JP2021514194A - ブタトリプシンの変異体 - Google Patents
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Abstract
Description
したがって、先行技術において、サイドアクティビティが低減した、特にエキソペプチダーゼ活性が低減した新規なトリプシン変異体に対するニーズがあった。かかる新規なトリプシン変異体は、PPIの切断において副産物の量を低減し、PPIからインスリン(またはインスリン誘導体)を産生するときに、インスリンおよびインスリン誘導体の収率がより向上するという結果をもたらすであろう。
ブタトリプシンの変異体であって、
配列番号1と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含みまたはそれからなり、
該アミノ酸配列は、配列番号1による天然ブタトリプシンのF24、S44、D56、G78、Y131、S172およびW193に対応する1つまたはそれ以上の位置での少なくとも1個またはそれ以上のアミノ酸置換がある点が配列番号1と異なり、但し、
該アミノ酸配列は、配列番号1による天然のブタトリプシンではないことを条件とし;かつ、
該アミノ酸配列は、配列番号2によるブタ変異体トリプシンS172Aではないことを条件とする、
前記ブタトリプシンの変異体、
に関する。
第3の態様に記載の宿主細胞を培養する工程、および培養培地からまたは該宿主細胞からブタトリプシンの該変異体を単離する工程
を含む前記方法に関する。
Aは1個またはそれ以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり;かつ
Bは1個またはそれ以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列である、前記使用に関する。
本発明を以下に詳細に説明するが、本発明は、本明細書に記載した特定の方法論、プロトコルおよび試薬に限定されるものではなく、それらは変更可能であることを理解されたい。また、本明細書で使用する用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的とするものであり、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定するものではないことも理解されたい。他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
本明細書で使用する場合、「アミノ酸アナログ」という用語は、天然のアミノ酸と同じ基本化学構造を有する化合物を指す。
本明細書で使用する場合、「アミノ酸模倣体」という用語は、アミノ酸の一般的な化学構造と異なるが、天然のアミノ酸と同様の様式で機能する構造を有する化合物を指す。
(i).「インスリンデテミル」、これは、B30位のC末端トレオニンが取り外され、かつB29位のリジンのイプシロン−アミノ官能基に脂肪酸残基(ミリスチン酸残基)が付着されているという点でヒトインスリンと異なる。
(ii).「インスリンデグルデク」、これは、最後のアミノ酸がB鎖から欠失されているという点で、かつBLys29からヘキサデカン二酸までグルタミルリンクが付加されていることにより、ヒトインスリンと異なる。
(i).「インスリンアスパルト」は、プロリンであるヒトインスリン中のアミノ酸B28(すなわちヒトインスリンのB鎖中の28番のアミノ酸)を、アスパラギン酸で置き換えるように組換えDNA技術により創出される;
(ii).「インスリンリスプロ」は、ヒトインスリンのB鎖のC末端上の最後から2番目のリジン残基とプロリン残基とが逆転するように組換えDNA技術により創出される(ヒトインスリン:B28Pro−B29Lys;インスリンリスプロ:B28Lys−B29Pro);
(iii).「インスリングルリジン」は、B3位のアミノ酸アスパラギンをリジンで置き換え、かつB29位のリジンをグルタミン酸で置き換えるという点でヒトインスリンと異なる;
(iv).「インスリングラルギン」は、A21位のアスパラギンをグリシンで置き換え、かつB鎖をカルボキシ末端で2個のアルギニンによって伸長しているという点でヒトインスリンと異なる。
一実施形態では、組成物は均一な剤形で提供され、それ自体既知の方法で製造することができる。組成物は、例えば、溶液または懸濁液の形態とすることができる。
以下の項では、本発明のある特定の要素について説明する。これらの要素は、特定の実施形態と共に列挙されるが、追加の実施形態を創出するために任意の様式でおよび任意の数で組み合わせることができるということを理解されたい。様々に説明される実施例および実施形態は、明確に説明された実施形態のみに本発明を限定すると解釈すべきではない。この説明は、明確に説明される実施形態を任意数の開示された要素と組み合わせる実施形態を、支持および包含すると理解されたい。さらに、本出願における全ての説明された要素の任意の入替えおよび組合せは、文脈において明記されない限り、本出願の説明によって開示されたものと見なされるべきである。
ブタトリプシンの変異体であって、
配列番号1と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含みまたはそれからなり、
該アミノ酸配列は、配列番号1による天然ブタトリプシンのF24、S44、D56、G78、Y131、S172およびW193に対応する1つまたはそれ以上の位置での少なくとも1個またはそれ以上のアミノ酸置換がある点が配列番号1と異なり、但し、
該アミノ酸配列は、配列番号1による天然のブタトリプシンではないことを条件とし;かつ、
該アミノ酸配列は、配列番号2によるブタ変異体トリプシンS172Aではないことを条件とする、
前記ブタトリプシンの変異体、
を対象とする。
F24に対応する位置のアミノ酸はAsp、Glu、もしくはGlyで置換されていない;
S44に対応する位置のアミノ酸はTyrで置換されていない;
Y131に対応する位置のアミノ酸はLysもしくはProで置換されていない;および/または
W193に対応する位置のアミノ酸はAsnもしくはCysで置換されていない。
F24に対応する位置のアミノ酸は、Ala、Asn、Arg、Gln、Ile、Leu、Lys、Met、Ser、Thr、およびValからなる群から選択されるアミノ酸で置換されている;
S44に対応する位置のアミノ酸は、LeuおよびProからなる群から選択されるアミノ酸で置換されている;
D56に対応する位置のアミノ酸は、Ala、Asn、His、およびTrpからなる群から選択されるアミノ酸で置換されている;
G78に対応する位置のアミノ酸は、Ala、Glu、Pro、Ser、およびTyrからなる群から選択されるアミノ酸で置換されている;
Y131に対応する位置のアミノ酸は、Ala、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Met、Ser、Thr、Trp、およびValからなる群から選択されるアミノ酸で置換されている;
S172に対応する位置のアミノ酸は、Ala、Cys、およびThrからなる群から選択されるアミノ酸で置換されている;ならびに/または
W193に対応する位置のアミノ酸は、Phe、Ser、Thr、およびTyrからなる群から選択されるアミノ酸で置換されている。
F24に対応する位置のアミノ酸はArgで置換されている;
S44に対応する位置のアミノ酸はProで置換されている;
D56に対応する位置のアミノ酸はHisで置換されている;
G78に対応する位置のアミノ酸はProで置換されている;
Y131に対応する位置のアミノ酸はMetで置換されている;
S172に対応する位置のアミノ酸をAlaで置換されている;および/または
W193に対応する位置のアミノ酸はSerで置換されている。
R107に対応する位置のアミノ酸はProで置換されていない。および/または
K170に対応する位置のアミノ酸は、IleまたはPheで置換されていない。
R99に対応する位置のアミノ酸は、Ala、Asn、Asp、Glu、Gly、His、Leu、Phe、Thr、Trp、およびTyrからなる群から選択されるアミノ酸で置換されている;
R107に対応する位置のアミノ酸は、Asp、Gly、Pro、Ser、およびThrからなる群から選択されるアミノ酸で置換されている;
K125に対応する位置のアミノ酸は、Ala、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Leu、Ser、およびTyrからなる群から選択されるアミノ酸で置換されている;ならびに/または
K170に対応する位置のアミノ酸は、Ala、Asn、GlyおよびTyrからなる群から選択されるアミノ酸で置換されている。
R99に対応する位置のアミノ酸は、Ala、His、およびAsnからなる群から選択されるアミノ酸で置換されている;
R107に対応する位置のアミノ酸はThrで置換されている;
K125に対応する位置のアミノ酸は、Ala、Cys、およびSerからなる群から選択されるアミノ酸で置換されている;ならびに/または
K170に対応する位置のアミノ酸はAlaで置換されている。
Xaa24は、Ala、Asn、Arg、Gln、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Ser、Thr、およびValからなる群から選択されるアミノ酸であり;
Xaa44は、Leu、Pro、およびSerからなる群から選択されるアミノ酸であり;
Xaa56は、Ala、Asn、Asp、His、およびTrpからなる群から選択されるアミノ酸であり;
Xaa78は、Ala、Glu、Gly、Pro、Ser、およびTyrからなる群から選択されるアミノ酸であり;
Xaa99は、Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gly、His、Leu、Phe、Thr、Trp、およびTyrからなる群から選択されるアミノ酸であり;
