CH649305A5

CH649305A5 - D-phenylalanyl-l-prolyl-l-arginin-aldehyd-sulfat.

Info

Publication number: CH649305A5
Application number: CH148/82A
Authority: CH
Inventors: Sandor Dr Bajusz; Erzsebet-Hasenoehrl Szell; Eva Dr Barabas; Daniel Dr Bagdy
Original assignee: Richter Gedeon Vegyeszet
Priority date: 1981-01-13
Filing date: 1982-01-12
Publication date: 1985-05-15
Also published as: US4399065A; JPS57181046A; JPH0251920B2; GB2091270B; SE8200135L; IT1210842B; SU1442078A3; SE453509B; IL64761A0; CA1182111A; DE3200812A1; ATA9782A; NL8200105A; DK151341C; PT74268B; DK151341B; FI74024C; GB2091270A; PT74268A; IT8219074A0

Description

Die Erfindung betrifft D-Phenylalanyl-L-prolyl-L-arginin-aldehyd-sulf at, das auch in einer wässrigen Lösung über eine hohe Stabilität verfügt.

Es ist bekannt, dass bei der antikoagulenten Therapie gegenwärtig Heparin und Polyanione mit ähnlicher Struktur (Hepari-noide) sowie Kumarinderivate eingesetzt werden. Diesen Verbindungen ist gemeinsam, dass sie die zur Blutgerinnung führenden proteolytischen Reaktionen nicht direkt hemmen. Das Heparin beschleunigt als Katalysator die Hemmungsreaktion des einen Plasma-Inhibitors, das Antithrombin-III und die der Enzyme des Gerinnungsprozesses, in erster Linie des Throm-bins. Die Kumarinderivate hingegen verzögern die Biosynthese dery-Carboxy-glutaminsäure(Gla) enthaltenden Eiweisse. An der Blutgerinnung nehmen vier Eiweisse solchen Typs teil, z. B. das Prothrombin. Die Gla-Teile nicht oder in nicht ausreichender Zahl enthaltenden Blutgerinnungsfaktoren sind inaktiv, sie nehmen am Blutgerinnungsprozess nicht teil. Es ist zu bemerken, dass die Syntheseinhibierung allgemein gültig ist, also z.B. einer der natürlichen Inhibitoren des Gerinnungsprozesses, das sogenannte C-Eiweiss (oder XI V-Faktor) auch in inaktiver Form in der Gegenwart von Kumarinderivaten synthetisiert wird, was nicht mehr vorteilhaft ist. Charakteristisch ist auch, dass das Heparin vor allem für intravenöse Infusionen verwendet wird, oral ist es praktisch wirkungslos, während die Kumarinderivate nur oral verabreicht werden können. Die Wirkung des Heparins tritt kurz nach der Verabreichung ein, die der Kumarinderivate -da sie Syntheseinhibitoren sind - erst nach 24—36 Stunden.

Weiterhin ist bekannt, dass einige Tripeptid-aldehyde ebenfalls über eine antikoagulente Wirkung verfügen und abweichend vom Obigen direkt auf das Thrombin wirken, auch in der Abwesenheit von Antithrombin-III hemmen sie dessen proteolytische Reaktionen. Das ist z. B. der Fall bei dem in der ungarischen Patentschrift Nr. 169 870 beschriebenen D-Phenyl-alanyl-L-prolyl-L-arginin-aldehyd-acetat. Ein Thrombin-Inhibitor mit ähnlich grosser Wirkung ist das in der belgischen Patentschrift Nr. 880 844 bekanntgemachte D-Phenylalanyl-L-prolyl-NG-carboxy-L-arginin-aldehyd.

Unserer Beobachtung nach ist die Antithrombin-Aktivität der Salze der obigen synthetischen Arginin-peptid-aldehyde, besonders der freies Aminoterminal enthaltenden Verbindungen, wie z. B. des beschriebenen D-Phenylalanyl-L-prolyl-L-arginin-alde-hyd-acetats und -chlorhydrats, unterschiedlich und bei Stehen in wässriger Lösung nimmt sie schnell ab, was die therapeutische Verwendung unmöglich macht. Das NG-Carboxyderivat der freien Tripeptid-aldehyde, z. B. des D-Phenylalanyl-L-prolyl-NG-carboxy-L-arginin-aldehyd, bewahrt zwar in einer wässrigen Pufferlösung 20-24 h lang seine Aktivität, aber nach einigen Tagen kann schon eine beträchtliche Aktivitätsabnahme beobachtet werden, und nach einigen Monaten lässt seine ursprüngliche Wirksamkeit auch in festem Zustand nach.

