CN113166222A - 长效胰岛素类似物及其复合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种长效胰岛素类似物以及一种长效胰岛素类似物复合物，所述长效胰岛素类似物通过将天然胰岛素的B链的第22个氨基酸替代并将所述天然胰岛素的A链或B链的一部分氨基酸另外替代而在体内具有增加的半衰期，所述长效胰岛素类似物复合物在体内具有进一步增加的半衰期，因为白蛋白结合结构域另外与所述长效胰岛素类似物结合。根据本发明的胰岛素类似物或胰岛素类似物复合物在体内具有明显增加的半衰期，并且因此可以为直接施用胰岛素作为注射剂的糖尿病患者提供便利。
Description
技术领域
本发明涉及长效胰岛素类似物及其衍生物，并且更特别地涉及具有增加的体内半衰期的长效胰岛素类似物，其中天然胰岛素的B链位置22处的氨基酸被取代并且天然胰岛素的A链或B链的一个或多个氨基酸被另外取代，以及更特别地涉及具有进一步增加的体内半衰期的长效胰岛素类似物衍生物，其中白蛋白结合结构域另外与所述长效胰岛素类似物融合。
背景技术
糖尿病是一种以高血糖水平为特征的代谢性疾病，并且由遗传和环境因素共同作用发展而来。糖尿病包括1型糖尿病、2型糖尿病、妊娠糖尿病以及其他引起高血糖的状态。糖尿病意指一种代谢障碍，其中胰腺产生的胰岛素量不足，或者其中人体细胞未能对胰岛素作出适当的反应，并且因此其吸收葡萄糖的能力受损。结果是，葡萄糖在血液中积聚。
1型糖尿病，也称为胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)和青少年发病型糖尿病，是由β细胞破坏引起的，从而导致绝对胰岛素缺乏。另一方面，被称为非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM)和成人发病型糖尿病的2型糖尿病与主要的胰岛素抵抗相关，并且因此与相对胰岛素缺乏和/或主要胰岛素分泌缺陷伴胰岛素抵抗相关。
特别地，糖尿病与各种并发症如心血管疾病和视网膜病变相关，并且因此是一种如果不进行适当的管理(如血糖控制)就会变得非常麻烦的疾病。预计糖尿病药物的世界市场将从2015年的417亿美元扩大到2022年的661亿美元，并有望成为仅次于抗癌药市场的第二大市场。在全球范围内，2014年有4.22亿成年人患有糖尿病，占成年总人口的8.5％，比1980年的4.5％增加了近一倍(WHO，2016年)。此外，估计全球因糖尿病造成的卫生支出总额为6730亿美元，并且预期20-79岁糖尿病患者的数量到2040年将增至约6.2亿。
用于治疗糖尿病的最具代表性的治疗方法包括一种施用胰岛素以将患者的血糖水平控制在正常水平的方法。胰岛素是一种由人体胰腺分泌的调节血糖的激素。它的功能是将血液中多余的葡萄糖转移到细胞，以为细胞提供能量，并将血糖水平维持在正常水平。
随着重组蛋白制造技术的发展，多种胰岛素产品已被投放市场。胰岛素产品根据其作用可以大致分为五种类型。其中，展现出最快作用的速效胰岛素的特征在于其显示出快速功效，在1分钟与20分钟之间开始起作用，并在约1小时后显示出最高功效，并且其功效持续3至5小时。代表性的速效产品包括门冬胰岛素
、赖脯胰岛素
和谷赖胰岛素
显示出第二最快作用的胰岛素是普通胰岛素。所述普通胰岛素在施用后30分钟开始降低血糖水平，并在2至4小时之间显示出最高功效，并且其功效持续6至8小时。代表性的普通胰岛素产品包括
R、Hypurin Neutral等。中效胰岛素是通过添加鱼精蛋白或锌来延缓其作用而获得的物质。这种胰岛素从注射后约1小时30分钟开始起作用，并且其功效在4小时与12小时之间达到最高水平，并持续16小时至24小时。代表性的中效产品包括
NPH和Hypurin 
。预混胰岛素是通过将速效胰岛素或普通胰岛素与中效胰岛素预混而获得的，使得这两种胰岛素可以通过单次注射容易地施用。可商购的预混胰岛素产品包括
(30％门冬胰岛素和70％鱼精蛋白结晶门冬胰岛素)、
(25％赖脯胰岛素和75％赖脯胰岛素鱼精蛋白混悬液)、和
(50％赖脯胰岛素和50％赖脯胰岛素鱼精蛋白混悬液)。最后，每天注射一次或两次长效胰岛素，并且其功效持续长达24小时。其通常用作基础胰岛素，并且可商购的长效胰岛素产品包括
(甘精胰岛素，EP 0368187)、
(地特胰岛素，US 5,750,497)和
(德谷胰岛素，US 7,615,532)。
胰岛素根据其作用被用于不同的应用。对于1型糖尿病，除了普通或速效胰岛素之外还需要施用长效胰岛素，并且对于需要胰岛素疗法的2型糖尿病，普通或速效胰岛素可以与长效胰岛素一起施用，或者也可以仅施用长效胰岛素。
如上所述，胰岛素施用是治疗糖尿病的最具代表性的治疗方法。然而，长效胰岛素是不便利的，因为它们需要每天施用一次或两次，因为其半衰期还不够长。这对通过注射自我施用胰岛素的糖尿病患者带来不适。
目前商业上的基础胰岛素产品大多是日配制品，并且没有产品与这些产品相比具有改善的施用便利性。Novo Nordisk开发了一种胰岛素类似物(US No.2011/0092419A1)，其通过在胰岛素序列中引入突变以在体内具有对蛋白酶的抗性而具有增加的体内半衰期，并且还开发了一种通过胰岛素类似物的酰化而具有另外增加的半衰期的胰岛素(WO 2009/115469、WO 2011/161125)，但这种胰岛素可以用作日配制品。Hanmi Pharmaceuticals通过将Fc区与胰岛素类似物缀合开发出具有增加的半衰期的胰岛素(KR 10-2015-0087130)。然而，一种由Hanmi Pharmaceuticals开发的产生胰岛素的方法比较复杂，因为胰岛素和Fc是分开产生的并且进行了聚乙二醇化。
因此，本发明旨在克服上述问题，以便最小化在常规基础胰岛素的使用中当注射次数多时发生的不便，开发作用时间延长的胰岛素，并且还改进其产生方法。
白蛋白是血液中含量最丰富的蛋白质，并对许多药物的体内药代动力学都具有影响，并且因此在新药开发中为了控制药物对白蛋白的结合亲和力进行了许多研究。例如，针对长效胰岛素的开发，Novo Nordisk开发了一种产品(地特胰岛素、德谷胰岛素)，其可以通过胰岛素与一种对白蛋白具有结合亲和力的脂肪酸的酰化作用，以降低的速率从皮下组织(施用部位)吸收到血液中。脂肪酸对白蛋白的结合亲和力与胰岛素的吸收速率显示出高度相关性。当对白蛋白具有高结合亲和力的脂肪酸被酰化到胰岛素上时，胰岛素的半衰期增加。例如，地特胰岛素与血液中的白蛋白结合，从而增加其半衰期。当静脉施用人胰岛素时，其半衰期为2.4分钟，而地特胰岛素的半衰期为18至25分钟，延长至至少10倍。与地特胰岛素相比，德谷胰岛素对白蛋白的结合亲和力增加了2.4倍，并且因此具有增加的半衰期。
然而，酰化胰岛素对白蛋白的结合亲和力(Kd)为几mM(Biochem.J.312,725-731(1995))，并且因此与日配制品相比，药代动力学特征没有改善。因此，本发明旨在通过使用对白蛋白的结合亲和力达到pM水平的白蛋白结合结构域(ABD)，使白蛋白的半衰期延长效果最大化。
因此，诸位发明人进行了广泛的努力，以开发具有改善的持续时间的长效胰岛素，其克服了对糖尿病患者频繁施用胰岛素的不便，并且结果是，已经发现通过取代天然胰岛素的A链和B链的一个或多个氨基酸并且另外地融合白蛋白结合结构域获得的胰岛素类似物衍生物具有显著增加的体内半衰期，从而完成了本发明。
