TW202019953A - 長效型胰島素類似物及其衍生物 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於具有增加之體內半衰期的長效型胰島素類似物，其中在天然胰島素B鏈之胺基酸第22號位的胺基酸被取代，且在天然胰島素A鏈或B鏈的一個或多個胺基酸被額外取代，而且本發明關於具有進一步增加之體內半衰期的長效型胰島素類似物衍生物，其中白蛋白結合域額外融合於長效型胰島素類似物。根據本發明之胰島素類似物或島素類似物衍生物具有顯著增加的體內半衰期，故對於經由注射自行給予胰島素的糖尿病患者提供便利性。

Description

長效型胰島素類似物及其衍生物
本發明係關於長效型胰島素類似物和其衍生物，尤其係關於具有增加之體內半衰期的長效型胰島素類似物，其中在天然胰島素B鏈第22號位的胺基酸被取代，且在天然胰島素中A鏈或B鏈的一個或多個胺基酸被額外取代，而且本發明尤其係關於具有進一步增加之半衰期的長效型胰島素類似物衍生物，其中白蛋白結合域額外融合於長效型胰島素類似物。
糖尿病(diabetes)是一種代謝疾病，其特徵為高葡萄糖濃度，糖尿病由遺傳與環境因素結合發展而成。糖尿病包含第一型糖尿病(type 1 diabetes)、第二型糖尿病(type 2 diabetes)、妊娠糖尿病(gestational diabetes)以及其他造成高血糖的狀態。糖尿病是指一種代謝異常，其中胰臟產生之胰島素的量不足或人體細胞無法對胰島素產生適當的反應，因而細胞吸收葡萄糖的能力受損。因此，葡萄糖在血液中累積。
第一型糖尿病，亦稱為胰島素依賴型糖尿病(insulin-dependent diabetes mellitus，IDDM)和青少年發病型糖尿病(adolescent-onset diabetes)，由β細胞損壞而造成，導致絕對胰島素缺乏。另一方面，第二型糖尿病，被稱為非胰島素依賴型糖尿病(non-insulin dependent diabetes mellitus，NIDDM)和成人發病型糖尿病(adult-onset diabetes)，與主要胰島素抗性(insulin resistance)相關，故為相對胰島素缺乏及/或具胰島素抗性的主要胰島素分泌缺陷。
尤其，糖尿病與諸如心血管疾病和視網膜病變之多種併發症相關，因此若未進行諸如血糖控制之適當管理，會變成非常麻煩的疾病。糖尿病藥物的世界市場預計自2015年的417億美元擴大到2022年的661億美元，並預計成為抗癌藥物市場之後的第二大市場。2014年全球有4.22億成人患有糖尿病，佔成人總人口數的8.5%，幾乎是1980年之4.5%的兩倍(WHO，2016)。此外，由糖尿病造成的全球醫療總支出估計為6730億美元，且20至70歲的糖尿病患者人數預計在2040年增加到約6.2億。
用於治療糖尿病之最具代表性的治療方法包含給予胰島素以控制患者的血糖濃度至正常濃度的方法。胰島素為自人類胰臟分泌的血糖調節激素。胰島素用以將血液中過多的葡萄糖轉移到細胞以提供能量至細胞，並維持血糖於正常濃度。
隨著重組蛋白質製造技術的發展，多種胰島素產品以被投入市場。依據胰島素的作用，可大致上分為五種類型。其中，速效型胰島素(rapid-acting insulin)表現最快速的作用，其特徵在於展現快速功效，1分鐘至20分鐘間開始作用，並在約1小時候展現最高功效，其功效持續3至5小時。代表性的速效型產品包含門冬胰島素(insulin aspart，NovoRapid® )、賴脯胰島素(insulin lispro，Humalog® )和谷氨酸胰島素(insulin glulisine，Apidra® )。展現第二快速作用的胰島素為常規型胰島素(regular insulin)在給藥後30分鐘開始降低血糖濃度，並在2至4小時之間展現最高功效，且功效持續6至8小時。代表性的常規型胰島素產品包含含愛速基因胰島素(Actrapid® )、優泌林胰島素(Humilin® R)、賀普林胰島素(Hypurin Neutral)等。中效型胰島素(intermediate-acting insulin)為由添加魚精蛋白(protamine)或鋅以延遲其作用而獲得的物質。此胰島素在注射之後約1小時30分鐘開始作用，其功效在4小時至12小時之間達到最高水平並持續16至24小時。代表性的中效型產品包含Protaphane® 、Humulin® NPH和Hypurin Isophane® 。預混型胰島素(premixed insulin)由將速效型胰島素或常規型胰島素與中效型胰島素預混合而獲得，使得可由單次注射容易給予兩種胰島素。市面上可取得的預混型胰島素產品包含諾和密斯30(NovoMix® 30，30%的insulin aspart和70%的protamine crystalline insulin aspart)、優泌樂筆-混合型25(Humalog® Mix 25，25%的insulin lispro和75%的insulin lispro protamine suspension)以及優泌樂筆-混合型50(Humalog® Mix 50，50%的insulin lispro和50%的insulin lispro protamine suspension)。最後，長效型胰島素(long-acting insulin)一天注射一次或兩次，其功效持續長達24小時。長效型胰島素通常作為基礎胰島素，而市面上可取得的長效型胰島素產品包含蘭德仕(Lantus® ，insulin glargine，歐洲專利第0368187號)、瑞和密爾(Levemir® ，地特胰島素(insulin detemir)，美國專利第5750497號)以及諾胰保諾特筆(Tresiba® ，德谷胰島素(insulin degludec)，美國專利第7615532號)。
胰島素依據其作用，用於不同的應用中。對於第一型糖尿病，除了常規型或素效型胰島素之外，還需要給予長效型胰島素，而對於需要胰島素療法的第二型糖尿病，常規型或速效型胰島素可與長效型胰島素一起給藥，或亦可僅給予長效型胰島素。
如上所述，給予胰島素為治療糖尿病最具代表性的治療方法。然而，長效型胰島素的不便之處在於，由於長效型胰島素的半衰期不夠長，需要一天給藥一次或兩次。這會對經由注射自行給予胰島素的糖尿病患者造成不適。
目前市面上基礎胰島素產品主要為一日配方(daily formulations)，且相較於這些產品，還沒有產品具有改善的給藥方便性。諾和諾德公司(Novo Nordisk)已研發一種胰島素類似物(美國專利第20110092419A1號)，此胰島素類似物藉由在胰島素序列中導入突變以在體內對蛋白酶具有抗性，從而具有增加的體內半衰期，諾和諾德公司還研發一種胰島素，此胰島素透過對胰島素類似物的醯化(acylation) (PCT專利申請案第2009115469號、PCT專利申請案第2011161125號)，從而具有額外增加的半衰期，但此胰島素可用作為一日配方。Hanmi Pharmaceuticals公司已研發一種胰島素，此胰島素藉由將Fc區域接合至胰島素類似物，而具有增加的半衰期(韓國專利第1020150087130號)。然而，由於胰島素和Fc區域為分別製造並受到聚乙二醇化(PEGylation)，故Hanmi Pharmaceuticals公司所研發之製造胰島素的方法為複雜。
因此，為了能在使用一般基礎胰島素注射次數為多時所造成的不便最小化，本發明旨在克服如上所述之問題，發展作用時效延長的胰島素，並改善其製造方法。