Das Ziel der Erfindung ist die Sicherung eines Verfahrens zur Herstellung eines neuen, abweichend vom Bisherigen auch in wässriger Lösung stabilen Salzes des D-Phenylalanyl-L-prolyl-L-arginin-aldehyds.

Es wurde nun gefunden, dass die Stabilität der verschiedenen Salze des D-Phenylalanyl-L-prolyl-L-arginin-aldehyds in wässriger Lösung, z. B. in physiologischer Kochsalzlösung, sehr unterschiedlich ist. Bei unseren Untersuchungen wurden die Peptide in einer Konzentration von 10 mg/ml gelöst und die Änderung der Antithrombin-Aktivität der gelösten Stoffe 180 Tage lang beobachtet. Die Lösungen wurden bei einer Temperatur von 5° C gelagert. Die Aktivitätswerte wurden in einem System, das aus folgenden Komponenten besteht, festgestellt:

0,2 ml 0,5%iges Rinderfibrinogen in einer 0,9%igen Kochsalzlösung,

0,1 ml Tris(hydroxymethyl)-amino-methan-chlorhydrat-Salz-säurepuffer (pH = 7,2), der die Peptidlösung enthält, und

0,1 ml US Standard Human Thrombin (NIH, Bethesda, Maryland, USA), 10 Einheiten/ml Lösung.

Die Gerinnungszeit des Systems beträgt ohne Peptid 15, bestimmt in einem «Schnither-Gross-Coagulometer». Die Aktivität von Tripeptid-aldehydsalz wurde mit 100 bewertet, wenn bei einer 3,5 x 10"7M Reaktionsgemisch-Endkonzentration (bei Tripeptid-aldehyd-sulfat 0,175 |xg/ml Reaktionsgemisch) eine fünffache relative Gerinnungszeit erreicht wurde.

Die Ergebnisse der Untersuchungen sind in Tabelle I zusam-mengefasst. Daraus geht hervor, dass während die anfängliche Aktivität des entsprechenden Chlorhydrats in physiologischer Kochsalzlösung nach 5 Tagen, die Aktivität von Acetat, Citrat, Tartarat sowie Tosylat schon nach einigen Tagen abzunehmen beginnt (ähnliche Eigenschaften weist auch das NG-Carboxy-derivat vonTripeptidaldehyd auf), das D-Phenylalanyl-L-prolyl-L-arginin-aldehyd-sulfat auch noch nach 90 Tagen seine Anti-thrombin-Aktivität bewahrt.

In prolongierten Stabilitätsuntersuchungen erwies sich das D-Phenylalanyl-L-prolyl-L-arginin-aldehyd-sulfat selbst nach 180 Tagen in wässriger Lösung noch als stabil, und auch in festem Zustand verliert es über 6 Monate hinweg nichts von seiner Aktivität.

2

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

649 305

Tabelle I

Änderung der Antithrombin-Aktivität von Tripeptidaldehydsalzen in physiologischer Kochsalzlösung

Peptid-aldehyd"

0

5

10

Relative Aktivitätb 15 Tagen nach 20

40

90

D-Phe-Pro-Arg-H-2 CH3COOHcd

70-50

60-40

40-30

35-25

30-20

D-Phe-Pro-Arg-H • 2 HC1C

90-60

80-50

70-40

60-40

50-30

40-30

D-Phe-Pro-Arg(COOH)-He

100

80

60

50

30

25

20

D-Phe-Pro-Arg-H-HiSO/

100

a Die Abkürzungen entsprechen der Fachliteratur [z. B. J. Biol. Chem., 247,977 (1972)] sowie Z steht für eine Benzyloxy-carbonyl-gruppe, Arg(COOH) und Arg(Z) bedeuten eine N°-Carboxy- bzw. NG-Benzyloxy-carbonyl-L-arginin-gruppe.

