NO158021B

NO158021B - Analogifremgangsmaate ved fremstilling av terapeutisk aktivt d-fenylalanyl-l-prolyl-l-argininaldehydsulfat.

Info

Publication number: NO158021B
Application number: NO820083A
Authority: NO
Inventors: Sandor Bajusz; Erzsebet Szell; Eva Barabas; Daniel Bagdy
Original assignee: Richter Gedeon Vegyeszet
Priority date: 1981-01-13
Filing date: 1982-01-12
Publication date: 1988-03-21
Also published as: US4399065A; JPS57181046A; JPH0251920B2; GB2091270B; SE8200135L; IT1210842B; SU1442078A3; SE453509B; IL64761A0; CA1182111A; DE3200812A1; ATA9782A; NL8200105A; DK151341C; PT74268B; DK151341B; FI74024C; GB2091270A; PT74268A; IT8219074A0

Description

Foreliggende oppfinnelsen angår en analogifremgangsmåte for fremstilling av terapeutisk aktivt D-fenylalanyl-L-prolyl-L-argininaldehydsulfat, som er meget stabil i vandig løs-ning .

Det er kjent at heparin, polyanioner av beslektet stuktur (heparinoider), og cumarin-derivater er de som mest anvendes innen antikoagulantterapien for tiden. Det er et fellestrekk ved disse midler at de ikke direkte inhiberer den proteolytiske reaksjonen som utløser blodklumping. Heparin som katalysator akselererer den inhiberende virkning av en av plasmainhibitorene, antitrombin III, på enzymene i koagulasjonsprosessen, i første rekke trombin, mens coumarinderivater inhiberer biosyntesen av proteiner inneholdende y-carboxy-glutaminsyre (Gla)-grupper. Det er fire proteiner av denne type som er involvert i blodkoagulasjonsprosessen, og en av disse er protrombin. Blodkoagulasjonsfaktorer som ikke har noen eller har mindre enn det normale antall av Gla-rester er inaktive, og deltar ikke i koagulasjonsprosessen. Det skal imidlertid bemerkes at denne inhibering dekker syntesen av det hele området av Gla-holdige proteiner, dvs. at en av de naturlige inhibitorer av koagulasjonsprosessen, protein C (eller faktor XIV) også syntetiseres i inaktiv form i nærvær av cumarinderivater, hvilket er ufordelaktig. Det er også et karakteristisk trekk at heparin administreres primært i intravenøs infusjon, da det er praktisk talt inaktivt ved oral administrering, mens .cumarinderivater bare kan gis oralt. Følgelig kan effekten av heparin registreres hurtig innen et kort tidsrom, mens effekten av cumarinderivatene, som er synteseinhibitorer, bare kan registreres etter 24 til 36 timer.

Ennvidere er det kjent at tripeptid-aldehyder også utviser antikoagulerende aktivitet, men i motsetning til de ovenfor angitte midler inntrer disse i direkte reaksjon med trombin, og inhiberer dets proteolytiske reaksjoner selv i fravær av antitrombin III. D-fenylalanyl-L-prolyl-L-arginin-aldehydacetat beskrevet i ungarsk patentskrift 169 870 såvel som D-fenylalanyl-L-prolyl-N -carboxy-L-argininaldehyd beskrevet i belgisk patentskrift 880 844 er begge kraftige trombininhibitorer.

Det ble observert at antitrombinstyrken av de ovenfor angitte syntetiske argininpeptidaldehydsalter - spesielt at forbindelsene med en fri aminoendegruppe - dvs. D-fenyl-L-prolyl-L-argininalaldehydacetat og h<y>drokloridet, er varie-rende og avtar hurtig ved henstand i vandig løsning, hvilket gjør terapeutisk administrering umulig. Selv om N Q-carboxy-derivatet av de fri tripeptidaldehyder, dvs. D-fenylalanyl-L-prolyl-NG<->carboxy-L-argininaldehyd bibeholder dets aktivitet i vandig bufferløsning i 20 til 24 timer, er det imidlertid etter flere dager allerede en signifikant reduksjon i styrken, og etter flere måneder er det et fullstendig tap av opprinne-lig aktivitet selv i fast form.