Xaa107は、Arg、Asp、Gly、Pro、Ser、およびThrからなる群から選択されるアミノ酸であり;
Xaa125は、Ala、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Leu、Lys、Ser、およびTyrからなる群から選択されるアミノ酸であり;
Xaa131は、Ala、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Met、Ser、Thr、Trp、Tyr、およびValからなる群から選択されるアミノ酸であり;
Xaa170は、Ala、Asn、Gly、Lys、およびTyrからなる群から選択されるアミノ酸であり;
Xaa172は、Ala、Cys、Ser、およびThrからなる群から選択されるアミノ酸であり;ならびに/または
Xaa193は、Phe、Ser、Thr、Trp、およびTyrからなる群から選択されるアミノ酸であり;但し、
配列番号3は、配列番号1によるブタ野生型トリプシンではないことを条件とし;かつ
配列番号3は、配列番号2によるブタ変異体トリプシンS172Aではないことを条件とする。
Xaa24は、PheおよびArgからなる群から選択されるアミノ酸であり;
Xaa44は、SerおよびProからなる群から選択されるアミノ酸であり;
Xaa56は、AspおよびHisからなる群から選択されるアミノ酸であり;
Xaa78は、GlyおよびProからなる群から選択されるアミノ酸であり;
Xaa99は、Ala、Arg、His、およびAsnからなる群から選択されるアミノ酸であり;
Xaa107は、ArgおよびThrからなる群から選択されるアミノ酸であり;
Xaa125は、Ala、Cys、LysおよびSerからなる群から選択されるアミノ酸であり;
Xaa131は、MetおよびTyrからなる群から選択されるアミノ酸であり;
Xaa170は、AlaおよびLysからなる群から選択されるアミノ酸であり;
Xaa172は、AlaおよびSerからなる群から選択されるアミノ酸であり;ならびに/または
Xaa193は、SerおよびTrpからなる群から選択されるアミノ酸であり;但し、
配列番号3は、配列番号1によるブタ野生型トリプシンではないことを条件とし;かつ
配列番号3は、配列番号2によるブタ変異体トリプシンS172Aではないことを条件とする。
Aは1個またはそれ以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり;かつ
Bは1個またはそれ以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。
− 本発明の第1の態様で定義したブタトリプシンの変異体;または
− 本発明の第1の態様で定義したブタトリプシンの変異体のトリプシノーゲン前駆体分子、
をコードする核酸分子を対象とする。
第3の態様に記載の宿主細胞を培養する工程;および
培養培地からまたは該宿主細胞からブタトリプシンの該変異体のトリプシノーゲン前駆体分子を単離する工程
を含む方法を、対象とする。
トリプシノーゲン前駆体分子を活性化し、それによりブタトリプシンの該変異体を得る工程
を含む。
食品成分として使用するための;飼料成分として使用するための、または食品成分もしくは飼料成分を製造する方法中で使用するための、
本発明のブタトリプシンの変異体、または本発明の核酸分子、または本発明の宿主細胞を対象とする。
食品成分としての本発明のブタトリプシンの変異体の使用。
飼料成分としての本発明のブタトリプシンの変異体の使用。
食品成分または飼料成分の製造方法における本発明のブタトリプシンの変異体の使用。
ヒトインスリン、インスリンアナログまたはインスリンの誘導体のin vivo産生における使用のための第1の態様に記載のブタトリプシンの変異体。
第6の態様の一実施形態では、インスリンアナログは、インスリンアスパルト、インスリンリスプロ、インスリングルリジン、およびインスリングラルギンからなる群から選択される。
Aは1個またはそれ以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり;かつ
Bは1個またはそれ以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列である、前記使用を対象とする。
酵素の改良は酵素工学によって行うことができる。この技法は、特性が改善された出発酵素の変異体の開発を伴う。酵素変異体を提供するために、まず変異を、通常の分子生物学的方法によりブタ膵臓トリプシンをコードする合成ヌクレオチド配列に遺伝子レベルで導入した。酵素変異体の遺伝子を発現ベクターpLE1A17(pRSF−1bの派生体、Novagen)にクローニングした。結果として生じるプラスミドを大腸菌BL21(DE3)細胞の形質転換向けに使用した。
大腸菌でのブタトリプシノーゲンの組換え発現を、カナマイシン(50mg/L)を補充した培地ZYM−5052を使用して30℃で、F.W.Studier(F.W.Studier(2005)Prot.Exp.Pur.41:207〜234頁)に従って自己誘導により行った。培養中のグルコースが代謝されると、存在する乳糖が発現を誘導する。グリセロールをC源として使用した。発現は、マイクロプレートでならびに振とうフラスコスケールで実行した。
ペリプラズマティック(periplasmatic)なトリプシノーゲンを浸透圧ショックによって遊離させた。細胞(実施例2から得た)3.6gを溶解バッファ(10mM Tris−HCl、pH=8、25mM MgCl2、200mM NaCl)10mLに、均一な懸濁液が得られるまで再懸濁した。懸濁液を5℃および180rpmで24時間撹拌した。遠心分離後、上澄みを活性化に供した。
トリプシノーゲンの活性化については、ブタの腸由来のエンテロキナーゼを使用した(Sigma、製品no.E0885;40単位;単位の定義:1単位のエンテロキナーゼは、25℃、pH5.6で1分あたりトリプシノーゲンから1.0ナノモルのトリプシンを産生する)。
エンテロキナーゼを、最終濃度17mU/mLへと無細胞抽出物に添加した。反応物を30℃で16〜24時間インキュベートした。結果として生じるトリプシン溶液を−20℃で保存した。
トリプシン活性を、100mM Tris pH8.0、20mM CaCl2に含まれるChromozym TRY(Roche Diagnostics GmbH)を使用して、25℃で決定した。Chromozym TRYは、アルギニンのカルボン酸側のペプチドを加水分解するプロテアーゼ(トリプシン、エンドプロテイナーゼ、Arg−C等)の活性に関する信頼性のある吸光分光定量用の基質(カルボベンゾキシ−L−バリル−L−グリシル−L−アルギニン−4−ニトラニリドアセテート)である。分光測定は405nmで実行した。
すべてのトリプシン変異体の一次スクリーニングを、モデルシステムとしてプレプロヒトインスリン(PPI)を用いて行った。PPIを、濃度0.75g/Lへとバッファ溶液(pH=8.3)に溶かした。トリプシン変異体溶液を実施例3に従って調製し、さらに処理することなく反応混合物に添加した。定期的に試料を採取し、1N HClで酸性化し、HPLCで分析した(実施例7)。
(1)トリプシン変異体がなんらかのPPI切断活性を示すかどうか(結果を表1、列Aに示す);
(2)トリプシン変異体がPPI切断活性を示すかどうか:トリプシン切断選択性が配列番号2と比較して改善されているかどうか(結果を表1、列Bに示す)。トリプシン変異体のdi−Arg選択性を評価するため、B31Arg−B32Arg−ヒトインスリンの形成をHPLC(実施例7を参照されたい)でモニターし、配列番号2と比較した。選択性を
[diArg]=B31Arg−B32Arg−ヒトインスリンの濃度
[monoArg]=desB32Arg−インスリンヒトの濃度
[desThr]=desB30Thr−インスリンヒトの濃度
[UI]=未知の切断中間体の濃度
である。
この実験は、20℃、pH値8.3(バッファ溶液)で実行し、1000mLスケールまで行った。
プレプロインスリングラルギン溶液を適当な恒温反応容器に充填し、ブタトリプシンの変異体の溶液を添加することにより反応を開始した。一定の時間間隔の後に試料を採取した;酵素反応を、1Nまたは2N HCl溶液を使用して試料溶液を酸性化することにより、即座に停止させた。試料をHPLCで分析した(実施例7を参照されたい)。
図2に、配列番号2の反応速度論を示す。図に、インスリングラルギンの形成の時間依存性の経過、ならびに、最も顕著な切断副産物B31Arg−インスリングラルギン(インスリングラルギンB鎖の31位の後の切断、「des−Arg」と呼ぶ)およびdesB30Thrインスリングラルギン(インスリングラルギンB鎖の29位の後の切断、「des−Thr」と呼ぶ)の形成を示す。
選択した変異体を、プレプロインスリングラルギンの切断に供した。結果を表2に記す。インスリングラルギン、desB32Arg−インスリングラルギン、およびdesB29Thr−インスリングラルギンの含有量は、切断の終了時での分析用HPLCクロマトグラムからのピーク面積の形態で与えられており、インスリングラルギンと副産物との比を表す。さらに、モル切断収率は、
n(インスリングラルギン)=形成されたインスリングラルギンのモル
n(プレプロインスリングラルギン)=展開されたプレプロインスリングラルギンのモル
である。
方法 高速液体クロマトグラフィー
カラム 製造業者: Macherey&Nagel
ブランド: Nucleosil120−5 C18
寸法:250×4mm
移動相A:45mMリン酸ナトリウムバッファ(pH2.5).315mM NaCl.
25%(v/v)アセトニトリル
移動相B 45mMリン酸ナトリウムバッファ(pH2.5).55mM NaCl.
