CN101679960A - 在发酵过程中具有改良生产水平的α-淀粉酶的变体 - Google Patents

Abstract

提供芽孢杆菌属物种no.707α淀粉酶的变体，其可以更有效，因此更经济的生产。通过引入促进该变体在发酵肉汤中溶解度的氨基酸变异获得更高的发酵产率。增加的溶解度使更多的酶可以在宿主细胞中表达后保留在溶液中。这反过来增加从发酵肉汤回收表达的变体酶的效率。

Description

在发酵过程中具有改良生产水平的α-淀粉酶的变体

序列表

还附带了包含SEQ ID NOS：1-26的序列表，其在这里以整体引用被并入。

发明领域

本发明公开了编码具有淀粉酶活性的多肽的核酸，其中该多肽是由芽孢杆菌属(Bacillus)α-淀粉酶，特别是第707号芽孢杆菌属物种(Bacillussp.no.707)α-淀粉酶修饰的。

背景技术

淀粉由直链淀粉(15-30％w/w)和支链淀粉(70-85％w/w)的混合物组成。直链淀粉是由具有分子量(MW)从约60,000至约800,000的α-1，4连接的葡萄糖单位的线性链组成。支链淀粉是分支多聚体，其含有相同的α-1，4连接的葡萄糖单位以及每24-30葡萄糖单位的α-1，6分支点，其分子量可以高达1亿。

目前是通过酶催化过程从淀粉产生浓缩的葡萄糖(dextrose)浆形式的的糖，所述催化过程涉及：(1)用α-淀粉酶将固体淀粉液化(或稀薄化)为具有平均聚合度约为7-10的糊精，和(2)用淀粉葡糖苷酶(也称为葡糖淀粉酶)对产生的液化淀粉，即，淀粉水解物，的糖化作用。产生的浆具有高的葡萄糖含量。商业生产的大部分葡萄糖浆随后被酶促异构化为右旋葡萄糖/果糖混合物，称为异构糖浆(isosyrup)。

α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)通过随机切割内在的α-1，4-糖苷键水解淀粉、糖原、和有关的多糖。这些酶具有多种重要的商业应用，包括淀粉液化、纺织品脱浆、在纸和纸浆工业中的淀粉修饰、谷物加工、支持和酿造。α-淀粉酶还可以被用于，包括那些含有漂白剂的自动洗碗机洗涤剂和洗衣洗涤剂的制剂中，用来在清洗过程中除去淀粉污渍。来自第707号芽孢杆菌属物种的α-淀粉酶当用于这些应用时显示尤其优势的作用。可惜的是，与其经济制造和商业应用相伴的，该α-淀粉酶并非以高水平表达。

α-淀粉酶是从多种的细菌、真菌、植物和动物来源分离。许多工业重要的α-淀粉酶分离自芽孢杆菌属物种，部分是由于芽孢杆菌属广泛具有分泌淀粉酶进入生长培养基的高能力。例如，芽孢杆菌属物种A7-7(DSM12368)，以较高水平分泌α-淀粉酶。尽管芽孢杆菌属物种A7-7α-淀粉酶能够经济的产生，该酶的作用不如来自第707号芽孢杆菌属物种的α-淀粉酶。因此，本领域需要以与例如芽孢杆菌属物种A7-7α-淀粉酶可相当的生产水平，表达第707号芽孢杆菌属物种α-淀粉酶的作用更好的变体。这一变体在更有效和经济的洗涤剂制剂或其它制剂中是有用的。

发明概述

本发明提供更有效产生因而更经济的α-淀粉酶的变体。通过引入促进该变体在发酵肉汤中的溶解度的氨基酸变异获得更高的发酵产量。即，增加的溶解度使能够在宿主细胞表达之后的溶液中保留更多的酶。这反过来增加了从发酵肉汤回收表达的变体酶的效率。

在一个实施方案中，该变体的一级结构被修饰以相似于在发酵肉汤中高浓度可溶的α-淀粉酶。该变体可以是高性能的第707号芽孢杆菌属物种α-淀粉酶，其可以被有利的更经济的表达用于清洁制剂等。合适的变体包括在酶表面具有更少疏水性氨基酸残基的那些，所述残基促进该酶在水性溶液中的聚集和沉淀。

因此，目的是提供野生型第一α-淀粉酶的分离的变体和编码核酸，其中

(a)该α-淀粉酶变体包含相对于野生型第一α-淀粉酶的至少一个修饰的氨基酸。

(b)该α-淀粉酶变体呈现α-淀粉酶活性；和

(c)该至少一个修饰的氨基酸与在第二α-淀粉酶的氨基酸序列的对应位置发现的氨基酸相同，其中第二α-淀粉酶比野生型第一α-淀粉酶具有更高的溶解度，和其中该变体α-淀粉酶的氨基酸序列与第二α-淀粉酶有至少一个氨基酸的不同。在一个实施方案中，与野生型第一α-淀粉酶的表达水平相比，该α-淀粉酶变体能够在宿主细胞中以更高水平表达。

该α-淀粉酶变体可以含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35或40个氨基酸修饰，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多的氨基酸。第一野生型α-淀粉酶和第二α-淀粉酶的氨基酸序列可以具有至少60％、80％或90％的序列同一性。在一个实施方案中，野生型第一α-淀粉酶和第二α-淀粉酶是细菌的α-淀粉酶，例如，芽孢杆菌属α-淀粉酶。如非限定性的实例，野生型第一α-淀粉酶可以是第707号芽孢杆菌属物种α-淀粉酶[Tsukamoto.A.，Kimura，K.，Ishii，Y.，Takano，T.和Yamane，K.(1988)Nucleotide sequence of the maltohexaose-producing amylase gene from an alkalophilic bacillus sp.#707andstructural similarity to liquefying typeα-amylases Biochem.Biophys.Res.Commun.151(1)，25-31]，其包含在SEQ ID NO：1提出的氨基酸序列，和/或第二α-淀粉酶可以是芽孢杆菌属物种A7-7(DSM 12368)α-淀粉酶[Bessler，C，Wieland，S.和Maurer，K.H.αamylase variants having anelevated solvent stability，method for the production thereof and detergentsand cleansers containing these αamylase variants.专利：WO2006037484-A13-APR-2006；HENKEL KOMMANDITGESELLSCHAFTAUF AKTIEN(DE)]，其包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3或SEQ IDNO：7或SEQ ID NO：8提出的氨基酸序列。该α-淀粉酶变体的修饰的氨基酸可以选自N28R、S36D、S83N、M116W、R142K、R172Q、H183D、A186G、N251T、S255N、A256T、F441Y、S452R和K485N，例如，N28R、S36D、M116W、R172Q、H183D、S255N和A256T。

目的还为提供包含以上编码核酸的分离的宿主细胞、有效连接于以上该分离核酸的载体和包含该相同载体的分离的宿主细胞。该分离的宿主细胞可以是微生物，例如，细菌或真菌。合适的宿主细胞可以选自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、迟缓芽孢杆菌(B.lentus)、短芽孢杆菌(B.brevis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)、嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、凝固芽孢杆菌(B.coagulans)、环状芽孢杆菌(B.circulans)、灿烂芽孢杆菌(B.lautus)、苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)、浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)或鼠灰链霉菌(S.murinus)；或革兰氏阴性细菌，其中所述革兰氏阴性细菌是大肠杆菌(Escherichia coli)或假单胞菌属(Pseudomonas)物种。

另一目的是提供包含以上α-淀粉酶变体的洗涤剂添加剂。该洗涤剂添加剂可为无粉尘颗粒(non-dusting granulate)、微颗粒(microgranulate)、稳定的液体、凝胶或受保护的酶的形式。该洗涤剂添加剂还可以包含酶，所述酶选自纤维素酶、蛋白酶、氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、壳多糖酶、角质酶(cutinase)、环糊精葡聚糖转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、卤代过氧化物酶(haloperoxidase)、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶分解酶(pectinolytic enzyme)、肽谷氨酰胺酶(peptidoglutaminase)、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶、支链淀粉酶、异淀粉酶、角叉菜酶(carrageenase)、或其任意组合。具体的，该淀粉酶可以是另一α-淀粉酶、β-淀粉酶、异淀粉酶或葡糖淀粉酶。

提供包含以上洗涤剂添加剂的洗涤剂组合物。该洗涤剂组合物还可以包含酶，所述酶选自纤维素酶、蛋白酶、氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精葡聚糖转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、卤代过氧化物酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶分解酶、肽谷氨酰胺酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶、支链淀粉酶、异淀粉酶、角叉菜酶、或其任意组合。

另一目的是提供人工或自动的包含以上α-淀粉酶变体的餐具洗涤组合物。该组合物还可以包含一种或多种的表面活性剂、洗涤剂助洗剂、络合剂、聚合物、漂白系统、稳定剂、泡沫促进剂、抑泡剂、防腐蚀剂、污垢悬浮剂、防尘污再沾着剂、染料、杀细菌剂、hytrotope、晦暗抑制剂和香料。该组合物还可以包含酶，所述酶选自纤维素酶、蛋白酶、氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精葡聚糖转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、卤代过氧化物酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶分解酶、肽谷氨酰胺酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶、支链淀粉酶、异淀粉酶、角叉菜酶、或其任意组合。清洁餐具的方法包括施用以上人工或自动餐具洗涤组合物。

另一目的是提供包含以上α-淀粉酶变体的洗衣洗涤剂添加剂。洗衣洗涤剂组合物可以包含洗衣添加剂和还可以包含一种或多种的表面活性剂、洗涤剂助洗剂、络合剂、聚合物、漂白系统、稳定剂、泡沫促进剂、抑泡剂、防腐蚀剂、污垢悬浮剂、防尘污再沾着剂、染料、杀细菌剂、hytrotope、荧光增白剂、织物调理剂(fabric conditioner)和香料。洗衣的方法包括施用以上洗衣洗涤剂添加剂。

另一目的是提供包含以上α-淀粉酶变体的生物膜-水解组合物。该生物膜水解组合物可以是溶液、粉末、糊、凝胶、液体、软膏、片剂或凝胶的形式。该组合物还可以包含纤维素酶、半纤维素酶、木聚糖酶、脂肪酶、蛋白酶、果胶酶、抗微生物剂或其任意的组合。水解生物膜的方法包括施用以上组合物，进行足以水解该生物膜的时间。

另一目的是提供包含在水溶液中的以上α-淀粉酶变体的淀粉加工组合物。该淀粉加工组合物还可以包含葡糖淀粉酶、异淀粉酶、支链淀粉酶、植酸酶或其组合。加工淀粉的方法包括施用该组合物，进行足够加工淀粉的时间。

另一目的是提供包含在溶液中的以上α-淀粉酶变体的用于糖化淀粉的组合物。糖化淀粉的方法包括施用该组合物足以糖化该淀粉的时间。另一目的是提供溶液形式的包含以上α-淀粉酶变体的用于液化淀粉的组合物。液化淀粉的方法包括施用该组合物足以液化该淀粉的时间。

另一目的是提供包含在溶液中的以上α-淀粉酶变体的纺织品(textile)脱浆组合物。该纺织品脱浆组合物还可以包含另一种酶。脱浆纺织品的方法包括施用该纺织品脱浆组合物足以脱浆该织物的时间。

另一目的是提供包含在溶液或凝胶中的以上α-淀粉酶变体的烘培组合物。烘培方法包括施用该烘培组合物。

附图概述

所附图被并入和组成本说明书的部分和说明不同的实施方案。在附图中：

图1描述了枯草芽孢杆菌物种第707号α-淀粉酶(SEQ ID NO：1)(Swissprot登录号P19571)和芽孢杆菌属物种A7-7α-淀粉酶(SEQ IDNO：2)的成熟形式之间的氨基酸序列比对。突出显示的残基是两个氨基酸序列中不同的。

图2描述了成熟形式的枯草芽孢杆菌物种第707号α-淀粉酶(SEQ IDNO：1)(Swissprot登录号P19571)和芽孢杆菌属物种A7-7(DSM12368)α-淀粉酶(SEQ ID NO：7)(基因文库登录号CAL48155)之间SIM氨基酸序列比对(Xiaoquin Huang和Webb Miller.(1991)ATime-Efficient，Linear-Space Local Similarity Algorithm.Advances inApplied Mathematics，12卷，第337-357页)。在序列比对下面通过星号标明相同氨基酸位置。

图3显示用于表达芽孢杆菌属物种第707号淀粉酶变体的质粒pICatH-Amy707的构图。pICatH含有下列特征：温度敏感型复制起点(oripE194，用于在芽孢杆菌中复制)，来自pBR322的复制起点(用于在大肠杆菌中扩增)，用于选择的新霉素抗性基因，和用于氯霉素抗生素选择、染色体整合和盒扩增的阴性地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)氯霉素抗性基因(CAT)。

图4描述了系列淀粉酶707变体(R172Q、H183D和S255N)与亲本酶相比的淀粉酶活性比较。

发明详述

本发明提供α-淀粉酶的变体，通过修饰对酶的溶解度重要的氨基酸残基使所述酶变体能够更有效的生产和因而更经济。例如，提供第707号芽孢杆菌属物种α-淀粉酶的变体，与野生型第707号芽孢杆菌属物种α-淀粉酶相比，该变体在表达该变体的宿主细胞发酵肉汤中更好溶解。该变体还可以在表达宿主细胞，例如，在宿主细胞细胞质中具有更高的溶解度。由于第707号芽孢杆菌属物种α-淀粉酶变体具有更高的溶解度，因此例如，可以从发酵肉汤更有效的分离和纯化该变体，和因此可以更加经济的生产包含该变体的制剂。

包含当前第707号芽孢杆菌属物种α-淀粉酶变体的制剂包括清洁制剂(例如，自动餐具洗涤剂和洗衣洗涤剂制剂)、生物膜处理制剂、淀粉加工制剂、纺织品脱浆剂、烘培制剂等。以下详述如何完成和提供由此产生的该α-淀粉酶变体的组合物和用途。

1.定义和缩写

在本详述中，应用下面的缩写和定义。必须注意如本文所使用，除非上下文另有明确指明，否则单数形式“一”、“一个”和“该”涵盖对复数形式的提及。因此，例如，提到“酶”包括多种此类酶，而提到“该制剂”包括一种或多种制剂以及本领域技术人员已知的其等价物，等等。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本领域普通技术人员通常所理解的含义。下面提供如下的术语。

1.1定义

“淀粉酶”应指这样的酶，即，其能够催化淀粉的降解等。“淀粉酶”包括任何淀粉酶，例如葡糖淀粉酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、芽孢杆菌属物种(例如地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌)的野生型α-淀粉酶。“淀粉酶是断裂淀粉中α-D-(1→4)O-糖苷键的水解酶。通常，将α-淀粉酶(EC 3.2.1.1；α-D-(l→4)-葡聚糖葡聚糖水解酶)定义为以随机方式切开淀粉分子内α-D-(1→4)O-糖苷键的内切酶。与此不同，诸如β-淀粉酶(EC 3.2.1.2；α-D-(1→4)-葡聚糖麦芽糖水解酶)等外切淀粉酶和如产麦芽糖(maltogenic)α-淀粉酶(EC 3.2.1.133)的一些产物特异性淀粉酶从底物的非还原末端切割淀粉分子。β-淀粉酶、α-葡糖苷酶(EC 3.2.1.20；α-D-葡糖苷葡糖水解酶)、葡糖淀粉酶(EC 3.2.1.3；α-D-(1→4)-葡聚糖葡糖水解酶)，以及产物特异性淀粉酶可以从淀粉产生特定长度的低聚麦芽糖。

“α-淀粉酶变体”、“α-淀粉酶变体多肽”和“变体酶”指具有对来自野生型α-淀粉酶的氨基酸序列已经进行修饰的氨基酸序列的α-淀粉酶蛋白。如本文所使用，“亲本酶”、“亲本序列”、“亲本多肽”、“野生型α-淀粉酶蛋白质”和“(复数形式的)亲本多肽”应指α-淀粉酶变体多肽所基于的衍生自的酶和多肽，例如，第707号芽孢杆菌属物种α-淀粉酶。野生型α-淀粉酶是天然存在的。“α-淀粉酶变体”与野生型α-淀粉酶在成熟蛋白(即，没有信号序列的蛋白质序列)的氨基酸残基上不同。该α-淀粉酶变体可以是融合蛋白，其包含连接于，例如，来自另一α-淀粉酶的信号肽的成熟或变体第707号芽孢杆菌属物种α-淀粉酶。术语“变体”可与术语“突变体”互换使用。

“变体“指多肽和核酸。变体包括在氨基酸或核苷酸序列的一个或多个位置上分别的插入、取代、颠换、截短和/或倒位。变体核酸可以包括与能够同本文提到的核苷酸序列杂交的序列之互补序列。例如，变体序列与能够在严紧条件(例如50℃和0.2XSSC{1X SSC＝0.15M NaCl、0.015M柠檬酸三钠，pH 7.0})下同本文所提到的核苷酸序列杂交的序列互补。更具体的，术语变体包括与能够在高严紧条件(例如65℃和0.1XSSC下同本文所提到核苷酸序列杂交的序列相互补的序列。

“分离的”指序列至少基本上不含有与该序列天然相关的和天然存在的至少一种其它组分。

“纯化的”指物质处于相对纯的状态，例如至少约90％纯的，至少约95％纯的，或至少约98％纯的。

“热稳定的”指该酶比参考酶更加热稳定。在本发明中，如果在相同试验条件下(例如，相同温度、底物浓度等)经过特定时间间隔后，该α-淀粉酶变体具有相对更高的酶活性，该α-淀粉酶变体比野生型第707号芽孢杆菌属物种α-淀粉酶更加热稳定。或者，与参考酶相比，通过差示扫描量热法确定，热稳定更好的酶具有更高的热容量。

“pH范围”指在其中酶显示活性的pH值。

如本文所使用，“pH稳定的”指酶在特定pH比参考酶更加稳定。在本发明中，在相同试验条件下(例如，相同pH等)经过特定时间间隔后，如果α-淀粉酶变体具有相对更高的活性，该α-淀粉酶变体比野生型第707号芽孢杆菌属物种α-淀粉酶具有更好的pH稳定性。

如本文所使用，“食品”包括制备的食品以及用于食品的成分，例如面粉。

如本文所使用，“食品成分”包括其为或能够被加入功能性食品或食物(foodstuff)中的制剂，和包括在需要，例如酸化或乳化的多种产品中以低水平使用的制剂。由应用的用途和/或模式和/或施用的模式决定，食品成分可以是溶液或固体的形式。

如本文所使用，“功能性食品”指不仅能够提供营养作用和/或味觉满足，还对消费者有任何更多有益效果的食品。

如本文所使用，“氨基酸序列”与术语“多肽”和/或术语“蛋白质”同义。一些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“肽”同义；一些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“酶”同义。

如本文所使用，“核苷酸序列”或“核酸序列”指寡核苷酸序列或多核苷酸序列，以及其变体、同源物、片段和衍生物。核苷酸序列可以是基因组的、合成的或重组的起源，并且可以是双链或单链(代表正义或反义链)。如本文所使用，术语“核苷酸序列”包括基因组DNA、cDNA、合成的DNA和RNA。核苷酸序列的合成是本技术领域众所周知的(见，例如，Beaucage和Caruthers，Tetrahedron Lett.，22：1859-1862[1981])，包括使用自动合成仪(见，例如，Needham-VanDevanter等人，Nucl.Acids Res.，12：6159-6168[1984])。DNA序列也可以是定制的和从多种商业来源订购的。

“同源物”应指与主题氨基酸序列和主题核苷酸序列具有一定程度同一性或“同源性”的实体。“同源序列“包括与主题序列具有至少75％、80％、85％或90％同一性，特别是具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。通常，同源物包括与主题氨基酸序列相同的活性位点残基。

如本文所使用，“杂交”包括核酸链通过碱基配对与互补链结合的过程，以及如在聚合酶链式反应(PCR)技术中进行的扩增过程。α-淀粉酶变体核酸可以以单链或双链DNA或RNA、RNA/DNA异源双链体或RNA/DNA共聚物形式存在。如本文所使用，“共聚物”指包括核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸两者的单核酸链。可以密码子优化α-淀粉酶变体核酸，以进一步增加表达。

如本文所使用，通过体外化学或酶促合成而产生“合成的”化合物。其包括，但不限于，制备的对于宿主生物具有最佳密码子选择的α-淀粉酶变体核酸，所述宿主生物例如甲基营养酵母毕赤酵母属(Pichia)、汉逊酵母属(Hansenula，)、链霉菌属(Streptomyces)和木霉菌属(Trichoderma)，例如，里氏木霉(T.reesei)或选择的其它表达宿主。

如本文所使用，“转化的细胞”包括通过重组DNA技术的应用而被转化的细胞。通常通过向细胞插入一个或多个核苷酸序列而发生转化。插入的核苷酸序列可以是异源核苷酸序列，即，对于要被转化的细胞而言并非天然的序列，例如融合蛋白的序列。

如本文所使用，“有效连接的”指所述及的组分之间是允许它们以其预期方式发挥功能的关系。例如，与编码序列有效连接的调节序列是以如下方式实现连接的，即，所述编码序列能够在与控制序列相容的条件下获得表达。

如本文所使用，“生物活性的”指序列与天然序列具有相似的结构的、调控的、或生化的功能，尽管不必是相同的程度。

“溶解度”指在特定物质在特定溶剂中能够溶解的量。比另一蛋白更加可溶的蛋白质能够在该溶剂中达到更高浓度而不会从溶液中析出沉淀。用于这一目的的溶剂包括该蛋白质可以在其中发生的任何环境(millieu)，例如水性缓冲液或盐溶液、发酵肉汤、或表达宿主的细胞质。

1.2缩写

除非另外说明，应用下面的缩写：

3D      三维

AE      醇乙氧基化物

AEO     醇乙氧基化物

AEOS    醇乙氧基硫酸盐

AES     醇乙氧基硫酸盐

AFAU    酸性真菌α-淀粉酶单位

AGU     葡糖淀粉酶活性单位

AOS     α-烯烃磺酸盐

AS      醇硫酸盐(alcohol sulfate)

BAA     细菌α-淀粉酶

cDNA    互补DNA

CMC     羧甲基纤维素

DE      葡萄糖当量

DNA     脱氧核糖核酸

DP3     三亚基的聚合度

DPn     n亚基的聚合度

DS      干燥固体

DTMPA   二乙基三氨基五乙酸

EC        酶分类的酶学委员会

EDTA      乙二胺四乙酸

EDTMPA    乙二胺四甲叉膦酸(ethylenediaminetetra methylenephosphonic acid)

EO        环氧乙烷

EP        表达蛋白

F&HC      织物和家居护理

HFCS      高果糖玉米糖浆

HFSS      高果糖淀粉基糖浆

IPTG      异丙基-β-D-硫代半乳糖苷

LAS       线性烷基苯磺酸盐

LAT       地衣芽孢杆菌α淀粉酶

LU        脂肪酶单位

MW        分子量

nm        纳米

NOBS      壬酰基氧基苯磺酸盐

NTA       次氮基三乙酸

PCR       聚合酶链反应

PEG       聚乙二醇

pI        等电点

ppm       百万分之一

PVA       聚(乙烯醇)

PVP       聚(乙烯吡咯烷酮)

