CN103097538B - 支链脂肪酸以及其生物性生产 - Google Patents

Abstract

本发明提供了生产反异脂肪酸的方法。所述方法包括在允许一种或更多种多核苷酸的表达和反异脂肪酸的生产的条件下培养细胞，所述细胞包含至少一种外来的或过表达的多核苷酸，所述多核苷酸包含编码多肽的核酸序列，所述多肽催化下列反应中的至少一种：丙酮酸至柠苹酸的转化；柠苹酸至柠康酸的转化；柠康酸至β-甲基-D-苹果酸的转化；β-甲基-D-苹果酸至2-氧代丁酸的转化；或苏氨酸至2-氧代丁酸的转化。任选地，所述细胞还包含至少一种外来的或过表达的多核苷酸，所述多核苷酸包含编码多肽的核酸序列：所述多肽催化下列反应：2-氧代丁酸至2-乙酰-2-羟丁酸的转化、2-乙酰-2-羟丁酸至2,3-二羟基-3-甲基戊酸的转化、和/或2,3-二羟基-3-甲基戊酸至α-酮基-3-甲基戊酸的转化。本发明也提供了生产反异脂肪酸的细胞以及使用所述细胞生产反异脂肪酸的方法。

Description

支链脂肪酸以及其生物性生产

发明领域

本发明涉及生产脂肪酸的细胞和方法，更具体地讲涉及生产反异和/或异支链脂肪酸的细胞和方法。

发明背景

反异和异支链脂肪酸是具有分别在n-2和n-1碳上具有甲基支链的羧酸。类似于其他脂肪酸，反异和异支链脂肪酸用于制造例如食品、洗涤剂、杀虫剂和个人护理产品如洗发剂、皂和化妆品。

反异和异支链脂肪酸能够通过化学合成或能够从某些动物和细菌中分离。虽然某些细菌例如大肠杆菌非天然生产反异或异支链脂肪酸，但一些细菌如芽孢杆菌属和链霉菌属的成员天然生产反异和异支链脂肪酸。例如，除虫链霉菌（Streptomyces avermitilis）和枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）都生产具有15个和17个总碳的反异脂肪酸和具有15个、16个和17个总碳的异支链脂肪酸（Cropp等人，Can.J.Microbiology 46：506-14（2000）；De Mendoza等人，Biosynthesis and Function of MembraneLipids，in Bacillus subtilis and Other Gram-Positive Bacteria，Sonenshein和Losick编辑，American Society for Microbiology，（1993））。然而，这些生物体不生产商业可用量的反异和/或异支链脂肪酸。这些天然生物体的另一限制是它们似乎不生产中链反异和/或异支链脂肪酸如具有11个或13个碳的那些。

同样地，需要商业可用的生物合成生产的反异和/或异支链脂肪酸。此外，需要生产此类反异和/或异支链脂肪酸的方法。

发明概述

提供了生产反异和/或异支链脂肪酸（本文也称为反异和/或异脂肪酸）的细胞和方法。多核苷酸包含编码催化与细胞中支链脂肪酸生产相关联的反应的多肽的核酸序列。

在一个方面，本发明提供生产反异脂肪酸的方法。所述方法包括在允许一种或更多种多核苷酸的表达和反异脂肪酸的生产的条件下培养细胞，所述细胞包含至少一种外来的或过表达的多核苷酸，所述多核苷酸包含编码多肽的核酸序列，所述多肽催化下列反应中的至少一种：(aa)丙酮酸至柠苹酸的转化；(bb)柠苹酸至柠康酸的转化；(cc)柠康酸至β-甲基-D-苹果酸的转化；(dd)β-甲基-D-苹果酸至2-氧代丁酸的转化；或(ee)苏氨酸至2-氧代丁酸的转化。所述细胞比不包含所述一种或更多种多核苷酸的其它类似的细胞生产更多的反异脂肪酸。在一些实施方案中，所述细胞还包含至少一种外来的或过表达的多核苷酸，所述多核苷酸包含编码多肽的核酸序列，所述多肽催化下列反应中的至少一种：(ff)2-氧代丁酸至2-乙酰-2-羟丁酸的转化，(gg)2-乙酰-2-羟丁酸至2,3-二羟基-3-甲基戊酸的转化，或(hh)2,3-二羟基-3-甲基戊酸至2-酮基-3-甲基戊酸的转化。任选地，所述方法还包括从培养物中提取反异脂肪酸或从培养物中提取来源于反异脂肪酸的产物。

本发明也提供细胞，所述细胞包含下列多核苷酸：包含编码苏氨酸脱氨酶的核酸序列的外来的或过表达的多核苷酸、包含编码支链α-酮酸脱氢酶的核酸序列的外来的或过表达的多核苷酸和包含编码3-酮脂酰-ACP合酶的核酸序列的外来的或过表达的多核苷酸，其中所述多核苷酸在所述细胞中表达。此外，本发明提供细胞，所述细胞包含下列多核苷酸：包含编码柠苹酸合酶的核酸序列的外来的或过表达的多核苷酸、包含编码支链α-酮酸脱氢酶的核酸序列的外来的或过表达的多核苷酸和包含编码3-酮脂酰-ACP合酶的核酸序列的外来的或过表达的多核苷酸，其中所述多核苷酸在所述细胞中表达。任选地，所述细胞还包含下列多核苷酸：包含编码乙酰羟酸合酶的核酸序列的外来的或过表达的多核苷酸和/或包含编码硫酯酶的核酸序列的外来的或过表达的多核苷酸。本发明也提供了通过培养细胞生产反异脂肪酸的方法。

在某些实施方案中，提供了具有至少一种外来的多核苷酸的细胞。作为另外一种选择或除此之外，所述细胞包含过表达的多核苷酸。所述多核苷酸具有编码多肽的核酸序列，所述多肽催化下列反应中的一种：异亮氨酸至2-酮基,3-甲基戊酸的转化；2-酮基,3-甲基戊酸至2-甲基丁酰-CoA的转化；2-甲基丁酰-CoA至2-甲基丁酰-ACP的转化；2-甲基丁酰-ACP至4-甲基3-酮己酰基-ACP的转化；2-甲基丁酰-CoA至4-甲基3-酮己酰基-ACP的转化；或酰基-ACP至反异脂肪酸的转化。包含外来的多核苷酸的细胞比不包含所述外来的多核苷酸的其它类似的细胞生产更多的反异脂肪酸。

本发明也提供了提高细菌细胞中反异脂肪酸的方法。所述方法包括在细菌细胞中表达编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化下列反应中的一种：2-酮基,3-甲基戊酸至2-甲基丁酰-CoA的转化；2-甲基丁酰-CoA至2-甲基丁酰-ACP的转化；2-甲基丁酰-ACP至4-甲基3-酮己酰基-ACP的转化；2-甲基丁酰-CoA至4-甲基3-酮己酰基-ACP的转化；或酰基-ACP至反异脂肪酸的转化，以及在允许细胞生产多肽的条件下培养所述细菌细胞使得反异脂肪酸生产。

本发明还提供了生产反异脂肪酸的大肠杆菌细胞。

还提供了提高细胞中反异脂肪酸的方法。所述方法包括在细胞中表达多核苷酸，所述多核苷酸编码外来的支链氨基酸氨基转移酶、外来的支链α-酮酸脱氢酶（BCDH）和外来的3-酮脂酰-ACP合酶；以及在使得反异脂肪酸生产的条件下培养所述细胞。

在某些实施方案中，提供了生产反异脂肪酸的方法。所述方法包括培养包含至少一种外来的多核苷酸的至少一种细胞，所述多核苷酸编码至少一种多肽，其能够在使得反异脂肪酸生产的条件下从异亮氨酸中生产反异脂肪酸。

此外，在某些实施方案中，还提供了包含至少两种外来的多核苷酸的细胞。所述外来的多核苷酸包含编码多肽的核酸序列，所述多肽催化下列反应中的至少两种：亮氨酸至2-酮基,4-甲基戊酸的转化；缬氨酸至2-酮基3-甲基丁酸的转化；2-酮基,4-甲基戊酸至3-甲基丁酰-CoA的转化；3-甲基丁酰-CoA至3-甲基丁酰-ACP的转化；3-甲基丁酰-ACP至5-甲基3-酮己酰基-ACP的转化；2-酮基3-甲基丁酸至2-甲基丙酰-CoA的转化；2-甲基丙酰-CoA至2-甲基丙酰-ACP的转化；2-甲基丙酰-ACP至4-甲基戊酰-ACP的转化；3-甲基丁酰-CoA至5-甲基3-酮己酰基-ACP的转化；2-甲基丙酰-CoA至4-甲基3-酮戊酰-ACP的转化；或酰基-ACP至异脂肪酸的转化，并且其中包含所述外来的多核苷酸的细胞比不包含所述外来的多核苷酸的其它类似的细胞生产更多的异脂肪酸。

还提供了提高细菌细胞中异脂肪酸的方法。所述方法包括在细菌细胞中表达编码至少两种多肽的多核苷酸，所述多肽催化下列反应中的至少两种：亮氨酸至2-酮基,4-甲基戊酸的转化；缬氨酸至2-酮基3-甲基丁酸的转化；2-酮基,4-甲基戊酸至3-甲基丁酰-CoA的转化；3-甲基丁酰-CoA至3-甲基丁酰-ACP的转化；3-甲基丁酰-ACP至5-甲基3-酮己酰基-ACP的转化；2-酮基3-甲基丁酸至2-甲基丙酰-CoA的转化；2-甲基丙酰-CoA至2-甲基丙酰-ACP的转化；2-甲基丙酰-ACP至4-甲基戊酰-ACP的转化；3-甲基丁酰-CoA至5-甲基3-酮己酰基-ACP的转化；2-甲基丙酰-CoA至4-甲基3-酮戊酰-ACP的转化；或酰基-ACP至异脂肪酸的转化，以及在允许细胞生产多肽的条件下培养所述细菌细胞使得异脂肪酸生产。

下列每个编号的段落简明地定义本发明的一个或多个示例性变型：

1.生产反异脂肪酸的方法，所述方法包括在在允许一种或更多种多核苷酸的表达和反异脂肪酸的生产的条件下培养细胞，所述细胞包含至少一种外来的或过表达的多核苷酸，所述多核苷酸包含编码多肽的核酸序列，所述多肽催化下列反应中的至少一种：(aa)丙酮酸至柠苹酸的转化；(bb)柠苹酸至柠康酸的转化；(cc)柠康酸至β-甲基-D-苹果酸的转化；(dd)β-甲基-D-苹果酸至2-氧代丁酸的转化；或(ee)苏氨酸至2-氧代丁酸的转化，其中所述细胞比不包含所述一种或更多种多核苷酸的其它类似的细胞生产更多的反异脂肪酸。

2.如段落1所述的方法，所述方法还包括将所述细胞暴露于硫胺素。

3.如段落1所述的方法，所述方法还包括从培养物中提取反异脂肪酸。

4.如段落1所述的方法，所述方法还包括从所述培养物中提取来源于反异脂肪酸的产物。

5.如段落1所述的方法，其中所述细胞还包含至少一种外来的或过表达的多核苷酸，所述多核苷酸包含编码多肽的核酸序列，所述多肽催化下列反应中的至少一种：(ff)2-氧代丁酸至2-乙酰-2-羟丁酸的转化，(gg)2-乙酰-2-羟丁酸至2,3-二羟基-3-甲基戊酸的转化，或(hh)2,3-二羟基-3-甲基戊酸至2-酮基-3-甲基戊酸的转化。

6.如段落5所述的方法，其中所述细胞包含外来的或过表达的多核苷酸，所述多核苷酸编码催化3、4、5、6、7或全部反应的多肽。

7.如段落5所述的方法，其中所述细胞包含外来的或过表达的多核苷酸，所述多核苷酸编码催化反应(aa)、(bb)、(cc)和(ff)的多肽。

8.如段落5所述的方法，其中所述细胞包含下列多核苷酸：编码柠苹酸合酶的外来的或过表达的多核苷酸、包含编码乙酰羟酸合酶的核酸序列的外来的或过表达的多核苷酸、包含编码异丙基苹果酸异构酶的核酸序列的外来的或过表达的多核苷酸、包含编码异丙基苹果酸脱氢酶的核酸序列的外来的或过表达的多核苷酸、或它们的组合。

9.如段落8所述的方法，其中所述细胞包含下列多核苷酸：编码柠苹酸合酶的外来的多核苷酸、编码乙酰羟酸合酶的外来的或过表达的多核苷酸、编码异丙基苹果酸异构酶的外来的或过表达的多核苷酸和编码异丙基苹果酸脱氢酶的外来的或过表达的多核苷酸。

10.如段落8所述的方法，其中所述柠苹酸合酶是来源于詹氏甲烷球菌（M.jannaschii）CimA。

11.如段落8所述的方法，其中所述异丙基苹果酸异构酶是大肠杆菌LeuCD。

12.如段落8所述的方法，其中所述异丙基苹果酸脱氢酶是大肠杆菌LeuB。

13.如段落8所述的方法，其中所述乙酰羟酸合酶是大肠杆菌IlvIH、大肠杆菌IlvIH（G14D）、大肠杆菌IlvGM或枯草芽孢杆菌IlvBH。

14.如段落5所述的方法，其中所述细胞包含外来的或过表达的多核苷酸，所述多核苷酸编码催化反应(ee)和(ff)的多肽。

15.如段落5所述的方法，其中所述细胞包含下列多核苷酸：编码苏氨酸脱氨酶的外来的或过表达的多核苷酸和编码乙酰羟酸合酶的外来的或过表达的多核苷酸。

16.如段落15所述的方法，其中所述苏氨酸脱氨酶是大肠杆菌TdcB。

17.如段落15所述的方法，其中所述乙酰羟酸合酶是大肠杆菌IlvIH、大肠杆菌IlvIH（G14D）、大肠杆菌IlvGM或枯草芽孢杆菌IlvBH。

18.如段落5所述的方法，其中所述一种或更多种外来的或过表达的多核苷酸（i）包含核酸序列，所述核酸序列与如SEQ ID NO:32、36、42、43、46、51、57、62、68或83所示的核酸序列具有至少约90%的同一性，或（ii）编码多肽，所述多肽包含的氨基酸序列与如SEQ ID NO:33、39、40、41、47、48、52、53、58、65、66、67、84或85所示的氨基酸序列具有至少约90%的同一性。

19.如段落5所述的方法，其中所述细胞经修饰以降低支链氨基酸氨基转移酶的活性。

20.如段落5所述的方法，其中所述细胞还包含下列多核苷酸：包含编码支链氨基酸氨基转移酶的核酸序列的外来的或过表达的多核苷酸、包含编码支链α-酮酸脱氢酶的核酸序列的外来的或过表达的多核苷酸、包含编码酰基转移酶的核酸序列的外来的或过表达的多核苷酸、包含编码3-酮脂酰-ACP合酶的核酸序列的外来的或过表达的多核苷酸、包含编码烯酰-ACP还原酶的核酸序列的外来的或过表达的多核苷酸、包含编码硫酯酶的核酸序列的外来的或过表达的多核苷酸、或它们的组合。

21.如段落20所述的方法，其中所述一种或更多种外来的或过表达的多核苷酸包含核酸序列（i）所述核酸序列与如SEQ ID NO:1、4、7、13、17、18、19、20、21、22、23、68、77或78所示的核酸序列具有至少90%的同一性，或（ii）所述核酸序列编码多肽，所述多肽具有的氨基酸序列，所述氨基酸序列与如SEQ ID NO:10、16、24、25、26、27、28、29或73所示的氨基酸序列具有至少90%的同一性。

22.如段落20所述的方法，其中所述细胞包含下列多核苷酸：包含编码支链α-酮酸脱氢酶的核酸序列的外来的或过表达的多核苷酸和包含编码3-酮脂酰-ACP合酶的核酸序列的外来的或过表达的多核苷酸。

23.如段落22所述的方法，其中所述细胞是埃希氏菌属细胞。

24.如段落22所述的方法，其中所述支链α-酮酸脱氢酶是枯草芽孢杆菌Bkd。

25.如段落22所述的方法，其中所述3-酮脂酰-ACP合酶是枯草芽孢杆菌FabH。

26.如段落22所述的方法，其中所述细胞还包含外来的或过表达的多核苷酸，所述多核苷酸包含编码硫酯酶的核酸序列。

27.细胞，所述细胞包含下列多核苷酸：包含编码苏氨酸脱氨酶的核酸序列的外来的或过表达的多核苷酸、包含编码支链α-酮酸脱氢酶的核酸序列的外来的或过表达的多核苷酸和包含编码3-酮脂酰-ACP合酶的核酸序列的外来的或过表达的多核苷酸，其中所述多核苷酸被表达，并且所述细胞比不包含所述一种或更多种多核苷酸的其它类似的细胞生产更多的反异脂肪酸。

28.如段落27所述的细胞，其中所述支链α-酮酸脱氢酶是枯草芽孢杆菌Bkd，并且所述3-酮脂酰-ACP合酶是枯草芽孢杆菌FabH。

29.如段落27所述的细胞，所述细胞还包含外来的或过表达的多核苷酸，所述多核苷酸包含编码硫酯酶的核酸序列。

30.如段落27所述的细胞，所述细胞还包含外来的或过表达的多核苷酸，所述多核苷酸包含编码乙酰羟酸合酶的核酸序列。

31.如段落30所述的细胞，其中所述乙酰羟酸合酶是大肠杆菌IlvIH、大肠杆菌IlvIH（G14D）、大肠杆菌IlvGM或枯草芽孢杆菌IlvBH。

32.如段落27所述的细胞，其中所述细胞是非天然生产反异脂肪酸的细菌细胞。

33.如段落32所述的细胞，其中所述细胞是埃希氏菌属细胞。

34.生产反异脂肪酸的方法，所述方法包括在允许所述多核苷酸的表达和反异脂肪酸的生产的条件下培养段落32的细菌细胞。

35.细胞，所述细胞包含下列多核苷酸：包含编码柠苹酸合酶的核酸序列的外来的或过表达的多核苷酸、包含编码支链α-酮酸脱氢酶的核酸序列的外来的或过表达的多核苷酸和包含编码3-酮脂酰-ACP合酶的核酸序列的外来的或过表达的多核苷酸，其中所述多核苷酸被表达，并且所述细胞比不包含所述一种或更多种多核苷酸的其它类似的细胞生产更多的反异脂肪酸。