65%(v/v)アセトニトリル
グラジエント 時間/分 移動相A 移動相B
0分 94% 6%
30分の線形 90% 10%
注入量: 5μL
検出: UV(215nm)
この実験は、8℃、pH値8.3(バッファ溶液)で実行した。
インスリングラルギン溶液(0.5g/L)を適当な恒温反応容器に充填し、配列番号2溶液(100U/gインスリン)を添加することにより反応を開始した。一定の時間間隔の後に試料を採取し、1N HCl溶液を使用して試料溶液を酸性化することにより、酵素反応を即座に停止した。試料をHPLCで分析した(実施例7を参照されたい)。反応速度論を図3に記す。
野生型ブタトリプシン、配列番号1:
IVGGYTCAAN SIPYQVSLNS GSHFCGGSLI NSQWVVSAAH CYKSRIQVRL GEHNIDVLEG
NEQFINAAKI ITHPNFNGNT LDNDIMLIKL SSPATLNSRV ATVSLPRSCA AAGTECLISG
WGNTKSSGSS YPSLLQCLKA PVLSDSSCKS SYPGQITGNM ICVGFLEGGK DSCQGDSGGP
VVCNGQLQGI VSWGYGCAQK NKPGVYTKVC NYVNWIQQTI AAN
バリアントS172A、配列番号2
IVGGYTCAAN SIPYQVSLNS GSHFCGGSLI NSQWVVSAAH CYKSRIQVRL GEHNIDVLEG
NEQFINAAKI ITHPNFNGNT LDNDIMLIKL SSPATLNSRV ATVSLPRSCA AAGTECLISG
WGNTKSSGSS YPSLLQCLKA PVLSDSSCKS SYPGQITGNM ICVGFLEGGK DACQGDSGGP
VVCNGQLQGI VSWGYGCAQK NKPGVYTKVC NYVNWIQQTI AAN
アミノ酸位置24、44、56、78、99、107、125、131、170、172、および193に可変位置を持つブタトリプシンの遺伝子配列;配列番号3:
IVGGYTCAAN SIPYQVSLNS GSHXCGGSLI NSQWVVSAAH CYKXRIQVRL GEHNIXVLEG
NEQFINAAKI ITHPNFNXNT LDNDIMLIKL SSPATLNSXV ATVSLPXSCA AAGTECLISG
WGNTXSSGSS XPSLLQCLKA PVLSDSSCKS SYPGQITGNM ICVGFLEGGX DXCQGDSGGP
VVCNGQLQGI VSXGYGCAQK NKPGVYTKVC NYVNWIQQTI AAN
配列番号4:
IVGGYTCAAN SIPYQVSLNS GSHRCGGSLI NSQWVVSAAH CYKSRIQVRL GEHNIDVLEG
NEQFINAAKI ITHPNFNGNT LDNDIMLIKL SSPATLNSAV ATVSLPRSCA AAGTECLISG
WGNTKSSGSS YPSLLQCLKA PVLSDSSCKS SYPGQITGNM ICVGFLEGGK DACQGDSGGP
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配列番号5:
IVGGYTCAAN SIPYQVSLNS GSHRCGGSLI NSQWVVSAAH CYKSRIQVRL GEHNIDVLEG
NEQFINAAKI ITHPNFNGNT LDNDIMLIKL SSPATLNSLV ATVSLPRSCA AAGTECLISG
WGNTKSSGSS YPSLLQCLKA PVLSDSSCKS SYPGQITGNM ICVGFLEGGK DACQGDSGGP
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配列番号6:
IVGGYTCAAN SIPYQVSLNS GSHRCGGSLI NSQWVVSAAH CYKSRIQVRL GEHNIDVLEG
NEQFINAAKI ITHPNFNGNT LDNDIMLIKL SSPATLNSFV ATVSLPRSCA AAGTECLISG
WGNTKSSGSS YPSLLQCLKA PVLSDSSCKS SYPGQITGNM ICVGFLEGGK DACQGDSGGP
VVCNGQLQGI VSSGYGCAQK NKPGVYTKVC NYVNWIQQTI AAN
配列番号7:
IVGGYTCAAN SIPYQVSLNS GSHRCGGSLI NSQWVVSAAH CYKSRIQVRL GEHNIDVLEG
NEQFINAAKI ITHPNFNGNT LDNDIMLIKL SSPATLNSWV ATVSLPRSCA AAGTECLISG
WGNTKSSGSS YPSLLQCLKA PVLSDSSCKS SYPGQITGNM ICVGFLEGGK DACQGDSGGP
VVCNGQLQGI VSSGYGCAQK NKPGVYTKVC NYVNWIQQTI AAN
配列番号8:
IVGGYTCAAN SIPYQVSLNS GSHRCGGSLI NSQWVVSAAH CYKSRIQVRL GEHNIDVLEG
NEQFINAAKI ITHPNFNGNT LDNDIMLIKL SSPATLNSGV ATVSLPRSCA AAGTECLISG
WGNTKSSGSS YPSLLQCLKA PVLSDSSCKS SYPGQITGNM ICVGFLEGGK DACQGDSGGP
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配列番号9:
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NEQFINAAKI ITHPNFNGNT LDNDIMLIKL SSPATLNSYV ATVSLPRSCA AAGTECLISG
WGNTKSSGSS YPSLLQCLKA PVLSDSSCKS SYPGQITGNM ICVGFLEGGK DACQGDSGGP
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配列番号10:
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WGNTKSSGSS YPSLLQCLKA PVLSDSSCKS SYPGQITGNM ICVGFLEGGK DACQGDSGGP
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配列番号11:
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NEQFINAAKI ITHPNFNGNT LDNDIMLIKL SSPATLNSNV ATVSLPRSCA AAGTECLISG
WGNTKSSGSS YPSLLQCLKA PVLSDSSCKS SYPGQITGNM ICVGFLEGGK DACQGDSGGP
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配列番号12:
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NEQFINAAKI ITHPNFNGNT LDNDIMLIKL SSPATLNSDV ATVSLPRSCA AAGTECLISG
WGNTKSSGSS YPSLLQCLKA PVLSDSSCKS SYPGQITGNM ICVGFLEGGK DACQGDSGGP
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配列番号13:
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WGNTKSSGSS YPSLLQCLKA PVLSDSSCKS SYPGQITGNM ICVGFLEGGK DACQGDSGGP
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配列番号14:
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NEQFINAAKI ITHPNFNGNT LDNDIMLIKL SSPATLNSHV ATVSLPRSCA AAGTECLISG
WGNTKSSGSS YPSLLQCLKA PVLSDSSCKS SYPGQITGNM ICVGFLEGGK DACQGDSGGP
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配列番号15:
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NEQFINAAKI ITHPNFNGNT LDNDIMLIKL SSPATLNSRV ATVSLPRSCA AAGTECLISG
WGNTASSGSS YPSLLQCLKA PVLSDSSCKS SYPGQITGNM ICVGFLEGGK DACQGDSGGP
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配列番号16:
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NEQFINAAKI ITHPNFNGNT LDNDIMLIKL SSPATLNSRV ATVSLPRSCA AAGTECLISG
WGNTGSSGSS YPSLLQCLKA PVLSDSSCKS SYPGQITGNM ICVGFLEGGK DACQGDSGGP
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配列番号17:
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WGNTYSSGSS YPSLLQCLKA PVLSDSSCKS SYPGQITGNM ICVGFLEGGK DACQGDSGGP
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配列番号18:
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NEQFINAAKI ITHPNFNGNT LDNDIMLIKL SSPATLNSRV ATVSLPRSCA AAGTECLISG
WGNTSSSGSS YPSLLQCLKA PVLSDSSCKS SYPGQITGNM ICVGFLEGGK DACQGDSGGP
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配列番号19:
IVGGYTCAAN SIPYQVSLNS GSHRCGGSLI NSQWVVSAAH CYKSRIQVRL GEHNIDVLEG
NEQFINAAKI ITHPNFNGNT LDNDIMLIKL SSPATLNSRV ATVSLPRSCA AAGTECLISG
WGNTCSSGSS YPSLLQCLKA PVLSDSSCKS SYPGQITGNM ICVGFLEGGK DACQGDSGGP
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配列番号20:
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WGNTESSGSS YPSLLQCLKA PVLSDSSCKS SYPGQITGNM ICVGFLEGGK DACQGDSGGP
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配列番号21:
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WGNTHSSGSS YPSLLQCLKA PVLSDSSCKS SYPGQITGNM ICVGFLEGGK DACQGDSGGP
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配列番号22:
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WGNTLSSGSS YPSLLQCLKA PVLSDSSCKS SYPGQITGNM ICVGFLEGGK DACQGDSGGP
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配列番号23:
IVGGYTCAAN SIPYQVSLNS GSHRCGGSLI NSQWVVSAAH CYKSRIQVRL GEHNIDVLEG
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配列番号24:
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配列番号25:
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配列番号26:
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配列番号27:
IVGGYTCAAN SIPYQVSLNS GSHRCGGSLI NSQWVVSAAH CYKSRIQVRL GEHNIDVLEG
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WGNTKSSGSS YPSLLQCLKA PVLSDSSCKS SYPGQITGNM ICVGFLEGGN DACQGDSGGP
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配列番号28:
IVGGYTCAAN SIPYQVSLNS GSHVCGGSLI NSQWVVSAAH CYKSRIQVRL GEHNIDVLEG
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配列番号29:
IVGGYTCAAN SIPYQVSLNS GSHLCGGSLI NSQWVVSAAH CYKSRIQVRL GEHNIDVLEG
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配列番号30:
IVGGYTCAAN SIPYQVSLNS GSHSCGGSLI NSQWVVSAAH CYKSRIQVRL GEHNIDVLEG
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配列番号31:
IVGGYTCAAN SIPYQVSLNS GSHQCGGSLI NSQWVVSAAH CYKSRIQVRL GEHNIDVLEG
NEQFINAAKI ITHPNFNGNT LDNDIMLIKL SSPATLNSRV ATVSLPRSCA AAGTECLISG
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配列番号32:
IVGGYTCAAN SIPYQVSLNS GSHRCGGSLI NSQWVVSAAH CYKSRIQVRL GEHNIDVLEG
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配列番号33:
IVGGYTCAAN SIPYQVSLNS GSHRCGGSLI NSQWVVSAAH CYKSRIQVRL GEHNIDVLEG
NEQFINAAKI ITHPNFNGNT LDNDIMLIKL SSPATLNSRV ATVSLPTSCA AAGTECLISG
WGNTKSSGSS YPSLLQCLKA PVLSDSSCKS SYPGQITGNM ICVGFLEGGK DACQGDSGGP
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配列番号34:
IVGGYTCAAN SIPYQVSLNS GSHRCGGSLI NSQWVVSAAH CYKSRIQVRL GEHNIDVLEG
NEQFINAAKI ITHPNFNGNT LDNDIMLIKL SSPATLNSRV ATVSLPRSCA AAGTECLISG
WGNTKSSGSS APSLLQCLKA PVLSDSSCKS SYPGQITGNM ICVGFLEGGK DACQGDSGGP
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配列番号35:
IVGGYTCAAN SIPYQVSLNS GSHRCGGSLI NSQWVVSAAH CYKSRIQVRL GEHNIDVLEG
NEQFINAAKI ITHPNFNGNT LDNDIMLIKL SSPATLNSRV ATVSLPRSCA AAGTECLISG
WGNTKSSGSS LPSLLQCLKA PVLSDSSCKS SYPGQITGNM ICVGFLEGGK DACQGDSGGP
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配列番号36:
IVGGYTCAAN SIPYQVSLNS GSHRCGGSLI NSQWVVSAAH CYKSRIQVRL GEHNIDVLEG
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配列番号37:
IVGGYTCAAN SIPYQVSLNS GSHRCGGSLI NSQWVVSAAH CYKSRIQVRL GEHNIDVLEG
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配列番号38:
IVGGYTCAAN SIPYQVSLNS GSHRCGGSLI NSQWVVSAAH CYKSRIQVRL GEHNIDVLEG
NEQFINAAKI ITHPNFNGNT LDNDIMLIKL SSPATLNSRV ATVSLPRSCA AAGTECLISG
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配列番号39:
IVGGYTCAAN SIPYQVSLNS GSHRCGGSLI NSQWVVSAAH CYKSRIQVRL GEHNIDVLEG
NEQFINAAKI ITHPNFNGNT LDNDIMLIKL SSPATLNSRV ATVSLPRSCA AAGTECLISG
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配列番号40:
IVGGYTCAAN SIPYQVSLNS GSHRCGGSLI NSQWVVSAAH CYKSRIQVRL GEHNIDVLEG
NEQFINAAKI ITHPNFNGNT LDNDIMLIKL SSPATLNSRV ATVSLPRSCA AAGTECLISG
WGNTKSSGSS EPSLLQCLKA PVLSDSSCKS SYPGQITGNM ICVGFLEGGK DACQGDSGGP
VVCNGQLQGI VSSGYGCAQK NKPGVYTKVC NYVNWIQQTI AAN
配列番号41:
IVGGYTCAAN SIPYQVSLNS GSHRCGGSLI NSQWVVSAAH CYKSRIQVRL GEHNIDVLEG
NEQFINAAKI ITHPNFNGNT LDNDIMLIKL SSPATLNSRV ATVSLPRSCA AAGTECLISG
WGNTKSSGSS HPSLLQCLKA PVLSDSSCKS SYPGQITGNM ICVGFLEGGK DACQGDSGGP
VVCNGQLQGI VSSGYGCAQK NKPGVYTKVC NYVNWIQQTI AAN
配列番号42:
IVGGYTCAAN SIPYQVSLNS GSHRCGGSLI NSQWVVSAAH CYKSRIQVRL GEHNIDVLEG
NEQFINAAKI ITHPNFNGNT LDNDIMLIKL SSPATLNSRV ATVSLPRSCA AAGTECLISG
WGNTKSSGSS YPSLLQCLKA PVLSDSSCKS SYPGQITGNM ICVGFLEGGK DACQGDSGGP
VVCNGQLQGI VSSGYGCAQK NKPGVYTKVC NYVNWIQQTI AAN
配列番号43:
IVGGYTCAAN SIPYQVSLNS GSHRCGGSLI NSQWVVSAAH CYKSRIQVRL GEHNIDVLEG
NEQFINAAKI ITHPNFNGNT LDNDIMLIKL SSPATLNSRV ATVSLPRSCA AAGTECLISG
WGNTKSSGSS YPSLLQCLKA PVLSDSSCKS SYPGQITGNM ICVGFLEGGK DTCQGDSGGP
VVCNGQLQGI VSSGYGCAQK NKPGVYTKVC NYVNWIQQTI AAN
配列番号44:
IVGGYTCAAN SIPYQVSLNS GSHRCGGSLI NSQWVVSAAH CYKSRIQVRL GEHNIDVLEG
NEQFINAAKI ITHPNFNGNT LDNDIMLIKL SSPATLNSRV ATVSLPRSCA AAGTECLISG
WGNTKSSGSS YPSLLQCLKA PVLSDSSCKS SYPGQITGNM ICVGFLEGGK DSCQGDSGGP
