CN104031393A - 改进的交联组合物 - Google Patents

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Abstract

改进的组合物包括可交联蛋白或多肽以及引发可交联蛋白交联的无毒性材料。组合物任选地且优选地在非磷酸盐缓冲溶剂中制备。任选地且优选地，可交联蛋白包括明胶和任何明胶变体，或本文中描述的变体蛋白。任选地且优选地，无毒性材料包括转谷氨酰胺酶(TG)，其可以任选地包括任何类型的钙依赖性或非依赖性转谷氨酰胺酶，转谷氨酰胺酶可以例如任选地是微生物转谷氨酰胺酶(mTG)。

Description

改进的交联组合物
本申请是申请日为2009年06月18日，申请号为200980131973.6，发明名称为“改进的交联组合物”的申请的分案申请。
发明领域
本发明涉及改进的交联组合物，其包括可交联蛋白和引发可交联蛋白交联的无毒性材料。
发明背景
可以原位形成凝胶的生物材料用于各种应用。在许多情形中，原位凝胶形成材料用作受控药物递送的可注射基质或用于组织工程的可注射支架。(Gutowska A、Jeong B、Jasionowski M.Anat Rec2001，263，342-349。Silva EA，Mooney DJ.J Thromb Haemost2007，5，590-8。Mahoney MJ，Anseth KS.J Biomed Mater Res A2007，81，269-78。)原位凝胶形成材料还可以用作粘合剂以在生理环境中粘结组织或密封渗漏(气体或流体)。
对软组织粘合剂的兴趣在逐渐增加，因为期望替换或补充用于伤口闭合的缝线(Glickman M，Gheissari A，Money S，Martin J，Ballard J.Arch Surg2002，137，326-31；讨论332。Pursifull NF，Morey AF.Curr Opin Urol2007，17，396-401。)，损伤更少和美容手术的趋势(Tissue Adhesives in ClinicalMedicine(临床医学中的组织粘合剂)；第2版；Quinn，J.V.，编；BC Decker：Hamilton，Ontario Canada，2005。Tissue Glue in Cosmetic Surgery(美容手术中的组织胶)；Saltz，R.；Toriumi，D.M.编辑；Quality Medical Publishing，Inc.，：St.Louis，Missouri，USA2004。)，以及紧急止血的需要(Pusateri AE，Holcomb JB，Kheirabadi BS，Alam HB，Wade CE，Ryan KL.Journal ofTrauma-Injury Infection and Critical Care2006，60，674-682。Acheson EM，Kheirabadi BS，Deguzman R，Dick EJ，Holcomb JB.Journal of Trauma-InjuryInfection and Critical Care 2005，59，865-874。Kheirabadi BS，Acheson EM，Deguzman R，Sondeen JL，Ryan KL，Delgado A，Dick EJ，Holcomb JB.Journal of Trauma-Injury Infection and Critical Care2005，59，25-34。)。
可以通过多种方法引起原位凝胶形成。形成凝胶的化学方法包括通过接触，如在氰基丙烯酸酯中，或诸如光引发的外部刺激来引发聚合。而且，可以通过下述方式实现凝胶形成：使用诸如戊二醛或碳二亚胺的低分子量交联剂来化学交联预聚物(Otani Y，TabataY，Ikada Y.Ann Thorac Surg1999，67，922-6。Sung HW，Huang DM，Chang WH，Huang RN，Hsu JC.J BiomedMater Res1999，46，520-30。Otani，Y.；Tabata，Y.；Ikada，Y.Biomaterials1998，19，2167-73。Lim，D.W.；Nettles，D.L.；Setton，L. A.；Chilkoti，A.Biomacromolecules2008，9，222-30。)，或使用聚合物上的活性取代基来化学交联预聚物(Iwata，H.；Matsuda，S.；Mitsuhashi，K.；Itoh，E.；Ikada，Y.Biomaterials1998，19，1869-76)。
除了化学方法外，通过利用自组装肽的物理方式可以实现凝胶形成(Ellis-Behnke RG， Liang YX，Tay DK，Kau PW，Schneider GE，Zhang S，WuW，So KF.Nanomedicine2006，2，207-15。Haines-Butterick L，Rajagopal K，Branco M，Salick D，Rughani R，Pilarz M，Lamm MS，Pochan DJ，Schneider JP.Proc Natl Acad Sci U S A2007，104，7791-6。Ulijn RV，Smith AM.Chem SocRev2008，37，664-75)。
最后，已经研究了引起凝胶形成的生物方法，这些生物方法是基于交联诸如贻贝胶的来自海洋粘合剂的交联组分(Strausberg RL，Link RP.Trends Biotechnol 1990，S，53-7)，或基于血液凝固，如在血纤蛋白密封剂中(Jackson MR.Am J Surg2001，182，1S-7S。Spotnitz WD.Am J Surg2001，182，8S-14S Buchta C，Hedrich HC，Macher M，Hocker P，Redl H.Biomaterials2005，26，6233-41.27-30)。
还考虑了多种仿生方法来原位形成凝胶。在这些方法中，聚合物交联和凝胶形成是模仿生物学中存在的交联操作之一。可能引起技术上最感兴趣的生物模型是在湿气条件下凝固的贻贝胶(Silverman HG，Roberto FF。Mar Biotechnol(NY)2007，9，661-81。Deacon MP，Davis SS，Waite JH，Harding SE。Biochemistry1998，37，14108-12。)。粘着蛋白的酚(即多巴)残基酶促转化成反应性醌残基来引发贻贝胶的交联，反应性醌残基可经历随后的蛋白内交联反应(Burzio LA，Waite JH.Biochemistry2000，39，11147-53。McDowell LM，Burzio LA，Waite JH，Schaefer JJ.Biol Chem1999，274，20293-5)。已经作为技术模型的第二种生物交联操作是在血液凝固期间发生的转谷氨酰胺酶催化反应(Ehrbar M，Rizzi SC，Hlushchuk R，DjonovV，Zisch AH，Hubbell JA，Weber FE，Lutolf MP。Biomaterials2007，28，3856-66)。用于原位凝胶形成的仿生学方法已经研究了XIIIa因子或其他组织转谷氨酰胺酶的使用(Sperinde J，Griffith L.Macromolecules2000，33，5476-5480。Sanborn TJ，Messersmith PB，Barron AE。Biomaterials2002，23，2703-10)。
特别感兴趣的一种用于原位凝胶形成的仿生方法是通过钙非依赖性微生物转谷氨酰胺酶(mTG)来交联明胶。mTG催化与XIIIa因子类似的交联反应，但微生物酶活性既不需要凝血酶，也不需要钙。mTG的最初研究指向食品行业的应用(Babin H，Dickinson E.Food Hydrocolloids2001，15，271-276。Motoki M，Seguro K.Trends in Food Science&Technology1998，9，204-210。)，而后来的研究考虑了可能的医学应用。先前的体外研究已经显示出mTG可以交联明胶以在数分钟内形成凝胶，明胶-mTG粘合剂可以与湿气或湿组织结合，且粘合剂强度与基于血纤蛋白的密封剂相当或优于它们(Chen TH，Payne GF等人，Biomaterials2003，24，2831-2841。McDermott MK，Payne GF等人，Biomacromolecules2004，5，1270-1279。Chen T，Payne GF等人，J Biomed Mater Res B Appl Biomater2006，77，416-22。)。
发明概述
背景技术并未教导或表明以一种或多种额外的赋形剂为特征的改进的组合物，这些额外的赋形剂用于控制基于非血纤蛋白或多肽的酶促交联材料的一种或多种特性，该改进的组合物可以用于多种应用，诸如用于止血或体液密封目的，包括但不限于手术应用、控制出血、密封流体渗漏、控制伤口流血。
根据至少一些实施方案，本发明提供了一种包括可交联蛋白或多肽和一种或多种交联材料的组合物。
根据本发明的一些实施方案，提供了一种包括在组合的乙酸盐和柠檬酸盐缓冲液中的可交联蛋白或多肽、引发所述可交联蛋白的交联的酶的组合物，条件是所述蛋白或多肽不是血纤蛋白。任选地，在所述可交联蛋白或多肽和所述酶及它们各自的缓冲液被混合以形成所述组合物之前，所述可交联蛋白或多肽存在于乙酸钠缓冲液中且其中所述酶在柠檬酸钠缓冲液中。优选地，所述可交联蛋白或多肽包括明胶。更优选地，所述明胶是至少250Bloom。
根据本发明的一些实施方案，提供了一种还包括任何药学上可相容的盐形式的钙的组合物。且任选地还包括脲。
优选地，所述钙与所述脲以组合存在时，与钙或脲的每一种单独存在时相比，钙和脲的每一种以减少的量存在。
更优选地，所述乙酸盐和/或所述柠檬酸盐小于约0.5M。
任选地且最优选地，所述乙酸盐和/或所述柠檬酸盐是至少约0.01M。
任选地，根据期望的交联时间，离子强度选自约0.1M到约0.5M，其中增大的离子强度导致相对缩短的交联时间。
任选地且优选地，对本文描述的任意组合物来说，酶包括转谷氨酰胺酶或多铜氧化酶中的一种或多种。
更优选地，所述转谷氨酰胺酶包括微生物转谷氨酰胺酶。
根据本发明的一些实施方案，提供了一种包括可交联蛋白或多肽、引发所述可交联蛋白的交联的酶、金属离子和变性剂的组合物，条件是所述蛋白或多肽不是血纤蛋白。
任选地，可交联蛋白或多肽包括明胶。优选地，所述明胶是至少250Bloom。
更优选地，所述金属离子包括任何药学上可相容的盐形式的钙。更优选地，所述钙盐包括氯化钙或氢氧化钙中的一种或多种。任选地且最优选地，所述钙以至多1M的量存在。
任选地，对本文描述的任意组合物来说，所述变性剂包括离液剂。优选地，所述离液剂包括脲。更优选地，所述脲以至多4M的量存在。最优选地，当所述钙和所述脲以组合存在时，钙和脲的每一种以减少的量存在。
任选地，当所述金属离子包括钙时，组合物还包括钙螯合剂。
根据本发明的一些实施方案，提供了一种包括可交联蛋白或多肽、引发所述可交联蛋白的交联的钙非依赖性酶和钙螯合剂的组合物，条件是所述蛋白或多肽不是血纤蛋白。
任选地，所述钙螯合剂包括EDTA、柠檬酸盐或calgon中的一种或多种。优选地，所述柠檬酸盐或所述EDTA以约0.01M到约2M的量存在。更优选地，所述柠檬酸盐或所述EDTA以约0.05M到约0.2M的量存在。最选地，所述柠檬酸盐或所述EDTA以约0.5M到约2M的量存在。
根据本发明的一些实施方案，提供了一种包括可交联蛋白或多肽、引发所述可交联蛋白交联的酶和增粘剂的组合物，条件是所述蛋白或多肽不是血纤蛋白，其中增粘剂选自由藻酸酯、阿拉伯树胶、高粘度羧甲基纤维素(CMC)、黄原酸胶、瓜尔胶和PVP组成的组。
根据本发明的一些实施方案，提供了一种包括可交联蛋白或多肽、引发所述可交联蛋白的交联的酶和稳液剂(kosmotrope)的组合物，条件是所述蛋白或多肽不是血纤蛋白。
任选地，所述稳液剂选自由脯氨酸、海藻糖和谷氨酸或其任意两种或多种的组合组成的组。还任选地，组合物还以离液剂为特征。
根据本发明的一些实施方案，提供了一种包括明胶、转谷氨酰胺酶和能够共价结合到所述明胶的PEG(聚乙二醇)衍生物的组合物。任选地，所述PEG衍生物包括任何胺化的PEG衍生物。优选地，所述胺化的PEG衍生物包括PEG胺。
根据本发明的一些实施方案，提供了一种包括明胶、转谷氨酰胺酶和能够共价结合到所述明胶的PVA(聚乙烯醇)衍生物的组合物。任选地，所述PVA衍生物包括任何胺化的PVA衍生物。优选地，所述胺化的PVA衍生物包括PVA胺。
根据本发明的一些实施方案，提供了一种包括明胶、胺底物交联剂和氨甲酰化的抑制剂的组合物。任选地，所述交联剂包括转谷氨酰胺酶。
优选地，所述氨甲酰化的抑制剂包括胺供体。更优选地，所述胺供体选自由甘氨酸和组氨酸组成的组。任选地且更优选地，所述胺供体以不会抑制由所述交联剂引起的所述明胶的交联的量存在。还任选地且更优选地，所述胺供体以部分抑制由所述交联剂引起的所述明胶的交联的量存在。上述组合物还可以任选地进一步包括脲。
根据本发明的一些实施方案，提供了一种包括至少部分琥珀酰化的明胶、未琥珀酰化的明胶和胺底物交联剂的组合物。
根据本发明的一些实施方案，提供了一种包括至少部分氨甲酰化的明胶、未氨甲酰化的明胶和胺底物交联剂的组合物。
根据本发明的一些实施方案，提供了一种包括明胶、二胺和胺底物交联剂的组合物。任选地，所述二胺包括腐胺。
根据本发明的一些实施方案，提供了一种包括明胶、胺供体和胺底物交联剂的组合物。
任选地，所述胺供体包括聚乙烯亚胺(PEI)。优选地，胺底物交联剂包括转谷氨酰胺酶。
根据本发明的一些实施方案，提供了一种交联组合物，包括泡沫明胶和转谷氨酰胺酶。任选地，所述转谷氨酰胺酶以冻干形式存在。
根据本发明的一些实施方案，提供了一种包括可交联蛋白或多肽、引发所述可交联蛋白交联的钙非依赖性酶、变性剂和用于逆转所述变性剂的作用，用于逆转所述变性剂的溶胶凝胶转变点降低作用的剂的组合物，条件是所述蛋白或多肽不是血纤蛋白。
任选地，所述变性剂包括脲，且所述用于逆转所述变性剂的所述作用的剂包括脲酶。
任选地，本文描述的任何组合物还可以包括山梨糖醇。任选地且优选地，所述山梨糖醇以足够增强交联组合物的柔性和/或加速交联速率的量存在。组合物还可以任选地进一步包括乙酸盐。
根据本发明的一些实施方案，本文中的任意组合物可以任选地进一步包括增塑剂。任选地，所述增塑剂选自由阿拉伯树胶、瓜尔胶、PVA、PEG6000、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、柠檬酸烷基酯、丙三醇酯、邻苯二甲酸烷基酯、癸二酸烷基酯、蔗糖酯、脱水山梨糖醇酯、乙酰化单酸甘油酯、丙三醇、脂肪酸酯、二醇、丙二醇、月桂酸、蔗糖、三乙酸甘油酯、伯洛沙姆、邻苯二甲酸二乙酯、食用脂或食用油的单甘油酯和二甘油酯、邻苯二甲酸二丁酯、癸二酸二丁酯、聚山梨醇酯、聚乙二醇200到12,000、聚碳蜡聚乙二醇，和浓度高于其CMC(临界胶束浓度)的所述表面活性剂；或其组合组成的组。优选地，所述表面活性剂包括聚氧乙烯-脱水山梨糖醇-脂肪酸酯、聚氧乙二醇十二烷基醚、聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物、月桂基硫酸钠、十二烷基硫酸钠、月桂基聚氧乙烯醚硫酸钠(sodium laurethsulfate)、月桂基乙醚硫酸钠(sodium lauryl ether sulfate)、伯洛沙姆、伯洛沙胺、烷基多葡糖苷、脂肪醇、脂肪酸盐、椰油酰胺单乙醇胺(cocamidemonoethanolamine)和椰油酰胺二乙醇胺。
更优选地，所述表面活性剂的浓度在所述可交联蛋白干重的约0.1％到约5％w/w的范围内。任选地且最优选地，所述聚氧乙烯-脱水山梨糖醇-脂肪酸酯包括聚山梨醇酯20、21、0、60、61、65、80或85中的一种或多种。
根据本发明的一些实施方案，本文中的任一种组合物还可以任选地包括增粘剂，增粘剂选自由藻酸酯、阿拉伯树胶、高粘度羧甲基纤维素(CMC)、黄原酸胶、瓜尔胶和PVP组成的组。
根据本发明的一些实施方案，对本文中的任一种组合物来说，任选地，所述酶包括转谷氨酰胺酶，组合物还包括胱胺、半胱氨酸、氰酸盐或黑色素中的一种或多种。
根据本发明的一些实施方案，本文中的任一种组合物还可以任选地包括氨清除剂、氨螯合剂或氨结合剂、氨代谢的刺激剂、或细胞氨摄取的抑制剂。任选地，所述氨清除剂包括二糖乳果糖。还任选地，所述氨结合剂包括皂苷。优选地，所述氨清除剂包括含有苯乙酸钠和苯甲酸钠的溶液。
还优选地，所述氨代谢的刺激剂包括L-谷氨酰胺、L-谷氨酸或其组合。
还优选地，所述细胞氨摄取的抑制剂包括L-谷氨酰胺、L-谷氨酸或其组合。
根据本发明的一些实施方案，本文中的任一种组合物还可以任选地包括缓冲液，缓冲液选自由琥珀酸盐缓冲液、马来酸盐缓冲液、三(羟甲基)甲胺(TRIS)、3-{[三(羟甲基)甲基]氨基}丙磺酸(TAPS)、N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸(N-二(羟乙基)甘氨酸)、N-三(羟甲基)甲基甘氨酸(三(羟甲基)甲基甘氨酸)、2-{[三(羟甲基)甲基]氨基}乙磺酸(TES)、3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)、哌嗪-N，N'-双(2-乙磺酸)(PIPES)、二甲基次胂酸、N-(2-羟乙基)哌嗪-N’-(2-乙磺酸)(HEPES)和2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)组成的组。
根据本发明的一些实施方案，本文中的任一种组合物可以任选地具有约6到约7范围内的pH，其还任选地是约6。
根据本发明的一些实施方案，对本文中可任选的任一种组合物来说，所述酶包括转谷氨酰胺酶。任选地，所述转谷氨酰胺酶是钙非依赖性的。优选地，所述转谷氨酰胺酶是微生物转谷氨酰胺酶。更优选地，所述转谷氨酰胺酶的蛋白浓度以组合物的约0.0001％到约2％w/w的量存在。最优选地，所述转谷氨酰胺酶以组合物的约0.01％到约1.35％w/w的量存在。还最优选地，所述转谷氨酰胺酶以组合物的约0.05％到约0.5％w/w的量存在。
任选地且最优选地，所述转谷氨酰胺酶以组合物的约0.1％到约0.4％w/w的量存在。
任选地，所述转谷氨酰胺酶的浓度在总组合物的约1到约180酶单位(U/mL)的范围内。优选地，所述转谷氨酰胺酶的浓度在总组合物的约4到约70酶单位(U/mL)的范围内。更优选地，所述转谷氨酰胺酶的浓度在总组合物的约10到约55酶单位(U/mL)的范围内。
任选地，对本文中的任一种组合物来说，交联材料：可交联蛋白溶液的比是约1∶1到1∶5v/v。
根据本发明的一些实施方案，对本文中的任一种组合物来说，所述可交联蛋白或多肽包括明胶，且其中所述明胶由动物源、重组源或其组合产生。任选地，所述动物源选自由鱼和哺乳动物组成的组。优选地，所述哺乳动物选自由猪和牛组成的组。更优选地，所述明胶是A类型(酸处理的)或B类型(碱处理的)。最优选地，所述明胶包括高分子量明胶。任选地且最优选地，所述明胶是至少约250Bloom。还任选地且最优选地，所述明胶是在第一次提取期间产生。
根据本发明的一些实施方案，本文中的任一种组合物还可以任选地包括一种制造用于交联的组合物的方法，包括：制备可交联蛋白或多肽、用于交联所述可交联蛋白或多肽的酶和药学上可接受的钙盐的溶液，条件是所述蛋白或多肽不是血纤蛋白；以及向所述溶液中添加钙螯合剂。
任选地，所述钙螯合剂包括多磷酸盐和羧酸盐、或其组合中的一种或多种。还任选地，所述多磷酸盐选自由焦磷酸盐、三聚磷酸盐、高级多磷酸盐和六偏磷酸盐或其组合组成的组。优选地，焦磷酸盐选自由焦磷酸四钠、焦磷酸二氢二钠、焦磷酸四钾、焦磷酸二氢二钾和焦磷酸二钠二钾或其组合组成的组。还优选地，所述三聚磷酸盐选自由三聚磷酸五钠和三聚磷酸五钾或其组合组成的组。
还优选地，所述羧酸盐选自由碱金属柠檬酸盐、碱金属乙酸盐、碱金属乳酸盐、碱金属酒石酸盐、碱金属苹果酸盐、乙二胺四乙酸的碱金属盐以及editronic酸、或其组合组成的组。更优选地，所述羧酸盐选自由乙二胺四乙酸和柠檬酸钠，或其组合组成的组。
任选地且更优选地，所述六偏磷酸盐包括六偏磷酸钠。
根据本发明的一些实施方案，提供了一种制造用于交联的组合物的方法，包括：制备可交联蛋白或多肽、用于交联所述可交联蛋白或多肽的酶和变性剂的溶液，条件是所述蛋白或多肽不是血纤蛋白；以及向所述溶液中添加用于逆转所述变性剂的作用，用于逆转所述变性剂的溶胶凝胶转变点降低作用的剂。
任选地，所述变性剂包括脲，且所述用于逆转所述变性剂的所述作用的剂包括脲酶。
根据本发明的一些实施方案，提供了一种制造用于交联的组合物的方法，包括：制备可交联蛋白或多肽、用于交联所述可交联蛋白或多肽的酶和离液剂的溶液，条件是所述蛋白或多肽不是血纤蛋白；以及向所述溶液中添加稳液剂。
任选地，其中所述稳液剂选自由脯氨酸、海藻糖和谷氨酸或其任意两种或多种的组合组成的组。
根据本发明的一些实施方案，提供了一种制造用于交联的组合物的方法，包括：制备可交联蛋白或多肽和用于交联所述可交联蛋白或多肽的转谷氨酰胺酶的溶液，条件是所述蛋白或多肽不是血纤蛋白；以及向所述溶液中添加胱胺、半胱氨酸、氰酸盐或黑色素中的一种或多种以至少部分抑制所述转谷氨酰胺酶。
根据本发明的一些实施方案，提供了一种具有比活性＞25酶单位每毫克、＞95％电泳纯度、＜5内毒素单位每克以及＜10CFU/g的微生物转谷氨酰胺酶组合物。这种转谷氨酰胺酶可以任选地被提供为上面要求保护的任一种交联剂。
根据本发明的一些实施方案，提供了一种组合物，包括可交联蛋白或多肽、引发所述可交联蛋白交联的酶、金属离子以及变性剂，条件是所述蛋白或多肽不是血纤蛋白，其中所述可交联蛋白或多肽包括明胶，其中所述酶包括转谷氨酰胺酶，其中所述金属离子包括任何药学上可相容的盐形式的钙并且其中所述变性剂包括脲。
在一些实施方案中，所述明胶可以是至少250bloom。
在一些实施方案中，所述钙盐可包括氯化钙或氢氧化钙中的一种或多种。
在一些实施方案中，所述钙可以以至多1M的量存在。
在一些实施方案中，所述脲可以以至多4M的量存在。
在一些实施方案中，所述组合物还可包括钙螯合剂。
在一些实施方案中，所述钙螯合剂可包括EDTA、柠檬酸盐或calgon中的一种或多种。
在一些实施方案中，所述柠檬酸盐或所述EDTA可以是以从0.01M到2M的量存在的。
在一些实施方案中，所述柠檬酸盐或所述EDTA可以是以从0.05M到0.2M的量存在的。
在一些实施方案中，所述组合物还可包括能够共价结合到所述明胶的PEG(聚乙二醇)衍生物。
在一些实施方案中，所述PEG衍生物可包括任何胺化的PEG衍生物。
在一些实施方案中，所述组合物还可包括能够共价结合到所述明胶的PVA(聚乙烯醇)衍生物。
在一些实施方案中，所述PVA衍生物可包括任何胺化的PVA衍生物。
在一些实施方案中，所述组合物还可包括乙酸盐。
在一些实施方案中，所述组合物还可包括增塑剂。
在一些实施方案中，所述增塑剂可选自由阿拉伯树胶、瓜尔胶、PVA、PEG6000、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、柠檬酸烷基酯、丙三醇酯、邻苯二甲酸烷基酯、癸二酸烷基酯、蔗糖酯、脱水山梨糖醇酯、山梨糖醇、乙酰化单酸甘油酯、丙三醇、脂肪酸酯、二醇、丙二醇、月桂酸、蔗糖、三乙酸甘油酯、伯洛沙姆、邻苯二甲酸二乙酯、食用脂或食用油的单甘油酯和二甘油酯、邻苯二甲酸二丁酯、癸二酸二丁酯、聚山梨醇酯、聚乙二醇200到12,000、碳蜡聚乙二醇，和浓度高于其CMC(临界胶束浓度)的表面活性剂、或其组合组成的组。
在一些实施方案中，所述表面活性剂可包括聚氧乙烯-脱水山梨糖醇-脂肪酸酯、聚氧乙二醇十二烷基醚、聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物、月桂基硫酸钠、十二烷基硫酸钠、月桂基聚氧乙烯醚硫酸钠、月桂基乙醚硫酸钠、伯洛沙姆、伯洛沙胺、烷基多葡糖苷、脂肪醇、脂肪酸盐、椰油酰胺单乙醇胺和椰油酰胺二乙醇胺。
