CN102791870A - 分散的支链脂肪酸及其生物性生产 - Google Patents

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L·T·劳林二世
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P·R·格林
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Abstract

本发明提供了用于生产分散的支链脂肪酸的方法和细胞。例如，本发明提供了用于生产支链脂肪酸的方法，所述支链脂肪酸在一个或更多个偶数碳上包含甲基。所述方法包括在允许一种或更多种多核苷酸的表达和支链脂肪酸的生产的条件下培养细胞，所述细胞包含下列多核苷酸：外来的或过表达的多核苷酸，所述多核苷酸包含编码多肽的核酸序列，所述多肽催化丙酰CoA转化成甲基丙二酰CoA，和/或外来的或过表达的多核苷酸，所述多核苷酸包含编码多肽的核酸序列，所述多肽催化琥珀酰CoA转化成甲基丙二酰CoA。所述细胞比不包含所述一种或更多种多核苷酸的其它类似的细胞生产更多的支链脂肪酸，所述支链脂肪酸在一个或更多个偶数碳上包含甲基。本发明还提供了生产支链脂肪酸的细胞和所述支链脂肪酸。

Description

分散的支链脂肪酸及其生物性生产
发明领域
本发明涉及生产脂肪酸的细胞和方法，更具体地讲涉及生产分散的支链脂肪酸的细胞和方法。
相关申请的交叉引用并以引用方式并入
本专利申请要求提交于2010年1月12日的美国临时专利申请号61/294,274的优先权，其据此全文以引用方式并入本文。
发明背景
支链脂肪酸是在一个或更多个碳上具有甲基或乙基支链的羧酸，它可通过化学合成或从某些动物和细菌中分离。虽然某些细菌如大肠杆菌（Escherichia coli）不天然产生支链脂肪酸，一些细菌如芽孢杆菌属（Bacillus）和链霉菌属（Streptomyces）的成员能够天然产生这些脂肪酸。例如阿维链霉菌（Streptomyces avermitilis）和枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）都产生具有14个至17个总碳的支链脂肪酸，其中支链位于异和反异位置（Cropp等人，Can.J.Microbiology 46：506-14（2000）；DeMendoza等人，Biosynthesis and Function of Membrane Lipids，Bacillussubtilis and Other Gram-Positive Bacteria，Sonenshein和Losick编辑，American Society for Microbiology（1993））。然而，这些生物不产生商业可用量的支链脂肪酸。这些天然生物的另一限制是它们似乎不产生中链支链脂肪酸如具有11个或13个碳的那些。此外，如果期望脂肪酸具有特定的链长、支链在特定碳上、或者支链在除异和反异位点之外的位点上，这些脂肪酸可能是不可用的或者不能轻易地从天然生物中分离有意义的量。
同样地，需要商业可用的、细菌制备的支链脂肪酸。此外，需要制备此类支链脂肪酸的方法。
发明概述
本发明提供了生产分散的支链脂肪酸的方法和细胞。在某些实施方案中，在细胞中生产支链脂肪酸的方法包括在细胞中表达一种或更多种重组多肽，所述多肽催化甲基丙二酰CoA转化成甲基丙二酰ACP；并且在适于生产所述多肽的条件下培养所述细胞使得支链脂肪酸产生。
本发明也提供了在细胞中生产支链脂肪酸的方法，所述方法包括在细胞中表达一种或更多种重组多肽，所述多肽提高细胞中的甲基丙二酰CoA的产量；并且在适于生产所述重组多肽的条件下培养所述细胞使得支链脂肪酸产生。
在某些实施方案中，本发明提供了在细胞中生产支链脂肪酸的方法，所述方法包括在细胞中表达具有丙酰CoA合成酶活性的多肽；抑制丙酰CoA合成酶的丙酰化；并且在适于生产所述多肽的条件下培养所述细胞使得支链脂肪酸产生。
本发明还提供了在细胞中生产支链脂肪酸的方法，所述方法包括在细胞中表达具有甲基丙二酰CoA变位酶活性的多肽；在细胞中表达具有甲基丙二酰CoA差向异构酶活性的多肽；并且在适于生产所述多肽的条件下培养所述细胞使得支链脂肪酸产生。
本发明还提供了包含生物性生产的支链脂肪酸混合物的组合物。所述组合物可包括具有C12至C16的链长并且约1个至约3个甲基支链定位在一个或更多个偶数碳上的支链脂肪酸。
在某些实施方案中，本发明提供了在细胞中生产支链脂肪酸的方法，所述方法包括在细胞中表达一种或更多种重组多肽，所述多肽提高细胞中的甲基丙二酰CoA的产量；在细胞中表达重组多肽，所述多肽催化甲基丙二酰CoA转化成甲基丙二酰ACP；并且在适于生产所述重组多肽的条件下培养所述细胞使得支链脂肪酸产生。
此外，在某些实施方案中，本发明提供了在细胞中生产支链脂肪酸的方法，所述方法包括在细胞中表达一种或更多种重组多肽，所述多肽提高细胞中的甲基丙二酰CoA的产量；在细胞中表达重组多肽，所述多肽催化甲基丙二酰CoA转化成甲基丙二酰ACP；在细胞中表达重组硫酯酶；并且在适于生产所述重组多肽的条件下培养所述细胞使得支链脂肪酸产生。
本发明还提供了在细胞中生产支链脂肪酸的方法，所述支链脂肪酸具有约10个至18个碳的链长并在第二个碳上支化。所述方法包括修饰所述细胞以提高流向甲基丙二酰CoA的碳流；并且在适于流向甲基丙二酰CoA的碳流增加的条件下培养所述细胞使得具有约10个至约18个碳的链长并在第二个碳上支化的支链脂肪酸产生。在某些实施方案中，支化可发生在第四个、第六个、第八个、第十个或第十二个碳上。
在某些实施方案中提供了在细胞中生产支链脂肪酸的方法，所述支链脂肪酸具有约10个至18个碳的链长并在第二个碳上支化。所述方法包括修饰所述细胞以从甲基丙二酰CoA中生成甲基丙二酰ACP；并且在适于从甲基丙二酰CoA中生成甲基丙二酰ACP的条件下培养所述细胞使得具有约10个至约18个碳的链长并在第二个碳上支化的支链脂肪酸产生。在某些实施方案中，支化可发生在第四个、第六个、第八个、第十个或第十二个碳上。
本发明还提供了在细胞中生产改性脂肪酸的方法，所述方法包括提供具有II型脂肪酸合酶活性的细胞；在细胞中表达一种或更多种重组多肽，所述多肽催化至少一种中间代谢物的形成，其中所述至少一种中间代谢物通过II型脂肪酸合酶混入；并且在适于生产所述重组多肽的条件下培养所述细胞使得改性脂肪酸产生。
本发明还提供了生产支链脂肪酸的埃希氏菌属（Escherichia）细胞，所述支链脂肪酸具有约10个至约18个碳的链长并且在一个或更多个偶数碳上包含一个或更多个甲基支链。
本发明还提供生产支链脂肪酸的方法，所述支链脂肪酸在一个或更多个偶数碳上包含甲基。所述方法包括培养细胞，所述细胞包含下列多核苷酸：（aa）外来的或过表达的多核苷酸，所述多核苷酸包含编码多肽的核酸序列，所述多肽催化丙酰CoA转化成甲基丙二酰CoA，和/或（bb）外来的或过表达的多核苷酸，所述多核苷酸包含编码多肽的核酸序列，所述多肽催化琥珀酰CoA转化成甲基丙二酰CoA。在允许一种或更多种多核苷酸的表达和支链脂肪酸的生产的条件下培养所述细胞。任选地，所述方法还包括从培养物中提取支链脂肪酸或支链脂肪酸的产物。本发明还提供了细胞，所述细胞包含下列多核苷酸：（i）包含编码缺少聚酮合成活性的酰基转移酶的核酸序列的外来的或过表达的多核苷酸，和（ii）包含编码丙酰CoA羧化酶的核酸序列的外来的或过表达的多核苷酸，和/或包含编码在细胞中表达的甲基丙二酰CoA变位酶的核酸序列的外来的或过表达的多核苷酸。所述细胞比不包含所述一种或更多种多核苷酸的其它类似的细胞生产更多的支链脂肪酸，所述支链脂肪酸在一个或更多个偶数碳上包含甲基。
以下每个编号的段落简明地定义本发明的一个或更多个示例性变型：
1.方法，所述方法用于生产在一个或更多个偶数碳上包含甲基的支链脂肪酸，所述方法包括在允许一种或更多种多核苷酸的表达和支链脂肪酸的生产的条件下培养细胞，所述细胞包含下列多核苷酸：
（aa）外来的或过表达的多核苷酸，所述多核苷酸包含编码多肽的核酸序列，所述多肽催化丙酰CoA转化成甲基丙二酰CoA，和/或（bb）外来的或过表达的多核苷酸，所述多核苷酸包含编码多肽的核酸序列，所述多肽催化琥珀酰CoA转化成甲基丙二酰CoA，其中所述细胞比不包含所述一种或更多种多核苷酸的其它类似的细胞生产更多的脂肪酸，所述脂肪酸在一个或更多个偶数碳上包含甲基。
2.如段落1所述的方法，所述方法还包括从培养物中提取所述支链脂肪酸或所述支链脂肪酸的产物。
3.如段落1或段落2所述的方法，其中所述催化丙酰CoA转化成甲基丙二酰CoA的多肽是丙酰CoA羧化酶，和/或所述催化琥珀酰CoA转化成甲基丙二酰CoA的多肽是甲基丙二酰CoA变位酶。
4.如段落3所述的方法，其中（i）所述丙酰CoA羧化酶是天蓝色链霉菌（Streptomyces coelicolor）PccB和AccA1或PccB和AccA2，和/或（ii）所述甲基丙二酰CoA变位酶是两面神菌（Janibacter sp.）HTCC2649甲基丙二酰CoA变位酶、肉桂地链霉菌（S.cinnamonensis）MutA和MutB或大肠杆菌Sbm。
5.如段落3所述的方法，其中（i）所述甲基丙二酰CoA变位酶包含的氨基酸序列与如SEQ ID NO:3、4或28所示的氨基酸序列具有至少约80%的序列同一性，和/或（ii）所述丙酰CoA羧化酶包含的氨基酸序列与如SEQ ID NO:9和10所示的氨基酸序列具有至少约80%的序列同一性。
6.如段落3-5中的任一项所述的方法，其中所述细胞包含具有编码甲基丙二酰CoA变位酶的核酸序列的外来的或过表达的多核苷酸，并且还包含具有编码甲基丙二酰CoA差向异构酶的核酸序列的外来的或过表达的多核苷酸。
7.如段落1-6中的任一项所述的方法，其中所述细胞还包含下列多核苷酸：编码缺少聚酮合成活性的酰基转移酶的外来的或过表达的多核苷酸，和/或包含编码硫酯酶的核酸序列的外来的或过表达的多核苷酸。
8.如段落7所述的方法，其中所述酰基转移酶是FabD，它是聚酮合酶的酰基转移酶结构域或分支杆菌属（Mycobacterium）结核蜡酸合酶的酰基转移酶结构域。
9.如段落1-8中的任一项所述的方法，其中所述细胞已经经修饰以降低内源甲基丙二酰CoA变位酶活性、内源甲基丙二酰CoA脱羧酶活性和/或内源酰基转移酶活性。
10.如段落1-9中的任一项所述的方法，其中所述细胞生产II型脂肪酸合酶。
11.如段落1-10中的任一项所述的方法，其中所述细胞是大肠杆菌。
12.由段落1-11中的任一项所述的方法生产的支链脂肪酸。
13.细胞，所述细胞包含下列多核苷酸：（i）包含编码缺少聚酮合成活性的酰基转移酶的核酸序列的外来的或过表达的多核苷酸，和（ii）包含编码丙酰CoA羧化酶的核酸序列的外来的或过表达的多核苷酸，和/或包含编码甲基丙二酰CoA变位酶的核酸序列的外来的或过表达的多核苷酸，其中所述一种或更多种多核苷酸被表达，并且所述细胞比不包含所述一种或更多种多核苷酸的其它类似的细胞生产更多的支链脂肪酸，所述支链脂肪酸在一个或更多个偶数碳上包含甲基。
14.如段落13所述的细胞，其中（i）所述丙酰CoA羧化酶是天蓝色链霉菌PccB和AccA1或PccB和AccA2，和/或（ii）所述甲基丙二酰CoA变位酶是两面神菌HTCC2649甲基丙二酰CoA变位酶、肉桂地链霉菌MutA和MutB或大肠杆菌Sbm。
15.如段落13所述的细胞，其中（i）所述甲基丙二酰CoA变位酶包含的氨基酸序列与如SEQ ID NO:3、4或28所示的氨基酸序列具有至少约80%的序列同一性，和/或（ii）所述丙酰CoA羧化酶包含的氨基酸序列与如SEQ ID NO:9和10所示的氨基酸序列具有至少约80%的序列同一性。
16.如段落13-15中的任一项所述的细胞，其中所述细胞包含具有编码甲基丙二酰CoA变位酶的核酸序列的外来的或过表达的多核苷酸，并且还包含具有编码甲基丙二酰CoA差向异构酶的核酸序列的外来的或过表达的多核苷酸。
17.如段落13-16中的任一项所述的细胞，其中所述酰基转移酶是FabD，它是聚酮合酶的酰基转移酶结构域或分支杆菌属结核蜡酸合酶的酰基转移酶结构域。
18.如段落13-17中的任一项所述的细胞，其中所述细胞还包含具有编码硫酯酶的核酸序列的外来的或过表达的多核苷酸。
19.如段落13-18中的任一项所述的细胞，其中所述细胞已经经修饰以降低内源甲基丙二酰CoA变位酶活性、内源甲基丙二酰CoA脱羧酶活性和/或内源酰基转移酶活性。
20.如段落13-19中的任一项所述的细胞，其中所述细胞是大肠杆菌。
21.在细胞中生产支链脂肪酸的方法，所述方法包括：a.在所述细胞中表达一种或更多种重组多肽，所述多肽催化甲基丙二酰CoA转化成甲基丙二酰ACP；以及b.在适于生产所述多肽的条件下培养所述细胞使得支链脂肪酸产生。
22.如段落21所述的方法，其中所述多肽是酰基转移酶。
23.如段落21所述的方法，其中所述多肽由fabD编码。
24.如段落22所述的方法，其中所述多肽是聚酮合酶或其一部分。
25.如段落21所述的方法，其中所述多肽是分支杆菌属结核蜡酸合酶或其一部分。
26.如段落21所述的方法，其中所述多肽与如SEQ ID NO:19所示的序列具有至少约60%的序列同一性。
27.如段落21所述的方法，其中所述方法还包括在所述细胞中表达
编码外来硫酯酶的多肽。
28.如段落21所述的方法，其中所述细胞是埃希氏菌属细胞。
29.如段落21所述的方法，其中所述细胞在表达所述多肽后比在表达所述多肽前产生更高水平的支链脂肪酸。
30.如段落21所述的方法，其中所述支链脂肪酸包含一个或更多个甲基支链。
31.如段落30所述的方法，其中所述一个或更多个甲基支链位于偶数碳上。
32.如段落21所述的方法，其中所述支链脂肪酸不在所述细胞中天然产生。
33.由段落21所述的方法生产的支链脂肪酸。
34.包含至少一种重组多肽的细胞，所述多肽催化甲基丙二酰CoA转化成甲基丙二酰ACP，其中包含所述重组多肽的细胞比不包含所述重组多肽的其它类似的细胞生产更多的支链脂肪酸。
