CN101090642A - 生产纯新蛇菊苷a的高收率方法 - Google Patents

生产纯新蛇菊苷a的高收率方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种从商业可得的甜菊(stevia rebaudiana)原材料中，分离和纯化新蛇菊苷A(“Reb”)的高生产率、高纯度和高收率系统和方法，该新蛇菊苷A具有适于所有商业用途的可接受水溶性。本发明也提供一种基于给定的一批甜菊原材料的性质，最大化99+％纯度Reb A收率的方法。通过本发明产生的Reb A是水溶性的，没有迄今为止与新蛇菊苷增甜剂有关的苦味，无热量，且适于用作试剂以及用作口服品中的成分，例如，作为增甜剂、香味增强剂和香味改进剂。

Description

生产纯新蛇菊苷A的高收率方法
[01]相关申请
[02]本申请要求了在美国专利商标局于2004年10月18日提出的序列号60/620,280和于2005年5月6日提出的序列号60/678,653的两项临时专利申请的权益，其发明名称为“High Yield Method of ProducingRebaudioside A”。
[03]背景技术
[04]技术领域
[05]本发明属于从植物甜菊(Stevia rebaudiana，L.Bertoni)(“甜菊(Stevia)”)的粗提取物中纯化新蛇菊苷A(在本文中也称为“RebA”和“RA”)的技术领域。Reb A是连同许多其他糖苷、非糖苷二萜(sterebins)和其他化合物发现于甜菊(Stevia)提取物中的双萜糖苷。Reb A是甜菊中最甜味道的糖苷(在食物中使用的增甜剂浓度下大概是蔗糖甜度的250至450倍)，并且作为无热量增甜剂具有巨大的商业潜力。一般而言，除新蛇菊苷A之外，甜菊糖苷(Stevia glycosides)都具有不期望的余味(一些具有苦的余味)，这通常限制了这类非Reb A糖苷作为增甜剂的应用。而且，甜菊提取物中的非糖苷二萜(sterebins)(一类通常称为“黄油(yollow oil)”的双萜化合物)具有非常苦的味道，即使在极小浓度下也是如此。简言之，技术领域和技术问题是从粗甜菊提取物中分离99+％纯度的Reb A，特别是在工业规模下；这样的纯度消除了所有目前可得的甜菊增甜剂所具有的苦味或异味。
[06]相关技术
[07]六种新蛇菊苷(A至F)、蛇菊苷(来自野生型甜菊的提取物中的主要糖苷)、杜尔可苷(dulcosides)和非糖苷二萜(sterebins)难于在溶液中分离。具体而言，六种新蛇菊苷都有相同的双萜骨架并且仅在糖苷部分上不同；除Reb A之外，所有新蛇菊苷都具有一定程度的苦余味。许多专利和期刊文章描述了对生产纯(即99+％纯度)新蛇菊苷A所做出的努力，但是迄今为止，还没有报告在实验室中生产纯Reb A的方法，更不用说商业量的生产。很多报告的生产方法需要使用离子交换柱或气体，其经济学破坏了饮料、包装食品、烘焙食品、糖果、个人护理产品、药物和其他行业所需的增甜剂扩大至商业数量。
[08]很多从甜菊中提取和纯化双萜糖苷的方法使用复杂的粗提取物处理过程，并且要求原材料中具有高浓度的新蛇菊苷A，然而却得到低收率和低纯度(＜95％)的新蛇菊苷A。一些方法使用链烷醇和/或含水链烷醇作为溶剂。例如，在Kitazume等的美国公开专利申请第2003/0138538 A1号的第49至53段中，描述了一种方法，其中利用甲醇、含水甲醇或含水乙醇(但未使用回流工艺)和柱纯化来处理甜菊的植物或干叶，以产生含有按重量计最小为40％新蛇菊苷A的提取物，并且其中新蛇菊苷A与蛇菊苷之比为1.5∶1。在Kitazume方法中，如果植物原材料不是按重量计40％新蛇菊苷A，并且不具有1.5∶1的新蛇菊苷A与蛇菊苷之比(“Kitazume阈值纯度(Kitazume ThresholdPurity)”)，则必须使用柱纯化或重结晶，以生产支持Kitazume专利申请目的(利用β-1，4-半乳糖转移酶在新蛇菊苷A上进行β-1，4-半乳糖的取代)所必需的足够纯度的新蛇菊苷A。在Kitazume方法中优选的原材料是具有至少70％Reb A含量的甜菊提取物。在Kitazume方法中，当利用重结晶来生产用于转移酶反应的Kitazume阈值纯度的新蛇菊苷A时，甜菊提取物在亲水有机溶剂如甲醇或乙醇中被溶解至饱和，在溶剂中无水，并将溶液浓缩或冷却，然后过滤收集沉淀，一种较高浓度的新蛇菊苷A；Reb A纯化的工艺参数例如加热速率和冷却速率、过滤规程等没有被公开。Kitazume也没有公开通过重结晶产生的Reb A的纯度，仅仅公开当原材料低于Kitazume阈值纯度时可以采用重结晶。重要的是，在Kitazume方法中，所有Reb A材料是利用任何结晶或重结晶步骤之后的阳离子交换树脂和阴离子交换树脂步骤生产的(第50段)。未公开高于91.3％(实施例3)的Reb A纯度，也没有公开Kitazume的Reb A的溶解度。事实上，Kitazume没有公开实施例中使用的91.3％纯度Reb A是否是利用重结晶或仅通过柱纯化生产的。具有91.3％纯度的Reb A对于转移酶反应是可以接受的，但其对于商业应用在食品和饮料中是不可接受的。
[09]授予Payzant等的美国专利第5,962,678号描述了从甜菊植物材料中七步提取和纯化Reb A，包括通过两个离子交换柱处理和从甲醇溶液中沉淀出来。为纯化Reb A，在从第二离子交换柱中用甲醇去除混合的甜糖苷之后，干燥所收集的洗脱液。在甲醇溶液中回流干燥固体然后冷却该溶液之后，蛇菊苷沉淀，并通过过滤获得。然后浓缩滤液(大概通过蒸发溶剂)并冷却，新蛇菊苷得以沉淀。在Payzant的实施例5中的方法被描述为生产具有纯度可达98.6％的新蛇菊苷A。然而，利用80％纯度Reb A甜菊提取物作为原材料，本发明的发明人重复Payzant的Reb A纯化的重复努力失败了；典型的结果是按重量计小于5％的Reb A收率和具有显著苦余味的无定形晶体。通过第三方进行的重复Payzant的尝试也失败了(未公布数据)。在重复实施例5的尝试中，直到从甲醇溶液中将热移走40小时以上之后，Reb A的沉淀才开始。实施例5中的Payzant纯化方法显然需要通过遵循Payzant权利要求1中的步骤(利用甲醇的七步工艺)而非通过获取商业可得的甜菊提取物而得到的Reb A原材料。Payzant方法因此通常既不适用于甜菊提取物，对Reb A的商业生产也不能规模化。
[010]除了不可重复之外，Payzant没有教导使用含水溶剂。Payzant利用含水甲醇作为回流溶剂来纯化蛇菊苷。在实施例2中，Payzant陈述到：“因为甜糖苷被从水中吸收到XAD-7树脂上，所以存在着包含在该树脂内或该树脂表面上的水，并且此种水是用甲醇去除的。进行干燥的唯一原因是去除此种水。如果少量的水不在那里，或者如果其是通过一些其他方法被去除的，那么甲醇可以通过蒸发至某种程度被去除，然后甜糖苷将从溶液中结晶。”在实施例3中，Payzant陈述到：“通过无水或者尽可能没有水，结晶收率被最大化，并且结晶时间被最小化。例如，在该初始结晶中，甲醇中0.5％水将显著降低收率。如果期望，通过利用在下面实施例5中所提出的纯化技术，蛇菊苷可以被进一步纯化。”在实施例5中，Payzant公开了一种纯化，其中在按质量计86.67％甲醇和13.33％水的溶剂中回流含有90.2％Reb A(然而，在实施例3中，最终产物具有7.9％Reb A含量)的甜菊提取物；该步骤据称产生98.6％Reb A；没有公开加热速率、冷却速率、搅拌和温度。Payzant提到，实施例5中所使用的提取物“并非来自实施例4”，但是在别处公开了仅仅达到7.9％纯度Reb A。Payzant在实施例5中陈述了将水包括在溶剂中“在实验室中是便利的”，但是“在商业规模上无水溶剂可能更便利”。在实施例3和5中，Payzant明白地教导没有使用含水链烷醇溶剂进行甜菊苷的纯化。Payzant没有公开实施例5中使用的90.2％纯度Reb A是如何得到的，即，将Reb A纯度从7.9％提高到90.2％的方法是不能实施的，因此实施例5是不能实施的。Payzant也没有公开用于测定所要求保护的Reb A纯度的方法。在目前供应自Chromadex(www.chromadex.com)或Wako(www.wako-chem.co.jp)的Reb A参比标准下，Payzant要求保护的纯度被认为是夸大的。如上所述，当现有的商业品质的甜菊提取物被用作原材料时，Payzant的Reb A纯化方法是失败的。纯化Reb A的Payzant方法需要首先在甲醇回流中沉淀出蛇菊苷，因此Payzant应当被限定作为参考文献。将忽略90.2％Reb A纯度如何获得撇开不谈，在Payzant方法中，缺乏参比标准以及使用无水溶剂的指示，工艺复杂性，低生产量和低收率意味着，其不可能被用作工业方法。而且，在分离Reb A中使用甲醇回流，具有最终产物中存在甲基化污染物的伴随风险，对获得具有食品产品政府标准的“通常被认为是安全的(generally recognized as safe)”身份可能是一个障碍。[011]生产较高纯度新蛇菊苷A的现有技术使用离子交换柱和其他低生产量步骤的复杂精细顺序。由Kitazume、Payzant及其他人使用的现有方法不能产生99+％纯度Reb A，无论是通过结晶、重结晶、柱纯化还是它们的组合。迄今为止，存在着未解决的问题，其引起在Reb A最终产物中存在不可接受的高水平污染。在包括新蛇菊苷A在内的甜菊苷的工业生产中，现有技术典型地开始于甜菊植物材料，并生产具有40％至90％纯度Reb A、混合有各种甜菊苷和“黄油”的甜菊提取物；这样的提取物一般被称为“甜菊提取物粉”或“甜菊提取物”，而在本文中被称为“甜菊原材料”。甜菊原材料(Stevia starting material)在附图中被缩写为“SSM”。缺乏生产99+％纯度新蛇菊苷A的工业方法意味着，甜菊增甜剂现今被典型地应用(例如在腌制(pickling)中)，其中，其他食用香料掩盖了源自甜菊增甜剂中残留污染物的苦或涩余味。由其他甜菊化合物引起的甚至1％的污染可在Reb A增甜剂中产生显著的苦余味，这导致Dobberstein在美国专利4,612,942中将口服成分中甜菊苷的使用限制在一定程度上(“甜度水平阈值(sweetness levelthreshold)”)，这改变了成分的味道，但是不能被感觉到是甜的。如本文所用，术语“口服成分(orally consumable composition)”是指与人或动物的口接触的物质，包括被送入口中并随后从口中吐出的物质以及被饮用、吃、吞咽或其他方式摄取的物质。对可以增甜、改良或提高口服成分如食品、吸烟成分、咀嚼成分、口用卫生成分和医药成分的味道的无热量材料存在需要，从而改进或改变它们的感官感觉。
[012]考虑到用在食品、饮料、医药、烟草产品、糖果等中的无热量天然增甜剂的庞大市场，长期以来，已经探索一种获得99+％纯度新蛇菊苷A的方法。99+％纯度Reb A可以用作试剂，用作食品和饮料中的成分，用作极佳的增甜剂以及用作辅助增甜剂(co-sweetener)。对于以下所述存在未能满足的需求：(1)在实验室中生产100％纯度、水溶性新蛇菊苷A的方法，和(2)生产适合用作试剂、用作食品和饮料中的成分、用作极佳的增甜剂以及用作辅助增甜剂的工业量的99+％纯度、水溶性新蛇菊苷A的方法。将要表明，与Payzant的教导相反，在回流溶剂中具有大的含水率对生产99+％纯度Reb A及避免所有其他研究者所报告的污染是必需的。
[013]发明内容
[014]本发明要解决的主要技术问题和主要目的是利用商业可得的甜菊原材料，提供一种分离和纯化Reb A(新蛇菊苷A)的高生产率、高纯度和高收率的系统和方法，该Reb A具有用于所有商业用途的可接受水溶性。本发明要解决的第二个技术问题是基于一批给定的甜菊原材料的性质，最大化99+％纯度Reb A的收率。针对所述技术问题的方案必须是实验室规模量以及工业生产容量可用的。工业生产包括每批处理数百或数千千克的甜菊原材料。本文所公开的本发明发明步骤的量化证据是，本发明的Reb A最终产物具有比最高可得纯度新蛇菊苷A的现有主要分析标准更高的纯度(即Chromadex参比标准，目录号ASB-00018226，www.chromadex.com)；Chromadex标准具有98.7％的认证纯度。纯度大于所提到的Chromadex参比标准的Reb A标志着在此所公开的本发明有可能得以利用，因为没有其他公开的方法获得这样的纯度。通过本发明所生产的更高纯度的Reb A源于使用了“原材料分析”和“选择的EtOH溶剂”，如下所述。未改动的词语“乙醇”是指用1％乙酸乙酯变性的乙醇。短语“无水乙醇”指100％没有变性的无水乙醇。“EtOH”是指由乙醇和水组成的溶剂；乙醇和水的百分比分别表示为“xxEt/xxW”。例如，由92％乙醇和8％水组成的溶剂将被表示为“92Et/08W”溶剂；在92％乙醇和8％水中的固体的混合物将被表示为“92Et/08W混合物”。“Reb A”和“RA”都表示新蛇菊苷A。术语“RAxx”是指其新蛇菊苷A含量大约为xx百分比的材料。例如，RA80是指其新蛇菊苷A含量大约为80％的材料。术语“RAxx.yy”是指其新蛇菊苷A含量为xx.yy百分比的材料。例如，RA81.58是指其新蛇菊苷A含量为81.58％的材料。
[015]在本发明的实验室实施方式中，甜菊原材料与溶剂——该溶剂包括按体积计4％至15％之间的水和剩余百分比的乙醇——混合，回流，然后在搅拌洗涤之后过滤。“水”是指可饮用水，并且优选是符合膳食补充剂生产用适用政府标准的过滤水。取决于上下文，“固体”是指中间产物，即通过过滤回流液或洗涤混合物而得到的保留物，或最终产物。短语“100％纯Reb A”被定义在实施例的HPLC方法部分。本文所述的原材料和最终产物的Reb A纯度是利用Reb A的ChromaDex参比标准测定的，如在实施例的HPLC方法部分所述。“生产者”是指加工甜菊原材料以生产纯化Reb A的实体。“较高品质甜菊原材料”是指具有大约85％或更高Reb A含量的甜菊原材料。“较低品质甜菊原材料”是指具有小于大约85％Reb A含量的甜菊原材料。如下所定义，一个或多个回流阶段和搅拌洗涤阶段被用于获取99+％纯度Reb A最终产物。利用RA90和更高Reb A纯度的甜菊原材料，单回流阶段和单搅拌洗涤阶段的结合典型地产生99+％纯度Reb A。对于给定的甜菊原材料，通过使用具有任选质量与溶剂比分析的原材料分析，最终产物RebA纯度和Reb A收率可以被定为目标并且可以得到，同时将操作成本降为最小，如下所述。在最小的操作成本下获得指定的最终产物Reb A纯度(“目标纯度”)被称为“工艺优化”。