36.如段落35所述的细胞，其中所述柠苹酸合酶是来源于詹氏甲烷球菌CimA，所述支链α-酮酸脱氢酶是枯草芽孢杆菌Bkd，并且所述3-酮脂酰-ACP合酶是枯草芽孢杆菌FabH。

37.如段落35所述的细胞，所述细胞还包含下列多核苷酸：包含编码异丙基苹果酸异构酶的核酸序列的外来的或过表达的多核苷酸、包含编码异丙基苹果酸脱氢酶的核酸序列的外来的或过表达的多核苷酸、包含编码乙酰羟酸合酶的核酸序列的外来的或过表达的多核苷酸、包含编码烯酰-ACP合酶的核酸序列的外来的或过表达的多核苷酸、包含编码硫酯酶的核酸序列的外来的或过表达的多核苷酸、或它们的组合。

38.如段落37所述的方法，其中所述异丙基苹果酸异构酶是大肠杆菌LeuCD。

39.如段落37所述的方法，其中所述异丙基苹果酸脱氢酶是大肠杆菌LeuB。

40.如段落37所述的细胞，其中所述乙酰羟酸合酶是大肠杆菌IlvIH、大肠杆菌IlvIH（G14D）、大肠杆菌IlvGM或枯草芽孢杆菌IlvBH。

41.如段落35所述的细胞，其中所述细胞是非天然生产反异脂肪酸的细菌细胞。

42.如段落41所述的细胞，其中所述细胞是埃希氏菌属细胞。

43.生产反异脂肪酸的方法，所述方法包括在允许所述多核苷酸的表达和反异脂肪酸的生产的条件下培养段落41的细菌细胞。

44.细胞，所述细胞包含至少一种外来的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码多肽的核酸序列，所述多肽催化下列反应中的其中一种：a.异亮氨酸至2-酮基,3-甲基戊酸的转化；b.2-酮基,3-甲基戊酸至2-甲基丁酰-CoA的转化；c.2-甲基丁酰-CoA至2-甲基丁酰-ACP的转化；d.2-甲基丁酰-ACP至4-甲基3-酮己酰基-ACP的转化；e.2-甲基丁酰-CoA至4-甲基3-酮己酰基-ACP的转化；或f.酰基-ACP至反异脂肪酸的转化，并且其中包含所述外来的多核苷酸的细胞比不包含所述外来的多核苷酸的其它类似的细胞生产更多的反异脂肪酸。

45.如段落44所述的细胞，其中所述多核苷酸编码支链氨基酸氨基转移酶、支链α-酮酸脱氢酶（BCDH）、酰基转移酶、3-酮脂酰-ACP合酶或硫酯酶。

46.如段落44所述的细胞，其中所述细胞是埃希氏菌属细胞。

47.如段落44所述的细胞，其中所述细胞包含多核苷酸，所述多核苷酸编码催化2、3、4、5或全部反应的多肽。

48.如段落44所述的细胞，其中所述多核苷酸与如SEQ ID NO:1、4、7、13、17、18、19、20、21、22或23所示的序列具有至少30%的序列同一性。

49.如段落44所述的细胞，其中所述多肽与如SEQ ID NO:10、16、24、25、26、27、28或29所示的序列具有至少40%的序列同一性。

50.如段落44所述的细胞，其中所述细胞是大肠杆菌细胞，并且所述多核苷酸与如SEQ ID NO:1、4、7、13、17、18、19、20、21、22或23所示的序列具有至少65%的序列同一性。

51.如段落44所述的细胞，其中所述多肽基本上与具有如SEQ IDNO:10、16、24、25、26、27、28或29所示的序列的多肽相同。

52.如段落44所述的细胞，其中所述反异脂肪酸是中链反异脂肪酸。

53.如段落44所述的细胞，其中所述反异脂肪酸在所述细胞中非天然生产。

54.反异脂肪酸由如段落44所述的细胞生产。

55.如段落44所述的细胞，其中所述多核苷酸编码来自芽孢杆菌属（Bacillus）、链霉菌属（Streptomyces）或李斯特菌属（Listeria）的脂肪酸合酶基因。

56.如段落44所述的细胞，其中所述多核苷酸编码来自天然生产支链脂肪酸的生物体的脂肪酸合酶基因。

57.提高细菌细胞中反异脂肪酸的方法，所述方法包括：

a.在细菌细胞中表达编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化下列反应中的一种：i.2-酮基,3-甲基戊酸至2-甲基丁酰-CoA的转化；ii.2-甲基丁酰-CoA至2-甲基丁酰-ACP的转化；iii.2-甲基丁酰-ACP至4-甲基3-酮己酰基-ACP的转化；iv.2-甲基丁酰-CoA至4-甲基3-酮己酰基-ACP的转化；或v.酰基-ACP至反异脂肪酸的转化，以及

b.在允许细胞生产所述多肽的条件下培养所述细菌细胞使得反异脂肪酸生产。

58.如段落57所述的方法，其中所述细胞在表达所述多核苷酸后比它在表达所述多核苷酸前生产更高含量的反异脂肪酸。

59.如段落57所述的方法，其中所述多肽是支链氨基酸氨基转移酶、支链α-酮酸脱氢酶（BCDH）、3-酮脂酰-ACP合酶或硫酯酶。

60.如段落57所述的方法，其中所述细胞是埃希氏菌属细胞。

61.如段落57所述的方法，其中所述方法包括在所述细菌中表达多核苷酸，所述多核苷酸编码催化2、3、4、5或全部反应的多肽。

62.如段落57所述的方法，其中所述多核苷酸与如SEQ ID NO:1、4、7、13、17、18、19、20、21、22或23所示的序列具有至少30%的序列同一性。

63.如段落57所述的方法，其中所述多肽与如SEQ ID NO:10、16、24、25、26、27、28或29所示的序列具有至少40%的序列同一性。

64.如段落57所述的方法，其中所述细胞是大肠杆菌细胞，并且所述多核苷酸与如SEQ ID NO:1、4、7、13、17、18、19、20、21、22或23所示的序列具有至少65%的序列同一性。

65.如段落57所述的方法，其中所述多肽基本上与具有如SEQ IDNO:10、16、24、25、26、27、28或29所示的序列的多肽相同。

66.如段落57所述的方法，其中所述反异脂肪酸是中链反异脂肪酸。

67.如段落57所述的方法，其中所述反异脂肪酸在所述细胞中非天然生产。

68.反异脂肪酸由如段落57所述的方法生产。

69.大肠杆菌细胞，所述细胞生产反异脂肪酸。

70.如段落69所述的细胞，其中所述反异脂肪酸是中链脂肪酸。

71.如段落69所述的细胞，其中所述细胞包含多核苷酸，所述多核苷酸与如SEQ ID NO:1、4、7、13、17、18、19、20、21、22或23所示的序列具有至少30%的序列同一性。

72.反异脂肪酸由如段落69所述的细胞生产。

73.提高细胞中反异脂肪酸的方法，所述方法包括：

a.在细胞中表达一种或更多种多核苷酸，所述多核苷酸编码外来的支链氨基酸氨基转移酶、外来的支链α-酮酸脱氢酶（BCDH）和外来的3-酮脂酰-ACP合酶；

b.在使得反异脂肪酸生产的条件下培养所述细胞。

74.如段落73所述的方法，其中所述方法还包括在所述细胞中表达编码外来硫酯酶的多核苷酸。

75.如段落73所述的方法，其中所述多核苷酸与如SEQ ID NO:1、4、7、13、17、18、19、20、21、22或23所示的序列具有至少30%的序列同一性。

76.如段落73所述的方法，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽与如SEQ ID NO:10、16、24、25、26、27、28或29所示的序列具有至少40%的序列同一性。

77.如段落73所述的方法，其中所述细胞是大肠杆菌细胞，并且所述多核苷酸与如SEQ ID NO:1、4、7、13、17、18、19、20、21、22或23所示的序列具有至少65%的序列同一性。

78.如段落76所述的方法，其中所述多肽基本上与具有如SEQ IDNO:10、16、24、25、26、27、28或29所示的序列的多肽相同。

79.如段落73所述的方法，其中所述反异脂肪酸是中链反异脂肪酸。

80.如段落73所述的方法，其中所述反异脂肪酸在所述细胞中非天然生产。

81.反异脂肪酸由如段落73所述的方法生产。

82.生产反异脂肪酸的方法，所述方法包括培养至少一种细胞，所述细胞包含至少一种外来的多核苷酸，所述多核苷酸编码至少一种多肽，所述多肽能够在使得反异脂肪酸生产的条件下从异亮氨酸中生产反异脂肪酸。

83.如段落82所述的方法，其中所述细胞是大肠杆菌细胞。

84.如段落82所述的方法，其中所述反异脂肪酸在所述细胞中非天然生产。

85.反异脂肪酸由如段落82所述的方法生产。

86.细胞，所述细胞包含至少两种外来的多核苷酸，其中所述外来的多核苷酸包含编码多肽的核酸序列，所述多肽催化下列反应中的至少两种：a.亮氨酸至2-酮基,4-甲基戊酸的转化；b.缬氨酸至2-酮基3-甲基丁酸的转化；c.2-酮基,4-甲基戊酸至3-甲基丁酰-CoA的转化；d.3-甲基丁酰-CoA至3-甲基丁酰-ACP的转化；e.3-甲基丁酰-ACP至5-甲基3-酮己酰基-ACP的转化；f.2-酮基3-甲基丁酸至2-甲基丙酰-CoA的转化；g.2-甲基丙酰-CoA至2-甲基丙酰-ACP的转化；h.2-甲基丙酰-ACP至4-甲基戊酰-ACP的转化；i.3-甲基丁酰-CoA至5-甲基3-酮己酰基-ACP的转化；j.2-甲基丙酰-CoA至4-甲基3-酮戊酰-ACP的转化；或k.酰基-ACP至异脂肪酸的转化，并且其中包含所述外来的多核苷酸的细胞比不包含所述外来的多核苷酸的其它类似的细胞生产更多的异脂肪酸。

87.如段落86所述的细胞，其中所述多核苷酸编码支链氨基酸氨基转移酶、支链α-酮酸脱氢酶（BCDH）、酰基转移酶、3-酮脂酰-ACP合酶或硫酯酶。

88.如段落86所述的细胞，其中所述细胞是埃希氏菌属细胞。

89.如段落86所述的细胞，其中所述多核苷酸包含核酸序列，所述核酸序列编码催化3、4、5、6、7、8、9、10或全部反应的多肽。

90.如段落86所述的细胞，其中所述多核苷酸与如SEQ ID NO:1、4、7、13、17、18、19、20、21、22或23所示的序列具有至少30%的序列同一性。

91.如段落86所述的细胞，其中所述多肽与如SEQ ID NO:10、16、24、25、26、27、28或29所示的序列具有至少40%的序列同一性。

92.如段落86所述的细胞，其中所述细胞是大肠杆菌细胞，并且所述多核苷酸与如SEQ ID NO:1、4、7、13、17、18、19、20、21、22或23所示的序列具有至少65%的序列同一性。

93.如段落86所述的细胞，其中所述多肽基本上与具有如SEQ IDNO:10、16、24、25、26、27、28或29所示的序列的多肽相同。

94.如段落86所述的细胞，其中所述异脂肪酸是中链异脂肪酸。

95.如段落86所述的细胞，其中所述异脂肪酸在所述细胞中非天然生产。

96.异脂肪酸由如段落86所述的细胞生产。

97.如段落86所述的细胞，其中所述多核苷酸编码来自芽孢杆菌属、链霉菌属或李斯特菌属的脂肪酸合酶基因。

98.如段落86所述的细胞，其中所述多核苷酸编码来自天然生产支链脂肪酸的生物体的脂肪酸合酶基因。

99.提高细菌细胞中异脂肪酸的方法，所述方法包括：

a.在细菌细胞中表达编码至少两种多肽的多核苷酸，所述多肽催化下列反应中的至少两种：i.亮氨酸至2-酮基,4-甲基戊酸的转化；ii.缬氨酸至2-酮基3-甲基丁酸的转化；iii.2-酮基,4-甲基戊酸至3-甲基丁酰-CoA的转化；iv.3-甲基丁酰-CoA至3-甲基丁酰-ACP的转化；v.3-甲基丁酰-ACP至5-甲基3-酮己酰基-ACP的转化；vi.2-酮基3-甲基丁酸至2-甲基丙酰-CoA的转化；vii.2-甲基丙酰-CoA至2-甲基丙酰-ACP的转化；viii.2-甲基丙酰-ACP至4-甲基戊酰-ACP的转化；ix.3-甲基丁酰-CoA至5-甲基3-酮己酰基-ACP的转化；x.2-甲基丙酰-CoA至4-甲基3-酮戊酰-ACP的转化；和xi.酰基-ACP至异脂肪酸的转化，以及

b.在允许细胞生产所述多肽的条件下培养所述细菌细胞使得异脂肪酸生产。

100.通过使用不能够降解脂肪酸的宿主菌株提高反异脂肪酸在所述培养基中积聚的方法。

101.如段落100所述的宿主菌株，其中所述生物体是大肠杆菌。

102.如段落100所述的宿主菌株，其中所述生物体是大肠杆菌fadD突变体。

103.提高细胞中反异脂肪酸产量的方法，所述方法包括：a.在所述细胞中表达编码多肽的多核苷酸，所述多肽具有下列活性中的一种：柠苹酸合酶、异丙基苹果酸异构酶和/或异丙基苹果酸脱氢酶，以及b.在允许细胞生产所述多肽的条件下培养所述细胞使得反异脂肪酸生产。

104.如段落103所述的方法，其中所述方法包括在所述细胞中表达编码具有2种或3种所述活性的多肽的多核苷酸。

105.提高细胞中反异脂肪酸产量的方法，所述方法包括：a.在所述细胞中表达编码ilvA、tdcB、ilvI、ilvH、ilvC和/或ilvD的多核苷酸的至少一种，以及b.在允许细胞生产由所述多核苷酸编码的多肽的条件下培养所述细胞使得反异脂肪酸生产。

106.提高细胞中异和/或反异脂肪酸产量的方法，所述方法包括：a.在所述细胞中表达编码具有乙酰-CoA羧化酶活性的多肽的多核苷酸，以及b.在允许细胞生产所述多肽的条件下培养所述细胞使得异和/或反异脂肪酸生产。

附图简述

图1是反异和异支链脂肪酸生物合成途径的图表。

图2是苏氨酸依赖型反异脂肪酸生物合成途径的图表。

图3是扩增的bkd操纵子的DNA序列（SEQ ID NO:1）。

图4是bkd引物的序列（SEQ ID NO:2、3）。

图5是bkd操纵子的lpdV基因的DNA序列（SEQ ID NO:4）。

图6是fabHA引物的序列（SEQ ID NO:5、6、8、9）。

图7是枯草芽孢杆菌fabHA DNA序列（SEQ ID NO:7）。

图8是枯草芽孢杆菌FabHA氨基酸序列（SEQ ID NO:10）。

图9是fabHB引物的序列（SEQ ID NO:11、12、14和15）。

图10是枯草芽孢杆菌fabHB DNA序列（SEQ ID NO:13）。

图11是枯草芽孢杆菌FabHB氨基酸序列（SEQ ID NO:16）。

图12是密码子优化的绿头鸭（Mallard）中链脂肪酸硫酯酶基因的DNA序列（SEQ ID NO:17）。

图13是最优化的开放阅读框（ORF）（SEQ ID NO:17）与初始绿头鸭中链脂肪酸硫酯酶序列（SEQ ID NO:18）的比对。

图14是密码子优化的大鼠乳腺中链脂肪酸硫酯酶基因的DNA序列（SEQ ID NO:19）。

图15是最优化的ORF（SEQ ID NO:19）与初始大鼠乳腺中链脂肪酸硫酯酶（SEQ ID NO:20）的比对。

图16是补充异亮氨酸对反异脂肪酸产量的效应的示意图。

图17是苏氨酸依赖型反异脂肪酸合成途径的图表。

图18是bkd操纵子的bkdAA基因的DNA序列（SEQ ID NO:21）

图19是bkd操纵子的bkdAB基因的DNA序列（SEQ ID NO:22）

图20是bkd操纵子的bkdB基因的DNA序列（SEQ ID NO:23）

图21是bkd操纵子的lpdV基因的蛋白质序列（SEQ ID NO:24）

图22是bkd操纵子的bkdAA基因的蛋白质序列（SEQ ID NO:25）

图23是bkd操纵子的bkdAB基因的蛋白质序列（SEQ ID NO:26）

图24是bkd操纵子的bkdB基因的蛋白质序列（SEQ ID NO:27）

图25是绿头鸭中链脂肪酸硫酯酶的蛋白质序列（SEQ ID NO:28）。

图26是大鼠乳腺中链脂肪酸硫酯酶的蛋白质序列（SEQ ID NO:29）。

图27是示出在大肠杆菌菌株K27-Z1（亲本菌株）、K27-Z1（Bs bkdBs fabH）、K27-Z1（Bs bkd Bs fabH Ec tcdB）和K27-Z1（Bs bkd Bs fabHEc tdcB Ec ilvIH（G14D））（x-轴）中的C15反异脂肪酸产量（在合成总脂肪酸中的a-C15反异脂肪酸部分；y-轴）的柱状图。制备三等份培养物，脂肪酸测量的标准偏差通过误差条表示。

图28是示出在表达不同AHAS基因的大肠杆菌K27-Z1衍生菌株中的C15和C17反异脂肪酸产量的柱状图。K27-Z1衍生菌株（x-轴）包含以下质粒和基因：（i）pTrcHisA和pZA31MCS（载体对照）；（ii）Bs bkd BsfabHA pTrcHisA；（iii）Bs bkd fabHA Ec tdcB；（iv）Bs bkd fabHA Ec tdcBEc ilvIH；（v）Bs bkd fabHA Ec tdcB Ec ilvIH（G14D）；和（vi）Bs bkd BsfabHA Ec tdcB Bs ilvBH。气相色谱分析的峰面积在y-轴上示出。一个生物平行测定用重复样品脂肪酸分析表示。

图29是示出大肠杆菌BL21 Star（DE3）衍生菌株的C15反异脂肪酸产量的柱状图。

图30是示出以下大肠杆菌衍生菌株的C15和C17反异脂肪酸产量的柱状图：K27-Z1（pTrcHisA pZA31 MCS（载体对照））、K27-Z1（Bs bkdBs fabHA）、K27-Z1（Bs bkd Bs fabHA Ec tdcB）和K27-Z1（Bs bkd BsfabHA Ec tdcB Ec ilvGM）。一个生物平行测定用重复样品脂肪酸分析来测试；标准偏差通过误差条表示。

