DE1804022A1 - Polypeptide sowie Verfahren zu ihrer Herstellung - Google Patents
Polypeptide sowie Verfahren zu ihrer HerstellungInfo
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Description
2000 Hamburg 52 · WaltutraBe 12 · Ruf 892255
«000 MOnchan 22 · LltbharrttraB« 20 · Huf 226548
| L | F | IS | IHRE | NACHRICHT VOM | J | UNSER ZEICHEN | HAMBURG |
| IHR ZEICHEN | o/t | ||||||
| Ok | 022 . 7 | ||||||
| BETRIFFT: | |||||||
AiCTlEBOLAGET IiOPORS1 69O 20 Boiors/Sohweden
Polypeptide sowie Verfahren zu ihrer Herstellung.
Die vorliegende Erfindung betrifft Polypeptide i'iit biologischen, insbesondere biutkoagulations—
hcftuieiiden Wirkungen.
Die Koagulation des Blutes ist bekanntlich ein
icouplizierter Vorgan'>
Scheuiatisch kann gemäß all—
.■verein anerkannten Hypothesen, der normale !Coagulations
Vorfall5 in drei Phasen unterteilt werden, nämlich
eine erste Puase, uei der durch ZusasimienwirkunL;
2 ν; iö eiien gewissen Pakt or on im iilut 'i'hroüiboplastin
jüciiüet wird, eine zweite Phase, während der das
Px-ötliroi,ii>in des Jjiutos unter eiizyuiafcischer Mitwirkung
eiaea Faktors, der vojii Throiiiboplastin aktiviert worden
ist, in 'L'iironijin uui/rev/andelt wird, soiiie eine dritte
909820/1295 ~
BAD ORIGtHAL
Phase, bei der das Thrombin, welches ein protheolytisches*
Enzym ist, das Fibrinogen in Fibrin umwandelt, welches ein festes Koagulat bildet.
Diese Umwandlung von Fibrinogen in Fibrin dürfte
so vor sich gehen, daß das Fibrinogen durch Beein~ flussurig des Thrombins ein Paar Polypeptide mit kurzen
Ketten abspaltet, welche Peptid A und Peptid B genannt werden.
Durch Aggregation über die aktiven Abspaltungsenden werden die Fibrintaoleküle in lange faser ähnliche
Komplexe in Form von weichen Aggregaten umgewandelt, welche darauf durch zwischenuolekulare Schwefeibrücken
in unlösbare Koagulate verwandelt werden.
Die einleitende Bildung von Thromboplastin wird in den Blutgefäßen an Stellen aktiviert, an denen
eine Verletzung vorliegt.
Dieses Thromboplastin, welches "intrinsic" Thromboplastin oder Plasuiathrombopiastin genannt
wird, kann jedoch durch ein aktives Produkt ersetzt werden, welches "extrinsic" Thromboplastin genannt
wird und das unter Einwirkung eines Faktors in den Gefäßgeweben gebildet wird.
Der ganze Koaguiatioxisvorgang ist eine Serie von.
enzymatischen Reaktionen, bei denen verschiedene Faktoren einander sukzessiv aktivieren.
BAD ORIGINAL "°""
Ö0962Ö/120&
18Q4022
Es sind mehrere Substanzgruppen mit einer verzögernden
Wirkung auf die Blutkoagulatioii bekannt. Diese Substanzen können ihre Wirkung auf verschiedene
Vorgänge in dem komplizierten Koagulationsprozeß ausüben,
und zwar von einer Beeinflussung der Blutgefäße
bis zu starker Fibrinolyse. Die Beeinflussung des
Koagulationsmechanismus kann somit eine Gefäßwirkung,
eine Antithroiabinwirkung, eine f ibrinolytiselie Wirkung
oder eine Antithroiuboplastinwirkung sein. Bei der Antikoagulationstherapie,
z.B. im Zusammenhang mit chirurgischen Eingriffen, gilt es, in eine.ii so früh als
möglichen Stadium Mittel einzusetzen, die deu Koa^u—
lationsprozeiJ verhindern, wenn pathologische Veränderungen zur Arermutung eines hohen Gefahrenmoinentes für
Thrombosebilduiii Anlaß gegeben haben. Ein solches
Gefahrenmoment liegt oft auch bei jüngeren Patienten
nach einem chirurgischen Eingriff vor.
Substanzen, die das Koagulationssystein beeinflussen,
sind z.B. Heparin, Kuuiarinderivate,
Streptochinase, Proteinaseiiihibitoren usw., und
diese Substanzen wurden üisher bei der Antikoagulationstherapie ijenutz-t. Bei der Anwendung dieser Substanzen
treten aber gewisse Schwierigkeiten auf, insbesondere ist'es ein nicht unwesentliches Problem, die individuell
geeignete Dosis festzustellen. Verbesserte Medikamente wurden die Therapiesituatioii verbessern.
6Q982U/129&
BAD
Die vorliegende Erfindung betrifft nun neue Substanzen, die in erster Linie eine antithroroboplastische
Wirkung zeigen und damit die Thrombinbildung sowie die Antithrombinwirkung beeinflussen, so daß sie
die Überführung des Fibrinogens in Fibrin hemmen. Außerdem haben gewisse erfIndungsgemäß hergestellte
Polypeptide andere interessante Wirkungen gezeigt9 z.B. beeinflussen einige von ihnen stark die Blutgefäße,
was bei der Behandlung von verschiedenen Kreislaufstörungen von großem Interesse ist.
Polypeptide gemäß der Erfindung weisen eine Kette von Aminosäuren auf, die mit dem Peptid A des Menschen
in naher Übereinstimmung steht. Die betreffenden natürlichen Fibrinopeptide bestehen aus Ik - 16 Aminosäuren, doch hat es sich erfindungsgemäß gezeigt, daß
gute Wirkungen bereits bei Anwendung von Polypeptiden erzielt werden können, die aus 3-9 Aminosäuren aufgebaut
sind, obwohl Polypeptide mit längeren Ketten im Rahmen der Erfindung liegen. Eine maximale antithromboplastische
Wirkung wird bei gleichem Helix in den Polypeptidketten erhalten, d.h. wenn die Anzahl
Aminosäuren ein Vielfaches von 3 ist. Speziell zwei Aminosäuren, nämlich Phenylalanin und Arginin, haben
sich für die Erhaltung einer guten antithromboplastischen Wirkung als wesentlich erwiesen, insbesondere
wenn sich diese Aminosäuren in End— positionell befinden.
Die interessanteste Wirkung der erf indungsgeiuäßen
Polypeptide ist die antithromboplastische Wirkung, weil sie eine Beeinflussung des Koagulationsverlaufes zu
einem früheren Zeitpunkt erlaubt. Wie bereits erwähnt, ist jedoch auch eine Antithronibinwirkung und eine
fibrinolytische Wirkung ebenso wie in gewissen Fällen
eine Gefäßwirkung festgestellt worden. Die letztgenannte
Wirkung steht nicht mit der Konfiguration des
natürlichen Peptides A in klarem Zusammenhang. In seiner Art kann die Gefäßwirkung als eine bradychinin«
ähnliche Aktivität angesehen werden.
Die oben erwähnten Wirkungen sind an großen
Versuchstieren in vivo und im menschlichen Blut geprüft worden, wie nachstehend näher erläutert wird.
Die infragestehenden Verbindungen enthalten optisch aktive Aminosäuren von L-Konfiguration, welche
durch Amidbindung miteinander vereinigt sind.
Im folgenden sollen sowohl in der allgemeinen Beschreibung als auch.in den Beispielen die erwärmten
Aminosäuren überall L—Konfiguration haben,. obwohl dies nicht besonders hervorgehoben wird.
Die Polypeptide nach der Erfindung können durch folgende allgemeine Formel wiedergegeben werden:
-6-
§09820/1295
OIL,C CH„ NH
5\X 3 .1
CII
I 2
H0N - CH -Ο
N-CH-C
ul
f f
H (CII9)
II
"2'EL
- X - N - CII - C - Y - N - CH - C - R,
O in
in der R1 Wasserstoff oder ein Butyl-, Isobutyl-, sekundär
Buiyl- oder Benzylrest sein kann. Der Aminosäurerest
— N — CII — CO kann also von Glycin, Isoleucin, Leucin,
R1"
Norleucin oder Phenylalanin gebildet werden. In gewissen Peptiden kann dieser Aminosäurerest bei gleichbleibender
Wirkung in Fortfall kommen. In der Formel kann daher m den Wert O oder 1 haben.
In der allgemeinen Formel bedeuten: a) X alternativ =
1. -(HNCII2CO)111-, wobei n1 den Wert 0-3 annehmen
kann,
2. -(HN - CHCO) - (lTNCH2CO)nl -, wobei η^ den
Wert O — 3 annehmen kann, und R. eiiie W—Alkyl—
carboxylgruppe mit üs ai8C—Atomen im Alkylrest
bedeutet, die esterifiziert oder ätiiidiert sein
kann. ;
Die— (NH - -CHCO) - Gruppe kann vorzugsweise ein
Rest von Asparaginsäure, Asparagin- r"-Alkylester
mit bfe ai 8C-Atomen im Alkylrest, Asparagin,
Glutamin, Glutaminsäure oder Glutaminsäure—a —
Alkylesib@48|£tDt)^s|^c3h|.toinien im Alkylrest sein.
ORIGINAL INSPECTED
3. AIa - (HN - CHCO) - (HN - CH2 - CO)n± -, wobei
k
"Ala" einen Alaninrest in Amidbindung bedeutet und n^ und R^ die unter a 2) angegebene Bedeutung haben.
"Ala" einen Alaninrest in Amidbindung bedeutet und n^ und R^ die unter a 2) angegebene Bedeutung haben.
Null
b) Y = .©/oder - NH - CII - CO -, wobei n2 sowie η
b) Y = .©/oder - NH - CII - CO -, wobei n2 sowie η
in der allgemeinen Formel zwischen 2—4 variieren kann und R,- sowie R2 Wasserstoff,
eine Guanyl-, oder Carbainyl- oder Alkylgruppe mit bis zu 8 C—Atomen bedeutet.
c) R~ alternativ =
1. eine Alkoxygruppe vorzugsweise mit einer geraden, verzweigten oder zyklischen, gesättigten oder
ungesättigten Kohlenwasserstoffkette mit bis
■ zu 8 Kohlenstoffatomen.
2. eine Alkylgruppe mit einer geraden, verzweigten
oder zyklischen, gesättigten oder ungesättigten
mit
Kohlenwasserstoffkette/bis zu 8 Kohlenstoff«
Kohlenwasserstoffkette/bis zu 8 Kohlenstoff«
atοπen.
3. eine Ainidgruppe - NR^-R», in der R/- und R„
Allcylgruppen mit einer geraden, verzweigten
oder cyklischen, gesättigten oder ungesättigten Kohlenwasserstoffkette mit bis zu 8 Kohlenstoff
atomen sein oder auch zusammen ein Hingsysteia
bilden können.
9820/1295
4. Gly-Pro-Y-Bg, wobei Y die gleiche Bedeutung wie
unter b) und RQ die gleiche Bedeutung wie R,
unter o) 1 ~· 5 hat.
^n der nachstehenden Tabelle ist die Bedeutung der
verwendeten Abkürzungen erläutert.
| t | Abkürzung | Tabelle 1 |
| VaI | Name der Aminosäure in L-Form | |
| Arg | Valin | |
| Phe | Arginin | |
| Gly | Phenylalanin | |
| Leu | Glycin | |
| AIa | Leucin | |
| GIu | Alanin | |
| Orn | Glutaminsäure | |
| Pro | Ornithin | |
| Prolin |
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können nach an sich
bekannten Methoden zur Synthese von Polypeptiden hergestellt werden.
Allgemein bedeutet es, daß man die infragestehenden
Polypeptide ausgehend von den einfachen Aminosäuren stufenweise durch Kopplung derselben in gewünschter Form unter
Ausbildung von Amidbindungen aufbaut. ,.
So können zwei Aminosäuren zu einem Zwischenprodukt umgesetzt werden, das dann mit einer dritten Aminosäure
oder mit einem ähnlichen aus zwei oder mehreren anderen
10 9 8 2UJA
Aminosäuren erhaltenen Zwischenprodukt zu einem neuen Peptid verkettet wird, das dann gegebenenfalls auf
ähnliche ¥eise weiter umgesetzt wird, bis die gewünschte Kette aufgebaut ist0 Die Reihenfolge im Zusammenbau
der Aminosäuren ist somit in vieltem Ausmaß wahlfrei, so lange man bloß beachtet, daß die Aminosäuren
in solcher Folge aneinander gekoppelt werden, daß die gewünschte Folge von Aminosäuren im Endprodukt erhalten
wird.
Bei den Umsetzungen ist darauf zu achten, daß
freie Aminogruppen und Carboxylgruppen, die nicht reagieren sollen, auf geeignete Weise geschützt werden,
damit die Kopplung in gewünschter Weise erfolgt. Eine geeignete Weise, die Aminogruppen zu schützen, besteht
darin, die Aminosäure in das Corbobenzyloxyderivat umzuwandeln.
Bei der Umsetzung von Produkten, die Guanidingruppen (wie Arginin) enthalten, wird die Guanidinen—
gruppe durch Umwandlung in das W-Nitroderivat geschützt.
Im erhaltenen Endprodukt können restliche Schutzgruppen auf geeignete Weise entfernt werden, z.B. durch
Hydrierung, wie untenstehend näher besehrieben wird.
Somit bedeutet das Verfahren nach der Erfindung eine Serie von Umsetzungen der Type
A - COZ + NII2 B ? A CONIIB,
wobei ACOZ eine einfache Aminosäure bedeutet oder ein
-10-
QU062U/129S
duroh eine ähnliohe Reaktion aufgebautes niedriges Peptid, worin Aminogruppen und Carboxylgruppen, die nicht
reagieren sollen, auf geeignete Weise gesohützt sind, oder ein zur Reaktion neigendes Derivat einer solchen
Aminosäure oder eines Peptides, und NH0B bedeutet eine Aminosäure oder ein Peptid, in denen Carboxylgruppen
geschützt sein können und Aminogruppen, die nicht reagieren sollen, auf geeignete Weise geschützt sind,
wobei die angewendeten Aminosäuren und die Reaktionsfolge so gewählt vtertfety daß ein Polypeptid nach der obenstehenden
Formel entsteht, worauf die nicht erwünschten Schutzgruppen entfernt werden.
