WO2020032422A1 - 지속형 인슐린 아날로그 및 그 복합체 - Google Patents

지속형 인슐린 아날로그 및 그 복합체 Download PDF

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WO2020032422A1
WO2020032422A1 PCT/KR2019/008953 KR2019008953W WO2020032422A1 WO 2020032422 A1 WO2020032422 A1 WO 2020032422A1 KR 2019008953 W KR2019008953 W KR 2019008953W WO 2020032422 A1 WO2020032422 A1 WO 2020032422A1
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WO
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insulin
amino acid
acid sequence
seq
insulin analogue
Prior art date
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PCT/KR2019/008953
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Inventor
안경훈
권오병
김승우
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주식회사 대웅제약
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/62—Insulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/31—Fusion polypeptide fusions, other than Fc, for prolonged plasma life, e.g. albumin

Definitions

  • the present invention relates to a sustained insulin analogue and a complex thereof, and more particularly, amino acid No. 22 of the B chain of natural insulin is substituted, and some amino acids of the A or B chain of natural insulin are further substituted to provide a living body.
  • the present invention relates to a sustained insulin analogue having an increased half-life in combination with an albumin binding domain, which further increases the half-life in vivo.
  • Diabetes is a metabolic disease characterized by hyperglycemia and is caused by a combination of genetic and environmental factors. Diabetes causes conditions such as type 1 diabetes, type 2 diabetes, gestational diabetes, and hyperglycemia, and the pancreas produces insufficient amounts of insulin or the body's cells do not respond properly to insulin, resulting in decreased glucose absorption. Metabolic disorder, which results in the accumulation of glucose in the blood.
  • Type 1 diabetes is also called insulin dependent diabetes (IDDM) and adolescent-onset diabetes, which is caused by beta cell destruction resulting in absolute insulin deficiency.
  • IDDM insulin dependent diabetes
  • Type 2 diabetes is also known as non-insulin dependent diabetes mellitus (NIDDM) and adult-onset diabetes, which is associated with marked insulin resistance and hence insulin deficiency accompanied by insulin deficiency and / or insulin resistance.
  • NIDDM non-insulin dependent diabetes mellitus
  • adult-onset diabetes which is associated with marked insulin resistance and hence insulin deficiency accompanied by insulin deficiency and / or insulin resistance.
  • diabetes is accompanied by a variety of complications, such as cardiovascular disease, retinopathy is a very burdensome disease when proper management, such as blood sugar control is not made.
  • the global market for diabetes treatment is expected to expand from $ 41.7 billion in 2015 to $ 66.1 billion in 2022, the second largest area after the cancer market.
  • Globally, 422 million adults have diabetes in 2014, accounting for 8.5% of the total adult population, nearly doubling from 4.5% in 1980 (WHO, 2016).
  • the total global health expenditure due to diabetes is estimated at $ 673 billion in 2015, and by 2040 the number of diabetics aged 20-79 is expected to increase to 620 million.
  • Insulin is a blood glucose control hormone secreted by the human pancreas. It transfers excess glucose in the blood to the cells to supply cells with energy and maintain blood sugar at normal levels.
  • Insulin products can be classified into five types according to their reactivity. Among these, super fast-acting insulin, which shows the fastest reactivity, starts to act quickly between 1 minute and 20 minutes, shows the best effect after 1 hour, and lasts for 3 to 5 hours. Examples include insulin aspart (NovoRapid®), insulin lispro (Humalog®), and insulin glulisine (Apidra®).
  • the fast responsive insulin is a fast-acting insulin, and the fast-acting insulin begins to lower blood glucose about 30 minutes after administration, showing the best efficacy between 2 to 4 hours and lasting for 6 to 8 hours.
  • Representative fast-acting insulins include Actrapid®, Humilin® R and Hypurin Neutral.
  • Medium-time insulin is a substance added with protamine or zinc in order to slow down the effect. It starts to work from about 1 hour and 30 minutes after injection and reaches the maximum effect between 4 and 12 hours, and lasts 16 to 24 hours.
  • Products include Protaphane®, Humulin® NPH and Hypurin Isophane®.
  • Mixed insulin is a pre-mix of super fast-acting or fast-acting insulin with medium-time insulin, making it easy to administer two types of insulin in a single injection.
  • NovoMix® 30 (30% insulin aspart, 70% protamine crystalline insulin aspart)
  • Humalog®Mix 25 (25% insulin lispro, 75% insulin lisproprotamine suspension
  • Humalog®Mix 50 (50% insulin lispro, 50% insulin lisproprotamine suspension) are commercially available.
  • long-acting insulin is injected once or twice a day and lasts up to 24 hours. It is usually used as a basal insulin.
  • Lantus® (insulin glargine, EP 0368187), Levemir® (insulin dieter) Meer insulin detemir, US 5,750,497) and Tresiba® (insulin degludec, US 7,615,532) are sold.
  • type of diabetes treatment varies according to the type of diabetes.
  • type 1 diabetes needs to be supplemented with sustained insulin in addition to fast-acting or super fast-acting drugs.
  • Type 2 diabetes requires insulin treatment.
  • fast-acting or super fast-acting insulins may be added, or only sustained insulins may be administered.
  • insulin administration is the most typical treatment for diabetes treatment.
  • long-acting insulins do not have long half-life yet, so there is a hassle to be administered once or twice daily. It causes discomfort.
  • the present invention is to extend the duration of action of the conventionally developed basal insulin to minimize the inconvenience caused by a large number of injections, and to develop an improved insulin manufacturing method.
  • Albumin is the most abundant protein in the blood, and because it affects the pharmacokinetics of many drugs, there are many studies trying to regulate the albumin binding of drugs in drug development. For example, to develop long-acting insulin, Novo Nordisk has acylatated fatty acids that bind to albumin to insulin to slow the transition from subcutaneous tissue to blood. Products were developed (insulin detemir, insulin degludec). The albumin binding ability of fatty acids has a high correlation with the absorption rate of insulin. The fusion of fatty acids with high albumin binding ability increases the half-life of insulin.
  • insulin determere binds to albumin in the blood to increase the half-life
  • the intravenous administration of human insulin has a half-life of 2.4 minutes
  • insulin determere increases the half-life by 18 to 25 minutes or more.
  • Insulin degludec has a 2.4-fold increase in albumin affinity compared to insulin determere, resulting in increased half-life of insulin.
  • acylated insulins do not have an in vivo profile of more than a daily formulation at affinity levels of albumin (K d ) at several mM levels (Biochem. J. 312, 725-731 (1995)). Therefore, in the present invention, the albumin binding domain (ABD) having affinity for albumin was used to maximize the half-life extending effect by albumin.
  • the present inventors have made diligent efforts to develop long-acting insulins with improved durations in order to alleviate the hassle caused by frequent insulin administration of diabetic patients.
  • the present inventors substituted some amino acids of the A and B chains of natural insulin,
  • the present invention was completed by remarkably increasing the in vivo half-life of the insulin analogue complex further bound to the albumin binding domain.
  • An object of the present invention is a novel insulin analogue which is cleavable by the enzyme clostripain and has an extended half-life in vivo, a nucleotide encoding the analog, a vector comprising the nucleotide and a recombinant microorganism into which the vector is introduced.
  • Another object of the present invention is to introduce a novel insulin analog complex, a nucleotide encoding the analog complex, a nucleotide encoding the analog complex, a vector comprising the nucleotide, and the vector are introduced, having a resistance to cleavage by the enzyme clostripain and having an extended half-life in vivo.
  • a novel insulin analog complex a nucleotide encoding the analog complex
  • a nucleotide encoding the analog complex a vector comprising the nucleotide, and the vector are introduced, having a resistance to cleavage by the enzyme clostripain and having an extended half-life in vivo.
  • Still another object of the present invention is to provide a method for preparing a sustained insulin analogue complex having an increased in vivo half-life of an active form.
  • the present invention comprises an insulin B chain mutation represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 in which the 22nd amino acid of the insulin B chain is substituted with arginine (Arg) with lysine (Lys) in natural insulin.
  • Arg arginine
  • Lys lysine
  • the present invention also provides a polynucleotide encoding the insulin analogue.
  • the present invention also provides a recombinant vector comprising the polynucleotide.
  • the present invention also provides a recombinant microorganism into which the recombinant vector is introduced.
  • the present invention also provides a sustained insulin analogue complex in which an albumin binding domain is bound to the insulin analogue.
  • the present invention also provides a polynucleotide encoding the insulin analog complex.
  • the present invention also provides a recombinant vector comprising a polynucleotide encoding the insulin analogue and a nucleotide encoding an albumin binding domain comprising an albumin binding motif represented by the following amino acid sequence.
  • X a is selected from D and E;
  • X b is selected from D and E;
  • X c is selected from A and E.
  • the present invention also provides a recombinant microorganism into which the recombinant vector is introduced.
  • the present invention also provides
  • CpB Clostripine and Carboxypeptidase B
  • Figure 2 shows the results of confirming the expression of ABD-fusion insulin analog complex 1-10 in recombinant E. coli by SDS-PAGE. Introducing one or more mutations in the insulin sequence maintained protein expression in E. coli.
  • Figure 3 monitors the solubilization and refolding of ABD-fused insulin analog 4 by RP-HPLC.
  • the retention time shift was observed in RP-HPLC as the tertiary structure was formed.
  • Figure 4 is the reaction according to the enzyme reaction conditions according to an embodiment of the present invention, the result of confirming the effect of increasing the active insulin conversion efficiency and reducing impurities. (Main Impurity Molecular Weight 10296 Da, Active Molecular Weight 11238 Da)
  • ABD-fusion insulin analogue 4 was digested with Clostripine and CpB and purified and analyzed by SDS-PAGE.
  • FIG. 6 is a result of analyzing the formation of hexamer by size exclusion chromatography by adding zinc and phenol to the ABD-fused insulin analogue according to an embodiment of the present invention.
  • the insulin analogue in which amino acid number 22 of the B chain of natural insulin is substituted with lysine (Lys) in arginine (Arg), and some amino acids of other A or B chains of natural insulin are further substituted.
  • lysine Lys
  • arginine Arg
  • the half-life is increased in vivo, it was confirmed that the microorganism can be easily produced.
  • the albumin-binding domain is further fused to the insulin analog, the half-life may be increased in vivo.
  • the present invention provides an insulin-ABD fusion protein having an extremely increased half-life by fusion of albumin binding domain (ABD) having high binding ability to albumin to natural insulin to slow the transition to blood as well as to increase blood stability.
  • a protease is introduced by introducing a mutation in which amino acid number 22 of the B chain of natural insulin is substituted with arginine (Arg) and lysine (Lys) and / or some amino acids of other A or B chains of natural insulin are substituted.
  • insulin analogues to minimize cleavage or insulin receptor mediated clearance.
  • the present invention also includes an insulin analogue-ABD fusion protein in which albumin binding domain (ABD) is fused to the various insulin analogues. This fusion protein retains insulin's inherent properties of forming hexamers, allowing for formulation studies and improved absorption.
  • the present invention provides an insulin comprising an insulin B chain mutation represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 in which the 22nd amino acid of the insulin B chain in natural insulin is substituted with lysine (Lys) in arginine (Arg). It's about analog.
  • the 22nd amino acid of the insulin B chain when the 22nd amino acid of the insulin B chain is substituted with lysine (Lys) in arginine (Arg), it may have cleavage resistance by the enzyme clostripain, which may induce an insulin analog in microorganisms or cells other than the human body.
  • clostripain an enzyme other than trypsin, can be converted into active form.
  • an insulin analogue comprising an insulin B chain mutation represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 in which the 22nd amino acid of the insulin B chain in natural insulin is substituted with lysine (Lys) in arginine (Arg)
  • lysine (Lys) in arginine (Arg) In addition to the substitution in which the 22nd amino acid in the native insulin B chain is replaced with lysine (Lys) in arginine (Arg), it means that it may include additional mutations in other amino acids of the insulin A chain or insulin B chain.