RAU       参考淀粉酶单位

RMS       均方根

RNA       核糖核酸

SAS       次级烷烃磺酸盐

1X SSC    0.15M NaCl，0.015M柠檬酸三钠，pH 7.0

SSF     同时糖化和发酵

TAED    四乙酰基乙二胺

TNBS    三硝基苯磺酸

w/v     重量/体积

w/w     重量/重量

wt      野生型

μL     微升

2.α-淀粉酶变体

这里的α-淀粉酶变体是从野生型α-淀粉酶，例如第707号芽孢杆菌属物种α-淀粉酶，产生的。本变体具有对氨基酸序列的一个或多个修饰，其例如通过在表达该变体的宿主细胞发酵肉汤中增加该变体的溶解度影响相对于野生型α-淀粉酶的生产水平。以此方式，变体可以结合来自第707号芽孢杆菌属物种α-淀粉酶的高性能特性和例如其它物种或菌株的α-淀粉酶的高的生产水平。在一个实施方案中，通过对改良α-淀粉酶变体的水性溶解度的氨基酸变异赋予高的生产水平。

出于本公开的目的，氨基酸取代可以设计为，例如，R172Q，指在位置172的精氨酸(R)残基被谷氨酰胺(Q)残基取代，其中氨基酸通过本技术领域公知的单字母缩写命名。残基位置数字与在第707号芽孢杆菌属物种α-淀粉酶中使用的相同，显示为图1(SEQ ID NO：1)中顶部的序列。

不受理论所限，认为α-淀粉酶的表达水平部分由于α-淀粉酶的初级序列。例如，特异性的氨基酸残基可以促进表达酶的聚集和沉淀，降低从发酵肉汤可回收的酶量。通过基因工程对酶的初级序列的系统变异可以鉴定对α-淀粉酶的表达水平有贡献的特异性氨基酸残基。高水平表达的α-淀粉酶的初级序列可以指导选择合适的氨基酸序列修饰。例如，第707号芽孢杆菌属物种α-淀粉酶的初级序列与来自芽孢杆菌属物种A7-7(DSM12368)的高表达的α-淀粉酶的初级序列有33个氨基酸不同。出于本公开的目的，″芽孢杆菌属物种A7-7(DSM 12368)″与″芽孢杆菌属物种A7-7″同义。认为33个氨基酸的一个或多个通过影响表达的α-淀粉酶的聚集和沉淀而影响表达水平。因此，在第707号芽孢杆菌属物种α-淀粉酶序列中这33个氨基酸的一个或多个可以被取代，从而该变体将含有对应于高表达的芽孢杆菌属物种A7-7α-淀粉酶的序列的一个或多个氨基酸。预期这样的变体将以更高水平表达。

或者，可以通过将芽孢杆菌属物种A7-7α-淀粉酶中的一个或多个氨基酸取代为对应于较差表达的第707号芽孢杆菌属物种α-淀粉酶的序列来鉴定对表达水平有贡献的氨基酸。在这一情况下，如果该取代影响表达，该变体预期在较低水平表达。

同样不为理论所限，通常预期暴露在酶表面的氨基酸对该酶的聚集和沉淀有贡献。具体的，预期在蛋白质表面的疏水区诱导聚集过程。3D(三维)结构模型能够鉴定最可能影响表达的那些取代，例如在蛋白质表面的氨基酸。氨基酸取代可以被单独的评估或以两个或多个成组评估。可以使用通过本技术领域公知的方法制备的组合文库以产生具有多个氨基酸取代的变体。

通过取代、添加或缺失一个或多个氨基酸使本变体与野生型α-淀粉酶序列不同。例如，变体α-淀粉酶可以包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35或40个氨基酸修饰，而保留α-淀粉酶活性。例如，第707号芽孢杆菌属物种α-淀粉酶的变体可以在任意的上述33个氨基酸位置具有一个或多个氨基酸取代，从而其序列更接近芽孢杆菌属物种A 7-7α-淀粉酶序列。在一个实施方案中“变体”具体的排除仅在成熟蛋白的第一个氨基酸残基与野生型序列不同的序列。

任何高表达α-淀粉酶的初级序列能够指导提供高表达变体的氨基酸序列修饰的选择。出于此目的，与第707号芽孢杆菌属物种α-淀粉酶具有高度序列同一性的α-淀粉酶是特别合适的，因为能够检测最少量的残基以确定影响表达的残基。例如，芽孢杆菌属物种A7-7α-淀粉酶与第707号芽孢杆菌属物种α-淀粉酶共有约93％的序列同一性。合适的芽孢杆菌属物种A7-7α-淀粉酶被公开在图1(SEQ ID NO：2；基因文库登录号CAL48155)。另一合适的芽孢杆菌属物种A7-7α-淀粉酶(SEQ ID NO：3；基因文库登录号CAD26710)与在SEQ ID NO：2中所示芽孢杆菌属物种A7-7α-淀粉酶序列有2个残基不同，D236G和Y353C。其它合适的α-淀粉酶包括比第707号芽孢杆菌属物种α-淀粉酶表达水平高的任何α-淀粉酶，特别是与第707号芽孢杆菌属物种α-淀粉酶具有相对高的序列同一性的那些α-淀粉酶。该变体在氨基酸序列上与高表达的α-淀粉酶不相同，而是与所述序列有至少一个氨基酸差异。氨基酸取代包括，但不限于，N28R、S36D、S83N、S91A、N94S、M116W、N125S、T132S、E134D、R142K、S154N、R172Q、N174Q、H183D、A186G、I250L、N251T、S255N、A256T、L272I、Q280S、K302R、N311Q、S323T、E360D、R383K、I410M、A434P、S437N、F441Y、S452R、T459S和K485N。并非全部的这些取代将赋予同等有用的特性。例如，取代A186G和A434P有利的减少疏水性，但是也预期使该变体不稳定。相似的，对不暴露于溶剂的氨基酸进行I250L取代；因此，这一取代预期对溶解度影响稳定性很少或没有影响。可以对相同残基进行额外的取代。例如，S452K、S452N或S452D可以产生比S452R更好的结果。在下文表1提出多种氨基酸取代。

2.1α-淀粉酶变体表征

通过3D结构建模，和/或通过其特异性活性，通过其核酸和初级多肽序列表征酶变体。α-淀粉酶变体的额外的特征包括稳定性、钙离子(Ca²⁺)依赖、pH范围、氧化稳定性和热稳定性。一方面，该α-淀粉酶变体以比野生型α-淀粉酶更高水平表达，而保留了野生型α-淀粉酶的性能特征。使用在本领域技术人员公知的标准测定评估表达水平和酶活性。在另一方面，变体证明相对于野生型酶的改良的性能特征，例如改良的高温稳定性(即，70-120℃)，和/或pH极限(即，pH 4.0至6.0或pH 8.0至11.0)，和/或低于60ppm的钙浓度。

表达特征指当在特定宿主细胞中生产该变体时，改变的变体表达水平。表达通常涉及在给定量时间使用本领域公知标准技术从发酵肉汤能够回收的活性变体的量。表达也可以涉及在宿主细胞内产生的或通过宿主细胞分泌的变体的量或比率。表达也可以涉及编码该变体酶的mRNA的翻译率。

改变的Ca²⁺稳定性指在Ca²⁺排空下该酶的稳定性已经被改变，即，增加或减少。重大突变包括那些在高pH，即，pH 8.0至10.5下改变Ca²⁺稳定性，特别是提高Ca²⁺稳定性的突变。

在另一方面，对于在清洗组合物中使用，重要的突变呈现改变的比活，特别是在温度从10-60℃，特别是20-50℃，和更尤其是30-40℃。对于烘培产物，重要突变可以在更高温度范围呈现改变的比活。

与亲本α-淀粉酶相比，α-淀粉酶变体也可以具有改变的氧化稳定性，特别是更高的氧化稳定性。例如，在洗涤剂组合物中增加的氧化稳定性是有利的，而在用于淀粉液化的组合物中降低的氧化稳定性是有利的。

变体α-淀粉酶可以是比野生型α-淀粉酶更热稳定的。这类α-淀粉酶变体对于在需要升高温度的烘培或其它加工中使用是有利的。例如，热稳定的α-淀粉酶变体可以在约55℃至约80℃或更高温度下降解淀粉。当暴露于高达约95℃温度之后，热稳定的α-淀粉酶变体可以保留其活性。

这里所述的α-淀粉酶变体多肽也具有突变，所述突变特别是在约55℃至约95℃或更多，尤其在约80℃的升高的温度下，与亲本酶相比将半衰期延伸10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％或更多。在一个实施方案中该α-淀粉酶变体可以在80℃或更高加热约1-10分钟。

例如，通过这里所述的外部特异性指数(exo-specificity indices)测量，该α-淀粉酶变体可以具有外部特异性。任选地当在相同条件下测量时，与亲本酶或由其衍生的多肽相比，α-淀粉酶变体包括具有更高或增加的外部特异性的那些。因此，例如，与其亲本多肽相比，α-淀粉酶变体多肽可以具有10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、500％、1000％、5000％、10,000％或更高的外部特异性指数。

一方面，由该核酸编码的α-淀粉酶变体多肽具有与亲本序列相同的pH稳定性。另一方面，该变体包含赋予更高pH稳定性范围或出于该酶的最终商业目的将pH范围转换为期望区域的突变。例如，在一个实施方案中，该变体可以在约pH 5.0至约pH 10.5降解淀粉。在相同条件下，该α-淀粉酶变体多肽与亲本多肽相比，可以具有更长的半衰期或更高的活性(由该测定决定)，或该α-淀粉酶变体可以具有与亲本多肽相同的活性。在相同pH条件下，与其亲本多肽相比，该α-淀粉酶变体多肽也可以具有约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％或更长的半衰期。可选的，或额外的，在相同pH条件下，与其亲本多肽相比，该酶变体可以具有更高的比活。

另一方面，提供与编码这里提出的任意α-淀粉酶变体的核酸互补的核酸。此外，提供能够杂交于该互补序列的核酸。在另一实施方案中，在这里所述方法和组合物中使用的序列是合成的序列。其包括，但不限于，用对于宿主生物体(例如甲基营养酵母毕赤酵母和汉逊酵母)表达中有最佳密码子选择而制备的序列。

3.生产α-淀粉酶变体

使用表达载体，可以以酶形式表达通过这里所述方法或通过本领域公知的备选方法生产的编码该酶变体的DNA序列，所述表达载体通常包括编码合适的启动子、操纵子、核糖体结合位点、翻译起始信号的控制序列和任选的阻抑物基因或多个激活子基因。

3.1载体

带有编码α-淀粉酶变体的DNA序列的重组表达载体可以是能够方便用于重组DNA操作的任何载体，载体的选择通常决定于其被引入的宿主细胞。

因此，该载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体存在的载体，其复制不依赖于染色体复制，例如，质粒、噬菌体或染色体外元件、微型染色体或人工染色体。或者，该载体可以是当其被引入宿主细胞时被整合进入宿主细胞基因组和与已经被整合进入的染色体一起复制的载体。通过使用由抗生素选择或其它选择压力(例如必需的调节基因)或由对必需代谢途径基因的补充而驱动的可扩增构建体，也可以扩增该整合基因以产生在该染色体中该基因的多个拷贝。

表达载体通常包括克隆载体的组分，例如，在选择的宿主生物体中允许载体自主复制的元件和用于选择目的的一个或多个表型可检测标记。表达载体通常包含编码启动子、操纵子、核糖体结合位点、翻译起始信号的控制核苷酸序列和任选的阻抑物基因或一个或多个激活子基因。一方面，使用的全部信号序列将该物质靶向于细胞培养基以方便酶收集和任选的纯化。使用的分别连接编码α-淀粉酶变体的DNA构建体、启动子、终止子和其它元件的操作，和用于将它们插入含有复制必需信息的合适载体的操作是本技术领域众所周知的(见，例如，Sambrook等人，MOLECULARCLONING：A LABORATORY MANUAL，第2版.，Cold Spring Harbor，1989和第3版，2001)。

载体中，该DNA序列应该被有效连接于合适的启动子序列。该启动子可以是在选择的宿主细胞中显示转录活性的任何DNA序列，并且可以衍生自编码与宿主细胞同源或异源的蛋白质的基因。指导编码α-淀粉酶变异的DNA序列转录(特别是在细菌宿主中)的合适启动子的实例是大肠杆菌lac操纵子的启动子、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)琼脂糖酶基因dagA或cel A启动子、多种芽孢杆菌属衍生的启动子，例如地衣芽孢杆菌，第707号芽孢杆菌属物种，或芽孢杆菌属物种A7-7α-淀粉酶基因(amyL)的启动子、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)生麦淀粉酶基因(amyM)的启动子、解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶(amyQ)的启动子、和枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因的启动子等。对于真菌宿主中的转录，有用的启动子的实例是源自编码米曲霉(Aspergillus oryzae)TAKA淀粉酶、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白水解酶、黑曲霉(Aspergillus niger)中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米黑根毛霉脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖异构酶或构巢曲霉(A.nidulans)乙酰胺酶的基因的启动子。当在诸如大肠杆菌的细菌物种中表达编码α-淀粉酶变体多肽的基因时，可以例如从噬菌体启动子(包括T7启动子和λ噬菌体启动子)，选择适合的启动子。适于在酵母物种中表达的启动子的实例包括但不限于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的Gal 1和Gal 10启动子和巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)的AOX1或AOX2启动子。对于在里氏木霉中表达，也可使用CBHII启动子。

表达载体也可包括与编码α-淀粉酶变体的DNA序列有效连接的适宜转录终止子以及，在真核生物中，多腺苷酸化序列。终止序列和多腺苷酸化序列可适宜地源自与启动子相同的来源。载体还可包括允许载体在所讨论的宿主细胞中复制的DNA序列。该序列的实例是质粒pUC19、pACYC177、pUB110、pE194、pAMB1、pICatH和pIJ702的复制起点。

载体也可包括选择标记，例如其产物能在分离的宿主细胞中弥补缺陷的基因，例如来自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因，或者赋予抗生素抗性(例如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性)的基因。此外，载体可包括曲霉属(Aspergillus)选择标记，例如amdS、argB、niaD和xxsC(产生潮霉素抗性的标记)，或者可通过诸如本领域已知的共转化实现选择。参见例如，国际PCT申请WO 91/17243。

3.2变体表达和宿主生物体

虽然细胞内表达或固体状态发酵在一些方面可能是有益的，例如当使用某些细菌或真菌作为宿主细胞时，但是变体的表达是细胞外的和进入培养基的也通常是有利的。一般，这里提到的芽孢杆菌属α-淀粉酶包括允许表达的蛋白酶分泌到培养基中的信号序列。如果需要，可由不同的信号序列代替该信号序列，其可以通过编码各自信号序列的DNA序列的取代而方便地实现。该信号序列通常表征为具有三个结构域，N-末端结构域、H-结构域和C末端结构域，并且长度在18-35个残基范围内。

成熟的蛋白可以是最初与前蛋白的融合蛋白的形式，所述前蛋白衍生自另一芽孢杆菌属物种或衍生自与亲本序列相同物种。为了在地衣芽孢杆菌宿主细胞中分泌蛋白质，例如，通常使用地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的信号肽；然而，也可以使用来自其它芽孢杆菌属α-淀粉酶的信号蛋白来取代。有用的信号肽包括例如，来自第707号芽孢杆菌属物种或芽孢杆菌属物种A7-7的那些。

有益地，将包括DNA构建体或表达载体的分离的细胞用作重组生产α-淀粉酶变体的宿主细胞。可用编码该变体的DNA构建体，通过将该DNA构建体(以一个或多个拷贝)整合到宿主染色体中而方便地转化细胞。通常认为这一整合是有利的，因为DNA序列更有可能稳定地保持在细胞中。可根据常规方法，例如通过同源或异源重组实现DNA构建体向宿主染色体的整合。或者，可以用与不同类型的宿主细胞相关的上述表达载体转化细胞。

适合的细菌宿主生物的实例为革兰氏阳性细菌物种，例如芽孢杆菌科(Bacillaceae)，包括枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、凝固芽胞杆菌、灿烂芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)和苏云金芽孢杆菌；链霉菌属物种(Streptomyces sp.)，例如，鼠灰链霉菌；乳酸细菌物种，包括乳球菌属物种(Lactococcus sp.)，如乳乳球菌(L.lactis)；乳杆菌属物种(Lactobacillus sp.)，包括，路氏乳杆菌(L.reuteri)；明串珠菌属物种(Leuconostoc sp.)；片球菌属物种(Pediococcus sp.)；和链球菌属物种(Streptococcus sp.)。其它仍然有用的宿主包括例如，芽孢杆菌属物种A7-7。或者，可以选择属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)(包括大肠杆菌)或属于假单胞菌科(Pseudomonadaceae)的革兰氏阴性细菌物种菌株作为宿主有机体。

适宜的酵母宿主生物可以选自生物技术相关酵母物种，例如但不限于毕赤酵母属物种、汉逊酵母属物种、克鲁维酵母属物种(Kluyveromycessp.)、耶氏酵母属物种(Yarrowinia sp.)，酵母属物种(Saccharomycessp.)(包括酿酒酵母(S.cerevisiae))或属于裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)的物种，如粟酒裂殖酵母(S.pombe)。甲基营养酵母物种(巴斯德毕赤酵母)菌株可以用作宿主生物。或者，宿主生物可以是汉逊酵母属物种。丝状真菌中适宜的宿主生物包括曲霉属(Aspergillus)物种，例如黑曲霉、米曲霉、塔宾曲霉(A.tubigensis)、泡盛曲霉(A.awamori)或构巢曲霉。或者，镰孢霉属物种(Fusarium sp.)，如尖镰孢(Fusarium oxysporum)或根毛霉属物种(Rhizomucor sp.)物种，如米黑根毛霉(R.miehei)，的菌株可以用作宿主生物。其他合适的菌株包括Thermomyces sp.和毛霉属物种(Mucor sp.)。可以以本技术领域公知的方式，通过涉及原生质体形成和原生质体转化接着细胞壁再生的过程转化真菌细胞。转化曲霉属宿主细胞的适宜操作例如EP238023中所述。

另一方面，提供了产生α-淀粉酶变体的方法，该方法包括在有利于变体生产的条件下培养上述宿主细胞，并从该细胞和/或培养基中回收变体。用于培养细胞的培养基可以是任何适于生长所讨论宿主细胞和获得α-淀粉酶变体表达的常规培养基。适宜的培养基和培养基组分可获自商品供应商或可根据公开的制剂(例如按美国典型培养物保藏中心(American TypeCulture Collection(ATCC))的目录所述)制备。示例培养基包括但不限于用于在三千升(3,000L)搅拌釜发酵罐中进行补料分批发酵的那些培养基。所用的培养基可以是最适合于正在使用的宿主细胞的培养基，例如下文所讨论的用于培养枯草芽孢杆菌属物种第707号的培养基。该情况下生长培养基可以包括玉米浆固形物和大豆粉作为有机化合物的来源，连同无机盐作为钠、钾、磷酸、镁和硫酸的来源，以及微量元素。通常，糖类来源如葡萄糖也是起始培养基的部分。一旦培养物自身已经建立并开始生长，则可以如本领域已知的那样向罐中定量供应糖类，以便维持培养物。定期从发酵罐中取样，以便利用例如比色测定法来测量酶滴度。根据测量，当酶生产速率停止增加时，终止发酵过程。

可通过公知的方法从培养基中方便地回收分泌自宿主细胞的α-淀粉酶变体，包括通过离心或过滤从培养基中分离细胞，通过诸如硫酸铵的盐沉淀培养基中的蛋白质组分，随后使用诸如离子交换层析、亲和层析等的层析方法。

可在允许α-淀粉酶变体蛋白质表达的适宜条件下培养宿主细胞。蛋白质的表达可以是组成型的，从而它们可以连续生产，或可以是诱导型的，从而需要刺激来起始表达。在诱导型表达的情况下，可以在需要时通过例如向培养基中加入诱导物(例如地塞米松或IPTG或Sepharose)来起始蛋白质生产。也可以在体外无细胞体系(例如TnT^TM(Promega)兔网织红细胞体系)中重组生产多肽。

也可以在有氧条件下，于对宿主适合的培养基中培养表达α-淀粉酶变体的宿主。可以提供振荡或搅拌及通风的组合，在对于该宿主适合的温度例如约30℃至约75℃进行生产，这取决于宿主的需要以及生产期望α-淀粉酶变体的需要。可以培养约12至约100小时或更长(以及其间的任何时间值)或例如24-72小时。通常，培养基(culture broth)pH在约5.5至约8.0，这也取决于相对于α-淀粉酶变体的生产，宿主细胞所需的培养条件。

4.α-淀粉酶变体的纯化

发酵、分离和浓缩技术是本领域公知的并且可以使用常规方法以制备浓缩的含有α-淀粉酶变体的溶液。发酵后，获得发酵液，可以通过常规分离技术除去微生物细胞和各种悬浮的固形物(包括残留的发酵原料)以便获得淀粉酶溶液。通常使用过滤、离心、微量过滤、转鼓真空过滤、随后超滤、提取或层析等。

希望浓缩包含α-淀粉酶变体的溶液以优化回收，因为使用未浓缩的溶液需增加孵育时间来收集包含纯化的α-淀粉酶变体的沉淀物。用常规技术浓缩溶液至获得期望的水平。可通过上文讨论的任何技术实现含酶变体溶液的浓缩。在一个实施方案中，使用旋转真空蒸发和/或超滤。备选地，可使用超滤。

用于纯化目的的“沉淀剂”是指有效从浓缩的酶变体溶液中以固体形式(不管其性质如何，即晶体、无定形或两者混合物)沉淀α-淀粉酶变体的化合物。可以使用例如金属卤化物沉淀剂进行沉淀。金属卤化物沉淀剂包含：碱金属氯化物、碱金属溴化物和这些金属卤化物中两种或更多种的混合物。金属卤化物可以选自氯化钠、氯化钾、溴化钠、溴化钾和这些金属卤化物中两种或更多种的混合物。适合的金属卤化物包含氯化钠和氯化钾，尤其是氯化钾，其还可用作防腐剂。

以有效沉淀α-淀粉酶变体的量使用金属卤化物沉淀剂。在常规试验后，本领域普通技术人员可以显而易见地至少选择出能够有效地造成酶变体沉淀的金属卤化物的有效量和最佳量、以及实现最大回收的沉淀条件，包括孵育时间、pH、温度和α-淀粉酶变体的浓度。

通常，向浓缩的酶变体溶液中加入至少约5％w/v(重量/体积)至约25％w/v的金属卤化物，且通常是至少8％w/v。通常，向浓缩的酶变体溶液中加入不超过约25％w/v的金属卤化物，且通常是不超过20％w/v。金属卤化物沉淀剂的最适浓度将取决于例如具体的α-淀粉酶变体的性质以及其在浓缩的α-淀粉酶变体溶液中的浓度等。

另一可选的实现酶沉淀的方法是应用有机化合物，其可以添加到浓缩的酶变体溶液中。有机化合物沉淀剂可以包括：4-羟基苯甲酸、4-羟基苯甲酸的碱金属盐、4-羟基苯甲酸的烷基酯、以及这些有机化合物中两种或更多种的混合物。所述有机化合物沉淀剂的添加可以在金属卤化物沉淀剂的添加之前、与其同时或在其后发生，并且两种沉淀剂(有机化合物和金属卤化物)的添加都可顺次进行或同时进行。进一步的描述见如GenencorInternational，Inc，的美国专利号5,281,526。

通常，有机化合物沉淀剂选自4-羟基苯甲酸的碱金属盐(例如钠或钾盐)，以及4-羟基苯甲酸的线性或分支的烷基酯(其中烷基含有1-12个碳原子)，以及这些有机化合物中两种或更多种的混合物。有机化合物沉淀剂可以是例如4-羟基苯甲酸的线性或分支的烷基酯(其中烷基含有1-10个碳原子)，以及这些有机化合物中两种或更多种的混合物。适合的有机化合物包含4-羟基苯甲酸的线性烷基酯(其中烷基含有1-6个碳原子)，以及这些有机化合物中两种或更多种的混合物。也可以使用4-羟基苯甲酸的甲基酯、4-羟基苯甲酸的丙基酯、4-羟基苯甲酸的丁基酯、4-羟基苯甲酸的乙基酯以及这些有机化合物中两种或更多种的混合物。其他有机化合物还包括但不限于4-羟基苯甲酸甲酯(称为甲基PARABEN)、4-羟基苯甲酸丙酯(称为丙基PARABEN)，它们也是淀粉酶防腐剂。