b Die Antithrombin-Aktivität ist 100, wenn das Peptid-aldehyd in einer 3,5 X 10"7M Reaktionsgemisch-Endkonzentration eine fünffache relative Gerinnungszeit hervorruft.

c Ein durch Hydrierung von Z-D-Phe-Pro-Arg(Z)-H in Gegenwart einer äquivalenten Säuremenge hergestelltes Produkt. d Ähnlich wie beim Acetat ändert sich die Antithrombin-Aktivität des entsprechenden Citrats, Tartarats und Tosylats.

e Wie in der belgischen Patentschrift Nr. 880844 beschrieben hergestelltes Produkt.

f Auf in der vorliegenden Patentanmeldung beschriebene Weise hergestelltes Produkt.

15 Die Antithrombin-Aktivität der Tripeptid-aldehyd-salze sowie des Carbaminsäure-derivats wurde auch an menschlichem Plasma, das den biologischen Bedingungen besser entspricht, in folgendem System untersucht:

0,2 ml humanes Citratplasma, 20 0,1 mlTris(hydroxymethyl)-amino-methan-chlorhydrat-Salz-säurepuffer (pH = 7,2), der auch die Peptidlösung enthält und

Die Gerinnungszeit des Systems wurde ohne Peptid in einem 2515 s «Schnither-Gross-Coagulometer» bestimmt.

Tabelle II

Antithrombin-Aktivität von Tripeptid-aldehyd-derivaten bei Humanplasma

Peptid-aldehyd

Zur doppelten Verlängerung der Gerinnungszeit notwendige Peptid-menge in einer ug/ml-Reaktionsgemisch-Konzentration direkt nach dem Auflösen des Peptids

Relative Aktivität

D-Phe-Pro-Arg-H-H2S04

D-Phe-Pro-Arg(COÓH)-H

D-Phe-Pro-Arg-H-2CH3COOH

D-Phe-Pro-Arg-H-2HCl

Heparin3

0,020 0,042

0,065-0,140 0,060-0,130 0,105

100 45

35-14 33-15 19

a Mit im Handel erhältlichem (132,2 E/mg, US. Ph. XVII.) 40 Antithrombin-Wirkung des D-Phenylalanyl-L-prolyl-L-arginin-Heparin gemessene Angabe aldehyd-sulfats ist in vivo auch sehr gross. Bei intravenöser und

Aus den Angaben von Tabelle II ist ersichtlich, dass die zur subkutaner Verabreichung reicht sie an die Wirkung des in der doppelten Verlängerung der Kontrollgerinnungszeit notwendige Therapie allgemein verwendeten Heparins heran, im Vergleich Peptidmenge bei Acetat und Chlorhydratsalzen von den Chargen zu Heparin verfügt es sogar über eine Pluswirkung. Nämlich abhängt und das Mehrfache, auch bei Carbaminsäure das Dop- 45 während das Heparin per os wirkungslos ist, kann mit dem pelte der Tripeptid-aldehyd-sulfatmenge beträgt. Tripeptid-aldehyd-sulfat in einer oralen Dosis von 25 mg/kg eine

Das Ergebnis der in vivo Untersuchungen der Tripeptid- therapeutische Wirkung erzielt werden (mit Carbaminsäure nur aldehyd-derivate wurde in Tabelle III zusammengefasst. Die in einer Dosis von 50 mg/kg.

Tabelle III In vivo Untersuchungen Zur Erzielung einer therapeutischen Wirkung" notwendige Dosis mg/kg/S td. mg/kg

Peptid-aldehyd i.v. Infusion subkutan per os

Kaninchen Hund Kaninchen Hund Kaninchen Hund

D-Phe-Pro-Arg-H-2CH3COOH

D-Phe-Pro-Arg-H-2HCl

D-Phe-Pro-Arg(COOH)-H

D-Phe-Pro-Arg-H-H2S04

Heparin

3,0 10,0

1,0 0,5 6,0

0,6 0,5 5,0

100 100

100

6,0 50 50

6,0 25 25

2,0 - -

Eine Therapeutische Wirkung wurde durch diel, 5-2,5-fache 65 Macmillan Pubi., Co. Inc., New York; Verstraete, M. Verwil-

Verlängerung der ganzen Blutgerinnungszeit gekennzeichnet ghen, R. (1980) in Drug Treatment, Principles and Practice of

[Fachliteratur: Nies, A.S. (1978) in Clinical Pharmacology (Mei- Clinical Pharmacology andTherapeutics, 2. Ausgabe, Avery,

mon,K.L. and Morelli, F.F. eds.)2. Ausgabe, S. 303-306, G.S. ed. (1980), S. 889-952, Edinburgh and London].

