NO122126B

NO122126B -

Info

Publication number: NO122126B
Application number: NO418868A
Authority: NO
Inventors: E Blombaeck; M Blombaeck; Ekenstam B Af; K Claeon; P Olsson; L Svendsen
Original assignee: Bofors Ab
Priority date: 1967-10-24
Filing date: 1968-10-23
Publication date: 1971-05-24
Also published as: DK123709B; CH535206A; JPS4823070B1; SE348465B; DE1804022A1; DE1804022B2; FR8346M; FI49153C; GB1234060A

Description

Analogifremgangstnåte ved fremstilling av polypeptider med terapeutiske virkninger.

Oppfinnelsen angår en analogifremgangsmåte ved- fremstilling av polypeptider med terapeutiske virkninger, spesielt blodkoagula-sjonshemmende virkninger.

Blodets, koagulasjon er som bekjent en komplisert prosess.

Skjematisk kan ifolge forholdsvis allment aksepterte hypoteser den vanlige h&gulasjonsprosess inndeles i tre faser, nemlig en for ste fase hvor tromboplastin dannes ved samvirkning mellom visse faktorer i blodet, en annen fase under hvilken blodets protrombin om- . dannes til trombin under enzymatisk medvirkning av en faktor' som aktiveres av tromboplastinet, og en tredje: fase hvor trombinet, som er et proteolytisk enzym, omdanner fibrinogenet til fibrin som danner en fast koagel. Denne omdannelse av fibrinogen til fibrin foregår antagelig ved at fibrinogenet ved påvirkning av' trombinet avspalter et par polypeptider med korte kjeder og. kaldt peptid A og peptid B. Ved aggregering over de .aktive avspåltningstermi-naler omvandles . fibrirtmolekylene til lange fiberlignende kompleks i form av myke aggregater som siden ved meHornmolekylære svovel-broer omdannes til uoppløselige koageler. Den innledende dannel-

se av tromboplastin aktiveres ved sted i blodkarene hvor en skade er oppstått. Detteitromboplastin som henevnes intrinsic tromboplastin eller plasmatromboplastin, kan imidlertid erstattes av et aktivt produkt som benevnes extrinsic tromboplastin som dannes under innvirkning av en faktor i karvevene. Hele koagulasjonsfor-lopet er en serie av enzymatiske reaksjoner hvor ulike faktorer suksessivt aktiverer hverandre.

.Flere substansgrupper med en forsinkende virkning på blod-koagulasjonen er kjente. Disse substanser kan utove sin virkning på ulike trinn i den kompliserte prosess fra (blodkarpåvirkning til sterk fibrinolyse. Således kan påvirkningen på koagulasjonsme-kanismen være en kareffekt, en antitrombineffekt, en antitrombo-plastineffekt eller en fibrinolytisk effekt. Ved antikoagulasjonsterapij f.eks. i forbindelse med kirurgiske inngrep, gjelder det på

et så tidlig stadium som mulig å anvende midler som forhindrer koagulasjonsprosessen dersom patologiske forandringer har gitt grunn til å anta at det foreligger et stort risikomoment for trom-bosedannelse. Et slikt risikomoment foreligger ofterselv hos yngre pasienter etter kirurgiske inngrep.

Stoffer som påvirker koagulasjonssystemet, er f.eks. heparin, kumarinderivater, streptokinase, trypsinpreparater etc., og disse stoffer er blitt anvendt ved antikoagulasjonsterapi. Ved anvendelse •av disse stoffer forekommer det dog visse vanskeligheter, og det er 'spesielt et ikke uvesentlig problem å uttitrere den'individuelt egnede dose. Forbedrede farmasSytiske preparater skulle kunne for-bedre terapisituasjonen.

Oppfinnelsen angår fremstilling>;»v nye stoffer som for det forste viser en antitromboplastisk effekt og som derved påvirker trombindannelsen, og en antibrombinvirkning hvorved de hemmer f ib-rinogenets overforing til fibrin. Enkelte av de ifolge oppfinnelsen fremstilte polypeptider har dessuten vist seg å ha andre-interes-sante virkninger. Således hår enkelte av dem vist seg &,ha én sterk karpåvirkning som er av stor interesse ved behandling av forskjellige sirkulasJonsforstyrreiser.

De ved foreliggende analogifremgangsmåte fremstilte polype\ptider har en sekvens av aminosyrer som står i nær overensstemmelse med peptid A fra mennesker. De angjeldende, naturlige fibrinopeptider består av lh - 16 aminosyrer, men det har ifolge oppfinnelsen vist seg at gode virkninger kan oppnåes allerede ved anvendelse av polypeptider oppbygget av 3 - 9 aminosyrer, selvom polypeptider med lengre kjeder også ligger innenfor oppfinnelsens ramme. Det fåes en maksimal antitromboplastisk virkning ved jevne spiraler i poly-peptidkjedene, d.v.s. når antall aminosyrer er et multiplum av 3. Spesielt har to aminosyrer, f.enylalanin og arginin, vist seg å være av vesentlig betydning for oppnåelse av en god antitromboplastisk virkning, og spesielt dersom disse aminosyrer befinner seg i endestillinger.

Den antitromboplastiske virkning er den interessanteste virkning hos polypeptidene fremstilt ifolge oppfinnelsen da den mulig-gjør en påvirkning av koagulas jonsf orlopet på et tidlig trinn.'

Som nevnt har imidlertid også en antitrombinvirkning og en fibrinolytisk virkning og i enkelte tilfelle en karvirkning kunnet fast-slåes. Den sistnevnte virkning har det ikke vært mulig å sette i noen klar sammenheng med konfigurasjonen hos det naturlige peptid A. Kareffekten kan av type betraktes som en bradykininlignende aktivitet.

De ovennevnte virkninger er blitt undersokt på store forsoks-dyr in vivo og i blod fra mennekser, som vil bli nærmere beskrevet.

De angjeldende forbindelser inneholder optisk aktive aminosyrer med L-konfigurasjon og er forbundet med hverandre gjennom amidbindinger. I det folgende er det både i den generelle beskrivelse og i eksemplene overalt i forbindelse med de nevnte aminosyrer ment at disse har L-konfigurasjon selv om dette ikke særskilt nevnes..

Oppfinnelsen angår derfor en analogifremgangsmåte ved fremstilling av nye peptider med antitromboplastin-, antitrombin- og antifibrinolysevirkning og karutvidende virkning og med formelen:

hvor R-^ er hydrogen, en butyL-, isobutyl-, sekundær butyl- eller benzylgruppe, m er 0 eller 1, X er -(HNCH2C0)n -, med n^ varierende

■ fra 0 til 3, eller <1>

med n^ varierende fra 0 til 3> og R^. utgjor en carboxyalkylgruppe,

hvor carboxylgruppen kan være fri, forestret. med en alkanol med hoyst 8 carbonatomer.eller amidert, eller

med n-^ og R^ med den ovenfor angitte betydning , hvor Ala betyr resten av alanin, og R^ er en rett eller forgrenet alkylgruppe med hoyst 8 carbonatomer, og fremgangsmåten er særpreget ved at de nodvendige aminosyrer i den angitte rekkefolge og/eller peptidbruddstykker som inneholder disse aminosyrer i den angitte rekkefolge, kondenseres til det angitte polypeptid, idet for den peptidiske kobling en ende-stående carboxylgruppe og/eller en aminogruppe aktiveres og de dvrige reaktive grupper beskyttes intermediært.

I den nedenstående tabell er angitt betydningen av anvendte forkortelser. Foreliggende fremgangsmåte innebærer således en rekke om-setninger av typen

hvor ACOZ er en enkel aminosyre eller et ved en likeartet reaksjon oppbygget lavere peptid hvor aminogrupper og carboxylgrupper som ikke skal reagere, er beskyttet på egnet måte, eller et reak-tivt derivat av en slik aminosyre eller peptid, og hvor NH"2B betyr en aminosyre eller peptid hvor carboxylgrupper kan være beskyttet og hvor aminogrupper som ikke skal reagere, er beskyttet på egnet måte, hvorved de anvendte aminosyrer og reaksjonsrekkefolgen vel-ges således at det dannes et polypeptid ifolge den ovennevnte for-mel, hvorpå uonskede beskyttende grupper fjernes.

Fremgangsmåten ifolge oppfinnelsen belyses av den nedenstående eksempler. Eksemplene 1-11 viser sammen den fullstend-ige syntese av

Phe - Leu - Ala r Glu (gamma - 0 Me) - Gly - Gly - Gly -Val - Arg - 0 Me. De dvrige eksempler viser synteser av andre forbindelser innen rammen av oppfinnelsen og forskjellige mellomprodukter for disse, hvorved produktene på samme måte fåes i form av derivater inneholdende beskyttende grupper. Fjernelsen av de beskyttende grupper beskrives i sammenfattet form etter eksemplene, og for ' enkelte av de fremstilte derivater angis eksperimentelle detaljer 1 tabellform.

Eksempel 1

Carbobenzyloxy - valyl - omega -> nitroarginin - methylester fremstilt ifolge to forskjellige fremgangsmåter (A og B).

-A. 10,8 - g finpulverisert og torket omega-nitroargininmethyl-esterhydroklorid- (0,0*f) mol ble opplost i 150 ml nydestillert di-methylformamid (DMF). Etter avkjoling ble 5?6 ml triethylamin (0,0^ mol) tilsatt og det dannede triethylaminhydroklorid frafiltrert. Den filtrerte opplosning ble avkjolt til -10°C, og lU-,92 g (0,04- mol) carbobenzyloxy-valin-p-nitrofenylester ble tilsatt under omroring. Etter 2 timer ved 10°C fikk reaksjonsblandin-dingens temperatur stige til værelsetemperatur, og reaksjonen fant sted ved denne temperatur i 1 dbgn. DMF ble fordampet under vakuum ved 30 - ^0°C, og resten ble opplost i en blanding av efchyl-acetat/n-butanol (2:1). Oppløsningen ble ekstrahert 5 ganger, jned 5 % natriumbicarbonatopplosning, 2 ganger med vann, 3 ganger med 1 N saltsyreopplosning og tilslutt 3 ganger med destillert vann.

Opplosningen ble torket over magnesiumsulfat, inndampet til torrhet og resten opplost i torr methanol. Forbindelsen ble krystallisert ut fra methanolopplosningen ved tilsetning av absolutt ether. Utbyttet var 1^,1 g, og produktet hadde et smeltepunkt av 163 - I6+<0>C.

Ved tilsetning av petroLeter til moderluten ble det oppnådd L,L g forbindeLse med et smeltepunkt av 155 - 156° C. Det samlede utbytte var således 8L,4 %.

Analyse: C2oH30^6°7 Cmol-ekylvekt 466, 5) (tbrking i 10 timer ved 70° C over P205).

Beregnet: C = 51,49 7„, H = 6,48 7,, N = L8.02 /,.

