RU2781307C2 - Способ получения активной формы производного аналога инсулина длительного действия с использованием клострипаина - Google Patents
Способ получения активной формы производного аналога инсулина длительного действия с использованием клострипаина Download PDFInfo
- Publication number
- RU2781307C2 RU2781307C2 RU2021105179A RU2021105179A RU2781307C2 RU 2781307 C2 RU2781307 C2 RU 2781307C2 RU 2021105179 A RU2021105179 A RU 2021105179A RU 2021105179 A RU2021105179 A RU 2021105179A RU 2781307 C2 RU2781307 C2 RU 2781307C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- insulin
- chain
- albumin
- amino acid
- clostripain
- Prior art date
Links
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical class N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 314
- 239000004026 insulin derivative Substances 0.000 title claims abstract description 90
- 108090001092 Clostripain Proteins 0.000 title claims abstract description 57
- 108010092217 Long-Acting Insulin Proteins 0.000 title claims abstract description 21
- 102000016261 Long-Acting Insulin Human genes 0.000 title claims abstract description 21
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 14
- 102100001249 ALB Human genes 0.000 claims abstract description 60
- 101710027066 ALB Proteins 0.000 claims abstract description 60
- 229940050528 albumin Drugs 0.000 claims abstract description 60
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 39
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 claims description 102
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 claims description 102
- 108090000087 Carboxypeptidase B Proteins 0.000 claims description 38
- 102000003670 Carboxypeptidase B Human genes 0.000 claims description 38
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 32
- VHJLVAABSRFDPM-UHFFFAOYSA-N 1,4-dimercaptobutane-2,3-diol Chemical compound SCC(O)C(O)CS VHJLVAABSRFDPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 30
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 26
- 101800000896 Insulin B chain Proteins 0.000 claims description 24
- 102400000454 Insulin B chain Human genes 0.000 claims description 24
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 24
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 22
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 19
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 14
- 239000003638 reducing agent Substances 0.000 claims description 10
- 101800001819 Insulin A chain Proteins 0.000 claims description 9
- 102400000453 Insulin A chain Human genes 0.000 claims description 9
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 6
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 6
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 claims description 6
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N Glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 claims description 5
- 229960003180 Glutathione Drugs 0.000 claims description 5
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 5
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 5
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims description 5
- 229960002433 Cysteine Drugs 0.000 claims description 4
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 4
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 4
- PBVAJRFEEOIAGW-UHFFFAOYSA-N 3-[bis(2-carboxyethyl)phosphanyl]propanoic acid;hydrochloride Chemical compound Cl.OC(=O)CCP(CCC(O)=O)CCC(O)=O PBVAJRFEEOIAGW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229960005261 Aspartic Acid Drugs 0.000 claims description 3
- 229960002989 Glutamic Acid Drugs 0.000 claims description 3
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 claims description 3
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims description 3
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 claims description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 claims description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 3
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 2-mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229920002101 Chitin Polymers 0.000 claims description 2
- DJHJJVWPFGHIPH-OODMECLYSA-N Chitin Chemical compound O[C@@H]1C(NC(=O)C)[C@H](O)OC(CO)[C@H]1COC[C@H]1C(NC(C)=O)[C@@H](O)[C@H](COC[C@H]2C([C@@H](O)[C@H](O)C(CO)O2)NC(C)=O)C(CO)O1 DJHJJVWPFGHIPH-OODMECLYSA-N 0.000 claims description 2
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 claims description 2
- 229920001451 Polypropylene glycol Polymers 0.000 claims description 2
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 claims description 2
- 239000004621 biodegradable polymer Substances 0.000 claims description 2
- 229920002988 biodegradable polymer Polymers 0.000 claims description 2
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 claims description 2
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 claims description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 claims description 2
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 claims description 2
- 150000004676 glycans Polymers 0.000 claims description 2
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N glycol Chemical group OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 claims description 2
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 claims description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims description 2
- 229920001583 poly(oxyethylated polyols) Polymers 0.000 claims description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 claims description 2
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 claims description 2
- 150000004804 polysaccharides Polymers 0.000 claims description 2
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 claims description 2
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N propylene glycol Substances CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- MAKUBRYLFHZREJ-JWBQXVCJSA-M sodium;(2S,3S,4R,5R,6R)-3-[(2S,3R,5S,6R)-3-acetamido-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-4,5,6-trihydroxyoxane-2-carboxylate Chemical compound [Na+].CC(=O)N[C@@H]1C[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](C([O-])=O)O[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O MAKUBRYLFHZREJ-JWBQXVCJSA-M 0.000 claims description 2
- 229920002554 vinyl polymer Polymers 0.000 claims description 2
- JEPNOJXFZHBCTB-ZCUALFGZSA-N Insulin C chain Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N1[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)CCC1 JEPNOJXFZHBCTB-ZCUALFGZSA-N 0.000 claims 2
- 108010076181 Proinsulin Proteins 0.000 abstract description 21
- 206010012601 Diabetes mellitus Diseases 0.000 abstract description 14
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 14
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 abstract description 13
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 abstract description 13
- 229960001322 trypsin Drugs 0.000 abstract description 13
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 abstract description 13
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 abstract description 12
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 230000001225 therapeutic Effects 0.000 abstract 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 38
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 34
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 34
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 27
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 23
- 210000004369 Blood Anatomy 0.000 description 18
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N D-Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 18
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 18
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 18
- 108010049041 glutamylalanine Proteins 0.000 description 18
- 230000001965 increased Effects 0.000 description 18
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N β-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 18
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 description 17
- VYZAGTDAHUIRQA-WHFBIAKZSA-N L-alanyl-L-glutamic acid Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O VYZAGTDAHUIRQA-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 16
- JZDHUJAFXGNDSB-WHFBIAKZSA-N Glu-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O JZDHUJAFXGNDSB-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 15
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 14
- 230000036499 Half live Effects 0.000 description 14
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 12
- UPJONISHZRADBH-XPUUQOCRSA-N Val-Glu Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O UPJONISHZRADBH-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 10
- 230000001131 transforming Effects 0.000 description 10
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 9
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 9
- ZOKVLMBYDSIDKG-CSMHCCOUSA-N Lys-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN ZOKVLMBYDSIDKG-CSMHCCOUSA-N 0.000 description 9
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 9
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 9
- QXRNAOYBCYVZCD-BQBZGAKWSA-N (2S)-6-amino-2-[[(2S)-2-aminopropanoyl]amino]hexanoic acid Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN QXRNAOYBCYVZCD-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 8
- PVMPDMIKUVNOBD-CIUDSAMLSA-N (3S)-3-[[(2S)-2-amino-4-methylpentanoyl]amino]-4-[[(1S)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O PVMPDMIKUVNOBD-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 8
- CCUAQNUWXLYFRA-IMJSIDKUSA-N Ala-Asn Chemical compound C[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@H](C([O-])=O)CC(N)=O CCUAQNUWXLYFRA-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 8
- YZQCXOFQZKCETR-UWVGGRQHSA-N Asp-Phe Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 YZQCXOFQZKCETR-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 8
- 108010075254 C-Peptide Proteins 0.000 description 8
- QOOWRKBDDXQRHC-BQBZGAKWSA-N L-lysyl-L-alanine Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN QOOWRKBDDXQRHC-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 8
- VTJUNIYRYIAIHF-IUCAKERBSA-N Leu-Pro Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O VTJUNIYRYIAIHF-IUCAKERBSA-N 0.000 description 8
- ATIPDCIQTUXABX-UWVGGRQHSA-N Lys-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN ATIPDCIQTUXABX-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 8
- HPYDSVWYXXKHRD-VIFPVBQESA-N Tyr-Gly Chemical compound [O-]C(=O)CNC(=O)[C@@H]([NH3+])CC1=CC=C(O)C=C1 HPYDSVWYXXKHRD-VIFPVBQESA-N 0.000 description 8
- AOLHUMAVONBBEZ-STQMWFEESA-N Tyr-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 AOLHUMAVONBBEZ-STQMWFEESA-N 0.000 description 8
- STTYIMSDIYISRG-WDSKDSINSA-N Val-Ser Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O STTYIMSDIYISRG-WDSKDSINSA-N 0.000 description 8
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 108010069205 aspartyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 8
- 229920003013 deoxyribonucleic acid Polymers 0.000 description 8
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 8
- STKYPAFSDFAEPH-LURJTMIESA-N gly-val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CN STKYPAFSDFAEPH-LURJTMIESA-N 0.000 description 8
- 108010037850 glycylvaline Proteins 0.000 description 8
- 108010057821 leucylproline Proteins 0.000 description 8
- 108010009298 lysylglutamic acid Proteins 0.000 description 8
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 108010051110 tyrosyl-lysine Proteins 0.000 description 8
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 7
- 125000000511 arginine group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 238000000034 method Methods 0.000 description 7
- 229940088598 Enzyme Drugs 0.000 description 6
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 6
- 108091006822 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 6
- OTXBNHIUIHNGAO-UWVGGRQHSA-N Leu-Lys Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN OTXBNHIUIHNGAO-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 6
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 6
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 6
- 108010034529 leucyl-lysine Proteins 0.000 description 6
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 6
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 6
- 210000003000 Inclusion Bodies Anatomy 0.000 description 5
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 5
- 230000002255 enzymatic Effects 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 5
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 5
- KTGFOCFYOZQVRJ-UHFFFAOYSA-N 2-[(2-amino-3-methylpentanoyl)amino]pentanedioic acid Chemical compound CCC(C)C(N)C(=O)NC(C(O)=O)CCC(O)=O KTGFOCFYOZQVRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- JWBXCSQZLLIOCI-GUBZILKMSA-N Ile-Leu Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(C)C JWBXCSQZLLIOCI-GUBZILKMSA-N 0.000 description 4
- 102000003746 Insulin Receptor Human genes 0.000 description 4
- 108010001127 Insulin Receptor Proteins 0.000 description 4
- WKXVAXOSIPTXEC-UHFFFAOYSA-N Isoleucyl-Aspartate Chemical compound CCC(C)C(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC(O)=O WKXVAXOSIPTXEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 4
- 210000000496 Pancreas Anatomy 0.000 description 4
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 4
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 208000001072 Type 2 Diabetes Mellitus Diseases 0.000 description 4
- 108010092854 aspartyllysine Proteins 0.000 description 4
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M buffer Substances [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L cacl2 Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 102000037240 fusion proteins Human genes 0.000 description 4
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 4
- 230000002068 genetic Effects 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 4
- 108010013359 miniproinsulin Proteins 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 230000036231 pharmacokinetics Effects 0.000 description 4
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 4
- 108010066381 preproinsulin Proteins 0.000 description 4
- 230000001105 regulatory Effects 0.000 description 4
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 229940110715 ENZYMES FOR TREATMENT OF WOUNDS AND ULCERS Drugs 0.000 description 3
- 210000002472 Endoplasmic Reticulum Anatomy 0.000 description 3
- 210000003935 Endoplasmic Reticulum, Rough Anatomy 0.000 description 3
- BCCRXDTUTZHDEU-VKHMYHEASA-N Gly-Ser Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O BCCRXDTUTZHDEU-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N L-serine Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- 229920001850 Nucleic acid sequence Polymers 0.000 description 3
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 3
- GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N Tris Chemical compound OCCN(CCO)CCO GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 210000000227 basophil cell of anterior lobe of hypophysis Anatomy 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 229940020899 hematological Enzymes Drugs 0.000 description 3
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 3
- 239000002609 media Substances 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 229920000023 polynucleotide Polymers 0.000 description 3
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 3
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 3
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 3
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 3
- AUTNXSQEVVHSJK-YVNDNENWSA-N (2S,3S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-4-carboxybutanoyl]amino]-4-carboxybutanoyl]amino]-3-methylpentanoic acid Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O AUTNXSQEVVHSJK-YVNDNENWSA-N 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 1-[(1S,2R,3R,4S,5R,6R)-3-carbamimidamido-6-{[(2R,3R,4R,5S)-3-{[(2S,3S,4S,5R,6S)-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-3-(methylamino)oxan-2-yl]oxy}-4-formyl-4-hydroxy-5-methyloxolan-2-yl]oxy}-2,4,5-trihydroxycyclohexyl]guanidine Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- ZSOICJZJSRWNHX-ACZMJKKPSA-N Ala-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@H](C)[NH3+] ZSOICJZJSRWNHX-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 2
- CKAJHWFHHFSCDT-WHFBIAKZSA-N Asp-Glu Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O CKAJHWFHHFSCDT-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 102000005593 Endopeptidases Human genes 0.000 description 2
- 108010059378 Endopeptidases Proteins 0.000 description 2
- 229940066758 Endopeptidases Drugs 0.000 description 2
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 2
- COCFEDIXXNGUNL-RFKWWTKHSA-N Glargine Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(=O)NCC(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 COCFEDIXXNGUNL-RFKWWTKHSA-N 0.000 description 2
- 102000005720 Glutathione Transferase family Human genes 0.000 description 2
