:3的PcuAmy1α-淀粉酶多肽的成熟 形式的氨基酸序列：
在SEQ ID NO:3中，R177和R178带有下划线。下面示出了同时 具有R177和R178的缺失的PcuAmy1α-淀粉酶的变体形式(本文中的 “PcuAmy1-v1”)的氨基酸序列(SEQ ID NO:4)：
下面示出了芽孢杆菌属TS-23α-淀粉酶的C末端截短型式(本文 中的“BASE”；参见，例如，US20120045817和WO2010/115028)的 氨基酸序列为SEQ ID NO:5：
在SEQ ID NO:5中，R180和S181带有下划线。下面示出了作为 SEQ ID NO:6的同时具有R180和S181的缺失的BASEα-淀粉酶的变 体形式(本文中的“ACE”)的氨基酸序列：
使用具有默认参数的Clustal W，CspAmy2(SEQ ID NO:1)、 PcuAmy1(SEQ ID NO:3)、和BASE(SEQ ID NO:5)的氨基酸序 列比对显示在图1中。CspAmy2中的位置N126、Y150、F153、 L171、R178、G179、T180、E187、I203、和S241分别对应于 PcuAmy1中的位置N125、Y149、F152、L170、R177、G178、D179、 E186、L202、和D240，以及分别对应于BASE中的位置N128、 Y152、F155、L173、R180、S181、T182、E189、L205、和S243。本 文中，使用比对结果和信息可确定遍及所述分子的其它位置的编号。
基于使用前述三个亲本α-淀粉酶获得的实验数据，本发明的α-淀 粉酶变体的实施方案包括在对应于E187或S241的氨基酸位置处具有 突变、并结合了在对应于选自N126、Y150、F153、L171、T180、和 I203的氨基酸位置处(使用SEQ ID NO:1来编号)的至少一个突变的 变体，其中所述突变为所得变体提供至少一种性能益处。
参见用于编号的SEQ ID NO:1，在氨基酸位置E187处的示例性突 变包括E187V和E187P。在氨基酸位置S241处的示例性突变包括 S241Q和S241A。在一些实施方案中，突变只在这些位置中的一处中产 生。在氨基酸位置N126处的示例性突变包括N126Y。在氨基酸位置 Y150处的示例性突变包括Y150F、Y150H、和Y150W。在氨基酸位置 F153处的示例性突变包括F153H、F153W、和F153Y。在氨基酸位置 L171处的示例性突变包括L171F、L171G、L171I、L171M、L171R、 L171V、L171W、L171Y、L171H、L171K、L171N、L171Q、和 L171S。在氨基酸位置T180处的示例性突变包括T180D和T180H。在 氨基酸位置I203处的示例性突变包括I203C、I203V、I203F、I203L、 I203M、和I203Y。
在一些实施方案中，α-淀粉酶变体还包括在对应于E132、Q167、 A277、和/或T400的氨基酸残基中的一个突变，使用SEQ ID NO:1来 编号。在氨基酸位置E132处的示例性突变包括E132A、E132C、 E132D、E132F、E132G、E132H、E132I、E132K、E132L、E132M、 E132N、E132P、E132Q、E132R、E132V、和E132W。在氨基酸位置 Q167处的示例性突变包括Q167A、Q167D、Q167E、Q167G、 Q167H、Q167K、Q167M、Q167N、Q167P、Q167S、Q167T、和 Q167V。在氨基酸位置A277处的示例性突变包括A277C、A277D、 A277E、A277F、A277G、A277I、A277K、A277L、A277M、 A277N、A277Q、A277R、A277S、A277T、A277V、A277W、和 A277Y。在氨基酸位置T400处的示例性突变包括T400A、T400C、 T400D、T400F、T400G、T400I、T400K、T400L、T400M、T400N、 T400Q、T400R、T400W、和T400Y。
在一些实施方案中，α-淀粉酶变体还包括在对应于G476的氨基酸 残基中的突变，使用SEQ ID NO:1来编号。在氨基酸位置G476处的 示例性突变包括G476A、G476C、G476H、G476K、G476N、 G476P、G476Q、G476R、G476S、G476T、G476V、和G476Y。
在一些实施方案中，α-淀粉酶变体是包括或进一步包括在对应于 G476和G477两者的氨基酸残基中的突变的那些，使用SEQ ID NO:1 来编号。出人意料的是，实验证据表明，尤其是在清洁应用中，除了在 许多天然存在的α-淀粉酶中存在的两个相邻甘氨酸之外、在这些位置 处的任何残基的组合增加了淀粉水解活性。在图25和26中的矩阵中举 例说明了成对组合。
在一些实施方案中，α-淀粉酶变体还包括在对应于R458、T459、 和/或D460的氨基酸残基中的突变。示例性的突变分别为R458N、 T459S、和D460T。
在一些实施方案中，α-淀粉酶变体还包括对应于R178、G179、 T180、和G181的与钙结合环相邻的X1G/S1X2G2基序中的缺失，使用 SEQ ID NO:1来编号。在一些实施方案中，α-淀粉酶变体包括对应于 R178和G179、或T180和G181的氨基酸残基的相邻的、成对的缺 失。在对应于R178和G179的氨基酸残基中的缺失可被称为 “ΔRG”，而对应于T180和G181的氨基酸残基中缺失被称为 “ΔTG”。这种命名法根据初始存在于亲本分子中的氨基酸残基将相应 变动。
在一些实施方案中，α-淀粉酶变体包括在对应于E132和/或T180 (使用SEQ ID NO:1来编号)的位置处的突变，结合RG-缺失或TG- 缺失(或基于亲本α-淀粉酶序列的等同的缺失)，使得在X1G/S1X2G2 基序中剩余的非G残基和位置132处的残基之间产生稳定相互作用。 在一些实施方案中，在位置132处的残基是带负电荷的(即，D或 E)，并且剩余的非G残基是带正电荷的(即，H、R、或K)。在一 些实施方案中，在位置132处的残基是带正电荷的(即，H、R、或 K)，并且剩余的非G残基是带负电荷的(即，D或E)。
如下示出了突变的示例性组合(使用SEQ ID NO：1来编号)：
E187P+I203Y+G476K(即，CspAmy2-v5)；
E187P+I203Y+G476K+R458N+T459S+D460T(即，CspAmy2-v6)；
T180D+E187P+I203Y+G476K(即，CspAmy2 v171)；
N126Y+T180D+E187P+I203Y+G476K(即，CspAmy2 v172)；
N126Y+T180D+E187P+I203Y+Y303D+G476T+G477E，(即，CspAmy2 v179)；
N126Y+T180D+E187P+I203Y+Y303D+N475E+G477Q，(即，CspAmy2 v180)；
N126Y+T180D+E187P+I203Y+Y303R+N475E+G476T+G477R，(即，CspAmy2 v181)；
T038N+N88H+N126Y+T129I+N134M+F153W+L171R+T180D+E187P+I203Y+ G476K+G477E，(即，CspAmy2 v186)；
N126Y+E132H+T180D+E187P+I203Y+Y303D+G476T+G477E，(即，CspAmy2 v191)；
N126Y+E187P+I203Y(即，CspAmy2-vC16A)；
N126Y+I203Y+S241Q(即，CspAmy2-vC16B)；
N126Y+T180H+E187P+I203Y(即，CspAmy2-vC16C)；
N126Y+T180H+I203Y+S241Q(即，CspAmy2-vC16D)；
N126Y+F153W+T180H+E187P+I203Y(即，CspAmy2-vC16E)；
N126Y+F153W+T180H+I203Y+S241Q(即，CspAmy2-vC16F)；
N126Y+Y150H+F153W+L171N+E187P+I203Y(即，CspAmy2-vC16G)；
N126Y+Y150H+F153W+L171N+I203Y+S241Q(即，CspAmy2-vC16H)；
N126Y+Y150H+F153W+L171N+T180H+E187P+I203Y(即，CspAmy2-vC16I)；
N126Y+Y150H+F153W+L171N+T180H+I203Y+S241Q(即，CspAmy2-vC16J)；
N126Y+F153W+T180D+I203Y+S241Q，(即，CspAmy2-v C18P)；
N126Y+E132H+F153W+T180D+I203Y+S241Q+A277F(即，CspAmy2-C25F)；
N126Y+E132H+F153W+Q167E+T180D+I203Y+S241Q+A277F(即，CspAmy2- C25B)；以及
N126Y+E132H+F153W+Q167E+T180D+I203Y+S241Q+A277F+T400K(即， CspAmy2-C25A)。
以上所有突变组合预期与前述在对应于R178、G179、T180、和/ 或G181的位置处的缺失结合使用。此类缺失可为天然存在的，如就地 衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)α-淀粉酶而言。
除前述突变之外，PcuAmy1变体可还包括在位置T333、A335、和 Q337E(使用SEQ ID NO：3来编号)处的突变。这些位置位于表面暴 露的环中，并且在这些位置处的突变，特别是在T333处，赋予了 PcuAmy1蛋白酶抗性但除此以外不影响性能。另外这些突变看起来与 其它突变完全相容。在PcuAmy1变体中另外一个突变是N205，该突 变将野生型N残基变成D。D是α-淀粉酶中通常占据这个位置的残 基。
因此，本发明的α-淀粉酶包括在上述CspAmy2的上下文中示出的 所有示例性突变组合，以及如下示出的示例性组合(使用SEQ ID NO： 3来编号)：
N125Y+E186P+T333G+A335S+Q337E+G472K(即，PcuAmy1-v1A)；
N125Y+F152W+E186P+T333G+A335S+Q337E+G472K(即，PcuAmy1-v6)；
N125Y+F152W+E186P+T333G+A335S+Q337E+G472R+G473R(即，PcuAmy1-v8)； 和
N125Y+F152W+E186P+N205D+T333G+A335S+Q337E+G472K(即，PcuAmy1- v16)。
以上所有突变组合预期与在对应于R177、G178、D179、和/或 G180的位置处的缺失结合使用，并且此类缺失可为天然存在的，如就 地衣芽孢杆菌α-淀粉酶而言。
本发明的变体也可根据BASE编号(即，SEQ ID NO：5)来描 述，例如
N128Y+E189P+G475R(即，BASE-V28)；
F155W+E189P+G475R(即，BASE-V29)；
T134E+T182H+E189P+G475R(即，BASE-V30)；
N128Y+T134E+T182H+E189P+G475R(即，BASE-V31)；
N128Y+F155W+E189P+G475R(即，BASE-V32)；
T134E+F155W+T182H+E189P+G475R(即，BASE-V33)；
N128Y+T134E+F155W+T182H+E189P+G475R(即，BASE-V34)；
N128Y+T134H+F155W+T182D+E189P+G475R(即，BASE-V35)；和
N128Y+T134E+F155W+T182G+E189P+G457R(即，BASE-V36)。
以上所有突变组合预期与在对应于R180、S181、T182、和/或 G183的位置处的缺失结合使用，并且此类缺失可为天然存在的，如就 地衣芽孢杆菌α-淀粉酶而言。
使用具有默认参数的Clustal W，使用CspAmy2(SEQ ID NO: 1)、PcuAmy1(SEQ ID NO:3)、或BASE(SEQ ID NO:5)，通过 氨基酸序列比对鉴定其它α-淀粉酶中对应的氨基酸位置。其中前述突 变可能产生性能益处的α-淀粉酶包括与熟知的芽孢杆菌(Bacillus)淀 粉酶(例如，来源于地衣芽孢杆菌(B.lichenifomis)(即，BLA和 LAT)，嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)(即，BSG)， 和解淀粉类芽孢杆茵(B.amyloliquifaciens)(即，P00692、 BACAM、和BAA))、碳水化合物-活性酶数据库(Carbohydrate- Active Enzymes database，CAZy)家族13淀粉酶、或之前用描述性用 语“Termamyl样”提到的任何淀粉酶中的任一个具有类似折叠和/或具 有60％或更高的氨基酸序列同一性的那些。示例性的α-淀粉酶包括但 不限于来源于芽孢杆菌属SG-1、芽孢杆菌属707、芽孢杆菌属 DSM12368(即，A7-7)、芽孢杆菌属DSM 12649(即，AA560)、芽 孢杆菌属SP722、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)(DSM90 14)、和KSM AP1378的那些α-淀粉酶。
读者将会知道在α-淀粉酶天然具有以上列出的突变的情况下 (即，在所述野生型α-淀粉酶已经包含被识别为突变的残基的情况 下)，则所述特定突变不适用于该α-淀粉酶。然而，其它所述突变可 与在该位置处天然存在的残基结合起作用。
在一些实施方案中，本发明的α-淀粉酶变体具有所示的突变组 合，并与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、或SEQ ID NO:5具有限定 程度的氨基酸序列同源性/同一性，例如，至少60％、至少65％、至少 70％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至 少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、 至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少 91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至 少97％、至少98％或甚至至少99％的氨基酸序列同源性/同一性。
在一些实施方案中，本发明的α-淀粉酶变体具有所示的突变组 合，并来源于与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、或SEQ ID NO：5具 有限定程度的氨基酸序列同源性/同一性的亲本淀粉酶，例如，至少 60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少76％、至少77％、至 少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、 至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少 89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至 少95％、至少96％、至少97％、至少98％或甚至至少99％的氨基酸 序列同源性/同一性。
在一些实施方案中，除上述突变之外，本发明的α-淀粉酶还包括 一种或多种提供另外的性能益处的突变。在与前述组合变体进行组合 时，另外的以实验方法确定的用于提供至少一个性能优点的突变包括在 对应于以下的位置处的突变，使用SEQ ID NO：1来编号： 6，7，8，11，14，15，20，21，23，26，27，28，37，38，39，40，42，45，46， 48，49，50，51，52，53，54，58，61，62，68，70，71，72，73，79，80，81，82，84，85，87，88，89，92，93， 94，95，96，97，98，101，108，111，112，113，114，115，116，117，118，120，122，123，124，126， 127，129，130，131，132，133，134，136，137，138，140，142，143，144，147，148，149，150，151， 152，153，154，155，156，158，159，165，167，168，170，171，172，175，176，177，180，181，182， 187，190，191，193，199，200，201，203，206，208，210，211，212，214，215，216，219，221，223， 225，226，227，235，238，239，240，241，242，243，245，246，247，248，249，250，252，253，254， 256，257，258，260，261，262，266，267，268，269，270，271，273，276，277，279，280，282，284， 285，286，288，296，299，300，301，302，303，304，307，308，310，311，312，313，316，317，318， 320，321，325，327，335，338，342，348，349，352，356，357，360，362，363，368，369，377，381， 382，383，384，385，388，390，392，394，395，396，397，398，400，401，402，403，404，405，407， 408，410，414，415，416，418，419，420，421，422，423，424，426，428，429，430，431，434，435， 436，439，441，442，444，445，446，447，448，449，450，451，454，455，457，460，461，462，463， 464，465，466，467，469，470，471，473，474，475，476，477，479，480，481，482，483，和484。 。具体的突变是T6A，T6D，T6E，T6G，T6K，T6M， T6N，T6Q，T6S，M7A，M7V，M8C，M8F，M8I，M8L，M8Y，F11V，Y14A，Y14I，Y14Q，Y14T， Y14V，V15C，V15D，V15I，V15N，V15T，Q20A，Q20C，Q20D，Q20H，Q20K，Q20M，Q20N， Q20R，Q20S，Q20Y，Q21F，Q21W，N23A，N23C，N23D，N23E，N23H，N23K，N23Q，N23R， N23S，N23T，N23V，R26C，R26E，R26G，R26K，R26M，R26S，R26T，T27A，T27C，T27D， T27E，T27F，T27H，T27I，T27K，T27L，T27M，T27N，T27Q，T27R，T27S，T27V，T27Y，D28A， D28C，D28T，I37F，I37V，T38D，T38N，A39L，V40A，V40C，V40D，V40G，V40H，V40I， V40K，V40M，V40P，V40Q，V40R，V40S，V40T，V40W，V40Y，T42A，T42C，T42I，T42M， T42V，A45C，A45G，Y46F，G48A，T49I，S50A，S50C，S50E，S50G，S50K，S50M，S50N，S50Q， S50R，S50T，S50Y，Q51C，Q51D，Q51E，Q51S，Q51V，A52C，A52D，A52E，A52F，A52G， A52H，A52K，A52L，A52M，A52R，A52S，A52T，A52V，A52Y，D53E，V54N，V54T，P58A， P58C，P58H，P58I，P58S，P58T，P58V，L61M，L61V，Y62A，Y62C，Y62D，Y62F，Y62G， Y62H，Y62I，Y62K，Y62L，Y62M，Y62N，Y62P，Y62Q，Y62R，Y62S，Y62V，N68C，N68D， N68E，N68F，N68H，N68L，N68P，N68Q，N68R，N68S，N68V，N68W，N68Y，K70R，G71A， G71C，G71D，G71E，G71K，G71R，G71S，T72G，T72S，V73S，T79F，T79I，T79L，T79M， T79N，T79S，T79Y，K80A，K80C，K80D，K80F，K80H，K80I，K80M，K80N，K80Q，K80R， K80S，K80T，K80V，K80Y，G81A，G81D，G81E，G81F，G81H，G81I，G81K，G81N，G81P， G81R，G81S，G81T，E82A，E82D，E82M，E82Q，K84A，K84C，K84E，K84I，K84Q，K84R， K84S，K84T，K84Y，S85A，S85C，S85D，S85E，S85G，S85H，S85I，S85L，S85M，S85N，S85Q， S85R，S85T，S85V，S85Y，V87I，V87T，N88C，N88D，N88E，N88G，N88H，N88I，N88K， N88L，N88M，N88Q，N88R，N88S，N88T，N88V，N88W，N88Y，T89A，T89D，T89E，T89F， T89H，T89I，T89K，T89L，T89M，T89N，T89Q，T89R，T89S，T89Y，S92A，S92C，S92D，S92E， S92F，S92G，S92H，S92L，S92M，S92N，S92Q，S92R，S92T，S92W，S92Y，N93A，N93C， N93E，N93F，N93H，N93I，N93K，N93L，N93Q，N93S，N93T，N93Y，G94A，G94C，G94N， I95M，Q96A，Q96E，Q96H，Q96I，Q96K，Q96L，Q96M，Q96N，Q96R，Q96V，Q96Y，V97I， V97T，Y98F，Y98I，Y98L，Y98V，V101C，V101T，G108A，G108S，Y111D，Y111E，Y111L， Y111N，Y111S，Y111T，Y111V，T112A，T112F，T112H，T112I，T112K，T112L，T112M， T112N，T112P，T112R，T112V，T112W，E113D，E113N，E113Q，E113T，N114A，N114C， N114D，N114E，N114F，N114G，N114H，N114I，N114L，N114P，N114Q，N114R，N114S， N114T，N114V，N114W，N114Y，V115A，V115I，T116A，T116C，T116D，T116G，T116H， T116I，T116K，T116N，T116P，T116Q，T116R，T116S，A117C，A117I，A117S，A117V， V118A，V118C，V118E，V118F，V118H，V118I，V118L，V118M，V118N，V118Q，V118R， V118S，V118W，V118Y，V120A，V120C，V120I，V120M，V120T，P122A，P122D，P122E， P122G，P122H，P122N，P122R，P122S，P122T，P122W，S123A，S123C，S123G，S123K，S123L， N124A，N124D，N124F，N124G，N124L，N124R，N124S，N124V，Y126A，Y126C，Y126D， Y126E，Y126G，Y126H，Y126I，Y126K，Y126L，Y126M，Y126N，Y126Q，Y126R，Y126S， Y126T，Y126V，Y126W，Q127A，Q127C，Q127D，Q127E，Q127F，Q127H，Q127I，Q127K， Q127L，Q127M，Q127N，Q127R，Q127S，Q127T，Q127V，Q127W，Q127Y，T129A，T129C， T129D，T129E，T129F，T129G，T129I，T129K，T129L，T129M，T129N，T129Q，T129R， T129S，T129V，T129W，T129Y，S130A，S130G，S130I，S130K，S130L，S130M，S130N， 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S424N，S424Q，S424R，S424T，L426S，L426T，L426V，T428G，T428V，V429A，V429C， V429I，V429L，I430C，I430G，I430L，I430M，I430Q，I430V，T431A，T431C，T431S，P434A， P434C，P434D，P434E，P434F，P434H，P434I，P434K，P434L，P434M，P434N，P434Q，P434R， P434S，P434V，P434Y，G435A，G435C，G435D，G435E，G435F，G435H，G435I，G435K， G435M，G435N，G435P，G435Q，G435R，G435S，G435T，G435W，G436F，G436I，G436M， G436N，G436Q，G436S，G436V，R439A，R439D，R439G，R439H，R439K，R439M，R439N， R439P，R439Q，R439S，R439V，R439W，R439Y，Y441A，Y441C，Y441D，Y441F，Y441G， Y441H，Y441K，Y441L，Y441M，Y441N，Y441P，Y441R，Y441S，Y441T，Y441W，V442A， V442C，V442I，V442T，T444C，T444D，T444E，T444F，T444G，T444H，T444I，T444K，T444L， T444M，T444N，T444P，T444R，T444S，T444W，S445A，S445C，S445E，S445G，S445H， S445K，S445L，S445M，S445N，S445T，S445V，N446A，N446C，N446H，N446K，A447C， A447D，A447F，A447H，A447L，A447M，A447N，A447Q，A447R，A447S，A447Y，G448A， G448C，G448D，G448E，G448H，G448K，G448L，G448M，G448N，G448Q，G448R，G448S， G448T，G448W，E449D，E449H，E449K，E449T，I450A，I450C，I450D，I450E，I450G，I450K， I450L，I450M，I450N，I450Q，I450S，I450T，I450W，I450Y，W451Y，L454A，L454I，L454K， L454M，L454W，T455A，T455I，T455L，T455S，N457H，N457K，N457R，N457T，N457V， N457Y，D460A，D460E，D460G，D460M，D460N，D460Q，D460S，D460V，K461C，K461H， K461L，K461M，K461N，K461Q，K461T，K461Y，I462A，I462L，I462M，I462Q，I462T，I462V， T463D，T463E，T463H，T463P，T463Q，T463R，T463V，T463Y，I464P，I464T，G465A，G465C， G465D，G465E，G465K，G465L，G465M，G465N，G465Q，G465W，G465Y，S466A，S466C， S466D，S466G，S466H，S466K，S466L，S466M，S466N，S466T，S466W，S466Y，D467E， D467G，D467L，Y469A，Y469D，Y469E，Y469I，Y469M，Y469N，Y469R，Y469S，Y469T， Y469V，Y469W，A470S，A470V，T471A，T471C，T471E，T471G，T471H，T471I，T471L， T471M，T471N，T471S，T471V，T471W，P473C，P473D，P473E，P473G，P473I，P473K， P473L，P473R，P473T，P473W，V474A，V474C，V474L，V474S，N475A，N475C，N475E， N475F，N475H，N475K，N475L，N475M，N475p，N475Q，N475R，N475S，N475T，N475V， G476A，G476D，G476E，G476F，G476H，G476I，G476L，G476M，G476N，G476P，G476Q， G476R，G476S，G476T，G476V，G476W，G476Y，G477A，G477D，G477F，G477H，G477I， G477K，G477L，G477M，G477Q，G477S，G477T，G477V，G477W，G477Y，V479C，V479D， V479E，V479F，V479H，V479I，V479N，V479P，V479Y，S480A，S480C，S480H，V481A， V481C，V481N，W482Y，V483A，V483G，V483I，V483K，V483L，V483M，V483R，V483Y， Q484A，Q484C，Q484F，Q484G，Q484H，Q484K，Q484L，Q484M，Q484P，Q484R，Q484T， 和Q484Y。
此外，本发明的淀粉酶可包括任何数量的保守氨基酸置换。在表1 中列出了示例性的保守氨基酸置换：
表1.保守氨基酸置换
读者将会知道上面提到的保守突变中的一些可通过遗传操作生成， 而其它的是通过遗传或其它方法将合成的氨基酸导入多肽而生成的。
本发明的淀粉酶在其包含信号序列的情况下可为“前体”、“未成 熟的”或“全长的”，或在其不含信号序列的情况下为“成熟的”。多 肽的成熟形式一般来讲是最可用的。除非另有说明，否则本文所用的氨 基酸残基编号是指对应的淀粉酶多肽的成熟形式。本发明的淀粉酶多肽 也可截短以去除N或C末端，只要所得多肽保持淀粉酶活性。
本发明的淀粉酶可为“嵌合的”或“杂交体”多肽，其中包括第一 淀粉酶多肽的至少一部分和第二淀粉酶多肽的至少一部分(此类嵌合淀 粉酶最近被“重发现”为结构域交换的淀粉酶)。本发明的淀粉酶可还 包括异源性的信号序列，抗原表位以允许追踪或纯化等等。示例性的异 源性的信号序列来自地衣芽孢杆菌淀粉酶(LAT)、枯草芽孢杆菌(B. subtilis)(AmyE或AprE)、和链霉菌(Streptomyces)CelA。
2.5.编码淀粉酶变体多肽的核苷酸
在另一方面，提供了编码淀粉酶变体多肽的核酸。所述核酸可编码 特定的淀粉酶多肽、或与特定淀粉酶具有指定程度的氨基酸序列同一性 的淀粉酶。
在一个示例中，核酸编码的淀粉酶与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO: 3、或SEQ ID NO:5(除了编码信号序列的核酸的部分外)具有至少 60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少76％、至少77％、至 少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、 至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少 89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至 少95％、至少96％、至少97％、至少98％或甚至至少99％的同源性/ 同一性。应当理解由于遗传密码的简并性，多个核酸可编码相同的多 肽。
在另一个示例中，核酸在严格或非常严格条件下与编码淀粉酶的核 酸(或与编码淀粉酶的核酸的互补链)杂交，所述淀粉酶与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、或SEQ ID NO:5(除了编码信号序列的核酸 的部分外)具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少 76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至 少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、 至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少 93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或甚 至至少99％的同源性/同一性。
在一些实施方案中，核酸在严格或非常严格条件下与SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO:33、或SEQ ID NO:38的核酸、或与这些核酸互补的 核酸杂交。
核酸可编码“全长”(“fl”或“FL”)淀粉酶(其包括信号序 列)、仅淀粉酶的成熟形式(其不含信号序列)、或淀粉酶的截短形式 (其不含成熟形式的N或C-末端)。
编码α-淀粉酶的核酸能够有效地连接至适用于在宿主细胞中表达 α-淀粉酶的载体中的各种启动子和调节子。示例性的启动子来自地衣芽 孢杆菌淀粉酶(LAT)、枯草芽孢杆菌(AmyE或AprE)和链霉菌 (Streptomyces)CelA。此类核酸也能连接至其它编码序列，例如，编 码嵌合多肽的。
3.淀粉酶变体的制备
本发明的淀粉酶变体能够在宿主细胞中，例如通过分泌或细胞内表 达来制备。在淀粉酶变体分泌至细胞培养基中后，可获得包含淀粉酶变 体的培养的细胞材料(例如，全细胞培养液)。任选地，淀粉酶变体可 分离自宿主细胞、或甚至分离自细胞培养液，这取决于期望的淀粉酶变 体最终纯度。可根据本领域所熟知的方法克隆和表达编码淀粉酶变体的 基因。合适的宿主细胞包括细菌细胞、真菌(包括酵母和丝状真菌)细 胞和植物(包括藻类)细胞。尤其可用的宿主细胞包括黑曲霉、米曲霉 (Aspergillus oryzae)或里氏木霉。其它宿主细胞包括细菌细胞，例 如，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或地衣芽孢杆菌，以及链霉菌 (Streptomyces)。
宿主细胞还可表达编码同源性或异源性的葡糖淀粉酶(即，与该宿 主细胞不同的葡糖淀粉酶)或一种或多种其它酶的核酸。葡糖淀粉酶可 为葡糖淀粉酶变体，诸如在例如美国专利8,058,033(Danisco US Inc.) 中公开的葡糖淀粉酶变体中的一个。另外，宿主可表达一种或多种其他 的酶、蛋白质、多肽。这些可有益于液化、糖化、发酵、SSF等工艺。 此外，宿主细胞可制备除酶之外的用于消化各种原料的生化物品。此类 宿主细胞可用于发酵或同步糖化发酵工艺以降低或消除添加酶的需要。
3.1.载体
可构建包含编码淀粉酶变体的核酸的DNA构建体以在宿主细胞中 表达。代表性的编码淀粉酶变体的核酸包括SEQ ID NO:4。由于熟知 的遗传密码简并性，能够以常规技能设计和制备编码相同氨基酸序列的 多核苷酸变体。优化用于特定宿主细胞的密码子在本领域中是熟知的。 可将编码淀粉酶变体的核酸掺入到载体中。可使用熟知的转化技术(诸 如下面公开的那些)将载体转移至宿主细胞。
载体可为能被转化到宿主细胞中并且在宿主细胞内复制的任何载 体。例如，可将包含编码淀粉酶变体的核酸的载体转化并且在细菌宿主 细胞中复制作为繁殖和扩增载体的方法。也可将载体转化到表达宿主 中，使得编码核酸可表达为有功能的淀粉酶。充当表达宿主的宿主细胞 可包括例如丝状真菌。真菌基因种源中心(Fungal Genetics Stock Center，FGSC)菌种目录列出了适用于在真菌宿主细胞中表达的载 体。参见FGSC菌种目录，密苏里大学，www.fgsc.net(最后修改于 2007年1月17日)。代表性的载体是pJG153，可在细菌宿主中复制 的无启动子的Cre表达载体。参见Harrison等人(June 2011)Applied Environ.Microbiol.77:3916-22。可用常规技能修饰pJG153以包含和表 达编码淀粉酶变体的核酸。
编码淀粉酶变体的核酸能够有效地连接至合适的启动子，其允许在 宿主细胞中转录。启动子可为在所选的宿主细胞中表现出转录活性的任 何DNA序列，并可来源于编码与所述宿主细胞同源或异源的蛋白质的 基因。用于指导编码淀粉酶变体的DNA序列的转录(尤其是在细菌宿 主中)的示例性启动子是大肠杆菌(E.coli)的lac操纵子的启动子、 天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)琼脂酶基因dagA或celA启动 子、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)的启动子、嗜热脂肪芽孢杆 菌(Bacillus stearothermophilus)产麦芽糖淀粉酶基因(amyM)的启 动子、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)α-淀粉酶 (amyQ)的启动子、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因的启动子等。对 于在真菌宿主中的转录，可用的启动子的示例是来源于编码米曲霉 (Aspergillus oryzae)TAKA淀粉酶、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉(A.niger) 酸稳定α-淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)脂酶、米曲霉(A.oryzae)碱性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖异构 酶、或构巢曲霉(A.nidulans)乙酰胺酶的基因的那些启动子。当编码 淀粉酶的基因在细菌菌种诸如大肠杆菌(E.coli)中表达时，可选择合 适的启动子例如，来源于包含T7启动子和噬菌体λ启动子的细菌噬菌 体启动子。用于在酵母菌种中表达的合适的启动子的示例包括但不限于 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的Gal 1和Gal 10启动子，以及 巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)的AOX1或AOX2启动子。cbh1是 来自里氏木霉(T.reesei)的内源性的、诱导型启动子。参见Liu等人 (2008)“Improved heterologous gene expression in Trichoderma reesei by cellobiohydrolase I gene(cbh1)promoter optimization”Acta Biochim.Biophys.Sin(Shanghai)40(2)：158-65。