图31是示出大肠杆菌K27-Z1衍生菌株的C15和C17反异脂肪酸产量的柱状图，所述菌株设计用于制备指定的重组蛋白：Bkd-FabHA、Bkd-FabHA-CimA-LeuBCD、Bkd-FabHA-CimA-LeuBCD-IlvIH、Bkd-FabHA-CimA-LeuBCD-IlvIH（G14D）、Bkd-FabHA-CimA-LeuBCD-IlvBH和Bkd-FabHA-CimA-LeuBCD-IlvGM。

图32是示出大肠杆菌K27-Z1（Bs bkd Bs fabH）和大肠杆菌K27-Z1（Bs bkd Bs fabHA Ec‘tesA）中的C13、C15和C17反异脂肪酸产量的柱状图。

图33是示出大肠杆菌BL21 Star（DE3）（Bs bkd Bs fabHA）和BL21Star（DE3）（Bs bkd Bs fabHA Ec‘tesA）中的C13、C15和C17反异脂肪酸产量的柱状图。

图34是示出在存在或不存在硫胺素的情况下培养的大肠杆菌中C15和C17反异脂肪酸产量的柱状图。大肠杆菌衍生菌株设计用于制备指定的重组蛋白。重复样品用“#2”表示。在培养基中存在的硫胺素改善反异脂肪酸的产量。

图35是示出大肠杆菌ilvE缺失菌株（Bs bkd Bs fabHA Ec tdcB Ec ilvIH（G14D））和对照ilvE缺失菌株（pZA31 MCS pTrcHisA）中的C15和C17反异脂肪酸产量的柱状图。

图36是示出在大肠杆菌BW25113衍生菌株中的反异和异支链脂肪酸产量的柱状图，所述菌株包含编码单核细胞增多性李斯特菌（Listeriamonocytogenes）FabH和枯草芽孢杆菌Bkd的多核苷酸。

发明详述

本发明涉及生物性生产的反异和/或异支链脂肪酸以及此类反异和/或异支链脂肪酸的改善的生物性生产。这种改善的生物性生产能够在某些实施方案中提供较高的反异和/或异支链脂肪酸产量。此外或作为另外一种选择，本发明提供将反异和/或异支链脂肪酸的链长度剪切至期望链长度的能力。

如本文所用，“扩增”指将多核苷酸序列拷贝成大量多核苷酸分子的任何方法或规程如反转录、聚合酶链反应和连接酶链反应。

如本文所用，“反义序列”指特异性地与第二个多核苷酸序列杂交的序列。例如反义序列是相对于其转录正常取向反向的DNA序列。反义序列能够表达与在宿主细胞内表达的靶mRNA分子互补的RNA转录物（例如它能够通过Watson-Crick碱基配对杂交到靶mRNA分子上）。

如本文所用，“cDNA”指以单链或双链形式与mRNA互补或相同的DNA。

如本文所用，“互补”指与多核苷酸与第二多核苷酸碱基成对。换句话说，“互补”描述了通过碱基配对退火的两个单链核酸序列之间的关系。例如具有序列5'-GTCCGA-3'的多核苷酸与具有序列5'-TCGGAC-3'的多核苷酸互补。

如本文所用，“保守取代”指用功能上类似的氨基酸取代多肽中的氨基酸。换句话说，保守取代涉及用具有相似侧链的氨基酸残基取代氨基酸残基。本领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族，它们包括具有碱性侧链的氨基酸（例如赖氨酸、精氨酸和组氨酸）、具有酸性侧链的氨基酸（例如天冬氨酸和谷氨酸）、具有不带电极性侧链的氨基酸（例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸和半胱氨酸）、具有非极性侧链的氨基酸（例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸和色氨酸）、具有β-支链侧链的氨基酸（例如苏氨酸、缬氨酸和异亮氨酸）和具有芳族侧链的氨基酸（例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和组氨酸）。

如本文所用，“编码”指核苷酸作为其他聚合物和大分子合成模板作用的固有特性。除非另外指明，“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括彼此为简并版本并编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。

如本文所用，“内源的”指在生物体或细胞内天然表达的或原生的多核苷酸、多肽或其他化合物。即，内源多核苷酸、多肽或其他化合物不是外来的。例如当所述细胞初始分离自天然来源时，“内源的”多核苷酸或肽存在于细胞中。

如本文所用，“表达载体”指包含重组多核苷酸的载体，所述多核苷酸包含可操作地连接到拟表达的核苷酸序列上的表达控制序列。例如合适的表达载体可为自主复制的或整合进染色体中的质粒。表达载体也可为基于病毒的载体。

如本文所用，“外来的”指在其中期望进行表达的特定细胞或生物体中非天然表达的任何多核苷酸或多肽。内源多核苷酸、多肽或其他化合物不是外来的。

如本文所用，“杂交”包括核酸链与互补核酸链通过碱基配对接合的任何过程。因此，该术语指靶序列结合到测试（即，靶）序列上的互补能力，或反之亦然。

如本文所用，“杂交条件”通常按测量杂交的条件的“严格性”程度分类。严格性程度可基于核酸结合络合物或探针的例如熔融温度（T_m）确定。例如“最大严格性”通常发生在约T_m-5℃（低于探针T_m5°）；“高严格性”在约低于T_m5-10°；“中严格性”在约低于探针T_m10-20°；并且“低严格性”在约低于T_m20-25°。作为另外一种选择或除此之外，杂交条件可基于杂交的盐或离子强度条件和/或一次或多次严格性洗涤来确定。例如，6xSSC=非常低的严格性；3xSSC=低至中的严格性；lxSSC=中严格性；并且0.5xSSC=高严格性。功能上，最大严格性条件可用于鉴定与杂交探针具有严格（即，约100%）同一性或近严格同一性的核酸序列；而高严格性条件可用于鉴定与探针具有约80%或更高序列同一性的核酸序列。

如本文所用，涉及两个或更多个多核苷酸或多肽序列的“相同的”或百分比“同一性”指两个或更多个序列当使用序列比较算法或目测比较并比对最大匹配时，它们是相同的或具有指定百分比的相同核苷酸或氨基酸残基。

如本文所用，“长链脂肪酸”指具有长于14个碳的脂族尾的脂肪酸。

如本文所用，“中链脂肪酸”指具有介于6个和14个碳之间的脂族尾的脂肪酸。在某些实施方案中，中链脂肪酸可具有11个至13个碳。

如本文所用，“天然存在的”指天然可见的物质。例如存在于生物体（包括病毒）中的多肽或多核苷酸序列，其能够从天然来源中分离并且未曾在实验室中受到人为地有意修饰，是天然存在的。

如本文所用，当描述两个DNA区域或两个多肽区域之间的关系时，“可操作地连接的”指所述区域彼此功能上相关。例如，如果启动子控制编码序列的转录，它可操作地连接至该序列；如果将核糖体结合位点定位以允许翻译，它可操作地连接至编码序列；并且如果一个序列功能上作为信号序列，例如通过参与成熟形式蛋白的分泌，它可操作地连接至一个肽。

如本文所用，“过表达”指在宿主细胞中以比正常表达水平更高的水平表达多核苷酸以生产产物（例如多肽或RNA）。过表达的多核苷酸一般是宿主细胞的天然多核苷酸，其生成的产物量大于宿主细胞中正常存在的量。过表达例如并且不受限制地通过将多核苷酸可操作地连接至与该多核苷酸天然启动子不同的启动子或将附加拷贝的所述多核苷酸导入宿主细胞中来完成。

如本文所用，“多核苷酸”指由核苷酸组成的聚合物。多核苷酸可为分离片段形式或可为较大的核苷酸序列构建体的组件，其已经来源于分离至少一次的核苷酸序列，该核苷酸序列的数量或浓度使其能够通过标准分子生物学方法如使用克隆载体鉴定、操纵、并回收该序列及其组成核苷酸序列。当核苷酸序列用DNA序列（即A、T、G、C）表示时，这也包括RNA序列（即A、U、G、C），其中“U”取代了“T”。换句话说，“多核苷酸”指与其他核苷酸分离的核苷酸聚合物（分离片段或实体）或可为较大核苷酸构建体的组件或元件，例如表达载体或多顺反子序列。多核苷酸包括DNA、RNA和cDNA序列。

如本文所用，“多肽”指由氨基酸残基组成的聚合物，其可包含或可不包含修饰形式如磷酸基和甲酰基。

如本文所用，“重组表达载体”指用于表达多核苷酸例如编码期望多肽的多核苷酸的DNA构建体。重组表达载体可包括例如转录亚基，其包括（i）具有基因表达调节功能的遗传元件如启动子和增强子的组合件，（ii）转录成mRNA并翻译成蛋白的结构或编码序列，以及（iii）合适的转录和翻译启动和终止序列。以任何合适的方式构建重组表达载体。载体的性质是不重要的，并且可使用任何载体包括质粒、病毒、噬菌体和转座子。本发明使用的可能载体包括但不限于染色体、非染色体和合成DNA序列如细菌质粒；噬菌体DNA；酵母质粒；和来源于质粒与噬菌体DNA组合的载体，来源于病毒如牛痘、腺病毒、禽痘、杆状病毒、SV40和伪狂犬病病毒的DNA。

如本文所用，“引物”指将多核苷酸引物置于诱导合成的条件下，能够特异性地杂交到指定多核苷酸模板上并提供互补多核苷酸合成启动点的多核苷酸如本文所用，“重组多核苷酸”指具有非天然连接在一起的序列的多核苷酸。可将重组多核苷酸包括在合适载体中，并且所述载体可用于转化合适的宿主细胞。包含重组多核苷酸的宿主细胞称为“重组宿主细胞”。然后将所述多核苷酸在重组宿主细胞中表达以生产例如“重组多肽”。

如本文所用，“特异性杂交”指多核苷酸在严格条件下优先结合、双联或杂交到特定核苷酸序列上。

如本文所用，“严格条件”指在该条件下探针将优先杂交到其靶向亚序列上，并且与其他序列杂交的程度较低或完全不杂交。

如本文所用，“短链脂肪酸”指具有少于6个碳的脂族尾的脂肪酸。

如本文所用，涉及两个核酸或多肽的“基本上同源的”或“基本上相同的”一般指两个或更多个序列或亚序列当使用序列比较算法或目测比较并比对最大匹配时，具有至少40%、60%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的核苷酸或氨基酸残基同一性。基本上相同能够存在于序列任何合适的区域，例如长度为至少约50个残基的区域，长度为至少约100个残基的区域，或长度为至少约150个残基的区域。在某些实施方案中，序列在任一个或两个比较生物聚合物全长上基本上相同。

在一个方面，本发明涉及使用细菌生产反异和/或异支链脂肪酸（或来源于反异和/或异支链脂肪酸的产物）的新方法。在一个方面，所述方法特征在于在合适细胞中例如通过用一种或更多种多核苷酸转染或转化细胞加入一个或多个外来的多核苷酸，其提高反异或异脂肪酸的产量。作为另外一种选择或除此之外，所述方法包括过表达一种或更多种多核苷酸以提高宿主细胞内反异或异脂肪酸的产量。在宿主细胞中生产反异和异脂肪酸的示例性代谢途径在图1、2和17中示出。图1示出生产以下产物的代谢途径：（1）反异脂肪酸，其经由包括异亮氨酸至2-酮基3-甲基戊酸的转化的途径生产，（2）奇数总碳异支链脂肪酸，其经由包括亮氨酸至2-酮异己酸（也称为2-酮基,4-甲基戊酸）的转化的途径生产，和（3）偶数总碳异支链脂肪酸，其经由包括缬氨酸至2-酮基-异戊酸（也称为2-酮基3-甲基丁酸）的转化的途径生产。在某些实施方案中，驱动碳流流向支链2-酮酸前体导致相应的支链脂肪酸产量提高。例如，1）流向异亮氨酸途径的碳流增加导致反异脂肪酸产量提高；2）流向亮氨酸途径的碳流增加导致具有奇数碳的异支链脂肪酸产量提高；和/或3）流向缬氨酸途径的碳流增加导致具有偶数碳的异支链脂肪酸产量提高。图2和图17示出了分别从苏氨酸或丙酮酸生成异亮氨酸和/或2-酮基3-甲基戊酸的途径。提高通过苏氨酸和/或丙酮酸途径的碳流提高重组宿主细胞中的异支链脂肪酸的产量。

在一个方面，本发明提供生产反异脂肪酸的方法。所述方法包括培养细胞，所述细胞包含至少一种外来的或过表达的多核苷酸，所述多核苷酸包含编码多肽的核酸序列，所述多肽催化下列反应中的至少一种：(aa)丙酮酸至柠苹酸的转化；(bb)柠苹酸至柠康酸的转化；(cc)柠康酸至β-甲基-D-苹果酸的转化；(dd)β-甲基-D-苹果酸至2-氧代丁酸的转化；或(ee)苏氨酸至2-氧代丁酸的转化。任选地，所述细胞还包含至少一种外来的或过表达的多核苷酸，所述多核苷酸包含编码多肽的核酸序列，所述多肽催化下列反应中的至少一种：(ff)2-氧代丁酸至2-乙酰-2-羟丁酸的转化，(gg)2-乙酰-2-羟丁酸至2,3-二羟基-3-甲基戊酸的转化，或(hh)2,3-二羟基-3-甲基戊酸至α-酮基-3-甲基戊酸的转化。在一些实施方案中，所述细胞包含外来的或过表达的多核苷酸，所述多核苷酸编码催化3、4、5、6、7或(aa)-(hh)全部反应的多肽。所述细胞在允许一种或更多种多核苷酸的表达和反异脂肪酸的生产的条件下培养。基于观察到的结果，至少部分地断定包含本文所述的基因修饰的宿主细胞比不包含所述一种或更多种多核苷酸外其它类似的细胞生产更多的反异脂肪酸。下文进一步描述了提高细胞中反异和异脂肪酸产量的代谢途径和基因修饰。

增加流向异亮氨酸途径的碳流的一个方法包括通过图2的苏氨酸依赖型途径上调2-酮基3-甲基戊酸的产量。能够在例如大肠杆菌（Lee等人，Molecular Systems Biology 3：149（2007））中并通过图2所示的一系列步骤生产高水平的苏氨酸，异亮氨酸经由作为中间体的2-酮基3-甲基戊酸从苏氨酸开始生产。如图2所示，苏氨酸依赖型的途径通过例如苏氨酸脱氨酶将苏氨酸转化成2-氧代丁酸；通过例如乙酰羟酸合酶（AHAS）（也称为乙酰羟基丁酸合酶）将2-氧代丁酸转化成2-乙酰-2-羟丁酸；通过例如乙酰羟酸异构还原酶将2-乙酰-2-羟丁酸转化成2,3-二羟基-3-甲基戊酸；并且通过例如二羟酸脱水酶将2,3-二羟基-3-甲基戊酸转化成2-酮基-3-甲基戊酸。通过表达外来的多核苷酸或过表达内源多核苷酸优化该途径使碳流流向2-酮基-3-甲基戊酸并且最终转化成反异脂肪酸，所述多核苷酸编码上述活性的任何一个或多个。例如通过过表达ilvA、tdcB、ilvI、ilvH、ilvC和/或ilvD优化该途径使碳流流向2-酮基3-甲基戊酸。IlvA和TdcB是苏氨酸脱氨酶。IlvC是乙酰羟酸异构还原酶（也称为酮醇酸还原异构酶），而IlvD是二羟酸脱水酶。IlvI和IlvH是形成AHAS的两个亚基，它们催化从丙酮酸形成2-乙酰乳酸以合成缬氨酸和亮氨酸，或催化从2-氧代丁酸和丙酮酸形成2-乙酰-2-羟丁酸以生物合成异亮氨酸（参见图1）。两个AHAS反应是合成两组不同的支链氨基酸的不可逆步骤和关键步骤。在某些实施方案中，例如AHAS I（ilvBN）的缺失和/或AHAS II（ilvGM）和/或AHAS III（ilvIH）的过量生产最小化来源于亮氨酸或缬氨酸的异脂肪酸的产量。IlvBH也是适用于本发明相关内容的AHAS。

因此，在一个方面本发明的细胞包含外来的或过表达的多核苷酸，所述多核苷酸编码的多肽催化苏氨酸转化成2-氧代丁酸（例如苏氨酸脱氨酶），并且催化2-氧代丁酸转化成2-乙酰-2-羟丁酸（例如AHAS）。

在某些实施方案中，本发明的细胞或生物体经工程化以在氮限制条件下积聚反异脂肪酸并利用苏氨酸依赖型异亮氨酸合成途径如图17所示的丙酮酸途径。如图17所示，通过例如柠苹酸合酶将丙酮酸和乙酰-CoA组合以生产柠苹酸。示例性的柠苹酸合酶是CimA，例如来源于詹氏甲烷球菌CimA。然后通过例如柠康酸水解酶（也称为异丙基苹果酸或柠苹酸异构酶）将柠苹酸转化成柠康酸，所述酶的一个实例由leuCD编码。通过例如异丙基苹果酸异构酶（如LeuCD）将柠康酸转化成β-甲基-D-苹果酸，并且通过例如异丙基苹果酸脱氢酶（如LeuB）将所得β-甲基-D-苹果酸转化成2-氧代丁酸（也称为α-丁酮酸）。丙酮酸途径与图2的苏氨酸途径衔接，通过例如AHAS将2-氧代丁酸转化成2-乙酰-2-羟丁酸；通过例如乙酰羟酸异构还原酶将2-乙酰-2-羟丁酸转化成2,3-二羟基-3-甲基戊酸；并且通过例如二羟酸脱水酶将2,3-二羟基-3-甲基戊酸转化成2-酮基3-甲基戊酸。通过表达外来的多核苷酸或过表达内源多核苷酸优化该途径使碳流流向2-酮基3-甲基戊酸并且最终转化成反异脂肪酸，所述多核苷酸编码上述活性的任何一个或多个。例如，通过过表达或表达外来cimA、leuCD、leuB、ilvI、ilvH、ilvC ilvG、ilvM和/或ilvD优化所述途径使碳流流向2-酮基3-甲基-戊酸。

