Opis patentowy opublikowano: 1986 09 30 133 451 Int. Cl.3 C07C 103/52 Twórca wynalazku: Uprawniony z patentu: Richter Gedeon Vegyesztei Gyar R. T., Budapeszt (Wegry) Sposób wytwarzania siarczanu D-fenyloalanylo-L-prolilo-L-argininoaldehydu Wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania siar¬ czanu D-fenyloalanylo-L-prolilo-L-argininoaldehy- du, wykazujacego wysoka stabilnosc w roztworze wodnym.Wiadomo, ze jako srodki przeciw krzepliwosci krwi stosuje sie obecnie w lecznictwie glównie heparyne, polianiony o zblizonej strukturze (hepa- rynoidy) oraz pochodne kumaryny. Cecha tych srodków jest to, ze nie sa w stanie wywolac bez¬ posredniego hamowania reakcji proteolitycznej wy¬ wolujacej krzepniecie krwi. Heparyna, dzialajaca jako katalizator, przyspiesza dzialanie hamujace jednego z inhibitorów osocza, antytrombiny III, na enzymy procesu krzepniecia, zwlaszcza na trombine, podczas, gdy pochodne kumaryny hamu¬ ja biosynteze protein zawierajacych ugrupowanie kwasu y-karboksyglutaminowego (Gla).• Istnieja cztery proteiny tego typu zwiazane z procesem krzepniecia krwi; jedna z nich jest protrombina. Czynniki krzepliwosci krwi nie za¬ wieraja wcale lub mniej niz normalna liczbe ugru¬ powan Gla sa nieaktywne i -nie biora udzialu w procesie krzepniecia..^Nalezy jednak zauwazyc, ze hamowanie to do¬ tyczy syntezy calego zakresu protein zawieraja¬ cych Gla, tak wiec jeden z naturalnych inhibito¬ rów procesu krzepniecia, proteina C (lub czynnik XIV) równiez zostaje zsyntetyzowany w nieak¬ tywnej postaci w obecnosci pochodnych kumaryny, CO Jest raczej niekorzystne. 10 ii Równiez cecha charakterystyczna jest fakt, ze heparyne podaje sie glównie w postaci wlewów dozylnych, poniewaz przy podawaniu doustnym jest ona praktycznie nieaktywna. Pochodne kuma¬ ryny zas moga byc podawane jedynie doustnie.W rezultacie, efekt dzialania heparyny mozna zarejestrowac bardzo szybko, w krótkim czasie, podczas, gdy efekty dzialania pochodnych kuma¬ ryny, które stanowia inhibitory syntezy, mozna ocenic dopiero po 24—36 godzinach.Ponadto znane sa trójpeptydoaldehydy, które równiez wykazuja aktywnosc przeciw krzepliwosci, jednakze, w przeciwienstwie do wyzej wymienio¬ nych czynników wchodza one w bezposrednia re¬ akcje z trombina, hamujac jej reakcje proteoli¬ tyczne, nawet w nieobecnosci antytrombiny III.-Octan. D-fenyloalanylo-L-prolilo-L-argininoaldehy- du, opisany w wegierskim opisie patentowym nr 169 870 oraz D-fenyloalanylo-L-prolilo-NG-karbo- ksy-L-argininoaldehyd, opisany w belgijskim opi¬ sie patentowym 880 844, stanowia oba bardzo silne inhibitory trombiny.Zaobserwowano, ze aktywnosc antytrombinowa powyzszych syntetycznych soli peptydo-arginino- -aldehydu, zwlaszcza zwiazków posiadajacych wol¬ na koncowa grupe aminowa — a mianowicie octa¬ nu lub chlorowodorku D-fenyloalanylo-L-prolilo- -L-argininoaldehydu zmienia sie i gwaltownie spa¬ da przy staniu w roztworze wodnym, przez co za¬ stosowanie ich do celów leczniczych staje sie