白蛋白(Albumin)為血液中最豐富的蛋白質，並對許多藥物的體內藥物動力學(pharmacokinetics)具有影響，因此在新藥開發中已進行許多研究以控制藥物對白蛋白的結合親和性(binding affinity)。舉例來說，對於長效型胰島素的研發，諾和諾德公司已研發一種產品(地特胰島素(insulin detemir)、德谷胰島素(insulin degludec))，此產品藉由使用對白蛋白具有結合親和性的脂肪酸來醯化胰島素，可以用較低的速率自皮下組織(給藥位置)吸收到血液中。脂肪酸對於白蛋白的接合親和性表現與胰島素的吸收速率高度相關。當對白蛋白具有高結合親和性的脂肪酸醯化到胰島素時，胰島素的半衰期會增加。舉例來說，地特胰島素與血液中的白蛋白結合，因此增加胰島素的半衰期。當人類胰島素透過靜脈注射給藥時，具有2.4分鐘的半衰期，而地特胰島素具有18至25分鐘的半衰期，此為至少10倍之長。相較於地特胰島素，德谷胰島素對白蛋白的結合親和性增加2.4倍，因此具有增加的半衰期。
然而，醯化的胰島素對白蛋白具有數毫莫耳濃度(mM)的結合親和性(Kd ) (Biochem. J. 312, 725–731 (1995))，因而相較於一日配方，未具有改善的藥物動力學特徵。因此，本發明旨在藉由使用對白蛋白之結合親和性達pM等級的白蛋白結合域(albumin-binding domain，ABD)，來最大化白蛋白的半衰期延長效應。
因此，本發明者進行廣泛的努力以研發具有改善支持續時間的長效型胰島素，此長效型胰島素克服對糖尿病患者頻繁給予胰島素造成的不便，並因此本發明者發現藉由取代天然胰島素之A鏈(A-chain)和B鏈(B-chain)中的一個或多個胺基酸，並另外融合(fusing)白蛋白結合域而獲得的胰島素類似物衍生物，此胰島素類似物衍生物具有顯著增加的體內半衰期，從而完成本發明。
本發明目的在於提供新穎的胰島素類似物、編碼此類似物的核苷酸、包含此核苷酸的載體以及導入此載體的重組微生物，其中此胰島素類似物展現對由梭菌蛋白酶(enzyme clostripain)之切割(cleavage)的抗性以及增加的體內半衰期。
本發明另一目的在於提供新穎的胰島素類似物衍生物、編碼此類似物衍生物的核苷酸、包含此核苷酸的載體以及導入此載體的重組微生物，其中此胰島素類似物衍生物展現對由梭菌蛋白酶之切割的抗性以及增加的體內半衰期。
本發明還有另一目的在於提供一種方法，此方法用以製造具有增加的體內半衰期之活化型(active form)的長效型胰島素類似物衍生物。
為了達成上述目的，本發明提供一種胰島素類似物，包含以序列識別號2的胺基酸序列表示的胰島素B鏈變體，並且在天然胰島素中以離胺酸(Lys)取代胰島素B鏈胺基酸第22號位的精胺酸(Arg)而得到胰島素B鏈變體。
本發明亦提供一種多核苷酸，編碼所述胰島素類似物。
本發明亦提供一種重組載體，包含所述多核苷酸。
本發明亦提供一種重組微生物，導入所述載體。
本發明亦提供一種長效型胰島素類似物衍生物，其中將白蛋白結合域(albumin-binding domain)融合於所述胰島素類似物。
本發明亦提供一種多核苷酸，編碼所述胰島素類似物衍生物。
本發明亦提供一種重組載體，包含編碼所述胰島素類似物的多核苷酸和編碼白蛋白結合域的多核苷酸，白蛋白結合域包含白蛋白結合模體(albumin-binding motif)，白蛋白結合模體以下列胺基酸序列表示： GVSDFYKKLIXa KAKTVEGVEALKXb Xc I其中Xa 獨立地選自D和E；Xb 獨立地選自D和E；以及Xc 獨立地選自A和E。
本發明亦提供一種重組微生物，導入所述重組載體。
本發明亦提供一種方法，用於製造具有增加的體內半衰期之活化型(active form)的長效型胰島素類似物衍生物，此方法包含以下步驟：(a)培養所述重組微生物；(b)裂解所培養的重組微生物，從而獲得長效型胰島素類似物衍生物；(c)誘導所獲得之長效型胰島素類似物衍生物的再摺疊，從而獲得前驅型(pre-pro form)的胰島素類似物衍生物；(d)藉由使用梭菌蛋白酶(clostripain)和羧肽酶B (Carboxypeptidase B，CpB)處理，將前驅型的胰島素類似物衍生物轉換成活化型；以及(e)純化活化型的長效型胰島素類似物衍生物。
除非另有定義，本文所使用之所有技術和科學術語與本發明所屬領域中具有通常知識者一般所理解的意義相同。一般來說，本文所使用的命名與將於下文描述的實驗方法為本領域已知且常用的那些。
本發明中，發現一種胰島素類似物，其中在天然胰島素B鏈第22號位的胺基酸精胺酸(Arg)由精胺酸(Arg)取代成離胺酸(Lys)，且在天然胰島素A鏈或B鏈中的一個或多個胺基酸被額外取代。此胰島素類似物具有增加的體內半衰期(in vivo half-life)，並同時可易於使用微生物來製造。此外，發現將白蛋白結合域另外融合於此胰島素類似物時，此胰島素類似物的體內半衰期可進一步增加。
本發明包含具有顯著提升之半衰期的胰島素—白蛋白結合域融合蛋白，其中對白蛋白具有高結合親和性的白蛋白結合域融合於天然胰島素，使得胰島素進入血液的吸收速率可降低，並使得血液中胰島素的穩定性可提升。此外，本發明包含胰島素類似物，其中此胰島素類似物為在天然胰島素B鏈第22號位的胺基酸精胺酸(Arg)由精胺酸(Arg)取代成離胺酸(Lys)及/或在天然胰島素A鏈或B鏈中的一個或多個胺基酸被取代，從而最小化蛋白酶的切割或胰島素受體媒介的移除。此外，本發明包含胰島素類似物—白蛋白結合域融合蛋白，其中所述多種胰島素類似物融合於白蛋白結合域。此融合蛋白保留形成為六聚體之胰島素的固有特性，因此可用於配方研發並能改善吸收速率。
因此，一方面，本發明針對一種胰島素類似物，包含以序列識別號2的胺基酸序列表示的胰島素B鏈變體，並且在天然胰島素中以離胺酸(Lys)取代胰島素B鏈胺基酸第22號位的精胺酸(Arg)而得到胰島素B鏈變體。根據本發明，當胰島素B鏈第22號位的胺基酸由精胺酸(Arg)取代成離胺酸(Lys)時，此胰島素類似物展現對由梭菌蛋白酶之切割的抗性，使得在微生物或除了人體以外的細胞製造胰島素類似物的過程中，能藉由除了胰蛋白酶(trypsin)以外的梭菌蛋白酶，將胰島素轉變為活化型。
在本發明中，「一種胰島素類似物，包含以序列識別號2的胺基酸序列表示的胰島素B鏈變體，並且在天然胰島素中以離胺酸(Lys)取代胰島素B鏈胺基酸第22號位的精胺酸(Arg)而得到胰島素B鏈變體」表示此胰島素類似物除了在天然胰島素B鏈之胺基酸第22號位的精胺酸(Arg)取代成離胺酸(Lys)以外，可更包含在胰島素A鏈或胰島素B鏈中的胺基酸變體。
本發明中，胰島素類似物可更包含選自由下列所組成之群組中之一個或多個胺基酸取代：(i) 以序列識別號4的胺基酸序列表示的胰島素A鏈，在胰島素A鏈胺基酸第3號位之纈胺酸(Val)取代成白胺酸(Leu)；(ii) 以序列識別號4的胺基酸序列表示的胰島素A鏈，在胰島素A鏈胺基酸第8號位之蘇胺酸(Thr)取代成天門冬胺酸(Asp)；(iii) 以序列識別號4的胺基酸序列表示的胰島素A鏈，在胰島素A鏈胺基酸第10號位之異白胺酸(Ile)取代成離胺酸(Lys)；(iv) 以序列識別號4的胺基酸序列表示的胰島素A鏈，在胰島素A鏈胺基酸第14號位之酪胺酸(Tyr)取代成麩胺酸(Glu)；(v) 以序列識別號4的胺基酸序列表示的胰島素A鏈，在胰島素A鏈胺基酸第19號位之酪胺酸(Tyr)取代成苯丙胺酸(Phe)；(vi) 以識別號2的胺基酸序列表示的胰島素B鏈變體，在胰島素B鏈變體胺基酸第5號位之組胺酸(His)取代成蘇胺酸(Thr)；(vii) 以序列識別號2的胺基酸序列表示的胰島素B鏈變體，在胰島素B鏈變體胺基酸第9號位之絲胺酸(Ser)取代成天門冬胺酸(Asp)；(viii) 以序列識別號2的胺基酸序列表示的胰島素B鏈變體，在胰島素B鏈變體胺基酸第13號位之麩胺酸(Glu)取代成丙胺酸(Ala)；(ix) 以序列識別號2的胺基酸序列表示的胰島素B鏈變體，在胰島素B鏈變體胺基酸第17號位之白胺酸(Leu)取代成麩醯胺酸(Gln)；以及(x) 以序列識別號2的胺基酸序列表示的胰島素B鏈變體，在胰島素B鏈變體胺基酸第24號位之苯丙胺酸(Phe)取代成絲胺酸(Ser)，但不限於此。
在本發明中，相較於天然胰島素，胰島素類似物具有增加的體內半衰期。體內半衰期以可持續至少48小時為佳，以至少72小時為較佳。