因此，在一个方面，本发明的细胞包含外来的或过表达的多核苷酸，所述多核苷酸编码多肽，所述多肽催化：丙酮酸至柠苹酸的转化、柠苹酸至柠康酸的转化、柠康酸至β-甲基-D-苹果酸的转化和2-氧代丁酸至2-乙酰-2-羟丁酸的转化。例如，在一个实施方案中，所述细胞包含下列多核苷酸：包含编码柠苹酸合酶的核酸序列的外来的或过表达的多核苷酸、包含编码异丙基苹果酸异构酶的核酸序列的外来的或过表达的多核苷酸、包含编码异丙基苹果酸脱氢酶的核酸序列的外来的或过表达的多核苷酸、包含编码AHAS的核酸序列的外来的或过表达的多核苷酸、或它们的组合，包括编码所有四个多肽的多核苷酸的组合。

在一个方面，修饰宿主细胞以表达外来的多核苷酸或过表达天然多核苷酸，所述多核苷酸编码调节从异亮氨酸、亮氨酸或缬氨酸中生产反异或异脂肪酸的下游反应的一种或更多种酶活性。例如，如图1所示，在某些实施方案中，修饰细胞以经由包括通过支链氨基酸氨基转移酶（BCAT）将异亮氨酸转化成2-酮基3-甲基戊酸的途径生产反异脂肪酸。作为另外一种选择，将2-酮基3-甲基戊酸导入异亮氨酸生物合成途径，无需首先将其转化成异亮氨酸。然后通过例如支链α-酮酸脱氢酶（BCDH）如由bkd编码的BCDH将2-酮基3-甲基戊酸转化成2-甲基丁酰-CoA。通过例如3-酮脂酰-ACP合酶缩合2-甲基丁酰-CoA与丙二酰-ACP，并且随后通过反异酰基-ACP的脂肪酸生物合成加入丙二酰-ACP。然后经由硫酯酶将Acyl-ACP转化成反异脂肪酸。

在某些实施方案中，奇数总碳异支链脂肪酸经由包括通过例如BCAT将亮氨酸转化成2-酮异己酸（也称为2-酮基,4-甲基戊酸）的途径生产。如果需要，将2-酮异己酸引入亮氨酸生物合成途径，无需首先将其转化成亮氨酸。然后通过例如BCDH如由bkd编码的BCDH将2-酮异己酸转化成异戊酰-CoA（也称为3-甲基丁酰-CoA）。通过例如3-酮脂酰-ACP合酶缩合异戊酰-CoA与丙二酰-ACP，并且随后通过异酰基-ACP的脂肪酸生物合成加入丙二酰-ACP。然后经由硫酯酶将异酰基-ACP转化成异脂肪酸。

此外，在某些实施方案中，偶数总碳的异支链脂肪酸经由包括通过BCAT将缬氨酸转化成2-酮基-异戊酸（也称为2-酮基3-甲基丁酸）的途径生产。任选地，将2-酮基-异戊酸导入缬氨酸生物合成途径，无需将其首先转化成缬氨酸。然后通过例如BCDH如由bkd编码的BCDH将2-酮基-异戊酸转化成异丁酰-CoA。通过例如3-酮脂酰-ACP合酶缩合异丁酰-CoA与丙二酰-ACP，并且随后通过异酰基-ACP的脂肪酸生物合成加入丙二酰-ACP。然后可经由硫酯酶将异酰基-ACP转化成异脂肪酸。

因此，在一些实施方案中，宿主细胞包含编码BCDH的外来的或过表达的多核苷酸或生物活性片段或其变体。作为另外一种选择或除此之外，所述细胞包含编码BCAT的外来的或过表达的多核苷酸和/或编码酰基转移酶的外来的或过表达的多核苷酸。作为另外一种选择或除此之外，所述细胞包含编码3-酮脂酰-ACP合酶的外来的或过表达的多核苷酸，所述酶在合适细胞中利用反异和/或异支链-CoA引物作为底物。作为另外一种选择或除此之外，所述细胞包含具有编码烯酰-ACP还原酶的核酸序列的外来的或过表达的多核苷酸。作为另外一种选择或除此之外，所述细胞包含编码硫酯酶的外来的或过表达的多核苷酸。取决于硫酯酶的活性和底物特异性，此类重组细胞能够生产具有期望链长的反异和/或异支链脂肪酸。例如，在一些实施方案中，宿主细胞优先生产长链脂肪酸、中链脂肪酸、或它们的期望组合（例如60%、70%、80%、85%、90%、95%或更多的脂肪酸包含期望数目的碳）。也设想本文所述的任何酶的组合，例如细胞包含编码BCDH、3-酮脂酰-ACP合酶和硫酯酶（例如TesA）的外来的或过表达的多核苷酸。实际上，本发明设想细胞经工程化以增加通过如上所述的苏氨酸依赖型和/或苏氨酸依赖型途径的碳流，并且还包含增加通过图1所示的异亮氨酸、亮氨酸和/或缬氨酸途径的碳流的外来的或过表达的多核苷酸。任选地，一种或更多种外来的或过表达的多核苷酸包含与如SEQ ID NO:1、4、7、13、17-23、68、77或78所示的核酸序列具有至少90%同一性的核酸序列。

作为另外一种选择或除此之外，在某些实施方案中，通过修饰细胞以提高乙酰-CoA羧化酶活性来提高反异和/或异支链脂肪酸的产量。例如，通过例如提高可利用的生物素量或通过提高生物素-蛋白连接酶BirA的活性或量来提高一种或更多种酶亚基的产量。本文也设想通过例如提高硫胺素合酶产量来上调宿主细胞中的硫胺素水平以进一步促进支链脂肪酸合成。

在本发明的一些实施方案中，细胞经工程化以表达编码本文所述的一种或更多种酶活性的一种或更多种外来的多核苷酸和/或经工程化以过表达编码本文所述的一种或更多种酶活性的一种或更多种内源多核苷酸。不同生物使用不同途径生产脂肪酸，并且内源脂肪酸合成反应能够从支链脂肪酸合成中获取资源。因此，在某些实施方案中，减弱天然酶活性以促进支链脂肪酸合成。例如，在非天然生产反异和/或异支链脂肪酸的大肠杆菌中，在脂肪酸合成中的第一缩合反应是乙酰-CoA与丙二酰-ACP的反应，该反应生产3-酮丁酰-ACP（Smirnova和Reynolds，J.IndustrialMicrobiology & Biotechnology 27：246-51（2001））。这一反应主要由fabH产物催化，该产物是3-酮脂酰-ACP合酶。然而大肠杆菌3-酮脂酰-ACP合酶显示其优选乙酰-CoA而不是支链酰基-CoA如2-甲基丁酰-CoA的特异性（Choi等人，J.Bacteriology 182：365-70（2000））。通过化学抑制剂如浅蓝菌素或通过基因工程（例如通过生成fabD和fabH双突变体）降低或除去内源FabH活性减少生产的直链脂肪酸的量。如果需要，也通过例如引入来源于微小杆菌属（Exiguobacterium）的脂肪酸合成基因以缩短链长和/或提高反异和/或异支链脂肪酸的量，从而通过除去或降低宿主细胞（例如大肠杆菌细胞）制备直链脂肪酸的能力来提高支链脂肪酸产量。

作为另外一种选择或除此之外，使用最小化流向不导致反异或异脂肪酸形成的分支途径碳流的基因敲除或减少。例如，在一个方面，减弱异亮氨酸转氨酶活性以使碳流从异亮氨酸合成再转向到反异支链脂肪酸合成（参见图2和17）。在这个方面，在本发明的示例性实施方案中，所述细胞经基因修饰以减少ilvE的表达或抑制基因产物的活性。在本发明的一个方面，修饰所述细胞以生成fadD突变体，其缺失将脂肪酸转化成脂肪酰-CoA的步骤，该步骤是脂肪酸降解的第一个步骤。从而提高脂肪酸含量。作为另外一种选择或除此之外，修饰所述细胞以减弱支链氨基酸氨基转移酶（BCAT）的活性。通过例如突变所述酶的编码序列以生成无功能或功能降低的多肽、从细胞基因组中移除酶的编码序列、干扰编码所述酶的RNA转录物的翻译（例如使用反义寡核苷酸）、或通过操纵影响所述酶表达的表达控制序列来减弱（即降低或消除）活性。

使用任何合适的细胞或生物体如细菌细胞或其原核细胞、酵母细胞或哺乳动物细胞生产反异和/或异支链脂肪酸。在某些实施方案中，本发明涉及细胞如埃希氏菌属细胞（例如大肠杆菌），其非天然生产反异和/或异支链脂肪酸。这些细胞经工程化以生产如本文所述的反异和/或异支链脂肪酸。在一个方面，修饰所述细胞以生产期望水平并具有期望链长的反异和/或异支链脂肪酸。此外，在某些实施方案中，工程化细胞耐受在生长培养基、质膜、或脂滴中的大量反异和/或异支链脂肪酸，和/或通过例如与未修饰细胞相比使用更便宜的原料、需要更少的发酵时间等来更经济地生产反异和/或异支链脂肪酸。

在某些实施方案中，天然生产反异和/或异支链脂肪酸的细胞或生物体如枯草芽孢杆菌或除虫链霉菌如本文所述经修饰以生产比未修饰细胞或生物体更高水平的反异和/或异支链脂肪酸。例如通过掺入导致细胞中脂肪酸水平提高的调节突变体和/或过表达提高支链酮酸前体和/或脂肪酸生物合成途径前体的酶活性来完成优化。也可通过减弱使碳流从支链脂肪酸生产改向的酶活性完成优化。作为另外一种选择或除此之外，所述细胞生产具有特定链长的反异和/或异支链脂肪酸。如果需要，选择硫酯酶的特异性以生产特定链长。例如，来自绿头鸭的尾脂腺和大鼠乳腺的硫酯酶优先生成具有C6-C14脂族尾的中链脂肪酸。

天然生产支链脂肪酸并适用于本发明的示例性的细菌包括但不限于橙黄螺旋体（Spirochaeta aurantia）、卵黃螺旋体（Spirochaeta littoralis）、嗜麦芽假单胞菌（Pseudomonas maltophilia）、腐败假单胞菌（Pseudomonas putrefaciens）、野油菜黄单胞菌（Xanthomonascampestris）、茴香军团菌（Legionella anisa）、卡他莫拉菌（Moraxellacatarrhalis）、水生栖热菌（Thermus aquaticus）、水生黄杆菌（Flavobacterium aquatile）、非解糖拟杆菌（Bacteroidesasaccharolyticus）、脆弱拟杆菌（Bacteroides fragilis）、溶淀粉琥珀酸单胞菌（Succinimonas amylolytica）、非洲脱硫弧菌（Desulfovibrioafricanus）、运动性微球菌（Micrococcus agilis）、粘滑口腔球菌（Stomatococcus mucilaginosus）、柠檬色动性球菌（Planococcuscitreus）、白色海球菌（Marinococcus albusb）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、厌氧消化链球菌（Peptostreptococcusanaerobius）、白色瘤胃球菌（Ruminococcus albus）、藤黄八叠球菌（Sarcina lutea）、炭疽杆菌（Bacillus anthracis）、菊糖芽孢乳杆菌（Sporolactobacillus inulinus）、热纤梭菌（Clostridium thermocellum）、脲芽孢八叠球菌（Sporosarcina ureae）、致黑脱硫肠状菌（Desulfotomaculumnigrificans）、单核细胞增多性李斯特菌（Listeria monocytogenes）、热杀索丝菌（Brochothrix thermosphacta）、鲑鱼肾杆菌（Renibacteriumsalmoninarum）、佐氏库特氏菌（Kurthia zopfii）、水生棒杆菌（Corynebacterium aquaticum）、耐射线节杆菌（Arthrobacterradiotolerans）、发酵短杆菌（Brevibacterium fermentans）、产丙酸丙酸杆菌（Propionibacterium acidipropionici）、迟缓真杆菌（Eubacteriumlentum）、水生噬纤维菌（Cytophaga aquatilis）、多食鞘氨醇杆菌（Sphingobacteriuma multivorumb）、牙龈二氧化碳噬纤维菌（Capnocytophaga gingivalis）、粘球生孢噬纤维菌（Sporocytophagamyxococcoides）、华美屈挠杆菌（Flexibacter elegans）、珊瑚状粘球菌（Myxococcus coralloides）、过渡原囊菌（Archangium gephyra）、橙色标桩菌（Stigmatella aurantiaca）、骚动厄氏菌（Oerskovia turbata）和绿色糖单胞菌（Saccharomonospora viridis）。生产支链脂肪酸的示例性的微生物也在例如Kaneda，Microbiol.Rev.55（2）：288-302（1991）中公开（参见表3）。

编码一种或更多种酶活性以生产反异和/或异脂肪酸的一种或更多种多核苷酸可得自任何来源。取决于本发明的实施方案，所述多核苷酸分离自天然来源如细菌、藻类、真菌、植物或动物；经由半合成途径（例如多核苷酸的核酸序列经密码子优化以在特定宿主细胞如大肠杆菌中表达）生产；或从头合成。在某些实施方案中，基于例如酶的底物特异性、由该来源生产的支链脂肪酸的类型、或在给定宿主细胞中的酶活性水平从特定来源选择酶是有利的。在本发明的一个方面，所述酶和相应的多核苷酸天然存在于宿主细胞中并且期望过表达多核苷酸。在这个方面，在某些情况下，将附加拷贝的多核苷酸导入宿主细胞中以提高脂肪酸生产可用的酶量。天然多核苷酸的过表达也通过上调内源启动子活性或将所述多核苷酸可操作地连接至较强启动子上来完成。

外来的酶和它们相应的多核苷酸也适用于本发明，并且可根据所用的特定酶改变生物合成途径的特征或终产物。如果需要，一种或更多种多核苷酸分离自或来源于本文所述的生产支链脂肪酸的生物。例如，大肠杆菌FabH，3-酮脂酰-ACP合酶，优先利用乙酰-CoA而不是支链酰基-CoA作为底物，而来自枯草芽孢杆菌的FabH较高效地促进支链脂肪酸合成。因此，在一个方面，本发明的细胞是包含编码枯草芽孢杆菌FabH的多核苷酸的大肠杆菌细胞。

由该细胞生产的示例性的柠苹酸合酶来源于詹氏甲烷球菌CimA。示例性的AHAS包括大肠杆菌IlvIH、大肠杆菌IlvIH（G14D）、大肠杆菌IlvGM和枯草芽孢杆菌IlvBH。示例性的BCDH是枯草芽孢杆菌Bkd，并且示例性的3-酮脂酰-ACP合酶是枯草芽孢杆菌FabH。示例性的苏氨酸脱氨酶是大肠杆菌TdcB。示例性的硫酯酶包括但不限于大肠杆菌TesA、来源于绿头鸭尾脂腺的硫酯酶和来源于大鼠乳腺的硫酯酶。示例性的异丙基苹果酸异构酶是大肠杆菌LeuCD，并且示例性的异丙基苹果酸脱氢酶是大肠杆菌LeuB。在一个方面，所述细胞包含核酸序列，所述核酸序列与如SEQ ID NO:32、36、42、43、46、51、57、62、68或83所示的核酸序列具有至少约90%的同一性，或所述细胞编码多肽，所述多肽包含的氨基酸序列与如SEQ ID NO:33、39、40、41、47、48、52、53、58、65、66、67、84或85所示的氨基酸序列具有至少约90%的同一性。调节反异和/或异脂肪酸生产的示例性的酶也在表A中公开。

表A

在某些实施方案中，重组细胞生产编码涉及脂肪酸生物合成的酶活性的多肽类似物或变体。所述多肽的氨基酸序列变体包括取代、插入或缺失变体，并且变体可与上述未修饰的多肽基本上同源或基本上相同。在某些实施方案中，所述变体保留所述多肽的至少一些生物活性，例如催化活性。其他变体包括所述多肽的变体，其保留至少约50%，优选地至少约75%，更优选地至少约90%的生物活性。

取代变体通常将蛋白内一个或多个位点上的一个氨基酸换成另一个。这种取代可为保守取代，即，一个氨基酸用一个类似形状和电荷的氨基酸取代。保守取代包括例如以下改变：丙氨酸变为丝氨酸；精氨酸变为赖氨酸；天冬酰胺变为谷氨酰胺；天冬氨酸变为谷氨酸；半胱氨酸变为丝氨酸；谷氨酰胺变为天冬酰胺；谷氨酸变为天冬氨酸；异亮氨酸变为亮氨酸或缬氨酸；亮氨酸变为缬氨酸或异亮氨酸；赖氨酸变为精氨酸；甲硫氨酸变为亮氨酸或异亮氨酸；苯丙氨酸变为酪氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸；丝氨酸变为苏氨酸；苏氨酸变为丝氨酸；色氨酸变为酪氨酸；酪氨酸变为色氨酸或苯丙氨酸；以及缬氨酸变为异亮氨酸或亮氨酸。

在某些情况下，所述重组细胞包含本文所述的外来的或过表达的一种或更多种多核苷酸的类似物或变体。核酸序列变体包括一个或多个取代、插入或缺失，并且变体可与未修饰的多核苷酸基本上同源或基本上相同。多核苷酸变体或类似物编码突变酶，所述酶具有未修饰的酶的至少部分活性。作为另外一种选择，多核苷酸变体或类似物编码与未修饰的多核苷酸相同的氨基酸序列。例如密码子优化的序列一般编码与亲本/天然序列相同的氨基酸序列，但是包含优先在特定宿主生物中表达的密码子。

“来源于”生物体的多肽或多核苷酸包含天然氨基酸序列或核苷酸序列的一个或多个修饰形式，并且表现出与天然酶相似的（如果不是更好的）活性（例如至少70%，至少80%，至少90%，至少95%，至少100%，或至少110%的天然酶活性水平）。例如，通过定向进化亲本/天然序列在某些程度上改善酶活性。作为另外一种选择或除此之外，酶编码序列发生突变以获得反馈抗性。截短来源于詹氏甲烷球菌并在实施例14中描述的柠苹酸合酶CimA3.7，与天然詹氏甲烷球菌柠苹酸合酶相比其包含取代。该修饰形式赋予CimA3.7酶反馈抗性并且改善它的活性。类似地，在大肠杆菌IlvIH AHAS序列（称为IlvIH（G14D））的氨基酸位点14用天冬氨酸取代甘氨酸赋予2-乙酰-2-羟丁酸抑制抗性。因此，在本发明的一个或多个实施方案中，由外来的多核苷酸编码的多肽是抗反馈的和/或经修饰以改变天然酶的活性。