nie- 133 451133 451 mozliwe. Chociaz pochodna NG-karboksy wolnych trójpeptydoaldehydów, mianowicie D-fenyloalany- lo-L-prolilo-NG-karboksy-L-argininoaldehyd za¬ chowuje swa aktywnosc w wodnym roztworze bu¬ forowym w ciagu 20—24 godzin, jednakze po kil¬ ku dniach nastepuje znaczne obnizenie aktywnos¬ ci, zas po kilku miesiacach nastepuje utrata pier¬ wotnej aktywnosci nawet w postaci stalej.Sposób' wedlug wynalazku dotyczy wytwarzania nowej soli D-fenyloalanylo-L-prolilo-L-argininoal- dehydu, która w przeciwienstwie do dotychczas znanych produktów jest stabilna równiez w wod¬ nym izotonicznym roztworze soli. Sposób dotyczy wytwarzania siarczanu D-fenyloalanylo-L-prolilo- -L-argininoaldehydu.Stwierdzono, ze stabilnosc róznych soli D-feny- loalanylo-L-prolilo-L-argininoaldehydu zmienia sie w wodnym roztworze, to jest w izotonicznym roz¬ tworze soli, w znacznym stopniu. W czasie prze¬ prowadzanych testów peptydy rozpuszczano w ste¬ zeniach 10 mg/ml, przechowywano w 5°C, a nas¬ tepnie rejestrowano zachodzace zmiany aktywnos¬ ci antytrombinowej w ciagu 180 dni.Aktywnosc mierzono w srodowisku zawierajacym nastepujace skladniki: 0,2 ml roztworu 0,5% fibrynogenu wolowego w 0,9% roztworze chlorku sodu, 0,1 ml roztworu buforowego chlorowodorku tris- -(hydroksymetylo)-aminometanu w kwasie solnym (pH 7,2), zawierajacego roztwór peptydu, 0,1 ml roztworu U.S. Standard Human Thrombin (NIH, Bethesda, Maryland, USA), 10 jedn./ml.Czas trombinowy ukladu nie zawierajacego pep- • tydów wynosi 15 sek. mierzony za pomoca urza¬ dzenia Sennither Cross Coagulometer".Aktywnosc roztworu trójpeptydoaldehydu usta¬ lono arbitralnie na 100, gdy mieszanina reakcyjna wywolywala pieciokrotny wzgledny czas trombino¬ wy przy koncentracji koncowej 3,5X10_7M (w przypadku sarczanu trójpeptydoaldehydu przy 0,175 ^g/ml).Wyniki testów zestawiono w Tablicy I. Wynika z nich, ze podczas, gdy aktywnosc odpowiedniego chlorowodorku w izotonicznym roztworze soli za- 10 15 20 25 so 36 40 45 czyna obnizac sie po 5 dniach, a aktywnosc oc¬ tanu, cytrynianu, winianu i tosylanu juz po kilku dniach (podobnie jak w przypadku pochodnej N^_ -karboksy wolnego trójpeptydoaldehydu o zblizo¬ nych wlasciwosciach), to siarczan D-fenyloalany- lo-L-prolilo-L-argininoaldehydu zatrzymuje swa aktywnosc antytrombinowa w ciagu 90 dni. Bada¬ nia przedluzonej stabilnosci siarczanu D-fenylo- alanylo-L-prolilo-L-argininoaldehydu wykazaly, ze jest on stabilny nawet w ciagu 180 dni w wodnym roztworze; jednoczesnie w postaci stalej nie traci aktywnosci w ciagu 6 miesiecy. a) Stosowano skróty zgodnie z ustaleniami w li¬ teraturze [J. Biol. Chem. 247, 977 (1972)], przy czym Z oznacza grupe benzyloksykarbonylowa, Arg. (COOH) i Arg (Z) oznaczaja odpowiednio grupy NG-karboksy- i NG-benzyloksykarbo- ksy-karbonylo-L-argiiiiowe). b) Peptydoaldehyd wywolujacy pieciokrotny wzgledny czas trombinowy przy koncowej kon¬ centracji 3,5X10-7 M w mieszaninie reakcyjnej wykazuje aktywnosc antytrombinowa 