35.在细胞中生产支链脂肪酸的方法，所述方法包括：a.在所述细胞中表达一种或更多种重组多肽，所述多肽提高所述细胞中的甲基丙二酰CoA的产量；b.在适于生产所述重组多肽的条件下培养所述细胞使得支链脂肪酸产生。
36.如段落35所述的方法，其中所述多肽的表达在所述细胞中引起提高的丙酰CoA合成酶活性。
37.如段落35所述的方法，其中所述多肽具有丙酰CoA羧化酶活性。
38.如段落35所述的方法，其中所述多肽与如SEQ ID NO:9或SEQID NO:10所示的序列具有至少约60%的序列同一性。
39.如段落35所述的方法，其中所述方法还包括在所述细胞中表达编码外来硫酯酶的多肽。
40.如段落35所述的方法，其中所述细胞是埃希氏菌属细胞。
41.如段落35所述的方法，其中所述细胞在表达所述多肽后比在表达所述多肽前产生更高水平的支链脂肪酸。
42.如段落35所述的方法，其中所述支链脂肪酸包含一个或更多个甲基支链。
43.如段落42所述的方法，其中所述一个或更多个甲基支链位于偶数碳上。
44.如段落35所述的方法，其中所述支链脂肪酸不在所述细胞中天然产生。
45.由段落35所述的方法生产的支链脂肪酸。
46.包含至少一种重组多肽的细胞，所述多肽提高所述细胞中甲基丙二酰CoA的产量，其中包含所述重组多肽的细胞比不包含所述重组多肽的其它类似的细胞生产更多的支链脂肪酸。
47.在细胞中生产支链脂肪酸的方法，所述方法包括：a.在所述细胞中表达具有丙酰CoA合成酶活性的多肽；b.抑制所述丙酰CoA合成酶的丙酰化；以及c.在适于生产所述多肽的条件下培养所述细胞使得支链脂肪酸产生。
48.如段落47所述的方法，其中所述多肽不包括经受丙酰化的赖氨酸。
49.如段落47所述的方法，其中步骤c）包括在用于培养所述细胞的培养基中提供白藜芦醇来源。
50.如段落47所述的方法，其中所述细胞不包括负责丙酰化所述丙酰CoA合成酶的N-乙酰转移酶。
51.如段落47所述的方法，其中所述多肽与SEQ ID NO:22编码的所述蛋白具有至少约60%的序列同一性。
52.如段落47所述的方法，其中所述细胞包含提高的酶活性以从丙酰CoA合成酶的一个或更多个赖氨酸残基上移除丙酰基。
53.如段落47所述的方法，其中所述方法还包括在所述细胞中表达编码外来硫酯酶的多肽。
54.如段落47所述的方法，其中所述细胞是埃希氏菌属细胞。
55.如段落47所述的方法，其中所述细胞在表达所述多肽后比在表达所述多肽前产生更高水平的支链脂肪酸。
56.如段落47所述的方法，其中所述支链脂肪酸包含一个或更多个甲基支链。
57.如段落56所述的方法，其中所述一个或更多个甲基支链位于偶数碳上。
58.如段落47所述的方法，其中所述支链脂肪酸不在所述细胞中天然产生。
59.由段落47所述的方法生产的支链脂肪酸。
60.在细胞中生产支链脂肪酸的方法，所述方法包括：a.在所述细胞中表达具有甲基丙二酰CoA变位酶活性的多肽；b.在细胞中表达具有甲基丙二酰CoA差向异构酶活性的多肽；以及c.在适于生产所述多肽的条件下培养所述细胞使得支链脂肪酸产生。
61.如段落60所述的方法，其中所述甲基丙二酰CoA变位酶多肽与如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示的序列具有至少约60%的序列同一性。
62.如段落60所述的方法，其中所述甲基丙二酰CoA差向异构酶多肽与如SEQ ID NO:6所示的序列具有至少约60%的序列同一性。
63.如段落60所述的方法，其中所述方法还包括在所述细胞中表达编码外来硫酯酶的多肽。
64.如段落60所述的方法，其中所述细胞是埃希氏菌属细胞。
65.如段落60所述的方法，其中所述细胞在表达所述多肽后比在表达所述多肽前产生更高水平的支链脂肪酸。
66.如段落60所述的方法，其中所述支链脂肪酸包含一个或更多个甲基支链。
67.如段落66所述的方法，其中所述一个或更多个甲基支链位于偶数碳上。
68.如段落60所述的方法，其中所述支链脂肪酸不在所述细胞中天然产生。
69.由段落60所述的方法生产的支链脂肪酸。
70.包含重组多肽的细胞，所述多肽具有甲基丙二酰CoA变位酶活性和甲基丙二酰CoA差向异构酶活性，其中包含所述重组多肽的细胞比不包含所述重组多肽的其它类似的细胞生产更多的支链脂肪酸。
71.包含生物性生产的支链脂肪酸混合物的组合物，所述支链脂肪酸具有C12至C16的链长以及定位在一个或更多个偶数碳上的约1个至约3个甲基支链。
72.在细胞中生产支链脂肪酸的方法，所述方法包括：a.在所述细胞中表达一种或更多种重组多肽，所述多肽提高所述细胞中的甲基丙二酰CoA的产量；b.在所述细胞中表达重组多肽，所述多肽催化甲基丙二酰CoA转化成甲基丙二酰ACP；以及c.在适于生产所述重组多肽的条件下培养所述细胞使得支链脂肪酸产生。
73.如段落72所述的方法，其中所述细胞在甲基丙二酰CoA脱羧酶的基因中具有缺失。
74.如段落72所述的方法，其中所述细胞附加地产生具有3-酮脂酰-ACP合酶活性的重组多肽，所述多肽识别甲基丙二酰ACP作为底物。
75.在细胞中生产支链脂肪酸的方法，所述方法包括：a.在所述细胞中表达一种或更多种重组多肽，所述多肽提高所述细胞中的甲基丙二酰CoA的产量；b.在所述细胞中表达重组多肽，所述多肽催化甲基丙二酰CoA转化成甲基丙二酰ACP；c.在所述细胞中表达重组硫酯酶；以及d.在适于生产所述重组多肽的条件下培养所述细胞使得支链脂肪酸产生。
76.如段落75所述的方法，其中所述细胞在甲基丙二酰CoA脱羧酶的基因中具有缺失。
77.如段落75所述的方法，其中所述细胞附加地产生具有3-酮脂酰-ACP合酶活性的重组多肽，所述多肽识别甲基丙二酰ACP作为底物。
78.在细胞中生产支链脂肪酸的方法，所述支链脂肪酸具有约10个至18个碳的链长并在所述第二个碳上支化，所述方法包括：a.修饰所述细胞以提高流向甲基丙二酰CoA的碳流；以及b.在适于流向甲基丙二酰CoA的碳流增加的条件下培养所述细胞使得具有约10个至约18个碳的链长并在所述第二个碳上支化的支链脂肪酸产生。
79.如段落78所述的方法，其中在所述第二个碳上的支链是甲基支链。
80.在细胞中生产支链脂肪酸的方法，所述支链脂肪酸具有约10个至18个碳的链长并在所述第四个碳上支化，所述方法包括：a.修饰所述细胞以提高流向甲基丙二酰CoA的碳流；以及b.在适于流向甲基丙二酰CoA的碳流增加的条件下培养所述细胞使得具有约10个至约18个碳的链长并在所述第四个碳上支化的支链脂肪酸产生。
81.如段落80所述的方法，其中在所述第四个碳上的支链是甲基支链。
82.在细胞中生产支链脂肪酸的方法，所述支链脂肪酸具有约10个至18个碳的链长并在所述第六个碳上支化，所述方法包括：a.修饰所述细胞以提高流向甲基丙二酰CoA的碳流；以及b.在适于流向甲基丙二酰CoA的碳流增加的条件下培养所述细胞使得具有约10个至约18个碳的链长并在所述第六个碳上支化的支链脂肪酸产生。
83.如段落82所述的方法，其中在所述第六个碳上的支链是甲基支链。
84.在细胞中生产支链脂肪酸的方法，所述支链脂肪酸具有约12个至18个碳的链长并在所述第八个碳上支化，所述方法包括：a.修饰所述细胞以提高流向甲基丙二酰CoA的碳流；以及b.在适于流向甲基丙二酰CoA的碳流增加的条件下培养所述细胞使得具有约12个至约18个碳的链长并在所述第八个碳上支化的支链脂肪酸产生。
85.如段落84所述的方法，其中在所述第八个碳上的支链是甲基支链。
86.在细胞中生产支链脂肪酸的方法，所述支链脂肪酸具有约14个至18个碳的链长并在所述第十个碳上支化，所述方法包括：a.修饰所述细胞以提高流向甲基丙二酰CoA的碳流；以及b.在适于流向甲基丙二酰CoA的碳流增加的条件下培养所述细胞使得具有约14个至约18个碳的链长并在所述第十个碳上支化的支链脂肪酸产生。
87.如段落86所述的方法，其中在所述第十个碳上的支链是甲基支链。
88.在细胞中生产支链脂肪酸的方法，所述支链脂肪酸具有约16个至18个碳的链长并在所述第十二个碳上支化，所述方法包括：a.修饰所述细胞以提高流向甲基丙二酰CoA的碳流；以及b.在适于流向甲基丙二酰CoA的碳流增加的条件下培养所述细胞使得具有约16个至约18个碳的链长并在所述第十二个碳上支化的支链脂肪酸产生。
89.如段落88所述的方法，其中在所述第十二个碳上的支链是甲基支链。
90.在细胞中生产支链脂肪酸的方法，所述支链脂肪酸具有约10个至18个碳的链长并在所述第二个碳上支化，所述方法包括：a.修饰所述细胞以从甲基丙二酰CoA中生成甲基丙二酰ACP；以及b.在适于从甲基丙二酰CoA中生成甲基丙二酰ACP的条件下培养所述细胞使得具有约10个至约18个碳的链长并在所述第二个碳上支化的支链脂肪酸产生。
91.如段落90所述的方法，其中在所述第二个碳上的支链是甲基支链。
92.在细胞中生产支链脂肪酸的方法，所述支链脂肪酸具有约10个至18个碳的链长并在所述第四个碳上支化，所述方法包括：a.修饰所述细胞以从甲基丙二酰CoA中生成甲基丙二酰ACP；以及b.在适于从甲基丙二酰CoA中生成甲基丙二酰ACP的条件下培养所述细胞使得具有约10个至约18个碳的链长并在所述第四个碳上支化的支链脂肪酸产生。
93.如段落92所述的方法，其中在所述第四个碳上的支链是甲基支链。
94.在细胞中生产支链脂肪酸的方法，所述支链脂肪酸具有约10个至18个碳的链长并在所述第六个碳上支化，所述方法包括：a.修饰所述细胞以从甲基丙二酰CoA中生成甲基丙二酰ACP；以及b.在适于从甲基丙二酰CoA中生成甲基丙二酰ACP的条件下培养所述细胞使得具有约10个至约18个碳的链长并在所述第六个碳上支化的支链脂肪酸产生。
95.如段落94所述的方法，其中在所述第六个碳上的支链是甲基支链。
96.在细胞中生产支链脂肪酸的方法，所述支链脂肪酸具有约12个至18个碳的链长并在所述第八个碳上支化，所述方法包括：a.修饰所述细胞以从甲基丙二酰CoA中生成甲基丙二酰ACP；以及b.在适于从甲基丙二酰CoA中生成甲基丙二酰ACP的条件下培养所述细胞使得具有约12个至约18个碳的链长并在所述第八个碳上支化的支链脂肪酸产生。
97.如段落96所述的方法，其中在所述第八个碳上的支链是甲基支链。
98.在细胞中生产支链脂肪酸的方法，所述支链脂肪酸具有约14个至18个碳的链长并在所述第十个碳上支化，所述方法包括：a.修饰所述细胞以从甲基丙二酰CoA中生成甲基丙二酰ACP；以及b.在适于从甲基丙二酰CoA中生成甲基丙二酰ACP的条件下培养所述细胞使得具有约14个至约18个碳的链长并在所述第十个碳上支化的支链脂肪酸产生。
99.如段落98所述的方法，其中在所述第十个碳上的支链是甲基支链。
100.在细胞中生产支链脂肪酸的方法，所述支链脂肪酸具有约16个至18个碳的链长并在所述第十二个碳上支化，所述方法包括：a.修饰所述细胞以从甲基丙二酰CoA中生成甲基丙二酰ACP；以及b.在适于从甲基丙二酰CoA中生成甲基丙二酰ACP的条件下培养所述细胞使得具有约16个至约18个碳的链长并在所述第十二个碳上支化的支链脂肪酸产生。
101.如段落100所述的方法，其中在所述第十二个碳上的支链是甲基支链。
102.在细胞中生产改性脂肪酸的方法，所述方法包括：a.提供具有II型脂肪酸合酶活性的细胞；b.在所述细胞中表达一种或更多种重组多肽，所述多肽催化至少一种中间代谢物的形成，其中所述至少一种中间代谢物通过所述II型脂肪酸合酶混入；以及c.在适于生产所述重组多肽的条件下培养所述细胞使得改性脂肪酸产生。
103.如段落102所述的方法，其中所述细胞是埃希氏菌属细胞。
104.如段落102所述的方法，其中所述中间代谢物是甲基丙二酰ACP。
105.如段落102所述的方法，其中所述一种或更多种多肽催化甲基丙二酰CoA转化成甲基丙二酰ACP。
106.如段落102所述的方法，其中所述细胞在表达所述多肽后比在表达所述多肽前产生更高水平的改性脂肪酸。
107.如段落102所述的方法，其中所述改性脂肪酸在偶数碳上包含一个或更多个甲基支链。
108.如段落102所述的方法，其中所述多肽是酰基转移酶。
109.如段落102所述的方法，其中所述多肽由fabD编码。
110.如段落102所述的方法，其中所述多肽是聚酮合酶或其一部分。
111.如段落102所述的方法，其中所述多肽是分支杆菌属结核蜡酸合酶或其一部分。
112.生产支链脂肪酸的埃希氏菌属细胞，所述支链脂肪酸具有约10个至约18个碳的链长并且在一个或更多个偶数碳上包含一个或更多个甲基支链。
附图简述
图1是mutA核苷酸序列（SEQ ID NO:1）。
图2是mutB核苷酸序列（SEQ ID NO:2）。
图3是MutA蛋白序列（SEQ ID NO:3）。
图4是MutB蛋白序列（SEQ ID NO:4）。
图5是甲基丙二酰CoA差向异构酶核苷酸序列（SEQ ID NO:5）。
图6是甲基丙二酰CoA差向异构酶蛋白序列（SEQ ID NO:6）。
图7是accA1（GenBank登录号AF113603.1）的DNA序列（SEQ IDNO:7）。
图8是pccB（GenBank登录号AF113605.1）的DNA序列（SEQ IDNO:8）。
图9是AccA1的蛋白序列（SEQ ID NO:9）。
图10是PccB的蛋白序列（SEQ ID NO:10）。
图11示出包括PLlac0-1序列和噬菌体T7基因10核糖体结合位点的元件1（SEQ ID NO:11）。
图12示出包括优化的accA1基因序列的元件2（SEQ ID NO:12）。
图13示出包括间隔序列的元件3（SEQ ID NO:13）。
图14示出包括优化的pccB序列的元件4（SEQ ID NO:14）。
图15是丙酰CoA羧化酶基因表达的合成序列（SEQ ID NO:15）。
图16是PrpE的正向引物序列（SEQ ID NO:16）。
图17是PrpE的反向引物序列（SEQ ID NO:17）。
图18是来自牛分支杆菌（Mycobacterium bovis）BCG的MMAT区域序列（SEQ ID NO:18）。
图19是牛分支杆菌BCG MAS（GenBank登录号YP_979046）的蛋白序列（SEQ ID NO:19）。