就pH、温度、α-淀粉酶变体浓度、沉淀剂浓度和孵育时间而论，所述有机化合物沉淀剂的添加提供了沉淀条件高度灵活性的优势。

可以以有效提高金属卤化物沉淀剂引起的酶变体沉淀的量使用有机化合物沉淀剂。基于本发明公开，在常规试验后，本领域普通技术人员将可以显而易见地至少选择出有机化合物沉淀剂的有效量和最佳量、以及用于实现最大回收的沉淀条件，包括孵育时间、pH、温度和酶变体浓度。

通常，向浓缩的酶变体溶液中加入至少0.01％w/v的有机化合物沉淀剂，且通常至少0.02％w/v。通常向浓缩的酶变体溶液中加入不多于0.3％w/v的有机化合物沉淀剂，且通常不多于0.2％w/v。

可以调整含有金属卤化物沉淀剂和，例如，有机化合物沉淀剂的浓缩酶变体溶液的pH，该pH必然地将取决于待纯化的酶变体。通常，将pH调整至淀粉酶等电点附近。例如，将pH调整至位于如下范围内：低于等电点(pI)大约2.5个pH单位至高于pI约2.5个pH单位。若变体的pI不同于野生型的pI，则可以相应地调节pH。

获得纯化的酶变体沉淀物所需的孵育时间取决于具体酶变体的性质、酶浓度、以及具体的沉淀剂(一种或多种)及其浓度。通常，有效沉淀酶变体的时间为约1至约30小时；通常不超过约25小时。在有机化合物沉淀剂存在下，孵育时间还可以减至小于约10小时，且在大多数情况下甚至是约6小时。

通常，孵育期间的温度为约4℃至约50℃。通常，在约10℃至约45℃或约20℃至约40℃的温度进行所述方法。用于诱导沉淀的最佳温度根据溶液条件和酶变体或所用沉淀剂而变化。

可以通过搅拌包括酶变体、添加的金属卤化物和添加的有机化合物的溶液，来提高纯化的酶变体沉淀物的总回收率以及该方法的实施效率。可以在添加金属卤化物和有机化合物期间，以及在随后的孵育期均进行搅拌步骤。适宜的搅拌方法包括机械搅拌或振荡、强有力的通风或任何类似的技术。

孵育期后，可以通过常规分离技术，例如过滤、离心、微量过滤、旋转真空过滤、超滤、压滤、交叉膜微量过滤(cross membranemicrofiltration)、交叉流膜微量过滤等，自解离的色素以及其他杂质中分离和收集纯化的酶变体。所用方法可以是交叉膜微量过滤。可以通过用水洗涤沉淀物获得对纯化的酶变体沉淀物的进一步纯化。例如，用包含金属卤化物沉淀剂的水来洗涤纯化的酶变体沉淀物，例如用包含金属卤化物和有机化合物沉淀剂的水。

培养期间，热稳定的淀粉酶胞外累积在培养基中。为了分离和纯化期望的α-淀粉酶变体，离心或过滤培养基以除去细胞，并利用所得的无细胞液体进行酶纯化。在一个实施方案中，使用约70％饱和度的硫酸铵对无细胞肉汤进行盐析；然后将该70％饱和度-沉淀级分溶解在缓冲液中并施加到诸如Sephadex G-100柱等柱中，并洗脱以回收酶变体活性级分。为了进一步的纯化，可使用诸如离子交换层析等常规方法。

纯化的酶变体可用于通常利用酶变体的所有应用中。例如，它们可以用于洗衣洗涤剂和除斑剂，用于食品工业，用于淀粉加工和烘焙，且可作为消化助洗剂用于药物组合物。可以将它们制成液体(溶液，浆液)或固体(颗粒，粉末)的终产物。

可选地，可以回收酶产物，并向培养基中加入絮凝剂(flocking agent)，以通过过滤或离心除去细胞和细胞碎片，而无需进一步纯化酶。

通过上述方法生产和纯化的α-淀粉酶变体可用在多种有用的工业应用中。变体具有便于织物和家庭护理(F&HC)相关应用的有价值的特性。例如，变变体可以用作洗涤、餐具洗涤和硬表面清洁洗涤剂组合物的组分。变体也可用于由淀粉生产增甜剂和乙醇，和/或用于纺织品脱浆。如在例如WO 2005/111203和美国公开申请号2006/0014265(Genencor International，Inc.)中所述，变体α-淀粉酶在淀粉转化过程(包含淀粉液化和/或糖化方法)中尤其有用。下文更详细地描述了α-淀粉酶变体的这些不同用途。

5.清洁和洗涤组合物和用途

可以将本文讨论的α-淀粉酶变体配制在用于清洁餐具的洗涤剂组合物中或其他清洁组合物中。这些组合物可以是凝胶、粉末或液体。组合物可以包括单独的α-淀粉酶变体、其他淀粉分解酶、其它清洁酶以及清洁组合物常用的其他组分。

因此，餐具洗涤洗涤剂组合物可以包括表面活性剂。表面活性剂可以是阴离子型、非离子型、阳离子型、两性离子型或这些类型的混合。洗涤剂可以含有按重量计0％至约90％的非离子表面活性剂，例如低或无泡沫乙氧基化丙氧基化直链醇。

在洗涤剂应用中，通常将α-淀粉酶变体用于含有丙二醇的液体组合物中。例如通过在含有10％氯化钙的25％体积/体积丙二醇溶液中循环，使α-淀粉酶变体溶解于丙二醇。

餐具洗涤洗涤剂组合物可含有无机和/或有机类型的洗涤剂助洗剂盐。洗涤剂助洗剂可细分为含磷和不含磷的类型。洗涤剂组合物通常含有约1％至约90％的洗涤剂助洗剂。当存在含磷的无机碱性洗涤剂助洗剂时，其实例包括水溶性盐，尤其是碱金属焦磷酸盐、正磷酸盐和多磷酸盐。当存在含磷的有机碱性洗涤剂助洗剂时，其实例包括水溶性膦酸盐。当存在不含磷的无机助洗剂时，其实例包括水溶性碱金属碳酸盐、硼酸盐和硅酸盐以及多种类型的水不溶性晶体或无定形硅铝酸盐，其中沸石是最为公知的代表。

适宜的有机助洗剂的实例包括碱金属；铵和取代的铵；柠檬酸盐；琥珀酸盐；丙二酸盐；脂肪酸磺酸盐；羧基甲氧基琥珀酸盐；聚乙酸铵；羧酸酯；聚羧酸酯；氨基聚羧酸酯；聚乙酰基羧酸酯；和多羟基磺酸酯(polyhydroxsulphonates)。

其他适宜的有机助洗剂包括已知具有助洗剂性能的较高分子量的聚合物和共聚物，例如适当的聚丙烯酸、聚马来酸和聚丙烯酸/聚马来酸共聚物，及它们的盐。

清洁组合物可含有氯/溴类型或氧类型的漂白剂。无机氯/溴类型漂白剂的实例是锂、钠或钙的次氯酸盐和次溴酸盐，以及氯化磷酸三钠。有机氯/溴类型漂白剂的实例是杂环N-溴和N-氯酰亚胺类，如三氯异氰脲酸、三溴异氰脲酸、二溴异氰脲酸、和二氯异氰脲酸，及其与水增溶性阳离子(如钾和钠)的盐。乙内酰脲化合物也是适宜的。

清洁组合物可含有氧漂白剂，例如以无机过酸盐的形式，任选与例如漂白前体一起或以过氧酸化合物的形式。适宜的过氧漂白化合物的典型实例是碱金属过硼酸盐(四水合物和一水合物)，碱金属过碳酸盐、碱金属过硅酸盐和碱金属过磷酸盐。合适的活性剂材料包含四乙酰乙二胺(TAED)和三乙酸甘油酯。酶促漂白活化体系也可以存在，例如过硼酸盐或过碳酸盐、三乙酸甘油酯和过水解酶(perhydrolase)，例如，如WO 2005/056783中所公开的那样。

可使用常规用于酶的稳定剂来稳定清洁组合物，该稳定剂例如多元醇例如丙二醇、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物(例如芳族硼酸酯)。清洁组合物也可含有其它常规洗涤剂成分，例如反絮凝剂材料、填充剂材料、抑泡剂(foam depressor)、防腐蚀剂、污垢悬浮剂、螯合剂、防尘污再沾着剂、脱水剂、染料、杀细菌剂、荧光剂、增稠剂和香料。

最后，α-淀粉酶变体可用于常规餐具洗涤洗涤剂中，例如用于如下专利公开中描述的任何洗涤剂中(可考虑用本文所公开的α-淀粉酶变体替代或加入所列专利和公开的申请中公开任意的α-淀粉酶)：CA 2006687、GB 2200132、GB 2234980、GB 2228945、DE 3741617、DE 3727911、DE4212166、DE 4137470、DE 3833047、DE 4205071、WO 93/25651、WO93/18129、WO 93/04153、WO 92/06157、WO 92/08777、WO 93/21299、WO 93/17089、WO 93/03129、EP 481547、EP 530870、EP 533239、EP554943、EP 429124、EP 346137、EP 561452、EP 318204、EP 318279、EP 271155、EP 271156、EP 346136、EP 518719、EP 518720、EP 518721、EP 516553、EP 561446、EP 516554、EP 516555、EP 530635、EP 414197和美国专利号5,112,518、5,141,664和5,240,632。

6.衣物洗涤剂组合物及用途

根据该实施方案，通常一种或多种α-淀粉酶变体可为洗涤剂组合物的组分。如此，其可以以无粉尘颗粒、稳定的液体或受保护的酶的形式包括在洗涤剂组合物中。可以例如，按美国专利No.4,106,991和4,661,452所公开的那样来生产无粉尘颗粒，并且可任选地由本领域已知的方法进行包衣。蜡质包衣材料的实例是平均摩尔质量为1,000至20,000的聚(环氧乙烷)产物(聚乙二醇，PEG)；具有16-50个环氧乙烷单元的乙氧基化壬基酚；乙氧基化脂肪醇，其中醇含有12-20个碳原子，且其中有15-80个环氧乙烷单元；脂肪醇；脂肪酸；以及脂肪酸的甘油单酯和甘油二酯及甘油三酯。例如英国专利No.1483591给出了适于通过流化床技术应用的成膜包衣材料的实例。可例如通过加入多元醇诸如丙二醇、糖或糖醇、乳酸或硼酸，按照已建立的方法来稳定液态酶制品。其他酶稳定剂是本领域公知的。可按照例如US 5,879,920(Genencor International，Inc.)或EP 238,216公开的方法来制备受保护的酶。长期以来多元醇被公认为蛋白质的稳定剂，和用于提高蛋白质的溶解性，参见例如，Kaushik等人，“Why is trehalose anexceptional protein stabilizer？An analysis of the thermal stability ofproteins in the presence of the compatible osmolyte trehalose”J.Biol.Chem.278：26458-65(2003)和其中引用的参考文献；以及M.Conti等人，“Capillary isoelectric focusing：the problem of protein solubility，”J.Chromatography757：237-245(1997)。

洗涤剂组合物可以是任何便利的形式，例如凝胶、粉末、颗粒、糊剂或液体。液体洗涤剂可以是水性的，通常含有高达约70％的水和0％至约30％的有机溶剂，其也可以是只含有约30％水的压缩凝胶(compact gel)类型的形式。

洗涤剂组合物可以包括一种或多种表面活性剂，其中每种都可以是阴离子型、非离子型、阳离子型或两性离子型。洗涤剂将通常包含0％至约50％的阴离子表面活性剂，例如线性烷基苯磺酸盐(LAS)；α-烯烃磺酸盐(AOS)；烷基硫酸盐(脂肪醇硫酸盐)(AS)；醇乙氧基硫酸盐(AEOS或AES)；仲烷基磺酸盐(SAS)；α-磺基脂肪酸甲酯；烷基或烯基琥珀酸；或皂。组合物也可包含0％至约40％的非离子表面活性剂，例如醇乙氧基化物(AEO或AE)、羧化的醇乙氧基化物、壬基酚乙氧基化物、烷基多苷、烷基二甲基胺氧化物、乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺、脂肪酸单乙醇酰胺、或多羟基烷基脂肪酸酰胺(如例如在WO 92/06154中所述)。

洗涤剂组合物可另外包括一种或多种其他酶，例如脂肪酶、角质酶、蛋白酶、纤维素酶、过氧化物酶、和/或漆酶的任何组合。

洗涤剂可含有约1％到约65％的洗涤剂助洗剂或络合剂，如沸石、二磷酸盐、三磷酸盐、膦酸盐、柠檬酸盐、次氮基三乙酸(NTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTMPA)、烷基或烯基琥珀酸、可溶性硅酸盐或层状硅酸盐(例如，来自Hoechst的SKS-6)。洗涤剂也可以是无助洗剂的，即基本上不含洗涤剂助洗剂。可以在与酶的稳定性兼容的任何组合物中使用酶。通常可以用已知的包囊化形式(例如通过造粒或隔离在水凝胶中)来保护酶免于遭遇有害组分。具有或不具有淀粉结合结构域的酶(尤其是α-淀粉酶)不局限于洗衣和餐具洗涤应用，而是可以用于表面清洁剂以及用于由淀粉或生物质(biomass)生产乙醇。

洗涤剂可包括一种或多种聚合物。实例包括羧甲基纤维素(CMC)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯如聚丙烯酸酯、马来酸/丙烯酸共聚物和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物。

洗涤剂可含有漂白系统，这可包括H₂O₂来源(例如过硼酸盐或过碳酸盐)，其可以与形成过酸的漂白活性剂，如四乙酰基乙二胺(TAED)或壬酰基氧基苯磺酸盐(NOBS)联用。或者，漂白系统可包括过氧酸(例如酰胺、亚胺或砜类过氧酸)。漂白系统也可以是酶促漂白系统，其中过水解酶活化过氧化物，例如WO 2005/056783中所述的那些。

可使用常规稳定剂来稳定洗涤剂组合物中的酶，稳定剂例如多元醇如丙二醇或甘油；糖或糖醇；乳酸；硼酸或硼酸衍生物如硼酸芳香酯；并且可按例如WO 92/19709和WO 92/19708所述配制组合物。

洗涤剂也可含有其它常规洗涤剂成分，例如织物调理剂，包括粘土、增泡剂、抑泡剂、防腐蚀剂、污垢悬浮剂、防尘污再沾着剂、染料、杀细菌剂、荧光增白剂或香料。pH(在使用浓度下于水性溶液中测量)通常是中性或碱性，例如pH约7.0至约11.0。

α-淀粉酶变体可以按常规用于洗涤剂中的浓度掺入。目前认为在洗涤剂组合物中可以按相当于每升洗液0.00001-1.0mg(按纯酶蛋白质计算)α-淀粉酶变体的量加入α-淀粉酶变体。包括α-淀粉酶变体的洗涤剂组合物可以配制成的具体形式包括：

(1)具有体积密度(bulk density)为至少600g/L的颗粒剂形式的洗涤剂组合物，包括约7％至约12％的线性烷基苯磺酸盐(按酸计算)；约1％至约4％的醇乙氧基硫酸盐(例如C_12-18醇，1-2环氧乙烷(EO))或烷基硫酸盐(例如C_16-18)；约5％至约9％的醇乙氧基化物(例如C_14-15醇，7EO)；约14％至约20％的碳酸钠(例如Na₂CO₃)；约2％至约6％的可溶性硅酸盐(例如Na₂O，2SiO₂)；约15％至约22％的沸石(例如NaAlSiO₄)；0％至约6％的硫酸钠(例如Na₂SO₄)；约0％至约15％的柠檬酸钠/柠檬酸(例如C₆H₅Na₃O₇/C₆H₈O₇)；约11％至约18％的过硼酸钠(例如NaBO₃H₂O)；约2％至约6％的TAED；0％至约2％的羧甲基纤维素(CMC)；0-3％的聚合物(例如马来酸/丙烯酸共聚物，PVP，PEG)；0.0001-0.1％蛋白质的酶(按纯酶计算)；和0-5％次要成分(例如抑泡剂、香料、荧光增白剂、光漂白剂)。

(2)具有体积密度为至少600g/L的颗粒剂形式的洗涤剂组合物，包括约6％至约11％的线性烷基苯磺酸盐(按酸计算)；约1％至约3％的醇乙氧基硫酸盐(例如C_12-18醇，1-2EO)或烷基硫酸盐(例如C_16-18)；约5％至约9％的醇乙氧基化物(例如C_14-15醇，7EO)；约15％至约21％的碳酸钠(例如Na₂CO₃)；约1％至约4％的可溶性硅酸盐(例如Na₂O，2SiO₂)；约24％至约34％的沸石(例如NaAlSiO₄)；约4％至约10％的硫酸钠(例如Na₂SO₄)；0％至约15％的柠檬酸钠/柠檬酸(例如C₆H₅Na₃O₇/C₆H₈O₇)；0％至约2％的羧甲基纤维素(CMC)；1-6％的聚合物(例如马来酸/丙烯酸共聚物，PVP，PEG)；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；0-5％的次要成分(例如抑泡剂、香料)。

(3)具有体积密度为至少600g/L的颗粒剂形式的洗涤剂组合物，包括约5％至约9％的线性烷基苯磺酸盐(按酸计算)；约7％至约14％的醇乙氧基化物(例如C_12-15醇，7EO)；约1％至约3％的皂如脂肪酸(例如C_16-22脂肪酸)；约10％至约17％的碳酸钠(如Na₂CO₃)；约3％至约9％的可溶性硅酸盐(例如Na₂O，2SiO₂)；约23％至约33％的沸石(如NaAlSiO₄)；0％至约4％的硫酸钠(例如Na₂SO₄)；约8％至约16％的过硼酸钠(例如NaBO₃H₂O)；约2％至约8％TAED；0％至约1％的膦酸盐(例如EDTMPA)；0％至约2％的羧甲基纤维素(CMC)；0-3％的聚合物(例如马来酸/丙烯酸共聚物，PVP，PEG)；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；0-5％的次要成分(例如抑泡剂、香料、荧光增白剂)。

(4)具有体积密度为至少600g/L的颗粒剂形式的洗涤剂组合物，包括约8％至约12％的线性烷基苯磺酸盐(按酸计算)；约10％至约25％的醇乙氧基化物(例如C_12-15醇，7EO)；约14％至约22％的碳酸钠(如Na₂CO₃)；约1％至约5％的可溶性硅酸盐(例如Na₂O，2SiO₂)；约25％至约35％的沸石(例如NaAlSiO₄)；0％至约10％的硫酸钠(例如Na₂SO₄)；0％至约2％的羧甲基纤维素(CMC)；1-3％的聚合物(例如马来酸/丙烯酸共聚物，PVP，PEG)；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；和0-5％的次要成分(例如抑泡剂、香料)。

(5)水性液体洗涤剂组合物，包括约15％至约21％的线性烷基苯磺酸盐(按酸计算)；约12％至约18％的醇乙氧基化物(例如C_12-15醇，7EO或C_12-15醇，5EO)；约3％至约13％的皂如脂肪酸(例如油酸)；0％至约13％的烯基琥珀酸(C_12-14)；约8％至约18％的氨基乙醇；约2％至约8％的柠檬酸；0％至约3％的膦酸盐；0％至约3％的聚合物(例如PVP，PEG)；0％至约2％的硼酸盐(例如B₄O₇)；0％至约3％的乙醇；约8％至约14％的丙二醇；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；和0-5％的次要成分(例如分散剂、抑泡剂、香料、荧光增白剂)。

(6)水性结构型液体洗涤剂组合物，包括约15％至约21％的线性烷基苯磺酸盐(按酸计算)；3-9％的醇乙氧基化物(例如C_12-15醇，7EO或C_12-15醇，5EO)；约3％至约10％的皂如脂肪酸(例如油酸)；约14％至约22％的沸石(如NaAlSiO₄)；约9％至约18％的柠檬酸钾；0％至约2％的硼酸盐(例如B₄O₇)；0％至约2％的羧甲基纤维素(CMC)；0％至约3％的聚合物(例如PEG，PVP)；0％至约3％的锚定聚合物(anchoring polymer)(例如甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物；摩尔比25∶1，MW 3800)；0％至约5％的甘油；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；和0-5％的次要成分(例如分散剂、抑泡剂、香料、荧光增白剂)。

(7)具有体积密度为至少600g/L的颗粒剂形式的洗涤剂组合物，包括约5％至约10％的脂肪醇硫酸盐；约3％至约9％的乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺；0-3％的皂如脂肪酸；约5％至约10％的碳酸钠(例如Na₂CO₃)；约1％至约4％的可溶性硅酸盐(例如Na₂O，2SiO₂)；约20％至约40％的沸石(例如NaAlSiO₄)；约2％至约8％的硫酸钠(例如Na₂SO₄)；约12％至约18％的过硼酸钠(例如NaBO₃H₂O)；约2％至约7％的TAED；约1％至约5％的聚合物(例如马来酸/丙烯酸共聚物，PEG)；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；和0-5％的次要成分(例如荧光增白剂，抑泡剂、香料)。

(8)颗粒剂形式的洗涤剂组合物，包括约8％至约14％的线性烷基苯磺酸盐(按酸计算)；约5％至约11％的乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺；0％至约3％的皂如脂肪酸；约4％至约10％的碳酸钠(例如Na₂CO₃)；约1％至约4％的可溶性硅酸盐(Na₂O，2SiO₂)；约30％至约50％的沸石(例如NaAlSiO₄)；约3％至约11％的硫酸钠(例如Na₂SO₄)；约5％至约12％的柠檬酸钠(例如C₆H₅Na₃O₇)；约1％至约5％的聚合物(例如PVP，马来酸/丙烯酸共聚物，PEG)；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；和0-5％的次要成分(例如抑泡剂、香料)。

(9)颗粒剂形式的洗涤剂组合物，包括约6％至约12％的线性烷基苯磺酸盐(按酸计算)；约1％至约4％的非离子表面活性剂；约2％至约6％的皂如脂肪酸；约14％至约22％的碳酸钠(例如Na₂CO₃)；约18％至约32％的沸石(例如，NaAlSiO₄)；约5％至约20％的硫酸钠(例如Na₂SO₄)；约3％至约8％的柠檬酸钠(例如C₆H₅Na₃O₇)；约4％至约9％的过硼酸钠(例如NaBO₃H₂O)；约1％至约5％的漂白活性剂(例如NOBS或TAED)；0％至约2％的羧甲基纤维素(CMC)；约1％至约5％的聚合物(例如聚羧酸酯或PEG)；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；和0-5％的次要成分(例如，荧光增白剂、香料)。

(10)水性液体洗涤剂组合物，包括约15％至约23％的线性烷基苯磺酸盐(按酸计算)；约8％至约15％的醇乙氧基硫酸盐(例如C_12-15醇，2-3EO)；约3％至约9％的醇乙氧基化物(例如C_12-15醇，7EO或C_12-15醇，5EO)；0％至约3％的皂如脂肪酸(例如月桂酸)；约1％至约5％的氨基乙醇；约5％至约10％的柠檬酸钠；约2％至约6％的助水溶物(例如甲苯磺酸钠)；0％至约2％的硼酸盐(例如B₄O₇)；0％至约1％的羧甲基纤维素；约1％至约3％的乙醇；约2％至约5％的丙二醇；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；和0-5％的次要成分(例如聚合物、分散剂、香料、荧光增白剂)。