  • the insulin analog is (i) the third amino acid of the insulin A chain represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 is substituted in valine (Val) to leucine (Leu); (ii) the eighth amino acid of the insulin A chain represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 is replaced by threonine (Thr) with aspartic acid (Asp); (iii) the tenth amino acid of the insulin A chain represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 is substituted for isoleucine (Ile) with lysine (Lys); (iv) the 14th amino acid of the insulin A chain represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 is substituted for tyrosine (Tyr) with glutamic acid (Glu); (v) the 19th amino acid of the insulin A chain represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 is replaced with phenylalanine (Phe) in tyrosine (Tyr); (vi) the fifth amino acid of the insulin
  • the insulin analogue may be characterized in that the in vivo half-life is increased compared to the natural insulin, and preferably, the in vivo half-life lasts at least 48 hours or more, more preferably at least 72 hours or more. can do.
  • the present invention relates to a polynucleotide encoding the insulin analog in another aspect, to a recombinant vector comprising the polynucleotide in another aspect, and to a recombinant microorganism into which the recombinant vector is introduced in another aspect.
  • the present invention relates to a sustained insulin analogue complex in which the albumin binding domain is bound to the insulin analogue.
  • the sustained insulin analogue complexes to which albumin binding domains are bound have a relatively high albumin affinity.
  • the albumin binding domain may be characterized in that it comprises an albumin binding motif represented by the following amino acid sequence.
  • X a is selected from D and E;
  • X b is selected from D and E;
  • X c is selected from A and E.
  • X a is D
  • X b is D
  • X c is A
  • the albumin binding domain may be characterized by comprising the following amino acid sequence.
  • [BM] is an albumin binding motif as defined above
  • X 3 is selected from C, E, Q and S;
  • X 6 is selected from C, E and S;
  • X 7 is selected from A and S;
  • X 10 is selected from A, R and S;
  • X 14 is selected from A, C, K and S;
  • X 43 is selected from A and K;
  • X 44 is selected from A, E and S.
  • the albumin binding domain may be characterized in that the albumin binding domain is represented by an amino acid sequence selected from the group consisting of amino acid sequences of SEQ ID NO: 6 to SEQ ID NO: 13, but is not limited thereto.
  • the albumin binding domain may be preferably an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6.
  • the insulin complex or insulin analog complex in the insulin or insulin analogue of the B-chain-C-chain-A-chain sequence, fusion of albumin binding domain to the C-terminus of the A-chain protein refolding Preferred in view of yield, enzymatic yield and insulin activity.
  • the A-chain and albumin binding domain can be fused by a linker.
  • the function of the sustained insulin analogue complex according to the invention depends on the tertiary structure of the complex. Therefore, in the present invention, the sustained insulin analogue complex can make small changes in the amino acid sequence constituting the complex without affecting its function. Therefore, the present invention encompasses variants of albumin binding domains or sustained insulin analogue complexes that maintain albumin binding properties and high resistance to enzyme cleavage. For example, amino acid residues belonging to a particular functional group of amino acid residues (eg, hydrophobicity, hydrophilicity, polarity, etc.) may be substituted with other amino acid residues belonging to the same functional group.
  • a particular functional group of amino acid residues eg, hydrophobicity, hydrophilicity, polarity, etc.
  • albumin binding and “binding affinity for albumin” refer to properties of polypeptides or proteins that can be tested using surface plasmon resonance techniques, such as, for example, in a Biacore instrument.
  • albumin binding affinity can be tested in an experiment in which albumin or a fragment thereof is fixed on a sensor chip of the device and a sample containing the polypeptide or protein to be tested is delivered to the chip.
  • the polypeptide or protein to be tested is immobilized on the sensor chip of the device and the sample or fragment thereof containing albumin is delivered to the chip.
  • the albumin may be serum albumin derived from a mammal such as human serum albumin.
  • surface plasmon resonance methods can also be performed when quantitative measurements, such as measuring KD values for interactions, are required.
  • binding values can be defined via a Biacore2000 instrument (Biacore AB).
  • Albumin is properly fixed to the measurement sensor chip, and polypeptide or protein samples to be measured for affinity are prepared by step dilution and injected in any order. The K D value can then be calculated from the results using, for example, a 1: 1 Langmuir binding model of BIAevaluation 4.1 software provided by Biacore AB.
  • the albumin to which the sustained insulin analogue complexes bind can be selected from, but is not limited to, human serum albumin, rat serum albumin, cynomolgus serum albumin, and mouse serum albumin. It doesn't happen.
  • the albumin to which the sustained insulin analog complex binds is human serum albumin.
  • the insulin analogue and albumin binding domain are peptide binding; Polypeptide linkers; Or polyethylene glycol, polypropylene glycol, ethylene glycol-propylene glycol copolymer, polyoxyethylated polyol, polyvinyl alcohol, polysaccharide, dextran, polyvinyl ethyl ether, biodegradable polymer, fatty acid, nucleotide, lipid polymer, chitin, hyaluronic acid And it may be characterized in that coupled to each other via a non-peptidyl linker selected from the group consisting of a combination thereof, but is not limited thereto.
  • GGGGS repeating sequence
  • the insulin analogue and albumin binding domain may be bound to each other by a polypeptide linker, and the polypeptide linker may be (GGGGS) n (n is an integer of 1 to 6), but is not limited thereto.
  • the polypeptide linker may be represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5.
  • the present invention further relates to a recombinant vector comprising a polynucleotide encoding an insulin analogue and a nucleotide encoding an albumin binding domain comprising an albumin binding motif represented by the following amino acid sequence.
  • X a is selected from D and E;
  • X b is selected from D and E;
  • X c is selected from A and E.
  • the albumin binding domain may be characterized by comprising the following amino acid sequence.
  • [BM] is an albumin binding motif as defined above
  • X 3 is selected from C, E, Q and S;
  • X 6 is selected from C, E and S;
  • X 7 is selected from A and S;
  • X 10 is selected from A, R and S;
  • X 14 is selected from A, C, K and S;
  • X 43 is selected from A and K;
  • X 44 is selected from A, E and S.
  • the albumin binding domain may be represented by an amino acid sequence selected from the group consisting of the amino acid sequences of SEQ ID NO: 6 to SEQ ID NO: 13, but is not limited thereto.
  • the albumin binding domain may be preferably an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6.
  • the polynucleotide encoding the insulin analogue and the nucleotide encoding the albumin binding domain may be introduced into a recombinant vector so that the insulin analogue and the albumin binding domain are fused and expressed.
  • albumin binding domain introduced into the recombinant vector overlaps with the description of the albumin binding domain constituting the sustained insulin analog complex, and the description thereof is omitted.
  • a polynucleotide encoding the insulin analogue and a nucleotide encoding the albumin binding domain may include a nucleotide encoding the polypeptide linker, and the description of the polypeptide linker also includes a polypeptide constituting the sustained insulin analog complex. Since the description of the linker is duplicated, the description thereof will be omitted.
  • albumin binding motif and albumin binding domain includes the contents described in Korean Patent Publication No. 10-2015-0058454 corresponding to International Publication WO2014048977. Shall be.
  • Recombinant vectors according to the present invention can typically be constructed as vectors for cloning or vectors for expression and as vectors for use of prokaryotic or eukaryotic cells as host cells.
  • the term "vector” refers to a nucleic acid construct that is a recombinant vector capable of expressing a protein of interest in an appropriate host cell, and that includes an essential regulatory element operably linked to express a nucleic acid insert.
  • the present invention can produce a recombinant vector comprising a nucleic acid encoding an insulin analogue or an analogue complex thereof, by transforming or transfecting the recombinant vector into a host cell, And / or analog complexes thereof.
  • the nucleic acid encoding the insulin analogue and / or analogue complex thereof is operably linked to nucleic acid expression control sequences.
  • the term “operatively linked” means a functional binding between a nucleic acid expression control sequence (eg, a promoter, signal sequence, ribosomal binding site, transcription termination sequence, etc.) and another nucleic acid sequence.
  • the regulatory sequence will control the transcription and / or translation of the other nucleic acid sequence.
  • promoter refers to a non-readed nucleic acid sequence upstream of a coding region, ie, a polymerase, that contains a binding site for a polymerase and has a transcription initiation activity to an mRNA of a promoter subgene. It refers to the DNA region to initiate the transcription of the gene, and is located at the 5'-site of the mRNA transcription start site.
  • the vector of the present invention is a recombinant vector and the prokaryotic cell is a host
  • powerful promoters capable of promoting transcription e.g., tac promoter, lac promoter, lacUV5 promoter, lpp promoter, pL ⁇ promoter, pR ⁇ promoter, rac5 promoter, amp promoter, recA promoter, SP6 promoter, trp promoter, trc promoter, phoA promoter, araBAD promoter, T5 promoter and T7 promoter, etc.
  • promoters capable of promoting transcription e.g., tac promoter, lac promoter, lacUV5 promoter, lpp promoter, pL ⁇ promoter, pR ⁇ promoter, rac5 promoter, amp promoter, recA promoter, SP6 promoter, trp promoter, trc promoter, phoA promoter, araBAD promoter, T5 promoter and T7 promoter, etc.
  • vectors that can be used in the present invention are plasmids often used in the art (eg, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8 / 9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14).
  • plasmids often used in the art (eg, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8 / 9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14).
  • pGEX series, pET series, pPICZ ⁇ series, pUC19, etc. phage (e.g. ⁇ gt4 ⁇ ⁇ B, ⁇ -Charon, ⁇ z1 and M13, etc.) or viruses (e.g. SV
  • a promoter derived from the genome of the mammalian cell e.g., metallothionine promoter
  • a promoter derived from a mammalian virus e.g., adenovirus
  • Late promoters vaccinia virus 7.5K promoters
  • SV40 promoters SV40 promoters
  • cytomegalovirus promoters tk promoters of HSV
  • polyadenylation sequences e.g., plastic growth hormone terminators and SV40 derived poly adenylation sequences
  • the recombinant vectors of the present invention include antibiotic resistance genes commonly used in the art as selection markers, and include, for example, ampicillin, gentamicin, carbenicillin, chloramphenicol, streptomycin, kanamycin, geneticin, neomycin Or resistance genes for tetracycline can be used.
  • the recombinant vector of the present invention may further comprise other sequences as necessary to facilitate purification of the protein of interest, ie insulin analog and / or insulin analog complex.
  • the additionally included sequence may be a tag purification tag sequence, such as glutathione S-transferase (Pharmacia, USA), maltose binding protein (NEB, USA), FLAG (IBI, USA) and 6 histidines. (hexahistidine) and the like, but the examples do not limit the type of sequence required for purification of the target protein. Fusion proteins expressed by recombinant vectors comprising such tag sequences can be purified by affinity chromatography.
  • glutathione-S-transferase when glutathione-S-transferase is fused, glutathione, which is a substrate of this enzyme, can be used, and when six histidine tags are used, a desired target protein can be easily recovered by using a Ni-NTA column. .
  • a recombinant vector comprising the polynucleotide encoding the insulin analogue and / or the insulin analogue complex
  • a recombinant microorganism transformed with the vector may be constructed.
  • transformation refers to the introduction of DNA into a host cell so that the DNA can be replicated as a factor of a chromosome or by completion of chromosome integration. It means a phenomenon causing change.
  • the transformation method of the present invention any transformation method may be used, and may be easily performed according to conventional methods in the art.