另一方面，本發明針對一種多核苷酸，此多核苷酸編碼所述胰島素類似物。另一方面，本發明針對一種重組載體，此重組載體包含所述多核苷酸。另一方面，本發明針對一種重組微生物，此重組微生物導入所述重組載體。
同時，本發明針對一種長效型胰島素類似物衍生物，其中白蛋白結合域融合於胰島素類似物。與白蛋白結合域融合的長效型胰島素類似物衍生物對白蛋白具有相對較高的親和性。
本發明一示例中，白蛋白結合域可包含白蛋白結合模體(albumin-binding motif)，此白蛋白結合模體以下列胺基酸序列表示： GVSDFYKKLIXa KAKTVEGVEALKXb Xc I其中Xa 獨立地選自D和E；Xb 獨立地選自D和E；以及Xc 獨立地選自A和E。
本發明一示例中，Xa 為D，Xb 為D，而Xc 為A。
本發明一實施例中，白蛋白結合域可包含下列胺基酸序列： LAX3 AKX6 X7 ANX10 ELDX14 Y-[BM]-LX43 X44 LP其中[BN]為如前述所定義之白蛋白結合模體，X3 獨立地選自C、E、Q和S；X6 獨立地選自C、E和S；X7 獨立地選自A和S；X10 獨立地選自A、R和S；X14 獨立地選自A、C、K和S；X43 獨立地選自A和K；以及X44 獨立地選自A、E和S。
白蛋白結合域可以選自由序列識別號6至13所組成之胺基酸序列識別號群組中的胺基酸序列表示，但不限於此。白蛋白結合域可以序列識別號6的胺基酸序列表示為較佳。
本發明中，就蛋白質再摺疊效率、酶反應效率和所產生之胰島素衍生物或胰島素類似物衍生物的活性而言，較佳為白蛋白結合域融合於B鏈—C鏈—A鏈之胰島素或胰島素類似物中A鏈的C端(C-terminus)。與此，胰島素(或胰島素類似物)與白蛋白結合域之間可導入連接鏈(linker)。
根據本發明之長效型胰島素類似物衍生物的功能依衍生物的三維結構而變化。因此，在根據本發明之長效型胰島素類似物衍生物的胺基酸序列中能夠做些小改變而不影響此衍生物的功能。因此，本發明包含白蛋白結合域的變體或長效型胰島素類似物衍生物，其中白蛋白結合域的變體保留白蛋白結合性質，長效型胰島素類似物衍生物保留對酶切割的抗性。舉例來說，屬於特定官能基之胺基酸殘基(例如疏水性、親水性、極性等)可被其他屬於相同官能基之胺基酸殘基取代。
如本文所使用之術語「白蛋白結合」與「對白蛋白的結合親和性」是指可藉由使用諸如Biacore儀器之表面電漿共振技術來測試的多肽或蛋白質的性質。舉例來說，將白蛋白或其碎片固定於儀器的感測晶片，並將欲測試之包含多肽或蛋白質的樣品通過此晶片，在此實驗中可測試白蛋白結合親和性。
或者，將欲測試之多肽或蛋白質固定於儀器的感測晶片，並將包含白蛋白或其碎片的樣品通過此晶片。在此方面，白蛋白可為哺乳動物的血清白蛋白，例如人類的血清白蛋白。本領域具有通常知識者可解釋透過這些實驗所獲得的結果，以建立對於白蛋白之多肽或蛋白質之結合親和性的定量測量。若需要定量測量，例如為了測定交互作用的KD 值，亦可使用表面電將共振方法。結合值可以例如Biacore 2000儀器(Biacore AB)來定義。將白蛋白適當地固定於測量感測晶片，欲測定親和性之多肽或蛋白質的樣品以序列稀釋(serial dilution)製備並以隨機順序注入。然後可使用例如儀器製造商提供之BIAevaluation 4.1軟體之1:1 Langmuir結合模型的結果來計算KD 值。
本實驗一實施例中，與長效型胰島素類似物衍生物結合的白蛋白可選自人類血清白蛋白、大鼠血清白蛋白、獼猴血清白蛋白(cynomolgus serum albumin)、小鼠血清白蛋白之中，但不限於此。
在一特定實施例中，與長效型胰島素類似物衍生物結合的白蛋白為人類血清白蛋白。
胰島素類似物和白蛋白結合域以胜肽鍵、多肽連接鏈或非多肽連接鏈彼此連接，非多肽連接鏈選自由聚乙二醇(polyethylene glycol)、聚丙二醇(polypropylene glycol)、乙二醇-丙二醇共聚物(ethylene glycol-propylene glycol copolymer)、聚氧乙醇化多元醇(polyoxyethylated polyol)、聚乙烯醇(polyvinyl alcohol)、多醣(polysaccharides)、聚葡萄糖(dextran)、聚乙烯基乙基醚(polyvinyl ethyl ether)、生物可降解聚合物(biodegradable polymers)、脂肪酸(fatty acids)、核苷酸(nucleotides)、脂質聚合物(lipid polymers)、幾丁質(chitin)、玻尿酸(hyaluronic acid)及其組合所組成之群組，但不限於此。
本發明中，由重複之(GGGGS)n 序列所組成的連接鏈可插入胰島素類似物和白蛋白結合域之間，其中n為1至6的整數。根據實驗結果顯示，當沒有導入連接鏈時，再摺疊率為低，但當導入二或更多重複之(GGGGS)序列時再摺疊率沒有顯著的變化。同時，隨著序列重複的數量(n)增加，藉由梭菌蛋白酶轉變成活化型胰島素的速率會增加，但胰島素類似物的體內藥物動力學不會受到顯著的影響。綜合如上所述的結果，連接鏈以由2至4重複的GGGGS序列組成為佳。
因此，在本發明中，胰島素類似物和白蛋白結合域可以多肽連接鏈彼此連接，多肽連接鏈可包含(GGGGS)n ，其中n為1至6的整數，但不限於此。較佳地，多肽連接鏈可以序列識別號5的胺基酸序列表示。
另一方面，本發明還針對一種重組載體，包含編碼胰島素類似物的多核苷酸和編碼白蛋白結合域的多核苷酸，白蛋白結合域包含白蛋白結合模體，白蛋白結合模體以下列胺基酸序列表示： GVSDFYKKLIXa KAKTVEGVEALKXb Xc I其中Xa 獨立地選自D和E；Xb 獨立地選自D和E；以及Xc 獨立地選自A和E。
在本發明一實施例中，白蛋白結合域可包含下列胺基酸序列： LAX3 AKX6 X7 ANX10 ELDX14 Y-[BM]-LX43 X44 LP其中[BN]為如前述所定義之白蛋白結合模體，X3 獨立地選自C、E、Q和S；X6 獨立地選自C、E和S；X7 獨立地選自A和S；X10 獨立地選自A、R和S；X14 獨立地選自A、C、K和S；X43 獨立地選自A和K；以及X44 獨立地選自A、E和S。
白蛋白結合域可以以選自由序列識別號6至13所組成之胺基酸序列識別號群組中的胺基酸序列表示，但不限於此。白蛋白結合域可以序列識別號6的胺基酸序列表示為較佳。
本發明中，編碼胰島素類似物的多核苷酸和編碼白蛋白結合域的多核苷酸可導入至重組載體，使得胰島素類似物和白蛋白結合域可被表現為融合蛋白。
導入至重組載體之白蛋白結合域的其他描述與長效型胰島素類似物衍生物之白蛋白結合域的描述重複，故省略。此外，編碼多肽連接鏈的多核苷酸可包含於編碼胰島素類似物的多核苷酸和編碼白蛋白結合域的多核苷酸之間。多肽連接鏈的描述亦與長效型胰島素類似物衍生物之多肽連接鏈的描述重複，故詳細描述將被省略以避免冗餘。
同時，對於白蛋白結合模體和白蛋白結合域(或白蛋白結合多肽)的描述視為包含對應PCT專利申請案第2014048977號之韓國專利公開第1020150058454號所揭露的內容。
根據本發明之重組載體可建構成用於一般選殖(cloning)或表現的載體，並可建構成用於以原核或真核細胞作為宿主細胞的載體。
如本文所使用之術語「載體」指能夠在適當宿主細胞中表現目標蛋白質的重組載體，重組載體為一種基因建構體，包含可操作地連接的必要調控因子以能夠表現核酸插入物。本發明可製備一種重組載體，包含編碼胰島素類似物及/或其類似物衍生物的核酸。本發明之胰島素類似物及/或其類似物衍生物可在重組微生物中製造，並透過裂解和純化所培養的重組微生物來獲得，其中重組載體以轉形作用(transformation)或轉染作用(transfection)導入重組微生物中。