Die Herstellung der erfindungsgewäßen Polypeptide
die
wird durch/nachstehenden Beispiele veranschaulicht. Die Beispiele i — XI erläutern zusammengenommen die vollständige Synthese von Phe - Leu - AIa - GIu(Y-OMe)-GIy - GIy - GIy - VaI - Arg - OMe. Die übrigen Beispiele erläutern die Synthesen von anderen im Rahmen der Erfindung liegenden Substanzen ebenso wie verschiedene Zwischenprodukte für diese, wobei die Produkte ebenfalls in Form von Schutzgruppen enthaltenden Derivaten erhalten werden,, Die Entfernung der Schutzgruppen wird in zusammenfassender Form anschließend an die Beispiele beschrieben und für einige der hergestellten Derivate werden experimentelle Einzelheiten in Tabellenform angegeben.
wird durch/nachstehenden Beispiele veranschaulicht. Die Beispiele i — XI erläutern zusammengenommen die vollständige Synthese von Phe - Leu - AIa - GIu(Y-OMe)-GIy - GIy - GIy - VaI - Arg - OMe. Die übrigen Beispiele erläutern die Synthesen von anderen im Rahmen der Erfindung liegenden Substanzen ebenso wie verschiedene Zwischenprodukte für diese, wobei die Produkte ebenfalls in Form von Schutzgruppen enthaltenden Derivaten erhalten werden,, Die Entfernung der Schutzgruppen wird in zusammenfassender Form anschließend an die Beispiele beschrieben und für einige der hergestellten Derivate werden experimentelle Einzelheiten in Tabellenform angegeben.
£09820/1255
Carbobenzyloxy—Valyl—<y <->Nitroarginin~Methylester
hergestellt nach Methoden A und B.
A. 10,8 g feinpulverisiertes und getrocknetes&) »
arginin-Methylesterhydroohlorid (0,04 Mol) werden in 150 ml
neudestilliertem Dimethylformamid gelöst. Nach Abkühlen
wird 5»6 ml Triethylamin (0,04 Mol) zugesetzt und das
gebildete Triäthylasninhydroohlorid abfiltriert. Die filtrierte Lösung wird auf ~10°C gekühlt und unter Rühren
werden 14,92 g Carbobenzyloxy~Valin-p~Nitrophenylester
(0,04 Mol) zugegeben. Nach 2 Stunden bei -i0°C darf die Temperatur in der Reaktionsmischung auf Raumtemperatur steigen und bei dieser Temperatur 24 Stunden
reagieren.
Das Dimethylformamid wird im Vakuum bei 30 ~ 400C
abgedunstet und der Rückstand in einer Mischung von Äthylazetat/n«Butylalkohol (2:1) gelöst. Die Lösung
wird 5mal mit 5 %-iger Natrium»bicarbonatlösung, 2mal
mit Wasser, 3mal mit 1 N-Salzsäurelösung und schließlich
3mal mit destilliertem Wasser extrahiert.
Die Lösung wird über Magnesiumsulfat getrocknet,
zur Trockne eingedampft und der Rückstand in trocknem Methanol gelöst. Aus der Methanollösung kristallisiert
die Substanz durch Zusatz von absolutem Äther aus. Ausbeute 14,1 g mit einem Schmelzpunkt von 163 - 1640C.
- 12 '-
9Ö9820/129S
Durch Zusatz von Petroläther zur Mutterlauge erhält man 1,1 g Substanz mit einem Schmelzpunkt von 155 - 1560C.
Summe der Ausbeute 81,4 %
Analyse: C2OH3ON6°7 (Molgewicnt 466,5) (Trooknung
Stunden bei 700C über P3O5)
Berechne^: C = 51,49 %, H = 6,48 %, N m 18,02 %
Erhalten: 52,02 %, 6,61 %, 17,99 %
B. 5,4 g cu -Nitroarginin-Methylesterhydroohlorid
(0,02 Mol) werden in 75 ml Dimethylformamid gelöst und nach dem Abkühlen werden 4,84 ml Tributylamin (0,02 Mol)
zugesetzt. Sobald die Temperatur der Lösung -100C beträgt,
werden 7,0 g Carbobenzyloxy-Valin (0,028 Mol), das sich leicht löst, und darauf 5,77 g Bicyclohexylcarbodiimid
(0,028 Mol) zugegeben. Die Reaktionsmischung wird 2 Stunden bei -100C, dann ca. 10 Stunden
bei O0C und schließlich 8 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Es wird zugesetzt 1 ml Essigsäure und nach
einer halben Stunde wird das gebildete Dioyclohexylkarbamid abfiltriert (Gewicht 5,9 g). Das Filtrat
wird eingedampft und der Rückstand in Äthylazetat— Butylalkohol (2:1) gelöst. Spuren von ungelösten
Dicyolohexylkarbamid werden abfiltriert. Sonst verfährt man wie unter a.
Ausbeute: 7,35 g mit einem Schmelzpunkt von I60 l6l°C,
was 78,9 % der Theorie entspricht. Aus der Mutterlauge erhält man eine Substanz, die bei ca.
131OC schmilzt und wahrscheinlich N—Carbobenzyloxy—
Valin-N, ^-Dizyklohexylharnstoff darstellt.
Ö09&2O/12S6·
-13-
- 13 Beispiel 2
Herstellung von Carbobenzyloxy-»Glycyl-»Glyoyl<»Valyl-iJ-Nitroarginin-Methylester.
9»33 g Carbobenzyloxy—Valyl«-<2J-Nitroarginin—Methyl-»
ester (0,020 Mol) werden in 120 ml trookener Essigsäure
gelöst und 10 g trookener, bromfreier Bromwasserstoff in die Lösung bei 20 C 45 Minuten lang eingeleitet.
80 ml Essigsäure und der Überschuß an Bromwasserstoff werden im Vakuum bei 20°C abdestilliert und der Rückstand
in einem Liter trockenem Äther kräftig digeriert. Die Ätherphase wird abdekantiert und der Rückstand noch 3mal
mit trockenem Äther digeriert. Die körnig gewordene Substanz wird über Phosphorpentaoxyd im Vakuumexsickator
getrocknet, Sie erweist sich als sehr hygroskopisoh. Die Analyse auf Bromwasserstoff ergab oa. 1,5 Äquivalente
Bromwasserstoff per Mol gegenüber dem berechneten einen Äquivalent Bromwasserstoff„
Ausbeute: 9,2 g Valyl~w -Nitroarginin-Methylester-1,5
HBr. Das Hydrobromid wird in 80 ml neudestilliertem Dimethylformamid gelöst und auf 0°C gekühlt. 4,30 ml
(0,031 Mol) Triethylamin werden zugesetzt und nach 10 Minuten Rühren wird das gebildete Triäthylamln~Hydrobromid
(ca, 3,55 g) abfiltriert, Dem Piltrat, das auf -100C abgekühlt wurde, werden 7»75 g Carbobenzyloxy-*
&lycyl-Glycin—ρ—Nitrophenylester mit einem Schmelzpunkt
von I63 - 164°C zugesetzt (0,020 Mol). Die Mischung
wird 1 Stunde lang bei -10°C gerührt, worauf man auf Raumtemperatur ansteigen läßt. Nach 4 Tagen Stehen bei
Raumtemperatur wird die Lösung im Vakuum bei 400C eingedampft
und der Rückstand mit Äthylazetat behandelt, worauf er kristallisiert.
Ausbeute: 12,45 g mit einem Schmelzpunkt von 152 -»
1540C. Die Substanz wird in Dimethylformamid gelöst
und mit 5 %—iger Natriumbicarhonatlösung ausgefällt.
Die Fällung wird mit destilliertem Wasser und Äthanol gewaschen. Die Substanz wird wiederum in Dimethylformamid
gelöst und mit 5%-iger Zitronensäurelösung ausgefällt,
mit destilliertem Wasser und gekühltem Äthanol gewaschen und im Vakuumexsickator über P2 0E getrocknet.
Ausbeute: 7,6 g mit einem Schmelzpunkt von 176—181°C.
Analyse: Cg^H^-NgOg (Molgewioht 579,6). (Trocknung
10 Stunden bei 7O0C über PgO- unter Q2 Torr)
Bereohnet: C = 49,73 #, H s 6,09 #, N = 19,34 %
Erhalten: 49,20 % 6,34 % 19,35 %
Herstellung von Carbobenzyloxy-Alanyl- jf -Methylglutaminsäure.
5,92 g Glutaminsäure—j'—Methylesterhydrochlorid
(0,03 Mol) werden in einer Mischung von Pyridin/Wasser
(lsi) gelöst und auf 5°C abgekühlt. Der Mischung werden
10,32 g (0,03 Mol) Carbobenzyloxy-Alanin-p-Nitrophenylester
portionsweise zugesetzt, und der pH-Wert mit Hilfe von 4 N NaOH konstant auf 8,7 gehalten. Nach 24stündigem
Stehen bei Baumtemperatur wird die Lösung mit Wasser verdünnt und mit Natriumbicarbonat gesättigt. Die
gesättigte Lösung wird 7*al nit Äthylazetat extrahiert
und mit halbkonzentrierter Salzsäure auf pH = 2,9 bei ca. O0C angesäuert, dann mit-Äthylazetat extrahiert
und die Äthylazetat-Phase mit kochealzgesattigtem Vaseer
gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und zur Trockne eingedampft. Der Bückstand wird in absolutem
Äther gelöst, und bei Zusatz von Petroläther kristallisiert die Substanz als Nadeln aus.
Ausbeutet 6,3 g mit einem Schmelzpunkt von 99»5~iOO$5°C,
was 57»3 % der Theorie entspricht.
Analyse: C17H22O7N2 (Molgewicht 366,4)
Berechnet: C = 55,75 #, H = 6,05 #, N = 7,65 %
Erhalten: 55,60 % 5,98 ^ 7,54 %
Äquivalentgewioht: Berechnet: 366,4. Erhalten 367,3, 368,1
Herstellung von Carbobenzyloxy-Glycin—Carbo—teIt.»"
Butyloxyhydrazid.
20,9 g Carbobenzyloxy-Glycin (0,1 Mol) und 13,2 g
Carbo-tert.-Butyloxyhydrazid (0,1 Mol) werden in 150 ml Azetonitril gelöst. Nach Abkühlung auf O0C
werden 20,6 g Dicyclohexylcarbodiimid (0,1 Mol), gelöst
in 50 ml Azetonitril, zugesetzt, worauf man die
Reaktionsmischung bei Raumtemperatur über die Nacht
stehenläßt. Gebildetes Dicyclohexylkarbamid wird abfiltriert und das Filtrat im Vakuum zur Trockne
eingedampft. Der Rückstand wird in Äthylazetat
-16-
90 9 82Q/129S
-, 16 -
gelöst und mit 5%-lger Zitronensäure! Wasser, 5 %-igem
Natriumbicarbonat und Wasser gewaschen. Die Äthylazetat«·
Phase wird über Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum auf ein kleines Volumen konzentriert, wobei die Substanz
auskristallisiert. Die Substanz wird in Äther gelöst und bei Zusatz von Petroläther kristallisieren 29,1 g
(90,i %) Carbobenzyloxy-Glycin-Carbo-tert.-Butyloxyhydrazid
aus. Schmelzpunkt 76 - 83°C. Umkristallisierung aus Äthylazetat-Petroläther ergibt 23,i g (71,5 %) mit
einem Schmelzpunkt von 81 - 840C. Weitere Umkristallisierung
erhöht den Schmelzpunkt auf 82 — 84 C.
Analyse: ϋ±κΕ2ί^3Ο5 (Molgewioht 323,36)
Bereohnet: C = 55,72 %, H ■ 6,54 %t N = 13,00 %
Erhaltern 55,39 > 6,66% 13,35%
Herstellung von Glyoin~Carbo«*tert.— Butyloxyhydrazid.
9,7 g Carbobenzyloxy— Glycin—Carbo—teit,-· Butyloxyhydrazid
(0,03 Mol) werden in 100 ml Methanol gelöst, 0,5 g 10 % Pd/C zugegeben und Wasserstoff eingeleitet.
Nach 12 Stunden sind 66Ο ml Wasserstoff verbraucht und die Hydrierung wird abgebrochen. Der Katalysator
wird abfiltriert, und das Methanol unter Vakuum abgetrieben.
Der Rückstand wird mit absolutem Äther digeriert, wobei eine Substanz mit einem Schmelzpunkt
von 141 - 143°C auskristallisiert.
909Ö20/1296 ;-;
Ausbeute: 5,3 (93 % der Theorie).
Der Schmelzpunkt der Substanz steigt naoh einer
Umkristallisation aus Methanol-Äther auf 145 - 146°C.
Analyse: C7H15K-O5 (Molgewicht 189,22)
Berechnet: C = 44,43 #, H = 7,99 %, N = 22,21 #, E-Gewioht *
189,2
Erhalten: 43,94 % 7,97 % 22,35 % 191,0
Herstellung von Carbobenzyloxy-Phenylalanyl-Leucin-Äthylester.
9,8 g Leuein-Äthylesterhydrochlorid (0,05 Mol) werden
in 30 ml Dimethylformamid gelöst und 5,06 g Triethylamin
(0,05 Mol) zugegeben. Das gebildete Triäthylaminhydrochlorid
wird abfiltriert und mit etwas gekühltem Dimethylformamid gewaschen.
15,0 g Carbobenzyloxy-Phenylalanin (0,05 Mol) werden
in 30 ml Dimethylformamid/Azetonitril (1:1) gelöst und auf -10°C abgekühlt, worauf 10,4 g Dicyclohexyl··
carbodiimid (0,05 Mol) und das obige Piltrat, das
Leucin—Äthylester enthält, zugesetzt werden. Die Temperatur in der Reaktionsmischung kann über Nacht
auf Raumtemperatur ansteigen, und dann wird 1 ml 50%-ige Essigsäure zugesetzt. Naoh 30 Minuten wird
gebildetes Dicyclohexylkarbamid abfiltriert und das Filtrat im Vakuum unter 400C zu Trookenheit eingedampft.