- 108010070675 Glutathione Transferase family Proteins 0.000 description 2
- 108010057186 Insulin Glargine Proteins 0.000 description 2
- 229960002869 Insulin Glargine Drugs 0.000 description 2
- 206010022489 Insulin resistance Diseases 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N Kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 108020004999 Messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 208000008466 Metabolic Disease Diseases 0.000 description 2
- 229960005190 Phenylalanine Drugs 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 description 2
- 102000019197 Superoxide Dismutase Human genes 0.000 description 2
- 108010012715 Superoxide Dismutase Proteins 0.000 description 2
- 108010038633 aspartylglutamate Proteins 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 230000002759 chromosomal Effects 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 230000000875 corresponding Effects 0.000 description 2
- 108010016616 cysteinylglycine Proteins 0.000 description 2
- 230000004059 degradation Effects 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 2
- 108010001064 glycyl-glycyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 2
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 2
- 230000001976 improved Effects 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl β-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- 230000002934 lysing Effects 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000001404 mediated Effects 0.000 description 2
- 229920002106 messenger RNA Polymers 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000030788 protein refolding Effects 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 235000019333 sodium laurylsulphate Nutrition 0.000 description 2
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 2
- BRZYSWJRSDMWLG-DJWUNRQOSA-N (2R,3R,4R,5R)-2-[(1S,2S,3R,4S,6R)-4,6-diamino-3-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-amino-4,5-dihydroxy-6-[(1R)-1-hydroxyethyl]oxan-2-yl]oxy-2-hydroxycyclohexyl]oxy-5-methyl-4-(methylamino)oxane-3,5-diol Chemical compound O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]([C@@H](C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-DJWUNRQOSA-N 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TUTIHHSZKFBMHM-UHFFFAOYSA-N 4-amino-5-[(3-amino-1-carboxy-3-oxopropyl)amino]-5-oxopentanoic acid Chemical compound OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O TUTIHHSZKFBMHM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710006746 7.5K Proteins 0.000 description 1
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 1
- 108010076441 Ala-His-His Proteins 0.000 description 1
- BUQICHWNXBIBOG-LMVFSUKVSA-N Ala-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)N BUQICHWNXBIBOG-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N Ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- OMLWNBVRVJYMBQ-YUMQZZPRSA-N Arg-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O OMLWNBVRVJYMBQ-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- SONUFGRSSMFHFN-IMJSIDKUSA-N Asn-Ser Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O SONUFGRSSMFHFN-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- 101710044578 At3g10140 Proteins 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 240000008371 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 229940075615 Bacillus subtilis Drugs 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 102100019264 CPE Human genes 0.000 description 1
- 229960003669 Carbenicillin Drugs 0.000 description 1
- FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N Carbenicillin Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)C(C(O)=O)C1=CC=CC=C1 FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N 0.000 description 1
- 108010058255 Carboxypeptidase H Proteins 0.000 description 1
- 102000005367 Carboxypeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010006303 Carboxypeptidases Proteins 0.000 description 1
- 208000008787 Cardiovascular Disease Diseases 0.000 description 1
- 229960005091 Chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N Chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 229920001405 Coding region Polymers 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- YXQDRIRSAHTJKM-IMJSIDKUSA-N Cys-Ser Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YXQDRIRSAHTJKM-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- AYKQJQVWUYEZNU-UHFFFAOYSA-N Cysteinyl-Asparagine Chemical compound SCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC(N)=O AYKQJQVWUYEZNU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WYVKPHCYMTWUCW-UHFFFAOYSA-N Cysteinyl-Threonine Chemical compound CC(O)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CS WYVKPHCYMTWUCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N D-sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229960000633 Dextran Sulfate Drugs 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- 229920001272 Exogenous DNA Polymers 0.000 description 1
- 102000018389 Exopeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010091443 Exopeptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000012541 Fractogel® Substances 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 208000004104 Gestational Diabetes Diseases 0.000 description 1
- YBAFDPFAUTYYRW-YUMQZZPRSA-N Glu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O YBAFDPFAUTYYRW-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- XIPZDANNDPMZGQ-UHFFFAOYSA-N Glutaminyl-Cysteine Chemical compound NC(=O)CCC(N)C(=O)NC(CS)C(O)=O XIPZDANNDPMZGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JZOYFBPIEHCDFV-UHFFFAOYSA-N Glutaminyl-Histidine Chemical compound NC(=O)CCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CN=CN1 JZOYFBPIEHCDFV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MRVYVEQPNDSWLH-UHFFFAOYSA-N Glutaminyl-Valine Chemical compound CC(C)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(N)=O MRVYVEQPNDSWLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IEFJWDNGDZAYNZ-BYPYZUCNSA-N Gly-Glu Chemical compound NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O IEFJWDNGDZAYNZ-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- KGVHCTWYMPWEGN-FSPLSTOPSA-N Gly-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CN KGVHCTWYMPWEGN-FSPLSTOPSA-N 0.000 description 1
- 210000002288 Golgi Apparatus Anatomy 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N HCl Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000009889 Herpes Simplex Diseases 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- MMFKFJORZBJVNF-UWVGGRQHSA-N His-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 MMFKFJORZBJVNF-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- 229940088597 Hormone Drugs 0.000 description 1
- 229960000310 ISOLEUCINE Drugs 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 125000003290 L-leucino group Chemical group [H]OC(=O)[C@@]([H])(N([H])[*])C([H])([H])C(C([H])([H])[H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000000510 L-tryptophano group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C2N([H])C([H])=C(C([H])([H])[C@@]([H])(C(O[H])=O)N([H])[*])C2=C1[H] 0.000 description 1
- HIZYETOZLYFUFF-BQBZGAKWSA-N Leu-Cys Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O HIZYETOZLYFUFF-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- NFNVDJGXRFEYTK-YUMQZZPRSA-N Leu-Glu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O NFNVDJGXRFEYTK-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- JYOAXOMPIXKMKK-UHFFFAOYSA-N Leucyl-Glutamine Chemical compound CC(C)CC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CCC(N)=O JYOAXOMPIXKMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HGNRJCINZYHNOU-LURJTMIESA-N Lys-Gly Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O HGNRJCINZYHNOU-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- 241000282567 Macaca fascicularis Species 0.000 description 1
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 1
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 108010079364 N-glycylalanine Proteins 0.000 description 1
- 210000001672 Ovary Anatomy 0.000 description 1
- FSXRLASFHBWESK-HOTGVXAUSA-N Phe-Tyr Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 FSXRLASFHBWESK-HOTGVXAUSA-N 0.000 description 1
- ZKQOUHVVXABNDG-IUCAKERBSA-N Pro-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 ZKQOUHVVXABNDG-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 241000589776 Pseudomonas putida Species 0.000 description 1
- 206010038923 Retinopathy Diseases 0.000 description 1
- 206010038932 Retinopathy Diseases 0.000 description 1
- 235000003534 Saccharomyces carlsbergensis Nutrition 0.000 description 1
- 229940081969 Saccharomyces cerevisiae Drugs 0.000 description 1
- 241000235347 Schizosaccharomyces pombe Species 0.000 description 1
- WOUIMBGNEUWXQG-VKHMYHEASA-N Ser-Gly Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O WOUIMBGNEUWXQG-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- NFDYGNFETJVMSE-BQBZGAKWSA-N Ser-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO NFDYGNFETJVMSE-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- XZKQVQKUZMAADP-IMJSIDKUSA-N Ser-Ser Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O XZKQVQKUZMAADP-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- BXLYSRPHVMCOPS-UHFFFAOYSA-N Serinyl-Isoleucine Chemical compound CCC(C)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CO BXLYSRPHVMCOPS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HBMJWWWQQXIZIP-UHFFFAOYSA-N Silicon carbide Chemical compound [Si+]#[C-] HBMJWWWQQXIZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- 229960005322 Streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 229960001052 Streptozocin Drugs 0.000 description 1
- ZSJLQEPLLKMAKR-GKHCUFPYSA-N Streptozotocin Chemical compound O=NN(C)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O ZSJLQEPLLKMAKR-GKHCUFPYSA-N 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-GDQSFJPYSA-N Sucrose Natural products O([C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)[C@@]1(CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-GDQSFJPYSA-N 0.000 description 1
- PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N TCEP Chemical compound OC(=O)CCP(CCC(O)=O)CCC(O)=O PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710002875 TYRO3 Proteins 0.000 description 1
- 229960002180 Tetracycline Drugs 0.000 description 1
- OFVLGDICTFRJMM-WESIUVDSSA-N Tetracycline Chemical compound C1=CC=C2[C@](O)(C)[C@H]3C[C@H]4[C@H](N(C)C)C(O)=C(C(N)=O)C(=O)[C@@]4(O)C(O)=C3C(=O)C2=C1O OFVLGDICTFRJMM-WESIUVDSSA-N 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- BIYXEUAFGLTAEM-WUJLRWPWSA-N Thr-Gly Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O BIYXEUAFGLTAEM-WUJLRWPWSA-N 0.000 description 1
- QOLYAJSZHIJCTO-VQVTYTSYSA-N Thr-Pro Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O QOLYAJSZHIJCTO-VQVTYTSYSA-N 0.000 description 1
- GXDLGHLJTHMDII-WISUUJSJSA-N Thr-Ser Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O GXDLGHLJTHMDII-WISUUJSJSA-N 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- UBAQSAUDKMIEQZ-QWRGUYRKSA-N Tyr-Gln Chemical compound NC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 UBAQSAUDKMIEQZ-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 210000001186 Vagus Nerve Anatomy 0.000 description 1
- WITCOKQIPFWQQD-FSPLSTOPSA-N Val-Asn Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O WITCOKQIPFWQQD-FSPLSTOPSA-N 0.000 description 1
- WPSXZFTVLIAPCN-UHFFFAOYSA-N Valyl-Cysteine Chemical compound CC(C)C(N)C(=O)NC(CS)C(O)=O WPSXZFTVLIAPCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003213 activating Effects 0.000 description 1
- 230000001058 adult Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 108010068380 arginylarginine Proteins 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal Effects 0.000 description 1
- 238000005047 biotechnology Methods 0.000 description 1
- 238000006664 bond formation reaction Methods 0.000 description 1
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003560 cancer drug Substances 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001413 cellular Effects 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 108010004073 cysteinylcysteine Proteins 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 229960002086 dextran Drugs 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 201000010870 diseases of metabolism Diseases 0.000 description 1
- 238000009509 drug development Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drugs Drugs 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N edta Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001516 effect on protein Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing Effects 0.000 description 1
- 230000028023 exocytosis Effects 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 230000005182 global health Effects 0.000 description 1
- 108010057083 glutamyl-aspartyl-leucine Proteins 0.000 description 1
- VPZXBVLAVMBEQI-VKHMYHEASA-N gly ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- KZNQNBZMBZJQJO-YFKPBYRVSA-N gly pro Chemical compound NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O KZNQNBZMBZJQJO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 108010082286 glycyl-seryl-alanine Proteins 0.000 description 1
- 108010010147 glycylglutamine Proteins 0.000 description 1
- 108010077515 glycylproline Proteins 0.000 description 1
- 239000001963 growth media Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 108010028295 histidylhistidine Proteins 0.000 description 1
- 108010025306 histidylleucine Proteins 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229910000041 hydrogen chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 201000001421 hyperglycemia Diseases 0.000 description 1
- 230000001771 impaired Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory Effects 0.000 description 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 1
- 108010027338 isoleucylcysteine Proteins 0.000 description 1
- 238000011031 large scale production Methods 0.000 description 1
- 108010044311 leucyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 101710030587 ligN Proteins 0.000 description 1
- 101700077585 ligd Proteins 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 108010053229 lysyl endopeptidase Proteins 0.000 description 1
- 108010064235 lysylglycine Proteins 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 108091022076 maltose binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cells Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- -1 neomycin Chemical compound 0.000 description 1
- 238000007500 overflow downdraw method Methods 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 108010073025 phenylalanylphenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 101700054060 phoA Proteins 0.000 description 1
- 101710016966 phoA2 Proteins 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- OZAIFHULBGXAKX-UHFFFAOYSA-N precursor Substances N#CC(C)(C)N=NC(C)(C)C#N OZAIFHULBGXAKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010090894 prolylleucine Proteins 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 210000001938 protoplasts Anatomy 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 108091007521 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000000717 retained Effects 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 108010048818 seryl-histidine Proteins 0.000 description 1
- 229910010271 silicon carbide Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000003381 solubilizing Effects 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating Effects 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing Effects 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 108010061238 threonyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 210000003412 trans-Golgi Network Anatomy 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 238000003151 transfection method Methods 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- IOUPEELXVYPCPG-UHFFFAOYSA-N val-gly Chemical compound CC(C)C(N)C(=O)NCC(O)=O IOUPEELXVYPCPG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 230000003442 weekly Effects 0.000 description 1
Abstract
Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению производных инсулина, и может быть использовано в медицине для лечения диабета. Предложенное изобретение позволяет получить активную форму производного аналога инсулина длительного действия, таким образом, что аналог инсулина может быть превращен в активную форму без расщепления В-цепи, даже когда он взаимодействует с клострипаином. В традиционном способе превращения проинсулина в активную форму посредством применения трипсина, альбумин-связывающий домен расщепляется, затрудняя превращение производного аналога инсулина длительного действия в активную форму. Способ получения согласно настоящему изобретению преодолевает данную трудность, и, таким образом, он может эффективно использоваться для получения длительно действующего терапевтического средства для лечения диабета. 2 н. и 12 з.п. ф-лы, 12 ил., 5 табл., 10 пр.