  • the transformation method includes a CaCl 2 precipitation method and a CaCl 2 precipitation method using a reducing agent called DMSO (dimethyl sulfoxide) to improve the efficiency of the Hanahan method, electroporation, calcium phosphate precipitation, plasma fusion method, silicon Agitation with carbide fibers, agrobacterial mediated transformation, transformation with PEG, dextran sulfate, lipofectamine and dry / inhibition mediated transformation.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • the method for transforming a recombinant vector comprising a nucleic acid encoding an insulin analogue and / or an insulin analogue complex according to the present invention is not limited to the above examples, and the transformation or transfection methods commonly used in the art are limited. Can be used without.
  • the transformant of the present invention can be obtained by introducing into a host cell a recombinant vector comprising a nucleic acid encoding an insulin analogue and / or an insulin analogue complex of interest.
  • Suitable hosts for the present invention are not particularly limited so long as they allow expression of the nucleic acid of the present invention.
  • Specific examples of hosts that can be used in the present invention include Escherichia genus bacteria such as E. coli; Bacillus genus bacteria such as Bacillus subtilis; Bacteria of the genus Pseudomonas, such as Pseudomonas putida; Yeasts such as Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, and Schizosaccharomyces pombe; Insect cells such as Spodoptera luciferda (SF9); And animal cells such as CHO, COS, BSC, and the like, but are not limited thereto.
  • the present invention provides a composition for treating diabetes comprising the insulin analogue or the insulin analogue complex.
  • the present invention provides a method for treating diabetes comprising administering the insulin analogue or the insulin analogue complex to a patient in need of glycemic control.
  • the present invention provides the use of the insulin analogue or the insulin analogue complex for use in the treatment of diabetes.
  • the present invention provides the use of the insulin analogue or the insulin analogue complex for the manufacture of a medicament for the treatment of diabetes.
  • the present invention also comprises the steps of (a) culturing the recombinant microorganism; (b) crushing the cultured recombinant microorganism to obtain a sustained insulin analog complex; (c) inducing refolding of the obtained sustained insulin analog complex to obtain a pre-pro form insulin analog complex; (d) reacting the pre-pro form insulin analog complex with Clostripine and CpB to convert it into active form; And (e) provides a method for producing a sustained-type insulin analogue complex with increased half-life of the active-type in vivo, comprising the step of purifying the active-type sustained insulin analogue complex.
  • ABD-fused insulin analogue is used in the same sense as the sustained insulin analogue complex in the present invention.
  • Human insulin is made in the form of pre-pro-insulin, which cuts the pre-sequence from the endoplasmic reticulum and processes it in the Golgi apparatus and vesicles to form mature insulin.
  • Proinsulin was designed to produce recombinant insulin by the process of expressing a protein in E. coli in the form of proinsulin and cutting the C chain using trypsin.
  • a fusion tag was inserted at the N-terminus and codon optimization was performed.
  • ABD albumin biding domain
  • PJ401 (DNA 2.0) vector was used as the expression vector, and the vector was digested with restriction enzymes NdeI and EcoRI, and then subjected to electrophoresis on 1% agarose gel to separate DNA fragments.
  • E. coli BL21 (DE3) was transformed by introducing plasmids by connecting the gene structure for ABD-fusion insulin expression and DNA fragments obtained from the expression vector as described above with T4 DNA ligase, and then introducing each plasmid by the calcium chloride method. .
  • Transformed strains resistant to kanamycin were selected and plasmid DNA was isolated to confirm that the desired DNA was correctly inserted by analysis by restriction enzyme digestion.
  • NdeI -Fusion tag-ABD-Linker-B-chain-C-chain-A-chain- EcoRI gene structure When NdeI -Fusion tag-ABD-Linker-B-chain-C-chain-A-chain- EcoRI gene structure was designed, the yield of protein refolding was very low and was not suitable for the present invention. Also. NdeI -Fusion tag-A-chain-C-chain-B-chain-Linker-ABD-When ABD-fusion insulin was prepared with gene of EcoRI structure, insulin activity was confirmed, but activity was low due to low refolding and yield of enzyme treatment. It was confirmed that the type insulin preparation method is not appropriate. Therefore, among the three types of ABD-fusion insulin, NdeI -Fusion tag-B-chain-C-chain-A-chain-Linker-ABD- EcoRI structure was selected and the experiment was conducted.
  • amino acid sequence of the said site which comprises ABD-fusion insulin used by this invention is as follows.
  • Codon optimization for gene expression in E. coli was performed according to GeneArt's algorithm and the genes were synthesized to have substituted amino acids.
  • the plasmid thus prepared was introduced into E. coli BL21 (DE3) in the same manner as described in Example 1 to prepare recombinant E. coli.
  • each recombinant E. coli strain was inoculated in 100 mL LB medium and shaken at 37 ° C. for 16 hours to use as species culture.
  • 2 L LB medium was added to a 7 L fermenter (New Brunswick BioFlo) and sterilized, followed by seed culture.
  • the culture conditions were the temperature 35 °C air volume 3 vvm, agitation rate 1,000 rpm, pH was adjusted with ammonia and phosphoric acid to maintain 6.8. Feeding was started when the carbon source of the medium was depleted and protein expression was induced by IPTG at the same time. After induction of expression, the cells were further cultured for 10 hours, and the recombinant cells were recovered using a centrifuge.
  • ABD-fusion insulin analogues were expressed as inclusion bodies in Escherichia coli and showed similar expression levels in the vector system used in the present invention even when the mutation of the insulin site amino acid site was introduced (FIG. 2).
  • ABD-fused insulin or ABD-fused insulin analogs were suspended in crush buffers (20 mM Tris, 10 mM EDTA, 10% sucrose, 0.2 M NaCl, pH 8.0), and cells were disrupted using a high pressure homogenizer. .
  • the lysate was centrifuged at 7,000 rpm in a high-speed centrifuge and the soluble protein and some cell debris were removed to separate the precipitate containing inclusion bodies.
  • the separated inclusion body was washed in a buffer containing 1% Triton X-100, 0.2 M NaCl, 1 M Urea, and then centrifuged at 7,000 rpm.
  • the precipitated inclusion body was further washed twice with distilled water and then stored at -80 ° C until use.
  • Cryopreserved inclusion bodies were dissolved in solubilization buffer (25 mM Tris, 8 M Urea, 30 mM cysteine-HCl, pH 10.5), diluted in refolding buffer (25 mM Tris-HCl, pH 10.5) and at 4 ° C. Refolding was performed for 16 hours. The refolding was confirmed by RP-HPLC analysis. As the solubilization solution was analyzed in RP-HPLC, the hydrophobic protein peak was observed in 20 minutes, and the refolding solution was observed to move the peak in 16 minutes (Fig. 3). This is because as the refolding proceeds, hydrophobicity decreases compared to the solubilization state. Refolding proceeded until no protein peak shift was observed in RP-HPLC analysis.
  • Clostripine When Clostripine is used to induce active conversion, cleavage occurs at position 22 of the insulin B chain, making it difficult to produce an intact form of insulin.
  • ABD-fused insulin analogue substituted with was used to prepare the active insulin.
  • Clostripine contains cysteine (Cys) in its active site, and requires reducing conditions to show the activity of the enzyme.
  • Cys cysteine
  • the refolding solution is treated with a reducing agent to maintain Clostripine activity, the disulfide bond at the insulin site is likely to be broken.
  • the derivation of conditions that increase the yield of the enzyme reaction without the breakage of disulfide bonds is required.
  • the experiment was performed using DTT, which is a reducing agent to be included in the enzyme reaction solution.
  • Clostripine was activated by inducing auto-cleavage because it is present in pro-form form. To this end, freeze-dried clostripine (Worthington, USA) was dissolved in distilled water, and activated buffer (500 mM Tris, 50 mM DTT, 25 mM CaCl 2 pH 7.8) was added and activated at 4 ° C. for 30 minutes. Clostripine activated to 0.1-5 units per mg of refolded protein was added and reacted at 25-40 ° C. for 2-8 hours. After Clostripine reaction, CpB was added to 0.001 to 1 unit per mg of protein to further react. The enzyme reaction was stopped by lowering the pH to 3.5 or less using HCl.
  • Samples enzymatically treated with Clostripine and CpB were first purified according to the manufacturer's method using Fractogel® EMD COO- (M) (Merck) ion exchange resin chromatography, followed by Pharmprep® P100 RP-18e (Merck). G) was subjected to secondary phase purification using reverse phase chromatography.
  • SPR Surface plasmon resonance
  • Analogues 1, 3, and 10 which showed glucose-lowering ability below 50% of insulin glargine, were excluded from the candidate material.
  • Insulin has a stable structure by binding to zinc in the body to form hexamers.
  • Hexamer insulin is used in formulation studies and may play an important role in increasing half-life in the body. Therefore, it was analyzed by size exclusion chromatography whether the ABD-fusion insulin analog retained the properties of hexamer formation. As a result, it was confirmed that the analog 4 maintains the ability to form hexamer according to the addition of zinc and phenol (FIG. 6). Hexamer formation was also confirmed in all analogs except analog 7, 9 and 10. As a result, analog Nos. 7 and 9 of the analogs having the sequences shown in Table 2 did not form hexamers and were further excluded from the candidates.
  • the ABD-fused insulin showed a significantly increased half-life compared with the known half-life of 5 minutes of natural insulin.
  • Analog 11 which replaced only insulin B chain 22, had a half-life of 7.2 hours, and Analog 4, which had the greatest half-life increase, was evaluated to have a half-life of 9.9 hours.
  • Insulin analogue or insulin analogue complex according to the present invention has a significant increase in the half-life in vivo compared to insulin, insulin analogue, and other insulin complexes used in the past, the stability is increased, the long-term effect can be maintained even with a single injection This can provide convenience to diabetic patients who directly administer insulin injections.

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Abstract

본 발명은 천연형 인슐린의 B 쇄의 22번 아미노산이 치환되고, 천연형 인슐린의 A 쇄 또는 B 쇄의 일부 아미노산이 추가로 치환되어 생체 내 반감기가 증가된 지속형 인슐린 아날로그 및 이에 알부민 결합 도메인이 추가로 결합되어 있어 생체 내 반감기가 더욱 증가된 지속형 인슐린 아날로그 복합체에 관한 것으로, 본 발명에 따른 인슐린 아날로그 또는 인슐린 아날로그 복합체는 생체 내 반감기가 현저히 증가하여 직접 인슐린을 주사제로 투여하는 당뇨병 환자들에게 편의를 제공할 수 있다.

Description

지속형 인슐린 아날로그 및 그 복합체
본 발명은 지속형 인슐린 아날로그 및 그 복합체에 관한 것으로, 더 상세하게는 천연형 인슐린의 B 쇄의 22번 아미노산이 치환되고, 천연형 인슐린의 A 쇄 또는 B 쇄의 일부 아미노산이 추가로 치환되어 생체 내 반감기가 증가된 지속형 인슐린 아날로그 및 이에 알부민 결합 도메인이 추가로 결합되어 있어 생체 내 반감기가 더욱 증가된 지속형 인슐린 아날로그 복합체에 관한 것이다.
당뇨는 고혈당을 특징으로 하는 대사질환으로 유전적 요인과 환경적 요인의 복합적인 작용에 의해 발생한다. 당뇨는 1형 당뇨, 2형 당뇨, 임신성 당뇨 및 고혈당증 등의 상태를 유발하고, 췌장이 불충분한 양의 인슐린을 생성하거나 인체의 세포가 인슐린에 적절하게 반응하지 못해 포도당을 흡수하는 능력이 저하된 대사장애를 의미하며, 그 결과 포도당이 혈액 중에 축적되어 나타난다.
1형 당뇨는 인슐린 의존성 당뇨(IDDM) 및 청소년기-발병 당뇨라고도 불리며, 이는 베타 세포 파괴에 의해 유발되어 절대적인 인슐린 결핍을 유발한다. 반면 2형 당뇨는 비인슐린 의존 당뇨(NIDDM) 및 성인-발병 당뇨라고도 알려져 있으며, 이는 뚜렷한 인슐린 저항성과 이에 따른 인슐린 결핍 및/또는 인슐린 저항성과 동반되는 인슐린 분비 결핍과 관련되어 있다.