Der Rückstand wird in Äthylazetat gelöst und etwas umgelöstes Dicyclohexylkarbamid abfiltriert.
-18-
6098 2 0/1206
~ 18 -
Die Äthylazetat-Lösung wird mit 1 N Salzsäure, Wasser, 50 %-iger Natriumbicarbonatlösung und Wasser gewaschen.
Die Äthylazetatphase wird über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum auf ein kleines Volumen konzentriert. Nach
Zusatz von Petroläther kristallisiert Corbobenzyloxy-Phenylalanyl—Leucin—Äthylester
als Nadeln mit einem Schmelzpunkt von 116 - 117°C aus. Ausbeute: 19,45 g
(88,3 % der Theorie). Durch Umkristallisierung aus
Äthylazetat/Petroläther erhöht sich der Schmelzpunkt auf 117 - 117,5°C.
Analyse: CgJH32N2O,. (Molgewicht 440,55)
Bereohnet: C = 68,16 %9 H = 7,32$, N - 6,36 %
Erhalten: 67,74 % 1,1Bf, 6, 58 %
Herstellung von Carbobenzyloxy—PhenylalanyI-Leucin—
hydrazid.
8,4 g Carbobenzyloxy—Phenylalanyl—Leucin-Äthylester
(0,02 Mol) werden in 150 ml Methanol gelöst und 4,0 g Hydrazinhydrat (0,08 Mol) zugesetzt. Die Mischung wird
über Nacht gerührt und gebildetes Carbobenzyloxy—Phenyl—
alanyl-Leuoinhydrazid wird abfiltriert und mit etwas Methanol gewaschen. Dann wird aus Methanol/Wasser
umkristallisiert, wodurch man 6,6 g mit einem Schmelzpunkt von 192,5 - 193,5 °C erhält, was 81,5 % der
Theorie entspricht.
-19-909820/1295
Analyse: C23H50N4O4 (Molgewicht 426,53)
Berechnetι C = 64,77 #, H = 7,09 #, N = 13»14 #
Erhalten: 64,85 % 7,12 # 13,16 %
Herstellung von Carbobenzyloxy-§ -Methylglutamyl-Glyoin—Carbo—tert.—Butyloxyhydrazid.
7,4 g Carbobenzyloxy—%" —Methylglutaminsäure (0,025
Mol) werden in 50 nl Methylenohlorid gelöst und auf
-1O°C gekühlt, worauf 5,4 g Dioyclohexylcarbodiimid (0,0265 Mol), gelöst in 25 ml gekühltem Methylenchlorid,
unter Rühren zugesetzt werden. Dann werden 4,73 g Glycin-Carbo-tert.-Butyloxyhydrazid (0,025 Mol),
gelöst in 25 »1 gekühltem Äthylazetat, zugegeben. Die
Temperatur der Mischung kann über Nacht auf Raumtemperatur ansteigen und 30 Minuten vor der
Abfiltrierung von Dioyolohexylkarbamid werden 2 Tropfen 50%-ige Essigsäure zugesetzt. Das Filtrat
wird im Vakuum zur Trockne eingedampft und der Rückstand in Äthylazetat gelöst, worauf mit 5 %igem
Natriumbicarbonat, Wasser, 5%iger Zitronensäurelösung und Wasser gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet
wird. Die Äthylazetat—Lösung wird auf ein kleines Volumen konzentriert, und nach Zusatz von
Petroläther kristallisieren 8,2 g Substanz mit einem
Schmelzpunkt von 104 — 105,5 °C aus. Umkristallisierung aus Äthylazetat/Petrοlather erhöht den Schmelzpunkt
auf 107 - 1080C.
9 0 9 8 20/12 9 5
' - 20 Beispiel 9
Herstellung von Carbobenzyloxy-Alanyl-fl -Methylglut—
amyl-Glyoin-Carbo-tert.«Butyloxyhydrazid nach
Methoden A und B.
A. 1,83 g Carbobenzyloxy-Alanyl-J -Methylglutaminsäure
(5 mMol) werden in 10 ml Methylenohlorid gelöst und nach
t ■
Abkühlung auf —1O°C werden 1,08 g Dioyclohexyloarbodiimid
(5»2 mMol), gelöst in 5 ml gekühltem Methylenchlorid,
zugesetzt und schließlich werden 0,95 g Glycin-Carbotert.-Butyloxyhydrazid
(5mMol), gelöst in 10 ml gekühltem Äthylazetat, zugegeben. Die Mischung wird gerührt und über
Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen, worauf 2 Tropfen 50 %—ige Essigsäure zugesetzt werden. Nach 30
Minuten wird das gebildete Dicyclohexylkarbamid (1,1 g) abfiltriert und mit etwas Äthylazetat gewaschen. Das
Filtrat wird im Vakuum zur Trockne eingedampft und der Rest in Äthylazetat gelöst, worauf mit 5 feiger
Natriumbicarbonatlösung, Wasser, 5 %—iger Zitronensäure—
lösung und Wasser gewaschen wird. Die Äthylazetat-Phase wird über Magnesiumsulfat getrocknet und auf ein
kleines Volumen konzentriert, wobei 2,3 g. Substanz mit einem Schmelzpunkt von 140 — 15O0C auskristallisieren.
Nach zwei Umkristallisationen aus Äthylazetat steigt
der Schmelzpunkt auf 154 — 156°G an und es ergibt
sich eine Ausbeute von 1,9 g (70,4 $ der Theorie).
-21-
909820/1295
Analyse: C34H35Ii5O9 (Molgewicht 537,58)
Berechnet: C s 53,62 %, H = 6,56 #, Ii = 13,03 %
Erhalten: 53,48 $ 6,52 % 12,79 %
B. 4,0 g Garbobenzyloxy-ü -Methylglutamyl-Glyoin-Carbo-tert.-Butyloxyhydrazid
(0,06 mMol) werden in 60 ml Methanol gelöst und 0,5 g 1O%—iges Pd/O (mit Wasser
angefeuchtet) zugesetzt. Die 0arbobenzyloxy—Schutzgruppe
wird mit Wasserstoff bei Raumtemperatur und Atmosphärendruck im Laufe von 2 bis 3 Stunden weg—
hydriert. Der Verbrauch an Wasserstoff beträgt 200 ml gegenüber den berechneten 195 ml. Der Katalysator wird
abfiltriert und das Filtrat im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Ruckstand wird in absolutem Äther gelöst
und zur Trockne eingedunstet, wobei ein Öl erhalten wird. Das Öl wird im Vakuumexsickator über Phosphorpentaoxyd
getrocknet, wobei das Öl in eine feste hygroskopische Substanz übergeht, die 2,76 g wiegt,
was 96,5 % der Theorie entspricht.
Das Produkt (2,76·g) wird in kO ml Dimethylformamid
gelöst und auf -100C abgekühlt, und es werden 3,0 g
Carbobenzyloxy—Alanin—p—Nitrophenylester (8,6 mMol)
zugesetzt. Die Lösung kann sodann langsam Raumtemperatur annehmen und nach 2k Stunden wird sie im Vakuum zur
Trockne eingedunstet. Der Rückstand wird wie unter A
behandelt.
90982 0/1295
- 22 Ausbeute: 3,35 g mit einem Schmelzpunkt von
153°C, was 75,5 % der Theorie entspricht. Nach drei
Umkristallisierungen aus Äthylazetat erhöht sich der
Schmelzpunkt auf 16O,5 - l6l°C (wurde bei 153°C
umgelagert).
Herstellung von Carbobenzyloxy—Phenylalanyl—Leuoyl—
Alanyl- jf -Methylglutamyl-Glyein-Carbo-tert.-Butyloxyhydrazid.
(2 mMol) 1,8 g des nach Beispiel 9 erhaltenen Produktes/werden
in 50 ml Methanol gelöst, 0,2 g 10 %-iges Pd/C zugesetzt
und Wasserstoff eingeleitet. Nach 3 Stunden ist die Hydrierung beendet, wobei 55 ml (theor, 45 ml) verbraucht wurden. Der Katalysator wird entfernt und die
Lösung im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand
wird in 15 ml Dimethylformamid gelöst,,
0,86 g des Produktes nach Beispiel 7 (2mMol) werden in 3 ml 6 N Salzsäure + 2 ml 5O^-iger Essigsäure gelöst
und mit k0 ml Äthylazetat überschichtet. Die Mischung
wird auf —10°C abgekühlt und 2,0 ml l—molares Natriumnitrit
unter Umrühren tropfenweise zugegeben. Nach Minuten bei -100C wird die Äthylazetat-Phase von der
Wasserphase getrennt und mit gekühlter, gesättigter Natrium— bicarbonatlösung und Eiswasser gewaschen. Die Äthylazetat-Lösung
wird über Magnesiumsulfat eine Stunde lang bei -100C getrocknet. Die Äthylazetat—Lösung, welche Carbobenzyloxy-Phenylalanyl-Leucinazid
enthält, wird langsam in die das freie Arainopeptid enthaltende Dimethylformamid—
9 0 9 8 2 0/1295 -23-
Lösung unter Umrühren und bei -1O0C eingetropft. Nach
24 Stunden hei 00G und 48 Stunden hei Raumtemperatur
wird die gebildete Ausfällung abfiltriert, Ausbeute: 0,35 g mit einem Schmelzpunkt von 207 - 2080C. Die
Mutterlauge wird zur Trockne eingedampft und der Rück«
stand in Äthylazetat gelöst, mit 5 %-igem Natriumbicarbonat,
Wasser, 5 %—iger Zitronensäurelösung und
Wasser gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum konzentriert. Der Rückstand wird in Äthylazetat
gelöst und bei Zusatz von Petroläther kristallisieren 0,70 g Substanz mit einem Schmelzpunkt von 180 - 200°C
aus. Zusammen gibt dies 0,80 g Ausbeute, was 50,1 %
der Theorie entspricht. Ein kleiner Teil wird nochmals aus Äthylazetat umkristallisiert.
Analyse: C39H55N7O11 (Molgewicht 797,9)
Berechnet: C = 58,7i %, H = 6,95 %, N β 12,29 %
Erhalten: 58,48 # 6,77 # 12,35 %
Herstellung von Carbobenzyloxy—Phenylalanyl—Leucyl—
Alanyl- J -"Methyl-Glutamyl-Glycyl-Glycyl-Glycyl-Valyl-
cc -Nitroarginin—Methylester.
334 mg des Produktes nach Beispiel 10 werden in 1,8 ml Trifluoressigsäure gelöst und nach 45 Minuten
bei 22°C wird die Trifluoressigsäurelösung unter Rühren
in 100 ml absoluten Äther eingetropft.
909820/1295
~ 24 -
Naoh zwei Stunden im Kühlschrank wird die Ausfällung
abfiltriert und mehrmals mit absolutem Äther gewaschen5
worauf sie in 4 ml Dimethylformamid und 1 ml 4 N Salz»
säure gelöst wird* Die Lösung wird auf -1O0C abgekühlt
und 0,42 ml 1 M Natriumnitritlösung werden im Laufe von 5 Minuten unter Rühren zugetropft, worauf die
Lösung samt der gebildeten Ausfällung in 30 ml eis»
kalte, 2 $»ige Natriumbioarbonatlösung getropft wird,
wodurch die Ausfällung des gebildeten Säureazids vollständig wird. Das Azid wird auf dem Filter mit
Eiswasser und eiskalter 5%-iger Zitronensäurelösung
gewaschen, anschließend mit Eiswasser von der Zitronen» säure freigewasohen und dann schnell über Phosphor»
pentaoxyd im Vakuum bei 50C getrocknet und unmittelbar
zur Kopplung angewendet. Die Ausbeute an trockenem Carbobenzyloxy»Phenylalanyl«Alanyl·«· Jj »Methylglutamyl—
Glycinazid beträgt 291 mg, was 98 % der Theorie
entspricht.
243 rag des Produktes naoh Beispiel 2 (0,42 mMol)
werden in 2 ml absoluter Essigsäure gelöst und 1 ml 4 N Bromwasserstoff in Essigsäure zugesetzt, worauf
die Mischung 45 Minuten gegen Luftfeuchtigkeit geschützt bei Raumtemperatur stehenbleibt. Dann wird
die Mischung in 100 ml absolutem Äther unter kräftigem Rühren eingetropft. Die Ausfällung wird gewaschen
und mit absolutem Äther digeriert, bis sie körnig (hygroskopisch) wird. Das Tetra-Peptidmethylester-
-25-
9098 2 0/1295
hydrobromid wird in 4 ml Dimethylformamid gelöst und der
Lösung werden 0,09 ml Triäthylamin (0,64 mMol) zugesetzt,
die auf -100C gekühlt wird, und das oben erwähnte Azid
wird, gelöst in 10 ml auf -100C vorgekühltem Dimethylformamid, unter Rühren bei —10°C zugetropft. Nach 24
Stunden bei O0C kann die Lösung 48 Stunden bei Raumtemperatur stehenbleiben, worauf sie auf 5 ml bei 20 C
unter Vakuum konzentriert wird. Darauf wird nochmals in 5 ml Dimethylformamid gelöst und unter Umrühren zu
40 ml 5 %~iger Zitronensäurelösung zugesetzt. Die
Ausfällung wird mit Wasser von Zitronensäure freige—
waschen und im Vakuum über Phosphorpentaoxyd getrocknet^ Ausbeute: 265 mg mit einem Schmelzpunkt von 203 ~ 213°C,
was 66,7 % der Theorie entspricht. Zwei Umfällungen aus Dimethylformamid/Wasser erhöhen den Schmelzpunkt
auf 211 ~ 2150C.
Analyse: C5oH73Ni3°l6 (Molgewicnt 1112,2)
Berechnet: C = 53,99 %, H = 6,62 #, N = 16,37 %
Erhalten: 53,5i % 6,56 % 16,72 %
Herstellung von Carbobenzyloxy—Phenylalanyl—^-»Nitro—
arginin-Methylester.