649 305 4

Auch die Toxitätsangaben von D-Phenylalanyl-L-prolyl-L- tätswerte aufgeführt, die bei Tripeptid-aldehyd-sulfat bei Mäu-arginin-aldehyd-sulfat sind positiver als die von Acetat sowie die sen einen Wert grösser als 2 g/kg ergaben, des Carbaminsäurederivats. In Tabelle IV sind die akuten Toxi-

Tabelle IV Akute Toxitätswerte bei Mäusen

Peptid-aldehyd

LDjn in mg/kg i.v. Bolus i.p.

p.o.

D-Phe-Pro-Arg-H • 2CH3COOH D-Phe-Pro-Arg(COOH)-Ha D-Phe-Pro-Arg-H-H2S04 Heparin

9 38

45b 230

keine Literaturangaben

1800

960

1200

>2000

a Wegen Löslichkeitsproblemen können die Toxitätsangaben für andere Verabreichungsformen nicht mit entsprechender Sicherheit gegeben werden.

b Bei einer einstündigen intravenösen Infusion ergab sich bei Kaninchen ein LD50-Wert von 58 mg/kg.

Im Hinblick auf die niedrige Toxität und hohe Wirksamkeit des D-Phenylalanyl-L-prolyl-L-arginin-aldehyd-sulfats ist der beide Faktoren berücksichtigende therapeutische Index - der von der pharmazeutischen Verwendung einer Verbindung her gesehen eine der wichtigsten Angaben ist-viel vorteilhafter als der der übrigen Tripeptid-aldehydderivate.

Aufgrund von intravenösen Infusionsuntersuchungen an Hunden beträgt die geplante humane intravenöse Infusionsdosis 1-2 mg/kg/Std.

Es wurde nun gefunden, dass das D-Phenylalanyl-L-propyl-L-arginin-aldehyd-sulfat einfach in zufriedenstellender Reinheit aus einem entsprechenden, auf seinem Aminoterminal eine säureempfindliche Schutzgruppe, z. B. Triphenyl-methyl- oder tert.-Alkyloxy-carbonylschutzgruppe enthaltenden Derivat hergestellt werden kann, z.B. aus tert.-Butyloxy-carbonyl-D-phe-nylalanyl-L-prolyl-L-arginin-aldehyd-hemisulfat oder aus tert.-Butyloxy-carbonyl-D-phenyl-alanyl-L-prolyl-N°-carboxy-argi-nin-aldehy d mit dem 1- bis 12-f achen der äquivalenten Menge von 1-12 n wässriger Schwefelsäure. Gleichzeitig hatten solche an sich bekannte Verfahren keinen Erfolg, wie z. B.

a) die Acidolyse der tert.-Butyloxy-carbonyl-gruppe mit Essigsäure gelöster Schwefelsäure [Beyerman et al. : in Peptides 1970 (Red.: H. Nesvadba), S. 138,NorthHolland, Amsterdam, 1973];

b) die direkte Überführung des D-Phe-Pro-Arg(COOH)-H Carbaminsäurederivates gemäss der belgischen Patentschrift Nr. 880844 zu einem freien Tripeptid-aldehyd-sulfat mit Schwefelsäure;

c) die Umsetzung von anderen Salzen des freien Tripeptid-aldehyds, z. B. des D-Phenylalanyl-L-prolyl-L-arginin-aldehyd-acetats nach der ungarischen Patentschrift Nr. 169 870, zu einem schwefelsauren Salz mit Ionenaustauscherharz oder Schwefelsäure.