Description
Область техники
Настоящее изобретение относится к способу получения активной формы производного аналога инсулина длительного действия с использованием клострипаина и, более конкретно, к способу получения активной формы производного аналога инсулина длительного действия, в котором аминокислота аргинин (Arg) в положении 22 В-цепи инсулина заменена на лизин (Lys), таким образом, что аналог инсулина может быть превращен в активную форму без расщепления В-цепи, даже когда он взаимодействует с клострипаином.
Предшествующий уровень техники
Диабет представляет собой метаболическое заболевание, отличающееся высокими уровнями глюкозы, и развивается в результате сочетания генетических факторов и факторов окружающей среды. Диабет включает диабет 1-го типа, диабет 2-го типа, гестационный диабет и другие состояния, которые вызывают гипергликемию. Диабет подразумевает нарушение метаболизма, при котором поджелудочная железа продуцирует недостаточные количества инсулина или при котором клетки организма человека не способны соответствующим образом отвечать на инсулин, и, таким образом, их способность поглощать глюкозу нарушается. В результате, глюкоза накапливается в крови.
Диабет 1-го типа, также называемый инсулинозависимым сахарным диабетом (IDDM - от англ. insulin-dependent diabetes mellitus) и юношеским диабетом, обусловлен разрушением бета-клеток, приводящим к абсолютному дефициту инсулина. С другой стороны, диабет 2-го типа, известный как инсулиннезависимый сахарный диабет (NIDDM - от англ. non-insulin dependent diabetes mellitus) и приобретенный диабет, ассоциирован с преобладающей инсулинорезистентностью и, таким образом, относительным дефицитом инсулина и/или преобладающим дефектом секреции инсулина с инсулинорезистентностью.
В частности, диабет ассоциирован с разными осложнениями, такими как сердечно-сосудистое заболевание и ретинопатия, и, вследствие этого, представляет собой заболевание, которое становится очень тяжелым, если не оказывается надлежащий контроль течения заболевания, как например, контроль уровня глюкозы в крови. Ожидается, что мировой рынок лекарственных средств против диабета расширится с $ 41,7 миллиарда в 2015 году до $ 66,1 миллиардов к 2022 году, и, как ожидается, станет вторым по величине после рынка противораковых лекарственных средств. Глобально, имеется 422 миллиона взрослых людей с диабетом в 2014 году, что составляет 8,5% всего взрослого населения, почти в два раза больше, по сравнению с 4,5% в 1980 году (ВОЗ (Всемирная организация здравоохранения), 2016 год). Кроме того, общие всемирные расходы на здравоохранение из-за диабета оцениваются на уровне $ 673 миллиардов, и ожидается, что число пациентов с диабетом в возрасте 20-79 лет будет увеличиваться до примерно 620 миллионов к 2040 году.
Наиболее репрезентативные способы лечения диабета включают способ введения инсулина для контроля уровня глюкозы в крови пациента до нормального уровня. Инсулин представляет собой гормон, регулирующий уровень глюкозы в крови, который секретируется в поджелудочной железе человека. Он функционирует, осуществляя перенос избытка глюкозы в крови к клеткам, снабжая клетки энергией и поддерживая уровни глюкозы в крови на нормальных уровнях.
Инсулин подвергается разным посттрансляционным модификациям на протяжении пути образования. Продукция и секреция главным образом независимы; полученный инсулин хранится в ожидании секреции. Как С-пептид, так и зрелый инсулин являются биологически активными.
У млекопитающих инсулин синтезируется в бета-клетках поджелудочной железы. Инсулин состоит из двух полипептидных цепей (А-цепи и В-цепи), которые связаны друг с другом дисульфидными связями. Однако, инсулин сначала синтезируется в виде одного единственного полипептида, называемого препроинсулином, в бета-клетках поджелудочной железы. Препроинсулин содержит сигнальный пептид из 24 аминокислот, который направляет выделяющуюся полипептидную цепь к шероховатому эндоплазматическому ретикулуму. Сигнальный пептид транслоцируется в просвет шероховатого эндоплазматического ретикулума и затем расщепляется, с образованием, вследствие этого, проинсулина. В шероховатом эндоплазматическом ретикулуме проинсулин сворачивается в правильной конформации, и образуется три дисульфидные связи. Через 5-10 минут после его сборки в эндоплазматическом ретикулуме проинсулин транспортируется в транс-сеть Гольджи, где образуются незрелые гранулы.
Проинсулин подвергается созреванию в активный инсулин под действием клеточных эндопептидаз, известных как прогормонконвертазы (РС1 и РС2), а также карбоксипептидазы Е, которая представляет собой экзопротеазу. Эндопептидазы осуществляют расщепление в 2 положениях, высвобождая фрагмент, называемый С-пептидом, и оставляя 2 пептидные цепи, В- и А-цепи, связанные 2 дисульфидными связями. Каждый из сайтов расщепления расположен после пары основных остатков (лизин (Lys)-64 и аргинин (Arg)-65, и аргинин (Arg)-31 и аргинин (Arg)-32). После расщепления С-пептида данные 2 пары основных остатков удаляются под действием карбоксипептидазы. С-пептид расположен в центральной части проинсулина, и первичная последовательность проинсулина находится в следующем порядке «В-С-А» (В-цепь и А-цепь идентифицировали, исходя из массы, и С-пептид был открыт позже).
Полученный зрелый инсулин (активный инсулин) упакован внутри зрелых гранул, ожидая метаболические сигналы (например, лейцин (Leu), аргинин (Arg), глюкоза и манноза) и стимуляцию блуждающего нерва для экзоцитоза из клетки в кровоток.
Для лечения диабета вводят активный инсулин. Технологии получения активного инсулина с использованием технологии рекомбинантных ДНК выглядят следующим образом. Сначала, в Eli Lilly Corp. использовали способ, который включает следующие стадии: экспрессия А-цепи и В-цепи по отдельности с использованием Е.coli, и смешивание А-цепи и В-цепи in vitro с образованием дисульфидных мостиков, со связыванием, таким образом, А- и В-цепей друг с другом дисульфидными связями. Однако, в данном способе имелась проблема, заключающаяся в том, что эффективность продукции являлась низкой. В таком случае, в Eli Lilly Corp. разработали способ, который включает следующие стадии: экспрессия проинсулина; образование дисульфидных связей in vitro; и затем отщепление С-пептида от продукта под действием трипсина и карбоксипептидазы В, с продукцией, таким образом, инсулина.
В Novo Nordisk Corp. разработали способ, который включает следующие стадии: экспрессия минипроинсулина, содержащего В-цепь и А-цепь, связанные двумя основными аминокислотами, в дрожжах; и затем обработка минипроинсулина трипсином с продукцией инсулина. Данный способ имеет преимущества, заключающиеся в том, что дисульфидные связи образуются во время экспрессии и секреции минипроинсулина и что минипроинсулин легко выделяется и очищается, поскольку он секретируется в культуральную среду. Однако, данный способ было сложно применять для крупномасштабного производства, сопоставимо с продукцией с использованием Е. coli.
С тех пор, активно ведется разработка новых способов получения инсулина посредством технологии рекомбинантных ДНК. Hoechst AG разработали способ, который включает следующие стадии: экспрессия нового производного инсулина или препроинсулина в Е. coli; и образование дисульфидных связей in vitro с последующей обработкой лизилэндопептидазой или клострипаином и карбоксипептидазой В, с получением, таким образом, инсулина. В Bio-Technology General Corp. разработали способ, в котором слитый белок, содержащий супероксиддисмутазу (SOD - от англ. superoxide dismutase), связанную с проинсулином, экспрессируется в Е. coli для повышения эффективности экспрессии и эффективности образования дисульфидных связей in vitro. Превращение проинсулина в инсулин проводили под действием трипсина и карбоксипептидазы В. Как описано выше, многие способы получения инсулина посредством технологии рекомбинантных ДНК пробовали и улучшали в отношении эффективности экспрессии, эффективности образования дисульфидных связей и процесса превращения проинсулина в инсулин (KR 10-2001-7013921).
Авторы настоящего изобретения сделали всесторонние попытки разработать способ получения, подходящий для нового производного аналога инсулина длительного действия, разработанного авторами настоящего изобретения, которое имеет увеличенный период полувыведения in vivo, приводя к улучшению длительности действия, по сравнению с нативным инсулином, и, как результат, обнаружили, что применение клострипаина делает возможным эффективное получение нового производного аналога инсулина длительного действия, разработанного авторами настоящего изобретения, таким образом, осуществляя настоящее изобретение.
Раскрытие изобретения
Техническая проблема
Цель настоящего изобретения заключается в предложении способа получения активной формы нового производного аналога инсулина длительного действия.
Техническое решение
Для достижения указанной выше цели, согласно настоящему изобретению предложен способ получения активной формы производного аналога инсулина длительного действия, причем способ включает стадию взаимодействия производного аналога инсулина, которое содержит аналог инсулина, содержащий вариант В-цепи инсулина, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 2, аргинин (Arg) в положении аминокислоты 22 В-цепи инсулина замещен лизином (Lys) в нативном инсулине, и слитый с ним альбумин-связывающий домен, с клострипаином.
Согласно настоящему изобретению также предложено производное аналога инсулина длительного действия, полученное данным способом.
Краткое описание графических материалов
На Фиг. 1 показаны результаты анализа стабильности производного аналога инсулина длительного действия, сконструированного посредством замены аргинина (Arg) в положении 22 В-цепи инсулина лизином (Lys), посредством обработки клострипаином. Масс-спектрометрия показала, что когда в В-цепи инсулина содержался аргинин (Arg) в положении 22, происходило ее расщепление, а когда аргинин (Arg) был заменен лизином (Lys), расщепления В-цепи не происходило.
На Фиг. 2 показаны результаты анализа экспрессии производных аналога инсулина длительного действия 1-10 в рекомбинантных Е.coli посредством SDS-PAGE (от англ. sodium dodecyl sulphate - polyacrylamide gel electrophoresis - электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия). Даже когда одну или более мутаций вводили в последовательность инсулина, сохранялась экспрессия белка в Е.coli.
На Фиг. 3 показаны результаты отслеживания солюбилизации и повторного сворачивания аналога инсулина 4, слитого с альбумин-связывающий доменом (ABD, от англ. - albumin-binding domain), посредством ОФ-ВЭЖХ (Обращенно-фазовая высоко-эффективная жидкостная хроматография). Когда структура белка была несвернута в результате солюбилизации и сопровождалась индукцией повторного сворачивания, наблюдали сдвиг времени удерживания в ОФ-ВЭЖХ вследствие образования трехмерной структуры.
На Фиг. 4 показаны результаты SDS-PAGE, проводимого для анализа эффективности получения активной формы аналога инсулина 4, слитого с ABD, посредством обработки клострипаином в зависимости от добавления ДТТ (Дитиотреитол).
На Фиг. 5 показаны результаты SDS-PAGE, проводимого для анализа эффективности получения активной формы аналога инсулина 4, слитого с ABD, в зависимости от времени обработки клострипаином и СрВ.