所述编码序列能够有效地连接至信号序列。编码信号序列的DNA 可为与待表达的淀粉酶基因天然相关联的、或来源于不同属或种的 DNA序列。包含信号序列以及启动子序列的DNA构建体或载体可被引 入到真菌宿主细胞中，并可来源于相同来源。例如，信号序列为有效地 连接至cbh1启动子的cbh1信号序列。
表达载体也可包含合适的转录终止子以及在真核生物中的多腺苷化 序列，其有效地连接至编码淀粉酶变体的DNA序列。终止序列和多腺 苷化序列可适宜地来源于与所述启动子相同的来源。
所述载体可还包含使得所述载体在宿主细胞中复制的DNA序列。 此类序列的示例是质粒pUC19、pACYC177、pUB110、pE194、 pAMB1、和pIJ702的复制起点。
所述载体还可包含可选择标记，例如，其产物补偿了分离的宿主细 胞中的缺陷的基因(诸如来源于枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基 因)或赋予抗生素抗性(诸如，例如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或 四环素抗性)的基因。此外，所述载体可包含曲霉(Aspergillus)选择 标记，诸如amdS、argB、niaD和xxsC，生成潮霉素抗性的标记，或 通过诸如本领域已知的共转化完成选择。参见例如，国际PCT专利申 请WO 91/17243。
细胞内表达可在一些方面是有利的，例如，在使用某些细菌或真菌 作为宿主细胞以制备大量淀粉酶用于后续富集或纯化时。也能够利用淀 粉酶细胞外分泌至培养基中以生成包含所述分离的淀粉酶的培养的细胞 材料。
所述表达载体通常包含克隆载体的组分，诸如，例如，允许所述载 体在所选择的宿主生物中自主复制的元件和一个或多个用于选择目的的 表现型上可检测的标记。所述表达载体通常包含控制核苷酸序列，诸如 启动子、操纵子、核糖体结合位点、转录起始信号和任选地阻遏蛋白基 因或一个或多个激活因子基因。另外，所述表达载体可包含编码氨基酸 序列的序列，所述氨基酸序列能够将所述淀粉酶靶向至宿主细胞细胞器 官(诸如过氧化物酶体)或靶向至特定宿主细胞隔室。此类靶向序列包 括但不限于序列SKL。为在控制序列的指导下表达，淀粉酶的核酸序 列以相对于表达为正确的方式有效地连接至所述控制序列。
用于分别连接编码淀粉酶的DNA构建体、启动子、终止子和其它 元件，以及将其插入到合适的包含复制所需信息的载体的方法是本领域 技术人员所熟知的(参见，例如，Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor， 1989，和第三版，2001)。
3.2.宿主细胞的转化与培养
包含DNA构建体或表达载体的分离的细胞有利地用作重组制备淀 粉酶中的宿主细胞。可用编码所述酶的DNA构建体，方便地通过将所 述DNA构建体(一个或多个拷贝)整合到宿主染色体中来转化所述细 胞。这种整合一般认为是有利的，因为所述DNA序列更可能稳定地保 持在细胞中。可根据常规方法，例如通过同源或异源重组，将所述 DNA构建体整合到宿主染色体中。另选地，可用如上所述与不同类型 宿主细胞相关的表达载体转化所述细胞。
合适的细菌宿主生物的示例为革兰氏阳性菌菌种，诸如芽孢杆菌科 (Bacillaceae)，包括枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌 (Bacillus lentus)、短小芽孢杆菌(Bacillus brevis)、嗜热脂肪地芽 孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)(以前的嗜热脂肪芽孢杆 菌)、嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌 (Bacillus amyloliquefaciens)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、 灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)和苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)；链霉菌 (Streptomyces)物种，诸如鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)；乳 酸细菌物种，包括乳球菌属(Lactococcus sp.)诸如乳酸乳球菌 (Lactococcus lactis)；乳杆菌属(Lactobacillus sp.)，其包括罗伊氏 乳杆菌(Lactobacillus reuteri)；明串珠菌属(Leuconostoc sp.)；片 球菌属(Pediococcus sp.)；以及链球菌属(Streptococcus sp.)。另选 地，属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的包括大肠杆菌(E.coli)或 假单胞菌科(Pseudomonadaceae)的革兰氏阴性细菌菌种可被选作宿 主生物。
合适的酵母宿主生物可选自生物技术相关的酵母菌种，诸如但不限 于酵母菌种诸如毕赤酵母属物种(Pichia sp.)、汉逊酵母属物种 (Hansenula sp.)、或克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、耶罗威亚酵 母属(Yarrowinia)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)物种；或酵 母菌属(Saccharomyces)的菌种，其包括酿酒酵母，或属于裂殖酵母 属(Schizosaccharomyces)的菌种，诸如，例如粟酒裂殖酵母(S. pombe)。甲基营养酵母菌种的一个菌株，巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)，可用作宿主生物。另选地，宿主生物可为汉逊酵母属 (Hansenula)菌种。在丝状真菌中合适的宿主生物包括曲霉的菌种， 例如，黑曲霉、米曲霉(Aspergillus oryzae)、塔宾曲霉(Aspergillus tubigensis)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、或构巢曲霉 (Aspergillus nidulans)。另选地，镰孢属的物种(Fusarium sp.)，例 如，尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum)、或根毛霉属的物种 (Rhizomucor sp.)，诸如米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)可用作宿 主生物。其它合适的菌株包括嗜热真菌属(Thermomyces)和毛霉属物 种(Mucor sp.)。此外，木霉属物种(Trichoderma sp.)可用作宿主。 合适的用于转化曲霉属宿主细胞的方法包括，例如在EP238023中所述 的那些。由真菌宿主细胞表达的淀粉酶可为糖基化的，即，将包含糖基 部分。该糖基化模式可与野生型淀粉酶中存在的(糖基化模式)相同或 不同。糖基化的类型和/或程度可赋予酶和/或生化特性的变化。
在可通过转化的表达载体治愈基因缺陷的情况下，从表达宿主缺失 基因是有利的。可使用已知的方法以获得具有一个或多个失活的基因的 真菌宿主细胞。可通过完全或部分缺失、通过插入失活或通过任何其它 使得基因对于其指定用途失去功能的方法来实现基因失活，以便阻止该 基因表达有功能的蛋白质。可缺失任何来自木霉属(Trichoderma sp.) 或其它丝状真菌宿主的被克隆的基因，例如，cbh1、cbh2、egl1、和 egl2基因。可通过本领域已知的方法，通过将期望失活的基因的一种形 式插入到质粒中来实现基因缺失。
将DNA构建体或载体导入宿主细胞的方法包括多种技术诸如转 化；电穿孔；核显微注射；转导；转染，例如，微脂粒感染介导的和 DEAE-糊精介导的转染；用磷酸钙DNA沉淀孵育；用DNA涂覆的微 粒高速轰击；以及原生质体融合。常规转化技术在本领域中是已知的。 参见，例如，Sambrook等人(2001)，同上文。例如在美国专利 6,022,725中描述了在木霉(Trichoderma)中表达异源蛋白质。也可参 考Cao等人(2000)Science 9：991-1001针对曲霉菌株的转化。可用 载体系统构建遗传稳定的转化体，由此编码淀粉酶的核酸稳定地整合到 宿主细胞染色体中。然后通过已知技术选择和纯化转化体。
用于转化的木霉属物种(Trichoderma sp.)的制备，例如，可涉及 从真菌菌丝制备原生质体。参见Campbell等人(1989)Curr.Genet. 16:53-56。可从萌发的营养性孢子获得菌丝。用消化细胞壁的酶处理菌 丝，得到原生质体。原生质体受到悬浮培养基中存在的渗透性稳定剂的 保护。这些稳定剂包括山梨醇(sorbitol)、甘露醇(mannitol)、氯 化钾、硫酸镁等等。通常这些稳定剂的浓度在介于0.8M和1.2M之间 变化，例如，在悬浮培养基中可使用1.2M的山梨醇溶液。
宿主木霉属物种菌株摄入DNA取决于钙离子浓度。一般来讲，在 摄入溶液中使用的浓度在约10-50mM CaCl2之间。另外的合适的化合 物包括缓冲体系，诸如TE缓冲液(10mM Tris，pH7.4；1mM乙二胺 四乙酸(EDTA))或10mM MOPS，pH 6.0和聚乙二醇。据信聚乙二 醇与细胞膜融合，因此允许培养基的内容物递送到木霉属物种菌株的细 胞质中。在很多情况下，这种融合使得多个拷贝的质粒DNA整合到宿 主染色体中。
通常木霉属物种的转化使用已经过渗透性处理的原生质体或细胞， 通常密度为105至107/mL，具体地为2×106/mL。可将100μL体积的在 适当溶液(例如，1.2M山梨醇和50mM CaCl2)中的这些原生质体或 细胞与期望的DNA混合。一般来讲，摄入溶液中添加了高浓度PEG。 可将0.1至1体积的25％PEG 4000添加到原生质体悬浮液中；然而， 可用的是将约0.25体积添加到原生质体悬浮液中。也可将添加剂，诸 如二甲基亚砜、肝素、亚精胺、氯化钾等等，添加到摄入溶液以有利于 转化。类似的方法可用于其它真菌宿主细胞。参见，例如美国专利 6,022,725。
3.3.表达
制备淀粉酶的方法可包括在有利于制备所述酶的条件下培养如上所 述宿主细胞并从细胞和/或培养基回收所述酶。
用于培养细胞的培养基可为任何适用于培养所考虑的宿主细胞并获 得淀粉酶的表达的常规培养基。合适的培养基和培养基组分购自商业供 应商或可根据已出版的配方来制备(例如，如美国典型培养物保藏中心 (American Type Culture Collection，ATCC)的目录所述)。
分泌自所述宿主细胞的酶可用于全培养液制品。在本发明的方法 中，可使用本领域已知的任何培养方法实现重组微生物的耗尽全发酵液 的制备，从而导致α-淀粉酶的表达。因此，发酵可理解为包括摇瓶培 养、在实验室或工业发酵罐中的小或大规模发酵(包括连续发酵、分批 发酵、分批补料式或固态发酵)，其在合适的培养基中和允许淀粉酶表 达或被分离的条件下进行。术语“耗尽的全发酵液”在本文中被定义为 发酵材料的未分级内容物，其包括培养基，细胞外蛋白(例如，酶)和 细胞生物质。应当理解术语“耗尽的全发酵液”也涵盖已采用本领域熟 知的方法裂解或透化的细胞生物质。
可通过熟知的方法从所述培养基便利地回收宿主细胞分泌的酶，包 括通过离心或过滤从所述培养基分离所述细胞，以及通过盐(诸如硫酸 铵)沉淀培养基的蛋白质组分，随后使用层析方法诸如离子交换层析、 亲和层析等等。
载体中编码淀粉酶的多核苷酸能够有效地连接至控制序列，该控制 序列能够通过宿主细胞提供编码序列的表达，即，载体是表达载体。控 制序列可为修饰的，例如通过增加另外的转录调控元件，以使控制序列 指导的转录水平更多响应于转录调节剂。特别是，控制序列可包含启动 子。
宿主细胞可在允许淀粉酶表达的合适条件下培养。酶的表达可为组 成型的使得其持续产生，或为诱导型的，从而需要刺激以引发表达。就 诱导型表达而言，在需要时，例如向培养基中添加诱导剂物质(例如地 塞米松或IPTG或槐糖)，可引发蛋白质制备。在体外无细胞系统中， 诸如TNTTM(Promega)兔网织红细胞系统，也能重组地制备多肽。
表达宿主也可在有氧条件下，在对于宿主适当的培养基中培养。可 提供摇动或搅拌和通气的组合，并在对于所述宿主适当的温度下进行制 备，例如，约25℃至约75℃(例如，30℃至45℃)，其取决于宿主和 制备期望的淀粉酶变体的需要。培养可进行约12至约100小时或更长 (以及之间的任何时间值，例如，24至72小时)。通常，培养物培养 液的pH为约4.0至约8.0，同样取决于宿主相对于淀粉酶制备所需的培 养条件。
3.4.淀粉酶活性的鉴定
为了评估宿主细胞中淀粉酶的表达，测定方法可测量所表达的蛋白 质，相应的mRNA，或α-淀粉酶活性。例如，合适的测定方法包括 RNA印迹、逆转录酶聚合酶链反应和采用适当的标记过的杂交探针的 原位杂交。合适的测定方法还包括测量样品中的淀粉酶活性，例如，通 过直接测量培养基中的还原性糖(诸如葡萄糖)的测定方法。例如，可 使用葡萄糖试剂盒No.15-UV(Sigma Chemical Co.)或设备诸如 Technicon Autoanalyzer测定葡萄糖浓度。也可通过任何已知方法测量 α-淀粉酶活性，诸如下面所述的PAHBAH或ABTS测定。
3.5.富集和纯化淀粉酶变体的方法
发酵，分离和浓缩技术是本领域所熟知的，可使用常规方法来制备 包含富集的α-淀粉酶变体多肽的溶液。
在发酵后，获得发酵液，通过常规分离技术去除微生物细胞和各种 悬浮固体(包括残余发酵原料)以获取淀粉酶溶液。一般来讲使用过 滤、离心、微量过滤、旋转式真空鼓过滤、超滤、离心之后进行超滤、 提取或层析法等等。
希望浓缩含α-淀粉酶变体多肽的溶液以优化回收。使用未富集的 溶液需要增加孵育时间以收集富集的或纯化的酶沉淀。
使用常规浓缩技术浓缩所述含酶的溶液直至获得期望的酶水平。可 通过本文所讨论的技术中的任一种来实现所述含酶的溶液的浓缩。示例 性的富集和纯化方法包括但不限于旋转式真空过滤和/或超滤。
将酶溶液浓缩成富集的酶溶液直至包含富集的α-淀粉酶变体多肽 溶液的酶活性处于期望水平。
可例如使用沉淀剂，诸如金属卤化物沉淀剂，来进行浓缩。金属卤 化物沉淀剂包括但不限于碱金属氯化物、碱金属溴化物、以及这些金属 卤化物中的两种或更多种的共混物。示例性的金属卤化物包括氯化钠、 氯化钾、溴化钠、溴化钾、以及这些金属卤化物中的两种或更多种的共 混物。金属卤化物沉淀剂，氯化钠，也可用作防腐剂。
金属卤化物沉淀剂以能有效地使淀粉酶沉淀的量使用。在常规测试 后，能有效引起所述酶沉淀的金属卤化物的至少有效量和最佳用量、以 及用于最大化回收的沉淀的条件包括孵育时间、pH、温度和酶的浓度 的选择对于本领域普通技术人员将是显而易见的。
一般来讲，向富集的酶溶液中添加至少约5％w/v(重量/体积)至 约25％w/v的金属卤化物，通常为至少8％w/v。一般来讲，向富集的 酶溶液中添加不超过约25％w/v的金属卤化物，通常为不超过约20％ w/v。金属卤化物沉淀剂的最佳浓度将取决于(除了别的以外)特定的 α淀粉酶变体多肽的性质和其在富集的酶溶液中的浓度。
沉淀酶的另一替代方法是使用有机化合物。示例性的有机化合物沉 淀剂包括：4-羟基苯甲酸、4-羟基苯甲酸的碱金属盐、4-羟基苯甲酸的 烷基酯、以及这些有机化合物中的两种或更多种的共混物。添加有机化 合物沉淀剂可在添加金属卤化物沉淀剂之前、同时或之后发生，并且两 种沉淀剂(有机化合物和金属卤化物)的添加可按顺序进行或同时进 行。
一般来讲，有机沉淀剂选自：4-羟基苯甲酸的碱金属盐，诸如钠盐 和钾盐；和4-羟基苯甲酸的直链或支链烷基酯，其中烷基基团包含1至 12个碳原子；以及这些有机化合物中的两种或更多种的共混物。有机 化合物沉淀剂可为，例如，4-羟基苯甲酸的直链或支链烷基酯，其中烷 基基团包含1至10个碳原子，以及这些有机化合物中的两种或更多种 的共混物。示例性的有机化合物是4-羟基苯甲酸的直链烷基酯，其中 烷基基团包含1至6个碳原子，以及这些有机化合物中的两种或更多种 的共混物。也可使用4-羟基苯甲酸的甲酯、4-羟基苯甲酸的丙酯、4-羟 基苯甲酸的丁酯、4-羟基苯甲酸的乙酯、以及这些有机化合物中的两种 或更多种的共混物。另外的有机化合物也包括但不限于4-羟基苯甲酸 甲酯(称为甲基PARABEN)、4-羟基苯甲酸丙酯(称为丙基 PARABEN)，两者同时也是淀粉酶防腐剂。进一步的描述参见，例 如，美国专利5,281,526。
有机化合物沉淀剂的添加提供了就pH、温度、淀粉酶变体浓度、 沉淀剂浓度和孵育时间而言的沉淀条件的高灵活性的优点。
有机化合物沉淀剂以能有效地改善借助于金属卤化物沉淀剂的酶的 沉淀的量使用。根据本公开，在常规测试后，有机化合物沉淀剂的至少 有效量和最佳用量以及针对最大回收的沉淀条件包括孵育时间、pH、 温度和酶的浓度的选择对于本领域普通技术人员将是显而易见的。
一般来讲，向富集的酶溶液中添加至少约0.01％w/v的有机化合物 沉淀剂，通常为至少约0.02％w/v。一般来讲，向富集的酶溶液中添加 不超过约0.3％w/v的有机化合物沉淀剂，通常为不超过约0.2％w/v。
可将包含金属卤化物沉淀剂和有机化合物沉淀剂的富集的多肽溶液 调节至一个pH值，其将必然取决于待富集或纯化的酶。一般来讲， pH被调节至接近淀粉酶的等电点的水平。pH可在从低于等电点(pI) 约2.5pH单位至高于等电点约2.5pH单位的pH范围内调节。
获得富集的或纯化的酶沉淀物所需的孵育时间取决于特定酶的性 质、酶的浓度、特定沉淀剂及其浓度。一般来讲，有效沉淀酶的时间在 约1至约30小时之间；通常不会超过约25小时。在有机化合物沉淀剂 存在下，孵育时间还可减少至少于约10小时，并且在大多数情况下甚 至为约6小时。
一般来讲，在孵育过程中温度为介于约4℃和约50℃之间。通常， 方法是在介于约10℃和约45℃之间(例如，在介于约20℃和约40℃之 间)的温度下进行。对于诱导沉淀的最佳温度根据溶液条件以及所用的 酶或沉淀剂而变化。
通过搅拌包含酶、添加的金属卤化物和添加的有机化合物的溶液提 高了经富集或纯化的酶沉淀物的总回收率，提高了该方法进行的效率。 在添加金属卤化物和有机化合物过程中、以及在后续孵育期间均进行搅 拌步骤。合适的搅拌方法包括机械搅动或摇动、剧烈曝气或任何类似技 术。
在孵育期后，然后通过常规分离技术，诸如过滤、离心、微滤、旋 转真空过滤、超滤、加压过滤、跨膜微滤、错流膜过滤等等将经富集或 纯化的酶与解离的色素和其它杂质分开并收集。可通过用水洗涤沉淀来 获得酶沉淀物的进一步富集或纯化。例如，用含金属卤化物沉淀剂的水 或用含金属卤化物和有机化合物沉淀剂的水洗涤经富集或纯化的酶沉淀 物。
在发酵过程中，培养物培养液中积聚了α-淀粉酶变体多肽。为了 分离、富集或纯化期望的α-淀粉酶变体，将培养物培养液离心或过滤 以去除细胞，并且所得的无细胞液体用于酶富集或纯化。在一个实施方 案中，无细胞培养液使用约70％饱和度的硫酸钠进行盐析；然后将 70％饱和度沉淀级分溶解在缓冲液中，上样至柱(诸如Sephadex G- 100柱)并且洗脱以回收具有酶活性的级分。为了进一步富集或纯化， 可使用常规方法诸如离子交换层析。
经富集或纯化的酶可用于衣物洗涤和清洁应用。例如，它们可用于 衣物洗涤剂和除斑剂中。它们可制成为液体(溶液，浆液)或固体(颗 粒状、粉末状)的最终产品。
在Sumitani等人(2000)“New type of starch-binding domain: the direct repeat motif in the C-terminal region of Bacillus sp.195α- amylase contributes to starch binding and raw starch degrading” Biochem.J.350：477-484中描述了富集和纯化方法的更具体的示例， 并且简要汇总在此。从4升浅青紫链霉菌(Streptomyces lividan) TK24培养上清液获得的酶用80％饱和度的(NH4)2SO4处理。通过离心 (10,000×g，20分钟，4℃)回收沉淀并重新溶解在20mM含5mM CaCl2的Tris/HCl缓冲液(pH 7.0)中。然后将溶解的沉淀用相同缓冲 液透析。将经透析的样品上样至先前用20mM Tris/HCl缓冲液(pH 7.0)，5mM CaCl2平衡过的Sephacryl S-200柱，并用相同的缓冲液以 7mL/小时的线性流速洗脱。收集来自柱的级分并通过酶测定法和SDS- PAGE判断来估计活性。如下进一步纯化蛋白质。用含5mM CaCl2和 1.5M(NH4)2SO4的20mM Tris/HCl缓冲液(pH 7.0)平衡Toyopearl HW55柱(Tosoh Bioscience，Montgomeryville，PA；目录号 19812)。用溶于含5mM CaCl2、pH 7.0的20mM Tris/HCL缓冲液中 的1.5至0M(NH4)2SO4的线性梯度洗脱所述酶。收集活性级分，用 80％饱和度的(NH4)2SO4沉淀所述酶。如上所述对沉淀进行回收、重新 溶解和透析。然后将经透析的样品上样至先前平衡过的Mono Q HR5/5 柱(Amersham Pharmacia；目录号17-5167-01)，平衡使用了含5mM CaCl2的20mM Tris/HCl缓冲液(pH 7.0)，流速为60mL/小时。收集 活性级分，并且添加到1.5M(NH4)2SO4溶液中。如前述将活性酶级分在 Toyopearl HW55柱上重新进行层析分析，以产生如通过SDS-PAGE测 定的均一的酶。参见，例如，Sumitani等人(2000)Biochem.J.350： 477-484，针对其所述方法和变化的一般讨论。
对于制备规模回收，一般如上所述可通过用聚合物絮凝去除细胞来 富集或部分纯化α-淀粉酶变体多肽。另选地，可通过微量过滤之后进 行浓缩(通过使用可用的膜和设备进行超滤)来富集或纯化所述酶。然 而，对于某些应用，不需要富集或纯化酶，可裂解全培养液培养物并且 无需进一步处理即可使用。然后可将所述酶进行处理，例如成为颗粒 剂。
4.淀粉酶变体的组分和用途
淀粉酶变体可用于多种工业应用。例如，淀粉酶变体可用于淀粉转 化处理，特别是用于已发生液化的淀粉的糖化处理。所期望的终产物可 为通过淀粉底物的酶转化生成的任何产物。例如，所期望的产物可为富 含葡萄糖和麦芽糖的糖浆，其可用于其它工艺，诸如HFCS的制备； 或其可被转化成多种其它可用的产物，诸如抗坏血酸中间体(例如，葡 糖酸盐；2-酮-L-古洛糖酸；5-酮-葡糖酸盐；和2,5-二酮葡糖酸盐)； 1,3-丙二醇；芳族氨基酸(例如，酪氨酸，苯丙氨酸和色氨酸)；有机 酸(例如，乳酸，丙酮酸，琥珀酸，异柠檬酸，和草酰乙酸)；氨基酸 (例如，丝氨酸和甘氨酸)；抗生素；抗微生物剂；酶；维生素；以及 激素。
淀粉转化处理可在设计以制备用于燃料或饮用的醇(即，饮用酒 精)的发酵过程之前或同时进行。本领域技术人员了解可用于制备这些 终产物的各种发酵条件。淀粉酶变体也可用于食品制备的组合物和方法 中。下面更详细地描述了淀粉酶变体的这些各种用途。
4.1.淀粉底物的制备
本领域的一般技术人员熟知可用于制备用于本文所公开的方法的淀 粉底物的可用方法。例如，可用的淀粉底物可得自块茎、根、茎、豆 类、谷物或整谷粒。更具体地，颗粒状的淀粉可得自玉米、玉米棒、小 麦、大麦、黑麦、黑小麦、蜀黍、西米、粟、木薯(cassava)、木薯 淀粉(tapioca)、高粱、稻、豌豆、菜豆、香蕉、或马铃薯。玉米含 约60％-68％的淀粉；大麦含约55％-65％的淀粉；粟含约75％-80％的 淀粉；小麦含约60％-65％的淀粉；并且抛光的稻含70％-72％的淀 粉。具体设想的淀粉底物是玉米淀粉和小麦淀粉。来自谷物的淀粉可以 是碾碎的或完整的，包括玉米固体，诸如籽粒、麸皮和/或玉米棒。淀 粉也可为高度精炼的原料淀粉或来自淀粉精炼工艺的原料。也可商购获 得各种淀粉。例如，玉米淀粉可购自Cerestar、Sigma、和Katayama Chemical Industry Co.(Japan)；小麦淀粉可购自Sigma；甘薯淀粉 可购自Wako Pure Chemical Industry Co.(Japan)；并且马铃薯淀粉 可购自Nakaari Chemical Pharmaceutical Co.(Japan)。
淀粉底物可为来自整谷粒碾磨的粗制淀粉，其包含非淀粉级分，例 如胚芽残余和纤维。研磨可包括湿磨或干磨或碾磨。在湿磨中，将整谷 粒浸泡在水或稀酸中以将谷物分离成其组成部分，例如淀粉、蛋白质、 胚芽、油、籽粒纤维。湿磨有效地分离胚芽和粗粉(即，淀粉颗粒和蛋 白质)，并且尤其适用于制备糖浆。在干磨或碾磨中，整个籽粒被碾磨 成细粉并且通常加工时未将谷物分成其组成部分。在一些情况下，回收 了来自籽粒的油。因此除淀粉之外，干碾过的谷物包含显著量的非淀粉 碳水化合物。干碾的淀粉底物可用于制备乙醇或其它生化物品。待加工 的淀粉可为高度精制的淀粉品质，例如，至少90％、至少95％、至少 97％、或至少99.5％纯的。
4.2.淀粉的糊化和液化
如本文所用，术语“液化作用”或“液化”是指将淀粉转化为低粘 性和更短链的糊精的过程。一般来讲，该过程涉及淀粉糊化同时或之后 进行α-淀粉酶的添加，虽然任选地可添加另外的诱导液化的酶。在一 些实施方案中，如上所述制备的淀粉底物用水混悬。淀粉浆液包含的淀 粉的干固体重量百分比可为约10％-55％、约20％-45％、约30％- 45％、约30％-40％、或约30％-35％。可用例如计量泵将α-淀粉酶添 加到浆液中。通常用于该应用的α-淀粉酶是热稳定的细菌α-淀粉酶， 诸如嗜热脂肪芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)α-淀粉酶。通 常以例如每千克淀粉干物质约1500单位来施加α-淀粉酶。为了优化 α-淀粉酶的稳定性和活性，通常将浆液的pH调节至约pH 5.5-6.5，也 可添加约1mM的钙(约40ppm游离钙离子)。在液化之后浆液中保 留的细菌α-淀粉酶可通过多种方法灭活，包括在后续反应步骤中降低 pH或通过去除浆液中的钙(如果在酶是依赖于钙的情况下)。
淀粉浆液加上α-淀粉酶可通过蒸汽加热至105℃的喷射式加压锅连 续泵送。在这些条件下糊化快速发生，并且酶活性加上显著的剪切力使 淀粉底物开始水解。在喷射式加压锅中的停留时间很短。可使部分糊化 的淀粉通过一系列的保持在105-110℃的保持管，保持5-8分钟以完成 糊化过程(“初级液化”)。水解至所需的DE是在贮槽中(85-95℃ 或更高温度下，处理约1至2小时)完成的(“二次液化”)。这些槽 可包含导流板以阻止逆向混合。如本文所用，术语“二次液化分钟数” 是指从二次液化开始至右旋糖当量被测量所经历的时间。然后使浆液冷 却至室温。该冷却步骤可为30分钟至180分钟，例如90分钟至120分 钟。液化的淀粉通常呈浆液的形式，其具有约10％-50％；约10％- 45％；约15％-40％；约20％-40％；约25％-40％；或约25％-35％的 干固体含量(w/w)。
采用淀粉酶变体的液化作用可有利地在低pH下进行，无需将pH 调节至约pH 5.5-6.5。淀粉酶变体可用于2至7的pH范围下的液化作 用，例如，pH 3.0-7.5，pH 4.0-6.0、或pH 4.5-5.8。淀粉酶变体可在约 85℃至95℃的温度范围保持液化活性，例如，85℃、90℃、或95℃。 例如，用800μg淀粉酶在25％DS玉米淀粉的溶液中可在例如pH 5.8 和85℃下、或pH 4.5和95℃下进行液化作用10分钟。可使用多个本 领域已知的粘度测定法中的任一个测定液化活性。
在使用本发明的淀粉酶变体的具体实施方案中，淀粉液化在90℃- 115℃的温度范围内进行，目的是制备高纯度的葡萄糖糖浆、HFCS、 麦芽糖糊精等。
4.3.糖化
使用淀粉酶变体，任选地在其它酶存在下，可将液化的淀粉糖化为 富含更低DP(例如，DP1+DP2)糖类的糖浆。糖化产物的确切成分 取决于所用酶的组合，以及被加工的颗粒状淀粉的类型。优选地，可使 用所提供的淀粉酶变体获得的糖浆包含的糖化的淀粉中全部低聚糖的 DP2的重量百分比可超过30％，例如，45％至65％或55％至65％。在 糖化的淀粉中(DP1+DP2)的重量百分比可超过约70％，例如，75％ 至85％或80％至85％。本发明的淀粉酶也制备了相对高收率的葡萄 糖，例如，在糖浆产物中DP1>20％。
液化一般来讲是以连续工艺进行的，而糖化通常是以分批工艺进行 的。通常在约60℃-65℃和约4.0-4.5的pH下(例如pH 4.3)糖化是最 有效的，需要将液化的淀粉冷却并调节pH。糖化可在例如约40℃、约 50℃、或约55℃至约60℃或约65℃的温度下进行。通常在搅拌槽中进 行糖化，这可能需要若干小时来填充或排空。通常在槽已填充时以固定 比率将酶添加至干燥的固体，或在填充阶段的开始以单剂量添加酶。生 成糖浆的糖化反应通常运行超过约24-72小时，例如，24-48小时。当 获得最大或所需的DE时，通过例如加热至85℃持续5分钟来终止反 应。进一步孵育会导致更低的DE，最终至约90DE，因为积聚的葡萄 糖通过酶促逆反应和/或以热力学平衡的方法重新聚合成异麦芽糖和/或 其它反应产物。在使用淀粉酶时，糖化最佳地在约30℃至约75℃的温 度范围内进行，例如，45℃至75℃或47℃至74℃。糖化可在约pH 3 至约pH 7的pH范围内进行，例如，pH 3.0至pH 7.5，pH 3.5至pH 5.5，pH 3.5，pH 3.8，或pH 4.5。
α-淀粉酶可以组合物的形式添加到浆液中。向颗粒状淀粉底物的浆 液中添加的α-淀粉酶的量为约0.6至10ppm ds，例如，2ppm ds。α-淀 粉酶可以全培养液、澄清的、富集的、部分纯化的或纯化的酶(形式) 添加。淀粉酶的比活性可为，例如，以PAHBAH测定法测量的约300 U/mg酶。α-淀粉酶也可以全培养液产物形式添加。
α-淀粉酶可以分离的酶溶液的形式添加至浆液。例如，α-淀粉酶可 以由表达淀粉酶的宿主细胞制备的细胞培养材料的形式添加。在发酵或 SSF过程期间，α-淀粉酶还可由宿主细胞分泌至反应培养基中，使得向 反应中持续提供酶。所述制备和分泌淀粉酶的宿主细胞也可表达另外的 酶，诸如葡糖淀粉酶。例如，美国专利5,422,267公开了酵母中的葡糖 淀粉酶用于制备含酒精饮料的用途。例如，宿主细胞，例如，里氏木霉 或黑曲霉，可经工程化以在糖化过程中共表达α-淀粉酶和葡糖淀粉 酶，例如，HgGA、TrGA、或TrGA变体。所述宿主细胞可经基因修 饰以便不表达其内源性的葡糖淀粉酶和/或其它酶、蛋白质或其它物 质。所述宿主细胞可经工程化以表达广谱的各种糖化酶。例如，重组酵 母宿主细胞可包含编码葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、利用戊糖的酶、α-淀 粉酶、支链淀粉酶、异淀粉酶和/或异支链淀粉酶的核酸。参见，例 如，WO 2011/153516 A2。
4.4.异构化
通过用淀粉酶处理制备的可溶性淀粉水解产物可转化为高果糖的基 于淀粉的糖浆(HFSS)，诸如高果糖玉米糖浆(HFCS)。可使用葡 萄糖异构酶实现这种转化，特别是固定在固体载体上的葡萄糖异构酶。 pH增大到约6.0至约8.0，例如，pH 7.5(取决于异构酶)，并且通过 离子交换去除Ca2+。合适的异构酶包括IT (Novozymes A/S)；IMGI、和G993、G993、G993液体、和IGI。在异构化后，混合物通常包含约40％-45％的果 糖，例如，42％的果糖。
4.5.发酵
可溶性淀粉水解产物，特别是富含葡萄糖的糖浆，可通过将淀粉水 解产物与发酵生物体接触来发酵，通常在32℃左右的温度下，诸如对 于产酒精酵母为30℃至35℃。发酵的温度和pH将取决于发酵生物 体。EOF产物包括代谢物，诸如柠檬酸、乳酸、琥珀酸、谷氨酸一 钠、葡糖酸、葡萄糖酸钠、葡萄糖酸钙、葡萄糖酸钾、衣康酸和其它羧 酸、葡萄糖酸δ内酯、异抗坏血酸钠、赖氨酸和其它氨基酸、Ω-3脂肪 酸、丁醇、异戊二烯、1,3-丙二醇和其它生物材料。
产乙醇微生物包括酵母，诸如酿酒酵母和细菌，例如运动发酵单胞 菌(Zymomonas moblis)，其表达乙醇脱氢酶和丙酮酸脱羧酶。所述产 乙醇微生物可表达木糖还原酶和木糖醇脱氢酶，其将木糖转化为木酮 糖。例如能够耐受高温的产乙醇微生物的改良菌株在本领域是已知的并 且能够使用。参见Liu等人(2011)Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao 27 (7)：1049-56。酵母的商业来源包括ETHANOL (LeSaffre)、(Lallemand)、RED(Red Star)、(DSM Specialties)和 (Alltech)。通过发酵制备其它代谢物(诸如柠檬酸和乳酸)的微生物 也是本领域中已知的。参见，例如，Papagianni(2007)“Advances in citric acid fermentation by Aspergillus niger:biochemical aspects, membrane transport and modeling”Biotechnol.Adv.25(3)：244- 63；John等人(2009)“Direct lactic acid fermentation:focus on simultaneous saccharification and lactic acid production,”Biotechnol. Adv.27(2)：145-52。
所述糖化和发酵工艺可以SSF工艺进行。发酵可包括例如后续的 富集、纯化和乙醇回收。在发酵过程中，培养液或“啤酒”的乙醇含量 可达到约8％-18％v/v，例如，14％-15％v/v。可将培养液蒸馏以制备 富集的，例如96％纯的乙醇溶液。另外，通过发酵生成的CO2可用 CO2洗涤器收集、压缩并出售用于其它用途，例如，碳酸饮料或干冰 制备。来自发酵过程的固体废物可用作富含蛋白质的产品，例如家畜饲 料。
如上所述，可使用在SSF全程持续表达和分泌淀粉酶的真菌细胞 进行SSF处理。表达淀粉酶的真菌细胞也可为发酵微生物，例如，产 乙醇微生物(ethanologenic microorganism)。因此可使用表达足够量淀 粉酶的真菌细胞进行乙醇制备，使得少添加或无需添加外源的酶。所述 真菌宿主细胞可来自适当工程化的真菌菌株。也可使用除了淀粉酶之外 表达和分泌其它酶的真菌宿主细胞。此类细胞可表达葡糖淀粉酶和/或 支链淀粉酶、植酸酶、α-葡糖苷酶、异淀粉酶、β-淀粉酶、纤维素酶、 木聚糖酶、其它半纤维素酶、蛋白酶、β-葡糖苷酶、果胶酶、酯酶、氧 化还原酶、转移酶、或其它酶。
该工艺的变型是“分批补料发酵”系统，其中在发酵过程中增量添 加底物。在分解代谢物阻遏可抑制细胞代谢并且希望限制培养基中底物 的量的情况下，分批补料系统是可有用的。通过可测量因素(诸如 pH、溶解氧和废气诸如CO2的分压)的变化估计分批补料系统中的真 实底物浓度。分批发酵和分批补料发酵是常见的并且是本领域所熟知 的。
连续发酵是一种开放系统，其中将限定的发酵培养基连续添加至生 物反应器，并且同时取出等量的条件培养基用于处理。连续发酵大体保 持培养物在恒定的高密度上，其中细胞主要处于对数生长期。连续发酵 允许调节细胞生长和/或产物浓度。例如，限制性营养物质诸如碳源或 氮源保持在固定速率，使所有其它参数为中等。因为生长保持在稳态， 由于培养基被抽出导致的细胞损耗应与发酵中的细胞生长速率保持平 衡。优化连续发酵工艺以及使产物形成速率最大化的方法是工业微生物 领域所熟知的。
4.6.包含淀粉酶变体的组合物
淀粉酶变体可与葡糖淀粉酶(EC 3.2.1.3)组合，例如，木霉葡糖 淀粉酶或其变体。示例性的葡糖淀粉酶是具有优异的比活性和热稳定性 的里氏木霉葡糖淀粉酶(TrGA)及其变体。参见美国已公布的专利申 请2006/0094080、2007/0004018、和2007/0015266(Danisco US Inc.)。TrGA的合适的变体包括具有葡糖淀粉酶活性并且与野生型 TrGA具有至少80％、至少90％、或至少95％序列同一性的那些。淀 粉酶变体有利地增加了在由TrGA催化的糖化过程中制备的葡萄糖的收 率。