发明内容
技术问题
本发明的一个目的是提供一种新型胰岛素类似物、编码所述类似物的核苷酸、包含所述核苷酸的载体以及其中引入了所述载体的重组微生物，所述胰岛素类似物显示出对由酶梭菌蛋白酶切割的抗性以及增加的体内半衰期。
本发明的另一个目的是提供一种新型胰岛素类似物衍生物、编码所述类似物衍生物的核苷酸、包含所述核苷酸的载体以及其中引入了所述载体的重组微生物，所述胰岛素类似物衍生物显示出对由酶梭菌蛋白酶切割的抗性以及增加的体内半衰期。
本发明的再另一个目的是提供一种用于产生具有增加的体内半衰期的长效胰岛素类似物衍生物的活性形式的方法。
技术方案
为了实现上述目的，本发明提供了一种胰岛素类似物，所述胰岛素类似物包含由SEQ ID NO:2的氨基酸序列表示的胰岛素B链变体，胰岛素B链的氨基酸位置22处的精氨酸(Arg)被天然胰岛素中的赖氨酸(Lys)取代。
本发明还提供了一种编码所述胰岛素类似物的多核苷酸。
本发明还提供了一种包含所述多核苷酸的重组载体。
本发明还提供了一种其中引入了所述重组载体的重组微生物。
本发明还提供了一种长效胰岛素类似物衍生物，其中白蛋白结合结构域与所述胰岛素类似物融合。
本发明还提供了一种编码所述胰岛素类似物衍生物的多核苷酸。
本发明还提供了一种重组载体，所述重组载体包含编码所述胰岛素类似物的多核苷酸和编码白蛋白结合结构域的多核苷酸，所述白蛋白结合结构域包含由以下氨基酸序列表示的白蛋白结合基序：
GVSDFYKKLIXaKAKTVEGVEALKXbXcI
其中
Xa独立地选自D和E，
Xb独立地选自D和E，并且
Xc独立地选自A和E。
本发明还提供了一种其中引入了所述重组载体的重组微生物。
本发明还提供了一种用于产生具有增加的体内半衰期的长效胰岛素类似物衍生物的活性形式的方法，所述方法包括以下步骤：(a)培养所述重组微生物；(b)裂解所培养的重组微生物，从而获得长效胰岛素类似物衍生物；(c)诱导所获得的长效胰岛素类似物衍生物的重折叠，从而获得胰岛素类似物衍生物的前-原形式；(d)通过用梭菌蛋白酶和CpB处理将所述胰岛素类似物衍生物的前-原形式转化为活性形式；并且(e)纯化所述长效胰岛素类似物衍生物的活性形式。
附图说明
图1示出了分析融合ABD的胰岛素类似物的稳定性的结果，所述融合ABD的胰岛素类似物是通过用梭菌蛋白酶处理、用赖氨酸(Lys)取代胰岛素B链位置22处的精氨酸(Arg)而构建的。质谱分析表明，当胰岛素B链在位置22处含有精氨酸(Arg)时，其切割发生，但当精氨酸(Arg)被赖氨酸(Lys)取代时，B链的切割不发生。
图2示出了通过SDS-PAGE分析融合ABD的胰岛素类似物衍生物1至10在重组大肠杆菌(E.coli)中的表达的结果。即使在胰岛素序列中引入一个或多个突变，大肠杆菌中的蛋白表达仍得以保留。
图3示出了通过RP-HPLC监测融合ABD的胰岛素类似物4的增溶和重折叠的结果。当通过增溶使蛋白质结构展开，并且随后诱导重折叠时，由于形成三维结构，因此在RP-HPLC中观察到保留时间发生了偏移。
图4示出了通过根据本发明实施例进行酶促反应并确认提高转化为胰岛素活性形式的效率和减少杂质(主要杂质的分子量：10296Da；胰岛素活性形式的分子量：11238Da)的效果而获得的结果。
图5示出了在用梭菌蛋白酶和CpB消化所述胰岛素并将其纯化后，通过SDS-PAGE分析融合ABD的胰岛素类似物4的结果。
图6示出了尺寸排阻色谱分析的结果，进行了所述尺寸排阻色谱分析以检查当根据本发明实施例将锌和苯酚添加到融合ABD的胰岛素类似物中时是否将形成六聚体。
图7示出了根据本发明实施例评价融合ABD的胰岛素类似物的降血糖能力的结果。
具体实施方式
除非另外定义，否则本文中使用的所有技术术语和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的那些相同的含义。通常，本文使用的命名法和下文将描述的实验方法是本领域熟知且常用的那些。
在本发明中，已经发现其中天然胰岛素的B链位置22处的氨基酸精氨酸(Arg)从精氨酸(Arg)被取代为赖氨酸(Lys)并且天然胰岛素的A链或B链的一个或多个氨基酸被另外取代的胰岛素类似物具有增加的体内半衰期，并且同时可以使用微生物容易地产生。此外，已经发现当白蛋白结合结构域另外地与所述胰岛素类似物融合时，所述胰岛素类似物的体内半衰期可以进一步增加。
本发明包括一种具有显著增加的半衰期的胰岛素-ABD融合蛋白，其中对白蛋白具有高结合亲和力的白蛋白结合结构域(ABD)与天然胰岛素融合，使得可以降低胰岛素在血液中的吸收速率，并且使得可以增加胰岛素在血液中的稳定性。此外，本发明包括一种胰岛素类似物，其中天然胰岛素的B链位置22处的氨基酸精氨酸(Arg)从精氨酸(Arg)被取代为赖氨酸(Lys)，并且/或者天然胰岛素的A链或B链的一个或多个氨基酸被取代，从而使蛋白酶切割或胰岛素受体介导的去除最小化。另外，本发明包括胰岛素类似物-ABD融合蛋白，其中所述各种胰岛素类似物与白蛋白结合结构域(ABD)融合。这种融合蛋白保留了胰岛素形成六聚体的固有特性，并因此可以用于配制品开发，并且使得能够提高吸收速率。
因此，在一个方面，本发明涉及一种胰岛素类似物，所述胰岛素类似物包含由SEQID NO:2的氨基酸序列表示的胰岛素B链变体，胰岛素B链的氨基酸位置22处的精氨酸(Arg)被天然胰岛素中的赖氨酸(Lys)取代。根据本发明，当胰岛素B链位置22处的氨基酸从精氨酸(Arg)被取代为赖氨酸(Lys)时，所述胰岛素类似物可以显示出对由酶梭菌蛋白酶切割的抗性，使得在除人体之外的微生物或细胞中产生胰岛素类似物的过程中，能够通过除胰蛋白酶之外的酶梭菌蛋白酶将胰岛素转化为活性形式。
在本发明中，“包含由SEQ ID NO:2的氨基酸序列表示的胰岛素B链变体且胰岛素B链的氨基酸位置22处的精氨酸(Arg)被天然胰岛素中的赖氨酸(Lys)取代的胰岛素类似物”意指除了天然胰岛素B链的氨基酸位置22处的精氨酸(Arg)至赖氨酸(Lys)取代之外，所述胰岛素类似物还可以包含胰岛素A链或胰岛素B链中的其他氨基酸变体。
在本发明中，所述胰岛素类似物还可以包含一个或多个选自以下的氨基酸取代：(i)由SEQ ID NO:4的氨基酸序列表示的胰岛素A链的氨基酸位置3处的缬氨酸(Val)至亮氨酸(Leu)取代；(ii)由SEQ ID NO:4的氨基酸序列表示的胰岛素A链的氨基酸位置8处的苏氨酸(Thr)至天冬氨酸(Asp)取代；(iii)由SEQ ID NO:4的氨基酸序列表示的胰岛素A链的氨基酸位置10处的异亮氨酸(Ile)至赖氨酸(Lys)取代；(iv)由SEQ ID NO:4的氨基酸序列表示的胰岛素A链的氨基酸位置14处的酪氨酸(Tyr)至谷氨酸(Glu)取代；(v)由SEQ ID NO:4的氨基酸序列表示的胰岛素A链的氨基酸位置19处的酪氨酸(Tyr)至苯丙氨酸(Phe)取代；(vi)由SEQ ID NO:2的氨基酸序列表示的胰岛素B链变体的氨基酸位置5处的组氨酸(His)至苏氨酸(Thr)取代；(vii)由SEQ ID NO:2的氨基酸序列表示的胰岛素B链变体的氨基酸位置9处的丝氨酸(Ser)至天冬氨酸(Asp)取代；(viii)由SEQ ID NO:2的氨基酸序列表示的胰岛素B链变体的氨基酸位置13处的谷氨酸(Glu)至丙氨酸(Ala)取代；(ix)由SEQ ID NO:2的氨基酸序列表示的胰岛素B链变体的氨基酸位置17处的亮氨酸(Leu)至谷氨酰胺(Gln)取代；以及(x)由SEQ ID NO:2的氨基酸序列表示的胰岛素B链变体的氨基酸位置24处的苯丙氨酸(Phe)至丝氨酸(Ser)取代，但不限于此。