Erholdt: 52,02 % 6,61 7. 17,99 /„

B. 5,4 g (0,02 mol) omega-nitroarginLn-methylesterhydrogen-klorid ble oplost i 75 ml DMF , og etter avkjoling ble 4,84 ml (0,02 mol) tributylamin tilsatt. Etter at temperaturen i oppløs-ningen var blitt -10° C, ble 7,0 g (0,028 mol) carbobenzyloxy-valin tilsatt som opp&ostes lett, og deretter 5,77 g (0,028 mol) dicyclo-hexylcarbodiimid (DCCI).

Reaksjonsblandingen ble omrbrt i 2 timer ved -10° C, der-på i ca. 10 timer ved 0° C og tilslutt i 8 timer ved vaerelsetemperatur. 1 ml AcOH ble tilsatt, og etter 1/2 time ble dannet dicyclohexylurinstoff avfiltrert, (vekt 5,9 g). Filtratet ble inndampet og resten opplost i EtOAc - BuOH (2:1). Spor av uopplbst dicyclohexylurinstoff ble frafiltrert. Det ble ellers gått frem som beskrevet under A.

Utbytte: 7,35 g med et smeltepunkt av 160 - 161° C, d.v.s. et utbytte av 78,9 % av det teoretiske. Fra moderluten ble det oppnådd en forbindelse som smeltet ved ca. 131° C og som antagelig var N-carbobenzyloxy-valin-N,N'-dicyclohexylurinstoff.

Eksempel 2

Fremstilling av carbobenzyloxy-glycyl-rglycyl-valyl-ai-ni troarginin-mettaylester.

9,33 g (0,020 mol) carbobenzyloxy-valyl-uc-nitroargininmethylester ble opplost i 120 ml torr AcOH og 10 g tort, bromfritt hydrogenbromid ble innfort i opplbsningen ved 20° C i lopet av 45 minutter. 80 ml AcOH og overskuddet av hydrogenbromid ble avdes-tillert under vakuum ved 20° C og resten oppsluttet kraftig i 1 liter torr ether. Etherfasen ble dekantert av og resten oppsluttet ytterligere 3 ganger med torr ether. Forbindelsen som var blitt kornformet, ble torket over fosforpentoxyd i en vakuumeksikator. Den viste seg å være meget hygroskopisk. En analyse for hydrogenbromid ga som resultat ca. 1,5 ekvivalenter hydrogenbromid pr. mol, mot beregnet 1 ekvivalent hydrogenbromid. Utbytte: 9,2 8

vinryl-cp-nitroargininmet^ HydfbgéhlirbmicleE' ble opplost i 80 ml nydestillert DMF og avkjolt til 0° C. 4,30 ml (0,031 mol) Et^N ble tilsatt, og etter 10 minutters omrbring ble dannet Et^N hydrogenbromid filtrert av (ca. 3,55 g). Til filtratet som ble avkjolt til -10° C, ble 7,75 g (0,020 mol) carbobenzyloxy-glycyl-glycin-p-nitrofenylester med et smeltepunkt av 163 - 164° C tilsatt, og blandingen ble omrbrt i 1 time ved -10° C, hvorpå temperaturen fikk stige til værelsetemperatur. Etter 4 dbgn ved værelsetemperatur ble opplbsningen inndampet under vakuum ved 40° C og resten behandlet med AcOEt, hvoretter den utkrystalliserte.

Utbytte: 12,45 g med smeltepunkt 154 - 152° C. Forbindelsen ble I opplest i DMF og utfelt med 5 % natriumbicarbonatopplbsning. Ut-! feiningen ble vasket to ganger med destillert vann og ethanol. i i Forbindelsen ble påny opplost i DMF og utfelt med 5 % citronsyre-i ! opplbsning, vasket med destillert vann og avkjolt ethanol Og tor- i I ket i vakuumeksikator over £>2^5*

'Utbytte: 7,6 g med smeltepunkt 176 - 181° C.

; Analyse: C24<H>35<N>8°9 (molekylvekt 579,6). (Tbrking i 10 timer ved i 70° C over P205 under 0,2 Torr).

' Beregnet: C = 49,73 %, H = 6,89 %, N = 19,34 % i Erholdt: 49,20% 6,34% 19,35%

I Eksempel 3

I ' kFrloermisd tibllle in5og ,p9pa2 v lg osct a(r0bi ,o0e3 bn enmozbyllal) noxdgyilnu-g atalamanv inypslyy-rrgaeidm-mgin aam-momag et-vhmayentln hgylul(t1eas:m1tei) nrohsyg yrdraeovg-eri-

I kjbtt til 5° C. 10,32 g (0,03 mol) carbobenzyloxy-alanin-p-nitra I fenylester ble satt til blandingen i små porsjoner, og pU ble holet konstant på 8,7 vdd hjelp av 4 N NaOH. Etter 1 dbgn ved værelsetemperatur ble opplbsningen fortynnet med vann og mettet med natriumbicarbonat. Den mettede opplbsning ble ekstrahert 7 ganger med EtOAc og gjort sur med halvkonsentrert saltsyre til pH av 2,9 ved ca. 0° C, ekstrahert med EtOAc og EtOAc-fasen vasket med koke-saltmettet vann, tbrket,over magnesiumsulfat og inndampet til tbrrhet. Resten ble opplbst i absolutt ether, og ved tilsetning j av petroleumether krystalliserte forbindelsen ut som nåler.

Utbytte: 6,3 g, smeltepunkt 99,5 - 100,5 C, tilsvarende et utbytte av 57,3 % av det teoretisk*. , •

•■ ■ t r-»

Analyse: CY7H22O7N2(molekylvekt 366,4).

Beregnet: C = 55,75 X, H = 6,05 %, N = 7,65 7, Erholdt: 55,60 % 5,98 % 7,54 7. j

i Ekvivalentvekt: Beregnet: 366,4. Erholdt: 367,3, 368,1. j Eksempel 4 j Fremstilling av carbobenzyloxy-glycin-carbo-tert.butyloxyhydrazid j

20,9 g (0,1 mol) carbobenzyloxy-glycin og 13,2 g carbo-tert.-butyloxyhydrazid (0,1 mol) ble opplost i 150 ml acetonitril Etter avkjoling til 0° C ble 20,6 g (0,1 mol) DDCCI opplost i

50 ml acetonitril tilsatt og reaksjonsblandingen fikk henstå ved værelsetemperatur over natten. Dannet DCU ble filtrert av og filtratet inndampet til tbrrhet under vakuum. Resten ble opplbst i EtOAc og vasket med 5 7. citronsyre, vann, 5 % natriumbicarbonat j og vann. EtOAc-fasen ble tbrket over natriumsulfat og konsentrert under vakuum til et 'lite volum, hvorved forbindelsen krystalliserte ut. Forbindelsen ble opplbst i ether, og ved tilsetning av petro-f leumsether krystalliserte 29,1 g (90,1 7o) carbobenzyloxy-glycin- j carbo-tert.butyloxyhydrazid ut. Smeltepunktet var 76 - 83° C. j Rekrystall iser ing fra EtOAc-petroleter ga 23.1 g (71,5 %) med ,j et smeltepunkt av 81 - 84° C. j

Ved ytterligere rekrystallisering bket smeltepunktet til 82 - 84° C. I

Analyse: ci5<H>2l<N>3°5 (molekylvekt 323,36) \ Beregnet: C = 55,72 7., H = 6,54 %, N = 13,00 % Erholdt: 55,39 7. 6,66 X 13,35 7. j Eksempel 5 j Fremstilling av glycin-carbo-tert.butyloxyhydrazid j

9,7 g (0,03 mol) carbobenzyloxy-glycin-carbo-tert.bntylf oxyhydrazid ble opplbst i 100 ml mebhanol, og 0,5 g 10 % Fd/C ble tilsatt og hydrogengass innfbrt. Etter 12 timer var 660 ml hydrogengass forbrukt, dg hydneeoeringeh.'ble avbrutt.Katalysatoren ble filtrert av og methanolen fordampet under vakuum. Resten ble tatt opp med absolutt ether, hvorved en forbindelse med et smeltepunkt av 141 - 143° C krystalliserte ut.

Utbytte: 3,3 g (93 % av det teoretiske).

Forbindelsens smeltepunkt Bket etter en rekrysitalliser! ig fra «ethanol/ether til 145 - 146° C.

Analyse: C , :; .0-, (molekyl"ekt 189,22)

Beregnet: C = M^3 K = 7,99 %, N = 22,21 Jg, E-vekt = 189,2 Erholdt: ^?:!9+ Vs97 5? 22,35 # 191,0

Eksempel i

Fremstiiling av eardob-nzyloxy-fenylaianyl-leucin-ethylester. 9,8 g (0,0:. mol) leucinethylester-hydroklorid ble oppløst i 30 ml DMF of 5.Ot ;-(0,0;- mo": ) Et,II "ilsatt. Dannet Et^N.HCl ble filtrert av og vasket med er. liten mengde avkjolt DMF. 15,0 g (0,05 mol) .: .-.r bobenzyloxy-f enylalanin ble opplost i 30 ml DMF-acetonitril (1:1"; og, avkjolt til -10°C, hvorefter 10,4 g (0,05) DCCI og det vv-nnevnte :iltr.--t inneholdende leucinethylester ble tilsatt. Re-.;ir jonsblanding? Temperatur fikk over natten oke til værelsetemperatur, og 1 ml -. 0 % AcOH ble tilsatt. Etter 30 minutter ble eannet DCU (N,;;' -dicyclohexylurea) f Utrert av og filtratet lnn6r.~ipet til torrhei under vakuum ved 4o°C. Resten ble opplost i EtOiic og noe uoppl<y>st DCU filtrert av. EtOAc-opplosningen ble vasket -ned i N Saltsyre, vann, 5 % natriumbicarboriatopp-lbsning og vann, Ethylacetatfasen ble torket over magnesiumsulfat og konsentrert 'ander vakuum til et lite volum. Etter tilsetning av petroleter krystalliserte carbobenzyloxy-fenylalanyl-leucin-ethylester ut som nåler med smeltepunkt 116 - 117°C. Utbytte: 19,^5 g (88,3 av det teoretiske). Etter rekrystallisering fra ethylacetat/petroleter exet smeltepunktet til 117 - 117,5°C.

Analyse: C^H^.Ii^ (molekyl jekt M+0,55)

Beregnet: C = 68,16 %, H = ?,32 %, N = 6,36 %

Erholdt: 67,74 % V ,l8 % 6 , 58 %

Eksempel 7

Fremstilling av carbobenzyloxy-fenylalanyl-leucinhydrazid »

8,4 g (0,02 mol) carbobenzyloxy-fenylalanyl-leucinethylester ble opplost i 150 ml methanoi og h, 0 g (0,0§ mol) hydrazinhydrat tilsatt. Blandingen ble omrort over natten og dannet carbobenzyloxy-f enyl-alanyl-leucinhydrazid filtrert av og vasket med en liten mengde methanoi. Produktet ble rekrystallisert fra methanol/vann, og det ble oppnådd et utbytte av 6,6 g, (8l,5 % av det teoretiske) idet produktet hadde et smeltepunkt av 192,5 - 193?5°C.

