ES2525150T3 - Ácidos grasos de cadena ramificada y producción biológica de los mismos - Google Patents

Ácidos grasos de cadena ramificada y producción biológica de los mismos Download PDF

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Abstract

Un método para producir ácido graso anteiso, comprendiendo el método cultivar una célula que comprende al menos un polinucleótido expresado en exceso, en donde un polinucleótido expresado en exceso es un polinucleótido en donde un polinucleótido expresado en exceso es un polinucleótido natural para la célula, cuyo producto se genera en mayor cantidad del que se encuentra normalmente en la célula, o un polinucleótido exógeno, comprendiendo dicho polinucleótido exógeno o expresado en exceso una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que cataliza al menos una de las siguientes reacciones: (aa) conversión de piruvato a citramalato; (bb) conversión de citramalato a citraconato; (cc) conversión de citraconato a ß-metil-D-malato; (dd) conversión de ß-metil-D-malato a 2-oxobutanoato; o (ee) conversión de treonina a 2-oxobutanoato bajo condiciones que permitan la expresión del polinucleótido o polinucleótidos y la producción de ácido graso anteiso, en donde la célula produce más ácidos grasos anteiso que una célula por otra parte similar que no comprende el polinucleótido o polinucleótidos.

Description

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respecto, en algunos casos, se introducen copias adicionales del polinucleótido en la célula huésped para aumentar la cantidad de enzima disponible para la producción de ácido graso. La sobreexpresión de un polinucleótido nativo también se consigue regulando en exceso la actividad del promotor endógeno, o uniendo de forma operativa el polinucleótido a un promotor más sólido.
5 Las enzimas exógenas y sus correspondientes polinucleótidos son también adecuados para usar en el contexto de la invención, y los rasgos de la ruta de biosíntesis o del producto final se pueden hacer a medida dependiendo de la enzima concreta utilizada. Si se desea, el polinucleótido o polinucleótidos se aíslan o derivan de los organismos productores de ácido graso de cadena ramificada descritos en la presente memoria. Por ejemplo, FabH de E. coli, una 3-cetoacil-ACP sintetasa, utiliza preferiblemente la acetil-CoA como sustrato en lugar de la
10 acil-CoA ramificada, mientras que FabH de B. subtilis impulsa de manera más eficaz la síntesis de ácido graso ramificado. Así, en un aspecto, la célula es una célula de E. coli que comprende un polinucleótido que codifica un FabH de B. subtilis.
Una citramalato sintetasa ilustrativa producida por las células se deriva de CimA de M. jannaschii. AHAS ilustrativas incluyen E. coli IlvIH, E. coli IlvIH (G14D), E. coli IlvGM, y B. subtilis IlvBH. Una BCDH ilustrativa es Bkd de B. 15 subtilis, y una 3-cetoacil-ACP sintetasa ilustrativa es FabH de B. subtilis. Una treonina desaminasa ilustrativa es TdcB de E. coli. Las tioesterasas ilustrativas incluyen, aunque no de forma limitativa, TesA de E. coli, tioesterasa de la glándula uropigial de Mallard, y tioesterasa de glándula mamaria de rata. Una isopropilmalato isomerasa ilustrativa es LeuCD de E. coli, y una isopropilmalato deshidrogenasa ilustrativa es LeuB de E. coli. En un aspecto, la célula comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos aproximadamente 90 por ciento de identidad con la
20 secuencia de ácido nucleico definida en la SEC ID N.°: 32, 36, 42, 43, 46, 51, 57, 62, 68, u 83, o codifica una polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 90 por ciento de identidad con la secuencia de aminoácido definida en la SEC ID N.°: 33, 39, 40, 41, 47, 48, 52, 53, 58, 65, 66, 67, 84, u 85. Las enzimas ilustrativas que median en la producción de ácidos grasos anteiso y/o iso también se han descrito en la Tabla A.
25 Tabla A
Actividad