(11)水性液体洗涤剂组合物，包括约20％至约32％的线性烷基苯磺酸盐(按酸计算)；6-12％的醇乙氧基化物(例如C_12-15醇，7EO或C_12-15醇，5EO)；约2％至约6％的氨基乙醇；约8％至约14％的柠檬酸；约1％至约3％的硼酸盐(例如B₄O₇)；0％至约3％的聚合物(例如马来酸/丙烯酸共聚物，锚定聚合物例如甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物)；约3％至约8％的甘油；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；和0-5％的次要成分(例如助水溶物、分散剂、香料、荧光增白剂)。

(12)具有体积密度为至少600g/L的颗粒剂形式的洗涤剂组合物，包括约25％至约40％的阴离子表面活性剂(线性烷基苯磺酸盐、烷基硫酸盐、α-烯烃磺酸盐、α-磺基脂肪酸甲酯、烷基磺酸盐、皂)；约1％至约10％的非离子表面活性剂(例如醇乙氧基化物)；约8％至约25％的碳酸钠(例如Na₂CO₃)；约5％至约15％的可溶性硅酸盐(例如Na₂O，2SiO₂)；0％至约5％的硫酸钠(例如Na₂SO₄)；约15％至约28％的沸石(NaAlSiO₄)；0％至约20％的过硼酸钠(例如NaBO₃·H₂O)；约0％至约5％的漂白活性剂(TAED或NOBS)；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；0-3％的次要成分(例如香料、荧光增白剂)。

(13)如上面组合物1)-12)所述的洗涤剂组合物，其中所有或者部分的线性烷基苯磺酸盐被(C₁₂-C₁₈)烷基硫酸盐代替。

(14)具有体积密度为至少600g/L的颗粒剂形式的洗涤剂组合物，包括约9％至约15％的(C₁₂-C₁₈)烷基硫酸盐；约3％至约6％的醇乙氧基化物；约1％至约5％的多羟基烷基脂肪酸酰胺；约10％至约20％的沸石(例如NaAlSiO₄)；约10％至约20％的层状焦硅酸盐(例如来自Hoechst的SK56)；约3％至约12％的碳酸钠(例如Na₂CO₃)；0％至约6％的可溶性硅酸盐(例如Na₂O，2SiO₂)；约4％至约8％的柠檬酸钠；约13％至约22％的过碳酸钠；约3％至约8％的TAED；0％至约5％的聚合物(例如聚羧酸酯和PVP)；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；和0-5％的次要成分(例如荧光增白剂、光漂白剂、香料、抑泡剂)。

(15)具有体积密度为至少600g/L的颗粒剂形式的洗涤剂组合物，包括约4％至约8％的(C₁₂-C₁₈)烷基硫酸盐；约11％至约15％的醇乙氧基化物；约1％至约4％的皂；约35％至约45％的沸石MAP或沸石A；约2％至约8％的碳酸钠(如Na₂CO₃)；0％至约4％的可溶性硅酸盐(例如Na₂O，2SiO₂)；约13％至约22％的过碳酸钠；1-8％的TAED；0％至约3％的羧甲基纤维素(CMC)；0％至约3％的聚合物(例如聚羧酸酯和PVP)；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；和0-3％的次要成分(例如荧光增白剂、膦酸盐、香料)。

(16)上面1)-15)所述的洗涤剂制剂，其含有被稳定化的或囊化的过酸作为额外组分或者作为已经述及的漂白系统的替代物。

(17)上面1)、3)、7)、9)和12)所述的洗涤剂组合物，其中过硼酸盐被过碳酸盐代替。

(18)上文1)、3)、7)、9)、12)、14)和15)所述的洗涤剂组合物，还含有锰催化剂。

(19)配制成非水性洗涤剂液体的洗涤剂组合物，包括液态非离子表面活性剂，例如，线性烷氧基化伯醇、助洗剂体系(例如磷酸盐)、酶和碱。该洗涤剂也可包括阴离子表面活性剂和/或漂白系统。

在另一个实施方案中，可将2，6-β-D-果聚糖水解酶掺入洗涤剂组合物中并用于家居和/或工业纺织品/衣物上存在的生物膜的去除/清洁。

例如，可以将洗涤剂组合物配制成手洗或机洗的洗衣洗涤剂组合物，包括适于预处理污染的织物的洗衣添加剂组合物和漂洗添加的织物软化剂组合物，或者配制成用于一般的家居硬表面清洁操作的洗涤剂组合物，或者配制以用于手洗或机洗的餐具洗涤操作。

一个具体的方面，洗涤剂组合物可以包括2，6-β-D-果聚糖水解酶，一种或多种α-淀粉酶变体，和一种或多种其它清洁酶，例如蛋白酶、脂肪酶、角质酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯聚糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶、漆酶和/或过氧化物酶和/或其组合。通常，所选酶的特性应与选择的洗涤剂兼容(例如最适pH、与其他酶和非酶成分的兼容性等)，且所述酶应以有效量存在。

蛋白酶：适宜的蛋白酶包括动物、植物或微生物来源的那些。包括经化学修饰或蛋白质改造的突变体。蛋白酶可以是丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶、碱性微生物蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶。碱性蛋白酶的实例是枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)，尤其是源自芽孢杆菌属的那些，例如枯草杆菌蛋白酶Novo、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg、枯草杆菌蛋白酶309(见如美国专利号6,287,841)、枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168(参见例如，WO89/06279)。胰蛋白酶样蛋白酶的实例是胰蛋白酶(例如源于猪或牛)和镰孢霉属蛋白酶(参见例如，WO 89/06270和WO 94/25583)。有用的蛋白酶的实例也包括但不限于WO 92/19729和WO 98/20115中所述的变体。合适的市售蛋白酶包括

和Kannase^TM(Novozymes，前身为Novo Nordisk A/S)；

Maxacal^TM、Maxapem^TM、Properase^TM、

Purafect OxP^TM、FN2^TM和FN3^TM(Genencor International，Inc.)。

脂肪酶：适宜的脂肪酶包括细菌或真菌来源的那些。包括经化学修饰或蛋白质改造的突变体。有用的脂肪酶的实例包括但不限于来自腐质霉属(Humicola)(与嗜热丝孢菌属(Thermomyces)同义)的脂肪酶，例如来自疏毛腐质霉(H.lanuginosa)(疏棉状嗜热丝孢菌(T.lanuginosus))(参见例如，EP 258068和EP 305216)、来自特异腐质霉(H.insolens)(参见例如，WO96/13580)；假单胞菌属(Pseudomonas)脂肪酶(例如来自产碱假单胞菌(P.alcaligenes)或类产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligenes)；参见例如EP 218272)，洋葱假单胞菌(P.cepacia)(参见例如EP 331 376)、斯氏假单胞菌(P.stutzeri)(参见例如GB 1,372,034)、荧光假单胞菌(P.fluorescens)、假单胞菌属菌株SD 705(参见例如，WO 95/06720和WO 96/27002)、P.wisconsinensis(参见例如WO 96/12012)的脂肪酶；芽孢杆菌属脂肪酶(例如来自枯草芽孢杆菌；参见例如Dartois等人，Biochemica et Biophysica Acta，1131：253-360(1993))，嗜热脂肪芽孢杆菌(参见例如JP 64/744992)或短小芽孢杆菌(B.pumilus)(参见例如WO 91/16422)的脂肪酶。其他可以考虑在制剂中使用的脂肪酶变体包括例如在WO 92/05249、WO 94/01541、WO95/35381、WO 96/00292、WO 95/30744、WO 94/25578、WO 95/14783、WO 95/22615、WO 97/04079、WO 97/07202、EP 407225和EP 260105中描述的那些。一些市售可得的脂肪酶包括

和Ultra(Novozymes，前身Novo Nordisk A/S)。

聚酯酶：适宜的聚酯酶包括但不限于WO 01/34899(GenencorInternational，Inc.)和WO 01/14629(Genencor Interntional，Inc.)中描述的那些，并且可以与本文描述的其他酶以任意组合包括在组合物中。

淀粉酶：组合物可与其他α-淀粉酶组合，如非变体α-淀粉酶。这些酶可包含市售的淀粉酶，例如但不限于Termamyl^TM、

和BAN^TM(Novozymes，前身是Novo Nordisk A/S)，

和

(Genencor International，Inc.)。

纤维素酶：可以向组合物中加入纤维素酶。适宜的纤维素酶包括细菌或真菌来源的那些。包括经化学修饰的或蛋白质改造的突变体。适宜的纤维素酶包括来自芽孢杆菌属、假单胞菌属、腐质霉属、镰孢霉属、梭孢壳属(Thielavia)、枝顶孢属(Acremonium)的纤维素酶，例如如美国专利No.4,435,307；5,648,263；5,691,178；5,776,757和WO 89/09259公开的自特异腐质霉、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)和尖镰孢产生的真菌纤维素酶。可以考虑使用的示例性纤维素酶为对于纺织品具有颜色护理益处的那些。此类纤维素酶的实例是描述于例如EP 0495257、EP 531372、WO99/25846(Genencor International，Inc.)，WO 96/34108(GenencorInternational，Inc.)，WO 96/11262、WO 96/29397和WO 98/08940中的纤维素酶。其他实例是纤维素酶变体，例如描述于WO 94/07998、WO98/12307、WO 95/24471、PCT/DK98/00299、EP 531315、美国专利No.5,457,046、5,686,593和5,763,254中的纤维素酶变体。市售纤维素酶包含

和

(Novozymes，前身是Novo Nordisk A/S)、Clazinase^TM和

HA(Genencor International，Inc.)、KAC-500(B)^TM(Kao Corporation)。

过氧化物酶/氧化酶：考虑用于组合物中的适合的过氧化物酶/氧化酶包含植物、细菌或真菌来源的过氧化物酶/氧化酶。其包含化学修饰或蛋白质工程突变体。有用的过氧化物酶的实例包含描述于WO 93/24618、WO95/10602和WO 98/15257中的来自鬼伞属(Coprinus)(例如灰盖鬼伞(C.cinereus))的过氧化物酶及其变体。

可通过添加含有一种或多种酶的分开的添加剂，或通过添加包括所有这些酶的组合的添加剂而在洗涤剂组合物中包括洗涤剂酶。可以将洗涤剂添加剂，即分开的添加剂或组合的添加剂配成例如颗粒、液体、浆液等。适宜的颗粒洗涤剂添加剂制剂包含无粉尘颗粒。

可例如按照美国专利No.4,106,991和4,661,452所公开来生产无粉尘颗粒，并且可任选地用本领域已知的方法进行包衣。蜡质包衣材料的实例是平均分子量为1,000至20,000的聚环氧乙烷(聚乙二醇，PEG)；具有16-50个环氧乙烷单元的乙氧基化壬基酚；乙氧基化脂肪醇，其中醇含有12-20个碳原子且其中有15-80个环氧乙烷单元；脂肪醇；脂肪酸；以及脂肪酸的甘油单酯和甘油二酯及甘油三酯。例如GB 1483591给出了适于通过流化床技术应用的成膜包衣材料的实例。可例如通过加入多元醇诸如丙二醇、糖或糖醇、乳酸或硼酸，按照已建立的方法来稳定液态酶制品。可按照如EP 238,216公开的方法来制备受保护的酶。

洗涤剂组合物可以是任何便利的形式，例如棒、片、凝胶、粉末、颗粒、糊或液体。液体洗涤剂可以是水性的，通常含有高达约70％的水，和0％至约30％的有机溶剂。也可以考虑含有约30％或更少水的压缩(compact)洗涤剂凝胶。洗涤剂组合物可以包括一种或多种表面活性剂，该表面活性剂可以是非离子型，包括半极性、阴离子型、阳离子型或两性离子型，或其组合。表面活性剂一般按以重量计约0.1％-60％的水平存在。

当包括在洗涤剂中时，洗涤剂典型地将含有约1％至约40％的阴离子表面活性剂，例如线性烷基苯磺酸盐、α-烯烃磺酸盐、烷基硫酸盐(脂肪醇硫酸盐)、醇乙氧基硫酸盐、仲烷基磺酸盐、α-磺基脂肪酸甲酯、烷基或烯基琥珀酸、或皂。

当包括在洗涤剂中时，洗涤剂通常将含有约0.2％至约40％的非离子表面活性剂，如醇乙氧基化物、壬基酚乙氧基化物、烷基多苷、烷基二甲基胺氧化物、乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺、脂肪酸单乙醇酰胺、多羟基烷基脂肪酸酰胺、或葡糖胺的N-酰基-N-烷基衍生物(“葡糖酰胺”)。

洗涤剂可含有0％至约65％的洗涤剂助洗剂或络合剂(complexingagent)，例如沸石、二磷酸盐、三磷酸盐、膦酸酯、碳酸盐、柠檬酸盐、次氮基三乙酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸、烷基或烯基琥珀酸、可溶性硅酸盐或层状硅酸盐(例如来自Hoechst的SKS-6)。

洗涤剂可包括一种或多种聚合物。实例有羧甲基纤维素(CMC)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚(乙烯基吡啶-N-氧化物)、聚乙烯基咪唑、聚羧酸酯(如聚丙烯酸酯、马来酸/丙烯酸共聚物)和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物。

洗涤剂可含有漂白系统，这可包括H₂O₂来源(例如过硼酸盐或过碳酸盐)，其可以与形成过酸的漂白活性剂(如四乙酰基乙二胺或壬酰基氧基苯磺酸盐)联用。或者，漂白系统可包括过氧酸(例如酰胺、酰亚胺或砜类过氧酸)。漂白系统也可以是酶促漂白系统。

可使用常规的稳定剂来稳定洗涤剂组合物中的酶，稳定剂例如：多元醇(如丙二醇或甘油)、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物(例如，硼酸芳族酯)、或苯基硼酸衍生物(例如4-甲酰基苯基硼酸)。可按照WO 92/19709和WO 92/19708所述配制所述组合物。

洗涤剂也可含有其他常规洗涤剂成分，例如织物调理剂，包括粘土、增泡剂、抑泡剂、防腐蚀剂、污垢悬浮剂、防尘污再沾着剂、染料、杀细菌剂、荧光增白剂、助水溶物、晦暗抑制剂或香料。

认为在洗涤剂组合物中，尤其是酶变体可以按相当于每升洗液约0.01至约100mg酶蛋白质(尤其是每升洗液约0.05至约5.0mg酶蛋白质，特别是每升洗液约0.1至约1.0mg酶蛋白质)的量加入。

6.1.评估洗涤剂组合物的方法

存在众多α-淀粉酶清洁测定法。检测清洁的示例性描述包括如下内容。“样片”(swatch)是一块材料，诸如其上施有污渍的织物。该材料可以是例如由棉、聚酯或天然和合成纤维的混合物制成的织物。备选的，该材料还可以是纸，例如滤纸或硝化纤维素，或者是一块硬材料，例如陶瓷、金属或玻璃。对于α-淀粉酶，污渍是基于淀粉的，但是也可以包括血液、乳、墨水、草、茶、酒、菠菜、肉汁、巧克力豆、奶酪、粘土、色素、油或这些化合物的混合物。

“小样片”是自样片上用单孔穿孔装置切下的部分，或者用定制的96孔穿孔装置(该多孔穿孔模式与标准96孔微滴定板匹配)切下的部分，或者是以其它方式自样片上取下的部分。样片可以是纺织品、纸、金属或其他适宜的材料。小样片可以在放入24孔、48孔或96孔微滴定板孔之前或之后被污物固着。“小样片”也可以通过向小块材料施加污物而制成。例如，小样片可以是直径为5/8”或0.25”的污染的织物片。定制的穿孔机经设计可以同时将96个样片递送至96孔板的所有孔中。该装置可以通过简单地向同一96孔板多次上样，而向每孔递送一个以上的样片。可以想到将多孔穿孔装置用于向任何格式的板(包括但不限于24孔、48孔和96孔板)同时递送多个样片。另一可想到的方法中，污染的测试平台可以是由金属、塑料、玻璃、陶瓷，或其他适宜材料形成的、被污物载污体包覆的珠。然后将一个或多个污物包覆的珠放入含有适宜缓冲液和酶的96孔、48孔或24孔板的孔中或更大形式的板的孔中。这种情况下，可以通过直接吸光度测量或在二级生色反应后在上清液中检测释放的污物。也可以通过质谱分析来进行释放的污染物的分析。

在一个实施方案中，处理方案提供对控制污渍固着(fixation)程度。结果是，可以产生例如当在不存在被检测的酶的情况下进行洗涤时能释放出不等量的污渍的样片。固着的样片的使用导致在洗涤试验中信噪比的显著提高。此外，通过改变固着程度，可以产生在不同清洁条件下给出最佳结果的污渍。

在多种材料类型上具有已知“强度”的污渍的样片是市售可得的(EMPA，St.Gallen，Switzerland；wfk-Testgewebe GmbH，KrefeldGermany；或Center for Test Materials，Vlaardingen，The Netherlands)和/或可以由从业者制得(Morris和Prato，Textile Research Journal 52(4)：280286(1982))。样片包含含棉织物，其含有血液/乳/墨水(BMI)污渍、菠菜污渍、草或巧克力/乳/烟灰。可以用0.0003％至0.3％的过氧化氢将BMI污渍固着在棉上。其他组合包括用0.001％-1％戊二醛固着的草或菠菜、用0.001％-1％戊二醛固着的明胶和考马斯染料、或用0.001％-1％戊二醛固着的巧克力、乳和烟灰。

也可以在用酶和/或洗涤剂制剂孵育期间搅拌样片。洗涤性能数据取决于孔中，尤其是在96孔板中的样片的取向(水平对垂直)。这表明在孵育期间混合是不充分的。尽管存在许多方式来保证孵育期间充分的搅拌，但可以构建将微滴定板夹在两个铝板之间的板夹。这可以简单地例如在孔上方放置粘性板密封物，然后用任何类型的适合的、市售可得的夹子将两个铝板与96孔板夹紧而实现。然后可以将它放到商品化的孵育摇床中。将摇床设定为约400转/分钟可以导致非常有效的混合，而板夹有效地阻止了泄漏或交叉污染。

可以使用三硝基苯磺酸(TNBS)来量化洗液中的氨基基团浓度。这可以用作从样片中去除的蛋白质量的量度(参见例如Cayot和Tainturier，Anal.Biochem.249：184-200(1997))。然而，如果洗涤剂或酶样品导致异乎寻常小的肽片段的形成(例如，因样品中存在肽酶所致)，那么人们将获得较大的TNBS信号，即更多“噪音”。

另一用于测量对血液/乳/墨水的洗涤性能的手段是基于墨水的释放，这可以通过测量洗液的吸光度而量化。可以在350和800nm之间的任何波长测量吸光度。另一方面，可以在410nm或620nm处测量波长。也可以检查洗液以确定对于含有草、菠菜、明胶或考马斯染料的污渍的洗涤性能。对于这些污渍，示例性的波长包括对于菠菜或草的670nm和对于明胶或考马斯染料的620nm。例如，移出等份试样的洗液(例如，通常来自96孔微板的100-150μL)并放到小杯或微孔微板中。然后将它放到分光光度计中并在适当的波长读取吸光度。也可以使用该体系，例如通过使用在诸如布、塑料或陶瓷的适宜载污体上的血液/乳/墨水污渍，来测定用于餐具洗涤的酶和/或洗涤剂组合物。

一方面，可以通过在25℃将0.3％过氧化氢施加到BMI/棉样片上30分钟或通过在60℃将0.03％过氧化氢施加到BMI/棉样片上30分钟，在棉上固着BMI污渍。从BMI/棉样片上切下约0.25″的小样片并放入96孔微滴定板的孔中。向各孔中放入已知的洗涤剂组合物和酶如变体蛋白质的混合物。向微滴定板顶部放置粘性板密封物后，将微滴定板与铝板夹在一起，并在定轨摇床上以约250转/分钟搅拌约10-60分钟。这个时间结束后，将上清液转移到新的微滴定板的孔中并测量620nm的墨水吸光度。这可以类似地用通过在25℃向菠菜/棉样片或草/棉样片施加0.01％戊二醛30分钟而固着在棉上的菠菜污渍或草污渍来进行检测。这也可以用巧克力、乳和/或烟灰污渍完成。

7.生物膜去除组合物和用途

组合物可以包括一种变体α-淀粉酶作为主要的酶组分，例如单组分组合物，用于去除生物膜。或者，组合物可以包括多种酶活性，例如多种淀粉酶，或酶混合物，包括氨肽酶、淀粉酶(β-或α-或葡糖-淀粉酶)、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精葡聚糖转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、卤代过氧化物酶(haloperoxidase)、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶分解酶、肽谷氨酰胺酶(peptidoglutaminase)、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶和/或木聚糖酶，或其任意组合，用于去除生物膜。其他酶可通过属于如下属或种的微生物生产：曲霉属，例如棘孢曲霉(A.aculeatus)、泡盛曲霉、黑曲霉或米曲霉；或木霉属；腐质霉属，例如特异腐质霉(H.insolens)；或镰孢霉属，例如杆孢状镰孢(F.bactridioides)、F.cerealis、F.crookwellense、大刀镰孢(F.culmorum)、禾本科镰孢(F.graminearum)、禾赤镰孢(F.graminum)、异孢镰孢(F.heterosporum)、合欢木镰孢(F.negundi)、尖镰孢、多枝镰孢(F.reticulatum)、粉红镰孢(F.roseum)、接骨木镰孢(F.sambucinum)、肤色镰孢(F.sarcochroum)、硫色镰孢(F.sulphureum)、F.toruloseum、拟丝孢镰孢(F.trichothecioides)或Fusarium venenatum。

包括α-淀粉酶变体的组合物可以按照本领域已知的方法制备，并且可以是液体或干组合物的形式。例如，含α-淀粉酶变体的组合物可以是颗粒或微颗粒的形式。欲包括在组合物中的多肽可以按照本领域已知的方法稳定化。

下文给出了多肽组合物用途的实例。含α-淀粉酶变体组合物的用量及组合物使用的其他条件可以基于本领域已知的方法来确定。还考虑α-淀粉酶变体与2，6-β-D-果聚糖水解酶或其变体一起用在组合物中。

一种方法是瓦解和/或去除生物膜。如本文所用的术语“瓦解”应理解为水解生物膜基质中的多糖，该多糖在生物膜中将个体微生物细胞连接并结合在一起，由此所述微生物细胞能够从生物膜中释放并除去。生物膜存在于表面，故生物膜的瓦解可以通过用含有α-淀粉酶变体或一种或多种其他负责降解生物膜的酶(例如但不限于2，6-β-D-果聚糖水解酶)的水性介质接触表面(例如通过浸没、覆盖或喷洒表面)而实现。组合物可用于水解例如纸浆业和纸业白水中的腐浆(slime)。

α-淀粉酶变体的存在量可以是0.0001-10,000mg/L，或0.001-1000mg/L，或0.01-100mg/L，或甚至是0.1-10mg/L。其他酶及酶变体可以以相似或更低的量存在。该方法可以适宜地在室温至约70℃的温度进行。适宜的温度范围为约30℃至约60℃，例如约40℃至约50℃。

用于水解生物膜的适宜pH处在约3.5至约8.5的范围内。尤其适宜的范围包括pH约5.5至约8，例如约6.5至约7.5。用于酶变体有效去除生物膜的接触时间或反应时间可以变化相当大，这取决于生物膜的特性以及表面用酶变体单独或组合其他酶如2，6-β-D-果聚糖水解酶处理的频率。例如，适宜的反应时间为约0.25至约25小时，例如约1至约10小时，例如约2小时。