Analyse: C23H30'N4C'4

Beregnet: C = 64,77 7=, H = 7,09 7a, N = 13,14 %

Erholdt: 64,85 % 7,12 /, L3.16 X

Eksempel 8

Fremstil1 ing av carbobenzyloxy-eamma-methylglutamyl-glyein-carbo-tert.butyloxy-hydrazid

7,4 g (0,025 mol) carbobenzytoxy-gamma-methylgtutamin-syre ble opplost i 60 ml methylenklorid og avkjolt til -10° C, hvorpå 5,4 g (0,0265 mol) DCCI opplbst i 25 'ml avkjolt methylenklorid ble tilsatt under omrbring, og tilslutt ble 4,73 g (0,025 moL) glycin-carbo-tert.butyloxyhydrazid opplbst i 25 ml avkjolt ethylacetat.tilsatt. Blandingstemperaturen fikk under natten oke til værelsetemperatur, og 30 minutter for DCU ble filtrert av ble 2 dråper 50 70 AcOH tilsatt. Filtratet ble inndampet til tbrrhet under vakuum og resten opplost i EtOAc som ble vasket med 5 % natriumbicarbonat, vann, 5 % citronsyreopplbsning, vann og tbrket over magnesiumsulfat. EtOAc-opplosningen ble konsentrert til et lite volum, og etter tilsetning av petroleter krystalliserte

8,2 g forbindelse ut med et smeltepunkt av 104 - 105,5° C. Ved rekrystallisering fra EtOAcytpetroleumether bket smeltepunktet til 107 - 108° C.

Eksempel 9

Fremstil 1ing av carbobenzyloxy-alanyl-gamma-methylglutamyl-glycin-carbo-tert .butyloxyhydrazid ved fremgangsmåten ifolge A og B

A. 1,83 g (<3 mmol) carbobenzyloxy-alanyl-gamma-methylgluta-minsyre ble opplbst i 10 ml methylenklorid, og etter avkjoling til -10° C ble 1,08 g (5,2 mmol) DCCI opplost i 5 ml avkjolt methylenklorid tilsatt, og tilslutt ble 0,95 g (5 mmol) glycin-carbo-tert.-butyloxyhydrazid opplbst i 10 ml avkjolt ethylacetat tilsatt.

Blandingen ble omrbrt over natten ved værelsetemperatur, hvoretter 2 dråper 50 % AcOH ble tilsatt. Etter 30 minutter ble dannet DCU (1,1 g) filtrert av og vasket med en liten mengde EtOAc. Filtratet ble inndampet til tbrrhet under vakuum og resten opplbst i EtOAc som ble vasket med 5 7D natriumbicarbonatopplbsning, vann, 5 7. citronsyreopplbsning og vann. EtOAc-fasen ble tbrket over magnesiumsulfat og konsentrert til et lite volum, hvorved.2,3 g forbindelse med et smeltepunkt av 140 - 150° C krystalliserte ut. Etter to rekrystalliseringer fra EtOAc bket smeltepunktet til 154 - 156° C, og det ble oppnådd et utbytte av 1,9 g som var 70,4 7. av det teoretiske.

Analyse :" C24H35N5°8" (molekylvekt "537,58) "j

Beregnet: C = 53,62 %, H = 6,56 %, N = 13,03 % Erholdt: 53,48 % 6,52% .12,79%

B. 4,0 g (0,06 mmol) carbobenzyloxy-gamma-methylglutamyl- | glycin-carbo-tert.butyloxyhydrazid ble opplost i 60 ml methanoi, ] og 0,5 g 10 7. Pd/C (fuktet med vann) ble tilsatt. Carbobenzyloxy-f beskyttelsesgruppen ble hydrogenert bort med hydrogengass ved vær-j

* elsetemperatur og atmosferetrykk i lopet av 2 - 3 timer. Forbruket i av hydrogengass var 200 ml mot beregnet 195 ml. Katalysatoren bl<i i filtrert av og filtratet inndampet til tbrrhet under vakuum. Res-! ten ble opplbst i absolutt ether og inndampet til tbrrhet hvorved i det ble oppnådd en olje. i i ■ ]

! Oljen ble tbrket i en vakuumeksikator over fosforpent-. oxyd hvorved oljen gikk over til en fast, hygroskopisk forbindelse 'som veiet 2,76 g som utgjorde 96,5 % av det teoretiske utbytte.

Produktet ble opplbst i 40 ml DMF og avkjolt til -10° C, log 3,0 g (8,6 mmol) carbobenzyloxy-alanin-p-nitrofenylester ble tilsatt. Opplbsningen fikk langsomt stige til værelsetemperatur 1 og etter 1 dbgn inndampet til tbrrhet under vakuum. Resten ble i behandlet som beskrevet under eksempel A. Utbytte: 3,35 g eller i 75,5 % av det teoretiske med et smeltepunkt av 151 - 153° C. Et-: ter tre rekrystalliseringer fra EtOAc bket smeltepunktet til 1160,5 - 161° C (omlagret ved 153° C).

I Eksempel 10

• Fremstilling av carbobenzyloxy-fenylalanyl-leucyl-alanyl-gamma-methyiglutamyl-glycin-carbo-tert .butylj+oxyhydrazid

1,08 g (2 mmol) av produktet fra eksempel 9 ble opplbst ji 50 ml methanoi, og 0,2 g 10 % Pd/C ble tilsatt og hydrogengass innfort. Etter 3 timer var hydrogeneringen ferdig, og 55 ml (teoretisk 45 ml) var forbrukt. Katalysatoren ble fjernet og opplbsningen inndampet til tbrrhet underrvakuunte Resten ble opplbst i

5 ml DMF.

0,86 g (2 mmol) av produktet fra eksempel 7 ble opplbst

i 3 ml 6 N saltsyre + 2 ml 50 % AcOH og 40 ml-EtOAc tilfort på toppen. Blandingen ble avkjblt til -10° C og 2,0 ml l-molar?n«.tri-umnitrit jdråpevis tilsatt under omrbring. Etter 15 minutter ved

-10° C ble EtOAc-fasen skilt fra vannfasen og vasket med avkjblt, mettet natriumbicarbonatopplbsning og isvann. EtOAc-opplbsningen

bTe tbrket over magnesiutnsulfat i 1 time ved -10° C. ÉtOAc-opplbsningen som inneholdt carbobenzyloxy-fenylalanyl-leucinazid ble langsomt dryppet inn i DMF-opplbsningen som inneholdt det frie aminopeptid, under omrbring og ved -10° C. Etter 1 dbgn ved 0° C og 2 dbgn ved værelsetemperatur ble den dannede utfelning f il trer j: av. Utbytte: 0,35 g med smeltepunkt av 207 - 208° C. Moderluten! ble inndampet til tbrrhet og resten opplbst i EtOAc, vasket med 5 7. natriumbicarbonat, vann, 5 7o citronsyreopplbsning, vann, tbrket over magnesiumsulfat og konsentrert under vakuum. Resten ble opplbst i EtOAc, og ved tilsetning av petroleter krystalliserte 0,70 g forbindelse ut med smeltepunkt av 180 - 200° C. Til • sammen ga dette et utbytte av 0,80 g som var 50 7. av det teoretiske. En liten del rekrystallisert ytterligere én gang fra EtOAc►

Analyse: C39H55N7Ou (molekylvekt 797,9) j Beregnet: C = 58,71 7., H = 6,95 %, N = 12,29 7. Erholdt: 58,48 7. 6,77 % 12,35 7.

Eksempel 11

Fremstilling av carbobenzyloxy-fenylalanyl-leucyl-alanyl-gamma- \ methylglutamyl-glycyl-glycyl-glycyl-valyl-omega-nitroarginin- i methylester. j

334 mg (0,42 mmol) av forbindelsen fremstilt ifolge j eksempel 10 ble opplbst i 1,8 ml trifluoreddiksyre, og etter 45 minutter ved 22° C ble trifluoreddiksvreopplbsningen under omrbring dråpevis tilsatt til 100 ml absolutt ether.

Etter 2 timer i kjoleskap ble utfelningen.filtrert av og vasket gjentatte ganger med absolutt ether, hvoretter den ble opplbst i 4 ml DMF og 1 ml 4 N saltsyre. Opplbsningen ble avkjblc til - lO°- t, t og 0,42 ml 1 molar na tr iumn i tritt opplbsning ble dråpef vis tilsatt under omrbring i lbpet av 5 minutter, hvoretter opplbsningen og dannet utfelning ble dråpevis tilsatt til 30 ml iskald j 2 7, natriumbicarbonatopplbsning, hvorved utfelningen av det dan- i nede syreazid ble fullstendig. Azidet ble vasket på filteret med i isvann og iskald 5 % citronsyreopplbsning og tilslutt vasket fri for kald citronsyre med isvann. Des ble så hurtig tbrket over fosforpentoxyd under vakuum ved 5° C og umiddelbart anvendt for kobling. Utbyttet av tbrt carbobenzyloxy-fenylalanyl-leucyl-alanyl-gamma-methylglutamyl-glycinazid var 291 mg som vaf 98 % av det teoretiske.

243 mg (0,42 mmol) av forbindelsen fremstilt ifolge

eksempel 2 ble opplbst i 2 ml absolutt AcOH og 1 ml 4 itf hydrogenbromid i AcOH tilsatt. Blandingen fikk henstå i 45 minutter ved værelsetemperatur og beskyttet mot luftfuktighet, hvoreter blandingen ble dråpevis tilsatt til 100 ml absolutt ether under kraftig omrbrin<g>. Utfelningen ble vasket to ganger og tatt opp med absolutt ether til den ble kornformet (hygroskopisk). Tetra-peptid-methylesterhydrogenbromidet ble opplbst i 4 ml DMF, og 0,09 ml (0,64 mmol) Et-jN ble satt til opplbsningen som ble avkjolt til -10° C, og det ovennevnte azid opplbst i 10 ml DMF på forhånd avkjolt til -10° C ble dråpevis tilsatt under omrbring ved -10° C. Etter 1 db<g>n ved 0° C fikk opplbsningen henstå i 2 dbgn ved værelsetemperatur, hvoretter den ble konsentrert til 5 ml under vakuum ved 20° C. Det ble foretatt en fornyet opplbsning i 5 ml DMF, og opplbsningen ble under omrbring tilsatt til 40 ml 5 % citronsyreopplbsning. Utfelningen ble med vann vasket fri for citronsyre og tbrket under vakuum over fosforpentoxyd. Utbytte: 265 mg som var 66,7 % av det teoretiske. Smeltepunktet var 203 - 213° C. Ved to rekrystalliseringer fra DMF-vann bket smeltepunktet til 211 - 215° C.