10,8 g λ —Nitroarginin—Methylesterhydrochlorid
(40 mMol) werden in Dimethylformamid gelöst und unter Kühlung 4,05 g Triäthylamin (40 mMol) zugesetzt.
-26-
909820/1295
~ 26 -
Gebildetes Triethylamin HCl wird abfiltriert und dem Filtrat
eine abgekühlte Lösung (-1O0C) von 12,0 g Carbobenzyloxy-Phenylalanin
(40 mMol) in Azetonitril zugegeben, der bei
-10°C 9,1 g Bieyclohexylearbodiimid (40 mMol) zugesetzt
waren. Es wird 2 Stunden bei -100C gerührt und über
Nacht auf Raumtemperatur gebracht.
Das gebildete Dicyclohexylkarhamid wird abfiltriert
und das Filtrat zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird in Äthylazetat gelöst und wie gewöhnlich gewaschen.
Aus der Äthylazetat-Lösung werden bei Zusatz von absolutem Äther Kristalle mit einem Schmelzpunkt von 87 -* 89°C
erhalten. Nach Umkristallisation aus 60%—igem Äthanol
werden Kristalle von anderer Modifikation mit einem Schmelzpunkt von 153»5 - i55°C erhalten. Ausbeute!
i7,9 g (87,1 % der Theorie).
Analyses C24H30NgO7 (Molgewicht 5i4,55) Berechnet: C = 56,02 %, H = 5,88 #, N = 16,33 $ Erhaltenι 55,9^ % 6,09 # 16,42 %
Analyses C24H30NgO7 (Molgewicht 5i4,55) Berechnet: C = 56,02 %, H = 5,88 #, N = 16,33 $ Erhaltenι 55,9^ % 6,09 # 16,42 %
Herstellung von Carbobenzyloxy—Phenylalanyl-valyl—tj—
Nitroarginin—Methylester.
9,33 g des Produktes nach Beispiel 1 (20 mMol) werden wie nach Beispiel 2 behandelt. Die Ausbeute an hygroskopischem
Valyl~<~<J~Nltroargininmethylester~i,5 HBr beträgt
nach Trooknung im Vakuum über KOH und P2Os 9,15 g, was
quantitativ ist.
90982 0/1295
Der Hydrobromiddipeptidester wird in 50 ml Dimethylformamid
gelöst und auf -50C abgekühlt, worauf 4,2 ml
Triethylamin (30 mMol) zugesetzt werden. Gebildetes
Triäthylamin.HBr wird abfiltriert und dem Filtrat
8,4 g Carbobenzyloxy-Phenylalamin-p-Nitrophenylester
(20 mMol) zugesetzt. Nach 24 Stunden bei Raumtemperatur wird die Lösung auf -100C abgekühlt und weitere 1,4 ml
Triäthylamin zugesetzt. Die Mischung kann dann 24 Stunden
stehen. Nach Zusatz von i ml Essigsäure wird die Lösung im Vakuum zur Trockne eingedampft und der Rückstand
in einer Mischung von Äthylazetat/Butylalkohol (3ti) gelöst und wie gewöhnlich mit Wasser, 5 %*iger
Zitronensäure und Wasser gewaschen. Die Lösung wird über Mg SO. getrocknet und auf ein kleines Volumen
eingedunstet, das nach Zusatz von abseintma Ä
10,1 g Substanz mit einem Schmelzpunkt von 108 — Hi0C
ergibt, was 82,3 % der Theorie entspricht. Umkriatallisation
aus Äthylazetat/Methanol nach Zusatz von absolutem Äther
erhöht den Schmelzpunkt auf 112 - 1140C.
Analyse: C29H39N7O8 (Molgewicht 613,69)
Berechnet: C = 56,76 %t H s 6,41 %, N = 15,98 %
Erhalten: 56,32 % 6,48 % 16,12 %
Herstellung von Carbobenzyloxy—Phenylalanyl—Glycyl—
Valyl— ::o -Nitroarginin—Methylester.
2,33 g des Produktes nach Beispiel 1 (5 mMol) werden
wie nach Beispiel 2 behandelt und der erhaltene Hydrobromid-Dipeptidmethylester wird in 15 ml
909820/129 5 -28-
Dimethylformamid gelöst, auf -5°C gekühlt und 1,05 ml Tr iäthylamin
(7,5 mMol) zugesetzt. Triäthylamin.HBr wird abfiltriert
und das Filtrat wird wie folgt angewendet!
1,85 g Carbobenzyloxy-Phenylalaiayl-Glycinhydrazid
(5 mMol) werden in 7 ml Dimethylformamid gelöst und
mit 1,5 ml 6 N Salzsäure versetzt, auf «i Q0C abgekühlt
und es werden unter Rühren 5,1 ml i M Natriumnitritlösung
(5,1 mMol) eingetropft. Nach 10 Minuten bei -.100C wird
50 ml 5%-ige Natriumbicarbonatlösung zugesetzt, und bei
OC beginnt das Azid auszufallen. Die Ausfällung ist vollständig
nach Zusatz von 30 ml eisgekühltem Wasser, 10 Minuten Rühren, Filtrierung und sorgfältiger Waschung mit Eis—
wasser. Das Auegefällte wird im Eiswasser unter Umrühren
abgeschlämmt, filtriert und mit 0° Wasser gewaschen. Der
Prozeß wird 3mal wiederholt und die Substanz bei 50C über
Po0e im Vakuum getrocknet, worauf sie unmittelbar angewendet
wird. Ausbeute: 1,77 g (93 % der Theorie).
In die auf —IQ0C gekühlte Dimethylformamid—Lösung des
Aminodipeptids wird das in 8 ml auf -100C vorgekühltem
Dimethylformamid gelöste Azid unter Rühren zugetropft. Nach 10 Minuten bei -100C kann die Mischung 48 Stunden
bei Raumtemperatur stehen und wird dann Im Vakuum auf 7 ml
konzentriert und wie nach Beispiel 11 behandelt. Ausbeute? 2,44 g (78,2 # der Theorie.) Umkristallisation aus 60 $-igem
Äthanol ergibt 1,95 g Substanz mit einem Schmelzpunkt von 147 - 1490C.
Analyse: °3ΐΗ42Ν8°9 (Molgewicht, 670,74)
Berechnet: C = 55,51 %, H = 6,31 %» N = 16,71 %
Erhalten: 55,38 % 6,58 % 16,90 %
—28 a —
909820/1295
Herstellung von Carbobenzyloxy-Phenylalanyl-Glycyl-Glycyl-Valyl-
u> -Nitroargininmethylester.
1,77 g des naoh Beispiel 1 gewonnenen Produktes (3,8 mMol) werden wie unter Beispiel 2 behandelt und
der erhaltene Hydrobromid-Dipeptidmethylester wird
in 10 ml Dimethylformamid gelöst, auf -5°C abgekühlt und es werden 0,79 ml Triäthylamin (5»7 mMol) zugesetzt. Das Tr iäthylamin-HBr wird abfiltriert und das Piltrat wie unten angewendet. 1,62 g Carbobenzyloxy— Phenylalanyl-Glycyl-Glyeinhydrazid (3,8 mMol) werden in ,10 ml Dimethylformamid gelöst, 1 ml 6 N-Salzsäure zugesetzt und auf —10 G gekühlt. Unter Rühren werden 3,85 ml 1 M Natriumnitritlösung (3,85 mMol) zugetropft und im übrigen wie in Beispiel Ik behandelt.
Ausbeute: 1,55 g (0,5 % der Theorie).
in 10 ml Dimethylformamid gelöst, auf -5°C abgekühlt und es werden 0,79 ml Triäthylamin (5»7 mMol) zugesetzt. Das Tr iäthylamin-HBr wird abfiltriert und das Piltrat wie unten angewendet. 1,62 g Carbobenzyloxy— Phenylalanyl-Glycyl-Glyeinhydrazid (3,8 mMol) werden in ,10 ml Dimethylformamid gelöst, 1 ml 6 N-Salzsäure zugesetzt und auf —10 G gekühlt. Unter Rühren werden 3,85 ml 1 M Natriumnitritlösung (3,85 mMol) zugetropft und im übrigen wie in Beispiel Ik behandelt.
Ausbeute: 1,55 g (0,5 % der Theorie).
In die auf -10°C gekühlte Dimethylformamid-Lösung
des Aminodipeptidesters wird das in 9 ml
auf -10°C vorgekühltem Dimethylformamid gelöste
Carhobenzyloxy-Tripeptidazid unter Rühren zugetropft. Im übrigen wird wie nach Beispiel 11 gearbeitet.
Ausbeute: 1,93 g mit einem Schmelzpunkt von
185 - 190°C, was 73,1 $ der Theorie entspricht.
Umkristallisation aus 90%-igem Äthanol erhöht
den Schmelzpunkt auf 188 - 1910C.
auf -10°C vorgekühltem Dimethylformamid gelöste
Carhobenzyloxy-Tripeptidazid unter Rühren zugetropft. Im übrigen wird wie nach Beispiel 11 gearbeitet.
Ausbeute: 1,93 g mit einem Schmelzpunkt von
185 - 190°C, was 73,1 $ der Theorie entspricht.
Umkristallisation aus 90%-igem Äthanol erhöht
den Schmelzpunkt auf 188 - 1910C.
-29-909820/1295
Analyse: C33H^N9O10 (Molgewicht 727,8)
Berechnet: C = 54,45 %, H = 6,23 #, N = 17,32 %
Erhalten: ' 55SO1 £ 6,18 # 17*52 %
Herstellung von Carbobenzyloxy^Phenylalanyl—Glyeyl—
Glyeyl—Glycyl—Valyl— «<j —Nitroargininmethylester.
Ij7£ g des nach Beispiel 2 gewonnenen Produktes (3mMol)
werden in 7 ml trockener Essigsäure gelöst, und unter wasserfreien
Bedingungen werden 7 ml Ί N HBr in Essigsäure zugesetzt. Nach 45 Minuten hei Raumtemperatur ist die Kohlendioxyd·»·
entwicklung beendet und die Reaktion vollständig. Im Vakuum wird der Überschuß an Bromwasserstoff und 7 ml
Essigsäure abdestilliert und der Rückstand unter kräftigem Rühren in I50 ml absolutem trocknen Äther eingetropft.
Der Äther wird abdekantiert, und der Rückstand, der eine
körnige Konsistenz annahm, wird weitere 3mal mit trocknem Äther digeriert„ Der Rückstand wird über
P2O1. und KOH im Vakuum getrocknet. Die Ausbeute an
Tetrapeptidesterhydrobromid beträgt 1,62 g, was 95 %
der Theorie entspricht, berechnet auf 1,5 Äquivalente HBr pro Mol Peptid. Das Hydrobromid wird in 20 ml
Dimethylformamid gelöst und auf -100C abgekühlt, worauf
0,60 ml Triethylamin (4,28 mMol) zugesetzt werden und
das gebildete Triethylamin.HBr abfiltriert wird. Unter
Rühren bei -100C wird dem Piltrat lthk g Carbobenzyloxy-Phenylalanyl—Glycin-p-Nitrophenylester
(3 mMol) zugesetzt, und nach 24 Stunden bei Raumtemperatur wird die Msung
909820/1295
Bf
wieder auf »1O°C abgekühlt und es werden weitere 0,20 ml
Triethylamin zugegeben, worauf man 24 Stunden stehenläßt.
Die Aufarbeitung erfolgt wie nach Beispiel 2. Ausbeutet 1,59 g Hit einem Schmelzpunkt von 164 - 167°C, was
71,2 # der Theorie entspricht, !^kristallisation aus
6O#—igem Methanol erhöht den Schmelzpunkt auf 169 1720C,
Analyse: C35H48N10O11 (Molgewicht 784, 85)
Berechnet: 0 = 53,56 #, H = 6,17V N = i7,85 #
Erhalten: 54,01 % 6,08 % 17,99 %
Herstellung von Carbobenzyloxy—Phenylalanyl—
Phenylalanjrl-Valyl-^J-Nitroargininmethylester.
2,35 g des Produktes nach Beispiel 1 (5 mMol) werden
wie in den Beispielen 2 und 14 behandelt und die erhaltene
Lösung von Valyl— <rx) —Nitroargininraethylester wird wie folgt
angewendet:
2,3 g Carbobenzyloxy—Phenylalanyl—Phenyl—alaninhydrazid
(5 mMol) werden in 7 ml Dimethylformamid gelöst und 3 ml 4 N
Salzsäure zugesetzt, gekühlt auf -"100C und 5,1 ml 1 m
NaNOg-Lösung unter Rühren eingetropft und die Mischung
wie nach Beispiel 14 aufgearbeitet. Die Ausbeute von 2,26 g Carbobenzyloxy—Phenylalanyl—Phenylalaninazid,
entsprechend 96 % der Theorie, wird in 8 ml Dimethylformamid gelöst, auf —10°C gekühlt und unter Rühren in
eine vorgekühlte Lösung des Aminodipeptidesters eingetropft. Die weitere Verfahrensweise entspricht den
9 09820/12 95 ~3±~
Beispielen 11 und 14» Ausbeute: 2,14 g mit einem Schmelz»
punkt von 218 - 2200C entsprechend 58,7 # der Theorie.
Analyses C38E48N8°9 (MolSewicnt 760,87)
Berechnet* C « 59,99 i»% H ■ 6,36 #, N s 14,73 %
Erhalten: 59*49 # 6»33 % 14,81 %
Herstellung von Carbobenzyloxy—Phenylalanyl^Leucyl'-Valyl«
OJ «Nitroarginin-Methylester.
2,35 g dee Produktes aus Beispiel 1 (5 raMol) werden
behandelt, wie es in den Beispielen 2 und Ik beschrieben ist. Die erhalten® Dimethylformaiiiid^Lb'sung von Valyl-<^«
arginim-Methylester wird wie folgt angewendet!