可与α-淀粉酶变体和2，6-β-D-果聚糖水解酶组合的其他酶包括但不限于：纤维素酶，半纤维素酶，木聚糖酶，其他淀粉酶，包括其他α-淀粉酶，脂肪酶，蛋白酶和/或果胶酶。所述酶还可以与抗微生物剂组合，例如酶的或非酶的生物杀灭剂。酶生物杀灭剂可以是例如包括氧化还原酶，例如漆酶或过氧化物酶，特别是卤代过氧化物酶，和任选的增强剂，例如丁香酸烷基酯的组合物，例如WO 97/42825和DK 97/1273中所描述的那样。

待去除和/或清除生物膜的表面可以是硬表面，其定义涉及基本上微生物不能透过的任何表面。实例是由金属例如不锈钢合金、塑料/合成聚合物、橡胶、板材、玻璃、木材、纸、纺织品、混凝土、岩石、大理石、石膏及陶瓷材料制成的表面，其任选地以例如油漆、珐琅、聚合物等包覆。从而，表面可以是支持、运输、处理或接触水性溶液的系统(如供水系统、食品处理系统、冷却系统、化学处理系统、药物处理系统或木材加工系统(如见于制浆和/或造纸工业))的构件。因此，酶变体和含有酶变体的组合物可用于常规的就地清洗(C-I-P)系统。表面可以是系统单元(如管道、罐、泵、膜、滤器、热交换器、离心机、蒸发器、混合器、喷雾塔、阀门和反应器)的一部分。表面也可以是医学科学和工业所用的器具(如污染的内窥镜、假体装置或医学内植物)或其部分。

用于生物膜去除的组合物也可以考虑用于防止当金属表面例如管道受微生物生物膜攻击时发生的所谓生物腐蚀，即通过瓦解生物膜，由此防止生物膜中的微生物细胞建立起腐蚀其所附着的金属表面的生物膜环境。

7.1.口腔护理组合物

抗生物膜组合物的其他应用包含口腔护理。因此表面包含具有牙菌斑的牙齿。因此，变体酶可用在组合物(例如牙膏)和方法中用于制备瓦解人或动物牙齿上的菌斑的含酶变体药物。另一用途是自粘膜瓦解生物膜，例如患有囊性纤维化的患者肺中的生物膜。表面还可以是具有生物来源的其他表面(例如皮肤、牙齿、头发、指甲)或可以是受污染的隐形镜片。

在口腔护理组合物中有用的其他酶包含但不限于2，6-β-D-果聚糖水解酶；葡聚糖酶；齿斑葡聚糖酶(mutanase)；氧化酶，例如葡糖氧化酶，L-氨基酸氧化酶，过氧化物酶，例如WO 95/10602中所述的鬼伞属物种(Coprinus sp.)过氧化物酶或乳过氧化物酶，卤代过氧化物酶，特别是衍生自弯孢霉属物种(Curvularia sp.)、特别是糙壁弯孢(C.verruculosa)和不等弯孢(C.inaequalis)的卤代过氧化物酶；漆酶；蛋白酶例如木瓜蛋白酶，酸性蛋白酶(例如WO 95/02044中所述的酸性蛋白酶)，内切糖苷酶，脂肪酶，淀粉酶，包括淀粉葡糖苷酶，如AMG(Novo Nordisk A/Ss，前身是NovoNordisk A/S)；抗微生物酶，以及它们的混合物。

口腔护理组合物可以具有任何适宜的物理形式(即，粉末、糊、凝胶、液体、膏、片等)。“口腔护理组合物”包括可用于维持或改善人和动物口中口腔卫生的组合物，预防龋齿、预防牙菌斑和牙垢形成、去除牙菌斑和牙垢、预防和/或治疗牙科疾病等。口腔护理组合物也包括用于清洁假牙、人工牙齿等的产品。口腔护理组合物的实例包括牙膏、牙霜、凝胶或牙粉、漱牙漱口水、刷牙前后的嗽洗制剂、口香糖、锭剂和糖果。牙膏和牙凝胶一般包括磨擦抛光材料、发泡剂、矫味剂、保湿剂、粘合剂、增稠剂、甜味剂、增白剂/漂白剂/去渍剂、水和任选地酶。嗽口水，包括菌斑去除液体，一般包括水/醇溶液、香料、保湿剂、增甜剂、发泡剂、着色剂和任选地酶。

磨擦抛光材料也可以掺入到口腔护理组合物中。从而，磨擦抛光材料可以包括铝及其水合物，例如三水α-氧化铝(alpha alumina trihydrate)；三硅酸镁；碳酸镁；高岭土；铝硅酸盐，例如煅烧硅酸铝和硅酸铝；碳酸钙；硅酸锆；还有粉状塑料，例如聚氯乙烯；聚酰胺；聚甲基丙烯酸甲酯；聚苯乙烯；苯酚甲醛树脂；蜜胺甲醛树脂；脲甲醛树脂；环氧树脂；粉状聚乙烯；氧化硅干凝胶；水凝胶和气凝胶等。同样适合作为磨料的有焦磷酸钙；水不溶性碱性偏磷酸盐；磷酸二钙和/或其二水合物，正磷酸二钙；磷酸三钙；羟基磷灰石颗粒等。还可以采用这些物质的混合物。根据口腔护理组合物的不同，磨擦产品可以以重量计约0％至约70％，例如约1％至约70％存在。对于牙膏，磨料含量一般处于以最终牙膏重量计10％-70％的范围内。

采用保湿剂以防止例如牙膏的水分流失。适合用于口腔护理组合物的保湿剂包括如下化合物及其混合物：甘油；多元醇；山梨糖醇；聚乙二醇(PEG)；丙二醇；1，3-丙二醇；1，4-丁二醇；氢化的部分水解多糖等。保湿剂一般以重量计0％至约80％，例如约5％至约70％存在于牙膏中。

二氧化硅、淀粉、黄芪胶、黄原胶、爱尔兰苔(Irish moss)提取物、藻酸盐、果胶、纤维素衍生物如羟乙基纤维素、羧甲基纤维素钠和羟丙基纤维素钠；聚丙烯酸及其盐、聚乙烯吡咯烷酮是帮助稳定牙粉产品的适合的增稠剂和粘合剂的实例。增稠剂在牙膏乳剂和凝胶中的存在量可以是以终产品重量计约0.1％至约20％，而粘合剂达到约0.01至约10％的程度。

可以使用阴离子、阳离子、非离子、兼性和/或两性离子表面活性剂作为发泡剂皂。这些可以以终产品重量计0％至约15％、或约0.1至约13％或甚至约0.25％至约10％的水平存在。表面活性剂仅在其不对本发明的酶施加失活效应的程度上是适宜的。表面活性剂包括脂肪醇硫酸盐，磺化甘油单酯或具10-20个碳原子的脂肪酸的盐，脂肪酸-清蛋白缩合产物，脂肪酸酰胺和牛磺酸的盐和/或脂肪酸羟乙基磺酸酯的盐。

适宜的增甜剂包括制剂用糖精。香料例如留兰香通常以低含量存在，例如以重量计约0.01％至约5％，尤其是约0.1％至约5％。增白剂/漂白剂包括H₂O₂，且可以以终产品重量计低于约5％，或约0.25％至约4％的量添加。增白剂/漂白剂可以是酶，例如氧化还原酶。适宜的牙齿漂白酶的实例为例如WO 97/06775中描述的那些。水通常以赋予例如牙膏可流动形式的量添加。也可以包括其它水溶性抗菌剂，例如二葡萄糖酸氯己定，氨己嘧啶(hexetidine)，双胍啶(alexidine)，三氯生

季铵抗菌化合物，以及水溶性的某些金属离子源，例如锌、铜、银和锡源(例如，氯化锌、氯化铜和氯化亚锡，以及硝酸银)。也可以使用能够用作为氟化物源、色素/着色剂、防腐剂、维生素、pH调节剂、防龋剂、脱敏剂等的化合物。

酶也可用于如上文所述的口腔护理组合物。当酶用于清洁口腔时可提供若干益处。蛋白酶降解唾液蛋白质，这些蛋白质吸附在牙齿表面并形成薄膜(pellicle)，即所致菌斑的第一层。蛋白酶连同脂肪酶一起通过裂解构成细菌细胞壁和膜的结构组分的蛋白质和脂质而破坏细菌。葡聚糖酶及其他糖酶如2，6-β-D-果聚糖水解酶可以降解细菌所产生的形成细菌粘附基质的有机骨架结构。蛋白酶和淀粉酶不仅防止牙菌斑形成，而且还可以通过降解结合钙的糖-蛋白质复合物防止矿化，从而阻止牙垢发展。

牙膏一般可以包括如下成分(以最终牙膏组合物的重量百分比计)：磨料至约70％；保湿剂：0％至约80％；增稠剂：约0.1％至约20％；粘合剂：约0.01％至约10％；增甜剂：约0.1％至约5％；发泡剂：0％至约15％；增白剂：0％至约5％；和酶：约0.0001％至约20％。在一个实施方案中，牙膏具有在约6.0至约8.0范围内的pH，且包括：约10％至约70％的磨料；0％至约80％的保湿剂；0.1％至约20％的增稠剂；0.01％至约10％的粘合剂；约0.1％至约5％的增甜剂；0％至约15％的发泡剂；0％至约5％的增白剂和约0.0001％至约20％的酶。这些酶包括α-淀粉酶变体，单独或组合其他酶如2，6-β-D-果聚糖水解酶，和任选地已知用于牙膏中的上述其他类型的酶等。

漱口剂一般可以包括如下成分(以最终漱口剂组合物的重量百分比计)：0％至约20％的保湿剂；0％至约2％的表面活性剂；0％至约5％的酶；0％至约20％的乙醇；0％至约2％的其他成分(例如香料，增甜剂活性成分，如氟化物)。组合物还可以含有约0％至约70％的水。漱口剂组合物可以用适当的缓冲剂进行缓冲，例如pH约6.0至约7.5的柠檬酸钠或磷酸钠。漱口剂可以是非稀释的形式(即，用前必须稀释)。口腔护理组合物可以利用任何口腔护理领域已知的常规方法来生产。

8.淀粉加工组合物和用途

另一方面，具有所公开的α-淀粉酶变体的组合物可用于淀粉液化和/或糖化。淀粉加工对生产增甜剂、生产用于燃料和饮料(即可饮用醇)的醇、生产饮料、加工蔗糖或生产所需的有机化合物(例如柠檬酸、衣康酸、乳酸、葡糖酸、酮类、氨基酸、抗生素、酶、维生素和激素)有用。将淀粉转换为果糖糖浆的传统方法通常包括三个连续的酶促步骤：液化步骤，糖化步骤以及异构化步骤。在液化步骤中，在约5.5至约6.2的pH值、约95℃至约160℃的温度，通过为期约2个小时的α-淀粉酶变体作用，使淀粉降解为糊精。为确保这些条件下的最佳酶稳定性，可以添加1mM的钙(40ppm游离钙离子)。其他α-淀粉酶变体可需要不同的条件。

液化步骤后，可以通过添加葡糖淀粉酶(例如AMG^TM)和任选的脱支酶(如异淀粉酶或支链淀粉糖(例如

))，将糊精转换为葡萄糖。在此步骤之前，将pH降至低于约4.5的值，维持高温(高于95℃)，并使液化α-淀粉酶变体的活性变性。使温度降至60℃，可以加入葡糖淀粉酶和脱支酶。糖化步骤通常进行约24至约72小时。

糖化步骤之后，将pH升至处于约6.0至约8.0范围的值(例如pH 7.5)，并通过离子交换除去钙。然后利用例如固定化的葡萄糖异构酶(如

)将葡萄糖浆转化为高果糖糖浆。

α-淀粉酶变体可以提供至少一种改良的酶特性用于进行液化步骤。例如，变体α-淀粉酶可以具有更高的活性，或者其可以具有降低的对钙的需要。游离的钙的加入是充分确保α-淀粉酶的高稳定性所需的；但是游离的钙强烈抑制葡萄糖异构酶的活性。因此，在异构化步骤之前，应利用昂贵的单元操作除去钙，达到游离钙的水平降至低于3-5ppm的程度。如果能够避免这样的操作，且液化步骤无需添加游离钙离子即能进行，则可以获得费用的节约。因此，不需要钙离子或具有降低的钙离子需要的α-淀粉酶变体尤其有益。例如，可在组合物和操作中利用钙依赖性较小的α-淀粉酶变体，其在低浓度游离钙(＜40ppm)时稳定且具有高活性。这样的α-淀粉酶变体应当具有位于pH范围约4.5至约6.5(例如，范围约4.5至约5.5)中的最适pH。α-淀粉酶变体可以单独使用以提供特异性水解，或者可以与其他淀粉酶组合以提供具有广谱活性的“混合物(cocktail)”。

待加工的淀粉可以具有高度精制的淀粉质量，例如至少90％、至少95％、至少97％或至少99.5％纯。或者，淀粉可以是较为粗制的含淀粉材料，其可以含有碾磨过的整个谷粒，包括非淀粉级分如胚芽残留物和纤维。碾磨原料如整个谷粒打开其结构，从而允许进一步加工。可以使用两种碾磨方法：湿磨法和干磨法。此外，可以使用玉米渣和碾磨过的玉米渣。干磨的谷粒除淀粉外还将包含显著量的非淀粉糖类化合物。当通过喷射蒸煮加工这样的异质原料时，往往仅能实现淀粉的部分糊化。由于酶变体对未糊化的淀粉具有高活性，α-淀粉酶变体应用在包括液化和/或糖化喷射蒸煮的干磨淀粉的方法中具有优势。

具有优良的水解活性的变体α-淀粉酶在液化步骤中有益地提高了糖化步骤的效率(见如WO 98/22613)和糖化步骤中对葡糖淀粉酶的需要。葡糖淀粉酶有利地以不超过或甚至低于0.5葡糖淀粉酶活性单位(AGU)/g DS(即每克干固形物葡糖淀粉酶活性单位)的量存在。葡糖淀粉酶可以源自曲霉属物种(Aspergillus sp.)、篮状菌属物种(Talaromyces sp.)、大纹饰孢属物种(Pachykytospora sp.)或栓菌属物种(Trametes sp.)的菌株，其中示例性的实例为黑曲霉(Aspergillus niger)、埃默森篮状菌(Talaromycesemersonii)、瓣环栓菌(Trametes cingulata)或纸质大纹饰孢(Pachykytosporapapyracea)。在一个实施方案中，该步骤还包含使用WO 98/22613中公开的类型的糖类结合区域。

另一方面，该步骤可以包括水解糊化(gelatinize)的淀粉或颗粒淀粉的浆液，特别是在低于所述颗粒淀粉的初始糊化温度的温度将颗粒淀粉水解成可溶淀粉水解物。除与α-淀粉酶变体接触外，淀粉还可以与一种或多种选自真菌α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)、β-淀粉酶(EC 3.2.1.2)和葡糖淀粉酶(EC 3.2.1.3)的酶接触。在一实施方案中，可向α-淀粉酶变体中进一步添加其他淀粉水解酶或脱支酶，例如异淀粉酶(EC 3.2.1.68)或支链淀粉糖(EC 3.2.1.41)。

在一实施方案中，所述方法在低于初始糊化温度的温度实施。此类方法时常在至少30℃、至少31℃、至少32℃、至少33℃、至少34℃、至少35℃、至少36℃、至少37℃、至少38℃、至少39℃、至少40℃、至少41℃、至少42℃、至少43℃、至少44℃、至少45℃、至少46℃、至少47℃、至少48℃、至少49℃、至少50℃、至少51℃、至少52℃、至少53℃、至少54℃、至少55℃、至少56℃、至少57℃、至少58℃、至少59℃或至少60℃实施。实施所述方法的pH可以处于约3.0至约7.0、或约3.5至约6.0、或约4.0至约5.0的范围。一方面考虑包括发酵的方法，例如，在32℃左右(例如30-35℃)的温度，例如利用酵母生产乙醇。另一方面，所述方法包括同时进行的糖化和发酵，例如，在30-35℃(例如32℃左右)的温度，例如利用酵母生产乙醇或者利用其他适宜的发酵生物生产期望的有机化合物。在上述发酵方法中，乙醇含量达到至少约7％、至少约8％、至少约9％、至少约10％、至少约11％、至少约12％、至少约13％、至少约14％、至少约15％，例如至少约16％乙醇。

在上述任何方面中使用的淀粉浆可以具有约20％至约55％的干固形物颗粒淀粉，或约25％至约40％的干固形物颗粒淀粉，或约30％至约35％的干固形物颗粒淀粉。酶变体将颗粒淀粉中的可溶性淀粉以至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的量转化成可溶性淀粉水解物。

在另一实施方案中，在用于液化、糖化糊化的淀粉(包括但不限于通过喷射蒸煮进行的糊化)的方法中使用α-淀粉酶。所述方法可以包括发酵以生产发酵产物例如乙醇。通过发酵由含淀粉原料生产乙醇的此类方法包括：(i)用α-淀粉酶液化所述含淀粉原料；(ii)糖化所得的液化醪(mash)；和(iii)在发酵生物的存在下发酵步骤(ii)所得的物质。任选该方法还包括回收乙醇。糖化和发酵的方法可以作为同时糖化和发酵法(SSF)实施。发酵期间，乙醇含量达到至少约7％、至少约8％、至少约9％、至少约10％，例如至少约11％、至少约12％、至少约13％、至少约14％、至少15％，例如至少16％乙醇。

在上述方面的方法中待加工的淀粉可以特别地来自块茎、根、茎、豆类、谷物或整个谷粒。更具体地，颗粒淀粉可以获自玉米、玉米芯、小麦、大麦、黑麦、买罗高梁、西米、木薯、木薯粉、高粱、稻、豌豆、豆、香蕉或马铃薯。具体考虑的有蜡质及非蜡质类型的玉米和大麦。

如本文所用，名词或动词形式的术语“液化”表示将淀粉转化为链长较短且粘性较小的糊精的过程。通常，此过程包括淀粉的糊化，同时或之后添加α-淀粉酶变体。也可以任选地添加其他液化诱导酶。如本文所用，术语“初次液化(primary liquefaction)”是指浆液温度升至或接近其糊化温度时的液化步骤。继温度升高之后，使浆液传送通过热交换器或喷射蒸煮器达到温度约90-150℃，例如100-110℃。继应用热交换器或喷射器温度之后，使浆液在该温度保持为期3-10分钟。这种保持浆液处于90-150℃的步骤为初次液化。

如本文所用，术语“二次液化”是指继初次液化(加热至90-150℃)之后，当浆液被允许冷却至室温时的液化步骤。此冷却步骤可以是30分钟至180分钟，例如90分钟至120分钟。如本文所用，术语“二次液化的分钟数”是指自二次液化开始时起所过去的时间，即测量葡萄糖当量(DE)的时间。

另一方面考虑在包含α-淀粉酶变体的组合物中额外应用β-淀粉酶，β-淀粉酶(EC 3.2.1.2)是外切产麦芽糖淀粉酶，其催化直链淀粉、支链淀粉以及相关的葡萄糖聚合物中的1，4-α-糖苷键水解，由此释放麦芽糖。已经从多种植物和微生物中分离到β-淀粉酶(Fogarty等人，PROGRESS ININDUSTRIAL MICROBIOLOGY，15卷，112-115页，1979)。这些β-淀粉酶的特征在于具有处于40℃至65℃范围内的最适温度，以及处于约4.5至约7.0范围内的最适pH。考虑的β-淀粉酶包括但不限于：来自大麦的

BBA 1500、DBA、Optimalt^TM ME、Optimalt^TM BBA(Genencor International，Inc.)和Novozym^TM WBA(Novozymes A/S)。

考虑用于组合物中的另一酶是葡糖淀粉酶(EC 3.2.1.3)。葡糖淀粉酶来自微生物或植物。例如，葡糖淀粉酶可以为真菌或细菌来源。示例性细菌葡糖淀粉酶有曲霉属葡糖淀粉酶，特别是黑曲霉G1或G2葡糖淀粉酶(Boel等人(1984)，EMBO J.3(5)：1097-1102)或其变体，例如WO 92/00381和WO 00/04136中所公开的；泡盛曲霉葡糖淀粉酶(WO 84/02921)；米曲霉葡糖淀粉酶(Agric.Biol.Chem.(1991)，55(4)：941-949)或其变体或片段。

其他考虑的曲霉属葡糖淀粉酶变体包括增强热稳定性的变体：G137A和G139A(Chen等人(1996)，Prot.Eng.9：499-505)；D257E和D293E/Q(Chen等人(1995)，Prot.Eng.8：575-582)；N182(Chen等人(1994)，Biochem.J.301：275-281)；二硫键，A246C(Fierobe等人(1996)，Biochemistry，35：8698-8704)；在A435和S436位引入Pro残基(Li等人(1997)Protein Eng.10：1199-1204)。其他考虑的葡糖淀粉酶包括篮状菌属葡糖淀粉酶，特别是来源于埃默森篮状菌(WO 99/28448)、T.leycettanus(美国专利No.RE 32,153)、杜邦篮状菌(T.duponti)、嗜热篮状菌(T.thermophilics)(美国专利No.4,587,215)。考虑的细菌葡糖淀粉酶包括来自梭菌属(Clostridium)，特别是C.thermoamylolyticum(EP 135138)和C.thermohydrosulfuricum(WO 86/01831)的葡糖淀粉酶。适宜的葡糖淀粉酶包括来源于米曲霉的葡糖淀粉酶，例如与WO 00/04136中SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或甚至90％同源性的葡糖淀粉酶。还考虑商业葡糖淀粉酶，例如AMG200L、AMG 300L、SAN^TM SUPER和AMG^TM E(Novozymes)；

300(Genencor International，Inc.)；AMIGASE^TM和AMIGASE^TM PLUS(来自DSM)；G-

G900(Enzyme Bio-Systems)；G-

G990ZR(黑曲霉(A.niger)葡糖淀粉酶和低蛋白酶含量)。可以以0.02-2.0AGU/g DS或0.1-1.0AGU/g DS(例如0.2AGU/g DS)的量加入葡糖淀粉酶。

组合物中可包含其他酶变体。两种或多种α-淀粉酶变体可单独或与本文讨论的其他酶组合使用。例如，第三种酶可以是另一种α-淀粉酶(例如酵母α-淀粉酶)或另一种α-淀粉酶变体。这些酶可以是芽孢杆菌属或非芽孢杆菌属α-淀粉酶。

可以任选加入的另一种酶是脱支酶，例如异淀粉酶(EC 3.2.1.68)或支链淀粉糖(EC 3.2.1.41)。异淀粉酶水解支链淀粉和β-极限糊精中的α-1，6-D-糖苷分支键，并且通过异淀粉酶不能攻击普鲁分支葡聚糖及其对α-极限糊精的有限作用而能够与支链淀粉糖区别开来。可以按本领域技术人员熟知的有效量加入脱支酶。

所述方法的产物的确切组成取决于所应用的酶组合以及所加工的颗粒淀粉的类型。可溶水解产物可以是纯度为至少约85％、至少约90％、至少约95.0％、至少约95.5％、至少约96.0％、至少约96.5％、至少约97.0％、至少约97.5％、至少约98.0％、至少约98.5、至少约99.0％或至少约99.5％的麦芽糖。备选地，可溶淀粉水解产物是葡萄糖，或者淀粉水解物具有至少94.5％、至少95.0％、至少95.5％、至少96.0％、至少96.5％、至少97.0％、至少97.5％、至少98.0％、至少98.5、至少99.0％或至少99.5％的DX(葡萄糖占总溶解的干固形物的百分比)。在一个实施方案中，生产冰淇淋、蛋糕、糖果、水果罐头的方法使用包含葡萄糖、麦芽糖、DP3和DPn的混合物的特制糖浆。