在一些实施方案中，所述表面活性剂的浓度可在所述可交联蛋白干重的0.1％到5％w/w的范围内。
在一些实施方案中，所述聚氧乙烯-脱水山梨糖醇-脂肪酸酯可包括聚山梨醇酯20、21、0、60、61、65、80或85中的一种或多种。
在一些实施方案中，所述组合物还可包括增粘剂，所述增粘剂选自由藻酸酯、阿拉伯树胶、高粘度羧甲基纤维素(CMC)、黄原酸胶、瓜尔胶和PVP组成的组。
在一些实施方案中，所述组合物还可包括胱胺、半胱氨酸、氰酸盐或黑色素中的一种或多种。
在一些实施方案中，所述组合物还可包括氨清除剂、氨螯合剂或氨结合剂、氨代谢的刺激剂、或细胞氨摄取的抑制剂。
在一些实施方案中，所述氨代谢的刺激剂或所述细胞氨摄取的抑制剂可包括L-谷氨酰胺、L-谷氨酸或其组合。
在一些实施方案中，所述组合物可具有从6到7范围内的pH。
在一些实施方案中，所述pH可以是6。
在一些实施方案中，所述转谷氨酰胺酶可以是钙非依赖性的。
在一些实施方案中，所述转谷氨酰胺酶可以是微生物的转谷氨酰胺酶。
在一些实施方案中，所述转谷氨酰胺酶的蛋白浓度可以是以所述组合物的从0.0001％到2％w/w的量存在的。
在一些实施方案中，所述转谷氨酰胺酶可以是以所述组合物的从0.01％到1.35％w/w的量存在的。
在一些实施方案中，所述转谷氨酰胺酶的浓度可以是在总组合物的从1到180个酶单位(U/mi)的范围内。
在一些实施方案中，酶溶液与明胶溶液的比例可以是1∶1到1∶5(v/v)。
在一些实施方案中，所述明胶可产自于动物源、重组源或它们的组合。
在一些实施方案中，所述动物源可选自由鱼和哺乳动物组成的组。
在一些实施方案中，所述明胶可以是A类型的(酸处理的)或B类型的(碱处理的)。
在一些实施方案中，所述明胶可包括具有至少250bloom的高分子量的明胶、或其等效物。
在一些实施方案中，在所述钙的存在下的所述脲的量，与不存在所述钙时的所述脲的量相比，可减少从30％到50％的范围内的百分比。
根据本发明的一些实施方案，组合物以缓冲液和一种或多种其他赋形剂为特征，选择它们以便克服背景技术缺陷中的至少一些。
任选地且优选地，缓冲液是非磷酸盐缓冲液，其任选地且更优选地选自由乙酸盐缓冲液(诸如乙酸钠)、柠檬酸盐缓冲液(诸如柠檬酸钠)、琥珀酸盐缓冲液、马来酸盐缓冲液、三(羟甲基)甲胺(TRIS)、3-{[三(羟甲基)甲基]氨基}丙磺酸(TAPS)、N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸(N-二(羟乙基)甘氨酸)、N-三(羟甲基)甲基甘氨酸(三(羟甲基)甲基甘氨酸)、2-{[三(羟甲基)甲基]氨基}乙磺酸(TES)、3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)、哌嗪-N，N'-双(2-乙磺酸)(PIPES)、二甲基次胂酸、N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-(2-乙磺酸)(HEPES)和2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)组成的组。
根据一些实施方案，组合物用作局部药物递送的载体。
根据一些实施方案，组合物是用于组织工程的可注入支架。
根据一些实施方案，组合物是止血组合物。根据一些实施方案，组合物是体液密封组合物。
本发明的组合物优选地提供快速止血，由此使受伤或手术后的血液损失最少。
正如本文中使用的，“伤口”指对患者的任何组织的任何损伤，其导致来自循环系统中的血液的损失或来自生理通道的任何其他体液的损失，所述生理通道诸如任意类型的管。此组织可以是肠组织，诸如器官或血管，或外部组织，诸如皮肤。血液或体液的损失可以是内部的，诸如来自破裂的器官，或外部的，诸如来自裂伤。伤口可以是在软组织中，诸如器官中，或在硬组织中，诸如骨中。损伤还可以因任何剂或源引起，包括外伤受伤、感染或手术干预。损伤可以是有生命危险的或无生命危险的。
“TG”指任意类型的转谷氨酰胺酶；“mTG”还可以指微生物转谷氨酰胺酶和/或任意类型的转谷氨酰胺酶，这取决于上下文(在下面具体的试验实施例中，该术语指微生物转谷氨酰胺酶)。任选地，转谷氨酰胺酶包括除了血液衍生因子XIII之外的源自植物、重组动物或微生物的转谷氨酰胺酶；然而，转谷氨酰胺酶的实际生产过程可以任选地包括本领域已知的任意类型的重组方法。
目前通过将组织牵拉在一起而促进愈合的缝线和U形钉来实现手术伤口闭合。然而，它们通常未能产生防止流体渗漏所需的足够的密封。因而，存在防止术后渗漏(包括经常沿着U形钉和缝线发生的渗漏)的器件和方法的大量的、未满足的医学需求。需要这种器件和方法作为缝线和U形钉的附件来在末梢血管重建、硬脑脊膜重建、胸、心血管、肺、神经和胃肠手术方面实现止血或止住其他流体。市场上目前的大多数高压止血器件如果在任何程度是粘合性的，也是名义上的。这种器件的良好实例是ACSTM(Z-Medica，Wallington，CT)和HemConTM绷带(HemCon，Portland，OR)，这两种止血器件目前供给美国武装力量的成员。当面临剧烈的涌流时或面对伤口的中等血流1-2小时后，构成HemCon绷带的壳聚糖网络可以被血液饱和并很快失效(B.S Kheirabadi等人(2005).J.Trauma.59：25-35；A.E.Pusateri等人(2006).J.Trauma.60：674-682)。QuikClot矿物为了有效，必须产生有害量的热(A.E.Pusateri等人(2006).J.Trauma.60：674-682)。
已经提议用于在出血控制中使用的基于其他多糖的止血器材是RDHTM(Acetyl Glucosamine)、TraumaDEXTM(MPH)和ChitoskinTM(Chitosan&Gelatin)。然而，这些类型的绷带中没有一种能够始终证明在面临严重血流时避免失效。最近采用的其他止血器材包括CeloxTM(Chitosan Crystals)和WoundStatTM(TraumaCure Inc.，MD)(蒙脱石矿物和超吸收性聚合物的颗粒混合物)。然而，这些产品都快速溶胀以填充伤口部位，使它们仅仅适合于加快特定类型的伤口中的血液凝结并带来减少或甚至消除周围的血管中的血流的危险。
上面提到的所有产品依赖于自然的凝结级联以控制从伤口部位的流体渗漏。这样，它们的容量受到了明显限制。一般的伤口部位密封，尤其是渗漏非血液流体的受伤部位的密封超出了这些产品的范围。
就先前由明胶与mTG的交联形成组织粘合的尝试来说(即McDermott等人，2004和Chen等人，2006)，这些尝试的商业化应用受到了限制，这是因为在操作室温下，明胶溶液中发生了热可逆胶凝。虽然过去已经提出脲用于降低用在粘合剂中的明胶溶液的胶凝转变点(Otani等人，1998)，但是这先前并未认为与明胶-mTG密封剂一起使用，因为已经确认脲是可以显著破坏酶活性的强变性剂(Rajagopalan等人，J Biologica Chem236(4)，1961)。此外，在特别采用脲存在下的mTG活性的研究中，发现非常低浓度的脲(＜0.5M)严重抑制了mTG作用(Nomura Y等人，Biosci BiotechBiochem65(4)，2001：第982-985页)，而高浓度的脲(8M)完全使mTG失活(Yokoyama K等人，Protein Exp&Purif26，2002：第329-335页2002)。
出人意料地，本发明人发现脲在某些条件下实际上能够成功地与明胶和mTG一起使用，正如本发明人的于2007年12月17日提交的PCT公布第WO/2008/076407号所描述，该专利在此通过引入并入，就好像它们在本文中提出一样。进一步出人意料地，本发明人扩展了脲在交联的明胶/mTG组合物中的可能的用途和引入，正如下面更详细描述的。
正如本文中使用的，“约”意指标示值的正或负约10％。
从下面的详细描述和从权利要求中，本发明的多个实施方案的其他特征和优势将是明显的。
附图简述
本文参考附图，仅作为例子，描述了本发明。现在，详细地具体参考附图，应强调所显示的细节仅作为例子且仅仅是为了示例性讨论本发明的优选实施方案的目的，并且因提供被认为是本发明的原理和概念方面最有用和易于理解的描述的内容而提出。在这一点上，并不试图显示比基本理解本发明所需更详细的本发明的结构细节，结合附图进行描述使如何可以在实践中具体实施本发明的若干形式对本领域的技术人员来说是明显的。
在附图中：
图1是显示了mTG的pH稳定性的图；
图2是显示了在0.5M乙酸钠(Na-Ac)和0.5M柠檬酸钠中的mTG的粘度随时间的变化的图。
图3A-F显示了根据本发明一些实施方案的不同示例性制剂达到粘度为3×106cP(完全成形的凝胶的30％)和粘度为9×106cP(完全成形的凝胶的90％)的时间；
图4显示了纯化的mTG材料的凝胶电泳的结果(2-8泳道)；
图5显示了与对照相比的不同增塑剂溶液的相对交联速率；
图6显示了根据本发明一些实施方案的一些示例性明胶溶液的结果：对照、A和B；
图7A、7B和7C概述了根据本发明一些实施方案的含有作为氨甲酰化抑制剂的多种甘氨酸和组氨酸添加剂的多种示例性明胶溶液在不同的孵育时间后交联并由粘度计测试的结果；
图8概述了根据本发明一些实施方案的含有和不含氰酸盐添加剂的对照溶液在高温的不同孵育时间后交联并由粘度计测试的结果；以及
图9显示了爆破压力系统和相关的组织歧管的示意图。
优选实施方案的描述
本发明是包括可交联蛋白或多肽的溶液和引发可交联蛋白交联的一种或多种无毒性材料的溶液的改进的组合物。
根据一些实施方案，将可交联蛋白或多肽的溶液，和引发可交联蛋白交联的一种或多种无毒性材料的溶液制备在非磷酸盐缓冲液溶剂中。
任选地且优选地，可交联蛋白包括明胶和本文描述的任何明胶变体或变体蛋白。任选地且优选地，无毒性材料包括转谷氨酰胺酶(TG)，其可以任选地包括任意类型的钙依赖性或非依赖性转谷氨酰胺酶，其可以，如任选地是钙非依赖性微生物转谷氨酰胺酶(mTG)。并不希望以任何方式进行限制，在本发明至少一些实施方案的改进的特性中，与背景技术的组合物相比，本发明的组合物提供了增大的蛋白交联速率。而且，mTG的交联反应显示超过由血液凝固系统的XIIIa因子催化的交联反应的显著改进。与XIIIa因子不同，微生物酶活性即不需要凝血酶，也不需要钙。
因此，在至少一些实施方案中，本发明提供了用于多种软组织应用的明胶-mTG粘合组合物改进的应用。在一些实施方案中，本发明还提供了一种用于制备组合物的方法，该方法包括提供可交联蛋白或多肽的溶液；提供一种或多种交联材料的溶液；以及使可交联蛋白或多肽的溶液与交联材料的溶液混合。
根据本发明的一些实施方案，组合物以绷带形式提供，该绷带优选地适于用作止血绷带。本文描述的组合物可以另外具有一种或多种用途，这些用途包括但不限于组织粘合剂(特别是仿生组织粘合剂)、组织培养支架、组织密封剂、止血组合物、药物递送平台、手术助剂或类似物，以及其他非医学用途，包括但不限于可食用的产品、化妆品以及类似物，诸如，如用在食品中的酶的纯化。
下文在各节标题下更详细地描述了本发明的多个实施方案，这仅仅是为了清楚的缘故且没有以任何方式对本发明进行限制的目的。
可交联蛋白
根据本发明的优选实施方案，可交联蛋白包括明胶。
明胶可以任选地包括任意类型的明胶，其包括本领域已知的蛋白，优选地包括但不限于由动物组织的部分水解获得的明胶和/或从动物获得的胶原，动物组织包括但不限于动物皮肤、结缔组织(包括但不限于韧带、软骨以及类似物)、茸角或角以及类似物，和/或骨、和/或鱼鳞和/或骨或其他部位；和/或利用细菌、酵母、动物、昆虫或植物系统或任意类型的细胞培养物产生的重组明胶。
根据本发明的优选实施方案，来自动物源的明胶优选包括来自哺乳动物源的明胶且更优选包括猪皮、猪肉和牛骨、或二层牛皮(split cattle hide)或任何其他猪源或牛源中的一种或多种。更优选地，这样的明胶包括猪明胶，因为其具有较低的过敏反应速率。来自动物源的明胶可以任选地是A型(酸处理的)或B型(碱处理的)，虽然优选A型(但是，下面给出了使用B型明胶的实施例)。
优选地，来自动物源的明胶包括在第一次提取期间获得的明胶，其通常在低温(50℃-60℃，但是此确切的温度范围未必是限制)下进行。这种方式产生的明胶将在250-300Bloom的范围内且具有至少约95-100千道尔顿的高分子量。优选地，使用275-300Bloom的明胶。
这种明胶的制造商的非限制性的实例是PB Gelatins(TessenderloGroup，Belgium)。
根据本发明的一些实施方案，来自动物源的明胶任选地包括来自鱼类的明胶。任选地，可以使用任何种类的鱼，优选冷水鱼种类，诸如鲤鱼、鳕鱼、或梭子鱼、或鲔鱼。此明胶的pH(在10％的溶液中测得)优选在4-6的范围。
冷水鱼明胶在10℃的水中形成溶液，且因而所有的冷水鱼明胶都被认为是0Bloom。对本发明来说，任选且优选地使用高分子量的冷水鱼明胶，更优选包括至少约95-100千道尔顿的分子量。这等同于250-300Bloom动物明胶的分子量。由于冷水鱼明胶的脯氨酸和羟脯氨酸的含量较低，因此其在比动物明胶低得多的温度下经历热可逆胶凝作用。与动物明胶中每1000个氨基酸残基中135-145个脯氨酸和90-100个羟脯氨酸相比，冷水鱼明胶每1000个氨基酸残基中具有100-130个脯氨酸和50-75个羟脯氨酸(Haug IJ，Draget KI，O.(2004)Food Hydrocolloids18：203-213)。
这种明胶的制造商的非限制性实例是Norland Products(Cranbury，NJ)。
在本发明的一些实施方案中，低内毒素毒性明胶用于形成明胶-mTG组合物的明胶溶液组分。这种明胶可从诸如GelitaTM(Eberbach，Germany)的供应商购得。低内毒素毒性明胶被定义为具有小于1000内毒素单位(EU)/克的明胶。更优选地，使用内毒素毒性小于500EU/克的明胶。
对非常高灵敏度的应用来说，诸如用将会接触脊柱或脑的材料，优选具有小于100EU/克的内毒素毒性的明胶，更优选具有小于50EU/克的明胶。具有小于10EU/克的内毒素毒性的明胶是非常昂贵的，但在一些灵敏的应用中，也能够用作本发明至少一些实施方案的一部分。
根据本发明的一些实施方案，类型I、类型II或任何其他类型的水解或非水解胶原替代明胶作为被交联的蛋白材料。已经证明了各种类型明胶形成热稳定的mTG交联的凝胶的能力(O′Halloran DM等人，Characterization of a microbial transglutaminase cross-linked type II collagenscaffold(微生物转谷氨酰胺酶交联的II型胶原支架的表征)。Tissue Eng.2006Jun；12(6)：1467-74。Garcia Y等人，Assessment of cell viability in athree-dimensional enzymatically cross-linked collagen scaffold(三维酶促交联的胶原支架中的细胞存活率的评价)。J Mater Sci Mater Med.2007年10月；18(10)：1991-2001。Epub2007年6月7日.Nomura Y等人，Improvementof shark type I collagen with microbial transglutaminase in urea(脲中用微生物转谷氨酰胺酶对I型鲨鱼胶原的改进)。Biosci Biotechnol Biochem.2001Apr；65(4)：982-5。)。
根据本发明的一些实施方案，使用重组人明胶。这种明胶可从诸如FibrogenTM(San Francisco，CA)的供应商购得。重组明胶优选是至少约90％的纯度且更优选是至少约95％的纯度。一些重组明胶在10℃下是非胶凝的且因而被认为是0Bloom。对本发明的一些实施方案来说，优选使用高分子量的重组明胶，更优选包括至少约95-100千道尔顿的分子量。
如上所述，可交联蛋白优选包括明胶，但还可以另外或可选择地包括另一种类型的蛋白。根据本发明的一些实施方案，蛋白还是转谷氨酰胺酶的底物，且优选以合适的转谷氨酰胺酶特异性多肽和聚合物序列为特征。这些蛋白可以任选地包括但不限于独立地具有形成生物粘合剂的特性的合成聚合物序列，或已经更优选地用转谷氨酰胺酶特异性底物修饰而增强了材料被转谷氨酰胺酶交联的能力的聚合物。下面描述了这些类型的材料中的每一种的非限制性的实例。
已经开发出具有合适的转谷氨酰胺酶交联靶的合成多肽和聚合物序列，它们具有优选约20℃到约40℃的转变点。优选的物理特性包括但不限于结合组织的能力和形成纤维的能力。与胶凝型明胶(如上所述)相同，这些多肽可以任选地被使用在组合物中，这些组合物还以降低它们转变点的一种或多种物质为特征。
这种肽的非限制性实例描述在美国专利第5,428,014号和第5,939,385号中，两篇专利都由ZymoGenetics Inc提交，这两篇专利通过引用并入就好像它们在本文中全文提出一样。两篇专利都描述了生物相容的、生物粘合的转谷氨酰胺酶可交联多肽，其中已知转谷氨酰胺酶催化蛋白结合谷氨酰基残基的γ-甲酰胺基团与赖氨酸残基的ε-氨基之间的酰基转移反应，导致形成ε-(γ-谷氨酰基)赖氨酸异肽键。
例如，描述了具有13-120个氨基酸残基的多肽，包括式S1-Y-S2的区段，其中：S1是Thr-Ile-Gly-Glu-Gly-Gln；Y是1-7个氨基酸的间隔肽或不存在；且S2是Xaa-Lys-Xaa-Ala-Gly-Asp-Val。任选地，间隔肽Y是Gln-His-His-Leu-Gly、Gln-His-His-Leu-Gly-Gly或His-His-Leu-Gly-Gly。还任选地，S2的Xaa氨基酸1是Ala或Ser。任选地，间隔肽包括His-His-Leu-Gly。任选地且优选地，Y和S2中的至少一个不含GIn残基。任选地，多肽的羧基端氨基酸残基是Pro或Gly。多肽的具体的非限制性的实例包括下述多肽：Thr-Ile-Gly-Glu-Gly-Gln-Gln-His-His-Leu-Gly-Gly-Ala-Lys-Gln-Ala-Gly-Asp-VaI、Thr-Ile-Gly-Glu-Gly-Gln-Gln-His-His-Leu-Gly-Ala-Lys-Gln-Ala-Gly-Asp-Val、Thr-Ile-Gly-Glu-Gly-Gln-His-His-Leu-Gly-Gly-Ala-Lys-Gln-Ala-Gly-Asp-Val或Leu-Ser-Gln-Ser-Lys-Val-Gly。该专利还描述了包括这些肽的高分子量的、生物相容的、生物粘合的转谷氨酰胺酶可交联的共聚物和均聚物。
美国专利第5,939,385号描述了生物相容的、生物粘合的转谷氨酰胺酶可交联多肽。这些多肽优选具有包括式S1-Y-S2的区段的约9-120个氨基酸残基，其中：S1选自由Ile-Gly-Glu-Gly-Gln、Gly-Glu-Gly-Gln、Glu-Gly-Gln和Gly-Gln组成的组；Y是His-His-Leu-Gly-Gly或His-His-Leu-Gly；且S2选自由Ala-Lys-Gln-Ala-Gly-Asp、Ala-Lys-Gln-Ala-Gly、Ala-Lys-Gln-Ala、Ala-Lys-Gln、Ala-Lys-Ala-Gly-Asp-Val、Ala-Lys-Ala和Ala-Lys组成的组，其中所述多肽具有氨基端和羧基端，且是可由转谷氨酰胺酶交联。优选的多肽是Gly-Gln-His-His-Leu-Gly-Gly-Ala-Lys-Gln。还优选一种多肽，其中弹性多肽位于该多肽的氨基端和羧基端的一侧或两侧。该专利还提供了弹性多肽，其中弹性多肽是五肽或四肽，尤其是侧翼多肽，其中侧翼弹性多肽是Val-Pro-Gly-Val-Gly、Ala-Pro-Gly-Val-Gly、Gly-Val-Gly-Val-Pro、Val-Pro-Gly-Gly或其任何部分，优选使侧翼多肽的氨基端是Val且侧翼多肽的羧基端是Gly。该专利还描述了包括这些多肽的高分子量的、生物相容的、生物粘合的转谷氨酰胺酶可交联的共聚物和均聚物。
交联材料
任选地且优选地，无毒性交联材料包括转谷氨酰胺酶(TG)，其可以任选地包括任何类型的钙依赖性或钙非依赖性转谷氨酰胺酶(mTG)，其可以如，任选地是微生物转谷氨酰胺酶。
根据本发明的一些实施方案，可以使用新近购得的包含10％或更多mTG的转谷氨酰胺酶产品。市售的此类型的转谷氨酰胺酶产品的非限制性实例包括由Ajinomoto Co.(Kawasaki，Japan)和Yiming Chemicals(China)制造的那些产品。来自此公司的这种产品的非限制性实例是Activa TG-成分：mTG(10％)和麦芽糖糊精(90％)；活性：810-1,350U/g的Activa。来自Yiming的这种产品的非限制性实例包括含有10％mTG和90％麦芽糖糊精的一种产品以及含有10％mTG和90％乳糖的一种产品，也是活性为810-1,350U/g的产品。来自Yiming的这种产品的其他非限制性实例包括含有30％mTG和70％麦芽糖糊精的一种产品以及含有30％mTG和70％乳糖的一种产品，两种都是活性为2,430-4,050U/g的产品。
如上所述，交联材料优选包括转谷氨酰胺酶，但根据本发明的一些实施方案，还可以另外包括别的类型的交联材料。
这种交联剂的非限制性实例包括碳二亚胺，诸如N，N-(3-(二甲基氨基)丙基)-N-乙基碳二亚胺(EDC)、含有EDC的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)或与聚(L-谷氨酸)(PLGA)和聚丙烯酸一起使用的碳二亚胺。在另一个实施方案中，这种交联剂可以包括酪氨酸酶或含有壳聚糖的酪氨酸酶。在另一个实施方案中，交联(聚合)是用紫外光或γ射线来光引发的。在另一个实施方案中，交联剂可以包括亚烃基、柠檬酸(碳酸)、或纳米-羟磷灰石(n-HA)+聚(乙烯醇)(PVA)。
在另一个实施方案中，交联剂是植物源多酚，诸如(即，羟基化肉桂酸，诸如咖啡酸(3，4-二羟基肉桂酸)、绿原酸(优选奎尼酸酯)、咖啡酰基酒石酸(caftaric acid)(优选酒石酸酯)和类黄酮(即，五羟黄酮和芸香苷)。在另一个实施方案中，额外的交联剂是氧化的单糖或二糖、氧代乳糖或基于糖部分的二醛(半乳糖-己糖二醛糖)(galacto-hexodialdose)(GALA)。在另一个实施方案中，京尼平或其他环烯醚萜糖苷衍生物，或裂环烯醚萜，优选橄榄苦苷，包括交联剂。在另一个实施方案中，交联剂是巯基反应性聚(乙二醇)。在另一个实施方案中，交联剂是葡聚糖、氧化葡聚糖、葡聚糖二醛。在另一个实施方案中，交联剂是多铜氧化酶，诸如漆酶或胆红素氧化酶。
示例性的组合物
根据本发明，上述交联底物和交联材料可以任选地与一种或多种额外的材料结合以形成不同的组合物。根据一些实施方案，粘合材料任选地且优选地包括：(i)明胶；(ii)转谷氨酰胺酶。更优选地，明胶和转谷氨酰胺酶以足够用作密封剂、止血剂的量提供。
此外，一种或多种添加物也可以被包括在止血产品中，如，诸如生长因子、多克隆抗体和单克隆抗体以及其他化合物的药物。这种添加物的示例性实例包括，但不限于：抗生素，诸如四环素和环丙沙星、阿莫西林以及甲硝哒唑；抗凝血剂，诸如活性蛋白C、肝素、前列腺环素(PGI2)、前列腺素、白细胞三烯、抗转谷氨酰胺酶III、腺苷二磷酸酶和纤溶酶原激活物；类固醇，诸如地塞米松，前列腺环素、前列腺素、白细胞三烯和/或激肽的抑制剂以抑制炎症；心血管药物，诸如钙通道阻断剂、血管舒张剂和血管收缩剂；化学引诱物；局部麻醉剂，诸如布比卡因；以及抗增生药物/抗肿瘤药物，诸如5-氟尿嘧啶(5-FU)、紫杉醇和/或泰索帝；抗病毒剂，诸如更昔洛韦、齐多夫定、金刚烷胺、阿糖腺苷、利巴韦林、曲氟尿苷、阿昔洛韦、二脱氧尿苷和病毒组分的抗体或基因产品；细胞因子，诸如α-干扰素或β-干扰素或γ-干扰素，α-或β-肿瘤坏死因子以及白细胞介素；细胞集落刺激因子；促红细胞生成素；抗真菌剂，诸如大扶康、酮康唑和制霉菌素；抗寄生虫剂，诸如戊双脒；抗炎剂，诸如α-1-抗胰蛋白酶和α-1-抗胰凝乳蛋白酶；麻醉剂，诸如布比卡因；镇痛药；防腐剂；以及激素。其他示例性的添加物包括，但不限于：维生素和其他营养添加物；糖蛋白；纤连蛋白；肽和蛋白；糖类(单糖和/或复合糖)；蛋白聚糖；抗血管紧张素；抗原；类脂或脂质体；以及寡核苷酸(有义和/或反义DNA和/或RNA)。