Die mit den Methoden a-c gewonnenen Produkte waren nach den dünnschichtchromatographischen Untersuchungen nicht einheitlich und/oder verfügten in wässriger Lösung nicht über ausreichende Stabilität.

Dementsprechend betrifft die Erfindung weiterhin ein Verfahren zur Herstellung von D-Phenylalanyl-L-prolyl-L-arginin-alde-hyd-sulfat aus an seiner endständigen Aminogruppe eine säureempfindliche Schutzgruppe aufweisenden D-Phenyl-alanyl-L-prolyl-L-arginin-aldehyd-hemisulfat oder D-Phenylalanyl-L-prolyl-NG-carboxy-L-arginin-aldehyd, das darin besteht, dass die säureempfindliche Schutzgruppe des Aminoterminals und die allfällig vorhandene N°-Carboxy-gruppe mit in einer 1-12 äquivalenten Menge angewendeter 1-12 n wässriger Schwefelsäure entfernt und dann das entstandene freie Tripeptid-aldehyd-sulfat abgetrennt wird.

25

Nach einer vorteilhaften Ausführungsform des erfindungsge-mässen Verfahrens wird so vorgegangen, dass auf seiner Guani-dino-Gruppe durch eine Benzyloxycarbonylgruppe geschütztes L-Arginin-laktam mit tert.-Butyloxy-carbonyl-D-phenylalanyl-20 L-prolin kondensiert, das entstandene geschützte Tripeptid-laktam reduziert wird, die Benzyloxy-carbonyl-gruppe auf der Guanidino-gruppe des erhaltenen geschützten Tripeptid-alde-hyds in Gegenwart einer äquivalenten Menge Schwefelsäure in 30—40 % Wasser enthaltendem Äthanol oder Tetrahydrofuran hydriert wird, dann wird das erhaltene, an seinem Aminoterminal geschützte Tripeptid-aldehyd-hemisulfat in mit einer Menge von 8-12 Äquivalenten, zweckmässig 10 Äquivalenten angewendeter 4-6 n, zweckmässig 5 n Schwefelsäure aufgelöst, 20-40, zweckmässig 30 min bei einer Temperatur von 40-60° C, zweck-30 mässig 50° C gehalten, dann wird die Lösung mit Kalziumcarbo-nat neutralisiert und filtriert. Die Lösung wird zweckmässig lyophilisiert. Das so hergestellte Produkt kann gegebenenfalls 4-6 % Kalziumsulfat enthalten, was allerdings die biologische Wirkung bzw. die pharmazeutische Verwendung des Produkts 35 nicht beeinflusst.

Das erfindungsgemässe Verfahren wird anhand der folgenden Durchführungsbeispiele weiter veranschaulicht.

Die in den Beispielen angegebenen RrWerte wurden durch Silikagel (Kieselgel G, Reanal, Budapest) Schichtchromatogra-40 phie in folgenden Lösungsmitteln bestimmt:

1. Äthylacetat-Pyridin-Essigsäure-Wasser - 480:20:6:11

2. Äthylacetat-Pyridin-Essigsäure-Wasser- 60:20:6:11

3. Äthylacetat-Pyridin-Essigsäure-Wasser- 30:20:6:11

45

Beispiel 1

Herstellung von D-Phenylalanyl-L-prolyl-L-arginin-aldehyd-

sulfat so 2,74 g (5 mMol) tert.-Butyloxy-carbonyl-D-phenylalanyl-L-prolyl-L-arginin-aldehyd-hemisulfat werden in 5 ml Wasser aufgelöst, unter Rühren werden 5 ml 10 n Schwefelsäure zugesetzt und auf 50° C erwärmt. Die Lösung wird 15 min lang bei 50° C gerührt, dann mit 25 ml Eiswasser verdünnt, und während dem 55 Kühlen mit Eiswasser wird der pH-Wert mit festem Kalzium-carbonat (etwa2,25 g sind notwendig) auf 6,5 eingestellt. Das ausgeschiedene Kalziumsulfat wird abfiltriert und zweimal mit 5 ml Wasser gewaschen. Das Filtrat wird zweimal mit 10 ml n-Butanol aufgeschüttelt, das bei vermindertem Druck auf etwa so 30 ml verdichtet, gewünschtenfalls filtriert und lyophilisiert. 2,25 g (79 %) der im Titel genannten Verbindung werden erhalten, die 4,8% Kalziumsulfat erhält.