另选地，葡糖淀粉酶可为另一种来源于植物(包括藻类)、真菌或 细菌的葡糖淀粉酶。例如，葡糖淀粉酶可为黑曲霉G1或G2葡糖淀粉 酶或其变体(例如，Boel等人(1984)EMBO J.3：1097-1102；WO 92/00381；WO 00/04136(Novo Nordisk A/S))；和泡盛曲霉(A. awamori)葡糖淀粉酶(例如，WO 84/02921(Cetus Corp.))。其它 设想的曲霉葡糖淀粉酶包括具有增强的热稳定性的变体，例如，G137A 和G139A(Chen等人(1996)Prot.Eng.9：499-505)；D257E和 D293E/Q(Chen等人(1995)Prot.Eng.8：575-582)；N182(Chen 等人(1994)Biochem.J.301：275-281)；A246C(Fierobe等人 (1996)Biochemistry，35：8698-8704)；和在位置A435和S436中 具有Pro残基的变体(Li等人(1997)Protein Eng.10：1199- 1204)。其它设想的葡糖淀粉酶包括踝节菌(Talaromyces)葡糖淀粉 酶，尤其是来源于埃默森踝节菌(T.emersonii)(例如，WO 99/28448 (Novo Nordisk A/S)、莱色踝节菌(T.leycettanus)(例如，美国专 利RE 32,153(CPC International，Inc.))、杜邦踝节菌(T. duponti)、或嗜热踝节菌(T.thermophilus)(例如，美国专利 4,587,215)的葡糖淀粉酶。设想的细菌葡糖淀粉酶包括来自梭菌 (Clostridium)的葡糖淀粉酶，尤其是高温产淀粉梭菌(C. thermoamylolyticum)(例如，EP 135,138(CPC International， Inc.)和热硫化氢梭菌(C.thermohydrosulfuricum)(例如， WO 86/01831(Michigan Biotechnology Institute))。合适的葡糖淀粉 酶包括来源于米曲霉(Aspergillus oryzae)的葡糖淀粉酶，诸如在WO 00/04136(Novo Nordisk A/S)中SEQ ID NO:2所示的葡糖淀粉酶。 另外合适的是商业型葡糖淀粉酶，诸如AMG 200L；AMG 300L； SANTM SUPER和AMGTM E(Novozymes)；300和 OPTIDEX L-400(Danisco US Inc.)；AMIGASETM和AMIGASETM PLUS(DSM)、G900(Enzyme Bio-Systems)；和G990ZR(低蛋白酶含量的黑曲霉葡糖淀粉酶)。其它合适 的葡糖淀粉酶包括烟曲霉(Aspergillus fumigatus)葡糖淀粉酶、踝节菌 (Talaromyces)葡糖淀粉酶、草根霉(Thielavia)葡糖淀粉酶、松庆 病菌(Trametes)葡糖淀粉酶、嗜热丝孢菌(Thermomyces)葡糖淀粉 酶、阿太氏菌(Athelia)葡糖淀粉酶、或腐质霉(Humicola)葡糖淀 粉酶(例如，HgGA)。通常葡糖淀粉酶以约0.1至2葡糖淀粉酶单位 (GAU)/克干固体(ds)的量添加，例如，约0.16GAU/g ds、0.23 GAU/g ds、或0.33GAU/g ds。
可与淀粉酶一起使用的其它合适的酶包括植酸酶、蛋白酶、支链淀 粉酶、β-淀粉酶、异淀粉酶、不同的α-淀粉酶、α-葡糖苷酶、纤维素 酶、木聚糖酶、其它半纤维素酶、β-葡糖苷酶、转移酶、果胶酶、脂肪 酶、角质酶，酯酶、氧化还原酶、或它们的组合。例如，可添加对于本 领域的技术人员所熟知的有效量的脱支酶，诸如异淀粉酶(EC 3.2.1.68)。支链淀粉酶(EC 3.2.1.41)，例如也是 合适的。支链淀粉酶通常以100U/kg ds的量添加。另外合适的酶包括 蛋白酶，诸如真菌和细菌蛋白酶。真菌蛋白酶包括得自曲霉的那些，诸 如黑曲霉、泡盛曲霉(A.awamori)、米曲霉(A.oryzae)；毛霉 (Mucor)(例如，米黑毛霉(M.miehei))；根霉(Rhizopus)；以 及木霉。
β-淀粉酶(EC 3.2.1.2)是外部作用的生麦芽糖淀粉酶，其催化1,4- α-糖苷键水解为支链淀粉和相关的葡萄糖聚合物，从而释放麦芽糖。已 经从各种植物和微生物分离出β-淀粉酶。参见Fogarty等人(1979)的 Progress in Industrial Microbiology，第15卷，第112-115页。这些β- 淀粉酶的最佳温度范围是40℃至65℃，最佳pH范围是约4.5至约 7.0。设想的β-淀粉酶包括但不限于来自大麦BBA 1500、DBA、OPTIMALTTM ME、OPTIMALTTM BBA(Danisco US Inc.)；和NOVOZYMTM WBA(Novozymes A/S)的β-淀粉酶。
包含本发明的淀粉酶的组合物可为含水的或不含水的制剂、颗粒 剂、粉末、凝胶、混悬液、糊剂等，其还可包含本文列出的另外的酶中 的任意一者或多者，连同缓冲液、盐、防腐剂、水、助溶剂、表面活性 剂等等。此类组合物可与已经存在于浆液、水浴、洗衣机、食品或饮料 产品等中的内源性的酶或其它成分结合起作用，例如，内源性的植物 (包括藻类)酶、由先前加工步骤残余的酶等等。
5.用于烘培和食品制备的组合物和方法
本发明还涉及“食品组合物”(包括但不限于包含淀粉酶的食物产 品、动物饲料和/或食品/饲料添加剂)和用于制备此类包含淀粉酶变体 和一种或多种食品成分的混合物的食物组合物的方法，或其用途。
此外，本发明涉及淀粉酶在制备食品组合物中的用途，其中所述食 品组合物在添加本发明的多肽后进行烘培。如本文所用，术语“烘培组 合物”是指在提供烘培的食物产品的过程中制备的任何组合物和/或添 加剂，包括但不限于面包粉、生面团、烘培添加剂和/或烘培产品。食 品组合物或添加剂可为液体或固体。
如本文所用，术语“面粉”是指已研磨或碾磨的谷粒。术语“面 粉”也指已被碾磨或捣碎的西米或块茎产品。在一些实施方案中，除已 研磨或捣碎的谷物或植物物质之外，面粉还可包含多种组分。其他组分 的示例，但不旨在用来限制，是发酵剂。谷粒包括小麦、燕麦、黑麦、 和大麦。块茎产品包括木薯粉(tapioca flour)、木薯淀粉(cassava flour)粉、和吉士粉(custard powder)。术语“面粉”也包括碾磨的 玉米面、玉米粗粉、米粉(rice flour)、全面粉、自发粉、木薯粉 (tapioca)、木薯淀粉、米粉(ground rice)、浓缩粉和吉士粉。
对于用于烘培和食品生产的商用和家用面粉，在面粉中保持适当的 α-淀粉酶活性水平是很重要的。过高的活性水平可导致产品变粘和/或 变糊从而滞销。α-淀粉酶活性不足的面粉可能不包含对于正常酵母功能 足够的糖类，其导致面包或烘培产品干燥或碎裂。因此，淀粉酶，其单 独或与其它α-淀粉酶组合，可添加到面粉中以增强面粉中内源性的α- 淀粉酶活性水平。
淀粉酶可进一步单独添加或与其它淀粉酶组合添加以阻止或延迟老 化，即烘培产品屑粒硬化。抗老化淀粉酶的量的范围通常为0.01-10mg 酶蛋白/kg面粉，例如，0.5mg/kg ds。可与淀粉酶结合地使用的另外的 抗老化淀粉酶包括内切淀粉酶，例如，来源于芽孢杆菌(Bacillus)的 细菌内切淀粉酶。另外的淀粉酶可为另一种生麦芽糖α-淀粉酶(EC 3.2.1.133)，例如，来源于芽孢杆菌(Bacillus)。是示例 性的来自嗜热脂肪芽杆菌(B.stearothermophilus)菌株NCIB 11837的 生麦芽糖α-淀粉酶，在Christophersen等人(1997)Starch 50：39-45 中有所描述。抗老化内切淀粉酶的其它示例包括来源于芽孢杆菌 (Bacillus)的细菌α-淀粉酶，诸如地衣芽孢杆菌或解淀粉芽孢杆菌 (B.amyloliquefaciens)的细菌α-淀粉酶。抗老化淀粉酶可为例如，来 自植物来源(诸如大豆)的或来自微生物来源(诸如芽孢杆菌 (Bacillus))的内切淀粉酶(诸如β-淀粉酶)。
包含淀粉酶的烘培组合物还可包含磷脂酶或具有磷脂酶活性的酶。 具有磷脂酶活性的酶具有以脂肪酶单位(LU)测量的活性。磷脂酶可 具有A1或A2活性以从磷脂去除脂肪酸，形成溶血磷脂。它可能具有 或者可能不具有脂肪酶活性，即对三甘油酯底物的活性。通常磷脂酶的 最佳温度在30℃-90℃的范围内，例如，30℃-70℃。添加的磷脂酶可为 动物来源的，例如，来自胰腺，例如，牛的或猪的胰腺、蛇毒或蜂毒。 另选地，磷脂酶可为微生物来源的，例如，来自丝状真菌、酵母或细 菌。
磷脂酶以提高面包在烘培后起始阶段期间(特别是最初24小时) 的柔软性的量添加。磷脂酶的量通常将在每kg面粉0.01-10mg酶蛋白 的范围内，例如，0.1-5mg/kg。即，一般来讲，磷脂酶活性将在20- 1000LU/kg面粉的范围内，其中脂肪酶单位被定义为在30℃，pH 7.0 下，用阿拉伯树胶作为乳化剂、甘油三丁酸酯作为底物，每分钟释放 1μmol丁酸所需的酶量。
生面团组合物大体包含小麦粗粉或小麦粉和/或其它类型粗粉，面 粉或淀粉诸如玉米粉、玉米淀粉、黑麦粗粉、黑麦粉、燕麦粉、燕麦粗 粉、大豆粉、高粱粗粉、高粱粉、马铃薯粗粉、马铃薯粉或马铃薯淀 粉。生面团可为新鲜、冷冻或半烘烤的。生面团可为发酵过的生面团或 将要进行发酵的生面团。生面团可以各种方式发酵，诸如通过添加化学 发酵剂(例如，碳酸氢钠)或通过添加发酵剂，即，发酵的生面团。生 面团还可通过添加合适的酵母培养物来发酵，诸如酿酒酵母(面包酵 母)的培养物，例如，可商购获得的酿酒酵母(S.cerevisiae)菌株。
生面团还可包含其它常规的生面团成分，例如，蛋白质，诸如奶 粉、谷蛋白和大豆；鸡蛋(例如，全蛋、蛋黄或蛋清)；抗氧化剂，诸 如抗坏血酸、溴酸钾、碘酸钾、偶氮二甲酰胺(ADA)或过硫酸铵； 氨基酸诸如L-半胱氨酸；糖类；或盐，诸如氯化钠、乙酸钙、硫酸钠 或硫酸钙。生面团还可包含脂肪，例如，三甘油酯，诸如颗粒状脂肪或 起酥油。生面团还可包含乳化剂诸如单甘油酯或二甘油酯、单甘油酯或 二甘油酯的二乙酰基酒石酸酯、脂肪酸的糖脂、脂肪酸的聚甘油酯、单 甘油酯的乳酸酯、单甘油酯的乙酸酯、硬脂酸聚氧乙烯酯、或溶血卵磷 脂。特别是，制备生面团可不加乳化剂。
生面团产品可为任何经处理的生面团产品，包括煎、炸、烤、烘 培、蒸和煮过的生面团，诸如馒头和年糕。在一个实施方案中，食物产 品是烘培产品。典型的烘培(烤过)产品包括面包诸如大面包、面包 卷、小圆面包、百吉饼，披萨底等糕饼、椒盐脆饼、玉米粉圆饼、蛋 糕、饼干、曲奇、薄脆饼干等。
任选地，另外的酶可与抗老化淀粉酶和磷脂酶一起使用。另外的酶 可为第二淀粉酶，诸如淀粉葡糖苷酶、β-淀粉酶、环糊精葡糖基转移 酶，或另外的酶可为肽酶，尤其是外肽酶、转谷氨酰胺酶、脂肪酶、纤 维素酶、木聚糖酶、蛋白酶、蛋白二硫键异构酶，例如，在WO 95/00636中公开的蛋白二硫键异构酶，例如，糖基转移酶、分支酶 (1,4-α-葡聚糖分支酶)、4-α-葡聚糖转移酶(糊精糖基转移酶)或氧 化还原酶，例如，过氧化物酶、漆酶、葡萄糖氧化酶、阿马多里酶、金 属蛋白酶、吡喃糖氧化酶、脂肪氧化酶、L-氨基酸氧化酶或碳水化合物 氧化酶。另外的酶可为任何来源的，包括哺乳动物的和植物的，以及尤 其是微生物(细菌、酵母或真菌)来源的，并且可通过本领域常规使用 的技术获得。
木聚糖酶通常是微生物来源的，例如，来源于细菌或真菌，诸如曲 霉菌株。木聚糖酶包括例如和NOVOZYM其为可 商购获得的由里氏木霉制备的木聚糖酶制剂。淀粉葡糖苷酶可为黑曲霉 淀粉葡糖苷酶(诸如)。其它可用的淀粉酶产品包括A 1000或A 5000(Grindsted Products，Denmark)和 AMYLASE HTM或AMYLASE PTM(DSM)。葡萄糖氧化酶可为真菌葡 萄糖氧化酶，特别是黑曲霉葡萄糖氧化酶(诸如)。示例 性的蛋白酶是
所述处理可用于由生面团制备的任何种类的烘培产品，柔软的或松 脆的，白色、浅色或深色类型。示例为面包，尤其是白色、全麦粉或全 黑麦面包，通常为大面包或面包卷形式，诸如但不限于法国法棍型面 包、皮塔饼、玉米粉圆饼、蛋糕、薄烤饼、饼干、曲奇、馅饼皮、脆面 包、馒头、披萨等。
淀粉酶可用于预混物，其包含面粉连同抗老化淀粉酶、磷脂酶和/ 或磷脂。预混物可包含其它生面团改良和/或面包改良添加剂，例如包 括以上提到的酶的添加剂中的任一种。淀粉酶可为用作烘培添加剂的酶 制剂(其包含抗老化淀粉酶和磷脂酶)的组分。
酶制剂任选地为颗粒或凝聚的粉末形式。该制剂可具有窄粒度分 布，超过95％(按重量计)的颗粒在25μm至500μm的范围内。颗粒 和凝聚的粉末可通过常规方法制备，例如，通过将淀粉酶喷涂在流化床 制粒机的载体上。载体可由具有合适粒度的粒状芯组成。载体可为可溶 性的或不溶性的，例如，盐(诸如氯化钠或硫酸钠)、糖类(诸如蔗糖 或乳糖)、糖醇(诸如山梨醇)、淀粉、稻、玉米糁、或大豆。
包膜颗粒，即α-淀粉酶颗粒，可包含淀粉酶。为制备包膜α-淀粉 酶颗粒，将酶与食品级脂质接触，所述脂质的量足以悬浮所有α-淀粉 酶颗粒。如本文所用，食品级脂质可为任何天然的有机化合物，其不溶 于水但可溶于非极性有机溶剂诸如烃或乙醚。合适的食品级脂质包括但 不限于脂肪或油形式(饱和或不饱和)的三甘油酯。构成饱和三甘油酯 的脂肪酸以及它们的组合的示例包括但不限于丁酸(来源于牛奶脂 肪)，棕榈酸(来源于动物和植物脂肪)、和/或硬脂酸(来源于动物 和植物脂肪)。构成不饱和三甘油酯的脂肪酸以及它们的组合的示例包 括但不限于棕榈油酸(来源于动物和植物脂肪)、油酸(来源于动物和 植物脂肪)、亚油酸(来源于植物油)、和/或亚麻酸(来源于亚麻籽 油)。其它合适的食品级脂质包括但不限于来源于以上讨论的三甘油酯 的单甘油酯和二甘油酯、磷脂和糖脂。
将食品级脂质(特别是液体形式的)与粉末形式的α-淀粉酶颗粒 接触，其接触方式使得脂质材料覆盖了至少大多数(例如100％)的α- 淀粉酶颗粒的表面的至少一部分。因此，每个α-淀粉酶颗粒单独包膜 在脂质中。例如，所有或基本上所有的α-淀粉酶颗粒具有一个薄的， 连续的，包被的脂质膜。这是能够通过以下方式实现的：首先将一定量 的脂质倾倒到容器中，然后制成α-淀粉酶颗粒浆液使得脂质完全润湿 每个α-淀粉酶颗粒的表面。在短时间段的搅拌后，将其表面上携带大 量脂质的包膜α-淀粉酶颗粒回收。可通过选择所用的脂质类型来控制 施加至α-淀粉酶颗粒的涂层厚度，并且在需要的时候通过重复这种操 作以构建更厚的膜。
可通过封装混合物的方式实现加载递送载体的存储、处理和结合。 所述封装混合物可包含包膜α-淀粉酶。然而，根据制造商或面包师的 需要封装混合物还可包含另外的成分。在将包膜α-淀粉酶结合到生面 团中后，面包师继续该产品的正常制备过程。
包膜α-淀粉酶颗粒的优点是双重的。第一，对于那些热不稳定的 酶，所述食品级脂质在烘培加工过程中保护酶免于热变性。结果是，尽 管在发酵和烘培阶段期间α-淀粉酶被稳定和得到保护，但是在最终烘 培好的食品产品中它从保护性涂层释放出来，在那里水解聚葡萄糖中的 糖苷键。加载递送载体还将活性酶缓释到烘培食品中。即，在烘培过程 后，活性α-淀粉酶从保护性涂层持续释放，其速率反作用于老化机制 的速率并因此降低了老化机制的速率。
一般来讲，根据脂类的性质、施用至α-淀粉酶颗粒的方式、待处 理的生面团混合物的组成以及涉及的生面团混合操作的激烈程度，施加 至α-淀粉酶颗粒的脂质的量可以是变化的，从α-淀粉酶总重量的几个 百分点至其重量的许多倍。
将有效量的加载递送载体(即脂质包膜的酶)添加至用于制备烘培 食品的成分以延长所述烘培食品的储存寿命。面包师计算如上所述制备 的包膜α-淀粉酶量，这将是实现期望的抗老化效果所必需的。基于被 包膜的酶的浓度和α-淀粉酶与指定面粉的比例来计算所需的包膜α-淀 粉酶量。已经发现宽泛的浓度范围是有效的，虽然如上所述，在抗老化 方面的明显改善与α-淀粉酶浓度不符合线性关系，但在某些最小水平 之上，α-淀粉酶浓度的大幅增加产生很少的额外改善。在特定烘培制备 中实际使用的α-淀粉酶浓度可比最小必需量高得多，以向面包师提供 一些针对面包师无心测量误差的保险。酶浓度的下限是由面包师希望实 现的最小抗老化效果来确定的。
制备烘培食品的方法可包括：a)制备脂质涂覆的α-淀粉酶颗粒， 其中基本上所有的α-淀粉酶颗粒都是涂覆的；b)混合包含面粉的生面 团；c)在混合完成前添加脂质涂覆的α-淀粉酶至生面团并且在脂质涂 层从α-淀粉酶去除前终止混合；d)醒发生面团；以及e)烘培生面团 以提供烘培好的食品，其中所述α-淀粉酶在混合醒发和烘培阶段期间 是无活性的，在烘培好的食品中是有活性的。
包膜α-淀粉酶可在混合循环期间(例如接近混合循环结束时)添 加至生面团。在混合阶段的一个时间点添加所述包膜α-淀粉酶使包膜 α-淀粉酶充分分布在整个生面团中；然而，在保护性涂层从α-淀粉酶颗 粒脱落前终止混合阶段。根据生面团的类型和体积、以及混合器的动作 和速度，可能需要从1分钟至6分钟或更长的时间以将包膜α-淀粉酶混 合到生面团中，但平均是二至四分钟。因此，若干变量可确定精确的过 程。第一，包膜α-淀粉酶的量应具有足以使包膜α-淀粉酶遍布在整个 生面团混合物中的总体积。如果包膜α-淀粉酶的制剂是高度富集的， 可能需要在将包膜α-淀粉酶添加到生面团之前将另外的油添加到预混 合物中。食谱和生产过程可能需要特定的修改；然而，在将面包生面团 配方中指定的25％的油取出生面团并在接近混合循环结束时用作添加 富集的包膜α-淀粉酶的载体的情况下，一般来讲能实现良好的结果。 在面包或其它烘培食品中，特别是具有低脂肪含量的那些(例如法式面 包)，占干面粉重量约1％的包膜α-淀粉酶混合物足以将包膜α-淀粉酶 与生面团恰当地掺和。合适的百分比范围是宽泛的，并且取决于配方、 成品、各个烘焙师的生产工艺要求。第二，为了与生面团完全混合应将 包膜α-淀粉酶悬浮液添加到混合物中至足够长的时间，但时间不能使 得过度的机械动作将保护性脂质涂层从包膜α-淀粉酶颗粒剥离。
在本发明的一个另外的方面，食品组合物是包含淀粉酶的油、肉 类、猪油的组合物。在上下文中，术语“[油/肉类/猪油]组合物”是指 基于分别由油、肉类或猪油制成的和/或分别包含油、肉类或猪油的任 何组合物。本发明的另一方面涉及制备包含淀粉酶的油或肉类或猪油的 组合物和/或添加剂的方法，该方法包括将本发明的多肽与油/肉类/猪油 组合物和/或添加剂成分混合。
在本发明的另外一个方面，食品组合物是包含淀粉酶及其变体的动 物饲料组合物、动物饲料添加剂和/或宠物食品。本发明还涉及用于制 备此类动物饲料组合物、动物饲料添加剂组合物和/或宠物食品的方 法，该方法包括将淀粉酶及其变体与一种或多种动物饲料成分和/或动 物饲料添加剂成分和/或宠物食品成分混合。此外，本发明涉及淀粉酶 在制备动物饲料组合物和/或动物饲料添加剂组合物和/或宠物食品中的 用途。
术语“动物”包括所有非反刍动物和反刍动物。在一个具体实施方 案中，动物是非反刍动物，诸如马和单胃动物。单胃动物的示例包括但 不限于猪(pig)和猪(swine)，诸如小猪、还在发育的猪、母猪；家 禽，诸如火鸡、鸭、小鸡、肉鸡、layers；鱼类，诸如大麻哈鱼、鲑 鱼、罗非鱼、鲶鱼和鲤鱼；以及甲壳动物诸如小虾和对虾。在另一个实 施方案中，动物是反刍动物，其包括但不限于牛、小牛犊、山羊、绵 羊、长颈鹿、野牛、驼鹿、麋鹿、牦牛、水牛、鹿、骆驼、羊驼、美洲 驼、羚羊、叉角羚(pronghorn)和蓝牛羚。
在本发明的上下文中，术语“宠物食品”旨在理解为家庭动物的食 物，诸如但不限于狗、猫、沙鼠、仓鼠、南美洲栗鼠、奇珍鼠、豚鼠； 禽宠物，诸如金丝雀、长尾小鹦鹉、和鹦鹉；爬行类宠物，诸如乌龟、 蜥蜴和蛇；和水生宠物，诸如热带鱼和青蛙。
术语“动物饲料组合物”、“饲料”和“草料”互换使用，并且可 包含一种或多种选自以下的饲料材料：a)谷类食物，诸如小粒谷物 (例如，小麦、大麦、黑麦、燕麦以及它们的组合)和/或大粒谷物诸 如玉米或高粱；b)来自谷物的副产品，诸如玉米蛋白粉、蒸馏器干酒 糟可溶物(DDGS)(特别是基于玉米的蒸馏器干酒糟可溶物 (cDDGS))、小麦麸、小麦粉头、小麦次粉、米糠、稻壳、燕麦 壳、棕榈仁、和柑橘渣；c)从诸如大豆、向日葵、花生、羽扇豆、豌 豆、蚕豆、棉花、卡诺拉、鱼肉粉、干燥血浆蛋白、肉骨粉、马铃薯蛋 白、乳清粉、椰肉、芝麻来源获得的蛋白；d)从植物和动物来源获得 的油和脂肪；e)矿物质和维生素。
6.纺织物退浆组合物及用途
还设想了使用淀粉酶处理织物(例如，使织物退浆)的组合物和方 法。织物处理方法是本领域所熟知的(参见，例如，美国专利 6,077,316)。例如，可通过包括使织物与在溶液中的淀粉酶接触的方法 改善织物的触感和外观。可在压力下用溶液处理织物。
可在织物的编织过程中或之后、或在退浆阶段中、或在一个或多个 其他的织物加工步骤中施加淀粉酶。在织物的编织过程中，线暴露于相 当大的机械应力。在机械织机上编织前，经纱经常涂有上浆的淀粉或淀 粉衍生物，以增加其拉伸强度，防止断裂。可在编织过程中或之后施加 淀粉酶以去除这些上浆的淀粉或淀粉衍生物。编织后，在进一步加工织 物前可使用淀粉酶以去除上浆涂层，以确保均匀和耐洗的结果。
淀粉酶作为洗涤剂添加剂，例如含水组合物，可单独使用或与其它 退浆化学试剂和/或退浆酶一起使用以退浆织物(包括含棉织物)。在 用于在靛蓝染色牛仔布和服装上产生石磨效果的组合物和方法中也可使 用淀粉酶。对于制造衣服，在整理之后织物可以裁剪和缝制成衣服或服 装。特别是，对牛仔裤的生产，已经开发出不同的酶促整理方法。牛仔 服装的整理通常是由酶促退浆步骤起始的，在此期间服装经受淀粉分解 酶的作用以提供织物柔软性并使棉花在后续酶促整理处理步骤中更易处 理。淀粉酶可用于牛仔服装整理(例如，“生物打磨工艺”)、酶促退 浆、以及向织物提供柔软性和/或整理过程的方法中。
7.清洁组合物
本发明的组合物和方法的一个方面是包括淀粉酶作为组分的清洁组 合物。淀粉酶多肽可用作洗涤剂组合物的组分，组合物例如手洗、衣物 洗涤、餐具洗涤和其它硬质表面清洁中。此类组合物包括高效液体 (heavy duty liquid，HDL)、高效干型(HDD)、和手洗(手动)衣 物洗涤剂组合物(其包括单位剂型衣物洗涤剂组合物)、以及自动餐具 洗涤(ADW)组合物和手洗(手动)餐具洗涤组合物(其包括单位剂 型餐具洗涤剂组合物)。
7.1.概述
优选地，以洗涤剂中常规使用的淀粉酶浓度或接近的浓度将淀粉酶 掺入到洗涤剂中。例如，可以对应于每升洗涤/餐具洗涤液体0.00001至 1mg(以纯酶蛋白计)淀粉酶的量添加淀粉酶多肽。本文提供了示例性 配方，举例说明如下：
淀粉酶多肽可为洗涤剂组合物的组分，作为唯一的酶或与其它酶 (包括其他淀粉分解酶)一起。因此，它可以无尘颗粒、稳定的液体、 或受保护的酶的形式包括在洗涤剂组合物中。可如美国专利4,106,991 和4,661,452中所公开制备无尘颗粒，并且可任选地通过本领域已知的 方法进行涂覆。蜡质涂覆材料的示例是平均摩尔质量为1,000至20,000 的聚(环氧乙烷)的产品(聚乙二醇，PEG)；具有16至50的环氧乙烷 单元的乙氧基化壬基苯酚；乙氧基化脂肪醇，其中醇包含12至20个碳 原子且其中有15至80个环氧乙烷单元；脂肪醇；脂肪酸；单甘油脂肪 酸酯和二甘油脂肪酸酯和三甘油脂肪酸酯。在例如GB 1483591中给出 了适用于通过流化床技术施加的形成薄膜的涂覆材料的示例。根据既定 的方法可通过例如添加多元醇(诸如丙二醇、糖或糖醇、乳酸或硼酸) 来稳定液体酶制剂。其它的酶稳定剂是本领域已知的。可根据在例如 EP 238 216中所公开的方法制备保护的酶。多元醇早已被公认为蛋白质 的稳定剂，以及改善蛋白质的溶解度。
洗涤剂组合物可为任何可用的形式，例如粉末、颗粒、糊剂、条 状、或液体。液体洗涤剂可为含水的，其通常包含至多约70％的水和 0％至约30％的有机溶剂。它也可为仅含约30％水的致密凝胶类型的形 式。
洗涤剂组合物包含一种或多种表面活性剂，其中的每种可为阴离子 型、非离子型、阳离子型、或两性离子型。洗涤剂通常将包含0％至约 50％的阴离子表面活性剂，诸如直链烷基苯磺酸盐(LAS)；α-烯类磺 酸盐(AOS)；烷基硫酸盐(脂肪醇硫酸盐)(AS)；醇乙氧基硫酸 盐(AEOS或AES)；仲烷基磺酸盐(SAS)；α-磺基脂肪酸甲酯；烷 基琥珀酸或烯基琥珀酸；或皂。组合物还可包含0％至约40％的非离子 表面活性剂，诸如醇乙氧基化物(AEO或AE)、羧化醇乙氧基化物、 壬基苯酚乙氧基化物、烷基多苷、烷基二甲基胺氧化物、乙氧基化脂肪 酸单乙醇酰胺，脂肪酸单乙醇酰胺、或聚羟基烷基脂肪酸酰胺(如例如 WO 92/06154中所述)。
洗涤剂组合物可另外包含一种或多种其它酶，诸如任意组合的下列 酶：蛋白酶、另一种淀粉分解酶、角质酶、脂肪酶、纤维素酶、果胶酸 裂合酶、过水解酶、木聚糖酶、过氧化物酶、和/或漆酶。
洗涤剂可包含约1％至约65％的洗涤剂助洗剂或络合剂，诸如沸 石、二磷酸盐、三磷酸盐、膦酸酯、柠檬酸、次氮基三乙酸 (NTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸 (DTMPA)、烷基琥珀酸或烯基琥珀酸、可溶性硅酸盐或层状硅酸盐 (例如来自Hoechst的SKS-6)。洗涤剂也可为未构建的，即基本上不 含洗涤剂助洗剂。酶可用于与酶的稳定性相容的任何组合物中。一般来 讲，酶可通过已知的封装形式来免于受到有害组分的影响，例如，通过 制粒或在水凝胶中隔离。酶，特别是具有或不具有淀粉结合结构域的淀 粉酶，可用于多种组合物中(其包括衣物洗涤和餐具洗涤应用、表面清 洁剂)，以及用于由淀粉或生物质制备乙醇的组合物中。
洗涤剂可包含一种或多种聚合物。示例包括羧甲基纤维素 (CMC)、聚(乙烯吡咯烷酮)(PVP)、聚乙二醇(PEG)、聚(乙烯 醇)(PVA)、聚羧酸酯(诸如聚丙烯酸酯、马来酸-丙烯酸共聚物、和 甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物)。
洗涤剂可包含漂白体系(其可包含H2O2源诸如过硼酸盐或过碳酸 盐)，其可与形成过酸的漂白活性剂(诸如四乙酰乙二胺(TAED)或 壬酰氧苯磺酸(NOBS))混合。另选地，漂白体系可包含过氧酸(例 如，酰胺、二酰亚胺或砜型过氧酸)。漂白体系也可为酶漂白体系，例 如，过水解酶，诸如在国际PCT申请WO 2005/056783中所述的那 些。
可使用常规稳定剂来稳定所述洗涤剂组合物的酶，例如，多元醇， 诸如丙二醇或甘油；糖或糖醇；乳酸；硼酸或硼酸衍生物诸如，例如， 芳族硼酸酯；以及可如例如WO 92/19709和WO 92/19708中所述配制 的组合物。
洗涤剂还可包含其它常规的洗涤剂成分，诸如例如织物调理剂，其 包括粘土、泡沫促进剂、抑泡剂、抗腐蚀剂、垢悬浮剂、抗垢再沉积 剂、染料、杀菌剂、变色抑制剂、荧光增白剂、或香料。
pH(在使用浓度的水性溶液中测量)通常为中性或碱性，例如， pH为约7.0至约11.0。
用于包含本发明的α-淀粉酶的洗涤剂组合物的具体形式描述如 下。为了便于使用，这些组合物中的许多种可以单位剂型提供。在例如 下列专利中描述了单位剂量配方和封装：US20090209445A1、 US20100081598A1，US7001878B2，EP1504994B1，WO2001085888A2，WO2003089562A1， WO2009098659A1，WO2009098660A1，WO2009112992A1，WO2009124160A1， WO2009152031A1，WO2010059483A1，WO2010088112A1，WO2010090915A1， WO2010135238A1，WO2011094687A1，WO2011094690A1，WO2011127102A1， WO2011163428A1，WO2008000567A1，WO2006045391A1，WO2006007911A1， WO2012027404A1，EP1740690B1，WO2012059336A1，US6730646B1，WO2008087426A1， WO2010116139A1，和WO2012104613A1。
7.2.高效液体(HDL)衣物洗涤剂组合物
示例性的HDL衣物洗涤剂组合物包含去污表面活性剂(10％-40％ wt/wt)，去污表面活性剂包括阴离子去污表面活性剂(选自由直链或 支链或无规链的、取代或未取代的烷基硫酸盐、烷基磺酸盐、烷基烷氧 基化硫酸盐、烷基磷酸盐、烷基膦酸盐、烷基羧酸盐、和/或它们的混 合物组成的组)，和任选的非离子表面活性剂(选自由直链或支链或无 规链的、取代或未取代的烷基烷氧基化醇，例如C8-C18烷基乙氧基化 醇和/或C6-C12烷基酚烷氧基化物组成的组)，其中阴离子去污表面活 性剂(具有6.0至9的亲水指数(HIc))与非离子去污表面活性剂的 重量比大于1∶1。合适的去污表面活性剂也包括阳离子去污表面活性剂 (选自由烷基吡啶化合物、烷基季铵化合物、烷基季盐化合物、烷 基三锍化合物、和/或它们的混合物组合的组)；两性离子的和/或兼性 的去污表面活性剂(选自由烷醇胺硫代甜菜碱组成的组)；两性表面活 性剂；半极性非离子型表面活性剂以及它们的混合物。
组合物可任选地包含表面活性增强聚合物，其由两亲性的烷氧基化 油脂清洁聚合物(选自由具有亲水性和疏水性支链的烷氧基化聚合物组 成的组，诸如在0.05重量％-10重量％范围内的烷氧基化聚亚烷基亚 胺)和/或无规接枝聚合物(通常包含亲水性主链，其包含选自下列的 单体：不饱和的C1-C6羧酸、醚、醇、醛、酮、酯、糖单元、烷氧基 单元、马来酸酐、饱和多元醇诸如甘油、以及它们的混合物；以及疏水 侧链，其选自：C4-C25烷基基团、聚丙烯、聚丁烯、饱和C1-C6单羧 酸的乙烯基酯、丙烯酸或甲基丙烯酸的C1-C6烷基酯、以及它们的混 合物)组成。
组合物可包含另外的聚合物诸如去垢性聚合物(包括阴离子封端的 聚酯，例如SRP1，包含选自糖类、二元羧酸、多元醇以及它们的组合 的至少一种单体单元的无规或嵌段结构的聚合物，无规或嵌段结构的基 于对苯二甲酸亚乙酯的聚合物和它们的共聚物，例如Repel-o-tex SF、 SF-2和SRP6、Texcare SRA100、SRA300、SRN100、SRN170、 SRN240、SRN300和SRN325、Marloquest SL)，抗再沉积聚合物 (0.1重量％至10重量％、包括羧酸酯聚合物，诸如包含选自丙烯酸、 马来酸(或马来酸酐)、延胡索酸、衣康酸、乌头酸、中康酸、柠康 酸、亚甲基丙二酸以及它们的任何混合物的至少一种单体的聚合物，乙 烯基吡咯烷酮均聚物，和/或聚乙二醇，分子量在500至100,000Da的 范围内)；纤维素聚合物(包括选自烷基纤维素、烷基烷氧基烷基纤维 素、羧甲基纤维素、烷基羧甲基纤维素，示例包括羧甲基纤维素、甲基 纤维素、甲基羟乙基纤维素、甲基羧甲基纤维素以及它们的混合物)和 聚合物羧酸盐(诸如马来酸/丙烯酸无规共聚物或聚丙烯酸酯均聚 物)。
组合物可还包含饱和或不饱和的脂肪酸，优选地饱和或不饱和的 C12-C24脂肪酸(0重量％至10重量％)；沉积助剂(其示例包括多 糖，优选地为纤维素聚合物，聚二烯丙基二甲基铵卤化物 (DADMAC)，和无规或嵌段结构的DAD MAC与乙烯基吡咯烷酮、 丙烯酰胺、咪唑、咪唑啉卤化物的共聚物以及它们的混合物，阳离子瓜 尔胶，阳离子纤维素诸如阳离子羟乙基纤维素、阳离子淀粉、阳离子聚 丙烯酰胺、以及它们的混合物。
组合物可还包含染料转移抑制剂，其示例包括锰酞菁、过氧化物 酶、聚乙烯吡咯烷酮聚合物、多胺N-氧化物聚合物、N-乙烯基吡咯烷 酮和N-乙烯基咪唑的共聚物、聚乙烯基唑烷酮和聚乙烯基咪唑和/或 它们的混合物；螯合剂，其示例包括乙二胺四乙酸(EDTA)、二乙烯 三胺五亚甲基膦酸(DTPMP)、羟基乙烷二膦酸(HEDP)、乙二胺- N，N'-二琥珀酸(EDDS)、甲基甘氨酸乙酰乙酸(MGDM)、二亚 乙基三胺五乙酸(DTPA)、丙烯二胺四乙酸(PDT A)、2-羟基吡啶- N-氧化物(HPNO)、或甲基甘氨酸乙酰乙酸(MGDA)、谷氨酸N， N-乙酰乙酸(N，N-二羧甲基谷氨酸的四钠盐(GLDA)、次氮基三乙 酸(NTA)、4,5-二羟基间苯二磺酸、柠檬酸以及它们的任何盐、N-羟 乙基乙二胺三乙酸(HEDTA)、三乙四胺六乙酸(TTHA)、N-羟乙 基亚氨基二乙酸(HEIDA)、二羟乙基甘氨酸(DHEG)、乙二胺四 丙酸(EDTP)、以及它们的衍生物。
组合物优选地包含酶(大体约0.01重量％的活性酶至0.03重量％ 的活性酶)，其选自蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、纤维素酶、胆碱氧化 酶、过氧化物酶/氧化酶、果胶酸裂合酶、甘露聚糖酶、角质酶、漆 酶、磷脂酶、溶血磷脂酶、酰基转移酶、过水解酶、芳基酯酶、以及它 们的任何混合物。组合物可包含酶稳定剂(其示例包括多元醇诸如丙二 醇或甘油、糖或糖醇、乳酸、可逆的蛋白酶抑制剂、硼酸或硼酸衍生 物，例如，芳族硼酸酯、或苯基硼酸衍生物诸如4-甲酰基苯基硼 酸)。
组合物任选地包含硅氧烷或基于脂肪酸的抑泡剂；调色染料，钙离 子和镁离子，可视信号成分，消泡剂(0.001重量％至约4.0重 量％)、和/或结构剂/增稠剂(0.01重量％至5重量％，选自二甘油酯 和三甘油酯，乙二醇二硬脂酸酯、微晶纤维素、基于纤维素的材料、微 纤维纤维素、生物聚合物、黄原胶、结冷胶、以及它们的混合物)。
组合物可为任何液体形式，例如液体或凝胶形式、或它们的任何组 合。组合物可为任何单位剂型，例如小袋。
7.3.高效干性/固体(HDD)衣物洗涤剂组合物
示例性的HDD衣物洗涤剂组合物包含去污表面活性剂，其包括阴 离子去污表面活性剂(例如，直链或支链的或无规链的、取代或未取代 的烷基硫酸盐，烷基磺酸盐，烷基烷氧基化硫酸盐，烷基磷酸盐，烷基 膦酸盐，烷基羧酸盐和/或它们的混合物)，非离子去污表面活性剂 (例如，直链或支链的或无规链的、取代或未取代的C8-C18烷基乙氧 基化物，和/或C6-C12烷基酚烷氧基化物)，阳离子去污表面活性剂 (例如，烷基吡啶化合物、烷基季铵化合物、烷基季盐化合物、烷 基三锍化合物、以及它们的混合物)，两性离子的和/或兼性去污表面 活性剂(例如，链烷醇胺磺基甜菜碱)，两性表面活性剂，半极性非离 子表面活性剂，以及它们的混合物；助洗剂，其包括无磷助洗剂(例如 沸石助洗剂，示例包括在0重量％至小于10重量％的范围内的沸石 A，沸石X，沸石P和沸石MAP)，磷酸盐助洗剂(例如在0重量％ 至小于10重量％的范围内的三磷酸钠)，柠檬酸，柠檬酸盐和次氮基 三乙酸，硅酸盐(例如在0重量％至小于10重量％的范围内的硅酸钠 或硅酸钾或偏硅酸钠，或层状硅酸盐(SKS-6))；碳酸盐(例如在0 重量％至小于80重量％的范围内的碳酸钠和/或碳酸氢钠)；以及漂白 剂，其包括光漂白剂(例如磺化酞菁锌，磺化铝酞菁，呫吨染料，以及 它们的混合物)疏水性或亲水性漂白活化剂(例如，十二烷酰基苯酚磺 酸酯，癸酰基苯酚磺酸酯，癸酰基羟苯甲酸酯或它们的盐，3,5,5-三甲 基己酰苯酚磺酸酯，四乙酰乙二胺-TAED，壬酰基苯酚磺酸酯- NOBS，腈季铵化合物，以及它们的混合物)，过氧化氢源(例如无机 过氧化氢合物盐，其示例包括过硼酸、过碳酸、过硫酸、过磷酸、或过 硅酸的单或四水合钠盐)，预制亲水性和/或疏水性过酸(例如，过羧 酸和盐，过碳酸和盐，过亚胺酸和盐，过氧单硫酸和盐，以及它们的混 合物)、和/或漂白催化剂(例如，亚胺漂白增效剂(其示例包括亚胺 阳离子和聚离子)，亚胺两性离子，改性胺，改性胺氧化物，N-磺酰 基亚胺，N-膦酰基亚胺，N-酰基亚胺，噻二唑二氧化物，全氟亚胺， 循环糖酮，以及它们的混合物，和含金属漂白催化剂(例如，铜，铁， 钛，钌，钨，钼，或锰离子连同辅助金属阳离子诸如锌或铝和封存剂 (sequestrate)诸如乙二胺四乙酸，乙二胺四(亚甲基膦酸)，以及它们 的水溶性盐)。
组合物优选地包含酶，例如，蛋白酶，淀粉酶，脂肪酶，纤维素 酶，胆碱氧化酶，过氧化物酶/氧化酶，果胶酸裂合酶，甘露聚糖酶， 角质酶，漆酶，磷脂酶，溶血磷脂酶，酰基转移酶、过水解酶，芳基酯 酶，以及它们的任何混合物。
组合物可任选地包含另外的洗涤剂成分，其包括香料微胶囊，淀粉 包封的香料谐香剂，调色剂，另外的聚合物，包括织物完整性和阳离子 聚合物，染料锁定成分，织物柔软剂，增白剂(例如C.I.荧光增白 剂)，絮凝剂，螯合剂，烷氧基化的多胺，织物沉积助剂和/或环糊 精。
7.4.自动餐具洗涤(ADW)洗涤剂组合物
示例性的ADW洗涤剂组合物包含非离子表面活性剂，其包括按重 量计以0至10％的量存在的乙氧基化的非离子表面活性剂，醇烷氧基 化的表面活性剂，环氧树脂封端的聚(烷氧基化的)醇，或氧化胺表面活 性剂；在5-60％范围内的助洗剂，其包括磷酸盐助洗剂(例如，单磷 酸盐，二磷酸盐，三聚磷酸盐，其它低聚-多磷酸盐，三聚磷酸钠- STPP)和无磷助洗剂(例如，基于氨基酸的化合物，其包括甲基甘氨 酸乙酰乙酸(MGDM)和盐以及它们的衍生物，谷氨酸-N,N-乙酰乙酸 (GLDA)和盐以及它们的衍生物，亚氨基二琥珀酸(IDS)和盐以及 它们的衍生物，羧甲基菊粉和盐以及它们的衍生物，次氮基三乙酸 (NTA)，二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)，B-丙氨酸二乙酸(B- ADA)和它们的盐，聚羧酸的共聚物和均聚物和它们的部分或完全中 和盐，在0.5重量％至50重量％的范围内的单体聚羧酸和羟基羧酸及 其盐；在约0.1重量％至约50重量％的范围内提供尺寸稳定性的磺化/ 羧基化聚合物；在约0.1重量％至约10重量％的范围内的助干剂(例 如，聚酯，尤其是阴离子聚酯，任选地连同另外的具有3至6个官能度 (通常为有利于缩聚的酸、醇或酯官能度)的单体，聚碳酸酯，聚氨酯 和/或聚脲-聚有机硅氧烷化合物或它们的前体化合物，尤其是反应性环 状碳酸酯和脲型)；在约1重量％至约20重量％的范围内的硅酸盐 (其包括硅酸钠或硅酸钾，例如二硅酸钠，偏硅酸钠和结晶层状页硅酸 盐)；无机漂白剂(例如过氧化氢合物盐诸如过硼酸盐，过碳酸盐，过 磷酸盐，过硫酸盐和过硅酸盐)和有机漂白剂(例如，有机过氧酸，包 括二酰基过氧化物和四酰基过氧化物，尤其是双过氧化十二烷基二酸 酸，双过氧化十四烷二酸，和双过氧化十六烷二酸)；漂白活化剂 (即，在约0.1％至约10％的范围内的有机过酸前体)；漂白催化剂 (例如，锰三氮杂环壬烷和相关复合体，Co，Cu，Mn，和Fe二吡啶 胺和相关复合物，和戊胺乙酸钴(III)和相关复合物)；在约0.1重 量％至5重量％的范围内的金属护理剂(例如，苯并三唑，金属盐和复 合物、和/或硅酸盐)；在每克自动餐具洗涤剂组合物约0.01至5.0mg 活性酶范围内的酶(例如，蛋白酶，淀粉酶，脂肪酶，纤维素酶，胆碱 氧化酶，过氧化物酶/氧化酶，果胶酸裂合酶，甘露聚糖酶，角质酶， 漆酶，磷脂酶，溶血磷脂酶，酰基转移酶、过水解酶，芳基酯酶，以及 它们的混合物)；以及酶稳定剂组分(例如，低聚糖，多糖，和无机二 价金属盐)。