缓冲液选择
2007年12月17日提交的PCT公开第WO/2008/076407号公开了包括作为可交联蛋白的明胶和作为无毒性交联材料的微生物转谷氨酰胺酶的组合物，其中磷酸盐缓冲盐水(PBS)用作溶解明胶和mTG的优选溶剂。然而，已经发现PBS降低了mTG促进的明胶交联的速度。不希望受限于一种假设，显示缓冲液中的磷酸盐分子降低了mTG酶的交联活性。因此，确定不含磷酸盐的缓冲液用作明胶和mTG溶液的缓冲液是更有效的。
适于用在本发明中的非磷酸盐缓冲液的非限制性实例包括乙酸盐缓冲液(诸如乙酸钠)、柠檬酸盐缓冲液(诸如柠檬酸钠)、琥珀酸盐缓冲液、马来酸盐缓冲液、三(羟甲基)甲胺(TRIS)、3-{[三(羟甲基)甲基]氨基}丙磺酸(TAPS)、N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸(N-二(羟乙基)甘氨酸)、N-三(羟甲基)甲基甘氨酸(三(羟甲基)甲基甘氨酸)、2-{[三(羟甲基)甲基]氨基}乙磺酸(TES)、3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)、哌嗪-N，N’-双(2-乙磺酸)(PIPES)、二甲基次胂酸、N-(2-羟乙基)哌嗪-N’-(2-乙磺酸)(HEPES)和2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)。
任选地且优选地，采用包括一个或多个羧基的缓冲液。更优选地，缓冲液包括乙酸钠或柠檬酸钠。更优选地，乙酸钠用作蛋白或多肽的缓冲液，而柠檬酸钠或乙酸钠用作交联材料的缓冲液。
任选地且优选地，缓冲液具有约0.01M到约0.6M范围内的浓度。更优选地，用于蛋白或多肽的缓冲液具有约0.05M到约0.15M范围内的浓度，且最优选具有约0.1M的浓度。更优选地，用于交联材料的缓冲液具有约0.1M到约0.5M范围内的浓度。就下面示例性的、非限制性的实施例描述了这些浓度的益处。
不希望受限于一种假设，认为乙酸钠缓冲液加速了蛋白的mTG催化的交联，正如下面示例性的、非限制性的实施例所描述。
不希望受限于一种假设，认为如果柠檬酸钠缓冲液连同交联剂一起加入到蛋白/多肽溶液中，则柠檬酸钠缓冲液改善了交联组合物的机械性能和生物相容性。下面更详细地描述了此效果。
出人意料地，发现通过在单一组合物中使用乙酸钠缓冲液与蛋白/多肽溶液以及柠檬酸钠缓冲液与交联剂溶液，能够同时获得使用每一种类型的缓冲液的益处(即，加速的交联和改善的机械性能)，而不会对任何反应产生任何不合适的抑制或不会发生任何不合适的额外的反应。就下面示例性的、非限制性的实施例描述了此方法的成功实施。
缓冲液pH
2007年12月17日提交的PCT公开第WO/2008/076407号还公开了根据优选的实施方案，将缓冲液的pH调节到约1.5到约5.0，或约7.0到约9.0范围内的值，此范围在明胶的等离子pH值的一般范围之外，以便增大明胶在溶液中的溶解度。根据该PCT申请的教导，产物pH距等离子pH越远，则明胶的溶解度越好。正如下面详细所述的，发现对转谷氨酰胺酶来说，在pH6.0附近的范围内的pH值是最有效的。
然而，根据将要在有生命的生物体内使用的组合物的可接受的实践，明胶应该溶解在缓冲在pH5.5-9.0的含水溶剂中，该pH范围包括等离子明胶溶液的pH范围。
根据本发明的一些实施方案，将明胶溶液的pH任选地且优选地调节到落入到使mTG保持超过其酶促活性的80％的pH水平的范围内。对当前已知的mTG的菌株来说，此范围是约5到约8(General Information，Ajinomoto Food Ingredients LLC)。
优选高mTG活性pH范围的较低部分，这是因为mTG促进的明胶交联释放了作为产物的NH3，NH3在交联过程中升高了局部环境中的pH。不希望受到一种假设的限制，如果初始溶液pH处于高mTG活性pH范围的较低部分，那么蛋白交联过程中释放NH3就不会立即使局部pH升高到高mTG活性的pH范围之上，从而使mTG能够以高活性水平连续发挥作用。因此，优选地，将明胶溶液组分的pH调节到约5到约8范围内的pH，且更优选约6到约7范围内的pH。更优选地，将明胶溶液组分的pH调节到约6的pH，这是粗转谷氨酰胺酶活性的最佳pH。
使用pH调节剂或本领域已知的任何其他方法可以调节pH。例如且无任何受到限制的意图，一种这样的方法包括用冰乙酸滴定溶解的缓冲盐溶液，直到溶液pH达到期望的pH水平。在pH调节之后，将溶液转移到容量瓶中且添加双蒸水，直至达到期望的缓冲液体积和相应的缓冲液浓度。
钙和脲的添加
2007年12月17日提交的PCT公开第WO/2008/076407号公开了向明胶溶液中添加氯化钙(CaCl2)基本上降低了明胶的转变点。2M氯化钙的缓冲液中25％(w/w)的明胶溶液具有低于22℃的转变点，该转变点是足够低的以在操作室温下维持液态。然而，mTG促进的明胶交联在这种高CaCl2环境中受到了极大地抑制，极大地增加了明胶凝胶固化所需的时间。而且，在这种环境中mTG交联得到的交联的明胶产物具有比在较低CaCl2环境中mTG交联得到的交联的明胶产物差的机械性能。
出人意料地，本发明人发现氯化钙和脲对降低明胶溶液的转变点具有协同效应。当以合适的浓度将氯化钙和脲都导入缓冲液中，且将明胶(25％w/w，A型300Bloom猪)溶解到该缓冲溶液中时，可以将明胶溶液转变点降低到操作室温(18℃-22℃)之下。在此协同溶液中，脲和氯化钙的各自要求浓度比如果脲和氯化钙中的仅仅一种用于降低明胶溶液的转变点时所需的浓度低得多。例如，替代将明胶溶解在2M CaCl2溶液中，通过将明胶溶解在包括2M脲的1M CaCl2溶液中或包括3M脲的0.5M CaCl2溶液中可以实现相同的转变点降低。就下面示例性的、非限制性的实施例描述了此效应的试验实施例。
在不存在CaCl2时，需要4M-4.5M脲溶液来同等程度地降低明胶溶液转变点。在许多情况下，当使用用于降低转变点的此协同溶液时，改善了由mTG交联得到的交联明胶凝胶的机械性能(粘合强度、胶粘强度以及弹性)。
在本发明的另一个实施方案中，作为CaCl2的替代物或补充物，使用不同的钙化合物。其他钙化合物的实例是氢氧化钙和碳酸钙。就下面示例性的、非限制性的实施例描述了使用氢氧化钙来降低明胶溶液的转变点，该明胶溶液随后使用mTG交联。
在另一个实施方案中，作为钙化合物的替代物或补充物，使用结合了不同二价阳离子的化合物。合适的二价化合物的非限制性实例是氯化镁。
转谷氨酰胺酶浓度
向明胶溶液中添加氯化钙和/或脲以降低溶液的转变点，即使以如上所述的较低浓度，仍对mTG促进的交联具有抑制效果，由此减缓对止血、组织密封、组织粘合以及其他伤口治疗应用所需的热不可逆的明胶胶凝化作用的固化。由于添加脲或CaCl2而使mTG促进的蛋白交联时间增加可以减少蛋白mTG交联用于上述医学应用的使用。
本发明人发现通过增大与蛋白溶液混合来开始mTG交联反应的mTG溶液中的mTG的浓度，可以增大mTG促进的蛋白交联反应速度的速率。根据本发明的一些实施方案，用于增大溶液中mTG的浓度的材料和方法包括使用市售的浓mTG混合物，从填充剂来纯化mTG溶液以及利用过滤技术来浓缩mTG溶液。通过使用这些方法和材料，可以将mTG溶液中的mTG的蛋白浓度增大到高达约2％w/w的浓度(按重量计10％mTG产品的20％w/w溶液，诸如ACTIVA TG)。
根据一些实施方案，当脲和/或CaCl2添加到明胶溶液的缓冲液中以降低明胶溶液的转变点时，相应mTG溶液的优选的蛋白浓度在总mTG溶液的约0.1％w/w到约2％w/w的范围内。更优选地，mTG溶液的浓度在总mTG溶液的约0.25％w/w到约1％w/w的范围内。最优选地，mTG溶液的浓度在总mTG溶液的约0.4％w/w到约0.8％w/w的范围内。
根据本发明的一些实施方案，以范围在1∶0.5到1∶8mTG溶液∶明胶溶液的体积比将mTG溶液与明胶溶液充分混合。优选地，体积比范围在1∶1到1∶4mTG溶液∶明胶溶液；更优选地，体积比范围在1∶1到1∶2，mTG溶液∶明胶溶液。
这些体积比和mTG浓度一起描述了本发明的实施方案，其中总组合物中mTG的蛋白浓度在约0.01％w/w到约1.35％w/w的范围内，优选在约0.05％w/w到约0.5％w/w的范围内，且更优选在约0.1％w/w到约0.4％w/w的范围内。
根据本发明的一些实施方案，总组合物中的酶活性在约1到约180酶单位(EU)每克的范围内，优选在约4EU/g到约70EU/g的范围内，且更优选在约10EU/g到约55EU/g的范围内。
钙螯合剂
如上所述，虽然CaCl2在降低包括可交联蛋白或多肽的溶液的转化点方面是非常有用的，但是其存在于交联的明胶溶液中具有有害的作用。因此，发生交联时中和CaCl2作用的方法在开发用于医学和手术密封剂和止血应用的组合物方面是极有用的。
根据本发明的一些实施方案，止血或流体密封组合物包括钙结合剂(calcium-binding agent)。当包括交联材料和至少一种钙结合剂的溶液混入含有CaCl2的可交联蛋白的溶液中时，钙结合剂附着到钙分子上并削弱了钙分子对止血组合物或流体密封组合物的负面影响。在本发明的上下文中，术语“钙结合剂”与术语“钙螯合剂(calcium-sequestering agent)”、“钙螯合剂(calcium-chelating agent)”、“钙螯合剂(calcium-chelator)”、“钙络合剂(calcium-complexing agent)”是同义的。
本发明的发明人进一步出人意料地发现，向可交联蛋白的溶液，诸如明胶中添加钙结合剂，除了中和溶液中的钙之外，还具有额外的作用。当这种剂添加到明胶溶液中时，明胶溶液经历物理热可逆胶凝。此胶凝过程的速率取决于添加到明胶溶液中的溶液中钙结合剂的浓度。优选地，mTG溶液中的钙结合剂的浓度在约0.1M到约0.5M的范围内。更优选地，浓度范围是约0.25M到约0.5M。高于0.5M的浓度，则由某些钙结合剂促进的热可逆胶凝可以足够迅速地发生，以便严重阻碍mTG促进的交联。
即使就在环境温度下不能形成热可逆凝胶的明胶溶液而言，发生了通过向明胶溶液中添加包含钙结合剂的溶液引起的热可逆凝胶。这些类型的明胶溶液包括上述包含使明胶溶液转变点降到低于18℃-22℃(足够低以在操作室温下维持液态)的量的脲和/或CaCl2的那些明胶溶液。
通过向明胶溶液中添加钙结合剂形成的热可逆明胶凝胶与使明胶溶液在其溶胶-凝胶转变点的温度之下时形成的热可逆明胶凝胶是明显不同的。由降低温度引起的胶凝过程通常是渐进的过程，这是因为明胶溶液具有低的导热率且其耗费大量的时间使整个明胶溶液的温度降到其溶胶-凝胶转变点之下。由明胶溶液形成的凝胶是透明的且结实的。如果添加足够量的钙结合剂，那么由钙结合剂引起的胶凝过程几乎立即发生。形成的凝胶是不透明的、白色的且非常有弹性。而且，由钙结合剂胶凝得到的凝胶只在高于40℃(它们近似的溶胶-凝胶转变点)的温度下转变成溶液，该温度明显高于由300Bloom明胶得到的凝胶的溶胶-凝胶转变点。
不希望受到一种假设的限制，由添加某些钙螯合剂，诸如柠檬酸盐、EDTA和Calgon引起的热可逆物理胶凝的机理可能是由于离子交联，因为这些剂是带负电的聚阴离子，A型明胶具有7-9的等离子点，这意味着A型明胶在pH6.0的溶液中带正电(正如下面的参考实施例)。将带负电的聚阴离子添加到带负电的明胶溶液中可以引起离子交联。
在本发明的另一个任选的实施方案中，不是钙螯合剂的带负电的聚阴离子另外或可选择地用于一种或多种钙螯合剂以引起对组合物的离子交联。
可以通过向明胶溶液或相关的可交联蛋白中添加钙结合剂引起的热可逆胶凝在改善用于医疗和手术应用的mTG促进的交联蛋白凝胶的组合物方面具有极大的益处。这对具有低于18℃-22℃(其是足够低的以在操作室温下维持液态)的溶胶-明胶转变点的明胶溶液制备的交联凝胶来说，诸如包含必要量的脲和/或CaCl2的交联凝胶来说，尤其如此。由包含降低转变点的添加剂的明胶溶液制备的交联的凝胶的弹性和粘结性被降低，这是因为该凝胶随后缺少通常发生在明胶溶液中的赋予明胶凝胶弹性和粘合性的物理热可逆胶凝。当该凝胶用于组织密封剂、止血和伤口闭合应用时，降低的弹性和粘合性给这些凝胶带来明显的害处，这是因为该凝胶不太能够在处于伤口部位之上的合适位置时经受血液或其他体液的流动而不在凝胶开裂或允许液体穿透凝胶。然而，如果将钙结合剂添加到与明胶溶液混合以促进交联的mTG溶液中，那么明胶溶液也将经历物理的热可逆胶凝，同时经历mTG促进的交联。用于本发明的此实施方案的钙结合剂的浓度任选地且优选地是其本身不会在发生mTG促进的交联所要求的时段内发生热可逆胶凝的量。如果添加太多的钙结合剂，那么热可逆胶凝就会立即发生，而mTG促进的交联将根本不会发生。
由钙结合剂引发的热可逆胶凝既发生在钙或含钙的分子作为凝胶溶液的一部分被包括在内的凝胶溶液中，又发生在不包含钙或含钙的分子的明胶溶液中。在不包含任何钙的明胶溶液中，添加钙结合剂仅仅用于引发的热可逆胶凝作用。在确实包含钙(单独或在较大的分子中)的明胶溶液中，钙结合剂用于降低钙的有害作用并引发热可逆胶凝作用。钙对交联的蛋白/多肽组合物的有害作用可以包括差的机械性能，特别增大的脆性和粘合强度的降低。另外，当钙以其毒性阈值之上的高浓度存在时，钙可能引起不利的组织反应。
用在本发明的上下文中的钙结合剂的非限制性实例包括多磷酸盐，诸如焦磷酸盐(包括焦磷酸四钠、焦磷酸二氢二钠、焦磷酸四钾、焦磷酸二氢二钾和焦磷酸二钠二钾)、三聚磷酸盐(包括三聚磷酸五钠和三聚磷酸五钾)，高级多磷酸盐，诸如四磷酸钠和四磷酸钾以及六偏磷酸盐，也称为“玻璃态磷酸盐”或“聚焦磷酸盐”以及羧酸盐(诸如碱金属柠檬酸盐、碱金属乙酸盐、乳酸盐、酒石酸盐和苹果酸盐、乙二胺四乙酸(EDTA)的碱金属盐以及editronic酸)。
合适的钙结合剂的优选实例包括EDTA和柠檬酸钠。
参照下面示例性的、非限制性的实施例描述了试验实施例，该试验实施例描述了mTG促进的明胶溶液交联，其中已经将不同浓度的EDTA或柠檬酸钠添加到mTG溶液中。
用于本发明的上下文中的多磷酸盐的优选实例是以商品名CalgonTM下销售的粉末六偏磷酸钠(SHMP)。Calgon在水中与周围的钙离子形成络合物。当用作本发明的一部分时，当将Calgon引入到含钙的明胶溶液中时，其与其他钙结合剂具有类似的作用。当将Calgon引入到不含钙的明胶溶液中时，其像其他钙结合剂一样引发类似的热可逆胶凝过程，但还具有缩短mTG促进的明胶凝胶的交联时间的额外益处。还观察到所产生的包括Calgon的凝胶的粘合性比所产生的包括其他钙结合剂的凝胶的粘合性强。
脲螯合剂和脲水解剂
如上所述，可以将脲添加到明胶溶液中以便显著降低其转变点。这对在操作室环境中简化明胶-mTG化合物的使用方面具有巨大的益处。然而，在高浓度的脲存在下形成的交联的明胶凝胶对某些应用来说并不理想，因为当它们被植入到体内的自身组织上时，它们具有高的渗透压且能够将水抽吸出周围的组织。
根据本发明的一些实施方案，如通过在与明胶溶液混合以形成明胶-mTG组合物的mTG溶液中包括脲络合剂或脲螯合剂，必要时连同活性剂来中和明胶溶液中脲的作用。另外，催化脲的水解的剂可以被包括在具有类似作用的mTG溶液中。当mTG溶液混合到明胶溶液中时，脲螯合剂或脲水解剂立即与明胶溶液中的脲形成反应并中和或降低了其对明胶-mTG组合物可能的不期望的作用。脲螯合剂或脲水解剂可以任选地对明胶-mTG组合物的机械性能具有积极作用并增大了组合物的胶粘强度、粘合强度和/或弹性(不希望提供封闭的列表且还不希望受到一种假设的限制)。
用于催化脲的水解的剂的非限制性实例是脲酶，脲酶是一种市售的酶，其催化脲水解成二氧化碳和氨。脲酶存在于许多细菌、几种酵母物种以及许多高等植物中。两个示例性的来源是：刀豆(直生刀豆(Canavliaensiformis))和巴氏芽孢杆菌(Bacillus pasteurii)，已经从刀豆结晶出脲酶并得到充分的研究。
脲酶优选地以范围在约0.1M到相应明胶溶液中的脲的摩尔浓度的约2倍，至多溶液中脲酶的饱和点的浓度被包括在mTG溶液中，mTG溶液将添加到该相应明胶溶液中以形成明胶-mTG组合物。例如，如果1M脲被包括在明胶缓冲液中，那么脲酶的最大优选浓度是2M。此优选浓度指1∶2，mTG溶液∶明胶溶液的比，该比在本文所述的明胶-mTG组合物中是优选的且允许每分子脲一分子脲酶。
根据本发明的一些实施方案，脲酶连同脲酶稳定剂一起包括在mTG溶液中。这种稳定剂的非限制性实例是约1M到约3M浓度的EDTA或mTG缓冲液中约50％v/v浓度的丙三醇。另外的实施例包括谷胱甘肽和柠檬酸盐，正如美国专利第4,188,465号中描述的。
脲络合剂的非限制性实例是石蜡，其可以在诸如低分子量醇和酮的活性剂的存在下络合脲。这样的过程描述在美国专利第2,719,145号中。
增塑剂
本发明的一些实施方案包括向组合物的交联材料的溶液，而不是向组合物的可交联蛋白组分中添加山梨糖醇。
出人意料地，正如下面详细描述的，发现包括在mTG溶液中的山梨糖醇可以在开始明胶交联之前，意想不到地与明胶溶液结合。在与明胶溶液混合之前将山梨糖醇添加到mTG溶液中时，山梨糖醇增强了明胶-mTG组合物的柔性和弹性。这种增强的柔性和弹性可以任选地表示组合物的某些应用或用途的改进的性能。而且，山梨糖醇可以作为mTG的载体分子，避免mTG氧化并增加了mTG溶液的贮存期限。
虽然被包括在mTG溶液中，但是优选地参照对应于特定的mTG溶液的明胶溶液中的明胶的量来确定待添加的山梨糖醇的优选浓度。以相应明胶溶液中的明胶的量的重量比表示的增塑剂的优选浓度的范围在1∶1到3∶1。添加到溶液中的此范围内的增塑剂的量并不会对明胶溶液的交联时间具有显著的影响。
如上所述，mTG促进的交联的明胶组合物的性能可以根据用于mTG溶液的缓冲液来改变。例如，当使用柠檬酸钠缓冲液时，包含山梨糖醇的明胶-mTG组合物是极柔性的。当使用乙酸钠缓冲液时，极大地缩短了形成结实的明胶凝胶所要求的交联时间。就柠檬酸钠和乙酸钠缓冲液两者来说，明胶-mTG组合物在山梨糖醇存在时比山梨糖醇不存在时具有更强的弹性和柔性。
依据下面示例性的、非限制性的实施例描述了向用柠檬酸钠缓冲液制备的mTG溶液中添加山梨糖醇。此试验实施例中的试验数据证实了山梨糖醇进一步增强了用柠檬酸钠缓冲液中的mTG制备的凝胶的柔性。
当山梨糖醇被包括在mTG溶液中时，与柠檬酸钠用作mTG溶液的缓冲液时制备的凝胶相比，乙酸钠用作mTG溶液的缓冲液时，mTG以更快的速率促进明胶凝胶的交联，正如下面详细描述的。
可以用在本发明上下文中的增塑剂的进一步的实例包括，但不限于，柠檬酸烷基酯、丙三醇、丙三醇酯、邻苯二甲酸烷基酯、癸二酸烷基酯、蔗糖酯、脱水山梨糖醇酯、乙酰化单酸甘油酯、丙三醇、脂肪酸酯、二醇、丙二醇、月桂酸、蔗糖、三乙酸甘油酯、泊洛沙姆、邻苯二甲酸二乙酯、食用脂或食用油的单甘油酯和二甘油酯、邻苯二甲酸二丁酯、癸二酸二丁酯、聚山梨醇酯、聚乙二醇(PEG)200到20,000、碳蜡聚乙二醇、聚乙烯醇(PVA)、阿拉伯树胶、瓜尔胶、黄原酸胶、(聚乙烯吡咯酮)、甘露醇及其混合物。
显示出阿拉伯树胶、瓜尔胶、PVA、PEG6000和Plasdone增强了mTG交联的明胶组合物的柔性。优选地，本发明的增塑剂包括山梨糖醇、聚乙二醇、聚乙烯醇或阿拉伯树胶中的一种或多种，尽管其他有用的增塑剂也可以被包括在正如本文描述的本发明的这些实施方案中。
稳液剂和/或渗透物
稳液剂是增强水溶液中围绕蛋白的溶剂化层中的水分子的秩序的物质且因此：
·使水溶液中的大分子和蛋白稳定
·增强疏水作用、分子间相互作用以及蛋白聚集。
稳液剂对生物分子的作用通常与诸如脲和氯化胍(GuCl)的离液剂的作用相反。离液剂破坏了水的结构且因此，以蛋白-蛋白相互作用为代价，在水与蛋白之间形成新的氢键，这导致：
·聚集体的溶解
·通过使蛋白的内部疏水区域暴露于溶液而使球蛋白解折叠
如上所述，诸如脲和GuCl的离液剂可以用于通过使蛋白/多肽链之间的氢键网络不稳定来破坏某些蛋白/多肽溶液的物理胶凝。因而，这些离液剂降低了这些溶液的溶胶到凝胶的转变温度。
然而，在一些情形中，破坏蛋白/多肽溶液的物理胶凝可能对交联的蛋白组合物的机械性能产生不利的影响。例如，物理胶凝可以起到增强这种组合物的弹性的作用。破坏物理胶凝可以降低这些组合物的弹性并增强它们的脆性，这对某些应用来说是不期望的。
通过将稳液剂引入到交联材料的溶液中，可以刺激物理胶凝与由交联材料促成的胶凝一起发生，优选是同时发生，因而维持了物理胶凝的有益的机械性能效果。
在本发明的一些实施方案中，降低了蛋白/多肽溶液的溶胶-凝胶转变点并将一种或多种稳液剂引入到交联材料或交联材料的溶液中。
在优选的实施方案中，以足以使蛋白/多肽溶液中发生物理胶凝的浓度添加稳液剂。
稳液剂浓度的非限制性范围是合并的交联蛋白组合物的0.5M-1M。
在一些实施方案中，稳液剂是离子型稳液剂。
在优选的实施方案中，稳液剂是非离子型稳液剂。
非离子型稳液剂的非限制性实例是脯氨酸和海藻糖。
离子型稳液剂的非限制性实例是三甲胺N-氧化物(TMAO)和谷氨酸(谷氨酸)。
稳液剂对体外蛋白稳定性的稳定作用以及它们与脲的反作用可能与它们在体内起到渗透物的作用有关。已经证明了脯氨酸的体外作用与体内作用之间的良好关系(Fisher等人，PNAS103，2006：第13265-6页)。
在优选的实施方案中，用在本发明中的稳液剂是渗透物。
渗透物的非限制性实例是谷氨酸或脯氨酸。
交联剂抑制剂
当增加蛋白/多肽溶液中的交联密度时，增加了交联组合物的硬度。因此，若期望由交联蛋白组合物增加柔性或弹性，那么交联抑制剂可以用于限制组合物中的交联密度。实现此的一种方式是通过向组合物中引入交联剂抑制剂来减少蛋白溶液中由交联材料催化的交联的量。
在本发明的实施方案中，向蛋白溶液或交联剂溶液中添加交联抑制剂，因此降低了交联组合物的交联程度。
在本发明的优选实施方案中，交联材料是酶且抑制剂是酶抑制剂。
在本发明的更优选实施方案中，交联材料是转谷氨酰胺酶(TG)且抑制剂是转谷氨酰胺酶抑制剂。
在本发明的更优选实施方案中，交联材料是微生物转谷氨酰胺酶(mTG)且抑制剂是mTG抑制剂。
mTG抑制剂的非限制性实例包括胱胺(一种可以与mTG形成二硫键的有机二硫化物)、半胱氨酸(一种具有反应性S-H侧链(巯基侧链)的疏水性氨基酸)、黑色素、变性剂、具有巯基或二硫键的其他化合物、赖氨酸以及包含mTG底物的尺寸＜5kDA的化合物。
巯基侧链，诸如胱胺、半胱氨酸、二硫苏糖醇(DTT)和巯基乙醇中的巯基侧链可以作为抑制剂，因为它们可以通过与mTG巯基反应来阻断mTG的活性部位。
之前将黑色素描述为具有竞争性mTG抑制剂的作用(Ikura K等人，Biosci Biotechnol Biochem.66(6)，2002，第1412-1414页)。
在本发明的优选实施方案中，包括足以将交联活性抑制了低于50％的量的抑制剂。在更优选的实施方案中，包括足以将交联活性抑制了低于30％的量的抑制剂。
在本发明的另一个实施方案中，在已经开始交联之后，将抑制剂释放到组合物中。
可交联蛋白/多肽的PEG或PVA共聚物
根据一些实施方案，将聚乙二醇(PEG)(也被称为聚(环氧乙烷)(PEO)或聚氧乙烯(POE))作为共聚物被添加到蛋白/多肽或交联剂溶液中，以改善组合物的一种或多种性能，例如(且不限于)增强组合物的柔性或避免身体对蛋白-交联剂组合物的免疫反应。可以获得300Da到10MDa的宽范围分子量内的PEG且PEG可以是液体或低熔点固体，这取决于分子量。
还可以获得不同形式的化学修饰的PEG，这取决于用于聚合过程的引发剂，最常用的是单官能的甲基醚PEG(甲氧基聚(乙二醇))。还可以获得具有不同几何形状的PEG。支化PEG具有从中间的核心基团引出的3到10个PEG链。星型PEG具有从中间的核心基团引出的10-100个PEG链。梳型PEG具有通常接枝到聚合物主链的多个PEG链。所有这些类型的PEG在本发明中都应该被认为是有用的。
可以将PEG添加到蛋白-交联剂组合物的蛋白或交联剂组分中。优选地，以蛋白∶PEG 20∶1到1∶1之间的干重比添加PEG。可以通过蛋白或交联剂的修饰和/或PEG分子的修饰将PEG添加到蛋白组分或交联剂组分。这种修饰的一个实例是被称为聚乙二醇化的过程。聚乙二醇化是PEG结构共价连接到另一个较大分子上的行为。此过程可以在蛋白或交联剂分子上实施。