Foreliggende oppfinnelse angår fremstilling av et nytt salt av D-fenylalanyl-L-prolyl-L-argininaldehyd som i motsetning til de hittil kjente produkter er stabilt også i vandig løsning.

Det er funnet at stabiliteten av forskjellige salter av D-fenylalanyl-L-prolyl-L-arginialdehyd varierte i vandig løsning, dvs. isotonisk saltløsning, i betydelig grad. I løpet av de angjeldende tester ble peptidene løst i konsen-trasjoner på 10 mg/ml, lagret ved 5°C og den påfølgende foran-dring i antitrombinaktivitet ble registrert i løpet av 180 dager. Styrken ble utprøvet i et system inneholdende føl-gende komponenter:

0,2 ml 0,5 %-ig oksefibrinogen i en 0,9 prosentig løsning

av natriumklorid,

0,1 ml tris(hydroxmethyl)-aminomethanhydroklorid - saltsyre-buffer (pH 7,2) inneholdende peptidløsningen

0,1 ml US Standard Human Thrombin (NIH, Bethesda, Maryland,

USA), 10 enhet/ml løsning.

Trombintiden for det peptid-fri system er 15 s, målt i "Schnither-Gross Coagulometer".

Aktiviteten av tripeptidaldehydløsningen ble vil-kårlig satt til 100 hvis reaksjonsblandingen fremkalte en femdobbel relativ trombintid ved en. sluttkonsentrasjon på

_7

3,5 x 10 M (når det gjelder tripeptidaldehydsulfat ved

0,175 yg/ml).

Testdataene er oppført i tabell I. Det fremgår tydelig at mens aktiviteten av det tilsvarende hydroklorid i isotonisk saltløsning begynner å avta etter 5 dager, og for acetatet, citratet, tartratet og tosylatet allerede etter flere dager (lik N Q-carboxy-derivatet av det fri tripeptidaldehyd med beslektede egenskaper) beholdt D-fenyladanyl-L-prolyl-L-argininaldehydsulfat sin antitrombinaktivitet i 90 dager. Ved forlengede stabilitetsforsøk viste D-fenylalanyl-L-prolyl-L-argininaldehydsulfat seg å være stabil selv i 180 dager i vandig medium, og i fast form beholdte det sin aktivitet i 6 måneder.

For å simulere fysiologiske tilstander ble antitrombin-aktiviteten av tripeptidaldehydsaltene såvel som av car-bamidsyrederivatene også testet på human plasma i følgende system:

0,2 ml human citratplasma,

0,1 ml tris(hydroxymethyl)-aminomethanhydroklorid - salt-syrebufferløsning (pH 7,2) inneholdende peptidløs-ningen, og

o,1 ml US Standard Human Thrombin (NIH, Behtesda, Maryland,

USA), 10 enheter/ml løsning.

Dataene i tabell 2. viser klart at mengden av peptid som er nødvendig for å oppnå en fordobling av trombinpeptiden sammenlignet med kontrollen varierer alt etter den anvendte sats når det gjelder acetatet og hydrokloridsaltene, og er mangedobbel av - hår det gjelder carbaminsyrederivatet -

den mengde som kreves for tripeptidaldehydsulfatet. (

In vivo-forsøket med tripeptidaldehydderivatene er oppført i tabell 3. D-fenyl-alanyl-L-prolyl-L-argininaldehydsulfat har en signifikant antitrombinstyrke in vivo. Ved intravenøs og subcutan administrering er dets effektivitet innen området for heparin, som generelt anvendes innen tera-pien, men utviser betydelige fordeler sammenlignet med dette. Mens heparin gitt oralt er inaktiv, kan terapeutisk effekt oppnås med orale doser på 25 mg/kg av tripeptidaldehydsulfatet (men bare med 50 mg/kg doser av carbamidsyrederivatet) .