[016]在选择的EtOH溶剂中单阶段回流，之后在无水乙醇中进行一次或两次搅拌洗涤典型地由较高品质甜菊原材料产生99+％纯度RebA。之前从未实现这样的Reb A高纯度，并且使用非常规的方法(Payzant教导：应当避免将水加入回流溶剂中)来实现这样的纯度根本不同于现有技术。并非从工艺中消除水，利用原材料分析而确定的较大的、认真控制的水量在回流阶段是必需的。
[017]达到目标纯度所需的回流阶段和搅拌洗涤阶段的数目反映出给定的一批甜菊原材料中污染物的水平和类型。在本发明的工业实施方式中，就时间、劳动力、试剂、加热和冷却成本而言，回流阶段比搅拌洗涤阶段昂贵得多。对于给定的一批甜菊原材料的工业方法典型地平衡了目标纯度、收率和生产成本。
[018]在本发明中，典型的回流阶段对于每4ml选择的EtOH溶剂而言使用1克甜菊原材料。一般而言，甜菊原材料的Reb A含量越低，(i)回流溶剂中所需的含水率越高(在4％至15％范围内)，以便生产99+％纯度Reb A，和(ii)将需要一个以上回流阶段的可能性越大，以便生产99+％纯度Reb A最终产物。然而，回流溶剂中的含水率越高，以及所使用的回流阶段越多，Reb A的收率越低。和回流阶段形成对比，搅拌洗涤阶段优选使用无水乙醇作为溶剂。变性乙醇或其他链烷醇可以被用作搅拌洗涤阶段中的溶剂；在搅拌洗涤阶段使用变性乙醇或无水乙醇避免了与其他链烷醇有关的食品安全问题。
[019]在本发明的一个实验室实施方式中，将RA89.95甜菊原材料(按重量计大约为90％Reb A的甜菊原材料在本文中被称为“RA90原材料”；同样按重量计大约为80％Reb A的甜菊原材料在本文中被称为“RA80原材料”；同样按重量计大约为70％Reb A的甜菊原材料在本文中被称为“RA70原材料”；等)在1克RA90原材料对4ml所选择EtOH溶剂的比率下溶解在94％乙醇、6％水中。选择的EtOH溶剂也被称为“回流溶剂”。甜菊原材料与回流溶剂的混合物被称为“回流混合物”。在初始回流的情况下，“原材料”是指甜菊原材料，而在起初回流阶段之后的阶段的情况下，“原材料”是指通过过滤回流混合物或搅拌洗涤物而得到的保留物。将RA90原材料与回流溶剂的混合物在配备有冷凝器的回流装置中在剧烈搅拌下从室温加热到大约79℃至80℃(无水乙醇的沸点是79℃；回流混合物的沸点通常不超过80℃)。在一个大气压下，当增加回流混合物温度并保持在79℃至80℃之间时，混合物变为乳白色并且是粘性的，因为新蛇菊苷A的晶体开始沉淀。一般将混合物回流1小时，然后过滤(在实验室实施方式中，纸或玻璃纤维过滤介质，例如，Whatman GF/A滤纸(Whatman，Florham Park，NJ))，并将湿固体在1克湿固体对4ml洗涤溶剂——通常为无水乙醇——的比值下置于100％无水乙醇中，以产生“洗涤混合物”。将该洗涤混合物在室温下搅拌15分钟。搅拌之后，将洗涤混合物经滤纸过滤，并将保留物固体在80℃的烘箱中干燥。该干燥的固体是100％RebA，并且表示回收了原材料中大约81％的Reb A。最终产物在水中具有大约33％的溶度(在3ml最终体积中为1克)，这适合所有商业用途。
[020]在本发明的工业实施方式中使用的装置典型地包括一个或多个夹套式不锈钢压力容器(“罐”或“混合罐”)，每一个典型具有数千升容量，其被装配用于混合(例如，装备有柔韧的刮桨)、加热(在夹套中的蒸汽)和冷却(夹套中的冷却水)，并装备有入口和出口路径和回流冷凝器。另外的装置包括一种或多种离心滗析器(典型地为连续流动模式)；泵；阀；收集罐；互相连接混合罐、滗析器(一个或多个)和所述装置其他元件的管，以及优选包括过程控制系统。本发明的工业方法使用与实验室方法相同的参数，只是用离心滗析器来代替滤纸，原材料和溶剂的质量和体积分别大得多(主要由罐体积限定)，在回流之后典型地使用冷却水，以及在最后回流或搅拌洗涤阶段之后，使用“乙醇清除和干燥”阶段，在该阶段将滗析器保留物溶解在80℃水中并搅拌，以便在喷雾干燥之前蒸发残留乙醇。工业方法的最终产物典型为99+％纯度Reb A，其在水中具有大约33％的溶度。该Reb A纯度水平在甜菊加工中是一个突破，特别对于在工业量中。
[021]使用一个以上回流阶段和搅拌洗涤阶段，如下定义，利用本发明，可以加工较低品质甜菊原材料，生产99+％纯度Reb A的最终产物。使用较低品质甜菊原材料降低了收率且需要更多回流以获得99+％Reb A纯度最终产物。
[022]附图简述
图1显示了本发明实验室实施方式的总图。
图2显示了实验室方法回流阶段中的步骤。
图3显示了实验室方法搅拌洗涤阶段中的步骤。
图4显示了原材料分析的第一半部分。
图5显示了原材料分析的第二半部分。
图6显示了在附加回流阶段中的步骤。
图7显示了本发明工业实施方式中所使用装置的总图。
图8显示了工业方法回流阶段中的步骤。
图9显示了工业方法搅拌洗涤阶段中的步骤。
图10显示了工业方法的乙醇清除和干燥阶段中的步骤。
图11显示了质量与体积比分析的第一半部分。
图12显示了质量与体积比分析的第二半部分。
[023]优选实施方式详述
[024]本发明包括(i)一种利用甜菊原材料提供100％纯新蛇菊苷A的高纯度、高收率实验室方法；(ii)一种直接源自实验室方法的高生产量、高纯度、高收率工业方法，其利用甜菊原材料提供工业量的99+％纯度新蛇菊苷A；(iii)通过这些方法制作的新蛇菊苷A；(iv)此类新蛇菊苷A的用途；和(v)一种基于给定的一批甜菊原材料的性质来最大化目标纯度Reb A收率的方法。
[025]实验室方法的实用性在于生产用于研究、分析和合成目的的100％纯的、水溶性Reb A的能力。工业方法的实用性在于生产用于饮料、食品、烘焙、糖果、个人护理产品、药物、烟草和其他行业以及用于研究、分析和合成的、工业量的(例如数千千克)99+％纯度RebA的能力。作为极低浓度的纯Reb A的感知甜度的结果，对于大部分应用，包括饮料，1％以下的Reb A水溶性是可以接受的(浓缩物需要较高的溶度，但足在由本发明提供的最终产物溶度的范围内)。
[026]与现有方法相比，利用本发明，生产Reb A显著地不昂贵，即使本发明生产的Reb A纯度高得多。与现有方法相比，本文所提供的基于给定的一批甜菊原材料最大化99+％纯度Reb A收率的方法能够在生产成本上实现甚至更大的节省。具有40％以上纯度Reb A含量的甜菊原材料优选用于本发明；RA40以下品质的甜菊原材料通常所需的附加回流阶段一般使得该方法在财政上是不利的，并且具有40％以上纯度Reb A的甜菊原材料易于得到。RA40和更高的甜菊原材料得自位于中国山东成武县大田集镇的山东成武奥星甜菊制品有限公司(ShandongChengwu Aoxing Stevia Production Co.，Ltd.)以及本领域已知的其他来源。甜菊原材料典型地不超过RA80；然而，少数商业可得的、显著更昂贵的甜菊提取物，如由日本大阪Joto-ku的Morita Kagaku Kogyou，Ltd.以产品名Rebaudio出售的甜菊提取物具有大约90％Reb A含量。在本发明的回流和搅拌洗涤阶段，由于成本原因，一般优选变性乙醇，特别是用于本发明的工业实施方式；在美国，无水乙醇比变性乙醇贵大约10倍，但是在变性乙醇和无水乙醇基本具有相同成本的地方，无水乙醇比变性乙醇优选用作单独溶剂以及用作回流溶剂组分。含有除1％乙酸乙酯的添加剂的变性乙醇(例如用5％异丙醇变性的乙醇)可以用在本发明中，但是典型地导致最终产物的收率和纯度减小。可以使用除乙醇之外的链烷醇，但是使用乙醇避免了与其他链烷醇有关的食品安全问题。
[027]图1显示了本发明总图。使用较高品质甜菊原材料的基本实施方式包括三或四个阶段：EtOH配制阶段、回流阶段、任选的搅拌洗涤阶段(一般为生产99+％纯度Reb A所需)和乙醇清除及干燥阶段。在使用较低品质甜菊原材料的实施方式中，通常在搅拌洗涤阶段之前加入第二回流阶段，以最大化Reb A最终产物的纯度。是否在第一回流之后紧跟单个搅拌洗涤阶段或更多回流阶段(具有或没有中间和最终搅拌洗涤阶段)的决定点示于图1(和某些其他图)中，并且被表示为“重复决定(Iteration decision)”。EtOH配制阶段总是包括原材料分析，并且可以包括质量与溶剂比分析。术语“原材料分析(starting materialassay)”包括回流阶段或搅拌洗涤阶段之后对湿固体保留物的分析；甜菊原材料是第一回流阶段的原材料；湿固体保留物是第一回流阶段之后阶段的原材料。原材料分析在附图中被缩写为“SMA”。
[028]因为在Reb A最终产物的收率与纯度之间存在着一种相反关系，所以确定从给定甜菊原材料中生产目标Reb A纯度例如99+％纯度RebA的最具成本效益的方法在生产的工艺优化和经济学上是重要的。工艺优化通过首先利用实验室实施方式进行，并且当工艺在实验室规模被优化时，将优化的结果在工业规模下应用。工艺优化的优选实施方式包括利用至少一次原材料分析，生产等于或大于目标纯度的最终产物Reb A纯度，以及渐增地用(i)一个或多个搅拌洗涤阶段，(ii)在剩余的回流阶段(一个或多个)和/或搅拌洗涤阶段(一个或多个)使用不同的质量与溶剂比，或(iii)(i)和(ii)的组合，代替任何附加回流阶段(一个或多个)(“附加回流阶段”是除第一回流阶段之外的回流阶段，如下更详细描述及如图6所示)。是否进行附加回流或搅拌洗涤，或者是否继续进行乙醇清除及干燥阶段的决定点在附图中被表示为“重复决定(Iteration decision)”。例如，当首次加工给定的较高品质甜菊原材料时，如果单个回流(典型地，质量与体积比为1比4)阶段和一个搅拌洗涤阶段在本发明的实验室实施方式中没有产生99+％纯度Reb A，通常将第一回流阶段溶剂和任选的第一搅拌洗涤阶段溶剂的质量与体积比分析引入EtOH配制阶段(一个或多个)，从而努力在没有第二搅拌洗涤阶段或第二回流阶段的情况下获得目标纯度。搅拌洗涤阶段的操作成本比回流阶段的成本小得多，而单个搅拌洗涤阶段的操作成本比两个搅拌洗涤阶段的操作成本小。
[029]如果最终产物的Reb A纯度在目标纯度以上，并且如果用搅拌洗涤阶段代替最后附加回流阶段没有产生目标纯度，则在前面倒数第二(和较早的)回流阶段(一个或多个)中的较高质量与溶剂比可以实现目标纯度，并免除对最后的附加回流阶段的需要。在这种情况下，如果在回流阶段(一个或多个)中使用和回收附加乙醇的成本小于在附加回流阶段中利用原始质量与溶剂比进行加热和冷却的成本，则典型地使用较高的质量与溶剂比，只要能获得目标纯度。
[030]如果在用搅拌洗涤和/或回流阶段(一个或多个)中的不同质量与溶剂比代替最后附加回流阶段之后，最终产物的Reb A纯度仍然高于目标纯度，生产者可以决定通过用搅拌洗涤阶段代替回流阶段和/或在剩下的回流阶段(一个或多个)或搅拌洗涤阶段(一个或多个)中使用不同的质量与溶剂比来进一步降低操作成本。如果在用搅拌洗涤代替最后的回流阶段或使用不同的质量与溶剂比之后，最终产物的Reb A纯度低于前面使用未决定采用的附加回流阶段所达到的目标纯度，则生产者返回使用被省去的附加回流阶段，因为在无该回流阶段的情况下不能实现目标纯度。以此方式，遵循EtOH配制、不同排列的回流和搅拌洗涤阶段，使用给定甜菊原材料生产给定目标纯度的成本被最小化。工艺优化典型地利用本发明的实验室实施方式来进行；然后将用于给定甜菊原材料的优化工艺在工业规模下应用。对于较低品质甜菊原材料，利用单回流和单搅拌洗涤的操作生产99+％纯度Reb A最终产物是不可能的。处理含有“顽固”污染物的较低品质甜菊原材料可能需要至少两个EtOH回流阶段和无水乙醇回流阶段，代替两个EtOH回流阶段和搅拌洗涤阶段，如实施例1显示(实施例使用了含有RA40的甜菊原材料的掺合物)。
[031]如图2中所示，步骤A包括EtOH配制阶段，步骤B至E包括本发明实验室实施方式的回流阶段。在配制用于给定甜菊原材料的所选择EtOH溶剂中混合并回流该甜菊原材料，然后通过过滤回流的混合物分离新蛇菊苷A是“回流阶段”。附加回流阶段包括在配制用于给定甜菊原材料或保留物的所选择EtOH溶剂中混合并回流保留物(通过过滤来自紧接前面阶段的混合物而分离的固体)，然后通过过滤回流的混合物分离新蛇菊苷A。
[032]如图3中所示，步骤F至I包括本发明实验室实施方式的搅拌洗涤阶段。在变性或无水乙醇洗涤中混合并搅拌分离的新蛇菊苷A，并然后通过过滤洗涤混合物分离新蛇菊苷A是“搅拌洗涤阶段”。如上所讨论，无水乙醇优选作为搅拌洗涤中的溶剂，但是成本管理可能要求在搅拌洗涤阶段使用变性乙醇。步骤J至K包括本发明实验室实施方式的乙醇清除和干燥步骤。在实验室实施方式中，步骤J至K，乙醇清除和干燥步骤也被称为“清洗乙醇并干燥分离的保留物”。
[033]如在图2中所示，在本发明实验室应用的实施方式中，甜菊原材料与包含乙醇和水的溶剂(按体积计4％至15％水)混合。实验室实施方式中的步骤A测定待用于回流溶剂中的溶剂的水与乙醇平衡值。测定水与乙醇平衡值的优选方法是甜菊原材料的分析，如下所述(“原材料分析”)。测定水与乙醇平衡值的可选方法是利用指南，其在本文中被称为“回流溶剂近似(reflux solvent approximation)”，也就是说，基于一批甜菊原材料宣称或标记的纯度，对于甜菊原材料中低于90％RebA纯度，在Reb A纯度上每5％减少，回流溶剂的含水率应当在6％水的基线以上增加1％；回流溶剂的剩余量为乙醇。例如，回流溶剂近似教导，使用按体积计8％水、92％水的回流溶剂来处理RA80原材料并最终产生100％纯Reb A(当使用RA80甜菊原材料时，得到这样的纯度典型地需要至少两个回流阶段)。回流溶剂近似是由第一署名发明人在完善原材料分析中所收集的经验数据得到的。
[034]原材料分析是测定回流溶剂中水与乙醇平衡值的优选方法，原因在于原材料分析揭示了在回流溶剂中所需含水率的最小值，而非仅仅是近似值，以便生产(结合一个或多个搅拌洗涤阶段)目标纯度，例如99+％纯度Reb A。超过最小值的含水率显著减小了Reb A最终产物的收率。如在图4和5中所示，通过利用同等的溶剂组进行原材料分析，其中含水率均一地被增加0.5％至15％，或位于该范围的子集内，例如2％至10％；各溶剂的平衡物是乙醇(水和乙醇的每一个组合在此被称为“测试溶剂)。所宣称或标记的甜菊原材料的纯度在分析中仅仅为一种输入，其程度仅为所宣称或标记的Reb A纯度和回流溶剂近似可以被用于使初始的测试溶剂组集中。例如，对标记为RA80的甜菊原材料的原材料分析将典型地使用一组集中于约8％水和92％乙醇的测试溶剂。在原材料分析中，将取自给定的一批或很多甜菊原材料(“样品批”)的甜菊原材料样品与一系列测试溶剂(例如，2％水和98％乙醇、4％水和96％乙醇、6％水和94％乙醇等)中的每一个混合，其质量与体积比为1g甜菊原材料对4ml测试溶剂。