图20是来自牛分支杆菌BCG的密码子优化的MMAT区域DNA序列（SEQ ID NO:20）。
图21是来自牛分支杆菌BCG的密码子优化的MMAT结构域与初始序列的比对（SEQ ID NO:20和21）。
图22是肠道沙门氏菌（Salmonella enterica）丙酰CoA合酶PrpE（GenBank登录号AAC44817）的蛋白序列（SEQ ID NO:22）。
图23是肠道沙门氏菌丙酰CoA合酶PrpE的DNA序列（SEQ ID NO.23）。
图24是示出在包含pTrcHisA pZA31（对照）、pZA31 mutAB Ss epi（MutAB Epi）、pTrcHisA Ec sbm（Sbm）或pTrcHisA Ec sbmpZA31 Mbmmat（Sbm/Mmat）的大肠杆菌菌株K27-Z1中的甲基丙二酰CoA产量（ng/ml）的柱状图。在对照样品中未鉴定出甲基丙二酰CoA；该图指示检测的背景水平。
图25是示出在包含pZA31-accA1-pccB（Pcc）的大肠杆菌BW25113（对照）和BW25113中的甲基丙二酰CoA产量（ng/ml）的柱状图。在对照样品中未鉴定出甲基丙二酰CoA；该图指示检测的背景水平。示出两个生物重复样本。
图26是由BL21 Star（DE3）大肠杆菌产生的脂肪酸样品的2D总离子色谱的二维（2D）图，所述菌株包含pTrcHisA Ec sbm So ce epi pZA31mmat。图上的发光区域指示样品材料的存在。峰名称和箭头符号指示通过质谱仪进一步表征的样品。
图27是由对照菌株BL21 Star（DE3）大肠杆菌产生样品的2D总离子色谱的二维（2D）图，所述菌株包含pTrcHisA pZA31。未检出支链脂肪酸。箭头符号指示标示链长的直链脂肪酸衍生物的存在。
图28示出在图26中识别的峰54、55和57的质谱。八个和十个碳的支链脂肪酸在顶部的两个特征图中示出，并且通过几乎完全缺失圆圈标示片段进行鉴定。初步鉴定了十二-支链脂肪酸并在第三个特征图中示出。
发明详述
本发明涉及改善的分散支链脂肪酸的生物性生产。此外，在某些实施方案中，本发明提供生物性生产的分散支链脂肪酸的改善组合物，所述分散的支链脂肪酸具有确定的链长以及在脂肪酸内的一个或更多个偶数碳上的甲基支链。此外，在某些实施方案中，可将脂肪酸长度修剪成预定的长度，例如产生具有C12至C16主链的脂肪酸。在某些实施方案中，所述方法和/或细胞能够产生具有不同数量甲基支链、不同位置甲基支链和不同长度甲基支链的脂肪酸的混合物，例如具有C12至C16的链长和位于一个或更多个偶数碳上的约0个至约3个甲基支链的脂肪酸的混合物。
如本文所用，“扩增”指将多核苷酸序列拷贝成大量多核苷酸分子的任何方法或规程如反转录、聚合酶链反应和连接酶链反应。
如本文所用，“反义序列”指特异性地与第二个多核苷酸序列杂交的序列。例如反义序列是相对于其转录正常取向反向的DNA序列。反义序列能够表达与在宿主细胞内表达的靶mRNA分子互补的RNA转录物（例如它能够通过Watson-Crick碱基配对杂交到靶mRNA分子上）。
如本文所用，“cDNA”指以单链或双链形式与mRNA互补或相同的DNA。
如本文所用，脂肪酸中的碳从作为羧酸基部分的第一个碳开始计数，并且第二个碳（C2）邻近第一个碳。计数继续进行以便最高的碳数距离羧酸基最远。“偶数”碳包括C2、C4、C6、C8、C10、C12、C14等等。
如本文所用，“互补”指与多核苷酸与第二多核苷酸碱基成对。换句话说，“互补”描述了通过碱基配对退火的两个单链核酸序列之间的关系。例如具有序列5'-GTCCGA-3'的多核苷酸与具有序列5'-TCGGAC-3'的多核苷酸互补。
如本文所用，“保守取代”指用将多肽中的一个氨基酸用功能上类似的氨基酸取代。换句话说，保守取代涉及用一个具有相似侧链的氨基酸残基取代一个氨基酸残基。本领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族，它们包括具有碱性侧链的氨基酸（例如赖氨酸、精氨酸和组氨酸）、具有酸性侧链的氨基酸（例如天冬氨酸和谷氨酸）、具有不带电极性侧链的氨基酸（例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸和半胱氨酸）、具有非极性侧链的氨基酸（例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸和色氨酸）、具有β-支链侧链的氨基酸（例如苏氨酸、缬氨酸和异亮氨酸）和具有芳族侧链的氨基酸（例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和组氨酸）。
如本文所用，“编码”指核苷酸作为其他聚合物和大分子合成模板作用的固有特性。除非另外指明，“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括彼此为简并版本并编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列
如本文所用，“内源的”指在生物体或细胞内天然表达的或原生的多核苷酸、多肽或其他化合物。即，内源多核苷酸、多肽或其他化合物不是外来的。例如当所述细胞初始分离自天然来源时，“内源的”多核苷酸或肽存在于细胞中。
如本文所用，“表达载体”指包含重组多核苷酸的载体，所述多核苷酸包含可操作地连接到拟表达的核苷酸序列上的表达控制序列。例如合适的表达载体无限制地包括自主复制载体或整合进染色体中的载体。在某些情况下，表达载体是基于病毒的载体。
如本文所用，“外来的”指在其中期望进行表达的特定细胞或生物体中非天然表达的任何多核苷酸或多肽。内源多核苷酸、多肽或其他化合物不是外来的。
如本文所用，“杂交”包括核酸链与互补核酸链通过碱基配对接合的任何过程。因此，该术语指靶序列结合到测试（即，靶）序列上的互补能力，或者反之亦然。
如本文所用，“杂交条件”通常按测量杂交的条件的“严格性”程度分类。严格性程度可基于核酸结合络合物或探针的例如熔融温度（Tm）确定。例如“最大严格性”通常发生在约Tm-5℃（低于探针Tm 5°）；“高严格性”在约低于Tm 5-10℃；“中严格性”在约低于探针Tm 10-20°；并且“低严格性”在约低于Tm 20-25°。作为另外一种选择或除此之外，杂交条件可基于杂交的盐或离子强度条件和/或一次或多次严格性洗涤来确定。例如，6×SSC=非常低的严格性；3×SSC=低至中的严格性；l×SSC=中严格性；并且0.5×SSC=高严格性。功能上，最大严格性条件可用于鉴定与杂交探针具有严格（即，约100%）同一性或近严格同一性的核酸序列；而高严格性条件可用于鉴定与探针具有约80%或更高序列同一性的核酸序列。
如本文所用，涉及两个或更多个多核苷酸或多肽序列的“相同的”或百分比“同一性”指两个或更多个序列当使用序列比较算法或目测比较并比对最大匹配时，它们是相同的或者具有指定百分比的相同核苷酸或氨基酸残基。
如本文所用，“长链脂肪酸”指具有长于14个碳的脂族尾的脂肪酸。在本发明的一些实施方案中，长链脂肪酸的前提条件是在碳主链中包含15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个或22个碳。
如本文所用，“中链脂肪酸”指具有介于6个和14个碳之间的脂族尾的脂肪酸。在某些实施方案中，中链脂肪酸可具有11个至13个碳。
如本文所用，“天然存在的”指天然可见的物质。例如存在于生物体（包括病毒）中的多肽或多核苷酸序列，其能够从天然来源中分离并且未曾在实验室中受到人为地有意改变，是天然存在的。
如本文所用，当描述两个DNA区域或两个多肽区域之间的关系时，“可操作地连接”指所述区域彼此功能上相关。例如，如果启动子控制编码序列的转录，它可操作地连接至该序列；如果将核糖体结合位点定位以允许翻译，它可操作地连接至编码序列；并且如果序列功能上作为信号序列，例如通过参与成熟形式蛋白的分泌，它可操作地连接至肽。
如本文所用，“超表达”指在宿主细胞中以比正常表达水平更高的水平表达多核苷酸以产生产物（例如多肽或RNA）。超表达的多核苷酸一般是宿主细胞的天然多核苷酸，其生成的产物量大于宿主细胞中正常存在的量。超表达例如并且不受限制地通过将多核苷酸可操作地连接至与该多核苷酸天然启动子不同的启动子或者将附加拷贝的所述多核苷酸引入宿主细胞中来完成。
如本文所用，“多核苷酸”指由核苷酸组成的聚合物。多核苷酸可为分离片段形式或者可为较大的核苷酸序列构建体的组件，其已经来源于分离至少一次的核苷酸序列，该核苷酸序列的数量或浓度使其能够通过标准分子生物学方法如使用克隆载体鉴定、操纵、并回收该序列及其组成核苷酸序列。当核苷酸序列用DNA序列（即，A、T、G、C）表示时，这也包括RNA序列（即，A、U、G、C），其中“U”取代了“T”。换句话说，“多核苷酸”指与其他核苷酸分离的核苷酸聚合物（分离片段或实体）或者可为较大核苷酸构建体的组件或元件，例如表达载体或多顺反子序列。多核苷酸包括DNA、RNA和cDNA序列。
如本文所用，“多肽”指由氨基酸残基组成的聚合物，其可包含或可不包含修改形式如磷酸基和甲酰基。
如本文所用，“重组表达载体”指用于表达多核苷酸例如编码期望多肽的多核苷酸的DNA构建体。重组表达载体可包括例如转录亚基，其包括（i）具有基因表达调节功能的遗传元件如启动子和增强子的组合件，（ii）转录成mRNA并翻译成蛋白的结构或编码序列，以及（iii）合适的转录和翻译启动和终止序列。以任何合适的方式构建重组表达载体。载体的性质是不重要的，并且可使用任何载体包括质粒、病毒、噬菌体和转座子。本发明使用的可能载体包括但不限于染色体、非染色体和合成DNA序列如细菌质粒；噬菌体DNA；酵母质粒；和来源于质粒与噬菌体DNA组合的载体、来源于病毒如牛痘、腺病毒、禽痘、杆状病毒、SV40、以及伪狂犬病病毒的DNA。
如本文所用，“引物”指将多核苷酸引物置于诱导合成的条件下，能够特异性地杂交到指定多核苷酸模板上并提供互补多核苷酸合成启动点的多核苷酸。
如本文所用，“重组多核苷酸”指具有非天然连接在一起的序列的多核苷酸。可将重组多核苷酸包括在合适载体中，并且所述载体可用于转化合适的宿主细胞。包含重组多核苷酸的宿主细胞称为“重组宿主细胞”。然后将所述多核苷酸在重组宿主细胞中表达以生成例如“重组多肽”。
如本文所用，“特异性杂交”指多核苷酸在严格条件下优先结合、双联或杂交到特定核苷酸序列上。
如本文所用，“严格条件”指在该条件下探针将优先杂交到其靶向亚序列上，并且与其他序列杂交的程度较低或者完全不杂交。
如本文所用，“短链脂肪酸”指具有少于6个碳的脂族尾的脂肪酸。
如本文所用，涉及两个核酸或多肽的“基本上同源的”或“基本上相同的”一般指两个或更多个序列或亚序列当使用序列比较算法或目测比较并比对最大匹配时，具有至少40%、60%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的核苷酸或氨基酸残基同一性。基本上相同能够存在于序列任何合适的区域，例如长度为至少约50个残基的区域，长度为至少约100个残基的区域，或者长度为至少约150个残基的区域。在某些实施方案中，序列在任一个或两个比较生物聚合物全长上基本上相同。
在一个实施方案中，本发明涉及使用细菌制备分散的支链脂肪酸（或衍生自分散的支链脂肪酸的产物）的新方法。一般来讲，所述方法包括增加细胞内甲基丙二酰CoA的供应和/或增加细胞内甲基丙二酰CoA向甲基丙二酰ACP的转化，将来自甲基丙二酰CoA动支链加到脂肪酸上，以及任选地使用硫酯酶以确定脂肪酸大小范围。在某些实施方案中，所述方法提供链长C12至C16的支链脂肪酸。此外，在某些实施方案中，所述支链脂肪酸具有约0个至约3个甲基支链，例如约1个至约3个甲基支链，例如约1个至约2个甲基支链，或位于一个或更多个碳上的1个、2个或3个甲基支链。在某些实施方案中，甲基支链位于偶数碳上。
在一个实施方案中，通过经由例如丙酰CoA和/或琥珀酰CoA中间体提高细胞内甲基丙二酰CoA的产量来提高分散的支链脂肪酸的产量。因此，在一个方面，本发明提供了生产支链脂肪酸的方法，所述支链脂肪酸在一个或更多个偶数碳上包含一个甲基。所述方法包括培养细胞，所述细胞包含下列多核苷酸：外来的或过表达的多核苷酸，所述多核苷酸包含编码多肽的核酸序列，所述多肽催化丙酰CoA转化成甲基丙二酰CoA，和/或外来的或过表达的多核苷酸，所述多核苷酸包含编码多肽的核酸序列，所述多肽催化琥珀酰CoA转化成甲基丙二酰CoA。在允许一种或更多种多核苷酸的表达和支链脂肪酸的生产的条件下培养细胞。所述细胞比不包含所述一种或更多种多核苷酸的其它类似的细胞（例如相同细胞类型的细胞或来源于不包含所述一种或更多种多核苷酸的相同生物的细胞）生产更多的支链脂肪酸，所述支链脂肪酸在一个或更多个偶数碳上包含甲基支链。通过丙酰CoA羧化酶的作用，将丙酰CoA转化成甲基丙二酰CoA。任何催化丙酰CoA转化成甲基丙二酰CoA的丙酰CoA羧化酶是本发明方法适用的。示例性的丙酰CoA羧化酶是来自天蓝色链霉菌的羧化酶，其包含两个异源亚基，它们由pccB和或者accA1或者accA2编码。在某些实施方案中，本发明方法的细胞经工程化以产生PccB和AccA1或PccB和AccA2。在一个方面，所述细胞包含一种或更多种多核苷酸，其编码的一种或更多种多肽包含的氨基酸序列与如SEQ ID NO:9和/或10所示的氨基酸序列具有至少约80%相同（例如85%、90%、95%或100%相同）。此外，催化丙酰CoA转化成甲基丙二酰CoA的多肽的非限制性实例是来自耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis）、人类（Homo sapiens）、鲍氏不动杆菌（Acinetobacter baumannii）、猪布鲁氏菌（Brucella suis）、红色糖多孢菌（Saccharopolyspora erythraea）、水稻细菌性谷枯病菌（Burkholderiaglumae）和埃及斑蚊（Aedes aegypti）的丙酰CoA羧化酶，以及如表A所示的丙酰CoA羧化酶。
表A