7.5.另外的洗涤剂组合物
在下面编号的段落中描述了可添加本发明的淀粉酶的另外的示例性 的洗涤剂配方。
1)具有至少600g/L的堆密度的配制成颗粒的洗涤剂组合物， 其包含约7％至约12％的直链烷基苯磺酸盐(以酸计)；约1％至约 4％的醇乙氧硫酸盐(例如，C12-18醇，1-2环氧乙烷(EO))或烷基 硫酸盐(例如，C16-18)；约5％至约9％的醇乙氧基化物(例如， C14-15醇，7EO)；约14％至约20％的碳酸钠(例如，Na2CO3)； 约2％至约6％的可溶性硅酸盐(例如，Na2O，2SiO2)；约15％至约 22％的沸石(例如，NaA1SiO4)；0％至约6％的硫酸钠(例如， Na2SO4)；约0％至约15％的柠檬酸钠/柠檬酸(例如， C6H5Na3O7/C6H8O7)；约11％至约18％的过硼酸钠(例如， NaBO3H2O)；约2％至约6％的TAED；0％至约2％的羧甲基纤维素 (CMC)；0-3％的聚合物(例如，马来酸/丙烯酸共聚物，PVP， PEG)；0.0001-0.1％蛋白的酶(以纯酶计)；以及0-5％的微量成分 (例如，抑泡剂、香料、光学增白剂、光漂白剂)。
2)具有至少600g/L的堆密度的配制成颗粒的洗涤剂组合物， 其包含约6％至约11％的直链烷基苯磺酸盐(以酸计)；约1％至约 3％的醇乙氧基化物(例如，C12-18醇，1-2EO)或烷基硫酸盐(例 如，C16-18)；约5％至约9％的醇乙氧基化物(例如，C14-15醇，7 EO)；约15％至约21％的碳酸钠(例如，Na2CO3)；约1％至约4％ 的可溶性硅酸盐(例如，Na2O，2SiO2)；约24％至约34％的沸石 (例如，NaA1SiO4)；约4％至约10％的硫酸钠(例如Na2SO4)； 0％至约15％的柠檬酸钠/柠檬酸(例如，C6H5Na3O7/C6H8O7)； 0％至约2％的羧甲基纤维素(CMC)；1-6％的聚合物(例如，马来酸 /丙烯酸共聚物，PVP，PEG)；0.0001-0.1％的酶(以纯酶蛋白计)； 0-5％的微量成分(例如，抑泡剂，香料)。
3)具有至少600g/L的堆密度的配制成颗粒的洗涤剂组合物， 其包含约5％至约9％的直链烷基苯磺酸盐(以酸计)；约7％至约 14％的醇乙氧基化物(例如，C12-15醇，7EO)；约1％至约3％的皂 如脂肪酸(例如，C16-22脂肪酸)；约10％至约17％的碳酸钠(如 Na2CO3)；约3％至约9％的可溶性硅酸盐(例如，Na2O， 2SiO2)；约23％至约33％的沸石(如NaA1SiO4)；0％至约4％的硫 酸钠(例如，Na2SO4)；约8％至约16％的过硼酸钠(例如， NaBO3H2O)；约2％至约8％的TAED；0％至约1％的膦酸盐(例 如，EDTMPA)；0％至约2％的羧甲基纤维素(CMC)；0-3％的聚 合物(例如，马来酸/丙烯酸共聚物，PVP，PEG)；0.0001-0.1％的酶 (以纯酶蛋白计)；0％-5％的微量成分(例如，抑泡剂，香料，光学 增白剂)。
4)具有至少600g/L的堆密度的配制成颗粒的洗涤剂组合物， 其包含约8％至约12％的直链烷基苯磺酸盐(以酸计)；约10％至约 25％的醇乙氧基化物(例如，C12-15醇，7EO)；约14％至约22％的 碳酸钠(如Na2CO3)；约1％至约5％的可溶性硅酸盐(例如， Na2O，2SiO2)；约25％至约35％的沸石(如NaA1SiO4)；0％至约 10％的硫酸钠(例如，Na2SO4)；0％至约2％的羧甲基纤维素 (CMC)；1％-3％的聚合物(例如，马来酸/丙烯酸共聚物，PVP， PEG)；0.0001-0.1％的酶(以纯酶蛋白计)；和0-5％的微量成分(例 如，抑泡剂，香料)。
5)水性液体洗涤剂组合物，其包含约15％至约21％的直链烷 基苯磺酸盐(以酸计)；约12％至约18％的醇乙氧基化物(例如， C12-15醇，7EO或C12-15醇，5EO)；约3％至约13％的皂如脂肪 酸(例如，油酸)；0％至约13％的烯基琥珀酸(C12-14)；约8％至 约18％的乙醇胺；约2％至约8％的柠檬酸；0％至约3％的膦酸盐； 0％至约3％的聚合物(例如，PVP，PEG)；0％至约2％的硼酸盐 (例如，B4O7)；0％至约3％的乙醇；约8％至约14％的丙二醇； 0.0001％-0.1％的酶(以纯酶蛋白计)；和0％-5％的微量成分(例如， 分散剂，抑泡剂，香料，光学增白剂)。
6)水性结构化的液体洗涤剂组合物，其包含约15％至约21％ 的直链烷基苯磺酸盐(以酸计)；3％至9％的醇乙氧基化物(例如， C12-15醇，7EO，或C12-15醇，5EO)；约3％至约10％的皂如脂肪 酸(例如，油酸)；约14％至约22％的沸石(NaA1SiO4)；约9％至 约18％的柠檬酸钾；0％至约2％的硼酸盐(例如，B4O7)；0％至约 2％的羧甲基纤维素(CMC)；0％至约3％的聚合物(例如，PVP， PEG)；0％至约3％的锚定聚合物诸如，例如，甲基丙烯酸月桂酯/丙 烯酸共聚物；摩尔比为25:1，分子量3800)；0％至约5％的甘油； 0.0001-0.1％的酶(以纯酶蛋白计)；和0％-5％的微量成分(例如，分 散剂，抑泡剂，香料，光学增白剂)。
7)具有至少600g/L的堆密度的配制成颗粒的洗涤剂组合物， 其包含约5％至约10％的脂肪醇硫酸酯；约3％至约9％的乙氧基化脂 肪酸单乙醇酰胺；0％-3％的皂如脂肪酸；约5％至约10％的碳酸钠 (例如，Na2CO3)；约1％至约4％的可溶性硅酸盐(例如，Na2O， 2SiO2)；约20％至约40％的沸石(例如，NaA1SiO4)；约2％至约 8％的硫酸钠(例如，Na2SO4)；约12％至约18％的过硼酸钠(例 如，NaBO3H2O)；约2％至约7％的TAED；约1％至约5％的聚合 物(例如，马来酸/丙烯酸共聚物，PEG)；0.0001％-0.1％的酶(以纯 酶蛋白计)；和0％-5％的微量成分(例如，光学增白剂，抑泡剂，香 料)。
8)配制成颗粒的洗涤剂组合物，其包含约8％至约14％的直链 烷基苯磺酸盐(以酸计)；约5％至约11％的乙氧基化脂肪酸单乙醇酰 胺；0％至约3％的皂如脂肪酸；约4％至约10％的碳酸钠(例如， Na2CO3)；约1％至约4％的可溶性硅酸盐(Na2O，2SiO2)；约 30％至约50％的沸石(例如，NaA1SiO4)；约3％至约11％的硫酸钠 (例如，Na2SO4)；约5％至约12％的柠檬酸钠(例如， C6H5Na3O7)；约1％至约5％的聚合物(例如，PVP，马来酸/丙烯酸 共聚物，PEG)；0.0001％-0.1％的酶(以纯酶蛋白计)；和0％-5％的 微量成分(例如，抑泡剂，香料)。
9)配制成颗粒的洗涤剂组合物，其包含约6％至约12％的直链 烷基苯磺酸盐(以酸计)；约1％至约4％的非离子表面活性剂；约 2％至约6％的皂如脂肪酸；约14％至约22％的碳酸钠(例如， Na2CO3)；约18％至约32％的沸石(例如，NaA1SiO4)；约5％至 约20％的硫酸钠(例如，Na2SO4)；约3％至约8％的柠檬酸钠(例 如，C6H5Na3O7)；约4％至约9％的过硼酸钠(例如， NaBO3H2O)；约1％至约5％的漂白活化剂(例如，NOBS或 TAED)；0％至约2％的羧甲基纤维素(CMC)；约1％至约5％的聚 合物(例如，聚羧酸或PEG)；0.0001％-0.1％的酶(以纯酶蛋白 计)；和0％-5％的微量成分(例如，光学增白剂，香料)。
10)水性液体洗涤剂组合物，其包含约15％至约23％的直链烷 基苯磺酸盐(以酸计)；约8％至约15％的醇乙氧基硫酸盐(例如， C12-15醇，2-3EO)；约3％至约9％的醇乙氧基化物(例如，C12-15 醇，7EO，或C12-15醇，5EO)；0％至约3％的皂如脂肪酸(例如， 月桂酸)；约1％至约5％的乙醇胺；约5％至约10％的柠檬酸钠；约 2％至约6％的水溶助长剂(例如，甲苯磺酸钠)；0％至约2％的硼酸 盐(例如，B4O7)；0％至约1％的羧甲基纤维素；约1％至约3％的乙 醇；约2％至约5％的丙二醇；0.0001％-0.1％的酶(以纯酶蛋白计)； 和0％-5％的微量成分(例如，聚合物，分散剂，香料，光学增白 剂)。
11)水性液体洗涤剂组合物，其包含约20％至约32％的直链烷 基苯磺酸盐(以酸计)；6％-12％的醇乙氧基化物(例如，C12-15醇， 7EO，或C12-15醇，5EO)；约2％至约6％的乙醇胺；约8％至约 14％的柠檬酸；约1％至约3％的硼酸盐(例如，B4O7)；0％至约3％ 的聚合物(例如，马来酸/丙烯酸共聚物，锚定聚合物诸如，例如，甲 基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物)；约3％至约8％的甘油；0.0001％- 0.1％的酶(以纯酶蛋白计)；和0％-5％的微量成分(例如，水溶助长 剂，分散剂，香料，光学增白剂)。
12)具有至少600g/L的堆密度的配制成颗粒的洗涤剂组合物， 其包含约25％至约40％的阴离子表面活性剂(直链烷基苯磺酸盐，烷 基硫酸盐，α-烯属磺酸酯，α-磺基脂肪酸甲酯，烷基磺酸盐，皂)；约 1％至约10％的非离子表面活性剂(例如，醇乙氧基化物)；约8％至 约25％的碳酸钠(例如，Na2CO3)；约5％至约15％的可溶性硅酸盐 (例如，Na2O，2SiO2)；0％至约5％的硫酸钠(例如，Na2SO4)； 约15％至约28％的沸石(NaA1SiO4)；0％至约20％的过硼酸钠(例 如，NaBO3.4H2O)；约0％至约5％的漂白活化剂(TAED或 NOBS)；0.0001-0.1％的酶(以纯酶蛋白计)；0-3％的微量成分(例 如，香料，光学增白剂)。
13)如上文组合物1)-12)中所述的洗涤剂组合物，其中所有或 部分的直链烷基苯磺酸盐被(C12-C18)烷基硫酸盐替换。
14)具有至少600g/L的堆密度的配制成颗粒的洗涤剂组合物， 其包含约9％至约15％的(C12-C18)烷基硫酸盐；约3％至约6％的 醇乙氧基化物；约1％至约5％的多羟基烷基脂肪酸酰胺；约10％至约 20％的沸石(例如，NaA1SiO4)；约10％至约20％的层状二硅酸盐 (例如，来自Hoechst的SK56)；约3％至约12％的碳酸钠(例如， Na2CO3)；0％至约6％的可溶性硅酸盐(例如，Na2O，2SiO2)；约 4％至约8％的柠檬酸钠；约13％至约22％的过碳酸钠；约3％至约 8％的TAED；0％至约5％的聚合物(例如，聚羧酸和PVP)； 0.0001％-0.1％的酶(以纯酶蛋白计)；和0％-5％的微量成分(例如， 光学增白剂，光漂白剂，香料，抑泡剂)。
15)具有至少600g/L的堆密度的配制成颗粒的洗涤剂组合物， 其包含约4％至约8％的(C12-C18)烷基硫酸盐；约11％至约15％的 醇乙氧基化物；约1％至约4％的皂；约35％至约45％的沸石MAP或 沸石A；约2％至约8％的碳酸钠(如Na2CO3)；0％至约4％的可溶 性硅酸盐(例如，Na2O，2SiO2)；约13％至约22％的过碳酸钠； 1％-8％的TAED；0％至约3％的羧甲基纤维素(CMC)；0％至约 3％的聚合物(例如，聚羧酸和PVP)；0.0001％-0.1％的酶(以纯酶蛋 白计)；和0％-3％的微量成分(例如，光学增白剂，膦酸盐，香 料)。
16)如上文1)-15)中所述的洗涤剂制剂，其包含稳定的或胶囊 包封的过酸作为一种其他组分，或作为已指定的漂白系统的替代品。
17)如上文1)，3)，7)，9)，和12)中所述的洗涤剂组合 物，其中过硼酸盐被过碳酸盐替换。
18)如上文1)，3)，7)，9)，12)，14)，和15)中所述 的洗涤剂组合物，其另外包含锰催化剂。所述锰催化剂例如是 "Efficient manganese catalysts for low-temperature bleaching"Nature 369：637-639(1994)中所述的化合物中的一种。
19)配制成非水性洗涤剂液体的洗涤剂组合物，其包含液体非离 子表面活性剂诸如，例如，直链烷氧基伯醇，助洗剂系统(例如，磷酸 盐)，酶，和碱。所述洗涤剂还可包含阴离子表面活性剂和/或漂白剂 系统。
如上，可以洗涤剂中常规采用的浓度掺入本发明的淀粉酶多肽。目 前预期在所述洗涤剂组合物中可按照每升洗涤液体对应于0.00001- 1.0mg(以纯酶蛋白计)淀粉酶多肽的量添加酶。
所述洗涤剂组合物也可包含其它常规的洗涤剂成分，例如，抗絮凝 剂材料，填充材料，泡沫抑制剂，抗腐蚀剂，垢悬浮剂，多价螯合剂， 抗污垢再沉积剂，脱水剂，染料，杀菌剂，荧光增白剂，增稠剂，和香 料。
所述洗涤剂组合物可配制为手洗(手动)或机洗(自动)衣物洗涤 剂组合物，包括适用于污渍织物的前处理衣物洗涤添加剂组合物和漂洗 附加织物柔软剂组合物，或配制用于一般家用硬表面清洗操作的洗涤剂 组合物，或针对手动或自动餐具洗涤操作配制。
本文所述清洁组合物中的任一种可包含任何数量的另外的酶。一般 来讲，所述酶应与所选择的洗涤剂兼容(例如，相对于最佳pH，与其 它酶或非酶成分等的兼容性)，并且所述酶应以有效量存在。提供下列 酶作为示例。
蛋白酶：合适的蛋白酶包括来源于动物、植物或微生物的那些。包 括化学修饰的或蛋白工程化的突变体，以及天然加工的蛋白质。所述蛋 白酶可为丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶，碱性微生物蛋白酶，胰蛋白酶样 蛋白酶、或胰凝乳蛋白酶样蛋白酶。碱性蛋白酶的示例是枯草杆菌蛋白 酶，尤其是来源于芽孢杆菌(Bacillus)的那些，例如，枯草杆菌蛋白 酶Novo，枯草杆菌蛋白酶Carlsberg，枯草杆菌蛋白酶309，枯草杆菌 蛋白酶147，和枯草杆菌蛋白酶168(参见，例如，WO 89/06279)。 另外的示例包括在美国专利RE 34,606、5,955,340、5,700,676、 6,312,936、和6,482,628中所述的那些突变蛋白酶，这些专利均据此以 引用方式并入本文。胰蛋白酶样蛋白酶的示例是胰蛋白酶(例如，来源 于猪的或牛的)，和镰孢(Fusarium)蛋白酶(参见，例如，WO 89/06270和WO 94/25583)。可用的蛋白酶的示例也包括但不限于在 WO 92/19729、WO 98/20115、WO 98/20116、和WO 98/34946中所述 的变体。可商购获得的蛋白酶包括但不限于： PrimaseTM、DuralaseTM、BLAZETM、 和(Novo Nordisk A/S和Novozymes A/S)、MaxacalTM、MaxapemTM、 Purafect OxPTM、Purafect PrimeTM、FNATM、FN2TM、 FN3TM、PURAMAXTM、 EXCELLASETM、和PURAFASTTM(Danisco US Inc./DuPont Industrial Biosciences,Palo Alto,California,USA)、BLAPTM和BLAPTM变体 (Henkel Kommanditgesellschaft auf Aktien,Duesseldorf, Germany)、和KAP(嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)枯草杆菌蛋白 酶；Kao Corp.，Tokyo，Japan)。另一个示例性的蛋白酶NprE来自 解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquifaciens)，ASP来自纤维单胞菌属 (Cellulomonas sp.)菌株69B4(Danisco US Inc./DuPont Industrial Biosciences，Palo Alto，California，USA)。在WO95/23221、WO 92/21760、WO 09/149200、WO 09/149144、WO 09/149145、WO 11/072099、WO 10/056640、WO 10/056653、WO 11/140364、WO 12/151534、美国专利公布2008/0090747和美国专利5,801,039， 5,340,735，5,500,364，5,855,625，US RE 34,606，5,955,340， 5,700,676，6,312,936，和6,482,628以及各种其它专利中描述了各种蛋 白酶。在一些另外的实施方案中，金属蛋白酶应用于本发明，包括但不 限于WO 07/044993中所述的中性金属蛋白酶。合适的蛋白酶包括天然 存在的蛋白酶或工程化的变体(经特别选择或工程化以在相对低温下发 挥作用)。
脂肪酶：合适的脂肪酶包括来源于细菌或真菌的那些。包括化学修 饰的、蛋白质分解修饰的、或蛋白质工程化的突变体。可用的脂肪酶示 例包括但不限于来自腐质霉(Humicola)(嗜热丝孢菌 (Thermomyces)同义)的脂肪酶，例如，来自疏绵状毛腐质霉(H. lanuginosa)(疏绵状嗜热丝孢菌(T.lanuginosus))(参见例如，EP 258068和EP 305216)，来自孤独腐质霉(H.insolens)(参见例如， WO 96/13580)；假单胞菌(Pseudomonas)脂肪酶(例如，来自产碱 假单胞菌(P.alcaligenes)或类产碱假单胞菌(P. pseudoalcaligenes)；参见，例如，EP 218 272)，洋葱假单胞菌(P. cepacia)(参见例如，EP 331 376)，施氏假单胞菌(P.stutzeri)(参 见例如，GB 1,372,034)，荧光假单胞菌(P.fluorescens)，假单胞菌 属(Pseudomonas sp.)菌株SD 705(参见例如，WO 95/06720和WO 96/27002)，威斯康辛假单胞菌(P.wisconsinensis)(参见例如，WO 96/12012)；芽孢杆菌(Bacillus)脂肪酶(例如，来自枯草芽孢杆 菌；参见例如，Dartois等人Biochemica et Biophysica Acta，1131： 253-360(1993))，嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)(参 见例如，JP 64/744992)、或短小芽孢杆菌(B.pumilus)(参见例 如，WO 91/16422)。设想的用于制剂中的另外的脂肪酶变体包括在例 如：WO 92/05249、WO 94/01541、WO 95/35381、WO 96/00292、WO 95/30744、WO 94/25578、WO 95/14783、WO 95/22615、WO 97/04079、WO 97/07202、EP 407225、和EP 260105中所述的那些。一 些可商购获得的脂肪酶包括和Lipolase UltraTM(Novo Nordisk A/S和Novozymes A/S)。
聚酯酶：组合物中可包含合适的聚酯酶，诸如在例如WO 01/34899，WO 01/14629，和US6933140中所述的那些。
淀粉酶：本发明的组合物可与其它淀粉酶混合，包括其它α-淀粉 酶。在不同的α-淀粉酶表现出不同的性能特征并且多个不同的α-淀粉 酶的组合导致组合物中提供不同的α-淀粉酶的有益效果的情况下，此 类组合是尤其可取的。其它淀粉酶包括可商购获得的淀粉酶，诸如但不 限于 和BANTM(Novo Nordisk A/S和Novozymes A/S)；和PREFERENZTM(来 自DuPont Industrial Biosciences.)。
纤维素酶：可向组合物中添加纤维素酶。合适的纤维素酶包括来源 于细菌或真菌的那些。包括化学修饰的或蛋白质工程化的突变体。合适 的纤维素酶包括来自芽孢杆菌(Bacillus)、假单胞菌 (Pseudomonas)、腐质霉菌(Humicola)、镰孢菌(Fusarium)、梭 菌(Thielavia)、枝顶孢霉(Acremonium)的纤维素酶，例如，在美 国专利4,435,307；5,648,263；5,691,178；5,776,757；和WO 89/09259 中公开的例如产自孤独腐质霉(Humicola.insolens)、嗜热毁丝菌 (Myceliophthora thermophila)和尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum) 的真菌纤维素酶。设想的使用的示例性的纤维素酶是对于纺织物具有颜 色护理有益效果的那些。此类纤维素酶的示例是在例如EP 0495257， EP 0531372，WO 96/11262，WO 96/29397，和WO 98/08940中所述的 纤维素酶。其它示例是纤维素酶变体，诸如在WO 94/07998；WO 98/12307；WO 95/24471；PCT/DK98/00299；EP 531315；美国专利 5,457,046；5,686,593；和5,763,254中所述的那些。可商购获得的纤维 素酶包括和(Novo Nordisk A/S和 Novozymes A/S)；和PURADAX(DuPont Industrial Biosciences)；以及KAC-500(B)TM(Kao Corporation)。
过氧化物酶/氧化酶：设想在组合物中使用的合适的过氧化物酶/氧 化酶包括来源于植物、细菌或真菌的那些。包括化学修饰的或蛋白质工 程化的突变体。可用的过氧化物酶的示例包括如WO 93/24618，WO 95/10602，和WO 98/15257中所述的那些来自鬼伞(Coprinus)(例如 来自灰盖鬼伞(C.cinereus))的过氧化物酶以及它们的变体。可商购 获得的过氧化物酶包括例如GUARDZYMETM(Novo Nordisk A/S和 Novozymes A/S)。
所述洗涤剂组合物可还包含2,6-β-D-果聚糖水解酶，其可有效地用 于去除/清洁家庭和/或工业纺织物/衣物上存在的生物膜。
可通过添加含有一种或多种酶的单独的添加剂，或通过添加包括所 有这些酶的混合添加剂，可使洗涤剂组合物中包含洗涤剂酶。洗涤剂添 加剂，即单独的添加剂或混合添加剂，可配制成例如颗粒、液体、浆液 等。示例性的洗涤剂添加剂制剂包括但不限于颗粒(尤其是无尘颗 粒)，液体(尤其是稳定的液体)或浆液。
例如可如美国专利4,106,991和4,661,452中所公开制备无尘颗粒， 并且可任选地通过本领域已知的方法进行涂覆。蜡质涂覆材料的示例是 具有平均摩尔质量1,000至20,000的聚(环氧乙烷)产品(聚乙二醇， PEG)；具有16至50个环氧乙烷单元的乙氧基化的壬基苯酚；乙氧基 化的脂肪醇，其中醇包含12至20个碳原子并且其中具有15至80个环 氧乙烷单元；脂肪醇；脂肪酸；脂肪酸的单甘油酯和甘油二酯和甘油三 酯。在例如GB 1483591中给出了适用于通过流化床技术施加的膜形成 涂覆材料的示例。根据既定的方法可通过例如添加多元醇(诸如丙二 醇、糖或糖醇、乳酸或硼酸)来稳定液体酶制剂。可按照EP 238,216 中所公开的方法制备保护的酶。
所述洗涤剂组合物可为任何便利的形式，例如，条状、片剂、粉 末、颗粒、糊剂或液体。液体洗涤剂可为水性的，通常包含至多约 70％的水，和0％至约30％的有机溶剂。还可以想到包含约30％或更 少水分的致密洗涤剂凝胶。所述洗涤剂组合物可任选地包含一种或多种 表面活性剂，其可为非离子的，包括半极性的和/或阴离子的和/或阳离 子的和/或两性离子的。所述表面活性剂可存在于约0.1重量％至约60 重量％的宽泛范围内。
当包含在其中时，洗涤剂通常将包含约1％至约40％的阴离子表面 活性剂，诸如直链烷基苯磺酸盐，α-烯属磺酸酯，烷基硫酸盐(脂肪醇 硫酸盐)，醇乙氧基化物，仲烷磺酸盐，α-磺基脂肪酸甲酯，烷基琥珀 酸或烯基琥珀酸、或皂。
当包含在其中时，所述洗涤剂通常将包含约0.2％至约40％的非离 子表面活性剂，诸如醇乙氧基化物，壬基苯酚乙氧基化物，烷基多糖 苷，烷基二甲胺氧化物，乙氧基化脂肪酸单乙醇胺，脂肪酸单乙醇胺， 多羟基烷基脂肪酸酰胺，或葡糖胺(“葡糖酰胺”)的N-酰基-N-烷基 衍生物。
所述洗涤剂可包含0％至约65％的洗涤剂助洗剂或络合剂，诸如沸 石，二磷酸，三磷酸，膦酸盐，碳酸盐，柠檬酸，次氮基三乙酸，乙二 胺四乙酸(EDTA)，二亚乙基三胺五乙酸，烷基或烯基琥珀酸，可溶 性硅酸盐或层状硅酸盐(例如，来自Hoechst的SKS-6)。
所述洗涤剂可包含一种或多种聚合物。示例性的聚合物包括羧甲基 纤维素(CMC)，聚(乙烯吡咯烷酮)(PVP)，聚(乙二醇)(PEG)， 聚(乙烯醇)(PVA)，聚(乙烯吡啶-N-氧化物)，聚(乙烯咪唑)，聚羧酸 例如聚丙烯酸酯，马来酸-丙烯酸共聚物)，和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯 酸共聚物。
可使用常规稳定剂来稳定洗涤剂组合物的酶，例如，多元醇(例 如，丙二醇或甘油)，糖或糖醇，乳酸，硼酸或硼酸衍生物(例如，芳 族硼酸酯)、或苯基硼酸衍生物(例如，4-甲酰基苯基硼酸)。可如 WO 92/19709和WO 92/19708中所述配制所述组合物。
预期在所述洗涤剂组合物中，尤其是酶变体，可按照每升洗涤液体 约0.01至约100mg的酶蛋白的量添加(例如，每升洗涤液体约0.05至 约5.0mg的酶蛋白或每升洗涤液体0.1至约1.0mg的酶蛋白)。
在WO2013063460中描述了多个示例性的洗涤剂制剂，其中可添 加本发明的淀粉酶(或在一些情况下鉴定为一种组分)。这些包括可商 购获得的单位剂量洗涤剂制剂/包装件，诸如UltraPacks (Henkel)，Quantum(Reckitt Benckiser)，CLOROXTM 2 Packs(Clorox)，OxiClean Max Force Power Paks(Church& Dwight)，Stain Release，ActionPacs，和 PodsTM(Procter&Gamble)，PS。
7.6.评估洗涤剂组合物中淀粉酶活性的方法
多种α-淀粉酶清洁测定法是本领域已知的，包括样本和微样本测 定。所附的实施例仅描述了几个此类测定法。
为了进一步说明所述组合物和方法以及它们的优点，下面给出的具 体实施例应理解为是例示性的，而不是限制性的。
8.酿造组合物
本发明的淀粉酶变体可为在酿造过程(即制备麦芽发酵饮料)中使 用的酿造组合物的组分。非发酵碳水化合物形成了最终的啤酒中不溶固 体的大多数。这些残余物的存在是由于麦芽淀粉酶不能水解淀粉的α- 1,6-键。对于每12盎司啤酒，非发酵碳水化合物贡献了约50卡路里。 淀粉酶，与葡糖淀粉酶和任选地支链淀粉酶和/或异淀粉酶结合，帮助 将淀粉转化为糊精和可发酵糖，降低了最终的啤酒中残留的非发酵碳水 化合物。
制备这些饮料所用的主要原材料是水、啤酒花和麦芽。此外，助剂 诸如常见的玉米糁、精制玉米糁、研磨过的啤酒酵母、稻、高粱、精制 玉米淀粉、大麦、大麦淀粉、脱壳大麦、小麦、小麦淀粉、烘烤过的谷 物、谷类食物薄片、黑麦、燕麦、马铃薯、木薯淀粉和糖浆，诸如玉米 糖浆、甘蔗糖浆、转化糖糖浆、大麦和/或小麦糖浆等可用作淀粉源。
由于多种原因，主要由所选择的大麦品种制得麦芽对啤酒的整体特 性和质量有最大的影响。第一，麦芽是啤酒中的主要调味剂。第二，麦 芽提供了可发酵糖的绝大部分。第三，麦芽提供了蛋白质，其贡献了啤 酒的主体和泡沫特性。第四，在糖化过程中麦芽提供了必要的酶活性。 啤酒花也显著地有助于啤酒质量，包括口味。具体地，啤酒花(或啤酒 花组分)向啤酒添加了所需的苦味物质。此外，啤酒花充当蛋白质沉淀 剂，已建立的防腐剂并且有助于泡沫形成和稳定性。
谷物，诸如大麦、燕麦、小麦以及植物组分(诸如玉米，啤酒花， 和稻)也用于酿造，工业和家庭酿造两者。用于酿造的组分可为未发芽 或可为发芽的，即部分萌发的，其导致酶(包括α-淀粉酶)的水平升 高。为了成功酿造，足够水平的α-淀粉酶酶活性是必要以确保适当水 平的糖用于发酵。因此淀粉酶可单独或与其它α-淀粉酶组合添加至用 于酿造的组分。
如本文所用，术语“原料”是指压碎或破碎的谷物和植物组分。例 如，用于啤酒制备的大麦是粗磨或压碎的谷物以产生适用于制备发酵用 的醪液的稠度。如本文所用，术语“原料”包括压碎或粗磨形式的前述 植物和谷物类型中的任一种。本文所述方法可用于测定面粉和原料两者 中的α-淀粉酶活性水平。
用于制备啤酒的工艺是本领域所熟知的。参见，例如，Wolfgang Kunze(2004)“Technology Brewing and Malting,”Research and Teaching Institute of Brewing，Berlin(VLB)，第三版。简而言之， 所述工艺涉及：(a)制备醪液，(b)过滤醪液以制备糖化醪，以及 (c)将糖化醪发酵以获取发酵饮料诸如啤酒。通常，将研磨或压碎的 麦芽与水混合，并在受控的温度下保持一段时间以允许麦芽中存在的酶 将麦芽中存在的淀粉转化为可发酵糖。然后将醪液转移至醪液过滤器， 其中将液体与谷物残余分离。这种甜的液体被称为“糖化醪”，剩下的 谷物残余被称为“酒糟”。醪液通常经受提取，其涉及向醪液添加水以 从酒糟中回收残余的可溶性提取物。然后将糖化醪煮沸以使糖化醪灭菌 并帮助发展颜色、口味和气味。在沸腾过程中的某个时间点添加啤酒 花。冷却糖化醪并转移至发酵罐。
然后使糖化醪在发酵罐中与酵母接触。可冷却发酵罐以停止发酵。 酵母絮凝并被去除。最终，啤酒冷却并储存一段时间，在此期间啤酒澄 清并且其口味发展，并且任何可能损害啤酒外观、口味和储存寿命的材 料沉淀下来。啤酒通常包含约2％至约10％v/v的醇，但可获得更高醇 含量(例如18％v/v)的啤酒。在封装前，将啤酒含二氧化碳并任选地 过滤和巴氏灭菌。
可将所述酿造组合物(包含淀粉酶，其与葡糖淀粉酶和任选地支链 淀粉酶和/或异淀粉酶组合)添加至上述步骤(a)(即在制备醪液的过 程中)的醪液。另选地或除此之外，可将所述酿造组合物添加至上述步 骤(b)(即在过滤醪液的过程中)的醪液。另选地或除此之外，可将 所述酿造组合物添加到上述步骤(c)(即在糖化醪发酵过程中)的糖 化醪中。
可通过上述方法中的一个制备发酵饮料，诸如啤酒。所述发酵饮料 可为啤酒，诸如全麦啤酒、根据“纯净法”(Reinheitsgebot)酿造的 啤酒、爱尔啤酒(ale)、印度淡色爱尔啤酒(IPA)、窖藏啤酒、苦味 啤酒、低麦芽啤酒(Happoshu)(第二啤酒)、第三啤酒、干啤酒、 淡啤酒、轻淡啤酒、低醇啤酒、低热量啤酒、波特啤酒、博克啤酒、烈 性黑啤酒、麦芽酒、无酒精啤酒、无酒精麦芽酒等等，但也包括替代谷 物和麦芽饮料，诸如水果味麦芽饮料(例如柑橘味的)、诸如柠檬味 的、橙味的、酸橙味的和浆果味的麦芽饮料、酒味的麦芽饮料(例如伏 特加味的、朗姆酒味的或龙舌兰酒味的麦芽酒、或咖啡味的麦芽饮料， 诸如咖啡因味的麦芽酒等等。
9.碘阳性淀粉的还原
在用于液化和/或糖化方法中时，淀粉酶变体可还原碘阳性淀粉 (IPS)。IPS的一个来源是来自逃脱了水解的直链淀粉和/或来自老化 淀粉聚合物。由于淀粉分子倾向于互相结合之后结晶度增加，在淀粉糊 或凝胶老化过程中自发产生淀粉老化。由于淀粉分子的逐步缔合成更大 的颗粒，低浓度的溶液变得越来越混浊。发生自发沉淀，并且沉淀的淀 粉似乎回复到原来的冷水不溶性状况。更高浓度的糊剂冷却凝结成凝 胶，由于淀粉分子的缔合增加，老化的凝胶变得稳定牢固。这是因为在 相邻的淀粉分子的羟基基团之间的氢键形成的强烈趋势。参见J.A. Radley编辑，Starch and its Derivatives 194-201(Chapman和Hall， London(1968))。
在糖酒中存在的IPS在对于最终产品质量具有负面影响，并且代表 了下游处理的主要问题。IPS堵塞或减缓了过滤系统，污染了用于纯化 的碳柱。当IPS到达足够高的水平时，它可渗漏穿过碳柱并降低制备效 率。另外，它可导致最终产品储存时变浑浊，这对于最终产品质量是无 法接受的。可通过隔离糖化罐并将内容物回混以降低IPS量。然而除了 其它方面，IPS将在碳柱和过滤系统中积累。期望使用淀粉酶变体通过 降低IPS量以改善总体工艺性能。
本文引用的所有参考文献均全文以引用方式并入本文中用于所有目 的。为了进一步说明所述组合物和方法以及它们的优点，下面给出的具 体实施例应理解为例示性的，而不是限制性的。
实施例
实施例1
测定
为了方便阅读，本文所用的各种测定示出如下。在后面的实施例中 与方法的任何偏差在相关章节中注明。在这些实验中，使用分光光度计 来测量在反应完成后形成的产物的吸光度。
A.Chelex珠处理培养上清液
从培养箱取出包含生长细胞培养物的96孔微孔板(MTPs)，用一 次性的塑性封膜(Nunc目录号236366；Rochester，NY，USA)替换 Enzyscreen盖。通过离心(1118RCF，5分钟)从培养上清液分离细 胞。从每个孔取出150μL上清液并转移至包含如下所述制备的Chelex 珠的滤板(Millipore Multiscreen HTS,Billerica，MA，USA)。将板剧 烈摇动5分钟，并且使用真空多头吸管装置将来自3次平行测定生长板 的上清液采集至单孔深孔微孔板(Axygen，PDW-11-C)中。将包含上 清液的板密封并储存在4℃下。
将200-400目的Chelex-100珠(BioRad，Hercules，CA，USA) 用两倍柱床体积的1M HCl洗涤两次，之后在烧结的玻璃过滤装置上 用5倍柱床体积的超纯水洗涤。用2倍柱床体积的1M KOH洗涤所述 珠，之后用另外的5倍柱床体积的超纯水洗。将过滤后的珠转移至烧 杯，并且用足够的超纯水悬浮以制备能混合的浆液。用HCl将所述浆 液的pH调节至8-8.5。去除液体，用烧结的玻璃过滤器干燥所述珠。 在超纯水中制备珠的浆液(40％w/v)，使用KOH/HCl调节pH至 8.0。通过剧烈混合使浆液保持恒定的稠度。使用气泡式储槽装置 (Bubble Paddle Reservoir，V&P Scientific，San Diego，CA，USA)来 将100μL浆液转移至滤板的所有孔。使用真空多头吸管装置去除液 体。
B.蛋白质纯化
将表达淀粉酶变体的芽孢杆菌(Bacillus)菌株在37℃下，2.5L烧 瓶中的培养基(基于MOPs缓冲液的浓缩半限定培养基，以脲为主要 氮源，葡萄糖为主要碳源，并添加1％的大豆胨用于促进细胞生长)中 培养60-72小时，或在36℃下，在14L的罐中以玉米浸液、大豆粉为 培养基，添加矿物质盐和作为碳源的葡萄糖，采用补料分批发酵工艺培 养100小时。在孵育后，通过离心从所述发酵培养基中分离细胞，通过 超滤来浓缩上清液。添加硫酸铵至最终浓度为0.5M。采用疏水相互作 用层析法，用苯基琼脂糖凝胶(sepharose)柱在AKTA Explorer FPLC system(GE Healthcare)上纯化蛋白质。用带有2mM CaCl2和 0.5M硫酸铵的50mM HEPES(pH 8)平衡柱子，用带有2mM CaCl2 和50％丙二醇的50mM HEPES(pH 8)洗脱蛋白质。在每次HPLC 运行后，合并与感兴趣的峰相关联的液体级分，测量合并级分的吸光度 以估算初始浓度。通过平均化来自三次不同测量的结果来确定浓缩样品 的蛋白质浓度：在280nm处测得的吸光度，酸处理样品相对于已知标 准的SDS-PAGE密度计量学，和通过在HPLC系统上运行蛋白质并在 215nm和280nm处测量吸光度。
C.蛋白质测定分析
使用经chelex珠处理的培养物上清液进行蛋白质测定分析，所述 培养物上清液来自在37℃、以300rpm摇动和80％湿度条件下在96孔 微滴定板(MTPs)上生长超过3天的培养物。高效液相层析法 (HPLC)蛋白质测定方法使用了每孔含有25μL上清液的新的96孔圆 底MTP。上清液用25mM乙酸钠(pH 5.5)稀释4倍，每种稀释样品 取10μL进行分析。采用了配备有Poroshell 300SB-C8(Agilent Technologies Santa Clara，CA，USA)柱的Agilent 1200(Hewlett Packard)HPLC仪。使用25mM乙酸钠(pH 5.5)将样品结合到柱 上，洗脱梯度最高至70％的乙腈。在220nm处测量吸光度，使用 ChemStation软件(Agilent Technologies)进行整合，并且基于纯化的 CspAmy2-v1蛋白的标准曲线测定样品的蛋白质浓度。
D.Ceralphaα-淀粉酶活性测定
使用Ceralpha试剂盒(Megazyme，Wicklow，Ireland)进行 Ceralphaα-淀粉酶活性测定。所述测定涉及将培养上清液与底物混合 物在限定条件下孵育，并且通过添加硼酸盐缓冲液(200mM硼酸 /NaOH缓冲液，pH 10)使反应终止(并发展出颜色)。所述底物是限 定的低聚糖“非还原端封闭的对-硝基苯基麦芽七糖苷”(BPNPG7) 和过量水平的α-葡糖苷酶(其由于所述“封闭基团”的存在对天然底 物不起作用)的混合物。在由内部作用的α-淀粉酶进行的低聚糖水解 中，在混合物中存在的过量的α-葡糖苷酶将对-硝基苯基麦芽低聚糖片 段瞬时、定量水解成葡萄糖和游离的对-硝基苯酚。测量在405nm处的 吸光度，其与所分析样品中的淀粉酶水平直接相关。
该测定法所用设备包括Biomek FX Robot(Beckman Coulter Brea，CA，USA)；SpectraMAX MTP Reader(型号340-Molecular Devices，Sunnyvale，CA，USA)和iEMS培养箱/摇床(Thermo Scientific，Rockford，IL，USA)。所用试剂和溶液为：
1)对-硝基苯基麦芽七糖苷(BPNPG7)底物(Megazyme Ceralpha HR试 剂盒)；
2)50mM苹果酸盐缓冲液，0.005％80，pH 5.6或50mM MOPS，0.005％80，pH 7(稀释缓冲液)；和
3)200mM硼酸/NaOH缓冲液，pH 10(STOP缓冲液)。