100. c) Produkt otrzymany przez wodorolize Z-D-Phe- -Pro-Arg (Z)-H w obecnosci równowaznej ilosci kwasu. . d) Aktywnosc antytrombinowa odpowiedniego cy¬ trynianu, winianu i tosylanu zmienia sie podob- ie do aktywnosci octanu. e) Produkt wytworzony sposobem wedlug belgij¬ skiego opisu patentowego nr 880844. f) Produkt wytworzony sposobem wedlug wynalaz¬ ku.W celu symulowania warunków fizjologicznych aktywnosci antytrombinowej soli trójpeptydoalde¬ hydu oraz aktywnosci antytrombinowej pochod¬ nych kwasu karbaminowego przeprowadzono rów¬ niez testy na osoczu ludzkim przy nastepujacych skladnikach: 0,2 ml osocza cytrynianowego ludzkiego 0,1 ml roztworu buforowego chlorowodorku tris- -(hydroksymetylo)-aminometanu w kwasie solnym (pH 7,2), zawierajacego roztwór peptydu 0,1 ml roztworu U.S. Standard Human Thrombin (NIH, Bethesda, Maryland, USA), 10 jedn./ml.Tablica I Aktywnosc antytrombinowa soli trójpeptydoaldehydu w izotonicznym roztworze soli Peptydoaldehyda D-Phe-Pro-Arg-H* •2CH3COOHcd D-Phe-Pro-Arg-H • 2HClc D-Phe-Pro-Arg(COOH)-He P-Phe-Pro-Arg-H•H2S04f wzgledna aktywnosc*3 po 0 5 10 15 20 40 90 dniach 70—50 90—60 100 100 60—40 90—60 80 100 40—30 80—50 60 100 40—30 70—40 50 100 40—30 60—40 30 100 35—25 50—30 25 100 30—20 40—30 20 100t&3 451 Czas trombinowy ukladu nie zawierajacego pep- tydów wynosi 15 sek., mierzony za- pomoca urza¬ dzenia „Schnither-Or^ss Coagulometer".Tablica II Aktywnosc antytrombinowa pochodnych trójpeptydoaldehydu w osoczu ludzkim Peptydoaldehyd D-Phe-Pro-Arg-H- •H2S04 D-Phe-Pro-Arg(COOH)- 1 -H D-Phe-Pro-Arg-H • 1 -2CH3COOH D-Phe-Pro-Arg-H- •2HC1 | ' Heparyna Ilosc pep¬ tydu (^g/ml+) potrzebna do zwiek¬ szenia dwu¬ krotnie czasu trom- binowego bezposred¬ nio po roz¬ puszczeniu peptydu 0,020 0,042 0,065—0,140 0,060—0,130 0,105 1 Aktywnosc wzgledna 100 1 45 35—14 33—15 19 15 20 25 35 a) Wartosc mierzona z handlowa heparyna (132,2 jedn./mg, U.S.Ph. XVII) + ) Ilpsc peptydu w mieszaninie reakcyjnej.Dane z tablicy II jasno wykazuja, ze ilosc pep¬ tydu potrzebnego do uzyskania dwukrotnego 40 nosila 2 g/kg. zwiekszenia czasu trombinowego w porównaniu do próbki kontrolnej zmienia sie w zaleznosci od pró¬ by w przypadku octanu i chlorowodorku, zas sta¬ nowi wielokrotnosc (dla pochodnych kwasu karba- minowego wartosc dwukrotna) ilosci potrzebnej w przypadku stosowania siarczanu trójpeptydoal¬ dehydu.Próby prowadzone mviva przedstawione sa w Tablicy III. Siarczan D-fenyloalanylo-L-prolilo- -L-arginuioaldehydu wykazuje znaczna aktywnosc antytrombinówa in vivo. Przy podawaniu dozyl¬ nym i podskórnym skutecznosc jest tego rzedu co heparyny, normalnie stosowanej w lecznictwie, jednakze srodek ten ma wielkie zalety w stosun¬ ku do heparyny. Podczas, gdy heparyna podawana doustnie jest nieaktywna, to efekt leczniczy moz¬ na osiagnac przy dawkach doustnych 25 mg/kg siarczanu trójpeptydoaldehydu; (dla pochodnych kwasu karbaminowego# efekt osiaga sie dopiero przy dawkach 50 mg/kg). a) Efekt leczniczy okresla sie dawka