任选地，修饰所述细胞以提高流向丙酰CoA（并且随后流向甲基丙二酰CoA）的碳流，例如提高prpE或其他丙酰CoA合成酶基因的表达（即，过表达）。作为另外一种选择或除此之外，将包含编码丙酰CoA合成酶的核酸序列的外来多核苷酸引入宿主细胞以上调丙酰CoA产量。此外，供应宿主细胞（例如微生物细胞）大量甲硫氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苏氨酸、丙酸和/或奇数链长的脂肪酸（例如戊酸）提高甲基丙二酰CoA的丙酰CoA前体的产量。
利用将丙酮酸转化成丙酰CoA的代谢途径也提高了经由丙酰CoA得到的甲基丙二酰CoA的产量，所述代谢途径用乳酸、乳酰CoA和丙烯酰CoA作为中间体。通过过量生产所述途径的酶、产生催化所述途径的一个或更多个转化的外来酶和/或通过提供比正常存在于宿主细胞中的丙酮酸或乳酸量更大的丙酮酸或乳酸量上调流向丙酰CoA的碳流。例如，在本发明的任何实施方案中，所述细胞包含编码乳酸脱氢酶、乳酸CoA转移酶、乳酰CoA脱水酶和/或丙烯酰CoA还原酶的外来的或过表达的多核苷酸。
此外，在本发明的任何方面，通过减弱负责碳分流的内源酶活性来最小化流向不导致期望支链脂肪酸形成的支链途径的碳流。不需要完全灭活内源活性；活性的任何减弱适用于本发明。通过例如突变所述酶的编码序列以产生不具备功能的或功能减弱的多肽、通过从细胞基因组中除去所述酶的全部或部分编码序列、通过干扰编码所述酶的RNA转录物的翻译（例如使用反义寡核苷酸）、或者通过操纵影响所述酶表达的表达控制序列来减弱（即，降低或灭活）酶活性。例如，在一个方面，修饰所述细胞以防止甲基丙二酰CoA降解，从而提高可用于转化成甲基丙二酰ACP的甲基丙二酰CoA的量。通过例如从宿主中除去或灭活甲基丙二酰CoA脱羧酶减少甲基丙二酰CoA的降解。换句话说，修饰所述细胞以减弱内源甲基丙二酰CoA脱羧酶的活性。例如在大肠杆菌中，甲基丙二酰CoA脱羧酶活性通过例如除去或突变ygfG来减弱。任选地，减弱内源酰基转移酶的活性。作为另外一种选择或除此之外，通过例如除去或换句话讲减低（减弱）内源甲基丙二酰CoA变位酶基因的活性、阻止丙酰CoA转化成琥珀酰CoA的可供选择的代谢来提高细胞内的甲基丙二酰CoA产量。任选地，通过增加缬氨酸直接降解成甲基丙二酰CoA来提高甲基丙二酰CoA的水平。缬氨酸降解包含以下中间体：α-酮异戊酸、异丁酰CoA、甲基丙烯酰CoA、β-羟基异丁酰CoA、β-羟基异丁酸和甲基丙二酸半醛。任选地，甲基丙二酸半醛直接或通过丙酰CoA中间体间接转化成甲基丙二酰CoA。在一个示例性实施方案中，本发明的细胞包含过表达的或外来的多核苷酸，其包含编码一种或更多种以下酶的核酸序列：L-缬氨酸:2-酮戊二酸氨基转移酶、2-氧代异戊酸脱氢酶、异丁酰CoA:FAD氧化还原酶、3-羟基-异丁酰CoA水解酶、3-羟基异丁酰CoA水解酶、3-羟基异丁酸脱氢酶和/或甲基丙二酸半醛脱氢酶。甲基丙二酸半醛脱氢酶催化产生丙酰CoA，它可通过CoA羧化酶转化成甲基丙二酰CoA。
在一个方面，所述细胞包含外来的或过表达的多核苷酸，所述多核苷酸包含编码多肽的核酸序列，所述多肽催化琥珀酰CoA转化成甲基丙二酰CoA。催化所述反应的示例性多肽是甲基丙二酰CoA变位酶。在本发明的任何实施方案中，所述细胞经工程化以过表达甲基丙二酰CoA变位酶基因，例如大肠杆菌中的sbm（编码Sleeping Beauty变位酶）。作为另外一种选择或除此之外，在细胞中表达包含编码甲基丙二酰CoA变位酶的核酸序列的外来多核苷酸。示例性的甲基丙二酰CoA变位酶包括但不限于来自大肠杆菌的Sbm、来自肉桂地链霉菌的MutA和/或MutB或来自两面神菌HTCC2649、谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）、小眼虫（Euglena gracilis）、人类（Homo sapiens）、谢氏丙酸杆菌（Propionibacterium shermanii）、巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）和耻垢分枝杆菌的甲基丙二酰CoA变位酶。此外，催化琥珀酰CoA转化成甲基丙二酰CoA的多肽的非限制性实例在表B中提供。
表B
Figure BDA00001880021900251
在一个方面，所述细胞包含一种或更多种多核苷酸，所述多核苷酸编码的一种或更多种多肽包含的氨基酸序列与如SEQ ID NO:3、4和/或28所示的氨基酸序列至少约80%相同（例如85%、90%、95%或100%相同）。所述细胞可包含编码甲基丙二酰CoA变位酶、丙酰CoA羧化酶或二者的多核苷酸。
取决于由所述细胞产生的脂肪酸合酶的底物特异性，也可期望甲基丙二酰CoA差向异构酶有利于在脂肪酸合成中利用甲基丙二酰CoA作为前体。因此，在一个方面，所述细胞还包含外来的或过表达的多核苷酸，其包含编码甲基丙二酰CoA差向异构酶的核酸序列。适用于本发明的甲基丙二酰CoA差向异构酶包括但不限于纤维堆囊菌（Sorangium cellulosum）Soce 56甲基丙二酰CoA差向异构酶、链霉菌属菌种（Streptomyces sviceus）ATCC 29083甲基丙二酰CoA差向异构酶、苍黄色克里布所菌（Kribbellaflavida）DSM 17836甲基丙二酰CoA差向异构酶和来自人类（Homosapiens）、巨大芽孢杆菌或耻垢分枝杆菌的甲基丙二酰CoA差向异构酶。
也通过上调甲基丙二酰CoA转化成甲基丙二酰ACP提高在一个或更多个偶数碳上包含甲基支链的支链脂肪酸的产量。在一个或更多个实施方案中，在细胞中通过工程化所述细胞以产生酰基转移酶（例如由大肠杆菌中的fabD编码的酰基转移酶）来催化甲基丙二酰CoA转化成甲基丙二酰ACP，从而提高甲基丙二酰CoA向甲基丙二酰ACP的转化。换句话说，在一个方面，所述细胞还包含外来的或过表达的多核苷酸，其包含编码酰基转移酶的核酸序列。可使用任何适用的酰基转移酶，例如并且无限制地包括来自聚酮合酶的酰基转移酶结构域，例如那些涉及莫能菌素、环氧聚微管素、两性霉素、杀假丝菌素、制霉菌素、匹马菌素、子囊霉素、雷帕霉素、阿维菌素、多杀菌素、麦新米星、尼达霉素、竹桃霉素、巨大霉素、南昌霉素、苦霉素、利福霉素、寡霉素红霉素、多烯类抗菌素和大环内酯物的合成的酰基转移酶结构域，以及来自分支杆菌属结核蜡酸合酶的酰基转移酶结构域。来自较大的脂肪酸合酶如分支杆菌属结核蜡酸合酶的酰基转移酶结构域在缺失其他较大合酶的酶结构域的情况下作用于甲基丙二酰CoA。任选地，酰基转移酶缺失聚酮合成活性。“聚酮合成活性”指非酰基转移酶活性的酶活性，其催化宿主细胞中的聚酮化合物生产，例如并且无限制地包括酰基转移酶活性、酮脂酰合酶活性、酮脂酰还原酶活性、脱水酶活性、烯酰还原酶活性、酰基载体蛋白活性和硫酯酶活性。
作为另外一种选择或除此之外，在某些实施方案中，将3-酮脂酰-ACP合酶结构域例如来自聚酮合酶或结核蜡酸合酶的结构域加到宿主细胞的脂肪酸合酶上。在某些实施方案中，宿主细胞（例如微生物细胞）经工程化以包括酰基转移酶和3-酮脂酰-ACP合酶结构域，其能够识别甲基丙二酰CoA。此外，在某些实施方案中，能够减少（例如删除）内源酰基转移酶和/或3-酮脂酰-ACP合酶活性的基因以最小化脂肪酸合成中混入的丙二酰CoA的量。
在某些实施方案中，本发明包括例如使用硫酯酶以确定脂肪酸的链长，从而产生中链脂肪酸。在某些实施方案中，所述宿主细胞还包含外来的或过表达的多核苷酸，其包含编码硫酯酶的核酸序列。在一个方面，所述宿主细胞（例如细菌细胞）经工程化以产生硫酯酶，其有助于产生中链支链脂肪酸。作为另外一种选择，所述宿主细胞经工程化以产生（或过量产生）硫酯酶，其有助于产生长链支链脂肪酸。示例性的硫酯酶包括例如绿头鸭尾脂腺硫酯酶、加洲月桂硫酯酶、大鼠乳腺硫酯酶II、大肠杆菌TesA、赖特萼距花硫酯酶、以及适用于期望链长的脂肪酸生产的其他硫酯酶。
任选地，修饰所述细胞以产生（或提高其产量）支化的酰基CoA，它是长链脂肪酸生产中的延伸酶底物。在这个方面，在本发明的示例性实施方案中，所述细胞包含外来的或过表达的多核苷酸，其包含编码辅酶A合成酶的核酸序列，所述合成酶将支链脂肪酸转化成支化的酰基CoA。辅酶A合成酶的实例包括但不限于来自巴西利什曼原虫（GenBank登录号XP_001561614）的辅酶A合成酶，以及来自大肠杆菌（GenBank登录号YP_541006）的辅酶A合成酶。任选地，所述细胞包含外来的或过表达的一种或更多种多核苷酸，其包含编码延伸酶的核酸序列以提高碳主链的长度。延伸酶是表现出3-酮脂酰CoA合酶、3-酮脂酰CoA还原酶、3-羟酰CoA脱水酶和烯酰CoA还原酶活性，并且一般利用丙二酰CoA作为碳链延伸的延伸单位的酶络合物。当酶络合物使用甲基-丙二酰CoA作为延伸单位时，在偶数碳位置上引入附加的甲基支链。示例性延伸酶包括但不限于包含一个或更多个以下亚基的延伸酶：啤酒糖酵母（Saccharomycescerevisiae）3-酮脂酰CoA合酶（GenBank登录号NP_013476）、3-酮脂酰CoA还原酶（GenBank登录号NP_009717）、3-羟酰CoA脱水酶（GenBank登录号NP_012438）和烯酰CoA还原酶（GenBank登录号NP_010269）；以及拟南芥（Arabidopsis thaliana）col 3-酮脂酰CoA合酶（GenBank登录号NP_849861）、3-酮脂酰CoA还原酶（GenBank登录号NP_564905）、3-羟酰CoA脱水酶（GenBank登录号NP_193180）和烯酰CoA还原酶（GenBank登录号NP_191096）。
任何合适的细胞或生物例如细菌细胞和其他原核细胞、以及酵母细胞，可用于本发明。在一个方面，本发明涉及细胞如埃希氏菌属细胞（例如大肠杆菌），其天然产生II型脂肪酸合酶和/或不天然产生分散的支链脂肪酸（即，支链脂肪酸，其在一个或更多个偶数碳上包含甲基支链）。如本文所述，这些细胞经工程化以产生支链脂肪酸。作为另外一种选择，所述细胞天然产生支链脂肪酸并且如本文所述经修饰以产生比未经修饰的细胞更高水平的支链脂肪酸（或不同比例的不同类型支链脂肪酸）。在某些实施方案中，使用已知细菌如链霉菌属、分支杆菌属或棒状杆菌（Corynebacterium）制造脂肪酸以产生甲基丙二酰CoA前体。在一个方面这些细菌经工程化以产生（i）酰基转移酶，其提高流向混入脂肪酸合成途径的甲基丙二酰ACP的碳流，和/或（ii）硫酯酶，其控制链长。
适用于本发明的示例性细菌包括但不限于橙黄螺旋体（Spirochaetaaurantia）、卵黃螺旋体（Spirochaeta littoralis）、嗜麦芽假单胞菌（Pseudomonas maltophilia）、腐败假单胞菌（Pseudomonasputrefaciens）、野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris）、茴香军团菌（Legionella anisa）、卡他莫拉菌（Moraxella catarrhalis）、水生栖热菌（Thermus aquaticus）、水生黄杆菌（Flavobacterium aquatile）、非解糖拟杆菌（Bacteroides asaccharolyticus）、脆弱拟杆菌（Bacteroides fragilis）、溶淀粉琥珀酸单胞菌（Succinimonas amylolytica）、非洲脱硫弧菌（Desulfovibrio africanus）、运动性微球菌（Micrococcus agilis）、粘滑口腔球菌（Stomatococcus mucilaginosus）、柠檬色动性球菌（Planococcuscitreus）、白色海球菌（Marinococcus albusb）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、厌氧消化链球菌（Peptostreptococcusanaerobius）、白色瘤胃球菌（Ruminococcus albus）、藤黄八叠球菌（Sarcina lutea）、炭疽杆菌（Bacillus anthracis）、菊糖芽孢乳杆菌（Sporolactobacillus inulinus）、热纤梭菌（Clostridium thermocellum）、脲芽孢八叠球菌（Sporosarcina ureae）、致黑脱硫肠状菌（Desulfotomaculumnigrificans）、单核细胞增多性李斯特菌（Listeria monocytogenes）、热杀索丝菌（Brochothrix thermosphacta）、鲑鱼肾杆菌（Renibacteriumsalmoninarum）、佐氏库特氏菌（Kurthia zopfii）、水生棒杆菌（Corynebacterium aquaticum）、耐射线节杆菌（Arthrobacterradiotolerans）、发酵短杆菌（Brevibacterium fermentans）、产丙酸丙酸杆菌（Propionibacterium acidipropionici）、迟缓真杆菌（Eubacteriumlentum）、水生噬纤维菌（Cytophaga aquatilis）、多食鞘氨醇杆菌（Sphingobacteriuma multivorumb）、牙龈二氧化碳噬纤维菌（Capnocytophaga gingivalis）、粘球生孢噬纤维菌（Sporocytophagamyxococcoides）、华美屈挠杆菌（Flexibacter elegans）、珊瑚状粘球菌（Myxococcus coralloides）、过渡原囊菌（Archangium gephyra）、橙色标桩菌（Stigmatella aurantiaca）、骚动厄氏菌（Oerskovia turbata）、大肠杆菌（Escherichia coli）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）、谷氨酸棒状杆菌（Corynebacteriumglutamicum）、天蓝色链霉菌（Streptomyces coelicolor）、变铅青链霉菌（Streptomes lividans）、热纤梭菌（Clostridium thermocellum）和绿色糖单胞菌（Saccharomonospora viridis）。