将小瓶中包含的54.5mg BPNPG7底物溶解在10mL的MilliQ水 中，然后稀释到30mL的稀释缓冲液中以构成40mL的工作底物 (1.36mg/mL)。用稀释缓冲液将淀粉酶样品(发酵上清液)稀释40 倍。通过将5μL的稀释的淀粉酶溶液添加到MTP孔中、之后添加 55μL的稀释的BPNPG7工作底物溶液来进行测定。将溶液混合并用封 板条密封MTP，在25℃下放置于培养箱/摇床(iEMS-Thermo Scientific)4分钟。通过添加70μL STOP缓冲液终止反应，在MTP- Reader中读取波长400nm处的吸光度。使用无酶对照物以校正背景吸 光度值。
E.热稳定性测定
通过使用Ceralphaα-淀粉酶测定法确定淀粉酶活性来测量 CspAmy2-v1和变体的热稳定性。该测定法所用设备包括Biomek FX Robot(Beckman Coulter)；SpectraMAX MTP Reader(型号340- Molecular Devices)，Tetrad2DNA Engine PCR仪(Biorad)，和 iEMS培养箱/摇床(Thermo Scientific)。所用试剂为(*不是在所有的 测定中)：
1)热应激缓冲液
a)50mM KOAc pH 4.5(5ppm CaCl2，50ppm NaCl)*，
b)50mM KOAc pH 5.0(10ppm CaCl2，10mM NaCl)
c)50mM KOAc pH 5.7(5ppm CaCl2，50ppm NaCl)，
d)50mM KOAc pH 5.7(无盐条件)*，
2)对-硝基苯基麦芽七糖苷(BPNPG7)底物(Megazyme Ceralpha HR试剂盒)：
3)50mM苹果酸盐缓冲液，0.005％80，pH 5.6(稀释缓 冲液)；和
4)200mM硼酸/NaOH，pH 10(STOP缓冲液)。
5)淀粉酶培养上清液：将1:10母板稀释酶平板以1:10稀释在PCR 板的四种热应激缓冲液中的每种中。
将5μL稀释的酶样品添加到包含55μL的稀释的BPNPG7工作底 物溶液的96孔PCR板中，使用如C部分所述的Ceralphaα-淀粉酶测 定法测定样品的初始淀粉酶活性。所述样品在PCR热循环仪中经受热 应激3-6分钟，如下：缓冲液(a)50℃,(b)59°-60℃,(c)65°- 70℃，和(d)65℃。将热应激的样品立即冷却至室温，取5μL等份试 样使用如C部分所述的Ceralphaα-淀粉酶测定法测定淀粉酶活性。对 于每种变体，采用初始和残余淀粉酶活性的比率来如下计算热稳定性： 热稳定性＝[t残余值]/[t初始值]，因此基于热孵育后的酶活性除以热孵育之 前的酶活性来计算热稳定活性比率。针对每种样品(变体)计算性能指 数(PI)。通过将变体酶的热稳定性与经过相似处理的参考酶的热稳定 性的进行比较来确定热稳定性的性能指数。
F.淀粉水解测定(玉米面和玉米淀粉应用测定)
使用玉米面和玉米淀粉的淀粉水解来测量CspAmy2-v1和变体的比 活性。以由玉米面或玉米淀粉的酶促分解生成的还原终产物来测量活 性。使用PAHBAH(对-羟基苯甲酸酰肼)测定法对在每一种底物孵育 过程中产生的还原终产物进行定量。该测定法所用设备包括Biomek FX Robot(Beckman Coulter)；SpectraMAX MTP Reader(型号 340-Molecular Devices)，Tetrad2DNA Engine PCR仪(Biorad)，和 iEMS培养箱/摇床(Thermo Scientific)，和气泡式储槽(Bubble Paddle Reservoir)。
用消费者咖啡研磨机将Azure Farms Organic Corn Flour (Norco，CA)磨成细粉，然后过筛以获得<250微米的级分。通过重 复悬浮和离心，将筛过的玉米面用MilliQ水充分洗涤。通过重复悬浮 和离心，也将Cargill Farms Organic Corn Starch材料用MilliQ水充分 洗涤。
将经玉米面和玉米淀粉洗的级分均悬浮在含0.005％叠氮化钠的 MilliQ水中作为20％(w/w)的储液。用20X原液缓冲液将储液进一 步稀释为10.9％w/v的玉米面和玉米淀粉溶液(最终的缓冲液浓度： 55mM KOAc，pH 5)。
用气泡式储槽将55μL的经稀释的玉米面和玉米淀粉底物连同5μL 的1:10稀释的酶样品添加到PCR微孔板。将板密封并在83℃下放置5 分钟之后斜降至45℃。通过添加70μL的0.1N NaOH终止淀粉水解反 应。将板密封，以1610RCF离心3分钟。通过如下所述的PAHBAH 测定法分析来自两种反应的淀粉水解反应产物。
PAHBAH测定：将0.5N NaOH的80μL等份试样添加到空PCR板 (“PAHBAH反应板”)的每个孔中，之后添加20μL的PAHBAH试 剂(5％w/v对-羟基苯甲酸酰肼(Sigma#H9882，St.Luois，MO)， 溶解在0.5N HCl中)。通过移液器吹吸来混合所述溶液。将20μL的 淀粉水解反应上清液添加到PAHBAH反应板的每个孔中。将板密封并 置于热循环仪中，设定为在95℃下2分钟以显色，然后冷却至20℃。 将显色的PAHBAH反应混合物的80μL样品转移至新板，在分光光度 计中测量450nm处的吸光度。
G.CS-28稻米淀粉微样测定
该淀粉酶测定的原理是由于掺入至棉花微样本中的稻米淀粉的水解 而释放橙色染料。测量洗涤液体在488nm处的吸光度，这涉及在期望 的条件下(pH、温度和缓冲液)所分析的样品中的淀粉酶活性水平。
该测定法所用设备包括Biomek FX Robot(Beckman Coulter)； SpectraMAX MTP Reader(型号340-Molecular Devices)，和iEMS 培养箱/摇床(Thermo Scientific)。所用试剂和溶液为：
1)CS-28微样本(稻米淀粉，着色的)；
2)10mM HEPES，2mM CaCl2，0.005％TWEEN80缓冲液， pH 8.0，电导率1mS/cm；
3)25mM CAPS，2mM CaCl2，0.005％TWEEN80缓冲液， pH 10.0；电导率5mS/cm(用5M NaCl调节)；和
4)10mM NaCl，0.1mM CaCl2，0.005％TWEEN80。
5)50mM MOPS pH7.15，0.1mM CaCl2。
由Center for Testmaterials(CFT，Vlaardingen，The Netherlands)提供了5.5mm圆形直径的CS-28微样本。在96孔 Corning 9017平底聚苯乙烯MTP的每孔中放置两个微样本。将培养上 清液用50mM MOPS pH7.15，0.1mM CaCl2稀释8倍，随后用10mM NaCl，0.1mM CaCl2，0.005％80溶液稀释至大约1ppm的最 终酶浓度。
将培养箱/摇床设定在期望的温度25℃(环境温度)或50℃下。分 别将174μL或177μL的HEPES或CAPS缓冲液添加到包含微样本的 MTP的每个孔中，随后将6μL或3μL的稀释的酶溶液添加到每个孔中 使总体积为180μL/孔。将MTP用封板条密封并置于iEMS培养箱/摇 床中，针对在pH 8，低电导率(1mS/cm)下清洁在25℃下以 1150rpm孵育15分钟，或针对在pH 10，高电导率(5mS/cm)下清洁 在50℃下以1150rpm孵育15分钟。在适当条件下孵育后，从每个孔取 100μL溶液转移至新MTP，使用MTP-分光光度计测量488nm处的吸 光度。包括含有两个微样本和缓冲液但无酶的对照用于减去背景清洁性 能。
通过减去空白(在不存在酶的微样本的孵育之后获得)来校正每个 吸光度值，所得的吸光度提供了水解活性的量度。针对每个样品计算性 能指数(PI)。
针对洗涤性能指数(PI)的计算，朗格缪尔方程(Langmuir equation)被用来拟合基于参考酶对照的数据。使用变体的蛋白质浓度 来计算基于拟合曲线的期望的性能。将观察的性能除以所计算的性能。 然后将这个值除以参考酶的性能。
H.洗涤剂稳定性测定
通过测量在10％洗涤剂混合物(市售购买的Persil Color Gel洗涤 剂，Henkel(Düsseldorf,Germany)，购买于2011年)存在下、在限 定条件下孵育之后参考酶及其变体的活性来测定其稳定性。在使用之前 将所述洗涤剂加热灭活，使用如上面C部分描述的Ceralphaα-淀粉酶 测定法测定初始和残余的淀粉酶活性。
该测定法所用设备包括Biomek FX Robot(Beckman Coulter)； SpectraMAX MTP Reader(型号340-Molecular Devices)， Tetrad2DNA Engine PCR仪(Biorad)，和iEMS培养箱/摇床 (Thermo Scientific)。所用试剂溶液为：
1)对-硝基苯基麦芽七糖苷(BPNPG7)底物(Megazyme Ceralpha HR试剂盒)：
2)液体洗涤剂(Persil color gel，通过在90℃下加热4小时使 酶失活)；
3)50mM MOPS，0.1mM CaCl2，0.005％80缓冲 液，pH 7(稀释缓冲液)；
4)用稀释缓冲液稀释的10％洗涤剂溶液；
5)200mM硼酸/NaOH缓冲液，pH 10(STOP缓冲液)；和
6)用包含0-100μg/mL蛋白的50mM MOPS pH 7.15，0.1mM CaCl2将淀粉酶培养上清液稀释8倍。
将85μL的10％洗涤剂溶液添加到96孔PCR板中，并与15μL的 稀释的培养上清液混合。将来自PCR板的样品用稀释缓冲液稀释3 倍，用5μL的这种稀释液的等分试样来测定初始淀粉酶活性。在 80.5℃下将该PCR板在Tetrad PCR部件中孵育5分钟。在孵育后，用 稀释缓冲液将洗涤剂-酶混合物稀释3倍，并测量残余的活性。通过如 上面C部分描述的Ceralphaα-淀粉酶测定法，使用5μL样本来测定初 始(t初始)和残余的(t残余)淀粉酶活性。
对于每种变体，使用残余淀粉酶活性和初始淀粉酶活性的比率如下 式计算洗涤剂稳定性：洗涤剂稳定性＝[t残余值]/[t初始值]。
针对每个样品(变体)计算性能指数(PI)。通过将变体酶的洗涤 剂稳定性与经过相似处理的参考酶的洗涤剂稳定性的进行比较来确定洗 涤剂稳定性的性能指数。
I.性能指数
性能指数(PI)比较了变体和参考酶在相同蛋白质浓度下的性能或 稳定性。此外，可使用标准酶的朗格缪尔方程的参数计算理论值。大于 1(PI>1)的性能指数(PI)表明与参考酶相比由变体改善的性能，而 1的PI(PI＝1)鉴定出了其表现与参考酶相同的变体，小于1的PI鉴 定出了其表现比参考酶差的变体。
实施例2
表达CspAmy2-v1的芽孢杆菌(Bacillus)菌株的生成
在该实施例中，描述了表达CspAmy2-v1(SEQ ID NO:2)淀粉酶 及其变体的枯草芽孢杆菌菌株的构建。CspAmy2-v1淀粉酶是 CspAmy2(SEQ ID NO:1)淀粉酶的变体，其同时具有R178和G179 缺失(即，ΔRG)。CspAmy2是来源于噬细胞菌属物种(Cytophaga sp.)的淀粉酶，Chii-Ling等人(2002)Appl.Environ.Microbiol. 68:3651-3654描述了其核苷酸序列。Rong-Jen等人(2003)Appl. Environ.Microbiol.69:2383-85描述了CspAmy2-v1具有比CspAmy2增 加的热稳定性。
由GeneArt AG(Regensburg，Germany)制备了编码CspAmy2- v1的合成DNA片段(SEQ ID NO:7)，其作为模板DNA用于构建表 达CspAmy2-v1淀粉酶及其变体的枯草芽孢杆菌菌株。所述DNA片段 包括密码子修饰的编码CspAmy2-v1淀粉酶的成熟形式的核苷酸序列， 该核苷酸序列与编码LAT信号肽的序列(带下划线的)相邻：
ATGAAACAACAAAAACGGCTTTACGCCCGATTGCTGACGCTGTTATTTGCGCTCATCTTCTTGC TGCCTCATTCTGCAGCTAGCGCAGCAGCGACAAACGGAACAATGATGCAGTATTTCGAGTGGTA TGTACCTAACGACGGCCAGCAATGGAACAGACTGAGAACAGATGCCCCTTACTTGTCATCTGTT GGTATTACAGCAGTATGGACACCGCCGGCTTATAAGGGCACGTCTCAAGCAGATGTGGGGTACG GCCCGTACGATCTGTATGATTTAGGCGAGTTTAATCAAAAAGGTACAGTCAGAACGAAGTATGG CACAAAAGGAGAACTTAAATCTGCTGTTAACACGCTGCATTCAAATGGAATCCAAGTGTATGGT GATGTCGTGATGAATCATAAAGCAGGTGCTGATTATACAGAAAACGTAACGGCGGTGGAGGTGA ATCCGTCTAATAGAAATCAGGAAACGAGCGGCGAATATAATATTCAGGCATGGACAGGCTTCAA CTTTCCGGGCAGAGGAACAACGTATTCTAACTTCAAATGGCAGTGGTTCCATTTTGATGGAACG GATTGGGACCAGAGCAGAAGCCTCTCTAGAATCTTCAAATTCACGGGAAAGGCGTGGGACTGGG AGGTTTCTTCAGAAAACGGAAATTATGACTATCTGATGTACGCGGACATTGATTATGACCATCC GGATGTCGTGAATGAAATGAAAAAGTGGGGCGTCTGGTATGCCAACGAAGTTGGGTTAGATGGA TACAGACTTGACGCGGTCAAACATATTAAATTTAGCTTTCTCAAAGACTGGGTGGATAACGCAA GAGCAGCGACGGGAAAAGAAATGTTTACGGTTGGCGAATATTGGCAAAATGATTTAGGGGCCCT GAATAACTACCTGGCAAAGGTAAATTACAACCAATCTCTTTTTGATGCGCCGTTGCATTACAAC TTTTACGCTGCCTCAACAGGGGGTGGATATTACGATATGAGAAATATTCTTAATAACACGTTAG TCGCAAGCAATCCGACAAAGGCTGTTACGTTAGTTGAGAATCATGACACACAGCCTGGACAATC ACTGGAATCAACAGTCCAACCGTGGTTTAAACCGTTAGCCTACGCGTTTATTCTCACGAGAAGC GGAGGCTATCCTTCTGTATTTTATGGAGATATGTACGGTACAAAAGGAACGACAACAAGAGAGA TCCCTGCTCTTAAATCTAAAATCGAACCTTTGCTTAAGGCTAGAAAAGACTATGCTTATGGAAC ACAGAGAGACTATATTGATAACCCGGATGTCATTGGCTGGACGAGAGAAGGGGACTCAACGAAA GCCAAGAGCGGTCTGGCCACAGTGATTACAGATGGGCCGGGCGGTTCAAAAAGAATGTATGTTG GCACGAGCAATGCGGGTGAAATCTGGTATGATTTGACAGGGAATAGAACAGATAAAATCACGAT TGGAAGCGATGGCTATGCAACATTTCCTGTCAATGGGGGCTCAGTTTCAGTATGGGTGCAGCAA
如下以SEQ ID NO：2示出了由pHPLT02-CspAmy2-v1载体制备 的CspAmy2-v1多肽的成熟形式。
AATNGTMMQYFEWYVPNDGQQWNRLRTDAPYLSSVGITAVWTPPAYKGTSQADVGYGPYDLYDL GEFNQKGTVRTKYGTKGELKSAVNTLHSNGIQVYGDVVMNHKAGADYTENVTAVEVNPSNRNQE TSGEYNIQAWTGFNFPGRGTTYSNFKWQWFHFDGTDWDQSRSLSRIFKFTGKAWDWEVSSENGN YDYLMYADIDYDHPDVVNEMKKWGVWYANEVGLDGYRLDAVKHIKFSFLKDWVDNARAATGKEM FTVGEYWQNDLGALNNYLAKVNYNQSLFDAPLHYNFYAASTGGGYYDMRNILNNTLVASNPTKA VTLVENHDTQPGQSLESTVQPWFKPLAYAFILTRSGGYPSVFYGDMYGTKGTTTREIPALKSKI EPLLKARKDYAYGTQRDYIDNPDVIGWTREGDSTKAKSGLATVITDGPGGSKRMYVGTSNAGEI WYDLTGNRTDKITIGSDGYATFPVNGGSVSVWVQQ
为表达CspAmy2-v1，将编码CspAmy2-v1的DNA片段克隆进 pHPLT02载体，一种pHPLT载体的修饰型式(Solingen等人(2001) Extremophiles 5：333-341)，通过GeneArt并使用独特的NheI和 XhoI限制性位点同阅读框融合至AmyL(LAT)信号肽，从而产生质 粒pHPLT02-CspAmy2-v1。所述pHPLT表达载体包含地衣芽孢杆菌 LAT启动子(Plat)和另外的来自pUB110(McKenzie等人(1986) Plasmid，15：93-103)的元件，其包括复制酶基因(reppUB)、新霉 素/卡那霉素抗性基因(neo)和博莱霉素抗性标记(bleo)。使用定点 诱变(Stratagene)将AmyL信号肽的丝氨酸28的核苷酸5′-TCA-3′变 为核苷酸5′-AGC-3′以便导入独特的NheI限制位点。
使用本领域已知的方法(WO 02/14490)用pHPLT02-CspAmy2- v1质粒DNA转化合适的枯草芽孢杆菌菌株。在琼脂平板上选择枯草芽 孢杆菌转化子，所述平板包含心浸液琼脂(Difco，目录号244400， Lawrence，KS，USA和10mg/L硫酸新霉素(Sigma，目录号N- 1876；包含732μg新霉素/mg，St.Louis，Missouri，USA)。携带 pHPLT02-CspAmy2-v1质粒的枯草芽孢杆菌转化子在37℃下，在摇瓶 中的包含5mM CaCl2和10ppm新霉素的MBD培养基(基于MOPs缓 冲液的浓缩半限定培养基，以脲作为主要氮源，葡萄糖作为主要碳源， 补充1％的大豆胨用于促进细胞生长)中选择性生长～65小时。生长导 致分泌的带有淀粉水解活性的CspAmy2-v1淀粉酶的制备。
实施例3
表达CspAmy2组合变体的芽孢杆菌(Bacillus)菌株的生成
在该实施例中描述了表达两种组合CspAmy2变体(CspAmy2-v5 和CspAmy2-v6)的枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌菌株的构建。 CspAmy2-v5是CspAmy2的变体，其带有突变E187P、I203Y、 G476K并缺失R178和G179。CspAmy2-v6是CspAmy2的变体，其带 有突变E187P、I203Y、G476K、R458N、T459S、D460T并缺失R178 和G179。为了表达CspAmy2-v5和CspAmy2-v6，使用标准技术，通 过基因合成和融合PCR的组合创建表达构建体。
如本领域所已知的(WO 2002/014490)，将CspAmy2-v5和 CspAmy2-v6表达构建体连接至载体pICatH(在例如EP2428572和 US7968691中所述)并转化进感受态枯草芽孢杆菌细胞(amyE阴性 的)。在这些克隆中，将编码CspAmy2-v5和CspAmy2-v6的DNA片 段同阅读框融合至编码地衣芽孢杆菌淀粉酶(amyL)信号肽的序列， 其导致所述淀粉酶变体分泌至生长培养基中。在这些克隆中CspAmy2- v5和CspAmy2-v6的表达是由地衣芽孢杆菌淀粉酶(amyL)启动子 (图1A和1B)驱动的。
在琼脂平板上选择枯草芽孢杆菌转化子，所述平板包含心浸液琼脂 (Difco)和10mg/L硫酸新霉素，5mg/L氯霉素和蓝淀粉(starch azure，Sigma)。对于每种构建体，选择一个带有淀粉水解活性的转化 子，通过DNA测序(BaseClear，the Netherlands)对pICatH中的淀 粉酶表达构建体进行测序验证。如EP2428572和US7968691中所述， 将所得的质粒(pICatH-CspAmy2-v5和pICatH-CspAmy2-v6)从枯草 芽孢杆菌克隆分离，并且转化进地衣芽孢杆菌细胞(amyL和catH阴 性)并整合进基因组中。在切除载体序列后，通过使菌株经受逐步增加 至多50μg/ml的氯霉素浓度来扩增表达构建体。所述地衣芽孢杆菌菌株 在蓝淀粉平板上显示晕环，表明活性CspAmy2-v5和CspAmy2-v6淀粉 酶的分泌。
下面示出了CspAmy2-v5的成熟形式的氨基酸序列为SEQ ID NO: 8：
AATNGTMMQYFEWYVPNDGQQWNRLRTDAPYLSSVGITAVWTPPAYKGTSQADVGYGPYDLYDL GEFNQKGTVRTKYGTKGELKSAVNTLHSNGIQVYGDVVMNHKAGADYTENVTAVEVNPSNRNQE TSGEYNIQAWTGFNFPGRGTTYSNFKWQWFHFDGTDWDQSRSLSRIFKFTGKAWDWPVSSENGN YDYLMYADYDYDHPDVVNEMKKWGVWYANEVGLDGYRLDAVKHIKFSFLKDWVDNARAATGKEM FTVGEYWQNDLGALNNYLAKVNYNQSLFDAPLHYNFYAASTGGGYYDMRNILNNTLVASNPTKA VTLVENHDTQPGQSLESTVQPWFKPLAYAFILTRSGGYPSVFYGDMYGTKGTTTREIPALKSKI EPLLKARKDYAYGTQRDYIDNPDVIGWTREGDSTKAKSGLATVITDGPGGSKRMYVGTSNAGEI WYDLTGNRTDKITIGSDGYATFPVNKGSVSVWVQQ
下面示出了CspAmy2-v6的成熟形式的氨基酸序列为SEQ ID NO： 9：
AATNGTMMQYFEWYVPNDGQQWNRLRTDAPYLSSVGITAVWTPPAYKGTSQADVGYGPYDLYDL GEFNQKGTVRTKYGTKGELKSAVNTLHSNGIQVYGDVVMNHKAGADYTENVTAVEVNPSNRNQE TSGEYNIQAWTGFNFPGRGTTYSNFKWQWFHFDGTDWDQSRSLSRIFKFTGKAWDWPVSSENGN YDYLMYADYDYDHPDVVNEMKKWGVWYANEVGLDGYRLDAVKHIKFSFLKDWVDNARAATGKEM FTVGEYWQNDLGALNNYLAKVNYNQSLFDAPLHYNFYAASTGGGYYDMRNILNNTLVASNPTKA VTLVENHDTQPGQSLESTVQPWFKPLAYAFILTRSGGYPSVFYGDMYGTKGTTTREIPALKSKI EPLLKARKDYAYGTQRDYIDNPDVIGWTREGDSTKAKSGLATVITDGPGGSKRMYVGTSNAGEI WYDLTGNNSTKITIGSDGYATFPVNKGSVSVWVQQ
实施例4
CspAmy2组合变体的清洁性能
在微样本清洁测定中分析了经纯化的CspAmy2-v5和CspAmy2-v6 的清洁性能。将在棉布样本上的CFT CS-28稻米淀粉或在棉质印花棉 布上的EMPA 161玉米淀粉(其包含结合至淀粉的指示染料) (Center for Testmaterials，BV，Vlaardingen，Netherlands)打孔以形成 测量直径为5.5mm的圆片。将两个圆片放置在3个平底非结合96孔测 定板的每个孔中。
用稀释缓冲液(50mM MOPS，pH 7.2，0.005％TWEEN)将两种 变体(即，CspAmy2-v5和CspAmy2-v6)，亲本分子(CspAmy2)， 和可商购获得的基准洗涤剂α-淀粉酶即(AmyL；地衣芽 孢杆菌α-淀粉酶；Danisco US Inc.)稀释至0.5mg/mL，然后在微孔板 中进一步稀释至2ppm。将200μL的这些样品转移至每个样本板的第一 排。然后将100μL的HEPES缓冲液(25mM HEPES，pH 8.0，带有 2mM CaCl2和0.005％TWEEN-80)添加到样本板后5排的每个孔中。 然后将100μL稀释的酶样品从第一排转移至第二排，混合均匀，并持 续系列稀释直至最后一排之前，其作为空白。一旦所有排包含100μL 的溶液，在板的每个孔中添加100μL的缓冲液使得最终体积为200μL/ 孔，最终酶浓度为1、0.5、0.25、0.125、0.0625、和0ppm。
将板在25℃下以1150rpm搅拌孵育15分钟。通过将150μL的最 终洗涤液体转移至结合了新培养基的微孔板、用分光光度计在488nm 处对释放到洗涤液体中的颜色量进行定量来评估酶性能。将一式三份的 读数减去空白背景并取平均值。污垢去除测定的结果示于图2中。 CspAmy2-v5和CspAmy2-v6展示出彼此类似的性能，并且显著优于亲 本分子CspAmy2，比好得多。
实施例5
CspAmy2组合变体的热稳定性评估
A.缓冲液中的热稳定性
将0.5mg/mL的经纯化的酶(即，CspAmy2-v5，CspAmy2-v6， CspAmy2)，(地衣芽孢杆菌α-淀粉酶)、和ACE-QK (在US20120045817和WO2010/115028中所述的芽孢杆菌属TS-23α- 淀粉酶的变体)的原液用稀释缓冲液(50mM MOPS，pH 7.2，0.005％ TWEEN)进一步稀释至5ppm。将50μL的每种酶添加到9条PCR管 中的每一管并密封。在实验的整个过程中，将每种酶的一份“未经应激 处理的”样品在室温下孵育。在热循环仪中将其它8个样品在45、 55、65、70、75、80、85、或90℃下孵育15分钟。然后将所述样品一 式三份转移至微孔板，使用Ceralpha试剂(Megazyme，Inc.)针对未 经应激处理的和经应激处理的样品α-淀粉酶活性。通过将热应激后每 种淀粉酶的活性除以未经应激处理的淀粉酶的活性来计算残余活性。结 果示于图3中。相对于所有其它被测试的酶，CspAmy2-v5和 CspAmy2-v6展示出在低钙浓度下增大的热稳定性。
B.在带有添加的钙的缓冲液中的热稳定性
如上，用稀释缓冲液将0.5mg/mL经纯化的酶的原液进一步稀释至 5ppm，在这种情况补充5mM氯化钙(即，50mM MOPS，pH 7.2， 0.005％TWEEN，5mM氯化钙)。如上所述进行实验。结果示于图4 中。CspAmy2-v5和CspAmy2-v6展示出相比于其它被测试的酶类似的 热稳定性。
C.在液体洗涤剂中的热稳定性
将商业洗涤剂EPSILTM Perfect(McBride)和OMOTM Color (Unilever)在90℃下加热灭活4小时以消除现有的酶活性。在灭活 后，使用Suc-AAPF-pNA和Ceralpha测定法测量加热灭活的洗涤剂中 CspAmy2-v5、CspAmy2-v6、CspAmy2、和ACE-QK 的活性，以确保已经分别废除了任何蛋白酶和淀粉酶活性。用水同时配 置这些液体洗涤剂的10％溶液。
将100μL的0.5mg/mL经纯化的酶原液中的每个添加到400μL的 10％洗涤剂溶液。如上所述，将50μL的这些样品添加到数条PCR 管，每个在前述温度下孵育15分钟。当样品从热循环仪取出时，在测 量α-淀粉酶活性前用稀释缓冲液另外配置1:20的稀释液。如上，通过 将洗涤剂和热应激后每种淀粉酶的活性除以未经处理的淀粉酶的活性来 计算残余活性。结果示于图5(OMOTM)和图6(EPSILTM)中。相比 于亲本酶和其它被测试酶，CspAmy2-v5和CspAmy2-v6展示出优异的 热稳定性。
实施例6
表达CspAmy2组合变体的芽孢杆菌(Bacillus)菌株的生成
A.设计组合变体
如实施例2中对于CspAmy2-v5和CspAmy2-v6所述，通过 GeneArt来构建编码CspAmy2-v1变体的合成DNA并作为转化进枯草 芽孢杆菌宿主的质粒递送，所述变体具有在位置N126、Y150、F153、 L171、T180、E187、I203、和S241(参见SEQ ID NO:1)处的各种 置换组合。在八个位点处的每一处带有单个置换，存在256种可能的组 合。选择特定的置换N126Y、Y150H、F153W、L171N、T180H、 E187P、I203Y、和S241Q，并且制备10种可能的组合并进行测试。在 表2中示出了所述变体的名称以及在八个位点中的每个处存在的氨基酸 残基。为清楚起见，表中所述变体的全名是CspAmy2-C16A至 CspAmy2-C16J。在一些表和图中，变体名称被缩写但总是描述的很清 楚。制备了另外具有E187P或S241Q突变的其他CspAmy2-v1变体， 分别命名为CspAmy2-v1-E187P或CspAmy2-v1-S241Q。
表2：测试的突变组合
名称 N126 Y150 F153 L171 T180 E187 I203 S241
C16A Y Y F L T P Y S
C16B Y Y F L T E Y Q
C16C Y Y W L T P Y S
C16D Y Y W L T E Y Q
C16E Y Y W L H P Y S
C16F Y Y W L H E Y Q
C16G Y H W N T P Y S
C16H Y H W N T E Y Q
C16I Y H W N H P Y S
C16J Y H W N H E Y Q
B.表达CspAmy2组合变体的芽孢杆菌(Bacillus)菌株的构建
将pHPLT02-CspAmy2-v1质粒DNA(编码CspAmy2-v1，参见实 施例2)作为模板以制备在成熟区域中预选择位点处的另外的组合库。 pHPLT02表达载体来源于所述pHPLT载体。所述pHPLT表达载体包 含地衣芽孢杆菌LAT启动子(Plat)和另外的来自pUB110 (McKenzie等人(1986)Plasmid，15：93-103)的元件，其包括复制 酶基因(reppUB)、新霉素/卡那霉素抗性基因(neo)和博莱霉素抗 性标记(bleo)。使用其标准规程，GeneArt AG(Regensburg， Germany)制备了在所述位置处的组合库。每个感兴趣的位点对应的密 码子被至少一种非野生型氨基酸的密码子所置换。如本领域已知的 (WO 2002/014490)，使用密码子诱变的pHPLT02-CspAmy2-v1混合 物来转化感受态枯草芽孢杆菌细胞以生成CspAmy2-v1组合库。将转化 混合物涂布在含10mg/L硫酸新霉素的心浸液(HI)琼脂平板上。对于 每个文库，挑选单个细菌菌落并在含10mg/ml新霉素的TSB(胰蛋白 胨大豆肉汤)液体培养基中上生长用于后续DNA分离和基因序列分 析。生成变体并鉴定为该组合物的成员。所述变体在96孔MTP中， 在37℃下MBD培养基(基于MOPs缓冲液的富集的半限定培养基， 以脲为主要氮源，以葡萄糖为主要碳源，并添加1％的大豆胨用于促进 细胞生长)中进行选择性生长68小时。
下面示出了成熟CspAmy2-16A的氨基酸序列为SEQ ID NO：10：
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下面示出了成熟CspAmy2-16B的氨基酸序列为SEQ ID NO：11：
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下面示出了成熟CspAmy2-16C的氨基酸序列为SEQ ID NO：12：
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下面示出了成熟CspAmy2-16D的氨基酸序列为SEQ ID NO：13：
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下面示出了成熟CspAmy2-16E的氨基酸序列为SEQ ID NO：14：
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下面示出了成熟CspAmy2-16F的氨基酸序列为SEQ ID NO：15：
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下面示出了成熟CspAmy2-16G的氨基酸序列为SEQ ID NO：16：
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下面示出了成熟CspAmy2-16H的氨基酸序列为SEQ ID NO：17：
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下面示出了成熟CspAmy2-16I的氨基酸序列为SEQ ID NO：18：
AATNGTMMQYFEWYVPNDGQQWNRLRTDAPYLSSVGITAVWTPPAYKGTSQADVGYGPYDLYDL GEFNQKGTVRTKYGTKGELKSAVNTLHSNGIQVYGDVVMNHKAGADYTENVTAVEVNPSNRYQE TSGEYNIQAWTGFNFPGRGTTHSNWKWQWFHFDGTDWDQSRSNSRIFKFHGKAWDWPVSSENGN YDYLMYADYDYDHPDVVNEMKKWGVWYANEVGLDGYRLDAVKHIKFSFLKDWVDNARAATGKEM FTVGEYWQNDLGALNNYLAKVNYNQSLFDAPLHYNFYAASTGGGYYDMRNILNNTLVASNPTKA VTLVENHDTQPGQSLESTVQPWFKPLAYAFILTRSGGYPSVFYGDMYGTKGTTTREIPALKSKI EPLLKARKDYAYGTQRDYIDNPDVIGWTREGDSTKAKSGLATVITDGPGGSKRMYVGTSNAGEI WYDLTGNRTDKITIGSDGYATFPVNGGSVSVWVQQ
下面示出了成熟CspAmy2-16J的氨基酸序列为SEQ ID NO：19：
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下面示出了成熟CspAmy2-v1-E187P的氨基酸序列为SEQ ID NO： 20：
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下面示出了成熟CspAmy2-v1-S241Q的氨基酸序列为SEQ ID NO： 21：
AATNGTMMQYFEWYVPNDGQQWNRLRTDAPYLSSVGITAVWTPPAYKGTSQADVGYGPYDLYDL GEFNQKGTVRTKYGTKGELKSAVNTLHSNGIQVYGDVVMNHKAGADYTENVTAVEVNPSNRNQE TSGEYNIQAWTGFNFPGRGTTYSNFKWQWFHFDGTDWDQSRSLSRIFKFTGKAWDWEVSSENGN YDYLMYADIDYDHPDVVNEMKKWGVWYANEVGLDGYRLDAVKHIKFQFLKDWVDNARAATGKEM FTVGEYWQNDLGALNNYLAKVNYNQSLFDAPLHYNFYAASTGGGYYDMRNILNNTLVASNPTKA VTLVENHDTQPGQSLESTVQPWFKPLAYAFILTRSGGYPSVFYGDMYGTKGTTTREIPALKSKI EPLLKARKDYAYGTQRDYIDNPDVIGWTREGDSTKAKSGLATVITDGPGGSKRMYVGTSNAGEI WYDLTGNRTDKITIGSDGYATFPVNGGSVSVWVQQ
实施例7
CspAmy2变体的热稳定性评估
在下列条件下测试来自实施例5的组合变体CspAmy2-C16A至 CspAmy2-C16J(即，分别为“C16A”至“C16G”或“16A至 16G”)的热稳定性：
1.50mM乙酸钾，pH 5.7，0.125mM CaCl2，2.2mM NaCl， 85℃。
2.50mM乙酸钾，pH 5.0，0.125mM CaCl2，2.2mM NaCl， 70℃。
3.50mM乙酸钾，pH 4.5，0.125mM CaCl2，2.2mM NaCl， 65℃。
通过用milli-Q水将经纯化的变体稀释至1mg/mL的最终蛋白质浓 度来制备每种变体的储液，然后在上述缓冲液中的每个中将每种变体进 一步稀释(200倍)(最终酶剂量为5μg/mL)。将经稀释的酶溶液预 加热至合适的温度2分钟，然后冰上冷却以破坏任何蛋白质聚集体。将 50μL的每种酶溶液转移至0.2mL PCR联排管，将其加热至合适温度 (基于缓冲液pH)并使其孵育超过两小时的时间段。然后将所述样品 置于冰水浴中以终止热应激阶段。
一旦在所有时间点收集了每种缓冲液，就如实施例1中所述的那 样，使用Ceralpha测定法测定残余活性。针对每种变体进行两个独立 的灭活时程实验。将残余活性与时间的曲线图用单指数衰减方程建模以 确定衰减的速率常数(k)。将衰减的半衰期定义为ln(2)/k。这些实 验针对每种变体一式两份地进行。
针对每种变体的性能指数(PI)被定义为所述变体半衰期与参考亲 本分子的半衰期的比率。对于变体C16A、C16C、C16E、C16G、和 C16I，参考分子是CspAmy2-v1-E187P。对于变体C16B、C16D、 C16F、C16H、和C16J，参考分子是CspAmy2-v1-S241Q。在图7的 表中示出了相对半衰期和性能指数。其它实验展示了C16D的稳定性与的稳定性类似，而C16F的稳定性大于的 稳定性(未示出)。在图8-10中分别以图形方式显示了在pH 4.5和 65℃下、在pH 5.0和70℃下、以及在pH 5.7和85℃下所述组合变体的 相对性能。所有的C16A-J变体都比其相应亲本分子更稳定。
实施例8
使用CspAmy2变体降低粘度