本發明中，編碼胰島素類似物及其類似物衍生物的核酸可操作地連接至核酸表現控制序列。如本文所使用之術語「可操作地連接」指核酸表現控制序列(例如啟動子(promoter)、訊息序列(signal sequence)、核糖體結合位點(ribosome-binding site)、轉錄終止序列(transcription termination sequence)等)和另一核苷酸序列之間的功能性連接，因此控制序列能控制核苷酸序列的轉錄及/或轉譯。
如本文所使用之術語「啟動子」指位於編碼區上游的非轉譯核酸序列(untranslated nucleic acid sequence)，啟動子包含聚合酶結合位點(polymerase-binding site)並具有將位於啟動子下游基因轉錄成mRNA的轉錄起始活性，例如聚合酶結合且啟動基因轉錄的DNA位點，此DNA位點位於mRNA轉錄起始區域的5端區域。
舉例來說，當本發明之載體為重組載體，且使用原核細胞作為宿主細胞時，通常包含能啟動轉錄的強啟動子(例如tac啟動子、lac啟動子、lacUV5啟動子、lpp啟動子、pLλ啟動子、pRλ啟動子、rac5啟動子、amp啟動子、recA啟動子、SP6啟動子、trp啟動子、trc啟動子、phoA啟動子、araBAD啟動子、T5啟動子和T7啟動子)、用於轉錄起始的核糖體結合位點以及轉錄/轉譯終止序列。
此外，用於本發明的載體可藉由操作質體(例如pSC101、pGV1106、pACYC177、ColE1、pKT230、pME290、pBR322、pUC8/9、pUC6、pBD9、pHC79、pIJ61、pLAFR1、pHV14、pGEX系列、pET系列、pPICZα系列、pUC19等)、噬菌體或病毒(例如SV40等)來製備，這些為本領域通常使用的，但不限於此。
同時，當本發明之載體為重組載體，且使用真核細胞作為宿主細胞時，可使用源自哺乳動物細胞基因組的啟動子(例如金屬硫蛋白(metallothionein)啟動子)、源自哺乳動物病毒基因組的啟動子(腺病毒晚期(adenovirus late)啟動子、牛痘病毒(vaccinia virus)的7.5K啟動子、SV40啟動子、巨細胞病毒(cytomegalovirus)啟動子以及HSV的tk啟動子)，並且一般來說，載體包含聚腺苷酸化(polyadenylated)序列(例如牛生長激素終止子(bovine growth hormone terminator)及源自SV40的聚腺苷酸化序列)作為轉錄終止序列。
此外，本發明之重組載體包含本領域常使用之抵抗抗生素基因作為篩選標記(selective marker)，例如可包含對胺苄青黴素(ampicillin)、慶大黴素(gentamicin)、羧苄西林(carbenicillin)、氯黴素(chloramphenicol)、鏈黴素(streptomycin)、卡納黴素(kanamycin)、遺傳黴素(geneticin)、新黴素(neomycin)或四環黴素(tetracycline)具有抗性的基因。
本發明之重組載體另外包含不同序列以便於純化所回收的目標蛋白質，例如胰島素類似物及/或胰島素類似物衍生物。另外包含的序列可為用於蛋白質純化的標籤序列(tag sequence)，例如麩胱甘肽S轉移酶(glutathione S-transferase，Pharmacia，USA)、麥芽糖結合蛋白(maltose-binding protein，NEB，USA)、FLAG (IBI，USA)、6-組胺酸(6-histidine)等，但用於純化目標蛋白質之必需序列的總類不限於此。以包含上述標籤序列之重組載體表現的融合蛋白可藉由親合層析法(affinity chromatography)來純化。舉例來說，當融合麩胱甘肽S轉移酶(glutathione S-transferase)時，會使用此酵素之受質的麩胱甘肽(glutathione)，而當使用6-組胺酸標籤(6-histidine tag)時，可容易以Ni-NTA管柱收集所欲目標蛋白質。一種具有載體的重組微生物可使用重組載體來建構，此重組載體包含編碼胰島素類似物及/或胰島素類似物衍生物的多核苷酸。
如本文所使用之術語「轉形(transformation)」指將DNA導入宿主細胞的過程並使DNA可複製為染色體因子，或是指完成染色體嵌入(chromosomal integration)的過程，此為藉由導入外源DNA至細胞而人為引起基因改變的現象。
本發明中所使用之轉形方法可為任何轉形方法，並可根據用於本領域中常用的方法輕易進行。常用之轉形方法的示例可包含氯化鈣沉澱法、在氯化鈣沉澱法中使用二甲亞碸(DMSO)作為還原劑以改善效率的Hanahan法、電穿孔法(electroporation)、磷酸鈣沉澱法、原生質體融合法(protoplast fusion method)、使用碳化矽纖維的攪拌法、農桿菌媒介轉形法(agrobacteria-mediated transformation method)、使用聚乙二醇(PEG)、硫酸葡聚糖(PEG)、脂轉染胺(lipofectamine)及乾/抑制媒介轉形的轉形方法等。
根據本發明之用於將包含編碼胰島素類似物及/或胰島素類似物衍生物之核酸的載體轉形的方法可不限於這些方法，可使用本領域中常用之任何用於轉形作用或轉染作用的方法而無限制。
本發明之重組轉形體可藉由將包含編碼胰島素類似物及/或胰島素類似物衍生物之核酸的載體導入宿主細胞內來獲得。
只要可表現本發明之核酸，用於本發明之適當的宿主可不特別受限。適當之宿主的示例可包含諸如大腸桿菌(E. coli )之屬於Escherichia 種的細菌、諸如Bacillus subtilis 之屬於Bacillus 種的細菌、諸如Pseudomonas putida 之屬於Pseudomonas 種的細菌、諸如Pichia pastoris 、Saccharomyces cerevisiae 和Schizosaccharomyces pombe 的酵母菌、諸如Spodoptera frugiperda (SF9)之昆蟲細胞以及諸如CHO、COS和BSC之動物細胞，但不限於此。
本發明亦提供用於治療糖尿病的一種成分，包含胰島素類似物或胰島素類似物衍生物。
本發明亦提供用於治療糖尿病的一種方法，包含將胰島素類似物或胰島素類似物衍生物給予需要控制血糖之受試者的步驟。
本發明亦提供用於糖尿病治療的胰島素類似物或胰島素類似物衍生物。
本發明亦提供用於製造治療糖尿病之藥物之胰島素類似物或胰島素類似物衍生物的用途。
本發明亦提供一種方法，用於製造具有增加的體內半衰期之活化型的長效型胰島素類似物衍生物，此方法包含以下步驟：(a)培養所述重組微生物；(b)裂解所培養的重組微生物，從而獲得長效型胰島素類似物衍生物；(c)誘導所獲得之長效型胰島素類似物衍生物的再摺疊，從而獲得前驅型(pre-pro form)的胰島素類似物衍生物；(d)藉由使用梭菌蛋白酶(clostripain)和羧肽酶B (Carboxypeptidase B，CpB)處理，將前驅型的胰島素類似物衍生物轉換成活化型；以及(e)純化活化型的長效型胰島素類似物衍生物。
〈示例〉
在下文中，將參考示例進一步詳細描述本發明。對本領域具有通常知識者顯而易見的是，這些示例僅用於說明目的，而不應解釋為限制本發明的範圍。
以下示例中，使用本發明中融合白蛋白結合域之胰島素類似物的涵義與長效型胰島素類似物衍生物相同。
示例1：建構融合白蛋白結合域之胰島素的表現載體和菌株
人類胰島素被合成為前胰島素原(pre-pro-insulin)的形式，前序列(pre sequence)在內質網(endoplasmic reticulum)被切除，胰島素原(pro-insulin)在高基氏體(Golgi body)和內質網被加工，從而形成成熟的胰島素。基於此事實，為了藉由在大腸桿菌中表現胰島素原蛋白質，再以胰蛋白酶處理移除C鏈以製造重組胰島素，而設計了胰島素原。為了增加大腸桿菌中胰島素原的表現效率和純化效率，而將融合標籤(fusion tag)插入N端，並進行密碼子最佳化。