potrzebna do przedluzenia, czadu trombinowego na calej krwi 1,5—2,5 krotnie [Nies, A.S. (1978), Clinical Phar- macology (wyd. Melmon, K.L, i Morrelli F.F), II wyd., s. 303—306, Macmillan Publ. Co., Inc.New York; oraz Versraete, M. i Verwilghen, , R, (1980), Drug Treatment, Principles and Prac- tice of Clinical Pharmacology and Therape- utics, II wyd., wyd. Avery G.S. (1980) s. 889— 952, Edinburgh and London] Dane na temat toksycznosci siarczanu D-fenylo- alanylo-L-prolilo-L-argininoaldehydu sa korzyst¬ niejsze niz dla octanu lub pochodnej kwasu kar- baminowego. Dane dotyczace ostrej toksycznosci zestawiono w Tablicy IV, dla siarczanu trójpepty¬ doaldehydu przy podawaniu doustnym dawka wy- Tablica III Próby in vivo Dawka potrzebna do uzyskania efektu leczniczego*) Peptydoaldehyd D-Phe-Pro-Arg-H« | -2CH3COOH D-Phe-Pro-Arg-H ¦ 2HC1 1 D-Phe-Pro-Arg(COOH)- D-Phe-Pro-Arg-H•H2S04 Heparyna 1 mg/kg/godz | wlewy dozylne królik — — — 1,0 0,6 . pies — — 3,0 0,5 0,5 - mg/kg podskórnie królik — — 10,0 6,0 5,0 pies — — • 6,0 6,0 2,0 doustnie królik 100 — 50 25 — pies 100 100 | 50 1 25 " I133 431 T a b 1 i c a IV Dane na temat toksycznosci dla myszy ! Peptydoaldehyd D-Phe-Pro~Arg-H • 2CH3COOH D-Phe-Pro-Arf(COOH)-Ha D-Phe-Pro~Arg-H • H2304 Heparyna LD50 mg/kg dawka jednostkowa i dozylnie |d°°trzew- ! nowo i 9 — 45b 38 — 230 podskór¬ nie — — laoo doustnie 960 1200 2000 brak danych literaturowych a) wskutek malej rozpuszczalnosci dane na temat toksycznosci przy innym podawaniu niz doustne sa raczej niepewne b) przy wlewach dozylnych 58 mg/kg dla królików.LD-ft dochodzila do 25 Biorac pod uwage, niska toksycznosc i wysoka aktywnosc siarczanu D-fenyloalanylo-L-prolilo-L- -argininoaldehydu, wskaznik terapeutyczny, uwzgledniajacy oba te parametry i bedacy najbar¬ dziej charakterystycznym miernikiem wartosci lecz¬ niczej leku, jest korzystniejszy niz wskazniki dla innych pochodnych trójpeptydoaldehydu.Na podstawie prób wlewów dozylnych dla psów ustalono dawke wlewu dozylnego dla ludzi na 1—2 mg/kg/godz. Stwierdzono, ze siarczan D-fenyloala- nylo-L-prolilo-L-argininoaldehydu mozna wytwa¬ rzac w znany sposób przez poddanie benzyloksy- karbonylo-D-fenyloalanylo-L-prolilo-NG-benzylo- ksykarbonylo-L/argininoaldehydu (Z-D-Phe-Pro- -Arg(Z)-H) wodorolizie w obecnosci jednego lub kilku równowazników kwasu siarkowego. Jedno¬ czesnie nastepujace sposoby nie daly zadowalaja¬ cych wyników: a) Hydroliza kwasowa grupy III-rzed-butylo- ksykarbonylowej kwasem siarkowym rozpuszczo¬ nym w kwasie octowym [Beyerman i in., Pepti- des, 1970 (wyd. H. Nesvadba), s. 138, North Holland, Amsterdam, 1973] b) Bezposrednia konwersja D-Phe-Pro-Arg- (COOH)-H w postaci pochodnej kwasu karbaminó- wego (z belgijskiego opisu patentowego nr 880 844) kwasem siarkowym do niechronionego siarczanu trójpeptydu aldehydu c) Przeksztalcenie róznych innych nieochronio- nych soli trójpeptydoaldehydu, np. octanu D-feny- loalanylo-L-prolilo-L-argininoaldehydu (z wegier¬ skiego opisu