CN102365092A - 牛蒡子苷元含量高的牛蒡子提取物及其制造方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供高含量地含有牛蒡子苷元的牛蒡子提取物及其制造方法，以及用于胰腺癌的治疗。利用牛蒡子自身存在的酶、即β-葡萄糖苷酶，将牛蒡子苷通过酶转换为牛蒡子苷元，加入乙醇进行提取、浓缩之后，进行冷冻干燥或者喷雾干燥，由此提供高浓度地含有牛蒡子苷元的牛蒡子提取物。

Description

牛蒡子苷元含量高的牛蒡子提取物及其制造方法
技术领域
本发明涉及高含量地含有牛蒡子苷元的牛蒡子提取物及其提取、制造方法。
背景技术
在日本药典第15版中规定，牛蒡子为牛蒡Arctum lappa Linne(Compositae)的果实，作为银翘散、祛风解毒汤、消风散等处方的配伍生药，其本质上归类于专门作为医药品而使用的成分。
牛蒡子含有约7％的归类于木脂素苷(lignan glycoside)的牛蒡子苷以及约0.6％的作为其苷元的牛蒡子苷元。
根据文献报道，近年来，诸如PANC-1、AsPC-1、BxPC-1、KP-3这些来源于胰腺癌的细胞即使在极度营养缺失状态下也体现出强的耐性，消除其耐性有可能成为癌治疗的全新的生化方法(专利文献1)。
另据报告称，使用胰腺癌细胞株PANC-1对能够消除低营养状态下肿瘤细胞生存能力的物质进行筛选时，发现牛蒡子苷元是有效的(非专利文献1)。
在先专利文献
专利文献1：日本特开2002-065298号公报
非专利文献
非专利文献1：S.Awale，J.Lu，S.K.Kalauni，Y.Kurashima，Y.Tezuka，S.Kadota，H.Esumi，Cancer Res.，2006，66(3)，1751-1757
发明内容
对于目前所知的牛蒡子而言，牛蒡子中的牛蒡子苷元含量较低，约为0.6％，并且难溶于水。因此，通过以往实施的热水提取法来制造高含量地含有牛蒡子苷元的提取物是极其困难的。
因此，期望提供一种能够实际向生物体给药的形态并且高含量地含有牛蒡子苷元的牛蒡子提取物。
于是，本发明的问题在于提供高含量地含有牛蒡子苷元的牛蒡子提取物及其制造方法。
为了解决上述问题，本发明人进行了深入研究，结果发现了着眼于生药自身存在的酶即β-葡萄糖苷酶，并利用该酶反应将牛蒡子苷转换为牛蒡子苷元的技术、将转换后的牛蒡子苷元有效提取的技术、以及高含量地含有牛蒡子苷元的牛蒡子提取物。
第一发明为牛蒡子苷元含量高的牛蒡子提取物，所述提取物含有3％以上的牛蒡子苷元。
第二发明为牛蒡子苷元含量高的牛蒡子提取物的制造方法，其特征在于，利用牛蒡子自身存在的β-葡萄糖苷酶，将牛蒡子苷通过酶转换为牛蒡子苷元，并进行提取。
第三发明为牛蒡子苷元含量高的牛蒡子提取物的制造方法，其特征在于，在上述任一发明中，将牛蒡子苷通过酶转换为牛蒡子苷元后，加入乙醇进行提取。
第四发明为牛蒡子苷元含量高的牛蒡子提取物的制造方法，其特征在于，在上述任一发明中，提取后浓缩，然后进行冷冻干燥或者喷雾干燥来制造。
第五发明为牛蒡子苷元高含量的牛蒡子提取物的制造方法，其特征在于，在上述任一发明中，提取后浓缩，然后添加糊精进行喷雾干燥。
根据本发明，能够提供具有抗肿瘤效果的、高含量地含有牛蒡子苷元的牛蒡子提取物。特别是，可以预期对胰腺癌患者给药后，抑制肿瘤增殖和抗肿瘤效果。并且，可以提高制造时的产率。
附图说明
图1为酶转换有效性结果的分析色谱；
图2为使用培养细胞(CAPAN-1)的细胞毒性评价；
图3为使用培养细胞(PANC-1)的细胞毒性评价；
图4为使用培养细胞(PSN-1)的细胞毒性评价；
图5为肿瘤模型动物(CAPAN-1异种移植瘤(Xenografts))中的抗肿瘤性评价；