能够以任何合适的方式制备重组细胞以在细胞内产生表达载体。该表达载体可包括可操作地连接至表达元件的外来的多核苷酸，所述表达元件例如启动子、增强子、核糖体结合位点、操纵子和激活序列。此类表达元件可为可调控的，例如可诱导的（通过加入诱导剂）。作为另外一种选择或除此之外，表达载体可包括附加拷贝的多核苷酸，所述多核苷酸编码可操作地连接至表达元件的天然基因产物。可用启动子的代表性实例包括但不限于：LTR（逆转录病毒的长末端35个重复序列）或SV40启动子、大肠杆菌lac、tet或trp启动子、噬菌体λP_L启动子、以及已知控制原核或真核细胞或它们的病毒中基因表达的其他启动子。在一个方面，表达载体也包括扩增表达的合适序列。表达载体可包含促进多核苷酸掺入细胞基因组的元件。将表达载体或其他多核苷酸导入细胞中可使用合适的方法完成，例如转化、电穿孔、显微注射、显微注射轰击、磷酸钙沉淀、改性磷酸钙沉淀、阳离子脂质处理、光穿孔、融合方法、受体介导的转移或聚凝胺沉淀。作为另外一种选择，可通过用病毒载体感染、缀合、转导或其他适用方法导入表达载体或其他多核苷酸。

细胞如细菌细胞或任何其他期望的宿主细胞包含编码外来的或过表达的蛋白的多核苷酸，在适合该细胞生长并表达一种或更多种多核苷酸的条件下培养所述细胞。表达一种或更多种多肽的细胞可通过任何适用的方法鉴定，例如通过PCR筛选、通过Southern印迹分析筛选或筛选表达的蛋白。在某些实施方案中，可通过在DNA构建体中包含选择性标记、然后在仅适合表达选择性标记基因的那些细胞存活的条件下培养包含选择性标记基因的细胞来选择包含所述多核苷酸的细胞。可通过在合适条件下培养经基因修饰的细胞（例如在一定浓度药物的存在下培养包含可扩增标记基因的经基因修饰的细胞，在此情况下仅有包含多拷贝可扩增标记基因的细胞能够存活）进一步扩增导入的DNA构建体。包含并表达编码外来或过表达蛋白的多核苷酸的细胞本文称为经基因修饰的细胞。包含并表达编码外来或过表达蛋白的多核苷酸的细菌细胞可称为经基因修饰的细菌细胞。

在某些实施方案中，经基因修饰的细胞（例如经基因修饰的细菌细胞）具有最佳的生长温度，例如比正常生长和/或发酵时温度更低的温度。例如，在某些实施方案中，将支链脂肪酸掺入膜中提高膜流动性，它是与低生长温度相关联的特性。此外，在某些实施方案中，本发明的细胞在比通常存在于该类型细胞的正常生长和/或发酵温度更高的温度下表现出生长下降。

适于宿主细胞生长和反异和/或异脂肪酸合成的任何细胞培养条件适用于本发明方法。本文设想加入脂肪酸合成中间体、前体和/或与反异和/或异支链脂肪酸合成相关联的酶的辅因子到培养物中。在一个实施方案中，所述方法包括使宿主细胞暴露于硫胺素，其促进反异脂肪酸的合成。在一些实施方案中将异亮氨酸、亮氨酸和/或缬氨酸加到培养物中。

本发明的方法任选地包括从培养物中提取反异和/或异脂肪酸。可从培养基中提取脂肪酸并用任何合适的方式测量。合适的提取方法包括例如如Bligh等人，“A rapid method for total lipid extraction and purification，”Can.J.Biochem.Physiol.37：911-917（1959）所述的方法。在某些实施方案中，可测量在培养上清液或重组细胞的膜部分中的脂肪酸产量。在这个实施方案中，用标准方法制备培养物，然而可将可提供增加底物供应的营养物质（例如2-甲基丁酸、异亮氨酸）加到培养物中。离心收获细胞，用盐酸或高氯酸酸化，并用氯仿和甲醇提取，使脂肪酸进入有机层。使用甲醇在100℃将脂肪酸转化成甲酯。通过气相色谱法（GC）分离甲酯并与已知的直链、异和反异脂肪酸（购自Larodan或Sigma）标准品比较。通过组合GC/质谱确认化学同一性，如果需要，对片段材料进行进一步的质谱分析。

在一个实施方案中，所述细胞利用支链反异和/或异脂肪酸作为前体制备多种其他产物。从反异或异脂肪酸中生物合成的（即，来源的）产物包括但不限于磷脂、甘油三酯、烷烃、烯烃、蜡酯、脂肪醇和脂肪醛。一些宿主细胞天然生产一种或更多种来源于反异或异脂肪酸的产物；其他宿主细胞经遗传工程化以将支链脂肪酸转化成例如烷烃、烯烃、蜡酯、脂肪醇和/或脂肪醛。合成来源于支链脂肪酸的产物的生物体和它们的基因修饰形式在例如国际专利公布WO 2007/136762、WO 2008/151149和WO2010/062480、以及美国专利公开申请公布US 2010/0298612中进行了进一步描述。在一个方面，本发明的方法包括从培养物中提取来源于反异脂肪酸（在细胞中从反异脂肪酸合成的磷脂、甘油三酯、烷烃、烯烃、蜡酯、脂肪醇和/或脂肪醛）的产物。任何提取方法是合适的，包括在国际专利公布WO 2007/136762、WO 2008/151149和WO 2010/062480、以及美国专利公开申请公布US 2010/0251601、US 20100242345、US 20100105963和US2010/0298612中描述的提取方法。

在一个实施方案中，本发明提供细胞，所述细胞包含下列多核苷酸：包含编码苏氨酸脱氨酶的核酸序列的外来的或过表达的多核苷酸、包含编码乙酰羟酸合酶的核酸序列的外来的或过表达的多核苷酸、包含编码支链α-酮酸脱氢酶的核酸序列的外来的或过表达的多核苷酸和包含编码3-酮脂酰-ACP合酶的核酸序列的外来的或过表达的多核苷酸。所述细胞任选地还包含至少一种外来的或过表达的多核苷酸，所述多核苷酸包含编码硫酯酶的核酸序列。所述多核苷酸在细胞中表达。在一个方面，所述细胞是细菌细胞例如大肠杆菌细胞，其非天然生产反异脂肪酸。本发明还提供一种生产反异脂肪酸的方法，所述方法包括在允许所述多核苷酸的表达和反异脂肪酸的生产的条件下培养细菌细胞。

在另一个实施方案中，本发明提供一种细胞，所述细胞包含下列多核苷酸：包含编码柠苹酸合酶（例如詹氏甲烷球菌CimA或其抗反馈衍生物）的核酸序列的外来的或过表达的多核苷酸、包含编码支链α-酮酸脱氢酶（例如枯草芽孢杆菌Bkd）的核酸序列的外来的或过表达的多核苷酸和包含编码3-酮脂酰-ACP合酶（例如枯草芽孢杆菌FabH）的核酸序列的外来的或过表达的多核苷酸，其中所述多核苷酸在所述细胞中表达。所述细胞任选地还包含至少一种外来的或过表达的多核苷酸，所述多核苷酸包含核酸序列，所述核酸序列编码异丙基苹果酸异构酶、异丙基苹果酸脱氢酶、乙酰羟酸合酶（例如大肠杆菌IlvIH、大肠杆菌IlvIH（G14D）、大肠杆菌IlvGM或枯草芽孢杆菌IlvBH）、硫酯酶、或它们的组合。

本发明的细胞优选地比不包含所述一种或更多种多核苷酸的其它类似的细胞生产更多的反异脂肪酸。本文描述了测量释放到发酵液或培养基中的脂肪酸的方法。然而反异脂肪酸产量不受培养物中积聚的脂肪酸的限制，但是也包括用作生产来源于反异脂肪酸的产物的下游反应前体的脂肪酸。因此，在一些实施方案中来源于反异（或异）脂肪酸的产物（例如磷脂、甘油三酯、脂肪醇、蜡酯、脂肪醛和烷烃）是用于测量宿主细胞中支链脂肪酸产量的替代物。本文描述了测量在细胞膜磷脂中的脂肪酸的方法。类似地，支链反异脂肪酸的降解产物的测量也指示宿主细胞中生产的反异脂肪酸量。根据本发明的特定实施方案，本发明的细胞比不包含所述一种或更多种多核苷酸的其它类似的细胞生产多至少3%、至少5%，至少10％，至少20%，至少25%，或至少50%的反异脂肪酸。

以下实施例进一步描述和例证了本发明保护范围内的实施方案。给出的这些实施例仅仅是说明性的，不可理解为是对本发明的限制，因为在不脱离本发明实质和范围的条件下可作出许多变型。

实施例1：构建枯草芽孢杆菌bkd表达载体。

这个实施例展示了在例如大肠杆菌中用于表达枯草芽孢杆菌bkd的重组表达载体的生成。

从枯草芽孢杆菌168（Bacillus Genetic Stock Center，Columbus，OH）中通过从琼脂平板上挑取菌落，将其悬浮在100μl 1mM Tris pH8.0，0.1mMEDTA中，煮沸该样品五分钟，并且通过离心除去不溶解片段制备基因组DNA。

枯草芽孢杆菌bkd cDNA（SEQ ID NO:1）（包括lpdV、bkdAA、bkdAB和bkdB基因，它们是枯草芽孢杆菌中较大bkd操纵子的一部分）通过聚合酶链反应（PCR），使用引物BKD1（SEQ ID NO:2）和BKD2（SEQ ID NO:3）5'从基因组DNA样品中扩增，所述PCR在PCR反应期间将侧接限制性位点ApaI和MluI加到bkd cDNA中。

使用10μl Pfu Ultra II Hotstart 2X master mix（Agilent Technologies，Santa Clara，CA），1μl两种引物的混合物（每种10微摩尔），1μl枯草芽孢杆菌基因组DNA和8μl水进行PCR。PCR开始于在95℃孵育两分钟，然后是30个如下的循环：在95℃变性20秒，在62℃的最优化温度下退火20秒，并且在72℃延伸90秒。样品在72℃孵育三分钟，然后保持在4℃。使用PCR纯化试剂盒（Qiagen，Valencia，CA）纯化PCR产物并用ApaI和MluI限制性酶消化。

细菌表达载体pZA31-MCS（Expressys，Ruelzheim，Germany）用ApaI、MluI和HindIII消化，并且消化后的载体和插入序列用Fast-Link（Epicentre Biotechnologies，Madison，WI）连接到一起。然后使用连接混合物转化大肠杆菌TOP10细胞（Invitrogen，Carlsbad，CA）。使用Spin Miniprep试剂盒（Qiagen）质粒小量制备试剂盒（spinplasmid miniprep kit）分离重组质粒，并且特征在于用EcoRV和PstI限制性消化产物的凝胶电泳。分离质粒DNA，并且DNA测序证实已经克隆了bkd插入序列并且该插入序列编码公布的氨基酸序列（Genbank #AL009126.3）（SEQ ID NO:4）。所得质粒称为pZA31-Bs bkd。

实施例2：构建枯草芽孢杆菌fabHA表达载体。

这个实施例展示了在例如大肠杆菌中用于表达枯草芽孢杆菌fabHA的重组表达载体的生成。

为了工程化大肠杆菌以较高效的加入2-甲基丁酰-CoA作为脂肪酸合成的引物，用包含枯草芽孢杆菌fabHA的载体转化大肠杆菌，其编码高效作用于2-甲基丁酰-CoA的3-酮脂酰-ACP合酶。枯草芽孢杆菌编码两个fabH基因，它们的产物催化这个反应。分别克隆每个fabH基因。

从枯草芽孢杆菌168（Bacillus Genetic Stock Center，Columbus，OH）中制备基因组DNA，所述制备通过从Luria琼脂平板中挑取分离菌落，将其悬浮在50μl无菌Milli-Q水（Millipore，Bedford，MA）中，在100℃下煮沸该样品五分钟，并且通过离心除去不溶解片段来进行。

为了生成缺失聚组氨酸标记的表达质粒，枯草芽孢杆菌fabHA cDNA通过PCR，使用引物Bs_939_fabHA_nco_U38（SEQ ID NO:5）和Bs_939_fabHA_pst_L30（SEQ ID NO:6）从基因组DNA样品中扩增，所述PCR将侧接限制性位点NcoI和PstI加到扩增的cDNA中。因为在这个克隆构建体中使用NcoI位点，将附加的三个碱基对加到fabHA上以便人们将预知额外的丙氨酸存在于FabHA蛋白中。

为了生成其中fabHA融合到聚组氨酸标记上的表达质粒，枯草芽孢杆菌fabHA cDNA（SEQ ID NO:7）通过PCR，使用引物Bs_939_fabHA_xho_U38（SEQ ID NO:8）和Bs_939_fabHA_pst_L30（SEQID NO:9）从基因组DNA样品中扩增，所述PCR将侧接限制性位点XhoI和PstI加到扩增的cDNA中。

样品进行PCR，其具有1μl枯草芽孢杆菌168基因组DNA，每种引物的1.5μl 10μM原液，5μl 10X Pfx反应混合物（Invitrogen Carlsbad，CA），0.5μl Pfx DNA聚合酶（1.25单位）和41μl水。PCR条件如下：所述样品初始在95℃孵育一分钟，然后是30个如下的循环：在95℃ 30秒（解链），58℃ 30秒（引物退火），并且在68℃延伸引物1.5分钟。在这些循环后，在68℃孵育十分钟，然后样品保持在4℃。

使用PCR纯化试剂盒（Qiagen）纯化PCR产物，用限制性酶XhoI/PstI或NcoI/PstI双消化，并且将消化产物连接到（Fast-LinkEpicentre Biotechnologies，Madison，WI）XhoI/PstI或NcoI/PstI消化的pBAD/His A（Invitrogen，Carlsbad，CA）中。使用连接混合物转化大肠杆菌DH5α^TM（Invitrogen Carlsbad，CA）。通过PCR筛选分离菌落，作为种菌使用无菌移液器-吸头加入仅包含水的反应管中，然后加入剩余的PCR反应混合物（AccuPrime^TM SuperMixII，Invitrogen Carlsbad，CA）和如上所述的引物。

使用Spin Miniprep Kit（Qiagen）分离并纯化重组质粒，并且其特征在于限制性酶消化（XhoI+PstI、NcoI+PstI、DraI、MfeI和HaeII，它们得自Invitrogen或New England Biolabs，Beverly，MA）。随后使用该质粒转化大肠杆菌菌株BW25113（大肠杆菌Genetics Stock Center，New Haven，CT），使用氯化钙方法将所述菌株制成感受态细胞。在包含100μg/ml氨苄青霉素的Luria琼脂平板上选择转化体。使用QIAfilter^TMPlasmid Midi Kit（Qiagen）分离并纯化质粒DNA。DNA测序证实已经克隆了fabHA插入序列并且该插入序列编码公布的氨基酸序列（SEQ ID NO:10）。缺失聚组氨酸标记的所得质粒称为Bs fabHA-His，并且掺入聚组氨酸标记的质粒称为pBAD-Bs fabHA+His。

实施例3：构建枯草芽孢杆菌fabHB表达载体。

这个实施例展示了在例如大肠杆菌中用于表达枯草芽孢杆菌fabHB的重组表达载体的生成。

从枯草芽孢杆菌168（Bacillus Genetic Stock Center，Columbus，OH）中制备基因组DNA，所述制备通过从Luria琼脂平板中挑取分离菌落，将其悬浮在50μl无菌Milli-Q水（Millipore，Bedford，MA）中，在100℃下煮沸该样品五分钟，并且通过离心除去不溶解片段来进行。

为了生成缺失聚组氨酸标记的表达质粒，枯草芽孢杆菌fabHB cDNA通过PCR，使用引物RC_Bs_978_fabHB_nco_U36（SEQ ID NO:11）和RC_Bs_978_fabHB_pst_L32（SEQ ID NO:12）从基因组DNA样品中扩增，所述PCR将侧接限制性位点NcoI和PstI加到扩增的cDNA中。因为在这个克隆中使用NcoI位点，预测在FabHB蛋白中发生丝氨酸变成丙氨酸的变化。

为了生成其中fabHB将被融合到聚组氨酸标记上的表达质粒，枯草芽孢杆菌fabHB cDNA（SEQ ID NO:13）通过PCR，使用引物RC_Bs_978_fabHB_xho_U41（SEQ ID NO:14）和RC_Bs_978_fabHB_pst_L35（SEQ ID NO:15）从基因组DNA样品中扩增，所述PCR将侧接限制性位点XhoI和PstI加到扩增的cDNA中。

样品进行PCR，其具有1μl枯草芽孢杆菌168基因组DNA，每种引物的1.5μl 10μM原液，5μl 10X Pfx反应混合物（Invitrogen Carlsbad，CA），0.5μl Pfx DNA聚合酶（1.25单位）和41μl水。PCR条件如下：所述样品初始在95℃孵育一分钟，然后是30个如下的循环：在95℃ 30秒（解链），58℃ 30秒（引物退火），并且在68℃延伸引物1.5分钟。在这些循环后，在68℃孵育十分钟，然后样品保持在4℃。

使用PCR纯化试剂盒（Qiagen）纯化PCR产物，用限制性酶XhoI/PstI或NcoI/PstI双消化，并将消化产物连接到（Fast-Link EpicentreBiotechnologies，Madison，WI）XhoI/PstI或NcoI/PstI消化的pBAD/His A（Invitrogen，Carlsbad，CA）中。使用连接混合物转化大肠杆菌DH5α^TM（Invitrogen Carlsbad，CA）。通过PCR筛选分离菌落，作为种菌使用无菌移液器-吸头加入仅包含水的反应管中，然后加入剩余的PCR反应混合物（AccuPrime^TM SuperMixII，Invitrogen Carlsbad，CA）和如上所述的引物。

使用Spin Miniprep Kit（Qiagen）分离并纯化重组质粒，并且其特征在于限制性酶消化（XhoI+PstI、NcoI+PstI、DraI、MfeI和HaeII，它们得自Invitrogen或New England Biolabs，Beverly，MA）。随后使用该质粒转化大肠杆菌菌株BW25113（大肠杆菌Genetics Stock Center，New Haven，CT），使用氯化钙方法将所述菌株制成感受态细胞。在包含100μg/ml氨苄青霉素的Luria琼脂平板上选择转化体。使用QIAfilter^TMPlasmid Midi Kit（Qiagen）分离并纯化质粒DNA。DNA测序证实已经克隆了fabHB插入序列并且该插入序列编码FabHB氨基酸序列（SEQ ID NO:16）。缺失聚组氨酸标记的所得质粒称为Bs fabHB-His，并且掺入聚组氨酸标记的质粒称为pBAD-Bs fabHB+His。