a Den terapeutiske effekt er karakterisert

ved den dose som er nødvendig for å forlenge trombin-tiden i helblod med 1,5 til 2,5 ganger ([Nies, A. S. (1 978) in Clinical Pharmacology (Melmon, K. L. and Morrelli, F. F. Eds.) 2nd Ed. pp. 303 to 306, Macmillan Publ. Co. Inc. New York; and Versraete, M. and Verwilghen, R. (1980) in Drug Treatment, Principles and Practice of Clinical Pharmacology and Therapéutics, 2nd Ed., Avery G. S. Ed.

(1980) pp. 889 to 952, Edinburgh and London].

Toksisitetdataene for D-fenylalanyl-L-prolyl-L-argininaldehydsulf at er også mer gunstige enn for både acetatet og carbaminsyrederivatet. De akutte toksisitetdata er oppført i tabell 4; og denne ble bestemt når det gjelder tripeptidaldehydaldehydsulfatet ved oral administrering til å være 2 g/kg.

Ved å betrakte den lave toksisitet og høye styrke av D-fenylalanyl-L-prolyl-L-argininaldehydsulfat, er den terapeutiske index (innbefattende begge parametre, og som er den mest karakteristiske indikator for terapeutisk verdi for et legemiddel) mere gunstig enn for de andre tripeptid-aldehydderivater.

På basis av intravenøs infusjonsforsøk i hunder ble dosen for human intravenøs infusjon beregnet til å være 1-2 mg/kg/time.

Analogifremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er kjenne-tegnet ved at D-fenylalanyl-L-prolyl-L-argininaldehyd hemisulfat eller D-fenylalanyl-L-prolyl-N Q-carboxy-L-arginaldehyd, inneholdende en syrefølsom beskyttende gruppe ved aminoendegruppen, fortrinnsvis t-butyloxycarbonylgruppen, behandles med 1 til 12 N svovelsyre, anvendt i 1 til 12 ekvivalentmengder, under samtidig fjerning av den syrefølsomme aminobeskyttende gruppe eller eventuelt N Q-carboxy-gruppen, hvorpå det resulterende fri tripeptidaldehydsulfat isoleres. Samtidig ga følgende i og for seg kjente metoder ikke tilfredsstil-lende resultater: a) Acidolyse av t-butyloxycarbonylgruppen med svovelsyre oppløst i eddiksyre (Beyerman et al.: in Peptides, 1970 (Ed.: H. Nesvadba), p. 138., North Holland, Amsterdam, 1973]. b) Direkte omdannelse av D-Phe-Arg(COOH)-H-carbaminsyrederivatet ifølge belgisk patentskrift 880 844 med svovelsyre i det ubeskyttede tripeptidaldehydsulfat. c) Omdannelse av forskjellige andre ubeskyttede tripeptid-aldehydsalter, dvs. av D-fenyl-alanyl-L-prolyl-L-arginin-aldehydacetat ifølge ungarsk patentskrift 169 870 i dets sulfat enten med en ionebytterharpiks eller med svovelsyre.

Produktene erholdt etter metoden i a-c viste seg å ha dårlig homogenitet og/eller stabilitet i vandig løsning.

For fremstilling av utgangsmaterialet kondenseres L-argi-ninlactamet, beskyttet ved dets guanidingruppe med en benzyloxycarbonyl-gruppe, med t-butyloxy-carbonyl-D-fenylalanyl-L-prolin, det resulterende blokkerte tripeptidlactam reduseres, og benzyloxycarbonylgruppen ved guanidingruppen i det erholdte beskyttede tripeptidaldehyd underkastes hydorgenolyse i ethanol eller tetrahydrofuran inneholdende 30 til 4 0 % vann, i nærvær av en ekvivalent mengde svovelsyre. Det resulterende tripeptidaldehyd hemisulfat, som fremdeles er beskyttet ved dets aminoendegruppe, oppløses i 8 til 12 ekvivalenter, fortrinnsvis 10 ekvivalenter 4 til 6 N, fortrinnsvis 5 N svovelsyre, og oppvarmes i 20

til 40 minutter, fortrinnsvis 30 minutter til 40 til 60°C, fortrinnsvis til 50°C, hvorpå løsningen deretter nøytraliseres med calciumcarbonat, filtreres og fortrinnsvis frysetørkes.