Rf = 0,35-0,40

M d = —117±1° (c = 1, in Wasser)

65 Elementaranalyse für C2oH3o03N6-H->OS04-3H->C)-0,2CaSC)4 (M = 565,85)

ber. : C 42,45 %, H 6,77 %, N 14,85 %, S0420,37 %, Ca 1,41 %, H->0 9,55 %

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gef.: C42,2 %, H 6,9 %, N 14,85 %, S0419,8 %, Ca 1,3 %, H.O 9,75%.

Der Ausgangsstoff wurde wie folgt hergestellt:

Schritt 1: tert.-Butyloxy-carbonyl-D-phenylalanyl-L-prolyl-NG-benzyloxy-carbonyl-L-arginin-lactam

8,6 g (22 mMol) tert.-Butyloxy-carbonyl-NG-benzyloxy-carbo-nyl-L-arginin-lactam (belgische Patentschrift Nr. 880844) werden in 20 ml Äthylacetat suspendiert, und bei einer Temperatur von 5° C werden unter Rühren 40 ml 4 M äthylacetathaltige Salzsäurelösung zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wird unter Kühlen mit Eiswasser 30 min gerührt, dann mit 100 ml gekühltem Äthylacetat verdünnt, der abgeschiedene Niederschlag abfiltriert, mit Äthylacetat gewaschen und über Kaliumhydroxyd in einem Vakuumexsikkator getrocknet. Das so gewonnene N°-Benzyloxy-carbonyl-L-arginin-Iactam-chlorhydrat wird in 20 ml Dimethylformamid gelöst und nach Kühlen auf -10° C werden 6,2 ml (44 mMol) Triäthylamin zugesetzt. Die entstehende Suspension wird dem folgenden Änhydrid zugesetzt.

7,5 g (20 mMol) tert.-Butyloxy-carbonyl-D-phenylalanyl-L-prolin [U. Ludescher und R. Schwyzer: Helv. Chim. Acta 55, 2052 (1972)] und 2,22 ml (20 mMol) N-Methyl-morpholin werden in 20 ml Dimethylformamid aufgelöst. Die Lösung wird auf -15° C gekühlt und unter Rühren werden 2,64 ml (20 mMol) Chlorkohlensäure-isobutylester, dann nach 5 min die obige Dimethylformamidlösung zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wird weiterhin eine Stunde lang bei —15° C und eine Stunde lang bei 0°C gerührt. Dann wird es mit 30 ml Benzol verdünnt, die abgeschiedenen Salze werden abfiltriert und zweimal mit 10 ml Benzol gewaschen. Die Benzol enthaltende Dimethylformamidlösung wird mit 50 ml Wasser verdünnt und die Phasen werden getrennt. Die wässrige Phase wird zweimal mit 10 ml Benzol ausgeschüttelt, dann werden die vereinigten benzolhaltigen Lösungen nacheinander dreimal mit 30 ml 10%igerNatriumcar-bonatlösung, 30 ml Wasser, dreimal mit 30 ml 0,5 n Schwefelsäure und zweimal mit 30 ml Wasser gewaschen, dann nach Trocknen über wasserfreiem Natriumsulfat bei vermindertem Druck eingedampft. Der Eindampfrückstand wird mit Petrol-äther verrieben, filtriert, mit Petroläther gewaschen und an der Luft getrocknet. 9,65 g (76 %) der im Titel genannten Verbindung werden erhalten.