实施例4：用枯草芽孢杆菌fabHA、fabHB和bkd基因共转化大肠杆 菌。

这个实施例展示用枯草芽孢杆菌fabHA，fabHB和bkd基因共转化大肠杆菌。

为了在大肠杆菌中生产反异脂肪酸，使用具有或不具有枯草芽孢杆菌bkd质粒构建体（实施例1）的每种枯草芽孢杆菌fabH质粒构建体（实施例2和3）的组合转化亲本BW25113和BW25113 ΔfadD730敲除菌株（大肠杆菌Genetic Stock Center，New Haven，CT）。ΔfadD730菌株缺失酰基-CoA合酶基因。酰基-CoA合酶是脂肪酸降解途径中的酶，并且缺失酰基-CoA合酶基因通过减弱细胞的天然脂肪酸降解途径提高宿主细胞中的脂肪酸含量。

通过氯化钙方法制备化学感受态的大肠杆菌菌株用于质粒DNA转化。活性生长的50ml大肠杆菌培养物生长至光密度（600nm）~0.4。培养物在冰上快速冷却，并且通过在2700×g离心10分钟回收细菌。弃去上清液并将沉淀物轻悬于30ml冰浴致冷的80mM MgCl₂，20mM CaCl₂溶液中。通过在2700×g离心10分钟再回收细胞。弃去上清液并将沉淀物轻柔重悬于2ml冰浴致冷的0.1M CaCl₂溶液中。

所述感受态细胞直接用于以下共转化：

pBAD-Bs fabHA和pZA31-Bs bkd

pBAD-Bs fabHA-His和pZA31-Bs bkd

pBAD-Bs fabHB和pZA31-Bs bkd

pBAD-Bs fabHB-His和pZA31-Bs bkd

细胞在冰上的预冷14ml圆底离心管中转化。大约25ng各种质粒在冰上与100μl感受态细胞一起孵育30分钟。在42℃热休克细胞90秒并立即置于冰上2分钟。加入500μl预热的SOC培养基（Invitrogen，Carlsbad，CA）并允许细胞在37℃，225rpm振荡条件下恢复。将50μl转化细胞混合物涂布到选择性LB琼脂100μg/ml氨苄青霉素平板上以选择携带pBAD-BsfabH质粒的细胞。将50μl转化细胞混合物涂布到选择性LB琼脂34μg/ml氯霉素平板上以选择携带pZA31-Bs bkd质粒的细胞。将150μl转化细胞混合物涂布到选择性LB琼脂100μg/ml氨苄青霉素平板和34μg/ml氯霉素平板上以选择携带pBAD-Bs fabH和pZA31-Bs bkd质粒的细胞。

从每个平板上挑取单菌落并划线接种到所有三个品种的LB琼脂平板上以确认抗生素抗性表型。将每种菌株划线接种至单菌落密度，并且选择单菌落以用QIAprep Spin Miniprep Kit（Qiagen，Valencia，CA）扩增质粒DNA分离物。分离质粒DNA用HaeII的限制性内切核酸酶消化分析确认了每个菌株的质粒DNA池。

实施例5：构建表达载体以表达来自绿头鸭尾脂腺的中等长度的支链 脂肪酸硫酯酶。

这个实施例展示了用于表达来自绿头鸭尾脂腺的中等长度支链脂肪酸硫酯酶的表达载体的构建。

硫酯酶（AAA49222.1）的编码序列经密码子优化以用于枯草芽孢杆菌表达。图13示出最优化的开放阅读框（ORF）（SEQ ID NO:17）与初始序列（SEQ ID NO:18）的比对。合成最优化的ORF（GenScript）并插入表达载体pTrcHisA（Invitrogen）的NcoI和BamHI位点之间。

实施例6：构建表达载体以表达来自大鼠乳腺的中等长度的支链脂肪 酸硫酯酶。

这个实施例展示了用于表达来自大鼠乳腺的中等长度支链脂肪酸硫酯酶的载体的构建。

编码序列（AAA41578.1）经密码子优化以用于枯草芽孢杆菌表达。图15示出最优化的ORF（SEQ ID NO:19）与初始序列（SEQ ID NO:20）的比对。合成最优化的ORF（GenScript）并插入表达载体pTrcHisA（Invitrogen）的NcoI和BamHI位点之间。

实施例7：从培养基中提取脂质。

这个实施例展示从培养基中提取脂质。

从细胞中释放的脂质如下进行提取：大肠杆菌细胞在Luria Broth，Miller（BD，Sparks，MD）中生长至光密度（600nm）为至少2个吸光度单位。在离心以沉淀细胞后，将上清液转移到新管中，并加入盐酸至最终pH介于1和2之间。作为另外一种选择，为了浓缩上清液，可冻干25-50ml上清液（VirTis，Gardiner，NY）并悬浮在1ml水中。使用新的或溶剂清洁的全玻璃Pyrex管（Corning，Lowell，MA）用于所有后续步骤。将3ml 1:2（v/v）氯仿:甲醇加到每个1ml上清液样品中。将1ml无菌Milli-Q（Millipore，Bedford，MA）水加到包含上清液的管中，然后加入1ml氯仿。在室温下简单离心所述管（1000rpm）五分钟后，除去顶部的水相，并且将底部的有机相转移到预称重并标记过的清洁（15-415，diam.×H 17mm×61mm；Corning）中。在氮气或大气中干燥样品。

实施例8：水解磷脂、从细胞中提取脂肪酸、以及酯化脂肪酸。

这个实施例描述水解磷脂、从细胞中提取脂肪酸、以及酯化脂肪酸。

细胞中的脂肪酸如下进行提取：大肠杆菌细胞在Luria Broth，Miller中生长至光密度（600nm）为至少2个吸光度单位。在离心（3700rpm 10分钟）以沉淀细胞后，弃去上清液。将两ml 0.1M NaCl+50mM Tris-HCl（pH为7.5-8.0）加到沉淀物中，涡旋处理所述管，离心（3700rpm 10分钟）以沉淀细胞，并弃去上清液。将无菌Milli-Q水（2ml）加到包含所述细胞沉淀物的管中，充分涡旋处理，并将所述管的内容物转移到预称重并标记过的清洁中，其具有固定的顶帽容量（2.0ml，螺帽尺寸，415，diam.×H：17mm×61mm）。将铝箔置于包含2ml沉淀物的小瓶上方，并且在-80℃冷冻样品30分钟并将其置于Virtis Freezemobile（VirTis，Gardiner，NY）冷冻干燥机中过夜（27℃）。

记录冷冻干燥样品的干重，加入氯仿（0.75ml）和15%硫酸（溶于甲醇中），并且将管置于100℃加热块中（在遮蔽通风柜中）。在四小时后，使用玻璃巴斯德吸管将反应混合物转移到13×100mm Pyrex管（Corning）中。将氯仿（1ml）和1M氯化钠（1ml）加到每个管中并手动混合，然后在1000rpm下简单混合5分钟。使用玻璃巴斯德吸管弃去顶部水层并将饱和量的无水硫酸钠（~50mg）加到管中。使用巴斯德吸管仔细除去剩余的体积（~1ml）并将其转移到预称重的玻璃GC管中。在氮气或通风柜中干燥所述管过夜。将1g（~700μl）氯仿与0.1g（~70μL）0.1g/l苯甲酸甲酯溶液加到干燥管中。

实施例9：分析脂肪酸甲酯。

这个实施例展示脂肪酸甲酯的气相色谱和质谱仪分析结果。

通过气相色谱分析脂肪酸甲酯，使用氢作为载气，初始流量为1cm³/sec。将进样口温度设为275℃并将FID检测器设为340℃。将炉温保持在70℃ 1分钟，然后注射1μL（50:1分流），温度斜坡为以10℃/min或3℃/min升温至325℃。HP GC 6890上使用的硅氧烷柱为J&W ScientificDB-1（部件号122-1131），60m×0.25mm ID×0.1μM薄膜厚度。

也通过气相色谱和质谱仪分析脂肪酸甲酯，使用氦气作为载气，初始流量为0.9ml/min（7.98psi，36cm/sec）。将进样口温度设为250℃。将炉温保持在70℃一分钟，然后注射1μL（20:1分流），温度斜坡为以10℃/min升温至325℃。在HP GC 6890上使用的柱子类型为HP-5 Crosslinked5%PhMe（Silicone；HP部件号19091J-433），其具有30m×0.25mm×0.25μM的薄膜厚度。

实施例10：通过包含pBAD-Bs fabHA-His和pZA31-Bs bkd的 BW25113生产反异和异脂肪酸。

这个实施例展示通过包含pBAD-Bs fabHA-His和pZA31-Bs bkd的BW25113生产反异和异脂肪酸。

细胞（50ml）在Luria肉汤（BD，Sparks，MD）中培养。当培养物光密度（600nm）为0.4-0.6时，加入阿拉伯糖（0.2%）以诱导fabHA表达。从细胞沉淀物（实施例8）中收获脂质并通过气相色谱法（实施例7）检查，结果揭示其峰与C15反异脂肪酸标准品的迁移度一致。通过气相色谱法、然后通过质谱仪鉴定这些峰。

这个实施例展示在非天然生产反异脂肪酸的微生物中（大肠杆菌）通过表达微生物异源多核苷酸生产反异和异脂肪酸的方法，所述异源多核苷酸编码3-酮脂酰-ACP合酶（fabHA，得自枯草芽孢杆菌）和支链α-酮酸脱氢酶（bkd，得自枯草芽孢杆菌）。

实施例11：通过增加相应的前体异亮氨酸、亮氨酸或缬氨酸提高反异 或异脂肪酸的产量。

这个实施例展示通过增加前体异亮氨酸、亮氨酸或缬氨酸提高反异或异脂肪酸的产量的方法。

培养包含pBAD-Bs fabHA-His和pZA31-Bs bkd的BW25113，并且表征的其脂肪酸特征如实施例10所述。为了展示可利用异亮氨酸的影响，在一克每升异亮氨酸的存在下制备平行培养物。

通过气相色谱法分离样品。使用软件Rev A.06.06[509]中的算法计算峰面积。累加所有反异脂肪酸以及另外的所有异脂肪酸的这些峰面积。存在的1克每升异亮氨酸与反异脂肪酸的提高和异脂肪酸的减少相关联，如图16所示。

这个实施例的结果显示增加流向支链脂肪酸合成的异亮氨酸途径的碳流增加了在宿主细胞中生产的异支链脂肪酸量。

实施例12：分析脂肪酸。

这个实施例描述了使用气相色谱法分析脂肪酸如在细菌细胞中生产的脂肪酸的方法。

用于分析的样品如下进行制备。细菌培养物（大约1.5ml）在2.0ml玻璃小瓶中冷冻并贮存在-15℃备加工用。样品在干冰上冷冻30分钟，然后冻干过夜（~16小时）直至干燥。将内标（十九烷酸甘油三酯（Sigma目录号T4632-1G））的10μl等分试样加到各个小瓶中，然后加入400μl 0.5NNaOH（溶解在甲醇中）。小瓶加盖并涡旋处理10秒。然后在65℃孵育样品30-50分钟，从培养箱中移出样品，并加入500μl三氟化硼试剂（Aldrich目录号B1252）。涡旋处理样品10秒。然后在65℃孵育样品10-15分钟并冷却至室温（大约20分钟）。加入己烷（350μl）并涡旋处理样品10秒。如果所述相不分离，加入50-100μl的饱和盐溶液（5g NaCl溶于5ml水中），并且再涡旋处理样品10秒。将至少100μl己烷上层置于气相色谱（GC）小瓶中，将其加盖并贮存在4℃或-20℃直至分析。

如下表B所述进行气相色谱分析。使用细菌酸甲酯标准品（Sigma目录号47080-U）和脂肪酸甲酯标准品（Sigma目录号47885-U）鉴定样品峰。利用甘油三棕榈酸酯l（Sigma目录号T5888-1G）的样品检查标准品被用于确认样品的酯化。使用空白标准品（仅用作内标）评估背景噪音。

表B

实施例13：通过增加经过苏氨酸依赖型途径的碳流提高反异脂肪酸产 量。

有两个主要途径负责生产2-氧代丁酸（也称为α-丁酮酸），该产物是2-甲基丁酰-CoA合成的中间体，反异脂肪酸合成的引物。一个途径从苏氨酸生成2-氧代丁酸（图2），而第二个途径使用柠苹酸作为前体（图17）。这个实施例展示增加通过利用苏氨酸的途径的碳流提高宿主细胞中的反异脂肪酸产量。

修饰大肠杆菌菌株以提高苏氨酸脱氨酶的产量，并且在某些情况下提高乙酰羟酸合酶（AHAS）的产量。苏氨酸脱氨酶和AHAS是用于生产反异脂肪酸的苏氨酸依赖型途径的头两个酶活性。苏氨酸脱氨酶促进苏氨酸转化成2-氧代丁酸，其经由AHAS转化成2-乙酰-2-羟丁酸。构建包含大肠杆菌苏氨酸脱氨酶编码序列tdcB（其可操作地连接至trc启动子）的表达载体。也制备包含基因融合的表达载体，其中AHAS III编码序列ilvIH被融合到tdcB编码序列上。

为了分离tdcB，从大肠杆菌BW25113（大肠杆菌Genetic StockCenter，Yale University，New Haven，CT）中制备基因组DNA，所述制备通过从Luria琼脂平板上挑取分离菌落，将其悬浮在100μl Tris（1mM；pH8.0），0.1mM EDTA中，煮沸该样品五分钟，并且通过离心除去不溶解片段制备基因组DNA来进行。通过PCR，使用引物GTGCCATGGCTCATATTACATACGATCTGCCGGTTGC（SEQ ID NO:2）和GATCGAATTCATCCTTAGGCGTCAACGAAACCGGTGATTTG（SEQ IDNO:3）从基因组DNA样品中扩增tdcB。样品进行PCR，其具有1μl大肠杆菌BW25113基因组DNA库，每种引物的1μl 10μM原液，25μl Pfu UltraII Hotstart 2X master mix（Agilent Technologies，Santa Clara，CA）和22μl水。PCR条件如下：所述样品初始在95℃孵育两分钟，然后是三个如下的循环：在95℃ 20秒（解链），56℃ 20秒（引物退火），并且在72℃延伸引物30秒。此外，进行27个如下循环：在95℃ 20秒，60℃ 20秒，并且在72℃延伸引物30秒。然后在72℃孵育三分钟，并且将样品保持在4℃。

使用PCR纯化试剂盒（Qiagen）纯化PCR产物，用限制性酶HindIII和NcoI双消化，并且将消化产物连接到（Fast-Link EpicentreBiotechnologies，Madison，WI）用HindIII/NcoI消化的pTrcHisA载体（Invitrogen，Carlsbad，CA）中。使用连接混合物转化OneShot Top10^TM大肠杆菌细胞（Invitrogen，Carlsbad，CA）。在包含100μg/ml氨苄青霉素的Luria琼脂平板上选择转化体。使用Qiagen HiSpeed Plasmid Midi Kit分离重组质粒并且特征在于用HindIII和NcoI限制性消化产物的凝胶电泳。DNA测序确认已经克隆了tdcB插入序列并且该插入序列编码公布的氨基酸序列（Genbank编号U00096.2）（SEQ ID NO:4和33）。所得质粒称为pTrcHisA Ec tdcB。

构建基因融合，其中AHAS基因位于Ec tdcB之后以便TdcB和重组AHAS都将从相同信使开始生产。在某些情况下，AHAS由两个亚基编码。例如，大肠杆菌AHAS III由两个基因编码，它们是IlvI（SEQ ID NO:34）和IlvH（SEQ ID NO:35）。为了将AHAS III基因，ilvIH（SEQ ID NO:36），融合到tdcB上，使用如SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38所示的引物序列从大肠杆菌BW25113基因组DNA样品中PCR扩增ilvIH，所述PCR在PCR反应期间将侧接限制性位点EcoRI加到ilvIH上。

使用25μl Pfu Ultra II Hotstart 2X master mix（Agilent Technologies，Santa Clara，CA），1μl两种引物的混合物（每种10微摩尔），1μl大肠杆菌BW25113基因组DNA和23μl水进行PCR。PCR开始于在95℃孵育两分钟，然后是两个如下的循环：在95℃变性20秒，在55℃退火20秒，并且在72℃延伸90秒。所述产物再通过如下的28个循环进行扩增：在95℃变性20秒，在62℃退火20秒，并且在72℃延伸90秒。样品在72℃孵育三分钟，然后保持在4℃。使用PCR纯化试剂盒（Qiagen，Valencia，CA）纯化PCR产物并用EcoRI限制性酶消化。

细菌表达载体pTrcHisA Ec tdcB（如上所述制备）用EcoRI消化，并且使用Fast-Link（Epicentre Biotechnologies，Madison，WI）连接消化后的载体和插入序列。然后使用连接混合物转化大肠杆菌TOP10细胞（Invitrogen，Carlsbad，CA）。使用Spin Miniprep试剂盒（Qiagen）分离重组质粒，并且特征在于用XmnI限制性消化产物的凝胶电泳。DNA测序确认已经克隆了ilvIH插入序列并且所述插入序列编码公布的氨基酸序列（ilvI，Swiss-Prot # P00893.2；ilvH Swiss-Prot # P00894.3）（分别是SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:40）。所得质粒称为pTrc Ec tdcBEc ilvIH。

通过使用对缬氨酸反馈不敏感的AHAS III增加流向2-氧代丁酸的碳流。缬氨酸不敏感性由例如在IlvH（SEQ ID NO:41；Vyazmensky等人，Biochemistry，35：10339-46（1996））的第十四个氨基酸上用甘氨酸取代天冬氨酸（G14D）赋予。制备用于表达后接大肠杆菌ilvIH G14D的大肠杆菌tdcB基因的表达载体。通过定点诱变（“SDM”）（GenScript，Piscataway，NJ），使用质粒pTrc Ec tdcB Ec ilvIH作为模板将大肠杆菌ilvH的第十四个密码子GGC（编码甘氨酸）突变成GAC（编码天冬氨酸）。使用在大亚基大肠杆菌ilvI基因中的AatI位点和在多克隆位点（MCS）中的XbaI位点亚克隆产生的SDM变体区域，使其返回到初始的pTrc-Ec tdcB Ec ilvIH模板中。SDM变体区域DNA序列列为SEQ ID NO:42，并且对应的初始DNA序列列为SEQ ID NO:43。DNA测序确认SDM产物是ilvIH（G14D）。SDM ilvH G14D开放阅读框（ORF）列为SEQ IDNO:41。用AflIII限制性消化质粒DNA确认由SDM产生的新AflIII位点的存在。所得质粒称为pTrc Ec tdcB Ec ilvIH G14D。