Nombre del gen Organismo N.° acceso
Aminoácido de cadena ramificada transaminasa
ilvE Salmonella enteric NP_457845
ilvE
Yersinia pestis YP_002348774
ilvE
Shigella flexneri NP_709575
ilvE
Pectobacterium carotovorum YP_003018265
ilvE
Ralstonia solanacearum YP_003753411
2-cetoácido de cadena ramificada deshidrogenasa, componente E1, subunidad alfa
bkdAA Anoxybacillus flavithermus YP_002315323
bfmBAA
Staphylococcus aureus NP_374631
bkdA1
Sphingobium japonicum YP_003544745
bkdA1
Brevibacillus brevis YP_002771850
bkdA
Lactobacillus casei YP_001987607
2-cetoácido de cadena ramificada deshidrogenasa, componente E1, subunidad beta
bkdAB Anoxybacillus flavithermus YP_002315324
bfmBAB
Staphylococcus aureus NP_374630
bkdA2
Sphingobium japonicum YP_003544746
bkdA2
Brevibacillus brevis YP_002771851
bkdB
Lactobacillus casei YP_001987606
2-cetoácido de cadena ramificada deshidrogenasa, componente E2
bkdB Anoxybacillus flavithermus YP_002315325
bfmBB
Staphylococcus aureus NP_374629
pdhC
Sphingobium japonicum YP_003544747
17
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bkdB
Brevibacillus brevis YP_002771852
bkdC
Lactobacillus casei YP_001987605
2-cetoácido de cadena ramificada deshidrogenasa, componente E3
lpdV Anoxybacillus flavithermus YP_002315322
Staphylococcus aureus
NP_374632
pdhD
Sphingobium japonicum YP_003545508
Lpd
Brevibacillus brevis YP_002771849
bkdD
Lactobacillus casei YP_001987608
3-cetoacil-ACP sintetasa III
fabH Geobacillus kaustophilus YP_146657.1
Bacillus megaterium
YP_003561163.1
fabH
Staphylococcus aureus ZP_05601460.1
fabH1
Streptomyces coelicolor P72392
Beutenbergia cavernae
YP_002881824
citramalato sintetasa
cimA Methanobrevibacter ruminantium YP_003424156
cimA
Leptospira interrogans ABK13754
Ignicoccus hospitalis
ABU82163
Cyanothece 51142
YP_001801665
Geobacter sulfurreducens
NP_952848
3-isopropilmalato deshidrogenasa
leuB Cronobacter turicensis YP_003209069.1
leuB
Shigella boydii YP_406624
leuB
Actinobacillus pleuropneumoniae YP_001651485
leuB
Cronobacter turicensis YP_003209069
leuB
Pantoea ananatis YP_003519000
isopropilmalato isomerasa subunidad grande
leuC Salmonella enteric NP_459116
leuC
Serratia proteamaculans YP_001476977
leuC
Photorhabdus asymbiotica YP_003039932
leuC
Klebsiella pneumoniae YP_002917788
leuC
Haemophilus influenzae NP_439151
isopropilmalato isomerasa subunidad pequeña
leuD Shigella dysenteriae YP_401823
leuD
Buchnera aphidicola YP_002477704
leuD
Actinobacillus pleuropneumoniae YP_001967934
leuD
Haemophilus somnus YP_718599
leuD
Xanthomonas campestris YP_365316
treonina desaminasa
Cha1 Saccharomyces cerevisiae NP_001018030
ilvA
Vibrio fischeri YP_002157347
ilvA
Shewanella violacea YP_003558613
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ilvA
Metilococcus capsulatus YP_112886
ilvA
Dichelobacter nodosus YP_001209243
treonina deshidratasa
tdcB Pantoea ananatis YP_003519179
tdcB
Klebsiella pneumoniae YP_001335951
tdcB
Shigella boydii YP_409322
tdcB
Acinetobacter baumannii YP_001706275
tdcB
Psychrobacter arcticum YP_264671
acetolactato sintetasa (AHAS) subunidad III grande
ilvI Yersinia enterocolitica YP_001005008
ilvI
Salmonella enterica YP_002113134
ilvI
Buchnera aphidicola NP_240056
ilvI
Xenorhabdus bovienii YP_003469370
ilvI
Klebsiella pneumoniae YP_001333772
acetolactato sintetasa (AHAS) subunidad III pequeña
ilvH Laribacter hongkongensis YP_002794162
ilvH
Burkholderia mallei YP_103450
ilvH
Nitrosomonas europaea NP_841373
ilvH
Campylobacter jejuni YP_178690
ilvH
Desulfomicrobium baculatum YP_003156951
acetolactato sintetasa (AHAS) subunidad II grande
ilvG Yersinia pestis YP_002348776
ilvG
Ralstonia solanacearum YP_003752653
ilvG
Bordetella bronchiseptica NP_887973
ilvG
Aeromonas salmonicida YP_001140066
ilvG
Stenotrophomonas maltophilia YP_001973605
acetolactato sintetasa (AHAS) subunidad II pequeña
ilvM Shigella dysenteriae YP_405398
ilvM
Dickeya dadantii YP_002989351