patentowego nr 169 870) na jego siar¬ czan za pomoca zywicy jonowymiennej lub za po¬ moca kwasu siarkowego.Produkty otrzymane sposobami a—c wykazywaly niski stopien homogenicznosci i/lub stabilnosci w wodnym roztworze.Sposobem wedlug wynalazku otrzymuje sie siar¬ czan D-fenyloalanylo-L-prolilo-L-arginino-aldehydu Q5 40 45 50 55 60 15 traktujac pólsiarczan D-fenyloalanylo-L-prolilo-L- -argininoaldehydu lub D-fenyloalanylo-L-prolilo- -NG-karboksy-L-argininoaldehyd, zawierajace wrazliwa na kwasy grupe ochronna przy koncowej grupie aminowej lub grupe NG-karboksylowa 1—12 N kwasem siarkowym, w ilosciach 1—12 równo¬ wazników, po czym wyodrebnia sie otrzymany wolny siarczan trójpeptydoaldehydu.W sposobie wedlug wynalazku korzystnie sto¬ suje sie 8—12 równowazników 4—6 N kwasu siar¬ kowego zwlaszcza 10 równowazników 5 N kwasu siarkowego. W zwiazku wyjsciowym wrazliwa na kwas grupe ochronna stanowi grupa III-rzed. al- koksykarbonyIowa, korzystnie III-rzed. butyloksy- karbonylowa.Korzystnie laktam L-argininy zabezpieczony przy swej grupie guanidynowej grupa benzyloksy- karbonylowa kondensuje sie z Ill-rzed.-butyloksy- karbonylo-D-fenyloalanylo^L-prolina, po czym otrzymany -zabezpieczony laktam trójpeptydu pod¬ daje sie redukcji, po czym grupe benzylokarbony- lowa przy grupie guanidynowej otrzymanego za¬ bezpieczonego trójpeptydoaldehydu poddaje sie wo¬ dorolizie w etanolu lub czterowodorofuranie, za¬ wierajacym 30—40.% wody, w obecnosci równowaz¬ nej ilosci kwasu siarkowego. Otrzymany pólsiar¬ czan III-rzed.-butyloksykarbonylo-D-fenyloalanylo- -L-prolilo-L-argininoaldehydu, rozpuszcza sie w 8— —12, korzystnie w 10 równowaznikach 4—6 N, a korzystnie 5 N kwasu siarkowego, po czym ogrzewa sie w ciagu 20—40 min., korzystnie 30 min. do 40—60°C, korzystnie do 50°C, po czym roztwór zobojetnia sie weglanem wapnia, saczy i korzystnie liofilizuje.W sposobie wedlug wynalazku nastepuje w jed¬ nym etapie oderwanie grupy ochronnej i wytwo¬ rzenie soli tzn. siarczanu. Zastosowanie innego jonu np. octanu znacznie obniza stabilnosc wodne¬ go roztworu.Otrzymany w ten sposób produkt koncowy mo¬ ze zawierac 4—6% siarczanu wapnia, który jed¬ nak nie wplywa ani na jego aktywnosc biologicz¬ na ani na zastosowanie w lecznictwie. Siarczan D-fenyloalanylo-L-prolilo-L-argininoaldehydu moze byc stosowany do leczenia zmian koagulacji krwi.133 9 ¦Wynalazek blizej wyjasniaja nastepujace przy¬ klady. Wartosc RF w przykladach oznaczono chro¬ matografia cienkowarstwowa na zelu krzemionko¬ wym (Kieselgel G, Reanal, Budapest) w nastepuja¬ cych mieszaninach: • 1. Octan etylu — pirydyna — kwas octowy — woda 480 : 20 : 6 : 11 2.- Octan etylu — pirydyna — kwas octowy — woda 60 : 20 : 6 : 11 3. Octan etylu — pirydyna — kwas octowy — 10 woda 30 : 20 :6 :11 Przyklad I. Siarczan D-fenyloalanylo-L-pro- lilo-L-argininoaldehydu.Pólsiarczan III-rzed.