Produktet fremstilt på denne måte kan eventuelt inneholde 4 til 6 % calciumsulfat, hvilket imidlertid ikke påvirker hverken dets biologiske aktivitet eller dets terapeutiske administrering.

Oppfinnelsen illustreres ytterligere i de etter-følgende eksempler.

R -verdiene i eksemplene ble bestemt ved silicagel tynnskiktskromatografi (kiselgel G) i følgende systemer: 1. Ethylacetat-pyridin-eddiksyre-vann - 480:20:6 :1 1

2. Ethylacetat-pyridin-eddiksyre-vann -

60:20:6:11 3. Ethylacetat-pyridin-eddiksyre-vann - 30:20:6:11.

Eksempel 1

D- fenylalanyl- L- prolyl- L- argininaldehydsulfat 2,74 g (5 millimol) t-butyloxycarbonyl-D-fenylalanyl-L-prolyl-L-argininaldehyd hemisulfat ble løst i 5 ml vann, 5 ml 10 N svovelsyre ble tilsatt under konstant omrøring, og blandingen ble oppvarmet til 50°C. Løsningen ble omrørt i 15 minutter ved 50°C, ble deretter fortynnet med 25 ml isvann og pH ble justert til 6,5 med ca. 2,25 g calciumcarbonat under isavkjøling. Det utfelte calciumsulfat ble filtrert fra og vasket to ganger med 5 ml vann. Filtratet ble ekstrahert to ganger med 10 ml N butanol, konsentrert til ca.

30 ml, filtrert om nødvendig og frysetørket.

Utbytte: 2,25 g (79 %) av tittelproduktet, inneholdende

4,8 % calciumsulfat.

R„ = 0,35 til 0,40

r

Hd° - ul~'{ 0 (C = 1 , vann).

Analyse beregnet for C20H30O3Ng.H2S04.3 H20.0.2 CaS04 (565.85): Beregnet: C 42,45, H 6,77, N 14,85, S04 20,37,

Ca 1,41, H20 9,55 %.

Funnet: C 42,2, H 6,9, N 14,85, S04 19,8,

Ca 1,3, H20 9,75 %.

Utgangsmaterialene ble fremstilt etter følgende prosedyre: Trinn 1: t-butyloxycarbonyl-D-fenylalanyl-L-prolyl-N Q-ben zyloxycarbonyl-L-arginin lactam 8,6 g (22 millimol, belgisk patentskrift 880 844) t-butyloxycarbonyl-N Q-benzyloxycarbonyl-L-argininlactam ble suspendert i 20 ml ethylacetat og ved 5°C og under konstant omrøring ble en løsning av 4M saltsyre i ethylacetat (40 ml) tilsatt. Reaksjonensblandingen ble omrørt i 30 minutter under isavkjøling, ble fortynnet med 100 ml kald ethylacetat, det dannede bunnfall ble filtrert fra,, vasket med ethylacetat og tørket ved redusert trykk i en eksikator over caliumhydroxyd. Det resulterende N -benzyloxycarbonyl-L-arginin lactam hydroklorid ble oppløst i 20 ml dimethylformamid, og -10°C ble 6,2 ml (44 millimol) triethylamin tilsatt. Den dannede suspensjon ble tilsatt til følgende blandede an-hydrid. 7,25 g (20 millimol) t-butyloxycarbonyl-D-fenylalanyl-L-prolin U. Ludescher and R. Schwyzer: Heiv Chim. Acta 55, 2052 (1972) og 2,22 ml (20 millimol) N-methyl-morfolin ble løst i 20 ml dimethylformamid. Løsningen ble avkjølt til -15°C, 2,64 ml (20 millimol) klormaursyreisobutylester ble tilsatt under omrøring, og etter 5 minutter ble den ovenfor angitte løsning i dimethylformamid tilsatt. Omrøringen ble fortsatt i 1 time ved -15°C, og i 1 time ved 0°C, hvorpå reaksjonsblandingen ble fortynnet med 30 ml benzen, de utfylte salter ble filtrert og vasket to ganger med 10 ml benzen. Løsningen av benzen-dimethylformamid ble fortynnet med 50 ml vann og fasene fraskilt. Det vandige lag ble ekstrahert to ganger med 10 ml benzen, og det kombinerte benzenekstraktet ble vasket tre ganger med en løsning av 30~ml av 10 %-ig natriumcarbonat, 30 ml vann, tre ganger med 30 ml 0,5 N svovelsyre, to ganger med 30 ml vann, hvorpå løsningen ble fordampet ved redusert trykk etter tørking over vannfritt natriumsulfat. Fordampningsresten ble homogenisert med petroleumether, filtrert, vasket med petroleumether og lufttørket.