Analyse: C50<H>73<N1>3°16 (molekylvekt 1112,2)

Beregnet: C - 53,99 %, H = 6,62 %, N = 16,37 7.

Erholdt: 53,51 % 6,56 7. 16,72 7.

Eksempel 12

Fremstilling av carbobenzyloxy-fenylalanyl-omega-nitroargininmethylester.

10,8 g (40 mmol) omega-nitroargininmethylesterhydro-klorid ble opplbst i DMF, og 5,05 g (40 mmol) Et^N ble tilsatt under avkjbling. Dannet Et^N. HC1 ble filtrert av og filtratet satt til en avkjolt opplbsning (-10° C) av 12,0 g (40 mmol) carbobenzyloxy-f enylalanin i acetonitril som ved -10° C var blitt tilsatt 9,1 g (40 mmol) DCCI. Det hele ble omrort i 2 timer ved -10° C og fikk ved henstand over natten anta værelsetemperatur.

Dannet DCU ble filtrert av, filtratet inndampet til tbrrhet og resten opplbst i EtOAc og vasket som vanlig. Fra EtOAc-opplbsningen ble det ved tilsetning av absolutt ether oppnådd krystaller med et smeltepunkt av 87 - 89° C. Etter krystal-lisering fra 60 % ethanol ble det oppnådd krystaller av en annen modifikasjon med et smeltepunkt av 153,5 - 155° C. Utbytte;

17,9 g (87,1 7» av det teoretiske)....

Analyse: C24H3o^6°7 (molekylvekt 514,55)

Beregnet: C - 56,02 '/„ H = 5,88 7o, N = 16,33 7.

Erholdt: 55,94 % 6,09 7„ 16,42 %

Eksempel 13

Fremstilling av carbobenzyloxy-fenylala.wl-vaLyl-omega-nitro-ar ginincnethylester.

9,33 g (20 mmol) av den ifolge eksempel 1 fremstilte forbindelse ble behandlet som beskrevet under eksempel 2. Utbyttet av hygroskopisk valyl-omega-nitroargininmethylester. 1,5 HBr var etter tbrking under vakuum over KOH og ?2^5 9>15 g som var kvantitativt.

Hydrogénbromiddipeptidesteren ble opplbst i 50 ml DMF og avkjolt til -5° C, hvorpå 4,2 ml (30 mmol) Et-jN ble tilsatt. Dannet Et-jN-HBr ble filtrert av, og tii filtratet ble det tilsatt 8,4 g (20 mmol) carbobenzyloxy-fenylalanin-p-nitroEenylester. Etter 1 dbgn ved værelsetemperatur ble opplbsningen avkjolt til -10° C, og ytterligere 1,4 ml triethylamin ble tilsatt og blandingen fikk stå i ennu 1 dbgn. Etter tilsetning av l ml AcOH ble opplbsningen inndampet til tbrrhet under vakuum og resten opplbst i en blanding av EtOAc-BuOH (3:1) og vasket som vanlig med vann, 5 % citronsyre og vann. Opplbsningen ble tbrket over MgSO^ og inndampet til et lite volum som etter tilsetning av absolutt eter ga 10,1 g £82,3 7» av det teoretiske) forbindelse med et smeltepunkt av 108 - 111° C. Ved rekrystallisering fra EtOAc-methanoi etter tilsetning av absolutt ether bket smeltepunktet tiL 112 - 114° C.

Analyse: C29<H>3<gN>7<0g> (molekylvekt 613,69)

Beregnet: C = 56,76 7., H = 6,41 7., N = 15,98 7.

Erholdt: 56,32 7. 6,48 7. 16,12 7..

Eksempel 14

Fremstilling av carbobenzyloxy-fenylalanyl-glycyl-valyl-omega-nitroargininmethylester.

2,33 g (5 mmol) av den ifolge eksempel 1 fremstilte forbindelse ble behandlet som beskrevet under eksempel 2, og den opp-nådde hydrogenbromid-dipeptidmethylester ble opplbst i L5 ml DMF, avkjolt til -5° C og 1,05 ml (7,5 mmol) Et^N tilsatt. Et^-HBr

ble filtrert av og filtratet anvendt som beskrevet nedenfor.

1,85 g (5 mmol) carbobenzyloxy-fenylalanyl-glycinhydraziU i ble opplbst i 7 ml DMF og tilsatt 1,5 ml 6 N saltsyre, avkjolt til1 1-10° C og under omrbring dråpevis tilsatt 5,1 ml 15,1 mmol) 1 Molar inatriumnitrittopplbsning. Etter 10 minutter ved -10° C ble 50 ml I 5 % natriumbicarbonatopplosning tilsatt, og ved 0° C begynte azidet |å felles ut og utfelningen var fullstendig etter tilsetning av 30 jml isavkjblt vann., hvorpå det hele ble omrbrt i 10 minutter, filtrert og nbye vasket med isvann. Utfelningen ble oppslemmet i isvann under omrbring, filtrert og vasket med vann med en temperatur av 0° C. Fremgangsmåten ble gjentatt 3 ganger, og forbindelsen blie tbrket under vakuum ved 5° C over ^2^5» ;*worPa den umiddelbart blei anvendt. Utbytte: 1,77 g (93 7. av de;t teoretiske).

i Til DMF-opplbsningen av aminodipeptidet avkjolt t-il

-10° C ble azidet opplbst i 8 ml på forhånd kjblt til -10° C DMF i dråpevis tilsatt under omrbring. Etter 10 minutter ved -10° C fikk ;blandingen gå to dbgn ved værelsetemperatur, og den ble så konsentrert under vakuum til 7 ml og behandlet som beskrevet i eksempel 11. Utbytte: 2,44 g (78,2 7. av den teoretiske). Bekrystalliser- 1 ing fra 60 7» ethanol ga 1,95 g forbindelse med et smeltepunkt av 147 - 149° C.

Analyse: c^^ 2ti809 (m°lekylvekt 670,74) j Beregnet: C = 55,51 7., H = 6,31 %, N = 16,71 7.

i Erholdt: 55,38 7. 6,58 % 16,90 %

i t

■ Eksempel 15

: Fremstilling av carbobenzyloxy-fenylalanyl-glycyl-glycyl-valyl-Iomega-nitroargininmethylester i 1,77 g (3,8 mmol) av den i eksempel l fremstilte for-'bindelse ble behandlet som 1 eksempel 2, og den ertioldte hydrogenbromid-dipeptidmethylester ble opplbst i 10 ml DMF og avkjolt til 1-5° C, hvorpå 0,79 ml (5,7 mmol) Bt^N ble tilsatt. Et^N<*>HBr ble filtrert av og filtratet anvendt som beskrevet nedenfor.

1,62 g (3,8 mmol) carbobenzyloxy-fenylalanylpglycyl-glycinydrazid ble opplbst i 10 ml DMF og tilsatt 1 ral 6 H saltsyre avkjolt til -10° C. Under omrbring ble 3,85 ml (3,85 mmol) 1 molar Inatriumnitrittopplbsning dråpevis tilsatt, og det hele ble behandlet som beskrevet i eksempel 14. Utbytte: 1,55 g (95 7. av det teoretiske).

Til DMF-opplbsningen av aminodipeptidesteren avkjblt til L-1Q° C. ble under omrbring carbobenzyloxy-trlpeptldazldet -opploat—i

9 ml på forhånd [27 7~til-10° C avkjolt DMF dråpevis tilsatt. "I Behandlingen ble forbvrig utfort som beskrevet i eksempel 11. Utbytte: 1,93 g (73,1 % av det teoretiske) med et smeltepunkt av 185 - 190° C. Rekrystallisering fra 90 % ethanol bevirket at smeltepunktet steg til 188 - 191° C. Analyse: C33h45NqP10 (molekylvekt 727,8) Beregnet: C = 54,45 %, H = 6,23 %, N = 17,32 %. Erholdt: 55,01 % 6,18 % 17,52 %. j j ; Eksempel 16 j Fremstilling av carbobenzyloxy-fenylalanyl-glycyl-glycyl-glycyl- ! valyl-omega-nitroargininmethylester. •1,73 g (3 mmol) av den i eksempel 2 fremstilte forbind-; else ble opplbst i 7 ml tbrr AcOH, og under fuktighetsfri beting- i eiser ble 7 ml 4 N HBr i AcOH tilsatt. Etter 45 minutter ved vær-j elsetemperatur hadde utviklingen av carbondioxyd opphørt, og reak sjonen var fullstendig. Overskuddet av hydrogenbromid og 7 ml AcOH ble destillert av under vakuum, og resten ble under kraftig omrbring dryppet ned i 150 ml absolutt tbrr ether. Etheren ble dekantert av, og resten som antok en kornformet konsistens, ble tatt opp ytterligere 3 ganger med tbrr ether. Resten ble tbrket over P2O5 og KOH under vakuum, og utbyttet av tetrapeptidester-hydrobromid var 1,62 g som tilsvarte 95 % av det teoretiske be-i regnet på-1,5 ekvivalenter HBr pr. mol peptid. Hydro bromidet ble opplbst i 20 ml DMF og avkjblt til -10° C, hvoretter 0,60 ml j (4,28 mmol) Etyj ble tilsatt og dannet Et^N«HBr filtrert av. Under omrbring ved -10° C ble 1,44 g (3 mmol) carbobenzyloxy-fenylalanyl-glycin-p-nitrofenylester satt til filtratet, og etter 1 dbgn ved j værelsetemperatur ble opplbsningen igjen avkjblt til -10° C og ytterligere 0,20 ml Et^N tilsatt, hvoretter opplbsningen igjen fikk gå 11 dbgn. Opparbeidelsen ble utfort som beskrevet under ; eksempel 2. Utbytte: 1,59 g (tilsvarende 71,2 % av det teoretisk^) med et smeltepunkt av 164 - 167° C. Ved rekrystallisering fra 601% methanoi steg smeltepunktet til 169 - 172° C.

Analyse: C35<H>48^1<0>°11 (molekylvekt 784,85)

Beregnet: C » 53,56 %, H = 6,17 %, N = 17,85 %, Erholdt: 54,01 % 6,08 % 17,99 %

Fremstilling av carbobenzyloxy-fenylalanyl-fenylalanyl-valyl-omég<i-Eksempel 17

ni troarg ininme thy1e s ter.

.._. 2 ,.33 g (5 mmol) ay for.blQiie.lsen fremstilt i folge eksempil 1 ble behandlet som beskrevet i eksemplene 2 og 14, og den erholdte ; opplbsning av valyl-omega-nitroargininmethylester ble anvendt som ; beskrevet nedenfor.