在本发明中，与天然胰岛素相比，所述胰岛素类似物可以具有增加的体内半衰期。所述体内半衰期可以持续优选至少48小时，更优选至少72小时。
在另一个方面，本发明涉及一种编码所述胰岛素类似物的多核苷酸。在再另一个方面，本发明涉及一种包含所述多核苷酸的重组载体。在又另一个方面，本发明涉及一种其中引入了所述重组载体的重组微生物。
同时，本发明涉及一种长效胰岛素类似物衍生物，其中白蛋白结合结构域与所述胰岛素类似物融合。与白蛋白结合结构域融合的长效胰岛素类似物衍生物对白蛋白具有相对高的亲和力。
在本发明的例子中，白蛋白结合结构域可以包含由以下氨基酸序列表示的白蛋白结合基序：
GVSDFYKKLIXaKAKTVEGVEALKXbXcI
其中
Xa独立地选自D和E，
Xb独立地选自D和E，并且
Xc独立地选自A和E。
在本发明的例子中，Xa是D，Xb是D，并且Xc是A。
在本发明的实施方案中，白蛋白结合结构域可以包含以下氨基酸序列：
LAX3AKX6X7ANX10ELDX14Y-[BM]-LX43X44LP
其中
[BM]是如前面段落中定义的白蛋白结合基序，
X3独立地选自C、E、Q和S；
X6独立地选自C、E和S；
X7独立地选自A和S；
X10独立地选自A、R和S；
X14独立地选自A、C、K和S；
X43独立地选自A和K；并且
X44独立地选自A、E和S。
所述白蛋白结合结构域可以由选自SEQ ID NO:6至13的氨基酸序列表示，不限于此。所述白蛋白结合结构域可以优选地由SEQ ID NO:6的氨基酸序列表示。
在本发明中，在所产生的胰岛素衍生物或胰岛素类似物衍生物的蛋白质重折叠效率、酶反应效率和活性方面，优选的是白蛋白结合结构域与胰岛素或具有B链-C链-A链的胰岛素类似物中的A链的C末端融合。在这种情况下，可以在胰岛素(或胰岛素类似物)与白蛋白结合结构域之间引入接头。
根据本发明的长效胰岛素类似物衍生物的功能根据所述衍生物的三维结构而改变。因此，可以在不影响所述衍生物功能的情况下对根据本发明的长效胰岛素类似物衍生物的氨基酸序列进行小的改变。因此，本发明包括白蛋白结合结构域或长效胰岛素类似物衍生物的变体，其保留白蛋白结合特性或对酶切割的高抗性。例如，属于氨基酸残基的特定官能团(例如，疏水性、亲水性、极性等)的氨基酸残基可以被属于相同官能团的其他氨基酸残基替代。
如本文所用，术语“白蛋白结合”和“对白蛋白的结合亲和力”是指多肽或蛋白质的特性，所述特性可以通过使用表面等离子体共振技术(如Biacore仪器)来测试。例如，可以在实验中测试白蛋白结合亲和力，其中将白蛋白或其片段固定在所述仪器的传感器芯片上，并且使含有待测试多肽或蛋白质的样品通过芯片。
可替代地，将待测试多肽或蛋白质固定在所述仪器的传感器芯片上，并使含有白蛋白或其片段的样品通过芯片。就此而言，所述白蛋白可以是哺乳动物来源的血清白蛋白，如人血清白蛋白。本领域技术人员可以解释通过此类实验获得的结果，以建立多肽或蛋白质对白蛋白的结合亲和力的定量测量。如果需要定量测量，例如以确定相互作用的KD值，还可以使用表面等离子体共振方法。可以例如在Biacore 2000仪器(Biacore AB)中定义结合值。将白蛋白适当地固定在测量传感器芯片上，并通过连续稀释制备待测定亲和力的多肽或蛋白质样品，并按随机顺序注射。然后可以使用例如由仪器制造商提供的BIAevaluation4.1软件的1:1朗缪尔(Langmuir)结合模型从所述结果计算KD值。
在本发明的一个实施方案中，长效胰岛素类似物衍生物结合的白蛋白可以选自人血清白蛋白、大鼠血清白蛋白、食蟹猴血清白蛋白和小鼠血清白蛋白，但不限于此。
在一个具体实施方案中，长效胰岛素类似物衍生物结合的白蛋白是人血清白蛋白。
所述胰岛素类似物和白蛋白结合结构域彼此通过以下项连接：肽键；多肽接头；或选自聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇-丙二醇共聚物、聚氧乙烯化多元醇、聚乙烯醇、多糖、葡聚糖(dextran)、聚乙烯基乙醚、生物可降解聚合物、脂肪酸、核苷酸、脂质聚合物、几丁质、透明质酸及其组合的非肽基接头，但不限于此。
在本发明中，可以在胰岛素类似物与白蛋白结合结构域之间插入由(GGGGS)n(其中n是范围为1至6的整数)序列的重复组成的接头。这是基于实验结果的，所述结果表明当未引入接头时，重折叠率较低，但当引入(GGGGS)序列的两个或更多个重复时，重折叠率没有显著差异。同时，随着所述序列的重复数(n)的增加，通过梭菌蛋白酶转化为胰岛素活性形式的速率增加，但所述胰岛素类似物的体内药代动力学未受到显著影响。综合上述结果，所述接头优选地由GGGGS序列的2至4个重复组成。
因此，在本发明中，所述胰岛素类似物和所述白蛋白结合结构域可以通过多肽接头彼此连接，并且所述多肽接头可以包括(GGGGS)n(其中n是范围从1至6的整数)，但不限于此。优选地，所述肽接头可以由SEQ ID NO:5的氨基酸序列表示。
在再另一个方面，本发明涉及一种重组载体，所述重组载体包含：编码所述胰岛素类似物的多核苷酸和编码白蛋白结合结构域的多核苷酸，所述白蛋白结合结构域包含由以下氨基酸序列表示的白蛋白结合基序：
GVSDFYKKLIXaKAKTVEGVEALKXbXcI
其中
Xa独立地选自D和E，
Xb独立地选自D和E，并且
Xc独立地选自A和E。
在本发明的实施方案中，白蛋白结合结构域可以包含以下氨基酸序列：
LAX3AKX6X7ANX10ELDX14Y-[BM]-LX43X44LP
其中
[BM]是如前面段落中定义的白蛋白结合基序，
X3独立地选自C、E、Q和S；
X6独立地选自C、E和S；
X7独立地选自A和S；
X10独立地选自A、R和S；
X14独立地选自A、C、K和S；
X43独立地选自A和K；并且
X44独立地选自A、E和S。
所述白蛋白结合结构域可以由选自SEQ ID NO:6至13的氨基酸序列表示，但不限于此。所述白蛋白结合结构域可以优选地由SEQ ID NO:6的氨基酸序列表示。
在本发明中，可以将编码胰岛素类似物的多核苷酸和编码白蛋白结合结构域的核苷酸引入重组载体，使得胰岛素类似物和白蛋白结合结构域可以作为融合蛋白表达。
引入重组载体中的白蛋白结合结构域的其他描述与长效胰岛素类似物衍生物的白蛋白结合结构域的描述重叠，并且因此被省略。此外，编码多肽接头的多核苷酸可以被包含在编码胰岛素类似物的多核苷酸与编码白蛋白结合结构域的多核苷酸之间。多肽接头的描述也与长效胰岛素类似物衍生物的多肽接头的描述重叠，并且因此将省略其详细描述以避免冗余。
同时，白蛋白结合基序和白蛋白结合结构域(或白蛋白结合多肽)的描述被解释为包括与WO 2014048977相对应的韩国专利公开号10-2015-0058454中披露的内容。
根据本发明的重组载体可以构建为用于常规克隆或表达的载体，并且可以构建为使用原核或真核细胞作为宿主细胞的载体。