[035]如下更详细地解释，甜菊原材料与回流溶剂之比可以在2至10体积份或更多EtOH溶剂/1质量份甜菊原材料的范围内变化，但是优选为3至6体积份EtOH溶剂/1质量份甜菊原材料，更优选为大约4体积份EtOH溶剂/1质量份甜菊原材料。如在实施例7中所示，1∶4的甜菊原材料与所选择EtOH溶剂之比通常最大化在利用较高品质甜菊原材料的单回流、单搅拌洗涤方法中的Reb A收率。将甜菊原材料与测试溶剂的每一混合物(每一个，“测试混合物”)在配备有冷凝器的回流装置中，伴随剧烈搅拌，在一个大气压下从室温加热(典型的加热速率为4℃/min)至大约79℃至80℃，回流大约1小时，然后冷却大约1小时(典型地，将烧瓶放置在冰浴中)，并经滤纸上过滤。将来自每一测试混合物的湿固体或保留物以1克湿固体保留物对大约4ml溶剂之比(每一个，“测试洗涤混合物”)各放置在100％无水乙醇中。
[036]如果在回流中使用除1∶4之外的甜菊原材料与EtOH溶剂比，则可以将来自每一测试混合物的湿固体保留物与100％无水乙醇的相同比用于测试洗涤混合物。然而，典型地，在测试洗涤混合物中，使用1∶4的甜菊原材料与乙醇之比，原因在于较高的比值典型地对最终RebA纯度具有最小的影响并且可能减少Reb A收率。
[037]将各测试洗涤混合物在室温下搅拌15分钟。搅拌之后，经滤纸过滤各测试洗涤混合物，并将来自过滤的保留物固体在烘箱、优选为鼓风机烘箱中在79℃或最低79℃以上干燥，以生产干燥的样品(每一个，“测试样品”)。烘箱温度不应当高于80℃太多，以避免分解测试样品或点燃残留乙醇。利用在下面实施例中的HPLC方法部分所述的HPLC分析方法，对每一个测试样品进行Reb A纯度测试。对于100％纯Reb A最终产物的目标纯度，选择(i)对应于在HPLC分析中显示为100％纯Reb A(或者在单回流、单搅拌洗涤未能产生100％纯Reb A的情况下的最高Reb A纯度)的测试样品，和(ii)含有最低水分的测试溶剂(“第一重复结果”)作为处理样品批的剩余部分的溶剂。例如，如果含有6％、8％和10％水(各测试溶剂的平衡物为乙醇)的测试溶剂各产生100％纯Reb A测试样品，那么6％水、94％乙醇溶剂是第一重复结果并且(除非原材料分析的第二次重复被用于改进该结果)将被用于处理样品批的剩余部分。
[038]原材料分析可以被多次重复，以选择进一步优化100％纯Reb A收率的溶剂。在原材料分析的第二次重复中，在同等的测试溶剂组中的含水率均一地被缩减为低于第一次重复结果的含水率，但是以较小量缩减，例如0.5％水的减量。例如，如果第一次重复结果是6％水、94％乙醇，在第二次重复中的测试溶剂可以是6.0％、5.5％、5.0％和4.5％水。如上所述的该方法剩余部分(第一回流、搅拌洗涤、干燥和HPLC分析)是利用第二次重复测试溶剂、测试混合物和测试洗涤混合物进行的。选择(i)对应于在HPLC分析中显示为100％纯Reb A(或者在单回流、单搅拌洗涤未能产生100％纯Reb A的情况下的最高RebA纯度)的测试样品，和(ii)含有最低水分的第二重复测试溶剂作为处理样品批的剩余部分的溶剂，并替代第一次重复结果。例如，如果含有6％、5.5％和5.0％水(各测试溶剂的平衡物为乙醇)的测试溶剂各产生100％纯Reb A测试样品，那么5％水、95％乙醇溶剂将被用于处理样品批的剩余部分。可以进行两次以上的原材料分析重复，以更精细地优化回流溶剂的选择，例如，第三次重复可以使用低于第二次重复结果的0.1％含水率减量。
[039]利用回流溶剂近似或原材料分析所选择的水和乙醇溶剂被称为“所选择EtOH溶剂(selected EtOH solvent)”。“EtOH”是乙醇与水掺合物的俗名。方便起见，待利用所选择EtOH溶剂(即使是利用回流溶剂近似而选择)进行处理的甜菊原材料被称为“样品批(sampledbatch)”。原材料分析典型地产生比回流溶剂近似精确得多的结果，并且是确定所选择EtOH溶剂的优选方法。
[040]利用原材料分析或回流溶剂近似，包括其多次重复被称为“为原材料配制所选择EtOH溶剂”，并且也被称为“EtOH配制阶段”。通过用过滤回流混合物(或搅拌洗涤混合物)而得到的湿固体保留物代替原材料分析中的甜菊原材料，在附加回流阶段(或搅拌洗涤阶段)之前可以进行EtOH配制阶段。在每一回流之前进行EtOH配制阶段通常仅在非常大量的湿固体保留物正被处理或在前回流阶段的收率和纯度不满足期望的情况下进行。
[041]EtOH配制阶段可以任选地包括在确定所选择EtOH溶剂之后改变EtOH溶剂对甜菊原材料之比(在初始回流阶段之前)或改变EtOH溶剂对湿固体保留物之比(在附加回流阶段或搅拌洗涤阶段之前)，以确定最大化Reb A收率的比值。该测定被称为“任选的质量与体积比分析”。甜菊原材料或湿固体保留物的质量与所选择EtOH溶剂的体积之比可以在始于至少3体积份所选择EtOH溶剂/1质量份原材料的开放端范围内变化，但是优选从3至10体积份所选择EtOH溶剂/1质量份原材料，更优选从4至6体积份所选择EtOH溶剂/1质量份原材料，最优选为大约4体积份所选择EtOH溶剂/1质量份原材料。利用较高品种甜菊原材料，典型地在或接近4体积份所选择EtOH溶剂/1质量份甜菊原材料(在初始回流阶段之前)或湿固体保留物(在附加回流阶段之前)的比值下获得最大Reb A收率。如果正在处理非常大量的湿固体保留物，或者如果在前的回流阶段的收率和纯度不满足期望，则可以在附加回流之前重复EtOH配制阶段和任选的质量与体积比分析。对于处理较高品质甜菊原材料而言，通常利用接近1∶4比值的小增量进行第一任选的质量与体积比分析，以确定可产生最大Reb A收率的质量与溶剂比。例如，当处理较高品质甜菊原材料时，1∶3.8、1∶3.9、1∶4.0、1∶4.1和1∶4.2(m/v)的比值可以用在第一任选的质量与体积比分析中。[042]当目标纯度是99+％纯度100％纯Reb A时，有时在回流中需要较高的甜菊原材料与EtOH溶剂比，如1∶6或1∶8(m/v)，以便处理较低品质甜菊原材料(例如RA40至RA85)。如在实施例7中所示，Reb A收率典型减小，因为回流中使用了较高的甜菊原材料与所选择EtOH溶剂之比，以及在搅拌洗涤或第二或随后的回流中使用了较高的湿固体保留物与乙醇比；当使用较高比值时，成本也增加，原因在于使用了更多试剂和较大的罐。如在实施例7中所示，这样的较高比值对利用两个回流阶段从较低品质甜菊原材料生产100％纯Reb A最终产物是必需的。低于1∶3.5(m/v)的在第一回流阶段中的甜菊原材料与所选择EtOH溶剂之比，或在附加回流阶段中的湿固体保留物与所选择EtOH溶剂之比，典型地产生难于加工的非常粘的混合物，产生较低的Reb A收率，以及产生较低纯度Reb A。低于1∶3(m/v)的在第一回流阶段中的甜菊原材料与所选择EtOH溶剂之比，或在随后回流阶段中的湿固体保留物与所选择EtOH溶剂之比，可能产生冷却时硬结或凝固的混合物，其使得处理变得非常复杂。
[043]作为一种普遍规则，在第一回流阶段中的甜菊原材料与所选择EtOH溶剂，或在附加回流阶段中的湿固体保留物与所选择EtOH溶剂的质量与体积比为1∶4或非常接近1∶4是最优选的比值，特别是对于高品质甜菊原材料而言，原因在于最大的Reb A收率将处于或非常接近1∶4(m/v)比值。
[044]如在图11和12中所示，用在质量与溶剂比分析中的步骤与原材料分析中的那些步骤非常类似，只是对于给定的甜菊原材料质量(或在第一回流之后，湿固体保留物的质量)，在质量与溶剂比分析中，对于给定的甜菊原材料质量(或在第一回流之后，湿固体保留物的质量)，所选择EtOH溶剂的体积是变化的，并且通常选择可最大化最终产物的Reb A纯度的质量与体积比，用于处理样品批。质量与体积比分析是任选的，并且典型地仅仅用于较低品质甜菊原材料；如在实施例7中所示，回流中的原材料与所选择EtOH溶剂的较高质量与体积比(例如1∶6)有时在较少的回流下可以产生100％纯Reb A。可以重复质量与体积比分析(利用所选择EtOH溶剂体积的较小增量和减量)，以优化对于给定甜菊原材料或保留物的质量与体积比的精确性。
[045]如实施例1中的数据显示，在回流溶剂中超过最佳含水率1％水可能将100％纯Reb A的收率降低1％或更多。在工业方法的经济学上，精细调整最佳含水率非常重要。所宣称或标记的甜菊原材料Reb A含量可能基本不同于真实的Reb A含量，并且给定的一批甜菊原材料经常是来自很多来源的甜菊提取物的掺合物。通过原材料分析确定的所选择EtOH溶剂对给定的一批甜菊原材料是特定的。本发明实验室实施方式的一种主要用途是进行原材料分析，用于本发明的工业实施方式。
[046]如在图2中所示，在选择EtOH溶剂之后，在本发明的实验室实施方式中，利用回流和搅拌洗涤阶段，如下处理生产者确定量的样品批。将样品批的甜菊原材料以1g甜菊原材料对4ml所选择EtOH溶剂的质量对体积比(或利用包括任何任选的质量与体积比分析在内的EtOH配制阶段确定的其他比值)与所选择EtOH溶剂混合。将甜菊原材料与所选择EtOH溶剂的混合物(“回流混合物”)在配备有冷凝器的回流装置中，伴随剧烈搅拌，在一个大气压下从室温加热(典型地，4℃/分钟)至大约79℃至80℃，并在回流下典型地保持1小时；然后将回流混合物冷却大约1小时(典型的冷却速率为-1.8℃/分钟，例如通过将烧瓶放置在冰浴中)，然后经滤纸上过滤。当加工较高品质甜菊原材料时，使溶剂混合物在回流结束之后和在过滤之前静置(stand)轻微地增加了Reb A收率，但是当处理较低品质甜菊原材料时显著增加了Reb A收率。
[047]如在图3中所示，将来自第一回流阶段的湿固体保留物放置在100％无水乙醇中，其比率为1克湿固体对4 ml溶剂(“洗涤混合物”)(或利用包括任何任选的质量与体积比分析在内的EtOH配制阶段确定的其他比值)。将洗涤混合物在室温下搅拌15分钟。在搅拌洗涤阶段低于1∶3.5(m/v)的湿固体保留物与乙醇比可能产生削弱处理的混合物粘度。使用较高品质甜菊原材料，在搅拌洗涤阶段高于1∶4(m/v)的湿固体保留物与乙醇比在Reb A纯度上产生可以忽略的改进，并且典型地减少Reb A收率。因此，当使用较高品质甜菊原材料时，在搅拌洗涤阶段，1∶4或非常接近1∶4的湿固体保留物与乙醇比是最优选的比值。搅拌之后，在滤纸上过滤洗涤混合物，并将来自过滤的保留物固体在烘箱中干燥，优选在79℃或最低限度79℃以上的鼓风机烘箱中干燥达2小时，以生产干燥的固体。80℃的烘箱温度安全蒸发洗涤混合物中的乙醇，而不会点燃乙醇，从而清洗了具有乙醇的保留固体。当加工较高品质甜菊原材料时，允许洗涤混合物在搅拌洗涤结束之后和在过滤之前静置轻微增加了收率，但是当处理较低品质甜菊原材料时显著增加了收率。如果需要粉状最终产物，将干燥的固体挤压经过30目筛，形成粗糙白色粉末的最终产物(RebA最终产物)。
[048]利用较高品质甜菊原材料和单回流、单搅拌洗涤方法而产生的最终产物干燥固体典型为100％Reb A，并且通常表示回收了原材料中大约81％的Reb A。最终产物在水中具有33％的溶度(在3ml最终体积中1克)，这适合所有商业用途，包括浓缩物。如在实施例3中所示，搅拌洗涤阶段典型地将Reb A纯度从大约96％纯度Reb A(在第一回流阶段之后和搅拌洗涤阶段之前的纯度)增加至100％纯Reb A(搅拌洗涤阶段之后)。如果最终产物的应用能忍受99％以下纯度的Reb A的残留苦味，则可以省略所述搅拌洗涤阶段，并且可以干燥从过滤回流混合物得到的保留物，并可以商业应用。然而，搅拌洗涤阶段是优选的，以消除所有可感觉的苦味。
[049]如在实施例1和2中所示，如果甜菊原材料是85％以下的RebA，则通常需要至少一个附加回流阶段，以生产100％纯Reb A。为处理小于RA85纯度的甜菊原材料，利用所选择EtOH溶剂进行第一回流阶段，但是从过滤回流混合物得到的湿固体保留物典型地被用作第二回流的原材料，而不是被放置在搅拌洗涤中。附加第二回流阶段(以及更多附加回流阶段，如实现目标Reb A纯度所需)的操作参数与第一回流阶段所述的相同，包括EtOH配制阶段。任选地，可以在回流阶段之间进行搅拌洗涤阶段(但是不干燥湿固体)，在这种情况下，从过滤洗涤混合物(“中间搅拌洗涤阶段”)得到的湿固体保留物被用作随后的回流阶段的原材料。当处理RA80或更低品质的甜菊原材料时，有时需要中间搅拌洗涤阶段。
[050]方便起见，用在第一回流中的所选择EtOH溶剂可以被用在附加回流阶段。然而，为进一步优化收率，可以在取自湿固体保留物的样品上进行原材料分析，所述湿固体保留物是在每一个回流阶段末尾的过滤步骤中产生的(如果中间搅拌洗涤阶段被插入回流阶段之间，则从过滤中间搅拌洗涤阶段洗涤混合物得到的湿固体保留物被用作原材料分析的原材料)。在最后的回流阶段之后，典型地进行搅拌洗涤阶段(然后是乙醇清除和干燥阶段)，如上所述，以生产可达100％纯Reb A。然而，每一个附加回流阶段降低了最终产物的收率。如果最终产物的应用能忍受99％以下纯度的Reb A残留苦味，则选择回流阶段(和任选的中间搅拌洗涤阶段)的数目，以生产特定用途所需的目标纯度和收率。
[051]尽管描述了4℃/min的加热速率和-1.8℃/min冷却速率，但可以使用用典型实验室设备可得的其他冷却和加热速率，而不显著降低最终产物中的Reb A收率或纯度。非常高的加热速率需要剧烈搅拌混合物以防止原材料燃烧或水解。可得的加热和冷却速率可能取决于批量大小。例如，实验室中的强制冷却(force-cooling)可以通过将反应烧瓶放置在冰上或冰水中完成；在特定烧瓶尺寸中的较大反应体积在冰上或冰水中需要较长时间来冷却。一般而言，在回流之后，在任选的静置步骤中(standing steps)期间，处于室温以下但0℃以上(对于含有水的混合物)的混合物温度以及长的放置时间(standing times)将提高Reb A的收率，特别是当处理较低品质甜菊原材料时。在长的静置时期期间，特别是对于低于室温的回流后混合物温度，搅拌混合物以避免该混合物胶凝、硬结或凝固是关键的；如果发生胶凝、硬结或凝固，收率和/或纯度可能受到不利的影响。如果在超过12小时的放置时间期间，回流后混合物被冷却并被不充分地搅拌，混合物可能胶凝、硬结或凝固；如果这种情况发生，一些或所有混合物其后可能不易转化为可泵吸的浆液，用于进一步处理。搅拌洗涤之后，可以使用0℃以下和接近乙醇凝固点的混合物温度。甚至当处理RA40甜菊原材料时，回流或搅拌洗涤之后96小时以上的放置时间也提供了在收率上很少的提高。