VVCNGQLQGI VSSGYGCAQK NKPGVYTKVC NYVNWIQQTI AAN
配列番号45:
IVGGYTCAAN SIPYQVSLNS GSHRCGGSLI NSQWVVSAAH CYKSRIQVRL GEHNIDVLEG
NEQFINAAKI ITHPNFNGNT LDNDIMLIKL SSPATLNSRV ATVSLPRSCA AAGTECLISG
WGNTKSSGSS YPSLLQCLKA PVLSDSSCKS SYPGQITGNM ICVGFLEGGK DCCQGDSGGP
VVCNGQLQGI VSSGYGCAQK NKPGVYTKVC NYVNWIQQTI AAN
配列番号46:
IVGGYTCAAN SIPYQVSLNS GSHACGGSLI NSQWVVSAAH CYKSRIQVRL GEHNIDVLEG
NEQFINAAKI ITHPNFNGNT LDNDIMLIKL SSPATLNSRV ATVSLPRSCA AAGTECLISG
WGNTKSSGSS YPSLLQCLKA PVLSDSSCKS SYPGQITGNM ICVGFLEGGK DACQGDSGGP
VVCNGQLQGI VSSGYGCAQK NKPGVYTKVC NYVNWIQQTI AAN
配列番号47:
IVGGYTCAAN SIPYQVSLNS GSHICGGSLI NSQWVVSAAH CYKSRIQVRL GEHNIDVLEG
NEQFINAAKI ITHPNFNGNT LDNDIMLIKL SSPATLNSRV ATVSLPRSCA AAGTECLISG
WGNTKSSGSS YPSLLQCLKA PVLSDSSCKS SYPGQITGNM ICVGFLEGGK DACQGDSGGP
VVCNGQLQGI VSSGYGCAQK NKPGVYTKVC NYVNWIQQTI AAN
配列番号48:
IVGGYTCAAN SIPYQVSLNS GSHMCGGSLI NSQWVVSAAH CYKSRIQVRL GEHNIDVLEG
NEQFINAAKI ITHPNFNGNT LDNDIMLIKL SSPATLNSRV ATVSLPRSCA AAGTECLISG
WGNTKSSGSS YPSLLQCLKA PVLSDSSCKS SYPGQITGNM ICVGFLEGGK DACQGDSGGP
VVCNGQLQGI VSSGYGCAQK NKPGVYTKVC NYVNWIQQTI AAN
配列番号49:
IVGGYTCAAN SIPYQVSLNS GSHTCGGSLI NSQWVVSAAH CYKSRIQVRL GEHNIDVLEG
NEQFINAAKI ITHPNFNGNT LDNDIMLIKL SSPATLNSRV ATVSLPRSCA AAGTECLISG
WGNTKSSGSS YPSLLQCLKA PVLSDSSCKS SYPGQITGNM ICVGFLEGGK DACQGDSGGP
VVCNGQLQGI VSSGYGCAQK NKPGVYTKVC NYVNWIQQTI AAN
配列番号50:
IVGGYTCAAN SIPYQVSLNS GSHNCGGSLI NSQWVVSAAH CYKSRIQVRL GEHNIDVLEG
NEQFINAAKI ITHPNFNGNT LDNDIMLIKL SSPATLNSRV ATVSLPRSCA AAGTECLISG
WGNTKSSGSS YPSLLQCLKA PVLSDSSCKS SYPGQITGNM ICVGFLEGGK DACQGDSGGP
VVCNGQLQGI VSSGYGCAQK NKPGVYTKVC NYVNWIQQTI AAN
配列番号51:
IVGGYTCAAN SIPYQVSLNS GSHKCGGSLI NSQWVVSAAH CYKSRIQVRL GEHNIDVLEG
NEQFINAAKI ITHPNFNGNT LDNDIMLIKL SSPATLNSRV ATVSLPRSCA AAGTECLISG
WGNTKSSGSS YPSLLQCLKA PVLSDSSCKS SYPGQITGNM ICVGFLEGGK DACQGDSGGP
VVCNGQLQGI VSSGYGCAQK NKPGVYTKVC NYVNWIQQTI AAN
配列番号52:
IVGGYTCAAN SIPYQVSLNS GSHRCGGSLI NSQWVVSAAH CYKLRIQVRL GEHNIDVLEG
NEQFINAAKI ITHPNFNGNT LDNDIMLIKL SSPATLNSRV ATVSLPRSCA AAGTECLISG
WGNTKSSGSS YPSLLQCLKA PVLSDSSCKS SYPGQITGNM ICVGFLEGGK DACQGDSGGP
VVCNGQLQGI VSSGYGCAQK NKPGVYTKVC NYVNWIQQTI AAN
配列番号53:
IVGGYTCAAN SIPYQVSLNS GSHRCGGSLI NSQWVVSAAH CYKPRIQVRL GEHNIDVLEG
NEQFINAAKI ITHPNFNGNT LDNDIMLIKL SSPATLNSRV ATVSLPRSCA AAGTECLISG
WGNTKSSGSS YPSLLQCLKA PVLSDSSCKS SYPGQITGNM ICVGFLEGGK DACQGDSGGP
VVCNGQLQGI VSSGYGCAQK NKPGVYTKVC NYVNWIQQTI AAN
配列番号54:
IVGGYTCAAN SIPYQVSLNS GSHRCGGSLI NSQWVVSAAH CYKSRIQVRL GEHNIAVLEG
NEQFINAAKI ITHPNFNGNT LDNDIMLIKL SSPATLNSRV ATVSLPRSCA AAGTECLISG
WGNTKSSGSS YPSLLQCLKA PVLSDSSCKS SYPGQITGNM ICVGFLEGGK DACQGDSGGP
VVCNGQLQGI VSSGYGCAQK NKPGVYTKVC NYVNWIQQTI AAN
配列番号55:
IVGGYTCAAN SIPYQVSLNS GSHRCGGSLI NSQWVVSAAH CYKSRIQVRL GEHNIWVLEG
NEQFINAAKI ITHPNFNGNT LDNDIMLIKL SSPATLNSRV ATVSLPRSCA AAGTECLISG
WGNTKSSGSS YPSLLQCLKA PVLSDSSCKS SYPGQITGNM ICVGFLEGGK DACQGDSGGP
VVCNGQLQGI VSSGYGCAQK NKPGVYTKVC NYVNWIQQTI AAN
配列番号56:
IVGGYTCAAN SIPYQVSLNS GSHRCGGSLI NSQWVVSAAH CYKSRIQVRL GEHNINVLEG
NEQFINAAKI ITHPNFNGNT LDNDIMLIKL SSPATLNSRV ATVSLPRSCA AAGTECLISG
WGNTKSSGSS YPSLLQCLKA PVLSDSSCKS SYPGQITGNM ICVGFLEGGK DACQGDSGGP
VVCNGQLQGI VSSGYGCAQK NKPGVYTKVC NYVNWIQQTI AAN
配列番号57:
IVGGYTCAAN SIPYQVSLNS GSHRCGGSLI NSQWVVSAAH CYKSRIQVRL GEHNIHVLEG
NEQFINAAKI ITHPNFNGNT LDNDIMLIKL SSPATLNSRV ATVSLPRSCA AAGTECLISG
WGNTKSSGSS YPSLLQCLKA PVLSDSSCKS SYPGQITGNM ICVGFLEGGK DACQGDSGGP
VVCNGQLQGI VSSGYGCAQK NKPGVYTKVC NYVNWIQQTI AAN
配列番号58:
IVGGYTCAAN SIPYQVSLNS GSHRCGGSLI NSQWVVSAAH CYKSRIQVRL GEHNIDVLEG
NEQFINAAKI ITHPNFNGNT LDNDIMLIKL SSPATLNSRV ATVSLPPSCA AAGTECLISG
WGNTKSSGSS YPSLLQCLKA PVLSDSSCKS SYPGQITGNM ICVGFLEGGK DACQGDSGGP
VVCNGQLQGI VSSGYGCAQK NKPGVYTKVC NYVNWIQQTI AAN
配列番号59:
IVGGYTCAAN SIPYQVSLNS GSHRCGGSLI NSQWVVSAAH CYKSRIQVRL GEHNIDVLEG
NEQFINAAKI ITHPNFNGNT LDNDIMLIKL SSPATLNSRV ATVSLPGSCA AAGTECLISG
WGNTKSSGSS YPSLLQCLKA PVLSDSSCKS SYPGQITGNM ICVGFLEGGK DACQGDSGGP
VVCNGQLQGI VSSGYGCAQK NKPGVYTKVC NYVNWIQQTI AAN
配列番号60:
IVGGYTCAAN SIPYQVSLNS GSHRCGGSLI NSQWVVSAAH CYKSRIQVRL GEHNIDVLEG
NEQFINAAKI ITHPNFNGNT LDNDIMLIKL SSPATLNSRV ATVSLPSSCA AAGTECLISG
WGNTKSSGSS YPSLLQCLKA PVLSDSSCKS SYPGQITGNM ICVGFLEGGK DACQGDSGGP
VVCNGQLQGI VSSGYGCAQK NKPGVYTKVC NYVNWIQQTI AAN
配列番号61:
IVGGYTCAAN SIPYQVSLNS GSHRCGGSLI NSQWVVSAAH CYKSRIQVRL GEHNIDVLEG
NEQFINAAKI ITHPNFNGNT LDNDIMLIKL SSPATLNSRV ATVSLPDSCA AAGTECLISG
WGNTKSSGSS YPSLLQCLKA PVLSDSSCKS SYPGQITGNM ICVGFLEGGK DACQGDSGGP
VVCNGQLQGI VSSGYGCAQK NKPGVYTKVC NYVNWIQQTI AAN
配列番号62:
IVGGYTCAAN SIPYQVSLNS GSHRCGGSLI NSQWVVSAAH CYKSRIQVRL GEHNIDVLEG
NEQFINAAKI ITHPNFNGNT LDNDIMLIKL SSPATLNSRV ATVSLPRSCA AAGTECLISG
WGNTKSSGSS VPSLLQCLKA PVLSDSSCKS SYPGQITGNM ICVGFLEGGK DACQGDSGGP
VVCNGQLQGI VSSGYGCAQK NKPGVYTKVC NYVNWIQQTI AAN
配列番号63:
IVGGYTCAAN SIPYQVSLNS GSHRCGGSLI NSQWVVSAAH CYKSRIQVRL GEHNIDVLEG