-butyloksykarbonylo-D-fcny- loalanylo-L-prolilo-L-argininoaldehydu (2,74 g, 5 15 mmoli) rozpuszcza sie w wodzie (5 ml), dodaje sie, stale mieszajac 10 N kwas siarkowy (5 ml), po czym mieszanine ogrzewa sie do 50°C. Roztwór miesza sie 15 min. w 50°C, nastepnie rozciencza sie woda z lodem (25 ml), a jego pH nastawia sie W na 6,5 weglanem wapnia (okolo 2,25 g), chlodzac lodem. Wytracony siarczan wapnia odsacza sie i przemywa dwukrotnie woda (5 ml). Przesacz ek¬ strahuje sie dwukrotnie N "butanolem (10 ml), za- teza do 30 ml, w razie potrzeby saczy sie i lio- 25 filizuje.Wydajnosc 2,25 g (79%) zwiazku tytulowego, za¬ wierajacego 4,8% siarczanu wapnia.RF = 0,35—0,40 [ab]D20 = 117+1° (c = 1, woda) 30 Analiza obliczana dla C20H30O3N6-H2SO4-3H2O- •0,2CaSO4 (565,85): Obliczono: C 42,45 H 6,77 N 14,85 S04 20,37, Ca 1,41, H20 9,55% Znaleziono: C 42,2 H 6,9 N 14,85 S04 19,8 35 Ca 1,3 H20 9,75%.Substancje wyjsciowe wytwarza sie nastepuja¬ cym sposobem: Etap I: Laktam III-rzed,-butyloksykarbonylo-D- -fenyloalanylo-L-prolilo-N^-benzyloksykarbonylo- w -L-argininy Laktam III-rzed.-butyloksykarbonylo-NG-benzy- loksykarbonylo-L-argininy (8,6 g, 22 mole, belgij¬ ski opis patentowy 880 844) zawiesza sie w octa¬ nie etylu „(20 ml) i dodaje sie do niego, stale mie- « szajac, w temperaturze 5°C roztwór 4 M kwasu chlorowodorowego w octanie etylu (40 ml). Mie¬ szanine reakcyjna miesza sie 30 min. chlodzac lo¬ dem, rozciencza sie zimnym octanem etylu (100 ml). .,.-*M*aj^ 50 Wytracony osad odsacza sie, przemywa octanem etylu i suszy pod zmniejszonym cisnieniem w ek- sykatorze nad wodorotlenkiem potasu. Otrzymany chlorowodorek laktamu NG-benzyloksykarbonylo- -L-argininy rozpuszcza sie w dwumetylofórmami- &5 dzie (20 ml), po czym w temperaturze — 10°C do¬ daje sie trójetyloamine (6,2 ml, 44 mmole). Otrzy¬ mana zawiesine dodaje sie do ponizszego miesza¬ nego bezwodnika.III-rzed, butyloksykarbonylo-D-fenyloalanylo-L- 60 -proline [U. Ludescher i R. Schwyzer: Helv. Chim.Acta, 55, 2052 (1972)], (7,25 g, 20 mmoli) oraz N- -metylomorfoline (2,22 ml, 20 mmoli) rozpuszcza sie w dwumetyloformamidzie (20 ml). Roztwór cfclodzi sie do temperatury —15°C, dodaje sie, mie- «• 10 szajac ester izobutylowy kwasu chloromrówkowego (2,64 ml, 20 mmoli), a nastepnie, po 5 min dodaje sie powyzszy roztwór w dwumetyloformamidzie.Miesza sie dalej 1 godz. w —15°C i l godz. w 0°C, po czym mieszanine reakcyjna rozciencza sie ben¬ zenem (30 ml), wytracone sole odsacza sie i prze¬ mywa dwukrotnie benzenem (10 ml).Roztwór benzenowo-dwumetyloformamidowy roz¬ ciencza sie woda (50 ml) i fazy rozdziela sie. Wod¬ na warstwe ekstrahuje sie dwukrotnie benzenem (10 ml), nastepnie polaczone ekstrakty benzenowe przemywa sie trzykrotnie roztworem 10% weglanu sodu (30 ml), woda (30 ml), trzykrotnie 0,5 N kwasem siarkowym (30 ml) dwukrotnie woda (.30 ml), po czym roztwór odparowuje sie pod zmniej¬ szonym cisnieniem i suszy nad bezwodnym siar¬ czanem sodu. Pozostalosc po odparowaniu homo¬ genizuje sie eterem naftowym, saczy, przemywa eterem naftowym i suszy na powietrzu.Wydajnosc: 9,65 g (76%) zwiazku tytulowego RF = 0,81—0,89 Etap 2. III-rzed.