如本文所用，术语“载体”是指能够在适当宿主细胞中表达靶蛋白的重组载体，它是包含可操作地连接的必需调节因子(以使得能够表达核酸插入物)的基因构建体。本发明可以制备一种包含编码胰岛素类似物和/或其类似物衍生物的核酸的重组载体。本发明的胰岛素类似物和/或其类似物衍生物可以在通过转化或转染将重组载体引入其中的重组微生物中通过裂解并纯化所培养的重组微生物而产生。
在本发明中，编码胰岛素类似物及其类似物衍生物的核酸可操作地连接到核酸表达控制序列。如本文所用，术语“可操作地连接”是指核酸表达控制序列(例如，启动子、信号序列、核糖体结合位点、转录终止序列等)与另一个核苷酸序列之间的功能性连接，并且因此所述控制序列可以控制所述核苷酸序列的转录和/或翻译。
如本文所用，术语“启动子”是指位于编码区上游的非翻译的核酸序列，其包括聚合酶结合位点并具有启动位于启动子下游的基因转录成mRNA的活性，即聚合酶结合并启动基因转录的DNA位点，并且它位于mRNA转录起始区的5'区。
例如，当本发明的载体是重组载体并使用原核细胞作为宿主细胞时，通常包括能够促进转录的强启动子(如tac启动子、lac启动子、lacUV5启动子、lpp启动子、pLλ启动子、pRλ启动子、rac5启动子、amp启动子、recA启动子、SP6启动子、trp启动子、trc启动子、phoA启动子、araBAD启动子、T5启动子和T7启动子)、用于启动翻译的核糖体结合位点和转录/翻译终止序列。
另外，可以通过操纵本领域中常用的质粒(例如，pSC101、pGV1106、pACYC177、ColE1、pKT230、pME290、pBR322、pUC8/9、pUC6、pBD9、pHC79、pIJ61、pLAFR1、pHV14、pGEX系列、pET系列、pPICZα系列、pUC19等)、噬菌体(例如，λgt4λB、λ-Charon、λΔz1、M13等)、或病毒(例如，SV40等)来制备可以在本发明中使用的载体，但不限于此。
同时，当本发明的载体是重组载体并使用真核细胞作为宿主细胞时，可以使用衍生自哺乳动物细胞基因组的启动子(例如，金属硫蛋白启动子)、衍生自哺乳动物病毒的启动子(例如，腺病毒晚期启动子、痘苗病毒的7.5K启动子、SV40启动子、巨细胞病毒启动子和HSV的tk启动子，并且通常，所述载体包括聚腺苷酸化序列(例如，牛生长激素终止子和衍生自SV40的聚腺苷酸化序列)作为转录终止序列。
此外，本发明的重组载体包括本领域中常用的抗生素抗性基因作为选择标记，并且可包括例如对于氨苄青霉素、庆大霉素、羧苄青霉素、氯霉素、链霉素、卡那霉素、遗传霉素、新霉素或四环素具有抗性的基因。
本发明的重组载体可以另外地包括不同的序列，以使其易于纯化被回收的靶蛋白，即胰岛素类似物和/或胰岛素类似物衍生物。另外包括的序列可以是用于蛋白质纯化的标签序列，例如谷胱甘肽S-转移酶(Pharmacia，美国)、麦芽糖结合蛋白(NEB，美国)、FLAG(IBI，美国)、6-组氨酸等，但是用于纯化靶蛋白所必需的序列种类不限于此。由包含上述标签序列的重组载体表达的融合蛋白可以通过亲和色谱纯化。例如，当融合谷胱甘肽S-转移酶时，可以使用谷胱甘肽(它是所述酶的底物)，并且当使用6-组氨酸标签时，可以通过Ni-NTA柱容易地收集所需的靶蛋白。可以使用包含编码胰岛素类似物和/或胰岛素类似物衍生物的多核苷酸的重组载体构建用所述载体转化的重组微生物。
如本文所用，术语“转化”是指将DNA引入宿主细胞并使DNA在其中可作为染色体因子复制或通过完成染色体整合而使DNA在其中可复制的过程，这是通过向细胞中引入外源DNA人为引起遗传改变的现象。
本发明中使用的转化方法可以是任何转化方法，并且可以根据本领域中使用的常规方法容易地进行。常用的转化方法的例子可以包括CaCl2沉淀法，使用二甲亚砜(DMSO)作为CaCl2沉淀法中的还原剂而改进效率的Hanahan方法，电穿孔，CaPO4沉淀法，原生质体融合法，使用碳化硅纤维的搅拌法，土壤杆菌介导的转化方法，使用PEG的转化方法，硫酸葡聚糖、脂质转染胺和干/抑制介导的转化等。
用于转化包含编码根据本发明的胰岛素类似物和/或胰岛素类似物衍生物的核酸的重组载体的方法可以不限于这些方法，但是可以使用本领域中常用的任何转化或转染方法而没有限制。
可以通过将包含编码胰岛素类似物和/或胰岛素类似物衍生物的核酸的重组载体引入宿主细胞中来获得本发明的重组转化体。
用于本发明的适当宿主可以没有特别限制，只要它可以表达本发明的核酸即可。适当的宿主的例子可包括属于埃希氏杆菌属的细菌(如大肠杆菌(E.coli))、属于芽孢杆菌属的细菌(如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis))、属于假单胞菌属的细菌(如恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida))、酵母菌(如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、和粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe))、昆虫细胞(如草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)(SF9))、以及动物细胞(如CHO、COS和BSC)，但不限于此。
本发明还提供了一种用于治疗糖尿病的组合物，所述组合物包含所述胰岛素类似物或所述胰岛素类似物衍生物。
本发明还提供了一种用于治疗糖尿病的方法，所述方法包括向需要血糖控制的受试者施用所述胰岛素类似物或所述胰岛素类似物衍生物的步骤。
本发明还提供了用于治疗糖尿病的所述胰岛素类似物或所述胰岛素类似物衍生物。
本发明还提供了所述胰岛素类似物或所述胰岛素类似物衍生物用于制造治疗糖尿病的药物的用途。
本发明还提供了一种用于产生具有增加的体内半衰期的长效胰岛素类似物衍生物的活性形式的方法，所述方法包括以下步骤：(a)培养所述重组微生物；(b)裂解所培养的重组微生物，从而获得长效胰岛素类似物衍生物；(c)诱导所获得的长效胰岛素类似物衍生物的重折叠，从而获得胰岛素类似物衍生物的前-原形式；(d)通过用梭菌蛋白酶和CpB处理将所述胰岛素类似物衍生物的前-原形式转化为活性形式；并且(e)纯化所述长效胰岛素类似物衍生物的活性形式。
实施例
在下文中，将参考实施例进一步详细描述本发明。对于本领域普通技术人员显而易见的是，这些实施例仅用于说明目的，而不应解释为限制本发明的范围。
在以下的实施例中，将融合ABD的胰岛素类似物作为与本发明中长效胰岛素类似物衍生物相同的含义使用。
实施例1：融合ABD的胰岛素表达载体和菌株的构建
人胰岛素是作为前胰岛素原的形式合成的，前序列在内质网中被切割开，并且胰岛素原在高尔基体和内质网中被加工，从而形成成熟的胰岛素。基于这一事实，为了通过在大肠杆菌中表达胰岛素原蛋白、并且然后通过胰蛋白酶处理去除C链的方法来产生重组胰岛素，设计了胰岛素原。为了提高胰岛素原在大肠杆菌中的表达效率和纯化效率，将融合标签插入N末端中，并进行密码子优化。