2,3 g (5 mmol) carbobenzyloxy-fenylalanyl-fenylalanth-hydrazid ble opplbst i 7 ml DMF og 3 ml 4 N saltsyre tilsatt, avkjblt til -10° C og 5,1 ml 1 molar NaN02-opplbsning ble dråpevis < ; tilsatt under omrbring. Det hele ble opparbeidet som beskrevet i; eksempel 14. Utbytte: 2,26 g (95 7. av det teoretiske) carbobenzyj-oxy-fenylalanyl-fenylalaninazid, ble opplbst i 8 ml DMF, avkjblt j til -10° C og under omrbring dråpevis tilsatt en på forhånd avkjblt : opplbsning av aminodipeptidesteren. Den videre fremgangsmåte var; { som beskrevet i eksemplene 11 og 14. Vtbytte: 2,14 g (58,7 av det I teoretiske) med et smeltepunkt av 218 - 220° C.

t•Analyse: C^gH^gNgOg {molekylvekt 760,87) ; Beregnet: C = 59,99 %, H = 6,36 %, N = 14,73 % i i Erholdt: 59,49 % 6,33 % 14,81 %

\ Eksempel lg j Fremstilling av carbobenzyloxy-fenylalanyi-leuc£l-valyi-omega-; nitroargininmethylester.

2,33 g (5 mmol) av forbindelsen fremstilt ifblge eksem-j pel 1 ble behandlet som beskrevet i eksemplene 2 og 14. Den er-j holdte DMF-opplbsning av valyi-omega-nitroarglninmethylester ble '; anvendt som beskrevet nedenfor.

2,13 g (5 mmol) av forbindelsen fremstilt ifblge eksempel 7 ble opplbst i en blanding av 5 ml 6 N ^saltsyre og,5 ml \ 50 % AcOH, og opplbsningen ble på toppen forsynt med et skikt av

i 80 ml EtOAc, og den videre fremgangsmåte var son beskrevet 1 ek-

j sempel 10. EtOAc-opplbsningen aed carbobenzyloxy-di-peptidazidet j ble avkjblt til -10° C og under omrbring dråpevis satt til den i ovenfor preparerte DMF-opplbsning son på forhånd var avkjblt til

i -10° C. Den videre fremgangsmåte var som beskrevet i eksempel 10,

i og den erholdte EtOAc-opplbsning ble Inndampet til tbrrhet og res

( ten opplbst i 7 ml DMF og renset som beskrevet 1 eksempel 11. ViM-\ bytte: 265 g (72,9 % av det teoretiske) med et smeltepunkt av 171 - : 181° C. Ved rekrystallisering ytterligere 2 ganger fra 60 7. ethaj-• noi ble produktets aaneltepunkt forhbyet til 179 - 182° C.

Analyse: C32<H>50<N>8°9 (molekylvekt 726,85) Beregnet: C = 57,84 %, H = 6,94 7., N = 15,42 X Erholdt: 58,05 % 7,01% 15.35 X-

Eksempel 19

Fremstilling av carbobenzyloxy-valyl-omega-nitroargininamid

45,8 g (0,13 mol) carbobenzyloxy-omega-nitroargininamid med et smeltepunkt av 217 - 218° C ble opplbst i 300 ml vannfri AcOH, og under fuktighetsfri betingelser ble 300 ml 2 N HBr i torr AcOH tilsatt under omrbring. Etter 45 minutter ved værelsetempe-; råtur hadde carbondioxydutviklingen opphbrt, og reaks jonsblandingjsn ble så inndampet under vakuum ved 20° C under fuktighetsfri betingelser inntil resten hadde fått et volum av 250 ml. Resten ble

l

dråpevis satt til 2,5 liter tbrr ether under kraftig omrbring, og det ble utfelt en plastisk masse. Etherfasen ble dekantert av og resten tatt opp ytterligere 3 ganger med tbrr ether, hvorved forbindelsen ble kornformet og fast. Forbineelsen ble tbrket under vakuum over P205 og KOH og opplbst i 350 ml DMF, og 18,5 ml (0,134 mol) Et3N ble tilsatt. Etter avkjbling til -10° C ble dannet Et3N<*>HBr filtrert av, og under omrbring ble 48,4 g (0,13 mol) carbobenzyloxy-valin-p-nitrofenylester satt til filtratet. Reak-; sjonsblandingen fikk gå i 1 dbgn ved værelsetemperatur, ble konsentrert til 100 ml og heldt under omrbring ned i 1 liter 5 % natriumbicarbonatopplbsning. Forbindelsen som ble felt ut, ble filtrert av, vasket med vann og påny opplbst i 75 ml DMF og heldt ned i

1 liter 1 N saltsyre, filtrert og vasket med vann. Utbytte: 47,11

g (80,2 % av det teoretiske) med et smeltepunkt av 61,6 - 63° C. : Ved rekrystallisering fra 60 7. methanoi steg produktets smelte- | punkt til 66 - 67° C, men etter rekrystallisering fra ethanol ved! tilsetning av vann steg smeltepunktet til 218 - 219° C.

Analyse: C1QH.,QN70<- (molekylvekt 451.5, forbindelse med smelte-!

punkt 218 - 219<*> C)

Beregnet: C = 50,55 7., H = 6,47 7., N = 21,72 7. j Erholdt: 50,57 7. 6,62 7. 21,89 7..

Eksempel 20

Fremstilling av carbobenzyloxy-fenylalanyl-omega-nitroargininamid;

1,76 g (5 mmol) carbobenzyloxy-omega-nitroargininamid i ble behandlet som beskrevet i eksempel 19, og den erholdte DMF-opplbsning av omega-nitroargininamidet ble avkjblt til -10° C, hvoretter 2,1 g (5 mmol) carbobenzyloxy-fenylalanin-p-nitrofenyl-: ester ble tilsatt og forbindelsen opparbeidet som beskrevet i eksempel 19. utbytte: 2,05 g (82 7. av detf teoretiske) med et smeltepunkt av 105 - 125° c. Ved rekrystallisering fra 80 7. etha--nolateg smeltepunktet til 128 - 130° C.

Analyse: <C>23<H>29N706 (molekylvekt 499,54) Beregnet: C = 55,30 %, H = 5,85 %, N = 19,63 %, 0 = 19,22 % ' Erholdt: 55,32 % 6,07% 19,42 7. 19,24 7.

Eksempel 21

Fremstilling av carbobenzyloxy-fenylalanyl-valyl-omega-nitroargininamid.

1,0 g (2,22 mmol) av forbindelsen fremstilt ifblge eksempel 19 ble opplbst i 5 ml tbrr AcOH, og under fuktighetsfri betingelser ble 5 ml 2 N HBr i tbrr AcOH tilsatt. Opparbeidelsen ble utfort som beskrevet i eksempel 19, og den erholdte DMF-opplbsning

(10 ml) av valyl-omega-nitroargininamidet ble avkjblt til -10° C, hvoretter 0,93 « (2,22 mmol) carbobenzyloxy-fenylalanin-p-nitro-fenylester ble tilsatt under omrbring. Rensingen av det beskyttede tripeptidamid ble utfort etter de samme retningslinjer som beskre-; vet i eksempel 19.

Utbytte: 1,15 g (86 % av det teoretiske) med et smeltepunkt av 213 - 220° C. Ved to rekrystalliseringer fra 80 % ethanol steg produktets smeltepunkt til 218 - 220° C.

Analyse: C28H38N8°7 (molekylvekt 598,68)

Beregnet: C = 56,18 %, H = 6,40 %, N = 18,72 %

Erholdt: 56,29 7. 6,52 % 18,87 7.

Eksempel 22

Fremstilling av carbobenzyloxy-omega-nitroarginyl-omega-nitroargininmethylester.

35,3 (0,1 mol) carbobenzyloxy-omega-nitroarginin med et smeltepunkt av 134,5 - 136° C ble opplost i 200 ml DMF - TH F (1:1);, og under omrbring ble 13,9 ml (0,1 mol) Et-jN dråpevis tilsatt. Etter avkjbling til -10° C ble 13,66 g (0,1 mol) klormaursyreiso-butylester tilsatt i lbpet av 20 minutter hvorved temperaturen i opplbsningen under tilsetningstiden holdt seg på -10° C og -5° C.

Til opplbsningen ble omega-nitroargininmethylester opplbst i DMF, i frigjort fra 27,0 g (o,l mol) omega-nitroarginimmethylester-HCl med 13,9 ml (0,1 mol) Et^N, på forhånd avkjblt til -10° C tilsatt, og reaksjonsblandingstemperaturen var -8° C under den dråpevise tilsetning. Reaksjonsopplosningens temperatur fikk langsomt stige til værelsetemperatur, og etter noen timer var reaksjonen avsluttet. EtoN.HCl som var blitt dannet vdd reaksjonen, ble filtrert av og filtratet inndampet til tbrrhet. Resten ble opplbst i 900 ml BuOR-EtOAc (2:1) og rystet med 1 N saltsyre, 5 % natriumbicarbonat-

(Opplbsning og vann og opplbsningsmiddelfasen tbrket over magnesium-Isulfat. Etter fordampning av opplbsningsmidlet ble det oppnådd en 'forbindelse med et smeltepunkt av 136 - 148° C.

■Utbytte: 34,6 g (60,8 7. av det teoretiske). Produktet ble rekrystallisert to ganger fra 80 7. methanoi, og smeltepunktet steg til 147 - 150° C.

Analyse: c2lH32<N>10°9 (molekylvekt 568,57)

Beregnet: C = 44,36 %, H = 5,67 7., N = 24,64 %

iErholdt: 44,38 7. 5,64 7, 24,72 7.

Eksempel 23

Fremstilling av carbobenzyloxy-fenylanalyl-valirtmethylester.

29,9 g (0,1 mol) carbobenzyloxy-fenylalanin ble opplost i 75 ml DMF og avkjblt til -10° C, hvoretter 20,6 g DCCI opplbst i 25 ml DMF ble dråpevis tilsatt. Valinmethylester opplbst i 30 ml DMF ble frigjort fra sitt hydroklorid ved tilsetning av 13,83 ml Et^N til 16,8 g (0,1 mol) valinmethylester.HCl i DMF og dråpevis tilsatt slik at reaksjonsopplbsningens temperatur holdt sei på -10° C. Reaksjonen var avsluttet etter 1 dbgn ved værelsetemperatur, og etter avkjbling ble dannet DCU filtrert av. Filtratet ble inndampet til tbrrhet og resten opplbst i EtOAc og rystet som van*

lig. Etter fordampning av EtOAc ble resten opplbst i 80 7. methanoi, og 33,5 g forbindelse med et smeltepunkt av 113 - 115 C krystallisert ut. Utbytte: 33,5 g (81,2 7. av det teoretiske).

;Analyse: <C>23<H>28N2°5 (molekylvekt 412,49)

Beregnet: C = 66,9/ 7., H = 6,84 7., N = 6,79 7.