[052]用5％至15％的水和剩余部分为乙醇的溶剂，甜菊原材料即刻在搅拌下成为溶液。然而，在无水乙醇溶剂中，甜菊原材料仅在加热下成为溶液，并且用无水乙醇作回流溶剂，在最终产物中Reb A的收率和纯度都较低。溶剂中具有5％至15％水的情况下，当溶剂与甜菊原材料的混合物达到50℃时，Reb A开始从溶液中沉淀出来；然而，相反地，在无水乙醇溶剂中，当溶剂与甜菊原材料的混合物达到50℃时，甜菊原材料仍是溶解的，并且Reb A的沉淀没有开始。在每一个回流阶段后，不是在除去热之后强制冷却混合物，而可以仅仅使该混合物空气冷却至室温，但是与强制冷却相比，Reb A的收率较低(即使是达到室温之后较长放置时间例如96小时的情况)。换句话说，回流混合物的强制冷却提高了较低品质甜菊原材料的收率。
[053]图7显示了用在本发明工业实施方式中的装置总图。用于处理较高品质甜菊原材料的基本工业实施方式包括三或四个阶段：EtOH配制阶段、回流阶段、任选的搅拌洗涤阶段(为生产90+％纯度Reb A典型所需)和乙醇清除及干燥阶段。第一回流之后是否紧跟单个搅拌洗涤阶段或者一个或更多附加回流阶段(具有或没有搅拌洗涤阶段)的决定点示于图1(和某些其他图)中，并且被表示为“重复决定(Iterationdecision)”。在使用较低品质甜菊原材料的实施方式中，在最后的搅拌洗涤阶段之前典型地增加至少一个附加回流阶段，以最大化Reb A最终产物的纯度。如分别在图8至10中所示，步骤I包括EtOH配制阶段，步骤II至V包括回流阶段；步骤VI至IX包括搅拌洗涤阶段；以及步骤X至XIII包括本发明工业实施方式的乙醇清除和干燥阶段。在工业实施方式中，步骤X至XIII，乙醇清除和干燥阶段也被称为“清除乙醇及干燥保留物”。
[054]如在图7中所示，实践工业实施方式的典型装置包括一个或多个夹套式不锈钢压力容器(“罐”或“混合罐”)，每一个通常具有3,000升容量，其被装备用于混合(柔性刮桨)、加热(在夹套中的蒸汽)和冷却(夹套中的冷却水)，并装备有入口和出口路径和回流冷凝器(未单独示于图7中)。在除下面步骤XI之外的所有罐工艺步骤中，连接至混合罐的回流冷凝器的出口被连接回到混合罐。无回流冷凝器的适当额定压力的容器可以被用在工业实施方式中，但是由于优异的混合物搅拌以及混合物过热的减少而优选回流冷凝器。所有罐、壳、管、阀、发动机等是经检验用于爆炸性液体和蒸汽的ASTM压力容器。每一个罐具有：压力和温度传感器以及流量和/或数量指示器；粉末储料斗和加料器，其具有入口流量计量；具有入口流量计量的乙醇和水进料装置；截止阀；以及在压力容器操作领域已知的其他常规设备，如一种或多种离心滗析器(典型地为连续流动模式)；膜滤器(任选的)；泵；收集罐；泵；喷雾干燥器；斗式进料器；使装置元件、滤器等互相连接的管；以及过程控制系统。
[055]如在图8中所示，在本发明工业实施方式中的步骤I是对回流溶剂中的水与乙醇平衡的确定步骤。确定所选择EtOH溶剂的优选方法是对原材料分析进行一至三次重复，如上所述，以及如在图4和5中所示。确定所选择EtOH溶剂的可选方法是使用回流溶剂近似，如上所述。原材料分析是优选的，因为原材料分析提供了当采用较高品质甜菊原材料时为生产(在最终搅拌洗涤阶段之后)100％纯Reb A而在回流溶剂中所需的最低含水率，而不仅仅是其近似值。假如大量的甜菊原材料、乙醇和能量用在工业方法中，通过优化所选择EtOH溶剂而优化收率对生产者的收益性经常是关键的。因此，原材料分析典型地被多次重复，如上所述，以便优化针对给定甜菊原材料(以及任选地，针对一次或多次附加回流之前的特定保留物)的所选择EtOH溶剂。如上所述，每一原材料分析可以在所选择EtOH溶剂被确定之后任选地包括质量对体积比分析，以确定最大化Reb A收率的所选择EtOH溶剂的质量与体积之比。
[056]如在图8中所示，在EtOH溶剂被选择之后，在本发明的工业实施方式中，利用回流和搅拌洗涤阶段(或者当处理较低品质甜菊原材料时，采用一次或多次附加回流，每一个附加回流阶段具有或没有中间搅拌洗涤阶段)来处理生产者确定量的样品批。在工业方法中的步骤II是在第一罐(“罐1”)中供应并混合乙醇和水，以生产是所选择EtOH溶剂的回流溶剂。贯穿方法步骤II至IV，通过利用回流冷凝器并将冷凝物返回至罐1来获取和冷却反应蒸汽，使所选择EtOH溶剂中的乙醇含量保持在大约+/-2％的乙醇含量。在步骤II中，加入甜菊原材料，并使其在1至4(甜菊原材料与所选择EtOH溶剂)的质量与体积比下或利用如上所述任选的质量与体积比分析而确定的质量与体积比下，与所选择EtOH溶剂混合。在步骤III中，在连续在罐1中进行混合的同时，将混合物加热(将蒸汽送入罐1的夹套中，典型的加热速率为1℃/min.)至79℃。在典型工业实施方式中的所有反应都是在一个大气压下。
[057]在罐1混合物达到79℃之后，在回流过程中继续混合1小时，同时使回流混合物温度保持在79℃至80℃之间(罐1中的乙醇沸腾并经回流冷凝器回收)。在步骤III中，当回流混合物温度增加50℃以上时，RebA典型地开始从溶液中沉淀出来。如果罐1未被填充至最大混合容量，浓厚的乳脂状物质(主要是沉淀的Reb A晶体)可能形成并覆盖在罐1的内表面；刮桨优选被用于使乳脂状物质回到混合物中。在步骤IV中，回流混合物被冷却(将冷却水(4℃)送至罐1夹套，典型的冷却速率为-0.3℃/min.)至4℃至20℃之间的温度，典型地为14℃。在步骤IV中，当处理RA80以下品质的甜菊原材料时，典型地使混合物在恒温下(典型地为14℃)保持冷却，同时进行混合，以提高收率。在这类情况中，冷却放置时期越长，沉淀的Reb A的回收率越大，可达大约96小时的放置时间。在该放置时间期间，混合桨刮擦罐1的内表面，以使浆液保持在罐1的底部。如果在放置时间期间冷却而没有搅拌，混合物可能变成凝胶状或者甚至硬结；如果混合物变成凝胶状或硬结，其后混合物不可能转化为用于进一步处理而不会不利地影响收率和/或纯度的可泵吸浆液。在步骤IV中，当处理较高品质甜菊原材料时，在冷却回流混合物之后(典型地冷却至14℃)，放置时间一般不是必需的。如上所述以及如下对罐1所述，成批处理甜菊原材料可以在其他可用的罐中同时进行。典型地，在工业生产装置中使用两个或多个罐，而批量基于劳动力和生产需求而调整。
[058]接下来，将足够的无水乙醇(无水的乙醇)加入罐1的内含物中，以产生可泵吸的浆液。一旦罐1中的冷却浆液变成可泵吸的(可泵吸性取决于泵的类型；典型地，隔膜泵处理比叶轮泵处理更粘的流体)，罐1中的浆液被泵至连续流动的离心滗析器中。该离心滗析器被供应以浆液蒸汽，而在步骤V中，乙醇被倾析至“轻组分(lights)”排放出口，而保留物被送出(典型地为重力自流进入)保留物或“重组分(heavies)”排放出口。典型地，在大规模生产中，“轻组分”排放蒸汽被泵送经过一种分离“轻组分”排放蒸汽中细小固体与乙醇的装置(例如，膜滤器或降膜蒸发器)。回收的乙醇通常被蒸馏并再利用。通过分离装置而捕获的细小固体通常被返回至混合罐，进一步处理(例如，在搅拌洗涤阶段或附加回流阶段)。
[059]即使离心滗析器不是真正的滤器，其也执行分离“轻组分”与“重组分”的类似滤器的功能(即，将液体与细小固体或轻组分与较重的颗粒或重组分分离)。因此，在本发明中使用离心滗析器被称为“过滤”。过滤要求，过滤装置从被过滤的混合物中分离其轴或直径大约为2.0μm以上，更优选为1.5μm以上；和最优选为等于或大于0.1μm的颗粒。可以使用其他分离液体与固体的装置来代替离心滗析器，如膜滤器和降膜蒸发器，但是对于装置上的给定投资而言，可选技术的生产量与离心滗析器的生产量相比经常是低得多。所选择的过滤装置必须适合待过滤的混合物的体积以及所需的生产量。基于该原因，在本发明的工业实施方式中，离心滗析器通常比膜滤器和降膜蒸发器有利地用于过滤回流混合物和搅拌洗涤混合物，因为与可选的技术相比，离心滗析器具有高得多的生产量、少得多的堵塞问题以及较小的成本。
[060]如在图9中所示，在步骤VI中，通过向可用罐(“罐2”)，通常在1克湿固体对4ml乙醇的比率或接近该比率下，供应来自离心滗析器保留物排放出口的湿固体和100％无水乙醇(“洗涤混合物”)，开始洗涤阶段。在搅拌洗涤阶段1∶3.5(m/v)以下的湿固体残留物与乙醇之比可能太粘，使得处理被削弱。在搅拌洗涤阶段高于1∶4(m/v)的湿固体保留物与乙醇之比通常在Reb A纯度上产生微不足道的提高，且通常降低Reb A收率。因此，当采用较高品质甜菊原材料时，在搅拌洗涤阶段，湿固体保留物与乙醇的质量/体积比为1∶4或非常接近该值是最优选的。在步骤VII中，利用罐2中的混合桨，搅拌洗涤混合物15分钟，不对该洗涤混合物进一步加热或冷却(即在环境温度下)。当采用较低品质甜菊原材料时，可以使混合物放置(步骤VIII)，以提高收率。在搅拌和任选的放置时间之后，在步骤IX中，将罐2中的洗涤混合物泵送至连续流动的离心滗析器中。该离心滗析器被供应以洗涤混合物作为输入，乙醇被倾析至“轻组分”排放出口，而保留物被送出(典型地为重力自流进料)保留物或“重组分”(保留物)排放出口。当处理较高品质甜菊原材料时，在搅拌洗涤结束之后和倾析之前，在搅拌洗涤过程中冷却洗涤混合物并使该洗涤混合物放置(步骤VIII)，通常伴随搅拌，轻微地增加了收率，但是当处理较低品质甜菊原材料时却显著增加了收率。
[061]如在图10中所示，乙醇清除和干燥阶段，为了产生为粉末的最终产物，在步骤X中，来自滗析器的保留物被送入(典型地为重力自流进料)可用罐(“罐3”)中并与水结合，使得最终体积为供应至罐3的保留物质量的大约2倍。例如，向500kg保留物中加入充足的可饮用(优选为过滤的)水，以产生大约1,000升最终的混合物体积(“水混合物”)。在步骤XI中，将罐3的内含物在配备有蒸汽排放出口的容器中加热(加热速率为1℃/min)至79℃，然后保持在79℃至80℃之间，并混合，以蒸发混合物中残留乙醇。在该温度(乙醇的沸点)下混合罐3的内含物引起残存在混合物中的任何乙醇蒸发；在排放蒸汽中的乙醇优选被捕获并再循环(但是可以作为废蒸汽被排出罐3)。继续混合，直到混合物的乙醇含量对喷雾干燥是安全的。用在步骤XIII中的喷雾干燥器的制造商规定了待喷雾干燥的液体中的易燃物最大含量，其为从罐3送入喷雾干燥器的乙醇含量的上限。可以使用不需要预先去除溶剂的可选干燥装置，如防爆型喷雾干燥器，但是此类可选装置可能要求操作者更加谨慎。防爆型喷雾干燥器将缩短生产时间并减小能耗。如在实施例6中所述，在工业规模下(例如500kg甜菊原材料)，在喷雾干燥前蒸发掉乙醇可能需要10小时或更多时间来清除乙醇。
[062]在步骤XII中，使罐3的内含物保持在60℃与99℃之间(优选在79℃至80℃之间)，同时将罐3的内含物泵送至喷雾干燥器(步骤XIII)。因为甜菊原材料在EtOH溶剂中被回流，因此不能确定是否任何病原体将幸免于回流(基于第三方实验室试验，在最终产物中的微生物含量是不能检测的)。在喷雾干燥前，可以任选地将混合物泵送经过膜滤器或相当的分离装置，以除去任何颗粒污染物。喷雾干燥器典型地经过自动控制的气密阀排放到进料斗(典型地配备有螺杆加料装袋器)中。进料斗(feed hopper)中的固体是粉末形式的最终产物，其为水溶性99+％纯度Reb A。如下面实施例4中所示(两个回流，工业方法)，当处理RA89.95甜菊原材料时，回收了按干重计68％的甜菊原材料，并且所回收的固体是99+％Reb A。实施例4表示回收了甜菊原材料中75.25％的Reb A。如下面实施例6中所示(采用RA83.14甜菊原材料，伴随单搅拌洗涤过程的单回流)，回收了按干重计59.04％的甜菊原材料，并且所回收的固体是99+％Reb A。实施例6表示回收了甜菊原材料中70.59％的Reb A。
[063]工业实施方式的99+％纯度Reb A最终产物典型地在水中具有33％的溶度(3ml最终体积中1克)。如在实施例4中所示，搅拌洗涤阶段典型地将Reb A纯度从大约96％纯度Reb A(在第一回流阶段之后和搅拌洗涤阶段之前的纯度)增加至100％纯Reb A(搅拌洗涤阶段之后)。如果该最终产物的应用能忍受99％以下纯度的Reb A残留苦味，例如，用于甜度阈值之下的腌制或味道改进，则可以省略所述搅拌洗涤阶段，并且可以干燥从过滤回流混合物得到的保留物并商业应用。然而，搅拌洗涤阶段是优选的，以消除所有可感觉的苦味。在水中约33％的溶度适合所有商业应用，包括浓缩物。
[064]如在下面实施例1、5和7中所示，如果采用较低品质甜菊原材料，典型地，需要至少一个附加回流阶段，以生产99+％纯度Reb A(搅拌洗涤阶段的最终产物)。为利用两个回流阶段处理甜菊原材料，使用所选择EtOH溶剂进行第一回流阶段，但来自过滤回流混合物的湿固体保留物被用作第二回流的原材料，而不是被放置在搅拌洗涤中。进行一个或多个附加回流和/或搅拌洗涤的决定被称为“重复决定(IterationDecision)”，在几个附图中被表示为“重复决定(Iteration decision)”。如在图6中所示，附加回流阶段(和任何多个附加回流阶段，如实现目标Reb A纯度所需)的操作步骤如上所述，包括一个或多个EtOH配制阶段。
[065]在图6中，在罐1A(如图7中所示)中通常进行附加回流阶段的混合、加热、回流、冷却和放置步骤(即步骤C′至E′)。任选地，可以在回流阶段之间进行中间搅拌洗涤阶段，在此种情况下，来自倾析中间搅拌洗涤混合物的湿固体保留物被用在任选的EtOH配制阶段(步骤B′)，或者另作为附加回流阶段的原材料(步骤C′至E′)。冷却之后，过滤混合物(步骤F′)。附加回流阶段之后为另一附加回流阶段、搅拌洗涤阶段或为乙醇清除和干燥阶段。优选在每一附加回流阶段的开始进行原材料分析的重复，以监测Reb A纯度上的提高。一般地，如果在回流阶段之后保留物Reb A纯度高于96％，那么搅拌洗涤阶段和乙醇清除及干燥阶段将产生99+％纯度Reb A最终产物。
[066]典型地，用在第一回流中的所选择EtOH溶剂也被用于任何附加回流阶段中。然而，为进一步优化收率，可以在取自湿固体保留物的样品上进行EtOH配制阶段，所述湿固体保留物是每一个回流阶段末尾的倾析步骤中产生的(如果中间搅拌洗涤阶段被插入回流阶段之间，则来自倾析中间搅拌洗涤阶段的湿固体保留物被用作EtOH配制阶段的原材料)。在工业方法中的最后回流阶段之后，进行搅拌洗涤阶段和乙醇清除及干燥阶段，如上所述，以生产可达99+％纯度Reb A。然而，每一个附加回流阶段降低了最终产物的收率。