明胶聚乙二醇化实施方案除了许多优势以外以及不希望为限制性的，还具有PEG是蛋白链的一部分的优势，因此引起蛋白表面性能的变化，表面性能包括但不限于电荷和亲水性，以及由于其松散性引起的空间效应。因此，共价连接的PEG可以对蛋白链之间的分子间相互作用产生极大的影响且转而对物理胶凝和交联剂依赖性交联以及对由这些方法制备的凝胶的机械性能产生极大的影响。
用于聚乙二醇化的PEG分子通常是被活化的，意指它们自发地与靶蛋白上的官能团反应。聚乙二醇化的非限制性实例是使用PEG的NHS酯衍生物。这些活化的PEG分子与蛋白上的伯胺反应以形成酰胺键并释放N-羟基-琥珀酰亚胺(NHS)
可以修饰蛋白的其他方式是通过使赖氨酸的链内部和蛋白链的氨基端处存在的伯胺反应。修饰可以通过烷基化、琥珀酰化、氨甲酰化或通过蛋白修饰的任何其他方法。
在优选的实施方案中，可交联蛋白/多肽先与活化的PEG反应以产生聚乙二醇化蛋白。通过下述方法从过量的未反应的PEG和其他反应产物中纯化聚乙二醇化蛋白，这些方法诸如，但不限于，透析、超滤和凝胶过滤色谱法。随后，聚乙二醇化蛋白可以与交联剂反应以形成交联凝胶。
也可以通过将PEG胺用作靶向胺基的交联剂的底物来任选地添加PEG。交联剂通过其端氨基将PEG分子交联到蛋白分子上的交联剂底物上，因而与蛋白上自身的氨基竞争。
PEG胺包括已经结合到胺官能团的PEG。这些PEG胺以所有类型的PEG几何形状来市售。胺官能的PEG产物的来源包括NOF(Japan)、Nanocs(New York，NY)和Pierce Biotechnology(Rockford，IL)。
在结合PEG的所有方法中，减少了可用于交联的天然底物的数目，这导致减少的交联。这可以影响交联凝胶的机械性能，如任选地使交联凝胶的刚性变弱且柔性更强。此外且不希望受到一种假设的限制，PEG分子本身可以作为增塑剂且还有助于所得凝胶的柔性。
根据优选的实施方案，PEG胺包括活性赖氨酸氨基酸。
根据本发明的另一个实施方案，将聚乙烯醇(PVA)作为共聚物添加到明胶或mTG溶液中以增强蛋白-交联剂组合物的柔性或粘合性。PVA是具有高拉伸强度和柔性的水溶性合成聚合物。在高湿度环境中，诸如在身体内，PVA将吸收水。作为增塑剂的水可以降低PVA的拉伸强度，但增大其延伸。
根据一些实施方案，共聚物包括PVA-胺。将胺靶向交联剂添加到溶液中时，蛋白和PVA-胺都将作为底物且将形成具有比相当的交联蛋白聚合物的柔性好的蛋白-PVA共聚物。
可以用于产生聚(乙烯醇)的胺官能衍生物的方法的非限制性实例描述在美国专利6107401中。
可以用于产生PVA的胺共聚物的方法的非限制性实例描述在美国专利4931501中，其中聚(乙烯醇)与氨基-醛二烷基缩醛反应。
作为另一个非限制性实例，之前描述了使用羰基二咪唑活化的二胺通过两步法合成胺修饰聚(乙烯醇)以产生具有不同胺取代度的PVA的方法(Wittman M等人，Biophysical and Transfection Studies of an Amine-Modified Poly(vinyl alcohol)for Gene Delivery(用于基因递送的胺修饰聚(乙烯醇)的生物物理和转染研究)。Bioconjugate Chem.，16(6)，1390-1398，2005)。
表面活性剂
根据本发明的一些实施方案，将一种或多种生物相容的表面活性剂添加到可交联蛋白或多肽的溶液中，如为了降低溶液的表面张力。
表面活性剂是降低液体表面张力的润湿剂，使得易于散布并降低两种液体之间的界面张力。较低的表面张力有利于容易处置可交联肽的溶液，因为其易于通过涂布器，且易于与可交联材料的溶液混合。表面活性剂还可以降低溶液的粘度。另外，当明胶溶液单独或与mTG溶液一起被冻干时，降低明胶溶液的表面张力具有大的益处，因为其可以防止在干明胶的顶层上形成膜。这种膜抑制冻干明胶重建成均匀的溶液。
用于本发明上下文中的生物相容的表面活性剂的非限制性实例是聚山梨醇酯20(TweenTM20)、聚氧乙烯二醇十二烷基醚(BrijTM35)、聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物(PluronicTM F-68)、月桂基硫酸钠(SLS)或十二烷基硫酸钠(SDS)、月桂基乙醚硫酸钠或月桂基聚氧乙烯醚硫酸钠(SLES)、泊洛沙姆或泊洛沙胺、烷基多葡糖苷、脂肪醇、脂肪酸盐、椰油酰胺单乙醇胺和椰油酰胺二乙醇胺。
表面活性剂也可以用作增塑剂。例如，已经显示出Tween80降低了若干种亲水性聚合物的玻璃化转变点(Tg)。聚合物内存在较小分子的Tween80被认为稀释并减弱了聚合物链之间的粘结相互作用。这通过增大聚合物基体内的体积而减轻了摩擦和缠结。(Ghebremeskel等人，2006，International Journal of Pharmaceutics328：119-129)。
在本发明的优选实施方案中，一种或多种表面活性剂用作增塑剂以改进交联组合物的弹性，特别因为其随着时间变硬。
在另一个任选的实施方案中，一种或多种表面活性剂与来自上面列出的与本发明有关的增塑剂中的另外的增塑剂相结合。Rodriguez等人(FoodResearch International39(2006)840-6)证明了增塑剂(丙三醇)和表面活性剂(Tween20、Span80、卵磷脂)对增强非交联的干凝胶膜的弹性的协同效应。
优选地，以溶液中明胶干重的0.1％-5％的重量比将表面活性剂添加到明胶溶液中。可选择地，以约等于溶液中的那种特定表面活性剂的临界胶束浓度(CMC)的浓度将表面活性剂添加到明胶溶液中。每一种表面活性剂的CMC是变化的且依赖于溶解了表面活性剂的溶液的离子浓度。
组织基质中和
根据本发明的一些实施方案，止血组合物或体液密封组合物还包括基质特异性结合剂，这中和了表面材料对用组合物密封、附着或以其他方式处理的组织基质的粘合抑制作用。例如，这些剂可以结合、溶解和/或分散具有抗粘合作用的基质表面材料。
根据优选的实施方案，本发明的组合物旨在粘合到粘膜，诸如胃肠道(GIT)或颊粘膜。
GIT中的组织，诸如肠，通常有粘膜，覆盖有连续产生的粘液。由于粘液不断地进行自我更新，因此成功地附着到GIT内的组织要求组合物特异性粘合到粘膜层下的组织本身。
特异性粘合GIT的靶向区域的一种方式是通过使用能够可逆地结合到GIT内的细胞表面的粘膜粘合剂。这些粘膜粘合剂以较大特异性发挥作用，因为它们是基于受体-配体样相互作用，其中分子牢固地且快速直接结合到粘膜细胞表面，而不是粘液本身。
具有这些独特要求的一类化合物的非限制性实例是凝集素。凝集素是蛋白或糖蛋白并享有特异性且可逆地结合到糖类的普遍能力。它们以可溶的或细胞结合的形式存在并具有糖选择性和识别部分。肠上皮细胞具有包含膜锚固的糖缀合物的细胞表面。正是因为凝集素能够靶向这些表面，因而实现了肠内递送构想(Shah KU，Rocca JG.，Drug Deliv.Tech.，2004，4(5)，1)。
粘膜粘合凝集素的非限制性实例是番茄凝集素(TL)。已经在体外结合方面广泛研究了TL且显示出TL选择性地结合到小肠上皮(Lehr C，Bouwstra JA，Kok W，Noach AB，de Boer AG，Junginger HE.Pharma Res.，1992，9(4)，547-53。)
凝集素用于改进粘合到包含膜锚固的糖缀合物的所有粘膜组织表面。这种组织表面的非限制性实例是颊粘膜和肠道壁。
改进颊粘膜粘合的化合物的非限制性实例是聚(天冬氨酸)(PAA)和聚乙二醇(PEG)单乙醚单甲基丙烯酸酯(PAA-共-PEG)(PEGMM)的共聚物(Shojaei AM，Li X.J.Control.Release，1997，47，151-61.27。)。优选地，PEGMM是16mol％的PEGMM，其具有最有利的热力学曲线和最高的粘膜粘合力。
根据本发明的一些实施方案，粘膜粘合剂是市售的粘膜粘合剂水凝胶。适用于改进本文描述的新颖的组合物的基质特异性粘合的水凝胶的非限制性实例是以商品名出售(Corium Technologies，Menlo Park，CA)。这些粘合性水凝胶是通过膜形成亲水性聚合物(如，聚乙烯吡咯烷酮，(PVP))与其链端具有补充的反应性羟基的短链增塑剂(通常是，但不一定是PEG)的非共价(氢键)交联制备的。
粘膜粘合化合物的另一种非限制性实例包括具有一个或多个巯基的聚合物。在这种聚合物中，引入巯基(sulphahydryl)增强了粘膜粘合剂聚合物的粘合性能((Bernkop-Schnurch A，Schwarch V，Steininger S.Pharm.Res.，1999，16，6，876-81.32。)。证明了对猪的肠粘膜的改进的粘合。已经证明了巯基化聚合物(巯基化物(thiomer))强力的颊粘合性能(Langoth N，Kalbe J，Bernkop-Schnurch A.Int.J.Pharm.，2003，252，141-48。)。
颊粘合剂的另一种非限制性实例是从哈克木属(Hakea)得到的天然的粘膜粘合树胶(Alur HH，Pather SI，Mitra AK，Johnston TP.Iht.J.Pharm.，1999，88(1)，1-10。)
酶纯化&浓缩
根据本发明的一些实施方案，转谷氨酰胺酶溶液经历一步或多步纯化以实施下述中的一个或多个1)从转谷氨酰胺酶混合物中去除发酵残余物；2)浓缩转谷氨酰胺酶溶液中活性转谷氨酰胺酶的量；3)从载体蛋白或糖进一步纯化转谷氨酰胺酶溶液；4)降低转谷氨酰胺酶溶液中的内毒素水平；和/或5)从转谷氨酰胺酶溶液中去除所有的微生物，有效地灭菌溶液；全都不希望受限于封闭的名单。
在至少一些实施方案中，本发明还提供了一种用于制备止血组合物或体液密封组合物的方法，该方法包括提供可交联蛋白或多肽的溶液；提供交联材料的溶液；以及将可交联蛋白或多肽的溶液与交联材料的溶液混合。
根据一些实施方案，在与多肽的可交联蛋白混合之前，过滤交联材料的溶液。
在本发明的优选实施方案中，过滤过程首先采用粗过滤，有时称为澄清，以去除将会迅速堵塞更细的过滤步骤的大块发酵残余物。这种粗过滤的非限制性实例是约0.45μm孔径的过滤和约0.65μm孔径的过滤。
根据本发明的另一个优选的实施方案，交联材料的溶液任选地且优选地通过小于0.22μm孔径的过滤器，如以将材料的生物负载降低到低于10个菌落形成单位(CFU)每克并使其适于医疗应用。优选地，几乎消除了生物负载以获得小于约10-2且更优选小于约10-3的无菌保证水平(SAL)，其中SAL是用在微生物学中来描述已经经受灭菌过程后，单一单位是非无菌的可能性的术语。
根据本发明的另一个优选的实施方案，切线流过滤或中空纤维超滤技术不仅用于通过去除载体糖和蛋白来纯化交联材料的溶液，而且用于浓缩溶液。用于本发明的优选的孔径是小于交联组合物的组分的尺寸的孔径。
在优选的实施方案中，交联材料是mTG且孔径在10kDa-50kDa的范围内。在更优选的实施方案中，交联材料是mTG且孔径在10kDa-30kDa的范围内。
根据另一个实施方案，一个或多个尺寸排阻色谱步骤用于选择性地将交联材料与周围的材料分开。
根据另一个实施方案，一个或多个疏水相互作用或亲水相互作用色谱步骤用于选择性地将交联材料与周围的材料分开。
根据本发明的另一个优选的实施方案，交联材料是蛋白，且一个或多个离子交换色谱法步骤用于优先结合交联蛋白，由此从周围的材料纯化交联蛋白。
根据更优选的实施方案，交联蛋白是mTG且一个或多个阳离子交换色谱法步骤用于纯化mTG。
在优选的实施方案中，阳离子交换树脂是琼脂糖树脂。
根据另一个优选的实施方案，纯化将交联材料的内毒素水平降低到＜5内毒素单位(EU)每克。
根据另一个优选的实施方案，交联材料是mTG且纯化产生mTG组合物，其中比活性大于20个酶单位每毫克且优选大于25个单位每毫克。
根据另一个优选的实施方案，交联材料是mTG且纯化产生至少95％且优选至少98％的电泳纯度。
作为非限制性实例，本文描述了mTG纯化过程，该过程纯化食品级mTG产品以产生具有比活性＞25个酶单位每克、＞95％电泳纯度、＜5内毒素单位每克和＜10CFU/g的mTG组合物。
如上所述，mTG浓度对本发明组合物的一些实施方案也是优选的参数。上面的纯化过程还可以产生浓度更大的mTG材料。除了交联明胶比交联未浓缩的mTG溶液更快之外，浓缩的mTG溶液形成的凝胶比未浓缩的对照的弹性更强、粘合性更强和透明度更高。
酶溶液的增大的粘度
根据本发明的另一个实施方案，增大无毒性交联剂溶液的粘度，以便减小交联剂溶液与明胶溶液之间的粘度差异。减小的溶液粘度的差异能够快速且均匀地混合两种溶液。
在本发明的优选实施方案中，将交联剂溶液的粘度增大至50cP到5000cP之间。
在本发明的更优选的实施方案中，将交联剂溶液的粘度增大至150cP到2500cP之间。
在此实施方案的非限制性实例中，向交联剂溶液中添加无胺官能团的高分子量分子以增大其粘度。这种分子的非限制性实例是可溶性淀粉，聚乙烯醇(PVA)、聚乙二醇(PEG)。
在本发明的优选实施方案中，向交联剂溶液中添加一种或多种增粘剂以增大溶液的粘度而不会抑制交联反应超过50％，优选地，不会抑制反应超过30％，且甚至更优选地，不会抑制该反应。合适的增粘剂的非限制性实例包括藻酸酯、阿拉伯树胶、羧甲基纤维素(CMC)、黄原酸胶、瓜尔胶和plasdone。
可交联蛋白/多肽的氨甲酰化的抑制
正如本专利中较早描述的，在本发明的一些实施方案中，使用脲以降低蛋白溶液的溶胶-凝胶转变点。使用脲可引起的一个缺点在于其可以离解成氰酸。氰酸盐离子与蛋白上的伯氨基团反应以产生氨甲酰化衍生物。这在称为氨甲酰化的过程中使可交联蛋白上的氨基去官能化。在本发明的优选实施方案中，可交联蛋白中的交联底物之一包括一种或多种胺基。当这些基团被去官能化时，减少了可用于交联的底物的数目且交联速率降低。脲存在于溶液中的时间以及溶液的温度影响氨甲酰化的速率，这是因为脲以温度依赖性速率随时间分解成氰酸盐。
并不是出人意料地，氨甲酰化会对本发明所述的实施方案可能带来问题，因为此过程先前已经被描述成对胺官能的蛋白和多肽产生不利的影响。美国专利4,605,513描述了一种通过使用1，2-乙二胺或结构上与1，2-乙二胺相关的化合物来抑制多肽的氨甲酰化的方法。美国专利7,459,425B2描述了一种用于通过添加氨甲酰化抑制剂来在包含脲或氰酸盐的溶液中抑制多肽的氨甲酰化的方法。
背景技术中描述的氨甲酰化抑制过程依赖于使用竞争性的胺基底物来结合氰酸盐离子，否则氰酸盐离子将造成靶分子的氨甲酰化。这些背景技术的方法可以产生关于本发明的优选实施方案的问题，这是因为可交联蛋白的可交联底物包括胺基。因此，添加竞争性胺基底物可以竞争性地抑制靶可交联蛋白的交联。举一个这样的实例，发明人发现在美国专利7,459,425B2中公开为优选的氨甲酰化抑制剂的羟胺增加了已经与脲孵育的蛋白溶液的交联时间。
交联材料可以任选地包括具有与伯胺反应的官能团的化学实体，包括，但不限于，芳基叠氮化物、碳二亚胺、羟甲基膦、亚氨酸酯、NHS-酯、乙烯基-砜、二异氰酸酯和醛，诸如，如戊二醛和甲醛。
交联材料还可以任选地(可选择地或另外)包括具有胺基底物的酶交联剂。优选地，酶交联剂使用赖氨酸的ε氨基作为底物。这种酶的非限制性实例是微生物转谷氨酰胺酶(mTG)和组织转谷氨酰胺酶。
将期望背景技术中描述的化合物将会抑制转谷氨酰胺酶依赖性交联，这是因为这些化合物包含是转谷氨酰胺酶的优选底物的伯胺。出人意料地，与背景技术的教导不同，本发明人发现通过添加竞争性的氨甲酰化抑制剂可以抑制蛋白/多肽溶液中的氨甲酰化且不会不利地影响蛋白/多肽的胺基依赖性交联。
在本发明的实施方案中，可交联蛋白/多肽组合物包括氨甲酰化抑制剂。
氨甲酰化抑制剂的非限制性描述是可以是比靶向蛋白/多肽更优先的氨甲酰化的底物的任何分子。
抑制剂的非限制性实例是在其结构中具有伯胺的分子。
在优选的实施方案中，氨甲酰化抑制剂不抑制多肽的交联能力或不会以比它们抑制氨甲酰化反应更大的程度抑制其交联能力。
在另一个优选的实施方案中，氨甲酰化抑制剂不抑制交联活性或不会以比它们抑制氨甲酰化反应更大的程度抑制其活性。
根据优选的实施方案，氨甲酰化抑制剂包括氨基酸或氨基酸盐。
根据更优选的实施方案，氨甲酰化抑制剂是甘氨酸或组氨酸中的一种或多种。根据更优选的实施方案，氨甲酰化抑制剂是甘氨酸。
甘氨酸任选地且优选地以约0.05M到约1.5M的浓度存在于组合物中。更优选地，以约0.1M到约0.9M的浓度使用甘氨酸。
出人意料地，本发明人发现虽然甘氨酸包含胺基，但是其并不抑制转谷氨酰胺酶的交联活性或mTG依赖的明胶交联的动力学。
显示出与包含其他伯胺基团的物质相比，甘氨酸在包含脲的明胶溶液中优先抑制氨甲酰化，并且是以剂量依赖的方式。组氨酸也可以任选地用于抑制氨甲酰化。
氰酸钠也产生抑制作用，这证实了脲分解是抑制mTG交联的原因。
可交联蛋白中的胺基的修饰
在本发明的另一个实施方案中，可交联蛋白/多肽包含胺基，胺基是交联材料的底物，且可交联蛋白/多肽上的伯胺基被修饰。
在明胶中，相关的胺基是赖氨酸侧链上的ε胺和明胶链的氨基端的游离胺。
修饰可交联蛋白/多肽上的胺基可以减少可用于交联的可交联底物的数目，由此通过维持组合物的弹性或改变组合物的化学性能，诸如表面电荷或亲水性来改进可交联蛋白组合物的机械性能。
在本发明的实施方案中，可以任选地用一种或多种方法来实施伯胺的修饰，这些方法包括但不限于烷基化、酰胺化、氨甲酰化或琥珀酰化。
在另一个实施方案中，可以任选地通过蛋白与醋酸酐、戊二酸酐和柠康酐反应来修饰明胶上的伯胺基。
在另一个实施方案中，还可以任选地通过与琥珀酰亚胺酯的衍生物反应来修饰伯胺基。此外，可以通过聚乙二醇化修饰伯胺基。在优选的实施方案中，琥珀酰化蛋白/多肽。
琥珀酰化是一种琥珀酸酐与赖氨酸的ε氨基和/或蛋白/多肽的氨基-N-端α-氨基反应的过程。
在优选的实施方案中，交联材料是转谷氨酰胺酶且可交联蛋白上的伯胺基被修饰。
例如，显示酪蛋白中的赖氨酸的琥珀酰化使蛋白成为转谷氨酰胺酶的非底物(Nio等人，Agricultural and Biol Chem50(4)，1986：第851-855页)。
在琥珀酰化的优选实施方案中，将琥珀酸酐任选地且优选地添加到蛋白/多肽中以开始琥珀酰化反应。当达到琥珀酰化的期望水平时，优选地通过下述方法将琥珀酰化蛋白从过量的未反应的琥珀酸酐和其他反应产物中分离并纯化，这些方法包括但不限于透析、超滤或凝胶过滤色谱法或其组合。任选地，过量的未反应的琥珀酸酐与一种或多种添加剂进行化学反应，以从功能上将其从进一步的反应中去除。
在另一个实施方案中，将修饰蛋白任选地且优选地与未修饰的蛋白以每重量未修饰蛋白的1∶10-10∶1重量的修饰蛋白的范围内的比混合。
在添加交联材料之前，可以任选地将修饰蛋白与未修饰蛋白混合，或可以任选地将修饰蛋白添加到交联材料中，使得修饰蛋白只有在添加交联材料时才与未修饰蛋白混合。
在另一个实施方案中，通常将是交联材料的底物的蛋白优选地被修饰并用于增大交联材料溶液的粘度。
在另一个实施方案中，交联材料是转谷氨酰胺酶且蛋白被优选地修饰，使得其赖氨酸基团的大部分成为非官能化底物，留下可以在二胺连接剂存在下被mTG交联的谷酰胺基团，二胺连接剂包括但不限于乙二胺、二氨基己烷、腐胺、尸胺、精胺、亚精胺和jeffamine。
在优选的实施方案中，蛋白是明胶。
明胶的完全琥珀酰化造成明胶不再被mTG交联。
还如下面描述的，可以任选地使用琥珀酰化明胶与未修饰明胶的混合物，例如且不限于改进交联的明胶组合物的机械性能。
在本发明另一个优选的实施方案中，任选地且优选地通过氨甲酰化修饰组合物中的蛋白/多肽。
蛋白的氨甲酰化是异氰酸与肽的氨基反应并形成氨甲酰化肽的过程。
当蛋白或肽的胺基用作交联过程的底物时，氨甲酰化可以任选地用于修饰胺基。
在非限制性的实施方案中，任选地且优选地将氰酸盐添加到蛋白/多肽中以开始氨甲酰化反应。当达到氨甲酰化的期望水平时，任选地通过一种或多种下述方法从过量的未反应的氰酸盐和其他反应产物分离或纯化氨甲酰化蛋白，这些方法包括但不限于透析、超滤或凝胶过滤色谱法或其组合。任选地，过量的未反应的氰酸盐与一种或多种添加剂进行化学反应，以从功能上将其从进一步的反应中去除。
在非限制性的实施方案中，优选地，在开始交联反应之前或在交联反应期间，将氰酸盐直接添加到蛋白/多肽中以引发氨甲酰化反应。
可以用于此目的的氰酸盐的实例包括但不限于氰酸钠、氰酸铵和氰酸钾。
在另一个实施方案中，蛋白溶液优选地包含脲且当脲分解成氰酸铵时，氨甲酰化开始。
优选地通过以每g蛋白0.001mM-0.1mM范围内的浓度将氰酸盐添加到全部蛋白-交联剂组合物中来实现部分氨甲酰化。优选地，以每g蛋白0.01mM-0.05mM范围内的浓度添加氰酸盐来实现部分氨甲酰化。
高于每g蛋白0.05mM，且优选高于每g蛋白0.1mM的浓度可以任选地用于引起蛋白中胺基的完全氨甲酰化。
蛋白分子链(二胺分子)之间的交联桥
根据本发明进一步优选的实施方案，将转谷氨酰胺酶对其有特异性活性的二胺添加到蛋白或交联剂组合物中，以引入到交联的蛋白组合物，而通过蛋白交联之间产生交联桥而改进明胶-mTG组合物的某些性能。交联桥的益处的非限制性实例(且不希望提供封闭的清单)包括增强的弹性、改变的生物吸收时间或改变的粘合强度中的一个或多个。
如上所述，例如，如果可交联蛋白包含是交联剂材料的底物的胺基时，此实施方案可以任选地是有用的。
在一些情形中，二胺还可以用于抑制交联动力。如果交联剂靶向赖氨酸侧链上的ε氨基，那么二胺可以与交联剂的靶底物竞争且减缓交联反应。
可以使用的二胺的非限制性实例是腐胺、尸胺、己二胺、亚精胺和精胺。此外，可以使用聚醚胺型二胺，诸如Jeffamine EDR-148(Huntsman)。还可以使用赖氨酸和聚赖氨酸或包含2个或更多个赖氨酸残基的多肽。
正如在修饰的氨基部分中提到的，在本发明的另一个实施方案中，转谷氨酰胺酶是交联剂且可以任选地将一种或多种二胺添加到蛋白溶液中，其中已经修饰了胺基。在这种情形中，修饰蛋白或其中的一些肽可以不是本身可交联的。那么，二胺提供了用于由转谷氨酰胺酶引起的交联的伯胺。二胺不会与天然的赖氨酸竞争并减缓交联反应属于本方法的许多优势。而且，它们通过二胺桥将使靶向蛋白中的谷氨酰胺底物相互桥接。不希望受到一种假设的限制，该方法产生具有更长的且更柔性的桥，以改进交联组合物的柔性的凝胶。
一些二胺可以用于改变交联的蛋白组合物的蛋白酶生物降解的速率。例如，证明了赖氨酸和己二胺具有减慢或加快蛋白酶生物降解的速率的能力(Ma等人，Biomaterials.2004，25(15)：第2997-3004页)。
在优选的实施方案中，通过二胺在可交联蛋白/多肽中的赖氨酸侧链之间形成交联桥。
可以使用在这一环境中的二胺的非限制性实例是己二酰二胺和戊二酰二胺。
关于下面示例性的、非限制性的实施例描述了二胺化合物、腐胺对明胶交联反应的动力学的影响。腐胺以剂量依赖方式减慢了交联反应，说明腐胺起到转谷氨酰胺酶的底物的作用且与明胶交联。腐胺还增强了弹性。
可交联蛋白或多肽的UHT灭菌
根据本发明的一些实施方案，超高温灭菌(UHT)处理用于在蛋白或多肽溶液用于医疗应用的制备中灭菌蛋白或多肽溶液，诸如明胶溶液。UHT是通过将呈液体形式的材料加热至120℃-140℃的温度范围持续约3-180秒短时间来灭菌该材料。高温缩短了处理时间，由此减轻机械性能的损害。UHT系统中精确的温控确保了材料中必要的生物负荷的减少。
成功地是，可重复地热灭菌蛋白溶液需要使全部量的溶液处于特定的温度且保持在该温度下持续设定量的时间(根据GMP标准定义了可接受的时间/温度组合)。这定义为“保持时间”。
在高压釜中，通常将材料保持在高压釜内30-40分钟以确保材料的所有部分都达到要求的温度(通常约121℃)持续至少保持时间的长度。
在UHT中，该过程受到更多的控制且因而可以快得多。与同时进行加热不同，材料经历连续流过程，其中在任何给定的时间正在加热少量的材料。
根据本发明的一些实施方案，常规的UHT用于部分或充分灭菌本文描述的新颖的组合物的蛋白溶液组分。在常规的UHT中，任何特定等分试样的材料的加热过程耗费数秒，然后将该材料保持在此温度下持续必要的保持时间。
根据本发明的另一个实施方案，在进入UHT系统之前，蛋白溶液经历脱气过程。
根据本发明的优选实施方案，在UHT系统中通过间接加热材料，如通过加热水或蒸汽，来实现材料的加热。
根据本发明的另一个实施方案，在UHT系统中通过直接加热材料，如通过注入热蒸汽，来实现材料的加热。