图6为肿瘤模型动物(PSN-1异种移植瘤)中的抗肿瘤性评价；
图7为人血中牛蒡子苷元(AG)的血中浓度变化；
图8为人血中牛蒡子苷元的葡萄糖醛酸结合物(AGG)的血中浓度变化。
具体实施方式
以下针对本发明进行详细说明。所公开的条件仅为一个例子，本发明并不受其限制。
本申请发明的牛蒡子提取物经过生药切制工序、提取工序、固液分离工序、浓缩工序、干燥工序来制造。
(生药切制工序)
将作为原料的牛蒡子切制成适于提取的大小。对于作为原料的生药来讲，植物的各种部位和矿物、动物等具有各种大小、形状、硬度，需要根据其特质来进行切制。粒度越细，越能促进酶反应，提取物收率也上升，但与之相反，有时酶反应过快而导致工艺管理困难，或者在后续工序中对正确的固液分离产生影响。因此，希望本发明中使用的生药的粒度切成碎块的程度。
(提取工序)
提取工序是中药提取物粉末制造工序中对质量最为重要的工序，该工序决定中药提取物粉末的质量。本申请发明中，提取工序分为酶反应工序和有机溶剂提取工序两个阶段来实施。
(酶反应工序)
本工序是本申请发明发现的最为重要的工序，是将牛蒡子中含有的牛蒡子苷通过酶转换为牛蒡子苷元的工序。
在前一工序中准备好的1kg牛蒡子碎块中加入7升水，在20～40℃进行搅拌等，经过大约1小时。通过该工序，牛蒡子苷经酶转换为牛蒡子苷元，使牛蒡子苷元的含量显著提升。该提取方法称作冷浸提取。
并且，从反应速度的观点来看，酶反应的峰值温度为37～40℃是理想的，但是，从质量控制方面来看，反应速度过快有时也会导致工艺管理困难。
因此，在小规模情况下，希望在20～25℃进行大约1小时的提取，但是，在工业规模情况下，根据搅拌装置的能力和温度控制的能力，可适宜设定为在30℃进行30分钟、在37℃进行15分钟等。另外，由于超过60℃后会出现酶失活，因此不能使用温度在60℃以上的以往的热水加热法。
(有机溶剂提取工序)
该工序为在牛蒡子苷元成为高含量的状态下进行加热回流来对牛蒡子提取物进行提取的工序。此处，由于牛蒡子苷元具有难溶于水的性质，因此，通过添加溶剂可以使收率提高。
具体方法如下：向完成酶反应工序的溶液(牛蒡子碎块1kg+水7升)中加入3升溶剂，并进一步加热回流1小时。此处，从安全性方面出发，适宜的溶剂为乙醇。
乙醇量越多，则牛蒡子苷元的溶解度越高，收率也会随之上升，但是溶解出很多不需要的油脂类，导致浓缩工序的负荷增大，因此，可根据情况适当决定投放量。并且，该工序中的加热回流还兼备了灭菌和杀菌。
(固液分离工序)
该工序为从提取液中将提取完的生药进行分离的工序。固液分离方式有过滤法、沉降法等，工业上理想的方法使用离心分离方式。
(浓缩工序)
该工序为在干燥之前去除提取液中的溶剂的工序。采用减压浓缩法，以使得所得提取物的提取液不会进一步长时间暴露在高温下。该工序中，浓缩至如下浓度：使下一工序的干燥可以适当进行，并且在将干燥提取物粉末进行制剂的情况下可以得到适当的制剂特性。
并且，由于牛蒡子苷元具有难溶于水的特性，因此附着在干燥工序的制造装置内的量很多，最终收率大幅降低。而通过添加糊精，可以防止附着在制造装置上。相对于浓缩液的固体成分，添加量为20％左右为宜。
(干燥工序)
该工序为使提取出的提取物成为粉末状的工序。已知的干燥法有冷冻干燥和喷雾干燥，通常如果为实验室水平，则采用前者，而如果为大批量生产水平，则使用后者。
通过上述制造工艺，可以得到牛蒡子苷元含量高的牛蒡子提取物。
(牛蒡子提取物粉末调配制剂)
通过上述操作得到的提取物粉末能够以其原状直接使用，但是通常来讲，加入在食品及/或医药品中使用的通常的赋形剂(例如结晶纤维素、蔗糖脂肪酸酯、乳糖等)，通过例如干式造粒法或湿式造粒法造粒并进行制造，通过该种操作得到的造粒物可以直接使用，还可以将它们作为进一步采用压片机的压缩成型物来使用。