在一个方面，通过本发明细胞产生的脂肪酸包含约80%至约100%（重量%）（例如约85%、约90%或约95%）的直链和支链脂肪酸。在所述细胞产生的直链和支链脂肪酸中，大约1%至约95%或更多的（例如5%、10%、15%、20%、30%、50%、60%、75%、85%或100%）脂肪酸是支链脂肪酸，其在一个或更多个碳上包含甲基。在一些实施方案中，所述细胞不产生或仅产生痕量在奇数碳上包含甲基支链的脂肪酸。“痕量”指由细胞产生的脂肪酸小于总脂肪酸含量的1%。作为另外一种选择或除此之外，在一个方面，由所述细胞产生的脂肪酸的混合物包含不超过50%的末端支化的脂肪酸（即，在40%的最长碳链非官能化末端内的碳原子上发生支化的脂肪酸）。任选地，本发明的细胞经修饰以优先产生具有期望链长的支链脂肪酸，例如在碳主链上具有约六个至约18个或更多的碳（不包括所述甲基支链）。在一些实施方案中，宿主细胞优选地产生长链脂肪酸、中链脂肪酸、短链脂肪酸、或期望脂肪酸的组合（例如细胞产生的60%、70%、80%、85%、90%、95%或更多的支链脂肪酸包含期望数目的碳）。此外，在某些实施方案中，工程化的细胞耐受在培养基、质膜、或脂滴中的大量支链脂肪酸，和/或通过例如与未改变细胞相比使用更便宜的原料、需要更少的发酵时间等来更经济地生产支链脂肪酸。
编码催化生成支链脂肪酸一种或更多种反应的一种或更多种多肽的一种或更多种多核苷酸可得自任何来源。取决于本发明的实施方案，所述多核苷酸分离自天然来源如细菌、藻类、真菌、植物或动物；经由半合成途径（例如多核苷酸的核酸序列经密码子优化以在特定宿主细胞如大肠杆菌中表达）产生；或从头合成。在某些实施方案中，基于例如酶的底物特异性、由该来源产生的支链脂肪酸的类型、或在给定宿主细胞中的酶活性水平从特定来源选择酶是有利的。在本发明的一个方面，所述酶和相应的多核苷酸天然存在于宿主细胞中并且期望超表达多核苷酸。在这个方面，在某些情况下，将附加拷贝的多核苷酸引入宿主细胞中以增加脂肪酸生产可用的酶量。天然多核苷酸的超表达也通过上调内源启动子活性或将所述多核苷酸可操作地连接至较强启动子上来完成。外来的酶和它们相应的多核苷酸也适用于本发明，并且可根据所用的特定酶改变生物合成途径的特征或终产物。如果需要，一种或更多种多核苷酸分离自或来源于本文所述的生产支链脂肪酸的生物。
在某些实施方案中，所述细胞生产本文所述多肽的类似物或变体。所述多肽的氨基酸序列变体包括取代、插入或缺失变体，并且变体可与上述未改变的多肽基本上同源或基本上相同。在某些实施方案中，所述变体保留所述多肽的至少一些生物活性，例如催化活性。其他变体包括所述多肽的变体，其保留至少约50%，优选地至少约75%，更优选地至少约90%的生物活性。
取代变体通常将蛋白内一个或更多个位点上的一个氨基酸换成另一个。这种取代可为保守取代，即，一个氨基酸用一个类似形状和电荷的氨基酸取代。保守取代包括例如以下改变：丙氨酸变为丝氨酸；精氨酸变为赖氨酸；天冬酰胺变为谷氨酰胺；天冬氨酸变为谷氨酸；半胱氨酸变为丝氨酸；谷氨酰胺变为天冬酰胺；谷氨酸变为天冬氨酸；异亮氨酸变为亮氨酸或缬氨酸；亮氨酸变为缬氨酸或异亮氨酸；赖氨酸变为精氨酸；甲硫氨酸变为亮氨酸或异亮氨酸；苯丙氨酸变为酪氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸；丝氨酸变为苏氨酸；苏氨酸变为丝氨酸；色氨酸变为酪氨酸；酪氨酸变为色氨酸或苯丙氨酸；以及缬氨酸变为异亮氨酸或亮氨酸。
在某些情况下，所述重组细胞包含本文所述的外来的或过表达的一种或更多种多核苷酸的类似物或变体。核酸序列变体包括一个或更多个取代、插入或缺失，并且变体可与未改变的多核苷酸基本上同源或基本上相同。多核苷酸变体或类似物编码突变酶，所述酶具有未改变的酶的至少部分活性。作为另外一种选择，多核苷酸变体或类似物编码与未改变的多核苷酸相同的氨基酸序列。例如密码子优化的序列一般编码与亲本/天然序列相同的氨基酸序列，但是包含优先在特定宿主生物中表达的密码子。
“来源于”生物的多肽或多核苷酸包含天然氨基酸序列或核苷酸序列的一个或更多个修改形式，并且表现出与天然酶相似的（如果不是更好的）活性（例如至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少100%或至少110%的天然酶活性水平）。例如，通过定向进化亲本/天然序列在某些程度上改善酶活性。作为另外一种选择或除此之外，酶编码序列发生突变以获得反馈抗性。因此，在本发明的一个或更多个实施方案中，由外来多核苷酸编码的多肽是抗反馈的和/或经修饰以改变天然酶的活性。“来源于”参考多核苷酸的多核苷酸包括但不限于包含已经经密码子优化以在期望宿主细胞中表达的核酸序列的多核苷酸。
本发明的细胞可包含本文所述多核苷酸的任何组合以产生在一个或更多个偶数碳上包含甲基支链的支链脂肪酸。例如，本发明提供细胞，所述细胞包含下列多核苷酸：（i）包含编码缺少聚酮合成活性的酰基转移酶的核酸序列的外来的或过表达的多核苷酸，和（ii）包含编码丙酰CoA羧化酶的核酸序列的外来的或过表达的多核苷酸，和/或包含编码在细胞中表达的甲基丙二酰CoA变位酶的核酸序列的外来的或过表达的多核苷酸，其中所述一种或更多种多核苷酸被表达，并且所述细胞比不包含所述一种或更多种多核苷酸的其它类似的细胞生产更多的支链脂肪酸，所述支链脂肪酸在一个或更多个偶数碳上包含甲基。能够以任何合适的方式制备重组细胞以在细胞内产生表达载体。该表达载体可包括可操作地连接至表达元件的外来多核苷酸，所述表达元件例如启动子、增强子、核糖体结合位点、操纵子和激活序列。此类表达元件可为可调控的，例如可诱导的（通过加入诱导剂）。作为另外一种选择或除此之外，表达载体可包括附加拷贝的多核苷酸，其编码可操作地连接至表达元件的天然基因产物。可用启动子的代表性实例包括但不限于：LTR（逆转录病毒的长末端35个重复序列）或SV40启动子、大肠杆菌lac、tet或trp启动子、噬菌体Lambda PL启动子、以及已知控制原核或真核细胞或它们的病毒中基因表达的其他启动子。在一个方面，表达载体也包括扩增表达的合适序列。表达载体可包含促进多核苷酸混入细胞基因组的元件。将表达载体或其他多核苷酸引入细胞中可使用任何合适的方法完成，例如转化、电穿孔、显微注射、显微注射轰击、磷酸钙沉淀、改性磷酸钙沉淀、阳离子脂质处理、光穿孔、融合方法、受体介导的转移或聚凝胺沉淀。作为另外一种选择，可通过用病毒载体感染、缀合、转导或其他适用方法引入表达载体或其他多核苷酸。
细胞如细菌细胞或任何其他期望的宿主细胞包含编码外来的或过表达的蛋白的多核苷酸，在适合该细胞生长并表达多核苷酸的条件下培养所述细胞。表达蛋白的细胞可通过任何适用的方法鉴定，例如通过PCR筛选、通过Southern印迹分析筛选或筛选表达的蛋白。在某些实施方案中，可通过在DNA构建体中包含选择性标记、然后在仅适合表达选择性标记基因的那些细胞存活的条件下培养包含选择性标记基因的细胞来选择包含所述一种或更多种多核苷酸的细胞。可通过在合适条件下培养经基因修饰的细胞（例如在一定浓度药物的存在下培养包含可扩增标记基因的经基因修饰的细胞，在此情况下仅有包含多拷贝可扩增标记基因的细胞能够存活）进一步扩增引入的DNA构建体。包含并表达编码外来或过表达蛋白的多核苷酸的细胞本文称为经基因修饰的细胞。包含并表达编码外来或过表达蛋白的多核苷酸的细菌细胞可称为经基因修饰的细菌细胞。
本发明的示例性细胞包括大肠杆菌BW25113，其包含pTrcHisA mmat和pZA31-accA 1-pccB，它依据Budapest Treaty for the InternationalRecognition of the Deposit of Microorganisms for the Purpose of num="FF-Procedure（“Budapest Treaty”）的条款，在2010年12月14日保藏于美国典型培养物保藏中心（ATCC），10801 University Blvd.，Manassas，VA，并且分配有根据日期[DATE]的保藏号[XXX]，以及大肠杆菌BL21Star（DE3），其包含pTrcHisA Ec sbm So ce epi和pZA31 mmat，它依据Budapest Treaty for the International Recognition of the Deposit ofMicroorganisms for the Purpose of num="FF- Procedure（“Budapest Treaty”）的条款，在2010年12月14日保藏于美国典型培养物保藏中心（ATCC），10801 University Blvd.，Manassas，VA，并且分配有根据日期[DATE]的保藏号[XXX]。本发明也包括本文所述的子代细胞的变体，其保留重组微生物的表型特性。本发明还提供了本文所述细胞的基本上纯的单培养细胞（即，包含至少80%或至少90%期望细胞的培养物）。
适于宿主细胞生长和支链脂肪酸合成的任何细胞培养条件适用于本发明方法。本文设想加入脂肪酸合成中间体、前体和/或与支链脂肪酸合成相关联的酶的辅因子到培养物中。在某些实施方案中，经基因修饰的细胞（例如经基因修饰的细菌细胞）具有最佳的生长温度，例如比正常生长和/或发酵时温度更低的温度。例如，在某些实施方案中，将支链脂肪酸混入膜中提高膜流动性，它是与低生长温度相关联的特性。此外，在某些实施方案中，本发明的细胞在比通常存在于该类型细胞的正常生长和/或发酵温度更高的温度下表现出生长下降。
本发明的方法任选地包括从培养物中提取支链脂肪酸。可从培养基中提取脂肪酸并用任何合适的方式测量。合适的提取方法包括例如下述方法：Bligh等人，A rapid method for total lipid extraction and purification，Can.J.Biochem.Physiol.37：911-917（1959）。在某些实施方案中，可测量在培养上清液或重组细胞的膜部分中的脂肪酸产量。在这个实施方案中，用标准方法制备培养物，然而可将可提供增加底物供应的营养物质（例如2-甲基丁酸、异亮氨酸）加到培养物中。离心收获细胞，用盐酸或高氯酸酸化，并用氯仿和甲醇提取，使脂肪酸进入有机层。使用甲醇在100℃将脂肪酸转化成甲酯。通过气相色谱法（GC）分离甲酯并与已知的脂肪酸（购自Larodan或Sigma）标准物比较。通过组合GC/质谱确认化学同一性，如果需要，对片段材料进行进一步的质谱分析。
在一个实施方案中，所述细胞利用支链脂肪酸作为前体制备多种其他产物。从支链脂肪酸中生物合成的（即，来源的）产物包括但不限于磷脂、甘油三酯、烷烃、烯烃、蜡酯、脂肪醇和脂肪醛。一些宿主细胞天然产生一种或更多种来源于支链脂肪酸的产物；其他宿主细胞经遗传工程化以将支链脂肪酸转化成例如烷烃、烯烃、蜡酯、脂肪醇、磷脂、甘油三酯和/或脂肪醛。合成衍生自支链脂肪酸的产物的生物以及它们的基因修饰形式在例如国际专利公布WO 2007/136762、WO 2008/151149和WO2010/062480、以及美国专利公开申请公布US 2010/0298612中进行了进一步描述，它们全部全文以引用方式并入本文。在一个方面，本发明的方法包括从培养物中提取衍生自支链脂肪酸（在细胞中从支链脂肪酸合成的磷脂、甘油三酯、烷烃、烯烃、蜡酯、脂肪醇和/或脂肪醛）的产物。任何提取方法是合适的，包括在国际专利公布WO 2007/136762、WO 2008/151149和WO 2010/062480、以及美国专利公开申请公布US 2010/0251601、US20100242345、US 20100105963和US 2010/0298612中描述的提取方法。
本发明细胞优选地比除不包含所述一种或更多种多核苷酸的其它类似的细胞生产更多的支链脂肪酸，所述支链脂肪酸在一个或更多个偶数碳上包含甲基支链。本文描述了测量释放到发酵液或培养基中或从细胞部分中释放出的脂肪酸的方法。然而支链脂肪酸产量不受培养物中积聚的脂肪酸的限制，但是也包括用作产生衍生自支链脂肪酸的产物的下游反应前体的脂肪酸。因此，在一些实施方案中衍生自支链脂肪酸的产物（例如磷脂、甘油三酯、脂肪醇、蜡酯、脂肪醛和烷烃）是用于测量宿主细胞中支链脂肪酸产量的替代物。本文描述了测量在细胞膜磷脂中的脂肪酸的方法。类似地，支链脂肪酸的降解产物的测量也指示宿主细胞中产生的支链脂肪酸量。根据本发明的特定实施方案，本发明的细胞比不包含所述一种或更多种多核苷酸的其它类似的细胞生产至少3%、至少5%，至少10%，至少20%，至少25%，或至少50%的支链脂肪酸。
本发明还提供包含本文所述的支链脂肪酸的组合物。例如，本发明提供包含在碳主链上具有10-18个碳的支链脂肪酸的组合物，例如包含10个至16个碳（例如包含10个、11个、12个、13个、14个、15个或16个碳的脂肪酸）的脂肪酸，其在偶数碳（例如C2、C4、C6、C8、C10、C12、C14和/或C16）上具有支链。提供了包含较长链脂肪酸的组合物，例如在最长碳链上包含19至22个碳的组合物。也提供了包含本文所述的任何脂肪酸组合的组合物（例如包含不同长度和/或沿碳主链的不同支链位置的脂肪酸的组合物）。
以下实施例进一步描述和证明了本发明范围内的实施方案。所给的这些实施例仅仅是说明性的，并且不可理解为是对本发明的限制，因为在不脱离本发明的实质和范围的情况下可以对其进行许多变型。
实施例1：构建甲基丙二酰CoA变位酶表达载体。