На Фиг. 6 показаны результаты SDS-PAGE, проводимого для определения диапазона рН, в котором активную форму аналога инсулина 4, слитого с ABD, получают с высокой эффективностью при одновременной обработке клострипаином и СрВ.
На Фиг. 7 показаны результаты SDS-PAGE, проводимого для анализа эффективности получения активной формы аналога инсулина 4, слитого с ABD, в зависимости от дополнительного добавления клострипаина и ДТТ.
На Фиг. 8 показаны результаты подтверждения эффектов повышения эффективности превращения в активную форму слитого с ABD аналога инсулина 4 и уменьшения примесей в оптимальных условиях ферментативной реакции в соответствии с примером настоящего изобретения (молекулярная масса основной примеси: 10296 Да; молекулярная масса активной формы инсулина: 11238 Да).
На Фиг. 9 показаны результаты SDS-PAGE, проводимого для определения температурного диапазона, в котором активную форму аналога инсулина 4, слитого с ABD, получают с высокой эффективностью при одновременной обработке клострипаином и СрВ.
На Фиг. 10 показаны результаты анализа аналога инсулина 4, слитого с ABD, посредством SDS-PAGE после расщепления под действием клострипаина и СрВ и его очистки.
На Фиг. 11 показаны результаты анализа - эксклюзионной хроматографии, проводимого для исследования того, будет ли образовываться гексамер, когда цинк и фенол добавляют к аналогу инсулина 4, слитому с ABD, в соответствии с примером настоящего изобретения.
На Фиг. 12 показаны результаты оценки способности аналогов инсулина, слитых с ABD, снижать уровень глюкозы в крови в соответствии с примером настоящего изобретения.
Наилучший способ осуществления изобретения
Если не определено иное, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют то же значение, обычно подразумеваемое одним из средних специалистов в области, к которой принадлежит данное раскрытие. В общем, номенклатура, используемая в данном документе, хорошо известна и обычно используется в данной области.
Аналог инсулина, полученный в результате осуществления замены одной или более аминокислот нативного инсулина, имеет увеличенный период полувыведения in vivo, и, таким образом, может использоваться в качестве основного средства инсулинотерапии. Когда данный аналог инсулина связывается с альбумином в организме человека, его период полувыведения in vivo может дополнительно увеличиваться, таким образом, что аналог инсулина может быть использован в виде композиции для еженедельного введения.
Авторы настоящего изобретения смогли обнаружить, что когда одна или более аминокислот нативного инсулина заменены, период полувыведения in vivo инсулина может быть увеличен, и когда с ним дополнительно слит альбумин-связывающий домен, инсулин может связываться с альбумином in vivo, и, таким образом, его период полувыведения может дополнительно увеличиваться. Однако, когда альбумин-связывающий домен был слит с аналогом инсулина, содержащим одну или более аминокислотных замен, и когда трипсин, используемый в известном уровне техники, использовали в процессе превращения аналога инсулина в активную форму, возникала проблема, заключающаяся в том, что происходило расщепление самого альбумин-связывающего домена, затрудняя получение активной формы, существующей на протяжении длительного периода времени.
Соответственно, в настоящем изобретении были сделаны попытки использовать клострипаин в качестве фермента, который позволяет превращать инсулин в активную форму, не индуцируя расщепление альбумин-связывающего домена. Однако, клострипаин индуцировал расщепление самого инсулина, и, по этой причине, аминокислоты инсулина заменяли, предотвращая, вследствие этого, расщепление самого инсулина.
Таким образом, в одном аспекте настоящее изобретение направлено на способ получения активной формы производного аналога инсулина длительного действия, причем способ включает стадию взаимодействия производного аналога инсулина с клострипаином, в котором аналог инсулина, содержащий вариант В-цепи инсулина, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 2, аргинин (Arg) в положении аминокислоты 22 В-цепи инсулина заменен лизином (Lys) в нативном инсулине, слит с альбумин-связывающим доменом.
В настоящем изобретении фраза «аналог инсулина, содержащий вариант В-цепи инсулина, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 2, аргинин (Arg) в положении аминокислоты 22 В-цепи инсулина заменен лизином (Lys) в нативном инсулине» означает, что аналог инсулина может дополнительно содержать вариант аминокислоты в А-цепи инсулина или В-цепи инсулина помимо замены аргинина (Arg) на лизин (Lys) в положении аминокислоты 22 В-цепи нативного инсулина.
В настоящем изобретении аналог инсулина может дополнительно содержать одну или более аминокислотных замен, выбранных из группы, состоящей из нижеследующего: замена валина (Val) на лейцин (Leu) в положении аминокислоты 3 А-цепи инсулина, представленной аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 4; замена треонина (Thr) на аспарагиновую кислоту (Asp) в положении аминокислоты 8 А-цепи инсулина, представленной аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 4; замена изолейцина (Не) на лизин (Lys) в положении аминокислоты 10 А-цепи инсулина, представленной аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 4; замена тирозина (Туг) на глутаминовую кислоту (Glu) в положении аминокислоты 14 А-цепи инсулина, представленной аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 4; замена тирозина (Tyr) на фенилаланин (Phe) в положении аминокислоты 19 А-цепи инсулина, представленной аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 4; замена гистидина (His) на треонин (Thr) в положении аминокислоты 5 варианта В-цепи инсулина, представленного аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 2; замена серина (Ser) на аспарагиновую кислоту (Asp) в положении аминокислоты 9 варианта В-цепи инсулина, представленного аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 2; замена глутаминовой кислоты (Glu) на аланин (Ala) в положении аминокислоты 13 варианта В-цепи инсулина, представленного аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 2; замена лейцина (Leu) на глутамин (Gln) в положении аминокислоты 17 варианта В-цепи инсулина, представленного аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 2; и замена фенилаланина (Phe) на серии (Ser) в положении аминокислоты 24 варианта В-цепи инсулина, представленного аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 2, но не ограничивается ими.
В одном примере настоящего изобретения альбумин-связывающий домен может содержать альбумин-связывающий мотив, представленный следующей аминокислотной последовательностью:
GVSDFYKKLIXaKAKTVEGVEALKXbXcI,
где:
Ха независимо выбран из D и Е,
Xb независимо выбран из D и Е, и
Xc независимо выбран из А и Е.
В одном примере настоящего изобретения Ха представляет собой D, Xb представляет собой D, и Xc представляет собой А.
В одном примере настоящего изобретения альбумин-связывающий домен может содержать следующую аминокислотную последовательность:
LAX3AKX6X7ANX10ELDX14Y-[BM]-LX43X44LP,
где:
[ВМ] представляет собой альбумин-связывающий мотив, как определено в предыдущем абзаце,
Х3 независимо выбран из С, Е, Q и S;
X6 независимо выбран из С, Е и S;
X7 независимо выбран из А и S;
Х10 независимо выбран из A, R и S;
Х14 независимо выбран из А, С, K и S;
Х43 независимо выбран из А и K; и
Х44 независимо выбран из А, Е и S.
Альбумин-связывающий домен может быть представлен аминокислотными последовательностями, выбранными из группы, состоящей из SEQ ID NO: 6-13, но не ограничивается ими. Альбумин-связывающий домен может предпочтительно быть представлен аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 6.
В настоящем изобретении предпочтительно, чтобы альбумин-связывающий домен был слит с С-концом А-цепи в инсулине или аналоге инсулина В-цепь - С-цепь - А-цепь в отношении эффективности повторного сворачивания белка, эффективности ферментативной реакции и активности полученного производного инсулина или производных аналога инсулина. В связи с этим, линкер может быть введен между инсулином (или аналогом инсулина) и альбумин-связывающим доменом.
В настоящем изобретении полинуклеотид, кодирующий аналог инсулина, и нуклеотид, кодирующий альбумин-связывающий домен, можно вводить в рекомбинантный вектор таким образом, чтобы аналог инсулина и альбумин-связывающий домен могли экспрессироваться в виде слитого белка.
Функция производного аналога инсулина согласно настоящему изобретению изменяется в зависимости от трехмерной структуры производного. Таким образом, возможно вносить небольшие изменения в аминокислотную последовательность производного аналога инсулина длительного действия согласно настоящему изобретению, не влияя на функцию данного производного. Таким образом, настоящее изобретение включает варианты альбумин-связывающего домена или производного аналога инсулина длительного действия, которые сохраняют свойство связывания альбумина или высокую устойчивость к ферментативному расщеплению. Например, аминокислотные остатки, принадлежащие к конкретной функциональной группе аминокислотных остатков (например, гидрофобность, гидрофильность, полярность и т.д.), могут быть заменены другими аминокислотными остатками, принадлежащими к той же функциональной группе.
В том виде, в котором они используются в данном документе, термины «альбумин-связывающий» и «аффинность связывания в отношении альбумина» относятся к свойству полипептида или белка, которое можно тестировать посредством применения технологии поверхностного плазмонного резонанса, как например, с помощью прибора Biacore. Например, аффинность связывания альбумина можно тестировать в эксперименте, в котором альбумин или его фрагмент иммобилизуют на сенсорном чипе прибора, и образец, содержащий полипептид или белок, подлежащий тестированию, пропускают через чип.
В качестве альтернативы, полипептид или белок, подлежащий тестированию, иммобилизуют на сенсорном чипе прибора, и образец, содержащий альбумин или его фрагмент, пропускают через чип. В связи с этим, альбумин может представлять собой альбумин сыворотки, происходящей из млекопитающего, как например, альбумин сыворотки человека. Специалисты в данной области могут интерпретировать результаты, полученные с помощью таких экспериментов, для установления количественного показателя аффинности связывания полипептида или белка в отношении альбумина. Если количественный показатель является желательным, например, для определения значения Ко для взаимодействия, могут быть также использованы методы поверхностного плазмонного резонанса. Величины связывания могут, например, быть определены на приборе Biacore 2000 (Biacore АВ). Альбумин подходящим образом иммобилизован на измерительном сенсорном чипе, и образцы полипептида или белка, чья аффинность подлежит определению, получают посредством серийного разведения и инъецируют в случайном порядке. Значения KD можно, затем, рассчитывать на основании результатов, используя, например, 1:1 модель связывания Ленгмюра программного обеспечения BIAevaluation 4.1, предоставленного производителем прибора.
В одном воплощении настоящего изобретения альбумин, с которым связывается производное аналога инсулина, выбран из альбумина сыворотки человека, альбумина сыворотки крысы, альбумина сыворотки яванского макака и альбумина сыворотки мыши, но не ограничивается ими.
В одном конкретном воплощении альбумин, с которым связывается производное аналога инсулина, представляет собой альбумин сыворотки человека.
Между тем, описание альбумин-связывающего мотива и альбумин-связывающего домена (или альбумин-связывающего полипептида) истолковывается как включающее содержание, раскрытое в выложенной для всеобщего ознакомления публикации корейского патента №10-2015-0058454, соответствующей WO 2014048977.
Аналог инсулина и альбумин-связывающий домен связаны друг с другом пептидной связью; полипептидным линкером; или непептидильным линкером, выбранным из группы, состоящей из полиэтиленгликоля, полипропиленгликоля, сополимера этиленгликоля и пропиленгликоля, полиоксиэтилированного полиола, поливинилового спирта, полисахаридов, декстрана, простого поливинилэтилового эфира, биоразлагаемых полимеров, жирных кислот, нуклеотидов, липидных полимеров, хитина, гиалуроновой кислоты и их комбинаций, но не ограничиваются ими.
В настоящем изобретении линкер, состоящий из повтора последовательности (GGGGS)n (где n представляет собой целое число, находящееся в интервале от 1 до 6), может быть вставлен между аналогом инсулина и альбумин-связывающим доменом. Это основано на результатах экспериментов, указывающих на то, что когда линкер не был введен, выход повторного сворачивания был низким, а когда два или более повторов последовательности (GGGGS) были введены, отсутствовало значимое различие в выходе повторного сворачивания. Между тем, при увеличении числа (n) повторов данной последовательности, скорость превращения в активную форму инсулина под действием клострипаина повышалась, но фармакокинетика in vivo аналога инсулина не подвергалась значимому влиянию. Принимая во внимание все описанные выше результаты, линкер предпочтительно состоит из 2-4 повторов последовательности GGGGS.