-butyloksykarbonylo-D-fenylo- alanylo-L-prolilo-NG-benzyloksykarbonylo-L-argini- noaldehyd.Laktam trójpeptydu (9,52 g, 15 mmoli, Etap 1) rozpuszcza sie w czterowodorofuranie (45 ml), po czym w —20°C, przy silnym mieszaniu, dodaje sie wodorotlenek glinowo-litowy (11,25 mmoli) w czte¬ rowodorofuranie (okolo 28 mim 0,4 M roztworu).Przebieg redukcji kontroluje sie za pomoca chro¬ matografii cienkowarstwowej [Rp1 = 0,71—0,77 (lak¬ tam) i Rp1 = 0,31—a,39 (aldehyd)]. W razie potrze¬ by dodaje sie .dalsza porcje roztworu wodorku. Po zakonczeniu reakcji roztwór w czterowodorofura¬ nie zakwasza sie ostroznie 0,5 N kwasem siarko¬ wym do pH = 3, a nastepnie rozciencza sie w taki sposób, ze nie nastepuje wytracania (okolo 100 ml).Roztwór wodno-czterowodorofuranowy ekstrahu¬ je sie trzykrotnie chlorkiem metylenu (75 ml), nas¬ tepnie polaczone ekstrakty w chlorku metylenu przemywa sie trzykrotnie roztworem 10% weglanu sodu (10 ml) i dwukrotnie woda (10 ml). Roztwór w chlorku metylenu suszy sie nastepnie nad bez¬ wodnym siarczanem sodu i odparowuje pod zmniej¬ szonym cisnieniem. Pozostalosc po odparowaniu rozpuszcza sie w benzenie (50 ml), a roztwór po¬ nownie odparowuje pod zmniejszonym cisnieniem.Nastepnie rozpuszczanie i odparowywanie powta¬ rza sie jeszcze raz. Pozostalosc po odparowaniu miesza sie z eterem, saczy, przemywa eterem ety¬ lowym i suszy na powietrzu. Wydajnosc: 6,9 g (72%) zwiazku tytulowego.Rp1 = 0,3—0,4 Etap 3: Pólsiarczan III-rzed.-butyloksykarbonylo- -D-fenyloalanylo-L^prolilo-L-argininoaldehydu.Zabezpieczony trójpeptydoaldehyd (6,4 g, 10 mmoli, Etap 2) rozpuszcza sie w mieszaninie wo¬ dy (50 ml), czterowodorofuranu (50 ml) i 1 N kwa¬ su siarkowego (10 ml) i poddaje sie wodorolizie w obecnosci 10% palladowanego wegla drzewnego jako katalizatora (1 g). Przebieg reakcji kontroluje sie chromtaografia cienkowarstwowa [RF2 = 0,95— —1,0 (trójpeptydoaldehyd zabezpieczony przyl swej135 451 li N 15,2 S04 8,7% D-fenyloalanylo-L- grupie guanidynowej) i R^ = 0,45—0,54 (niezabez¬ pieczony trójpeptydoaldehyd)].Po zakonczeniu reakcji katalizator odsacza sie, przemywa 50% wodnym roztworem czterowodoro- fujranu (30 ml), po czym polaczone przesacze za¬ teza sie pod zmniejszonym cisnieniem do okolo 60 ml. Pozostalosc ekstrahuje sie 4-krotnie n-foutano- lem. Warstwy, n-butanolowe laczy sie i odparowu¬ je pod zmniejszonym cisnieniem do suchosci. Po¬ zostalosc po odparowaniu miesza sie z mieszanina eter etylowy — eter izopropylowy (1 :1), saczy, przemywa powyzsza mieszanina i suszy pod zmniejszonyrh cisnieniem w eksykatorze. Wydaj¬ nosc: 4,4' g (80%) zwiazku tytulowego.RF* =0,45^-0,54 [«]D20 =< -65±1° (c = 1, woda) Analiza obliczona dla C25H3805N6«0,5H2S04 (551,04: Obliczono: C 54,43 H 7,13 N 15,23 S04 8,71% Znaleziono: C 54,5 H 7,3 Przyklad II. Siarczan -prolilo-L-argininoaldehydu.III-rzed^butyloksykarbonylo-D-tenyloalanylo-L- -prolilo-NG-karboksy-L-argininoaldehyd .