[067]尽管在工业方法中描述了1℃/min的加热速率和-0.3℃/min的冷却速率，可以使用用典型工业设备可得的其他冷却和加热速率，而不显著降低最终产物中的Reb A收率或纯度。非常高的加热速率需要剧烈搅拌混合物，以防止原材料燃烧或水解。可得的加热和冷却速率可能取决于批量大小、加压加热和冷却以及(在冷却的情况下)使用制冷剂来代替冷却水。例如，强制冷却(force-cooling)可以通过在压力容器夹套中使用温度为0℃(当混合物温度比0℃高得多时，至少在初始冷却期间伴随剧烈搅拌)以下的制冷剂来完成。在第一或附加回流步骤之后，在任选的放置期间，4℃以下而0℃以上(这避免冰形成在混合物中)的混合物温度以及长的放置时间(standing times)将稍微提高Reb A的收率，特别是当处理RA80以下的甜菊原材料时。然而，甚至当处理RA40甜菊原材料时，回流或搅拌洗涤之后96小时以上的放置时间在收率上几乎没有提供改善。
[068]不使用实验室和工业方法中的回流冷凝器，而可以采用其他方法(例如，排去蒸汽并供应新鲜乙醇和水，或者能捕获和冷凝溶剂蒸汽并使其返回混合物的其他装置)，以保持混合组分的近似期望浓度。
[069]代替EtOH，本发明中使用的回流溶剂可以是非EtOH的含水链烷醇，但是如果用其他含水链烷醇代替EtOH，纯度和收率都降低。同样，搅拌洗涤溶剂可以是非乙醇的链烷醇。利用其他含水链烷醇作为回流溶剂以及其他链烷醇用作搅拌洗涤溶剂，可能导致与人消费用成分中的用途不相容的烷基化污染物。如果使用其他含水链烷醇，则进行原材料分析(或回流溶剂近似)以及任选的质量与体积比分析，以分别确定对于给定回流和甜菊原材料的回流溶剂的含水率和质量与溶剂比。
[070]如上所述，对于给定的甜菊原材料和目标Reb A纯度，实现目标Reb A纯度所需的回流阶段和搅拌洗涤阶段的最小数目是利用回流(有时对于较低品质甜菊原材料，其质量与溶剂比高于1比4)与搅拌洗涤的排列变换而经验地决定的。作为一个普遍规则，当单回流阶段和一个或两个搅拌洗涤阶段没有产生99+％纯度Reb A时，将质量与体积比分析包括在一个或多个EtOH配制阶段中。如上所提及，利用单回流和单搅拌洗涤以及1比4的质量与体积比，在本发明中采用较高品质甜菊原材料典型地提供99+％纯度Reb A。对于较低品质甜菊原材料，针对99+％纯度Reb A最终产物的目标纯度，一种优选的方法是使用1比4的质量与体积比以及所需的许多回流(“所选择的回流重复数”)，以便在EtOH配制阶段获得约96％至98％纯度Reb A最终产物。然后进行具有所选择EtOH重复数的EtOH配制阶段，加上搅拌洗涤阶段，以确定增加最后搅拌洗涤是否将提供目标纯度；如果不是，选择方法是在一个或多个EtOH配制阶段中增加另一个回流阶段或调整质量与溶剂比(利用质量与溶剂比分析)，并再次确定目标纯度是否已经达到。如实施例7显示，如果采用RA82.3甜菊原材料，目标纯度是100％纯度Reb A最终产物，并且使用两次回流、单搅拌洗涤以及1∶4的质量与体积比不能达到该目标纯度，则在回流中增加质量与体积比至1∶6可提供目标纯度。较低品质甜菊原材料比较高品质原材料便宜得多。在乙醇和能量的成本低的地方，较低品质甜菊原材料可以被成本有效地处理为99+％纯度Reb A。在乙醇和能量的成本高的国家，由于成本效率的原因，较高品质甜菊原材料通常是需要的。
[071]回流混合物温度在79℃至80℃通常产生了最短的可接受回流时间(典型地为1小时)。可以使用79℃以下的回流混合物温度；然而，这样的回流混合物温度通常需要更长的回流期间并且生产相当低收率的Reb A。例如，当回流混合物温度被增加50℃以上时，回流混合物变成乳白色，因为Reb A开始沉淀；回流混合物可以被保持在50℃至60℃范围内，并取决于回流的持续时间，可以降低加热成本，然而与79℃至80℃之间的回流混合物温度相比，Reb A的收率将被大大减小。然而，在一些地方，例如使用太阳能加热的地方，仅较低回流混合物温度可能是可行的。
[072]Reb A产品的用途。通过本发明生产的99+％纯度Reb A(“Reb A产品”)可以被用作食品、饮料、药、烟草、药物和个人护理产品的唯一增甜剂，或者与此类产品中的其他增甜剂混合(即作为“辅助增甜剂”)。通常一种以上增甜剂被用于获得特定的味道概况和/或物理性质。此类增甜剂包括常规增甜剂(蔗糖、甜菜糖、蜂蜜、糖浆和其他“天然”增甜剂)和高强度增甜剂(甜密素、糖精、蔗糖素、天冬甜精、甜菊和其他化学产生的和/或天然的高强度增甜剂)。
[073]为改良含Reb A产品的口服成分的感觉甜度，可以通过加入味道改进部分如半乳糖苷来改良Reb A产品。例如，在本领域已知的反应中利用β-1，4-半乳糖转移酶，将β-1，4-半乳糖取代在Reb A产品上。通过本发明所产生的99+％纯度Reb A，其已被一个或多个官能团修饰而当用在口服成分中时产生具有舒适感官感觉的化合物，被包括在术语“Reb A产品”中。
[074]对于用作辅助增甜剂而言，Reb A产品可以以增甜剂(例如，蒸汽沉积(vapor-deposited)在辅助增甜剂上的蒸汽、乙醇或链烷醇气雾化的RebA产品)领域已知的方式使用，以涂布或渗透其他固体增甜剂、此类粒状和粉末状糖和人造增甜剂，作为单独的粉末与此类固体增甜剂混合，与其他固体增甜剂共结晶，或者被悬浮或溶解在液体增甜剂如玉米糖浆和蜂蜜中。在工业实施方式的乙醇清除和干燥阶段使用的商业可得的喷雾干燥器通常可以被配置，以生产适合期望用途的Reb A产品颗粒大小。
[075]如本文所用，术语“滋味(flavor)”或“滋味特征(flavorcharacteristic)”是味道、气味和/或组织组分的结合感官感觉。如本文所用，术语“提高(enhance)”包括增加、强化、强调、放大及加强滋味特征的感官感觉，而不改变其本质或品质。如本文所用，术语“改良(modify)”包括更改、改变、抑制、降低、增强和补充滋味特征的感官感觉，其中此种特征的品质或持续期间是不足的。
[076]在给食品和药用成分调味的领域中，对可以改良和改善此类物质的味道的成分存在持续的需求，因为对食品和药用产品的接受和需求通常与它们的感官感知有关。在给口腔卫生成分调味的领域中，如漱口水和牙膏，以及在给咀嚼成分调味的领域中，如咀嚼烟草(chewingtobacco)、鼻烟和口香糖，对用味道改良剂或增味剂来改善此类咀嚼成分的味道特性存在需求，所述味道改良剂或增味剂不生龋并且不支持导致蛀牙(tooth decay)的链球菌、乳酸菌或类似物的生长。同样，对改进吸烟成分(smoking compositions)的味道特征存在需求。
[077]术语“口服成分(orally consumable composition)”包括食品、药用成分、吸烟成分、咀嚼成分和口腔卫生成分，包括漱口水和牙膏。术语“食品(foodstuff)”包括固体和液体可摄取物质，其通常但并非必须具有营养价值，并且它们意图用于人或动物的消费。食品的代表性例子包括咖啡、茶、草药茶、烘焙食物、天然和合成调味品、香料、调料、汤、炖肉、方便食品、饮料(碳酸和非碳酸饮料)、乳制品、糖果、蔬菜、谷类、水果、水果饮料、快餐、可可制品、巧克力、动物饲料以及类似食品。术语“药用成分(medicinal composition)”包括固体、气体和液体，它们是具有药用价值的可摄取物质，如止咳糖浆、止咳滴剂、药用喷雾剂、维生素和咀嚼药片。术语“咀嚼成分(chewingcompositions)”包括咀嚼烟草、无烟香烟、鼻烟、口香糖和其他可以咀嚼并随后吐出的成分。口香糖包括含基本不溶水的、可咀嚼胶基体的成分，所述胶基体如树胶或其代用品，包括jetulong、guttakay rubber或某些可食用的天然合成树脂或蜡。术语“口腔卫生成分(oral hygienecompositions)”包括漱口水、固龈液、牙膏、牙粉、洁齿剂、口腔喷液和口腔清新剂。如此处所用，术语“吸烟成分(smoking composition)”包括香烟、烟斗香烟和雪茄烟以及所有形式的香烟，如片、粒或其他形式的切碎的烟心、叶、茎、梗、陈化的均化叶(homogenized leaf cured)、复原的捆扎烟叶(reconstituted binders)和来自烟草粉末、细粒或其他来源的复原烟草。术语“吸烟成分(Smoking compositions)”也包括从非烟草物质配制的烟草替代品，如在美国专利第3,529,602、3,703,177和4,079,742号中及其中引用的参考文献中所述的代表性烟草替代品。
[078]按照本发明的一个实施方式，提供了具有利用Reb A产品增强或改良的味道的口服成分。Reb A产品可以改良或增强味道特性——甜的、果味的、花的、草本的、辛辣的、芳香的、刺激性的、“似坚果的”(如杏仁、山核桃)、“香料的”(如肉桂、丁香、肉豆蔻、大茴香和冬青油)、“非柑橘类水果”味道(例如，草莓、樱桃、苹果、葡萄、黑醋栗、番茄、醋栗和黑莓)、“柑橘类水果”味道(例如橙子、柠檬和柚子)以及其他有用的味道，包括咖啡、可可、胡椒薄荷、绿薄荷、香草和槭树。
[079]按照本实施方式的一种变化，口服成分包括有效量的Reb A产品，以增甜或改良或增强该口服成分的味道、气味和/或特征。
[080]术语“有效的量(amount effective)”或“有效量(effective amount)”是指产生感官感知的量。使用过量的Reb A产品将产生对味道改良或增强而言可能不期望的甜味，正如同向食品或饮料中加入了太多的糖。所采用的Reb A产品的量可以在相当宽的范围内变化，这取决于口服成分将要达到的期望感官效果以及初始成分的本性。
[081]通过使Reb A产品与口服成分混合或者使Reb A产品与所述口服成分的组分混合，可以将Reb A产品加入口服成分。
[082]Reb A产品可以用在烟草和烟草相关的制品中，这些烟草和烟草相关的制品选自香烟、雪茄、鼻烟、嚼烟、其他烟草商品、滤嘴、卷烟纸和其他吸烟成分。具有增甜的、增强的或改良味道的吸烟成分包括选自烟草、复原烟草、非烟草替代品及其混合物的吸烟填料，并且含有有效量的Reb A产品。“含有”是指作为一种成分被包括在内并且被吸附至一种物质上。在本实施方式的一种变更中，吸烟成分包括含有Reb A产品的过滤工具。如本文所用，术语“过滤工具(filter means)”包括吸烟设备工具，如具有并入其中的过滤或调味组件的雪茄或香烟烟嘴，并且包括乙酸酯、棉花、木炭和其他纤维的、片状或颗粒过滤工具。在本实施方式的另一变更中，吸烟成分包括含有Reb A产品的包裹工具。在本发明的本实施方式的一种变更中，将按重量计0.003至0.30份Reb A产品加入按重量计100份吸烟填料中。在本发明的本实施方式的一种优选变更中，将按重量计0.015至0.30份Reb A产品加入按重量计100份吸烟填料中。
[083]给烟草调味领域的普通技术人员理解，加入到吸烟成分中的RebA产品的有效量可取决于Reb A产品被加入吸烟成分中的方法以及取决于Reb A产品被加入到吸烟成分的哪部分中。Reb A产品可以被直接加入吸烟填料中、加入过滤工具中或者加入吸烟成分的包裹工具中。可以通过给过滤工具调味领域的普通技术人员已知的任何方式将RebA产品加入吸烟成分的过滤工具中，包括但不限于，将Reb A产品并入过滤工具的纤维、薄片或颗粒中，将Reb A产品填充在纤维过滤工具的两层或多层纤维之间，以形成三层过滤工具，或者将Reb A产品插入吸烟设备工具如烟嘴中。
[084]仅有一部分吸烟填料或过滤工具需要用Reb A产品处理，这对本领域普通技术人员而言是显然的，因为掺合或其他操作可以用于将最后或最终吸烟成分调整在有效或期望的Reb A产品浓度范围内。除Reb A产品外，吸烟成分调味领域中已知的其他调味品或芳香添加剂可以与Reb A产品一起使用，并且可以随Reb A产品一起被加入吸烟成分中。用在吸烟成分调味领域中的典型调味品包括乙酸乙酯、乙酸异戊酯、异丁酸丙酯、丁酸异丁酯、丁酸乙酯、戊酸乙酯、甲酸苄酯、薄荷醇、苧烯、伞花烃、蒎烯、里哪醇、香叶醇、二氢香叶醇(citroneilol)、柠檬醛、薄荷油、桔油、芫荽油、柠檬油、冰片、可可提取物、烟草提取物、甘草提取物和水果抽提物。
[085]喷雾干燥之后纯化态的Reb A产品通常为细粉，具有范围在约1至100微米的粒度。细粉难以处理且难于与口服成分如茶叶、烟草制品、药草叶、咖啡以及其他口服成分混合。同样，当Reb A产品被用作味道改良剂或增味剂、增甜剂或辅助增甜剂时，通常仅有相对少量Reb A产品与口服成分一起使用。
[086]按照本发明的另一实施方式，将Reb A产品加入口服成分的方法包括使Reb A产品与载体混合，以形成Reb A产品-载体混合物。优选的载体包括水、乙醇、用在食品加工中的其他链烷醇、或它们的混合物。使如此形成的Reb A产品溶液与口服成分接触，并通过蒸发或其他方式将所述载体从口服成分中除去，而Reb A产品余留物与口服成分沉积在一起。该方法对将Reb A产品加入茶叶、药草植物叶和其他增甜剂，特别是粒状蔗糖(砂糖(table sugar))中特别有用。
[087]按照本发明的又一实施方式，用Reb A产品制备适合与口服成分一起使用的液体滤器材料。如本文所用，术语“液体滤器(liquid filter)”指的是用于制备口服成分的多孔或半多孔滤器材料，如茶袋、咖啡滤器或滤盘。术语“滤盘(filter disk)”指的是加入口服成分中的多孔或半多孔非活性物品，目的是充当用于将调味品或增甜成分加入口服成分中的载体。用于制备包含过滤材料和Reb A产品的液体滤器的方法通常是：通过使Reb A产品与载体混合，从而形成Reb A产品-载体混合物；使该Reb A产品-载体混合物与过滤材料接触；和从所述过滤材料中去除载体，藉此将Reb A产品余留物沉积在过滤材料上。
[088]Reb A产品可以用在选自如下的饮料、汤汁和饮料配制品中：碳酸的、非碳酸的、冰冻、半冰冻(“浆”)、非冰冻、即饮型、浓缩型(粉末状、冰冻的或糖浆)、奶制品、非奶制品、药草、非药草、咖啡因型、非咖啡因型、酒精型、非酒精型、香味的、无香味的、蔬菜型、水果型、根/块茎/球茎型、坚果型、其他植物型、可乐型、巧克力型、肉类型、海味型、其他动物型、藻类型、热量增强型、热量减少型和无热量产品，任选地分配在开口容器、罐、瓶或其他包装中。此类饮料和饮料配制品可以是即饮型、即煮型、即混型、未加工的或成分形式，并且可以使用Reb A产品作为单独的增甜剂或作为辅助增甜剂。