根据本发明优选的实施方案，当采用直接蒸汽注入加热进行UHT处理时，最初以比最终用于医疗的蛋白/多肽-交联剂组合物所要求的浓度高的浓度来制备受处理的蛋白或多肽溶液。
在本发明更优选的实施方案中，受处理的蛋白/多肽溶液的初始浓度高于该溶液的期望的最终浓度约5％(w/v)。
根据本发明的一些实施方案，采用微波UHT，其中在保持时间之前，每一等分试样的加热过程耗费不到1秒，优选不到0.5秒且更优选约2/10秒。通过确保材料的每一部分以恒定的流速通过热波均匀场可以实现这一短的加热时间。这是十分受控的且极精确的过程。
成功地灭菌用在本发明中的明胶溶液要求加热过程不会导致明胶分子的任何水解。已知蛋白溶液，如明胶溶液的高压灭菌造成部分水解和交联活性的明显损失。而且，包括诸如脲的材料的明胶溶液的高压灭菌导致明胶材料的交联活性几乎完全丧失。换句话说，成功地高压灭菌所要求的延长的加热时段产生对明胶溶液材料的某些不期望的影响。
对蛋白处理来说，UHT比高压灭菌精密许多倍，因为所需要的加热时间比高压灭菌所需要的时间短得多。UHT并不会导致明胶溶液中的明胶分子明显的部分水解。
在UHT处理期间，直接加热蛋白或多肽溶液是常规UHT中更快形式的加热。然而，直接加热需要将蒸汽直接注入到材料中。通常，当材料已经灭菌后，借助真空去除蒸汽。然而，在诸如明胶溶液的高粘度蛋白溶液中，这是不可能的。因此，如果采用直接蒸汽注入加热，需要定标UHT系统以评估被灭菌的材料被注入蒸汽稀释的百分数。通常，此百分数是约5％。当确定了精确的稀释百分数后，可以制备允许由蒸汽注入稀释所要求的更浓的初始溶液。
间接加热耗费约20-30秒且因而比直接加热略慢，间接加热比直接加热简单，因为间接加热完全不会影响受到处理的材料的含量。
虽然均匀微波场UHT是非常新的技术，但也是用于蛋白溶液的十分受控的和精密的灭菌方法。微波UHT依赖于均匀微波的波技术，这是一种相对新的技术。此技术允许等分试样的材料被均匀加热到非常特定的温度。将全部量的材料加热至该特定的温度。没有一种材料达到比该温度更高的温度，且没有逸出物(escapes)被加热至该温度。整个UHT过程依赖于此均匀加热方法的可靠性和一致性。标准微波不能够产生热波的均匀场。结果是加热在某种程度上总是不均匀的。在将确保全部材料被充分加热的灭菌过程中，材料的一些部分将变得过热且不适于使用。
通过实现直接蒸汽注入加热的快速加热且不要求受到处理的材料的浓度的任何变化使微波UHT的总过程时间最短。
在UHT处理之前，溶液的脱气可以是极大的优势，这是因为经历UHT处理的材料中的气泡在处理过程中将破裂。这可以破坏该过程且导致灭菌热过程的不均匀的结果。
优选地，采用设计用于小规模热处理的系统(界定为流速不到2L/min的连续流处理)来进行蛋白或多肽的UHT处理。甚至更优选地，以低于1.2L/min的流速进行UHT处理。采用小规模的常规或均匀微波UHT系统，诸如由Microthermics(Raleigh，NC)供给的那些系统，任选且优选地获得了此量级的流速。低的流速提供更准确且有效的UHT处理。
胺供体
根据本发明的一些实施方案，其中伯胺基团是交联剂材料的底物，向明胶溶液中添加胺供体以改变交联反应动力学或交联蛋白组合物的机械性能。
聚胺是具有两个或更多个伯胺基团的有机化合物。由于聚胺的化学性质，所以它们可以与其他分子形成氢键、离子键或共价键。在动物中，已经证明了聚胺与许多蛋白的翻译后共价键，存在许多证据表明这些反应受到转谷氨酰胺酶的催化，转谷氨酰胺酶分别与两个或一个肽结合的谷氨酰胺残基形成交联络合物(Serafinie-Fracassini D等人，Plant Physiol.(1988)87，757-761。Ohtake Y等人，Life Sciences2007；81，7：第577-584页)。
合适的聚胺的实例包括但不限于聚赖氨酸、壳聚糖或聚乙烯亚胺。
另一种合适的聚胺是聚乙烯胺，一种由BASF(Germany)生产的商业化胺反应性PVA物质。可以改变聚乙烯胺分子的链长度和电荷密度以获得不同特征的结合了聚乙烯胺的共聚物。
在一些实施方案中，在蛋白与交联剂材料的混合物之前，聚胺任选地被包括在蛋白组合物中。
在一些实施方案中，在蛋白与交联剂材料的混合物之前，聚胺任选地被包括在交联剂组合物中。
在一个实施方案中，包括聚赖氨酸，聚赖氨酸是一种带有多个正电荷且用于调节对活细胞的粘合的赖氨酸聚合物。通过大多数哺乳动物细胞的膜上存在的带负电荷的唾液酸糖来调节与活细胞的相互作用。可以与这一目的相关的聚胺的另一种非限制性实例是聚乙烯亚胺。
在一些实施方案中，在交联开始之后，任选地添加聚胺。通常，在A型明胶中，明胶的每1000个氨基酸残基存在比赖氨酸更多的谷氨酰胺，谷氨酰胺与赖氨酸分别是48个残基和30个残基。在组合物中包括聚胺可以将平衡朝向伯胺过量倾斜。伯胺可以起到用于附着到组织中的锚固点的作用。
向本发明的组合物中添加聚胺可以通过增加组合物中的反应位点的数目来增大组合物的粘合强度以及其粘合性。
此外，聚胺可以在明胶链之间形成柔性的交联桥，因而增大交联凝胶的柔性。
而且，已经显示出聚胺结合组织纤连蛋白(参见上面的参考文献)。因而，引入到蛋白-交联剂组合物中的聚胺还可以作为将组合物连接到自然组织的中间剂。
在本发明的优选实施方案中，聚乙烯亚胺(优选支化聚乙烯亚胺)任选地被包括在蛋白组合物中。
支化聚乙烯亚胺是具有伯胺基团、仲胺基团和叔胺基团的高度支化的聚合物。
实施例29描述了使用，如且不限于聚乙烯亚胺(PEI)来增强mTG交联的明胶组合物的弹性。
氨清除剂、螯合剂和结合剂
氨是高度毒性的。血铵浓度通常＜50μmol/L，且仅增大到100μmol/L就能够导致意识障碍。200μmol/L的血铵浓度与昏迷和惊厥有关。
铵产生在身体的大多数细胞中，是由氨基酸和胺的脱氨作用引起的。高于铵的阈值浓度的铵的毒性是因为酶谷氨酸脱氢酶的作用。此酶催化谷氨酸氧化脱氨成铵和酮戊二酸；反应是易于可逆的，且反应方向(朝向谷氨酸盐的脱氨或谷氨酸形成)取决于不同底物的相对浓度。当铵的浓度上升时，使得反应以从酮戊二酸盐形成谷氨酸的方向进行。当血铵上升时，由于已经超过了通过形成谷氨酸和谷氨酰胺来解毒血铵的容量，因此发生氨中毒。
通过血纤蛋白、明胶和其他蛋白上由转谷氨酰胺酶促进的交联反应释放了氨分子。因此，在极端情形中，在局部生理环境中实现大量的mTG交联引起氨的毒性水平的释放。
在生理环境中，诸如可植入的和/或手术环境中使用明胶-mTG组合物的实施方案中，优选地，通过在明胶-mTG组合物中引入氨清除剂、氨结合剂或其他氨中和剂将氨的局部水平降到低于可能有害的阈值。这种剂可以被包括在明胶组分或mTG组分中，明胶组分与mTG组分混合以形成明胶-mTG组合物。
这种剂的非限制性实例是二糖乳果糖。乳果糖是未被肠酶水解的合成二糖。乳果糖通过酸化肠的内容物来抑制细菌氨产生。乳果糖促进结肠菌群的生长。生长的生物质利用来自氨基酸的氨和氮合成细菌蛋白，细菌蛋白又抑制蛋白降解成NH3。乳果糖通过抑制细菌脲降解并缩短结肠传输时间而产生了较少的氨，因而缩短了可用于产生氨的时间并加快了氨的消除。(Deglin JH等人。Lactulose.于Davis′s drug guide for nurses(戴维斯护士药物指南)(第9版，2003)中(第589-590页)。Philadelphia：F.A.Davis)。乳果糖可从Solvay SA(Brussels)以及其他供应商购得。
本发明的另一个实施方案任选地且优选地以氨中毒的治疗中的四种形式的强阳离子交换树脂的混合物AmberliteTMIR-120(dvancedBiosciences，Philadelphia，PA)为特征。当具有750mEq总量的此树脂混合物使用在体外循环系统中时，其被认为在纠正试验狗的血氨过多方面是有效的且被认为不伴随任何不良反应。(Juggi JS等人，In-Vivo Studies with a Cation Exchange Resin Mixture in the Removal of Excessive Ammonium from the Extracorporeal Circulation System(在从体外循环系统中去除过量氨的阳离子交换树脂混合物的体内研究)。ANZ J Surg1968；38(2)：第194-201页)。
本发明的另一个实施方案任选地且优选地以皂苷，且特别是丝兰皂苷或丝兰属植物的糖部分衍生物为特征，它们都已经证明了氨结合能力(Hussain I，Ismail AM，Cheeke PR.Animal Feed Science and Technology(动物饲料科学和技术)，1996；62(2)，第121-129页)。
本发明的另一个实施方案任选地且优选地以苯乙酸钠和苯甲酸钠溶液作为氨清除剂为特征。在非限制性的实例中，这种溶液是以商品名(Medicis，Scottsdale，AZ)市售的，其由10％的苯乙酸钠、10％的苯甲酸钠的溶液组成。
在本发明的另一个实施方案中，将L-谷氨酰胺(L-Gin)或L-谷氨酸(L-Glu)添加到蛋白-交联剂组合物中，优选添加到组合物的蛋白组分中。L-Gin和L-Glu刺激细胞中的氨代谢成脲，且还抑制从细胞摄取氨，并促进氨从细胞挤出(Nakamura E，Hagen SJ.Am J of Phys.GI and LiverPhys，2002；46(6)，第G1264-G1275页)。不希望受到一种假设的限制，释放氨、L-Gln和/或L-Glu的原位交联过程在通过减少环境中的游离氨的量来中和释放的氨方面具有功效，由此减少了由细胞吸收的量并加速细胞代谢氨的固有能力。通过引入谷氨酸来螯合由mTG交联反应释放的氨显著改进了此组织对在大鼠皮下植入mTG交联的明胶组合物的开始的14天内的反应，正如关于下面示例性的、非限制性的实例所描述的。
着色剂
在本发明的另一个实施方案中，向蛋白或交联剂溶液中添加生物相容的着色剂以改进应用时组合物的可视性。
额外的止血剂
根据本发明的一些实施方案，上面描述的任一种组合物还可以包括额外的止血剂，止血剂可以选自由凝血因子、凝血引发剂、血小板激活剂、血管收缩剂和血纤蛋白溶解抑制剂组成的组。这些的实例包括但不限于肾上腺素、肾上腺色素、胶原、凝血酶、血纤蛋白、血纤蛋白原、氧化纤维素以及壳聚糖。
冻干产物的构型
在本发明的实施方案中，形成了干燥的或冷冻的组合物，其中可交联蛋白或多肽与无毒性交联剂充分混合以形成均匀的溶液并立即降低溶液的温度以防止交联过程的结束。接着冷冻或冷冻并干燥混合的组合物以形成新的、均匀的组合物。
此类型的组合物具有很多效用，因为其允许精确地控制使组合物原位成为粘结凝胶所耗费的时间。正如可以在实施例中呈现的粘度计图中看到的，可以非常精确地确定发生交联耗费的时间。由于诸如mTG的一些交联剂的活性是温度依赖性的，如果将组合物的温度降到低于交联剂的活化温度，那么可以有效地停止交联过程。在mTG的情形中，交联活性在低于约20℃的温度下基本停止。
在本发明的优选实施方案中，在组合物达到其极限机械强度的30％之前终止反应。
在本发明的更优选实施方案中，在组合物达到其极限机械强度的15％之前终止反应。
在本发明的甚至更优选的实施方案中，在组合物达到其极限机械强度的5％之前终止反应。
由于本实施方案的缘故，极限机械强度被定义为已经将组合物的所有可交联材料交联到充足的程度以便不会自由流动的点。在粘度计测试中，此点大约在10M cP时出现。
在本发明的实施方案中，形成干燥组合物，其中干交联剂材料充分分散遍布可交联蛋白或多肽的冻干组合物。
在优选的实施方案中，蛋白是明胶且在交联剂分散遍布这种多孔泡沫之前，冻干未交联的明胶泡沫。
在另一个优选的实施方案中，向明胶泡沫中添加干交联剂材料，使得交联剂不会溶解到泡沫中(即，在冻干之前，未观察到交联活性)。
出人意料地发现，可重构的泡沫可以任选地由足够稳定的明胶溶液形成，以便允许冻干泡沫形式的明胶，无需添加任何稳定剂或交联剂。
在本发明的用于形成这种泡沫的优选的示例性实施方案中，制备明胶溶液并保持在明胶溶液呈液体形式的温度下。当将明胶溶液冷却至低于其溶胶-凝胶转变点的温度时，使明胶溶液经受延长的且优选连续的泡沫化过程。
明胶溶液的浓度优选在0.5％-20％w/w，更优选在5％-10％w/w的范围内。
明胶溶液的初始温度是30℃-70℃，优选30℃-50℃，且更优选35℃-40℃。泡沫化过程期间的环境温度是0℃-25℃，优选15℃-25℃且更优选20℃-23℃。泡沫化过程的非限制性实例包括搅拌、混合、共混和气体的注入。
优选地，泡沫化过程包括搅拌或混合。
一种或多种泡沫化技术可以任选地用于泡沫化过程。可选择地，可以任选地在不同的条件下多次使用一种泡沫化技术：如，轻微地搅拌以产生低水平的泡沫，然后剧烈地搅拌以在明胶泡沫中实现最大程度的通气。
在任选的实施方案中，当泡沫化结束后，优选地将明胶泡沫转移到已经被冷却至比泡沫化过程结束时的明胶泡沫的温度低的容器中。
在另一个实施方案中，当泡沫化过程结束时，任选地且优选地立即快速冷却明胶泡沫。快速冷却的非限制性实例是在泡沫化过程之后，使明胶泡沫立即暴露于液氮。
在优选的实施方案中，干凝胶泡沫包含小于约12％的水分。在更优选的实施方案中，干凝胶泡沫包含小于约8％的水分。
在另一个实施方案中，当泡沫化结束时，没有任选地立即(至多5分钟内)通过冷却或其他方法来进一步稳定明胶泡沫，使得泡沫部分缩陷，导致在泡沫的底部上形成明胶泡沫的更密实的层。
在上面的实施方案中，更密实的层任选地包括小于冻干明胶组合物厚度的约50％，优选小于约35％，且更优选小于约20％。
正如使用在本文中的，密度指的是每体积冻干组合物，明胶重量的增加。这种增加可以任选地低至5％，但优选大于约10％且更优选大于约20％。
不希望受限于一种假设或受限于封闭的名单，但认为明胶泡沫的这种密实层赋予冻干明胶组合物机械强度，而不会影响干组合物的顶部部分的重构曲线。
实施例
现在参考下面的实施例，这些实施例与上文的描述一起以非限制性的方式阐释了本发明的一些实施方案。
实施例1：使用乙酸盐缓冲液和柠檬酸盐缓冲液材料的交联时间的比较
材料
本实验中采用以下材料：300Bloom的A型猪明胶(Sigma，St.Louis，Missouri)、Medex明胶-300Bloom，70目，药用明胶[Medex，Englandbatch]、98％脲[Alfa Aesar，Lancester]、氯化钙97％干粉[Alfa Aesar，Lancester]、0.1M乙酸钠缓冲液(pH6.1)、0.5M柠檬酸钠脱水物99％[AlfaAesar，Lancaster]、D-山梨糖醇97％[Sigma，St.Louis，Missouri]、10％微生物转谷氨酰胺酶-ACTIVA-TG10％(10％酶，90％麦芽糖糊精)[Ajinomoto，Japan]。
方法
配制2M钙溶液、4.5M和5M脲、0.1M乙酸钠溶液pH6.0、0.5M乙酸钠溶液pH6.0、2M柠檬酸钠溶液pH6.0以及2.36M柠檬酸溶液的储备溶液。
配制含2M脲、1M钙、0.1M乙酸钠的25％(w/w)明胶溶液(溶液A)。通过将mTG溶于下列不同溶液中配制7.5％(w/w)微生物转谷氨酰胺酶(10％w/w mTG-ACTIVA-TG)溶液：
溶液1-0.5M乙酸钠
溶液2-0.5M柠檬酸钠
粘度计测试
在每一次粘度计测试中，将25mL明胶溶液和12.5mL mTG溶液混合在50mL烧杯中。然后追踪混合的明胶-mTG溶液经历胶凝时的粘度。通过记录每个测试组达到最大粘度的30％和90％所需的时间来比较不同的测试组，所述最大粘度能够在比速下且具有用于那个测试的特定转子的粘度计所记录。
在本实验中，采用具有T-E95″t-bar″转子的DV II+PRO数字粘度计(Brookfield Engineering，Middleboro，MA)。helipath粘度计台用于在粘度计测试过程中维持转子的垂直运动。Helipath沿1em的路径移动。粘度计读数由粘度计输出并采用HyperTerminal软件以每秒读取1次的速率读数。用于粘度计测试的转子的转速为0.5rpm。在此转速下，采用T-E95转子的最大可记录粘度是10×106cP，这意味着30％点等同于3×106cP，且90％点等同于9×106cP。
在粘度计测试的整个过程中，将烧杯浸没在37℃的水浴中。在整个测试中还记录烧杯中的平均温度以确保测试组之间的一致性。
结果
图2和表1显示了与0.5M乙酸钠(溶液1)中的和与0.5M柠檬酸钠(溶液2)中的7.5％(w/w)ACTIVA-TG10％反应的1M钙、2M脲(溶液A)中的25％(w/w)明胶的粘度变化。
表1-mTG缓冲液粘度随时间变化的比较
此实验的结果证明了与0.5M柠檬酸钠中的mTG相比，采用0.5M乙酸钠中的mTG导致明显较短的交联时间。
实施例2：不同缓冲液和缓冲液离子浓度对交联时间的影响
材料
本实验中采用以下材料：300Bloom、A型药用猪明胶(70目)[ItalGelatine，Santa Vittoria d′Alba，Italy]、脲-最少99.5％[Sigma，St.Louis]、氯化钙97％干粉[Alfa Aesar，Lancester]、柠檬酸钠脱水物99％[Alfa Aesar，Lancaster]、无水柠檬酸[Frutarom，Israel]、乙酸钠三水合物[Sigma，St.Louis]、冰醋酸分析级[Frutarom，Israel]和10％微生物转谷氨酰胺酶-ACTIVA-TG10％(10％酶，90％麦芽糖糊精)[Ajinomoto，Japan]。
方法
配制下列储备溶液：2M钙溶液、4M和4.5M脲溶液、0.1M乙酸钠溶液、2M柠檬酸钠溶液以及2.36M柠檬酸溶液。
配制2M脲和1M CaCl2中的25％(w/w)明胶溶液(溶液A)。
配制7.5％(w/w)微生物转谷氨酰胺酶溶液并溶解到下面的6种溶液中：
溶液1-0.1M乙酸钠
溶液2-0.25M乙酸钠
溶液3-0.5M乙酸钠
溶液4-0.25M柠檬酸钠
溶液5-0.5M柠檬酸钠
溶液6-0.6M柠檬酸钠
为了确定交联(XL)时间，将2mL明胶溶液与1mL每一种类型的mTG溶液混合。对于每一种类型的mTG溶液来说，在12孔培养板的不同孔中配制3份单独的样品。充分混合溶液以形成均匀的溶液，然后由混合溶液形成粘的凝胶物质的时间来确定交联时间。
结果
如表2所示，发现无论采用乙酸钠缓冲液还是柠檬酸钠缓冲液，mTG缓冲液中较低的离子浓度(0.1M而不是0.5M)导致更快的交联。
表2：采用不同离子强度的mTG溶液的明胶交联结果。XL指交联。
表2的结果显示了离子强度和交联时间之间的直接关联性，其中mTG缓冲溶液中较低的离子强度导致更快的交联。乙酸钠缓冲液中的mTG溶液比柠檬酸钠缓冲液中的mTG溶液交联更快且形成更均匀的凝胶。含柠檬酸钠缓冲液的酶溶液交联更慢且形成非均匀的凝胶，可能是由于柠檬酸钠引起了物理明胶胶凝。然而，由柠檬酸钠中的mTG形成的凝胶的柔性和粘合性比用乙酸钠形成的凝胶更强。
实施例3：明胶缓冲液的离子强度对交联时间的影响
材料
本实验中采用以下材料：300Bloom、A型猪明胶(Sigma，St.Louis，Missouri)、乙酸钠-0.1M乙酸钠缓冲液(pH6.0)、乙酸钠-0.25M乙酸钠缓冲液(pH6.0)、乙酸钠-0.5M乙酸钠缓冲液(pH6.0)[Sigma Aldrich]以及10％微生物转谷氨酰胺酶-ACTIVA-TG10％(10％酶、90％麦芽糖糊精)[Ajinomoto，Japan]。
方法
配制0.1M乙酸钠缓冲液中的25％(w/w)明胶(溶液A)、0.25M乙酸钠缓冲液中的25％(w/w)明胶(溶液B)、0.5M乙酸钠缓冲液中的25％(w/w)明胶(溶液C)、0.1M乙酸钠缓冲液中的7.5％(w/w)ACTIVA-TG(溶液1)和0.25M乙酸钠缓冲液中的7.5％(w/w)ACTIVA-TG(溶液2)。
结果
发现明胶缓冲液的离子浓度升高到0.25M-0.5M将减少交联时间。然而，当明胶缓冲液和mTG缓冲液都是高离子浓度时，并不形成凝胶。此外，发现由高离子浓度缓冲液中的明胶溶液形成的交联凝胶比低离子浓度形成的凝胶的热稳定性差。
如表3、4和5所阐释，增加含0.1M mTG溶液的明胶溶液的离子强度减少了交联时间，从而改进了反应时间。与0.1M乙酸钠形成的凝胶相比，未观察到0.25M和0.5M形成的凝胶的显著差异。
随着明胶溶液的增大的离子强度的mTG溶液的增大的离子强度提供了具有较长凝胶形成反应时间的机械性较差的交联凝胶。
表3：转变温度检测
表4：交联检测-采用mTG溶液1(0.1M乙酸钠)的实验结果的概述
表5：采用mTG溶液2(0.25M乙酸钠)的实验结果的概述
实施例4：氯化钙和脲对转变点的影响
材料
本实验中采用以下材料：300Bloom的A型猪明胶(Sigma，St.Louis，Missouri)、98％脲[Alfa Aesar，Lancester]、氯化钙97％[Alfa Aesar，Lancester]、PBS-无钙和镁的Dulbecco磷酸盐缓冲盐水[Biological Industries，Israel]、微生物转谷氨酰胺酶ACTIVA-WM，麦芽糖糊精中1％酶粉[Ajinomoto，Japan]、10％微生物转谷氨酰胺酶-ACTIVA-TG10％(10％酶、90％麦芽糖糊精)[Ajinomoto，Japan]。
方法
配制5M钙溶液、5M脲溶液的储备溶液。通过稀释脲和钙储备溶液来配制25％(w/w)明胶溶液、脲和钙溶液。
对照A-明胶溶于PBS中。
对照钙A-明胶溶于2M钙中。
对照钙B-明胶溶于1M钙中。
溶液C-明胶溶于包含1M钙和2M脲的PBS溶液中。
溶液D-明胶溶于包含1M钙和3M脲的PBS溶液中。
溶液E-明胶溶于包含0.5M钙和2M脲的PBS溶液中。
溶液F-明胶溶于包含0.5M钙和3M脲的PBS溶液中。
结果
如表6所示，脲和钙对降低25％(w/w)明胶溶液的转变点具有协同作用。含1M氯化钙和2M脲的25％(w/w)明胶溶液在室温下具有低粘度。含0.5M氯化钙和3M脲的25％(w/w)明胶溶液在室温下是粘的。含脲的明胶凝胶的交联提供了较不结实的凝胶。脲的浓度越高，所形成的凝胶越不结实。明胶溶液中存在钙增加了交联凝胶的强度。
表6：在24℃下明胶凝胶的溶胶-凝胶转变结果的概述
实施例5
进行优化试验以确定用于明胶和mTG溶液的每一种组合的交联剂的合适量
材料
本实验中采用以下材料：Gelita 300Bloom、A型猪明胶(Medex，England)、99.5％脲(Sigma-Aldrich，St.Louis)、氯化钙(Alfa Aesar，Lancester)、乙酸钠三水合物(Sigma-Aldrich，St.Louis)、100％乙酸(Ridel-DeHaen)、ACTIVA TG(10％蛋白、90％麦芽糖糊精)微生物转谷氨酰胺酶(Ajinomoto，Japan)、柠檬酸钠(Sigma-Aldrich，St.Louis)、柠檬酸一水合物(Sigma-Aldrich，St.Louis)、D-山梨糖醇，97％(Sigma Aldrich St.Louis，MO)。
储备溶液制备：
在pH6.0的0.1M乙酸钠中制备2M钙溶液。用1号Whatman滤纸过滤该溶液。
在pH6.0的0.1M乙酸钠中制备4M和5M脲溶液。用具有22μm的乙酸纤维素膜的250mL过滤系统过滤该溶液并保持冷藏。
制备pH6.0的0.1M乙酸钠溶液且用具有22μm的乙酸纤维素膜的250mL过滤系统过滤并保持冷藏。
制备2M柠檬酸钠溶液。
制备2.36M柠檬酸溶液。
明胶溶液制备：
将25％(w/w)明胶溶液制备在不同的添加剂中，如下：
溶液A-在2M脲、1M氯化钙、0.1M乙酸钠中，pH6.0。
溶液B-在4.5M脲、0.1M乙酸钠中，pH6.0。
为了完全溶解明胶粉末，将溶液加热至50℃并剧烈搅拌。然后将溶液送至24℃孵育箱并保持过夜(ON)直到使用。
微生物转谷氨酰胺酶制备：
通过将不同浓度的微生物转谷氨酰胺酶(mTG)(ACTIVA-TG10％)溶解于不同的溶液中来制备mTG溶液。溶液现用现配。为了完全溶解mTG，必须用塑料棒剧烈搅拌溶液。制备的溶液如下：
溶液1-0.1M乙酸钠中7.5％(w/w)ACTIVA-TG10％
溶液2-0.1M乙酸钠中5％(w/w)ACTIVA-TG10％
溶液3-0.1M乙酸钠中6％(w/w)ACTIVA-TG10％
溶液4-0.1M乙酸钠中7％(w/w)ACTIVA-TG10％
溶液5-含0.1M乙酸钠的3∶1的山梨糖醇(山梨糖醇干重对明胶干重的比)中5％(w/w)ACTIVA-TG10％