특히 당뇨는 심혈관 질환, 망막병증 등 다양한 합병증을 동반하기 때문에 혈당 조절 등 적절한 관리가 이루어지지 않을 경우 부담이 매우 큰 질환이다. 당뇨 치료제 세계 시장 규모는 2015년 417억 달러에서 2022년 661억 달러로 확대될 것으로 예측되는데 이는 항암제 시장에 이어 두 번째로 큰 영역이 될 것으로 예측된다. 전 세계적으로 2014년 기준 4억 22백만 명의 성인이 당뇨를 앓고 있으며, 이는 전체 성인 인구의 8.5%에 달하는데, 이는 1980년 4.5%에서 두 배 가까이 증가한 수치이다(WHO, 2016). 또한 당뇨로 인한 세계 보건 지출 총액은 2015년 기준 6,730억 달러 규모로 추산되며, 2040년까지 20-79세 당뇨 환자의 수는 6억 2천만 명 규모로 증가할 것으로 예측되고 있다.
당뇨를 치료하기 위한 가장 대표적인 방법으로는 인슐린을 투여하여 환자의 혈당을 정상 수준으로 조절하는 방법이 있다. 인슐린은 인체의 췌장에서 분비되는 혈당 조절 호르몬으로, 혈액 내의 잉여 포도당을 세포로 옮겨 세포에 에너지원을 공급하는 한편 혈당을 정상 수준으로 유지시켜 주는 역할을 한다.
재조합 단백질 제조 기술이 발달하면서 다양한 종류의 인슐린 제품이 출시되었다. 인슐린 제품은 그 반응성에 따라 크게 5가지 종류로 구분할 수 있다. 이 중 가장 신속한 반응성을 나타내는 초속효성 인슐린은 약효가 빠르게 나타나 1분에서 20분 사이에 작용하기 시작하여, 1시간 후 즈음 최고의 약효를 보이고 3시간 내지 5시간 효과가 지속되는 특징이 있으며, 대표적인 제품으로는 인슐린 아스파트(NovoRapid®), 인슐린 리스프로(Humalog®), 인슐린 글루리신(Apidra®)이 있다. 다음으로 빠른 반응성을 나타내는 인슐린은 속효성 인슐린으로, 속효성 인슐린은 투여 후 약 30분 후에 혈당을 낮추기 시작하여 2시간에서 4시간 사이에 최고의 약효를 보이고 6시간 내지 8시간 효과가 지속된다. 대표적인 속효성 인슐린으로는 Actrapid®, Humilin® R, Hypurin Neutral 등이 있다. 중시간형 인슐린은 약효를 늦추기 위하여 프로타민이나 아연을 더한 물질로, 주사 후 약 1시간 30분부터 작용하기 시작하여 4시간에서 12시간 사이에 약효가 최대에 달하며, 16시간에서 24시간 지속되고, 대표적인 제품으로는 Protaphane®, Humulin® NPH, Hypurin Isophane®가 있다. 혼합형 인슐린은 초속효성 인슐린이나 속효성 인슐린을 중시간형 인슐린과 미리 섞어 두 종류의 인슐린을 한 번의 주사로 쉽게 투여할 수 있도록 한 것으로, NovoMix® 30 (30% 인슐린 아스파트, 70% 프로타민 결정 인슐린 아스파트), Humalog®Mix 25 (25% 인슐린 리스프로, 75% 인슐린 리스프로 프로타민 현탁), Humalog®Mix 50 (50% 인슐린 리스프로, 50% 인슐린 리스프로 프로타민 현탁)가 시중에 판매되고 있다. 마지막으로 지속형 인슐린은 하루에 한 번 혹은 두 번 주사하며 약효가 24시간까지 지속되는 인슐린으로 이는 보통 기저 인슐린으로 사용되는데, Lantus® (인슐린 글라진 insulin glargine, EP 0368187), Levemir® (인슐린 디터미어 insulin detemir, US 5,750,497), Tresiba® (인슐린 디글루덱 insulin degludec, US 7,615,532)가 판매되고 있다.
인슐린의 반응시간에 따라 당뇨유형 별로 치료방법이 상이한데, 제1형 당뇨는 속효성이나 초속효성과 더불어 지속형 인슐린을 추가로 보완하여야 할 필요가 있으며, 인슐린 치료를 필요로 하는 제2형 당뇨는 지속형 인슐린과 더불어 속효성 또는 초속효성 인슐린을 추가하거나, 단지 지속형 인슐린만 투여할 수도 있다.
이처럼 인슐린 투여는 당뇨 치료의 가장 대표적인 치료방법이지만, 지속형 인슐린들은 아직 충분히 반감기가 길지 않아 매일 1회 또는 2회 투여하여야 하는 번거러움이 존재하여 직접 인슐린을 주사제로 투여하는 당뇨 환자들에게 일상 생활의 불편함을 초래한다.
현재 출시된 기저 인슐린은 대부분 1일 제형으로 그 이상 투여 편의성이 개선된 제품은 없는 실정이다. 노보 노디스크사(Novo Nordisk)는 체내 존재하는 프로테아제에 저항성을 갖도록 인슐린 서열에 변이를 주어 체내 반감기가 증대된 인슐린 아날로그를 개발하였고(US 2011/0092419 A1), 또한 인슐린 아날로그에 아실화(acylation)를 통해 반감기가 추가로 증대된 인슐린을 개발하였으나(WO 2009/115469, WO2011/161125), 이는 1일 제형 이상은 되지 않는다. 한미약품은 인슐린 아날로그에 Fc 부위를 융합하여 반감기가 증가된 인슐린을 제조하였다 (KR 10-2015-0087130). 그러나, 한미약품에서 개발한 인슐린은 인슐린과 Fc를 별도로 생산하고 페길화(PEGylation) 과정을 거치므로 그 제조 방법이 복잡하다.
따라서, 상기한 문제점을 보완하기 위하여, 본 발명에서는 주사 횟수가 많아 발생되는 불편함을 최소화하고자 종래 개발된 기저 인슐린의 작용기간을 연장시키며, 제조방법도 개선된 인슐린을 개발하고자 하였다.
알부민은 혈액 중 가장 풍부한 단백질로, 많은 약물의 체내동태(pharmacokinetics)에 영향을 미치기 때문에, 신약 개발에서 약물의 알부민 결합력을 조절하고자 하는 많은 연구가 있다. 예를 들어, 지속형 인슐린의 개발을 위해 노보 노디스크(Novo Nordisk)사는 알부민에 결합력을 가진 지방산(fatty acid)을 인슐린에 아실화(acylation)하여 투여 부위인 피하조직에서 혈중으로 이행 속도를 늦출 수 있는 제품을 개발하였다 (insulin detemir, insulin degludec). 지방산의 알부민 결합력은 인슐린의 흡수율과 높은 상관관계를 보이는데 알부민 결합력이 높은 지방산을 융합하면 인슐린의 반감기가 증대된다. 예를 들어, 인슐린 디터미어는 혈중에서 알부민과 결합하여 반감기를 증대시키는 효과가 있는데, 인간 인슐린의 정맥 투여시 반감기가 2.4분인데 반해 인슐린 디터미어는 반감기가 18~25분으로 10배 이상 증가되었고, 인슐린 디글루덱은 인슐린 디터미어에 비해 알부민 친화도가 2.4배 증가되어 인슐린의 반감기가 증가되었다.
그러나 아실화 인슐린은 알부민과의 친화도(Kd)가 수 mM 수준(Biochem. J. 312, 725-731 (1995))으로 1일 제형 이상의 체내동태 프로파일을 가지지 못한다. 따라서 본 발명에서는 알부민에 대한 친화도가 pM 수준에 달하는 알부민 결합 도메인(ABD)을 이용하여 알부민에 의한 반감기 연장효과를 극대화 하고자 하였다.
따라서, 본 발명자들은 당뇨 환자들의 빈번한 인슐린 투여에 따른 번거로움을 해소하기 위하여 지속기간이 개선된 지속형 인슐린을 개발하고자 예의 노력한 결과, 천연형 인슐린의 A 쇄와 B 쇄의 일부 아미노산을 치환하고, 알부민 결합 도메인을 추가로 결합시킨 인슐린 아날로그 복합체의 생체 내 반감기가 획기적으로 증가하는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 효소 클로스트리파인(clostripain)에 의한 절단 저항성을 갖고 생체 내 반감기가 연장된 신규한 인슐린 아날로그, 상기 아날로그를 코딩하는 뉴클레오티드, 상기 뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 상기 벡터가 도입된 재조합 미생물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 효소 클로스트리파인(clostripain)에 의한 절단 저항성을 갖고 생체 내 반감기가 연장된 신규한 인슐린 아날로그 복합체, 상기 아날로그 복합체를 코딩하는 뉴클레오티드, 상기 뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 상기 벡터가 도입된 재조합 미생물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 활성형의 생체 내 반감기가 증가된 지속형 인슐린 아날로그 복합체 제조방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 천연형 인슐린에서 인슐린 B 쇄의 22번째 아미노산이 아르지닌(Arg)에서 라이신(Lys)으로 치환된 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 인슐린 B 쇄 변이를 포함하는 인슐린 아날로그를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 인슐린 아날로그를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 재조합 벡터가 도입된 재조합 미생물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 인슐린 아날로그에 알부민 결합 도메인이 결합된 지속형 인슐린 아날로그 복합체를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 인슐린 아날로그 복합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 인슐린 아날로그를 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 하기 아미노산 서열로 표시되는 알부민 결합 모티프를 포함하는 알부민 결합 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
GVSDFYKKLI XaKAKTVEGVE ALKXbXcI
상기에서, 서로 독립적으로, Xa는 D와 E로부터 선택되고; Xb는 D와 E로부터 선택되고;
Xc는 A와 E로부터 선택된다.
본 발명은 또한, 상기 재조합 벡터가 도입된 재조합 미생물을 제공한다.
본 발명은 또한,
(a) 상기 재조합 미생물을 배양하는 단계;
(b) 상기 배양된 재조합 미생물을 파쇄하여 지속형 인슐린 아날로그 복합체를 수득하는 단계;
(c) 상기 수득된 지속형 인슐린 아날로그 복합체의 재접힘을 유도하여 프리프로 형태(pre-pro form)의 인슐린 아날로그 복합체를 수득하는 단계;
(d) 상기 프리프로 형태(pre-pro form)의 인슐린 아날로그 복합체를 클로스트리파인 및 카르복시펩티다아제 B(이하 CpB)와 반응시켜 활성형으로 전환시키는 단계; 및
(e) 상기 활성형의 지속형 인슐린 아날로그 복합체를 정제하는 단계; 를 포함하는 활성형의 생체 내 반감기가 증가된 지속형 인슐린 아날로그 복합체 제조방법을 제공한다.
도 1은 인슐린 B 쇄의 22번 아르지닌(Arg)을 라이신(Lys)으로 치환하여 ABD-융합 인슐린 아날로그를 제작한 후 클로스트리파인으로 처리하여 그 안정성을 확인한 결과이다. 인슐린의 B 쇄의 22번 위치에 아르지닌(Arg)을 포함하는 경우, 절단이 발생되나 라이신(Lys)으로 치환하면 B 쇄의 절단이 현저히 감소함을 질량분석기를 통해 확인하였다.
도 2는 재조합 대장균에서 ABD-융합 인슐린 아날로그 복합체 1-10의 발현을 SDS-PAGE로 확인한 결과이다. 인슐린 서열에 하나 이상의 변이를 도입하여도 대장균에서의 단백질 발현은 유지되었다.