理论上，白蛋白结合结构域(ABD)可以融合到胰岛素位点的数目是四个。然而，A链的N末端是对胰岛素活性而言重要的位置，并且因此被排除在融合位置之外。虽然B链的N末端对胰岛素六聚体的形成很重要，但它被包含在融合位置，因为胰岛素的活性可得以保持。如果ABD在B链与C链之间融合，则可能对蛋白质折叠产生影响。因此，胰岛素构建体被设计成B-C-A顺序或A-C-B顺序作为候选结构。最后，设计了用于表达以下三种形式的融合ABD的胰岛素的基因结构：
NdeI-融合标签-B链-C链-A链-接头-ABD-EcoRI，
NdeI-融合标签-ABD-接头-B链-C链-A链-EcoRI，和
NdeI-融合标签-A链-C链-B链-接头-ABD-EcoRI。
使用pJ401(DNA 2.0)载体作为表达载体。用限制酶NdeI和EcoRI消化所述载体，并且然后在1％琼脂糖凝胶上通过电泳分离DNA片段。使用T4DNA连接酶将用于表达ABD融合蛋白的基因结构和如上所述从表达载体获得的DNA片段彼此连接，从而构建质粒。然后，通过氯化钙法将各质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中。选择对卡那霉素具有抗性的转化菌株，并从中分离DNA。通过基于限制酶消化的分析方法确定DNA是否正确地插入。
当所述基因被设计成具有NdeI-融合标签-ABD-接头-B链-C链-A链-EcoRI结构时，由于蛋白质重折叠率很低，因此被认为是不合适的。此外，当所述基因被设计成具有NdeI-融合标签-A链-C链-B链-接头-ABD-EcoRI结构时，融合ABD的胰岛素具有胰岛素活性，但其显示出低重折叠率和酶处理率，因此被视为不适合作为制备胰岛素活性形式的方法。因此，在三种形式的融合ABD的胰岛素中，选择了NdeI-融合标签-B链-C链-A链-接头-ABD-EcoRI结构并用于后续实验。
在A链与白蛋白结合结构域(ABD)之间，插入一个由(GGGGS)序列的1至6个重复组成的接头。在这种情况下，当未引入接头时，重折叠率很低，但当引入由(GGGGS)序列的两个或更多个重复组成的接头时，重折叠率没有显著差异。同时，随着(GGGGS)n序列中的n的增加，通过梭菌蛋白酶转化为胰岛素活性形式的速率增加，但胰岛素的体内药代动力学未受到显著影响。综合上述结果，将所述接头设计成由GGGGS序列的2至4个重复组成。
在本发明中使用的融合ABD的胰岛素的每个部分的氨基酸序列在下表1中示出。
表1
实施例2：具有经修饰胰岛素氨基酸序列的融合ABD的胰岛素类似物的构建
为了使用重组大肠杆菌产生胰岛素，通过使用胰蛋白酶将胰岛素原转化为活性形式的方法是必要的。然而，胰蛋白酶以高效率切割双碱性氨基酸，并且也切割单一氨基酸(如赖氨酸(Lys)或精氨酸(Arg))，这使得难以产生所需的胰岛素活性形式。此外，所述ABD序列还包括许多赖氨酸(Lys)和精氨酸(Arg)残基，这使得难以进一步通过使用胰蛋白酶产生具有活性的所需的融合ABD的胰岛素。
出于此原因，使用梭菌蛋白酶作为能够替代胰蛋白酶的酶，以便诱导转化为活性形式。在这种情况下，当梭菌蛋白酶与融合ABD的胰岛素反应时，胰岛素B链位置22处的精氨酸(Arg)发生切割。为了解决这一问题，用赖氨酸(Lys)取代B链的位置22处的精氨酸(Arg)。在这种情况下，梭菌蛋白酶对胰岛素B链位置22处的切割显著降低，并且因此可以有效地产生融合ABD的胰岛素的活性形式(图1)。
除了如上所述的突变之外，还将另外的突变引入融合ABD的胰岛素，以便进一步提高融合ABD的胰岛素的稳定性和体内半衰期。A链和B链各有五个氨基酸被取代，并且被取代的位置在下表2中示出。
表2
| 类似物 | 经修饰的序列 |
| 类似物1 | A链位置3处的V→L |
| 类似物2 | A链位置8处的T→D |
| 类似物3 | A链位置10处的I→K |
| 类似物4 | A链位置14处的Y→E |
| 类似物5 | A链位置19处的Y→F |
| 类似物6 | B链位置5处的H→T |
| 类似物7 | B链位置9处的S→D |
| 类似物8 | B链位置13处的E→A |
| 类似物9 | B链位置17处的L→Q |
| 类似物10 | B链位置24处的F→S |
| 类似物11 | A链或B链中没有另外的突变 |
使用GeneArt算法对大肠杆菌中的基因表达进行密码子优化，并合成基因以具有取代的氨基酸。
将如上所述构建的质粒以与实施例1所述相同的方式引入大肠杆菌BL21(DE3)，从而构建大肠杆菌菌株。
实施例3：融合ABD的胰岛素类似物的表达
为了表达融合ABD的胰岛素类似物，将每种重组大肠杆菌菌株接种于100mL LB培养基中，并在37℃下振荡培养16小时，并且将所述培养物用作种子培养物。将2L LB培养基添加到7L发酵罐(New Brunswick BioFlo)中，灭菌，并且然后接种所述种子培养物。在温度为35℃、空气流量为3vvm以及搅拌速度为1,000rpm的条件下进行培养，并用氨水和磷酸将培养过程中的pH维持在6.8。在培养基中碳源耗尽的时间点，开始进料并且同时用IPTG诱导蛋白表达。在诱导表达后再进行10小时的培养，并使用离心机回收重组菌株。
融合ABD的胰岛素类似物在大肠杆菌菌株中作为包涵体表达，并且即使当氨基酸突变被引入胰岛素结构域中时，表达水平在本发明中使用的载体系统中出现(图2)。
实施例4：诱导细胞裂解和增溶/重折叠
将表达融合ABD的胰岛素或融合ABD的胰岛素类似物的各菌株悬浮在裂解缓冲液(20mM Tris、10mM EDTA、10％蔗糖、0.2M NaCl，pH 8.0)中，并使用高压均质器裂解细胞。以7,000rpm在高速离心机中离心裂解的细胞，并除去可溶性蛋白和一些细胞碎片，从而分离出包括包涵体的沉淀。将分离的包涵体用缓冲液(含有1％Triton X-100、0.2M NaCl和1M尿素)洗涤，并且然后以7,000rpm离心。将沉淀的包涵体用蒸馏水另外洗涤两次，并且然后在-80℃下储存直至使用。
将冷冻储存的包涵体溶解在增溶缓冲液(25mM Tris、8M尿素、30mM半胱氨酸-HCl，pH 10.5)中，并且然后在重折叠缓冲液(25mM Tris-HCl，pH 10.5)中稀释，并在4℃下重折叠16小时。通过RP-HPLC分析确定是否发生重折叠。当通过RP-HPLC分析增溶的溶液时，由于高疏水性，在约20分钟时观察到蛋白质峰，但当进行重折叠时，观察到所述峰偏移至16分钟(图3)。这是因为随着重折叠的进行，疏水性与增溶溶液中的疏水性相比有所下降。重折叠继续进行，直至在通过RP-HPLC分析期间不再观察到蛋白质峰偏移。
实施例5：通过使用酶转化为活性形式
为了使用重组大肠杆菌菌株产生胰岛素，需要通过使用胰蛋白酶将胰岛素原转化为活性形式。然而，融合ABD的胰岛素或融合ABD的胰岛素类似物在其序列中具有多个胰蛋白酶切割位点，并且出于此原因，使用梭菌蛋白酶作为能够替代胰蛋白酶的酶，以便诱导转化为活性形式。
当使用梭菌蛋白酶诱导转化为活性形式时，胰岛素B链位置22处发生切割，使得难以产生所需形式的胰岛素。出于此原因，使用通过将B链位置22从精氨酸(Arg)取代为赖氨酸(Lys)而获得的融合ABD的胰岛素类似物来产生胰岛素的活性形式。
梭菌蛋白酶在其活性位点中含有半胱氨酸(Cys)，并且因此需要还原条件才能展现出酶活性。此外，在用还原剂处理重折叠溶液以维持梭菌蛋白酶活性的情况下，胰岛素区域中的二硫键极有可能被破坏。出于此原因，要求推导出在不破坏二硫键的情况下提高酶促反应产率的条件。因此，使用酶促反应溶液中含有的还原剂DTT，进行实验。