两种碾磨方法是适用的：湿磨法和干磨法。在干磨法中，碾磨和使用整个谷粒。湿磨法提供胚芽和粗磨粉(淀粉颗粒和蛋白质)的良好分离，当淀粉水解产物用于糖浆生产时通常使用这种方法。。干磨法和湿磨法均为淀粉加工领域公知，且同等地考虑与所公开的组合物和方法一起使用。所述方法可在超滤体系中进行，其中保留物在酶、粗淀粉和水的存在下保持再循环，且其中透过物为可溶淀粉水解产物。同等考虑的是在具有超滤膜的连续膜反应器中进行的方法，其中保留物在酶、粗淀粉和水的存在下保持再循环，且其中透过物为可溶淀粉水解产物。同样考虑的是在具有微过滤膜的连续膜反应器中进行的方法，其中保留物在酶、粗淀粉和水的存在下保持再循环，且其中透过物为可溶淀粉水解产物。

一方面，将该方法的可溶淀粉水解产物转化为高果糖淀粉基糖浆(HFSS)，例如高果糖玉米糖浆(HFCS)。这种转化可利用葡萄糖异构酶(尤其是固定在固相支持物上的酶)实现。所考虑的异构酶包括商品

IT(Novozymes AJS)；G-

IMGI和G-

G993，G-

G993，G-

G993液体和

IGI。

另一方面，所生产的可溶淀粉水解产物出产燃料或饮用乙醇。在第三方面的方法中，发酵可以与颗粒淀粉浆的水解同时或分开/相继进行。当发酵与水解同时进行时，温度可以在30℃-35℃之间，尤其是31℃-34℃之间。该方法可以在超滤体系中进行，其中保留物在酶、粗淀粉、酵母、酵母营养物和水的存在下保持再循环，且其中透过物为含乙醇的液体。同等考虑的是在具有超滤膜的连续膜反应器中进行的方法，其中保留物在酶、粗淀粉、酵母、酵母营养物和水的存在下保持再循环，且其中透过物为含乙醇的液体。

所述方法的可溶淀粉水解产物也可以用于发酵产品的生产，其包括将所处理的淀粉发酵成发酵产品，例如柠檬酸、谷氨酸单钠、葡糖酸、葡萄糖酸钠、葡萄糖酸钙、葡萄糖酸钾、葡糖酸δ-内酯或异抗坏血酸钠。

α-淀粉酶变体的淀粉水解活性可以利用马铃薯淀粉作为底物来测定。此方法基于该酶对改性马铃薯淀粉的降解，且反应后接着将淀粉/酶溶液样品与碘溶液混合。最初形成黑蓝色，但是在淀粉降解期间，蓝色变弱，逐渐变成红棕色，将其与有色玻璃标准进行比较。

9.纺织品脱浆组合物及用途

还考虑使用一种或多种α-淀粉酶变体处理织物(例如，使纺织品脱浆)的组合物和方法。α-淀粉酶变体可以用于本领域众所周知的任何织物处理方法中，参见例如美国专利No.6,077,316。例如，一方面，可以通过包括将织物与酶变体溶液接触的方法，改善该织物的触感和外观。一方面，该织物可以用该溶液在压力下处理。

一方面，在纺织品纺织期间或之后、或在脱浆阶段或者一个或多个其他织物加工步骤的过程中施加酶。在纺织品纺织期间，纺线暴露于相当大的机械张力。在机械织机上纺织之前，径纱通常涂上淀粉或淀粉衍生物浆料，以增加其抗张强度并防止断裂。可以施加α-淀粉酶以除去这些淀粉或淀粉衍生物浆料。在纺织品织成之后，织物可以进入脱浆阶段。这之后可接着一个或多个其他织物加工步骤。脱浆是从纺织品中除去浆料的行为。纺织后必须除去浆料涂层，之后再进一步加工织物，以确保均一和耐洗效果。本文还提供了包括通过酶变体的作用来酶促水解上浆料的脱浆方法。α-淀粉酶变体可以单独或与其他脱浆化学试剂和/或脱浆酶一起用作为洗涤剂添加剂，在例如水性组合物中，使织物(包括含棉织物)脱浆。α-淀粉酶变体也可用于在靛蓝染色的粗斜棉布织物和衣服上产生石洗外观的组合物和方法中。为生产衣服，织物可以剪裁并缝纫成衣服或衣物，之后进行整理(finish)。特别是，为生产粗斜棉布牛仔服(denim jeans)，已研发了不同的酶促整理方法。粗斜棉布衣服的整理通常始于酶促脱浆步骤，在此期间淀粉分解酶作用于衣服，以使织物柔软，并使该棉布更易于接受随后的酶促整理步骤。α-淀粉酶变体可用于整理粗斜棉布衣服(例如“生物打磨法”(bio-stoning))、酶促脱浆及为织物提供柔软度，和/或整理的方法中。

10.用于烘焙和食品制备的组合物和方法

对于面粉在烘焙和食品生产中的商用和家用而言，重要的是维持面粉中适当水平的α-淀粉酶活性。太高的活性水平可能产生粘性和/或面团似的滞销产品；但是α-淀粉酶活性不足的面粉可能不含足够的糖用于正常酵母功能，导致不甜的易碎的面包。因此，可以将α-淀粉酶变体多肽自身或与其他α-淀粉酶组合加入面粉来增加面粉中内源性α-淀粉酶活性的水平。α-淀粉酶在淀粉存在下一般具有例如30-90℃、50-80℃、55-75℃或60-70℃范围内的最适温度。可以在1％的可溶淀粉溶液中于pH 5.5测量最适温度。

除了在烘焙中应用谷物及其他植物产品外，诸如大麦、燕麦、小麦等谷物以及诸如玉米、啤酒花和稻等植物成分还应用于工业酿造以及家庭酿造。酿造中所用的成分可以是未制芽或是制芽的(malted)，这意味着部分发芽，从而导致包括α-淀粉酶在内的酶水平增加。为成功酿造，充足水平的α-淀粉酶酶活性是必要的，以确保有适当水平的糖进行发酵。因此，可以将α-淀粉酶变体多肽自身或与其他α-淀粉酶组合加入用于酿造的成分中。

如本文所用，术语“面粉”指研磨或磨碎的粮谷。术语“面粉”还可以表示已经磨碎或捣碎的西米或块茎产品。在一些实施方案中，面粉还可以含有除研磨或捣碎的谷类或植物材料之外的成分。其他成分的一个实例是发酵剂(leavening agent)，不过并非旨在限制。粮谷包括：小麦、燕麦、黑麦和大麦。块茎产品可包括木薯淀粉(tapioca flour)、木薯粉(cassava flour)和乳蛋糕粉(custard powder)。术语“面粉”还包括磨碎的玉米粉、玉米面、米粉(rice flour)、粗面粉、自发粉(self-rising flour)、木薯淀粉、木薯粉、米粉(ground rice)、强化面粉和乳蛋糕粉。

如本文所用，术语“原材料(stock)”表示粉碎或破碎的谷类和植物成分。例如，啤酒生产中所用的大麦是已经被粗磨或粉碎的谷类，以便提供适于产生发酵醪的粘稠度。如本文所用，术语“原材料”包括任何前述类型的粉碎或粗磨形式的植物和谷类。本文所述的方法可用于确定面粉以及原材料中的α-淀粉酶活性水平。

可单独地或与其他淀粉酶组合添加α-淀粉酶变体多肽以防止陈化(即烘焙产品的面包心固化)。抗陈化淀粉酶的量一般可在每公斤面粉0.01-10mg酶蛋白质的范围内，例如1-10mg/kg。可与α-淀粉酶变体多肽组合使用的其他抗陈化淀粉酶包括内切淀粉酶，例如来自芽孢杆菌属的细菌内切淀粉酶。例如，其他淀粉酶可以是产麦芽糖α-淀粉酶(EC 3.2.1.133)，例如来自芽孢杆菌属。

是来自嗜热脂肪芽孢杆菌菌株NCIB 11837的适宜的产麦芽糖α-淀粉酶，并描述在C.Christophersen等人，1997Starch50(1)：39-45中。抗陈化内切淀粉酶的其他实例可包括其他细菌α-淀粉酶，源自例如芽孢杆菌属，例如地衣芽孢杆菌或解淀粉芽孢杆菌。抗陈化淀粉酶可以是外切淀粉酶，例如β-淀粉酶，例如来自植物(例如大豆)，或来自微生物来源(例如芽孢杆菌属)。

包括α-淀粉酶变体多肽的烘焙组合物还可以包括磷脂酶。磷脂酶可具有A1或A2活性，以从磷脂中移去脂肪酸并形成溶血磷脂。其可以具有或可以不具有脂肪酶活性，即对甘油三酸酯的活性。磷脂酶可具有范围30-90℃(例如30-70℃)的最适温度。所添加的磷脂酶可以是动物来源的，例如来自胰腺(例如牛或猪胰腺)、蛇毒液或蜂毒液。或者，磷脂酶可以是微生物来源的，例如来自丝状真菌、酵母或细菌，例如来自如下属或种：曲霉属，黑曲霉；网柄菌属(Dictyostelium)，盘基网柄菌(D.discoideum)；毛霉属，爪哇毛霉(M.javanicus)，大毛霉(M.mucedo)，细孢毛霉(M.subtilissimus)；脉孢霉属(Neurospora)，粗糙脉孢霉(N.crassa)；根毛霉属，微小根毛霉(R.pusillus)；根霉属(Rhizopus)，少根根霉(R.arrhizus)，日本根霉(R.japonicus)，匐枝根霉(R.stolonifer)；核盘菌属(Sclerotinia)，大豆核盘菌(S.libertiana)；发癣菌属(Trichophyton)，红色发癣菌(T.rubrum)；维氏核盘菌属(Whetzelinia)，W.sclerotiorum；芽孢杆菌属，巨大芽孢杆菌(B.megaterium)，枯草芽孢杆菌；柠檬酸细菌属(Citrobacter)，弗氏柠檬酸细菌(C.freundii)；肠杆菌属(Enterobacter)，产气肠杆菌(E.aerogenes)，阴沟肠杆菌(E.cloacae)；爱德华氏菌属(Edwardsiella)，迟钝爱德华氏菌(E.tarda)；欧文氏菌属(Erwinia)，草生欧文氏菌(E.herbicola)；埃希氏菌属(Escherichia)，大肠杆菌(E.coli)；克雷伯氏菌属(Klebsiella)，肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)；变形杆菌属(Proteus)，普通变形杆菌(P.vulgaaris)；普罗威登斯菌属(Providencia)，斯氏普罗威登斯菌(P.stuartii)；沙门氏菌属(Salmonella)，鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)；沙雷氏菌属(Serratia)，液化沙雷氏菌(S.liquefasciens)，粘质沙雷氏菌(S.marcescens)；志贺氏菌属(Shigella)，弗氏志贺氏菌(S.flexneri)；链霉菌属(Streptomyces)，紫红链霉菌(S.violeceoruber)；耶尔森氏菌属(Yersinia)，小肠结肠炎耶尔森氏菌(Y.enterocolitica)；镰孢霉属，尖镰孢(例如菌株DSM 2672)。

磷脂酶在烘焙后的初始阶段，特别是头24个小时，以改进面包柔软度的量添加。磷脂酶的量通常在每公斤面粉0.01-10mg酶蛋白质的范围内，例如0.1-5mg/kg。这意味着，磷脂酶活性一般在每公斤面粉20-1000脂肪酶单位(LU)的范围内，其中脂肪酶单位定义为用阿拉伯树胶为乳化剂、三丁酸甘油酯为底物，在30℃、pH 7.0下，每分钟释放1μmol丁酸所需的酶量。

面团(dough)的组合物通常包括小麦面或小麦粉和/或其他类型的面、粉或淀粉，如玉米粉、玉米淀粉、黑麦面、黑麦粉、燕麦粉、燕麦面、大豆粉、高粱面、高粱粉、马铃薯面、马铃薯粉或马铃薯淀粉。面团可以是新鲜的、冷冻的或是部分烘焙的。面团可以以多种方式进行发酵，例如通过添加化学发酵剂(例如小苏打)或通过添加起子(发酵面团)。例如，面团可通过添加适宜的酵母培养物(例如酿酒酵母(面包酵母)培养物，例如商购可得的酿酒酵母菌株)来发酵。

面团也可以包括其他常规的面团成分，例如蛋白质，如奶粉、面筋和大豆；蛋(全蛋、蛋黄、或蛋清之一)；氧化剂如抗坏血酸、溴酸钾、碘酸钾、偶氮双甲酰胺(ADA)或过硫酸铵；氨基酸如L-半胱氨酸；糖；盐如氯化钠、乙酸钙、硫酸钠或硫酸钙。面团可以包括脂肪(甘油三酸酯)如颗粒状脂肪或起酥油。面团可以还包括乳化剂，例如甘油单酸酯或甘油二酸酯、甘油单酸酯或甘油二酸酯的双乙酰基酒石酸酯、脂肪酸的糖脂、脂肪酸的聚甘油酯、甘油单酸酯的乳酸酯、甘油单酸酯的乙酸酯、聚氧乙烯硬脂酸酯(polyoxyetliylene stearates)或溶血卵磷脂特别地，可不加入乳化剂制备面团。

任选地，可与抗陈化淀粉酶和磷脂酶一起使用其他酶。其他酶可以是第二淀粉酶，如淀粉葡糖苷酶、β-淀粉酶、环糊精葡聚糖转移酶；或者其他酶可以是肽酶，特别是外肽酶，转谷氨酰胺酶、脂肪酶、纤维素酶、半纤维素酶，特别是戊聚糖酶如木聚糖酶，蛋白酶，蛋白质二硫键异构酶，例如WO 95/00636中所公开的蛋白质二硫键异构酶，葡聚糖转移酶，分支酶(1，4-α-葡聚糖分支酶)，4-α-葡聚糖转移酶(糊精糖基转移酶)或氧化还原酶，例如过氧化物酶、漆酶、葡萄糖氧化酶、吡喃糖氧化酶、脂加氧酶、L-氨基酸氧化酶或糖氧化酶。其他酶可以是任何来源的，包括哺乳动物和植物来源，尤其是微生物(细菌、酵母或真菌)来源，并可通过本领域常规使用的技术获得。

木聚糖酶通常是微生物来源，例如源自细菌或真菌，例如曲霉属菌株，特别是棘孢曲霉、黑曲霉(例如WO 91/19782)、泡盛曲霉(例如WO 91/18977)或塔宾曲霉(A.tubigensis，例如WO 92/01793)；源自木霉属菌株，例如里氏木霉(Trichoderma reesei)，或源自腐质霉属菌株，例如特异腐质霉(H.insolens，WO 92/17573)。

和Novozym

为市售的由里氏木霉生产的木聚糖酶制品。淀粉葡糖苷酶可以是黑曲霉淀粉葡糖苷酶(如

)。其他有用的淀粉酶产品包括

A 1000或A 5000(购自Grindsted Products，丹麦)。葡萄糖氧化酶可以是真菌葡萄糖氧化酶，特别是黑曲霉葡萄糖氧化酶(如

)。示例性蛋白酶有

示例性脂肪酶可来源于嗜热丝孢菌属(腐质霉属)、根毛霉属、假丝酵母菌属(Candida)、曲霉属、根霉属(Rhizopus)或假单胞菌属的菌株，特别是来自疏棉状嗜热丝孢菌(疏毛腐质霉)、米黑根毛霉、南极洲假丝酵母(Candidaantarctica)、黑曲霉、德氏根霉(Rhizopus delemar)或少根根霉(Rhizopusarrhizus)或洋葱假单胞菌(Pseudomonas cepacia)。在具体实施方案中，脂肪酶可以是如WO 88/02775中所述来自南极洲假丝酵母的脂肪酶A或脂肪酶B，或者脂肪酶可以如EP 238,023中所述源自米黑根毛霉，或如EP 305,216中所述源自疏毛腐质霉，或如EP 214,761和WO 89/01032中所述源自洋葱假单胞菌。

该方法可用于任何类型由面团制备的烘焙产品，柔软或松脆特征之一、白色、浅色或深色类型之一。实例是面包(尤其是白面包、全麦面包或黑麦面包)，一般为块或卷的形式，法式长棍型面包、比塔饼、玉米粉圆饼、蛋糕、薄煎饼、饼干、曲奇饼、馅饼皮、酥面包、馒头、比萨等等。

在另一个实施方案中，在包括面粉连同抗陈化淀粉酶、磷脂酶和磷脂的预混物中应用α-淀粉酶变体多肽。预混物可以含有其他改进面团和/或改进面包的添加剂，例如任何添加剂，包括上文所述的酶。一方面，α-淀粉酶变体多肽是在包含抗陈化淀粉酶和磷脂酶的酶制剂中用作烘焙添加剂的成分。

酶制品可为颗粒或团聚的粉末的形式。其可具有窄的粒径分布，95％(以重量计)以上的颗粒处于25-500μm的范围。颗粒和团聚的粉末可通过常规方法制备，例如在流化床制粒机中通过向载体上喷α-淀粉酶变体多肽。载体可包括具有适宜粒径的粒核。载体可以是可溶或不可溶的，例如盐(如NaCl或硫酸钠)、糖(如蔗糖或乳糖)、糖醇(如山梨糖醇)、淀粉、稻、玉米渣或大豆。

另一方面考虑考虑包封包含α-淀粉酶变体多肽的颗粒(即α-淀粉酶颗粒)。为制备包封的α-淀粉酶颗粒，使酶与食品级脂质以足以悬浮所有α-淀粉酶颗粒的量接触。如本文所使用，食品级脂质可以是任何天然的不溶于水但溶于非极性有机溶剂如烃或乙醚的有机化合物。适宜的食品级脂质可包括但不限于饱和或不饱和的脂肪或油形式的甘油三酸酯。构成所用的饱和甘油三酸酯的脂肪酸及其组合的实例包括但不限于：丁酸(来源于乳脂肪)、棕榈酸(来源于动物及植物脂肪)和/或硬脂酸(来源于动物及植物脂肪)。构成所用的不饱和甘油三酸酯的脂肪酸及其组合的实例包括但不限于：棕榈油酸(来源于动物及植物脂肪)、油酸(来源于动物及植物脂肪)、亚油酸(来源于植物油)和/或亚麻酸(来源于亚麻子油)。其他适宜的食品级脂质包括但不限于：衍生自上文所讨论的甘油三酸酯的甘油单酯和甘油二酯，磷脂及糖酯。

将尤其是液体形式的食品级脂质与粉末形式的α-淀粉酶颗粒以这样的方式接触，从而脂质物质覆盖至少大多数(例如100％)α-淀粉酶颗粒的至少一部分表面。因此，各α-淀粉酶颗粒独立地包封在脂质中。例如，全部或基本上全部的α-淀粉酶颗粒均被提供有薄层连续的包封脂膜。这可通过首先向容器中倾入一定量的脂质，然后将α-淀粉酶调成浆液，从而使脂质彻底润湿各α-淀粉酶颗粒的表面而实现。在短期搅拌之后，回收其表面携带实质量脂质的包封的α-淀粉酶颗粒。可通过选择所用脂质的类型，来控制向α-淀粉酶颗粒如此施加的包衣的厚度，并在期望时通过重复操作以建造较厚的膜。

包载的递送载体的储存、处理和掺入可通过包装混合物实现。包装混合物可包括包封的α-淀粉酶。不过，包装混合物可以还含有生产商或面点师所需的其他成分。在包封的α-淀粉酶掺入到面团之中后，面点师继续进行产品的常规生产方法。

包封α-淀粉酶的优势有两重。首先，对于热不稳定性酶而言，食品级脂质在烘焙过程中保护酶免受热变性。结果，虽说α-淀粉酶在醒发和烘焙阶段被稳定化和受保护，其在最终的烘焙产品中从保护性包膜中释放出来，在这里水解多聚葡聚糖中的糖苷键。包载的递送载体也确保向烘焙品持续释放活性酶。也就是说，继烘焙过程之后，活性α-淀粉酶从保护性包膜中持续释放，其释放速率抵消并因此减小陈化机制的速率。

一般而言，向α-淀粉酶颗粒施用的脂质的量可从α-淀粉酶总重的几个百分点到该重量的许多倍进行变动，这取决于脂质的性质、向α-淀粉酶颗粒施用脂质的方式、待处理面团混合物的组成、以及所涉及的面团混合操作的强度。

以有效延长烘焙商品保存限期的量向用于制备烘焙商品的成分中添加包载的递送载体(即，脂质包封的酶)。面点师可以计算为实现期望抗陈化效果所需的如上文那样制备的包封α-淀粉酶的量。所需的包封α-淀粉酶的量基于被包封的酶的浓度以及α-淀粉酶与指定面粉的比例来计算。虽然已发现广范围的浓度有效，但是正如已经讨论过的那样，抗陈化方面的可见改进与α-淀粉酶浓度并不线性相关，而是超过一定的最低水平后，α-淀粉酶浓度的大幅增加仅产生很小的额外改进。在特定烘焙生产中实际应用的α-淀粉酶浓度可能比最低需要量高得多，以便向面点师提供一定的保障以对抗因其无意低估引起的错误。酶浓度的下限由面点师希望达到的最低抗陈化效果决定。

制备烘焙品的典型方法包括：(a)制备脂质包被的α-淀粉酶颗粒，其中基本上100％的α-淀粉酶颗粒被包覆；(b)混合含面粉的面团；(c)在完成混合之前向面团中添加脂质包被的α-淀粉酶，在脂质包衣从α-淀粉酶上去掉之前终止混合；(d)醒发面团；和(e)烘焙面团以提供烘焙品，其中α-淀粉酶在混合、醒发和烘焙阶段无活性，而在烘焙品中有活性。

可在混合周期(例如接近混合周期结束的时候)中向面团中添加包封的α-淀粉酶。在混合阶段中的一个时间点加入包封的α-淀粉酶允许包封的α-淀粉酶充分地遍及整个面团分布，不过，混合阶段在保护性包膜从α-淀粉酶颗粒剥落之前终止。根据面团的类型和体积、以及混合器的作用方式和速度不同，可能需要1-6分钟或更长的任何时间将包封的α-淀粉酶混入面团中，但平均为2-4分钟。因此，存在可以决定该精确程序的几种变量。第一，包封的α-淀粉酶的量必须具有足以允许包封的α-淀粉酶分布于整个面团混合物的总体积。如果包封的α-淀粉酶制品为高度浓缩的，可能需要在向面团添加包封的α-淀粉酶之前先向预混物中添加额外的油。食谱和生产方法可能需要特定的改变；不过，当将面包面团配方中指定的25％的油从面团中扣除，而用作为浓缩的包封α-淀粉酶的载体在接近混合周期结束的时候加入时，一般能够达成良好的结果。在食谱具有极低脂肪含量的面包或其他烘焙品(如法式面包)中，已发现干面粉重量约1％的包封α-淀粉酶混合物足以使包封的α-淀粉酶与面团彻底地混合，但可以生效的百分比范围非常宽泛，并取决于个体面点师的配方、成品以及生产方法需求。第二，必须在混合周期中余下足够时间以向混合物中添加包封的α-淀粉酶悬液，以便完全的混合入面团中，但是不要太早以致于过度的机械作用使保护性脂质包膜从大比例的包封α-淀粉酶颗粒上剥落下来。