2,13 g des Produktes nach Beispiel 7 (5 ffiMol) werden
in einer Misohung von 5 nl 6 N Salzsäure und 5^1 5®$™lg©r
Essigsäure gelöst, mit 80 ml Äthylazetat überschichtet und das Verfahren wie in Beispiel 10 beschrieben fort·»
gesetzt. Die Äthylazetat^Lösung mit dem Garbobenzyloxy»
Dipeptidazid wird auf -1O0C abgekühlt und unter Rühren
in die oben erwähnte DisaethylforüBamld^Lösung eingetropft#
die auf ~10°C vorgekühlt war. Die weitere Ausführung entspricht dem Beispiel 10, und die erhaltene Äthylazetat-»
Lösung wird zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird in 7 ml Dimethylformamid gelöst und nach Beispiel 11 gereinigt.
Ausbeute: 2,65 g mit einem Schmelzpunkt von 171 - 1810C
entsprechend 72,9 % der Therie. Das Produkt wird weitere
2mal aus 60%~igem Äthanol umkristallisiert, wobei sich
der Schmelzpunkt auf 179 - 1820C erhöht. -32-
90982 0/1295
1804Ö22
Analyse: C32H50NgO (Molgewicht 726,85)
Berechnet: C =57,84 #, H = 6,94 %,'N = 15,42 %
Erhalten: 58,05 % 7,01 # 15,35 %
Herstellung von Carbobenzyloxy—Valyl— 6ü —Nitro—
argininamid.
45,8 g Carbobenzyloxy— cö —Nitroargininamid (0,13
Mol) mit einem Schmelzpunkt von 217 — 218°C werden
in 300 ml wasserfreier Essigsäure gelöst und unter wasserfreien Bedingungen werden 300 ml 2 N HBr in
trockener Essigsäure unter Rühren zugesetzt. Nach 45
Minuten bei Raumtemperatur ist die Kohlendioxydentwicklung
beendet, worauf die Reaktionsmischung im Vakuum bei 200C unter wasserfreien Bedingungen eingedampft
wird, bis der Rüokstand ein Volumen von 250 ml hat. Der Rückstand wird unter kräftigem Rühren in
2,5 1 trockenem Äther eingetropft, wobei eine plastische
Masse ausfällt. Die Ätherphase wird abdekantiert und
der Rüokstand weitere 3mal mit trockenem Äther digeriert, wobei die Substanz körnig und fest wird.
Die Substanz wird im Vakuum über P2 0^ un<* ^0H getrocknet,
in 350 ml Dimethylformamid gelöst und es werden 18,5 ral Triäthylamin (0,134 Mol) zugesetzt. Naoh Abkühlung
auf -100C wird das gebildete Triäthylamin.HBr
abfiltriert und unter Rühren wird dann dem Piltrat
48,4 g Carbobenzyloxy—Valin—p—Nitrophenylester (0,13 Mol)
-33-
9 09820/1295
3?
zugesetzt. Die Reaktionsmischung läßt man 24 Stunden bei Raumtemperatur stehen, konzentriert sie auf iOO ml und
schüttelt sie unter Rühren in 1 1 5%~ig© Natriumbicarbonat—
lösung. Die ausfallende Substanz wird abfiltriert, mit Wasser gewaschen und wieder in 75 ml Dimethylformamid
gelöst und dann in 1 1 i N Salzsäure geschüttet, filtriert und mit Wasser gewaschen. Ausbeute: 47 »1 g mit
einem Schmelzpunkt von 61,5 — 63 C1 entsprechend 80,2 fo
der Theorie. Umkristallisation aus 60 $-»igem Methanol
erhöht den Schmelzpunkt des Produktes auf 66 - 67 °C, jedoch nach Umkristallisation aus Äthanol mit Zusatz
von Wasser wird der Schmelzpunkt auf 218 — 219°C heraufgesetzt.
Analyse: ^iq-^29^7^6 (Molgewicht 451,5s Substanz mit
Schmelzpunkt 218 - 219°C)
Berechnet: C a 50,55 %t H = 6,47 %t N = 21,72 %
Erhalten: 50,57 % 6,62 % 21,89 %
Herstellung von Carbobenzyloxy-Phenylalanyl-co-Nitro—
arginln-Amid.
1,76 g Carbobenzyloxy-t^ —Nitroarginin—Amid (5 mMol)
werden wie in Beispiel 19 beschrieben behandelt und die erhaltene Dimethylformamid-Lösung des co-Nitroarginin-Amids
wird auf -100C abgekühlt, worauf 2,1 g Carbobenzyloxy-Phenylalanin—p-Nitrophenylester
(5 mMol) zugesetzt werden.
-34-909820/1295
3?
Die Substanz wird dann wie in Beispiel 19 angegeben aufgearbeitet.
Ausbeute: 2,05 g mit einem Schmelzpunkt von 105 ~ 125°G, was 82 % der Theorie entspricht. Umkristallisation
aus 80 %-igem Äthanol erhöht den Schmelzpunkt auf 128 1300C.
Analyse: C23H29N7°6 (M°lgöwicht ^99,5*)
Berechnet: C = 55,30 #, H = 5,85 #, N « 19,63$, 0 = 19,22 #
Erhalten: 55,32 # 6,07 % 19,42% 19,24 %
Herstellung von Carbobenzyloxy—Phenylalanyl—Valyl—ω—
Nitroarginin-Amid.
1,0 g des Produktes nach Beispiel 19 (2,22 mMol) werden in 5 ml trockner Essigsäure gelöst, und unter wasserfreien
Bedingungen werden 5 ml.2 N HBr in trookner Essigsäure zugesetzt. Die Aufarbeitung erfolgt nach Beispiel 19.
Die erhaltene Dimethylformamid—Losung (10 ml) des Valyl—6U—
Nitroarginin—Amids wird auf ~10°C gekühlt, und es werden
0,93 g Carbobenzyloxy-Phenylalanin-p-Nitrophenylester
(2,22 mMol) unter Rühren zugesetzt. Die Reinigung des geschützten Tripeptidamids erfolgt nach den Richtlinien
des Beispiele 19* Ausbeute: 1,15 g mit einem Schmelzpunkt von 213 — 220°C, entsprechend 86,5 %
der Theorie. Zwei Umkristallisationen aus 80%—igem
Äthanol erhöhen den Schmelzpunkt des Produktes auf 218 - 220°C.
909820/1295
18Q4022
Analyse: C28H38N8°7 (MolSewioht 598,68)
Bereehnets C a 56,18 %9 H = 6,40 %, N = 18972 %
Erhalten? 56,29 % 6,52 % 18,87 %
Herstellung von Carbobenzyloxy- to -Nitroarginyl- oO Nitroargininmethylester.
35,5 g Carbobenzyloxy—^ —Nitroarginin (0,1 Mol) mit
einem Schmelzpunkt von 134t» 5 — i36°C werden in 200 ml
" Dimethylformamid/Tetrahydrofuran (1:1) gelöst und
unter Rühren werden 13,9 ml Triethylamin (0,1 Mol)
zugetropft. Naoh Abkühlung auf -100C werden 13,66 g
Ohlorameisexisäureisobutylester (0,1 Mol) in der Zeit
von 20 Minuten zugesetzt, wobei die Temperatur in der
Lösung sioh zwischen ~10°C und -<5OC hält. Der Lösung
wird oJ «.Nitroargininmethylester, in Dimethylformamid
gelöst und aus 27,0 g ^—Nitroargininmethylester . HCl (0,1 Mol) mittels 13,9 ml Triäthylamin (0,l Mol) frei«
gemacht und auf —10 C vorgekühlt, zugesetzt, wobei die
Temperatur in der Reaktionsmischung während des Ein— tropfens -80C beträgt. Man läßt die Reaktionsmischung
langsam Raumtemperatur annehmen und nach einigen Stunden ist die Reaktion beendet. Triäthylamin . HCl, das
während der Reaktion gebildet wurde, wird abfiltriert und das FiItrat zur Trockne eingedampft. Der Rückstand
wird in 900 ml Butylakohol/Äthylazetat (2:1) gelöst,
mit 1 N Salzsäure, 5 %-iger Natriumbicarbonatlösung und
Wasser geschüttelt und die Lösungsmittelphase wird über Magnesiumsulfat getrocknet» Nach Verdunsten des
©Ö98 2Ö/12ÖB
Lösungsmittels wird eine Substanz mit einem Schmelzpunkt von I56 - 1480C erhalten. Ausbeute? 34,6 g (60,8 # der
Theorie). Das Produkt wird einige Male aus 80%-igem Methanol umkristallisiert, wobei sich der Schmelzpunkt
auf 147 - 150oC erhöht.
Analyse: C2iH32N10°9 (MolSewicht 568,57)
Berechnet: C »■ 44,36 #, H s 5f67 %, N =* 24,64 %
Erhalten: 44,38% 5,64 % 24,72%
Herstellung von Carbobenzyloxy-Phenylalanyl-Valin«
Methylester.
2919 g Carbobenzyloxy-Phenylalanin (0,1 Mol) werden
in 75 ml Dimethylformamid gelöst, auf -1O°C gekühlt und
darauf 20,6 g Dicyclohexylcarbodiimid, gelöst in 25 ml Dimethylformamid, dazugetropft. Valin-Methylester, in
30 ml Dimethylformamid gelöst und durch Zusatz von 13*85 ml Triäthylamin zu 16,8 g Valin-Methylester-HCl
(0,1 Mol) in Dimethylformamid aus seinem Hydrochlorid freigemacht, wird tropfenweise so zugesetzt, daß sich
die Temperatur der Reaktionslösung bei -IO C hält. Die Reaktion ist nach 24 Stunden bei Raumtemperatur voll-*
ständig, und nach Abkühlung wird das gebildete Bicyclohexyl karbamid abfiltriert. Das Piltrat wird zur Trockne eingedampft, der Rückstand in Äthylazetat gelöst und wie
gewöhnlich geschüttelt. Nach Verdunsten des Äthylazetats wird der Rückstand in 80%~igem Methanol gelöst, wobei
ö09820/1296
Sc
auskristallisieren. Ausbeute: 33,5 g (31,2 % der Theorie),
auskristallisieren. Ausbeute: 33,5 g (31,2 % der Theorie),
33,5 g Substanz mit einem Schmelzpunkt von 113 - Ii5 C
Analyse: C23H28N2°5 (Molgewiont 412,49)
Berechnet: C * 66,97 #, H = 6,84 #, N = 6,79 %
Erhalten: 67,09 % 6,85 % 6,91 %.
Herstellung von Carboibenzylöxy-Phenylalanyl—
. Valinhydrasid.
8,25 g des nach Beispiel 23 gewonnenen Produktes
(20 mMol) werden in 150 ml Methanol gelöst und 3,94 g
Hydrazinhydrat (80 mMol) zugesetzt. Es wird 48 Stunden lang unter Rühren am Rückfluß gekocht, konzentriert,
und nach Zusatz von etwas Wasser kristallisiert ein Produkt aus, das aus Methanol/Wasser umkristallisiert
wird. Ausbeute: 7,35 g mit einem Schmelzpunkt von 210 — 211,50C, entsprechend 89 % der Theorie.
Analyse: C22H28Ä4°4 (M°lgewicnt 412,5)
' Berechnet: C = 64,06 %9 H = 6,84 %, N = 13,58 %
Erhalten: 64,64 $ 6,58 % 13,63 %
Herstellung von. Carbobenzyloxy—Phenyl al anyl-Phenylalanin-Methylester.
16,2 g Phenylalanin-Methylester - HCl (75 mMol) mit
einem Schmelzpunkt von 158,5 - 159°C werden in Dimethylformamid
gelöst, auf O0C abgekühlt und 10,5 «nl Triethylamin
(75 mMol) zugesetzt. Gebildetes Triäthylassia «->
HCl
d das FiItrat
0 9 8 2 Ö / 1 2 9 S -38-
0 9 8 2 Ö / 1 2 9 S -38-
wird abfiltriert, und das Piltrat auf -100C gekühlt,
worauf 3i»5 g Carbobenzyloxy—Phenylalanin—p—Nitrophenyl—
ester (75 mMol) zugegeben werden. Nach 24 Stunden bei Raumtemperatur wird die Lösung wieder auf —iO°C abge—
kühlt und es werden 3,5 ml Triethylamin (25 mMol) zugesetzt,
worauf man die Lösung nochmals 24 Stunden stehen läßt. Darauf wird im Vakuum zur Trockne eingedunstet,
der Rückstand in Äthylazetat gelöst und mit 5 %«iger
Natriumbioarbonatlösung, Wasser, 3 %~iger Salzsäure
und Wasser gewaschen. Die Äthylazetat-Lösung wird über Magnesiumsulfat getrocknet, auf kleineres Volumen
konzentriert. Naoh Zusatz von Petroläther kristallisiert das Produkt als Nadeln aus, das 2mal aus Äthylazetat/
Petroläther umkristallisiert wird. Ausbeute: 27,85 g mit Schmelzpunkt von 148,5 ~ 149°C entsprechend 80,7 %
der Theorie.
Analyses C27H28N2°5 (Molgewich* 460,54)
Berechnet: C = 70,42 #, H = 6,13 %, N = 6,08 %
Erhalten: 70,69 % 6,15 % 6,12 %
Herstellung von Carbobenzyloxy—Phenylalanyl-Phenylalaninhydrazid.
23,0 g des nach Beispiel 25 gewonnenen Produktes (50 mMol) werden in 500 ml trocknem Methanol gelöst, 7,5 g Hydrazinhydrat (0,15 Mol) zugesetzt, und
die Mischung wird 4 Stunden am Rückfluß gekocht, worauf man sie bei Raumtemperatur über Nacht stehen läßt.
-.39-,
909820/129B
ho'
Die gebildete Ausfällung von 18,1 g mit einem Schmelzpunkt von 198 - 2OO,5°C wird abgesaugt und das Filtrat auf ca.
100 ml eingedunstet. Nach Zusatz von etwas Wasser kristallisieren 4,15 g Substanz mit einem Schmelzpunkt
von 196,5 ~* 197,5°C aus. Beide Fraktionen werden aus
Methanol umkristallisiert, wobei sich der Schmelzpunkt auf 201 - 2O3,5°C erhöht. Ausbeute» 19,5 g (84,8 % der
Theorie).