由于梭菌蛋白酶作为原形式(pro-form)存在，因此诱导自动切割来激活它。为此，将冷冻干燥的梭菌蛋白酶(沃辛顿，美国)溶解在蒸馏水中，并且然后在添加激活缓冲液(500mM Tris、50mM DTT、25mM CaCl2 pH 7.8)后在4℃下激活30分钟。将激活的梭菌蛋白酶以每mg蛋白质0.1至5个单位的浓度添加到重折叠蛋白质中，并允许在25℃至40℃下反应2至8小时。在梭菌蛋白酶反应后，以每1mg蛋白质0.001至1个单位的浓度添加CpB，并使其反应。通过使用HCl将pH降低至3.5或更低来停止酶促反应。
结果是，如在图4中可以看出，酶促反应显示出提高转化为胰岛素活性形式的效率和减少杂质的效果。
实施例6：融合ABD的胰岛素的纯化
根据制造商的说明，首先使用
EMD COO-(M)(Merck)通过离子交换树脂色谱来纯化用梭菌蛋白酶和CpB酶法处理的样品，并且然后根据制造商的说明，使用
P100 RP-18e(Merck)通过反相色谱进一步纯化。
结果是，如在图5中可以看出，通过这两种纯化方法可以纯化无杂质的融合ABD的胰岛素的活性形式。
实施例7：融合ABD的胰岛素类似物对白蛋白的结合亲和力的测量
为了测量融合ABD的胰岛素类似物蛋白对白蛋白的结合亲和力，使用了表面等离子体共振(SPR，BIACORE 3000，GE healthcare)分析方法。通过胺偶联法将重组人血清白蛋白固定在CM5芯片上，并使得稀释至五种或更多种浓度的ABD或融合ABD的胰岛素类似物与所述重组人血清白蛋白结合，并且测定所述ABD或融合ABD的胰岛素类似物对人血清白蛋白的亲和力。
结果是，如在下表3中可以看出，胰岛素类似物对人血清白蛋白的亲和力维持在pM水平，尽管其低于ABD本身的亲和力。
表3
实施例8：天然胰岛素和融合ABD的胰岛素类似物对胰岛素受体的亲和力比较
为了测量天然胰岛素和融合ABD的胰岛素类似物对胰岛素受体的结合亲和力，使用了表面等离子体共振(SPR，BIACORE 3000，GE healthcare)分析方法。通过胺偶联法将胰岛素受体固定在CM5芯片上，并将稀释至五种或更多种浓度的天然胰岛素和融合ABD的胰岛素类似物中的每一种与所述胰岛素受体结合，并且测定所述天然胰岛素和融合ABD的胰岛素类似物中的每一种对胰岛素受体的亲和力。
结果是，如在下表4中可以看出，与天然胰岛素相比，融合ABD的胰岛素类似物的亲和力降低。特别地，类似物3的亲和力显示出最大的降低，并且相对于天然胰岛素下降至19.4％的水平。
表4
| 类似物 | K<sub>a</sub>(1/Ms) | K<sub>d</sub>(1/s) | K<sub>D</sub>(M) |
| 类似物1 | 8.54×10<sup>4</sup> | - | - |
| 类似物2 | 4.38×10<sup>4</sup> | 3.15×10<sup>-3</sup> | 7.2×10<sup>-8</sup> |
| 类似物3 | 2.52×10<sup>4</sup> | 2.18×10<sup>-3</sup> | 8.65×10<sup>-8</sup> |
| 类似物4 | 2.82×10<sup>4</sup> | 1.31×10<sup>-3</sup> | 4.65×10<sup>-8</sup> |
| 类似物5 | 4.07×10<sup>4</sup> | 2.34×10<sup>-3</sup> | 5.75×10<sup>-8</sup> |
| 类似物6 | 5.23×10<sup>4</sup> | 2.27×10<sup>-3</sup> | 4.33×10<sup>-8</sup> |
| 类似物7 | 5.05×10<sup>4</sup> | - | - |
| 类似物8 | 4.86×10<sup>4</sup> | 1.47×10<sup>-3</sup> | 3.04×10<sup>-8</sup> |
| 类似物9 | 2.13×10<sup>4</sup> | 1.29×10<sup>-3</sup> | 6.06×10<sup>-8</sup> |
| 类似物10 | 3.83×10<sup>4</sup> | - | - |
| 胰岛素 | 1.03×10<sup>5</sup> | 1.72×10<sup>-3</sup> | 1.68×10<sup>-8</sup> |
在通过链脲佐菌素诱导的1型糖尿病模型中，与甘精胰岛素相比，评价了融合ABD的胰岛素类似物的功效。类似物1、3和10被排除在候选物之外，因为与甘精胰岛素相比，它们显示出50％或更低的降血糖能力。
实施例9：六聚体合成
胰岛素在体内与锌结合，从而形成稳定的六聚体结构。胰岛素形成六聚体的特性也用于配制品开发，并且可能在增加胰岛素体内半衰期方面发挥重要作用。因此，通过尺寸排阻色谱分析了融合ABD的胰岛素类似物是否保留形成六聚体的特性。结果表明，通过添加锌和苯酚，类似物4保留了形成六聚体的能力(图6)。在排除类似物7、9和10之外的所有类似物中也观察到了六聚体的形成。因此，在具有表2所示序列的类似物中，类似物7和9被进一步排除在候选物之外。
实施例10：融合ABD的胰岛素类似物的体内药代动力学和降血糖能力评价
为了评价六种融合ABD的胰岛素类似物的体内药代动力学，向正常SD大鼠(6周龄)皮下施用每种胰岛素类似物，并且然后在0、1、4、8、24、48、72和96小时采血。使用ELISA测量每个时间点在血液中残留的每种融合ABD的胰岛素类似物的浓度。此外，使用所采血液的一部分，用血糖监测装置测量时间依赖性血糖水平。
结果是，如在下表5中可以看出，与已知半衰期为5分钟的天然胰岛素相比，融合ABD的胰岛素类似物显示出显著增加的半衰期。通过仅取代胰岛素B链的位置22而获得的类似物11显示出7.2小时的半衰期，并且显示出最大半衰期增加的类似物4被评价为具有9.9小时的半衰期。
分析了正常动物的血糖水平维持在降低水平的时间。结果表明，类似物5、6和8具有增加的半衰期，但血糖水平维持时间较短。与这些类似物相比，类似物4具有最好的降低血糖水平的能力，并且最长时间地维持其功效(图7)。
表5
| 参数 | 类似物2 | 类似物4 | 类似物5 | 类似物6 | 类似物8 | 类似物11 |
| T<sub>1/2</sub>(小时) | 9.4±3.4 | 9.9±0.1 | 9.1±0.7 | 8.4±1.7 | 8.8±0.4 | 7.2±2.3 |
| MRT(小时) | 17.0±2.2 | 22.1±1.3 | 21.2±0.3 | 15.9±1.5 | 19.8±1.5 | 16.3±0.9 |
虽然已经参考具体特征详细描述了本发明，但对本领域技术人员应清楚的是，此描述仅针对优选实施方案，并不限制本发明的范围。因此，本发明的实质范围将由所附权利要求及其等效物限定。
实用性
相对于常规胰岛素、胰岛素类似物或其他胰岛素衍生物，根据本发明的胰岛素类似物或胰岛素类似物衍生物具有的优势在于其具有显著增加的体内半衰期和增加的稳定性，使得其即使被注射一次时也可以具有持久的效果。因此，它可以为通过注射来自我施用胰岛素的糖尿病患者提供便利。
文本文件
参见所附序列表。
<110> 株式会社大熊制药