在另一实施方案中，将细菌α-淀粉酶(BAA)加入包含α-淀粉酶变体多肽的脂质包被颗粒。BAA可以使面包缩小成为粘团，这是由于其在充分烘焙的面包块中具有过度的热稳定性和保留活性。然而，已发现当在受保护的酶产品中掺入BAA时，可以获得相当大的附加抗陈化保护作用，即便以非常低的BAA剂量水平也是如此。例如，已发现150RAU(参考淀粉酶单位)/100磅面粉的BAA剂量是有效的。在一个实施方案中，向脂质包被的酶产品添加约50-2000RAU的BAA。此低BAA剂量水平，组合保护性包衣能够在充分烘焙的面包块中阻止酶与淀粉自由接触的能力(除水蒸气随机地将酶自其包衣中释放出来的情况之外)，有助于达成非常高水平的抗陈化活性，而没有BAA的反面副作用。

对于本领域技术人员显而易见的是，可以对本文所述的以及下文实施例中进一步举例的组合物和方法进行多种改动和变动而不偏离目的用途的精神或范围。

以上引用的全部参考在这里以其整体被并入作为参考用于全部目的。

实施例

实施例1

作为在开发α-淀粉酶变体中的第一步，选择在以上所述多种制剂中呈现有利性能特征的α-淀粉酶。代表性的α-淀粉酶来自第707号芽孢杆菌属物种(SEQ ID NO：1，Swissprot登录号P 19571的残基34-518)。

然后，鉴定α-淀粉酶，其在宿主细胞中呈现优良的表达和与第707号芽孢杆菌属物种α-淀粉酶具有相对接近的序列同一性。这类α-淀粉酶是芽孢杆菌属物种A 7-7(DSM 12368)α-淀粉酶(SEQ ID NO：2；又见基因文库登录号CAL48155，SEQ ID NO：7)。

在图1和以下显示这些α-淀粉酶的成熟氨基酸序列的比对，其中顶端序列来自第707号芽孢杆菌属物种α-淀粉酶(SEQ ID NO：1)，下部序列来自芽孢杆菌属物种A 7-7(DSM 12368)α-淀粉酶(SEQ ID NO：2)。在485个氨基酸序列中仅33个氨基酸位置不同，提供在成熟蛋白中序列同一性为约93％。在两个序列中不同的氨基酸位置在以下突出显示。

1        11        21        31        41        51

HHNGTNGTMM QYFEWYLPND GNHWNRL

SD ASNLK

KGIT AVWIPPAWKGASQNDVGYGA

HHNGTNGTMM QYFEWYLPND GNHWNRL

SD ASNLK

KGIT AVWIPPAWKGASQNDVGYGA

61        71        81        91        101        111

YDLYDLGEFN QKGTVRTKYG TR

QLQAAVTLK

NGIQVY GDVVMNHKGGADATE

VRAV

YDLYDLGEFN QKGTVRTKYG TR

QLQAAVT

LK

NGIQVY GDVVMNHKGGADATE

VRAV

121        131        141        151        161        171EVNPNRNQE V

G

YTIEAW T

FDFPGRGN THSFKWRWY HFDGVDWDQSR

LNRIYKF

EVNP

NRNQE V

G

YTIEAW T

FDFPGRGN THS

FKWRWY HFDGVDWDQSR

LNRIYKF

181        191        201        211        221        231

RGGK

WDWE VDTENGNYDY LMYADIDMDH  PEVVNELRNW GVWYTNTLGLDGFRIDAVKH

RGGK

WDWE VDTENGNYDY  LMYADIDMDH  PEVVNELRNW GVWYTNTLGLDGFRIDAVKH

241        251        261        271        281        291

IKYSFTRDW

HVRTGKN MFAVAEFWKN D

GAIENYLKTNWNHSVFDVPLHYNLYNA

IKYSFTRDW

HVR

TGKN MFAVAEFWKN D

GAIENYL

KTNWNHSVFDVPLHYNLYNA

301        311        321        331        341        351

S

SGGNYDMR

IFNGTVVQR HPHAVTFVD NHDSQPEEAL ESFVEEWFKPLAYALTLTR

S

SGGNYDMR

IFNGTVVQR HP

HAVTFVD NHDSQPEEAL ESFVEEWFKPLAYALTLTR

361        371        381        391        401        411

QGYPSVFYGD YYGIPTHGVP AM

SKIDPIL EARQKYAYGK QNDYLDHHN

IGWTREGNTA QGYPSVFYGD YYGIPTHGVP AM

SKIDPIL EARQKYAYGKQNDYLDHHNIGWTREGNTA

421        431        441        451        461        471HPNSGLATIM SDG

GG

KWM

VGRNKAGQVW

DITGNR

G TVTINADGWGNFSVNGGSVS HPNSGLATIM SDG

GG

KWM

VGRNKAGQV WDITGNRGTVTINADGWG NFSVNGGSVS

481

IWVN

芽孢杆菌属物种第707号α-淀粉酶(SEQ ID NO：1)

IWVN

芽孢杆菌属物种A7-7(DSM 12368)α-淀粉酶(SEQ ID NO：2)

实施例2

接着评估在两个序列中不同的氨基酸对于取代的表达的可能影响，所述取代为将在第707号芽孢杆菌属物种α-淀粉酶中发现的氨基酸用在芽孢杆菌属物种A 7-7(DSM 12368)α-淀粉酶中发现的氨基酸取代。在这一情况下，为各个建议的变体构建3D结构模型，其中该3D结构模型是基于已知的α-淀粉酶晶体结构。第707号芽孢杆菌属物种α-淀粉酶的3D结构模型具有蛋白质数据库Brookhaven PDB/RSCB蛋白质数据库登录号为IWPC。使用该结构模型评估具体氨基酸对溶剂的暴露和给定取代使蛋白质结构不稳定的程度。最后，使用结构模型预测特定取代对于变体在酶表面的疏水性的影响。预期暴露于溶剂并减少蛋白质的疏水性的氨基酸的取代将提高变体的表达。以下表1列出多个可能的氨基酸变化并且按照这些标准评估每一个。

实施例3

基于以上公开的结构模型，预期下列取代是特别有利的：N28R、S36D、M116W、R172Q、H183D、S255N和A256T。也预期有利的取代是S83N、R142K、A186G、N251T、F441Y、S452R和K485N。可以按照，例如在Sambrook等人，MOLECULAR CLONING：A LABORATORYMANUAL，第2版，Cold Spring Harbor，1989和第3版，2001中所述通过在本技术领域众所周知的蛋白质工程技术制备取代。通过例如以上所述技术表达和纯化变体。与野生型蛋白质相比，还通过比活和通过从发酵肉汤回收的变体蛋白质水平评估变体。

变体可以含有单个的氨基酸取代或取代的组合，包括以上公开的全部14个残基的取代或其子集。使用突变体的组合文库制备和检测突变的子集。例如，可以用限制性内切核酸酶将编码具有全部14个突变的蛋白质的核苷酸消化为片段，其中各个限制性片段编码一个或多个突变。可以通过随机混合多种突变的和野生型基因片段，和使用本领域众所周知的连接操作将其连接起来来构建文库。选择产生的核酸，其编码具有多个突变子集的全长蛋白质。

实施例4

构建707淀粉酶突变体用于改良的iboada

构建6个Amy707淀粉酶突变体(N28R、S36D、R172Q、H183D、S255N和A256T)和一个双突变(S36D/S255N)以改良其表达。

密码子优化的、合成的芽孢杆菌属物种no.707淀粉酶基因是从GeneArt Inc.(Toronto，Canada)订购的，并且作为XhoI片段(用引物EBS2XhoI_RV和PlatXho5_FW进行PCR)被克隆进入载体pICatH(在专利WO/2005/052146中的图20中)。通过PCR测定Amy707基因对于CAT基因的方向，并且选择其中两个基因具有相同方向的一个克隆(ori1)，将其命名为pICatH-Amy707(ori1)(图3)。

EBS2XhoI_RV：

5’TGG AAT CTC GAG GTT TTA TCC TTT ACC TTG TCT CC 3’(SEQ ID NO：9)

Plat5XhoI_FW：

5’CCC CCG CTC GAG GCT TTT CTT TTG GAA GAA AAT ATA GGG AAA ATG

GTA CTT GTT AAA AAT TCG GAA TAT TTA TAC AAT ATC ATA TGT TTC

ACA TTG AAA GGG G 3’(SEQ ID NO：10)

将pICatH-Amy707(ori1)转化进入感受态的枯草芽孢杆菌菌株(BG3594comK)。通过诱导在木糖诱导的启动子控制下的comK基因制备感受态的枯草芽孢杆菌菌株(Hahn等人，MoI.Microbiol.，21：763-775[1996])。

使用Qiagen小量制备(miniprep)试剂盒从枯草芽孢杆菌细胞分离pICatH-Amy707(ori)质粒DNA。使用50μL小量制备DNA(～10-20ng/uL)、10μL的dam甲基化酶10x缓冲液(NEB)、0.2μL的S-腺苷甲硫氨酸、4μL的dam甲基化酶、36μL的无菌水在37℃作用4小时来执行质粒pICatH-Amy707淀粉酶的dam甲基化。使用QiaQuik(Qiagen柱)分离反应产物，该质粒DNA被洗脱在30μL缓冲液EB(Qiagen)中。

使用来自Stratagene，La Jolla，CA的

XL多位点定向的诱变试剂盒对甲基化的pICatH-707淀粉酶质粒进行快速交换的多位点诱变(Quick-Change Multi-Site mutagenesis，QCMS)。根据以下厂商推荐制备反应混合物，由以下组成：15μL无菌水、2.5μL反应缓冲液、1μL dNTP混合物、0.5μLQuick溶液、0.5μL正向引物(25uM)、0.5μL反向引物(25uM)、4μLpICatH-707淀粉酶甲基化和纯化的质粒(共～20-30ng)、1μL

DNA聚合酶，总体积为25μL。循环条件：95℃1min 1X；95℃1min 1X，55℃1min 1X，65℃18min 30X(X表示循环数)。

使用的引物如下：

707N28R-F 5’ACC ATT GGA ACC GCC TGC GCA GCG AT 3’(SEQ ID NO：11)

707N28R-R 5’CAG GTT GCT CGC ATC GCT GCG CAG GC 3’(SEQ ID NO：12)

707S36D-F 5’GAT GCG AGC AAC CTG AAA GAT AAA GG 3’(SEQ ID NO：13)

707S36D-R 5’ACT GCT GTG ATG CCT TTA TCT TTC AGG TT3’(SEQ ID NO：14)

707R172Q-F 5’GAT TGG GAT CAA AGC CGC CAG CTG AAC A3’(SEQ ID NO：15)

707R172Q-R 5’AGA TGC GGT TGT TCA GCT GGC GGC TTT3’(SEQ ID NO：16)

707H183D-F 5’ATC TAT AAA TTT CGC GGC GAT GGC AAA3’(SEQ ID NO：17)

707H183D-R 5’CAA TCC CAT GCT TTG CCA TCG CCG CGA3’(SEQ ID NO：18)

707S255N-F 5’TGG ATC AAT CAT GTC AGA AAC GCG ACG3’(SEQ ID NO：19)

707S255N-R 5’CAT ATT TTT GCC CGT CGC GTT TCT GAC3’(SEQ ID NO：20)

707A256T-F 5’CAA TCA TGT CAG AAG CAC GAC GGG CAA A3’(SEQ ID NO：21)

707A256T-R 5’CAT ATT TTT GCC CGT CGT GCT TCT GAC3’(SEQ ID NO：22)

QCMS PCR之后，向QCMS反应加入1μL的限制性酶DpnI，并且在37℃孵育4小时。加入额外的0.5μL的DpnI，将该反应在37℃孵育额外2小时。将在5μL的样品缓冲液中的1μL DpnI-消化的QCMS反应在95℃孵育3分钟，冷却至4℃，使用滚环扩增(RCA)TempliPhi试剂盒(Amersham Cat#256400)扩增。将5μL的反应缓冲液和0.2μL的Phi29聚合酶加入DpnI-消化的QCMS反应中，在30℃孵育16小时。在完成反应之后，按照Amersham的操作手册灭活该酶。

将滚环扩增反应在去离子水中稀释10倍，使用2μL的DNA转化100μL的枯草芽孢杆菌(基因型：ΔaprE、ΔnprE、Δepr、ΔispA、Δbpr、degU^Hy32、oppA、ΔspoIIE3501、amyE::xylRPxylAcomK-ermC)感受态细胞并用木糖诱导。将转化反应物铺板于LB琼脂+10ppm新霉素+1％不溶淀粉平板上，在37℃生长过夜。

对于各个诱变反应，选择4个克隆，将它们各自重新悬浮于在微滴定板中的20μL的无菌水中，用于使用puReTaq Ready-To-Go PCR珠子(GEHealthcare)的菌落PCR。该反应由2μL的细胞悬液、22μL水、和0.5μL的各自的707PCR F1&R1引物(各自为25uM储液，序列在以下列出)和PureTaq珠子组成。

707 PCR F1：5’GCA AGT TCA CCA TGC AGT GTG TGA C3’(SEQ ID NO：23)

707 PCR R1：5’TAT CAA GCT TAT CGA TAC CGT CGA C3’(SEQ ID NO：24)

循环条件是：95℃4min 1x；95℃1min，53℃1min，72℃1min，25x；72℃5min 1x。运行琼脂糖凝胶以证实菌落PCR反应已经成功。使用ExoSAP-IT(GE Healthcare)除去引物和dNTP。将5μL的PCR产物加入2μL的ExoSAP-IT试剂，并将该反应在37℃孵育15分钟继之以在80℃15分钟。

将克隆送至Sequetech公司(Mountain View，CA)，对其使用以下引物进行序列分析：

707seq F1：5’CGA TTG TGA GGA GTG GCT TGT G3’(SEQ ID NO：25)

707seq R1：5’CTT ATC GAT ACC GTC GAC CCT C3’(SEQ ID NO：26)

将克隆(N28R-1、S36D-4、R172Q-4、H183D-1、S255N-7或A256T-2)划线培养在补充有5μg/mL氯霉素和1％不溶淀粉的LB平板上，在37℃生长过夜。使用标准技术分离该质粒。

以本来已知的方式，使用原生质体方法，用来自先前测序克隆之一的质粒载体转化宿主地衣芽孢杆菌(Δmpr、Δapr、Δcat)。对于Amy707淀粉酶、N28R、S36D、R172Q、H183D和S255N获得转化体。全部转化菌株具有整合进入宿主基因组的目的基因(Amy707或变体)和环出的质粒DNA(plasmid DNA looped out)。

实施例5

在摇瓶中的蛋白质表达

通过使用摇瓶以分步方式(从5μg/mL CMP至75μg/mL CMP)将转化的地衣芽孢杆菌细胞扩增，至75μg/mL氯霉素(CMP)，接着铺平板直至获得单个的、淀粉清楚的菌落。将地衣芽孢杆菌细胞中的针对R172Q、H183D和S36D/S255N所获得的转化体整合、环出，并扩增以在50μg/mL

CMP生长。在地衣芽孢杆菌中的针对N28R、S36D和S255N所获得的转化体被整合、环出，并在5μg/mL CMP生长。

为了在摇瓶中生长，挑取单个菌落的变体，接种于含有5mL LB+合适浓度氯霉素的高玻璃管中，令其生长5-6小时以提供预培养物。用50mL摇瓶培养基(基于磷酸钾的、4％乳糖、2％Nutrisoy)(potassium phosphatebased，4％lactose，2％Nutrisoy)填入250mL带挡板的摇瓶，用1mL预培养物接种，并在37℃在250rpm孵育90小时。对等分试样离心以收集培养物上清，对其测定淀粉酶活性或冻存在-20℃直至进一步使用。

实施例6

在这一实施例中，使用如下所述的Megazyme Ceralpha测定检测在地衣芽孢杆菌中表达并在摇瓶中生长的第707号芽孢杆菌属物种淀粉酶和707淀粉酶单位点变体(R172Q、H183D和S255N)和双位点变体(S36D/S255N)的淀粉酶活性。

对淀粉酶活性的Megazyme Ceralpha测定

这一测定是对Megazyme内切α-淀粉酶试剂盒K-CERA 08/05(AOAC Method 2002.01，Megazyme International Ireland)公开的操作手册的修饰。试剂瓶含有底物，其为非还原性末端封闭的对位硝基苯基麦芽七糖苷(p-nitrophenyl maltoheptaoside)(BPNPG7，54.5mg)和热稳定的葡糖苷酶(125U于pH 6.0)。为了执行该测定，将整个的1瓶内容物溶解在10.0mL的蒸馏水中。2mL等分试样被冷冻贮存在15ml螺旋盖试管中。在使用之前，将6mL测定缓冲液(50mM苹果酸钠、2.6mM CaCl₂、50mM NaCl、0.002％Triton X-100，pH 6.7)加入各个管中。将0.79mL缓冲液中的底物溶液加入(优选加盖的)杯中。将所述杯置于杯托中，获得空白的读数。然后将10μL酶样品(在测定缓冲液中稀释)加入所述杯中并开始该测定。在400nm或410nm测量每分钟的吸光度，并针对稀释和蛋白质浓度校正所述值。以任意的单位报告各个变体的淀粉酶活性，显示在图4中。

以上引用的全部参考以其整体通过参考被并入本文用于全部目的。

序列表

SEQ ID NO：1

来自枯草芽孢杆菌物种(Bacillus subtilus)no.707的成熟α-淀粉酶的序列

HHNGTNGTMM QYFEWYLPND GNHWNRLNSD ASNLKSKGIT AVWIPPAWKG ASQNDVGYGA

YDLYDLGEFN QKGTVRTKYG TRSQLQAAVT SLKNNGIQVY GDVVMNHKGG ADATEMVRAV

EVNPNNRNQE VTGEYTIEAW TRFDFPGRGN THSSFKWRWY HFDGVDWDQS RRLNNRIYKF

RGHGKAWDWE VDTENGNYDY LMYADIDMDH PEVVNELRNW GVWYTNTLGL DGFRIDAVKH

IKYSFTRDWI NHVRSATGKN MFAVAEFWKN DLGAIENYLQ KTNWNHSVFD VPLHYNLYNA

SKSGGNYDMR NIFNGTVVQR HPSHAVTFVD NHDSQPEEAL ESFVEEWFKP LAYALTLTRE

QGYPSVFYGD YYGIPTHGVP AMRSKIDPIL EARQKYAYGK QNDYLDHHNI IGWTREGNTA

HPNSGLATIM SDGAGGSKWM FVGRNKAGQV WSDITGNRTG TVTINADGWG NFSVNGGSVS

IWVNK

SEQ ID NO：2

来自芽孢杆菌属物种(Bacillus sp.)A7-7(DSM 12368)的成熟α-淀粉酶的序列

HHNGTNGTMM QYFEWYLPND GNHWNRLRSD ASNLKDKGIT AVWIPPAWKG ASQNDVGYGA

YDLYDLGEFN QKGTVRTKYG TRNQLQAAVT ALKSNGIQVY GDVVMNHKGG ADATEWVRAV

EVNPSNRNQE VSGDYTIEAW TKFDFPGRGN THSNFKWRWY HFDGVDWDQS RQLQNRIYKF

RGDGKGWDWE VDTENGNYDY LMYADIDMDH PEVVNELRNW GVWYTNTLGL DGFRIDAVKH

IKYSFTRDWL THVRNTTGKN MFAVAEFWKN DIGAIENYLS KTNWNHSVFD VPLHYNLYNA

SRSGGNYDMR QIFNGTVVQR HPTHAVTFVD NHDSQPEEAL ESFVEEWFKP LAYALTLTRD

QGYPSVFYGD YYGIPTHGVP AMKSKIDPIL EARQKYAYGK QNDYLDHHNM IGWTREGNTA

HPNSGLATIM SDGPGGNKWM YVGRNKAGQV WRDITGNRSG TVTINADGWG NFSVNGGSVS

IWVNN

SEQ ID NO：3

来自芽孢杆菌属物种A7-7(DSM 12368)的α-淀粉酶的全长氨基酸序列

MRKRKNGLIS ILLAFLLVLT SIPFTSANVE AHHNGTNGTM MQYFEWYLPN DGNHWNRLRS

DASNLKDKGI TAVWIPPAWK GASQNDVGYG AYDLYDLGEF NQKGTVRTKY GTRNQLQAAV

TALKSNGIQV YGDVVMNHKG GADATEWVRA VEVNPSNRNQ EVSGDYTIEA WTKFDFPGRG

NTHSNFKWRW YHFDGVDWDQ SRQLQNRIYK FRGDGKGWDW EVDTENGNYD YLMYADIDMD

HPEVVNELRN WGVWYTNTLG LDGFRIDAVK HIKYSFTRDW LTHVRNTTGK NMFAVAEFWK

NDIGAIENYL SKTNWNHSVF DVPLHYNLYN ASRSGGNYDM RQIFNGTVVQ RHPTHAVTFV

DNHDSQPEEA LESFVEEWFK PLAYALTLTR DQGYPSVFYG DYYGIPTHGV PAMKSKIDPI

LEARQKYAYG KQNDYLDHHN MIGWTREGNT AHPNSGLATI MSDGPGGNKW MYVGRNKAGQ

VWRDITGNRS GTVTINADGW GNFSVNGGSV SIWVNN

SEQ ID NO：4

芽孢杆菌属物种no.707α-淀粉酶的核苷酸序列(对应于信号肽的序列为下划线的)