NEQFINAAKI ITHPNFNGNT LDNDIMLIKL SSPATLNSRV ATVSLPRSCA AAGTECLISG
WGNTKSSGSS IPSLLQCLKA PVLSDSSCKS SYPGQITGNM ICVGFLEGGK DACQGDSGGP
VVCNGQLQGI VSSGYGCAQK NKPGVYTKVC NYVNWIQQTI AAN
配列番号64:
IVGGYTCAAN SIPYQVSLNS GSHRCGGSLI NSQWVVSAAH CYKSRIQVRL GEHNIDVLEG
NEQFINAAKI ITHPNFNGNT LDNDIMLIKL SSPATLNSRV ATVSLPRSCA AAGTECLISG
WGNTKSSGSS WPSLLQCLKA PVLSDSSCKS SYPGQITGNM ICVGFLEGGK DACQGDSGGP
VVCNGQLQGI VSSGYGCAQK NKPGVYTKVC NYVNWIQQTI AAN
配列番号65:
IVGGYTCAAN SIPYQVSLNS GSHRCGGSLI NSQWVVSAAH CYKSRIQVRL GEHNIDVLEG
NEQFINAAKI ITHPNFNGNT LDNDIMLIKL SSPATLNSRV ATVSLPRSCA AAGTECLISG
WGNTKSSGSS GPSLLQCLKA PVLSDSSCKS SYPGQITGNM ICVGFLEGGK DACQGDSGGP
VVCNGQLQGI VSSGYGCAQK NKPGVYTKVC NYVNWIQQTI AAN
配列番号66:
IVGGYTCAAN SIPYQVSLNS GSHRCGGSLI NSQWVVSAAH CYKSRIQVRL GEHNIDVLEG
NEQFINAAKI ITHPNFNGNT LDNDIMLIKL SSPATLNSRV ATVSLPRSCA AAGTECLISG
WGNTKSSGSS SPSLLQCLKA PVLSDSSCKS SYPGQITGNM ICVGFLEGGK DACQGDSGGP
VVCNGQLQGI VSSGYGCAQK NKPGVYTKVC NYVNWIQQTI AAN
配列番号67:
IVGGYTCAAN SIPYQVSLNS GSHRCGGSLI NSQWVVSAAH CYKSRIQVRL GEHNIDVLEG
NEQFINAAKI ITHPNFNGNT LDNDIMLIKL SSPATLNSRV ATVSLPRSCA AAGTECLISG
WGNTKSSGSS QPSLLQCLKA PVLSDSSCKS SYPGQITGNM ICVGFLEGGK DACQGDSGGP
VVCNGQLQGI VSSGYGCAQK NKPGVYTKVC NYVNWIQQTI AAN
配列番号68:
IVGGYTCAAN SIPYQVSLNS GSHRCGGSLI NSQWVVSAAH CYKSRIQVRL GEHNIDVLEG
NEQFINAAKI ITHPNFNGNT LDNDIMLIKL SSPATLNSRV ATVSLPRSCA AAGTECLISG
WGNTKSSGSS DPSLLQCLKA PVLSDSSCKS SYPGQITGNM ICVGFLEGGK DACQGDSGGP
VVCNGQLQGI VSSGYGCAQK NKPGVYTKVC NYVNWIQQTI AAN
配列番号69:
IVGGYTCAAN SIPYQVSLNS GSHRCGGSLI NSQWVVSAAH CYKSRIQVRL GEHNIDVLEG
NEQFINAAKI ITHPNFNGNT LDNDIMLIKL SSPATLNSRV ATVSLPRSCA AAGTECLISG
WGNTKSSGSS YPSLLQCLKA PVLSDSSCKS SYPGQITGNM ICVGFLEGGK DACQGDSGGP
VVCNGQLQGI VSFGYGCAQK NKPGVYTKVC NYVNWIQQTI AAN
配列番号70:
IVGGYTCAAN SIPYQVSLNS GSHRCGGSLI NSQWVVSAAH CYKSRIQVRL GEHNIDVLEG
NEQFINAAKI ITHPNFNGNT LDNDIMLIKL SSPATLNSRV ATVSLPRSCA AAGTECLISG
WGNTKSSGSS YPSLLQCLKA PVLSDSSCKS SYPGQITGNM ICVGFLEGGK DACQGDSGGP
VVCNGQLQGI VSYGYGCAQK NKPGVYTKVC NYVNWIQQTI AAN
配列番号71:
IVGGYTCAAN SIPYQVSLNS GSHRCGGSLI NSQWVVSAAH CYKSRIQVRL GEHNIDVLEG
NEQFINAAKI ITHPNFNGNT LDNDIMLIKL SSPATLNSRV ATVSLPRSCA AAGTECLISG
WGNTKSSGSS YPSLLQCLKA PVLSDSSCKS SYPGQITGNM ICVGFLEGGK DACQGDSGGP
VVCNGQLQGI VSTGYGCAQK NKPGVYTKVC NYVNWIQQTI AAN
配列番号72:
IVGGYTCAAN SIPYQVSLNS GSHRCGGSLI NSQWVVSAAH CYKSRIQVRL GEHNIDVLEG
NEQFINAAKI ITHPNFNSNT LDNDIMLIKL SSPATLNSRV ATVSLPRSCA AAGTECLISG
WGNTKSSGSS YPSLLQCLKA PVLSDSSCKS SYPGQITGNM ICVGFLEGGK DACQGDSGGP
VVCNGQLQGI VSSGYGCAQK NKPGVYTKVC NYVNWIQQTI AAN
配列番号73:
IVGGYTCAAN SIPYQVSLNS GSHRCGGSLI NSQWVVSAAH CYKSRIQVRL GEHNIDVLEG
NEQFINAAKI ITHPNFNANT LDNDIMLIKL SSPATLNSRV ATVSLPRSCA AAGTECLISG
WGNTKSSGSS YPSLLQCLKA PVLSDSSCKS SYPGQITGNM ICVGFLEGGK DACQGDSGGP
VVCNGQLQGI VSSGYGCAQK NKPGVYTKVC NYVNWIQQTI AAN
配列番号74:
IVGGYTCAAN SIPYQVSLNS GSHRCGGSLI NSQWVVSAAH CYKSRIQVRL GEHNIDVLEG
NEQFINAAKI ITHPNFNPNT LDNDIMLIKL SSPATLNSRV ATVSLPRSCA AAGTECLISG
WGNTKSSGSS YPSLLQCLKA PVLSDSSCKS SYPGQITGNM ICVGFLEGGK DACQGDSGGP
VVCNGQLQGI VSSGYGCAQK NKPGVYTKVC NYVNWIQQTI AAN
配列番号75:
IVGGYTCAAN SIPYQVSLNS GSHRCGGSLI NSQWVVSAAH CYKSRIQVRL GEHNIDVLEG
NEQFINAAKI ITHPNFNYNT LDNDIMLIKL SSPATLNSRV ATVSLPRSCA AAGTECLISG
WGNTKSSGSS YPSLLQCLKA PVLSDSSCKS SYPGQITGNM ICVGFLEGGK DACQGDSGGP
VVCNGQLQGI VSSGYGCAQK NKPGVYTKVC NYVNWIQQTI AAN
配列番号76:
IVGGYTCAAN SIPYQVSLNS GSHRCGGSLI NSQWVVSAAH CYKSRIQVRL GEHNIDVLEG
NEQFINAAKI ITHPNFNENT LDNDIMLIKL SSPATLNSRV ATVSLPRSCA AAGTECLISG
WGNTKSSGSS YPSLLQCLKA PVLSDSSCKS SYPGQITGNM ICVGFLEGGK DACQGDSGGP
VVCNGQLQGI VSSGYGCAQK NKPGVYTKVC NYVNWIQQTI AAN
配列番号77:
IVGGYTCAAN SIPYQVSLNS GSHRCGGSLI NSQWVVSAAH CYKPRIQVRL GEHNIHVLEG
NEQFINAAKI ITHPNFNGNT LDNDIMLIKL SSPATLNSHV ATVSLPTSCA AAGTECLISG
WGNTCSSGSS MPSLLQCLKA PVLSDSSCKS SYPGQITGNM ICVGFLEGGK DACQGDSGGP
VVCNGQLQGI VSSGYGCAQK NKPGVYTKVC NYVNWIQQTI AAN
配列番号78:
IVGGYTCAAN SIPYQVSLNS GSHRCGGSLI NSQWVVSAAH CYKSRIQVRL GEHNIHVLEG
NEQFINAAKI ITHPNFNPNT LDNDIMLIKL SSPATLNSHV ATVSLPTSCA AAGTECLISG
WGNTCSSGSS YPSLLQCLKA PVLSDSSCKS SYPGQITGNM ICVGFLEGGK DACQGDSGGP
VVCNGQLQGI VSSGYGCAQK NKPGVYTKVC NYVNWIQQTI AAN
配列番号79:
IVGGYTCAAN SIPYQVSLNS GSHRCGGSLI NSQWVVSAAH CYKPRIQVRL GEHNIHVLEG
NEQFINAAKI ITHPNFNPNT LDNDIMLIKL SSPATLNSHV ATVSLPRSCA AAGTECLISG
WGNTASSGSS MPSLLQCLKA PVLSDSSCKS SYPGQITGNM ICVGFLEGGK DACQGDSGGP
VVCNGQLQGI VSSGYGCAQK NKPGVYTKVC NYVNWIQQTI AAN
配列番号80:
IVGGYTCAAN SIPYQVSLNS GSHRCGGSLI NSQWVVSAAH CYKSRIQVRL GEHNIHVLEG
NEQFINAAKI ITHPNFNPNT LDNDIMLIKL SSPATLNSHV ATVSLPTSCA AAGTECLISG
WGNTSSSGSS MPSLLQCLKA PVLSDSSCKS SYPGQITGNM ICVGFLEGGK DACQGDSGGP
VVCNGQLQGI VSSGYGCAQK NKPGVYTKVC NYVNWIQQTI AAN
配列番号81:
IVGGYTCAAN SIPYQVSLNS GSHRCGGSLI NSQWVVSAAH CYKSRIQVRL GEHNIHVLEG
NEQFINAAKI ITHPNFNPNT LDNDIMLIKL SSPATLNSHV ATVSLPTSCA AAGTECLISG
WGNTASSGSS MPSLLQCLKA PVLSDSSCKS SYPGQITGNM ICVGFLEGGK DACQGDSGGP