可融合白蛋白結合域之胰島素位點的數量理論上為四個。然而，A鏈的N端對於胰島素的活性為重要的位置，故排除將A鏈的N端作為融合位置。儘管B鏈的N端對於胰島素六聚體的形成為重要，但由於胰島素的活性能維持，故B鏈的N端被包含為融合位置。若白蛋白結合域融合於B鏈和C鏈之間，會影響蛋白質摺疊。因此，胰島素建構體設計為以B-C-A順序或A-C-B作為候選結構。最後，設計了用於表現下列三種形式之融合白蛋白結合域之胰島素的基因結構：NdeI - Fusion tag - B-chain - C-chain - A-chain - Linker - ABD -EcoRI ，NdeI - Fusion tag - ABD - Linker - B-chain - C-chain - A-chain -EcoRI ，以及NdeI - Fusion tag - A-chain - C-chain - B-chain - Linker - ABD -EcoRI 。
作為表現載體，使用pJ401 (DNA 2.0)載體。此載體由限制內切酶(restriction enzyme)NdeI 和EcoRI 裁切，然後DNA片段於1%瓊脂糖凝膠(agarose gel)中以電泳分離。使用T4 DNA接合酶(ligase)接合用於表現白蛋白結合域之融合蛋白質的基因結構以及上述由表現載體所獲得的DNA片段，從而建構質體。接著，各質體以氯化鈣法轉形至E. coli BL21(DE3)。篩選具有卡納黴素抗性的轉形菌株，並將DNA自其中分離。藉由基於限制內切酶裁切的分析方法確定DNA是否正確被插入。
當基因設計成具有NdeI - Fusion tag - ABD - Linker - B-chain - C-chain - A-chain -EcoRI 的結構時，由於再摺疊率非常低，故被認為不適合。此外，當基因設計成具有NdeI - Fusion tag - A-chain - C-chain - B-chain - Linker - ABD -EcoRI 的結構時，融合白蛋白結合域的胰島素具有胰島素活性，但展現低的再摺疊率和和酶處理率，故被認為不適合作為製作活化型胰島素的方法。因此，在三種形式之融合白蛋白結合域之胰島素中，NdeI - Fusion tag - B-chain - C-chain - A-chain - Linker - ABD -EcoRI 結構被選擇並使用於後續的實驗中。
在A鏈和白蛋白結合域之間，插入包含由1至6重複(GGGGS)序列組成的連接鏈。在此情況下，當未沒有導入連接鏈時，再摺疊率為低，但當導入二或更多重複之(GGGGS)序列時再摺疊率沒有顯著的變化。同時，隨著(GGGGS)n 序列的n增加，藉由梭菌蛋白酶轉變成活化型胰島素的速率會增加，但胰島素的體內藥物動力學不會受到顯著的影響。綜合如上所述的結果，連接鏈設計成由2至4重複的GGGGS序列組成。
用於本發明中所使用之融合白蛋白結合域的胰島素之各部分的胺基酸序列如下表1所示。
〈表1〉
Figure 108128077-A0304-0001
示例2：建構具有修飾胰島素胺基酸序列之融合白蛋白結合域的胰島素類似物
為了使用重組大腸桿菌製造胰島素，需要藉由使用胰蛋白酶將胰島素原轉變為活化型的過程。然而，胰蛋白酶以高效率切割二元鹼胺基酸(di-basic amino acid)，亦會切割諸如離胺酸(Lys)或精胺酸(Arg)之單一胺基酸，使得難以製造活化型胰島素。此外，白蛋白結合域序列亦包含多個離胺酸(Lys)和精胺酸(Arg)殘基，使得更難以藉由使用胰蛋白酶來製造具有高活性之融合白蛋白結合域的胰島素。
為此，使用梭菌蛋白酶作為可取代胰蛋白酶以誘導轉變成活化型的酵素。在此情況下，當梭菌蛋白酶與融合白蛋白結合域的胰島素反應時，會發生胰島素B鏈第22號位的切割。為了解決此問題，以離胺酸(Lys)取代B鏈第22號位的精胺酸(Arg)。在此情況下，梭菌蛋白酶在胰島素B鏈第22號位的切割會顯著降低，故可有效率地製造活化型之融合白蛋白結合域的胰島素(如圖1所示)。
除了如上所述的突變之外，為了進一步增加融合白蛋白結合域之胰島素的穩定性和體內半衰期，亦將額外的突變導入融合白蛋白結合域之胰島素。A鏈和B鏈中各取代五個胺基酸，取代的位置如以下表2所示。
〈表2〉
Figure 108128077-A0304-0002
使用GeneArt演算法進行在大腸桿菌中用於基因表現的密碼子最佳化，並合成基因以具有取代的胺基酸。
以與示例1中所描述之相同方法，將如上述所建構的質體導入E. coli BL21(DE)，從而建構大腸桿菌菌株。
示例3：表現融合白蛋白結合域的胰島素類似物
為了表現融合白蛋白結合域的胰島素類似物，將各重組大腸桿菌菌株接種(inoculated)於100毫升LB培養液，在37°C搖晃培養16小時，培養物作為種菌(seed culture)。2公升LB培養液加入7公升發酵槽(New Brunswick BioFlo)、滅菌、再以種菌接種。在溫度35°C、空氣流速3 vvm(air volume/culture volume/min，通氣比)、攪拌速率1000 rpm (revolutions per minute，每分鐘轉速)以及在培養過程中使用胺和磷酸將pH值維持為6.8的條件下，進行種菌培養。在培養液中碳源耗盡的時點開始餵養(feeding)，同時以IPTG誘導蛋白質表現。在誘導表現之後進行10小時額外的培養，並使用離心回收重組菌株。
在大腸桿菌菌株中，融合白蛋白結合域之胰島素類似物被表現為包涵體(inclusion body)，即使當胺基酸突變導入胰島素域時，胰島素類似物的表現能力亦出現在本發明使用之載體系統中(如圖2示)。
示例4：誘導細胞裂解與溶解/再摺疊
將表現融合白蛋白結合域之胰島素或融合白蛋白結合域之胰島素類似物的各菌株懸浮於裂解緩衝液(lysis buffer) (20 mM Tris，10 mM EDTA，10%蔗糖，0.2 M NaCl，pH 8.0)，並使用高壓均質機將細胞裂解。裂解的細胞以高速離心機以7000 rpm離心，移除可溶蛋白和一些細胞碎片，從而分離含有包涵體的沉澱物。分離的包涵體以緩衝液(包含1% Triton X-100、0.2 M NaCl和1 M尿素)沖洗，再以7000 rpm離心。沉澱的包涵體以二次蒸餾水額外沖洗兩次，再保存於-80°C直到要使用時。
將冷凍保存的包涵體溶解於溶解緩衝液(25 mM Tris，8 M尿素，30 mM cysteine-HCl，pH 10.5)，再稀釋到再摺疊緩衝液(25 mM Tris-HCl，pH 10.5)，並在4℃進行再摺疊16小時。藉由RP-HPLC分析確定再摺疊時否發生。當溶解的溶液以RP-HPLC分析時，由於高疏水性，會在約20分鐘時觀察到蛋白質峰，但當進行再摺疊時，可觀察到峰值移動到16分鐘(如圖3所示)。這是由於隨著再摺疊進行，相較於溶解的溶液，疏水性會降低。再摺疊會進行直到在RP-HPLC分析期間再也觀察不到蛋白質峰的位移為止。
示例5：藉由使用酵素轉變為活化型
為了使用重組大腸桿菌製造胰島素，需要使用胰蛋白酶將胰島素原轉變成活化型。然而，融合白蛋白結合域之胰島素或融合白蛋白結合域之胰島素類似物在其序列中具有胰蛋白酶切位，為此，使用梭菌蛋白酶作為能取代胰蛋白酶的酵素以誘導轉變成活化型。
當使用梭菌蛋白酶誘導轉變成活化型時，切割會發生於胰島素B鏈第22號位，使得難以製造所欲形式的胰島素。為此，使用藉由在B鏈第22號位將精胺酸(Arg)取代成離胺酸(Lys)而獲得之融合白蛋白結合域的胰島素類似物，以製造活化型的胰島素。
梭菌蛋白酶在其活性位置包含半胱胺酸(Cys)，故需要還原的環境以展現酵素活性。此外，在使用還原劑處理再摺疊溶液以維持梭菌蛋白酶的活性時，胰島素域的二硫鍵(disulfide bond)很有可能被破壞。為此，需要得到可提升酶反應率而不破壞二硫鍵的環境。因此，使用酶反應溶液中所含的還原劑DTT來進行實驗。