另外，由于提取物粉末具有特有的涩味，因此从服用上讲，优选制成将提取物粉末进行掩蔽的制剂，也可以制成通过包覆剂进行包覆的薄膜包衣剂。另外，从成分稳定性的观点出发，或者作为可以简单摄取的形态，还可以将上述提取物粉末或者上述造粒物直接填充在硬胶囊或者软胶囊中来摄取。
(试验)牛蒡子苷元的酶转换有效性试验
在提取工序的酶反应工序(冷浸提取)中，实施牛蒡子苷是否经酶转换成牛蒡子苷元的评价。
比较例1
取牛蒡子粗粉(过18号筛)0.1g，加入50％甲醇50mL，加热1小时后，进行过滤。
试验例1
取牛蒡子粗粉(过18号筛)0.1g，加入25mL水，振荡混合，在室温(20℃)放置1小时后，加入25mL甲醇，进行过滤。
在以下分析条件下，通过HPLC法对试验例1和比较例1得到的浓缩液进行测定。
〔牛蒡子苷元含量测定方法〕
色谱柱：YMC-Pack ProC18 AS-307-3(3μm，4.6mm ID×7.5cm)
柱温：30℃
检测：UV280nm(图1中每组色谱图上方的那条色谱流出曲线)，UV230nm(图1中每组色谱图下方的那条色谱流出曲线)
流速：0.8mL/min
进样量：5μL、10μL
流动相：A液/0.05M磷酸二氢钠溶液∶乙腈混合液(5∶1)；
B液/0.05M磷酸二氢钠溶液∶乙腈混合液(1∶1)
梯度洗脱条件：0～10min/B液20％、10～25min/B液40％
[比较例1]如表1所示，生药原料中牛蒡子苷及牛蒡子苷元的含量分别为6.88％及0.58％，牛蒡子苷元/牛蒡子苷含量比(以下称作AG/A)为0.08。
[试验例1]如表1所示，牛蒡子苷及牛蒡子苷元含量分别为0.15％及3.80％，AG/A比为25.33，牛蒡子苷元含量明显上升。另外，如图1所示，生药原料中，牛蒡子苷基本上定量地转换成牛蒡子苷元。
表1
实施例
实施例1(通过切碎、冷浸提取制造牛蒡子提取物)
将300g牛蒡子碎块加入1.5L水(22℃)中并搅拌1小时后，进一步加热回流1小时。同样进行过滤，用0.5L水进行清洗，将合并后的提取液(1.5L)冷冻干燥。
如表2所示，对生药碎块进行冷浸提取后的提取物中，牛蒡子苷及牛蒡子苷元含量分别为10.1％及4.8％，AG/A比为0.48。
实施例2(通过切碎、冷浸提取、添加乙醇制造牛蒡子提取物)
将200g牛蒡子碎块加入1L水(22℃)中并搅拌1小时后，加入0.45L乙醇并进一步加热回流1小时。使用4张丝网(100目金属网)进行过滤，用30％乙醇0.5L进行清洗，将混合后提取液(1.5L)冷冻干燥。
如表2所示，对生药切碎物进行冷浸提取后的提取物的牛蒡子苷及牛蒡子苷元含量分别为13.3％及11.4％，AG/A比为0.86。与实施例1相比，牛蒡子苷元含量大幅上升，这可以推测是由于通过添加乙醇溶解了牛蒡子苷元。
实施例3～6(通过中等规模、喷雾干燥制造牛蒡子提取物)
将2kg牛蒡子碎块加入14L水(37℃)中并搅拌1小时后，加入6L乙醇并进一步加热回流1小时。对该液体进行离心分离，将得到的提取液大约16L减压浓缩，添加相对于提取物固体成分0～50％的糊精，进行喷雾干燥。
由于牛蒡子苷元难溶于水，因此在喷雾干燥工序中由于附着所致的损失很大，提取物收率降至5％(实施例3)。
因此，通过添加糊精(实施例3～6)可以防止附着在设备上，制备出流动性优异的喷雾干燥提取物。提取物收率从5％上升至20％左右。
作为添加量，添加相对于浓缩液的固体成分的20％左右为宜。
实施例7(通过中等规模、喷雾干燥制造牛蒡子提取物)
将2kg牛蒡子碎块加入14L水(22℃)中并搅拌1小时后，加入6L乙醇并进一步加热回流1小时。对该液体进行离心分离，将得到的约16L提取液减压浓缩，添加相对于提取物固体成分20％的糊精，进行喷雾干燥。