R{ = 0,81-0,89

Schritt 2: tert.-Butyloxy-carbonyl-D-phenylalanyl-L-prolyl-NG-benzyloxy-carbonyl-L-arginin-aldehyd

9,52 g (15 mMol) geschütztes Tripeptid-lactam (Schritt 1) werden in 45 ml Tetrahydrofuran aufgelöst, bei einer Temperatur von —20° C werden unter starkem Rühren 11,25 mMol Lithium-aluminiumhydrid enthaltende Tetrahydrofuran-LiAlH4-Lösung (von einer 0,4 molaren Lösung etwa 28 ml) zugesetzt. Der Erfolg der Reduktion wird durch Schichtchromatographie kontrolliert (der Rj-Wert des Lactams beträgt 0,71-0,77 und der des Aldehyds 0,31-0,39), falls notwendig kann weitere Hydridlösung zugesetzt werden. Am Ende der Reaktion wird die Tetrahydrofuranlösung vorsichtig mit 0,5 n Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 3 angesäuert, dann mit Wasser so verdünnt, dass der Stoff nicht ausgeschieden wird (etwa 100 ml). Dann wird sie zweimal mit 30 ml n-Hexan ausgeschüttelt. Die wässrige tetrahydrofuranhaltige Lösung wird dreimal mit 75 ml Methylen-chlorid ausgeschüttelt, dann werden die vereinigten Methylen-chlorid-Lösungen dreimal mit 10 ml 10%iger Natrium-carbonatlösung und zweimal mit 10 ml Wasser gewaschen. Dann wird die methylenchloridhaltige Lösung über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingedampft. Der Eindampfsrückstand wird in 50 ml Benzol aufgelöst und die Lösung erneut bei gesenktem Druck eingedampft. Das Lösen in Benzol und das Eindampfen werden noch einmal wiederholt. Der so erhaltene Eindampfsrückstand wird mit Diäthyläther verrieben, filtriert, mit Diäthyläther gewaschen und an der Luft getrocknet. 6,9 g (72 %) der im Titel genannten Verbindung werden erhalten.

Rf = 0,3-0,4.

5 Schritt 3: tert.-butyloxy-carbonyl-D-phenylalanyl-L-prolyl-L-ar-ginin-aldehyd-hemisulfat

6,4 g (10 mMol) geschütztes Tripeptid-aldehyd (Schritt 2) werden in einem Gemisch von 50 ml Wasser, 50 ml Tetrahydrofuran und 10 ml 1 n Schwefelsäure gelöst, dann in Gegenwart von 1 g 10%igem Palladium-Aktivkohle-Katalysator hydriert. Dem Fortschreiten der Reaktion wird mit Schichtchromatographie gefolgt (der Rf-Wert des an seiner Guanidino-Gruppe geschützten Tripeptidaldehyds beträgt 0,95-1,0 und der Rf-Wert des freien Tripeptidaldehyds 0,45-0,54). Am Ende der Reaktion wird der Katalysator abfiltriert, mit 30 ml 50%igem wässrigem Tetrahydrofuran gewaschen, dann wird das Filtrat unter vermindertem Druck auf etwa 60 ml verdichtet. Der Rückstand wird viermal mit 40 ml Butanol ausgeschüttelt. Enthält die wässrige Phase das im Titel genannte Produkt (Rf = 0,45-0,54), so werden 5 ml Tetrahydrofuran zugesetzt, und sie wird zwei bis dreimal mit 40 ml n-Butanol ausgeschüttelt. Die n-Butanolphasen werden vereinigt und bei vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Der Eindampfsrückstand wird mit einem Gemisch von 1:1 Diäthyläther-Diisopropyläther verrieben, filtriert und mit dem 25 obigen Gemisch gewaschen, dann in einem Vakuumexsikkator getrocknet. 4,4 g (80 %) des im Titel genannten Produkts werden erhalten.

Rf = 0,45-0,54

[a] d = —65±1° (c = 1, in Wasser)

30 Analyse auf die Formel C25H3805N6.0,5 H2S04 (551,64) bezogen:

ber.: C 54,43%, H 7,13%, N 15,23%, S04 8,71 % gef.: C54,5%, H 7,3%, N 15,2%, SO4 8,7%