Erholdt: 67,09 7. 6,85 7. 6,91 7.

Eksempel 24

i

Fremstilling av carbobenzyloxy-fenylalanyl-valinhydrazid

i 8,25 g (20 mmol) av forbindelsen fremstilt ifblge eksem-jpel 23 ble opplbst i 150 ml methanoi, og 3,94 g (80 mmol) hydrazin-!hydrat ble tilsatt. Det hele ble tilbakelbpsdestillert under om-;rbring i 2 dbgn og konsentrert, og etter tilsetning av en liten jmengde vann krystalliserte produktet ut. Det ble rekrystallisert jfra methanoi-vann. Utbytte: 7,35 g (89 7. av det teoretiske) med et smeltepunkt av 210 - 211,5° C.

Analyse: C^H^gNnO^ (molekylvekt 412,5)

Beregnet: C = 64,06 7., H = 6,84 7», N = 13,58 7.

JfchQldt: 64,64 7. 6,58 7. 13,63 7.

.'■-. semneI 2_5

Fremstill ine av carbobenzyloxy-fenylalanyl-fenylalaninmethylester.

16,2 g (75 mmol) f enylalaninrnothyl e s ter «HCl med et smeltepunkt av 153,5 - 159° C, ble o<pp>lost i DMF og avkjolt til 0° C,

oe 10,5 ml (75 mæol) Et^N ble tilsatt. Frrcr-stilt Et^.i-HCL ble filtrert av oe filtratet avkjblt til -10° C, hvoretter 31,5 g (75 mmol) cacbobenzyloxy-fenylalanin-p-nitrofenyiester ele tilsatt. Etter 1 dbgn ved værelsetemperatur ble opplbsningen Igjen avkjblt til -10°C, 3,5 ml (25 mmol) St^' ble tilsatt og opnlbsainoen fikk henstå i ennu 1 dbgn. Opplesningen ble så inndamnet til tbrrhet under vakuum og resten opnibst i EtOAc og vasket med 5 >„ natriumbicarbonatopplbsning, vann, 3 % saltsyre og vann. EtCAc-opplbsningen ble tbrket over magnesiumsulfat og konsentrert tiL et mindre volum, og etter tilsetning av petroleumsether krystalliserte produktet ut som nåler. Produktet ble rekrystallisert 2 ganger fra EtOAc/petrol-ether. Utbytte: 27,85 g (80, 7 70 av det teoretiske) med et smeltepunkt av 148,5 - 149° C.

Analyse: c27<H>2<8i>"2°5 (molekylvekt 460,54)

Beregnet: C ^ 70,42 H ^ 6,13 U A = 6,08

Erholdt: 70,69 % 6,15 7. 6,12 %

Eksempel 26

Fremstilling av carbobenzyloxy-fenylalanyl-Eenylalaninhydrazid

23,0 g (50 mmol) av forbindelsen fremstilt ifblge eksempel 25 ble opplost i 500 ml tbrr methanoi, og 7,5 g (0,15 mol) hydrazinhydrat ble tilsatt, og blandingen ble tilbakelbpsdestillert i 4 timer og fikk deretter henstå over natten ved værelsetemperatur. Den dannede utfelning på 18,1 g med et smeltepunkt av 198 - 200° C ble avsuget og filtratet inndampet til ca. 100 ml, og etter tiLsetning av en liten mengde vann krystalliserte 4,15 g forbindelse ut med et smeltepunkt av 196,5 - 197,5° C. Begge frak-sjoner ble rekrystallisert fra methanoi, og smeltepunktet steg da til 201 - 203,5° C. Utbytte: 19,5 g (84,8 % av det teoretiske).

Analyse: C26<H>28<W>4°4 (molekylvekt 460,54)

Beregnet: C = 67,81 7., H = 6,13 %, W 12,17 %

Erholdt: 67,57 % 6,08 % 12,37 %

Eksempel 27

Fremstilling av carbobenzyloxy-fenylalanyl-glycinethylester

2,8 g (20 mmol) glycinethylester-HC1 ble opplbst i 20 ml

DMF, 2,05 g Et^N ble tilsatt og blandingen avkjblt til. 0° C os dannet Et^N-HCl filtrert av. En blanding av 6,^ g (20 mmol) carbobenzyloxy-f enylalanin og 4,2 g (20 mmol) DCCI i 20 ml DMF ved -10°C ble satt til filtratet. Etter 1 dbgn ved værelsetemperatur ble blandingen avkjblt til 0° C, dannet DCU filtrert av, filtratet inndampet til tbrrhet og resten o<pp>lost i EtOAc og rystet som vanlig med 4 % saltsyre, 5 % natriumbicarbonatopplbsning og vann. Etter tbrking over magnesiumsulfat og konsentrering krystalliserte produktet ut ved tilsetning av petroleter1. Utbytte: 6,34 g (83,9 /„ av det teoretiske) med et smeltepunkt av 109- 111,5° C. Ved rekrystallisering fra EtOAc-petroleter. steg smeltepunktet til 112 - 112,5° C.

Analyse: C21<H>24<N>2°5 (molekylvekt 384,44)

Beregnet: C = 65,64 %, H - 6,29 %, i\ = 7,29 %

Erholdt: 65, 35 7„ 6,35 % 7,40 •/„.

Eksempel 28

Fremstilling av carbobenzyloxy-fenylalanyl-<g>l<y>cvl- :lvcinethylester

1,97 g (10 mmol) glycyl-glycinethylester-HCl med et smeltepunkt av 182 - 184° C ble onibst i 30 ml DMF, 1,4 ml (10 mmol) Et3N ble tilsatt, dannet Et^HCl filtrert av og 4,2 g (10 mmol) carbobenzyloxy-fenylalanin-p-nitro-fenylester satt til filtratet. Det hele ble opparbeidet som beskrevet i eksempel 13. Produktet ble rekrystallisert fra DMF/vann. Utbytte: 3,85 (87,2 /„ av det teoretiske) med et smeltepunkt av 93 95° C.

Analyse: <C>23<H>27lS3°6 (molekylvekt 441,49)

Beregnet: C = 62,57 H = 6,16 %, W 9,52 70

Erholdt: 62,20 % 6,05 ;Q 9,72 %

Eksempel 29

Fremstilling av carbobenzyloxy-fenylalanyl-glycinhydrazid

6,35 g (16,5 mmol) av forbindelsen ifblge eksempel 27 ble opplbst i 50 ml methanoi, 3,2 g (64 mmol) hydrazinhydrat ble tilsatt og etter omrbring i 1 dbgn ved værelsetemperatur ble opplbsningen inndampet til tbrrhet. Resten ble oplbst i en liten mengde var;m methanoi, hvoretter produktet krystalliserte ut. Utbytte: 4,95 g (81,0 7o av det teoretiske) med et smeltepunkt av 151,5 - 152,5° C.

Analyse: '-'19^22^4^4 (molekylvekt 370,42)

Beregnet: C = 61,61 %, H = 5,99 %, N = 15,13 %

Erholdt: 61,80 5,87 % 15,22

Eksempel 30 i

i Fremstilling av carbobenzyloxy-fenylalanylglycyl-glycinhydrazid

i j 2,1 g (4,.73 mmol) av forbindelsen fremstilt ifblge eksem-ipel 28 ble opplbst i 25 ml methanoi, 0,9 g (18 mmol) hydrazinhydra<t>t ble tilsatt og etter 2 dbgn ved værelsetempera tur ble den dannede; utfelning filtrert av og vasket med vann. Produktet ble rekrystalj-lisert fra methanoi. Utbytte: 1,75 g (86,6 % av det teoretiske) j med et smeltepunkt av 190 - 191° C. j Analyse: C21<H2>5N5°5 (molekylvekt 427,47) j Beregnet: C = 59,01 7o, H = 5,90 %, N = 16,38 % j Erholdt: 59,49 % 5,95 % 16,50 % \

i Peptidenes gamma-aminogrupper ved endene og bvrige aminoj-grupper som var beskyttet av carbobenzyloxygrupper, ble frigjort fra sine beskyttende grupper ved å hydrogenere bort carbobenzyloxy-gruppene i form av tbluen og carbondioxyd. Nitrogruppene i argininet ble samtidig redusert bort i form av ammoniakk med hydrogengass som reduksjonsmiddel og palladium på carbon som katalysator. , Da samtlige reduksjoner ble utfort på samme måte, bortsett fra mindre variasjoner som kan tas med i en tabell, folger bare en gene-rell beskrivelse av forsbkene. (For eksperimentelle detaljer se tabell 1).

Den beskyttede peptidester ble opplbst i en alkohol, methanoi eller ethanol, og det nbdvendige antall ekvivalenter av den saltdannende syre ble tilsatt i form av en vannopplbsning ellar alkbholopplbsning. Katalysatoren fuktet med vann (10 %, palladium på carbon) ble tilsatt i en mengde tilsvarende 100 mg pr. millitnol peptid. Katalysatormengden ble bket noe ved bkende lengde av pep-' tidet. Etter at katalysatoren var blitt spylt ned fra reaksjons-karets sider, ble all luft drevet ut av reduksjonsapparatet med nitrogengass. Denne ble i sin tur drevet ut med hydrogengass. \ Reduksjonssystemet ble lukket, og via et målekar som ble benyttet som reservoar for hydrogengass, ble hydrogengassen for reduksjonen tilfort. Reaksjonen ble Startet ved sterk omrbring i reduksjons-karet, og dannet carbondioxyd ble under omrbring absorbert i en til reaksjonskaret tilknyttet kolbe inneholdende 50 % kaliumlut. Ved hjelp av en nivåflaske tilsluttet til hydrogengassreservoaret i• og inneholdende vann j som sperrevæske ble hydrogengassforbruket ; for fullstendig reaksjon (korrigert til normalt trykk og temperatur og redusert med vannets partialtrykk ved den angjeldende tem-i peratur) avlest. Reaksjonstiden varierte betraktelig fra 2 til 12 j timer avhengig av peptidenes lengde og tilstedeværelse av nitro-igrupper i argininet. Etter avsluttet reaksjon ble nitrogengass ;ledet gjennom reaksjonskaret for å drive ut hydrogengassen. Katalysatoren ble filtrert av, filtratet inndampet til tbrrhet og resten tatt opp en rekke ganger med tbrr ether, hvoretter produktet ble fast og kornformet. Samtlige peptidestere var meget hygro-Iskopiske som hydrogenklorider og måtte derfor opparbeides og sepa-!reres i et tbrkekammer og lagres kjblig under fuktighetsfrie be-:tingel ser.

Antitromboplastinnvirkningen for enkelte av de interess-

anteste strukturer beregnet som en virkning tilsvarende en bestemt mengde av trypsinhemmende midler fra lunge i standardisert form.