牛蒡子苷及牛蒡子苷元含量分别为7.1％及6.3％，AG/A比为0.89，可以再现实验室中的结果，得到大量的提取物。
实施例8(通过工业规模、喷雾干燥制造牛蒡子提取物)
将80kg牛蒡子碎块加入保温在30℃的560L水中并搅拌30分钟后，加入265L乙醇并升温至85℃，进一步加热30分钟来提取。对该液体进行离心分离，得到处理后的提取液。合并重复两次该操作所得提取液，减压浓缩，添加相对于提取物固体成分20％的糊精，进行喷雾干燥。
牛蒡子苷及牛蒡子苷元含量分别为6.8％及5.9％，AG/A比为0.87，可以再现中等规模时的结果，得到31.5kg提取物粉末(含有20％糊精)。
比较例2(通过切碎、热水提取制造牛蒡子提取物)
将300g牛蒡子碎块(过8.6号筛)加入1.5L热水(80℃)中并加热回流1小时后，在热的时候使用4张丝网(100目金属网)进行过滤。用0.5L水进行清洗，将合并后的提取液(1.4L)冷冻干燥。
将该生药原料使用通常的水作为提取溶剂，进行加热提取所得热水提取的提取物中，牛蒡子苷及牛蒡子苷元含量分别为29.2％及0.92％，AG/A比为0.03。由于AG/A比率进一步降低，因此可以确认牛蒡子苷元难以转移至提取物。
表2
Figure BDA0000095416980000081
实施例9(牛蒡子提取物粉末调配颗粒剂)
(1)实施例8的牛蒡子提取物粉末        33.3％
(2)乳糖                             65.2％
(3)羟丙基纤维素                     1.5％
总计：                              100％
(制造方法)
依据《日本药典》制剂总则及颗粒剂项目制造颗粒剂。也就是说，采用上表中记述的、从牛蒡子提取物粉末到羟丙基纤维素为止的成分制成颗粒状，将其以每1.5g装填在铝层压膜中，得到每包中含有0.5g牛蒡子提取物粉末的实施例9的颗粒剂。
实施例10(牛蒡子提取物粉末调配片剂)
(1)实施例8的牛蒡子提取物粉末    37.0％
(2)结晶纤维素                   45.1％
(3)羧甲基纤维素钙               10.0％
(4)交联聚维酮                   3.5％
(5)含水二氧化硅                 3.4％
(6)硬脂酸镁                     1.0％
总计：                          100％
(制造方法)
依据《日本药典》制剂总则、片剂项目制造片剂。也就是说，采用上表中记述的从牛蒡子提取物粉末到硬脂酸镁为止的成分得到实施例10的片剂。
试验例2(采用培养细胞的细胞毒性评价)
(实验方法)
在96孔板中接种胰腺癌细胞株CAPAN-1、PANC-1以及PSN-1，在通常营养状态的DMEM培养基中，在37℃、5％CO2/95％空气状态下，预培养24小时。用PBS清洗细胞后，将提取方法不同的提取物(图中：实施例2以及比较例2)在保持牛蒡子苷元浓度一定的情况下添加到通常营养状态的DMEM培养基(图中：末尾为D)以及营养缺失培养基的NDM培养基(图中：末尾为I)中得到的物质加入各个孔，进行24小时的培养。再次用PBS清洗细胞，加入含有10％WST-8的DMEM培养基100μL并反应2小时，用酶标仪测定450nm的吸光度，对细胞的生存状态进行评价。
评价的结果为：如图2～4所示，牛蒡子提取物对营养缺失培养基中的胰腺癌细胞株均显示出显著的选择性细胞毒性。另外，对于其效果，也明确了即使是提取物，也具有依赖于牛蒡子苷元浓度的、与精制牛蒡子苷元同等的抗肿瘤效果。另外，作为牛蒡子苷元(图中：AG)前体的牛蒡子苷(图中：A)在这些条件下均未观察到抗肿瘤活性。