溶液6-含0.1M乙酸钠的3∶1的山梨糖醇中6.25％(w/w)ACTIVA-TG10％
溶液7-含0.1M乙酸钠的3∶1的山梨糖醇中7.5％(w/w)ACTIVA-TG10％
溶液8-0.1M柠檬酸钠中10％(w/w)ACTIVA-TG10％
溶液9-0.1M柠檬酸钠中12.5％(w/w)ACTIVA-TG10％
溶液10-0.1M柠檬酸钠中2.5％(w/w)ACTIVA-TG10％
溶液11-0.1M柠檬酸钠中5％(w/w)ACTIVA-TG10％
溶液12-0.1M柠檬酸钠中7.5％(w/w)ACTIVA-TG10％
溶液13-0.1M柠檬酸钠中3％(w/w)ACTIVA-TG10％
溶液14-含0.5M柠檬酸钠的3∶1的山梨糖醇(山梨糖醇对明胶的比)中5％(w/w)ACTIVA-TG10％
溶液15-含0.5M柠檬酸钠的3∶1的山梨糖醇(山梨糖醇对明胶的比)中6.25％(w/w)ACTIVA-TG10％
粘度计测试
粘度计实验依据上面描述的程序进行。
结果
经由粘度计检测溶液并测定每种明胶-mTG溶液的最佳酶浓度。检测每种溶液在整个实验过程中的平均温度、达到扭矩的30％的时间和达到扭矩的90％的时间。
图3显示了上述不同制剂达到粘度为3×106cP(完全成形的凝胶的30％)和粘度为9×106cP(完全成形的凝胶的90％)的时间。
图3A显示了上面用0.1M乙酸钠中的4.5M脲的25％明胶溶液达到各粘度的时间。前两个柱分别指5％浓度的mTG达到扭矩的30％和90％的时间；接着的两个柱分别指6％浓度的mTG达到扭矩的30％和90％的时间；而最后两个柱分别指7％浓度的mTG达到扭矩的30％和90％的时间。如所示，达到扭矩的30％和90％的时间随mTG浓度的增加而缩短，这显示mTG量的增加会加快交联。
图3B显示了上面用0.1M乙酸钠中的4.5M脲，和以3∶1的山梨糖醇∶明胶比存在的山梨糖醇的25％明胶溶液达到各粘度的时间。前两个柱分别指6.3％浓度的mTG达到扭矩的30％和90％的时间；而最后两个柱分别指7.5％浓度的mTG达到扭矩的30％和90％的时间。同样，达到扭矩的30％和90％的时间随mTG浓度的增加而缩短。
图3C显示了上面用0.1M乙酸钠中的2M脲、1M钙，且具有7.5％的单一浓度的mTG的25％明胶溶液达到各粘度的时间。左柱显示了达到扭矩的30％的时间而右柱显示了达到扭矩的90％的时间。在这些条件下也发现了有效的交联。
图3D显示了上面用0.1M乙酸钠中的4.5M脲和1M钙，以及以3∶1的山梨糖醇∶明胶比存在的山梨糖醇的25％明胶溶液达到各粘度的时间。前两个柱分别指5％浓度的mTG达到扭矩的30％和90％的时间，接着的两个柱分别指6.3％浓度的mTG达到扭矩的30％和90％的时间以及最后两个柱分别指7.5％浓度的mTG达到扭矩的30％和90％的时间。与图3C相比，山梨糖醇明显产生更快速度的交联，因为达到扭矩的时间显著缩短，尽管这仍然至少在某种程度上取决于mTG的浓度。
图3E显示了上面用4.5M脲的25％明胶溶液达到各粘度的时间，其中明胶溶液是在0.1M乙酸钠缓冲液中，且mTG是在0.5M柠檬酸钠缓冲液中。前两个柱分别指7.5％浓度的mTG达到扭矩的30％和90％的时间，接着的两个柱分别指5％浓度的mTG达到扭矩的30％和90％的时间以及最后两个柱分别指2.5％浓度的mTG达到扭矩的30％和90％的时间。无钙时脲的增加仍然导致更快速度的交联，因为达到扭矩的时间显著缩短，尽管这仍然至少在某种程度上取决于mTG的浓度。
图3F显示了上面用0.1M乙酸钠和0.5M柠檬酸钠中的4.5M脲，且以对明胶3∶1的比添加山梨糖醇的25％明胶溶液达到各粘度的时间。两个柱分别指5％浓度的mTG达到扭矩的30％和90％的时间。山梨糖醇显示出降低交联的速度，且因此缩短达到无论是扭矩的30％还是90％的时间。
实施例6
氢氧化钙对蛋白溶液转变点的影响
本实施例显示了氢氧化钙对明胶溶液的溶胶-凝胶转变点的影响。显示出氢氧化钙会降低此转变点。
材料
本实验中采用以下材料：300Bloom、A型猪明胶(Gelita，Sioux City)、氢氧化钙(Sigma-Aldrich，St.Louis)、脲98％(Alfa Aesar，Lancester)、乙酸钠三水合物(Sigma-Aldrich，St.Louis)、乙酸(Frutaron，Israel)。
方法
制备0.1M乙酸钠缓冲液pH6.0、4M脲和2M氢氧化钙的储备溶液。
制备下列溶液：
对照-0.1M乙酸钠中25％(w/w)明胶溶液
溶液A-2M CaOH中25％(w/w)明胶
溶液B-2M脲、1M CaOH中25％(w/w)明胶溶液
溶液C-0.5M CaOH中25％(w/w)明胶溶液
所有的溶液均加热到50℃同时应用持续的搅拌以确保形成均匀的溶液。获得均匀的溶液后，将所有的溶液转移至22℃环境。2小时后，手动触摸溶液以评估其物理状态(液体或凝胶)。
结果
溶液A和B在22℃下为液体形式，而对照溶液和溶液C为凝胶形式，这表明氢氧化钙能降低明胶溶液的溶胶-凝胶转变点，并且这种影响是剂量依赖性的。
实施例7
钙螯合剂对明胶溶液的mTG交联的影响
在下面的实施例中描述了对mTG促进的明胶溶液交联的影响，其中向mTG溶液中加入EDTA或柠檬酸钠。
材料
本实验中采用以下材料：300Bloom的A型猪明胶(Sigma，St.Louis，Missouri)、98％脲[Alfa Aesar，Lancester]、氯化钙97％[Alfa Aesar，Lancester]、PBS-无钙和镁的Dulbecco磷酸盐缓冲盐水[Biological Industries，Israel]、乙二胺四乙酸、柠檬酸钠脱水物99％[Alfa Aesar，Lancaster]、无水柠檬酸[Frutarom，Israel]、微生物谷氨酰胺转胺酶ACTIVA-WM，麦芽糖糊精中1％酶粉[Ajinomoto，Japan]、10％微生物谷氨酰胺转胺酶-ACTIVA-TG10％(10％酶、90％麦芽糖糊精)[Ajinomoto，Japan]。
方法
制备5M钙溶液、5M脲溶液和2M EDTA的储备溶液。通过稀释脲和钙储备溶液来制备25％(w/w)明胶溶液、脲和钙溶液。
对照A-明胶溶于PBS中。
对照钙A-明胶溶于2M钙中。
对照钙B-明胶溶于1M钙中。
溶液C-明胶溶于含1M钙和2M脲的PBS溶液中。
溶液D-明胶溶于含1M钙和3M脲的PBS溶液中。
溶液E-明胶溶于含0.5M钙和2M脲的PBS溶液中。
溶液F-明胶溶于含0.5M钙和3M脲的PBS溶液中。
溶液G-明胶溶于含4M脲的PBS溶液中。
0.2％w/w mTG溶液(20％w/w ACTIVA-WM溶液：1％mTG、99％麦芽糖糊精)制备如下：
mTG对照-mTG溶于PBS中。
溶液1-mTG溶于含2M EDTA的PBS溶液中。(注意：当将mTG溶于EDTA中时，将形成略微白色的不透明溶液。mTG形成块状物，之后会溶于溶液中。)
溶液2-mTG溶于含1.5M EDTA的PBS溶液中。
溶液3-mTG溶于含0.75M EDTA的PBS溶液中。
溶液4-mTG溶于含2M柠檬酸钠的溶液中。
溶液5-mTG溶于含1M柠檬酸钠的溶液中。
溶液6-mTG溶于含0.5M柠檬酸钠的溶液中。
制备1％w/w浓缩的mTG溶液(10％w/w ACTIVA-WM溶液：10％mTG、90％麦芽糖糊精)：
对照-浓缩的mTG溶于PBS中。
溶液7-浓缩的mTG溶于0.5M柠檬酸钠溶液中。
结果
下面的表7和8概述了明胶凝胶与mTG交联(CL)的实验结果。表7描述了明胶凝胶与含EDTA的mTG交联，而表8描述了明胶凝胶与含柠檬酸钠的mTG交联。表9概述了柠檬酸钠对明胶溶液的影响。
表7：采用含EDTA的mTG的明胶溶液交联
表8：采用含柠檬酸钠的mTG的明胶溶液的交联
表9：采用含柠檬酸钠的mTG的明胶溶液的交联
如上表所示，EDTA物理交联明胶溶液。高浓度的EDTA(0.75M-2M)立即交联明胶溶液。与EDTA交联的明胶凝胶无粘合性。当与明胶混合时，EDTA形成非常结实且柔性的凝胶。EDTA浓度越高，形成的凝胶越结实。在EDTA浓度中等时(0.5M-0.75M)，发生非均匀交联。这可能是由于试剂未充分混合。在EDTA浓度较低时(低于0.5M)，没有观察到明胶溶液的物理交联且明胶略微变粘。明胶溶液与含EDTA的mTG溶液交联产生了结实柔性的凝胶，其具有粘合性。
柠檬酸钠物理交联25％(w/w)明胶溶液。形成的凝胶在37℃下是稳定的。柠檬酸钠形成无粘合性的高度柔性、结实的凝胶。含有或不含添加剂下，1M和2M柠檬酸钠溶液立即交联25％(w/w)明胶溶液。在不含添加剂下，浓度范围在0.5M-0.75M之间的柠檬酸钠溶液立即交联明胶。然而，含脲的明胶溶液仅仅变粘。根据本文提供的实验，采用浓度范围是0.1M到0.5M的柠檬酸钠溶液并不导致物理胶凝。高于这些浓度时，柠檬酸钠浓度越高，形成的凝胶越结实。结果表明存在或不存在mTG时，柠檬酸钠用作明胶溶液的交联剂。所形成的凝胶在37℃下的稳定性表明这些凝胶可以在诸如手术缝合的应用中在身体腔内原位交联。由于柠檬酸钠未显示出与明胶形成粘合性的凝胶，那么可优选或考虑柠檬酸钠和mTG的组合。明胶溶液与含0.5M柠檬酸钠的mTG溶液交联形成高度柔性、结实且粘合性的凝胶。
实施例8
Calgon对明胶溶液的mTG交联的影响
正如本文中使用的，术语“Calgon”指无定形多磷酸钠，诸如，如六偏磷酸钠。
材料
采用以下材料：300BloomA型猪明胶(Sigma，St.Louis，Missouri)、98％脲[Alfa Aesar，Lancester]、如前所述制备0.1M乙酸钠缓冲液(pH6.1)、0.5M柠檬酸钠脱水物99％[Alfa Aesar，Lancaster]、氯化钙97％，干粉[AlfaAesar，Lancester]、Calgon[Global Environmental Solutions，INC]、10％微生物谷氨酰胺转胺酶-ACTIVA-TG10％(10％酶、90％麦芽糖糊精)[Ajinomoto，Japan]。
制备乙酸钠中的4M脲储备溶液和4M氯化钙的储备溶液。
方法
制备下列对照和实验溶液：
明胶溶液A，含4M脲的25％(w/w)明胶
明胶溶液B，含2M CaCl2的25％w/w)明胶
明胶溶液C，含2M脲1M CaCl2的25％(w/w)明胶。
明胶溶液D，含2M脲2M CaCl2的25％(w/w)明胶。
mTG溶液1，0.1M Na-Ac缓冲液中0.5％mTG-5％(w/w)ACTIVA-TG10％
mTG溶液2，含10％wt Calgon的0.5％mTG-5％(w/w)ACTIVA-TG10％
mTG溶液3，含5％wt Calgon的0.5％mTG-5％(w/w)ACTIVA-TG10％
mTG溶液4，含5％wt Calgon的1.0％mTG-10％(w/w)ACTIVA-TG10％
mTG溶液5，含5％wt Calgon的2.0％mTG-20％(w/w)ACTIVA-TG10％
mTG溶液6，含5％wt Calgon0.1M乙酸钠缓冲液中的1.0％mTG-10％(w/w)ACTIVA-TG10％
mTG溶液7，含5％wt Calgon0.5M柠檬酸钠缓冲液中的1.0％mTG-10％(w/w)ACTIVA-TG10％。
由充分混合2mL明胶溶液与1mL mTG溶液来主观测试通过不同明胶溶液与不同mTG溶液的混合物形成的凝胶的凝胶特性。通过将明胶时间评估为整个明胶物质形成粘结性的固体凝胶时的时间来追踪胶凝时间。
结果
使用Calgon的初始测试证明其适度缩短了无钙的对照溶液的交联时间。然而，未发现机械性能的改进。Calgon导致产生粘合性和弹性极高的凝胶，但也证明会显著增加不含钙添加剂的溶液的交联时间。此外，Calgon似乎在较低浓度时表现得更好，因为5％wt的Calgon溶液比等同的10％wtCalgon溶液更好且更快地产生凝胶。
表10：胶凝时间和交联凝胶的描述
在进一步的测试中，Calgon有助于产生粘合性和弹性极高的凝胶，但也显著增加了含钙添加剂的溶液的交联时间。应该注意，由Calgon形成的凝胶的机械性能(粘合性、弹性、强度)会保持长时间段(45+分钟)，并随着时间延长而改善。与含2M脲和2M钙的25％w/w明胶相比，采用含0.1M乙酸钠或0.5M柠檬酸钠的5％wt Calgon的10％w/w mTG溶液引起含2M脲1M钙的25％w/w明胶的缩短的交联时间(更快的反应)。相比含0.5M柠檬酸钠的mTG溶液，含0.1M Na-Ac的mTG溶液与含2M脲2M钙的25％w/w明胶溶液更快形成交联凝胶。
表11：胶凝时间和交联凝胶的描述
实施例9采用脲酶逆转脲的溶胶-凝胶转变点降低影响
材料
本实验中采用以下材料：Gelita 275BloomA型猪明胶(Gelita，SiouxCity)、98％脲(Alfa Aesar，Lancester)、乙酸钠三水合物(Sigma-Aldrich，St.Louis)、100％乙酸(Ridel-De Haen)、III型脲酶：来源于Jack Beans(Sigma-Aldrich，St.Louis)。
方法
制备0.1M乙酸钠缓冲液pH6.0和4.5M脲溶液的储备溶液。
制备0.1M醋酸钠中的25％w/w明胶溶液(溶液A)和含4.5M脲和0.1M乙酸钠的25％w/w明胶溶液(溶液B)。
在获得均匀的溶液后，将一半的溶液B移到另外一个添加了0.125g脲酶(5000单位)的烧杯中(溶液C)并持续搅拌。然后将溶液A、B和C移至22℃环境中。
结果
22℃下60分钟后，发现溶液B仍然呈粘性的液体形式，而溶液C和A转变成凝胶形式。
这些结果表明脲酶逆转了尿添加到明胶溶液中的溶胶-凝胶转变点降低作用。
实施例10
山梨糖醇对交联凝胶柔性的影响；山梨糖醇对加快mTG交联反应的影响
材料
采用以下材料：Gelatin-300Bloom的A型猪明胶(Sigma，St.Louis，Missouri)、98％脲[Alfa Aesar，Lancester]、0.1M乙酸钠缓冲液(pH6.1)、氯化钙97％[Alfa Aesar，Lancester]、柠檬酸钠脱水物99％[Alfa Aesar，Lancaster]、无水柠檬酸[Frutarom，Israel]、10％微生物转谷氨酰胺酶-ACTIVA-TG10％(10％酶、90％麦芽糖糊精)[Ajinomoto，Japan]。
方法
制备下列溶液：制备Na-Ac中4M脲溶液、4M钙溶液、2M柠檬酸钠溶液。制备0.5M柠檬酸钠。
明胶溶液A-含4M脲的25％(w/w)明胶。
明胶溶液B-含2M脲和1M Ca的25％(w/w)明胶。
mTG溶液1-含1∶1(w/w)(相对于明胶溶液中的明胶干重)的山梨糖醇和0.5M柠檬酸钠的0.5％w/w mTG溶液(5％(w/w)ACTIVA-TG溶液)。
mTG溶液2-含2∶1(w/w)(相对于明胶溶液中的明胶干重)的山梨糖醇和0.5M柠檬酸钠的0.5％w/w mTG溶液(5％(w/w)ACTIVA-TG溶液)。
mTG溶液3-含3∶1(w/w)(相对于明胶溶液中的明胶干重)的山梨糖醇和0.5M柠檬酸钠的0.5％w/w mTG溶液(5％(w/w)ACTIVA-TG溶液)。
结果
本实验实施例中的实验数据证实了山梨糖醇进一步增强了用柠檬酸钠缓冲液中的mTG制备的凝胶的柔性。
如表12-14阐释，不论是与4M脲中25％(w/w)明胶，还是与2M脲和1M CaCl2中25％(w/w)明胶，在mTG溶液中采用山梨糖醇和柠檬酸钠都证明产生相当柔性的凝胶。因而，山梨糖醇可以起到增强柔性并维持mTG活性的作用。还发现增大山梨糖醇的浓度导致更快的交联反应。
表12：与0.5％mTG溶液(5％(w/w)ACTIVA-TG10％)、山梨醇对明胶的比为1∶1(w/w)和0.5M Na交联
表13：与0.5％mTG溶液(5％(w/w)ACTIVA-TG10％)、山梨糖醇对明胶的比为2∶1(w/w)和0.5M Na交联
表14：与0.5％mTG溶液(5％(w/w)ACTIVA-TG10％)、山梨糖醇对明胶比为3∶1(w/w)和0.5M柠檬酸钠交联
实施例11
阿拉伯树胶、瓜尔胶、PVA、PEG6000和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)作为增塑剂
阿拉伯树胶、瓜尔胶、聚乙烯醇(PVA)、聚乙二醇(PEG)6000和PVP均为增塑剂，在溶解它们的溶液中作为间隔物。本实施例阐述了这些增塑剂可以加入到用于交联蛋白溶液的交联剂溶液中，以提高交联的蛋白溶液的柔性。
材料
本实验中采用以下材料：Gelita275Bloom的A型猪明胶(Gelita，SiouxCity)、99.5％脲(Sigma-Aldrich，St.Louis)、氯化钙(Sigma，St.Louis，Missouri)、乙酸钠三水合物(Sigma-Aldrich，St.Louis)、100％乙酸(Ridel-DeHaen)、ACTIVA TG(10％蛋白，90％麦芽糖糊精。Ajinomoto，Japan)、柠檬酸钠(Sigma-Aldrich，St.Louis)、柠檬酸一水合物(Sigma-Aldrich，St.Louis)、氯化钠(Frutarom，Israel)、阿拉伯树胶(Sigma-Aldrich，St.Louis)、PVA(Merck；Darmstadt，Germany)、PEG6000(Fluka；St.Louis，MO)、瓜尔胶(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)、Plasdone K-90形式的PVP(ISPTechnologies Inc.；Texas City，TX)。
制备下列储备溶液：0.1M Na-Ac溶液pH6.0、0.4M柠檬酸钠溶液pH6.0、0.1M Na-Ac溶液中的4.5M脲、0.1M Na-Ac中的2M CaCl2储备溶液、WFI中40％w/v的阿拉伯树胶溶液、WFI中5％w/v的瓜尔胶溶液、WFI中20％w/w的PVP溶液、WFI中5％w/v的PVA溶液、WFI中5％w/v的瓜尔胶溶液、WFI中10％w/v的PEG6000。
在3.8M脲、0.15M CaCl2和0.1M Na-Ac的缓冲液中制备12.5％w/w明胶溶液(溶液A)和25％w/w明胶溶液(溶液B)。
通过将Activa TG(10％mTG、90％麦芽糖糊精)溶解于0.4M柠檬酸钠中来制备0.375％w/w mTG粉末溶液(溶液1)和0.5％w/w mTG粉末溶液(溶液2)。
方法
以1∶1的体积比将0.375％mTG溶液(溶液1)的等分试样与每种增塑剂储备溶液混合。如果要求的增塑剂浓度低于储备溶液的浓度的一半，那么在与mTG溶液混合前先稀释增塑剂。对于每种mTG-增塑剂溶液来说，将10mL溶液与20mL明胶溶液A完全混合，然后倒入100mL烧杯中。
在混合溶液后的10分钟内，移出由100mL烧杯中30mL材料形成的明胶-mTG-增塑剂塞(plug)。然后将每种塞存放于室温下的生理盐水中24小时。
24小时存储期后，由盲试者触摸每种塞，他们以1-3(+、++或+++)的级别判断塞的柔性。记录每种塞的柔性标记。
结果
对照凝胶(无增塑剂)标记为基准柔性(+)，而其他增塑剂组获得的标记表明凝胶的柔性明显增强，如下表显示：
表15-所形成的明胶凝胶的弹性随增塑剂组分的变化
实施例12
mTG溶液的浓度对胶凝时间的影响
材料和方法
通过将10％(w/w)mTG粉末溶解于0.1M乙酸钠缓冲液中来制备mTG溶液。采用的mTG为ACTIVA WM(Ajinomoto，Japan)，包括99％麦芽糖糊精和1％蛋白。采用50KDa超滤器去除载体材料和缓冲液以将每种mTG溶液的体积浓缩至指定倍数。
单独地制备包含pH6.0的0.1M乙酸钠缓冲液中20％(w/w)的A型300Bloom的明胶的明胶溶液。
浓缩mTG溶液后，以mTG溶液∶明胶溶液为1∶2的体积比将每种mTG溶液的等分试样添加到明胶溶液的等分试样中。接着充分混合此混合物。管中的混合的组合物每隔30秒经受倒置，且胶凝时间定义为组合物停止流动时的时间。
结果
表16显示了mTG溶液的浓度对胶凝时间的影响。
表16：mTG溶液浓度对凝胶时间的影响
实施例13
微生物转谷氨酰胺酶(mTG)纯化工艺
本实施例涉及微生物转谷氨酰胺酶(mTG)的纯化工艺，其纯化在本非限制性实施例中为食品级的mTG产品，以产生比活性＞25酶单位每毫克、＞95％电泳纯度、＜5内毒素单位每克以及＜10CFU/g的mTG组合物。
采用食品级的mTG产品(ActivaTM TG；Ajinomoto，Japan)作为起始原材料。表17显示了本mTG产品的初始特性：
表17-mTG初始特性
根据下面描述的纯化工艺方案来处理本食品级产品：
表18-mTG纯化工艺方案
所得到的、纯化的mTG溶液如下所述，正如表19A所显示的：
表19A
图4显示了纯化材料的凝胶电泳结果(2-8泳道)。每一条泳道装载了不同量的纯化的mTG，范围从1μg-20μg，如表19B显示。
表19B
第1泳道显示了分子量标准品，并给出分子量。纯化的mTG由约38kd的主要条带表示。由于没有计算装载量高于6μg的密度计线性，因此6微克蛋白的条带(第5道)进行了密度计分析。下面的表20显示了结果。
表20-密度计分析结果
上面表20的结果显示样品中主条带密度包含～95.9％总蛋白。本纯化工艺证明了其可以将食品级mTG纯化为更适合医用的mTG组合物。
实施例14
采用藻酸酯、阿拉伯树胶、羧甲基纤维素(CMC)、黄原酸胶、瓜尔胶和PVP来增大交联剂材料溶液的粘度
藻酸酯、阿拉伯树胶、羧甲基纤维素(CMC)、黄原酸胶、瓜尔胶和PVP是众所周知的增粘剂，其增加了溶解它们的溶液的粘度。本实施例证明了可以向用于交联蛋白溶液的交联剂溶液中加入这些增粘剂，不会抑制导致蛋白溶液的胶凝的交联速率超过50％。甚至更令人惊讶地是，这些增粘剂中的一些加快了胶凝速度。
材料
本实验中采用以下材料：Gelita275Bloom的A型猪明胶(Gelita，SiouxCity)、99.5％脲(Sigma-Aldrich，St.Louis)、氯化钙(Sigma，St.Louis，Missouri)、乙酸钠三水合物(Sigma-Aldrich，St.Louis)、100％乙酸(Ridel-DeHaen)、AC TIVA TG(10％蛋白、90％麦芽糖糊精。Ajinomoto，Japan)、柠檬酸钠(Sigma-Aldrich，St.Louis)、柠檬酸一水合物(Sigma-Aldrich，St.Louis)、氯化钠(Frutarom，Israel)、藻酸酯(Sigma-Aldrich；St.Louis，MO)、阿拉伯树胶(Sigma-Aldrich，St.Louis)、羧甲基纤维素(高粘度和中度粘度，Sigma-Aldrich；St.Louis，MO)、黄原酸胶(Sigma-Aldrich，St.Louis)、瓜尔胶(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)、Plasdone K-90(ISP TechnologiesInc.；Texas City，TX)。
制备下列储备溶液：0.1M Na-Ac溶液pH6.0、0.4M柠檬酸钠溶液pH6.0、4.5M脲的0.1Na-Ac溶液、0.1M Na-Ac pH6.0中的2M CaCl2储备溶液、注射用水(WFI)中的5％w/v海藻酸酯溶液、WFI中的40％w/v阿拉伯树胶溶液、WFI中的4.2％w/v中度粘度CMC溶液、WFI中的2.5％w/v高粘度CMC溶液、WFI中的1.8％w/v黄原胶溶液、WFI中的5％w/v瓜尔胶溶液、WFI中的20％w/w Plasdone溶液。
在3.8M脲、0.15M CaCl2和0.1M Na-Ac缓冲液中制备12.5％w/w明胶溶液(溶液A)和25％w/w明胶溶液(溶液B)。
通过将Activa TG溶解于0.4M柠檬酸钠制备3.75％w/w mTG粉末溶液(溶液1)和0.5％w/w mTG粉末溶液(溶液2)
方法
以1∶1的体积比将3.75％mTG溶液(溶液1)的等分试样与每种增粘剂储备溶液混合。如果需要的增粘剂浓度低于储备溶液一半，那么在与mTG溶液混合前先稀释增粘剂。通过手动搅拌来定性评估每种mTG-增粘剂溶液的粘度。