<120> 长效胰岛素类似物及其复合物
<130> PP-B2240
<150> KR 10-2018-0092243
<151> 2018-08-08
<160> 13
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 融合标签(Fusion Tag)
<400> 1
Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala His His His His His His
1 5 10 15
Ser Ser Gly Ser Ala Arg
20
<210> 2
<211> 30
<212> PRT
<213> 智人(homo sapiens)
<400> 2
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Lys Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr
20 25 30
<210> 3
<211> 35
<212> PRT
<213> 智人(homo sapiens)
<400> 3
Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly
1 5 10 15
Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu
20 25 30
Gln Ala Arg
35
<210> 4
<211> 21
<212> PRT
<213> 智人(homo sapiens)
<400> 4
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 5
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 接头(Linker)
<400> 5
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 6
<211> 46
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 白蛋白结合结构域(Albumin binding domain)
<400> 6
Leu Ala Glu Ala Lys Glu Ala Ala Asn Ala Glu Leu Asp Ser Tyr Gly
1 5 10 15
Val Ser Asp Phe Tyr Lys Lys Leu Ile Asp Lys Ala Lys Thr Val Glu
20 25 30
Gly Val Glu Ala Leu Lys Asp Ala Ile Leu Ala Ala Leu Pro
35 40 45
<210> 7
<211> 46
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 工程化白蛋白结合多肽(Engineered albumin binding polypeptide)
<400> 7
Leu Ala Glu Ala Lys Glu Ala Ala Asn Ala Glu Leu Asp Ser Tyr Gly
1 5 10 15
Val Ser Asp Phe Tyr Lys Lys Leu Ile Asp Lys Ala Lys Thr Val Glu
20 25 30
Gly Val Glu Ala Leu Lys Asp Glu Ile Leu Ala Ala Leu Pro
35 40 45
<210> 8
<211> 46
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 工程化白蛋白结合多肽(Engineered albumin binding polypeptide)
<400> 8
Leu Ala Glu Ala Lys Glu Ala Ala Asn Ala Glu Leu Asp Ser Tyr Gly
1 5 10 15
Val Ser Asp Phe Tyr Lys Lys Leu Ile Asp Lys Ala Lys Thr Val Glu
20 25 30
Gly Val Glu Ala Leu Lys Glu Ala Ile Leu Ala Ala Leu Pro
35 40 45
<210> 9
<211> 46
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 工程化白蛋白结合多肽(Engineered albumin binding polypeptide)
<400> 9
Leu Ala Glu Ala Lys Glu Ala Ala Asn Ala Glu Leu Asp Ser Tyr Gly
1 5 10 15
Val Ser Asp Phe Tyr Lys Lys Leu Ile Asp Lys Ala Lys Thr Val Glu
20 25 30
Gly Val Glu Ala Leu Lys Glu Glu Ile Leu Ala Ala Leu Pro
35 40 45
<210> 10
<211> 46
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 工程化白蛋白结合多肽(Engineered albumin binding polypeptide)
<400> 10
Leu Ala Glu Ala Lys Glu Ala Ala Asn Ala Glu Leu Asp Ser Tyr Gly
1 5 10 15
Val Ser Asp Phe Tyr Lys Lys Leu Ile Glu Lys Ala Lys Thr Val Glu
20 25 30
Gly Val Glu Ala Leu Lys Asp Ala Ile Leu Ala Ala Leu Pro
35 40 45
<210> 11
<211> 46
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 工程化白蛋白结合多肽(Engineered albumin binding polypeptide)
<400> 11
Leu Ala Glu Ala Lys Glu Ala Ala Asn Ala Glu Leu Asp Ser Tyr Gly
1 5 10 15
Val Ser Asp Phe Tyr Lys Lys Leu Ile Glu Lys Ala Lys Thr Val Glu
20 25 30
Gly Val Glu Ala Leu Lys Asp Glu Ile Leu Ala Ala Leu Pro
35 40 45
<210> 12
<211> 46
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 工程化白蛋白结合多肽(Engineered albumin binding polypeptide)
<400> 12
Leu Ala Glu Ala Lys Glu Ala Ala Asn Ala Glu Leu Asp Ser Tyr Gly