[089]Reb A产品可以用在选自如下的食品和食品配制品(例如增甜剂、汤、酱油、佐料、香料、油、脂肪和调味品)中：奶制品型、谷类型、烘焙型、蔬菜型、水果型、根/块茎/球茎型、坚果型、其他植物型、蛋类型、肉类型、海味型、其他动物型、藻类型、已加工的(例如酒席)、保存型(例如即时餐配定量)和合成(例如凝胶)产品。此类食品和食品饮料配制品可以是即饮型、即煮型、即混型、未加工的或成分形式，并且可以使用Reb A产品作为单独的增甜剂或作为辅助增甜剂。
[090]Reb A产品可以用在选自如下的糖果、蜜饯、甜品和快餐中：奶制品型、谷类型、烘焙型、蔬菜型、水果型、根/块茎/球茎型、坚果型、树胶型、其他植物型、蛋类型、肉类型、海味型、其他动物型、藻类型、已加工的(例如酒席)、保存型(例如即时餐配定量)和合成(例如凝胶)产品。此类糖果、蜜饯、甜品和快餐可以是即饮型、即煮型、即混型、未加工的或成分形式，并且可以使用Reb A产品作为单独的增甜剂或作为辅助增甜剂。
[091]Reb A产品可以用在选自如下的处方和非处方药物、检定、诊断试剂盒和治疗中：重量控制、营养补充、维生素、婴儿食物、糖尿病患者食物、运动员食物、老人食物、低碳水化合物食物、低脂食物、低蛋白食物、高碳水化合物食物、高脂食物、高蛋白食物、低卡路里饮食、无热量饮食、口腔卫生产品(例如，牙膏、漱口水、嗽洗液、牙线、牙刷、其他器具)、个人护理产品(例如，肥皂、洗发精、嗽洗液、护肤液、香膏、药膏、软膏、纸制品、香水、唇膏、其他化妆品)、其中味道或气味是要素的专业牙科产品(例如，液体、咀嚼片、吸入剂、注射剂、药膏、树脂、嗽洗液、垫、牙线、器具)、其中味道或气味是要素的内科、兽医和外科产品(例如，液体、咀嚼片、吸入剂、注射剂、药膏、树脂、嗽洗液、垫、拉线、器具)以及药物混合填料、糖浆、胶囊、凝胶和涂覆产品。
[092]Reb A产品可以用在选自如下的消费品包装材料和容器中：塑料膜、热固性和热塑性树脂、树胶、箔、纸、瓶、箱、油墨、油漆、胶粘剂和包装涂敷产品。
[093]Reb A产品可以用在选自如下的物品中：增甜剂、辅助增甜剂、涂布增甜剂棒(coated sweetener sticks)、冰冻蜜饯棒(frozen confectionsticks)、药勺(人和兽医用途)、牙科器械、预加糖一次性餐具和用具、香袋、可食用香粉、芬芳袋(pot pourris)、可食用芬芳袋、杂烩(hotchpotches)、可食用杂烩(edible hotch potches)、人工花、可食用人工花、衣服、可食用衣服、按摩油和可食用按摩油。
[094]实施例
[095]HPLC方法
[096]使用高效液相色谱(HPLC)来测定通过本发明方法所生产的最终产物的纯度。在实施例和上面的说明书中使用的HPLC分析方法中，将0.1克干燥固体(例如使用本发明生产的最终产物)溶解在25ml50％乙腈/50％水中，形成样品。使该样品经过0.45μm尼龙滤器，并将10μl滤液注入HPLC注射口。HPLC装置包括Shimadzu LC-10AS泵(Shimadzu North America，www.ssi.shimadzu.com)、Shimadzu SCL-10A控制仪和Shimadzu SPD-10A可变波长检测器。在Shimadzu CR501Chromatopac积分仪上收集原始数据。使用4.2mm i.d.×250mm、10μm胺柱(Alltech and Associates Inc.，www.alltech.com)，其具有由72.5％乙腈/27.5％水组成的恒溶剂流动相以及0.8ml/min的流量。检测210nm处的峰。通过与标准线性回归曲线(y＝mx+b)比较，量化糖苷(蛇菊苷和新蛇菊苷A)，该标准线性回归曲线分别从蛇菊苷(Chromadex CatalogNo.ASB-00019351)或新蛇菊苷A(Chromadex Catalog No.ASB-00018226)的已知浓度而构建。参比标准被用于分析甜菊原材料和由本发明生产的固体。在利用本发明生产的最终产物中，蛇菊苷和新蛇菊苷C处于检测的下限，如下所述。本发明中所述的最终产物具有比目前主要的新蛇菊苷A分析标准高的纯度，所述新蛇菊苷A分析标准具有98.7％的鉴定纯度(Chromadex，Inc.，Santa Ana，Calif.，www.chromadex.com)。Chromadex标准是在约2002年确立的。由本发明生产的更高纯度的Reb A主要是由于使用了EtOH配置阶段和所选择EtOH溶剂而产生的，如上所述。短语“100％纯Reb A”是指，从上述高效液相色谱(HPLC)对利用本发明生产的最终产物样品的分析得到的色谱显示蛇菊苷和新蛇菊苷C的细微显示信号(通过保留时间)、RebA的单强峰，并且HPLC积分仪报告了等于或大于210nm处最低值(典型地为98.7％)的一个值，所述最低值是由HPLC积分仪对仅有纯Reb A的Chromadex参比标准的样品报告的。已发现，在2002年之前，在普通用途中许多Reb A纯度参比标准夸大了Reb A纯度；例如，据认为，2002年之前在加拿大公知使用的标准与使用Chromadex标准的分析结果相比，夸大Reb A纯度大约6％。
[097]因为在HPLC装置中，210nm处的吸收基于洗脱化合物的本质和化合物生色团(一个或多个)而变化，所以使用除根据已知纯度的参比化合物(例如，Chromadex Catalog No.ASB-00018226)构建的标准线性回归曲线之外的分析方法将产生不稳定的结果。
[098]实施例1
[099]实施例1.使用一系列测试溶剂的两个回流阶段，之后是无水乙醇回流。
[0100]实施例1说明了回流溶剂中的含水率对固体收率和新蛇菊苷A纯度的影响。在实施例1中，配置了含有0％、2％、4％、6％、8％和10％水和剩余部分为乙醇(体积/体积)的一系列6个溶剂；每一个溶剂掺合物被称为“测试溶剂”。通过掺合两种商业可得的甜菊提取液RA81.58和RA40.27，制备三组6个5克甜菊原材料样品，其含有(i)71.85％RA、13.55％蛇菊苷；(ii)76.13％RA、6.96％蛇菊苷；和(iii)81.58％新蛇菊苷A、4.49％蛇菊苷(每组中的剩余部分由不同浓度的杜尔可苷、新蛇菊苷和非糖苷二萜化合物组成)。将所有三组甜菊原材料的掺合物(每一个，“甜菊掺合物”)在80℃的鼓风机烘箱中干燥过夜，并且假定处理之前含0％水分。
[0101]将5克每一种甜菊掺合物各放置在三组六个100ml玻璃圆底烧瓶中，并分别将20ml每一种测试溶剂加入烧瓶组中，以产生每一种甜菊掺合物的100Et/00W、98Et/02W、96Et/04W、94Et/06W、92Et/08W和90Et/10W“测试混合物”。将所述测试混合物在室温下混合。除100Et/00W测试混合物之外，所有甜菊原材料进入溶液中。将各测试混合物在80℃下回流1小时。然后将各测试混合物在冰上冷却1小时。然后将各测试混合物经Whatman GF/A玻璃微纤维滤器(1.6μm孔径)过滤。收集来自各测试混合物过滤的固体(“第一保留物”)，并将每一种第一保留物与另外20ml用于相应测试混合物的第一次回流的相同测试溶剂混合，以产生“第二测试混合物”。将各第二测试混合物在80℃下回流1小时。然后将各第二测试混合物在4℃下贮存96小时。然后将各第二测试混合物经Whatman GF/A玻璃微纤维滤器过滤而产生湿固体的保留物(“第二保留物”)，并将各第二保留物在80℃的鼓风机烘箱中干燥，直到达到恒重。将来自给定第二测试混合物的每克干燥第二保留物与4ml无水乙醇在100ml玻璃圆底烧瓶中混合，以产生“第三测试混合物”。将各第三测试混合物在80℃下回流1小时。然后将各第三测试混合物经Whatman GF/A玻璃微纤维滤器过滤，收集固体(“第三保留物”)，并在80℃的鼓风机烘箱中干燥，直到观察到恒重。为测量收率，测定每一种干燥第三保留物的重量。为测量纯度，利用上述HPLC方法，分析0.1克各第三保留物样品的新蛇菊苷A和蛇菊苷含量。
[0102]结果：
[0103]表1显示测试溶剂中的含水率对RA71.85、RA76.13和RA81.58甜菊原材料的固体收率的影响。
[0104]图表1绘制了改变测试溶剂中的含水率对RA71.85、RA76.13和RA81.58甜菊原材料的固体收率的影响。
[0105]从表1中可见，当测试溶剂中的含水率增加到8％时，固体收率逐渐下降。然而，当测试溶剂中的含水率超过8％时，在所有情况下，固体收率显著下降，并且是以比较低含水率大得多的速率下降。这表明，为保持RA70或更高甜菊原材料的收率，最大含水率按体积计不应当超过8％。Reb A收率与甜菊原材料中的新蛇菊苷A含量正向关联：在所有测试溶剂中，较高的初始Reb A含量产生了较高的固体收率。甜菊原材料中的水分贡献了测试溶剂的总含水率，并因此将对固体收率产生影响。因此，为控制测试混合物中的总含水率，在配置测试混合物之前，所有甜菊原材料都被干燥。
[0106]表2显示测试溶剂中的含水率对来自RA71.85、RA76.13和RA81.58甜菊原材料的新蛇菊苷A纯度的影响。
[0107]图表2绘制了测试溶剂中的含水率对来自RA71.85、RA76.13和RA81.58甜菊原材料的新蛇菊苷A纯度的影响。
[0108]从表2和图表2可见，最终产物的Reb A纯度通常随测试溶剂中含水率增加而增加。例外情况是2％含水率，其中，与在测试溶剂中无水相比，Reb A纯度存在减小或者Reb A纯度仅有非常小的增加。为获得含99％+纯度Reb A的最终产物，表2显示(粗体字)，对于RA81.58甜菊原材料而言，在测试溶剂中的6％水分产生了具有最高收率的期望的99+％Reb A纯度。对于RA76.13甜菊原材料，8％含水率产生了具有最高收率的期望的99+％Reb A纯度。对于RA71.85甜菊原材料，10％含水率产生了具有最高收率的期望的99+％Reb A纯度。然而，如通过来自表1的数据所示，在较低品质甜菊原材料情况下，达到期望的99+％Reb A纯度导致较低的绝对收率。
[0109]实施例1说明需要对使用的每一种甜菊原材料经验地确定测试溶剂中的最佳含水率。这些经验性观察导致上述原材料分析和回流溶剂近似。
[0110]实施例2
[0111]实施例2.利用系列测试溶剂的一个回流阶段，之后是搅拌洗涤阶段。
[0112]实施例2说明，当采用RA80或更高甜菊原材料(如果甜菊原材料不含需要附加回流阶段的“顽固”污染物)时，在实施例1中的第二回流可以去除，并且用无水乙醇的回流可以用在无水乙醇中的较短期间搅拌洗涤代替。实施例2的结果显示，采用RA90，单回流阶段和单洗涤阶段典型地产生99+％纯度Reb A。
[0113]在实施例2中，如同在实施例1中，配置了含有0％、2％、4％、6％、8％和10％水和剩余百分比为乙醇(体积/体积)的6个系列溶剂；每一个溶剂掺合物被称为“测试溶剂”。将5克RA89.95甜菊掺合物放置在六个100 ml玻璃圆底烧瓶的每一烧瓶中，并与20ml 100Et/00W、98Et/02W、96Et/04W、94Et/06W、92Et/08W和90Et/10W测试溶剂混合，以产生甜菊原材料的100Et/00W、98Et/02W、96Et/04W、94Et/06W、92Et/08W和90Et/10W“测试混合物”。除100Et/00W测试混合物之外，所有甜菊原材料进入溶液中。将各测试混合物在80℃下回流1小时。然后，将各测试混合物在室温下保持96小时，然后经Whatman GF/A玻璃微纤维滤器(1.6μm孔径)过滤。收集各测试混合物中的固体(“最初保留物”)，并将每一种最初保留物与16ml无水乙醇混合并在室温下搅拌(搅拌棒)15分钟(“搅拌洗涤”)。假定在实施例2的第一次回流和96小时放置时间之后初始固体的20％(即1克)保留在溶液中，因此16ml EtOH溶剂被用于各搅拌洗涤，以保持测试混合物1∶4的质量与体积比。搅拌之后，将各测试混合物经Whatman GF/A玻璃微纤维滤器过滤，收集固体(“搅拌洗涤保留物”)，并在80℃的鼓风机烘箱中干燥，直到该搅拌洗涤保留物维持恒重。将各干燥搅拌洗涤保留物称重，利用上述HPLC方法，分析0.1克样品的新蛇菊苷A含量。
[0114]结果：
[0115]表3显示了采用RA89.95甜菊原材料，在单EtOH回流和搅拌洗涤之后的最终固体(干燥搅拌洗涤保留物)重量、新蛇菊苷A回收率和纯度。
[0116]采用RA81.67甜菊原材料代替RA89.95甜菊原材料，其他条件均相同，重复实施例2的方法，结果示于表4中。
[0117]表4显示采用RA81.67甜菊原材料，在单EtOH回流和搅拌洗涤之后的最终固体(来自搅拌洗涤阶段的干燥保留物)重量、新蛇菊苷A回收率和RebA纯度。从表3中可见，对于较高品质甜菊原材料(RA90)而言，单EtOH回流、然后在无水乙醇中短时间洗涤，足以获得100％纯Reb A最终产物。利用较高品质甜菊原材料，不需要第二次EtOH回流或者在无水乙醇中的回流。在无水乙醇中15分钟洗涤是足够的。
[0118]然而，对于Reb A纯度低大约10％的甜菊原材料(即RA80)，同样的方法(一次EtOH回流，一次搅拌洗涤)不能导致具有96.24％以上新蛇菊苷A含量的最终产物。而且，采用RA80甜菊原材料的收率低大约10％(表4)。因此，对于较低品质甜菊原材料而言，必需使用附加回流阶段以产生99+％纯度Reb A。
[0119]实施例3
[0120]实施例3.一个回流阶段，无搅拌洗涤阶段。
[0121]实施例3说明省略搅拌洗涤阶段对最终产物的新蛇菊苷A纯度的影响。
[0122]在实施例3中，将两个5克RA89.95甜菊原材料样品分别放在两个100ml玻璃圆底烧瓶中，并将每一个与20ml 92Et/08W测试溶剂混合而形成测试混合物(进行该试验，同时仍旧完善原材料分析)。将各测试混合物在80℃下回流1小时。将该两种测试混合物在室温下放置96小时，然后经Whatman GF/A玻璃微纤维滤器(1.6μm孔径)过滤。收集各测试混合物的固体(“回流保留物”)。将一个回流保留物在80℃的鼓风机烘箱中干燥(“非搅拌保留物”)，并将其他回流保留物与16ml 100％乙醇混合并在室温下搅拌(搅拌棒)15分钟，然后经Whatman GF/A玻璃微纤维滤器过滤，收集固体(“搅拌保留物”)。将非搅拌保留物和搅拌保留物在80℃的鼓风机烘箱中干燥，直到所述保留物维持恒重。然后利用上述HPLC方法，对来自两种保留物的0.1克样品分析新蛇菊苷A含量。
[0123]结果：