大肠杆菌AHAS II是两个基因的产物，它们是ilvG（SEQ ID NO:44）和ilvM（SEQ ID NO:45）。由于ilvG的突变，AHAS II在大肠杆菌K-12菌株中是功能上无活性的。为了产生活性AHAS II，根据BL21（DE3）的基因组序列（GenBank登录号CP001509.3，从碱基3840800至3842706）合成ilvG和ilvM。将NotI位点加到ilvG的5'末端，并将EcoRI位点加到ilvM的3'末端。将合成的基因（SEQ ID NO:46）与紧随tdcB的、在NotI和EcoRI位点上的pTrcHisA Ec tdcB相连。设计tdcB和ilvGM以通过相同启动子转录。DNA测序确认已经克隆了ilvGM插入序列并且所述插入序列编码公布的氨基酸序列（GenBank登录号CAQ34112（ilvG）和GenBankCAQ34113（ilvM）；分别是SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:48）。所得质粒称为pTrc Ec tdcB Ec ilvGM。

与其他AHAS酶相似，枯草芽孢杆菌AHAS包含来自两个基因的产物，所述基因是ilvB（SEQ ID NO:49）和ilvH（SEQ ID NO:50）。使用来自菌株168的序列合成枯草芽孢杆菌AHAS基因（GenScript，Piscataway，NJ）。在天然基因中存在一个内部EcoRI位点，但是在合成基因中它被移除以促进随后的亚克隆。将一个NotI位点加到ilvB序列的5'末端并将一个EcoRI位点加到ilvH序列的3'末端。将合成的基因（SEQ ID NO:51）与紧随tdcB的、在NotI和EcoRI位点上的pTrcHisA Ec tdcB相连。设计tdcB和ilvBH以通过相同启动子转录。DNA测序确认已经克隆了ilvBH插入序列并且所述插入序列编码公布的氨基酸序列（GenBank登录号CAA99561（ilvB）和Swiss-Prot No.P37252.2（ilvH）；分别是SEQ ID NO:52和SEQID NO:53）。所得质粒称为pTrc Ec tdcB Bs ilvBH。

为了用数量增加的表达载体转化大肠杆菌，将一部分包括调控基因araC和araBAD启动子（SEQ ID NO:54）的聚组氨酸标记的枯草芽孢杆菌fabHA载体（实施例2；pBAD Bs fabHA+His），克隆进包含枯草芽孢杆菌bkd（包括较大bkd操纵子的lpdV、bkdAA、bkdAB和bkdB基因）（pZA31Bs bkd）的载体。

如下利用ClonEZ PCR克隆试剂盒（GenScript，Piscataway，NJ）：首先通过PCR从线性pBAD Bs fabHA+His质粒模板中，使用引物扩增目标区域，所述引物为（i）5'引物（SEQ ID NO:55），其包含15个碱基对的同源序列下游（并且包括）pZA31 Bs bkd的the MluI位点，以及（ii）3'引物（SEQ ID NO:56），其包含15个碱基对的同源序列上游（并且包括）pZA31-Bs bkd的themluI位点。使用25μl Pfu Ultra II Hotstart 2X master mix（Agilent Technologies，Santa Clara，CA），1μl两种引物的混合物（每种10微摩尔），1μl线性pBAD Bs fabHA+His（20ng）质粒DNA和23μl水进行PCR。PCR开始于在95℃孵育两分钟，然后是30个如下的循环：在95℃变性20秒，在62℃退火20秒，并且在72℃延伸90秒。样品在72℃孵育三分钟，然后保持在4℃。使用PCR纯化试剂盒（Qiagen，Valencia，CA）纯化PCR产物。

用6μl（105ng）的pZA31 Bs bkd（用MluI限制性消化），8μl（211ng）PCR扩增的插入序列，2μl 10X ClonEZ缓冲液，2μl 10X ClonEZ酶混合物和2μl蒸馏水进行ClonEZ反应。反应在22℃进行30分钟。使用一些（8μl）反应混合物转化大肠杆菌TOP-10感受态细胞（Invitrogen，Carlsbad，CA）。通过PCR筛选分离菌落。使用Spin Miniprep试剂盒（Qiagen）分离重组质粒，并且特征在于用HaeII和EcoRV限制性消化产物的凝胶电泳。DNA测序确认已经将Ec araC Bs fabHA插入序列克隆进pZA31 Bs bkd并且该插入序列与模板序列匹配。所得质粒称为pZA31Bs bkd fabHA。

生成缺失脂肪酸降解（Voelker等人，J.Bacteriology，176：7320-7327（1994））并能够调控重组基因转录的大肠杆菌菌株。大肠杆菌K-12菌株缺失fadD，因此缺失脂肪酰-CoA合成酶，其用作原料。菌株K27（F-，tyrT58（AS），fadD88，mel-1；CGSC菌株编号5478）获取自大肠杆菌Genetic Stock Center（New Haven，CT）。将来自菌株DH5αZ1[laci^q，PN25-tetR，Sp^R，deoR，supE44，Δ（lacZYA-argFV169），lacZΔM15（Expressys，Ruelzheim，Germany）]的基因组调节盒转导到宿主菌株中。转导噬菌体P1_vir携带如下的DH5αZ1 DNA。供体菌株DH5αZ1的对数生长培养物（5ml LB肉汤，包含0.2%葡萄糖和5mM CaCl₂）用100μl P1_vir噬菌体的溶菌液原液感染。所述培养物再培养三小时以使感染的细胞溶解。沉淀所述片段，并且通过0.45μM注射器过滤单元进一步澄清上清液。新制溶解产物通过将10μl在TM缓冲液（10mM MgSO₄/10mM Tris·Cl，pH 7.4）中连续1:10稀释的溶解产物涂布到100mm LB（具有2.5mM CaCl₂）平板上进行滴定，所述平板用在LB上层琼脂（具有2.5mM CaCl₂）中培养的大肠杆菌菌苔覆盖。使用新制的噬菌体原液重复该过程直至噬菌体滴度超过10⁹pfu/mL。

使用较高滴度的噬菌体原液如下所述将DH5αZ1基因组片段转入受体K27菌株。沉淀K27的过夜培养物（1.5ml）并重悬在750μl P1盐溶液（10mM CaCl₂/5mM MgSO₄）中。悬浮细胞的等分试样（100μl）用不同量的DH5αZ1供体P1_vir溶解产物（1、10和100μl）接种到无菌测试管中。允许细胞在37℃吸收噬菌体30分钟。加入1ml LB肉汤加200μl 1M柠檬酸钠终止吸收，并且进一步在37℃透气孵育1小时。沉淀所述培养物，将细胞悬浮在100μl LB肉汤（加0.2M柠檬酸钠）中，并且将其涂布到具有50μg/ml奇放线菌素的LB琼脂平板上。分离抗奇放线菌素菌株并且通过PCR筛选存在tetR、lacI^q和fadD88的基因组DNA。将一个此类转导体称为K27-Z1并用于进一步的研究。

为了转化K27-Z1细胞，将感受态细胞置于在冰上预冷的14ml圆底离心管中。大约30ng各种质粒与50μl化学感受态K27-Z1细胞（Cohen等人，Proceedings National Academy Sciences U.S.A.，69：2110-4（1972））一起孵育30分钟。在42℃热休克细胞90秒并立即置于冰上两分钟。加入预热的SOC培养基（250μl）（Invitrogen，Carlsbad，CA），并且允许细胞在37℃，125rpm振荡条件下恢复一小时。将转化细胞混合物（20μl）涂布到具有100μg/ml氨苄青霉素的选择LB琼脂上以选择携带任何pTrc-HisA-基质粒的细胞。将转化细胞混合物（50μl）涂布到具有34μg/ml氯霉素的LB琼脂上以选择携带pZA31 Bs bkd Bs fabH质粒的细胞。将转化细胞混合物（150μl）涂布到具有100μg/ml氨苄青霉素和34μg/ml氯霉素的LB琼脂上以选择携带pTrc-HisA-基和pZA31 Bs bkd Bs fabH质粒的细胞。在一些情况下，需要两次转化以生成三重转化体：首先生成双转化体，将其制成感受态细胞，并用第三质粒转化。

挑取每个菌株的单菌落并划线接种到合适的抗生素选择平板上至单菌落密度。选择单菌落以用QIAprep Spin Miniprep Kit（Qiagen，Valencia，CA）扩增质粒DNA分离物。分离质粒DNA用AflIII的限制性内切核酸酶消化分析确认了每个菌株的质粒DNA池。

将所得表达载体导入包含枯草芽孢杆菌bkd和fabH的大肠杆菌宿主细胞中，将其在包含IPTG、四环素和阿拉伯糖的M9甘油培养基中培养以诱导重组基因表达。依据Budapest Treaty for the International Recognition of theDeposit of Microorganisms for the Purpose of Patent Procedure（“BudapestTreaty”）的条款，包含pZA31 Bs bkd fabHA和pTrc Ec tdcB Ec ilvGM的K27-Z1样品在2010年12月14日保藏于美国典型培养物保藏中心（ATCC），10801 University Blvd.，Manassas，VA，其分配有根据日期[DATE]的保藏号[XXX]。也测试提高反异脂肪酸产量的其他AHAS基因。分离由细菌细胞生产的脂肪酸。比较由修饰细菌生产的反异脂肪酸量与由未修饰亲本大肠杆菌菌株和生产枯草芽孢杆菌Bkd和FabH的大肠杆菌生产的脂肪酸量。每种类型的脂肪酸量除以生产的脂肪酸总量。意外地是，表达tdcB的宿主细胞表现出反异脂肪酸产量的降低。Ec tdcB（编码苏氨酸脱氨酶）和Ec ilvIH基因（编码AHAS III）的共表达提高了大肠杆菌菌株中的反异C15脂肪酸的产量，该菌株相对于携带Bs fabH Bs bkd的大肠杆菌菌株还携带Bs fabH和Bs bkd，并且其不被苏氨酸依赖型途径的酶修饰。观察到对缬氨酸不敏感的ilvIH G14D（图27）、Ec ilvIH（图28和29）、外来枯草芽孢杆菌基因Bs ilvBH（图28）和大肠杆菌ilvGM（图30）的反异脂肪酸产量提高。

这个实施例的结果展示设计用于增加通过苏氨酸依赖型途径的碳流的基因修饰形式提高了反异脂肪酸的产量。

实施例14：通过增加经过柠苹酸依赖型途径的碳流提高反异脂肪酸产 量。

这个实施例描述了生产外来柠苹酸合酶以进一步提高反异脂肪酸产量的重组微生物的制备。

天然詹氏甲烷球菌柠苹酸合酶编码序列也通过定向进化发生突变以改善酶活性和反馈抗性以生成cimA3.7（SEQ ID NO:58）（Atsumi等人，Applied and Environmental Microbiology 74：7802-8（2008））。未知大肠杆菌是否具有柠苹酸合酶活性，并且菌株经工程化以生产外来柠苹酸合酶，同时过量生产多个天然大肠杆菌酶：LeuB、LeuC、LeuD和多个AHAS中的每一个。柠苹酸合酶、LeuB、LeuC、LeuD和IlvIH（G14D）介导柠苹酸途径中的前五个化学转化以生产反异脂肪酸（图17）。

为了生成经密码子优化用于大肠杆菌表达的合成CimA3.7基因，合成包含限制性位点BspHI（碱基1-6）、密码子优化的cimA3.7片段（碱基3-1118）、终止密码子TGA（碱基1119-1121）、从大肠杆菌LeuB基因开始的52个碱基的片段（碱基1121-1173），以及包含NotI、PacI、PmeI、XbaI和EcoRI位点的连接子序列（碱基1174-1209）的DNA片段（SEQ IDNO:57）（GenScript，Piscataway，NJ）。cimA3.7的终止密码子（TGA）和leuB的起始密码子（ATG）重叠一个碱基（A），推测能够发生翻译偶联。这个重叠模仿大肠杆菌中的天然leuA和leuB偶联。合成片段用BspHI和EcoRI消化，并且使用由BspHI和NcoI生成的配伍末端将其克隆进在NcoI和EcoRI位点的pTricHisA（Invitrogen）。leuB片段的末端（碱基1168-1173）也包含一个BspEI位点（用下划线标示）以克隆leuBCD。这个载体称为pTrcHisA Mj cimA。

leuB（SEQ ID NO:59）基因编码3-异丙基苹果酸脱氢酶。leuC（SEQID NO:60）和leuD（SEQ ID NO:61）基因分别编码异丙基苹果酸异构酶大亚基和小亚基。为了融合在Mj cimA之后的三基因复合leuBCD（SEQ IDNO：57)，使用PCR引物(SEQ ID NO：63和SEQ ID NO：64)从大肠杆菌BW25113基因组DNA样品中扩增大肠杆菌LeuBCD cDNA，其包括一个在leuB中的BspEI限制性位点并在PCR反应期间在leuD的3′终止密码子掺入一个NotI限制性位点。使用50μl Pfu Ultra II Hotstart 2X master mix(Agilent Technologies，Santa Clara，CA)，1μl两种引物的混合物(每种10微摩尔)，1μl大肠杆菌BW25113基因组DNA和48μl水进行PCR。PCR开始于在95℃孵育两分钟，然后是30个如下的循环：在95℃变性20秒，在64℃退火20秒，并且在72℃延伸两分钟。样品在72℃孵育三分钟，然后保持在4℃。使用PCR纯化试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)纯化PCR产物(leuBCD插入序列)。

leuBCD插入序列和细菌表达载体pTrcHisA Mj cimA用BspEI消化。在用NotI限制性消化之前，消化的载体和leuBCD插入序列用PCR纯化柱再次纯化。在最后的柱纯化之后，消化载体和插入序列使用Fast-Link(Epicentre Biotechnologies，Madison，WI)连接。然后使用连接混合物转化大肠杆菌TOP10细胞(Invitrogen，Carlsbad，CA)。使用Spin Miniprep试剂盒(Qiagen)分离重组质粒，并且特征在于用AflIII限制性消化产物的凝胶电泳。DNA测序确认已经克隆了leuBDC插入序列并且该插入序列编码公布的氨基酸序列(GenBank登录号AAC73184(Ec lueB)(SEQ ID NO：65)；GenBank登录号AAC73183(Ec leuC)(SEQ ID NO：66)；和GenBank登录号AAC73182(Ec leuD)(SEQ IDNO：67))。所得质粒称为pTrc Nj cimA Ec leuBCD。

将侧接5′NotI和3′EcoRI位点(如上所述)的AHAS基因(ilvIH、ilvIH G14D、ilvGM和Bs ilvBH)克隆进表达质粒pTrc Mj cimA Ec leuBCD的NotI和EcoRI位点并命名如下：

大肠杆菌AHAS III ilvIH(SEQ ID NO：36)→pTrc Mj cimA Ec leuBCDEc ilvIH

大肠杆菌AHAS III ilvIH(G14D)(SEQ ID NO：41)→pTrc Mj cimAEc leuBCD Ec ilvIH(G14D)

大肠杆菌BL21(DE3)AHAS II ilvGM(SEQ ID NO：46)→pTrc MjcimA Ec leuBCD Ec ilvGM

枯草芽孢杆菌AHAS ilvBH（SEQ ID NO:51）→pTrc Mj cimA EcleuBCD Ec ilvBH。

依据Budapest Treaty for the International Recognition of the Deposit ofMicroorganisms for the Purpose of Patent Procedure（“Budapest Treaty”）的条款，包含pZA31 Bs bkd fabHA和pTrc Mj cimA Ec leuBCD Ec ilvGM的K27-Z1样品在2010年12月14日保藏于美国典型培养物保藏中心（ATCC），10801 University Blvd.，Manassas，VA，其分配有根据日期[DATE]的保藏号[XXX]。在生产来自枯草芽孢杆菌的FabH和Bkd的大肠杆菌宿主中表达这些重组多核苷酸进一步提高了反异脂肪酸的产量，如链长为十五个和十七个碳的反异脂肪酸所示（图31）。

实施例15：用硫酯酶剪切反异脂肪酸的链长。

这个实施例展示用硫酯酶剪切反异脂肪酸链长的方法。本文所述方法用于例如生产预定链长的脂肪酸池以供商业应用。

构建表达载体（pTrc Ec‘tesA），其包含编码大肠杆菌酶‘TesA的核酸序列，该酶具有硫酯酶活性（Cho等人，J.Biological Chemistry，270：4216-9（1995））。截短的大肠杆菌tesA（‘tesA）cDNA（SEQ ID NO:68）通过大肠杆菌tesA基因（GenBank登录号L06182）的PCR扩增生成。设计5'引物（SEQ ID NO:69）以在tesA的第26个密码子之后退火，将第27个密码子从丙氨酸变为甲硫氨酸并生成NcoI限制性位点。设计3'引物（SEQ ID NO:71）以掺入一个BamHI限制性位点。使用50μl PfuUltra II Hotstart 2X master mix（Agilent Technologies，Santa Clara，CA），1μl两种引物的混合物（每种10微摩尔），1μl大肠杆菌BW25113基因组DNA和48μl水进行PCR。PCR开始于在95℃孵育两分钟，然后是30个如下的循环：在95℃变性20秒，在58℃退火20秒，并且在72℃延伸15秒。样品在72℃孵育三分钟，然后保持在4℃。使用PCR纯化试剂盒（Qiagen，Valencia，CA）纯化PCR产物（Ec‘tesA）。细菌表达载体pTrcHisA和‘tesA PCR产物用NcoI和BamHI消化。消化载体和插入序列使用Fast-Link（Epicentre Biotechnologies，Madison，WI）连接。然后使用连接混合物转化大肠杆菌TOP10细胞（Invitrogen，Carlsbad，CA）。使用Spin Miniprep试剂盒（Qiagen）分离重组质粒，并且特征在于用HaeII限制性消化产物的凝胶电泳。DNA测序确认已经克隆了‘tesA插入序列并且该插入序列编码期望的氨基酸序列（SEQ ID NO:73）。所得质粒称为pTrc Ec‘tesA。