ilvM
Xenorhabdus bovienii YP_003470064
ilvM
Photorhabdus luminescens NP_931846
ilvM
Xanthomonas oryzae YP_199583
cetol-ácido reductoisomerasa
ilvC Buchnera aphidicola NP_240398
ilvC
Pseudomonas aeruginosa YP_002442658
ilvC
Francisella tularensis YP_001122021
ilvC
Vibrio fischeri YP_205911
ilvC
Actinobacillus pleuropneumoniae YP_001652891
dihidroxiácido deshidratasa
ilvD Citrobacter rodentium YP_003367413
ilvD
Buchnera aphidicola YP_002468875
ilvD
Xanthomonas campestris YP_001901776
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asoció con un aumento en los ácidos grasos anteiso y una disminución en los ácidos grasos iso, según muestra la Figura 16.
Los resultados de este Ejemplo muestran que aumentar el flujo de carbono hacia la ruta de la isoleucina de la síntesis de ácido graso ramificado aumenta la cantidad de ácido graso ramificado anteiso producido en la célula 5 huésped.
Ejemplo 12. Análisis de ácidos grasos.
Este ejemplo describe un método para analizar ácidos grasos, tal como los ácidos grasos producidos en células bacterianas mediante cromatografía de gases.
Las muestras para análisis se prepararon de la siguiente forma. Los cultivos bacterianos (aproximadamente 1,5 ml)
10 se congelaron en viales de vidrio de 2,0 ml y se guardaron a -15 °C hasta estar listos para su procesamiento. Las muestras se enfriaron en hielo seco durante 30 minutos y a continuación se liofilizaron durante la noche (~16 horas) hasta sequedad. Se añadió a cada vial una alícuota de 10 µl de patrón interno (trinonadecanoato de glicerol (n.° de catálogo Sigma T4632-1G)), seguido por adición de 400 µl de NaOH 0,5 N (en metanol). El vial se tapó y se vortizó durante 10 segundos. A continuación, las muestras se incubaron a 65 °C durante 30-50 minutos, se retiraron de la
15 incubadora, y se añadieron 500 µl de reactivo de trifluoruro de boro (número de catálogo Aldrich B1252). Las muestras se vortizaron durante 10 segundos. A continuación, las muestras se incubaron a 65 °C durante 10-15 minutos y se enfriaron a temperatura ambiente (aproximadamente 20 minutos). Se añadió hexano (350 µl), y las muestras se vortizaron durante 10 segundos. Si las fases no se separan, se añadieron 50-100 µl de una solución salina saturada (5 g NaCl en 5 ml de agua), y la muestra se volvió a vortizar durante 10 segundos. Al menos 100 µl
20 de la capa superior de hexano se introdujo en un vial de cromatografía de gases (CG), que se cerró y guardó a 4 °C o -20 °C hasta análisis.
La cromatografía de gases se llevó a cabo como se describe en la Tabla B siguiente. Un patrón de éster metílico de ácido bacteriano (número de catálogo Sigma 47080-U) y un patrón de éster metílico de ácido graso (número de catálogo Sigma 47885-U) se utilizaron para identificar picos en las muestras. Se utilizó una muestra de
25 comprobación con tripalmitato de glicerilo l (número de catálogo Sigma T5888-1G) para confirmar la esterificación de las muestras. Se utilizó un patrón de blanco (solamente el patrón interno) para evaluar el ruido de fondo.
Tabla B
Cromatógrafo de gases
HP 5890 GC Series II
Detector
FID 360 °C 40 ml/min Hidrógeno, 400 ml/min Aire
Gas portador
Helio
Programa cuantitativo
GC Chemstation A.09.03. (Agilent)
Columna
VF-5 ms 15 M x 0,150 mm x 0,15 mm número de catálogo Varian CP9035
Revestimiento de inyección
Gooseneck (con envoltura de lana de vidrio)
Inyector
HP 7673
Jeringa de inyección
10 ml
Modo de inyección
División 25:1
Volumen de inyección
4 ml (velocidad del émbolo = rápida; 5 bombeos de la muestra)
Lavados con disolvente antes de la inyección
2 muestras
Lavados con disolvente después de la inyección
3 tanto con acetona como con hexano
Temperatura del inyector
325 °C
Tiempo total del programa
16 minutos
27
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Claims (1)

  1. imagen1
    imagen2
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