对于每种mTG-增粘剂溶液，将10mL溶液与20mL明胶溶液A完全混合，然后倒入100mL烧杯中。采用DV-II+Pro粘度计(Brookfield；Middleboro，MA)追踪测定混合溶液的粘度的增加，该粘度计采用t-bar型转子沿着螺旋路径以0.5RPM速度移动。对于每一类型的mTG-增粘剂溶液，重复本实验3次。
根据明胶-mTG-增粘剂溶液达到9×106cP粘度时所花费的时间来定义交联速率。然后将每种明胶-mTG-增粘剂组合物的平均交联速率与不含增粘剂的对照明胶-mTG组合物的平均交联速率比较，以确定交联抑制百分比。
结果
观察到含Plasdone、黄原酸胶、CMC、阿拉伯树胶和藻酸酯的mTG溶液的粘度明显高于没有添加增粘剂的mTG溶液的粘度。
图5中可以观察到含有不同增粘剂的明胶-mTG溶液的相对交联速率，其显示了与对照相比的不同增塑剂溶液相对交联速率。采用粘度计定量测定交联。列标题中的百分比值指凝胶中增塑剂的浓度。
增粘剂抑制反应不超过30％。Plasdone、黄原酸胶和高粘度CMC加快了交联速率。
实施例15
谷氨酸改进了对mTG-交联明胶组合物的组织反应
材料
本实验中采用以下材料：Gelita Bloom275的A型猪明胶(Gelita，SiouxCity)、99.5％脲(Sigma-Aldrich，St.Louis)、氯化钙(Sigma，St.Louis，Missouri)、乙酸钠三水合物(Sigma-Aldrich，St.Louis)、100％乙酸(Sigma-Aldrich，St.Louis)、柠檬酸钠(Sigma-Aldrich，St.Louis)、柠檬酸一水合物(Sigma-Aldrich，St.Louis)、L-谷氨酸(Sigma-Aldrich，St.Louis)、微生物转谷氨酰胺酶-ACTIVA-TG(10％酶，90％麦芽糖糊精)(Ajinomoto，Japan)、8只Sprague-Dawley(SD)大鼠。
制备2种明胶溶液：
1)4.5M脲、0.1M乙酸钠缓冲液中的25％w/w明胶溶液(溶液A)。
2)以明胶溶液的1.2g/100mL的浓度将L-谷氨酸添加到上述溶液中(溶液B)。
还制备了0.2M柠檬酸钠中的7.5％(w/w)Activa TG溶液(mTG溶液)。
方法
在每次植入前，以体积比2∶1将明胶溶液与mTG溶液混合。然后立即将0.1mL混合的明胶-mTG组合物植入SD大鼠4个不同的皮下部位。在8只大鼠上重复该操作，4只大鼠采用明胶溶液A且4只大鼠采用明胶溶液B(谷氨酸)。
14天后处死大鼠。移出植入部位的损伤并进行组织病理学评估。
在进行各自既定的尸体剖检期间，从所有动物收集所有的组织并在将其运送到测试实验室之前固定在10％中性福尔马林缓冲液(大约4％的甲醛溶液)中至少48小时固定期。
制备玻片，然后对研究方案中所列的组织进行组织病理学检查。修整组织、石蜡包埋，以约5微米厚度切片并用苏木精-伊红(H&E)染色。
分别对14天后处死的每一组进行总体评估和评分。总分值是相对的且包括慢性和急性炎症分数。
结果
植入每一种材料14天后处死大鼠的组织病理学评分(值为4只动物的平均值)。结果显示在表21和22。
表21 明胶溶液A+mTG：14天后处死
表22：明胶溶液B(谷氨酸)+mTG：14天后处死
这些结果表明在其他相同的条件下，向植入的交联明胶组合物中添加谷氨酸会引起较低水平的炎症反应。
实施例16
脯氨酸和海藻糖对恢复具有离液剂降低的溶胶-凝胶转变点的明胶溶液的物理胶凝的影响
材料
本实验中采用以下材料：Gelita275Bloom的A型猪明胶(Gelita，SiouxCity)、99.5％脲(Sigma-Aldrich，St.Louis)、氯化钙(Sigma，St.Louis，Missouri)、三水乙酸钠(Sigma-Aldrich，St.Louis)、100％乙酸(Ridel-DeHaen)、脯氨酸(Sigma-Aldrich，St.Louis)、海藻糖二水合物(Sigma-Aldrich，St.Louis)。
方法
制备0.1M乙酸钠缓冲液pH6.0、4.5M脲、2M CaCl2储备溶液。
制备3.8M脲、0.15M Ca、0.1M乙酸钠中的25％(w/w)明胶溶液(对照溶液)、1M脯氨酸、3.8M脲、0.15M Ca、0.1M乙酸钠中的25％(w/w)明胶溶液(溶液A)、1.5M脯氨酸、3.8M脲、0.15M Ca、0.1M乙酸钠中的25％(w/w)明胶溶液(溶液B)、0.5M脯氨酸、0.4M海藻糖、3.8M脲、0.15M Ca、0.1M乙酸钠中的25％(w/w)明胶溶液(溶液C)、1.5M脯氨酸、0.4M海藻糖、3.8M脲、0.15M Ca、0.1M乙酸钠中的25％(w/w)明胶溶液(溶液D)。所有溶液均加热至50℃并持续搅拌以获得均匀溶液。
获得溶液后，将所有溶液移至设定为25℃的恒温水浴中。60分钟后，触摸溶液以检查每种溶液的物理状态。然后将溶液移至22℃，再过60分钟后检查物理状态。
结果
对照溶液在25℃仍然如预期是轻微粘性的液体形式。溶液A具有非常高的粘性。溶液B、C和D在60分钟后完全凝固。
在22℃处理另外60分钟后，溶液A也形成了固体凝胶。
对照明胶溶液在22℃或25℃都没有形成凝胶。
这些观察表明，相比对照溶液，添加脯氨酸导致明胶溶液具有更高的转变点。结果也表明相比单独使用脯氨酸，当联合使用脯氨酸和海藻糖时他们之间具有协同作用，因为0.5M脯氨酸和0.4M海藻糖在25℃引起胶凝而单独的1M脯氨酸没有。
实施例17
脯氨酸和谷氨酸(稳液剂)对增加mTG-交联明胶凝胶弹性的影响
材料
本实验中采用以下材料：Gelita，275Bloom的A型猪明胶(Gelita，SiouxCity)、99.5％脲(Sigma-Aldrich，St.Louis)、氯化钙(Sigma，St.Louis，Missouri)、乙酸钠三水合物(Sigma-Aldrich，St.Louis)、100％乙酸(Ridel-DeHaen)、柠檬酸钠(Sigma-Aldrich，St.Louis)、柠檬酸一水合物(Sigma-Aldrich，St.Louis)、L-脯氨酸99％(Sigma，St.Louis，Missouri)、L-谷氨酸(谷氨酸)，非动物来源(Sigma，St.Louis，Missouri)、10％微生物转谷氨酰胺酶-ACTIVA-TG10％(10％酶、90％麦芽糖糊精)(Ajinomoto，Japan)。
方法
制备0.1M乙酸钠缓冲液pH6.0、0.2M柠檬酸钠缓冲液pH6.0、4.5M脲、2M CaCl2的储备溶液。
制备3.8M脲、0.15M Ca、0.1M乙酸钠中25％(w/w)明胶溶液(溶液A)、0.2M柠檬酸钠中0.25％(w/w)mTG(mTG对照)、含0.04g/ml谷氨酸的0.2M柠檬酸钠中0.25％(w/w)mTG(mTG1)、含2.5M脯氨酸的0.2M柠檬酸钠中0.25％(w/w)mTG(mTG2)。
对通过混合上述每一种明胶溶液的等分试样和mTG溶液的等分试样形成的交联凝胶进行拉伸测试。
对于每一次测试，混合6ml明胶溶液和3ml mTG溶液。将所得到的混合物应用于狗骨形模具中，且每个模具中2mL。形成在这些模具中的凝胶的有效测试横截面积为12mm×1.7mm。包含凝胶的模具在37℃下孵育10分钟。孵育后，将模具掩没在盐水中并从模具中提取所形成的凝胶。
对于每份凝胶的测试，将狗骨形凝胶的任一端上的突起物夹到3343型单柱材料测试系统(InstronTM；Norwood，MA)中。然后以0.5mm/s的速度向上牵拉顶部突起物，导致在凝胶狗骨上产生张力。继续拉伸试样直至观察到断裂。Bluehill 2材料测试软件(InstronTM；Norwood，MA)用于分析结果并计算包括弹性模量、峰值应力和断裂应变在内的材料性能。
结果
材料测试结果表明脯氨酸和谷氨酸都可以用于增强mTG-交联明胶组合物的弹性，如表23所示。
表23-脯氨酸和谷氨酸增加混合物的弹性
实施例18
表面活性剂Tween20和Tween80对增加交联蛋白组合物的弹性的影响
本实施例涉及表面活性剂在高于其CMC(临界胶束浓度)使用的影响。作为非限制性的实例，给出了“Tween”家族的两个成员。TweenTM亲水性表面活性剂(聚山梨醇酯)属于PEG脱水山梨糖醇酯(聚氧乙烯-脱水山梨糖醇-脂肪酸酯)家族，如已知类型和以商品名TweenTM市售的单月桂酯和三月桂酯、棕榈酯、硬脂酯和油酯(Fiedler，H.P.，″Lexikon der Hilfsstoffefur Pharmazie，Kosmetic und Angrenzende Gebiete″，Editio Cantor.D-7960Aulendorf，第3版，1989，第1300-1304页)。TweenTM20(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单月桂酸酯)具有16.7的HLB。其他类型的TweenTM表面活性剂也可以用于本发明的至少一些实施方案的组合物中。
TweenTM表面活性剂可溶于水但不溶于油。此家族的表面活性剂的化学结构以具有通过酯键连接到脱水山梨糖醇的一个、二个或三个短PEG链，通常约5到20个乙二醇单元为特征。这些表面活性剂由不同的公司(Croda，ICI，Sandoz，Mazer，Atlas)生产，可能出现不同的商品名，除了TweenTM，还有：SorlateTM、MonitanTM、CrilletTM等等。该家族中的聚山梨醇酯20、21、0、60、61、65、80和85的成员优选用于本发明的此实施方案中。
材料
本实验中采用以下材料：Gelita275Bloom的A型猪明胶(Gelita，SiouxCity)、99.5％脲(Sigma-Aldrich，St.Louis)、氯化钙(Sigma，St.Louis，Missouri)、乙酸钠三水合物(Sigma-Aldrich，St.Louis)、100％乙酸(Ridel-DeHaen)、柠檬酸钠(Sigma-Aldrich，St.Louis)、柠檬酸一水合物(Sigma-Aldrich，St.Louis)、Tween20(Sigma，St.Louis，Missouri)，Tween80(Sigma，St.Louis，Missouri)、10％微生物转谷氨酰胺酶-ACTIVA-TG10％(10％酶、90％麦芽糖糊精)(Ajinomoto，Japan)。
方法
制备0.1M乙酸钠缓冲液pH6.0、0.2M柠檬酸钠缓冲液pH6.0、4.5M脲、2M CaCl2的储备溶液。
制备3.8M脲、0.15M Ca、0.1M乙酸钠中的25％(w/w)明胶溶液(溶液A)，3.8M脲、0.15M Ca、0.1M乙酸钠中含0.1％或1％Tween20的25％(w/w)明胶溶液(分别为溶液B和C)，3.8M脲、0.15M Ca、0.1M乙酸钠中含0.1％或1％Tween80的25％(w/w)明胶溶液(分别为溶液D和E)以及0.2M柠檬酸钠中的0.25％(w/w)食品级mTG溶液(溶液1)。
对通过混合上述每一种明胶溶液的等分试样和mTG溶液的等分试样形成的交联凝胶进行拉伸测试。
对于每一次测试，混合6ml明胶溶液和3ml mTG溶液。将所得到的混合物应用于狗骨形模具中，且每个模具中2mL。形成在这些模具中的凝胶的有效测试横截面积为12mm乘1.7mm。包含凝胶的模具在37℃下孵育10分钟。孵育后，将模具掩没在盐水中并从模具中提取所形成的凝胶。
对于每份凝胶的测试，将狗骨形凝胶的任一端上的突起物夹到3343型单柱材料测试系统(InstronTM；Norwood，MA)中。然后以0.5mm/s的速度向上牵拉顶部突起物，导致在凝胶狗骨上产生张力。继续拉伸试样直至观察到断裂。Bluehill2材料测试软件(InstronTM；Norwood，MA)用于分析结果并计算包括弹性模量、峰值应力和断裂应变在内的材料性能。
结果
材料测试结果表明Tween20和Tween80都可以用于增强交联明胶凝胶的弹性(断裂应变)且这种影响是浓度依赖性的，如表24所示。
表24-Tween表面活性剂对弹性的影响
实施例19
采用胱胺、半胱氨酸和黑色素作为mTG抑制剂
材料
本实验中采用以下材料：Gelita275Bloom的A型猪明胶(Gelita，SiouxCity)、99.5％脲(Sigma-Aldrich，St.Louis)、氯化钙(Sigma，St.Louis，Missouri)、乙酸钠三水合物(Sigma-Aldrich，St.Louis)、100％乙酸(Ridel-DeHaen)、柠檬酸钠(Sigma-Aldrich，St.Louis)、柠檬酸一水合物(Sigma-Aldrich，St.Louis)、98％胱胺二盐酸盐(Sigma，St.Louis，Missouri)、97％L-半胱氨酸(Sigma，St.Louis，Missouri)、黑色素(Sigma，St.Louis，Missouri)、10％微生物转谷氨酰胺酶-ACTIVA-TG10％(10％酶、90％麦芽糖糊精)(Ajinomoto，Japan)。
方法
制备0.1M乙酸钠缓冲液pH6.0、0.2M柠檬酸钠缓冲液pH6.0、4.5M脲、2M CaCl2的储备溶液。
制备3.8M脲、0.15M Ca、0.1M乙酸钠中的25％(w/w)明胶溶液(对照溶液)，3.8M脲、0.15M Ca、0.1M乙酸钠中含0.1％w/v胱胺的25％(w/w)明胶溶液(溶液A)，3.8M脲、0.15M Ca、0.1M乙酸钠中含10％w/v半胱氨酸的25％(w/w)明胶溶液(溶液B)，0.2M柠檬酸钠中的0.75％(w/w)mTG(溶液1)，0.2M柠檬酸钠中的0.25％(w/w)mTG(溶液2)，含2mg/ml黑色素的0.2M柠檬酸钠中的0.25％(w/w)mTG(溶液3)，含10mg/ml黑色素的0.2M柠檬酸钠中的0.25％(w/w)mTG(溶液4)。
通过粘度计用mTG溶液1测试含胱胺和半胱氨酸的明胶溶液(A、B)。
用对照溶液以定性方式测试含黑色素的mTG溶液(3、4)。
粘度计试验
在每一次粘度计测试中，将20mL明胶溶液和10mL mTG溶液混合在50mL烧杯中。然后追踪混合的明胶-mTG溶液经历胶凝时的粘度。通过记录每个测试组达到最大粘度的30％和90％所需的时间来比较不同的测试组，所述最大粘度能够在比速下且具有用于那个测试的特定转子的粘度计所记录。
在本实验中，采用具有T-E95″t-bar″转子的DV II+PRO数字粘度计(Brookfield Engineering，Middleboro，MA)。helipath粘度计台用于在粘度计测试过程中维持转子的垂直运动。Helipath沿1cm的路径移动。粘度计读数由粘度计输出并采用HyperTerminal软件以每秒读取1次的速率读数。用于粘度计测试的转子的转速为0.5rpm。在此转速下，采用T-E95转子的最大可记录粘度是10×106cP，这意味着30％点等于3×106cP，且90％点等于9×106cP。
在粘度计测试的整个过程中，将烧杯浸没在37℃的水浴中。在整个测试中还记录烧杯中的平均温度以确保测试组之间的一致性。
定性交联测试
以2∶1的比混合明胶和mTG溶液，然后移至37℃恒温箱，当检测到明显的胶凝时确定交联时间。
结果
胱胺和半胱氨酸抑制结果：
图6显示了明胶溶液对照A和B的结果。正如所看到的，向明胶溶液中添加胱胺会增加底物交联时间约40％。添加半胱氨酸导致平均交联时间增加约28％。这些结果证明了向明胶溶液中添加胱胺或半胱氨酸的mTG抑制作用。
当检查时，来自含胱胺或半胱氨酸的交联凝胶比等同的没有胱胺或半胱氨酸添加剂的交联凝胶呈现出更强的柔性。
黑色素结果：
表25描述了关于黑色素影响的交联时间的结果。当使用含黑色素的mTG时，交联时间显著增加。增加的黑色素浓度会增加交联时间。此发现结果证明了添加黑色素的mTG抑制作用。
表25-黑色素对交联时间的影响
实施例20
PEG-胺对明胶交联反应的动力学和交联明胶组合物的弹性的影响。
材料
本实验中采用以下材料：Gelita275Bloom的A型猪明胶(Gelita，SiouxCity)、99.5％脲(Sigma-Aldrich，St.Louis)、氯化钙(Sigma，St.Louis，Missouri)、乙酸钠三水合物(Sigma-Aldrich，St.Louis)、100％乙酸(Ridel-DeHaen)、柠檬酸钠(Sigma-Aldrich，St.Louis)、柠檬酸一水合物(Sigma-Aldrich，St.Louis)、PEG-胺MW5000(Nof Corporation，Japan)、PEG6000(Fluka，Switzerland)、微生物转谷氨酰胺酶-ACTIVA-TG(10％酶、90％麦芽糖糊精)(Ajinomoto，Japan)。
方法
制备0.1M乙酸钠缓冲液pH6.0、0.2M柠檬酸钠缓冲液pH6.0、4.5M脲、2M CaCl2的储备溶液。
制备3.8M脲、0.15M CaCl2、0.1M乙酸钠中的25％(w/w)明胶(对照溶液)，3.8M脲、0.15M CaCl2、0.1M乙酸钠中含5％w/v PEG-胺的25％(w/w)明胶(溶液A)，3.8M脲、0.15M CaCl2、0.1M乙酸钠中含10％PEG-胺的25％(w/w)明胶(溶液B)，3.8M脲、0.15M CaCl2、0.1M乙酸钠中含20％PEG-胺的25％(w/w)明胶(溶液C)，3.8M脲、0.15M CaCl2、0.1M乙酸钠中含20％PEG6000的25％(w/w)明胶(溶液D)，0.2M柠檬酸钠中的0.25％(w/w)mTG(mTG溶液)。
采用定性测试和弹性测试来检测溶液。
定性交联测试
在玻璃管中以2∶1的体积比将明胶溶液A、B、C的每一种分别与mTG溶液混合，然后移至37℃的摇动恒温箱，交联时间定义为观察到液体溶液流动停止时的时间。
弹性测试
检测与mTG溶液交联的对照溶液和溶液B的弹性随时间的变化。
对于每一次弹性测试，混合6ml明胶溶液和3ml mTG溶液。将所得到的混合物应用于狗骨模具中，且每个模具中2mL。将模具在37℃下孵育10分钟。孵育后，将模具掩没在盐水中并从模具中提取明胶-mTG组合物。
接着，使样品在37℃的盐水中进行孵育或立即检测。用卡尺测量从凝胶移出的明胶-mTG组合物的厚度。
对于每份凝胶的测试，将狗骨形凝胶的任一端上的突起物夹到3343型单柱材料测试系统(InstronTM；Norwood，MA)中。然后以0.5mm/s的速度向上牵拉顶部突起物，导致在凝胶狗骨上产生张力。继续拉伸试样直至观察到断裂。Bluehill2材料测试软件(InstronTM；Norwood，MA)用于分析结果并计算包括弹性模量、峰值应力和断裂应变在内的材料性能。
结果
定性交联测试
表27显示了定性交联测试的结果，显示增加PEG-胺的量会减少胶凝时间。
表27-交联结果
弹性测试
表28显示了弹性测试的平均结果；结果针对在37℃的盐水中孵育2小时。结果显示PEG-胺能增强胶凝组合物的弹性。
表28-弹性测试结果
总之，这些结果表明包含PEG-胺会影响明胶溶液mTG交联的胶凝动力学；且包含PEG-胺会增强交联明胶组合物的弹性。能够共价结合到明胶的合适的PEG衍生物的另一个非限制性实例是PVA-胺，其也包括在本发明的此实施方案中。
实施例21
氨甲酰化的抑制
本实施例显示了甘氨酸以剂量依赖的方式抑制含脲的明胶溶液的氨甲酰化而并不抑制之后的mTG交联。组氨酸也能类似地用于抑制氨甲酰化。
材料
本实验中采用以下材料：Gelita275Bloom的A型猪明胶(Gelita，SiouxCity)、99.5％脲(Sigma-Aldrich，St.Louis)、氯化钙(Sigma，St.Louis，Missouri)、乙酸钠三水合物(Sigma-Aldrich，St.Louis)、100％乙酸(Ridel-DeHaen)、柠檬酸钠(Sigma-Aldrich，St.Louis)、柠檬酸一水合物(Sigma-Aldrich，St.Louis)、甘氨酸，非动物来源(Sigma，St.Louis，Missouri)、10％微生物转谷氨酰胺酶-ACTIVA-TG10％(10％酶、90％麦芽糖糊精)(Ajinomoto，Japan)。
方法
制备0.1M乙酸钠缓冲液pH6.0、0.2M柠檬酸钠缓冲液pH6.0、4.5M脲、2M CaCl2的储备溶液。
制备3.8M脲、0.15M Ca、0.1M乙酸钠中的25％(w/w)明胶溶液(对照溶液)，3.8M脲、0.15M Ca、0.1M乙酸钠中含0.1M组氨酸的25％(w/w)明胶溶液(溶液A)，3.8M脲、0.15M Ca、0.1M乙酸钠中含0.1M甘氨酸的25％(w/w)明胶溶液(溶液B)，3.8M脲、0.15M Ca、0.1M乙酸钠中含0.4M甘氨酸的25％(w/w)明胶溶液(溶液C)，3.8M脲、0.15M Ca、0.1M乙酸钠中含0.5M甘氨酸的25％(w/w)明胶溶液(溶液D)，3.8M脲、0.15M Ca、0.1M乙酸钠中含0.7M甘氨酸的25％(w/w)明胶溶液(溶液E)，3.8M脲、0.15M Ca、0.1M乙酸钠中含0.9M甘氨酸的25％(w/w)明胶溶液(溶液F)，3.8M脲、0.15M Ca、0.1M乙酸钠中含1M甘氨酸的25％(w/w)明胶溶液(溶液G)，0.2M柠檬酸钠中的0.25％(w/w)mTG(溶液1)，0.2M柠檬酸钠中的0.75％(w/w)mTG(溶液2)。
结果
图7A、7B和7C概述了含有作为氨甲酰化抑制剂的不同甘氨酸和组氨酸添加剂的明胶溶液在高温(50℃)下孵育不同时间后进行交联和由粘度计测试的结果。所有图都显示了总交联时间的30％和90％的值。
图7A显示了含有和不含甘氨酸或组氨酸添加剂(每一种0.1M)的明胶溶液在50℃下孵育1天后的归一化交联时间值。基于在4℃下储存1天后的无添加剂的对照溶液来归一化这些值，因此值100％定义为明胶对照溶液达到交联时间所需的时间。图7A显示了明胶对照、溶液A和溶液B在50℃下孵育1天后的归一化交联时间。圆锥体显示达到30％扭矩的时间，而圆柱体显示达到90％扭矩的时间。数据成对显示：前2个指单独的对照溶液，第二对指溶液A以及第三对指溶液B。
图7A的结果表明孵育1天后，含0.1M组氨酸的明胶溶液(A)和在50℃下孵育的无添加剂的明胶溶液(对照)都比在4℃下储存的对照消耗长30％-40％的时间来获得粘度水平。然而，使用0.1M甘氨酸(B)降低了反应抑制水平，且交联反应延迟限制到14-17％。
图7B显示了含有和不含甘氨酸或组氨酸添加剂的明胶溶液在50℃下孵育2天后的归一化交联时间值。圆锥体显示达到30％扭矩的时间，而圆柱体显示达到90％扭矩的时间。数据成对显示：前2个指单独的溶液B，第二对指溶液C，第三对指溶液F且第四对指溶液A。基于也在50℃下孵育2天的无添加剂的明胶对照溶液来归一化这些值，因此100％的交联时间为孵育的对照溶液时达到交联时间所需的时间。
图7B的结果表明含有0.9M的最高甘氨酸浓度(溶液F)的明胶溶液产生最好的交联时间。反应比对照溶液快约22％，而0.1M甘氨酸浓度(溶液B)引起的反应仅比对照快5％-6％的反应时间。使用含0.1M组氨酸的明胶溶液(溶液A)产生与含0.9M甘氨酸的明胶溶液(F)类似的交联时间，且交联时间比对照溶液快18％。
图7C显示在50℃下孵育2周后的含甘氨酸的明胶溶液的交联时间值，以及在4℃下储存2周后的明胶对照溶液的交联时间值。圆锥体显示达到30％扭矩的时间，而圆柱体显示达到90％扭矩的时间。数据成对显示：前2个指单独的对照溶液，第二对指溶液D，第三对指溶液E，第四对指溶液F而第五对涉及溶液G。
图7C的结果表明使用最高甘氨酸浓度的明胶溶液并不一定会产生最佳的结果，因为含0.9M甘氨酸的明胶溶液(F)的交联时间比含1M甘氨酸的明胶溶液(G)所达到的交联时间低50％。同时，结果也显示0.9M甘氨酸是最佳浓度，因为0.7M甘氨酸(E)达到的交联时间比含0.9M甘氨酸的明胶溶液高约50％。结果也表明在超过23分钟后，无添加剂的明胶溶液没有观察到交联，表明溶液变质了。
总之，这些结果表明甘氨酸和组氨酸都能抑制明胶中的氨甲酰化反应。然而，物质的特定浓度和选择依赖于溶液中产生氰酸盐的条件。
实施例22
针对不含脲的明胶溶液的部分交联添加氰酸盐
本实施例显示了氰酸钠的存在会引起抑制作用，证实了脲分解是抑制mTG交联的原因。
材料