[0124]干燥非搅拌保留物含有96.32％新蛇菊苷A。干燥搅拌保留物含有100％新蛇菊苷A。因此，除单EtOH回流之外，在无水乙醇中的15分钟搅拌洗涤步骤也是采用RA90甜菊原材料获得最终产物的期望99+％Reb A纯度所必需的。
[0125]实施例4
[0126]实施例4.具有工业方法的乙醇清除和干燥阶段的两个回流阶段，与实验室方法的搅拌洗涤阶段串联。
[0127]实施例4说明，采用较高品质甜菊原材料，在无水乙醇中进行15分钟搅拌洗涤，足以获得具有期望溶度的99+％Reb A最终产物。在实施例4中，通过本发明工业实施方式的两个回流阶段来处理RA89.95甜菊原材料，并且工业方法最终产物的样品被用作本发明实验室实施方式的搅拌洗涤阶段的原料。具体而言，将100千克RA90甜菊原材料与400升90Et/10W溶剂混合(进行该试验，同时仍旧完善原材料分析)，并在80℃下回流1小时，然后冷却(在罐夹套中的冷却水)，并使其在维持在4℃与20℃之间的混合物温度下放置最少2小时。将该混合物过滤经过离心滗析器，并将保留物加入400升90Et/10W溶剂中，并在80℃下回流1小时。将来自第二回流的混合物经过离心滗析器过滤。将过滤第二回流混合物得到的保留物与水混合，直到混合物的体积大约为保留物质量的两倍(例如在700升的总混合物体积中有350kg保留物)。将水中的混合物加热至80℃大约1小时，以便从混合物中清除任何残留乙醇，然后将该混合物喷雾干燥。在喷雾干燥之前，没有在无水乙醇中的回流。将喷雾干燥产物称重，并利用上述HPLC方法，分析0.1克样品的新蛇菊苷A。将5克喷雾干燥物质与20ml无水乙醇在100ml圆底烧瓶中混合，并在在80℃下回流1小时(“回流样品”)，然后使其冷却至室温。将第二个5克喷雾干燥物质与20ml无水乙醇混合并在室温下搅拌15分钟(“搅拌样品”)。将两种样品经Whatman GF/A玻璃纤维滤器(1.6μm孔径)过滤，并将两样品的剩余固体在80℃的鼓风机烘箱中干燥，直到所述固体维持恒重。将回流样品和搅拌样品各1克放在15ml玻璃离心管中。将水以0.1ml增量加入各管中，并充分振荡混合物以确保最大溶解。加入递增的等分水，直到实现完全溶解，这通过在溶液中没有任何可观察的悬浮固体来证实。记下各样品中出现完全溶解时的最终体积。
[0128]结果：
[0129]表5显示利用两个回流阶段而达到的新蛇菊苷A纯度和固体收率，该两个回流阶段伴随有本发明工业实施方式的乙醇清除和干燥阶段。
[0130]表6显示回流样品和搅拌样品在水中的溶度。
[0131]利用与本发明工业实施方式的乙醇清除和干燥阶段串联的两个回流阶段产生了99.6％Reb A纯度产物。然而，该产物在室温下于水中的溶度仅为2％。该溶度对有些商业应用可能是有用的。通过在无水乙醇中的1小时回流而得到的增加的溶度(40％，室温下)将满足如果不是全部也是大部分商业应用的要求。然而，据发现，用在室温下于无水乙醇中进行15分钟搅拌洗涤来代替该1小时回流产生了具有33％溶度的产品(室温下)，该溶度对于大部分商业需求是可接受的，包括浓缩物。
[0132]实施例5
[0133]实施例5.一个回流阶段和搅拌洗涤阶段，放置时间减少且没有冷却。
[0134]实施例5说明放置时间减少和省略冷却对新蛇菊苷A纯度和收率的影响。
[0135]在实施例5中，将五个5克RA81.58甜菊原材料样品和五个5克RA89.95甜菊原材料样品分别放置在两组5个100ml圆底玻璃烧瓶中，并将每一个样品与20ml 92Et/08W溶剂混合(每一个，“测试混合物”)。将所述测试混合物在80℃下回流1小时。回流之后，使给定组中的五个测试混合物在室温下(无搅拌)放置0、18、24、36和160小时，每种放置时间每组一个测试混合物。将各测试混合物经WhatmanGF/A玻璃微纤维滤器(1.6μm孔径)过滤，收集各保留物，并使其与16ml无水乙醇混合(每一个，“测试样品”)并在室温下搅拌(搅拌棒)15分钟。在相应的放置时间之后，将给定测试样品经Whatman GF/A玻璃微纤维滤器过滤，收集保留物并在80℃下干燥，直到固体保持恒重。然后称重各样品，利用上述HPLC方法，对0.1克样品分析Reb A含量。
[0136]结果：
[0137]表7显示各放置时间之后最终产物的收率和新蛇菊苷A纯度。
[0138]对于RA81.58纯度甜菊原材料而言，最少18小时的放置时间使得能够达到最大固体收率。对于RA89.95纯度甜菊原材料而言，零放置时间产生99+％纯度Reb A最终产物。对于较低RA纯度甜菊原材料而言，增加回流阶段之后的放置时间增加了最终产物的收率(当采用较低品质甜菊原材料时，多次回流通常是生产99+％纯度Reb A所需的)。
[0139]实施例6
[0140]实施例6.具有乙醇清除和干燥阶段的一个回流阶段和两个搅拌洗涤阶段，工业规模。
[0141]实施例6说明，当采用较低品质甜菊原材料时，伴随喷雾干燥的单回流和两次搅拌洗涤可以在工业规模下生产具有可接受水溶性的99+％纯度新蛇菊苷A。
[0142]在实施例6中，将五百(500)千克RA83.14甜菊原材料与2000升92Et/08W EtOH溶剂混合并在79℃下回流1小时，然后冷却(罐夹套中的冷却水)至29℃(从回流结束到倾析开始共用时间为7小时15分钟)。将该冷却的回流混合物过滤经过离心滗析器，并将保留物在室温(29℃)下加入1,600升乙醇(400kg保留物质量，1∶4质量与体积比)中并搅拌15分钟(搅拌洗涤阶段)。将该搅拌洗涤混合物经过离心滗析器过滤，然后重复搅拌洗涤阶段，即将来自离心滗析器的保留物在室温下(29℃)加入1,600升乙醇(1∶4质量与体积比)中并搅拌15分钟(第二搅拌洗涤阶段)。将该第二搅拌洗涤混合物经过离心滗析器过滤，并将保留物与水混合，直到混合物的体积大约为保留物质量的两倍(例如在1,600升的总混合物体积中有800kg保留物)。在乙醇清除和干燥阶段，将含水混合物加热至80℃并在此温度下保持大约10小时，以便从该混合物中清除任何残留乙醇，然后将该混合物喷雾干燥。由于喷雾干燥器有限的生产量，所以喷雾干燥过程需要6.5小时。从500kg甜菊原材料中回收了302.3kg固体或者按干重计甜菊原材料的60.46％。该500kg甜菊原材料是RA83.14，也就是说，含有415.7kgReb A。302.3kg固体的回收量表示甜菊原材料中回收了72.3％RebA。最终产物是99.4％纯度Reb A，是利用上述HPLC方法测定的。溶度为59.0％(25℃下)。
[0143]实施例7
[0144]实施例7.改变固体重量与溶剂体积比对纯度和收率的影响。
[0145]实施例7说明任选的质量与体积比分析。
[0146]将10克含82.3％新蛇菊苷A的烘箱干燥的甜菊原材料样品放置在五个100ml玻璃圆底烧瓶中的每一个中，并向每个烧瓶中分别加入20ml、30ml、40ml、50ml和60ml 92Et/08W所选择EtOH溶剂，这导致1∶2至1∶6的质量与溶剂比。
[0147]将磁搅拌棒加入各烧瓶中，并使混合物在80℃搅拌下回流1小时。然后通过将样品放在冰上1小时而使它们冷却。然后将各混合物经Whatman GF/A玻璃纤维滤器过滤。通过加入40ml100％无水乙醇并在室温下搅拌15分钟来洗涤湿固体保留物。然后将混合物经Whatman GF/A玻璃纤维滤器过滤并将湿固体保留物在80℃鼓风机烘箱中干燥。然后称重所产生的干燥固体，并通过如上所述HPLC方法分析新蛇菊苷A含量。
[0148]将两组五个100ml玻璃圆底烧瓶——每一个含有10克RA82.3甜菊原材料和每一烧瓶含有如上所述的各体积的92Et/08W溶剂，进行类似的混合并在80℃下回流1小时，冷却，然后过滤。将湿固体保留物放回五个100ml玻璃圆底烧瓶组中，并且如上所述，在每个烧瓶中加入各体积的92Et/08W溶剂并混合。将所述混合物在80℃下回流1小时，冷却，过滤，然后在40ml无水乙醇中洗涤。然后过滤各洗涤混合物，并将产生的湿固体保留物在80℃的鼓风机烘箱中干燥。称重干燥固体，并通过如上所述的HPLC方法分析新蛇菊苷A含量。
[0149]下面的表7显示利用一个回流阶段和搅拌洗涤阶段进行处理的每一种样品所获得的收率和纯度数据。
表7
使用92Et/08W所选择EtOH溶剂
 回流次数/质量∶溶剂比 ％Reb A  ％固体收率  ％Reb A收率
 1回流/1∶2比 88.88  79.7  70.8
 1回流/1∶3比 90.85  79.7  72.4
 1回流/1∶4比 93.67  78.6  73.6
 1回流/1∶5比 96.51  74.8  72.2
 1回流/1∶6比 97.15  72.8  70.7
[0150]下面的表8显示利用2个回流阶段和1个搅拌洗涤阶段进行处理的每一种样品所获得的收率和纯度数据。
表8
使用92Et/08W所选择EtOH溶剂
 回流次数/质量∶溶剂比 ％Reb A  ％固体收率  ％Reb A收率
 2回流/1∶2比 92.74  65.3  60.6
 2回流/1∶3比 97.42  62.4  60.8
 2回流/1∶4比 99.17  59.9  59.4
 2回流/1∶5比 99.03  56.1  55.6
 2回流/1∶6比 100.00  51.9  52.2
[0151]在上述试验步骤过程中，注意到，采用1∶4以下的质量与溶剂比导致回流之后混合物在烧瓶中凝固。在工业规模采用1∶4以下的比值因此将显著阻碍物质在回流之后从混合罐中转移。从上面的表7中可见，尽管单回流和搅拌洗涤通常提高新蛇菊苷A纯度，然而采用此种特殊RA82.3甜菊原材料，甚至1∶6质量与溶剂比(m/v)都不足以获得99％+纯度Reb A的最终产品。另外，采用单回流和搅拌洗涤，当质量与溶剂比之比增加3倍时，固体收率仅下降7.1％。Reb A收率未显示随固体质量与回流溶剂之比的增加而线性变化。这表明，增加回流溶剂的量并不简单地稀释样品并使回流之后保留在溶液中的固体的量直接成比例增加，而是表明，在回流过程中的化学相互作用——其使得Reb A优先沉淀——更直接地与所选择EtOH溶剂中的水与乙醇之比有关，如在实施例1和2中所示。
[0152]表8显示了采用RA82.3甜菊原材料、两次回流和搅拌洗涤而得到的结果。当采用1∶4或更高的比时，最终产物中的新蛇菊苷A纯度仅仅超过99％。当质量与溶剂比(m/v)增加三倍时，固体回收率下降13.4％。该收率下降大约为采用单回流和单搅拌洗涤所见的两倍，这反映出附加回流阶段的作用。另外，在所使用的质量与溶剂比范围内(1∶2至1∶6(m/v))，新蛇菊苷A收率下降8.4％。特别地，1∶6质量与溶剂比从RA82.3甜菊原材料中产生了100％纯新蛇菊苷A最终产物。
[0153]基于实施例7中的数据，对于99+％Reb A的目标纯度而言，优选最小的1∶4质量与溶剂(m/v)比。可以使用较高的质量与溶剂比，但是由于所消耗的总溶剂、加热和冷却较大混合罐而增加的成本必须与期望目标纯度平衡。实施例7也显示，采用此种特殊的较低品质甜菊原材料时，两个回流阶段和乙醇清除与干燥阶段是获得99+％纯度RebA产品所必需的。
[0154]与实施例7中采用RA82.3甜菊原材料所需的两个回流阶段和单搅拌洗涤阶段相比，实施例6中采用RA83.14甜菊原材料、单回流和两次搅拌洗涤而获得99+％纯度Reb A最终产物的经验阐明了具有任选的质量与溶剂比分析的EtOH配制阶段在工艺优化中的重要性(通常，在最小化操作成本的同时最大化99+％纯度最终产物下的RebA收率)。
[0155]实施例8
[0156]实施例8说明采用一个回流阶段，结合其中质量与溶剂比是变化的两个搅拌洗涤阶段，处理RA82.3甜菊原材料(与实施例7中所用的批量相同)。
[0157]为测定改变单回流阶段之后的两个搅拌洗涤阶段中的溶剂比的影响，将10克RA82.3甜菊原材料的样品放置在四个100ml圆底烧瓶中的每一个中(加入了磁搅拌棒)。将40ml 92Et/08W加入四个烧瓶的每一个烧瓶中，并搅拌混合物以溶解固体。将各混合物在80℃搅拌下回流1小时。回流之后，将各混合物在冰上放置1小时，然后过滤经过Whatman GF/A玻璃微纤维滤纸。将来自各混合物的湿固体保留物放置在分别具有30ml、40ml、50ml或60ml的100％乙醇的100ml圆底烧瓶(加入了磁搅拌棒)中，并用磁搅拌子在室温下搅拌15分钟。然后将各混合物过滤经过Whatman GF/A玻璃微纤维滤纸，以产生四个湿固体保留物样品。将各样品的小样品(大约0.1克)在80℃的鼓风机烘箱中干燥，直到到达恒重，然后通过如上所述的HPLC方法分析新蛇菊苷A含量。将来自各混合物的剩余湿固体保留物放置在分别具有30ml、40ml、50ml或60ml的100％乙醇的100ml圆底烧瓶(加入了磁搅拌棒)中，并用磁搅拌子在室温下搅拌15分钟。最后，过滤各混合物，并将各样品的湿固体保留物在80℃下干燥，直到到达恒重。称重干燥固体的各样品，并利用如上所述的HPLC方法分析干燥固体样品的新蛇菊苷A含量。
[0158]表9
回流次数/质量∶溶剂比   ％Reb A     ％固体收率     ％Reb A收率
1回流1∶4，1洗涤1∶3   89.90     nd*     nd*
1回流1∶4，1洗涤1∶4   89.28     nd*     nd*
1回流1∶4，1洗涤1∶5   90.74     nd*     nd*
1回流1∶4，1洗涤1∶6   92.85     nd*     nd*
1回流1∶4，2洗涤1∶3   95.25     64.4     74.54
1回流1∶4，2洗涤1∶4   96.99     64.2     75.66
1回流1∶4，2洗涤1∶5   95.01     64.0     73.88
1回流1∶4，2洗涤1∶6   95.16     63.7     73.65
*无数据
[0158]基于表9中的数据，第二洗涤步骤的引入提高了最终新蛇菊苷A纯度2.3％至7.7％之间，其中最大纯度增加从附加的1∶4(质量与溶剂比)洗涤可见。然而，采用单回流和两个搅拌洗涤，不管搅拌洗涤阶段中的质量与溶剂比，未获得99+％纯度Reb A的目标产物。不管所用的比率，第二搅拌洗涤阶段之后的最终纯度仅变化1.98％。这表明，仅提高搅拌洗涤阶段(一个或多个)中的质量与溶剂比对提高Reb A纯度没有显著影响。同样地，收率没有显著地受到搅拌洗涤阶段中质量与溶剂比增加的影响。
[0159]实施例9
[0160]实施例9说明采用两个其中质量与溶剂比是变化的两个回流阶段，结合最后的搅拌洗涤阶段(1∶4质量与溶剂比)来处理RA82.3甜菊原材料(与实施例7中所用的批量相同)。