15

20

35

Beispiel 2

Herstellung von D-Phenylalanyl-L-prolyl-L-arginin-aldehyd-

sulfat

2,85 g (5 mMol) tert.-Butyloxy-carbonyl-D-phenyl-alanyl-L-prolyl-NG-carboxy-L-arginin-aldehyd werden in 5 ml Wasser 40 aufgelöst, unter Rühren werden 5 ml 10 n Schwefelsäure zugesetzt. Die Lösung wird auf 50° C erwärmt, 15 min lang bei 50° C erhitzt, dann mit 25 ml Eiswasser verdünnt und unter Kühlen mit Eiswasser mit festem Kalziumhydroxyd (etwa 1,6 g sind notwendig) wird der pH-Wert auf 6,5 eingestellt. Das ausgeschiedene 45 Kalziumsulfat wird abfiltriert und zweimal mit 5 ml Wasser gewaschen. Das Filtrat wird zweimal mit 10 ml n-Butanol ausgeschüttelt, dann bei vermindertem Druck auf etwa 30 ml verdichtet, falls notwendig filtriert, schliesslich lyophilisiert. 2,3 g (81 %) des im Titel genannten Produkts werden erhalten, das 4,9 % 50 Kalziumsulfat enthält.

Rf = 0,35-0,40

[a]20 = -117±1° (c = 1, in Wasser)

Der Ausgangsstoff wird wie folgt hergestellt:

6,4 g (10 mMol) geschütztes Tripeptid-aldehyd (Beispiel 1, 55 Schritt 2) werden in 100 ml75%igem wässrigem Äthanol und in der Gegenwart von 1 g 10%igem Palladium-Aktivkohle-Katalysator hydriert. Dem Verlauf der Reaktion wird mit Schichtchromatographie gefolgt (der R2rWert des geschützten Tripeptidaldehyds und des NG-Carboxyderivats beträgt 0,90-0,95 bzw. 60 0,45-0,55). Am Ende der Reaktion wird der Katalysator abfiltriert, mit 30 ml Wasser gewaschen, dann wird das Filtrat bei vermindertem Druck auf30-40 ml verdichtet. Der Rückstand wird mit 100 ml Wasser verdünnt, zweimal mit 20 ml Methylenchlorid ausgeschüttelt und lyophilisiert. 5,1g (85 %) des im Titel 65 genannten Produkts werden erhalten.

Rf = 0,45-0,55

Aminosäureanalyse: Phe = 0,96; Pro = 1 (Bezugsgrundlage) Molekulargewicht aufgrund der Aminosäureanalyse: = 570

649 305 6

Beispiel 3 420-840 mg D-Phenylalanyl-L-prolyl-L-arginin-aldehyd-sulfat

Wirkstoff und 40-80 mg humanes Albumin werden zusammen Herstellung eines pharmazeutischen Präparats lyophilisiert. Der Inhalt der so lyophilisierten Ampulle wird vor

Ein 2-Ampullen Präpartat, das für 6- bzw. 12-stündige Infusion der Verewendung in 100-200 ml steriler, pyrogenfreier isotoni-geeignet ist, wird wie folgt hergestellt: 5 scher Kochsalzlösung gelöst.

M

Claims

649 305 PATENTANSPRÜCHE

1. D-Phenylalanyl-L-prolyl-L-arginin-aldehyd-sulfat.

2. Verfahren zur Herstellung der Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man von an seiner endständigen Aminogruppe eine säureempfindliche Schutzgruppe aufweisenden D-Phenylalanyl-L-prolyl-L-arginin-aldehyd-hemisulfat oder D-Phenylalanyl-L-prolyl-NG-carboxy-L-arginin-aldehyd die säureempfindliche Schutzgruppe der endständigen Aminogruppe und die allfällig vorhandene NG-Carboxygruppe mit dem 1- bis 12-fachen der äquivalenten Menge von 1 bis 12 n wässriger Schwefelsäure entfernt und das erhaltene freie D-Phenyl-alanyl-L-prolyl-L-arginin-aldehyd-sulfat abtrennt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass man als säureempfindliche Schutzgruppe an der endständigen Aminogruppe des Ausgangsstoffes eine tert.-Alkoxy-carbonyl-gruppe, insbesondere die tert.-Butyloxycarbonylgruppe, einsetzt.

4. Arzneimittel mit blutgerinnungshemmender Wirkung, gekennzeichnet durch einen Gehalt an der Verbindung nach Anspruch 1 als Wirkstoff.

5. Arzneimittel nach Anspruch 4, gekennzeichnet durch einen Gehalt an einem oder mehreren pharmazeutisch annehmbaren Konfektionierungsmitteln.