VVCNGQLQGI VSSGYGCAQK NKPGVYTKVC NYVNWIQQTI AAN
配列番号82:
IVGGYTCAAN SIPYQVSLNS GSHRCGGSLI NSQWVVSAAH CYKPRIQVRL GEHNIHVLEG
NEQFINAAKI ITHPNFNPNT LDNDIMLIKL SSPATLNSHV ATVSLPRSCA AAGTECLISG
WGNTCSSGSS MPSLLQCLKA PVLSDSSCKS SYPGQITGNM ICVGFLEGGK DACQGDSGGP
VVCNGQLQGI VSSGYGCAQK NKPGVYTKVC NYVNWIQQTI AAN
配列番号83:
IVGGYTCAAN SIPYQVSLNS GSHRCGGSLI NSQWVVSAAH CYKPRIQVRL GEHNIHVLEG
NEQFINAAKI ITHPNFNPNT LDNDIMLIKL SSPATLNSNV ATVSLPTSCA AAGTECLISG
WGNTSSSGSS MPSLLQCLKA PVLSDSSCKS SYPGQITGNM ICVGFLEGGK DACQGDSGGP
VVCNGQLQGI VSSGYGCAQK NKPGVYTKVC NYVNWIQQTI AAN
配列番号84:
IVGGYTCAAN SIPYQVSLNS GSHRCGGSLI NSQWVVSAAH CYKPRIQVRL GEHNIHVLEG
NEQFINAAKI ITHPNFNPNT LDNDIMLIKL SSPATLNSNV ATVSLPTSCA AAGTECLISG
WGNTSSSGSS MPSLLQCLKA PVLSDSSCKS SYPGQITGNM ICVGFLEGGK DSCQGDSGGP
VVCNGQLQGI VSSGYGCAQK NKPGVYTKVC NYVNWIQQTI AAN
配列番号85:
IVGGYTCAAN SIPYQVSLNS GSHRCGGSLI NSQWVVSAAH CYKPRIQVRL GEHNIHVLEG
NEQFINAAKI ITHPNFNPNT LDNDIMLIKL SSPATLNSHV ATVSLPTSCA AAGTECLISG
WGNTCSSGSS MPSLLQCLKA PVLSDSSCKS SYPGQITGNM ICVGFLEGGK DACQGDSGGP
VVCNGQLQGI VSSGYGCAQK NKPGVYTKVC NYVNWIQQTI AAN
配列番号86:
IVGGYTCAAN SIPYQVSLNS GSHRCGGSLI NSQWVVSAAH CYKPRIQVRL GEHNIDVLEG
NEQFINAAKI ITHPNFNPNT LDNDIMLIKL SSPATLNSAV ATVSLPTSCA AAGTECLISG
WGNTSSSGSS MPSLLQCLKA PVLSDSSCKS SYPGQITGNM ICVGFLEGGK DACQGDSGGP
VVCNGQLQGI VSSGYGCAQK NKPGVYTKVC NYVNWIQQTI AAN
配列番号87:
IVGGYTCAAN SIPYQVSLNS GSHRCGGSLI NSQWVVSAAH CYKPRIQVRL GEHNIHVLEG
NEQFINAAKI ITHPNFNPNT LDNDIMLIKL SSPATLNSHV ATVSLPTSCA AAGTECLISG
WGNTSSSGSS MPSLLQCLKA PVLSDSSCKS SYPGQITGNM ICVGFLEGGK DACQGDSGGP
VVCNGQLQGI VSSGYGCAQK NKPGVYTKVC NYVNWIQQTI AAN
配列番号88:
IVGGYTCAAN SIPYQVSLNS GSHRCGGSLI NSQWVVSAAH CYKPRIQVRL GEHNIHVLEG
NEQFINAAKI ITHPNFNPNT LDNDIMLIKL SSPATLNSHV ATVSLPTSCA AAGTECLISG
WGNTSSSGSS MPSLLQCLKA PVLSDSSCKS SYPGQITGNM ICVGFLEGGK DSCQGDSGGP
VVCNGQLQGI VSSGYGCAQK NKPGVYTKVC NYVNWIQQTI AAN
配列番号89:
IVGGYTCAAN SIPYQVSLNS GSHRCGGSLI NSQWVVSAAH CYKPRIQVRL GEHNIHVLEG
NEQFINAAKI ITHPNFNPNT LDNDIMLIKL SSPATLNSHV ATVSLPTSCA AAGTECLISG
WGNTASSGSS MPSLLQCLKA PVLSDSSCKS SYPGQITGNM ICVGFLEGGK DACQGDSGGP
VVCNGQLQGI VSSGYGCAQK NKPGVYTKVC NYVNWIQQTI AAN
配列番号90:
IVGGYTCAAN SIPYQVSLNS GSHRCGGSLI NSQWVVSAAH CYKPRIQVRL GEHNIHVLEG
NEQFINAAKI ITHPNFNPNT LDNDIMLIKL SSPATLNSHV ATVSLPTSCA AAGTECLISG
WGNTASSGSS MPSLLQCLKA PVLSDSSCKS SYPGQITGNM ICVGFLEGGK DSCQGDSGGP
VVCNGQLQGI VSSGYGCAQK NKPGVYTKVC NYVNWIQQTI AAN
配列番号91:
IVGGYTCAAN SIPYQVSLNS GSHRCGGSLI NSQWVVSAAH CYKPRIQVRL GEHNIHVLEG
NEQFINAAKI ITHPNFNPNT LDNDIMLIKL SSPATLNSAV ATVSLPTSCA AAGTECLISG
WGNTSSSGSS MPSLLQCLKA PVLSDSSCKS SYPGQITGNM ICVGFLEGGK DACQGDSGGP
VVCNGQLQGI VSSGYGCAQK NKPGVYTKVC NYVNWIQQTI AAN
配列番号92:
IVGGYTCAAN SIPYQVSLNS GSHRCGGSLI NSQWVVSAAH CYKPRIQVRL GEHNIHVLEG
NEQFINAAKI ITHPNFNPNT LDNDIMLIKL SSPATLNSAV ATVSLPTSCA AAGTECLISG
WGNTCSSGSS MPSLLQCLKA PVLSDSSCKS SYPGQITGNM ICVGFLEGGK DACQGDSGGP
VVCNGQLQGI VSSGYGCAQK NKPGVYTKVC NYVNWIQQTI AAN
配列番号93:
IVGGYTCAAN SIPYQVSLNS GSHRCGGSLI NSQWVVSAAH CYKSRIQVRL GEHNIDVLEG
NEQFINAAKI ITHPNFNPNT LDNDIMLIKL SSPATLNSNV ATVSLPTSCA AAGTECLISG
WGNTCSSGSS MPSLLQCLKA PVLSDSSCKS SYPGQITGNM ICVGFLEGGA DACQGDSGGP
VVCNGQLQGI VSSGYGCAQK NKPGVYTKVC NYVNWIQQTI AAN
配列番号94:
IVGGYTCAAN SIPYQVSLNS GSHRCGGSLI NSQWVVSAAH CYKPRIQVRL GEHNIHVLEG
NEQFINAAKI ITHPNFNGNT LDNDIMLIKL SSPATLNSNV ATVSLPRSCA AAGTECLISG
WGNTCSSGSS MPSLLQCLKA PVLSDSSCKS SYPGQITGNM ICVGFLEGGA DACQGDSGGP
VVCNGQLQGI VSSGYGCAQK NKPGVYTKVC NYVNWIQQTI AAN
配列番号95:
IVGGYTCAAN SIPYQVSLNS GSHRCGGSLI NSQWVVSAAH CYKPRIQVRL GEHNIHVLEG
NEQFINAAKI ITHPNFNPNT LDNDIMLIKL SSPATLNSHV ATVSLPRSCA AAGTECLISG
WGNTSSSGSS MPSLLQCLKA PVLSDSSCKS SYPGQITGNM ICVGFLEGGA DACQGDSGGP
VVCNGQLQGI VSSGYGCAQK NKPGVYTKVC NYVNWIQQTI AAN
配列番号96:
IVGGYTCAAN SIPYQVSLNS GSHRCGGSLI NSQWVVSAAH CYKPRIQVRL GEHNIDVLEG
NEQFINAAKI ITHPNFNPNT LDNDIMLIKL SSPATLNSHV ATVSLPRSCA AAGTECLISG
WGNTSSSGSS MPSLLQCLKA PVLSDSSCKS SYPGQITGNM ICVGFLEGGA DACQGDSGGP
VVCNGQLQGI VSSGYGCAQK NKPGVYTKVC NYVNWIQQTI AAN
配列番号97:
IVGGYTCAAN SIPYQVSLNS GSHRCGGSLI NSQWVVSAAH CYKPRIQVRL GEHNIHVLEG
NEQFINAAKI ITHPNFNPNT LDNDIMLIKL SSPATLNSAV ATVSLPTSCA AAGTECLISG
WGNTASSGSS MPSLLQCLKA PVLSDSSCKS SYPGQITGNM ICVGFLEGGA DACQGDSGGP
VVCNGQLQGI VSSGYGCAQK NKPGVYTKVC NYVNWIQQTI AAN
配列番号98:
IVGGYTCAAN SIPYQVSLNS GSHRCGGSLI NSQWVVSAAH CYKPRIQVRL GEHNIHVLEG
NEQFINAAKI ITHPNFNPNT LDNDIMLIKL SSPATLNSAV ATVSLPTSCA AAGTECLISG
WGNTASSGSS MPSLLQCLKA PVLSDSSCKS SYPGQITGNM ICVGFLEGGA DSCQGDSGGP
VVCNGQLQGI VSSGYGCAQK NKPGVYTKVC NYVNWIQQTI AAN
配列番号99:
IVGGYTCAAN SIPYQVSLNS GSHRCGGSLI NSQWVVSAAH CYKSRIQVRL GEHNIHVLEG
NEQFINAAKI ITHPNFNPNT LDNDIMLIKL SSPATLNSNV ATVSLPTSCA AAGTECLISG
WGNTSSSGSS YPSLLQCLKA PVLSDSSCKS SYPGQITGNM ICVGFLEGGA DACQGDSGGP
VVCNGQLQGI VSSGYGCAQK NKPGVYTKVC NYVNWIQQTI AAN
配列番号100:
IVGGYTCAAN SIPYQVSLNS GSHRCGGSLI NSQWVVSAAH CYKPRIQVRL GEHNIDVLEG