Таким образом, в настоящем изобретении аналог инсулина и альбумин-связывающий домен могут быть связаны друг с другом полипептидным линкером, и полипептидный линкер может содержать (GGGGS)n (где n представляет собой целое число, находящееся в интервале от 1 до 6, но не ограничивается ими). Предпочтительно, полипептидный линкер может быть представлен аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 5.
В настоящем изобретении восстанавливающий агент можно добавлять во время реакции с клострипаином. Восстанавливающий агент может быть выбран из группы, состоящей из цистеина, β-меркаптоэтанола, ТСЕР (от англ. Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride - Трис (2-карбоксиэтил) фосфин гидрохлорид), GSH (от англ. glutathione - глутатион) и ДТТ, но не ограничивается ими. В качестве восстанавливающего агента предпочтительно добавляют 0,1-0,5 мМ ДТТ. Более предпочтительно добавляют 0,1-0,4 мМ ДТТ.
ДТТ может быть добавлен только один раз на начальной стадии, на которой производное аналога инсулина взаимодействует с клострипаином, а именно, в момент времени, в который инициируется реакция, и ДТТ может дополнительно быть добавлен 2-5 раз после его добавления в момент времени, в который инициирована реакция. Однако, наиболее предпочтительно ввиду удобства и эффективности способа получения, чтобы ДТТ был добавлен на начальной стадии реакции производного аналога инсулина с клострипаином и дополнительно был добавлен через 3-6 часов после реакции. Клострипаин можно добавлять в концентрации 0,1-5 единиц, предпочтительно 0,5-2 единиц, на мг белка, но не ограничивается ими.
В настоящем изобретении производное аналога инсулина могут дополнительно приводить во взаимодействие с карбоксипептидазой В (СрВ), которую добавляют во время или после реакции с клострипаином. В связи с этим, СрВ можно добавлять вместе с клострипаином при инициации реакции.
В настоящем изобретении клострипаин и/или карбоксипептидаза В (СрВ) приводится(ятся) во взаимодействие в условиях рН 6,0-9,0, предпочтительно 6,5-7,5, и в температурных условиях 4-40°С, предпочтительно, 30-40°С, но не ограничивается ими.
СрВ можно добавлять в концентрации 0,001-1 единиц, предпочтительно 0,001-0,1 единиц, на мг белка, но, не ограничиваясь ими.
В другом аспекте настоящее изобретение направлено на активную форму производного аналога инсулина, полученную описанным выше способом.
В настоящем изобретении производное аналога инсулина можно получать в рекомбинантном микроорганизме, в котором рекомбинантный вектор содержит полинуклеотид, кодирующий производное аналога, посредством лизиса и очистки культивируемого рекомбинантного микроорганизма.
Рекомбинантный вектор согласно настоящему изобретению может быть сконструирован в качестве вектора для общепринятого клонирования или экспрессии, и может быть сконструирован в качестве вектора для применения прокариотической или эукариотической клетки в качестве клетки-хозяина.
В том виде, в котором он используется в данном документе, термин «вектор» относится к рекомбинантному вектору, способному экспрессировать целевой белок в соответствующей клетке-хозяине, который представляет собой генетическую конструкцию, включающую существенные регуляторные факторы, функционально связанные, для обеспечения экспрессии вставки нуклеиновой кислоты. Согласно настоящему изобретению можно получать рекомбинантный вектор, который включает нуклеиновую кислоту, кодирующую производное аналога инсулина, и данное производное аналога инсулина по настоящему изобретению можно получать посредством трансформации или трансфекции клетки-хозяина рекомбинантным вектором.
В настоящем изобретении нуклеиновая кислота, кодирующая аналог инсулина и производное аналога, функционально связана с последовательностью контроля экспрессии нуклеиновой кислоты. В том виде, в котором он используется в данном документе, термин «функционально связан» относится к функциональной связи между последовательностью контроля экспрессии нуклеиновой кислоты (например, промотором, сигнальной последовательностью, сайтом связывания рибосом, последовательностью терминации транскрипции и т.д.) и другой нуклеотидной последовательностью, и, таким образом, регуляторная последовательность может контролировать транскрипцию и/или трансляцию другой нуклеотидной последовательности.
В том виде, в котором он используется в данном документе, термин «промотор» относится к нетранслируемой последовательности нуклеиновой кислоты, расположенной выше кодирующей области, которая включает сайт связывания полимеразы, и обладает активностью инициации транскрипции гена, расположенного ниже промотора, в мРНК, а именно, сайт ДНК, с которым связывается полимераза и инициирует транскрипцию гена, и он расположен в 5' области участка инициации транскрипции мРНК.
Например, когда вектор по настоящему изобретению представляет собой рекомбинантный вектор, и в качестве клетки-хозяина используется прокариотическая клетка, обычно включены сильный промотор, способный стимулировать транскрипцию (такой как промотор tac, промотор lac, промотор lacUV5, промотор lpp, промотор pLλ, промотор pRλ, промотор rac5, промотор amp, промотор recA, промотор SP6, промотор trp, промотор trc, промотор phoA, промотор araBAD, промотор Т5 и промотор Т7), сайт связывания рибосом для инициации трансляции и последовательности терминации транскрипции/трансляции.
Кроме того, вектор, который может быть использован в настоящем изобретении, может быть получен посредством манипуляций с плазмидами (например, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, рМЕ290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, серия pGEX, серия pET, серия pPICZa, pUC19 и т.д.), фагами (например, λgt4λB, λ-Charon, λΔz1, M13 и т.д.) или вирусами (например, SV40 и т.д.), которые обычно используются в данной области, но, не ограничиваясь ими.
Между тем, когда вектор по настоящему изобретению представляет собой рекомбинантный вектор, и эукариотическую клетку используют в качестве клетки-хозяина, можно использовать промоторы, происходящие из геномов клеток млекопитающего (например, промотор металлотионеина), промоторы, происходящие из вирусов млекопитающего (например, поздний промотор аденовируса, 7,5K промотор вируса осповакцины, промотор SV40, промотор цитомегаловируса и промотор tk HSV (от англ. Herpes Simpiex Virus - вирус простого герпеса)), и, в общем, вектор включает полиаденилированную последовательность (например, терминатор гормона роста крупного рогатого скота и полиаденилированную последовательность, происходящую из SV40) в качестве последовательности терминации транскрипции.
Кроме того, рекомбинантный вектор по настоящему изобретению включает ген устойчивости к антибиотику, обычно используемый в данной области в качестве селективного маркера, и может включать, например, гены устойчивости к ампициллину, гентамицину, карбенициллину, хлорамфениколу, стрептомицину, канамицину, генетицину, неомицину и тетрациклину.
Рекомбинантный вектор по настоящему изобретению может дополнительно включать другую последовательность для облегчения очистки собираемых целевых белков, а именно, инсулина и/или его аналога. Последовательность, подлежащая дополнительному включению, может представлять собой последовательность метки для очистки белка, например, глутатион-S-трансферазу (Pharmacia, США), мальтоза-связывающий белок (NEB, США), FLAG (IBI, США), 6-гистидин и т.д., но виды последовательности, необходимой для очистки целевых белков, не ограничиваются ими. Слитые белки, экспрессируемые рекомбинантным вектором, включая указанную выше последовательность метки, могут быть очищены посредством аффинной хроматографии. Например, когда подвергают слиянию глутатион S-трансферазу, можно использовать глутатион, который представляет собой субстрат данного фермента, и когда используется 6-гистидиновая метка, желательный целевой белок может быть с легкостью собран посредством колонки Ni-NTA. Рекомбинантный микроорганизм, трансформированный вектором, может быть конструирован, используя рекомбинантный вектор, содержащий полинуклеотид, кодирующий аналог инсулина и/или производное аналога.
В том виде, в котором он используется в данном документе, термин «трансформация» относится к способу введения ДНК в клетку-хозяина и получения ДНК, реплицируемой в ней, в виде хромосомного фактора или посредством выполнения хромосомной интеграции, которая является явлением искусственного осуществления генетического изменения посредством введения экзогенной ДНК в клетку.
Способ трансформации, используемый в настоящем изобретении, может представлять собой любой способ трансформации, и его можно легко осуществлять в соответствии с общепринятым способом, используемым в данной области. Примеры обычно используемого способа трансформации могут включать способ осаждения с использованием CaCl2, способ Hanahan с улучшенной эффективностью, используя диметилсульфоксид (ДМСО) в качестве восстанавливающего агента в способе осаждения с использованием CaCl2, электропорацию, способ осаждения с использованием CaPO4, способ слияния протопластов, способ перемешивания с использованием карбидокремниевого волокна, способ трансформации, опосредованной агробактериями, способ трансформации с использованием ПЭГ (полиэтиленгликоль), трансформации, опосредованные сульфатом декстрана, липофектамином и сушкой/давлением, и т.д.
Способ трансформации рекомбинантным вектором, включающим нуклеиновую кислоту, кодирующую аналог инсулина и/или производное аналога согласно настоящему изобретению, может не ограничиваться данными способами, но любой способ трансформации или трансфекции, обычно используемый в данной области, можно использовать без ограничения.
Рекомбинантный трансформант по настоящему изобретению может быть получен посредством введения рекомбинантного вектора, включающего нуклеиновую кислоту, кодирующую производное аналога инсулина, в клетку-хозяина. Соответствующий хозяин, подлежащий использованию в настоящем изобретении, может особым образом не ограничиваться при условии, что он может экспрессировать нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению. Примеры соответствующего хозяина могут включать бактерии, принадлежащие к роду Escherichia, как например, Е. coli, бактерии, принадлежащие к роду Bacillus, как например, Bacillus subtilis, бактерии, принадлежащие к роду Pseudomonas, как например, Pseudomonas putida, дрожжи, как например Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae и Schizosaccharomyces pombe, клетку насекомого, как например Spodoptera frugiperda (SF9), и животные клетки, такие как СНО (от англ. - Chinese Hamster Ovary - яичник китайского хомячка), COS и BSC, но не ограничиваются ими.
В том виде, в котором он используется в данном документе, термин «активная форма» означает зрелую форму инсулина, аналога инсулина или производного аналога инсулина, способную регулировать уровни глюкозы в крови in vivo, и относится к инсулину, аналогу инсулина или производному аналога инсулина, которую получают посредством удаления С-пептида из формы проинсулина и которая содержит А-цепь и В-цепь инсулина.
Примеры
Далее в данном документе, настоящее изобретение будет описано более подробно со ссылкой на примеры. Специалисту, обладающему средней квалификацией в данной области, будет очевидно, что данные примеры представлены исключительно в иллюстративных целях, и не должны истолковываться как ограничивающие объем настоящего изобретения.
В приведенных ниже примерах аналог инсулина, слитый с ABD, используют в том же значении, как производное аналога инсулина длительного действия в настоящем изобретении.
Пример 1: Конструирование экспрессионного вектора и штамма с инсулином, слитым с ABD
Человеческий инсулин синтезируется в форме пре-про-инсулина, препоследовательность отщепляется в эндоплазматическом ретикулуме, и проинсулин обрабатывается в аппарате Гольджи и эндоплазматическом ретикулуме, с образованием, таким образом, зрелого инсулина. На основе данного факта, для получения рекомбинантного инсулина способом экспрессии белка проинсулина в Е. coli и затем удаления C-цепи обработкой трипсином, конструировали проинсулин. Для повышения эффективности экспрессии проинсулина в Е. coli и эффективности очистки, метку слияния включали в N-конец, и проводили оптимизацию кодонов.
Число участков инсулина, с которыми может быть слит альбумин-связывающий домен (ABD), теоретически равно четырем. Однако, N-конец А-цепи представляет собой положение, важное для активности инсулина и, вследствие этого, его исключали из положений слияния. Несмотря на то, что N-конец В-цепи важен для образования гексамера инсулина, он был включен в положения слияния, поскольку активность инсулина могла сохраняться. Если ABD слит между В-цепью и С-цепью, он может оказывать действие на сворачивание белка. Таким образом, конструкцию инсулина конструировали либо в порядке В-С-А или порядке А-С-В в качестве структуры кандидата. Наконец, генные структуры для экспрессии следующих трех форм инсулина, слитого с ABD, конструировали следующим образом:
Ndel - Метка слияния - В-цепь - С-цепь - А-цепь - Линкер - ABD - EcoRI,
Ndel - Метка слияния - ABD - Линкер - В-цепь - С-цепь - А-цепь - EcoRI и
Ndel - Метка слияния - А-цепь - С-цепь - В-цепь - линкер - ABD - EcoRI.