ATGAAAATGAGAACAGGAAAAAAGGGTTTTTTAAGTATTTTATTAGCGTTCTTATTGGTGATTACTTCAA

TACCGTTTACTTTAGTAGATGTAGAAGCACATCATAACGGTACGAACGGGACAATGATGCAATACTTTGA

ATGGTATCTACCTAATGACGGAAATCATTGGAATCGATTAAACTCTGATGCGAGTAACCTTAAAAGCAAA

GGGATTACAGCGGTGTGGATTCCTCCAGCATGGAAGGGCGCTTCTCAAAATGACGTAGGATACGGAGCCT

ATGACCTGTATGATCTGGGAGAATTTAATCAAAAAGGTACCGTCCGTACAAAATATGGAACACGTAGTCA

GTTACAAGCTGCGGTAACCTCCTTAAAAAATAATGGAATTCAAGTATATGGTGACGTTGTTATGAATCAC

AAAGGTGGCGCAGACGCTACTGAAATGGTAAGGGCCGTTGAAGTGAATCCCAATAACCGTAACCAAGAAG

TGACTGGTGAATATACCATTGAAGCTTGGACTAGATTTGATTTTCCAGGGCGAGGAAATACTCATTCTAG

CTTTAAATGGAGATGGTATCATTTTGATGGTGTGGATTGGGATCAGTCACGTAGACTGAACAATCGCATC

TATAAATTTAGAGGTCATGGCAAAGCTTGGGATTGGGAAGTTGATACGGAAAATGGTAATTATGATTATT

TAATGTACGCTGATATTGATATGGATCACCCAGAAGTAGTAAATGAATTAAGAAATTGGGGTGTTTGGTA

CACAAACACATTAGGACTCGATGGATTTAGAATAGATGCGGTTAAACATATAAAGTATAGCTTTACGCGC

GATTGGATTAATCACGTTAGAAGTGCAACAGGTAAAAATATGTTTGCGGTTGCTGAGTTTTGGAAGAATG

ATTTAGGTGCAATTGAAAACTATCTGCAGAAAACAAACTGGAACCATTCAGTCTTTGATGTGCCGTTACA

TTATAATCTTTATAATGCATCAAAAAGCGGAGGGAACTATGATATGCGAAACATATTTAATGGAACGGTT

GTTCAACGACATCCAAGTCATGCTGTAACATTTGTTGATAATCATGATTCGCAGCCTGAAGAAGCATTAG

AATCTTTTGTTGAAGAATGGTTTAAACCATTAGCGTATGCGCTTACATTAACGCGTGAACAAGGATACCC

TTCTGTATTTTACGGAGATTATTATGGGATTCCAACACATGGAGTGCCAGCAATGAGATCAAAAATCGAT

CCGATTTTAGAAGCACGTCAAAAGTATGCATACGGAAAACAAAATGATTACTTAGACCATCATAATATCA

TTGGTTGGACGCGTGAAGGGAATACAGCACACCCCAATTCAGGTCTAGCTACCATCATGTCTGATGGAGC

GGGTGGAAGTAAGTGGATGTTTGTTGGGCGTAATAAGGCTGGTCAAGTATGGAGTGATATTACAGGAAAC

CGTACAGGTACGGTTACAATCAATGCAGACGGTTGGGGCAATTTCTCTGTGAATGGAGGGTCAGTTTCTA

TTTGGGTCAACAAA

SEQ ID NO：5

来自芽孢杆菌属物种A 7-7(DSM 12368)的成熟α-淀粉酶的核苷酸序列

CACCATAATG GCACAAATGG AACAATGATG CAATATTTTG AATGGTATTT GCCAAATGAC GGTAATCATT

GGAATAGATT AAGATCAGAT GCAAGTAATC TTAAAGATAA AGGGATTACA GCGGTTTGGA TACCACCTGC

TTGGAAAGGG GCTTCTCAAA ATGATGTAGG GTATGGAGCC TATGATCTGT ATGATTTAGG AGAATTCAAT

CAAAAAGGAA CCGTACGTAC AAAGTACGGA ACCCGTAATC AATTACAAGC TGCAGTAACC GCCTTAAAAA

GTAATGGTAT TCAAGTATAC GGAGATGTCG TAATGAATCA TAAGGGTGGA GCGGATGCCA CTGAGTGGGT

TCGAGCGGTT GAAGTGAACC CAAGTAATCG TAATCAAGAA GTCTCTGGTG ATTATACGAT TGAGGCTTGG

ACTAAGTTTG ATTTTCCTGG TCGAGGTAAT ACCCACTCTA ACTTTAAATG GAGATGGTAT CATTTCGATG

GTGTAGATTG GGATCAGTCA CGTCAATTGC AGAATCGAAT CTATAAATTC AGAGGAGATG GAAAAGGTTG

GGACTGGGAA GTTGATACAG AGAACGGAAA CTATGACTAT CTAATGTACG CGGATATTGA TATGGATCAC

CCTGAAGTAG TGAATGAACT CAGAAACTGG GGTGTATGGT ATACCAATAC ACTGGGGCTA GACGGGTTCA

GAATAGATGC GGTAAAACAT ATAAAATATA GCTTTACTCG TGATTGGCTT ACTCACGTTA GAAATACGAC

AGGTAAAAAT ATGTTTGCAG TTGCAGAGTT CTGGAAGAAT GACATAGGTG CAATTGAAAA TTACTTAAGT

AAAACAAATT GGAATCATTC AGTTTTTGAT GTGCCCCTGC ATTATAACCT TTATAATGCA TCGAGAAGTG

GTGGCAATTA TGATATGAGG CAAATATTTA ATGGAACAGT TGTTCAGAGA CATCCTACAC ATGCTGTAAC

ATTTGTTGAT AACCATGATT CACAGCCGGA AGAAGCCCTA GAGTCATTTG TTGAAGAGTG GTTCAAACCG

TTAGCGTATG CTCTCACACT AACACGTGAT CAAGGATATC CTTCCGTTTT TTATGGAGAT TATTATGGGA

TTCCGACGCA TGGTGTACCA GCAATGAAAT CTAAGATTGA TCCGATTTTA GAAGCACGTC AAAAGTATGC

GTACGGAAAA CAAAATGATT ATTTGGATCA CCATAATATG ATTGGCTGGA CGCGTGAAGG TAATACAGCA

CATCCCAACT CAGGACTAGC AACTATTATG TCGGATGGCC CAGGAGGAAA TAAATGGATG TATGTTGGGC

GTAATAAGGC TGGACAAGTT TGGAGAGATA TTACAGGAAA TCGCTCAGGT ACGGTGACGA TTAACGCAGA

TGGGTGGGGT AATTTTTCTG TAAATGGTGG GTCTGTATCT ATATGGGTAA AT

SEQ ID NO：6

来自芽孢杆菌属物种A 7-7(DSM 12368)全长α-淀粉酶的核苷酸序列

   1 ATGACGATGA GAAAACGTAA AAATGGATTA ATCAGTATTC TATTGGCATT TTTGTTGGTA

  61 CTTACATCAA TACCTTTTAC TTCAGCAAAC GTAGAAGCAC ACCATAATGG CACAAATGGA

 121 ACAATGATGC AATATTTTGA ATGGTATTTG CCAAATGACG GTAATCATTG GAATAGATTA

 181 AGATCAGATG CAAGTAATCT TAAAGATAAA GGGATTACAG CGGTTTGGAT ACCACCTGCT

 241 TGGAAAGGGG CTTCTCAAAA TGATGTAGGG TATGGAGCCT ATGATCTGTA TGATTTAGGA

 301 GAATTCAATC AAAAAGGAAC CGTACGTACA AAGTACGGAA CCCGTAATCA ATTACAAGCT

 361 GCAGTAACCG CCTTAAAAAG TAATGGTATT CAAGTATACG GAGATGTCGT AATGAATCAT

 421 AAGGGTGGAG CGGATGCCAC TGAGTGGGTT CGAGCGGTTG AAGTGAACCC AAGTAATCGT

 481 AATCAAGAAG TCTCTGGTGA TTATACGATT GAGGCTTGGA CTAAGTTTGA TTTTCCTGGT

 541 CGAGGTAATA CCCACTCTAA CTTTAAATGG AGATGGTATC ATTTCGATGG TGTAGATTGG

 601 GATCAGTCAC GTCAATTGCA GAATCGAATC TATAAATTCA GAGGAGATGG AAAAGGTTGG

 661 GACTGGGAAG TTGATACAGA GAACGGAAAC TATGACTATC TAATGTACGC GGATATTGAT

 721 ATGGATCACC CTGAAGTAGT GAATGAACTC AGAAACTGGG GTGTATGGTA TACCAATACA

 781 CTGGGGCTAG ACGGGTTCAG AATAGATGCG GTAAAACATA TAAAATATAG CTTTACTCGT

 841 GATTGGCTTA CTCACGTTAG AAATACGACA GGTAAAAATA TGTTTGCAGT TGCAGAGTTC

 901 TGGAAGAATG ACATAGGTGC AATTGAAAAT TACTTAAGTA AAACAAATTG GAATCATTCA

 961 GTTTTTGATG TGCCCCTGCA TTATAACCTT TATAATGCAT CGAGAAGTGG TGGCAATTAT

1021 GATATGAGGC AAATATTTAA TGGAACAGTT GTTCAGAGAC ATCCTACACA TGCTGTAACA

1081 TTTGTTGATA ACCATGATTC ACAGCCGGAA GAAGCCCTAG AGTCATTTGT TGAAGAGTGG

1141 TTCAAACCGT TAGCGTATGC TCTCACACTA ACACGTGATC AAGGATATCC TTCCGTTTTT

1201 TATGGAGATT ATTATGGGAT TCCGACGCAT GGTGTACCAG CAATGAAATC TAAGATTGAT

1261 CCGATTTTAG AAGCACGTCA AAAGTATGCG TACGGAAAAC AAAATGATTA TTTGGATCAC

1321 CATAATATGA TTGGCTGGAC GCGTGAAGGT AATACAGCAC ATCCCAACTC AGGACTAGCA

1381 ACTATTATGT CGGATGGCCC AGGAGGAAAT AAATGGATGT ATGTTGGGCG TAATAAGGCT

1441 GGACAAGTTT GGAGAGATAT TACAGGAAAT CGCTCAGGTA CGGTGACGAT TAACGCAGAT

1501 GGGTGGGGTA ATTTTTCTGT AAATGGTGGG TCTGTATCTA TATGGGTAAA T

SEQ ID NO：7

GenBank CAL48155

HHNGTNGTMM QYFEWYLPND GNHWNRLRSD ASNLKDKGIT AVWIPPAWKG ASQNDVGYGA

YDLYDLGEFN QKGTVRTKYG TRNQLQAAVT ALKSNGIQVY GDVVMNHKGG ADATEWVRAV

EVNPSNRNQE VSGDYTIEAW TKFDFPGRGN THSNFKWRWY HFDGVDWDQS RQLQNRIYKF

RGDGKGWDWE VDTENGNYDY LMYADIDMDH PEVVNELRNW GVWYTNTLGL DGFRIDAVKH

IKYSFTRDWL THVRNTTGKN MFAVAEFWKN DIGAIENYLS KTNWNHSVFD VPLHYNLYNA

SRSGGNYDMR QIFNGTVVQR HPTHAVTFVD NHDSQPEEAL ESFVEEWFKP LAYALTLTRD

QGYPSVFYGD YYGIPTHGVP AMKSKIDPIL EARQKYAYGK QNDYLDHHNM IGWTREGNTA

HPNSGLATIM SDGPGGNKWM YVGRNKAGQV WRDITGNRSG TVTINADGWG NFSVNGGSVS

IWVN

SEQ ID NO：8

全长CAL48155，包括信号序列

MTMRKRKNGL ISILLAFLLV LTSIPFTSAN VEAHHNGTNG TMMQYFEWYL PNDGNHWNRL

RSDASNLKDK GITAVWIPPA WKGASQNDVG YGAYDLYDLG EFNQKGTVRT KYGTRNQLQA

AVTALKSNGI QVYGDVVMNH KGGADATEWV RAVEVNPSNR NQEVSGDYTI EAWTKFDFPG

RGNTHSNFKW RWYHFDGVDW DQSRQLQNRI YKFRGDGKGW DWEVDTENGN YDYLMYADID

MDHPEVVNEL RNWGVWYTNT LGLDGFRIDA VKHIKYSFTR DWLTHVRNTT GKNMFAVAEF

WKNDIGAIEN YLSKTNWNHS VFDVPLHYNL YNASRSGGNY DMRQIFNGTV VQRHPTHAVT

FVDNHDSQPE EALESFVEEW FKPLAYALTL TRDQGYPSVF YGDYYGIPTH GVPAMKSKID

PILEARQKYA YGKQNDYLDH HNMIGWTREG NTAHPNSGLA TIMSDGPGGN KWMYVGRNKA

GQVWRDITGN RSGTVTINAD GWGNFSVNGG SVSIWVN

SEQ ID NO：9

合成核苷酸EBS2XhoI_RV

TGG AAT CTC GAG GTT TTA TCC TTT ACC TTG TCT CC

SEQ ID NO：10

合成核苷酸Plat5XhoI_FW：

CCC CCG CTC GAG GCT TTT CTT TTG GAA GAA AAT ATA GGG AAA ATG GTA CTT

GTT AAA AAT TCG GAA TAT TTA TAC AAT ATC ATA TGT TTC ACA TTG AAA GGG G

SEQ ID NO：11

合成核苷酸707N28R-F

ACCATT GGA ACC GCC TGC GCA GCG AT

SEQ ID NO：12

合成核苷酸707N28R-R

CAG GTT GCT CGC ATC GCT GCG CAG GC

SEQ ID NO：13

合成核苷酸707S36D-F

GAT GCG AGC AAC CTG AAA GAT AAA GG

SEQ ID NO：14

合成核苷酸707S36D-R

ACT GCT GTG ATG CCT TTA TCT TTC AGG TT

SEQ ID NO：15

合成核苷酸707R172Q-F

GAT TGG GAT CAA AGC CGC CAG CTG AAC A

SEQ ID NO：16

合成核苷酸707R 172Q-R

AGA TGC GGT TGT TCA GCT GGC GGC TTT

SEQID NO：17

合成核苷酸707H183D-F

ATC TAT AAA TTT CGC GGC GAT GGC AAA

SEQ ID NO：18

合成核苷酸707H183D-R

CAA TCC CAT GCT TTG CCA TCG CCG CGA

SEQ ID NO：19

合成核苷酸707S255N-F

TGG ATC AAT CAT GTC AGA AAC GCG ACG

SEQ ID NO：20

合成核苷酸707S255N-R

CAT ATT TTT GCC CGT CGC GTT TCT GAC

SEQ ID NO：21

合成核苷酸707A256T-F

CAA TCA TGT CAG AAG CAC GAC GGG CAA A

SEQ ID NO：22

合成核苷酸707A256T-R

CAT ATT TTT GCC CGT CGT GCT TCT GAC

SEQ ID NO：23

合成核苷酸707PCR F1

GCA AGT TCA CCA TGC AGT GTG TGA C

SEQ ID NO：24

合成核苷酸707PCR R1

TAT CAA GCT TAT CGA TAC CGT CGA C

SEQ ID NO：25

合成核苷酸707seq F1

CGA TTG TGA GGA GTG GCT TGT G

SEQID NO：26

合成核苷酸707seq R1

CTT ATC GAT ACC GTC GAC CCT C

Claims (63)

1.编码野生型第一α-淀粉酶变体的分离的核酸，其中

(a)该α-淀粉酶变体与野生型第一α-淀粉酶变体相比包含至少一个修饰的氨基酸；

(b)该α-淀粉酶变体呈现α-淀粉酶活性；和

(c)所述至少一个修饰的氨基酸与在第二α-淀粉酶氨基酸序列的对应位置中发现的氨基酸相同，

其中第二α-淀粉酶在发酵肉汤中具有比野生型第一α-淀粉酶更高的溶解度，并且

其中该变体α-淀粉酶的氨基酸序列与第二α-淀粉酶有至少一个氨基酸不同。

2.权利要求1的分离的核酸，其中α-淀粉酶变体与野生型第一α-淀粉酶的表达水平相比，还能够在宿主细胞中以更高水平被表达。

3.权利要求1的分离的核酸，其中该α-淀粉酶变体包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35或40个氨基酸修饰。

4.权利要求1的分离的核酸，其中该α-淀粉酶变体与第二α-淀粉酶在氨基酸序列中有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多氨基酸不同。

5.权利要求1的分离的核酸，其中第一野生型α-淀粉酶与第二α-淀粉酶的氨基酸序列具有至少60％的序列同一性。

6.权利要求5的分离的核酸，其中第一野生型α-淀粉酶与第二α-淀粉酶的氨基酸序列具有至少80％的序列同一性。

7.权利要求6的分离的核酸，其中第一野生型α-淀粉酶与第二α-淀粉酶的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性。

8.权利要求1的分离的核酸，其中野生型第一α-淀粉酶和第二α-淀粉酶是细菌α-淀粉酶。

9.权利要求8的分离的核酸，其中野生型第一α-淀粉酶和第二α-淀粉酶是芽孢杆菌属(Bacillus)α-淀粉酶。

10.权利要求9的分离的核酸，其中野生型第一α-淀粉酶是包含在SEQ ID NO：1中提出的氨基酸序列的第707号芽孢杆菌属物种α-淀粉酶。

11.权利要求10的分离的核酸，其中第二α-淀粉酶是包含在SEQ IDNO：2或SEQ ID NO：3中提出的氨基酸序列的芽孢杆菌属物种A7-7(DSM12368)α-淀粉酶。

12.权利要求11的分离的核酸，其中α-淀粉酶变体的修饰的氨基酸选自N28R、S36D、S83N、M116W、R142K、R172Q、H183D、A186G、N251T、S255N、A256T、F441Y、S452R和K485N。

13.权利要求12的分离的核酸，其中α-淀粉酶变体的修饰的氨基酸选自N28R、S36D、M116W、R172Q、H183D、S255N和A256T。

14.分离的宿主细胞，其包含权利要求1的核酸。

15.有效连接于权利要求1的分离的核酸的载体。

16.包含权利要求15的载体的分离的宿主细胞。

17.权利要求14或16的分离的宿主细胞，其中该细胞是微生物。

18.权利要求17的分离的宿主细胞，其中该微生物是细菌或真菌。

19.权利要求18的分离的宿主细胞，其中该细菌是选自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、迟缓芽孢杆菌(B.lentus)、短芽孢杆菌(B.brevis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)、嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、凝固芽孢杆菌(B.coagulans)、环状芽孢杆菌(B.circulans)、灿烂芽孢杆菌(B.lautus)、苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)、浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)或鼠灰链霉菌(S.murinus)的革兰氏阳性菌；或革兰氏阴性菌，其中所述革兰氏阴性菌是大肠杆菌(Escherichia coli)或假单胞菌属(Pseudomonas)物种。

20.野生型第一α-淀粉酶的变体，其中

(a)该α-淀粉酶变体与野生型第一α-淀粉酶相比包含至少一个修饰的氨基酸；

(b)该α-淀粉酶变体呈现α-淀粉酶活性；和

(c)所述至少一个修饰的氨基酸与在第二α-淀粉酶的氨基酸序列的对应位置中发现的氨基酸相同，

其中第二α-淀粉酶在发酵肉汤中具有比野生型第一α-淀粉酶更高的溶解度，并且

其中变体α-淀粉酶的氨基酸序列与第二α-淀粉酶有至少一个氨基酸不同。

21.权利要求20的α-淀粉酶变体，其中该变体α-淀粉酶与野生型第一α-淀粉酶的表达水平相比还能够在宿主细胞中以更高水平被表达。

22.权利要求20的α-淀粉酶变体，其中该变体α-淀粉酶包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35或40个氨基酸修饰。

23.权利要求20的α-淀粉酶变体，其中该变体α-淀粉酶在氨基酸序列中与第二α-淀粉酶有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多氨基酸不同。

24.权利要求20的α-淀粉酶变体，其中第一野生型α-淀粉酶与第二α-淀粉酶的氨基酸序列具有至少60％的序列同一性。

25.权利要求24的α-淀粉酶变体，其中第一野生型α-淀粉酶与第二α-淀粉酶的氨基酸序列具有至少80％的序列同一性。

26.权利要求25的α-淀粉酶变体，其中第一野生型α-淀粉酶与第二α-淀粉酶的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性。

27.权利要求20的α-淀粉酶变体，其中野生型第一α-淀粉酶与第二α-淀粉酶是细菌α-淀粉酶。

28.权利要求27的α-淀粉酶变体，其中野生型第一α-淀粉酶与第二α-淀粉酶是芽孢杆菌属α-淀粉酶。

29.权利要求28的α-淀粉酶变体，其中野生型第一α-淀粉酶是包含在SEQ ID NO：1中提出的氨基酸序列的第707号芽孢杆菌属物种α-淀粉酶。

30.权利要求28的α-淀粉酶变体，其中第二α-淀粉酶是包含在SEQID NO：2或SEQ ID NO：3中提出的氨基酸序列的芽孢杆菌属物种A 7-7(DSM 12368)α-淀粉酶。

31.权利要求29的α-淀粉酶变体，其中修饰的氨基酸选自N28R、S36D、S83N、M116W、R142K、R172Q、H183D、A186G、N251T、S255N、A256T、F441Y、S452R和K485N。

32.权利要求31的α-淀粉酶变体，其中修饰的氨基酸选自N28R、S36D、M116W、R172Q、H183D、S255N和A256T。

33.洗涤剂添加剂，其包含权利要求20-32的任一项的α-淀粉酶变体。

34.权利要求33的洗涤剂添加剂，其为无粉尘颗粒、微颗粒、稳定的液体或受保护的酶的形式。

35.权利要求33的洗涤剂添加剂，其中该洗涤剂添加剂还包含酶，所述酶选自纤维素酶、蛋白酶、氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精葡聚糖转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、卤代过氧化物酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶分解酶、肽谷氨酰胺酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶、支链淀粉酶、异淀粉酶、角叉菜酶或其任意组合。

36.权利要求35的洗涤剂添加剂，其中该淀粉酶是另一α-淀粉酶、β-淀粉酶、异淀粉酶或葡糖淀粉酶。

37.洗涤剂组合物，其包含权利要求33的洗涤剂添加剂。

38.权利要求37的洗涤剂组合物，其还包含酶，所述酶选自纤维素酶、蛋白酶、氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精葡聚糖转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、卤代过氧化物酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶分解酶、肽谷氨酰胺酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶、支链淀粉酶、异淀粉酶、角叉菜酶、或其任意组合。

39.人工或自动的餐具洗涤组合物，其包括权利要求20-32的任一项的α-淀粉酶变体。

40.权利要求39的人工或自动的餐具洗涤组合物，其还包含一种或多种的表面活性剂、洗涤剂助洗剂、络合剂、聚合物、漂白系统、稳定剂、泡沫促进剂、抑泡剂、防腐蚀剂、污垢悬浮剂、防尘污再沾着剂、染料、杀细菌剂、hytrotope、晦暗抑制剂和香料。

41.权利要求39的人工或自动的餐具洗涤组合物，其还包含酶，所述酶选自纤维素酶、蛋白酶、氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精葡聚糖转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、卤代过氧化物酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶分解酶、肽谷氨酰胺酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶、支链淀粉酶、异淀粉酶、角叉菜酶、或其任意组合。

42.清洁餐具的方法，其包括施用权利要求39的人工或自动的餐具洗涤组合物。

43.洗衣洗涤剂添加剂，其包含权利要求20-32的任一项的α-淀粉酶变体。

44.洗衣洗涤剂组合物，其包括权利要求43的洗衣添加剂，并且还包括一种或多种的表面活性剂、洗涤剂助洗剂、络合剂、聚合物、漂白系统、稳定剂、泡沫促进剂、抑泡剂、防腐蚀剂、污垢悬浮剂、防尘污再沾着剂、染料、杀细菌剂、hytrotope、荧光增白剂、织物调理剂和香料。

45.洗衣方法，其包括施用权利要求43的洗衣洗涤剂添加剂。

46.生物膜水解组合物，其包含权利要求20-32的任一项的α-淀粉酶变体。

47.权利要求46的生物膜水解组合物，其中该组合物是溶液、粉末、糊、凝胶、液体、软膏、片剂或凝胶的形式。

48.权利要求46的生物膜水解组合物，其还包含纤维素酶、半纤维素酶、木聚糖酶、脂肪酶、蛋白酶、果胶酶、抗微生物剂或其任意的组合。

49.水解生物膜的方法，其包括施用权利要求46的组合物，进行足以水解生物膜的时间。

50.淀粉加工组合物，其包含在水溶液中的权利要求20-32的任一项的α-淀粉酶变体。

51.权利要求50的淀粉加工组合物，其还包含葡糖淀粉酶、异淀粉酶、支链淀粉酶、植酸酶或其组合。

52.加工淀粉的方法，其包括施用权利要求49的组合物，进行足以加工淀粉的时间。

53.用于糖化淀粉的组合物，其包含在溶液中的权利要求20-32的任一项的α-淀粉酶变体。

54.糖化淀粉的方法，其包括施用权利要求53的组合物，进行足以糖化淀粉的时间。

55.用于液化淀粉的组合物，其包含在溶液中的权利要求20-32的任一项的α-淀粉酶变体。

56.液化淀粉的方法，其包括施用权利要求55的组合物，进行足以液化淀粉的时间。

57.纺织品脱浆组合物，其包含在溶液中的权利要求20-32的任一项的α-淀粉酶变体。

58.权利要求57的纺织品脱浆组合物，其还包含另一种酶。

59.脱浆纺织品的方法，其包括施用权利要求57的纺织品脱浆组合物，进行足以脱浆纺织品的时间。

60.烘培组合物，其包含在溶液或凝胶中的权利要求20-32的任一项的α-淀粉酶变体。

61.烘培方法，其包括施用权利要求60的烘培组合物。

62.权利要求20-32的任一项的α-淀粉酶变体的用途。

63.溶液中的权利要求20-32的任一项的α-淀粉酶变体的用途，其用于清洁餐具、洗衣、水解生物膜、加工淀粉、糖化淀粉、液化淀粉、脱浆纺织品或烘培。

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