1 5 10 15
Val Ser Asp Phe Tyr Lys Lys Leu Ile Glu Lys Ala Lys Thr Val Glu
20 25 30
Gly Val Glu Ala Leu Lys Glu Ala Ile Leu Ala Ala Leu Pro
35 40 45
<210> 13
<211> 46
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 工程化白蛋白结合多肽(Engineered albumin binding polypeptide)
<400> 13
Leu Ala Glu Ala Lys Glu Ala Ala Asn Ala Glu Leu Asp Ser Tyr Gly
1 5 10 15
Val Ser Asp Phe Tyr Lys Lys Leu Ile Glu Lys Ala Lys Thr Val Glu
20 25 30
Gly Val Glu Ala Leu Lys Glu Glu Ile Leu Ala Ala Leu Pro
35 40 45
Claims (21)
1.一种胰岛素类似物，所述胰岛素类似物包含由SEQ ID NO:2的氨基酸序列表示的胰岛素B链变体，胰岛素B链的氨基酸位置22处的精氨酸(Arg)被天然胰岛素中的赖氨酸(Lys)取代。
2.根据权利要求1所述的胰岛素类似物，其中所述胰岛素类似物显示出对由酶梭菌蛋白酶切割的抗性。
3.根据权利要求1所述的胰岛素类似物，其中所述胰岛素类似物还包含一个或多个选自以下的氨基酸取代：
由SEQ ID NO:4的氨基酸序列表示的胰岛素A链的氨基酸位置3处的缬氨酸(Val)至亮氨酸(Leu)取代；
由SEQ ID NO:4的氨基酸序列表示的胰岛素A链的氨基酸位置8处的苏氨酸(Thr)至天冬氨酸(Asp)取代；
由SEQ ID NO:4的氨基酸序列表示的胰岛素A链的氨基酸位置10处的异亮氨酸(Ile)至赖氨酸(Lys)取代；
由SEQ ID NO:4的氨基酸序列表示的胰岛素A链的氨基酸位置14处的酪氨酸(Tyr)至谷氨酸(Glu)取代；
由SEQ ID NO:4的氨基酸序列表示的胰岛素A链的氨基酸位置19处的酪氨酸(Tyr)至苯丙氨酸(Phe)取代；
由SEQ ID NO:2的氨基酸序列表示的胰岛素B链变体的氨基酸位置5处的组氨酸(His)至苏氨酸(Thr)取代；
由SEQ ID NO:2的氨基酸序列表示的胰岛素B链变体的氨基酸位置9处的丝氨酸(Ser)至天冬氨酸(Asp)取代；
由SEQ ID NO:2的氨基酸序列表示的胰岛素B链变体的氨基酸位置13处的谷氨酸(Glu)至丙氨酸(Ala)取代；
由SEQ ID NO:2的氨基酸序列表示的胰岛素B链变体的氨基酸位置17处的亮氨酸(Leu)至谷氨酰胺(Gln)取代；以及
由SEQ ID NO:2的氨基酸序列表示的胰岛素B链变体的氨基酸位置24处的苯丙氨酸(Phe)至丝氨酸(Ser)取代。
4.根据权利要求3所述的胰岛素类似物，其中与天然胰岛素相比，所述胰岛素类似物具有增加的体内半衰期。
5.一种多核苷酸，其编码根据权利要求1至4中任一项所述的胰岛素类似物。
6.一种重组载体，其包含根据权利要求5所述的多核苷酸。
7.一种其中引入了根据权利要求6所述的重组载体的重组微生物。
8.一种长效胰岛素类似物衍生物，其中白蛋白结合结构域与根据权利要求1至4中任一项所述的胰岛素类似物融合。
9.根据权利要求8所述的长效胰岛素类似物衍生物，其中所述白蛋白结合结构域包含由以下氨基酸序列表示的白蛋白结合基序：
GVSDFYKKLIXaKAKTVEGVEALKXbXcI
其中
Xa独立地选自D和E，
Xb独立地选自D和E，并且
Xc独立地选自A和E。
10.根据权利要求9所述的长效胰岛素类似物衍生物，其中所述白蛋白结合结构域包含以下氨基酸序列：
LAX3AKX6X7ANX10ELDX14Y-[BM]-LX43X44LP
其中
[BM]是根据权利要求9中所定义的白蛋白结合基序，
X3独立地选自C、E、Q和S；
X6独立地选自C、E和S；
X7独立地选自A和S；
X10独立地选自A、R和S；
X14独立地选自A、C、K和S；
X43独立地选自A和K；并且
X44独立地选自A、E和S。
11.根据权利要求10所述的长效胰岛素类似物衍生物，其中所述白蛋白结合结构域由选自SEQ ID NO:6至13的氨基酸序列表示。
12.根据权利要求11所述的长效胰岛素类似物衍生物，其中所述白蛋白结合结构域由SEQ ID NO:6的氨基酸序列表示。
13.根据权利要求8所述的长效胰岛素类似物衍生物，其中所述胰岛素类似物和所述白蛋白结合结构域彼此通过以下项连接：肽键；多肽接头；或选自聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇-丙二醇共聚物、聚氧乙烯化多元醇、聚乙烯醇、多糖、葡聚糖、聚乙烯基乙醚、生物可降解聚合物、脂肪酸、核苷酸、脂质聚合物、几丁质、透明质酸及其组合的非肽基接头。
14.根据权利要求13所述的长效胰岛素类似物衍生物，其中所述多肽接头是(GGGGS)n(其中n＝范围从1至6的整数)。
15.根据权利要求14所述的长效胰岛素类似物衍生物，其中所述肽接头由SEQ ID NO:5的氨基酸序列表示。
16.一种重组载体，其包含：根据权利要求5所述的多核苷酸；和编码白蛋白结合结构域的多核苷酸，所述白蛋白结合结构域包含由以下氨基酸序列表示的白蛋白结合基序：
GVSDFYKKLIXaKAKTVEGVEALKXbXcI
其中
Xa独立地选自D和E，
Xb独立地选自D和E，并且
Xc独立地选自A和E。
17.根据权利要求16所述的重组载体，其中所述白蛋白结合结构域包含以下氨基酸序列：
LAX3AKX6X7ANX10ELDX14Y-[BM]-LX43X44LP
其中
[BM]是根据权利要求16中所定义的白蛋白结合基序，
X3独立地选自C、E、Q和S；
X6独立地选自C、E和S；
X7独立地选自A和S；
X10独立地选自A、R和S；
X14独立地选自A、C、K和S；
X43独立地选自A和K；并且
X44独立地选自A、E和S。
18.根据权利要求17所述的重组载体，其中所述白蛋白结合结构域由选自SEQ ID NO:6至13的氨基酸序列表示。
19.根据权利要求18所述的重组载体，其中所述白蛋白结合结构域由SEQ ID NO:6的氨基酸序列表示。
20.一种其中引入了根据权利要求16所述的重组载体的重组微生物。
21.一种用于产生具有增加的体内半衰期的长效胰岛素类似物衍生物的活性形式的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)培养根据权利要求20所述的重组微生物；
(b)裂解所培养的重组微生物，从而获得长效胰岛素类似物衍生物；
(c)诱导所获得的长效胰岛素类似物衍生物的重折叠，从而获得胰岛素类似物衍生物的前-原形式；
(d)通过用梭菌蛋白酶和CpB处理将所述胰岛素类似物衍生物的前-原形式转化为活性形式；并且
(e)纯化所述长效胰岛素类似物衍生物的活性形式。
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