测试来自实施例5的组合变体CspAmy2-C16A至CspAmy2-C16J 的降低淀粉溶液粘度的能力，作为淀粉水解活性的量度。使用具有 38mm×68mm的平洗罐(部件号AA0384001)和双裙桨(部件号 NS101783)的Rapid Visco Analyser(Newport Scientific；本文中 “RVA”)进行粘度实验。用Thermocline for Windows(版本3.11； (Newport Scientific))进行数据采集和分析。就在每次运行之前，如 下所述在RVA罐中制备33g的25％干固体(ds)玉米面浆液：在分析 天平上称量9.17g的玉米面(11.8％含水量)，与23.83g去离子水混 合。样品pH用0.0828mL 1N硫酸(用于pH 5.8)或用0.285mL 1N硫 酸(用于pH 5.0)来调节。添加适当剂量的酶，将罐放置在粘度计 中。所有的运行时间长度为10分钟，经过80秒的温度斜升至85℃， 之后其余的运行温度保持在85℃。在三个剂量下评估每种酶。针对粘 度曲线的两部分计算剂量响应。峰值粘度被定义为在实验过程中达到的 最大粘度，最终粘度被定义为在实验结束时读取的粘度。因为粘度与酶 的剂量存在倒数关系，通过将粘度倒数(也称为流动性)对酶剂量作图 使剂量响应曲线线性化。这些曲线的斜率用做每种变体比活性的定量量 度。每种变体的性能指数(PI)被定义为所述变体比活性与参考亲本分 子比活性的比率。对于变体CspAmy2-C16A、CspAmy2-C16C、 CspAmy2-C16E、CspAmy2-C16G、和CspAmy2-C16I，参考物是 CspAmy2-v1-E187P。对于变体CspAmy2-C16B、CspAmy2-C16D、 CspAmy2-C16F、CspAmy2-C16H、和CspAmy2-C16J，参考物是 CspAmy2-v1-S241Q。在表3和表4中示出了粘度降低性能。
表3：在pH5.8下粘度降低的改善
表4：在pH5.0下粘度降低的改善
实施例9
CspAmy2变体的清洁性能和洗涤剂稳定性
A.CspAmy2变体的清洁性能
在微样本清洁测定中使用在棉布样本上的CFT CS-28稻米淀粉来 分析来自实施例5的组合变体CspAmy2-C16A至CspAmy2-C16J的清 洁性能。使用培养上清液进行所述测定。使用HPLC对所述上清液的 蛋白质浓度定量。该测定法所用设备包括Biomek FX Robot(Beckman Coulter)；SpectraMAX MTP Reader(型号340-Molecular Devices)，和iEMS培养箱/摇床(Thermo Scientific)。所用试剂和溶 液为：
1)CS-28微样本(稻米淀粉，着色的)；
2)10mM HEPES，2mM CaCl2，0.005％TWEEN80缓冲液，pH 8.0，电导率1mS/cm；
3)50mM MOPS pH7.15，0.005％TWEEN80。
由Center for Testmaterials(CFT，Vlaardingen，The Netherlands)提供了5.5mm圆形直径的CS-28微样本。在96孔 Corning 9017平底聚苯乙烯MTP的每孔中放置两个微样本。用50mM MOPS pH7.15，0.005％TWEEN80将所述培养上清液稀释20倍。
将培养箱/摇床设定为25℃(环境温度)。分别将178.5μL的 HEPES缓冲液添加到包含微样本的MTP的每个孔中，并且随后将 1.5μL的稀释的酶溶液添加到每个孔中使总体积为180μL/孔。将MTP 用封板条密封并置于iEMS培养箱/摇床，并且在25℃下以1150rpm孵 育15分钟。在适当条件下孵育后，从每个孔转移100μL溶液至新 MTP，使用MTP-分光光度计测量488nm处的吸光度。将含两个微样 本和缓冲液但无酶的对照用于减去背景清洁性能。
通过减去空白(在不含酶的微样本的孵育之后获得)来校正每个吸 光度值，并且所得的吸光度提供了水解活性的量度。假设在测定所用范 围内是线性响应的，对每个样品计算相比于CspAmy2-v1的性能指数
(PI)。结果示于表4.1中。
B.CspAmy2变体的洗涤剂稳定性
通过测量在10％洗涤剂混合物(市售购买的Persil Color Gel洗涤 剂，Henkel(Düsseldorf,Germany)，购买于2011年)存在下、在限 定条件下孵育之后通过测定另外的CspAmy2变体的活性来确定其洗涤 剂稳定性。在使用前将所述洗涤剂加热灭活，并且使用Ceralphaα-淀 粉酶测定法测定初始和残余的淀粉酶活性。该测定法所用设备包括 Biomek FX Robot(Beckman Coulter)；SpectraMAX MTP Reader (型号340-Molecular Devices)，Tetrad2DNA Engine PCR仪 (Biorad)，和iEMS培养箱/摇床(Thermo Scientific)。所用试剂溶 液如下：
1)对-硝基苯基麦芽七糖苷(BPNPG7)底物(Megazyme Ceralpha HR试剂盒)：
2)液体洗涤剂(Persil color gel，通过在90℃下加热4小时使酶失 活)；
3)50mM MOPS，0.1mM CaCl2，0.005％80缓冲液，pH 7 (稀释缓冲液)；
4)用稀释缓冲液稀释的10％洗涤剂溶液；
5)200mM硼酸/NaOH缓冲液，pH 10(STOP缓冲液)
6)用包含0-100μg/mL蛋白的50mM MOPS pH7.15，0.1mM CaCl2 将淀粉酶培养上清液稀释8倍。
将80μL的10％洗涤剂溶液添加到96孔PCR板中，并与20μL的 所述稀释的培养上清液混合。将来自所述PCR板的样品用稀释缓冲液 稀释10倍，并且用5μL的这种稀释液的等分试样来测定初始淀粉酶活 性。在80.5℃下将所述PCR板在Tetrad PCR部件中孵育5分钟。在 孵育后，用稀释缓冲液将洗涤剂-酶混合物稀释10倍，并测量残余活 性。通过Ceralphaα-淀粉酶测定法，使用5μL样本一式三份测定初始 (t初始)和残余(t残余)淀粉酶活性。
对于每种变体，使用残余淀粉酶活性与初始淀粉酶活性的比率如下 计算洗涤剂稳定性：洗涤剂稳定性＝[t残余值]/[t初始值]。
针对每个样品(变体)计算性能指数(PI)。通过将所述变体酶的 洗涤剂稳定性与经相似处理的CspAmy2-v1酶的洗涤剂稳定性进行比较 来确定洗涤剂稳定性的性能指数。结果示于表5中。
表5.CspAmy2变体的清洁性能和稳定性
实施例10
表达CspAmy2组合变体的芽孢杆菌(Bacillus)菌株的生成
A.组合变体的设计
通过GeneArt构建编码两种另外的CspAmy2变体的合成DNA， 并且以转化的质粒在枯草芽孢杆菌宿主中递送，如实施例2中对于 CspAmy2-v5和CspAmy2-v6所述。CspAmy2v171是CspAmy2的变 体，其具有突变T180D、E187P、I203Y、G476K，并缺失R178和 G179。CspAmy2v172是CspAmy2的变体，其具有突变N126Y、 T180D、E187P、I203Y、G476K，并缺失R178和G179。
下面示出了成熟CspAmy2-v171的氨基酸序列为SEQ ID NO：22：
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下面示出了成熟CspAmy2-v172的氨基酸序列为SEQ ID NO：23：
AATNGTMMQYFEWYVPNDGQQWNRLRTDAPYLSSVGITAVWTPPAYKGTSQADVGYGPYDLYDL GEFNQKGTVRTKYGTKGELKSAVNTLHSNGIQVYGDVVMNHKAGADYTENVTAVEVNPSNRYQE TSGEYNIQAWTGFNFPGRGTTYSNFKWQWFHFDGTDWDQSRSLSRIFKFDGKAWDWPVSSENGN YDYLMYADYDYDHPDVVNEMKKWGVWYANEVGLDGYRLDAVKHIKFSFLKDWVDNARAATGKEM FTVGEYWQNDLGALNNYLAKVNYNQSLFDAPLHYNFYAASTGGGYYDMRNILNNTLVASNPTKA VTLVENHDTQPGQSLESTVQPWFKPLAYAFILTRSGGYPSVFYGDMYGTKGTTTREIPALKSKI EPLLKARKDYAYGTQRDYIDNPDVIGWTREGDSTKAKSGLATVITDGPGGSKRMYVGTSNAGEI WYDLTGNRTDKITIGSDGYATFPVNKGSVSVWVQQ
实施例11
CspAmy2组合变体的热稳定性评估
如实施例5中所述的那样，将经纯化的CspAmy2-v171和 CspAmy2-v172的清洁洗涤剂稳定性与CspAmy2-v5和ACE-QK的清 洁洗涤剂稳定性进行比较。结果示于图11中。CspAmy2-v172的稳定 性高于所有其它被测试的酶。
实施例12
CspAmy2组合变体在手洗餐具洗涤中的清洁益处
在手洗餐具洗涤应用中，将CspAmy2变体的清洁益处与可商购获 得的α-淀粉酶[(Novozymes A/S)]的清洁有益效果进行 比较。在旨在模拟手洗的测定中，将0.01％(wt/wt)的活性酶 (CspAmy2-v6，或不含酶作为对照)添加到 European Dreft衣物洗涤剂(1g/L的水溶液；Procter&Gamble， Cincinnati，Ohio，USA)中，并在DM77淀粉监视器(即，ADW三 聚氰胺瓦，来自Center for Test Materials CFT BV，Vlaardingen，the Netherlands)存在下、在40℃下在耐洗牢度试验仪中搅拌孵育。结果 示于图12中。根据观察到的清洁速率和达到的终点，CspAmy2-v5的 清洁性能远优于重要的是，由CspAmy2-v5实现的清 洁速率是如此迅捷使得在与手洗餐具洗涤应用有关的时间段内(即约 30秒)观到了有益效果。这些结果表明CspAmy2变体具有作为用作手 洗餐具洗涤组合物的添加剂的潜力。
实施例13
CspAmy2组合变体在自动餐具洗涤中的清洁益处
在自动餐具洗涤(ADW)应用中，将CspAmy2变体的清洁益处 与两种基准α-淀粉酶(即，和)的清洁有 益效果进行比较。清洁测定在标准Miele 6382餐具洗涤机中使用正常 循环(50℃和60分钟)、用具有21GH和37.5FH硬度的水进行。每 个餐具洗涤循环使用20g的ADW粉末洗涤剂。该洗涤剂是WfK B型 或C型(Testgewebe GmbH，Brüggen，Deutschland)，其在图13的 表A和表B中分别描述。
试验样品是有面食制品污渍或混合淀粉污渍的餐具。通过将150g 的在17GH水中烹煮过的粗滤的面食在共混机中与200mL蒸馏水混合 5分钟以获得口香糖样悬浮液来制备面食制品。将约3g的所述悬浮液 刷在待清洁测定的每个餐具的表面，使其干燥24小时，将所述餐具在 120℃下烤2小时，并且使之冷却。通过向洗涤过的餐具添加碘并使用 1-10的照片比例评级来评估清洁性能。通过将26g的马铃薯、玉米、稻 和小麦淀粉的每个与约4L g 16GH水混合并加热至95℃保持10分钟 来制备混合淀粉样本。在冷却至室温后，将约30mL的所述混合物施加 到待清洁测定的每个餐具的表面，使所述餐具表面在室温下干燥48小 时，将所述餐具在80℃下烤1小时，并且使之冷却。通过对清洁测定 前后的餐具称重以测定去除淀粉的量来测定清洁性能。
图14和图15示出了在约2.5cents/kg(ct/kg)WfK B洗涤剂中 0、1、2、4或8ppm剂量下，CspAmy2-v6(正方形)相比于(菱形)针对混合淀粉污渍(图14)和面食制品污渍 (图15)的清洁性能。CspAmy2-v6明显优于尤其是 针对混合淀粉污渍。图16和图17示出了在约2.5ct/kg WfK B洗涤剂中 0、1、2、4或8ppm剂量下，CspAmy2-v6(正方形)相比于(圆圈)针对混合淀粉污渍(图16)和面食制品污渍 (图17)的清洁性能。CspAmy2-v6明显优于尤其是 在低剂量下。图18和图19示出了在约2.5ct/kg WfK C洗涤剂中0、 1、2、4或8ppm剂量下，CspAmy2-v6(正方形)相比于(菱形)针对混合淀粉污渍(图18)和面食制品污渍 (图19)的清洁性能。针对两种污渍CspAmy2-v6表现明显优于
实施例14
C18P的位点评估文库筛选和活性增强突变的鉴定
构建位点评估文库(SELs)并在变体CspAmy2-C18P中485个位 置的283处进行筛选以鉴定另外的变体，变体CspAmy2-C18P即为带 有突变N126Y、F153W、T180D、I203Y、和S241Q并缺失R178和 G179的CspAmy2(参见用于编号的SEQ ID NO:1)，所述另外的变 体在下列底物中的一个或多个上具有增强的活性：玉米支链淀粉、溶胀 的玉米淀粉、颗粒状的玉米淀粉、和带玉米淀粉污渍的微样本。在整个 分子中发现增强活性的突变。将这些变体的子集在不同的剂量响应下重 新测试以确认增强的活性。
下面示出了成熟CspAmy2-C18P淀粉酶多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:24(置换位置加下划线)：
玉米支链淀粉测定
利用可溶性玉米支链淀粉的水解来测量淀粉酶变体的比活性。使用 二辛可宁酸(BCA)测定对支链淀粉聚合物的酶促水解形成的还原终 产物进行定量来测量活性。该测定法所用设备包括Biomek FX Robot (Beckman Coulter)；SpectraMAX MTP Reader(型号340- Molecular Devices)，和Tetrad2DNA Engine PCR仪(Biorad)。
通过煮沸5分钟同时搅拌将经纯化的玉米支链淀粉(MP Biomedicals，LLC，目录号#195048)溶解为1.5％(w/w)的水悬浮 液。使所述材料冷却至室温，并且添加水和浓缩原液以获得最终的支链 淀粉底物，其具有1.25％(w/w)的支链淀粉、6.25ppm的钙、 62.5ppm的钠、62.5mM乙酸钾(pH 5.0)、和0.005％(v/v)的 TWEEN80。
将40μl的支链淀粉底物添加到3个PCR微孔板。在板中加入用水 /0.005％TWEEN80以1:2000稀释的10μl的培养上清液，之后通过移 液器吹吸进行混合。将板密封并置于70℃下5分钟，之后斜降至 25℃。通过立即添加/混合10μL 0.5N NaOH来终止支链淀粉水解。
通过BCA测定分析淀粉水解反应产物。简而言之，根据制造商的 说明制备在商业试剂盒(Pierce Chemical，目录号23225)中提供的试 剂。将90μl等分至PCR板，之后添加上面所描述的10μL的终止酶反 应物。在经过混合组分后，将板密封并置于热循环仪中，程序设定为在 95℃下3分钟以显色，然后冷却至30℃。将显色的BCA反应混合物的 70μL样品转移至新板，并且在分光光度计中测量562nm处的吸光度。 将采集自三次平行测定板的数据取平均值。
玉米淀粉测定
在用于所述测定之前，通过用MilliQ水重复悬浮和离心来充分洗 涤Cargill玉米淀粉材料(面粉或淀粉)。将经洗涤的玉米淀粉悬浮于 包含0.005％叠氮化钠的MilliQ水中以获得20％(w/w)的原液，将其 用20X的原液缓冲液溶液进一步稀释成10.9％w/v的玉米面和玉米淀 粉溶液(最终的缓冲液浓度为55mM KOAc，pH 5)。
使用气泡式储槽将55μL的所述稀释的玉米面或玉米淀粉底物连同 5μL的1:10稀释的酶样品添加到PCR微孔板。将板密封并在86℃下放 置5分钟，之后斜降至45℃。通过添加70μL的0.1N NaOH终止淀粉 水解反应。将板密封，并以1,610RCF离心3分钟。如上所述，通过 BCA测定来分析淀粉水解反应产物。
溶胀的玉米淀粉(SCS)测定
SCS测定法测量了水合的但完整的(“溶胀的”)淀粉颗粒上的 α-淀粉酶活性。使用BCA还原糖测定法来评估酶促代谢周转的总体数 量，而使用碘染色法来评估酶将大淀粉片段释放至溶液中的趋势。
通过将2g玉米淀粉(Cargill Farms Organic Corn Starch)用90g 的MilliQ水制成悬浮液并且在设定为80℃的浸没式水浴中加热1小时 (定期涡旋)来制备2％(w/w)溶胀的玉米淀粉底物。在室温下过夜 冷却后，通过添加乙酸钾缓冲液、氯化钙、氯化钠和TWEEN-80将体 积提升至100mL以赋予50mM KOAc(pH5.5)、0.125mM CaCl2、 2mM NaCl和0.005％TWEEN-80的最终浓度。
使用气泡式储槽将55μL的溶胀的玉米淀粉底物分配至NUNC V型 底聚苯乙烯微孔板中。通过向板中添加5μL的12x酶溶液以赋予反应 中～0.03ppm的最终酶浓度来起始所述反应。用Nunc密封件将所述反 应板密封并立即置于iEMS培养箱中。在以1,150RPM摇动情况下， 在25℃下孵育10分钟或在60℃下孵育4分钟。在孵育之后，通过添加 70μL的0.1N NaOH来终止反应。将板密封，并且以3,000RPM旋转3 分钟。以单个板完成溶胀的玉米淀粉反应，但一式三份测定以用于后续 的碘测定和BCA测定。
以上描述了BCA测定。对于碘反应，将95μL的Lugol试剂(在 水中新鲜稀释12倍；Sigma-Aldrich L6146-1L)添加到96孔Costar 9017微孔板中。向板中添加5μL的上清液样品并通过移液器吹吸混合 6次。然后将板在桌上型微孔板混合器中以速度6-7摇动1分钟。使用 SpectraMax M5分光光度计读取530nm处的吸光度。
CS-26玉米淀粉微样本测定
如上所述进行测定，不同的是将170μL的乙酸钾缓冲液添加至包 含微样本的MTP的每个孔中，随后将10μL的稀释的酶溶液添加至每 个孔中使总体积为180μL/孔。将MTP密封，并且在25℃下以 1,150rpm孵育20分钟。
粘度分析
使用具有38mm×68mm的平洗罐(部件号AA0384001)和双裙桨 (部件号NS101783)的Rapid Visco Analyser(Newport Scientific)进 行粘度实验。用Thermocline for Windows(版本3.11)进行数据采集 和分析。在每次运行之前，如下所述在RVA罐中制备33g的25％干固 体(ds)玉米面浆液：在分析天平上称量9.17g的玉米面(11.8％含水 量)，并且与23.83g去离子水混合。样品pH用0.0828mL 1N硫酸 (针对pH 5.7)或用0.285mL 1N的硫酸(针对pH 5.2)来调节。添加 适当剂量的酶，并且将罐置于在粘度计中。所有的运行时间长度为10 分钟，经过80秒温度斜升至85℃或95℃，之后其余的运行温度保持在 85℃或95℃。
初始筛选结果
在每种测定中指定测定中的任一个中，将导致变体表达大于250 ug/mL并且至少为CspAmy2-C18P的性能的110％的突变归类为性能 增强的突变。在以下位置处具有突变的CspAmy2-C18P SEL变体符合 这个标准：6，7，8，11，14，15，20，21，23，26，27，28，37，38，39，40，42，45，46，48，49， 50，51，52，53，54，58，61，62，68，70，71，72，73，79，80，81，82，84，85，87，88，89，92，93，94，95， 96，97，98，101，108，111，112，113，114，115，116，117，118，120，122，123，124，126，127，129， 130，131，132，133，134，136，137，138，140，142，143，144，147，148，149，150，151，152，153， 154，155，156，158，159，165，167，168，170，171，172，175，176，177，180，181，182，187，190， 191，193，199，200，201，203，206，208，210，211，212，214，215，216，219，221，223，225，226， 227，235，238，239，240，241，242，243，245，246，247，248，249，250，252，253，254，256，257， 258，260，261，262，266，267，268，269，270，271，273，276，277，279，280，282，284，285，286， 288，296，299，300，301，302，303，304，307，308，310，311，312，313，316，317，318，320，321， 325，327，335，338，342，348，349，352，356，357，360，362，363，368，369，377，381，382，383， 384，385，388，390，392，394，395，396，397，398，400，401，402，403，404，405，407，408，410， 414，415，416，418，419，420，421，422，423，424，426，428，429，430，431，434，435，436，439， 441，442，444，445，446，447，448，449，450，451，454，455，457，460，461，462，463，464，465， 466，467，469，470，471，473，474，475，476，477，479，480，481，482，483，和484。
具体的性能增强的突变包括：T6A，T6D，T6E，T6G，T6K，T6M， T6N，T6Q，T6S，M7A，M7V，M8C，M8F，M8I，M8L，M8Y，F11V，Y14A，Y14I，Y14Q，Y14T， Y14V，V15C，V15D，V15I，V15N，V15T，Q20A，Q20C，Q20D，Q20H，Q20K，Q20M，Q20N， Q20R，Q20S，Q20Y，Q21F，Q21W，N23A，N23C，N23D，N23E，N23H，N23K，N23Q，N23R， N23S，N23T，N23V，R26C，R26E，R26G，R26K，R26M，R26S，R26T，T27A，T27C，T27D， T27E，T27F，T27H，T27I，T27K，T27L，T27M，T27N，T27Q，T27R，T27S，T27V，T27Y，D28A， D28C，D28T，I37F，I37V，T38D，T38N，A39L，V40A，V40C，V40D，V40G，V40H，V40I， V40K，V40M，V40P，V40Q，V40R，V40S，V40T，V40W，V40Y，T42A，T42C，T42I，T42M， T42V，A45C，A45G，Y46F，G48A，T49I，S50A，S50C，S50E，S50G，S50K，S50M，S50N，S50Q， S50R，S50T，S50Y，Q51C，Q51D，Q51E，Q51S，Q51V，A52C，A52D，A52E，A52F，A52G， A52H，A52K，A52L，A52M，A52R，A52S，A52T，A52V，A52Y，D53E，V54N，V54T，P58A， P58C，P58H，P58I，P58S，P58T，P58V，L61M，L61V，Y62A，Y62C，Y62D，Y62F，Y62G， Y62H，Y62I，Y62K，Y62L，Y62M，Y62N，Y62P，Y62Q，Y62R，Y62S，Y62V，N68C，N68D， N68E，N68F，N68H，N68L，N68P，N68Q，N68R，N68S，N68V，N68W，N68Y，K70R，G71A， G71C，G71D，G71E，G71K，G71R，G71S，T72G，T72S，V73S，T79F，T79I，T79L，T79M， T79N，T79S，T79Y，K80A，K80C，K80D，K80F，K80H，K80I，K80M，K80N，K80Q，K80R， K80S，K80T，K80V，K80Y，G81A，G81D，G81E，G81F，G81H，G81I，G81K，G81N，G81P， G81R，G81S，G81T，E82A，E82D，E82M，E82Q，K84A，K84C，K84E，K84I，K84Q，K84R， K84S，K84T，K84Y，S85A，S85C，S85D，S85E，S85G，S85H，S85I，S85L，S85M，S85N，S85Q， S85R，S85T，S85V，S85Y，V87I，V87T，N88C，N88D，N88E，N88G，N88H，N88I，N88K， N88L，N88M，N88Q，N88R，N88S，N88T，N88V，N88W，N88Y，T89A，T89D，T89E，T89F， T89H，T89I，T89K，T89L，T89M，T89N，T89Q，T89R，T89S，T89Y，S92A，S92C，S92D，S92E， S92F，S92G，S92H，S92L，S92M，S92N，S92Q，S92R，S92T，S92W，S92Y，N93A，N93C， N93E，N93F，N93H，N93I，N93K，N93L，N93Q，N93S，N93T，N93Y，G94A，G94C，G94N， I95M，Q96A，Q96E，Q96H，Q96I，Q96K，Q96L，Q96M，Q96N，Q96R，Q96V，Q96Y，V97I， V97T，Y98F，Y98I，Y98L，Y98V，V101C，V101T，G108A，G108S，Y111D，Y111E，Y111L， Y111N，Y111S，Y111T，Y111V，T112A，T112F，T112H，T112I，T112K，T112L，T112M， T112N，T112P，T112R，T112V，T112W，E113D，E113N，E113Q，E113T，N114A，N114C， N114D，N114E，N114F，N114G，N114H，N114I，N114L，N114P，N114Q，N114R，N114S， N114T，N114V，N114W，N114Y，V115A，V115I，T116A，T116C，T116D，T116G，T116H， T116I，T116K，T116N，T116P，T116Q，T116R，T116S，A117C，A117I，A117S，A117V， V118A，V118C，V118E，V118F，V118H，V118I，V118L，V118M，V118N，V118Q，V118R， V118S，V118W，V118Y，V120A，V120C，V120I，V120M，V120T，P122A，P122D，P122E， P122G，P122H，P122N，P122R，P122S，P122T，P122W，S123A，S123C，S123G，S123K，S123L， N124A，N124D，N124F，N124G，N124L，N124R，N124S，N124V，Y126A，Y126C，Y126D， Y126E，Y126G，Y126H，Y126I，Y126K，Y126L，Y126M，Y126N，Y126Q，Y126R，Y126S， Y126T，Y126V，Y126W，Q127A，Q127C，Q127D，Q127E，Q127F，Q127H，Q127I，Q127K， Q127L，Q127M，Q127N，Q127R，Q127S，Q127T，Q127V，Q127W，Q127Y，T129A，T129C， T129D，T129E，T129F，T129G，T129I，T129K，T129L，T129M，T129N，T129Q，T129R， T129S，T129V，T129W，T129Y，S130A，S130G，S130I，S130K，S130L，S130M，S130N， S130P，S130R，S130T，S130V，S130W，G131A，G131C，G131D，G131F，G131H，G131I， G131K，G131L，G131M，G131P，G131Q，G131V，G131W，G131Y，E132A，E132C，E132D， E132F，E132G，E132H，E132I，E132K，E132L，E132M，E132N，E132P，E132Q，E132R， E132V，E132W，Y133A，Y133D，Y133E，Y133G，Y133K，Y133L，Y133M，Y133R，Y133S， Y133T，Y133W，N134A，N134D，N134F，N134G，N134H，N134I，N134K，N134L，N134M， N134R，N134S，N134V，N134W，N134Y，Q136A，Q136C，Q136D，Q136E，Q136F，Q136H， Q136K，Q136L，Q136M，Q136N，Q136R，Q136S，Q136T，Q136V，Q136W，Q136Y，A137S， A137T，A137V，W138F，W138Y，G140A，G140M，N142F，N142K，N142L，N142M，N142P， N142V，N142W，N142Y，F143H，F143Y，P144C，P144D，P144E，P144G，P144H，P144I， P144K，P144L，P144M，P144N，P144Q，P144S，P144T，P144Y，G147A，G147C，G147H， G147K，G147L，G147M，G147N，G147Q，G147R，T148A，T148D，T148E，T148F，T148I， T148K，T148L，T148R，T148S，T148V，T148W，T149A，T149C，T149D，T149E，T149F， T149H，T149K，T149L，T149M，T149N，T149Q，T149V，T149W，T149Y，Y150H，S151A， S151E，S151F，S151H，S151I，S151K，S151L，S151M，S151Q，S151R，S151V，N152A，N152C， N152D，N152E，N152G，N152H，N152K，N152M，N152P，N152Q，N152R，N152S，N152T， W153F，W153H，W153Q，W153R，W153T，W153Y，K154A，K154C，K154D，K154E，K154G， K154I，K154L，K154M，K154N，K154R，K154T，K154Y，W155P，Q156A，Q156D，Q156E， Q156F，Q156G，Q156H，Q156I，Q156L，Q156M，Q156N，Q156R，Q156S，Q156Y，F158C， F158D，F158K，F158L，F158M，F158N，F158P，F158Q，F158R，F158S，F158V，H159M， H159Y，W165C，W165D，W165E，W165F，W165H，W165I，W165K，W165L，W165M， W165Q，W165R，W165T，W165Y，Q167A，Q167D，Q167E，Q167G，Q167H，Q167K，Q167M， Q167N，Q167P，Q167S，Q167T，Q167V，S168A，S168D，S168F，S168H，S168I，S168K， S168M，S168N，S168Q，S168R，S168T，S168V，S168W，S168Y，S170A，S170C，S170D， S170E，S170F，S170L，S170M，S170N，S170Q，S170R，S170T，L171A，L171C，L171F，L171G， L171H，L171I，L171N，L171Q，L171R，L171T，L171V，L171W，L171Y，S172A，S172D， S172H，S172R，S172T，F175M，F175Y，K176I，K176T，F177L，F177V，F177W，D180A， D180C，D180F，D180G，D180H，D180I，D180L，D180M，D180N，D180Q，D180R，D180S， D180T，D180V，D180W，D180Y，G181A，G181C，G181D，G181E，G181F，G181H，G181K， G181L，G181M，G181N，G181Q，G181R，G181S，G181T，G181V，G181Y，K182A，K182P， E187D，E187I，E187K，E187M，E187N，E187P，E187R，E187S，E187T，E187V，E187Y， S190A，S190C，S190D，S190F，S190L，S190N，S190P，S190Q，E191A，E191C，E191F，E191G， E191H，E191I，E191K，E191N，E191Q，E191R，E191S，E191T，E191W，E191Y，G193A， G193C，G193D，G193E，G193F，G193H，G193K，G193L，G193M，G193N，G193Q，G193R， G193S，G193T，G193V，G193W，M199L，Y200F，A201M，Y203I，Y203L，Y203V，D206A， D206E，D206G，D206H，D206M，D206N，D206Q，D206R，D206S，D206T，P208A，P208E， P208F，P208I，P208K，P208L，P208T，P208V，P208Y，V210A，V210E，V210H，V210K， V210N，V210Q，V210R，V210S，V210T，V211A，V211E，V211H，V211I，V211Q，V211R， N212E，N212F，N212G，N212L，N212M，N212R，N212V，M214I，M214L，K215C，K215E， K215F，K215M，K215N，K215R，K215Y，K216F，V219I，V219T，Y221F，Y221I，Y221L， N223C，N223E，N223I，N223K，N223Q，N223R，N223S，N223T，N223V，N223W，N223Y， V225A，V225I，V225L，V225M，G226D，G226M，G226Q，G226R，G226S，L227F，L227I， L227W，L227Y，V235A，I238A，I238L，I238M，K239D，K239E，K239P，K239Q，K239R， K239S，K239T，F240K，F240L，F240M，F240Q，F240R，Q241A，Q241C，Q241D，Q241E， Q241G，Q241H，Q241K，Q241L，Q241M，Q241N，Q241P，Q241R，Q241S，Q241T，Q241V， Q241W，Q241Y，F242V，L243C，L243Y，D245A，D245C，D245E，D245G，D245L，D245M， D245N，W246F，V247I，V247L，D248E，D248H，D248N，D248T，D248V，N249A，N249E， N249G，N249H，N249Q，N249Y，A250M，A250S，A250V，A252C，A252D，A252E，A252G， A252H，A252I，A252K，A252L，A252M，A252N，A252Q，A252S，A252V，A252W，A252Y， A253E，A253I，A253K，A253L，A253M，A253Q，A253S，A253T，A253V，A253Y，T254F， T254K，T254S，K256A，K256M，K256N，K256S，E257Q，E257S，M258L，T260A，T260C， T260S，T260V，V261I，V261W，G262A，Q266A，Q266D，Q266E，Q266H，Q266I，Q266M， Q266N，Q266S，Q266T，Q266V，Q266Y，N267H，N267I，N267Q，N267R，N267S，N267T， N267V，N267Y，D268G，D268N，L269C，L269D，L269I，L269K，L269Q，L269S，L269T， L269Y，G270A，G270D，G270E，G270F，G270H，G270I，G270L，G270M，G270Q，G270T， G270V，G270Y，A271C，A271D，A271E，A271H，A271K，A271M，A271Q，A271R，A271S， A271T，A271V，A271Y，N273C，N273G，N273H，N273I，N273K，N273R，L276I，L276M， A277C，A277D，A277E，A277F，A277G，A277I，A277K，A277L，A277M，A277N，A277Q， A277R，A277S，A277T，A277V，A277W，A277Y，V279C，V279T，N280A，N282S，N282T， S284T，S284Y，L285A，L285C，L285I，L285V，F286M，A288C，A296C，A296D，A296E， A296F，A296G，A296H，A296I，A296L，A296M，A296N，A296Q，A296R，A296S，A296V， A296W，A296Y，T299A，T299D，T299E，T299F，T299G，T299K，T299L，T299M，T299R， T299S，T299V，T299W，G300A，G300C，G300D，G300E，G300F，G300H，G300K，G300M， G300Q，G300R，G300V，G300W，G301A，G301C，G301D，G301E，G301F，G301H，G301K， G301L，G301M，G301Q，G301R，G301S，G301T，G301V，G301W，G301Y，G302S，Y303A， Y303C，Y303D，Y303E，Y303F，Y303G，Y303H，Y303I，Y303K，Y303L，Y303M，Y303N， Y303Q，Y303R，Y303S，Y303T，Y303V，Y303W，Y304F，Y304K，Y304W，R307A，R307C， R307E，R307G，R307H，R307K，R307M，R307N，R307Q，R307S，R307T，N308C，N308D， N308E，N308G，N308L，N308M，N308T，N308V，L310A，L310C，L310D，L310E，L310H， L310I，L310M，L310P，L310W，L310Y，N311C，N311E，N311G，N311H，N311K，N311Q， N311