由於梭菌蛋白酶以前體型(pro-form)存在，故誘導自切割(auto-cleavage)以活化梭菌蛋白酶。至此，冷凍乾燥的梭菌蛋白酶(Worthington，USA)溶解於二次蒸餾水，再加入活化緩衝液(500 mM Tris，50 mM DTT，25 mM CaCl2 ，pH 7.8)之後在4°C活化30分鐘。活化的梭菌蛋白酶以每毫克蛋白質0.1至5單位的濃度加入再摺疊蛋白質，並在25至40°C反應2至8小時。梭菌蛋白酶反應之後，CpB以每毫克蛋白質0.001至1單位的濃度加入並反應。藉由使用HCL將pH降低至3.5或更低來終止酶反應。
因此，如圖4所示，酶反應展現出提高轉變成活化型胰島素效率且減少雜質的效果。
示例6：純化融合白蛋白結合域的胰島素
使用梭菌蛋白酶和CpB酶處理的樣品首先由離子交換樹脂層析法(ion-exchange resin chromatography)純化，其中離子交換樹脂層析法根據其製造商的說明使用Fractogel® EMD COO- (M) (Merck)，再由逆向層析法(reverse-phase chromatography)純化，其中逆向層析法根據其製造商的說明使用Pharmprep® P100 RP-18e (Merck)。
因此，如圖5所示，可藉由兩種純化方式純化出無雜質之活化型融合白蛋白結合域的胰島素。
示例7：測量融合白蛋白結合域之胰島素類似物對於白蛋白的結合親和性
為了測量融合白蛋白結合域之胰島素類似物對於白蛋白的結合親和性，使用表面電將共振(surface plasmon resonance (SPR, BIACORE 3000，GE healthcare)分析法。藉由胺耦合法(amine coupling method)將重組人類血清白蛋白固定於CM5晶片，並將稀釋成五種或更多種濃度的白蛋白結合域或融合白蛋白結合域之胰島素類似物與重組人類血清白蛋白結合，測量白蛋白結合域或融合白蛋白結合域之胰島素類似物對於人類血清白蛋白的親和性。
結果，如表3所示，儘管胰島素類似物對於人類血清白蛋白的親和性低於白蛋白結合域本身，但仍維持在pM等級。
〈表3〉
Figure 108128077-A0304-0003
示例8：比較天然胰島素與融合白蛋白結合域之胰島素類似物對於胰島素受體的親和性
為了測量天然胰島素與融合白蛋白結合域之胰島素類似物對於胰島素受體的親和性，表面電將共振(SPR, BIACORE 3000，GE healthcare)分析法。藉由胺耦合法(amine coupling method)將胰島素受體固定於CM5晶片，稀釋成五種或更多種濃度的各天然胰島素與融合白蛋白結合域之胰島素類似物與胰島素受體結合，測量天然胰島素與融合白蛋白結合域之胰島素類似物對於胰島素受體的親和性。
結果，如表4所示，相較於天然胰島素，融合白蛋白結合域之胰島素類似物的親和性降低。尤其，類似物3的親和性展現最大的降低，並降至相對於天然胰島素19.4%的水平。
〈表4〉
Figure 108128077-A0304-0004
在由鏈佐黴素(streptozotocin)誘導之第一型糖尿病模型中，與甘精胰島素(insulin glargine)相比，來評價融合白蛋白結合域之胰島素類似物的功效。相較於甘精胰島素，由於類似物1、3和10展現出50%或更低的降低血糖能力，故被排除為候選物之外。
示例9：六聚體合成
胰島素在體內結合鋅，從而成為穩定的六聚體結構。胰島素之形成六聚體的性質亦使用於配方研發，並在增加胰島素之體內半衰期扮演重要的角色。因此，藉由粒徑篩析層析法(size-exclusion chromatography)分析融合白蛋白結合域之胰島素類似物是否保留形成六聚體的特性。結果顯示，類似物4藉由加入鋅或酚而保留形成六聚體的能力(如圖6所示)。除了類似物7、9和10，其他類似物亦可觀察到六聚體的形成。因此，具有如表2所示之序列的類似物之中，類似物7和9被進一步排除為後選物之外。
示例10：評價融合白蛋白結合域之胰島素類似物的體內藥物動力學與降低血糖能力
為了評價六種融合白蛋白結合域之胰島素類似物的體內藥物動力學，將各胰島素類似物皮下給予正常SD大鼠(六周齡)，再於0、1、4、8、24、48、72和96小時採樣血液。使用ELISA測量在各時間點殘留在血液中之各合白蛋白結合域之胰島素類似物的濃度。此外，使用部分採樣血液，以血糖監測裝置測量時間依賴的血糖濃度。
結果，如以下表5所示，相較於已知具有5分鐘之半衰期的天然胰島素，融合白蛋白結合域之胰島素類似物展現顯著提升的半衰期。僅在胰島素B鏈第22號位取代而獲得之類似物11展現7.2小時的半衰期，而展現最大增加之半衰期的類似物4估計具有9.9小時的半衰期。
分析正常動物中血糖濃度維持在低濃度的時間。結果顯示，類似物5、6和8具有增加的半衰期，但維持血糖濃度的時間短。相較於這些類似物，類似物4具有降低血糖濃度的最佳能力及維持其功效最長時間(如圖7所示)。
〈表5〉
Figure 108128077-A0304-0005
儘管參考具體特徵已詳細描述本發明，對於本領域具有通常知識者顯而易見的是，此描述僅用於較佳實施例且不限制本發明的範圍。因此，本發明之實質範圍將由申請專利範圍及其同等物所定義。
〈產業利用性〉
根據本發明之胰島素類似物或胰島素類似物衍生物優於一般胰島素，胰島素類似物或其他胰島素衍生物具有顯著增加的體內半衰期和提升的穩定性，故即使注射一次亦可具有長效作用。因此，對於經由注射自行給予胰島素的糖尿病患者提供便利性。
無序列表 >110>南韓商大熊製藥股份有限公司 >120>長效型胰島素類似物及其衍生物 >130>P17-B266 >160>13 >170>KoPatentIn 3.0 >210>1 >211>22 >212>PRT >213>人工序列 >220> >223>Fusion Tag >400>1 Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala His His His His His His 1          5              10            15 Ser Ser Gly Ser Ala Arg 20 >210>2 >211>30 >212>PRT >213>homo sapiens >400>2 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1          5              10            15 Leu Val Cys Gly Glu Lys Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr 20             25             30 >210>3 >211>35 >212>PRT >213>homo sapiens >400>3 Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly 1          5              10            15 Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu 20             25             30 Gln Ala Arg 35 >210>4 >211>21 >212>PRT >213>homo sapiens >400>4 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu 1          5              10            15 Glu Asn Tyr Cys Asn 20 >210>5 >211>10 >212>PRT >213>人工序列 >220> >223>Linker >400>5 