[0161]为测定改变两个回流阶段中的溶剂比的影响，将10克RA82.3甜菊原材料的样品放置在十一个100ml圆底烧瓶中的每一个中(加入了磁搅拌棒)。向该11个烧瓶的三个中，分别将40ml 92Et/08W溶剂加入烧瓶中(统称地，“4x/系列”)，并搅拌混合物以溶解固体。向该11个烧瓶的四个中，分别将50ml 92Et/08W溶剂加入烧瓶中(统称地，“5x/系列”)，并搅拌混合物以溶解固体。向该11个烧瓶的剩余四个中，分别将60ml 92Et/08W溶剂加入烧瓶中(统称地，“6x/系列”)，并搅拌混合物以溶解固体。将各混合物在80℃搅拌下回流1小时。回流之后，将各混合物在冰上放置1小时，然后经Whatman GF/A玻璃微纤维滤纸过滤。将4x/系列中三样品中的湿固体保留物分别与40ml、50ml或60ml的92Et/08W溶剂混合，并将样品在80℃搅拌下回流第二时间。将5x/系列中四样品中的湿固体保留物分别与30ml、40ml、50ml或60ml的92Et/08W溶剂混合，并将样品在80℃搅拌下回流第二时间。将6x/系列中四样品的湿固体保留物分别与30ml、40ml、50ml或60ml的92Et/08W溶剂混合，并将样品在80℃搅拌下回流第二时间。将各混合物在冰上放置1小时，然后经Whatman GF/A玻璃微纤维滤纸过滤。最后，将各样品的湿固体保留物与40ml无水乙醇混合并在室温下搅拌15分钟，然后经Whatman GF/A玻璃微纤维滤纸过滤。然后，将来自各样品的湿固体保留物在80℃下鼓风机烘箱中干燥至恒重。然后称重所有样品，并用如上所述的HPLC方法分析新蛇菊苷A。
[0162]表10
样品*   ％RA   ％固体收率   ％RA收率
4x/4x   100   58.6   71.26
 4x/5x    100     56.7     68.85
 4x/6x    99.5     44.7     53.99
 5x/3x    99.3     49.0     59.12
 5x/4x    99.9     60.2     73.03
 5x/5x    99.9     48.7     59.10
 5x/6x    100     56.9     69.14
 6x/3x    99.0     53.4     64.29
 6x/4x    98.4     60.3     72.10
 6x/5x    100     46.2     56.10
 6x/6x    100     42.9     52.10
*“4x/4x”是指采用1∶4质量与溶剂比的第一回流阶段，之后是采用1∶4质量与溶剂比的第二回流阶段；
“4x/5x”是指采用1∶4质量与溶剂比的第一回流阶段，之后是采用1∶5质量与溶剂比的第二回流阶段；等等。
在所有样品中，第二回流阶段之后是搅拌洗涤阶段。
[0163]表10中的数据显示，改变两个回流步骤的各步骤中的质量与溶剂比对纯度没有大的影响，事实上，所有最终产物达到99+％纯度RebA的期望目标纯度。然而，当考虑固体收率时，新蛇菊苷A回收率受到比值改变的影响。采用1∶4和1∶4以及1∶5和1∶4质量与溶剂比处理的样品在99+％纯度Reb A的目标纯度产生了最高的新蛇菊苷A回收率。因此，实现最大收率和目标纯度的最经济的方法是通过利用具有1∶4质量与溶剂比的第一回流阶段，之后是1∶4质量与溶剂比的第二回流阶段。
表1
    萃取溶剂中的水％     81.58％RA原材料固体回收率％     76.13％RA原材料固体回收率％     71.85％RA原材料固体回收率％
    0     74.2     72.8     69.6
    2     71.8     69.4     64.8
    4     65.2     61.8     56.2
    2     58.4     52     45.6
    8     51.8     44.8     37.8
    10     31.2     29     13.8
图表1：
Figure A20058003568500541
表2
    萃取溶剂中的水％     81.58％RA原材料最终产物纯度％     76.13％RA原材料最终产物纯度％     71.85％RA原材料最终产物纯度％
    0     88.49     87.66     82.68
    2     88.34     88.29     82.38
    4     98.56     95.65     85.99
    2     99.62     98.55     87.59
    8     99.88     99.72     93.87
    10     100     100     100
图表2：
Figure A20058003568500551
表3
    初始萃取中的水％     起始重量克     最终重量克     新蛇菊苷A含量％     新蛇菊苷A回收率％
    0     5     3.970     95.06     83.91
    2     5     3.929     95.82     83.72
    4     5     3.635     98.04     79.24
    2     5     3.647     100     81.09
    8     5     3.609     100     80.24
    10     5     3.422     100     76.08
表4
    初始萃取中的水％     起始重量克     最终重量克     新蛇菊苷A含量％     新蛇菊苷A回收率％
    0     5     3.280     89.76     72.10
    2     5     3.609     88.46     78.18
    4     5     3.106     92.54     70.39
    2     5     2.834     90.59     62.87
    8     5     2.999     94.58     69.46
    10     5     2.882     96.24     67.92
表5
    起始干重(克)     工艺结束Reb A含量(％干重)     工艺结束蛇菊苷含量(％干重)     工艺结束干重(克)     固体回收率％
    100,000     99.6     ND*     68,000     68
表6
样品     ％溶度(固体(g)/最终体积(ml))
无100％乙醇处理     2
在100％乙醇中1小时回流     40
在100％乙醇中15分钟搅拌     33
表7
  81.58％新蛇菊苷A原材料   89.95％新蛇菊苷A原材料
    放置时间(小时) 固体收率％    新蛇菊苷A纯度％ 固体收率％    新蛇菊苷A纯度％
    0   31.6    99.44   73.4    99.87
    18   38.7    99.68   71.8    100
    24   40.5    99.55   72.9    99.84
    36   38.5    99.45   72.8    100
    160   40.1    99.48   72.2    99.77

Claims (20)

1.一种从甜菊原材料中纯化新蛇菊苷A的方法，包括：利用下面的步骤处理甜菊原材料：(i)EtOH配制阶段，以配制所选择EtOH溶剂，(ii)利用甜菊原材料的第一回流阶段，以及任选的利用分离自回流混合物或搅拌洗涤混合物的保留物的附加回流阶段，(iii)任选地，一个或多个搅拌洗涤阶段，和(iv)乙醇清除和干燥阶段。
2.一种从甜菊原材料中纯化新蛇菊苷A的方法，包括：
配制用于所述甜菊原材料的所选择EtOH溶剂；
在所述所选择EtOH溶剂中混合并回流所述甜菊原材料，以产生回流混合物；
通过过滤所述回流混合物分离保留物；
在乙醇中混合并搅拌所述保留物，以产生搅拌洗涤混合物；
通过过滤所述搅拌洗涤混合物，分离保留物；和
清除所述乙醇并干燥所述保留物，其中所述干燥的保留物是新蛇菊苷A。
3.一种从甜菊原材料中纯化新蛇菊苷A的方法，包括：
配制用于所述甜菊原材料的所选择EtOH溶剂；
在所述所选择EtOH溶剂中混合并回流所述甜菊原材料，以产生回流混合物；
通过过滤所述回流混合物分离保留物，以及任选地在乙醇中混合并搅拌所述保留物，以产生搅拌洗涤混合物，并且通过过滤所述搅拌洗涤混合物，分离保留物；
在所述所选择EtOH溶剂中混合并回流所述保留物，以产生回流混合物；
通过过滤所述回流混合物，分离保留物，以及任选地在乙醇中混合并搅拌所述保留物，以产生搅拌洗涤混合物，并且通过过滤所述搅拌洗涤混合物，分离保留物；
任选地重复一次或多次前述两个步骤；和
清除所述乙醇并干燥所述保留物，其中所述干燥的保留物是新蛇菊苷A。
4.权利要求1、2或3所述的方法，其中所述配制所选择EtOH溶剂的方法包括原材料分析或回流溶剂近似，以及任选地包括重量与体积比分析。
5.权利要求1、2或3所述的方法，其中所述混合并回流所述甜菊原材料的方法包括：
使1质量份甜菊原材料与3至10体积份、更优选4至6体积份以及最优选约4体积份的所选择EtOH溶剂混合，以产生回流混合物；和
在适当的装置中大约在乙醇的沸点下回流所述回流混合物大约1小时。
6.权利要求1或3所述的方法，其中所述在一个或多个附加回流中混合并回流所述保留物的方法包括：
使1质量份所述保留物与3至10体积份、更优选4至6体积份以及最优选约4体积份的所选择EtOH溶剂混合，以产生回流混合物；和
在适当的装置中大约在乙醇的沸点下回流所述回流混合物大约1小时。
7.权利要求1、2或3所述的方法，其中所述通过过滤所述回流混合物或搅拌洗涤混合物而分离保留物的方法包括：
采用过滤工具过滤所述混合物，所述过滤工具适于回流混合物体积以及所需生产量并且分离轴或直径大约为2.0μm以上，更优选1.5μm以上，以及最优选等于或大于0.1μm的颗粒；和
从所述过滤工具收集所述分离的颗粒。
8.权利要求1、2或3所述的方法，其中所述在搅拌洗涤中混合并搅拌来自前面步骤的保留物并且通过过滤所述搅拌洗涤混合物而分离保留物的方法包括：
使1质量份所述分离的新蛇菊苷A与3至10体积份、更优选4至6体积份以及最优选约4体积份乙醇混合，以产生洗涤混合物；
在适当的装置中搅拌所述洗涤混合物大约15分钟；
采用过滤工具过滤所述洗涤混合物，所述过滤工具适于回流混合物体积以及所需生产量，并且分离轴或直径大约为2.0μm以上，更优选1.5μm以上，以及最优选等于或大于0.1μm的颗粒；和
从所述过滤工具收集所述分离的颗粒。
9.权利要求1、2或3所述的方法，其中所述清除乙醇和干燥所述分离的新蛇菊苷A的方法包括，在本发明的实验室实施方式中，在79℃或以上的烘箱、优选鼓风机烘箱中干燥所述分离的新蛇菊苷A，以及在本发明工业实施方式中，包括：
使1质量份通过过滤回流混合物或搅拌洗涤混合物而在前面步骤中分离的保留物与水混合，使得最终混合物量大约为所述保留物质量的两倍；
在搅拌的同时将所述混合物在敞开容器中加热至至少79℃；
搅拌所述混合物，直到所述混合物的乙醇含量等于或小于联合的喷雾干燥器所允许的最大乙醇含量；
将所述混合物送入所述喷雾干燥器；和
收集所述干燥的新蛇菊苷A。
10.权利要求1、2或3所述的方法，其中在配制所述EtOH溶剂以及在所选择EtOH溶剂中所使用的乙醇是无水乙醇或变性乙醇。
11.权利要求1、2或3所述的方法，其中除乙醇之外的链烷醇代替乙醇用在所述所选择EtOH溶剂中。
12.权利要求1、2或3所述的方法，其中链烷醇代替乙醇用在所述所选择EtOH溶剂中以及用在任何搅拌洗涤阶段中。
13.权利要求1、2或3所述的方法，其中第一链烷醇被用在所选择EtOH溶剂中，而第二链烷醇被用在任何搅拌洗涤阶段中。
14.新蛇菊苷A，其采用权利要求1、2或3所述的方法生产。
15.新蛇菊苷A，其采用权利要求1、2或3所述的方法生产，并且用在选自下述的饮料、汤汁和饮料配制品中：碳酸的、非碳酸的、冰冻的、半冰冻的、非冰冻的、即饮型、浓缩型、奶制品、非奶制品、药草、非药草、咖啡因型、非咖啡因型、酒精型、非酒精型、香味的、无香味的、蔬菜型、水果型、根/块茎/球茎型、坚果型、其他植物型、可乐型、巧克力型、肉类型、海味型、其他动物型、藻类型、热量增强型、热量减少型和无热量产品，其任选地分配在开口容器、罐、瓶或其他包装中。
16.新蛇菊苷A，其采用权利要求1、2或3所述的方法生产，并且用在选自奶制品型、谷类型、烘焙型、蔬菜型、水果型、根/块茎/球茎型、坚果型、其他植物型、蛋类型、肉类型、海味型、其他动物型、藻类型、已加工的、保存的和合成产品的食品和食品配制品中。
17.新蛇菊苷A，其采用权利要求1、2或3所述的方法生产，并且用在选自下述的糖果、蜜饯、甜品和快餐中：奶制品型、谷类型、烘焙型、蔬菜型、水果型、根/块茎/球茎型、坚果型、树胶型、其他植物型、蛋类型、肉类型、海味型、其他动物型、藻类型、已加工的、保存的和合成产品。
18.新蛇菊苷A，其采用权利要求1、2或3所述的方法生产，并且用在选自下述的处方和非处方药物、检定、诊断试剂盒和治疗中：重量控制、营养补充、维生素、婴儿食物、糖尿病患者食物、运动员食物、老人食物、低碳水化合物食物、低脂食物、低蛋白食物、高碳水化合物食物、高脂食物、高蛋白食物、低卡路里饮食、无热量饮食、口腔卫生产品、个人护理产品、专业牙科产品、内科、兽医和外科产品以及药物混合填料、糖浆、胶囊、凝胶和涂覆产品。
19.新蛇菊苷A，其采用权利要求1、2或3所述的方法生产，并且用在选自下述的消费品包装材料和容器中：塑料膜、热固性和热塑性树脂、树胶、箔、纸、瓶、箱、油墨、油漆、胶粘剂和包装涂敷产品。
20.新蛇菊苷A，其采用权利要求1、2或3所述的方法生产，并且用在选自增甜剂、辅助增甜剂、涂布增甜剂棒、冰冻蜜饯棒、药勺(人和兽医用途)、牙科器械、预加糖一次性餐具和用具、香袋、可食用香粉、芬芳袋、可食用芬芳袋、杂烩、可食用杂烩、人工花、可食用人工花、衣服、可食用衣服、按摩油和可食用按摩油的物品中。
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