Analyse ι C26H28N4°4 (Molßewicnt ^60,54)
Berechnet* C « 67,81 %, H « 6,13 £, N ■ 12,17 %
Erhalten: 67,57 % 6,08 12,37 %
Herstellung von Carbobenzyloxy-Phenylalanyl-Glycin-Äthyläther.
2,8 g Glycin-Äthylester - HCl (20 mMol) werden in
20 ml Dimethylformamid gelöst und 2,05 g Triethylamin zugegeben. Die Mischung wird auf O0C gekühlt und gebildetes
Triäthylamin - HCl abfiltriert. Dem Filtrat wird eine Mischung aus 6,0 g Carbobenzyloxy-Phenylalanin
(20 mMol) und 4,2 g Dioyolohexyloarbodiimid (20 mMol)
in 20 ml Dimethylformamid bei -100C zugesetzt. Nach 24
Stunden bei Raumtemperatur wird die Mischung auf O0C
abgekühlt und gebildetes Dioyclohexylkarbamid abfiltriert. Das Filtrat wird zur Trockne eingedampft, der Rückstand
in Äthylazetat gelöst und wie üblich mit 4 %-iger
Salzsäure, 5 %—iger Natriumbicarbonatlösung und Wasser
9G98 2Ö/12SS
geschüttelt. Nach Trocknung über Magnesiumsulfat und
Konzentrierung kristallisiert das Produkt hei Zusatz
von Petroläther aus. Ausbeute: 6,45 g mit einem Schmelzpunkt von 109 - 111,5°C, entsprechend 83,9 % der Theorie.
Der Schmelzpunkt wird durch Umkristallisation aus Äthylazetat-Petroläther auf 112 - 112,50C erhöht.
Analyse: C21H24N2°5 (Molgewi°ht 384,44)
Berechnet: C = 65,64 %, H = 6,29 #, N = 7,29 #
Erhalten: 65,35 % 6,35 # 7,40 %
Herstellung von Carbobenzyloxy—Phenylalanyl—Glycyl—
Glycin-Äthylester.
1,97 g Glycyl-Glycin-Äthylester - HCl (iO mMol)
mit einem Schmelzpunkt von 182 - 184°C werden in 30 ml Dimethylformamid gelöst, 1,4 ml Triäthylamin
(10 mMol) zugesetzt und gebildetes Triäthylamin -HCl
(10 mMol) abfiltriert. Dem Piltrat werden 4,2 g/Carbobenzyloxy-Phenylalanin-p-Nitrophenylester
zugegeben. Es wird wie in früheren Beispielen (13) beschrieben aufgearbeitet. Das Produkt wird aus Dimethylformamid/
Wasser umkristallisiert. Ausbeute: 3,85 g mit Schmelzpunkt 93 - 95°C, was 87,2 ^ der Theorie entspricht.
Analyse: C25H37N5Og (Molgewicht 441,49)
Berechnet: C = 62,57 %, H = 6,16 %, N s 9,52 %
Erhalten: 62,20 % 6,05 % 9,72 1»
-41-
8 0 9 8 2 ü / 1 2 9 5
Herstellung von Carbobenzyloxy—Phenylalanyl—
Glycinhydrazid.
6,35 g des naoh Beispiel 27 gewonnenen Produktes (l6,5 mMol) werden in 50 ml Methanol gelöst und 3,2 g
Hydrazinhydrat (64 mMol) zugesetzt. Naoh 24stündigem Rühren bei Raumtemperatur wird die Lösung zur Trockne
eingedampft. Der Rückstand wird in etwas warmem Methanol
" gelöst, worauf das Produkt auskristallisiert. Ausbeute:
4,95 g mit einem Schmelzpunkt von 15i»5 - 152,5°C,
entsprechend 81,0 % der Theorie.
Analyse: cia.H22N4°4 (Molgewicht 370,42)
Berechnet: C = 61,61 #, H= 5f99 %, N =15,13 %
Erhalten: 61,80 $ 5,8.7 % 15,22 %
Herstellung von Carbobenzyloxy-Phenylalanylglycyl—
Glyoinhydrazid.
' 2,1 g des nach Beispiel 28 gewonnenen Produktes
(4,73 mMol) werden in 25 ml Methanol gelöst und 0,9 g
Hydrazinhydrat (18 mMol) zugesetzt. Nach 48stündigem
Stehen bei Raumtemperatur wird die gebildete Ausfällung abfiltriert und mit Wasser gewaschen. Das Produkt wird
aus Methanol umkristallisiert. Ausbeute: 1,75g mit
einem Schmelzpunkt von 190 — 191 C, entsprechend
86,6 % der Theorie.
909820/1295
Analyse: C21H25N5O5 (Molgewicht 427,47)
Berechnet: C= 59tOl $, H= 5,90 %, N = 16,38 %
Erhalten: 59,^9 % 5,95% 16,50$
Herstellung von Carbobenzyloxy—Valyl— &->
—Nitroarginin-Isopropylester.
2,5 g C-U -Nitroarginin-Isopropylester-Hydrochlorid
(8,4 mMol) werden in 30 ml Dimethylformamid gelöst.
Nach Kühlung werden 1,2 ml Triäthylamin zugegeben und das ausfallende Triäthylaminhydrochlorid wird durch
Abfiltrierung entfernt. Das Piltrat wird auf -100C gekühlt
und 3,2 g Carbobenzyloxy—Valin—p—Nitrophenylester
(8,4 mMol) werden unter Rühren zugesetzt. Nach zweistündigem
Rühren bei -10°C läßt man die Substanz Raumtemperatur annehmen und bei dieser Temperatur einen Tag
lang* reagieren. Die Reaktionsmischung wird wieder
ο
auf -10 C abgekühlt, worauf weitere 1,2 ml Triäthylamin zugesetzt werden. Nach einigen Stunden ist die Reaktion praktisch beendet. Dimethylformamid wird im Vakuum bei 30 bis 40°C abgedampft, und der Rückstand in etwa 500 ml mit Wasser gesättigtem Äthylacetat gelöst. Die Lösung wird wie üblich mit 5%lger, wässriger Natriumbicarbonatlösung, Wasser, 1 Ν—wässriger Chlorwasserstoffsäure und Wasser extrahiert. Die organische Phase wird über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum zur Trookne eingedampft. Der Rückstand wird in heißen Äthylacetat
auf -10 C abgekühlt, worauf weitere 1,2 ml Triäthylamin zugesetzt werden. Nach einigen Stunden ist die Reaktion praktisch beendet. Dimethylformamid wird im Vakuum bei 30 bis 40°C abgedampft, und der Rückstand in etwa 500 ml mit Wasser gesättigtem Äthylacetat gelöst. Die Lösung wird wie üblich mit 5%lger, wässriger Natriumbicarbonatlösung, Wasser, 1 Ν—wässriger Chlorwasserstoffsäure und Wasser extrahiert. Die organische Phase wird über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum zur Trookne eingedampft. Der Rückstand wird in heißen Äthylacetat
90 98 2Ü/1295
gelöst, und nach Zusatz von trooknem Isopropyläther kristallisiert die Substanz aus, wenn sie in einer Kühlkammer stehengelassen
wird. Die 3,65 g Ausbeute haben einen Schmelzpunkt von 162 bis 1660C, das sind 88 % der Theorie. Nach einer
weiteren ^kristallisation aus Äthylacetat/lsopropyläther
erhöht sich der Schmelzpunkt auf 165 bis 1680C. Beim
Umkristallisieren aus Methanol/Äthylacetat weist die
Substanz einen Schmelzpunkt von 115 ~ 1160C auf. Die Substanz
ist einheitlich bei Dünnschichtchromatographie auf Silikagel in drei verschiedenen Lösungssyst**»men und hat eine
Γ "l24
optische Drehung von \_OLjj) a -24,6° (C=I, Methanol).
optische Drehung von \_OLjj) a -24,6° (C=I, Methanol).
Analyse: C22H34N6°7 (Mol8ewiont *94,56)
Bereohnet: C « 53,43 %, H - 6,93 #, N = 16,99 %
Erhalten: 53,20 % 6,99 # 17,ü %
Herstellung von Carbobenzyloxy—Phenylalanyl—Valyl— <u_? —
Nitroarginin—Isopropylester.
2,0 g Carbobenzyloxy—Valyl—£«->
—Nitroarginin—Isopropyl— ester (4,05 mMol) werden in 10 ml trooknem Eisessig gelöst,
dann 5 ml 4 N-Bromwasserstoff in Eisessig zugesetzt und
die Mischung eine Stunde lang bei Raumtemperatur gerührt, wobei die Reaktion vor Feuchtigkeit aus der Luft geschützt
wird. VKhrend der Reaktionszeit kristallisiert eine Menge
von Tripeptiiester-Hyirobromid aus, und zwar vollständig naoh Zusatz von 2,50 ml trooknem Äther. Die Ätherphase wird
dekantiert und der Niederschlag 3 bis 4mal weiterhin mit
0/1295
HS
trocknen! Äther behandelt. Der Niederschlag wird im Vakuum
über Kaliumhydroxyd und P2 0^ getrocknet und ist stark
hygroskopisch. Das gewonnene Tripeptidester-Hydrobromid
wird in 15 ml Dimethylformamid gelöst und auf 00C
gekühlt und mit 1 ml Triethylamin (713 mMol) versetzt.
Das angefallene Triäthylaminhydrobromid wird abfiltriert
und dem Piltrat 1,7 g Carbobenzyloxy-Phenyl-Alanin-p-Nitrophenylester
(4 mMol) zugesetzt. Nachdem einige Stunden
bei —10 C stehengelassen wurde, läßt man die Temperatur in der Reaktionslösung auf 20°C ansteigen. Die
Reaktionslösung wird dann auf -100C abgekühlt, worauf ein weiteres Mal 1 ml Triethylamin zugesetzt wird und
man die Reaktionsmisohung über Nacht stehenläßt. Die Lösung
wird im Vakuum zur Trockne eingedampft und der Rückstand in einer Mischung von Äthylaoetat/n—Butanol (2:1) gelöst.
Die organische Phase wird wie gewöhnlioh mit 5%iger
wässriger Natriumblcarbonatlösung, Wasser, i normaler wässriger Chlorwasserstoffsäure und Wasser extrahiert
und über Magnesiumsulfat getrocknet0 Die getrocknete
Lösung wird zur Trockne eingedampft und der Rückstand in heißer Methanol/Äthylacetatmischung (1:1) gelöst,
worauf die Lösung einen Tag lang in der Kühlkammer verbleibt. Es werden 1,93 g einer auskristallisierten
Substanz mit einem Schmelzpunkt von 175 - 177°'C gewonnen„
Eine Umkristallisierung erhöht den Schmelzpunkt auf 178 - 179°C. Die Ausbeute beträgt 1,7 g, was 68 % der
Theorie entspricht. Die Substanz ist einheitlich in der
809820/12 95
Dünnschichtchromatographie auf Silikagel und hat eine
Γ Π 25 η
optische Drehung von [^ OCJ D = 25,7 (C=I, Methanol)
Analyse: C3iH43N7°8 (Molgewioht
Berechnet: C =58,01%, H = 6,75 %, N = 15,28 %
Erhalten: 58,32 % 6,92 % 15,19 $
Herstellung von Carbobenzyloxy-Valyl- ^ü-Iiitroarginyl-
Ού -Nitroarginin-Methylester,
5,7 g Carbobenzyloxy-* cd -Nitroarginyl- 6J-Nitroarginin
Methylester (10 mMol) und 30 ml trockner Eisessig werden
in einen vor Luftfeuchtigkeit geschützten Kolben eingebracht,
worauf 10 BiIW Bromwasserstoff in trocknen! Eisessig
schnell zugesetzt werden. Nach einstündigem Rühren bei Raumtemperatur ist die Carbobenzyloxylierung vollständig,
und es hat sich eine plastische Substanz gebildet. Die Reaktionsmischung wird unter kräftigem Rühren
in 700 ml trocknen Äther eingegossen, woduroh sich eine ^ plastische harte Masse bildet, die auf der Oberfläche
teilweise kristallin ist. Die Ätherphase wird abdekantiert und der Rückstand mit trocknem Äther digeriert,
der dann wieder abdekantiert wird. Das Verfahren wird solange wiederholt, bis das Produkt kristallin geworden
ist, worauf das Produkt über Ρρ^ς un(* Kaliumhydroxyd im
Vakuum getrocknet wird. Die Ausbeute an Dipeptidester-Hydrobromid beträgt 6,5 g und die Bestimmung des Bromgehaltes zeigt, daß die Substanz 2,3 Äquivalente Bromwasserstoff
enthält. Die Substanz wird in 40 ml Dimethylformamid gelöst, auf O0C abgekühlt und mit 3,5 ml
9Ö982D/1295
-46-
Triethylamin (25 mMol) versetzt. Das resultierende Triäthylaminhydrobromid
wird abfiltriert und 3,75 g Carbobenzyloxy— Valin-p-Nitrophenylester.werden dem Piltrat zugesetzt, worauf
man die Reaktionsmischung langsam über Nacht Raumtemperatur
annehmen läßt. Weitere 1,4 ml Triäthylamin (IO mMol) werden der Misohung nach Abkühlung auf ~iO°C
zugesetzt, worauf man sioh die Reaktion über Nacht fortsetzen läßt. Die Lösung wird zur Trockne eingedampft
und der Rückstand mit Äther, einer kleinen Menge Äthylacetat, einer 5%igen, wässrigen Natriumbicarbonat—
lösung, einer 10%igen wässrigen Zitronensäurelösung und
Wasser behandelt und in heißem Methanol gelöst. Auf anschließenden Zusatz von Äthylacetat werden 5,1 g eines
gelben kristallinen Produktes gewonnen. Zwei Umkristalli—
sationen aus Methanol/Äthylaoetat (l:l) ergeben endlich ein Produkt mit einem Schmelzpunkt vom 119 *- 1220C und
/ ^25
einer optischen Drehung von LoCJ D s -12,3 (C=»i, Dimethylformamid).