有多个基因注解为编码甲基丙二酰CoA变位酶的两个亚基。两面神菌HTCC2649编码两个此类基因。制备这些基因的合成型，使用的密码子经改变以匹配许多大肠杆菌基因使用的密码子（即，编码序列经密码子优化以在大肠杆菌中表达）。通过与其他甲基丙二酰CoA变位酶基因类比，这些合成基因称为mutA（SEQ ID NO:1）和mutB（SEQ ID NO:2），它们对应于MutA（SEQ ID NO:3）和MutB（SEQ ID NO:4）蛋白亚基。在合成DNA中，将额外的三个碱基对（编码紧接着起始甲硫氨酸的丙氨酸残基）加到mutA上以有利于NcoI位点的引入。XhoI限制性位点也位于mutB编码序列之后以插入pBAD载体（Invitrogen）。将NcoI/XhoI片段克隆进pBAD中。
实施例2：构建甲基丙二酰CoA差向异构酶表达载体。
有多个基因注解为编码甲基丙二酰CoA变位酶。一个此类基因来自链霉菌属菌种（Streptomyces sviceus）。可使用类似于大肠杆菌基因的密码子和侧接编码区的EcoRI与Hind III位点构建合成基因（SEQ ID NO:5）。可将大肠杆菌的夏因-达尔加诺（Shine-Dalgarno）序列加到EcoRI位点和差向异构酶基因的起始密码子之间。预测的蛋白产物与来自链霉菌属菌种（S.sviceus）基因（SEQ ID NO:6）的预测蛋白产物相同。可将差向异构酶基因克隆进pBAD-mutAB构建体中，所述克隆使用EcoRI和Hind III限制性位点（mutB下游）以形成pBAD-mutAB-差向异构酶基因质粒。大肠杆菌培养物可在用阿拉伯糖诱导后在27℃下生长并补充羟钴胺以完成功能性甲基丙二酰CoA变位酶的表达和支链脂肪酸的生产。
实施例3：构建丙酰CoA羧化酶表达载体。
核苷酸序列（SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8）分别编码两个丙酰CoA羧化酶亚基AccA1（GenBank登录号AF113603.1；SEQ ID NO:9）和PccB（GenBank登录号AF113605.1；SEQ ID NO:10）），它们来自天蓝色链霉菌A3（2）丙酰CoA羧化酶（Rodríguez E.，Gramajo H.，Microbiology.1999Nov；145：3109-19），其经密码子优化以在大肠杆菌中表达。用以下元件按顺序构建表达丙酰CoA羧化酶的基因构建体1）PLlac0-1启动子和操纵子加T7基因10核糖体结合位点（SEQ ID NO:11）；2）优化的accA1（SEQ ID NO:12）；3）三个限制性位点序列，包括BlII、NotI和XbaI以及T7基因10核糖体结合位点（SEQ ID NO:13）；和4）密码子优化的pccB（SEQ ID NO:14）。将合成的DNA片段克隆进表达载体pZA31-MCS（Expressys，Ruelzheim，Germany）的XhoI和PstI位点，产生质粒pZA31-accA1-pccB（SEQ ID NO:15）。
实施例4：构建丙酰CoA合成酶表达载体。
肠道沙门氏菌丙酰CoA合成酶基因prpE用PCR和如SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17所示的引物进行扩增并用限制性酶PstI和BamHI置于质粒pZA31-accA1-pccB（SEQ ID NO:15）中的夏因-达尔加诺序列之后。期望提高丙酰CoA合成酶的产量以增加流向丙酰CoA合成的流量。
实施例5：减少丙酰CoA合成酶的丙酰化。
在肠道沙门氏菌中，当丙酰CoA水平积聚时，丙酰CoA合成酶经受在赖氨酸592处的丙酰化抑制。（Garrity等人，J.Biol.Chem.，Vol.282，Issue 41，30239-30245，2007年10月12日）。在其他物种中可发生类似的酶抑制，然而改变的赖氨酸的位置可能不同。将测试并比较克服这种抑制的多个方法。首先，将丙酰CoA合成酶基因突变以改变从赖氨酸（在丙酰化位点）至精氨酸或其他氨基酸的编码能力以防止丙酰化。其次，白藜芦醇或其他乙酰化酶活化剂的来源将被引入培养基以活化乙酰化酶，从而去丙酰化PrpE。第三，敲除负责丙酰化反应的内源N-乙酰转移酶。例如，如果用肠道沙门氏菌工作，可去除pat。又如，如果用枯草芽孢杆菌工作，可去除acuA。第四，流入脂肪酸合成的丙酰CoA将通过提高丙酰CoA羧化酶的活性而增加，从而保持游离丙酰CoA水平下降。第五，乙酰化酶活性将提高，因此增加丙酰CoA羧化酶的脱乙酰化。例如，肠道沙门氏菌cobB的表达可能增加。
实施例6：产生包含来自分支杆菌属结核蜡酸合酶（MAS）的MMAT （甲基丙二酰CoA酰基转移酶）结构域编码区的表达载体。
分支杆菌属MAS是多功能蛋白，其催化结核蜡酸的合成并且包含具有MMAT活性的结构域。来自牛分支杆菌BCG（YP_979046）（SEQ IDNO:19）的MAS的MMAT结构域（氨基酸508-890）（SEQ ID NO:18）经密码子优化以在大肠杆菌中表达（SEQ ID NO:20）。合成优化序列并将其克隆进载体pTrcHisA（Invitrogen），所述载体位于BamHI和HindIII位点之间。所得构建体融合MMAT结构域与所述载体编码的His标记前导序列肽。将表达载体引入生产甲基丙二酰CoA的重组大肠杆菌宿主中。MMAT活性催化甲基丙二酰ACP的形成，其随后可进入II型脂肪酸合成途径以形成位于脂肪酸链偶数位置上的甲基支链。
实施例7：检测酰基CoA的方法。
这个实施例描述检测并定量样品中的酰基CoA（例如甲基丙二酰CoA）的示例性的方法，例如生产支链脂肪酸的重组宿主细胞样品。
制备稳定的、标记的（氘）包含内标的master mix，其包含d3-3-羟甲基戊二酰CoA（在10ml 15%三氯乙酸中的200μl 50μg/ml原液）。将master mix的等分试样（500μl）加到2mL管中。硅油（AR200；Sigma目录号85419；800μl）在master mix上形成层。大肠杆菌培养物（800μl）在硅油顶部轻柔分层，并且所得样品在4℃下，在Eppendorf 5417C离心机中以20,000×g离心五分钟。将一部分（300μl）包含master mix的层转到空管中并在干冰上冷冻30分钟。
使用HPLC/MS/MS测定样品的酰基CoA含量。单个辅酶A标准物（丙酰CoA、甲基丙二酰CoA、琥珀酰CoA、丙二酰CoA、异丁酰CoA、异戊酰CoA和乙酰CoA）购自Sigma Chemical Company（St.Louis，MO）并在甲醇中制成500μg/ml的原液。收集分析物，并且通过用15%的三氯乙酸稀释制备具有所有分析物的标准物。用于回归分析的标准物通过将500μl工作标准物转移到包含10μl 50μg/mL内标的自动取样机小瓶中进行制备。样品峰面积（或高度）对稳定的-标记的内标（d3-3-羟甲基戊二酰CoA，Cayman Chemical Co.）归一化。通过HPLC/MS/MS在Sciex API5000质谱仪上，在阳离子Turbo Ion Spray中测定样品。通过反相高效液相色谱法，使用Phenomenex Onyx Monolithic C18柱（2×50mm）和以下流动相进行分离：（1）5mM乙酸铵，5mM二甲基丁胺，6.5mM乙酸，和（2）具有0.1%甲酸的乙腈，梯度如表C所示。
表C
Figure BDA00001880021900381
在质谱仪上的条件是：DP 160、CUR 30、GS165、GS265、IS 4500、CAD 7、TEMP 650C。如表D所示的转变用于多反应监测（MRM）。
表D
Figure BDA00001880021900382
*MS/MS分析的能量（伏）
实施例8：分析宿主细胞产生的脂肪酸。
这个实施例示出分析由细胞（例如重组微生物细胞）产生的支链脂肪酸的方法。
细胞培养物（大约1.5mL）在2.0mL玻璃小瓶中冷冻并贮存在-20℃直至进行加工。样品在干冰冷冻30分钟并冻干过夜（~16小时）直至干燥。将内标（十九烷酸甘油三酯（Sigma目录号T4632-1G））的10μl等分试样加到每个小瓶中，然后加入400μl 0.5N氢氧化钠（在甲醇中）。小瓶加盖并涡旋处理10秒。样品在65℃孵育30-50分钟。然后从培养箱中移出样品，并加入500μl三氟化硼试剂（Aldrich目录号B1252）。再次涡旋处理样品10秒，在65℃孵育样品10-15分钟并冷却至室温（大约20分钟）。加入己烷（350μl）并再次涡旋处理样品10秒。如果所述相不分离，加入50-100μl的饱和盐溶液（5g NaCl溶于5ml水中），并且涡旋处理样品10秒。将至少100μl己烷上层置于气相色谱小瓶中。将小瓶加盖并贮存在4℃直至通过气相色谱进行分析。
如下表E所述进行气相色谱分析。使用细菌酸甲酯标准物（Sigma目录号47080-U）和脂肪酸甲酯标准物（Sigma目录号47885-U）鉴定样品峰。利用甘油三棕榈酸酯（Sigma目录号T5888-1G）的样品检查标准物被用于确认样品的酯化。使用空白标准物（仅用作内标）评估背景噪音。
表E
Figure BDA00001880021900391
实施例9：构建包含肉桂地链霉菌mutA和mutB以及链霉菌属菌种（S. sviceus）epi的表达载体。
生成合成DNA构建体，其包含肉桂地链霉菌mutA（SEQ ID NO:24）（GenBank登录号AAA03040.1）、肉桂地链霉菌mutB（SEQ ID NO:25）（GenBank登录号AAA03041.1）和链霉菌属菌种（Streptomyces sviceus）ATCC 29083甲基丙二酰CoA差向异构酶基因（SEQ ID NO:26）（GenBank登录号ZP_06919825.1）。所述基因经密码子优化以在大肠杆菌中表达。EcoRI限制性位点位于合成基因构建体的5'末端，并且BamHI位点位于合成基因构建体的3'末端。这些位点随后用于克隆进pZA31载体（Expressys，Ruelzheim，Germany）。核糖体结合序列和间隔区位于mutA和差向异构酶基因起始密码子（SEQ ID NO:27）之前。所述质粒称为pZA31 mutAB Ss epi。
实施例10：构建包含sbm和malE/sbm多核苷酸的表达载体。
Sleeping beauty变位酶（Sbm）（也称为甲基丙二酰CoA变位酶（MCM））是催化琥珀酰CoA重排成L-甲基丙二酰CoA的酶。所述酶是维生素B12（钴胺素）依赖性的。甲基丙二酰CoA是分散的支链脂肪酸（sBCFA）（即，在脂肪酸主链的一个或更多个偶数碳上包含甲基支链的支链脂肪酸）的构件。生成包含编码Sbm的多核苷酸的质粒以引入Sbm编码序列（可调控启动子的下游）的多个拷贝到大肠杆菌宿主细胞中。
基于大肠杆菌sbm（SEQ ID NO:28）（GenBank登录号NP_417392.1）的序列合成多核苷酸，其来自大肠杆菌菌株MG1655。核酸序列经密码子优化以匹配高表达的大肠杆菌基因模式，同时保持所述酶的天然氨基酸序列。生成的核酸序列如SEQ ID NO:29所示。将BamHI和XbaI位点加到合成Sbm编码序列的5'末端，所述合成Sbm编码序列具有邻近ATG翻译起始序列的序列GGATCCATGTCTAGA（SEQ ID NO:49）。将SacI限制性位点序列加到合成Sbm编码序列的3'末端。所述基因被合成、克隆进pUC57载体、并测序（GenScript，Piscataway，NJ）。然后通过限制性酶BamHI和SacI从pUC57中释放合成的sbm，并且将其亚克隆进质粒pTrcHisA（Invitrogen，Carlsbad，CA）中，与聚组氨酸序列同框（GenScript，Piscataway，NJ）。所述质粒称为pTrcHisA Ec sbm。通过测序（GenScript，Piscataway，NJ）确认所述序列。由所述序列编码的重组蛋白包含聚组氨酸序列（Met-Gly-Gly-Ser-His-His-His-His-His-His-Gly-Met-Ala-Ser-Met-Thr-Gly-Gly-Gln-Gln-Met-Gly-Arg-Thr-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-Asp-Arg-Trp-Gly-Ser（SEQ ID NO:50））和全长天然Sbm氨基酸序列。
已经报道了重组甲基丙二酰CoA变位酶在大肠杆菌中是不溶解的（Korotkova，N.和M.E.Lidstrom，J.Biological Chemisty 279：13652-8（2004））。与麦芽糖结合蛋白（MBP，由malE编码）的翻译融合阻止了重组蛋白的聚集（Kapust，R.B.和D.S.Waugh，Protein Science 8：1668-74（1999））。通过插入sbm的malE上游产生重组构建体。基于麦芽糖结合蛋白（大肠杆菌MG1655 GenBank NC_000913.2（GenScript，Piscataway，NJ））的序列合成malE多核苷酸。BamHI位点位于邻近malE的翻译起始密码子处，并且XbaI位点位于紧接malE序列（SEQ ID NO:30）5'的终止密码子处。也改变一个核苷酸（将T438变为C438）以除去BlII的限制性位点识别序列。
首先合成MalE编码序列（SEQ ID NO:30）并将其克隆进pUC57质粒中。在确认它的序列后，使用限制性酶BamHI和XbaI释放malE多核苷酸。然后将释放的malE再次克隆进质粒pTrcHisA Ec sbm中的BamHI和XbaI位点（GenScript，Piscataway，NJ）。所得质粒称为pTrcHisA Ec malEEc sbm。由pTrcHisA Ec malE Ec sbm编码的重组蛋白包含三个肽：聚组氨酸标记、全长MBP和全长Sbm。
实施例11：构建包含编码来自分支杆菌属结核蜡酸合酶（MAS）的甲 基丙二酰CoA酰基转移酶（MMAT）结构域的多核苷酸的重组表达载体。