R，N311S，N311V，N311W，N311Y，N312D，N312F，N312G，N312H，N312K，N312Q， N312R，T313A，T313S，A316D，A316E，A316G，A316H，A316K，A316Q，A316R，A316Y， S317C，S317D，S317G，S317H，S317K，S317L，S317N，S317Q，S317R，S317T，S317W， S317Y，N318A，N318C，N318F，N318G，N318I，N318K，N318L，N318M，N318Q，N318R， N318S，N318T，N318V，N318W，T320A，T320C，T320D，T320E，T320G，T320H，T320I， T320K，T320N，T320P，T320Q，T320R，T320V，T320W，T320Y，K321C，K321F，K321H， K321N，K321S，K321Y，L325A，L325C，L325F，L325I，L325M，L325Q，L325V，E327D， E327L，Q335C，Q335E，E338A，E338D，E338F，E338G，E338H，E338I，E338K，E338P， E338Q，E338R，E338T，E338V，E338Y，Q342A，Q342C，Q342G，Q342L，Q342M，Q342R， Q342S，Q342T，Q342V，Q342W，L348A，L348C，L348H，L348I，L348M，L348Q，L348S， L348T，A349G，A349R，F352I，F352L，F352M，F352T，F352V，R356Q，S357A，S357C， S357D，S357E，S357F，S357H，S357I，S357K，S357L，S357N，S357Q，S357T，S357V，S357W， S357Y，Y360F，Y360I，Y360L，Y360M，Y360V，S362A，S362C，S362E，S362I，S362T，S362V， V363I，V363L，M368F，M368I，M368L，M368Y，Y369A，Y369E，Y369I，Y369L，Y369N， Y369V，R377A，R377C，R377D，R377E，R377F，R377G，R377H，R377I，R377K，R377L， R377N，R377Q，R377S，R377T，R377V，R377W，R377Y，A381C，A381E，A381G，A381H， A381K，A381L，A381M，A381N，A381P，A381Q，A381V，A381W，A381Y，L382F，L382H， L382Q，L382S，K383A，K383C，K383D，K383E，K383H，K383I，K383L，K383M，K383N， K383Q，K383R，K383S，K383W，K383Y，S384A，S384C，S384D，S384F，S384G，S384H， S384I，S384L，S384N，S384R，S384V，S384Y，K385A，K385D，K385E，K385F，K385G， K385H，K385L，K385M，K385Q，K385R，K385T，K385V，K385Y，P388A，P388C，P388D， P388I，P388L，P388N，P388R，P388S，P388T，P388V，L390M，L390V，A392C，A392S，K394A， K394C，K394E，K394F，K394G，K394H，K394I，K394L，K394Q，K394R，K394S，K394T， K394V，K394W，K394Y，D395A，D395E，D395N，D395S，D395T，Y396A，Y396D，Y396F， Y396K，Y396M，Y396N，Y396Q，Y396T，Y396V，Y396W，A397D，A397E，A397H，A397K， A397M，A397N，A397Q，A397V，Y398A，Y398C，Y398F，Y398H，Y398I，Y398L，Y398W， T400A，T400C，T400D，T400F，T400G，T400I，T400K，T400L，T400M，T400N，T400Q， T400R，T400W，T400Y，Q401A，Q401C，Q401F，Q401H，Q401I，Q401L，Q401M，Q401N， R402C，R402D，R402F，R402K，R402L，R402M，R402N，R402Q，R402S，R402W，D403E， D403N，D403S，Y404E，Y404G，Y404K，Y404M，Y404N，Y404R，Y404W，I405C，I405F， I405L，I405M，I405V，N407A，N407C，N407D，N407E，N407G，N407K，N407M，N407Q， N407R，P408A，P408C，P408D，P408I，P408K，P408L，P408M，P408N，P408Q，P408V， P408W，V410A，V410C，V410D，V410E，V410F，V410H，V410I，V410L，V410M，V410N， V410Q，V410S，V410T，T414A，T414I，T414S，T414V，R415M，E416C，E416D，E416F， E416H，E416I，E416K，E416L，E416M，E416N，E416Q，E416R，E416T，E416V，E416W， E416Y，D418A，D418E，D418G，D418H，D418I，D418K，D418L，D418M，D418N，D418Q， D418S，D418T，D418V，D418W，S419A，S419C，S419E，S419G，S419L，S419M，S419N， S419R，S419V，S419W，S419Y，T420A，T420C，T420D，T420E，T420G，T420H，T420I， T420K，T420M，T420P，T420S，T420V，T420W，T420Y，K421A，K421D，K421E，K421H， K421I，K421L，K421M，K421N，K421P，K421Q，K421R，K421T，K421V，K421W，K421Y， A422C，A422D，A422E，A422F，A422G，A422I，A422L，A422N，A422P，A422Q，A422R， A422S，A422Y，K423A，K423D，K423E，K423F，K423H，K423I，K423L，K423M，K423N， K423Q，K423R，K423S，K423T，K423V，K423W，K423Y，S424A，S424C，S424G，S424K， S424N，S424Q，S424R，S424T，L426S，L426T，L426V，T428G，T428V，V429A，V429C， V429I，V429L，I430C，I430G，I430L，I430M，I430Q，I430V，T431A，T431C，T431S，P434A， P434C，P434D，P434E，P434F，P434H，P434I，P434K，P434L，P434M，P434N，P434Q，P434R， P434S，P434V，P434Y，G435A，G435C，G435D，G435E，G435F，G435H，G435I，G435K， G435M，G435N，G435P，G435Q，G435R，G435S，G435T，G435W，G436F，G436I，G436M， G436N，G436Q，G436S，G436V，R439A，R439D，R439G，R439H，R439K，R439M，R439N， R439P，R439Q，R439S，R439V，R439W，R439Y，Y441A，Y441C，Y441D，Y441F，Y441G， Y441H，Y441K，Y441L，Y441M，Y441N，Y441P，Y441R，Y441S，Y441T，Y441W，V442A， V442C，V442I，V442T，T444C，T444D，T444E，T444F，T444G，T444H，T444I，T444K，T444L， T444M，T444N，T444P，T444R，T444S，T444W，S445A，S445C，S445E，S445G，S445H， S445K，S445L，S445M，S445N，S445T，S445V，N446A，N446C，N446H，N446K，A447C， A447D，A447F，A447H，A447L，A447M，A447N，A447Q，A447R，A447S，A447Y，G448A， G448C，G448D，G448E，G448H，G448K，G448L，G448M，G448N，G448Q，G448R，G448S， G448T，G448W，E449D，E449H，E449K，E449T，I450A，I450C，I450D，I450E，I450G，I450K， I450L，I450M，I450N，I450Q，I450S，I450T，I450W，I450Y，W451Y，L454A，L454I，L454K， L454M，L454W，T455A，T455I，T455L，T455S，N457H，N457K，N457R，N457T，N457V， N457Y，D460A，D460E，D460G，D460M，D460N，D460Q，D460S，D460V，K461C，K461H， K461L，K461M，K461N，K461Q，K461T，K461Y，I462A，I462L，I462M，I462Q，I462T，I462V， T463D，T463E，T463H，T463P，T463Q，T463R，T463V，T463Y，I464P，I464T，G465A，G465C， G465D，G465E，G465K，G465L，G465M，G465N，G465Q，G465W，G465Y，S466A，S466C， S466D，S466G，S466H，S466K，S466L，S466M，S466N，S466T，S466W，S466Y，D467E， D467G，D467L，Y469A，Y469D，Y469E，Y469I，Y469M，Y469N，Y469R，Y469S，Y469T， Y469V，Y469W，A470S，A470V，T471A，T471C，T471E，T471G，T471H，T471I，T471L， T471M，T471N，T471S，T471V，T471W，P473C，P473D，P473E，P473G，P473I，P473K， P473L，P473R，P473T，P473W，V474A，V474C，V474L，V474S，N475A，N475C，N475E， N475F，N475H，N475K，N475L，N475M，N475P，N475Q，N475R，N475S，N475T，N475V， G476A，G476D，G476E，G476F，G476H，G476I，G476L，G476M，G476N，G476P，G476Q， G476R，G476S，G476T，G476V，G476W，G476Y，G477A，G477D，G477F，G477H，G477I， G477K，G477L，G477M，G477Q，G477S，G477T，G477V，G477W，G477Y，V479C，V479D， V479E，V479F，V479H，V479I，V479N，V479P，V479Y，S480A，S480C，S480H，V481A， V481C，V481N，W482Y，V483A，V483G，V483I，V483K，V483L，V483M，V483R，V483Y， Q484A，Q484C，Q484F，Q484G，Q484H，Q484K，Q484L，Q484M，Q484P，Q484R，Q484T， 和Q484Y。
剂量响应筛选结果
对具有性能增强的突变的变体的子集进行更严格的测试以展示在多 个蛋白质浓度下相对于野生型改善的活性(即，改善的比活性)。图 20示出了在高温下具有改善的玉米淀粉水解的变体的示例。图21示出 了具有改善的水解来自玉米的支链淀粉的变体的示例。图22示出了具 有改善的从淀粉生产还原糖的变体的示例。图23示出了具有改善的从 淀粉释放碘染色材料的变体示例。在图20-23中，与图相邻的图例指明 了除了在对照变体CspAmy2-C18P中存在的那些突变之外存在的突 变。图24示出了展示出相比于CspAmy2-C18P对照改善的玉米浆液粘 性减少的变体示例。CspAmy2-C16F也被纳入比较。
实施例15
在位置476和477处突变的成对组合
构建位点评估文库并筛选以测定在变体CspAmy2-C16F(带有突 变N126Y、F153W、T180H、I203Y、和S241Q并缺失R178和G179 的CspAmy2)中位置476和477处突变的成对组合的效应。图25中的 矩阵示出了在如上所述的CS-26玉米淀粉微样本测定中，CspAmy2- C16F的位置476/477变体相比于CspAmy2-C16F对照(PI值设定为 1)的PI值。将位置476和477处的氨基酸残基分别标明在矩阵的左侧 和顶端。用实验方法得到的“野生型”回复突变体(即， G476G/G477G)的PI值为1.01，表明所述测定产生了非常可靠的结 果。在矩阵中一个位置处的数字缺失表明特定变体的表达很低或所述变 体不在被测试的那些其间。在图26中矩阵示出了在如上所述的直链淀 粉水解测定中相同变体的PI值。同样，用实验方法得到的“野生型” 回复突变体(即，G476G/G477G)的PI值对应于对照的PI值。
显著地，所述结果表明在位置476和477处的几乎任何残基组合， 除了在CspAmy2(和许多α-淀粉酶中)天然存在的甘氨酸对外，就改 善不溶性支链淀粉的水解和改善从水合淀粉释放碘染色材料方面而言， 增强了所述α-淀粉酶的性能。不受理论的束缚，据信在α-淀粉酶的C 末端的相邻GG残基有助于结合淀粉。虽然在有限底物情况下与底物结 合紧密可为理想的性质，但在工业应用中更期望酶在水解淀粉分子后从 淀粉分子释放并找到不同的淀粉分子来水解，而不是与第一个淀粉分子 保持结合并将其陆续水解。
实施例16
另外的基于C18P的在二次液化中具有优异性能的变体
构建位点评估文库(SELs)并进行筛选以测定在CspAmy2-C18P 中在位置E132、Q167、A277、和T400处突变的效应。在表6中示出 了在最佳测试变体中这些位置处存在的残基。
表6：测试的突变组合
名称 E132 A277 Q167 T400
C16F E A Q T
C25F H F Q T
C25B H F E T
C25A H F E K
在图27中示出了在液化测定中相比于C18F，CspAmy2-C25A、 B、和F的相对性能。在位置132和277处的突变增加了性能。从位置 167处的突变观察到了其他有益效果。在另外的实验中，显示出在pH 5.2和5.8，有或没有附加的钙的条件下C25B展示出比C16F优异的液 化性能。变体CspAmy2-C25A、B、和F全都胜过变体CspAmy2- C18P(未示出)。
下面示出了成熟CspAmy2-C25A淀粉酶多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:25[相关的置换带下划线]：
下面示出了成熟CspAmy2-C25B淀粉酶多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:26[相关的置换带下划线]：
下面示出了成熟CspAmy2-C25F淀粉酶多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:27[相关的置换带下划线]：
实施例17
在清洁应用中具有优异性能的基于CspAmy2-v5的另外的变体
制备基于CspAmy2-v5的另外的变体以努力进一步改善在清洁应用 中的性能。在表7中示出了所述变体和突变。先前在实施例11中描述 了CspAmy2-v171和CspAmy2-172。所有变体包括在位置R178和 G179处的缺失，用“del(R178，G179)”标明。
表7.基于CspAmy2-v5的另外的变体
在基本如上所述进行的微样本清洁测定中分析经纯化的变体的清洁 性能。将CFT CS-28样本打孔以形成测量直径为5.5mm的圆片。将两 个圆片放置在3个平底非结合96孔测定板的每个孔中。用稀释缓冲液 (50mM MOPS(pH 7.2)和0.005％TWEEN)将CspAmy2变体、和ACE-QK各自稀释至0.5mg/mL，然后在微孔板中 进一步稀释至18ppm。在微孔板中进行若干次稀释后，降至 0.27ppm。向三个样本板中添加这些样品各自10μL，并且向每孔中添 加170μL的HEPES缓冲液(25mM HEPES，pH 8.0，含2mM CaCl2 和0.005％TWEEN-80)至总体积为180μL。最终酶浓度在1ppm低至 0.015ppm的范围内。将板在25℃下以1150rpm搅拌孵育15分钟。通 过释放到洗涤液体中的颜色量来判断酶性能。通过将140μL的最终洗 涤溶液转移至新鲜培养基结合微孔板，用定量分光光度法在488nm处 对颜色释放进行定量，并且将三次读数减去空白并取平均值。
图28中示出了在0.015ppm酶下进行的微样本清洁测定的结果。 与CspAmy2-v5相比，变体CspAmy2-v179、v186、和v191都展示出 优异清洁性能，并且所有的CspAmy2组合变体远远优于表8中示出了在所有酶浓度下进行的清洁测定的结 果。与相比，所有的CspAmy2展示了在更低浓度下的 优异清洁性能。
表8.使用CspAmy2变体进行的清洁测定的结果
基本上如所述进行热稳定性测定。用稀释缓冲液(50mM MOPS (pH 7.2)和0.005％TWEEN)将CspAmy2变体、 和ACE-QK的0.5mg/mL的原液分别稀释至5ppm、10ppm、或1ppm 以解释其在可溶性底物上的相对比活性。向PCR管的12个孔中的每个 中添加每种酶50μL并密封。在整个实验的持续时间中，将“未经应激 的”样品在室温下孵育。将其它样品在热循环仪中以77℃至97℃的温 度梯度孵育15分钟。将样品一式三份转移至微孔板，并且使用 Ceralpha试剂(Megazyme，Inc.)测量所有未经应激的和经过应激的 样品上的α-淀粉酶活性。通过将热应激后每种淀粉酶的活性除以未经 应激处理的淀粉酶活性来计算残余活性。
图29中示出了热稳定性测定的结果。与CspAmy2-v5相比，变体 CspAmy2-v186和v191均展示出优异的热稳定性。与和 ACE-QK相比，所有的CspAmy2变体展示出优异的热稳定性。
在若干商业洗涤剂中测试了CspAmy2变体的洗涤剂中储存稳定 性，即，针对美国市场的常规HDL和PODSTM(Procter &Gamble)，针对欧洲市场的ARIELTM HDL(Procter&Gamble)和 OMO Color HDL(Unilever)，和针对中国市场的OMOTM (Unilever)和LIBYTM HDL(Liby)。将所有洗涤剂在90℃下加热灭 活4小时以消除现有的酶活性。使用分别用于测量蛋白酶和淀粉酶活性 的Suc-AAPF-pNA和Ceralpha测定来测量经加热灭活的洗涤剂中的酶 活性。
为制备稳定性样品，将2％w/w的蛋白酶(Prime HA，DuPont Industrial Biosciences)和0.5％w/w的淀粉酶添加到每种 洗涤剂样品并混合。将样品在37℃下的CO2培养箱(Sanyo)中储存 28天。在不同时间点从每个反应样品取等分试样，用含1％BSA的 50mM MOPS(pH 7.15)缓冲液稀释，使用Ceralpha底物 (Megazyme，Inc)测量α-淀粉酶活性。使用校准的标准品，使用 Arena 20XT Photometric Analyzer(Thermo Scientific)测定每个样品 的活性。以零时测定的总活性的百分比报告孵育28天后剩余的活性。
图30-35中示出了CspAmy2变体相比于和ACE- QK的残余活性量。与其它被测试的变体和对照相比，CspAmy2-v179 尤其稳定。
下面示出了成熟CspAmy2-v179的氨基酸序列为SEQ ID NO：28：
AATNGTMMQYFEWYVPNDGQQWNRLRTDAPYLSSVGITAVWTPPAYKGTSQADVGYGPY DLYDLGEFNQKGTVRTKYGTKGELKSAVNTLHSNGIQVYGDVVMNHKAGADYTENVTAV EVNPSNRYQETSGEYNIQAWTGFNFPGRGTTYSNFKWQWFHFDGTDWDQSRSLSRIFKF DGKAWDWPVSSENGNYDYLMYADYDYDHPDVVNEMKKWGVWYANEVGLDGYRLDAVKHI KFSFLKDWVDNARAATGKEMFTVGEYWQNDLGALNNYLAKVNYNQSLFDAPLHYNFYAA STGGGDYDMRNILNNTLVASNPTKAVTLVENHDTQPGQSLESTVQPWFKPLAYAFILTR SGGYPSVFYGDMYGTKGTTTREIPALKSKIEPLLKARKDYAYGTQRDYIDNPDVIGWTR EGDSTKAKSGLATVITDGPGGSKRMYVGTSNAGEIWYDLTGNRTDKITIGSDGYATFPV NTESVSVWVQQ
下面示出了成熟CspAmy2-v180的氨基酸序列为SEQ ID NO：29：
AATNGTMMQYFEWYVPNDGQQWNRLRTDAPYLSSVGITAVWTPPAYKGTSQADVGYGPY DLYDLGEFNQKGTVRTKYGTKGELKSAVNTLHSNGIQVYGDVVMNHKAGADYTENVTAV EVNPSNRYQETSGEYNIQAWTGFNFPGRGTTYSNFKWQWFHFDGTDWDQSRSLSRIFKF DGKAWDWPVSSENGNYDYLMYADYDYDHPDVVNEMKKWGVWYANEVGLDGYRLDAVKHI KFSFLKDWVDNARAATGKEMFTVGEYWQNDLGALNNYLAKVNYNQSLFDAPLHYNFYAA STGGGDYDMRNILNNTLVASNPTKAVTLVENHDTQPGQSLESTVQPWFKPLAYAFILTR SGGYPSVFYGDMYGTKGTTTREIPALKSKIEPLLKARKDYAYGTQRDYIDNPDVIGWTR EGDSTKAKSGLATVITDGPGGSKRMYVGTSNAGEIWYDLTGNRTDKITIGSDGYATFPV EGQSVSVWVQQ
下面示出了成熟CspAmy2-v181的氨基酸序列为SEQ ID NO：30：
AATNGTMMQYFEWYVPNDGQQWNRLRTDAPYLSSVGITAVWTPPAYKGTSQADVGYGPY DLYDLGEFNQKGTVRTKYGTKGELKSAVNTLHSNGIQVYGDVVMNHKAGADYTENVTAV EVNPSNRYQETSGEYNIQAWTGFNFPGRGTTYSNFKWQWFHFDGTDWDQSRSLSRIFKF DGKAWDWPVSSENGNYDYLMYADYDYDHPDVVNEMKKWGVWYANEVGLDGYRLDAVKHI KFSFLKDWVDNARAATGKEMFTVGEYWQNDLGALNNYLAKVNYNQSLFDAPLHYNFYAA STGGGDYDMRNILNNTLVASNPTKAVTLVENHDTQPGQSLESTVQPWFKPLAYAFILTR SGGYPSVFYGDMYGTKGTTTREIPALKSKIEPLLKARKDYAYGTQRDYIDNPDVIGWTR EGDSTKAKSGLATVITDGPGGSKRMYVGTSNAGEIWYDLTGNRTDKITIGSDGYATFPV ETRSVSVWVQQ
下面示出了成熟CspAmy2-v186的氨基酸序列为SEQ ID NO：31：
AATNGTMMQYFEWYVPNDGQQWNRLRTDAPYLSSVGINAVWTPPAYKGTSQADVGYGPY DLYDLGEFNQKGTVRTKYGTKGELKSAVHTLHSNGIQVYGDVVMNHKAGADYTENVTAV EVNPSNRYQEISGEYMIQAWTGFNFPGRGTTYSNWKWQWFHFDGTDWDQSRSRSRIFKF DGKAWDWPVSSENGNYDYLMYADYDYDHPDVVNEMKKWGVWYANEVGLDGYRLDAVKHI KFSFLKDWVDNARAATGKEMFTVGEYWQNDLGALNNYLAKVNYNQSLFDAPLHYNFYAA STGGGYYDMRNILNNTLVASNPTKAVTLVENHDTQPGQSLESTVQPWFKPLAYAFILTR SGGYPSVFYGDMYGTKGTTTREIPALKSKIEPLLKARKDYAYGTQRDYIDNPDVIGWTR EGDSTKAKSGLATVITDGPGGSKRMYVGTSNAGEIWYDLTGNRTDKITIGSDGYATFPV NKESVSVWVQQ
下面示出了成熟CspAmy2-v191的氨基酸序列为SEQ ID NO：32：
AATNGTMMQYFEWYVPNDGQQWNRLRTDAPYLSSVGITAVWTPPAYKGTSQADVGYGPY DLYDLGEFNQKGTVRTKYGTKGELKSAVNTLHSNGIQVYGDVVMNHKAGADYTENVTAV EVNPSNRYQETSGHYNIQAWTGFNFPGRGTTYSNFKWQWFHFDGTDWDQSRSLSRIFKF DGKAWDWPVSSENGNYDYLMYADYDYDHPDVVNEMKKWGVWYANEVGLDGYRLDAVKHI KFSFLKDWVDNARAATGKEMFTVGEYWQNDLGALNNYLAKVNYNQSLFDAPLHYNFYAA STGGGDYDMRNILNNTLVASNPTKAVTLVENHDTQPGQSLESTVQPWFKPLAYAFILTR SGGYPSVFYGDMYGTKGTTTREIPALKSKIEPLLKARKDYAYGTQRDYIDNPDVIGWTR EGDSTKAKSGLATVITDGPGGSKRMYVGTSNAGEIWYDLTGNRTDKITIGSDGYATFPV NTESVSVWVQQ
实施例18
PcuAmy1的组合变体
为了确定在不同α-淀粉酶分子中等同形式的组合突变是否导致类 似的性能增益，在来自解凝乳类芽孢杆菌(Paenibacillus curdlanolyticus)的α-淀粉酶(即，PcuAmy1)中生成等同形式的突 变。下面示出了成熟PcuAmy1多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：3)：
ADNGTIMQYFEWYLPNDGAHWNRLNNDAQNLKNVGITAVWIPPAYKGGSSADVGYGVYD TYDLGEFNQKGTVRTKYGTKSELISAVNNLHAKGIAVYGDVVLNHRMNADATELVDAVE VDPNNRNVETTSTYQIQAWTQYDFPGRGNTYSSFKWRWYHFDGVDWDQSRGLNRIYKLR GDGKDWDWEVDSEYGNYDYLMGADLDFNHPDVVNETKTWGKWFVNTVNLDGVRLDAVKH IKFDFMRDWVNNVRSTTGKNLFAVGEYWHYDVNKLNSYITKTNGTMSLFDVPLHFRFYD ASNGGGGYDMRNLLNNTLMSSNPMKAVTFVENHDTQPTQALQSTVQSWFKPLAYATILT REQGYPCVFYGDYYGTSDGKISSYKPIMDKLLNARKVYAYGTQRDYFDHPDIVGWTREG DAAHAGSGLATLITDGPGGSKWMYVGTSKAGQVWTDKTGNRSGTVTIDANGWGNFWVNG GSVSVWAK
在位置N125、F152、R177、G178、E186、G472、和G473处 (使用SEQ ID NO：3来编号)生成突变，分别对应于CspAmy2 (SEQ ID NO：1)中位置N126、F153、R178、G179、E187P、 G476、和G477处的突变。在位置N205处引入另外的突变。与先前的 命名一致，“del(R177，G178)”在这种情况下是指位置R177和 G178处的缺失。除前述突变之外，PcuAmy1变体还包括在位置 T333、A335、和Q337E处的突变。这些突变，特别是在T333处，赋 予PcuAmy1蛋白酶抗性但不影响性能(参见实施例19)。表9中示出 了所述变体。
表9.PcuAmy1淀粉酶的组合变体
PcuAmy1基因的密码子优化的核苷酸序列如SEQ ID NO：33所 示：
GCCGACAACGGCACAATCATGCAGTATTTCGAGTGGTACCTGCCGAACGACGGAGCGCA CTGGAACAGACTTAATAACGACGCACAAAACCTGAAAAATGTGGGCATCACGGCAGTGT GGATTCCTCCGGCATACAAGGGCGGCAGCTCAGCAGATGTTGGCTACGGAGTTTACGAT ACATACGACCTGGGCGAGTTCAATCAGAAAGGCACGGTCAGAACAAAGTACGGAACGAA GAGCGAACTGATTTCAGCGGTCAACAATCTTCACGCAAAGGGCATTGCGGTTTACGGCG ACGTGGTCCTGAACCATAGAATGAATGCGGATGCAACGGAGCTTGTGGATGCGGTTGAG GTGGATCCGAACAACAGAAACGTCGAGACGACAAGCACGTATCAGATCCAGGCATGGAC GCAATACGATTTCCCGGGCAGAGGCAACACGTACAGCAGCTTTAAATGGAGATGGTATC ACTTCGACGGCGTCGACTGGGACCAGAGCAGAGGCCTGAACAGAATCTATAAGCTGAGA GGCGATGGCAAGGATTGGGACTGGGAGGTCGACAGCGAGTACGGCAACTACGATTACCT GATGGGAGCGGACCTGGACTTCAACCACCCGGATGTGGTTAACGAAACAAAGACATGGG GCAAATGGTTTGTGAACACGGTGAACCTGGATGGCGTCAGACTGGACGCGGTTAAGCAC ATCAAGTTCGACTTCATGAGAGACTGGGTGAACAACGTGAGAAGCACGACGGGCAAGAA CCTTTTCGCAGTTGGCGAGTATTGGCACTACGACGTGAACAAACTGAACAGCTACATCA CGAAGACGAATGGCACGATGAGCCTGTTCGACGTGCCGCTGCACTTTAGATTTTATGAT GCAAGCAACGGCGGAGGCGGCTACGACATGAGAAACCTGCTGAATAACACGCTGATGAG CAGCAACCCGATGAAGGCGGTTACATTCGTTGAGAACCATGACACACAACCGACGCAGG CCCTGCAATCAACGGTCCAAAGCTGGTTTAAGCCGCTTGCGTATGCTACAATCCTGACG AGAGAGCAAGGCTACCCGTGCGTTTTCTACGGCGACTATTATGGAACAAGCGACGGCAA AATTAGCAGCTACAAGCCGATCATGGATAAGCTTCTTAACGCGAGAAAGGTGTACGCCT ACGGCACGCAGAGAGATTACTTCGATCATCCGGACATCGTTGGCTGGACAAGAGAAGGC GATGCAGCACATGCTGGCTCAGGACTGGCAACGCTTATCACAGATGGCCCTGGCGGAAG CAAGTGGATGTATGTTGGAACGTCAAAGGCAGGCCAGGTCTGGACGGATAAAACAGGAA ACAGAAGCGGAACGGTGACGATTGATGCCAATGGCTGGGGAAACTTTTGGGTTAATGGC GGATCAGTTAGCGTTTGGGCAAAATAA
下面示出了成熟PcuAmy1-v1A多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO：34：
ADNGTIMQYFEWYLPNDGAHWNRLNNDAQNLKNVGITAVWIPPAYKGGSSADVGYGVYD TYDLGEFNQKGTVRTKYGTKSELISAVNNLHAKGIAVYGDVVLNHRMNADATELVDAVE VDPNNRYVETTSTYQIQAWTQYDFPGRGNTYSSFKWRWYHFDGVDWDQSRGLNRIYKLD GKDWDWPVDSEYGNYDYLMGADLDFNHPDVVNETKTWGKWFVNTVNLDGVRLDAVKHIK FDFMRDWVNNVRSTTGKNLFAVGEYWHYDVNKLNSYITKTNGTMSLFDVPLHFRFYDAS NGGGGYDMRNLLNNTLMSSNPMKAVTFVENHDTQPGQSLESTVQSWFKPLAYATILTRE QGYPCVFYGDYYGTSDGKISSYKPIMDKLLNARKVYAYGTQRDYFDHPDIVGWTREGDA AHAGSGLATLITDGPGGSKWMYVGTSKAGQVWTDKTGNRSGTVTIDANGWGNFWVNKGS VSVWAK
下面示出了成熟PcuAmy1-v6多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO： 35：
ADNGTIMQYFEWYLPNDGAHWNRLNNDAQNLKNVGITAVWIPPAYKGGSSADVGYGVYD TYDLGEFNQKGTVRTKYGTKSELISAVNNLHAKGIAVYGDVVLNHRMNADATELVDAVE VDPNNRYVETTSTYQIQAWTQYDFPGRGNTYSSWKWRWYHFDGVDWDQSRGLNRIYKLD GKDWDWPVDSEYGNYDYLMGADLDFNHPDVVNETKTWGKWFVNTVNLDGVRLDAVKHIK FDFMRDWVNNVRSTTGKNLFAVGEYWHYDVNKLNSYITKTNGTMSLFDVPLHFRFYDAS NGGGGYDMRNLLNNTLMSSNPMKAVTFVENHDTQPGQSLESTVQSWFKPLAYATILTRE QGYPCVFYGDYYGTSDGKISSYKPIMDKLLNARKVYAYGTQRDYFDHPDIVGWTREGDA AHAGSGLATLITDGPGGSKWMYVGTSKAGQVWTDKTGNRSGTVTIDANGWGNFWVNKGS VSVWAK
下面示出了成熟PcuAmy1-v8多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO：36：
ADNGTIMQYFEWYLPNDGAHWNRLNNDAQNLKNVGITAVWIPPAYKGGSSADVGYGVYD TYDLGEFNQKGTVRTKYGTKSELISAVNNLHAKGIAVYGDVVLNHRMNADATELVDAVE VDPNNRYVETTSTYQIQAWTQYDFPGRGNTYSSWKWRWYHFDGVDWDQSRGLNRIYKLD GKDWDWPVDSEYGNYDYLMGADLDFNHPDVVNETKTWGKWFVNTVNLDGVRLDAVKHIK FDFMRDWVNNVRSTTGKNLFAVGEYWHYDVNKLNSYITKTNGTMSLFDVPLHFRFYDAS NGGGGYDMRNLLNNTLMSSNPMKAVTFVENHDTQPGQSLESTVQSWFKPLAYATILTRE QGYPCVFYGDYYGTSDGKISSYKPIMDKLLNARKVYAYGTQRDYFDHPDIVGWTREGDA AHAGSGLATLITDGPGGSKWMYVGTSKAGQVWTDKTGNRSGTVTIDANGWGNFWVNRRS VSVWAK
下面示出了成熟PcuAmy1-v16多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO：37：
ADNGTIMQYFEWYLPNDGAHWNRLNNDAQNLKNVGITAVWIPPAYKGGSSADVGYGVYD TYDLGEFNQKGTVRTKYGTKSELISAVNNLHAKGIAVYGDVVLNHRMNADATELVDAVE VDPNNRYVETTSTYQIQAWTQYDFPGRGNTYSSWKWRWYHFDGVDWDQSRGLNRIYKLD GKDWDWPVDSEYGNYDYLMGADLDFDHPDVVNETKTWGKWFVNTVNLDGVRLDAVKHIK FDFMRDWVNNVRSTTGKNLFAVGEYWHYDVNKLNSYITKTNGTMSLFDVPLHFRFYDAS NGGGGYDMRNLLNNTLMSSNPMKAVTFVENHDTQPGQSLESTVQSWFKPLAYATILTRE QGYPCVFYGDYYGTSDGKISSYKPIMDKLLNARKVYAYGTQRDYFDHPDIVGWTREGDA AHAGSGLATLITDGPGGSKWMYVGTSKAGQVWTDKTGNRSGTVTIDANGWGNFWVNKGS VSVWAK
图36中示出了PcuAmy1-v1、PcuAmy1-v6、和PcuAmy1-v16相 比于和ACE-QK的清洁性能。如实施例17中所述进行 微样本测定。在低剂量(例如，0.1ppm酶或更少)下PcuAmy1-v6和 PcuAmy1-v16胜过PcuAmy1-v1和
图37示出了PcuAmy1-v1、PcuAmy1-v6、和PcuAmy1-v16相比 于的热稳定性。如实施例17中所述进行测定。使用相 同的洗涤剂和酶剂量，PcuAmy1-v16比其它被测试的分子更热稳定。
实施例19
BASE中的组合变体