为了限制基因表达，将截短的大肠杆菌‘tesA基因亚克隆进低拷贝的细菌表达载体pZS21-MCS（Expressys，Ruelzheim，Germany）中。表达载体pTrc Ec‘tesA是PCR反应的模板，所述PCR使用设计用于生成侧接XhoI限制性位点并包括pTrcHisA lac启动子（以置换pZS21-MCS载体tet启动子）的5'引物（SEQ ID NO:74）和掺入HindIII限制性位点的3'引物（SEQID NO:75）。使用50μl Pfu Ultra II Hotstart 2X master mix（AgilentTechnologies，Santa Clara，CA），1μl两种引物的混合物（每种10微摩尔），1μl pTrc Ec‘tesA质粒DNA（6ng）和48μl水进行PCR。PCR开始于在95℃孵育两分钟，然后是30个如下的循环：在95℃变性20秒，在57℃退火20秒，并且在72℃延伸20秒。样品在72℃孵育三分钟，然后保持在4℃。使用PCR纯化试剂盒（Qiagen，Valencia，CA）纯化PCR产物。细菌表达载体pZS21-MCS和Ec‘tesA PCR产物用XhoI和HindIII消化。消化载体和插入序列使用Fast-Link（EpicentreBiotechnologies，Madison，WI）连接。然后使用连接混合物转化大肠杆菌TOP10细胞（Invitrogen，Carlsbad，CA）。使用Spin Miniprep试剂盒（Qiagen）分离重组质粒，并且特征在于用HaeII限制性消化产物的凝胶电泳。DNA测序确认已经克隆了‘tesA插入序列并且该插入序列编码期望的氨基酸序列（SEQ ID NO:73）。所得质粒称为pZS22 Ec‘tesA。

将表达载体导入大肠杆菌宿主细胞。与不生成‘TesA（图32）的宿主细胞相比，生成‘TesA的宿主细胞生产更多的中链长度（十三个碳）反异脂肪酸和更少的长链脂肪酸（十五个和十七个碳）。‘tesA表达也导致在大肠杆菌BL21 Star（DE3）菌株中生产短链反异脂肪酸（图33）。令人惊讶地是，包含Ec‘tesA的大肠杆菌BL21 Star（DE3）菌株生产比包含Ec‘tesA大肠杆菌K-12衍生菌株更多的反异脂肪酸。

这个实施例表明过表达硫酯酶提高由宿主微生物生产的中链长度反异脂肪酸（例如长度为13个碳的反异脂肪酸）的比例。

实施例16：硫胺素增加反异脂肪酸合成。

硫胺素（维生素B1）是负责生产反异脂肪酸的两个酶（AHAS和Bkd）的辅因子。将硫胺素加到LB（改为较低的盐浓度）中并观察到反异C15和C17脂肪酸的提高（图34）。

实施例17：在生产李斯特菌属FabH的大肠杆菌中合成反异脂肪酸。

这个实施例展示通过经工程化以生产外来3-酮脂酰-ACP合酶的微生物生产反异和异脂肪酸。

单核细胞增多性李斯特菌10403S 3-酮脂酰-ACP合酶III（fabH）基因（GenBank登录号FJ749129.1；SEQ ID NO:77）经密码子优化以在大肠杆菌中表达并被合成以包括5'-XhoI和3'-PstI限制性位点（SEQ ID NO:78）。将所得合成并测序的DNA亚克隆进pMA载体（GENEART Inc.，Toronto，ON，Canada）。为了生成其中李斯特菌属fabH被融合到聚组氨酸标记上的表达质粒，包含单核细胞增多性李斯特菌fabH基因的pMA载体用XhoI和PstI消化并用XhoI/PstI消化的pBAD/HisA（Invitrogen，Carlsbad，CA）连接（Fast-Link Epicentre Biotechnologies，Madison，WI）。使用连接混合物转化大肠杆菌DH5α^TM（Invitrogen Carlsbad，CA）。通过PCR筛选分离菌落，作为种菌使用无菌牙签加入仅包含水的反应管中，然后加入PCR反应混合物（AccuPrime^TM SuperMixII，InvitrogenCarlsbad，CA）和如上所述的引物（SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80）。使用Spin Miniprep Kit（Qiagen）分离并纯化重组质粒，并且其特征在于限制性酶消化（DraI、MfeI和HaeII（New England Biolabs，Beverly，MA））。随后使用该质粒转化菌株BW25113（大肠杆菌Genetics Stock Center，New Haven，CT），使用氯化钙方法将所述菌株制成感受态细胞。在包含100μg/ml氨苄青霉素的Luria琼脂平板上选择转化体。使用QIAfilter^TM Plasmid Midi Kit（Qiagen）分离并纯化质粒DNA。所得质粒掺入聚组氨酸标记，将其称为pBAD Lm_fabH+。这个质粒和pZA31一起用于转化BW25113。

在Luria肉汤中培养转导细胞。当培养物光密度（600nm）达到0.4-0.6时，加入阿拉伯糖（0.2%）以诱导fabH表达。从细胞沉淀物中收获脂质并通过气相色谱法检查，结果揭示其峰与C15反异和C15异脂肪酸标准品的迁移度一致。通过气相色谱法，然后通过质谱仪确认所述峰的同一性（图36）。

这个实施例展示了表达外来3-酮脂酰-ACP合酶（李斯特菌属fabH）和外来支链α-酮酸脱氢酶（芽孢杆菌属bkd）的微生物（大肠杆菌菌株BW25113）的反异和异脂肪酸生产。

实施例18：乙酰羟酸异构还原酶和二羟酸脱水酶提高反异脂肪酸的产 量。

表达重组Ec tdcB的大肠杆菌菌株表现出提高的直链C15（n-C15）脂肪酸产量（图29），说明2-氧代丁酸（也称为2-丁酮酸）导致丙酰基-CoA增加，所述丙酰基-CoA用作合成具有奇数碳原子的直链脂肪酸的引物（图2）。重组AHAS的产生降低了n-C15脂肪酸水平并提高了C15反异（a-C15）脂肪酸的水平，说明AHAS去除了2-氧代丁酸（图30）。n-C15消耗的较大效应说明不是所有2-氧代丁酸涉及反异脂肪酸的生产。在本发明的一个实施方案中，IlvC和/或IlvD是催化反异脂肪酸合成途径中产生2-氧代丁酸后的两个化学转化的酶，它们被过表达以提高反异脂肪酸的产量。为了生成分别编码乙酰羟酸异构还原酶和二羟酸脱水酶的大肠杆菌基因ilvC（由如GenBank登录号U00096.2位点3955993至位点3957468所示的核酸序列编码；SEQ ID NO:81）和ilvD（由如GenBank登录号U00096.2位点3951501至位点3953351所示的核酸序列编码；SEQ ID NO:82）的转录融合，经密码子优化的合成DNA侧接XhoI和MluI位点（SEQ ID NO:83）并被连接到表达载体pZS22-MCS中。ilvCD基因可操作地连接至一个得自pTrc HisA的trc启动子。所述插入序列编码trc启动子、lac操纵子、rrnB抗终止序列、T7基因10翻译增强子、核糖体结合位点、IlvC（GenBank登录号AAC76779）和IlvD（GenBank登录号AAT48208.1）（分别是SEQ ID NO:84和SEQ ID NO:85）的公布氨基酸序列、以及NotI、PmeI、EcoRI和XbaI的独特限制性位点。

实施例19：减弱反异脂肪酸生物合成中由Ec ilvE编码的转氨酶活 性。

通过反异脂肪酸的代谢途径的碳流能经由转氨酶IlvE转向到异亮氨酸生产（图2）。这个实施例示出通过减弱IlvE活性提高反异脂肪酸的方法。

使用氯化钙将ilvE缺失突变体大肠杆菌JW5606-1（大肠杆菌GeneticStock Center，Yale University，New Haven，CT）制成活性感受态细胞。用包含枯草芽孢杆菌bkd、枯草芽孢杆菌fabHA、大肠杆菌tdcB和大肠杆菌ilvIH的重组质粒或空载体对照pZA31MCS & pTrcHisA转化细胞。转化的细胞（40ml）在M9基础培养基中培养，所述培养基补充有L-异亮氨酸、L-缬氨酸和L-亮氨酸，其每种为0.1%的最终浓度。当培养物的光密度（600nm）达到0.4-0.6时，加入阿拉伯糖（0.2%）、异丙基β-D-硫代半乳糖苷（1mM）和无水四环素（100ng/ml）以诱导基因表达。在大约48小时后，从细胞培养物悬浮液中收获脂质，将其水解，转化成甲酯，并且通过气相色谱法检查。存在的重组Bs fabHA、Bs bkd、Ec tdcB和Ec ilvIH G14D导致在缺失Ec ilvE的菌株中生产反异脂肪酸（图35）。

实施例20：构建烯酰-ACP还原酶表达载体。

烯酰-ACP还原酶是大肠杆菌fabI的产物，它催化脂肪酸合成中的限速步骤（Zheng等人，J.Microbiol.Biotechnol.20：875-80（2010））。这个实施例通过生产编码烯酰-ACP还原酶的表达载体的方法。在一些实施方案中，将编码烯酰-ACP还原酶的表达载体导入非天然生产支链脂肪酸的微生物如大肠杆菌中以提高支链脂肪酸的产量。在一个实施方案中，修饰烯酰-ACP还原酶以提高其对支链脂肪酸的活性。

为了构建编码枯草芽孢杆菌烯酰-CoA还原酶（由fabI（SEQ ID NO:92）编码）的表达载体，通过从Luria琼脂平板上挑取分离菌落，将所述菌落悬浮在41μl无菌Milli-Q水中，并且使用利用基因特异性引物的PCR反应的直接扩增从枯草芽孢杆菌菌株168（芽孢杆菌属Genetic Stock Center，Columbus，OH）中制备枯草芽孢杆菌基因组DNA。为了生成不编码聚组氨酸标记的表达质粒，枯草芽孢杆菌fabI通过PCR，使用引物（SEQ IDNO:87和SEQ ID NO:88）从基因组DNA样品中扩增，所述PCR将侧接限制性位点NcoI和PstI加到扩增的DNA（SEQ ID NO:89）中。为了生成其中fabI将被融合到聚组氨酸标记上的表达质粒，枯草芽孢杆菌fabI通过PCR，使用引物（SEQ ID NO:91和SEQ ID NO:88）从基因组DNA样品中扩增，所述PCR将侧接限制性位点XhoI和PstI加到扩增的DNA（SEQ IDNO:90）中。

样品进行PCR，其具有41μl水和枯草芽孢杆菌168的一个悬浮菌落，每种引物的1.5μl 10μM原液，5μl 10X Pfx反应混合物（InvitrogenCarlsbad，CA）和0.5μl Pfx DNA聚合酶（1.25单位）。PCR条件如下：所述样品初始在95℃孵育三分钟，然后是30个如下的循环：在95℃ 30秒（解链），58℃ 30秒（引物退火），并且在68℃延伸引物1.5分钟。在这些循环后，在68℃孵育十分钟，然后样品保持在4℃。

使用PCR纯化试剂盒（Qiagen）纯化PCR产物，用限制性酶XhoI/PstI或NcoI/PstI双消化，并将消化产物连接到（Fast-Link EpicentreBiotechnologies，Madison，WI）XhoI/PstI或NcoI/PstI消化的pTrc/His A（Invitrogen，Carlsbad，CA）中。使用连接混合物转化大肠杆菌DH5α^TM（Invitrogen Carlsbad，CA）。通过PCR筛选分离菌落，作为种菌使用无菌牙签加入仅包含水的反应管中，然后加入PCR反应混合物（AccuPrime^TMSuperMixII，Invitrogen Carlsbad，CA）和如上所述的引物。

使用Spin Miniprep Kit（Qiagen）分离并纯化重组质粒，并且其特征在于限制性酶消化（XhoI+PstI、NcoI+PstI、DraI、MfeI和HaeII（Invitrogen，Carlsbad，CA或New England Biolabs，Beverly，MA））。所述质粒随后用于转化化学感受态BL21 STAR（DE3）（Invitrogen，Carlsbad，CA）。在包含100μg/ml氨苄青霉素的Luria琼脂平板上选择转化体。使用QIAfilter^TM Plasmid Midi Kit（Qiagen）分离并纯化质粒DNA。DNA测序证实已经克隆了fabI插入序列并且该插入序列编码FabI氨基酸序列（SEQ ID NO:89）。缺失聚组氨酸标记的所得质粒称为pTrc Bs_fabI-，并且掺入聚组氨酸标记的质粒称为pTrc Bs_fabI+。

本文所公开的量纲和值不旨在被理解为严格地限于所述的精确值。相反，除非另外指明，每个这样的量纲均是指所引用数值和围绕那个数值的功能上等同的范围。例如所公开的量纲“40mm”旨在表示“约40mm”。

除非明确排除或换句话讲有所限制，本文中引用的每一个文件，包括任何交叉引用或相关专利或专利申请，均据此以引用方式全文并入本文。

对任何文献的引用均不是承认其为本文公开的或受权利要求书保护的任何发明的现有技术、或承认其独立地或以与任何其它一个或多个参考文献的任何组合的方式提出、建议或公开任何此类发明。此外，如果此文献中术语的任何含义或定义与任何以引用方式并入本文的文献中相同术语的任何含义或定义相冲突，将以此文献中赋予那个术语的含义或定义为准。

尽管已用具体实施方案来说明和描述了本发明，但对于本领域的技术人员显而易见的是，在不背离本发明的精神和保护范围的情况下可作出许多其它的改变和变型。因此，随附权利要求书中旨在涵盖本发明范围内的所有这些改变和变型。

Claims (4)

1.一种生产反异脂肪酸的方法，所述方法包括培养细胞，所述细胞包含催化下列反应(aa)、(bb)、(cc)、(dd)、(ff)、(gg)和(hh)的外来的或过表达核苷酸编码的多肽：

(aa)丙酮酸至柠苹酸的转化；

(bb)柠苹酸至柠康酸的转化；

(cc)柠康酸至β-甲基-D-苹果酸的转化；

(dd)β-甲基-D-苹果酸至2-氧代丁酸的转化；

(ff)2-氧代丁酸至2-乙酰-2-羟丁酸的转化；

(gg)2-乙酰-2-羟丁酸至2,3-二羟基-3-甲基戊酸的转化；

(hh)2,3-二羟基-3-甲基戊酸至2-酮基-3-甲基戊酸的转化，

其中所述细胞包含编码柠苹酸合酶的的外来的或过表达的多核苷酸、包含编码乙酰羟酸合酶的核酸序列的外来的或过表达的多核苷酸、包含编码异丙基苹果酸异构酶的核酸序列的外来的或过表达的多核苷酸、包含编码异丙基苹果酸脱氢酶的核酸序列的外来的或过表达的多核苷酸、包含编码支链α-酮酸脱氢酶的核酸序列的外来的或过表达的多核苷酸、包含编码3-酮脂酰-ACP合酶的核酸序列的外来的或过表达的多核苷酸；

其中，所述柠苹酸合酶是来源于詹氏甲烷球菌CimA，所述异丙基苹果酸异构酶是大肠杆菌LeuC、LeuD，所述异丙基苹果酸脱氢酶是大肠杆菌LeuB，所述乙酰羟酸合酶是大肠杆菌IlvIH、大肠杆菌IlvIH(G14D)，所述支链α-酮酸脱氢酶是枯草芽孢杆菌Bkd，并且所述3-酮脂酰-ACP合酶是枯草芽孢杆菌FabH；

其中所述细胞比不包含所述一种或更多种多核苷酸的其它类似的细胞生产更多的反异脂肪酸。

2.一种生产反异脂肪酸的方法，所述方法包括培养细胞，所述细胞包含催化下列反应(ee)、(ff)、(gg)和(hh)的外来的或过表达核苷酸编码的多肽：：

(ee)苏氨酸至2-氧代丁酸的转化；

(ff)2-氧代丁酸至2-乙酰-2-羟丁酸的转化，

(gg)2-乙酰-2-羟丁酸至2,3-二羟基-3-甲基戊酸的转化，或

(hh)2,3-二羟基-3-甲基戊酸至2-酮基-3-甲基戊酸的转化，

任选的是，所述细胞经修饰以降低支链氨基酸氨基转移酶的活性；

其中所述细胞包含编码苏氨酸脱氨酶的外来的或过表达的多核苷酸，包含编码乙酰羟酸合酶的外来的或过表达的多核苷酸，包含编码异丙基苹果酸异构酶的核酸序列的外来的或过表达的多核苷酸、包含编码异丙基苹果酸脱氢酶的核酸序列的外来的或过表达的多核苷酸、包含编码支链α-酮酸脱氢酶的核酸序列的外来的或过表达的多核苷酸、包含编码3-酮脂酰-ACP合酶的核酸序列的外来的或过表达的多核苷酸；

其中，所述苏氨酸脱氨酶是大肠杆菌TdcB，所述乙酰羟酸合酶是大肠杆菌IlvIH、大肠杆菌IlvIH(G14D)，所述支链α-酮酸脱氢酶是枯草芽孢杆菌Bkd，并且所述3-酮脂酰-ACP合酶是枯草芽孢杆菌FabH。

3.如权利要求1或2所述的方法，所述方法还包括从培养物中提取反异脂肪酸或来源于反异脂肪酸的产物。

4.一种细胞，所述细胞包含下列多核苷酸：

(i)包含编码苏氨酸脱氨酶的核酸序列的外来的或过表达的多核苷酸，或编码柠苹酸合酶的的外来的或过表达的多核苷酸，

(ii)包含编码支链α-酮酸脱氢酶的核酸序列的外来的或过表达的多核苷酸，和

(iii)包含编码3-酮脂酰-ACP合酶的核酸序列的外来的或过表达的多核苷酸，

其中所述多核苷酸被表达，并且所述细胞比不包含所述一种或更多种多核苷酸的其它类似的细胞生产更多的反异脂肪酸；

其中(i)所述苏氨酸脱氨酶是大肠杆菌TdcB，或所述柠苹酸合酶是来源于詹氏甲烷球菌CimA，(ii)所述支链α-酮酸脱氢酶是枯草芽孢杆菌Bkd，和(iii)所述3-酮脂酰-ACP合酶是枯草芽孢杆菌FabH。