도 3은 ABD-융합 인슐린 아날로그 4의 가용화 및 재접힘 과정을 RP-HPLC로 모니터링 하였다. 가용화를 통해 단백질 구조를 풀어 준 후 재접힘을 유도하면 3차 구조를 형성함에 따라 RP-HPLC에서 retention time의 이동이 관찰되었다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따른 효소반응 조건에 따라 반응시켜, 활성형 인슐린 전환 효율 증가 및 불순물 감소 효과를 확인한 결과이다. (주요 불순물 분자량 10296 Da, 활성형 분자량 11238 Da)
도 5는 ABD-융합 인슐린 아날로그 4를 클로스트리파인과 CpB로 절단한 후 정제하여 SDS-PAGE로 분석한 결과이다.
도 6은 본 발명의 일실시예에 따른 ABD-융합 인슐린 아날로그에 아연(zinc)과 페놀(phenol)을 첨가하여 헥사머(hexamer) 형성 여부를 크기 배제 크로마토그래피로 분석한 결과이다.
도 7은 본 발명의 일실시예에 따른 ABD-융합 인슐린 아날로그의 혈당 강하능을 평가한 결과이다.
발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서는 천연형 인슐린의 B 쇄의 22번 아미노산이 아르지닌(Arg)에서 라이신(Lys)으로 치환되고, 천연형 인슐린의 기타 A 쇄 또는 B 쇄의 일부 아미노산이 추가로 치환되는 인슐린 아날로그의 경우 생체 내 반감기가 증가되면서도 미생물을 이용하여 용이하게 생산이 가능함을 확인하였고, 상기 인슐린 아날로그에 알부민 결합 도메인이 추가로 융합되어 있으면 생체 내 반감기가 더욱 증가될 수 있음을 확인하였다.
본 발명은 알부민에 높은 결합력을 가진 알부민 결합 도메인(ABD)을 천연형 인슐린에 융합하여 혈중으로의 이행 속도를 늦출 뿐 아니라 혈액 내 안정성을 증대함으로써 극도로 증대된 반감기를 갖는 인슐린-ABD 융합 단백질을 포함한다. 또한 천연형 인슐린의 B 쇄의 22번 아미노산이 아르지닌(Arg)에서 라이신(Lys)으로 치환 및/또는 천연형 인슐린의 기타 A 쇄 또는 B 쇄의 일부 아미노산이 치환되는 변이를 도입하여 프로테아제(protease) 절단이나 인슐린 수용체 매개 제거를 최소화 하는 인슐린 아날로그를 포함한다. 또한 본 발명은 상기 다양한 인슐린 아날로그에 알부민 결합 도메인(ABD)을 융합한 인슐린 아날로그-ABD 융합 단백질을 포함한다. 이러한 융합 단백질은 헥사머(hexamer)를 형성하는 인슐린 고유의 특성을 유지시켜 제형 연구와 흡수율 개선이 가능한 특성을 갖는다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서 천연형 인슐린에서 인슐린 B 쇄의 22번째 아미노산이 아르지닌(Arg)에서 라이신(Lys)으로 치환된 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 인슐린 B 쇄 변이를 포함하는 인슐린 아날로그에 관한 것이다. 본 발명에서 인슐린 B 쇄의 22번째 아미노산이 아르지닌(Arg)에서 라이신(Lys)으로 치환되면 효소 클로스트리파인(clostripain)에 의한 절단 저항성을 가질 수 있고, 이는 인슐린 아날로그를 인체 외의 미생물 또는 세포에서 생산하는 과정에서, 트립신 이외의 효소인 클로스트리파인(clostripain)에 의해 활성형으로 전환이 가능하게 한다.
본 발명에서, “천연형 인슐린에서 인슐린 B 쇄의 22번째 아미노산이 아르지닌(Arg)에서 라이신(Lys)으로 치환된 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 인슐린 B쇄 변이를 포함하는 인슐린 아날로그”는 천연형 인슐린 B쇄에서 22번째 아미노산이 아르지닌(Arg)에서 라이신(Lys)으로 치환된 변이 이외에도 인슐린 A쇄 또는 인슐린 B쇄의 다른 아미노산에서의 추가 변이를 포함할 수 있음을 의미한다.
본 발명에서 상기 인슐린 아날로그는 (i) 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 인슐린 A 쇄의 3번째 아미노산이 발린(Val)에서 루신(Leu)으로 치환; (ii) 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 인슐린 A 쇄의 8번째 아미노산이 트레오닌(Thr)에서 아스파르트산(Asp)으로 치환; (iii) 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 인슐린 A 쇄의 10번째 아미노산이 이소루신(Ile)에서 라이신(Lys)으로 치환; (iv) 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 인슐린 A 쇄의 14번째 아미노산이 티로신(Tyr)에서 글루탐산(Glu)으로 치환; (v) 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 인슐린 A 쇄의 19번째 아미노산이 티로신(Tyr)에서 페닐알라닌(Phe)으로 치환; (vi) 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 인슐린 B 쇄 변이의 5번째 아미노산이 히스티딘(His)에서 트레오닌(Thr)으로 치환; (vii) 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 인슐린 B 쇄 변이의 9번째 아미노산이 세린(Ser)에서 아스파르트산(Asp)으로 치환; (viii) 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 인슐린 B 쇄 변이의 13번째 아미노산이 글루탐산(Glu)에서 알라닌(Ala)으로 치환; (ix) 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 인슐린 B 쇄 변이의 17번째 아미노산이 루신(Leu)에서 글루타민(Gln)으로 치환; 및 (x) 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 인슐린 B 쇄 변이의 24번째 아미노산이 페닐알라닌(Phe)에서 세린(Ser)으로 치환된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산이 추가로 치환된 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에서 상기 인슐린 아날로그는 생체 내 반감기가 천연형 인슐린에 비해 증가된 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 생체 내 반감기가 적어도 48시간 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 72시간 이상 지속되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서 상기 인슐린 아날로그를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이고, 또 다른 관점에서 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터에 관한 것이며, 또 다른 관점에서 상기 재조합 벡터가 도입된 재조합 미생물에 관한 것이다.
한편, 본 발명은 상기 인슐린 아날로그에 알부민 결합 도메인이 결합된 지속형 인슐린 아날로그 복합체에 관한 것이다. 알부민 결합 도메인이 결합된 지속형 인슐린 아날로그 복합체는, 비교적 높은 알부민 친화성을 갖는다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 알부민 결합 도메인은 하기 아미노산 서열로 표시되는 알부민 결합 모티프를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
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상기에서, 서로 독립적으로,
Xa는 D와 E로부터 선택되고;
Xb는 D와 E로부터 선택되고;
Xc는 A 와 E로부터 선택된다.
본 발명의 일실시예에서, Xa는 D이고, Xb는 D이며, Xc는 A이다.
본 발명의 일 양태에 따른 일 실시형태에서, 상기 알부민 결합 도메인은 하기 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
LAX3AKX6X7ANX10ELDX14Y-[BM]-LX43X44LP
상기에서, [BM]은 상기에서 정의된 바와 같은 알부민 결합 모티프이고,
서로 독립적으로,
X3는 C, E, Q 및 S로부터 선택되고;
X6는 C, E 및 S로부터 선택되고;
X7는 A 및 S로부터 선택되고;
X10는 A, R 및 S로부터 선택되고;
X14는 A, C, K 및 S로부터 선택되고;
X43는 A 및 K로부터 선택되고;
X44는 A, E 및 S로부터 선택된다.
상기 알부민 결합 도메인은, 상기 알부민 결합 도메인은 서열번호 6 내지 서열번호 13의 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 상기 알부민 결합 도메인은 바람직하게는 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 인슐린 복합체 또는 인슐린 아날로그 복합체는 B-chain - C-chain - A-chain 순서의 인슐린 또는 인슐린 아날로그에서, A-chain의 C-말단에 알부민 결합 도메인을 융합하는 것이 단백질 재접힘 수율, 효소처리 수율 및 인슐린 활성의 관점에서 바람직하다. 이 경우, A-chain과 알부민 결합 도메인은 링커에 의해 융합될 수 있다.
본 발명에 따른 지속형 인슐린 아날로그 복합체의 기능은 복합체의 삼차 구조에 따라 달라진다. 따라서, 본 발명에서 지속형 인슐린 아날로그 복합체는 그 기능에 영향을 미치지 않으면서 복합체를 구성하는 아미노산 서열에 작은 변화를 줄 수 있다. 그러므로, 본 발명은 알부민 결합 특성 및 효소 절단에 대한 높은 저항성을 유지하는 알부민 결합 도메인 또는 지속형 인슐린 아날로그 복합체의 변이체를 포함한다. 예를 들어, 아미노산 잔기의 특정 기능기 그룹에 속한(예를 들어, 소수성, 친수성, 극성 등) 아미노산 잔기는 같은 기능기에 속한 다른 아미노산 잔기로 치환될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "알부민 결합"과 "알부민에 대한 결합 친화성"은 예컨대, Biacore 기기에서와 같이 표면 플라즈몬(plasmon) 공명 기술을 사용하여 시험할 수 있는 폴리펩타이드 또는 단백질의 특성을 의미한다. 예를 들면, 알부민 결합 친화성은 알부민 또는 그의 단편을 기기의 센서 칩(sensor chip) 위에 고정하고, 테스트할 폴리펩타이드 또는 단백질을 포함하는 샘플을 그 칩으로 전달하는 실험에서 테스트할 수 있다.
다른 방법으로, 테스트할 폴리펩타이드 또는 단백질은 기기의 센서 칩 위에 고정하고, 알부민을 포함한 샘플 또는 그의 단편을 칩으로 전달한다. 이와 관련하여 알부민은 인간 혈청 알부민 같은 포유동물에서 유래한 혈청 알부민일 수 있다. 당업자는 상기 실험에 의해 얻어진 결과를 해석하여 알부민에 대한 폴리펩타이드 또는 단백질의 결합 친화성의 정량적인 측정을 확립할 수 있다. 예를 들어, 상호작용에 대한 KD값 측정 같은 정량적인 측정이 요구되는 경우, 표면 플라즈몬 공명 방법을 또한 수행할 수 있다. 예컨대, 결합 값은 Biacore2000 기기(Biacore AB)를 통해 정의할 수 있다. 알부민은 측정 센서 칩에 적절히 고정하고, 친화성을 측정할 폴리펩타이드 또는 단백질 샘플은 단계희석에 의해 준비하여 임의의 순서로 주입한다. 이어서 KD값은 예를 들어 기기제조업체(Biacore AB)에 의해 제공된 BIAevaluation 4.1 소프트웨어의 1:1 Langmuir 결합 모델을 사용하여 상기 결과로부터 계산할 수 있다.
본 발명의 일 실시형태에서, 지속형 인슐린 아날로그 복합체가 결합하는 알부민은 인간 혈청 알부민, 래트(rat) 혈청 알부민, 원숭이(cynomolgus) 혈청 알부민 및 마우스(mouse) 혈청 알부민으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
하나의 특정 실시형태에서, 지속형 인슐린 아날로그 복합체가 결합하는 알부민은 인간 혈청 알부민이다.
상기 인슐린 아날로그와 알부민 결합 도메인은 펩타이드 결합; 폴리펩타이드 링커; 또는 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜-프로필렌 글리콜 공중합체, 폴리옥시에틸화폴리올, 폴리비닐알콜, 다당류, 덱스트란, 폴리비닐에틸에테르, 생분해성 고분자, 지방산, 뉴클레오티드, 지질중합체, 키틴, 히아루론산 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 비펩타이드성 링커를 통해 서로 결합된 것을 특징으로 할 수 있으나 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에서 인슐린 아날로그와 알부민 결합 도메인 사이에는 (GGGGS)n (여기서, n=1 내지 6의 정수) 서열이 반복된 링커가 삽입될 수 있다. 이는 링커가 도입되지 않으면 재접힘 수율이 낮았으나, (GGGGS) 서열이 2번 이상 반복될 경우 재접힘 수율에는 큰 차이를 보이지 않는다는 실험결과에 따른 것이다. 한편, n수가 증가할수록 클로스트리파인에 의한 활성형 인슐린 전환율이 높게 나타났으나 체내동태에는 큰 영향을 미치지 않았다. 상기와 같은 결과를 종합하면, 링커는 GGGGS 서열이 2 내지 4번 반복된 형태로 구성하는 것이 바람직하다.