I tabell 2 angir verdien i kolonne 3 den 50-prosentige

hemning av tromboplastinaktiviteten uttrykt i tilsvarende mengde trypsinhemmende middel (mg) pr. raillimol peptid. -OMe i tabell-formlene betyr en methylestergruppe, De fem for ste forbindelser i

tabellen, som ikke er fremstilt ifolge oppfinnelsen, er blitt tatt med for sammenlignings skyld. Det fremgår av i.sbellen .-it oet inntreffer en markert bkning av aktiviteten dersom tre aminosyrer forekommer i peptidene, d.v.s. når jevne spiraler fåes.

Den karaktive bradykininlignende virkning til to av de mest aktive peptider fremstilt ifolge oppfinnelsen er blitt målt som prosentuell bkning av gjennomblodningen i arteria femoralis ved intraartiell injeksjon i en hund med en opplbsning med en konsen-trasjon av 1 mg peptid/ml og en injeksjonshastighet av 1 - 3 ml/min.

Eksempel 31 ! i Fremstilling av carbobenzyloxy-valyl-omega-nitroarginin-iso-propylester 2,5 g (8,4 mmol) omega-nitroarginin-isopropylesterhydro-i genklorid ble opplbst i 30 ml DMF, og etter avkjbling ble 1,2 ml (8,4 mmol) triethylamin tilsatt og dannet triethylaminhydroklorid ! avfiltrert. Filtratet ble avkjblt til -10° C, og under omrbring ble det tilsatt 3,2 g (8,4 mmol) carbobenzyloxyvalin-p-nitrofenyl-j ester. Etter 2 timer ved -10° C fikk temperaturen stige til vær- j elsetemperatur, og blandingen fikk reagere ved denne temperatur i | 1 dbgn. Reaksjonsblandingen ble på nytt avkjblt til -10° C, hvor-j på ytterligere 1,2 ml triethylamin ble tilsatt, og etter noen timér var reaksjonen praktisk talt aysluttet. DMF ble fordampet under j vakuum ved 30 - 40° C, og resten etter inndampningen ble opplbst i ca. 500 ml ethylacetat mettet med vann. Opplbsningen ble ekstraj-hert som vanlig med 5 % natriumbicarbonatopplbsning, vann, 1 N saltsyreopplbsning og vann og den organiske fase tbrket over mag-nesiumsulf at og inndampet til tbrrhet under vakuum. Resten ble i opplbst i varm ethylacetat, og etter tilsetning av tbrr isopropyl-' ether krystalliserte forbindelsen ut etter oppbevaring i kjoleskap!. Utbyttet var 3,65 g, hvilket tilsvarer 88 7. av det teoretiske, og ;

det fremstilte produkt hadde et smeltepunkt av 162 - 166° C. Etter ytterligere en rekrystallisering av ethylacetat-isopropylether bkejt smeltepunktet til 165 - 168° C. Ved rekrystallisering fra metha- I nol-ethylacetat hadde forbindelsen et smeltepunkt av 115 - 116° cj Forbindelsen var enhetlig ved tynnskiktskromatografi på silicagel ! i tre forskjellige opplbsningsmiddelsystemer og hadde en optisk dreining av |>]d<*> = "24»°°» Cc=1» methanoi).

Analyse: C22<H>3<4>N6°7 (molekylvekt 494,56)

Beregnet: C=53,43 7., H = 6,93 7., N = 16,99 7.

Oppnådd: 53,20 7. 6,99 7. 17,11 7.

o

Eksempel 32

Fremstilling av carbobenzyloxy-fenylalanyl-valyl-omega-nitro-argininisopropylester

2,0 g (4,05 mmol) carbobenzyloxy-valyl-omega-nitro-argininisopropylester ble opplbst i 10 ml tbrr iseddik, 5 ml 4 N hydrogenbromid i iseddik ble tilsatt og blandingen omrbrt i 1 time ved værelsetemperatur idet den var beskyttet mot luftfuktighet. Under reaksjonstiden falt en del krystallinsk tripeptidesterhydrogenbromid ut, og utfelningen ble fullstendig etter tilsetning av 250 ml tbrr ether. Etherfasen ble dekantert av og utfelningen i behandlet ytterligere 3-4 ganger med tbrr ether. Utfelningen j ble tbrket over kaliumhydroxyd og P2O5 under vakuum og- var meget i hygroskopisk.

i Det erholdte tripeptidesterhydrogenbromid ble opplbst i ; 15 ml DMF, avkjblt til 0° C og 1 ml £7,3 mmol) triethylamin til-\ satt. Dannet triethylaminhydrogenbromid ble filtrert av, og 1,7 g ' (4 mmol) carbobenzyloxy-fenylalanin-p-nitrofenylester ble satt til I filtratet. Etter noen timer ved -10° C fikk reaksjonsopplbsningens : temperatur stige til 20° C. Reaksjonsopplbsningen ble påny ned-Ikjblt til -10° C, hvorpå ytterligere 1 ml triethylamin ble tilsatt, jog reaksjonsblandingen fikk gå over natten.- Opplbsningen ble inn-jdampet til tbrrhet under vakuum og resten opplbst i en blanding av j ethylacetat/n-butanol i et forhold av 2:1. Den organiske fase ble i som vanlig ekstrahert med 5 7. natriumbicarbonat, vann, 1 N saltsyre, i vann og tbrket over magnesiumsulfat. Den tbrkede opplbsning ble inndampet til tbrrhet og resten opplbst i en blanding av varm methanoi og ethylacetat i et forhold av 1:1, og etter 1 dbgn i kjbleskap krystalliserte 1,93 g av en forbindelse med' et smeltepunkt av 175 - 177° C. Ved rekrystallisering bket smeltepunktet til 178 - 179° C. Utbyttet var 1,75 g som utgjorde 68 % av det teoretiske. Forbindelsen [var enhetlig ved tynnskiktskromatografi på silicagel og hadde en optisk dreining av £<*]n = 25,7 (C=l, methanoi).

Analyse: '-'31.^4j-1(molekylvekt 641,74)

Beregnet: C •- 58,0? H - 6,7 5 70, N 15,28 /„

!;:rhnldt: 58,32 7. 6,92 $ 15,19 \

Eksemnel 33

Fremstilling av carbobenzyloxy-valyl-orrera-nitroarginyl-omega-nitroargininmethvlester

5,7 g (10 mmol) carbobenz<y>loxy-ome^a-nitroarginyl-omega-nitroar.gininmethylester og 30 ml tbrr iseddik ble anbragt i en kolbe som var beskyttet mot luft fukt i-het, hvoretter 10 ml 4N hydrogenbromid i tbrr iseddik hurtig ble tilsatt. Etter l times omrbring ved værelsetemperatur var decarbobenzyloxyleringen fullstendig, og det ble dannet en plastisk masse. Reaksjonsblai dingen ble under kraft in omrbring heldt ned i 700 ml tbrr ether hvorved det ble dannet en hård, plastisk, på overflaten delvis krystallinsk masse. Etherfasen ble dekantert av og resten tatt opp med tbrr ether som isjen ble dekantert av. Prosessen ble gjentatt inntil produktet var blitt krystallinsk, hvorpå det ble tbrket under vakuum over ?2^5 °£ kaliumhydroxyd. Utbyttet av dipeptidr esterhydrogenbromid var 6,5 g, og en bromidinnholdbestemmelse viste at forbindelsen inneholder 2,3 ekvivalenter hydrogenbromid. Forbindelsen ble opplbst i 40 ml DMF, avkjblt til 0° C og.3,5 ml

(25 mmol) triethylamin tilsatt. Dannet triethylaminhydrogenbromid ble filtrert av og 3,75 g carbobenzyloxy-valin-p-nitrofenylester satt til filtratet, hvoretter reaksjonsblandingen langsomt fikk anta værelsetemperatur over natten. Ytterligere 1,4 ml (10 mmol) triethylamin ble tilsatt blandingen etter at den var blitt avkjblt til -10° C, og fikk påny reagere over natten. Opplbsningen ble inndampet til tbrrhet, resten behandlet med ether, en liten mengde ethylacetat, 5 % natriumbicarbonatopplbsning, 10 % citronsyreopp-lbsning og vann og opplbst i varm methanoi som etter tilsetning av ethylacetat ga 5,1 g av et gul farvet krystallinsk produkt. To re-krystalliserin<g>er fra methanol-ethylacetat (1:1) ga tilslutt et produkt med et smeltepunkt av 119 - 122° C og en optisk dreining av Ck]q^ ~ -12,3° (C-l, DMF). Tynnskiktskromatografi av produktet nå silicagel i tre forskjellige opplbsningsmiddelsystemer ga bare én flekk, os dette indikerte at forbindelsen var enhetlig. Utbyttet var 4,35 g som tilsvarer 65,2 7, av det teoretiske.

Analyse: C24<H>41^11°10 (molekylvekt 643,68)

Beregnet: C = 44,78 7», H = 6,42 7=, N = 23,94 %

Erholdt: 44,52 % 6,38 % 24,11 %

Eksempel 34

Fremstilling av carbobenzyloxy-fenylalanyl-valyl-omega-nitro-arginyl-omega-nitroargininmethylester

1,30 g carbobenzyloxy-valyl-omega-nitroarginyl-omega-nitroargininmethylester ble decarbobenzyloxylert som beskrevet i tidligere eksempler. Etter opparbeidelse ble det oppnådd 1,55 g av et meget hygroskopisk ttipeptidesterhydrogenbromid som ved be-stemmelse av dets bromidinnhold viste seg å inneholde 2,4 ekvivalenter hydrogenbromid. Tripeptidesterhydrogenbromidet ble opplost i 15 ml DMF og avkjblt til -10° C, hvoretter 0,67 ml (4,8 mmol) triethylamin ble tilsatt. Dannet triethylaminhydrogenbromid ble filtrert av, og til filtratet ble det tilsatt 0,84 g (2 mmol) carbobenzyloxy-fenylalanin-p-nitrofenyléster, hvoretter reaksjonsopplbsningen fikk anta værelsetemperatur over natten. 0,28 ml triethylamin ble satt til opplbsningen som ble omrbrt i ytterligere noen timer. Reaksjonsblandingen ble inndampet til tbrrhet og resten behandlet med ether inneholdende en liten mengde ethylacetat, 5 7. natriumbicarbonatopplbsning, vann, 10 7o citronsyreoplbsning og vann.