(2,85 g, 5 mmoli) rozpuszcza sie w wodzie (5 ml), dodaje sie 10 N kwas siarkowy (5 ml) i ogrzewa do 50°C.Roztwór miesza sie 15 min w 50°C, nastepnie roz¬ ciencza woda z lodem (25 ml) i nastawia pH na 6,5 stalym wodorotlenkiem wapnia (okolo 1,6 g), chlodzac lodem. Wytracony siarczan wapnia saczy sie i przemywa dwukrotnie woda (5 ml). Przesacz ekstrahuje sie dwukrotnie n-butanolem (10 ml), zateza pod zmniejszonym Cisnieniem do okolo 30 ml, saczy w razie potrzeby, po czym liofilizuje.Wydajnosc: 2,3 g (81%) zwiazku tytulowego, zawie¬ rajacego 4,9% siarczanu sodu.Rr3 = 0,35—0,40 MD20 = -117+1° (c = 1, woda) Substancje wyjsciowe wytwarza sie nastepu- j acyni sposobem. lil-rzed.-butyloksykarbonylo-D-fenyloalanylo-L- -prolilo-NG-benzyloksykarbonylo-L-argininoaldehyd (6,4 g, 10 mmoli, przyklad 1, etap 2) rozpuszcza sie w 75% wodnym etanolu (100 ml) i poddaje sie wodorolizie w obecnosci 10% palladowanego wegla drzewnego jako katalizatora (1 g). Przebieg reakcji kontroluje sie chromatografia cienkowarstwowa 12 [RF2 = 0,90—0,95 (zabezpieczony trójpeptydoalde¬ hyd) i 0,45—0,55 (pochodne NG-karboksy)]. Po za¬ konczeniu reakcji katalizator odsacza sie i prze¬ mywa woda (30 ml), a przesacz zateza sie do 30— 8 —40 ml pod zmniejszonym cisnieniem. Pozostalosc rozciencza sie woda (100 ml), ekstrahuje dwukrot¬ nie chlorkiem metylenu (20 ml) i liofilizuje. Wy¬ dajnosc: 5,1 g (85%) zwiazku tytulowego.RF2 = 0,45—0,55 io Analiza aminokwasowa: Phe = 0,96; Pro = 1 (ami¬ nokwas odniesienia). Ciezar czasteczkowy wedlug analizy aminokwasowej: 570.Przyklad III. Wytwarzanie kompozycji far¬ maceutycznej. 15 Preparat dwuampulkowy nadajacy sie do 6 lub 12 godz. wlewu dozylnego otrzymuje sie nastepu¬ jaco: Siarczan D-fenyloalanylo-L-prolilo-L-argininoal- dehydu (420—480 mg) oraz albumine ludzka (40— 20 —80 mg) poddaje sie lacznie liofilizacji. Zawartosc liofilizowanej ampulki: rozpuszcza sie przed uzy¬ ciem w jalowym, wolnym od zarodków izotonicz- nym roztworze soli (100—200 ml). 25 Zastrzezenia'patentowe 1. Sposób wytwarzania siarczanu D-fenyloalany- lo-L-prolilo-L-argininoaldehydu, znamienny tym, ze pólsiarczan D-fenyloalanylo-L-prolilo-L-argini- 30 noaldehydu lub D-fenyloalanylo-L-prolilo-NG-kar- boksy-L-argininoaldehyd, zawierajace wrazliwa na kwasy grupe ochronna przy koncowej grupie aminowej lub grupe NG-karboksylowa, traktuje sie 1—12 N kwasem siarkowym, w ilosci 1—12 rów- 35 nowazników, po czym wyodrebnia sie otrzymany wolny siarczan trójpeptydoaldehydu. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze stosuje sie korzystnie 8—12 równowazników 4—6 N kwasu siarkowego. 40 , 3. Sposób wedlug zastrz. 2, znamienny tym, ze stosuje sie zwlaszcza 10 równowazników 5 N kwa¬ su siarkowego. 4. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze stosuje sie zwiazek wyjsciowy, w którym wrazli- 45 wa na kwas grupe ochronna stanowi grupa III- -rzed., alkoksykarbonylowa, korzystnie grupa III- -rzed. butylotosykarbonylowa. zakl. Graf. Badom—1835/86 a5+20egz.A4 GMfelMtl PL PL PL