本实验中采用以下材料：Gelita275Bloom的A型猪明胶(Gelita，SiouxCity)、乙酸钠三水合物(Sigma-Aldrich，St.Louis)、100％乙酸(Ridel-DeHaen)、柠檬酸钠(Sigma-Aldrich，St.Louis)、柠檬酸一水合物(Sigma-Aldrich，St.Louis)、96％氰酸钠(Sigma-Aldrich，St.Louis)、10％微生物转谷氨酰胺酶-ACTIVA-TG10％(10％酶、90％麦芽糖糊精)(Ajinomoto，Japan)。
方法
制备0.1M乙酸钠缓冲液pH6.0和0.2M柠檬酸钠缓冲液pH6.0的储备溶液。
制备0.1M乙酸钠中的25％(w/w)明胶溶液(对照溶液)、0.1M乙酸钠中的25％(w/w)明胶+0.1M氰酸钠(溶液A)和0.2M柠檬酸钠中的0.25％(w/w)mTG(溶液1)。
粘度计测试
按照实施例19中的描述进行粘度计测试。
结果
图8概述了含有和不含氰酸盐添加剂的对照溶液在高温(50℃)下孵育不同时间后进行交联和由粘度计测试的结果。圆锥体显示达到30％扭矩的时间，而圆柱体显示达到90％扭矩的时间(即交联时间)。数据成对显示：前2个指对照溶液，而第二对指溶液A。基于在4℃下储存1天后的无添加剂的对照溶液来归一化交联时间的值。因此，值100％为实现该溶液的交联所需的时间。
结果表明虽然在50℃下孵育的对照溶液显示会略微增加的交联时间(约10％)，但是也包含0.1M氰酸盐的溶液(溶液A)显著增加其交联时间超过76％。该发现结果证明了不论是直接添加还是通过分解脲，添加氰酸盐阴离子都可以明显减少明胶溶液的交联时间且具有明显的抑制作用。
实施例23
明胶溶液可以被完全琥珀酰化使得明胶不再作为mTG交联的底物
材料
本实验中采用以下材料：Gelita275Bloom的A型猪明胶(Gelita，SiouxCity)、琥珀酸酐(Sigma-Aldrich，St.Louis)、氢氧化钠(Ridel-De Haen)、碳酸氢钠(Frutarum，Israel)、柠檬酸钠(Sigma-Aldrich，St.Louis)、10％微生物转谷氨酰胺酶-ACTIVA-TG10％(10％酶、90％麦芽糖糊精)(Ajinomoto，Japan)。
方法
制备0.1M碳酸氢钠缓冲液pH8.0、4M氢氧化钠和0.2M柠檬酸钠的储备溶液。
制备0.1M碳酸氢钠缓冲液中的1％(w/w)明胶溶液(溶液A)。将溶液加热至37℃同时施加持续搅拌。而且，制备0.2M柠檬酸钠中的0.75％(w/w)mTG(mTG溶液)。
在达到均匀稳定的状态后，向溶液中添加粉末形式的琥珀酸酐。持续监测溶液的pH并通过添加4M氢氧化钠保持pH＝8。当观察到pH不再变化时，将溶液放入透析袋中并浸没到蒸馏水中持续24小时。
用30KDa截留膜的超滤过程浓缩所得到的溶液。在超滤过程中，进气压力不超过1.5巴。
用溶液280nm吸光度测定溶液的浓度(溶液A)。制备与溶液A相同浓度的未琥珀酰化明胶的相应溶液(溶液B)。
将2.5ml mTG溶液分别与5ml溶液A和B混合，放置于40℃下。
结果
定性交联测试
在溶液孵育过程中，观察到溶液B在1分钟后进行交联，而溶液A甚至在2小时后还没有进行交联。因此明胶的琥珀酰化明确地阻止交联。
实施例24
琥珀酰化明胶可以以改进交联明胶组合物的机械性能的方式与未修饰的明胶混合
材料
本实验中采用以下材料：Gelita275Bloom的A型猪明胶(Gelita，SiouxCity)、99.5％脲(Sigma-Aldrich，St.Louis)、氯化钙(Sigma，St.Louis，Missouri)、乙酸钠三水合物(Sigma-Aldrich，St.Louis)、100％乙酸(Ridel-DeHaen)、柠檬酸钠(Sigma-Aldrich，St.Louis)、柠檬酸一水合物(Sigma-Aldrich，St.Louis)、10％微生物转谷氨酰胺酶-ACTIVA-TG10％(10％酶、90％麦芽糖糊精)(Ajinomoto，Japan)、如前面描述制备的琥珀酰明胶。
方法
制备0.1M乙酸钠缓冲液pH6.0、0.2M柠檬酸钠缓冲液pH6.0、4.5M脲、2M CaCl2的储备溶液。
制备含琥珀酰化明胶溶液和3.8M脲、0.15M Ca、0.1M乙酸钠的21％(w/v)明胶溶液(溶液A)，含蒸馏水和3.8M脲、0.15M Ca、0.1M乙酸钠的21％(w/v)明胶溶液(溶液B)，0.2M柠檬酸钠中的0.75％(w/w)mTG(溶液1)。
由粘度计测试溶液A和B的mTG交联时间。对每一次粘度计测试，将20mL明胶溶液和10mL mTG溶液混合在50mL烧杯中。然后追踪混合的明胶-mTG溶液经历胶凝时的粘度。通过记录每个测试组达到最大粘度的90％所需的时间来比较不同的测试组，所述最大粘度能够在比速下且具有用于那个测试的特定转子的粘度计所记录。
在本实验中，采用具有T-E95″t-bar″转子的DV II+PRO数字粘度计(Brookfield Engineering，Middleboro，MA)。helipath粘度计台用于在粘度计测试过程中维持转子的垂直运动。Helipath沿1cm的路径移动。粘度计读数由粘度计输出并采用HyperTerminal软件以每秒读取1次的速率读数。用于粘度计测试的转子的转速为0.5rpm。在此转速下，采用T-E95转子的最大可记录粘度是10×106cP，这意味着30％点等于3×106cP，且90％点等于9×106cP。
在粘度计测试的整个过程中，将烧杯浸没在37℃的水浴中。在整个测试中还记录烧杯中的平均温度以确保测试组之间的一致性。
粘度计测试完成后，从烧杯中移出所得到的交联的明胶塞并浸入盐水浴中。24小时后，从盐水浴中移出溶液A和溶液B明胶塞，手动触摸以评估相对柔性。
结果
表29描述了交联时间的结果，证明了琥珀酰化和未琥珀酰化的混合物的交联需求更长的时间。
表29
由溶液A形成的全部三个(3)明胶塞的柔性明显比由溶液B形成的全部三个(3)个明胶塞强，这表明明胶溶液中包含琥珀酰化明胶降低了mTG交联后该溶液的脆性。
实施例25
采用氨甲酰化来阻断明胶中的胺基底物
本实施例描述了采用氨甲酰化来改进交联明胶组合物的柔性和弹性。
材料
本实验中采用以下材料：Gelita 275Bloom的A型猪明胶(Gelita，SiouxCity)、99.5％脲(Sigma-Aldrich，St.Louis)、氯化钙(Sigma，St.Louis，Missouri)、乙酸钠三水合物(Sigma-Aldrich，St.Louis)、100％乙酸(Ridel-DeHaen)、柠檬酸钠(Sigma-Aldrich，St.Louis)、柠檬酸一水合物(Sigma-Aldrich，St.Louis)、96％氰酸钠(Sigma-Aldrich，St.Louis)、10％微生物转谷氨酰胺酶-ACTIVA-TG10％(10％酶、90％麦芽糖糊精)(Ajinomoto，Japan)。
方法
制备0.1M乙酸钠缓冲液pH6.0、0.2M柠檬酸钠缓冲液pH6.0、4.5M脲、2M CaCl2、0.3M氰酸钠的储备溶液。
制备3.8M脲、0.15M Ca、0.1M乙酸钠中的25％(w/w)明胶溶液(溶液A)和0.2M柠檬酸钠中的0.75％(w/w)mTG(溶液1)。
粘度计测试
按照实施例19中的描述进行粘度计测试。
在混合明胶和酶之前，向溶液A或溶液1中如下加入氰酸钠：
向10ml溶液1中添加100μl-200μl的0.3M氰酸钠。将混合物颠倒数次，然后添加到20ml溶液A中并进行粘度计测试。
向20ml溶液A中添加50μl-150μl的0.3M氰酸钠。将混合物颠倒数次，然后添加到10ml溶液1中并进行粘度计测试。
结果
表30描述了粘度计测试的结果。除了因赖氨酸链中部分阻断的侧链氨基而引起交联时间增加外，定性观察结果表明用氰酸盐基团处理的交联凝胶产生柔性、弹性和粘合性更强的交联凝胶。
表30-粘度计测试结果
实施例26
二胺化合物、腐胺对明胶交联反应的动力学的影响
本实施例证明了腐胺以剂量依赖的方式减慢了交联反应，这表明其作为转谷氨酰胺酶的底物并与明胶交联。此外，所得到的交联明胶的弹性更强。
材料
本实验中采用以下材料：Gelita 275Bloom的A型猪明胶(Gelita，SiouxCity)、99.5％脲(Sigma-Aldrich，St.Louis)、氯化钙(Sigma，St.Louis，Missouri)、乙酸钠三水合物(Sigma-Aldrich，St.Louis)、100％乙酸(Ridel-DeHaen)、柠檬酸钠(Sigma-Aldrich，St.Louis)、柠檬酸一水合物(Sigma-Aldrich，St.Louis)、腐胺二盐酸盐(Sigma-Aldrich，St.Louis)、10％微生物转谷氨酰胺酶-ACTIVA-TG10％(10％酶、90％麦芽糖糊精)(Ajinomoto，Japan)。
方法
制备0.1M乙酸钠缓冲液pH6.0、0.2M柠檬酸钠缓冲液pH6.0、4.5M脲、2M CaCl2的储备溶液。
制备3.8M脲、0.15M CaCl2、0.1M乙酸钠中的25％(w/w)明胶(对照溶液)，3.8M脲、0.15M CaCl2、0.1M乙酸钠中含1-1摩尔比的腐胺的25％(w/w)明胶(溶液A)，3.8M脲、0.15M CaCl2、0.1M乙酸钠中含1-1/2摩尔比的腐胺的25％(w/w)明胶(溶液B)，3.8M脲、0.15M CaCl2、0.1M乙酸钠中含1-1/4摩尔比的腐胺的25％(w/w)明胶(溶液C)，0.2M柠檬酸钠中的1.25％(w/w)mTG(溶液1)、0.2M柠檬酸钠中的0.75％(w/w)mTG(溶液2)，0.2M柠檬酸钠中的0.5％(w/w)mTG(溶液3)和0.2M柠檬酸钠中的0.25％(w/w)mTG(溶液4)。
采用定性测试和弹性测试检测溶液。
定性交联测试
以2∶1的比将溶液A、B和C与溶液1和2混合，然后移至37℃的恒温箱且交联时间定义为注意到明显胶凝时的时间。
弹性测试
分别使用mTG3和mTG4来检测对照溶液和溶液B的弹性随时间的变化。
对于每一次弹性测试，混合6ml明胶溶液和3ml mTG溶液。将所得到的混合物应用于狗骨模具中，且每个图样中2mL。将模具在37℃下孵育10分钟。孵育后，将模具掩没在盐水中并从模具中取出。
接着，使试样在室温的盐水中孵育或立即检测。测量图样厚度并将试样置于仪器的夹具之间。
结果
定性交联测试
表31显示了定性交联测试的结果，显示腐胺浓度的增加导致交联时间的增加。
表31-样品交联时间
弹性测试
表32显示了弹性测试的平均结果；结果均为在室温下的盐水中孵育2小时后。
表32-弹性测试结果
实施例27
采用胺供体、聚乙烯亚胺(PEI)来增强mTG-交联的明胶组合物的弹性
材料
本实验中采用以下材料：Gelita 275Bloom的A型猪明胶(Gelita，SiouxCity)、99.5％脲(Sigma-Aldrich，St.Louis)、氯化钙(Sigma，St.Louis，Missouri)、乙酸钠三水合物(Sigma-Aldrich，St.Louis)、100％乙酸(Ridel-DeHaen)、柠檬酸钠(Sigma-Aldrich，St.Louis)、柠檬酸一水合物(Sigma-Aldrich，St.Louis)、聚乙烯亚胺(PEI)MW750，000(Sigma，St.Louis，Missouri)、10％微生物转谷氨酰胺酶-ACTIVA-TG10％(10％酶、90％麦芽糖糊精)(Ajinomoto，Japan)。
方法
制备0.1M乙酸钠缓冲液pH6.0、0.2M柠檬酸钠缓冲液pH6.0、4.5M脲、2M CaCl2的储备溶液。
制备3.8M脲、0.15M Ca、0.1M乙酸钠中的25％(w/w)明胶溶液(溶液A)，0.2M柠檬酸钠中的0.75％(w/w)mTG(溶液1)，0.2M柠檬酸钠中含10％v/v PEI的0.75％(w/w)mTG(溶液2)，0.2M柠檬酸钠中的0.25％(w/w)mTG(溶液3)和0.2M柠檬酸钠中的含10％v/v PEI的0.25％(w/w)mTG(溶液4)。
粘度计测试
按照实施例19中的描述进行粘度计测试。
采用Instron进行机械测试
采用Instron设备测试用于表征材料的机械性能。
对于每一次弹性测试，混合6ml明胶溶液和3ml mTG溶液。将所得到的混合物应用于狗骨模具中，且每个图样中2mL。将模具在37℃下孵育10分钟。孵育后，将模具掩没在盐水中并从模具中取出。
使试样在室温(RT)的盐水中孵育或立即检测。测量图样厚度并将试样置于仪器的夹具之间。
计算每个试样的模量、断裂拉伸应力和断裂拉伸应变(伸长的程度)。
结果
表32概述了溶液A与含PEI和不含PEI的mTG溶液交联的结果。进行粘度计测试和Instron测试以获得交联时间和交联凝胶的机械性能。在孵育2小时后进行Instron测试。
结果表明与使用不含PEI的mTG溶液(溶液1)相比，溶液A与含PEI的mTG(溶液2)的交联时间略微增加7％-14％。
正如可以从溶液3的A1与溶液4的A之间的比较观察到，含PEI交联凝胶的机械性能得到较大改进；与不含PEI的交联凝胶相比，基于PEI的交联凝胶的模量要低10％，且所获得的伸长率要大60％多，如表33所示。
表33-与添加和不添加10％v/v PEI的mTG反应的明胶溶液的粘度计测试和Instron测试。在室温下孵育2小时后进行Instron测试。
实施例28
将mTG粗粉分散至泡沫化明胶中
本实施例描述了合适的明胶泡沫的形成和将干mTG分散至泡沫中，使得不会立即检测到反应。只有当干组合物重组时，才会显示交联活性。
材料
本实验中采用以下材料：Gelita 275Bloom的A型猪明胶(Gelita，SiouxCity)、WFI(注射用水；Cure，Israel)、10％微生物转谷氨酰胺酶-ACTIVA-TG10％(10％酶、90％麦芽糖糊精)(Ajinomoto，Japan)。
方法
选择用于泡沫化明胶溶液为WFI水的5％w/w溶液(当溶剂选择为WFI时，该浓度被证实获得良好的明胶结构，这样低共熔点将是相对高的。)在泡沫化前将明胶溶液维持在36-37摄氏度，而环境温度是21℃-22℃。采用机械设备装载和泡沫化36℃-37℃的明胶溶液。泡沫化步骤完成后，在每个铝盘上装载15g泡沫，然后用筛子将0.25g mTG粗粉(含90％麦芽糖糊精)分散到泡沫层上。然后在每层盘上添加15g泡沫并覆盖mTG层以实现总共30g的具有少于1％的w/w mTG的泡沫整合于每个盘中。因为之前显示mTG粗粉因其低溶解度而不会立即与其底物反应，所以当装载盘时未观察到交联反应(没有检测到变硬)。所有盘被转移并装载到冻干机的架子上。测试程序仅在所有盘子都在冻干机内时才启动。所有盘子都储存在相同的最终温度环境(-40摄氏度)中。冻干程序的总时间是36-40小时。
重组测试：
从盘子中取出冻干垫并浸没入水中以观察重组过程。
这些测试揭示了泡沫基质内的大部分区域未溶解。这些发现连同那些区域中观察到的典型的灰色mTG粉末一起表明了部分泡沫基质经历了交联反应且因此甚至在20分钟后都不溶解。
实施例29
重组明胶的mTG交联
材料
100kDa重组明胶(r明胶)冻干块，厚度约2cm。ACTIVA TG微生物转谷氨酰胺酶粉(10％蛋白、90％麦芽糖糊精；Ajinomoto，Japan)。磷酸盐缓冲盐水(PBS)，pH7.4。
方法
将PBS置于室温(23℃-25℃)。将重组明胶手动搅拌成均匀的溶液来制备PBS中25％w/w重组明胶溶液。溶液完全混合后，短暂地离心以去除空气。
将mTG手动搅拌成均匀的溶液(mTG溶液)来制备PBS中的7.5％w/wACTIVA TG溶液。
用移液管将2mL重组明胶溶液和1mL mTG溶液分配至塑料称重盘中。紧接着分配后，用移液管端头充分混合溶液。每隔30秒用移液管端头触摸混合溶液以定性评估胶凝时间。观察到胶凝后，从盘上手动去除样品并手动拉伸来证明样品的弹性。
重复上面的样品制备步骤并将样品置于50℃浴中的烧杯中10分钟。然后主观评估样品以确定其是否保持其凝胶相或者回到液相(即，评估热可逆性)。
预期结果
预期在该过程后观察到胶凝，因此预期重组凝胶具有作为微生物转谷氨酰胺酶交联的底物的作用。
实施例30
B型明胶的mTG交联
之前已经尝试采用mTG来交联B型明胶。然而，虽然已经报道B型明胶的物理胶凝，但是B型明胶的mTG交联的尝试一直不成功(Crescenzi等人Biomacromolecules.2002，3：第1384-1391页)。出人意料地，在本发明的明胶溶于乙酸盐缓冲液中且mTG溶于柠檬酸盐缓冲液中的实施方案中，发现B型明胶的mTG交联导致形成结实的凝胶。
材料
225Bloom的B型猪明胶(Sigma，St.Louis，MO)、乙酸钠三水合物(Sigma-Aldrich，St.Louis)、100％乙酸(Ridel-De Haen)、柠檬酸钠(Sigma-Aldrich，St.Louis)、柠檬酸一水合物(Sigma-Aldrich，St.Louis)、ACTIVA TG微生物转谷氨酰胺酶粉(10％蛋白，90％麦芽糖糊精；Ajinomoto，Japan)。
方法
制备下列溶液：50℃下pH6.0的0.1M乙酸钠中的25％(w/w)明胶溶液，0.2M柠檬酸钠中的7.5％(w/w)ACTIVA溶液(mTG溶液)。
将一部分明胶溶液在室温下(22℃-23℃)孵育并在温度从50℃下降时追踪温度。通过随着温度下降，定期搅拌明胶溶液来测定从液体溶液到物理凝胶的转变点。物理胶凝点测定为搅拌棒不能够再用于移动明胶溶液时的温度。
50℃下将2mL等分试样的明胶溶液分别与1mL或2mL的mTG溶液在塑料管中混合。将这些管置于37℃的恒温箱中。每隔30秒取出这些管并倒置以确定是否已形成酶促交联的凝胶。胶凝时间定义为当塑料管倒置时明胶-mTG混合物不再流动时的时间。
结果
明胶溶液的物理溶胶-凝胶转变点出现在30℃。2分钟内观察到两种明胶-mTG组合物的胶凝。
这些结果表明B型明胶不仅在约30℃以下形成热可逆的物理凝胶，也能在较高的温度形成mTG-交联的化学凝胶。
实施例31：爆破压力粘合性测试
材料
本测试采用的材料为300Bloom，70目的A型药用猪明胶(Medex，England batch#80067)、98％脲，干粉(Alfa Aesar，Lancester：批号10110586)、97％CaCl2，干粉(Alfa Aesar，Lancester：批号10110561)、0.1M乙酸钠缓冲液(pH6.1)、0.5M柠檬酸钠缓冲液、D-山梨糖醇，97％(Sigma，St.Louis，Missouri：批号1344776)、10％微生物转谷氨酰胺酶-ACTIVA-TG10％(10％酶、90％麦芽糖糊精)[Ajinomoto，Japan]。
方法
制备明胶溶液：
1.对照-0.1M乙酸钠缓冲液中的25％(w/w)明胶溶液。
2.0.1M乙酸钠缓冲液中的25％(w/w)明胶、4.5M脲。
3.0.1M乙酸钠缓冲液中的25％(w/w)明胶、2M脲1M Ca。
为了完全溶解明胶粉末，将溶液加热至40℃并剧烈搅拌。然后在实验之前将溶液置于24℃恒温箱中过夜。
制备微生物转谷氨酰胺酶溶液：
乙酸钠溶液：
a.0.1M乙酸钠中的5％(w/w)ACTIVA-TG10％且加入山梨糖醇∶明胶为3∶1w/w比的山梨糖醇。
b.0.25M乙酸钠中的5％(w/w)ACTIVA-TG10％且加入山梨糖醇∶明胶为3∶1w/w比的山梨糖醇。
c.0.1M乙酸钠中的7.5％(w/w)ACTIVA-TG10％且加入山梨糖醇∶明胶为3∶1w/w比的山梨糖醇。
d.0.1M乙酸钠中的7％(w/w)ACTIVA-TG10％。
e.0.1M乙酸钠中的7.5％(w/w)ACTIVA-TG10％且加入山梨糖醇∶明胶为3∶1w/w比的山梨糖醇。
柠檬酸钠溶液：
f.0.1M柠檬酸钠中的2.5％(w/w)ACTIVA-TG10％。
g.0.1M柠檬酸钠中的3％(w/w)ACTIVA-TG10％。
h.0.1M柠檬酸钠中的10％(w/w)ACTIVA-TG10％。
i.0.5M柠檬酸钠中的5％(w/w)ACTIVA-TG10％且加入山梨糖醇∶明胶为3∶1w/w比的山梨糖醇。
j.0.5M柠檬酸钠的10％(w/w)ACTIVA-TG10％且加入山梨糖醇∶明胶为3∶1w/w比的山梨糖醇。
k.0.5M柠檬酸钠的5％(w/w)ACTIVA-TG10％且加入山梨糖醇∶明胶为0.6∶1w/w比的山梨糖醇。
使用之前用1号whatman滤纸过滤酶溶液。
爆破压力测试
根据ASTM方案代号F2392-04的修改形式进行爆破压力测试。
进行爆破压力粘合性测试以比较不同粘合剂组合物的粘合性。对于每次爆破压力测试，胶原蛋白肠衣(Nitta Casings，New Jersey)用作底物。在每个肠衣样品上穿1个直径2mm的孔并将每个样品夹到样品保持歧管中。然后用加热(37℃)的生理流体(盐水溶液)填充组织歧管。填充歧管后，制备试验交联组合物并应用于样品孔之上以用组合物完全覆盖孔。
在25mL烧杯中将4mL可交联蛋白溶液与2mL无毒性交联剂混合来制备试验组合物。然后将4mL混合溶液抽入5mL注射器中。在小烧杯中混合明胶和mTG溶液后，将4mL所形成的凝胶转移到注射器中。接着，应用3mL组合物以覆盖样品孔。4分钟后(从混合的时候开始)，启动爆破压力系统，且孔下的压力累积到指定水平直到粘合剂组合物破损，且流体冲破样品孔。
为了获得可重复性，除非另有提及，否则每种制剂测试至少4次。
图9显示了爆破压力系统和相关的组织歧管的示意图。
结果
下表概述了不同明胶-mTG结合物的爆破压力测试的结果。测得初始大气压为755mmHg。这样，在所有情形中，粘附在底物上的明胶-mTG组合物受到的净压力等于记录的压力值(结果表中标注)减去755mmHg。例如，855mmHg的记录值表示爆破压力系统中待测试的组合物的粘合强度为100mmHg。
对照-0.1M Na-Ac溶液中的25％(w/w)明胶
表34：采用含mTG的0.1M Na-Ac溶液中的25％(w/w)明胶的测试的概述
0.1M Na-Ac溶液中的25％(w/w)明胶、4.5M脲
表35：采用0.1M Na-Ac溶液中25％(w/w)明胶、4.5M脲与基于不同mTG的溶液的测试概述
0.1M Na-Ac溶液中的25％(w/w)明胶、4.5M脲1M Ca
表36：采用0.1M Na-Ac溶液中的25％(w/w)明胶、2M脲1M Ca与基于不同mTG的溶液的测试概述
用本发明的其他实施方案获得了类似的爆破压力结果。
应理解，为了清楚，在不同实施方案的情况中描述的本发明的某些特征可以组合提供在单个实施方案中。相反，为了简洁，在单个实施方案的情况中描述的本发明的多个特征也可以单独地或以任何合适的子组合提供。
虽然已经结合本发明具体的实施方案描述了本发明，但是很明显，许多替换、修改和变化对本领域的技术人员将是明显的。因此，期望包括落入所附权利要求的精神和宽泛范围内的所有这样的替换、修改和变化。本说明书中提到的所有的出版物、专利和专利申请在此通过引用并入本说明书中，就好像每一份单独的出版物、专利或专利申请被具体地且单独地被指明在此通过引用而并入。此外，本说明书中任何参考文献的引述或确认不应该被解释为承认这样的参考文献可作为本发明的现有技术。

Claims (10)

1.一种组合物，包括可交联蛋白或多肽、引发所述可交联蛋白交联的酶、金属离子以及变性剂，条件是所述蛋白或多肽不是血纤蛋白，其中所述可交联蛋白或多肽包括明胶，其中所述酶包括转谷氨酰胺酶，其中所述金属离子包括任何药学上可相容的盐形式的钙并且其中所述变性剂包括脲。
2.如权利要求1所述的组合物，其中所述明胶是至少250bloom。
3.如权利要求2所述的组合物，其中所述钙盐包括氯化钙或氢氧化钙中的一种或多种。
4.如权利要求3所述的组合物，其中所述钙以至多1M的量存在。
5.如权利要求4所述的组合物，其中所述脲以至多4M的量存在。
6.如权利要求1-5中任一项所述的组合物，还包括钙螯合剂。
7.如权利要求6所述的组合物，其中所述钙螯合剂包括EDTA、柠檬酸盐或calgon中的一种或多种。
8.如权利要求7所述的组合物，其中所述柠檬酸盐或所述EDTA是以从0.01M到2M的量存在的。
9.如权利要求8所述的组合物，其中所述柠檬酸盐或所述EDTA是以从0.05M到0.2M的量存在的。
10.如权利要求1所述的组合物，还包括能够共价结合到所述明胶的PEG(聚乙二醇)衍生物。
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