NEQFINAAKI ITHPNFNPNT LDNDIMLIKL SSPATLNSHV ATVSLPTSCA AAGTECLISG
WGNTCSSGSS MPSLLQCLKA PVLSDSSCKS SYPGQITGNM ICVGFLEGGA DACQGDSGGP
VVCNGQLQGI VSSGYGCAQK NKPGVYTKVC NYVNWIQQTI AAN
配列番号101:
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Claims (16)
- ブタトリプシンの変異体であって、
配列番号1と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含みまたはそれからなり、
該アミノ酸配列は、配列番号1による天然ブタトリプシンのF24、S44、D56、G78、Y131、S172およびW193に対応する1つまたはそれ以上の位置での少なくとも1個またはそれ以上のアミノ酸置換がある点が配列番号1と異なり;但し、
該アミノ酸配列は、配列番号1による天然ブタトリプシンではないことを条件とし;かつ、
該アミノ酸配列は、配列番号2によるブタ変異体トリプシンS172Aではないことを条件とする、
前記ブタトリプシンの変異体。 - F24に対応する位置のアミノ酸は、Ala、Asn、Arg、Gln、Ile、Leu、Lys、Met、Ser、Thr、およびValからなる群から選択されるアミノ酸で置換されている;
S44に対応する位置のアミノ酸は、LeuおよびProからなる群から選択されるアミノ酸で置換されている;
D56に対応する位置のアミノ酸は、Ala、Asn、His、およびTrpからなる群から選択されるアミノ酸で置換されている;
G78に対応する位置のアミノ酸は、Ala、Glu、Pro、Ser、およびTyrからなる群から選択されるアミノ酸で置換されている;
Y131に対応する位置のアミノ酸は、Ala、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Met、Ser、Thr、Trp、Valからなる群から選択されるアミノ酸で置換されている;
S172に対応する位置のアミノ酸は、Ala、Cys、およびThrからなる群から選択されるアミノ酸で置換されている;ならびに/または
W193に対応する位置のアミノ酸は、Phe、Ser、Thr、およびTyrからなる群から選択されるアミノ酸で置換されている、
請求項1に記載のブタトリプシンの変異体。 - 前記アミノ酸配列は、配列番号1による天然ブタトリプシンのR99、R107、K125、およびK170に対応する1つまたはそれ以上の位置での少なくとも1個またはそれ以上のアミノ酸置換がある点が配列番号1とはさらに異なる、請求項1または2に記載のブタトリプシンの変異体。
- R99に対応する位置のアミノ酸は、Ala、Asn、Asp、Glu、Gly、His、Leu、Phe、Thr、Trp、およびTyrからなる群から選択されるアミノ酸で置換されている;
R107に対応する位置のアミノ酸は、Asp、Gly、Pro、Ser、およびThrからなる群から選択されるアミノ酸で置換されている;
K125に対応する位置のアミノ酸は、Ala、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Leu、Ser、およびTyrからなる群から選択されるアミノ酸で置換されている;ならびに/または
K170に対応する位置のアミノ酸は、Ala、Asn、GlyおよびTyrからなる群から選択されるアミノ酸で置換されている、
請求項3に記載のブタトリプシンの変異体。 - 前記アミノ酸配列は配列番号3であり、ここで、
− Xaa24は、Ala、Asn、Arg、Gln、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Ser、Thr、およびValからなる群から選択されるアミノ酸であり;
− Xaa44は、Leu、Pro、およびSerからなる群から選択されるアミノ酸であり;
− Xaa56は、Ala、Asn、Asp、His、およびTrpからなる群から選択されるアミノ酸であり;
− Xaa78は、Ala、Glu、Gly、Pro、Ser、およびTyrからなる群から選択されるアミノ酸であり;
− Xaa99は、Ala、Arg、Asn、Asp、Glu、Gly、His、Leu、Phe、Thr、Trp、およびTyrからなる群から選択されるアミノ酸であり;
− Xaa107は、Arg、Asp、Gly、Pro、Ser、およびThrからなる群から選択されるアミノ酸であり;
− Xaa125は、Ala、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Leu、Lys、Ser、およびTyrからなる群から選択されるアミノ酸であり;
− Xaa131は、Ala、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Met、Ser、Thr、Trp、Tyr、およびValからなる群から選択されるアミノ酸であり;
− Xaa170は、Ala、Asn、Gly、Lys、およびTyrからなる群から選択されるアミノ酸であり;
− Xaa172は、Ala、Cys、Ser、およびThrからなる群から選択されるアミノ酸であり;ならびに/または
− Xaa193は、Phe、Ser、Thr、Trp、およびTyrからなる群から選択されるアミノ酸であり;但し、
配列番号3は、配列番号1によるブタ野生型トリプシンではないことを条件とし;かつ
配列番号3は、配列番号2によるブタ変異体トリプシンS172Aではないことを条件とする、
請求項1〜4のいずれか1項に記載のブタトリプシンの変異体。 - 前記アミノ酸配列は、
配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47、配列番号48、配列番号49、配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、配列番号57、配列番号58、配列番号59、配列番号60、配列番号61、配列番号62、配列番号63、配列番号64、配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68、配列番号69、配列番号70、配列番号71、配列番号72、配列番号73、配列番号74、配列番号75、配列番号76、配列番号77、配列番号78、配列番号79、配列番号80、配列番号81、配列番号82、配列番号83、配列番号84、配列番号85、配列番号86、配列番号87、配列番号88、配列番号89、配列番号90、配列番号91、配列番号92、配列番号93、配列番号94、配列番号95、配列番号96、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号100、配列番号101、配列番号102、配列番号103、配列番号104、配列番号105、配列番号106、配列番号107、配列番号108、配列番号109、配列番号110、配列番号111、配列番号112、配列番号113、配列番号114、配列番号115、配列番号116、配列番号117、配列番号118、および配列番号119
からなる群から選択される、請求項1〜5のいずれか1項に記載のブタトリプシンの変異体。 - (i) 前記変異体は、一般式A−Lys−Thr−Arg−Arg−Bを有するペプチドを切断して、少なくとも80%の収率で、一般式A−Lys−Thr−Arg−Argの切断産物を生じることができ、
Aは1個またはそれ以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり;かつ
Bは1個またはそれ以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列である;かつ/または
(ii) 該変異体は、配列番号2によるブタ変異体トリプシンS172Aと比較して、B32−Arg位のC末端側の位置での、プレプロヒトインスリン、プレプロインスリングラルギン、プレプロインスリンリスプロ、プレプロインスリンアスパルト、またはプレプロインスリングルリジンの切断に対して向上した選択性を呈する、
請求項1〜6のいずれか1項に記載のブタトリプシンの変異体。 - 核酸分子であって、
− 請求項1〜7のいずれか1項に記載のブタトリプシンの変異体、または
− 請求項1〜7のいずれか1項に記載のブタトリプシンの変異体のトリプシノーゲン前駆体分子
をコードし、
ベクターに場合により含有されるか、またはゲノムに場合により組み込まれている前記核酸分子。 - 宿主細胞であって、請求項8に記載の核酸分子を含有する宿主細胞。
- 請求項1〜7のいずれか1項に記載のブタトリプシンの変異体を産生する方法であって:
請求項9に記載の宿主細胞を培養する工程;および
培養培地からまたは該宿主細胞からブタトリプシンの該変異体のトリプシノーゲン前駆体分子を単離する工程、ならびに
場合により、該トリプシノーゲン前駆体分子を活性化し、それによりブタトリプシンの該変異体を得る工程
を含む前記方法。 - 食品成分または飼料成分を製造する方法中で使用するための、
請求項1〜7のいずれか1項に記載のブタトリプシンの変異体、または請求項8記載の核酸分子、または請求項9記載の宿主細胞。 - ヒトインスリン、インスリンアナログまたはインスリンの誘導体の産生のための方法における、請求項1〜7のいずれか1項に記載のブタトリプシンの変異体の使用。
- インスリンアナログは、インスリンアスパルト、インスリンリスプロ、インスリングルリジン、およびインスリングラルギンからなる群から選択される、請求項12に記載の使用。
- 一般式A−Lys−Thr−Arg−Arg−Bを有するタンパク質またはペプチドを切断するための、請求項1〜7のいずれか1項に記載のブタトリプシンの変異体の使用であって、
Aは1個またはそれ以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり;かつ
Bは1個またはそれ以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列である、前記使用。 - 切断により、切断産物A−Lys−Thr−Arg−Argを生じる、請求項14に記載の使用。
- 切断により、少なくとも80%の収率で、切断産物A−Lys−Thr−Arg−Argを生じる、請求項15に記載の使用。
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