Utbytte: 0,6 5 g (76 %) av tittelproduktet.

Rp = 0,81 til 0,89.

Trinn 2: t-butyloxycarbonyl-D-fenylalanyl-L-prolyl-N Q-benzyloxycarbonyl-L-argininaldehyd.

9,52 g ( 15 millimol, trinn 1) ble løst i 45 ml tetrahydrofuran og ved -20°C og under kraftig omrøring ble 11,25 millimol lithiumaluminiumhydrid tilsatt i tetrahydrofuran (ca. 28 ml av en 0,4 M løsning). Forløpet av reduksjonen ble kontrollert ved tynnskiktskromatografi £"r^ = 0,71 til 0,7 7 (lactam) og R^, 0,31 til 0,39 (aldehyd) J. Om nødvendig ble en ytterligere mengde av hydridløsningen tilsatt. Når reaksjonen, var fullført ble tetrahydrofuranløsningen forsiktig surgjort med 0,5 N svovelsyre til pH 3, og ble deretter fortynnet på en slik måte at ingen utfelling fant sted (ca. 100 ml). Den vandige tetrahydrofuranløsning ble ekstrahert tre ganger med 75 ml methylenklorid, og de kombinerte methylen-kloridekstrakter ble vasket tre ganger med en løsning av 10 %

natriumcarbonat (10 ml), deretter to ganger med vann (10 ml). Methylenkloridløsningen ble deretter tørket over vannfritt natriumsulfat og fordampet ved redusert trykk. Fordampningsresten ble løst i 50 ml benzen og løsningen ble på nytt fordampet ved redusert trykk. Deretter ble oppløsning og for-dampning gjentatt en gang til. Fordampningsresten ble opparbeidet med ether, ble filtrert, vasket med diethylether og lufttørket.

Utbytte: 6,9 g (72 %) av tittelproduktet.

Rjj, = 0,3 til 0,4.

Trinn 3: t-butyloxycarbonyl-D-fenylalany1-L-prolyl-L-argininaldehyd hemisulfat.

6,4 g (10 millimol, trinn 2) beskyttet tripeptidaldehyd ble løst i en blanding av 50 ml vann, 50 ml tetrahydrofuran og 10 ml 1 N svovelsyre og underkastet hydrogenolyse i nærvær av 1 g av en 10 %-ig palladium-carbonkatalysator. Forløpet av reaksjonen ble kontrollert ved tynnskiktskromatografi (R_ = 0,95 til 1,0 2/tripeptidaldehyd beskyttet ved dets guanidinske gruppe) og Rp 0,45 til 0,54 (ubeskyttet tripep-tidaldehydfj. Etter at reaksjonen var fullført ble katalysa-toren filtrert fra, vasket med 30 ml av en 50 %-ig vandig tetrahydrofuranløsning, og de kombinerte filtrater ble konsentrert ved redusert trykk til ca. 60 ml. Residuet ble ekstrahert fire ganger med n-butanol. n-butanol-lag ble kombi-nert og fordampet ved redusert trykk til tørrhet. Fordampningsresten ble opparbeidet med en blanding av dimethylether - diisopropylether (1:1), ble filtrert, vasket med den ovenfor angitte blanding og deretter tørket ved redusert trykk i en eksikator.