В качестве экспрессионного вектора использовали вектор pJ401(DNA 2.0). Вектор расщепляли рестриктазами Ndel и EcoRI, и затем ДНК-фрагменты разделяли посредством электрофореза в 1%-ном агарозном геле. Генетические структуры для экспрессии слитых белков ABD и ДНК-фрагменты, полученные из экспрессионного вектора, как описано выше, лигировали друг с другом, используя ДНК-лигазу Т4, конструируя, таким образом, плазмиды. Далее, каждой из данных плазмид трансформировали Е. coli BL21(DE3) способом на основе хлорида кальция. Отбирали трансформированные штаммы, обладающие устойчивостью к канамицину, и из них выделяли ДНК. То, была ли ДНК правильно вставлена, определяли аналитическим способом на основе расщепления эндонуклеазами рестрикции.
Когда конструировали ген, имеющий следующую структуру: Ndel - метка слияния - ABD - Линкер - В-цепь - С-цепь - А-цепь - EcoRI, его определяли ненадлежащим из-за очень низкого выхода повторного сворачивания белка. Кроме того, когда конструировали ген, имеющий следующую структуру Ndel - метка слияния - А-цепь - С-цепь - В-цепь - Линкер - ABD - EcoRI, слитый с ABD инсулин обладал активностью инсулина, но он демонстрировал низкий выход повторного сворачивания и выход ферментативной обработки, таким образом, он считался неподходящим в качестве способа получения активной формы инсулина. Таким образом, среди данных трех форм инсулина, слитого с ABD, структуру Ndel - метка слияния - В-цепь - С-цепь - А-цепь - линкер - ABD - EcoRI отбирали и использовали в последующем эксперименте.
Между А-цепью и альбумин-связывающим доменом (ABD) вставляли линкер, состоящий из 1-6 повторов последовательности (GGGGS). В данном случае, когда линкер не вводили, выход повторного сворачивания был очень низким, но когда вводили линкер, состоящий из двух или более повторов последовательности (GGGGS)n, не было значимого различия в выходе повторного сворачивания. Между тем, при увеличении n в последовательности (GGGGS)n, скорость превращения в активную форму инсулина под действием клострипаина повышалась, но фармакокинетика in vivo инсулина значимо не подвергалась воздействию. Принимая во внимание все описанные выше результаты, конструировали линкер, состоящий из 2-4 повторов последовательности GGGGS.
Аминокислотные последовательности каждого из фрагментов для инсулина, слитого с ABD, используемого в настоящем изобретении, показаны ниже в Таблице 1.
Пример 2: Конструирование слитых с ABD аналогов инсулина, имеющих модифицированные аминокислотные последовательности инсулина
Для получения инсулина, используя рекомбинантные Е. coli, способ превращения проинсулина в активную форму посредством применения трипсина является необходимым. Однако, трипсин расщепляет двухосновные аминокислоты с высокой эффективностью и также расщепляет единичные аминокислоты, такие как лизин (Lys) или аргинин (Arg), осложняя получение желательной активной формы инсулина. Кроме того, последовательность ABD также включает некоторое количество остатков лизина (Lys) и аргинина (Arg), дополнительно осложняя получение желательного инсулина, слитого с ABD, обладающего активностью, посредством применения трипсина.
По этой причине, клострипаин использовали в качестве фермента, способного заменять трипсин для индукции превращения в активную форму. В данном случае, когда клострипаин взаимодействовал с инсулином, слитым с ABD, происходило расщепление аргинина (Arg) в положении 22 В-цепи инсулина. Для решения данной проблемы аргинин (Arg) в положении 22 В-цепи заменяли лизином (Lys). В данном случае расщепление в положении 22 В-цепи инсулина под действием клострипаина значимо уменьшалось и, таким образом, активная форма слитого с ABD инсулина могла быть эффективно получена (Фиг. 1).
Помимо мутации, как описано выше, дополнительные мутации вводили в инсулин, слитый с ABD, для дополнительного увеличения стабильности и in vivo периода полувыведения инсулина, слитого с ABD. Пять аминокислот в каждой из А-цепи и В-цепи заменяли, и замененные положения показаны ниже в Таблице 2.
Оптимизацию кодонов для экспрессии генов в Е. coli проводили, используя алгоритм GeneArt, и синтезировали гены, имеющие замененные аминокислоты.
Плазмиды, сконструированные как описано выше, вводили в Е. coli BL21 (DE3) таким же образом, как описано в Примере 1, конструируя, таким образом, штаммы Е coli.
Пример 3: Экспрессия аналогов инсулина, слитых с ABD
Для экспрессии аналогов инсулина, слитых с ABD, каждый из рекомбинантных штаммов Е. coli инокулировали в 100 мл среды LB и культивировали при встряхивании при 37°С в течение 16 часов, и культуры использовали в качестве культур для посева. 2 л среды LB добавляли в 7-л ферментер (New Brunswick BioFlo), стерилизовали и затем инокулировали с культурой для посева. Культивирование проводили в условиях температуры 35°С, скорости потока воздуха 3 об/об/мин и скорости перемешивания 1000 об/мин, и рН во время культивирования поддерживали на уровне 6,8 с помощью аммония и фосфорной кислоты. В момент времени, в который источник углерода в среде истощался, начинали подачу и в тот же момент времени экспрессию белка индуцировали IPTG (от англ. isopropylthiogalactoside - изопропилтиогалактозид). Дополнительное культивирование проводили в течение 10 часов после индукции экспрессии, и рекомбинантные штаммы выделяли, используя центрифугу.
Аналоги инсулина, слитые с ABD, экспрессировали в виде телец включения в штамме Е. coli, и даже когда аминокислотные мутации вводили в домены инсулина, уровни экспрессии обнаруживались в векторной системе, используемой в настоящем изобретении (Фиг. 2).
Пример 4: Индукция лизиса клеток и солюбилизации/повторного сворачивания
Каждый из штаммов, экспрессирующих инсулин, слитый с ABD, или аналоги инсулина, слитые с ABD, суспендировали в лизирующем буфере (20 мМ Tris, 10 мМ ЭДТА, 10% сахароза, 0,2 М NaCl, рН 8,0), и клетки лизировали, используя гомогенизатор высокого давления. Лизированные клетки центрифугировали в высокоскоростной центрифуге при 7000 об/мин, и растворимый белок и некоторые обломки клеток удаляли, выделяя, таким образом, осадок, включающий тельце включения. Выделенное тельце включения промывали буфером (содержащим 1% Triton Х-100, 0,2 М NaCl и 1 М мочевину) и затем центрифугировали при 7000 об/мин. Осажденное тельце включения дополнительно два раза промывали дистиллированной водой и затем хранили при -80°С до применения.
Хранящееся в замороженном виде тельце включения растворяли в солюбилизирующем буфере (25 мМ Tris, 8 М мочевина, 30 мМ цистеин-HCl, рН 10,5), и затем разбавляли в буфере для повторного сворачивания (25 мМ Tris-HCl, рН 10,5) и подвергали повторному сворачиванию при 4°С в течение 16 часов. Происходило ли повторное сворачивание, определяли посредством анализа ОФ-ВЭЖХ. Когда солюбилизированный раствор анализировали посредством ОФ-ВЭЖХ, пик белка наблюдался на уровне примерно 20 минут вследствие высокой гидрофобности, но когда происходило повторное сворачивание, наблюдался сдвиг данного пика к 16 минутам (Фиг. 3). Причина этого состоит в том, что когда протекает повторное сворачивание, гидрофобность снижается, по сравнению с гидрофобностью в солюбилизированном растворе. Повторное сворачивание продолжали до тех пор, пока сдвига пика белка больше не наблюдалось во время анализа посредством ОФ-ВЭЖХ.
Пример 5: Превращение в активную форму посредством применения фермента
Для получения инсулина, используя рекомбинантный штамм Е. coli, требуется превращение проинсулина в активную форму посредством применения трипсина. Однако, инсулин, слитый с ABD, или аналог инсулина, слитый с ABD, имеет целый ряд сайтов расщепления трипсином в своей последовательности, и по этой причине клострипаин использовали в качестве фермента, способного заменить трипсин для индукции превращения в активную форму.
Когда индуцировали превращение в активную форму, используя клострипаин, происходило расщепление в положении 22 В-цепи инсулина, осложняя получение желательной формы инсулина. По данной причине, аналог инсулина, слитый с ABD, полученный посредством замены в положении 22 В-цепи аргинина (Arg) на лизин (Lys), использовали для получения активной формы инсулина. Между тем, слитый с ABD аналог инсулина 4 использовали во всех экспериментах, если дополнительно конкретно не определено иное.
Клострипаин содержит цистеин (Cys) в своем активном сайте, и, таким образом, требует восстанавливающих условий для демонстрации ферментативной активности. Кроме того, когда раствор для повторного сворачивания обрабатывают восстанавливающим агентом для сохранения активности клострипаина, дисульфидная связь в области инсулина с высокой долей вероятности будет разорвана. По данной причине, требуется установить условия, которые повышают выход ферментативной реакции без разрыва дисульфидной связи. Таким образом, используя восстанавливающий агент ДТТ, содержащийся в растворе ферментативной реакции, проводят эксперименты по концентрации обработки и дополнительной обработки.
Для превращения аналога инсулина, слитого с ABD, в форме предшественника в активную форму, также дополнительно требуется карбоксипептидаза В (СрВ). СрВ представляет собой фермент, который расщепляет основные аминокислоты на С-конце, и конкретные условия также тестировали. Конкретно, оценивали время обработки клострипаином и СрВ, возможность одновременной обработки, количество ферментативной обработки, температуру ферментативной обработки и соответствующий уровень рН.
Поскольку клострипаин существует в виде проформы, для его активации индуцировали авторасщепление. С этой целью сублимированный клострипаин (Worthington, США) растворяли в дистиллированной воде и затем активировали при 4°С в течение 30 минут после добавления активирующего буфера (500 мМ Tris, 50 мМ ДТТ, 25 мМ CaCl2, рН 7,8). Активированный клострипаин добавляли к повторно свернутому белку в концентрации 0,1-5 единиц на мг белка и позволяли взаимодействовать при 25-40°С в течение 2-8 часов. После реакции с клострипаином СрВ добавляли в концентрации 0,001-1 единица на 1 мг белка и давали прореагировать. Ферментативную реакцию останавливали, снижая рН до 3,5 или меньше посредством применения HCl.
5-1: Оценка эффективности превращения в активную форму после добавления ДТТ
Для исследования условий ферментативной реакции для клострипаина и СрВ ДТТ добавляли к раствору для повторного сворачивания до концентрации 0-0,4 мМ, и затем за продукцией активной формы инсулина под действием клострипаина наблюдали посредством SDS-PAGE. Было показано, что когда добавляли более чем 0,5 мМ ДТТ, дисульфидные связи между А-цепью и В-цепью инсулина были разорваны (данные не показаны).
Между тем, как может быть видно на Фиг. 4, ДТТ не добавляли к раствору ферментативной реакции, скорость превращения аналога инсулина, слитого с ABD, в активную форму была низкой, но при повышении концентрации ДТТ эффективность превращения в активную форму повышалась.
5-2: Оценка эффективности превращения в активную форму инсулина в разные моменты времени добавления СрВ
Для превращения аналога проинсулина, слитого с ABD, в активную форму аналог проинсулина должен быть обработан как клострипаином, так и СрВ. В связи с этим, определяли момент времени добавления СрВ. Для расщепления С-пептида инсулина и метки слияния сначала нужно провести обработку клострипаином, и для удаления аргинина (Arg) из сайта расщепления затем нужно провести обработку СрВ. Однако, для сокращения времени получения, обработку СрВ через 2-4 часа после обработки клострипаином сравнивали с одновременной обработкой клострипаином и СрВ.
В результате, как можно видеть на Фиг. 5, картина ферментативной реакции при одновременной обработке клострипаином и СрВ не отличалась от картины ферментативной реакции в условиях, при которых сначала проводят обработку клострипаином. Таким образом, для улучшения эффективности способа выбирали одновременную обработку клострипаином и СрВ.
5-3: рН условия при одновременной обработке клострипаином и СрВ
Известно, что клострипаин демонстрирует оптимальную активность при рН 7,4-7,8, и СрВ демонстрирует оптимальную активность при рН 9,0. Поскольку оптимальные диапазоны рН двух ферментов отличаются друг от друга, диапазон рН, демонстрирующий наивысшую эффективность превращения в активную форму инсулина, определяли посредством одновременной обработки двумя данными ферментами. Теоретические значения pl всех аналогов инсулина, слитых с ABD, показанных в таблице 2 согласно настоящему изобретению, находились близко к 6, и, таким образом, обращали внимание на осаждение. Соответственно, рН 6,0 или ниже исключали. Кроме того, при рН 9,0 или выше агрегат увеличивался. По данной причине оценку проводили при рН от 6,0 до 9,0.