Die Dünnschichtchromatographie auf Sllikagel des Produktes ergab in drei verschiedenen Lösungssystemen
nur eine gefärbte Zone, was anzeigt, daß die Substanz einheitlich ist. Ausbeute: 4,35 g (65»2 % der Theorie).
Analyse: C24H41Nll°i0 (MolSewioht 643,68)
Berechnet: C = 44,78 #, H = 6,42 #, N= 23,94 %
Erhalten: 44,52 % 6,38 % 24,11 %
-47-
90 9820/1295
Herstellung von Carbobenzyloxy*-Phenylalanyl~Valyl—
^ -»Nitroarginyl·- oJ «.Nitroarginin«Methylester.
1,30 g Carbobenzyloxy«~Valyl— £->--Nitroarginyl— <^>~
Nitroarginin-Methylester werden wie in den vorhergehenden
t ·
Beispielen beschrieben decarbobenzyloxyliert. Beim an««
schließenden Aufarbeiten werden 1,55 g eines stark
L· hygroskopischen Tripeptidester-»Hydrobrpmids gewonnen,
das aufgrund einer Bestimmung des Bromgehalts 2,4 Äquivalente an Bromwasserstoff enthält. Das Tripeptidester«
Hydrobromid wird in 15 ml Dimethylformamid gelöst,auf
-1O0C gekühlt und 0,67 ml Triethylamin (4,8 mMol)
zugesetzt. Das entstandene Triäthylaminhydrobromid wird
durch Filtern entfernt und 0,64 g CarhobenzyloxyttPhenylalanin—
p~Nitrophenylester (2 mMol) werden dem Filtrat zugesetzt,
worauf man die Reaktionslöeung über Nacht Raumtemperatur
annehmen läßt. 0,28 ml Triäthylamin werden der Lösung
" zugesetzt, die mehrere Stunden lang weiter gerührt wird.
Die Reaktionsmischung wird zur Trockne eingedampft und
der Rückstand mit Äther behandelt, der eine kleine Menge Äthylaoetat enthält, und darauf alt wässriger, 5#igör
Natriumbloarbonatlösung, Wasser, einer 1Oxigen wässrigen
Zitronensäurelösung und Wasser.
Der Rückstand wird getrocknet und dann in Methanol/ Dimethylformamid (4:1) gelöst, mit Aktivkohle behandelt
und die klarfiltrierte Lösung über Nacht in die Kühlkammer
eingesetzt, wodurch 1,48 g eines Produktes gewonnen werden,
das einen Schmelzpunkt von 234 — 240 C aufweist. Durch
weitere Umkristallisation der Substanz erhöht sich der Schmelzpunkt auf 239 - 241°C. Die Ausbeute von
ohromatographisch einheitlicher Substanz beträgt 1,15 g mit einer optischen Drehung von /_p</J D _ — 9,6 (C=O,5 »Dimethyl—
"* formamid),
was 70,6 <?o der Theorie entspricht.
Analyse: C35H5oNi2°ll (Molgewicht 814,88)
Berechnet: C = 51,59 %, H = 6,19 ^, N= 20,62 %
Erhalten: 51,81 % 6,09 % 20,95 #
Herstellung von Carbobenzyloxy—Phenylalany1-Valyl- 6J —
Nitroarginyl— CsJ —Nitroarginin-Methylester.
408 mg Carbobenzyloxy—Phenylalanyl—Valyl- CJ-Nitroarginyl-
l*J —Nitroarginin-Methylester (0,5 mMol) werden
decarbobenzyloxyliert, wie es in den vorherigen Beispielen
beschrieben ist. 538 mg des anfallenden Tetrapeptidester— Hydrobromids, das 2,4 chemische Äquivalente des Bromwasserstoff s enthält, werden in 10 ml Dimethylformamid gelöst,
auf -100C gekühlt und mit 0,17 ml Triäthylamin versetzt,
worauf das anfallende Triäthylaminhydrobromid duroh Filtrierung entfernt wird. 0,21 g Carbobenzyloxy—
Phenylalanin—p—Nitrophenylester (0,5 mMol) werden dem
Filtrat zugesetzt. Die Reaktionsfolge ist die gleiche, wie in den vorhergehenden Beispielen beschrieben. Die
Lösung wird im Vakuum zur Trockne eingedampft und der Rückstand mit Äther, einer 5%igen wässrigen Natriumbi—
wässrigen carbonatlösung, Wasser, einer lO^igen/Zitronensäurelösung
909820/1295
-49-
und Wasser digeriert. Das so behandelte Produkt wird in
heißem Methanol gelöst, und die Lösung ergibt, nachdem sie einen Tag in der Kühlkammer stehengelassen wurde,
4,18 mg eines Produktes mit einem Schmelzpunkt von 230 - 2380C. Anschließend wird die Substanz zusätzlich
zweimal aus Methanol umkristallisiert, was eine chromatographisch einheitliche Substanz mit einem
fc Schmelzpunkt von 236 - 2400C und einer optischen Drehung
r -, D
von L.CcJ 25 = -20,0 (0=3,8, Dimethylformamid) ergibt.
von L.CcJ 25 = -20,0 (0=3,8, Dimethylformamid) ergibt.
Die Ausbeute beträgt 338 mg, was 70,3 % der Theorie
entspricht.
Analyse: ciiii EH9^1'5O12 (MolSewit>ht 962,06)
Berechnet: C = 5^,93 %, H = 6,18 #, N a 18,93 %
Erhalten: 54,62 % 6,25 % 19,10 %
Herstellung von Carbobenzyloxy—Glyeyl-Prolin.
) 7)2 g Prolin (63 mMol) werden in einer Mischung von
160 ml Pyridin/Wasser (1:1) gelöst und der pH-Grad der
Lösung mit 4N NaOH auf 8,8 eingestellt, 20,7 g Carbobenzyloxy-Glycin-Nitrophenylester (63 mMol)
werden bei Raumtemperatur in kleinen Anteilen unter Rühren zugesetzt, wobei der pH—Grad während des
Zusatzes dieser Anteile mit 4N NaOH zwischen 8,5 und
8,8 gehalten wird. Nach einer Stunde werden 25 g Natriumbicarbonat
und 200 ml Wasser zugesetzt und die Lösung mit Äthylaoetat (10 χ 60 ml) extrahiert und die Wasser-
9 0 9 8 2 0/1295 -
phase mit 4N Chlorwasserstoffsäure auf ein pH von 3,5
angesäuert. Die angesäuerte Wasserphase wird mit Äthyl— azetat extrahiert und die organische Phase mit einer
IN wässrigen Chlorwasserstoffsäurelösung gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Nach der anschließenden
Konzentration im Vakuum kristallisieren 14,5 g einer Substanz aus, die anschließend einer
weiteren Umkristallisation aus Äthylazetat unterworfen
wird. Es wurden 12,2 g eines Produktes mit einem Schmelzpunkt von 155 — 156°C und einer optischen
P -,25
Drehung vonJ^c^JD β -54,0 (C=I1 Dimethylformamid) sowie von einem Äquivalentgewicht von 304,8 gegenüber dem berechneten 306,3 erhalten.
Drehung vonJ^c^JD β -54,0 (C=I1 Dimethylformamid) sowie von einem Äquivalentgewicht von 304,8 gegenüber dem berechneten 306,3 erhalten.
Herstellung von Carbobenzyloxy—Glycyl—Prolin—
Nitrophenylester.
9,2 g Carbobenzyloxy—Glyoyl—Prolin (30 mMol)
werden in 75 ml Dimethylformamid zusammen mit 4,6 g p-Nitrophenpl (33 mMol) gelöst. Die Lösung wird auf
—5°C abgekühlt und 6,4 g DicyclohexyloarbodÜBid
(31 mMol), gelöst in einer kleinen Menge von Dimethylformamid, werden zugesetzt, wobei verhindert wird, daß
die Temperatur über O0C ansteigt. Über Nacht läßt man
die Temperatur langsam auf Raumtemperatur ansteigen und der Niederschlag (Dioyclohexylharnstoff) wird
abfiltriert. Das Filtrat wird auf 40 ml im Vakuum
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konzentriert und einen Liter Vasβer unter Rühren tropfenweise zugesetzt. Die anfallende halbfeste Substanz wird
isoliert und in Äthylazetat gelöst, das über Magnesium«»
sulfat getrocknet war. Die Äthylazetatlösung wird zur
Trockne eingedampft und der Rückstand in einer Mischung von Äthylazetat/trooknem Äther (lxl) gelöst. Nach
anschließendem Zusatz von Petroläther kristallisieren 6,6 g einer Substanz mit einem Schmelzpunkt von 104 <·*
1O5,5°C und einer optischen Drehung von
β -87,5° (C=i, Dimethylformamid) aus,
Herstellung von Carbobenzyloxy~Glycyl~Prolyl-LO ~Nitroarginine»Methylester·
2,7 gi<J «Nitroarginin-i-MethylesterwHydrochlorid
(10 mMol) werden in 30 ml Dimethylformamid gelöst und die Mischung auf O0C gekühlt, worauf 1,40 ml
Triäthylamin zugesetzt werden. Das gebildete Triethylaminhydroohlorid wird abfiltriert und 4,3 g Garbobenzyloxy-Glycyl-Prolin-p-Nitrophenylester werden den Filtrat zugesetzt, worauf naoh eintägigem Stehen bei Raumtemperatur
ein zweites Mal 1,4 ml Triäthyrlaain zugesetzt werden.
Die Reaktionslösung wird im Vakuum zur Trockne eingedampft und der Rückstand mit Äther, einer 5#igen
wässrigen Natriumbioarbonatlösung, Wasser, einer !Obigen
wässrigen Zitronensäurelöeung und Wasser digeriert.
-52-
9098 2 0/1295
Der Rückstand wird in einer kleinen Menge von heißem
Dimethylformamid gelöst, und nach anschließendem Zusatz von Wasser kristallisieren 3*1 g eines Produktes aus,
das aus Dimethylformamid/Wasser umkristallisiert wird. Die Substanz wird in einer Ausbeute von 53»7 % (2,8 g)
erhalten und ist chromatographisch einheitlich und hat einen Schmelzpunkt von 105 ·*· 1O7°C.
Analyse: C22H31N708 (Molgewioht 521,55)
Berechnet: C = 50,66 %, H = 5t99 %, N = 18,80 %
Erhalten: 51,01 % 5,84 % 18,85 %
Herstellung von Carbobenzyloxy—Phenyl-Alanyl—Valjrl— cu
liitroarginin.
2,45 g Carbobenzyloxy—Phenyl -Alanyl —Valyl— u) —Nitro-·
arginin—Methylester (k mMol) werden in 30 ml 80%igem
Aceton gelöst und mit 4 ml NaOH unter Einstellung eines pH—Grades von 11,1 — 12,5 verseift. Kohlendioxyd wird
in die Lösung eingeleitet, bis der pH-Grad 7,8 g beträgt,
worauf die Lösung im Vakuum eingedampft wird. Der Rückstand wird im Wasser gelöst und die Lösung mit Äthyl—
azetat extrahiert und die Wasserphase mit Zitronensäure—
lösung angesäuert. Der angefallene Niederschlag wird mit Äthylazetat extrahiert und die organische Phase mit
Wasser neutral gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rüokstand wird
aus Äthanol/Wasser umkristallisiert. Die Ausbeute des
chromatographisch reinen Produktes beträgt 1,95 g»
909820/1295
-53-
«ras 76,7 % der Theorie entspricht. Das Produkt hat eine
Γ I3 ο optisohe Drehung von ^aL JJ) = -12,2 (C= 1,1, Methanol)
mit einem Äquivalentgewicht von 625,3 gegenüber dem
berechneten 626,7 für die Hauptsubstanz, die 2 Mol
Kristallwasser enthält.
Herstellung von Carbobenzyloxy-Phenyl-Alanyl-Valyl- CO-Nitroarginyl-Glycyl-Prolyl-
Cu .--Nitroarginin-Methylester.
33^j 6 mg Carbobenzyloxy-Glycyl-Prolyl-. ^-Nitroarginin«
Methylester (0,8 mMol) werden decarbobenzyloxyliert und
wie in den vorhergehenden Beispielen beschrieben aufgearbeitet. Das Tripeptidester-Hydrobromid wird in 2 ml
frischdestilliertem Dimethylformamid gelöst und es werden 2ö,2 ml Triethylamin zugesetzt und das an»
fallende Triäthylhydrobromid wird abfiltriert, worauf das Piltrat auf -100C gekühlt und 509 mg Carbobenzyloxy-Phenyl-Alanyl-Valyl-6O-Nitroarginin
(0,8 mMol), die in 2,5 ml auf —100C vorgekühltem Dimethylformamid
gelöst waren, werden zugesetzt. I65 mg Dicyclohexylcarbodiimid (0,8 mMol) werden unter Rühren der Lösung
zugegeben und diese drei Tage lang bei Raumtemperatur stehengelassen. Die Lösung wird im Vakuum zur Trockne
eingedampft und der Rückstand von 933 mg in 3 ml auf -20°C gekühltem Dimethylformamid gelöst, worauf 128 mg
Dioyolohexylkarbamid auskristallisierten. Die Dünnsohichtchromatographie
des anfallenden Produktes auf
-54-9 0 9 8 2 0/1295
Silikagel in dem Lösungsmittelsystem: η—Butanol/Essig—
säure/Wasser (6:2:2) ergibt ein reines Produkt mit einem
Rf-Wert von 0,64. Die totale Hydrolyse von 1,2 mg der Substanz in 6 N Chlorwasserstoffsäure während 48 Stunden
bei 110°C in zweidimensionaler Chromatographlesohicht
des Hydrolysates auf Silikagel ergibt die Aminosäure in dem Hexapeptidderivat. Die Ausbeute an ohromatographisoh reiner Substanz beträgt 185 nig (19* 1 % der
Theorie). Die Substanz hat einen Schmelzpunkt von 125 - 127°C und eine optisphe Drehung von
L0Od β -32,0°C (C β 0,5, Dimethylformamid).