试验例3(肿瘤模型动物中抗肿瘤性的评价)
(实验方法)
在作为供体的裸小鼠(BALB-cAJ nu/nu，日本クレァ)的背皮下接种人胰腺癌细胞株CAPAN-1或者PSN-1，并将得到的供体小鼠的肿瘤块移植到受体小鼠的背皮下，由此得到肿瘤模型动物。牛蒡子苷元(AG)、牛蒡子苷(A)以及牛蒡子提取物(实施例2)以10mg/ml的浓度溶解于DMSO，将得到的物质用生理盐水稀释，对每只小鼠经口向胃内给药50μg，每周5次。通过经时性地测量背皮下肿瘤块的大小来评价抗肿瘤性。
开始给药后的一个月内，与对照相比，可以确认药剂给药组的显著的肿瘤增殖抑制效果。另外，在精制牛蒡子苷元的给药组中也得到了抗肿瘤效果，但是同时含有作为前体的牛蒡子苷的牛蒡子提取物(实施例2)具有更强的抗肿瘤效果(图5、6)。
试验例4(血中浓度)
(实验方法)
以健康男性志愿者1名为对象，在服用实施例9的颗粒剂2包(牛蒡子提取物粉末1g)后，经时地于服用前30分钟以及服用后0.5小时、1小时、1.5小时、2小时、3小时、4小时、7小时、24小时从静脉中采取大约5mL的血液，得到血浆样本。向通过该操作得到的血浆样本500μL加入0.1mol/L磷酸二氢钠溶液500μL以及内标溶液(IS)100μL。将其移至试验管，加入甲醇6mL并振荡混合后，进行离心分离，收集甲醇层，在减压下干燥固化，向残留物中加入70％乙腈250μL，制作试样溶液。对其通过采用下述条件的高效液相色谱法(HPLC)进行测定，根据相对于内标物质的峰高比，分别计算出牛蒡子苷元(AG)和牛蒡子苷元的葡萄糖醛酸结合物(AGG)的浓度。
(HPLC条件)
色谱柱：YMC-pack ODS-A-312
流动相：含磷酸0.2％的0.1mol/L磷酸二氢钠溶液/乙腈混合液(73.5∶26.5)
柱温：40℃
流速：1.0mL/min
检测器：UV210nm
进样量：10μL
内标溶液：将尼泊金异丙酯10mg溶于50％甲醇得到50mL溶液，向1mL该液体中加入50％甲醇得到100mL溶液，作为内标溶液
(试验结果)
人血浆中的AG以及AGG的浓度变化分别表示在图7及图8中。基于图7及图8明确可知，通过服用本发明的牛蒡子提取物粉末，血中检测出的主要成分为AGG。AG浓度(GAG)在1小时和2小时检测出双峰性的峰值，最大浓度(Cmax)为0.15μg/mL。另外，根据从血中消失缓慢这一情况，可认为存在肠-肝循环的影响。确认了AGG的血中浓度(CAGG)在1.5小时的峰值，Cmax为10.7μg/mL。另外，即便24小时后从血中消失也较缓慢，为3.6μg/mL，同样可认为存在肠-肝循环的影响。如上所述，通过服用本发明的牛蒡子提取物粉末，血中可以长时间维持AG及AGG的浓度，因此可预期在生物体内的效果。

Claims (5)

1.一种牛蒡子苷元含量高的牛蒡子提取物，所述提取物含有3％以上的牛蒡子苷元。
2.一种牛蒡子苷元含量高的牛蒡子提取物的制造方法，其特征在于，利用牛蒡子自身存在的β-葡萄糖苷酶，将牛蒡子苷通过酶转换为牛蒡子苷元，并进行提取。
3.如权利要求2所述的牛蒡子苷元含量高的牛蒡子提取物的制造方法，其特征在于，将牛蒡子苷通过酶转换为牛蒡子苷元后，加入乙醇进行提取。
4.如权利要求2或3所述的牛蒡子苷元含量高的牛蒡子提取物的制造方法，其特征在于，提取后浓缩，然后进行冷冻干燥或者喷雾干燥来制造。
5.如权利要求2～4中任一项所述的牛蒡子苷元含量高的牛蒡子提取物的制造方法，其特征在于，提取后浓缩，然后添加糊精进行喷雾干燥。
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