Одновременная обработка двумя данными ферментами в диапазоне рН 6,5-8,5 демонстрировала высокую эффективность превращения в активную форму инсулина. Кроме того, как показано на Фиг. 6, эффективность превращения в активную форму инсулина была особенно высокой в диапазоне рН 6,5-7,5.
5-4: Оценка эффективности превращения в активную форму инсулина после дополнительного добавления клострипаина и ДТТ
Как показано в Примере 5-1, когда добавляют ДТТ, эффективность превращения в активную форму инсулина повышалась. Однако, период полувыведения ДТТ, как известно, уменьшается быстро при высоких рН и температурах, и, таким образом, полагали, что будет трудно сохранять активность клострипаина на протяжении длительного времени ферментативной реакции. Соответственно, исследовали способ, способный сохранять активность клострипаина на протяжении длительного времени.
В связи с этим, способ, в котором 1 U/мг клострипаина дополнительно добавляют через 4,5 часа после начала ферментативной реакции, оценивали в сравнении со способом, в котором дополнительно добавляют 0,2 мМ ДТТ. В результате, как показано на Фиг. 7, даже когда дополнительно добавляли клострипаин, эффективность превращения в активную форму значимо не повышалась, но когда дополнительно добавляли ДТТ, превращение в активную форму значимо увеличивалось, даже когда клострипаин дополнительно не добавляли. Кроме того, когда и клострипаин, и ДТТ дополнительно добавляли, наблюдали, что количество непревращенной формы было относительно маленьким, и эффективность превращения в активную форму повышалась.
Однако анализ раствора ферментативной реакции посредством масс-спектрометрии указывал на то, что когда добавляли ДТТ, превращение в активную форму инсулина значимо увеличивалось, но когда ДТТ и клострипаин добавляли одновременно, вместо этого индуцировалось неспецифичное расщепление инсулина, приводя к увеличению количества примесей. Таким образом, можно было видеть, что добавление только лишь восстанавливающего агента ДТТ было преимущественным для превращения в активную форму инсулина (Фиг. 8).
5-5: Оценка эффективности превращения в активную форму инсулина при разных температурах
Оценку проводили для определения температурного интервала, в котором клострипаин и СрВ будут демонстрировать оптимальные активности. В данное время, рассматривая технологический процесс в промышленном масштабе, температуру 4°С или ниже и температуру 40°С или выше исключали, и оценку проводили при температуре от 10 до 30°С. В результате, как показано на Фиг. 9, было видно, что при повышении температуры с 10°С до 20°С и 30°С, количество непревращенной формы было меньше, и превращение в активную форму протекало быстрее. Кроме того, было показано, что, когда концентрация ДТТ повышалась, превращение в активную форму протекало быстрее.
Пример 6: Очистка аналога инсулина, слитого с ABD
Образец, ферментативно обработанный клострипаином и СрВ, сначала очищали посредством хроматографии на ионообменной смоле, используя Fractogel® EMD COO- (М) (Merck) в соответствии с инструкцией производителя, и затем дополнительно очищали посредством обращенно-фазовой хроматографии, используя PharmprepO Р100 RP-18e (Merck) в соответствии с инструкцией производителя.
В результате, как может быть видно на Фиг. 10, активная форма беспримесного аналога инсулина, слитого с ABD, могла быть очищена двумя данными способами очистки.
Пример 7: Измерение аффинностей связывания аналогов инсулина, слитых с ABD, в отношении альбумина
Для измерения аффинностей связывания белков - аналогов инсулина, слитых с ABD, в отношении альбумина использовали аналитический метод поверхностный плазмонный резонанс (SPR - от англ. surface plasmon resonance, BIACORE 3000, GE healthcare). Рекомбинантный человеческий сывороточный альбумин иммобилизовали на чипе СМ5 способом связывания аминогрупп, и ABD или аналоги инсулина, слитые с ABD, разведенные до пяти и более концентраций, связывались с ним, и измеряли их аффинности в отношении человеческого сывороточного альбумина.
В результате, как может быть видно ниже в Таблице 3, аффинности аналогов инсулина в отношении человеческого сывороточного альбумина сохранялись на уровнях пМ, даже при том, что они были ниже, чем аффинности самого ABD.
Пример 8: Сравнение аффинностей нативного инсулина и аналогов инсулина, слитых с ABD, в отношении инсулинового рецептора
Для измерения афинностей связывания нативного инсулина и аналогов инсулина, слитых с ABD, в отношении инсулинового рецептора, использовали метод анализа поверхностный плазмонный резонанс (SPR, BIACORE 3000, GE healthcare). Инсулиновый рецептор иммобилизовали на чипе СМ5 способом связывания аминогрупп, и каждый из нативного инсулина и аналогов инсулина, слитых с ABD, разведенных до пяти или более концентраций, связывался с ним, и измеряли их аффинности в отношении инсулинового рецептора.
В результате, как можно видеть ниже в Таблице 4, аффинности аналогов инсулина, слитых с ABD, уменьшались, по сравнению с аффинностью нативного инсулина. В частности, аффинность аналога 3 демонстрировала наибольшее уменьшение и падала до уровня примерно 19,4% относительно нативного инсулина.
Эффективности аналогов инсулина, слитых с ABD, оценивали в сравнении с эффективностью инсулина гларгин в моделях диабета 1-го типа, индуцируемого стрептозотоцином. Аналоги 1, 3 и 10 исключали из кандидатов, поскольку они демонстрировали способность снижения уровня глюкозы в крови 50% или меньше, в сравнении с инсулином гларгин.
Пример 9: Синтез гексамера
Инсулин связывается с цинком in vivo, образуя, вследствие этого, стабильную гексамерную структуру. Свойство инсулина образовывать гексамер также используется в разработке препарата и может играть важную роль в увеличении периода полувыведения in vivo инсулина. Соответственно, будут ли аналоги инсулина, слитые с ABD, сохранять свойство образования гексамеров, анализировали посредством эксклюзионной хроматографии. В результате, было показано, что аналог 4 сохранял способность образовывать гексамер посредством добавления цинка и фенола (Фиг. 11). Образование гексамера также наблюдали во всех аналогах, за исключением аналогов 7, 9 и 10. Таким образом, среди аналогов, имеющих последовательности, показанные в Таблице 2, аналоги 7 и 9 дополнительно исключали из кандидатов.
Пример 10: Оценка фармакокинетики in vivo и способности снижения уровня глюкозы в крови аналогов инсулина, слитых с ABD
Для оценки in vivo фармакокинетики шести аналогов инсулина, слитых с ABD, каждый из аналогов инсулина вводили подкожно нормальным крысам SD (возраст 6 недель), и затем брали образцы крови в моменты времени 0, 1, 4, 8, 24, 48, 72 и 96 часов. Концентрацию каждого аналога инсулина, слитого с ABD, оставшегося в крови в каждый из моментов времени, измеряли, используя ELISA (от англ. enzyme-linked immunosorbent assay - твердофазный иммуноферментный анализ). Кроме того, используя часть отобранных образцов крови, уровни глюкозы в крови в зависимости от времени измеряли с помощью устройства, контролирующего уровень глюкозы в крови.
В результате, как можно видеть ниже в Таблице 5, аналоги инсулина, слитые с ABD, демонстрировали значимо увеличенные периоды полувыведения, по сравнению с нативным инсулином, как известно, имеющим период полувыведения 5 минут. Аналог 11, полученный посредством замены только в положении 22 В-цепи инсулина, демонстрировал период полувыведения 7,2 часов, и аналог 4, демонстрирующий самое большое увеличение периода полувыведения, по оценке имел период полувыведения 9,9 часов.
Анализировали время, на протяжении которого уровни глюкозы в крови у нормальных животных сохранялись на пониженных уровнях. В результате, было показано, что аналоги 5, 6 и 8 имели увеличенные периоды полувыведения, но поддерживали уровни глюкозы в крови на протяжении короткого периода времени. По сравнению с данными аналогами, аналог 4 обладал наилучшей способностью снижать уровни глюкозы в крови и сохранял свою эффективность на протяжении самого длительного периода времени (Фиг. 12).
Несмотря на то, что настоящее изобретение подробно описано со ссылкой на конкретные признаки, специалистам в данной области будет очевидно, что данное описание предназначено исключительно для предпочтительного воплощения и не ограничивает объем настоящего изобретения. Таким образом, существенный объем настоящего изобретения будет определяться прилагаемой формулой изобретения и ее эквивалентами.
Промышленная применимость
В общепринятом способе превращения проинсулина в активную форму посредством применения трипсина альбумин-связывающий домен нового производного аналога инсулина длительного действия, впервые разработанного авторами настоящего изобретения, также расщепляется, таким образом, осложняя превращение нового производного аналога инсулина длительного действия в активную форму. Для преодоления данной трудности клострипаин использовали для превращения производного аналога инсулина согласно настоящему изобретению в активную форму. Таким образом, способ по настоящему изобретению может эффективно использоваться для получения длительно действующего терапевтического средства для лечения диабета.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> DAEWOONG PHARMACEUTICAL CO., LTD.