Analyse: ο^2Η6θΝ14°13 (Moleewioht 969,05)
Berechnet: C = 52,06 %, H « 6,24 %, N m 20,24 %
Erhalten: 51*84 # 6,15 % 20,13 #
Die endständig6noC~AlB:i-nogruPPe]a sowie die übrigen
durch Carbobenzyloxygruppen geschützten Aminogruppen der Peptide werden von diesen Sohutzgruppen durch Weghydrierung der Carbobenzyloxygruppe in Form von Toluol
und Kohlensäure freigemacht. Die Nitrogruppe im Arginin wird gleichzeitig als Ammoniak wegreduziert, und zwar
mit Hilfe von Wasserstoff als Reduktionsmittel und Palladium auf Kohlenstoff als Katalysator. Naohdem
sämtliche Reduktionen auf gleiohe Weise ausgeführt werden, mit Ausnahme von kleineren Variationen, die
in einer Tabelle angeführt sind, folgt hier nur eine allgemeine Beschreibung der Versuche (experimentelle
Einzelheiten siehe Tabelle 2).
909820/1295 «,
Der geschützte Peptidester wird In einem Alkohol «·
Methanol oder Äthanol «· gelöst und die erforderliche
Anzahl an Äquivalenten der salzbildenden Säure in Form
einer Wasser·-* oder Alkohollösung zugesetzt. Der mit
' Wasser angefeuchtete Katalysator (10 % Palladium auf
Kohlenstoff) wird in einer Menge zugesetzt, die 100 mg pro Mlllimol Peptid entspricht. Die Katalyeatormenge
wird etwas erhöht, eobald die Länge des Peptide zunimmt. W Sobald der Katalysator von den Wandungen des Reaktionär
gefäBes abgespült ist, wird alle Luft mit Stickstoff aus dem Reaktionsapparat verdrängt» Der Stickstoff wird seinerseits mit Wasserstoff ausgetrieben. Das Reductionssystem
wird geschlossen und über ein Meßgefäß ale Waseerstoff—
reservoir wird der Wasserstoff für die Reduktion einge«·»
leitet. Die Reaktion beginnt unter starkem Umrühren im
Reduktionsgefäß, und das gebildete Kohlendioxyd wird unter Rühren in einem an das Reaktionsgefäß angesohlossenen Kolben absorbiert) der 50 #«-ige Kalilauge
enthält. Mit Hilfe einer an das Wasserstoffreservoir
angeschlossenen Niveauflasehe, die Wasser als Sperrflüssigkeit enthält, wird der Vasserstoffverbrauch
tilt die vollständige Reaktion abgelesen (korrigiert auf Normaldruck und Normaltemperatur sowie reduziert
mit dem Partialdruok des Wassers bei der betreffenden Temperatur). Die Reaktionszeit variiert In Abhängigkeit
von der Länge der Peptide und Aftweaenheitjvon Nitrogruppen
im Arginin zwischen 2 und 12 Stunden. Sobald die Reaktion
909820/1295 ~56~
1804Ö22
beendet ist, wird Stickstoff duroh das Reaktionsgefäß geleitet,
um den Wasserstoff zu verdrängen. Der Katalysator wird abfiltriert, das Filtrat zur Trockne eingedampft, und
der Rückstand einige Male mit trooknem Äther digeriert,
worauf das Produkt fest und körnig wird. Sämtliche Peptidester
sind als Hydrochloride sehr hygroskopisoh und müssen daher in einer Trockenkammer verarbeitet und isoliert
werden sowie kühl und unter wasserfreien Bedingungen aufbewahrt werden.
-57-
909820/1295
Tabelle"; £,,
| 53 | g | 20 | r | g | 1804022 | 1580 | Reduk— tions— zeit in Stunden |
|
| Peptidde~ rivat zur Reduktion des Beispiels |
Menge Peptid"· derivat Gewicht mMol |
g | 10 | g | Wasserstoff» gasmenge in ml Bereohn. Verbr. |
1025 | 4 | |
| HCL<rH~Arg (NOg)-OMe |
5 ,'39 | mg | 0,227 | Menge -10 % pd/c |
mg | 1793 | 22,5 | 5 |
| 1 | 4,66 | mg | 1 | 2 | mg | 1120 | 112 | 12 |
| 11 | 253 | g | 8,15 | 1 | g | 25,5 | 880 | 5 |
| 12 | 515,6 | mg | 1,23 | 75 | mg | 112 | 135 | 6 |
| 13 | 5,0 | mg | 1,06 | 100 | mg | 913 | 112 | 6 |
| 14 | 826 | mg | 0,57 | 1 | mg | 138 | 55 | 7 |
| 15 | 773 | mg | 0,46 | 150 | mg | 119 | 55 | 8 |
| 16 | 450 | mg | 1,89 | 125 | mg | 64 | 200 | 6 |
| 17 | 352 | mg | 1,24 | 100 | mg | 52 | 150 | 7 |
| 18 | 1374 | mg | 2,48 | 50 | mg | 212 | 295 | 5 |
| 19 | 560 | mg | 1,13 | 200 | mg | 139 | 141 | 6 |
| 20 | 1237 | I50 | 278 | 6 | ||||
| 21 | 675 | 200 | 126 | |||||
| 100 | ||||||||
909820/1295
Ausbeute an Chloridge-
reduziertea halt des
Peptidestor + Produktes
NELCl Bereoh. Erhalten
Hflont Pro »ent __
5,3 g 87,6
31,15 33,90
3,25 g 78,6 25,02 24,12 195 eg 80,9 10,04 9,76
| 375 | Mg | ng | 81,2 | 23,03 | 21,92 |
| 4,45 g | ag | 97,4 | 18,96 | 17,90 | |
| 695 | ag | 91,3 | 17,21 | 17,05 | |
| 650 | mg | 90,7 | 15,76 | 14,98 | |
| 390 | mg | 92,9 | 14,53 | 14,13 | |
| 283 | ag | 86,4 | 15,02 | 14,27 | |
| 1050 | ag | 82,4 | 15,78 | 14,54 | |
| 450 | ■g | 91,0 | 26,68 | 24,53 | |
| 995 | 89,9 | 23,81 | 22,49 | ||
| $15 | 83,7 | 19,49 | 18,64 |
Aainoeäureanalyse
YaI t Arg x NH-0,99 t 1,01 ί -^0,92
Phe:Leu:Ala:GIu:GIytVaItArgtNH-0,95t
1,03t 1,0911,04:3P011,0310,9b»0,95
Phe t Arg 1 NH-1,00: 1,00t 0,85
Phe : YaI ι Arg : NH3
1,01: 1,02: 0,97t 0,83
Phe : GIy : YaI 1,02: 1,00: 1,02
Phe : GIy : VaI 1,02: 2,03: 0,98
Phe t GIy : VaI 1,00: 2,98t 0,98
Arg : NH3 0,96: 0,97
Arg : NH3 0,97 tO,84
Arg : NH3 O,96x 0,72
Phe
2,01
2,01
Phe
1,01
1,01
1,02
VaI : Arg : NH3 1,02: 0,97t 0,73
Leu t VaI : Arg : N% 0,99t 1,02: 0,97t 0,76
Arg : NH3 0,98: 1,74
VaI : Arg : NH3
1,02: 0,98: 1,74
Phe : VaI : Arg : NH3
1,00: 1,02: 0,97t 1,94
09.8^0/1295
-58-
Die Antithromboplastinwirkung für einige der
interessantesten Verbindungen let in Tabelle 3 angegeben,
und zwar bereohnet als eine Wirkung, die einer bestimmten
Menge von Trypsinhemmer von der Lunge in standardisierter Form entspricht· |
In Tabelle 5 geben die Werte in Kolonne 3 die 5O#-ige
Hemmung der Thromboplastinaktivität per Millimol Peptid
an, und zwar ausgedruckt in entsprechender Menge Trypsin« hemmer (mg). - OMe in den Tabellenformeln bedeutet eine
Methylestergruppe.
Peptide
Arg - OMe
Phe-Arg-OMe
Val-Arg-OMe
VaI-ATg-NH2
Phe-Arg-NHg
VaI-Ar g-OMe ^ 9 0,39
Die gefäßaktive bradyohininähnllohe Wirkung von zwei
der wirksamsten Peptide nach der Erfindung wurde als
prozentuale Steigerung der Durchblutung in der a. femoralis bei intraarterieller Injektion bei Hunden
mit einer Lösung in einer Konzentration von 1 mg Peptid/ml
909820/1295
. -59-
| Anzahl | Relative |
| Aminosäure | Hemmung |
| i | 0,028 |
| 2 | 0,053 |
| 2 | 0,032 |
| 2 | 0,037 |
| 2 | 0,000 |
| 3 | 0,18 |
| ■.■*■' | |
| 4 | 0,19 |
| k | 0,11 |
| 5. | 0,076 |
| 6 | o,i5 |
und einer Injektionsgesehwindigkeit zwisohen 1-3 »l/min
gemessen.
Peptid
Phe-Val-Arg-OMe
Phe-.Leu«Ala-Glu-.( GIy) --
| Tabelle 3 | Surohflufl- eteigerung in % |
| Menge Peptid per ml Blut |
130 |
| 0,017 | 270 |
| 0,031 | 260 |
| 0,033 | 480 |
| 0,05 | 520 |
| 0,1 | 140 |
| 0,033 | 36O |
| 0,05 | 3IO |
| 0,1 | |
909820/1295
-60-
Claims (3)
1) Peptide folgender S
N
IL. C
II
Nil
II
-X.-N- CH -C-Y-N- CH -C-
Ul
in der R. Wasserstoff oder ein Butyl-, Isobutyl-, sekundär
Butyl— oder Benzylrest sein kann, der Aminosäurerest - N - CH - CO also von Glycin, Isoleucin, Leucin,
B1
Norleucin oder Phenylalanin gebildet werden, aber auch m den Wert O oder 1 haben kann, wobei in der allgemeinen Formel bedeuten:
Norleucin oder Phenylalanin gebildet werden, aber auch m den Wert O oder 1 haben kann, wobei in der allgemeinen Formel bedeuten:
a) X alternativ =
1. -(HNCHgCO)nl"i wobei η^ den Wert 0-3 annehmen
kann,
2. -(HN - CHCO) - (HNCH2C0)nl -, wobei n± den
B4
Wert 0-3 annehmen kann, und R^ eineW «Alkylcarboxylgruppe mit bis zu 8 C-Atomen im Alkylrest bedeutet, die esterifiziert oder amidiert sein kann, wobei die «· (NH «· CHCO) - Gruppe Vorzugs-
Wert 0-3 annehmen kann, und R^ eineW «Alkylcarboxylgruppe mit bis zu 8 C-Atomen im Alkylrest bedeutet, die esterifiziert oder amidiert sein kann, wobei die «· (NH «· CHCO) - Gruppe Vorzugs-
weise ein Rest von Asparaginsäure, Asparagin- P Alkylester mit bis zu 8 C-Atomen im Alkylrest,
- Asparagin, Glutamin, Glutaminsäure oder Glutamin-
909 8 2 0/1295
- 6i -
säure« X—Alkyl ester mit bis zu 8 C-Atomen im Alkyl-·
rest sein kann,
3. AIa - (HN - CHCO) - (HN - CH2 - CO) ^ ~, wobei "Ala"
einen Alaniarest in Amidbindung bedeutet und n^ und R.
die unter a 2) angegegebene Bedeutung haben,
Null
b) Y ■ «/oder ·. NH « CH - CO - , wobei ag sowie η in der
allgemeinen Formel zwischen 2 «- 4 variieren kann und
R1- sowie Rg Wasserstoff, eine Guanyl«, oder Carbamyl«*
oder Alkylgruppe mit bis zu 8 C-Atomen bedeutet,
e) R, alternativ «
1. eine Alkoxygruppe vorzugsweise mit einer geradem, ver·*
zweigten oder zyklischen, gesättigten oder ungesättigten Kohlenwasserstoffkette mit bis zu 8 Kohlenstoffatomen,
2. eine Alkylgruppe mit einer geraden, verzweigten oder zyklisohen, gesättigten oder ungesättigten Kohlenwasser«·
stoffkette mit bis zu 8 Kohlenstoffatomen,
3. eine Amidgruppe - NRgR-, in der Rg und R7 Alkylgruppen
mit einer geraden, verzweigten oder cyklisehen, ge»
sättigten oder ungesättigten Kohlenwasserstoffkette mit bis zu 8 Kohlenstoffatomen sein oder auoh zusammen ein
Ringsystem bilden können,
4. Gly-rPro~Y~Ra, wobei Y die gleiche Bedeutung wie unter b)
und Rg die gleiche Bedeutung wie R, unter c) i - 3 hat.
«62»
909820/1295
2) Verfahren zur Herstellung der Peptide naoii
Anspruoh 1, dadurch gekennzeichnet9 daß die frag«
liehen Polypeptide aus einfachen Aminosäuren in an
sich bekannter Weise durch Kupplung der Aminosäuren unter Ausbildung von Amidbindungen aufgebaut werden,
wobei die Aminosäuren so gewählt werden und die Reaktionen in einer solchen Reihenfolge durchgeführt
werden, daß die beabsichtigte Ansinosäurensequenz
erhalten wird.
9 09620/1295
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SE1455767 | 1967-10-24 | ||
| SE1455767A SE348465B (de) | 1967-10-24 | 1967-10-24 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE1804022A1 true DE1804022A1 (de) | 1969-05-14 |
| DE1804022B2 DE1804022B2 (de) | 1976-05-06 |
| DE1804022C3 DE1804022C3 (de) | 1976-12-16 |
Family
ID=
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DK123709B (da) | 1972-07-24 |
| FI49153C (fi) | 1975-04-10 |
| FR8346M (de) | 1970-12-21 |
| NO122126B (de) | 1971-05-24 |
| DE1804022B2 (de) | 1976-05-06 |
| GB1234060A (de) | 1971-06-03 |
| CH535206A (de) | 1973-03-31 |
| JPS4823070B1 (de) | 1973-07-11 |
| SE348465B (de) | 1972-09-04 |
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| SH | Request for examination between 03.10.1968 and 22.04.1971 | ||
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