Resten ble tbrket og deretter opplbst i en blanding av

methanoi og DMF i et forhold av 4:1 og behandlet med aktivt carbon, og den klarfiltrerte opplbsning ble plasert i kjoleskap over natten hvorpå 1,48 g av et stoff med smeltepunkt av 234 - 240° C ble oppnådd. Ved ytt erligere én rekrystallisering bket smeltepunktet I til 239 - 241° C. Ved kromatografi ble utbyttet av enhetlig for-[ binddlse 1,15 g tilsvarende 70,6 % av det teoretiske utbytte, og ! forbindelsen hadde en optisk dreining av [a]j^ = -9,6° (C-0,5, j DMF) .

tAnalyse: C35H5oNl2°ll (molekylvekt 814,88)

I Beregnet: C = 51,59 %, H = 6,19 %, N = 20,62 %

i Erholdt: 51,81 % 6,09 % 20,95 7.

l

1

Ek sempel 35 !

i i ! Fremstilling av carbobenzyloxy-fenylalanyl-fenylalanyl-valyl-omega-nitroarginyl-omega-nitroargininmethylester 408 mg (0,5 mmol) carbobenzyloxy-fenylalanyl-valyl-omegå!-nitroarginyl-omega-nitroargininmethylester ble decarbobenzyloxy- : lert som beskrevet i foregående eksempler. Det erholdte tetrapep-f tidesterhydrogenbromid i en mengde av 538 mg og inneholdende 2,4 ekvialenter hydrogenbromid ble opplost i 10 ml DMF og avkjblt tilj -10° C, 0,17 ml triethylamin ble tilsatt og dannet triethylamin- j hydrogenbromid filtrert av. Til filtratet ble det satt 0,21 g j (0,5 mmol) carbobenzyloxy-fenylalanin-p-nitrofenylester. Reak- i sjonsforlonet var det samme som beskrevet i foregående eksempler.; Opplbsningen ble inndampet til tbrrhet under vakuum og resten tatt opp med ether, 5 % natriumbicarbonatopplbsning, vann, 10 7. Eitron? syreopplbsning og vann. Det således behandlede produkt ble opplbst i varm methanoi, og etter 1 dbgn i kjoleskap ble det oppnådd 4,28 mg produkt med et smeltepunkt av 230 - 238° C. Etter ytterligere to rekrystalliseringer fra methanoi ble det oppnådd en kromatografisk enhetlig forbindelse med et smeltepunkt av 236 - 240° C og en optisk dreining av [a]^<5> -20,0° (C=3,8, DMF). Utbyttet var 338 mg tilsvarende 70,3 7. av det teoretiske.

Analyse: c44H59lv|i3<0>i2 (molekylvekt 962,06)

Beregnet: C = 54,93 7., H = 6,18 7., N - 18,93 %

Erholdt: 54,62 % 6,25 % 19,10 %

Eksempel 36

Fremstilling av carbobenzyloxyglycylprolin

7,2 g (63 mmol) prolin ble opplost i 160 ml av en blanding av pyridin og vann i et forhold av 1:1 og opplbsningens pH regulert til 8,8 med 4N NaOH. Under omrbr ing ved værelsetemperatur ble det tilsatt 20,7 g (63 mmol) carbobenzyloxyglycin-p-nitro-fenylester i små porsjoner idet pH under tilsetningen ble holdt mellom 8,5 og 8,8 med 4N NaOH. Etter 1 time ble 25 g natriumbicarbonat og 200 ml vann tilsatt, og opplbsningen ble ekstrahert med ethylacetat (10 x 60 ml) og vannfasen ansyret med 4N saltsyre til en pH av 3,5. Den ansyrte vannfase ble ekstrahert med ethylacetat og den organiske fase vasket med IN saltsyreopplbsning og vann og tbrket over magnesiumsulfat. Etter konsentrering under vakuum krystalliserte 14,5 g av et stoff ut som etter ytterligere én rekrystallisering fra ethylacetat ga 12,2 g produkt med et smeltepunkt av 155 - 156° C, en optisk dreining av 0]j<*5> = -54,0°

i (C=1,DMF) og en ekvivalent vekt av 304,8 mot beregnet 306,3.

Eksempel 37

Fremstilling av carbobenzyloxyglycylprolin-p-nitrofenylester

. 9,2 g (30 mmol) carbobenzyloxyglycylprolin ble sammen med 4,6 g (33 mmol) p-nitrofenyl opplost i 75 ml DMF. Opplosning-I en ble avkjolt til -5° C og 6,4 g (31 mmol) dicyclohexylcarbodi-imid opplost i en liten mengde DMF tilsatt idet temperaturen ikke fikk overstige 0° C. Blandingen fikk over natten langsomt anta ! værelsetemperatur og etter avfiltrering av dannet DCU (dicyclo-hexylurinstoS) konsentrertes filtratet til 40 ml i vakuum og ble der-; etter under omrbring dryppet ned i 1 liter vann. Den dannede halv-; faste masse ble fraskilt og opplbst i ethylacetat som ble tbrket over magnesiumsulfat. Ethylacetatopplbsningen ble inndampet til I tbrrhet og resten opplbst i en blanding av ethylacetat og tbrr

I ether i et forhold av 1:1, og etter tilsetning av petroleter

<1> krystalliserte 6,6' g stoff ut med et smeltepunkt av 104 - 105,5° C ! og en optisk dreining av [<x]q4 = -87,5° (C=l, DMF).

; Eksempel 38

Fremstilling av carbobBnzyloxyglycylprolyl-omega-nitroargininmethylester

2,7 g (10 mmol) omega-nitroargininmethylesterhyrirogen-klorid ble opplbst i 30 ml DMF og avkjblt til 0° C, hvoretter <:> 1,40 ml triethylamin ble tilsatt. Dannet triethylaminhydrogen-klorid ble filtrert av, 4,3 g carbobenzyloxyglycylprolin-p-nitro-

■ fenylester satt til filtratet og etter 1 dbgn ved værelsetempera-

j tur ytterligere 1,4 ml triethylamin. Reaksjonsopplbsningen ble ' inndampet til tbrrhet under vakuum og resten tatt opp med ether,

j 5 % natriumbicarbonatopplbsning, vann, 10 % citronsyreopplbsning I og vann. Resten ble opplbst i en liten mengde varm DMF, og etter tilsetning av vann krystalliserte 3,1 g produkt ut som ble rekrystallisert fra en blanding av DMF og vann. Det ble oppnådd et ut-j bytte av 2,8 g tilsvarende 53,7 7. av det teoretiske, og det er-

I holdte produkt var kromatografisk enhetlig og hadde et smeltepunkt

I av 105 - 107° C.

I Analyse: C22H31N7°8 (molekylvekt 521,55)

( Beregnet: C = 50,66 7., H = 5,99 7., N = 18,80 %

! Erholdt: 51,01 7. 5,84 7. 18,85 %

i

Eksempel- 39

Fremstilling av carbobenzyloxy-fenylalanyl-valyl-omega-nitroarginin

2,45 g (4 mmol) carbobenzyloxy-fenylalanyl-valyl-omega-nitroargininmethylester ble opplost i 30 ml 80 % aceton og forsåpet med 4 ml IN HaQti ved en pH av 11,5 - 12,5. Carbondioxyd ble innfort i opplbsningen inntil dens pH var 7,8, hvoretter opplbsningen ble inndampet under vakuum. Resten ble opplbst i vann, oplbs-ningen ekstrahert med ethylacetat og vannfasen 'ansyret" med citron-syreoplbsning. Den dannede utfelning ble ekstrahert med ethylacetat og den organiske fase vasket hbytral med vann, tbrket over MgSO^ og inndampet til tbrrhet under vakuum. Resten ble rekrystallisert fra en blanding av ethanol og vann. Utbyttet av kromatografisk rent produkt var 1,95 g tilsvarende 76,7 % av det teoretiske, og produktet hadde en optisk dreining av [<02n 3 = -12,2 o (c-1,1, methanoi) og en ekvivalentvekt av 625,3 mot beregnet 626,7 for den i titelen angitte forbindelse inneholdende to molekyler krystall-vann.

Eksempel 40

Fremstilling av carbobenzyloxy-fenylalanyl-valyl-omega-nitroargi-nyl-glycylproiyl-omega-nitroargininmethylester

334,6 mg (0,8 mmol) carbobenzyloxy-glycylprolyl-omega-nitroargininmethylester ble decarbobenzyloxylert og opparbeidet som beskrevet i foregåend e eksempler. Tripeptidesterhydrogenbromidet ble opplbst i 2 ml nydestillert DMF, 22,2 ml triethylamin tilsatt, dannet triethylaminhydrogenbromid filtrart av, filtratet avkjblt til -10° C og 509 mg (0,8 mmol) carbobenzyloxy-fenylalanyl-valyl-omega-nitroarginin opplost i 2,5 ml DMF på forhånd avkjblt til -10° C tilsatt. 165 mg (0,8 mmol) DCCI ble tilsatt under omrbring, og opplbsningen fikk stå i 3 dbgn vad værelsetemperatur. Opplbsningen ble inndamet fcil tbrrhet under vakuum og resten i en mengde av 933 mg opplbst i 3 ml- DMF og avkjblt til -20° C hvorved 128 mg DCU krystalliserte ut. Preparativ tynnskiktskromatografi av råproduktet på silicagel i opplbsnings-middelsystemet: n-butanol:eddiksyre:vann (6:2:2) ga et rent produkt med en Rf-verdi av 0,64. Eh totalhydrolyse av 1,2 mg stoff i 6N saltsyre i 48 timer ved 110° C og todimensjonal tynnskiktskromatografi av hydrolysatet på silicagel ga de i hexapeptidderi-vatet inngående aminosyrer. Utbyttet av kromatografisk rent stoff var 185 mg tilsvarende 19,1 % av det teoretiske. Stoffet hadde et smeltepunkt av 125 - 127° C og en optisk dreining av Ca3n -32,0° (c=0,5,DMF).

Analyse: C^H^N-^O-^ (molekylvekt 969,05)

Beregnet: C = 52,06 %, H = 6,24 %, N = 20,24 %

Erholdt: 5l,8U- % 6,15 % 20,13 %

Claims

Analogifremgangsmåte ved fremstilling av nye peptider med antitromboplastin-, antitrombin- og antifibrinolysevirkning og karutvidende virkning og med formelen:

hvor er hydrogen, en butyl-, isobutyl-, sekundær butyl- eller benzylgruppe, m er 0 eller 1, X er -(HNCH2C0)n -, med n1 varierende fra 0 til 3, eller med n^ varierende fra 0 til 3* og R^ utgjor en carboxyalkylgruppe, hvor carboxylgruppen kan være fri, forestret med en alkanol med hoyst 8 carbonatomer eller amidert, eller med n^ og Rl med den ovenfor angitte betydning, hvor Ala betyr resten av alanin, og R^ er en rett eller forgrenet alkylgruppe med hoyst 8 carbonatomer, karakterisert ved at de nodvendige aminosyrer i den angitte rekkefolge og/eller peptidbruddstykker som inneholder disse aminosyrer i den angitte rekkefolge, kondenseres til det angitte polypeptid, idet for den peptidiske kobling en ende- stående carboxylgruppe og/eller en aminogruppe aktiveres og de ovrige reaktive grupper beskyttes intermediært.