따라서, 본 발명에서 인슐린 아날로그와 알부민 결합 도메인은 폴리펩타이드 링커에 의해 서로 결합될 수 있으며, 상기 폴리펩타이드 링커는 (GGGGS)n (n은 1 내지 6의 정수)일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 바람직하게, 상기 폴리펩타이드 링커는 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시될 수 있다.
본 발명은 또한 다른 관점에서 인슐린 아날로그를 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 하기 아미노산 서열로 표시되는 알부민 결합 모티프를 포함하는 알부민 결합 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터에 관한 것이다.
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상기에서, 서로 독립적으로,
Xa는 D와 E로부터 선택되고;
Xb는 D와 E로부터 선택되고;
Xc는 A와 E로부터 선택된다.
본 발명의 양태에 따른 일 실시형태에서, 상기 알부민 결합 도메인은 하기 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
LAX3AKX6X7ANX10ELDX14Y-[BM]-LX43X44LP
상기에서, [BM]은 상기에서 정의된 바와 같은 알부민 결합 모티프이고,
서로 독립적으로,
X3는 C, E, Q 및 S로부터 선택되고;
X6는 C, E 및 S로부터 선택되고;
X7는 A 및 S로부터 선택되고;
X10는 A, R 및 S로부터 선택되고;
X14는 A, C, K 및 S로부터 선택되고;
X43는 A 및 K로부터 선택되고;
X44는 A, E 및 S로부터 선택된다.
상기 알부민 결합 도메인은, 서열번호 6 내지 서열번호 13의 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 상기 알부민 결합 도메인은 바람직하게는 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 인슐린 아날로그를 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 알부민 결합 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드는 상기 인슐린 아날로그와 알부민 결합 도메인이 융합되어 발현될 수 있도록 재조합 벡터에 도입된 것일 수 있다.
재조합 벡터에 도입된 알부민 결합 도메인에 대한 그 밖의 설명은 상기, 지속형 인슐린 아날로그 복합체를 구성하는 알부민 결합 도메인에 대한 설명과 중복되는바, 그 기재를 생략한다. 또한, 인슐린 아날로그를 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 알부민 결합 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드 사이에는 상기 폴리펩타이드 링커를 코딩하는 뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 폴리펩타이드 링커에 대한 설명도 지속형 인슐린 아날로그 복합체를 구성하는 폴리펩타이드 링커의 설명과 중복되는바, 그 기재를 생략하기로 한다.
한편, 본 발명의 명세서에 있어서, 알부민 결합 모티프 및 알부민 결합 도메인(또는, 알부민 결합 폴리펩타이드)에 관한 설명은 국제공개특허 WO2014048977에 상응하는 대한민국 공개특허 10-2015-0058454호에 기재된 내용을 포함하는 것으로 한다.
본 발명에 따른 재조합 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있고, 원핵세포 또는 진핵세포를 숙주세포로 사용하기 위한 벡터로서 구축될 수 있다.
본 발명에서 용어, "벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 재조합 벡터로서, 핵산 삽입물이 발현되도록 작동 가능하게 연결된 필수적인 조절요소를 포함하는 핵산 구조물(construct)을 의미한다. 본 발명은 인슐린 아날로그 또는 이의 아날로그 복합체를 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 벡터를 제조할 수 있는데, 상기 재조합 벡터를 숙주세포에 형질전환(transformation) 또는 형질감염(transfection) 시킴으로써, 본 발명의 인슐린 아날로그 및/또는 이의 아날로그 복합체를 수득할 수 있다.
본 발명에서 인슐린 아날로그 및/또는 이의 아날로그 복합체를 코딩하는 핵산은 핵산 발현 조절서열에 작동 가능하게 연결된다. 본 발명에서 용어, "작동 가능하게 연결된(operatively linked)"은 핵산 발현 조절서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 라이보좀 결합부위, 전사 종결서열 등)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.
본 발명에서 용어, "프로모터"는 폴리머라제에 대한 결합 부위를 포함하고 프로모터 하위 유전자의 mRNA로의 전사 개시 활성을 가지는, 코딩 영역의 상위(upstream)의 비해독된 핵산 서열, 즉, 폴리머라제가 결합하여 유전자의 전사를 개시하도록 하는 DNA 영역을 말하며, mRNA 전사 개시부위의 5'-부위에 위치한다.
예를 들어, 본 발명의 벡터가 재조합 벡터이고 원핵세포를 숙주로 하는 경우에, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예: tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, pLλ프로모터, pRλ프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로모터, trp 프로모터, trc 프로모터, phoA 프로모터, araBAD 프로모터, T5 프로모터 및 T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합부위 및 전사/해독 종결서열을 포함하는 것이 일반적이다.
또한, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드(예: pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈, pPICZα 시리즈, pUC19 등), 파지(예: λgt4·λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스(예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
한편, 본 발명의 벡터가 재조합 벡터이고 진핵세포를 숙주로 하는 경우에, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터(예: 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 우두바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열(예: 소성장 호르몬 터미네이터 및 SV40 유래 폴리 아데닐화 서열)을 일반적으로 갖는다.
또한, 본 발명의 재조합 벡터는 선택 마커로서 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 또는 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 사용될 수 있다.
본 발명의 재조합 벡터는 회수되는 목적 단백질, 즉 인슐린 아날로그 및/또는 인슐린 아날로그 복합체의 정제를 용이하게 하기 위하여 필요에 따라 다른 서열을 추가로 포함할 수 있다. 상기 추가로 포함될 수 있는 서열은 단백질 정제용 태그 서열일 수 있으며, 예컨대, 글루타티온 S-트랜스퍼라제(Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질(NEB, USA), FLAG(IBI, USA) 및 6개 히스티딘(hexahistidine) 등이 있으나, 상기 예들에 의하여 목적 단백질의 정제를 위하여 필요한 서열의 종류가 제한되는 것은 아니다. 상기와 같은 태그 서열을 포함하는 재조합 벡터에 의해 발현된 융합 단백질은 친화성 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다. 예컨대, 글루타티온-S-트랜스퍼라제가 융합된 경우에는 이 효소의 기질인 글루타티온을 이용할 수 있고, 6개 히스티딘 태그가 이용된 경우에는 Ni-NTA 칼럼을 이용하여 원하는 목적 단백질을 용이하게 회수할 수 있다. 상기 인슐린 아날로그 및/또는 인슐린 아날로그 복합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 이용하여, 상기 벡터가 형질전환된 재조합 미생물이 구축될 수 있다.
본 발명에서 용어, "형질전환(transformation)"이란 DNA를 숙주세포 내로 도입하여 DNA가 염색체의 인자로서 또는 염색체 통합 완성에 의해 복제 가능하게 되는 것으로, 외부의 DNA를 세포 내로 도입하여 인위적으로 유전적인 변화를 일으키는 현상을 의미한다.
본 발명의 형질전환 방법은 임의의 형질전환 방법이 사용될 수 있으며, 당업계의 통상적인 방법에 따라 용이하게 수행할 수 있다. 일반적으로 형질전환 방법에는 CaCl2 침전법, CaCl2 침전법에 DMSO(dimethyl sulfoxide)라는 환원물질을 사용함으로써 효율을 높인 Hanahan 방법, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘 침전법, 원형질 융합법, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반법, 아그로박테리아 매개 형질전환법, PEG를 이용한 형질전환법, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환법 등이 있다.
본 발명에 따른 인슐린 아날로그 및/또는 인슐린 아날로그 복합체를 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 벡터를 형질전환시키기 위한 방법은 상기 예들에 국한되지 않으며, 당업계에서 통상적으로 사용되는 형질전환 또는 형질감염 방법이 제한 없이 사용될 수 있다.
목적 핵산인 인슐린 아날로그 및/또는 인슐린 아날로그 복합체를 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 벡터를 숙주세포 내로 도입함으로써 본 발명의 형질전환체(transformant)를 획득할 수 있다.
본 발명에 적합한 숙주는 본 발명의 핵산을 발현하도록 하는 한 특별히 제한되지 않는다. 본 발명에 사용될 수 있는 숙주의 특정한 예로는 대장균(E. coli)과 같은 에스케리키아(Escherichia) 속 세균; 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)와 같은 바실러스(Bacillus) 속 세균; 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)와 같은 슈도모나스(Pseudomonas) 속 세균; 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)와 같은 효모; 스포도프테라 프루기페르다(SF9)와 같은 곤충세포; 및 CHO, COS, BSC 등과 같은 동물세포가 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또 다른 관점에서 상기 인슐린 아날로그 또는 상기 인슐린 아날로그 복합체를 포함하는 당뇨병 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또 다른 관점에서 상기 인슐린 아날로그 또는 상기 인슐린 아날로그 복합체를 혈당 조절이 필요한 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 당뇨병 치료방법을 제공한다.
본 발명은 또 다른 관점에서 당뇨병 치료에 사용하기 위한 상기 인슐린 아날로그 또는 상기 인슐린 아날로그 복합체의 용도를 제공한다.
본 발명은 또 다른 관점에서 당뇨병 치료를 위한 의약품 제조를 위한 상기 인슐린 아날로그 또는 상기 인슐린 아날로그 복합체의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 상기 재조합 미생물을 배양하는 단계; (b) 상기 배양된 재조합 미생물을 파쇄하여 지속형 인슐린 아날로그 복합체를 수득하는 단계; (c) 상기 수득된 지속형 인슐린 아날로그 복합체의 재접힘을 유도하여 프리프로 형태(pre-pro form)의 인슐린 아날로그 복합체를 수득하는 단계; (d) 상기 프리프로 형태(pre-pro form)의 인슐린 아날로그 복합체를 클로스트리파인 및 CpB와 반응시켜 활성형으로 전환시키는 단계; 및 (e) 상기 활성형의 지속형 인슐린 아날로그 복합체를 정제하는 단계를 포함하는 활성형의 생체 내 반감기가 증가된 지속형 인슐린 아날로그 복합체 제조방법을 제공한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예에서, ABD-융합 인슐린 아날로그는 본 발명에서 지속형 인슐린 아날로그 복합체와 동일한 의미로 사용된다.
실시예 1. ABD-융합 인슐린의 발현 벡터 및 균주 제작
인간의 인슐린은 프리프로인슐린(pre-pro-insulin) 형태로 만들어져 소포체에서 프리-서열(pre sequence)이 잘려나가고, 골지체와 소포 내에서 프로세싱되어 성숙된 형태의 인슐린을 형성하게 된다. 이를 응용하여 프로인슐린 형태로 대장균에서 단백질을 발현시킨 후 트립신을 이용하여 C 쇄를 잘라내는 공정으로 재조합 인슐린을 생산하고자, 프로인슐린을 설계하였다. 대장균에서 프로인슐린의 발현 효율 및 정제 효율을 높이기 위하여 N-말단에는 융합 태그(fusion tag)를 삽입하였고, 코돈 최적화(codon optimization)하였다.