如实施例18，为确定在不同α-淀粉酶分子中等同形式的组合突变 是否导致类似的性能增益，在来自芽孢杆菌属TS-23的α-淀粉酶中生 成等同形式的突变。下面示出了BASE，芽孢杆菌属TS-23的α-淀粉酶 的C末端截短型式(参见，例如，US20120045817和 WO2010/115028)的氨基酸序列SEQ ID NO:5：
NTAPINETMMQYFEWDLPNDGTLWTKVKNEAANLSSLGITALWLPPAYKGTSQ SDVGYGVYDLYDLGEFNQKGTIRTKYGTKTQYIQAIQAAKAAGMQVYADVVFN HKAGADGTEFVDAVEVDPSNRNQETSGTYQIQAWTKFDFPGRGNTYSSFKWRW YHFDGTDWDESRKLNRIYKFRSTGKAWDWEVDTENGNYDYLMFADLDMDHPEV VTELKNWGTWYVNTTNIDGFRLDAVKHIKYSFFPDWLTYVRNQTGKNLFAVGE FWSYDVNKLHNYITKTNGSMSLFDAPLHNNFYTASKSSGYFDMRYLLNNTLMK DQPSLAVTLVDNHDTQPGQSLQSWVEPWFKPLAYAFILTRQEGYPCVFYGDYY GIPKYNIPGLKSKIDPLLIARRDYAYGTQRDYIDHQDIIGWTREGIDTKPNSG LAALITDGPGGSKWMYVGKKHAGKVFYDLTGNRSDTVTINADGWGEFKVNGGS VSIWVAK
编码BASE(AmyTS23t)的成熟形式的密码子修饰的核酸序列
如SEQ ID NO：38所示：
在BASE中位置N128、T134、F155、T182、R180、S181、E189、和G475处 (使用SEQ ID NO：5来编号)生成突变，其分别对应于CspAmy2(SEQ ID NO：1) 中位置N126、E132、F153、R178、G179、E187P、和G476处的突变。表10中示 出了所述变体。
表10.BASE淀粉酶的组合变体
变体 突变
BASE-V28 del(R180，G181)+N128Y+E189P+G475R
BASE-V29 del(R180，G181)+F155W+E189P+G475R
BASE-V30 del(R180，G181)+T134E+T182H+E189P+G475R
BASE-V31 del(R180，G181)+N128Y+T134E+T182H+E189P+G475R
BASE-V32 del(R180，G181)+N128Y+F155W+E189P+G475R
BASE-V33 del(R180，G181)+T134E+F155W+T182H+E189P+G475R
BASE-V34 del(R180，G181)+N128Y+T134E+F155W+T182H+E189P+G475R
BASE-V35 del(R180，G181)+N 128Y+T134H+F155W+T182D+E189P+G475R
BASE-V36 del(R180，G181)+N128Y+T134E+F155W+T182G+E189P+G457R
ACE-QK del(R180，G181)+S243Q+G475K
下面示出了BASE-V28的氨基酸序列为SEQ ID NO：39：
NTAPINETMMQYFEWDLPNDGTLWTKVKNEAANLSSLGITALWLPPAYKGTSQS DVGYGVYDLYDLGEFNQKGTIRTKYGTKTQYIQAIQAAKAAGMQVYADVVFNHK AGADGTEFVDAVEVDPSNRYQETSGTYQIQAWTKFDFPGRGNTYSSFKWRWYHF DGTDWDESRKLNRIYKFTGKAWDWPVDTENGNYDYLMFADLDMDHPEVVTELKN WGTWYVNTTNIDGFRLDAVKHIKYSFFPDWLTYVRNQTGKNLFAVGEFWSYDVN KLHNYITKTNGSMSLFDAPLHNNFYTASKSSGYFDMRYLLNNTLMKDQPSLAVT LVDNHDTQPGQSLQSWVEPWFKPLAYAFILTRQEGYPCVFYGDYYGIPKYNIPG LKSKIDPLLIARRDYAYGTQRDYIDHQDIIGWTREGIDTKPNSGLAALITDGPG GSKWMYVGKKHAGKVFYDLTGNRSDTVTINADGWGEFKVNRGSVSIWVAK
下面示出了BASE-V29的氨基酸序列为SEQ ID NO：40：
NTAPINETMMQYFEWDLPNDGTLWTKVKNEAANLSSLGITALWLPPAYKGTSQS DVGYGVYDLYDLGEFNQKGTIRTKYGTKTQYIQAIQAAKAAGMQVYADVVFNHK AGADGTEFVDAVEVDPSNRNQETSGTYQIQAWTKFDFPGRGNTYSSWKWRWYHF DGTDWDESRKLNRIYKFTGKAWDWPVDTENGNYDYLMFADLDMDHPEVVTELKN WGTWYVNTTNIDGFRLDAVKHIKYSFFPDWLTYVRNQTGKNLFAVGEFWSYDVN KLHNYITKTNGSMSLFDAPLHNNFYTASKSSGYFDMRYLLNNTLMKDQPSLAVT LVDNHDTQPGQSLQSWVEPWFKPLAYAFILTRQEGYPCVFYGDYYGIPKYNIPG LKSKIDPLLIARRDYAYGTQRDYIDHQDIIGWTREGIDTKPNSGLAALITDGPG GSKWMYVGKKHAGKVFYDLTGNRSDTVTINADGWGEFKVNRGSVSIWVAK
下面示出了BASE-V30的氨基酸序列为SEQ ID NO：41：
NTAPINETMMQYFEWDLPNDGTLWTKVKNEAANLSSLGITALWLPPAYKGTSQS DVGYGVYDLYDLGEFNQKGTIRTKYGTKTQYIQAIQAAKAAGMQVYADVVFNHK AGADGTEFVDAVEVDPSNRNQETSGEYQIQAWTKFDFPGRGNTYSSFKWRWYHF DGTDWDESRKLNRIYKFHGKAWDWPVDTENGNYDYLMFADLDMDHPEVVTELKN WGTWYVNTTNIDGFRLDAVKHIKYSFFPDWLTYVRNQTGKNLFAVGEFWSYDVN KLHNYITKTNGSMSLFDAPLHNNFYTASKSSGYFDMRYLLNNTLMKDQPSLAVT LVDNHDTQPGQSLQSWVEPWFKPLAYAFILTRQEGYPCVFYGDYYGIPKYNIPG LKSKIDPLLIARRDYAYGTQRDYIDHQDIIGWTREGIDTKPNSGLAALITDGPG GSKWMYVGKKHAGKVFYDLTGNRSDTVTINADGWGEFKVNRGSVSIWVAK
下面示出了BASE-V31的氨基酸序列SEQ ID NO：42：
NTAPINETMMQYFEWDLPNDGTLWTKVKNEAANLSSLGITALWLPPAYKGTSQS DVGYGVYDLYDLGEFNQKGTIRTKYGTKTQYIQAIQAAKAAGMQVYADVVFNHK AGADGTEFVDAVEVDPSNRYQETSGEYQIQAWTKFDFPGRGNTYSSFKWRWYHF DGTDWDESRKLNRIYKFHGKAWDWPVDTENGNYDYLMFADLDMDHPEVVTELKN WGTWYVNTTNIDGFRLDAVKHIKYSFFPDWLTYVRNQTGKNLFAVGEFWSYDVN KLHNYITKTNGSMSLFDAPLHNNFYTASKSSGYFDMRYLLNNTLMKDQPSLAVT LVDNHDTQPGQSLQSWVEPWFKPLAYAFILTRQEGYPCVFYGDYYGIPKYNIPG LKSKIDPLLIARRDYAYGTQRDYIDHQDIIGWTREGIDTKPNSGLAALITDGPG GSKWMYVGKKHAGKVFYDLTGNRSDTVTINADGWGEFKVNRGSVSIWVAK
下面示出了BASE-V32的氨基酸序列SEQ ID NO：43：
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下面示出了BASE-V33的氨基酸序列SEQ ID NO：44：
NTAPINETMMQYFEWDLPNDGTLWTKVKNEAANLSSLGITALWLPPAYKGTSQS DVGYGVYDLYDLGEFNQKGTIRTKYGTKTQYIQAIQAAKAAGMQVYADVVFNHK AGADGTEFVDAVEVDPSNRNQETSGEYQIQAWTKFDFPGRGNTYSSWKWRWYHF DGTDWDESRKLNRIYKFHGKAWDWPVDTENGNYDYLMFADLDMDHPEVVTELKN WGTWYVNTTNIDGFRLDAVKHIKYSFFPDWLTYVRNQTGKNLFAVGEFWSYDVN KLHNYITKTNGSMSLFDAPLHNNFYTASKSSGYFDMRYLLNNTLMKDQPSLAVT LVDNHDTQPGQSLQSWVEPWFKPLAYAFILTRQEGYPCVFYGDYYGIPKYNIPG LKSKIDPLLIARRDYAYGTQRDYIDHQDIIGWTREGIDTKPNSGLAALITDGPG GSKWMYVGKKHAGKVFYDLTGNRSDTVTINADGWGEFKVNRGSVSIWVAK
下面示出了BASE-V34的氨基酸序列为SEQ ID NO：45：
NTAPINETMMQYFEWDLPNDGTLWTKVKNEAANLSSLGITALWLPPAYKGTSQS DVGYGVYDLYDLGEFNQKGTIRTKYGTKTQYIQAIQAAKAAGMQVYADVVFNHK AGADGTEFVDAVEVDPSNRYQETSGEYQIQAWTKFDFPGRGNTYSSWKWRWYHF DGTDWDESRKLNRIYKFHGKAWDWPVDTENGNYDYLMFADLDMDHPEVVTELKN WGTWYVNTTNIDGFRLDAVKHIKYSFFPDWLTYVRNQTGKNLFAVGEFWSYDVN KLHNYITKTNGSMSLFDAPLHNNFYTASKSSGYFDMRYLLNNTLMKDQPSLAVT LVDNHDTQPGQSLQSWVEPWFKPLAYAFILTRQEGYPCVFYGDYYGIPKYNIPG LKSKIDPLLIARRDYAYGTQRDYIDHQDIIGWTREGIDTKPNSGLAALITDGPG GSKWMYVGKKHAGKVFYDLTGNRSDTVTINADGWGEFKVNRGSVSIWVAK
下面示出了BASE-V35的氨基酸序列为SEQ ID NO：46：
NTAPINETMMQYFEWDLPNDGTLWTKVKNEAANLSSLGITALWLPPAYKGTSQS DVGYGVYDLYDLGEFNQKGTIRTKYGTKTQYIQAIQAAKAAGMQVYADVVFNHK AGADGTEFVDAVEVDPSNRYQETSGHYQIQAWTKFDFPGRGNTYSSWKWRWYHF DGTDWDESRKLNRIYKFDGKAWDWPVDTENGNYDYLMFADLDMDHPEVVTELKN WGTWYVNTTNIDGFRLDAVKHIKYSFFPDWLTYVRNQTGKNLFAVGEFWSYDVN KLHNYITKTNGSMSLFDAPLHNNFYTASKSSGYFDMRYLLNNTLMKDQPSLAVT LVDNHDTQPGQSLQSWVEPWFKPLAYAFILTRQEGYPCVFYGDYYGIPKYNIPG LKSKIDPLLIARRDYAYGTQRDYIDHQDIIGWTREGIDTKPNSGLAALITDGPG GSKWMYVGKKHAGKVFYDLTGNRSDTVTINADGWGEFKVNRGSVSIWVAK
下面示出了BASE-V36的氨基酸序列SEQ ID NO：47：
NTAPINETMMQYFEWDLPNDGTLWTKVKNEAANLSSLGITALWLPPAYKGTSQS DVGYGVYDLYDLGEFNQKGTIRTKYGTKTQYIQAIQAAKAAGMQVYADVVFNHK AGADGTEFVDAVEVDPSNRYQETSGEYQIQAWTKFDFPGRGNTYSSWKWRWYHF DGTDWDESRKLNRIYKFGGKAWDWPVDTENGNYDYLMFADLDMDHPEVVTELKN WGTWYVNTTNIDGFRLDAVKHIKYSFFPDWLTYVRNQTGKNLFAVGEFWSYDVN KLHNYITKTNGSMSLFDAPLHNNFYTASKSSGYFDMRYLLNNTLMKDQPSLAVT LVDNHDTQPGQSLQSWVEPWFKPLAYAFILTRQEGYPCVFYGDYYGIPKYNIPG LKSKIDPLLIARRDYAYGTQRDYIDHQDIIGWTREGIDTKPNSGLAALITDGPG GSKWMYVGKKHAGKVFYDLTGNRSDTVTINADGWGEFKVNRGSVSIWVAK
图38示出了BASE-V28、V29、V30、V31、V32、V33、V34、和 V35相比于ACE-QK(例如，US20120045817和WO2010/115028)的 热稳定性。所有的BASE变体都比ACE-QK更稳定，尽管BASE-V28 只是稍微更稳定。
实施例19
在RG缺失的分子中残基间的相互作用
在残基132和180(参见用于编号的SEQ ID NO：1)之间的结构 相互作用解释了一些变体的增强的稳定性。图39-42中示出了 CspAmy2-v1的晶体结构细节。如图39中所示，在位置132处天然存 在的谷氨酸侧链朝向在位置180处天然存在的苏氨酸的侧链定位。然而 5.4埃的距离对于形成任何稳定相互作用来说太大了。如图40中所示， T180H变体(例如，CspAmy2-vC16C)的组氨酸咪唑的NH基团位于 E132谷氨酸的羧酸附近。3.2埃的距离允许形成稳定的氢键。在约4.5 至7.0的pH值下，在这些残基之间也可能存在有利的电荷相互作用 (即盐桥)。参见例如，实施例6和实施例7和图8-10，观察到 CspAmy2-C16E比CspAmy2-C16C更稳定，CspAmy2-C16F比 CspAmy2-C16D更稳定，CspAmy2-C16I比CspAmy2-C16G更稳定， 并且CspAmy2-C16J比CspAmy2-C16H更稳定，支持了这一假说，其 中每对变体的区别仅在于突变T180H的存在与否。相似地，参见例 如，实施例17和图29，观察到CspAmy2-v191比CspAmy2-v179更稳 定，支持了这一假说，其中变体对的区别仅在于突变E132H的存在与 否。
如图41中所示，在位置180处的天冬氨酸也能与在位置132处的 谷氨酸氢键合，尽管氢键合可能被不利因素如电荷相互作用压倒。然 而，在位置132处组氨酸的存在，与在位置180处的天冬氨酸组合，恢 复了由T180D突变创建的有利相互作用的可能性(图42)。在 CspAmy2-v191和CspAmy2-C25A、B、和F(其全部具有T180D突 变)中E132H突变的稳定效应支持了这种假说(例如，实施例16和图 27)。
BASE中，位置E132对应于位置T134，并且位置T180对应于位 置T182。观察到BASE-V31比BASE-V28更稳定，并且BASE-V33比 BASE-V29更稳定，这进一步支持了不同α-淀粉酶上下文中的这种假 说。在两种情况下，突变T134E和T180H看起来共同起作用以允许形 成稳定相互作用，如盐桥。相似地，由于在V34中谷氨酸和组氨酸之 间的稳定相互作用，V34比V36更稳定，这种稳定相互作用没有发生 在V36中的谷氨酸和甘氨酸之间。
尽管用“RG”缺失展示了在位置132-180处的相互作用，其完全 可以期待在相邻“DG”或“TG”缺失的上下文中起作用。应当理解保 守的氨基酸序列基序X1G/S1X2G2(SEQ ID NO:48)，例如CspAmy2 α-淀粉酶(SEQ ID NO:1)中的RGTG(SEQ ID NO:49)所例示，与 α-淀粉酶中的钙结合环相邻。X1通常是精氨酸。G/S1是最常见的甘氨 酸，但就BASE而言是丝氨酸。X2是变化的但常见的是天冬氨酸或苏 氨酸。G2是高度保守的。CspAmy2α-淀粉酶中缺失TG，而不是 RG，将意味着保留的残基将为RG而不是TG。虽然精氨酸是来源于 位置178与来自位置180的苏氨酸相对，所得变体的三维结构与具有 RG缺失加R向G的置换的变体别无二致，并且稳定所得分子很简 单：在位置132处选择合适的残基与X1G/S1X2G2基序中等同位置处保 留的无论任何残基形成稳定相互作用，无论其最初是否对应于亲本分子 的位置180或位置178(使用SEQ ID NO:1来编号)。为方便起见， 这个残基可称为前述基序中保留的非G残基。
因此，一般来讲，如果位置132是带负电的(即，D或E)，那么 保留的非G残基将是带正电的(即，H、R、或K)。如果位置132是 带正电的(即，H、R、或K)，那么保留的非G残基将是带负电的 (即，D或E)。
实施例19
PcuAmy1和变体的蛋白酶剪切
将野生型PcuAmy1淀粉酶、或PcuAmy-v1变体与枯草杆菌蛋白酶 孵育导致蛋白质剪切，正如反应产物经受SDS/PAGE电泳时所观察到 的。图43是SDS/PAGE凝胶的图像，显示了在增加量的GG36蛋白酶 (如凝胶上方标明的0至40μg)存在下20μg的PcuAmy1-v1的剪切。 凝胶右侧的字母表示(A)完整的全长PcuAmy1-v1，(B)PcuAmy1- v1的第一剪切产物，(C)GG36蛋白酶，(D)在GG36蛋白制品中 的污染物，和(E)PcuAmy1-v1的第二剪切产物。PcuAmy-v1淀粉酶 与枯草杆菌蛋白酶孵育后观察到的主要降解产物具有约38和16kDa的 分子量(分别为B和E)。蛋白质分解降解的量依赖于所用蛋白酶的浓 度。这使得PcuAmy1淀粉酶对于包含在酶洗涤剂制剂(其包含通常使 用的枯草杆菌蛋白酶)中是次优的。
将PcuAmy-v1蛋白样品与GG36蛋白酶(迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentis)枯草杆菌蛋白酶)孵育，并且通过质谱分析反应产物。结果符 合水解发生在残基Q334和L336之间(未示出)。
为了确定能否工程化PcuAmy的蛋白酶稳定变体，构建了 PcuAmy1-v3和另外的变体3A至3L并进行测试。PcuAmy1-v3是带有 突变E186P、G472K并缺失R177和G178的PcuAmy1变体(使用 SEQ ID NO：3来编号)。置换E186P和在R177和G178处的缺失增加 了PcuAmy1的洗涤剂稳定性。置换G472K改善了清洁性能。这些突 变对蛋白酶敏感性没有任何影响(数据未示出)。因此，在制备以探究 其它突变对蛋白酶稳定性影响的变体中包括这些突变不会对结果产生干 扰。
下面示出了PcuAmy1-v3的成熟形式(SEQ ID NO：50)：
ADNGTIMQYFEWYLPNDGAHWNRLNNDAQNLKNVGITAVWIPPAYKGGSSADVG YGVYDTYDLGEFNQKGTVRTKYGTKSELISAVNNLHAKGIAVYGDVVLNHRMNA DATELVDAVEVDPNNRNVETTSTYQIQAWTQYDFPGRGNTYSSFKWRWYHFDGV DWDQSRGLNRIYKLDGKDWDWPVDSEYGNYDYLMGADLDFNHPDVVNETKTWGK WFVNTVNLDGVRLDAVKHIKFDFMRDWVNNVRSTTGKNLFAVGEYWHYDVNKLN SYITKTNGTMSLFDVPLHFRFYDASNGGGGYDMRNLLNNTLMSSNPMKAVTFVE NHDTQPTQALQSTVQSWFKPLAYATILTREQGYPCVFYGDYYGTSDGKISSYKP IMDKLLNARKVYAYGTQRDYFDHPDIVGWTREGDAAHAGSGLATLITDGPGGSK WMYVGTSKAGQVWTDKTGNRSGTVTIDANGWGNFWVNKGSVSVWAK
为了鉴定PcuAmy1蛋白酶敏感性的原因，将PcuAmy1的氨基酸 序列与显示出蛋白酶抗性的其它CAZy家族GH-13淀粉酶的氨基酸序 列进行比较，其它CAZy家族GH-13淀粉酶诸如ST(地 衣芽孢杆菌淀粉酶或AmyL)、XTRA(嗜热脂肪地芽孢 杆菌(Geobacillus stearothermophilus)淀粉酶或AmyS)、ACE-QK (WO2010/115021)、和(Novozymes)。基于观察到 的序列差异，设计了PcuAmy1变体PcuAmy1-v3A至PcuAmy1-v3L (即，3A-3L)并针对蛋白酶抗性进行测试。表11中列出了每个变体 中存在的突变。它们是使用标准方法导入PcuAmy1-v3(SEQ ID NO： 49)的，其中许多是上面所描述的。
表11.导入PcuAmy1-v3从而产生变体3A至3L的突变列表
位置 wt 3A 3B 3C 3D 3E 3F 3G 3H 3I 3J 3K 3L
319 M T
333 T G G G G G G
335 A S S S S S S
337 Q E E E E E
339 T W
341 Q E
342 S P P P P T
351 T F F W
如上所述在枯草芽孢杆菌中表达12种PcuAmy1变体。将40μL来 自每种PcuAmy1变体培养物培养液的经过滤的上清液与100μg GG36 蛋白酶在室温下孵育6小时，并且随后用Megazyme Ceralpha底物测 定(Megazyme International Ireland，Co.Wicklow，Ireland)分析保 留的淀粉酶活性。将蛋白酶孵育后的残余活性和每种样品在仅与缓冲液 孵育后的淀粉酶活性进行比较。结果示于图44中。也用蛋白质标准品Plus2(Invitrogen)，通过SDS-PAGE分析样品的子集 (图45)。包括可商购获得的淀粉酶用于比较。
在与GG36蛋白酶孵育后，PcuAmy1变体3A、3B、3C、3D、和 3L保持了＞70％的其酶活性。在与GG36蛋白酶孵育后，PcuAmy1变 体3J和3K保持了＞65％的其酶活性。与野生型酶相比，PcuAmy1变 体3E、3F、3G、3H、和3I未显示出可测量的稳定性增强。通过 SDS/PAGE分析3B、3C、3D和3L孵育的样品，显示出当与GG36蛋 白酶孵育时降解产物显著减少，确认了残余淀粉酶活性增加是由于降低 了蛋白酶剪切。
这些小规模实验的结果表明在位置T333处突变的导入显著减少了 PcuAmy1的蛋白酶剪切，在A335、Q337、和S342处的另外的突变进 一步减少了蛋白酶剪切。T351W突变而不是T351F突变也看起来减少 了PcuAmy1的蛋白酶剪切。
为了更好地表征这些突变对蛋白酶抗性的相对贡献，制备了如下所 述另外的变体：
PcuAmy1-v10：del(R177，G178)+E186P+T333G+Q337E+G472K
PcuAmy1-v11：del(R177，G178)+E186P+T333G+A335S+G472K
PcuAmy1-v12：del(R177，G178)+E186P+A335S+Q337E+G472K
PcuAmy1-v13：del(R177，G178)+E186P+T333G+A335S+Q337E+T351W+G472K
变体PcuAmy1-v10，PcuAmy1-v11，和PcuAmy1-v12包括在位置 T333、A335、和Q337处的成对突变组合。PcuAmy1-v3-v13包括在所 有前述位置处的突变并包括另外的突变T351W。在大规模洗涤剂稳定 性测定中将这些变体与下列先前描述过的变体进行比较：
PcuAmy1-v3B：del(R177，G178)+E186P+T333G+A335S+Q337E+G472K
PcuAmy1-v3L：del(R177，G178)+E186P+T333G+A335S+Q337E+S342T+G472K
将商业洗涤剂Total Color(MIFA Ag Frenkendorf， Switzerland)和Omo(Unilever，London，UK)在90℃下加热灭活4 小时以消除现有的酶活性。使用分别用于测量蛋白酶和淀粉酶活性的 Suc-AAPF-pNA和Ceralpha测定来测量经加热灭活的洗涤剂中的酶活 性。为制备稳定性样品，向每种洗涤剂样品中添加2％w/w的蛋白酶 (Prime 4000L，Danisco US Inc.)和0.5％w/w的淀粉 酶并混合。将样品在37℃下的CO2培养箱(Sanyo)中储存14天。在 不同时间点从每个反应样品取等分试样，用含1％BSA的50mM MOPS(pH 7.15)缓冲液稀释，并使用Ceralpha底物(Megazyme， Inc)测量α-淀粉酶活性。使用校准的标准品，使用Arena 20XT Photometric Analyzer(Thermo Scientific)测定每个样品的活性。以零 时测定的总活性的百分比(％)报告在每个时间点保留的活性。
图46-50中示出了在MIFA Total(MIFA Ag Frenkendorf， Switzerland)和Unilever OMO(Unilever，London，UK)中进行的 洗涤剂稳定性测定的结果。图46和图48分别示出了在补充了FNA蛋 白酶的MIFA Total和Unilever Omo中，随时间推移PcuAmy1变体的 残余活性。图47和图49汇总了针对3天和14天时间点的数据。包括 T333突变的PcuAmy1变体，即3B、3L、v10、v13，和较少程度的v 11，是最稳定的。不包括T333突变的变体，即，V1和v12，是最不稳 定的。如v10和v11所证实的那样，Q337E处突变的存在进一步改善了 稳定性。
在微样本清洁测定中分析了经纯化的PcuAmy1-v3B和PcuAmy1- v3L的清洁性能。将在棉布样本上的CFT CS-28稻米淀粉(Center for Testmaterials,BV,Vlaardingen,Netherlands)(其包含结合至淀粉的 指示染料)打孔以形成测量直径为5.5mm的圆片。将两个圆片置于3 个平底非结合96孔测定板的每个孔中。
用稀释缓冲液(50mM MOPS，pH 7.2，0.005％TWEEN)将酶和 两种商业淀粉酶产物：ST(来自地衣芽孢杆菌的α-淀粉 酶；DuPont Industrial Biosciences，Palo Alto，California，USA)， 和(Novozymes，Copenhagen，Denmark)稀释至 0.5mg/mL，然后在微孔板中进一步稀释至2ppm。将200μL的这些样 品转移至三个样本板中每个的第一排。然后将100μL的HEPES缓冲液 (25mM HEPES，pH 8.0，带有2mM CaCl2和0.005％TWEEN-80) 添加至样本板后5排的每个孔中，并且进行系列稀释以使最终酶浓度为 2、1、0.5、0.25、和0.125ppm，以及一排每孔200μL的空白孔(只有 缓冲液)。在25℃下将板以1150rpm搅拌孵育15分钟。将所述洗涤液 体转移至新微孔板，并通过释放至洗涤液体中的颜色量来判断酶性能。 用分光光度法在488nm处对颜色释放进行定量，将三次读数减去空白 并取平均值。
结果示于图50中。PcuAmy1-v3B和PcuAmy1-v3L均展示出极佳 的清洁性能。
将商业洗涤剂Persil Universal Gel Gold(Henkel，Düsseldorf， Germany)在90℃下加热灭活4小时以消除现有的酶活性。在灭活 后，分别使用基于Suc-AAPF-pNA底物的测定和Ceralpha测定 (Megazyme，Wicklow，Ireland)来测量经加热灭活的洗涤剂中的酶 活性以确保消除了任何蛋白酶和淀粉酶活性。然后用水制备10％的洗 涤剂溶液。
将100μL的每种酶原液(0.5mg/mL)添加到400μL的所述10％的 洗涤剂溶液。被测试的酶是 PcuAmy1-v3B和PcuAmy-v3L。向PCR管中添加50μL的酶原液，并 且在60、70、80、或90℃下孵育15分钟。在孵育之前，取出10μL， 在整个实验持续时间室温下孵育以用作“未经应激的”样品。在孵育之 后，每个样品用稀释缓冲液制备另外1:10稀释液。然后将样品一式三 份转移至微孔板，并且使用Ceralpha测定来测量所有未经应激处理和 经应激处理的样品的α-淀粉酶活性。通过将热应激后每种淀粉酶的活 性除以未经应激处理的淀粉酶的活性来计算残余活性。
结果示出于图51和图52中。PcuAmy1-v3B和PcuAmy-v3L展示 出与相比类似的热稳定性，和比明显更好 的稳定性。
虽然出于清晰理解的目的以例证和举例的方式描述了前述组合物和 方法的一些细节，对于本领域的技术人员来说可能进行某些改变和修改 将是显而易见的。因此，本说明书不应理解为是对本发明的范围的限 制，本发明的范围描绘在所附权利要求书中。
本文引用的所有出版物、专利和专利申请据此全文以引用方式并入 用于所有的目的并至相同的程度，如同每个单独的出版物、专利或专利 申请被具体地和单个地标明以引用方式并入一样。

Claims (49)

1.一种亲本α-淀粉酶的重组变体，其包含突变E187P+I203Y+G476K 并缺失氨基酸残基R178和G179，或突变 E187P+I203Y+G476K+R458N+T459S+D460T并缺失氨基酸残基R178 和G179，其中所述亲本α-淀粉酶如SEQ ID NO:1所示并使用SEQ ID NO: 1来编号；并且
其中所述变体与所述亲本α-淀粉酶或参考α-淀粉酶相比具有增强的热稳 定性、洗涤剂稳定性、淀粉液化活性、和/或清洁性能，所述参考α-淀粉酶 与所述α-淀粉酶变体的差别仅为不存在所述突变。
2.一种组合物，其包含根据权利要求1所述的α-淀粉酶变体。
3.根据权利要求2所述的组合物，其中所述组合物有效用于从餐具或纺 织物中去除含淀粉的污渍。
4.根据权利要求3所述的组合物，其中所述所述纺织物是衣物。
5.根据权利要求2或3所述的组合物，其还包含表面活性剂。
6.根据权利要求2或3所述的组合物，其中所述组合物是洗涤剂组合 物。
7.根据权利要求2或3所述的组合物，其中所述组合物是衣物洗涤剂或 衣物洗涤剂添加剂。
8.根据权利要求2或3所述的组合物，其中所述组合物是手动餐具洗涤 剂或自动餐具洗涤剂。
9.根据权利要求2或3所述的组合物，其还包含一种或多种其他的酶， 所述其他的酶选自蛋白酶、半纤维素酶、纤维素酶、脂解酶、木聚糖酶、酯 酶、过水解酶、角质酶、果胶酶、果胶酸裂合酶、甘露聚糖酶、还原酶、氧 化酶、木质酶、支链淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、麦拉宁酶、β-葡聚糖酶、 阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶、阿马多里酶、葡糖淀粉酶、阿拉伯 呋喃糖苷酶、植酸酶、异构酶、转移酶、以及根据权利要求1所述的淀粉酶 之外的淀粉酶。
10.根据权利要求9所述的组合物，其中所述蛋白酶是角蛋白酶、金属 蛋白酶。
11.根据权利要求9所述的组合物，其中所述氧化酶是过氧化物酶、酚 氧化酶、脂氧合酶。
12.根据权利要求11所述的组合物，其中所述酚氧化酶是漆酶。
13.根据权利要求9所述的组合物，其中所述脂解酶是金属脂解酶。
14.根据权利要求9所述的组合物，其中所述酯酶是脂肪酶。
15.根据权利要求14所述的组合物，其中所述脂肪酶是磷脂酶。
16.根据权利要求2所述的组合物，其中所述组合物用于液化淀粉。
17.根据权利要求2所述的组合物，其中所述组合物用于糖化包含淀粉 的组合物、用于SSF后液化、或用于无在先液化的直接SSF。
18.根据权利要求2所述的组合物，其中所述组合物用于制备发酵饮 料。
19.根据权利要求2所述的组合物，其中所述组合物用于制备烘培的食 物产品。
20.根据权利要求2所述的组合物，其中所述组合物用于纺织物退浆。
21.一种用于从表面去除含淀粉的污渍或污垢的方法，该方法包括：
在包含有效量的根据权利要求1所述的α-淀粉酶重组变体的组合物存在 下，接触所述表面，以及
使所述α-淀粉酶重组变体水解含淀粉的污渍中存在的淀粉组分以生成溶 解在含水组合物中的更小的淀粉衍生分子，
从而从所述表面去除所述含淀粉的污渍。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述含水组合物还包含表面活性 剂。
23.根据权利要求21或22所述的方法，其中所述表面是纺织物表面或 餐具表面。
24.根据权利要求21或22所述的方法，其中所述组合物还包含至少一 种其他的酶，所述其他的酶选自蛋白酶、半纤维素酶、纤维素酶、脂解酶、 木聚糖酶、酯酶、过水解酶、角质酶、果胶酶、果胶酸裂合酶、甘露聚糖 酶、还原酶、氧化酶、木质酶、支链淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、麦拉宁 酶、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶、阿马多里酶、葡 糖淀粉酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、植酸酶、异构酶、转移酶、以及根据权利要 求1所述的淀粉酶之外的淀粉酶。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述蛋白酶是角蛋白酶、金属蛋 白酶。
26.根据权利要求24所述的方法，其中所述氧化酶是过氧化物酶、酚氧 化酶、脂氧合酶。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述酚氧化酶是漆酶。
28.根据权利要求24所述的方法，其中所述脂解酶是金属脂解酶。
29.根据权利要求24所述的方法，其中所述酯酶是脂肪酶。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述脂肪酶是磷脂酶。
31.一种用于糖化包含淀粉的组合物以制备包含葡萄糖的组合物的方 法，其中所述方法包括：
(i)使所述包含淀粉的溶液与有效量的根据权利要求1所述的α-淀粉酶 重组变体接触；以及
(ii)使所述包含淀粉的溶液糖化以制备所述包含葡萄糖的组合物，其中 所述α-淀粉酶重组变体催化所述淀粉溶液糖化为葡萄糖或其它富集的碳水化 合物糖浆。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述包含淀粉的组合物包含液化 的淀粉、糊化的淀粉、颗粒状的淀粉、或在低于其胶凝温度的热处理的淀 粉。
33.根据权利要求31或32所述的方法，其中所述方法是同步糖化发酵 反应。
34.根据权利要求31或32所述的方法，其中所述方法还包括使醪液和/ 或糖化醪与淀粉酶接触。
35.根据权利要求31或32所述的方法，该方法还包括向所述淀粉溶液 添加葡糖淀粉酶、己糖激酶、木聚糖酶、葡萄糖异构酶、木糖异构酶、磷酸 酶、植酸酶、支链淀粉酶、β-淀粉酶、非所述α-淀粉酶变体的α-淀粉酶、蛋 白酶、纤维素酶、半纤维素酶、角质酶、异淀粉酶、氧化还原酶、酯酶、转 移酶、果胶酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、或它们的组合。
36.根据权利要求31或32所述的方法，其中所述淀粉酶是由宿主细胞 表达和分泌的。
37.根据权利要求36所述的方法，其中使所述包含淀粉的组合物与所述 宿主细胞接触。
38.根据权利要求36所述的方法，其中所述宿主细胞还表达和分泌一种 或多种选自下列的酶：葡糖淀粉酶、己糖激酶、木聚糖酶、葡萄糖异构酶、 木糖异构酶、磷酸酶、植酸酶、支链淀粉酶、β-淀粉酶、非所述α-淀粉酶变 体的α-淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、半纤维素酶、角质酶、异淀粉酶、氧化 还原酶、酯酶、转移酶、果胶酶、α-葡糖苷酶、和β-葡糖苷酶。
39.根据权利要求36所述的方法，其中所述宿主细胞还表达和分泌葡糖 淀粉酶。
40.根据权利要求36所述的方法，其中所述宿主细胞能够发酵所述组合 物。
41.根据权利要求1所述的α-淀粉酶重组变体在制备包含葡萄糖的组合 物中、在制备液化淀粉中、在制备发酵饮料中、在清洁含淀粉的污渍中、或 在纺织物退浆中的用途。
42.一种纺织物退浆的方法，该方法包括使退浆组合物与已上浆的纺织 物接触足以将所述纺织物退浆的时间，其中所述退浆组合物包含根据权利要 求1所述的α-淀粉酶重组变体。
43.一种分离的多核苷酸，其编码根据权利要求1所述的α-淀粉酶的重 组变体。
44.一种表达载体，其包含根据权利要求43所述的多核苷酸。
45.一种宿主细胞，其包含根据权利要求44所述的表达载体。
46.根据权利要求35所述的方法，其中所述酯酶是脂肪酶。
47.根据权利要求38所述的方法，其中所述酯酶是脂肪酶。
48.根据权利要求1的亲本α-淀粉酶的重组变体，其中所述重组变体的 突变是E187P+I203Y+G476K和缺失氨基酸残基R178和G179，
其中所述亲本α-淀粉酶如SEQ ID NO:1所示并使用SEQ ID NO:1来 编号；并且
其中所述变体与所述亲本α-淀粉酶或参考α-淀粉酶相比具有增强的热稳 定性、洗涤剂稳定性、淀粉液化活性、和/或清洁性能，所述参考α-淀粉酶 与所述α-淀粉酶变体的差别仅为不存在所述突变。
49.根据权利要求1的亲本α-淀粉酶的重组变体，其中所述重组变体的 突变是E187P+I203Y+G476K+R458N+T459S+D460T并缺失氨基酸残基 R178和G179，
其中所述亲本α-淀粉酶如SEQ ID NO:1所示并使用SEQ ID NO:1来 编号；并且
其中所述变体与所述亲本α-淀粉酶或参考α-淀粉酶相比具有增强的热稳 定性、洗涤剂稳定性、淀粉液化活性、和/或清洁性能，所述参考α-淀粉酶 与所述α-淀粉酶变体的差别仅为不存在所述突变。
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