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1          5              10 >210>6 >211>46 >212>PRT >213>人工序列 >220> >223>白蛋白結合域(Albumin binding domain) >400>6 Leu Ala Glu Ala Lys Glu Ala Ala Asn Ala Glu Leu Asp Ser Tyr Gly 1          5              10            15 Val Ser Asp Phe Tyr Lys Lys Leu Ile Asp Lys Ala Lys Thr Val Glu 20             25             30 Gly Val Glu Ala Leu Lys Asp Ala Ile Leu Ala Ala Leu Pro 35             40             45 >210>7 >211>46 >212>PRT >213>人工序列 >220> >223>Engineered albumin binding polypeptide >400>7 Leu Ala Glu Ala Lys Glu Ala Ala Asn Ala Glu Leu Asp Ser Tyr Gly 1          5              10            15 Val Ser Asp Phe Tyr Lys Lys Leu Ile Asp Lys Ala Lys Thr Val Glu 20             25             30 Gly Val Glu Ala Leu Lys Asp Glu Ile Leu Ala Ala Leu Pro 35             40             45 >210>8 >211>46 >212>PRT >213>人工序列 >220> >223>Engineered albumin binding polypeptide >400>8 Leu Ala Glu Ala Lys Glu Ala Ala Asn Ala Glu Leu Asp Ser Tyr Gly 1          5              10            15 Val Ser Asp Phe Tyr Lys Lys Leu Ile Asp Lys Ala Lys Thr Val Glu 20             25             30 Gly Val Glu Ala Leu Lys Glu Ala Ile Leu Ala Ala Leu Pro 35             40             45 >210>9 >211>46 >212>PRT >213>人工序列 >220> >223>Engineered albumin binding polypeptide >400>9 Leu Ala Glu Ala Lys Glu Ala Ala Asn Ala Glu Leu Asp Ser Tyr Gly 1          5              10            15 Val Ser Asp Phe Tyr Lys Lys Leu Ile Asp Lys Ala Lys Thr Val Glu 20             25             30 Gly Val Glu Ala Leu Lys Glu Glu Ile Leu Ala Ala Leu Pro 35             40             45 >210>10 >211>46 >212>PRT >213>人工序列 >220> >223>Engineered albumin binding polypeptide >400>10 Leu Ala Glu Ala Lys Glu Ala Ala Asn Ala Glu Leu Asp Ser Tyr Gly 1          5              10            15 Val Ser Asp Phe Tyr Lys Lys Leu Ile Glu Lys Ala Lys Thr Val Glu 20             25             30 Gly Val Glu Ala Leu Lys Asp Ala Ile Leu Ala Ala Leu Pro 35             40             45 >210>11 >211>46 >212>PRT >213>人工序列 >220> >223>Engineered albumin binding polypeptide >400>11 Leu Ala Glu Ala Lys Glu Ala Ala Asn Ala Glu Leu Asp Ser Tyr Gly 1          5              10            15 Val Ser Asp Phe Tyr Lys Lys Leu Ile Glu Lys Ala Lys Thr Val Glu 20             25             30 Gly Val Glu Ala Leu Lys Asp Glu Ile Leu Ala Ala Leu Pro 35             40             45 >210>12 >211>46 >212>PRT >213>人工序列 >220> >223>Engineered albumin binding polypeptide >400>12 Leu Ala Glu Ala Lys Glu Ala Ala Asn Ala Glu Leu Asp Ser Tyr Gly 1          5              10            15 Val Ser Asp Phe Tyr Lys Lys Leu Ile Glu Lys Ala Lys Thr Val Glu 20             25             30 Gly Val Glu Ala Leu Lys Glu Ala Ile Leu Ala Ala Leu Pro 35             40             45 >210>13 >211>46 >212>PRT >213>人工序列 >220> >223>Engineered albumin binding polypeptide >400>13 Leu Ala Glu Ala Lys Glu Ala Ala Asn Ala Glu Leu Asp Ser Tyr Gly 1          5              10            15 Val Ser Asp Phe Tyr Lys Lys Leu Ile Glu Lys Ala Lys Thr Val Glu 20             25             30 Gly Val Glu Ala Leu Lys Glu Glu Ile Leu Ala Ala Leu Pro 35             40             45