인슐린에 ABD(albumin biding domain)를 융합시킬 수 있는 부위는 이론적으로 4개 부위이지만, A 쇄의 N 말단은 인슐린의 활성에 중요한 위치이므로 융합 위치에서 제외하였고, B 쇄의 N 말단은 인슐린 헥사머 형성에 중요하지만 인슐린의 활성은 유지될 수 있으므로 융합 위치에 포함시켰다. 인슐린 B 쇄와 C 쇄 사이에 ABD가 삽입되는 경우 단백질 폴딩에 영향을 줄 것으로 판단되어 이러한 구조는 배제하였으며, 이에 B-C-A 쇄 혹은 A-C-B 쇄의 순서로 후보물질을 디자인하였고, 최종적으로 하기 3가지 형태로 ABD-융합 인슐린의 발현을 위한 유전자 구조를 설계하였다.
Figure PCTKR2019008953-appb-I000001
발현 벡터로는 pJ401(DNA 2.0) 벡터를 사용하였으며 벡터를 제한효소 NdeI과 EcoRI으로 절단한 후, 1% 아가로스 겔 상에서 전기영동하여 DNA 절편을 분리하였다. ABD-융합 인슐린 발현을 위한 상기 유전자 구조와 상기와 같이 발현 벡터에서 얻은 DNA 절편을 T4 DNA 리가제로 연결하여 플라스미드를 제작한 후, 염화칼슘법으로 각 플라스미드를 도입하여 대장균 BL21(DE3)을 형질전환시켰다. 카나마이신에 저항성을 지닌 형질전환된 균주를 선별하고 플라스미드 DNA를 분리하여, 제한효소 절단에 의한 분석방법으로 원하는 DNA가 제대로 삽입되었는지를 확인하였다.
NdeI - Fusion tag - ABD - Linker - B-chain - C-chain - A-chain - EcoRI 유전자 구조로 설계하였을 경우 단백질 재접힘 수율이 매우 낮아 본 발명에 적합하지 않은 것으로 판단되었다. 또한. NdeI - Fusion tag - A-chain - C-chain - B-chain - Linker - ABD - EcoRI 구조의 유전자로 ABD-융합 인슐린을 제조하였을 경우 인슐린의 활성은 확인되었으나, 재접힘과 효소처리 수율이 낮아 활성형 인슐린 제조방법으로 적절치 않음을 확인하였다. 그러므로 상기 3가지 형태의 ABD-융합 인슐린 중, NdeI - Fusion tag - B-chain - C-chain - A-chain - Linker - ABD - EcoRI 구조를 선택하여 이후 실험을 진행하였다.
A 쇄와 알부민 결합 도메인(ABD) 사이에는 (GGGGS) 서열이 1 내지 6회 반복된 링커를 삽입하였다. 이 경우, 링커가 없으면 재접힘 수율이 매우 낮았었고, (GGGGS) 서열이 2번 이상 반복될 경우 재접힘 수율에는 큰 차이를 보이지 않았다. 한편, (GGGGS)n 서열에서 n수가 증가할수록 클로스트리파인에 의한 활성형 인슐린 전환율이 높아졌으나 체내동태에는 큰 영향을 미치지 않았다. 이상 결과를 종합하여 링커는 GGGGS 서열이 2~4번 반복된 형태로 구성 하였다.
본 발명에서 사용된 ABD-융합 인슐린을 구성하는 해당 부위의 아미노산 서열은 하기와 같다.
Figure PCTKR2019008953-appb-T000001
실시예 2. 인슐린 아미노산 서열이 변경된 ABD-융합 인슐린 아날로그 제작
재조합 대장균를 이용한 인슐린 제조에는 트립신을 이용하여 프로인슐린을 활성형으로 전환하는 과정이 필요하다. 그러나 트립신은 이염기성(di-basic) 아미노산을 높은 효율로 절단하며 단일 아미노산인 라이신(Lys)이나 아르지닌(Arg) 부위도 절단하기 때문에 온전한 활성형의 인슐린을 제조하기 어렵고, ABD 서열 내에도 다수의 라이신(Lys)과 아르지닌(Arg) 잔기가 포함되어 있어 트립신을 이용하여 활성을 갖는 온전한 ABD-융합 인슐린을 제조하는 것은 더욱 어렵다.
이에 트립신을 대체할 수 있는 효소로 클로스트리파인(clostripain)을 활용하여 활성형 전환을 유도하고자 하였다. 이 경우, 클로스트리파인은 ABD-융합 인슐린과 반응하면 인슐린 B 쇄의 22번 위치의 아르지닌(Arg)에 절단이 발생하였다. 이를 해결하고자, B 쇄 22번 위치를 라이신(Lys)으로 치환한 결과 클로스트리파인에 의한 인슐린 B 쇄의 22번 위치에서의 절단이 현저히 감소하여 ABD가 융합된 활성형 인슐린을 효과적으로 제조할 수 있었다(도 1).
상기 변이와 더불어, ABD-융합 인슐린의 안정성과 생체 내 반감기를 보다 향상시키기 위하여 인슐린에 추가 변이를 도입하였다. A 쇄와 B 쇄에 각각 5개의 아미노산을 치환하였으며, 치환된 위치는 하기 표 2와 같다.
Figure PCTKR2019008953-appb-T000002
대장균에서 유전자 발현을 위한 코돈 최적화는 GeneArt사의 알고리즘에 따라 수행하였으며 치환된 아미노산을 갖도록 유전자를 합성하였다.
이와 같이 제작된 플라스미드는 실시예 1에 기재된 방식과 동일하게 대장균 BL21(DE3)에 도입하여 재조합 대장균을 제작하였다.
실시예 3. ABD-융합 인슐린 아날로그의 발현
ABD-융합 인슐린 아날로그의 발현을 위하여, 각 재조합 대장균 균주를 100 mL LB 배지에 접종하고 37℃에서 16시간 동안 진탕 배양하여 종 배양액으로 사용하였다. 7 L 발효기(New Brunswick BioFlo)에 2 L의 LB 배지를 넣고 멸균 후 종 배양액을 접종하였다. 배양 시 조건은 온도 35℃공기량 3 vvm, 교반 속도 1,000 rpm로 하고, pH는 6.8이 유지되도록 암모니아와 인산으로 조절하였다. 배지의 탄소원이 고갈될 시점에 feeding을 시작하고 동시에 IPTG로 단백질 발현을 유도하였다. 발현 유도 후 10시간 추가 배양하였고 원심 분리기를 이용하여 재조합 균체를 회수하였다.
ABD-융합 인슐린 아날로그는 대장균에서 봉입체(inclusion body)로 발현되었으며 인슐린 부위 아미노산 부위의 변이를 도입하여도 본 발명에서 사용하는 벡터시스템 내에서 유사한 발현수준을 나타내었다(도 2).
실시예 4. 세포 파쇄 및 가용화/재접힘 유도
ABD-융합 인슐린 또는 ABD-융합 인슐린 아날로그를 발현하는 균체를 각각 파쇄버퍼 (20 mM Tris, 10 mM EDTA, 10% sucrose, 0.2 M NaCl, pH 8.0)에 현탁하고 고압균질기를 이용하여 세포를 파쇄하였다. 파쇄액을 고속 원심분리기에서 7,000 rpm으로 원심분리하고, 용해성 단백질과 일부 세포파편을 제거하여, 봉입체 가 포함된 침전물을 분리하였다. 분리된 봉입체는, 1% Triton X-100, 0.2 M NaCl, 1M Urea를 포함하는 버퍼에 세척한 후, 7,000 rpm에서 원심분리 하였다. 침전된 봉입체는 증류수로 2회 추가 세척한 후 사용시까지 -80℃에 보관하였다.
냉동 보관한 봉입체를 가용화 버퍼 (25 mM Tris, 8 M Urea, 30 mM cysteine-HCl, pH 10.5)에 넣어 용해시킨 후 재접힘 버퍼(25 mM Tris-HCl, pH 10.5)에 희석하고 4°C에서 16 시간 재접힘을 수행하였다. 재접힘 여부는 RP-HPLC 분석을 통하여 확인하였는데, 가용화 용액을 RP-HPLC에서 분석시 소수성이 높아 20분대에서 단백질 피크가 관찰되었고, 재접힘액은 16분대로 피크가 이동함을 관찰하였다 (도 3). 이는 재접힘이 진행되면 가용화 상태에 비해 소수성이 감소하기 때문이다. 재접힘은 RP-HPLC분석시 단백질 피크의 이동이 더 이상 관찰되지 않을 때까지 진행하였다.
실시예 5. 효소를 이용한 활성형 전환
재조합 대장균을 이용한 인슐린의 제조에는 트립신을 이용한 프로인슐린의 활성형으로의 전환이 요구되나, ABD-융합 인슐린 또는 ABD-융합 인슐린 아날로그는 그 서열 내에 트립신에 의한 다수의 절단 부위를 가지고 있으므로, 트립신을 대체 가능한 효소로 클로스트리파인(clostripain)을 이용하여 활성형 전환을 유도하고자 하였다.
클로스트리파인을 이용하여 활성형 전환을 유도할 때 인슐린 B 사슬의 22번 위치에서 절단이 일어나 온전한 형태의 인슐린을 제조하기 어렵기 때문에, B 사슬 22번 위치를 아르지닌(Arg)에서 라이신(Lys)으로 치환한 ABD-융합 인슐린 아날로그를 활용하여 활성형의 인슐린을 제조하고자 하였다.
클로스트리파인은 활성 부위에 시스테인(Cys)을 포함하고 있어 효소의 활성을 나타내기 위해서는 환원조건을 필요로 한다. 또한, 클로스트리파인 활성 유지를 위해 재접힘 용액에 환원제를 처리한다면 인슐린 부위의 이황화 결합이 끊어질 가능성이 높다. 이에 이황화 결합의 절단 없이 효소반응 수율을 높이는 조건 도출이 요구되는바, 효소반응액에 포함될 환원제인 DTT를 사용하여 실험하였다.
클로스트리파인은 전구체(pro-form) 형태로 존재하기 때문에 자가절단(auto-cleavage)을 유도하여 활성화시켰다. 이를 위해서 동결 건조된 클로스트리파인(Worthington, USA)을 증류수에 녹인 후 활성화 버퍼 (500 mM Tris, 50 mM DTT, 25 mM CaCl2 pH 7.8)를 가하여 4℃에서 30분간 활성화 하였다. 재접힘된 단백질 1 mg당 0.1~5 unit 되도록 활성화된 클로스트리파인을 첨가하고 25~40℃에서 2~8시간 반응시켰다. 클로스트리파인 반응 후 CpB를 단백질 1 mg당 0.001~1 unit 되도록 첨가하여 추가 반응하였다. 효소반응은 HCl을 이용하여 pH를 3.5 이하로 낮추어 중단되도록 하였다.
그 결과, 도 4에서와 같이, 효소 반응에 따라 활성형 인슐린 전환 효율 증가 및 불순물 감소 효과를 확인할 수 있었다.
실시예 6. ABD-융합 인슐린 정제
클로스트리파인과 CpB를 이용하여 효소처리된 샘플을 Fractogel® EMD COO- (M) (Merck사) 이온교환 수지 크로마토그래피를 사용하여 제조자 방식에 따라 1차 정제한 후 Pharmprep® P100 RP-18e (Merck사)을 역상 크로마토그래피로 사용하여 제조자 방식에 따라 2차 정제하였다.
그 결과, 도 5에서와 같이 2번의 정제 과정을 통해 불순물이 없는 활성형 ABD-융합 인슐린을 정제할 수 있었다.
실시예 7. ABD-융합 인슐린 아날로그의 알부민 결합력 측정
ABD-융합 인슐린 아날로그 단백질의 알부민 결합력을 측정하기 위하여, 표면 플라스몬 공명SPR, BIACORE 3000, GE healthcare) 분석법을 이용하였다. CM5칩에 재조합 인간 혈청 알부민을 아민 커플링 방법으로 고정화 시키고, 5개 이상의 농도로 희석한 ABD 또는 ABD-융합 인슐린 아날로그를 결합시켜 인간 혈청 알부민에 대한 친화도를 확인하였다.