Utbytte: 4,4 g (80 %) av tittelforbindelsen.

R^ = 0,45 til 0,54.

r

Hd<0> -65-1° ( c vann) •

Analyse beregnet på C25H38°5N6,0*5 H2S04

(551 ,64) : Beregnet: C 54,43, H 7,13, N 15,23, S04 8,71 %.

Funnet: C 54,5, H 7,3, N 15,2 S04 8,7 %.

Eksempel 2

D- fenylalanyl- L- prolyl- L- argininaldehydsulfat

2,85 % (5 millimol) t-butyloxycarbonyl-D-fenylalde-hyd-L-prolyl-N Q-carboxy-L-argininaldehyd ble løst i 5 ml vann, 5 ml 10 N svovelsyre ble tilsatt og det hele oppvarmet til 50°C. Løsningen ble omrørt i 15 minutter ved 50°C, ble deretter fortynnet med 25 ml isvann og pH ble justert til 6,5 med ca. 1,6 g fast calciumhydroxyd. under isavkjøling. Det utfelte calciumsulfat ble filtrert fra og vasket to ganger med 5 ml vann. Filtratet ble ekstrahert to ganger med 10 ml n-butanol, ble konsentrert ved redusert trykk til ca. 30 ml, ble filtrert om nødvendig og deretter frysetørket.

Utbytte: 2,3 g (81 %) av tittelforbindelsen, inneholdende 4,9 % calciumsulfat.

= 0,35 til 0,40.

Md° -117-1° c 1> vann).

Utgangsmaterialet ble fremstilt etter følgende prosedyre: 6,4 g (10 millimol, eksempel 1, trinn 2) t-butyloxycarbonyl-D-fenylalanyl-L-prolyl-N - ble løst i 100 ml 75 %-ig vandig ethanol og underkastet hydrogenolyse i. nærvær av 1 g av en 10 %-ig palladium-carbonkatalysator. Forløpet av reaksjonen ble regulert ved tynnskiktskromatografi

r3 = 0,90 til 0,95 (beskyttet tripeptidaldehyd) og 0,45 til 0,55 (N -carboxyderivat) . Etter endt reaksjon ble kataly-satoren filtrert fra, vasket med 30 ml vann hvorpå filtratet ble konsentrert til 30-4 0 ml ved redusert trykk. Residuet

ble fortynnet med 100 ml vann, ble ekstrahert to ganger med 20 ml methylenklorid og frysetørket.

Utbytte: 5,1 g (85 %) av tittelproduktet.

R^ = 0,45 til 9,55.

r

Aminosyreanalyse: Phe = 0,96; Pro = 1 (referanseaminosyre). Molvekt ifølge aminosyreanalysen: 570.

Claims

Analogifremgangsmåte for fremstilling av terapeutisk aktivt D-fenylalanyl-L-prolyl-L-argininaldehydsulfat, karakterisert ved at D-fenylalanyl-L-prolyl-L-argininaldehyd hemisulfat eller D-fenylalanyl-L-prolyl-N Q-carboxy-L-arginaldehyd, inneholdende en syrefølsom beskyttende gruppe ved aminoendegruppen, fortrinnsvis t-butyloxycarbonylgruppen, behandles med 1 til 12 N svovelsyre, anvendt i 1 til 12 ekvivalentmengder, under samtidig fjerning av den syrefølsomme aminobeskyttende gruppe eller eventuelt N Q-carboxy-gruppen, hvorpå det resulterende fri tripeptid-aldehydsulf at isoleres.