<120> СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АКТИВНОЙ ФОРМЫ ПРОИЗВОДНОГО АНАЛОГА ИНСУЛИНА
ДЛИТЕЛЬНОГО ДЕЙСТВИЯ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ КЛОСТРИПАИНА
<130> P17-B267
<160> 13
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 22
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Метка слияния
<400> 1
Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala His His His His His His
1 5 10 15
Ser Ser Gly Ser Ala Arg
20
<210> 2
<211> 30
<212> Белок
<213> homo sapiens
<400> 2
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Lys Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr
20 25 30
<210> 3
<211> 35
<212> Белок
<213> homo sapiens
<400> 3
Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly
1 5 10 15
Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu
20 25 30
Gln Ala Arg
35
<210> 4
<211> 21
<212> Белок
<213> homo sapiens
<400> 4
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 5
<211> 10
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Линкер
<400> 5
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 6
<211> 46
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Сконструированный альбумин-связывающий полипептид (ABD)
<400> 6
Leu Ala Glu Ala Lys Glu Ala Ala Asn Ala Glu Leu Asp Ser Tyr Gly
1 5 10 15
Val Ser Asp Phe Tyr Lys Lys Leu Ile Asp Lys Ala Lys Thr Val Glu
20 25 30
Gly Val Glu Ala Leu Lys Asp Ala Ile Leu Ala Ala Leu Pro
35 40 45
<210> 7
<211> 46
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Сконструированный альбумин-связывающий полипептид
<400> 7
Leu Ala Glu Ala Lys Glu Ala Ala Asn Ala Glu Leu Asp Ser Tyr Gly
1 5 10 15
Val Ser Asp Phe Tyr Lys Lys Leu Ile Asp Lys Ala Lys Thr Val Glu
20 25 30
Gly Val Glu Ala Leu Lys Asp Glu Ile Leu Ala Ala Leu Pro
35 40 45
<210> 8
<211> 46
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Сконструированный альбумин-связывающий полипептид
<400> 8
Leu Ala Glu Ala Lys Glu Ala Ala Asn Ala Glu Leu Asp Ser Tyr Gly
1 5 10 15
Val Ser Asp Phe Tyr Lys Lys Leu Ile Asp Lys Ala Lys Thr Val Glu
20 25 30
Gly Val Glu Ala Leu Lys Glu Ala Ile Leu Ala Ala Leu Pro
35 40 45
<210> 9
<211> 46
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Сконструированный альбумин-связывающий полипептид
<400> 9
Leu Ala Glu Ala Lys Glu Ala Ala Asn Ala Glu Leu Asp Ser Tyr Gly
1 5 10 15
Val Ser Asp Phe Tyr Lys Lys Leu Ile Asp Lys Ala Lys Thr Val Glu
20 25 30
Gly Val Glu Ala Leu Lys Glu Glu Ile Leu Ala Ala Leu Pro
35 40 45
<210> 10
<211> 46
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Сконструированный альбумин-связывающий полипептид
<400> 10
Leu Ala Glu Ala Lys Glu Ala Ala Asn Ala Glu Leu Asp Ser Tyr Gly
1 5 10 15
Val Ser Asp Phe Tyr Lys Lys Leu Ile Glu Lys Ala Lys Thr Val Glu
20 25 30
Gly Val Glu Ala Leu Lys Asp Ala Ile Leu Ala Ala Leu Pro
35 40 45
<210> 11
<211> 46
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Сконструированный альбумин-связывающий полипептид
<400> 11
Leu Ala Glu Ala Lys Glu Ala Ala Asn Ala Glu Leu Asp Ser Tyr Gly
1 5 10 15
Val Ser Asp Phe Tyr Lys Lys Leu Ile Glu Lys Ala Lys Thr Val Glu
20 25 30
Gly Val Glu Ala Leu Lys Asp Glu Ile Leu Ala Ala Leu Pro
35 40 45
<210> 12
<211> 46
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Сконструированный альбумин-связывающий полипептид
<400> 12
Leu Ala Glu Ala Lys Glu Ala Ala Asn Ala Glu Leu Asp Ser Tyr Gly
1 5 10 15
Val Ser Asp Phe Tyr Lys Lys Leu Ile Glu Lys Ala Lys Thr Val Glu
20 25 30
Gly Val Glu Ala Leu Lys Glu Ala Ile Leu Ala Ala Leu Pro
35 40 45
<210> 13
<211> 46
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Сконструированный альбумин-связывающий полипептид
<400> 13
Leu Ala Glu Ala Lys Glu Ala Ala Asn Ala Glu Leu Asp Ser Tyr Gly
1 5 10 15
Val Ser Asp Phe Tyr Lys Lys Leu Ile Glu Lys Ala Lys Thr Val Glu
20 25 30
Gly Val Glu Ala Leu Lys Glu Glu Ile Leu Ala Ala Leu Pro
35 40 45
<---
Claims (40)
1. Способ получения активной формы производного аналога инсулина длительного действия, включающий
- стадию взаимодействия производного аналога инсулина, в котором альбумин-связывающий домен слит с аналогом инсулина посредством линкера, с клострипаином,
где во время реакции с клострипаином добавляют восстанавливающий агент,
где производное аналога инсулина дополнительно приводят во взаимодействие с карбоксипептидазой В (СрВ), которую добавляют во время или после реакции с клострипаином,
где указанный аналог инсулина содержит А-цепь инсулина или ее вариант, вариант В-цепи инсулина и С-цепь инсулина, где А-цепь инсулина или ее вариант
i) представлены SEQ ID NO 4;
ii) представлены аминокислотной последовательностью, содержащей замену треонина (Thr) на аспарагиновую кислоту (Asp) в положении аминокислоты 8 в SEQ ID NO 4; или
iii) представлены аминокислотной последовательностью, содержащей замену тирозина (Tyr) на глутаминовую кислоту (Glu) в положении аминокислоты 14 в SEQ ID NO 4;
где вариант В-цепи инсулина, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 2, аргинин (Arg) в положении аминокислоты 22 В-цепи инсулина заменен лизином (Lys) в нативном инсулине,
где линкер представляет собой полипептидный линкер (GGGGS)n (где n представляет собой целое число, находящееся в интервале от 1 до 6),
где производное аналога инсулина содержит вариант В-цепи инсулина, С-цепь инсулина, А-цепь инсулина или ее вариант, линкер и альбумин-связывающий домен в этом порядке; и
- стадию очистки активной формы производного аналога инсулина длительного действия.
2. Способ по п. 1, в котором альбумин-связывающий домен содержит альбумин-связывающий мотив, представленный следующей аминокислотной последовательностью:
GVSDFYKKLIXaKAKTVEGVEALKXbXcI,
где:
Xa независимо выбран из D и Е,
Xb независимо выбран из D и Е, и
Xc независимо выбран из А и Е.
3. Способ по п. 2, в котором альбумин-связывающий домен содержит следующую аминокислотную последовательность:
LAX3AKX6X7ANX10ELDX14Y-[BM]-LX43X44LP,
где:
[ВМ] представляет собой альбумин-связывающий мотив, как определено в п. 2,
X3 независимо выбран из С, Е, Q и S;
Х6 независимо выбран из С, Е и S;
Х7 независимо выбран из А и S;
Х10 независимо выбран из A, R и S;
Х14 независимо выбран из А, С, K и S;
Х43 независимо выбран из А и K; и
Х44 независимо выбран из А, Е и S.
4. Способ по п. 3, в котором альбумин-связывающий домен представлен аминокислотными последовательностями, выбранными из группы, состоящей из SEQ ID NO: 6-13.
5. Способ п. 4, в котором альбумин-связывающий домен представлен аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 6.
6. Способ по п. 1, в котором аналог инсулина и альбумин-связывающий домен слиты друг с другом посредством пептидной связи; полипептидного линкера; или непептидильного линкера, выбранного из группы, состоящей из полиэтиленгликоля, полипропиленгликоля, сополимера этиленгликоля и пропиленгликоля, полиоксиэтилированного полиола, поливинилового спирта, полисахаридов, декстрана, простого поливинилэтилового эфира, биоразлагаемых полимеров, жирных кислот, нуклеотидов, липидных полимеров, хитина, гиалуроновой кислоты и их комбинаций.
7. Способ по п. 1, в котором полипептидный линкер представлен аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 5.
8. Способ по п. 1, в котором восстанавливающий агент выбран из группы, состоящей из цистеина, β-меркаптоэтанола, Трис-(2-карбоксиэтил)-фосфин гидрохлорида (ТСЕР), глутатиона (GSH) и дитиотреитола (ДТТ).
9. Способ по п. 8, в котором добавляют от 0,1 до 0,5 мМ ДТТ в качестве восстанавливающего агента.
10. Способ по п. 9, в котором ДТТ добавляют на начальной стадии, на которой производное аналога инсулина взаимодействует с клострипаином, и дополнительно добавляют через 3-6 часов после реакции.
11. Способ по п. 1, в котором клострипаин и/или карбоксипептидазу В (СрВ) приводят во взаимодействие в условиях рН 6,0-9,0.
12. Способ по п. 11, в котором клострипаин и/или карбоксипептидазу В (СрВ) приводят во взаимодействие в условиях рН 6,5-7,5.
13. Способ по п. 1, в котором клострипаин и/или карбоксипептидазу В (СрВ) приводят во взаимодействие в условиях 4-40°С.
14. Активная форма производного аналога инсулина длительного действия, полученная способом по п. 1.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR10-2018-0092244 | 2018-08-08 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2021105179A RU2021105179A (ru) | 2022-09-09 |
RU2781307C2 true RU2781307C2 (ru) | 2022-10-11 |
Family
ID=
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2062301C1 (ru) * | 1990-09-05 | 1996-06-20 | Хехст АГ | Способ гидролиза аминокислотной последовательности предшественника инсулина человека |
RU2495131C2 (ru) * | 2008-02-19 | 2013-10-10 | Байокон Лимитид | Способ получения рекомбинантного инсулина гларгина |
WO2014048977A1 (en) * | 2012-09-25 | 2014-04-03 | Affibody Ab | Albumin binding polzpeptide |
RU2524150C2 (ru) * | 2006-09-22 | 2014-07-27 | Ново Нордиск А/С | Аналоги инсулина, устойчивые к протеазам |
KR20150138101A (ko) * | 2014-05-29 | 2015-12-09 | 한미약품 주식회사 | 지속형 인슐린 아날로그 결합체 및 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체를 포함하는 당뇨병 치료용 조성물 |
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2062301C1 (ru) * | 1990-09-05 | 1996-06-20 | Хехст АГ | Способ гидролиза аминокислотной последовательности предшественника инсулина человека |
RU2524150C2 (ru) * | 2006-09-22 | 2014-07-27 | Ново Нордиск А/С | Аналоги инсулина, устойчивые к протеазам |
RU2495131C2 (ru) * | 2008-02-19 | 2013-10-10 | Байокон Лимитид | Способ получения рекомбинантного инсулина гларгина |
WO2014048977A1 (en) * | 2012-09-25 | 2014-04-03 | Affibody Ab | Albumin binding polzpeptide |
KR20150138101A (ko) * | 2014-05-29 | 2015-12-09 | 한미약품 주식회사 | 지속형 인슐린 아날로그 결합체 및 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체를 포함하는 당뇨병 치료용 조성물 |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
KATSOYANNIS P.G. et al., A synthetic human insulin analogue modified at position B-22. [Lys-22-B] human insulin, J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1, 1975, Iss.5, p.464-469, WEITZEL G.et al., Structure and activity of insulin, XV[1-5]. Further evidence for the importance of arginine residue B22 in the activity of insulin. Semisyntheses of despentapeptide-(B23 - 30)-insulins varied in B22 using desnonapeptide-(B22 - 30)-insulin and tetrapeptides, Hoppe Seylers Z PhysiolChem, 1977, v.358, n.12, p.1573-1582, * |
ИНСУЛИНОТЕРАПИЯ, ПОСОБИЕ ДЛЯ ВРАЧЕЙ, под ред. И. И. Дедова, 2004, Москва, 23 с., раздел "ВИДЫ ПРЕПАРАТОВ ИНСУЛИНА. ПУТИ ИХ ПРОИЗВОДСТВА", PAKULA A.A. et al., Genetic analysis of protein stability and function. Anna. Rev. Genet. 1989, v.23, p.289-310, TOKURIKI N. ET AL., Stability effects of mutations and protein evolvability, Curr. Opin. Struct. Biol., 2009, v.19, n.5, p.596-604, SCHILLING R.J. ET AL., Degradation of insulin by trypsin and alpha chymotrypsin, Pharmaceutical Research, 1991, v.8, n.6, p.721-727, ORLANDO M., Modification of proteins and low molecular weight substances with hydroxyethyl starch (HES), Inauguraldissertation, Giesen, 2003, p.166, с.15 ZHOU J. et al. Preparation and PEGylation of exendin-4 peptide secreted from yeast Pichia pastoris, European journal of pharmaceutics and biopharmaceutics, 2009, V. 72, N. 2, p.412-417, CHEN X. et al., Fusion protein linkers: property, design and functionality, Advanced drug delivery reviews, 2013, v. 65, n. 10, p.1357-1369, MAE * |
с.5-7. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
KR102406654B1 (ko) | 지속형 인슐린 및 그 용도 | |
US6037143A (en) | Enzymatic method for modification of recombinant polypeptides | |
TWI774694B (zh) | 具有降低對胰島素受體之親和力之胰島素類似物及其用途 | |
KR20160101702A (ko) | 지속형 인슐린 또는 이의 아날로그 결합체 | |
CN113105536B (zh) | 一种新甘精胰岛素原及其制备甘精胰岛素的方法 | |
CN113166222B (zh) | 长效胰岛素类似物及其复合物 | |
KR20190036956A (ko) | 지속형 단쇄 인슐린 아날로그 및 이의 결합체 | |
KR100554490B1 (ko) | 분자내 샤퍼론 유사 서열을 함유하는 키메라 단백질 및이것의 인슐린 제조용 용도 | |
RU2781307C2 (ru) | Способ получения активной формы производного аналога инсулина длительного действия с использованием клострипаина | |
US20160166653A1 (en) | Chemically and thermodynamically stable insulin analogues and improved methods for their production | |
CN112789290B (zh) | 使用梭菌蛋白酶制备长效胰岛素类似物缀合物的活性形式的方法 | |
Liu et al. | Large scale preparation of recombinant human parathyroid hormone 1–84 from Escherichia coli | |
RU2781308C2 (ru) | Аналоги инсулина длительного действия и их производные | |
CN112105635A (zh) | 用于重组蛋白的更高表达的前导序列 | |
JP2021514194A (ja) | ブタトリプシンの変異体 | |
EP3344651B1 (en) | A process for obtaining insulin with correctly formed disulfide bonds | |
JP2014509603A (ja) | システイン置換を含むヒトインスリン類似体およびヒトインスリン誘導体 | |
US20020164712A1 (en) | Chimeric protein containing an intramolecular chaperone-like sequence | |
RU2729737C1 (ru) | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pF882, КОДИРУЮЩАЯ ГИБРИДНЫЙ ПОЛИПЕПТИД, СОДЕРЖАЩИЙ В30-ДЕЗТРЕОНИН-ИНСУЛИН, И ШТАММ БАКТЕРИЙ Escherichia coli - ПРОДУЦЕНТ ГИБРИДНОГО ПОЛИПЕПТИДА, СОДЕРЖАЩЕГО В30-ДЕЗТРЕОНИН-ИНСУЛИН | |
US20060094651A1 (en) | Formulations and methods of production of FGF-20 |