그 결과, 하기 표 3에서와 같이, ABD 대비 친화도가 낮아졌으나 pM 수준의 알부민 결합력이 유지됨을 확인할 수 있었다.
Figure PCTKR2019008953-appb-T000003
실시예 8. 천연형 인슐린, ABD-융합 인슐린 아날로그의 수용체 친화도 비교
천연형 인슐린, ABD-융합 인슐린 아날로그의 인슐린 수용체 결합력을 측정하기 위하여, 표면 플라스몬 공명(SPR, BIACORE 3000, GE healthcare) 분석법을 이용하였다. CM5칩에 인슐린 수용체를 아민 커플링 방법으로 고정화 시키고, 5개 이상의 농도로 희석한 천연형 인슐린, ABD-융합 인슐린 아날로그를 각각 결합시켜 인슐린 수용체 친화도를 확인하였다.
그 결과 표 4에 나타난 바와 같이, 천연형 인슐린 대비 대부분의 ABD-융합 인슐린 아날로그의 친화도가 감소되었는데 가장 큰 감소폭을 보이는 아날로그 3이 천연형 인슐린 대비 19.4% 수준으로 확인되었다.
Figure PCTKR2019008953-appb-T000004
ABD-융합 인슐린 아날로그의 약효는 streptozotocin로 유도한 1형 당뇨모델에서 인슐린 글라진과 비교 평가하였다. 인슐린 글라진 대비 50% 이하의 혈당 강하능을 보이는 아날로그 1번과 3번 그리고 10번은 후보물질에서 제외하였다.
실시예 9. Hexamer 형성
인슐린은 체내에서 아연(zinc)과 결합하여 헥사머(hexamer)를 형성함으로써 안정된 구조를 갖는다. 헥사머(Hexamer)를 이루는 인슐린의 특성은 제형연구에도 활용되며 체내의 반감기를 증대 시키는데 중요한 역할을 할 수 있다. 이에 ABD-융합 인슐린 아날로그가 헥사머(hexamer) 형성의 특성을 유지하고 있는지 크기 배제 크로마토그래피 (size exclusion chromatography)로 분석하였다. 그 결과, 아날로그 4는 아연(zinc)과 페놀(phenol) 첨가에 따라 헥사머(hexamer)를 형성능을 유지하고 있음을 확인하였다(도 6). Hexamer의 형성은 아날로그 7번, 9번, 10번을 제외한 모든 아날로그에서도 확인되었다. 이에, 표 2의 서열을 가진 아날로그 중 아날로그 7번과 9번은 hexamer를 형성하지 않는 것으로 확인되어 후보물질에서 추가로 제외하였다.
실시예 10. ABD-융합 인슐린 아날로그의 체내동태 (pharmacokinetics) 및 혈당 강하능 평가
ABD-융합 인슐린 아날로그 6종의 체내동태를 확인하기 위해 정상 랫트 (SD rat, 6주령)에 피하 투여한 후 0, 1, 4, 8, 24, 48, 72, 96 시간에 채혈하였다. 각 시간에서의 ABD-융합 인슐린 아날로그의 혈중 내 잔여 농도는 ELISA를 이용하여 측정하였다. 또한, 채혈된 일부의 혈액을 이용하여 시간에 따른 혈당 수준을 혈당측정기를 이용하여 측정하였다.
그 결과, 하기 표 5에서 볼 수 있듯이, 천연형 인슐린의 반감기가 5분으로 알려져 있는 것과 비교하여 ABD가 융합된 인슐린은 크게 증가된 반감기를 나타냈다. 인슐린 B쇄 22번만 치환한 아날로그 11은 7.2 시간의 반감기를 보였으며, 가장 큰 반감기 증대를 보인 아날로그 4는 9.9시간의 반감기를 갖는 것으로 평가 되었다.
정상 동물에서 혈당을 낮추어 유지시키는 시간을 분석했을 때, 아날로그 5번, 6번, 8번은 반감기의 증대가 확인되었지만 혈당 유지시간이 짧은 것으로 나타났다. 이에 반해 아날로그 4는 혈당을 낮추는 능력도 가장 우수하였으며 약효 유지시간도 가장 오래 지속되는 것을 확인하였다 (도 7).
Figure PCTKR2019008953-appb-T000005
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 청구항들과 그들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
본 발명에 따른 인슐린 아날로그 또는 인슐린 아날로그 복합체는 종래 사용되던 인슐린이나 인슐린 아날로그, 기타 인슐린 복합체에 비해 생체 내 반감기가 현저히 증가되고, 그 안정성이 증대되어, 한 번의 주사로도 장기간 효과가 지속될 수 있는 장점이 있는바, 직접 인슐린을 주사제를 투여하는 당뇨 환자들에게 편의를 제공할 수 있다.
전자파일 첨부하였음.

Claims (21)

  1. 천연형 인슐린에서 인슐린 B 쇄의 22번째 아미노산이 아르지닌(Arg)에서 라이신(Lys)으로 치환된 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 인슐린 B 쇄 변이를 포함하는 인슐린 아날로그.
  2. 제1항에 있어서, 상기 인슐린 아날로그는 효소 클로스트리파인(clostripain)에 의한 절단 저항성을 갖는 것을 특징으로 하는 인슐린 아날로그.
  3. 제1항에 있어서, 상기 인슐린 아날로그는 하기 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산이 추가로 치환된 것을 특징으로 하는 인슐린 아날로그:
    서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 인슐린 A 쇄의 3번째 아미노산이 발린(Val)에서 루신(Leu)으로 치환;
    서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 인슐린 A 쇄의 8번째 아미노산이 트레오닌(Thr)에서 아스파르트산(Asp)으로 치환;
    서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 인슐린 A 쇄의 10번째 아미노산이 이소루신(Ile)에서 라이신(Lys)으로 치환;
    서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 인슐린 A 쇄의 14번째 아미노산이 티로신(Tyr)에서 글루탐산(Glu)으로 치환;
    서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 인슐린 A 쇄의 19번째 아미노산이 티로신(Tyr)에서 페닐알라닌(Phe)으로 치환;
    서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 인슐린 B 쇄 변이의 5번째 아미노산이 히스티딘(His)에서 트레오닌(Thr)으로 치환;
    서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 인슐린 B 쇄 변이의 9번째 아미노산이 세린(Ser)에서 아스파르트산(Asp)으로 치환;
    서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 인슐린 B 쇄 변이의 13번째 아미노산이 글루탐산(Glu)에서 알라닌(Ala)으로 치환;
    서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 인슐린 B 쇄 변이의 17번째 아미노산이 루신(Leu)에서 글루타민(Gln)으로 치환; 및
    서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 인슐린 B 쇄 변이의 24번째 아미노산이 페닐알라닌(Phe)에서 세린(Ser)으로 치환.
  4. 제3항에 있어서, 상기 인슐린 아날로그는 생체 내 반감기가 천연형 인슐린에 비해 증가된 것을 특징으로 하는 인슐린 아날로그.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 인슐린 아날로그를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  6. 제5항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터.
  7. 제6항의 재조합 벡터가 도입된 재조합 미생물.
  8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 인슐린 아날로그에 알부민 결합 도메인이 결합된 지속형 인슐린 아날로그 복합체.
  9. 제8항에 있어서, 상기 알부민 결합 도메인은 하기 아미노산 서열로 표시되는 알부민 결합 모티프를 포함하는 것을 특징으로 하는 지속형 인슐린 아날로그 복합체.
    GVSDFYKKLI XaKAKTVEGVE ALKXbXcI
    상기에서, 서로 독립적으로,
    Xa는 D와 E로부터 선택되고;
    Xb는 D와 E로부터 선택되고;
    Xc는 A와 E로부터 선택된다.
  10. 제9항에 있어서, 상기 알부민 결합 도메인은 하기 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 지속형 인슐린 아날로그 복합체.
    LAX3AKX6X7ANX10ELDX14Y-[BM]-LX43X44LP
    상기에서, [BM]은 제9항에서 정의된 바와 같은 알부민 결합 모티프이고,
    서로 독립적으로,
    X3는 C, E, Q 및 S로부터 선택되고;
    X6는 C, E 및 S로부터 선택되고;
    X7는 A 및 S로부터 선택되고;
    X10는 A, R 및 S로부터 선택되고;
    X14는 A, C, K 및 S로부터 선택되고;
    X43는 A 및 K로부터 선택되고;
    X44는 A, E 및 S로부터 선택된다.
  11. 제10항에 있어서, 상기 알부민 결합 도메인은, 서열번호 6 내지 서열번호 13의 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 지속형 인슐린 아날로그 복합체.
  12. 제11항에 있어서, 상기 알부민 결합 도메인은 서열번호 6의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 지속형 인슐린 아날로그 복합체.
  13. 제8항에 있어서, 상기 인슐린 아날로그와 알부민 결합 도메인은 펩타이드 결합; 폴리펩타이드 링커; 또는 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜-프로필렌 글리콜 공중합체, 폴리옥시에틸화폴리올, 폴리비닐알콜, 다당류, 덱스트란, 폴리비닐에틸에테르, 생분해성 고분자, 지방산, 뉴클레오티드, 지질중합체, 키틴, 히아루론산 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 비펩타이드성 링커를 통해 서로 결합된 것을 특징으로 하는 지속형 인슐린 아날로그 복합체.
  14. 제13항에 있어서, 상기 폴리펩타이드 링커는 (GGGGS)n (n은 1 내지 6의 정수)인 것을 특징으로 하는 지속형 인슐린 아날로그 복합체.
  15. 제14항에 있어서, 상기 폴리펩타이드 링커는 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 지속형 인슐린 아날로그 복합체.
  16. 제5항의 폴리뉴클레오티드와 하기 아미노산 서열로 표시되는 알부민 결합 모티프를 포함하는 알부민 결합 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터.
    GVSDFYKKLI XaKAKTVEGVE ALKXbXcI
    상기에서, 서로 독립적으로,
    Xa는 D와 E로부터 선택되고;
    Xb는 D와 E로부터 선택되고;
    Xc는 A와 E로부터 선택된다.
  17. 제16항에 있어서, 상기 알부민 결합 도메인은 하기 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
    LAX3AKX6X7ANX10ELDX14Y-[BM]-LX43X44LP
    상기에서, [BM]은 제16항에서 정의된 바와 같은 알부민 결합 모티프이고,
    서로 독립적으로,
    X3는 C, E, Q 및 S로부터 선택되고;
    X6는 C, E 및 S로부터 선택되고;
    X7는 A 및 S로부터 선택되고;
    X10는 A, R 및 S로부터 선택되고;
    X14는 A, C, K 및 S로부터 선택되고;
    X43는 A 및 K로부터 선택되고;
    X44는 A, E 및 S로부터 선택된다.
  18. 제17항에 있어서, 상기 알부민 결합 도메인은 서열번호 6 내지 서열번호 13의 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
  19. 제18항에 있어서, 상기 알부민 결합 도메인은 서열번호 6의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
  20. 제16항의 재조합 벡터가 도입된 재조합 미생물.
  21. 다음 단계를 포함하는 활성형의 생체 내 반감기가 증가된 지속형 인슐린 아날로그 복합체 제조방법:
    (a) 제20항의 재조합 미생물을 배양하는 단계;
    (b) 상기 배양된 재조합 미생물을 파쇄하여 지속형 인슐린 아날로그 복합체를 수득하는 단계;
    (c) 상기 수득된 지속형 인슐린 아날로그 복합체의 재접힘을 유도하여 프리프로 형태(pre-pro form)의 인슐린 아날로그 복합체를 수득하는 단계;
    (d) 상기 프리프로 형태(pre-pro form)의 인슐린 아날로그 복합체를 클로스트리파인 및 CpB와 반응시켜 활성형으로 전환시키는 단계; 및
    (e) 상기 활성형의 지속형 인슐린 아날로그 복합체를 정제하는 단계.
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