圖1表示以離胺酸(Lys)取代胰島素B鏈第22號位的精胺酸(Arg)而建構之融合白蛋白結合域(ABD-fused)之胰島素類似物經梭菌蛋白酶處理的穩定性分析結果。質譜顯示，當胰島素B鏈第22號位置包含精胺酸(Arg)時，胰島素B鏈會發生斷裂，但當以離胺酸(Lys)取代精胺酸(Arg)時，B鏈的斷裂不會發生。 圖2表示由SDS-PAGE分析重組大腸桿菌(E. coli )中之融合白蛋白結合域(ABD-fused)之胰島素類似物1至10的表現結果。即使當一個或多個突變導入胰島素序列，亦能維持大腸桿菌中的蛋白質表現。 圖3表示由RP-HPLC監控融合白蛋白結合域(ABD-fused)之胰島素類似物4之溶解與再摺疊的結果。當蛋白質結構由溶解而展開，隨後誘導再摺疊時，由於形成三維結構而在RP-HPLC觀察到滯留時間的位移。 圖4表示由進行根據本發明一示例之酶反應(enzymatic reaction)所獲得的結果，並證實提高轉變成活化型胰島素效率且減少雜質的效果(主要雜質的分子量：10296 Da；活化型胰島素的分子量：11238 Da)。 圖5表示使用梭菌蛋白酶和CpB切斷胰島素並純化之後，由SDS-PAGE分析融合白蛋白結合域之胰島素類似物4的結果。 圖6表示當鋅或酚加入根據本發明一示例之融合白蛋白結合域的胰島素類似物時，進行粒徑篩析層析法分析(size-exclusion chromatography analysis)以檢查是否形成六聚體的結果。 圖7表示評估根據本發明一示例之融合白蛋白結合域的胰島素類似物之降低血糖能力的結果。
無。

Claims (21)

  1. 一種胰島素類似物，包含以序列識別號2的胺基酸序列表示的胰島素B鏈變體，並且在天然胰島素中以離胺酸(Lys)取代胰島素B鏈胺基酸第22號位的精胺酸(Arg)而得到胰島素B鏈變體。
  2. 如請求項1所述之胰島素類似物，其中該胰島素類似物展現對梭菌蛋白酶(enzyme clostripain)之切割(cleavage)的抗性。
  3. 如請求項1所述之胰島素類似物，其中該胰島素類似物更包含選自由下列所組成之群組中之一個或多個胺基酸取代：以序列識別號4的胺基酸序列表示的胰島素A鏈，在胰島素A鏈胺基酸第3號位之纈胺酸(Val)取代成白胺酸(Leu)；以序列識別號4的胺基酸序列表示的胰島素A鏈，在胰島素A鏈胺基酸第8號位之蘇胺酸(Thr)取代成天門冬胺酸(Asp)；以序列識別號4的胺基酸序列表示的胰島素A鏈，在胰島素A鏈胺基酸第10號位之異白胺酸(Ile)取代成離胺酸(Lys)；以序列識別號4的胺基酸序列表示的胰島素A鏈，在胰島素A鏈胺基酸第14號位之酪胺酸(Tyr)取代成麩胺酸(Glu)；以序列識別號4的胺基酸序列表示的胰島素A鏈，在胰島素A鏈胺基酸第19號位之酪胺酸(Tyr)取代成苯丙胺酸(Phe)；以識別號2的胺基酸序列表示的胰島素B鏈變體，在胰島素B鏈變體胺基酸第5號位之組胺酸(His)取代成蘇胺酸(Thr)；以序列識別號2的胺基酸序列表示的胰島素B鏈變體，在胰島素B鏈變體胺基酸第9號位之絲胺酸(Ser)取代成天門冬胺酸(Asp)；以序列識別號2的胺基酸序列表示的胰島素B鏈變體，在胰島素B鏈變體胺基酸第13號位之麩胺酸(Glu)取代成丙胺酸(Ala)；以序列識別號2的胺基酸序列表示的胰島素B鏈變體，在胰島素B鏈變體胺基酸第17號位之白胺酸(Leu)取代成麩醯胺酸(Gln)；以及以序列識別號2的胺基酸序列表示的胰島素B鏈變體，在胰島素B鏈變體胺基酸第24號位之苯丙胺酸(Phe)取代成絲胺酸(Ser)。
  4. 如請求項3所述之胰島素類似物，其中相較於天然胰島素，該胰島素類似物具有增加的體內半衰期。
  5. 一種多核苷酸，編碼如請求項1至4之任一項所述之胰島素類似物。
  6. 一種重組載體，包含如請求項5所述之多核苷酸。
  7. 一種重組微生物，導入如請求項6所述之載體。
  8. 一種長效型胰島素類似物衍生物，其中將一白蛋白結合域(Albumin-binding domain)融合於如請求項1至4之任一項所述之胰島素類似物。
  9. 如請求項8所述之長效型胰島素類似物衍生物，其中該白蛋白結合域包含一白蛋白結合模體(Albumin-binding motif)，該白蛋白結合模體以下列胺基酸序列表示：GVSDFYKKLIXa KAKTVEGVEALKXb Xc I其中Xa 獨立地選自D和E；Xb 獨立地選自D和E；以及Xc 獨立地選自A和E。
  10. 如請求項9所述之長效型胰島素類似物衍生物，其中該白蛋白結合域包含下列胺基酸序列：LAX3 AKX6 X7 ANX10 ELDX14 Y-[BM]-LX43 X44 LP其中[BN]為如請求項9所定義之白蛋白結合模體，X3 獨立地選自C、E、Q和S；X6 獨立地選自C、E和S；X7 獨立地選自A和S；X10 獨立地選自A、R和S；X14 獨立地選自A、C、K和S；X43 獨立地選自A和K；以及X44 獨立地選自A、E和S。
  11. 如請求項10所述之長效型胰島素類似物衍生物，其中該白蛋白結合域以選自由序列識別號6至13所組成之胺基酸序列識別號群組中的胺基酸序列表示。
  12. 如請求項11所述之長效型胰島素類似物衍生物，其中該白蛋白結合域以序列識別號6的胺基酸序列表示。
  13. 如請求項8所述之長效型胰島素類似物衍生物，其中該胰島素類似物和該白蛋白結合域以一胜肽鍵、一多肽連接鏈或一非多肽連接鏈彼此連接，該非多肽連接鏈選自由聚乙二醇(polyethylene glycol)、聚丙二醇(polypropylene glycol)、乙二醇-丙二醇共聚物(ethylene glycol-propylene glycol copolymer)、聚氧乙醇化多元醇(polyoxyethylated polyol)、聚乙烯醇(polyvinyl alcohol)、多醣(polysaccharides)、聚葡萄糖(dextran)、聚乙烯基乙基醚(polyvinyl ethyl ether)、生物可降解聚合物(biodegradable polymers)、脂肪酸(fatty acids)、核苷酸(nucleotides)、脂質聚合物(lipid polymers)、幾丁質(chitin)、玻尿酸(hyaluronic acid)及其組合所組成之群組。
  14. 如請求項13所述之長效型胰島素類似物衍生物，其中該多肽連接鏈為(GGGGS)n ，其中n為1至6的整數。
  15. 如請求項14所述之長效型胰島素類似物衍生物，其中該多肽連接鏈以序列識別號5的胺基酸序列表示。
  16. 一種重組載體，包含：如請求項5所述之多核苷酸；以及編碼一白蛋白結合域的多核苷酸，其中該白蛋白結合域包含以下列胺基酸序列表示的一白蛋白結合模體：GVSDFYKKLIXa KAKTVEGVEALKXb Xc I其中Xa 獨立地選自D和E；Xb 獨立地選自D和E；以及Xc 獨立地選自A和E。
  17. 如請求項16所述之重組載體，其中該白蛋白結合域包含下列胺基酸序列：LAX3 AKX6 X7 ANX10 ELDX14 Y-[BM]-LX43 X44 LP其中[BN]為如請求項16所定義之白蛋白結合模體，X3 獨立地選自C、E、Q和S；X6 獨立地選自C、E和S；X7 獨立地選自A和S；X10 獨立地選自A、R和S；X14 獨立地選自A、C、K和S；X43 獨立地選自A和K；以及X44 獨立地選自A、E和S。
  18. 如請求項17所述之重組載體，其中該白蛋白結合域以選自由序列識別號6至13所組成之胺基酸序列識別號群組中的胺基酸序列表示。
  19. 如請求項18所述之重組載體，其中該白蛋白結合域以序列識別號6的胺基酸序列表示。
  20. 一種重組微生物，導入如請求項16所述之重組載體。
  21. 一種方法，用於製造具有增加的體內半衰期之活化型(active form)的長效型胰島素類似物衍生物，該方法包含以下步驟：(a)培養如請求項20所述之重組微生物；(b)裂解所培養的重組微生物，從而獲得長效型胰島素類似物衍生物；(c)誘導所獲得之長效型胰島素類似物衍生物的再摺疊，從而獲得前驅型(pre-pro form)的胰島素類似物衍生物；(d)藉由使用梭菌蛋白酶(clostripain)和羧肽酶B (Carboxypeptidase B，CpB)處理，將前驅型的胰島素類似物衍生物轉換成活化型；以及(e)純化活化型的長效型胰島素類似物衍生物。
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