分支杆菌属MAS是多功能蛋白，其包含催化结核蜡酸合成的MMAT活性。编码来自牛分支杆菌BCG（GenBank登录号YP_979046）（SEQ IDNO:19）MAS的MMAT结构域（氨基酸508-890）（SEQID NO:18）的核酸序列经密码子优化以在大肠杆菌中表达（SEQ ID NO:20）。优化的序列称为“mmat”，将其合成并克隆进位于BamHI和HindIII位点之间的载体pTrcHisA（Invitrogen）中。所得构建体融合MMAT结构域与由所述载体编码的聚组氨酸标记。将表达载体（pTrcHisA mmat）引入生产甲基丙二酰CoA的重组大肠杆菌宿主中。MMAT活性催化甲基丙二酰ACP的形成，其通过II型脂肪酸合酶加入脂肪酸，形成在脂肪酸链偶数位置上的甲基支链。
也产生编码融合到聚组氨酸标记上的牛分支杆菌BCG的表达载体。上述pTrcHisA mmat质粒DNA通过PCR，使用合成以包括5'-KpnI（SEQ IDNO:31）和3'-HindIII限制性位点（SEQ ID NO:32）（Integrated DNATechnologies，Inc.，Coralville，IA）的寡核苷酸进行扩增。样品进行PCR，其具有1μl（2ng）pTrcHisA mmat DNA，每种引物的1.5μl 10μM原液，5μl 10X Pfx反应混合物（Invitrogen Carlsbad，CA），0.5μl Pfx DNA聚合酶（1.25单位）和41μl水。PCR条件如下：所述样品初始在95℃孵育三分钟，然后是30个如下的循环：在95℃30秒（解链），58℃30秒（引物退火），并在68℃延伸引物1.5分钟。在这些循环后，在68℃孵育10分钟，然后样品保持在4℃。
使用PCR纯化试剂盒（Qiagen）纯化PCR产物，用限制性酶KpnI和HindIII消化并将消化产物连接到（Fast-Link EpicentreBiotechnologies，Madison，WI）KpnI/HindIII  消化的pZA31MCS（Expressys，Ruelzheim，Germany）中。使用连接混合物转化大肠杆菌DH5αTM（Invitrogen Carlsbad，CA）。通过PCR筛选分离菌落，作为种菌使用无菌移液器-吸头加入仅包含水的反应管中，然后加入剩余的PCR反应混合物（AccuPrimeTM SuperMixII，Invitrogen Carlsbad，CA）和如上所述的引物。
使用Spin Miniprep Kit（Qiagen）分离并纯化重组质粒，并且其特征在于限制性酶消化（DraI、KpnI和HindIII，它们得自NewEngland Biolabs，Beverly，MA）。随后使用该质粒转化BW25113（大肠杆菌，Genetics Stock Center，New Haven，CT），使用氯化钙方法将所述菌株制成感受态细胞。在包含34μg/ml氯霉素的Luria琼脂平板上选择转化体。使用QIAfilterTM Plasmid Midi Kit（Qiagen）分离并纯化质粒DNA。DNA测序证实插入序列是mmat（SEQ ID NO:34）。混入聚组氨酸标记的所得质粒称为pZA31 mmat。
实施例12：生成包含编码丙酰CoA羧化酶的外来多核苷酸和编码来自 分支杆菌属结核蜡酸合酶（MAS）的甲基丙二酰CoA酰基转移酶 （MMAT）结构域的外来多核苷酸的重组宿主细胞的方法。
这个实施例描述了用于制备细胞的示例性方法，所述细胞包含外来的多核苷酸，所述多核苷酸包含编码多肽的核酸序列，所述多肽催化丙酰CoA转化成甲基丙二酰CoA，和外来的多核苷酸，所述多核苷酸包含编码多肽的核酸序列，所述多肽催化甲基丙二酰CoA转化成甲基丙二酰ACP。所述方法需要大肠杆菌的共转导，所述大肠杆菌具有包含来自天蓝色链霉菌的丙酰CoA羧化酶基因和编码来自分支杆菌属MAS的MMAT结构域的基因的质粒。
通过氯化钙方法制备化学感受态的大肠杆菌BW25113细胞（大肠杆菌Genetic Stock Center，New Haven，CT）用于质粒DNA转化。使活性生长的50ml大肠杆菌培养物生长至光密度（600nm）~0.4。培养物在冰上快速冷却，并且通过在2700×g离心10分钟回收细菌。弃去上清液并将沉淀物轻悬于30ml冰浴致冷的80mM MgCl2，20mM CaCl2溶液中。通过在2700×g离心10分钟再回收细胞。弃去上清液并将沉淀物轻柔重悬于2ml冰浴致冷的0.1M CaCl2溶液中。
细胞在冰上的预冷14ml圆底离心管中转化。大约25ng各种pTrcHisAmmat和pZA31-accA1-pccB（如上所述）在冰上与100μl感受态细胞一起孵育30分钟。在42℃热休克细胞90秒并立即置于冰上两分钟。加入500μl预热的SOC培养基（Invitrogen，Carlsbad，CA）并允许细胞在37℃，225rpm振荡条件下恢复。将一部分（50μl）转化的细胞混合物涂布到选择性LB琼脂100μg/ml氨苄青霉素和34μg/ml氯霉素平板上以选择携带pTrcHisA mmat和pZA31/32-accA1-pccB质粒的细胞。从每个平板上挑取单菌落并划线接种到LB琼脂平板（具有氨苄青霉素和氯霉素）上以确认抗生素抗性表型。分离质粒DNA用HaeII的限制性内切核酸酶消化分析确认了每个菌株的质粒DNA池。包含pTrcHisA mmat和pZA31-accA1-pccB的大肠杆菌BW25113样品依据Budapest Treaty for the International Recognitionof the Deposit of Microorganisms for the Purpose of num="FF- Procedure（“Budapest Treaty”）的条款，在2010年12月14日保藏于美国典型培养物保藏中心（ATCC），10801 University Blvd.，Manassas，VA，并且分配有根据日期[DATE]的保藏号[XXX]。
实施例13：构建编码纤维堆囊菌So ce 56甲基丙二酰CoA差向异构酶 的表达载体。
设计并合成纤维堆囊菌甲基丙二酰CoA差向异构酶合成基因（So ceepi）（SEQ ID NO:37）。所述编码序列经密码子优化以在大肠杆菌中表达并经修饰以除去限制性位点（GenScript，Piscataway，NJ）。所述核酸序列侧接SacI位点和来自pBAD载体（Invitrogen，Carlsbad，CA）的合成核糖体结合位点，所述载体邻近翻译起始序列（SEQ ID NO:39）。将合成基因克隆成SacI/PstI片段进入pTrcHisA Ec sbm和pTrcHisA Ec malE Ec sbm，所得质粒分别称为pTrcHisA Ec sbm So ce epi和pTrcHisA Ec malE Ec sbm Soce epi。
实施例14：构建编码苍黄色克里布所菌DSM 17836甲基丙二酰CoA 差向异构酶的表达载体。
设计并合成苍黄色克里布所菌甲基丙二酰CoA差向异构酶基因（Kfepi）（SEQ ID NO:35）。编码序列经优化以在大肠杆菌中表达并除去限制性位点（GenScript，Piscataway，NJ）。所述基因侧接SacI位点和来自pBAD载体的合成核糖体结合位点，所述载体邻近翻译起始序列（SEQ IDNO:39）。将合成基因克隆成SacI/PstI片段进入pTrcHisA Ec sbm和pTrcHisA Ec malE Ec sbm。所得质粒分别称为pTrcHisA Ec sbm Kf epi和pTrcHisA Ec malE Ec sbm Kf epi。
实施例15：制备生产支链脂肪酸的宿主细胞
这个实施例描述使用重组宿主细胞（例如大肠杆菌）生产支链脂肪酸，所述细胞表达编码丙酰CoA羧化酶或甲基丙二酰CoA变位酶和甲基丙二酰CoA差向异构酶的多核苷酸，在某些情况下与编码酰基转移酶和/或硫酯酶的多核苷酸联合表达。
具有修剪脂肪酸链长的能力是有用的。不同长度的支链脂肪酸具有不同的物理特性，它们适用于不同的商业用途。为了展示修剪支链脂肪酸链长的能力，将大肠杆菌‘TesA（Cho，H.和J.E.Cronan，Jr.J.BiologicalChemistry 270：4216-9（1995））加入上述表达载体并插入宿主细胞。为了产生pTrc Ec‘tesA表达载体，截短的大肠杆菌tesA（‘tesA）cDNA（SEQ IDNO:40）通过大肠杆菌tesA基因（GenBank登录号L06182）的PCR扩增生成。设计5'引物（SEQ ID NO:41）以在tesA的第26个密码子之后退火，将第27个密码子从丙氨酸变为甲硫氨酸并生成NcoI限制性位点。设计3'引物（SEQ ID NO:43）以混入一个BamHI限制性位点。使用50μl PfuUltra II Hotstart 2X master mix（Agilent Technologies，Santa Clara，CA），1μl两种引物的混合物（每种10微摩尔），1μl大肠杆菌BW25113基因组DNA和48μl水进行PCR。PCR开始于在95℃孵育两分钟，然后是30个如下的循环：在95℃变性20秒，在58℃退火20秒，并在72℃延伸15秒。样品在72℃孵育三分钟，然后保存在4℃。使用
Figure BDA00001880021900451
PCR纯化试剂盒（Qiagen，Valencia，CA）纯化PCR产物（Ec‘tesA）。细菌表达载体pTrcHisA和‘tesA PCR产物用NcoI和BamHI消化。消化载体和插入序列使用Fast-Link（Epicentre Biotechnologies，Madison，WI）连接。然后使用连接混合物转化大肠杆菌TOP10细胞（Invitrogen，Carlsbad，CA）。使用
Figure BDA00001880021900452
Spin Miniprep试剂盒（Qiagen）分离重组质粒，并且特征在于用HaeII限制性消化产物的凝胶电泳。DNA测序确认已经克隆了‘tesA插入序列并且该插入序列编码期望的氨基酸序列（SEQ ID NO:45）。所得质粒称为pTrc Ec‘tesA。
为了限制基因表达，将截短的大肠杆菌‘tesA基因亚克隆进低拷贝的细菌表达载体pZS21-MCS（Expressys，Ruelzheim，Germany）中。表达载体pTrcEc‘tesA是PCR反应的模板，所述PCR使用设计用于生成侧接XhoI限制性位点并包括pTrcHisA lac启动子（以置换pZS21-MCS载体tet启动子）的5'引物（SEQ ID NO:46）和混入HindIII限制性位点的3'引物（SEQID NO:47）。使用50μl Pfu Ultra II Hotstart 2X master mix（AgilentTechnologies，Santa Clara，CA），1μl两种引物的混合物（每种10微摩尔），1μl pTrc Ec‘tesA质粒DNA（6ng）和48μl水进行PCR。PCR开始于在95℃孵育两分钟，然后是30个如下的循环：在95℃变性20秒，在57℃退火20秒，并在72℃延伸20秒。样品在72℃孵育三分钟，然后保存在4℃。使用
Figure BDA00001880021900453
PCR纯化试剂盒（Qiagen，Valencia，CA）纯化PCR产物。细菌表达载体pZS21-MCS和Ec‘tesA PCR产物用XhoI和HindIII消化。使用Fast-Link（Epicentre Biotechnologies，Madison，WI）连接消化后的载体和插入序列。然后使用连接混合物转化大肠杆菌TOP10细胞（Invitrogen，Carlsbad，CA）。使用
Figure BDA00001880021900461
Spin Miniprep试剂盒（Qiagen）分离重组质粒，并且特征在于用HaeII限制性消化产物的凝胶电泳。DNA测序确认已经克隆了‘tesA插入序列并且该插入序列编码期望的氨基酸序列（SEQ ID NO:45）。所得质粒称为pZS22Ec‘tesA。
如下生成缺失脂肪酸降解（Voelker，T.A.和H.M.Davies，J.Bacteriology 176：7320-7（1994））并能够调控重组基因转录的大肠杆菌菌株。大肠杆菌K-12菌株（K27）缺失fadD，因此缺失负责脂肪酸降解初始步骤的脂肪酰CoA合成酶。菌株K27（F-，tyrT58（AS），fadD88，mel-1；CGSC菌株编号5478）获得自大肠杆菌Genetic Stock Center（NewHaven，CT）。将来自菌株DH5αZ1[lacIq、PN25-tetR、SpR、deoR、supE44、Δ（lacZYA-argFV 169）、80lacZΔM15（Expressys，Ruelzheim，Germany）]的基因组调节盒引入到宿主菌株中。转导噬菌体P1vir携带如下的DH5αZ1 DNA。供体菌株DH5αZ1的对数生长培养物（5ml LB肉汤，包含0.2%葡萄糖和5mM CaCl2）用100μl P1vir噬菌体的溶菌液原液感染。所述培养物再培养三小时以使感染的细胞溶解。沉淀所述片段，并且通过0.45μM注射器过滤单元进一步澄清上清液。新制溶解产物通过将10μl在TM缓冲液（10mM MgSO4/10mM Tris·Cl，pH 7.4）中连续1:10稀释的溶解产物涂布到100mm LB（具有2.5mM CaCl2）平板上进行滴定，所述平板用在LB上层琼脂（具有2.5mM CaCl2）中培养的大肠杆菌菌苔覆盖。使用新制的噬菌体原液重复该过程直至噬菌体滴度超过109pfu/mL。
使用较高滴度的噬菌体原液将DH5αZ1基因组片段转入受体K27菌株。沉淀K27的过夜培养物（1.5ml）并重悬在750μl P1盐溶液（10mMCaCl2/5mM MgSO4）中。悬浮细胞的等分试样（100μl）用不同量的DH5αZ1供体P1vir溶解产物（1、10和100μl）接种到无菌测试管中。允许细胞在37℃吸收噬菌体30分钟。加入1ml LB肉汤加200μl 1M柠檬酸钠终止吸收，并且所述培养物进一步在37℃透气孵育1小时。沉淀所述培养物，将细胞悬浮在100μl LB肉汤（加0.2M柠檬酸钠）中，并且将其涂布到具有50μg/ml奇放线菌素的LB琼脂平板上。分离抗奇放线菌素菌株并且通过PCR筛选存在tetR、tetR、lacIq和fadD88的基因组DNA。将一个此类转导体称为K27-Z1并用于进一步的研究。
为了转化K27-Z1细胞，将感受态细胞置于在冰上预冷的14ml圆底离心管中。各种质粒与50μl化学感受态K27-Z1细胞（Cohen，S.N.，Change，A.C.Y.和L.Hsu，Proceedings National Academy Sciences U.S.A.69：2110-4（1972））一起孵育30分钟。在42℃热休克细胞90秒并立即置于冰上两分钟。加入预热的SOC培养基（250μl）（Invitrogen，Carlsbad，CA），并且允许细胞在37℃，125rpm振荡条件下恢复一小时。将转化的细胞混合物（20μl）涂布到具有100μg/ml氨苄青霉素的选择LB琼脂上以选择携带任何pTrc-HisA-基质粒的细胞。将转化的细胞混合物（50μl）涂布到具有34μg/ml氯霉素的LB琼脂上以选择携带pZA31基质粒的细胞。将转化的细胞混合物（150μl）涂布到具有100μg/ml氨苄青霉素和34μg/ml氯霉素的LB琼脂上以选择携带pTrcHisA-基和pZA31-基质粒的细胞。在一些情况下，需要两次转化以生成三重转化体：首先生成双转化体，将其制成感受态细胞，并用第三质粒转化。
使用上述方法，大肠杆菌菌株K27-Z1用pTrcHisA pZA31（对照）、pZA31 mutAB Ss epi、pTrcHisA Ec sbm和pTrcHisA Ec sbm/pZA31Mb mmat转导。所述细菌在22℃的烧瓶中，在具有甘油（0.2%）的M9中培养，所述烧瓶涂覆有黑色Scotch管道胶带。在细菌光密度（600nm）达到0.4后，将IPTG、无水四环素、阿拉伯糖和羟基钴胺素盐酸盐的混合物加到培养物中至终浓度分别为1mM、100ng/ml、0.2%和20μM。二十四小时后，收获细菌进行辅酶A分析。甲基丙二酰CoA产量在图24中示出。产生外来甲基丙二酰CoA变位酶和甲基丙二酰CoA差向异构酶（由pZA31 mutAB Ssepi编码）的宿主细胞产生超过25ng甲基丙二酰CoA/mL培养物。包含Sbm（甲基丙二酰CoA变位酶）编码序列附加拷贝的宿主细胞产生超过三倍的甲基丙二酰CoA/mL培养物的量，并且共表达的甲基丙二酰CoA酰基转移酶减少培养基中存在的甲基丙二酰CoA的量。
研究表达外来丙酰CoA羧化酶的宿主细胞中的甲基丙二酰CoA的产量并在图25中示出。BW25113（对照）和包含pZA31-accA1-pccB（在图中标记为Pcc）的BW25113在LB中培养，并且如上所述分离并表征硫酯辅酶A。包含编码外来丙酰CoA羧化酶的多核苷酸的宿主细胞产生超过约15ng甲基丙二酰CoA/mL培养物。
当Ec‘tesA存在时，宿主细胞产生较少的长链（十五个和十七个碳）支链脂肪酸和较多的中链（十三个碳）支链脂肪酸，指示硫酯酶的产生提高了通过本发明方法产生的中链长度支链脂肪酸的比例。
实施例16：通过二维（2D）气相色谱分析分散的支链脂肪酸。
为了鉴定由本文所述的重组大肠杆菌产生的支链脂肪酸，从细菌培养物中分离脂肪酸并生成衍生物以有利于鉴定。通过2D气相色谱和质谱仪分离的脂肪酸衍生物用于表征成片段的样品。已经描述了在经由质谱仪分析之前脂肪酸衍生成它们的4,4'二甲基
Figure BDA00001880021900481
唑啉衍生物（Zhang，J.Y.，QT.Yu，B.N.Liu和Z.H.Huang，Biomed Env.Mass Spectrom.15:33（1988））。通过仔细检查微小的光谱差异，测定脂肪酸衍生物主链上的支化点位置是可能的。
在用IPTG、无水四环素和阿拉伯糖诱导后，在具有氰钴胺（20μM）的LB（除非另外指明，经修饰以仅包含0.5mg/mL氯化钠）中的一升细菌样品在22℃培养25小时。通过在3500rpm离心收集细胞沉淀物并弃去上清液。将细胞沉淀物悬浮在剩余液体中，并且将所述浆液转移到Pyrex管（号9826，Corning Inc.，Lowell，MA）中。加入等体积的氯仿，并且样品在室温下干燥过夜。
为了产生用于分析的样品，将细胞沉淀物（0.5克）置于圆底烧瓶中，并且加入0.5克KOH沉淀物和25mL水。大肠杆菌沉淀物和KOH溶液回流三小时，并且使样品冷却。逐滴加入浓HCl，使用甲基橙滴定终点以确保脂肪羧酸为酸性形式。然后用25mL己烷等分试样提取酸性水溶液三次以将脂肪酸提取到有机层中。
为了将脂肪酸转化成
Figure BDA00001880021900482
唑啉衍生物，蒸发干燥己烷提取物并将其再加到5mL己烷中，其中加入硫酸钠作为干燥剂。在将样品蒸发到1mL的体积后，将一部分（0.6mL）滗析到ReactithermTM小瓶中。再次蒸发干燥ReactithermTM小瓶中的己烷，并且加入2mL 2-甲基-2-氨丙醇。小瓶加盖并在200℃加热4小时。将冷却的2-甲基-2-氨丙醇溶液转移到闪烁小瓶中，其中加入5mL二氯甲烷。样品用5mL体积的水洗涤三次。将硫酸钠加到二氯甲烷中以除去任何残余的水，并且将等分试样转移到GC小瓶中用于分析。
在Leco Pegasus 4D Comprehensive 2D气相色谱飞行时间质谱仪上分析衍生物样品，该质谱仪配有在第一维度中的30M Supelco GammaDex 120（Supelco 24307）柱和在第二维度中的2M Varian VF5-MS（VarianCP9034）柱。测试样品中的主要链长脂肪酸的保留时间（在第一和第二维度中）通过相同的制备和分析Supleco（47080-U）BAME（细菌酸甲酯）标准混合物进行确认。使用这些柱，期望4,4'二甲基
Figure BDA00001880021900491
唑啉衍生的支链脂肪酸在第一维度中在它们的直链链长同源物之前洗脱，并且这通过在上述BAME标准参考中的C15甲酯的异和反异结构异构体进行确认（衍生成它们的4,4'-二甲基
Figure BDA00001880021900492
唑啉衍生物）。
比较两个菌种产生的脂肪酸特征。第一个菌株经工程化以产生支链脂肪酸[BL21 Star（DE3）（pTrcHisA Ec sbm So ce epi pZA31 mmat）]，并且第二个菌株是对照菌株[BL21 Star（DE3）（pTrcHisA pZA31）]。包含pTrcHisA Ec sbm So ce epi和pZA31 mmat的大肠杆菌BL21 Star（DE3）的样品依据Budapest Treaty for the International Recognition of the Deposit ofMicroorganisms for the Purpose of num="FF- Procedure（“Budapest Treaty”）的条款，在2010年12月14日保藏于美国典型培养物保藏中心（ATCC），10801 University Blvd.，Manassas，VA，并且分配有根据日期[DATE]的保藏号[XXX]。来自第一个菌株的样品在所述区域中显示多个峰，其中预期有支链脂肪酸（图26），而来自对照菌株的样品不显示此类峰（图27）。例如，多个峰（标记的54、55和57）在与支链C15酸一致的位置，并且峰137和139在支链C17酸预期的位置。质谱仪确定这些峰包含支链脂肪酸。
Figure BDA00001880021900493
唑啉衍生物的质谱裂解图用于确认使用包含2D GC的支链鉴定的脂肪酸。沿碳链的
Figure BDA00001880021900494
唑啉衍生物片段从分子的功能末端开始。如果支化点沿主链发生，早质谱图中有一个间隙；哪个峰缺失（或减弱）取决于支链的位置。图28描述了图26中标记为甲基-支链十四脂肪酸
Figure BDA00001880021900495
唑啉衍生物的54、55和57峰的质谱。圆圈标示的离子相对于直链十五烷脂肪酸（底部质谱）的参考质谱表现出减弱的强度或无强度，并且将它们指定为8-甲基、10-甲基和12-甲基（反异）十四脂肪酸（都是
Figure BDA00001880021900501
唑啉衍生物）。尽管直链样品的质谱数据类似，峰57暂定为反异C15
Figure BDA00001880021900502
唑啉衍生物，这是因为1）在2D气相色谱上峰61在反异C15标准物的位置上迁移，2）252分子量的离子的存在量相对于邻近的238和266分子量的离子的量略低，以及3）通过这种技术可能难以鉴定反异化合物。8-和10-支链脂肪酸在图28的顶部双特征图中显示，它们易于通过几乎完全缺失圆圈标示片段进行鉴定。图26中的峰137和139指定为8-甲基十四烷酸和12-甲基十四烷酸（作为
Figure BDA00001880021900503
唑啉衍生物）。因此，Bl32 Star（DE3）（pTrcHisA Ec sbm So ce epi pZA31mmat）（即包含过表达的或重组的多核苷酸的重组微生物，所述多核苷酸编码甲基丙二酰CoA变位酶、甲基丙二酰CoA差向异构酶和酰基转移酶）产生支链C15和C17脂肪酸，其在偶数碳上包含甲基支链。
也在产生外来丙酰CoA羧化酶和天蓝色链霉菌甲基丙二酰CoA变位酶的宿主细胞中观察到支链脂肪酸的产生。包含丙酰CoA羧化酶基因的菌株产生如表F所示的支链脂肪酸。
表F
Figure BDA00001880021900504
包含天蓝色链霉菌甲基丙二酰CoA变位酶基因的微生物（BL21 Star（DE3），其包含pZA31 mutAB Ss epi pTrcHisA mmat）产生四种支链脂肪酸：6-甲基十四烷酸、10-甲基十四烷酸、6-甲基十六烷酸和12-甲基十六烷酸。
使用2D气相色谱和质谱仪，比较两个重组菌株的脂肪酸特征，所述菌株包含Ec sbm、So ce epi、Mb mmat并且包含或缺失硫酯酶编码序列（‘tesA）。支链C15脂肪酸相对于支链C17脂肪酸的量在包含‘tesA的菌株中较大。在K27-Z1（pTrcHisA Ec sbm So ce epi pZA31 mmat）中的支链C15脂肪酸相对于支链C17脂肪酸的面积百分比比率为1.4，而由K27-Z1（pTrcHisA Ec sbm So ce epi pZA31 mmat pZS22Ec‘tesA）产生的比率为7.0。表达硫酯酶缩短了支链脂肪酸的链长。
这些结果展示本发明产生丙酰CoA羧化酶或产生甲基丙二酰CoA变位酶、甲基丙二酰CoA差向异构酶和酰基转移酶的细胞产生支链脂肪酸，所述支链脂肪酸在偶数碳上包含甲基支链。重组宿主细胞还包含编码硫酯酶的多核苷酸，该细胞优先产生包含较短链长的脂肪酸。
本文所公开的量纲和值不旨在被理解为严格地限于所述的精确值。相反，除非另外指明，每个这样的量纲是指所引用的数值和围绕该数值的功能上等同的范围。例如，所公开的量纲“40mm”旨在表示“约40mm”。
除非明确排除或换句话讲有所限制，本文中引用的每一个文件，包括任何交叉引用或相关专利或专利申请，均据此以引用方式全文并入本文。对任何文献的引用均不是承认其为本文公开的或受权利要求书保护的任何发明的现有技术、或承认其独立地或以与任何其它一个或更多个参考文献的任何组合的方式提出、建议或公开任何此类发明。此外，如果此文献中术语的任何含义或定义与任何以引用方式并入本文的文献中相同术语的任何含义或定义相冲突，将以此文献中赋予那个术语的含义或定义为准。
虽然已经举例说明和描述了本发明的特定实施方案，但是对于本领域的技术人员来讲显而易见的是，在不脱离本发明的实质和范围的情况下可做出各种其他改变和变型。因此，随附权利要求书中旨在涵盖本发明范围内的所有这些改变和变型。
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Claims (10)

1.一种方法，所述方法用于生产在一个或更多个偶数碳上包含甲基的支链脂肪酸，所述方法包括在允许一种或更多种多核苷酸的表达和支链脂肪酸的生产的条件下培养细胞，所述细胞包含下列多核苷酸：
（aa）外来的或过表达的多核苷酸，所述多核苷酸包含编码多肽的核酸序列，所述多肽催化丙酰CoA转化成甲基丙二酰CoA，和/或（bb）外来的或过表达的多核苷酸，所述多核苷酸包含编码多肽的核酸序列，所述多肽催化琥珀酰CoA转化成甲基丙二酰CoA，其中所述细胞比不包含所述一种或更多种多核苷酸的其它类似的细胞生产更多的支链脂肪酸，所述支链脂肪酸在一个或更多个偶数碳上包含甲基。
2.如权利要求1所述的方法，所述方法还包括从培养物中提取所述支链脂肪酸或所述支链脂肪酸的产物。
3.如前述权利要求中的任一项所述的方法，其中所述催化丙酰CoA转化成甲基丙二酰CoA的多肽是丙酰CoA羧化酶，和/或所述催化琥珀酰CoA转化成甲基丙二酰CoA的多肽是甲基丙二酰CoA变位酶。
4.如前述权利要求中的任一项所述的方法，其中所述细胞包含具有编码甲基丙二酰CoA变位酶的核酸序列的外来的或过表达的多核苷酸，并且还包含具有编码甲基丙二酰CoA差向异构酶的核酸序列的外来的或过表达的多核苷酸。
5.如前述权利要求中的任一项所述的方法，其中所述细胞还包含下列多核苷酸：编码缺少聚酮合成活性的酰基转移酶的外来的或过表达的多核苷酸，和/或包含编码硫酯酶的核酸序列的外来的或过表达的多核苷酸。
6.如前述权利要求中的任一项所述的方法，其中所述细胞生产II型脂肪酸合酶。
7.如前述权利要求中的任一项所述的方法，其中所述细胞是大肠杆菌。
8.一种由前述权利要求中的任一项所述的方法生产的支链脂肪酸。
9.一种细胞，所述细胞包含下列多核苷酸：
(i)包含编码缺少聚酮合成活性的酰基转移酶的核酸序列的外来的或过表达的多核苷酸，和
(ii)包含编码丙酰CoA羧化酶的核酸序列的外来的或过表达的多核苷酸，和/或包含编码甲基丙二酰CoA变位酶的核酸序列的外来的或过表达的多核苷酸，
其中所述一种或更多种多核苷酸被表达，并且所述细胞比不包含所述一种或更多种多核苷酸的其它类似的细胞生产更多的支链脂肪酸，所述支链脂肪酸在一个或更多个偶数碳上包含甲基。
10.如权利要求9所述的细胞，其中所述细胞是大肠杆菌。
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