WO2020032423A1 - 클로스트리파인을 이용한 지속형 인슐린 아날로그 복합체의 활성형 제조방법 - Google Patents

클로스트리파인을 이용한 지속형 인슐린 아날로그 복합체의 활성형 제조방법 Download PDF

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WO2020032423A1
WO2020032423A1 PCT/KR2019/008958 KR2019008958W WO2020032423A1 WO 2020032423 A1 WO2020032423 A1 WO 2020032423A1 KR 2019008958 W KR2019008958 W KR 2019008958W WO 2020032423 A1 WO2020032423 A1 WO 2020032423A1
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insulin
amino acid
chain
seq
acid sequence
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PCT/KR2019/008958
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안경훈
정선경
윤채하
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주식회사 대웅제약
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    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/22—Cysteine endopeptidases (3.4.22)
    • C12Y304/22008—Clostripain (3.4.22.8)

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing an active insulin analogue complex using Clostripine, and more particularly, by replacing the 22nd amino acid of the insulin B chain from Arginine (Arg) to Lysine (Lys)
  • the present invention relates to a method for preparing an active insulin analogue complex, which can be converted into an active form without breaking the insulin B chain.
  • Diabetes is a metabolic disease characterized by hyperglycemia and is caused by a combination of genetic and environmental factors. Diabetes causes conditions such as type 1 diabetes, type 2 diabetes, gestational diabetes, and hyperglycemia, and the pancreas produces insufficient amounts of insulin or the body's cells do not respond properly to insulin, resulting in decreased glucose absorption. Metabolic disorder, which results in the accumulation of glucose in the blood.
  • Type 1 diabetes is also called insulin dependent diabetes (IDDM) and adolescent-onset diabetes, which is caused by beta cell destruction resulting in absolute insulin deficiency.
  • IDDM insulin dependent diabetes
  • Type 2 diabetes is also known as non-insulin dependent diabetes mellitus (NIDDM) and adult-onset diabetes, which is associated with marked insulin resistance and hence insulin deficiency accompanied by insulin deficiency and / or insulin resistance.
  • NIDDM non-insulin dependent diabetes mellitus
  • adult-onset diabetes which is associated with marked insulin resistance and hence insulin deficiency accompanied by insulin deficiency and / or insulin resistance.
  • diabetes is accompanied by a variety of complications, such as cardiovascular disease, retinopathy is a very burdensome disease when proper management, such as blood sugar control is not made.
  • the global market for diabetes treatment is expected to expand from US $ 41.7 billion in 2015 to US $ 66.1 billion in 2022, which is expected to be the second largest area after the anticancer drug market.
  • Globally, 422 million adults have diabetes in 2014, accounting for 8.5% of the total adult population, nearly doubling from 4.5% in 1980 (WHO, 2016).
  • the total global health expenditure due to diabetes is estimated at $ 673 billion in 2015, and by 2040 the number of diabetics aged 20-79 is expected to increase to 620 million.
  • Insulin is a blood glucose control hormone secreted by the human pancreas. It transfers excess glucose in the blood to the cells to supply cells with energy and maintain blood sugar at normal levels.
  • Insulin undergoes various post-translational modifications depending on the production pathway. Production and secretion are independent and manufactured insulin is stored for secretion. C-peptide and mature insulin are biologically active.
  • insulin is synthesized in the beta cells of the pancreas.
  • Insulin is composed of two polypeptide chains, A chain and B chain, which are linked by disulfide bonds.
  • Early insulin is synthesized in beta cells into a single polypeptide called preproinsulin.
  • Preproinsulin contains a signal peptide of 24 amino acid residues that transfers the newborn polypeptide chain to the rough endoplasmic reticulum. The signal peptide moves to the lumen of the rough endoplasmic reticulum and is cleaved to form proinsulin.
  • proinsulin folds in the correct form and forms three disulfide bonds. After 5-10 minutes of assembly in the endoplasmic reticulum, proinsulin is transported to a trans-Golgi network where immature granules are formed.
  • Proinsulin matures into active insulin by the activity of exoprotease carboxypeptidase E and cellular endopeptidase known as prohormone convertases (PC1, PC2). Endopeptidase induces cleavage at two positions, releasing fragments called C-peptides, and the two peptide chains, B chain and A chain, are joined by two disulfide bonds.
  • the cleavage site is located after a pair of basic residues (lysine (Lys) -64 and arginine (Arg) -65, arginine (Arg) -31 and arginine (Arg) -32), respectively.
  • C-peptide is located in the central part of proinsulin, and the primary structure of proinsulin corresponds to "BCA" in sequence (B and A chains were identified based on mass, and C-peptides were later discovered) .).
  • the resulting mature insulin (active insulin) is packaged in mature granules and secreted into the circulation by cells by metabolic signals (eg Leucine, Arginine, Glucose, Mannose) and vagus nerve stimulation. .
  • metabolic signals eg Leucine, Arginine, Glucose, Mannose
  • vagus nerve stimulation eg Leucine, Arginine, Glucose, Mannose
  • Eli Lilly uses E. coli to express A and B chains, respectively.
  • the method of mixing disulfide bonds and linking A chain and B chain by mixing in vitro was used, but there was a problem of poor production efficiency.
  • Eli Lilly then switched to a method of expressing proinsulin and making disulfide bonds in vitro and then cutting the C-peptide with trypsin and carboxypeptidase B to make insulin.
  • Novo Nordisk has developed a method of expressing miniproinsulin, which connects B and A chains with two basic amino acids, in yeast and trypsin treatment under laboratory conditions to obtain insulin.
  • Proinsulin has the advantage of forming disulfide bonds in the process of expression and secretion, and has the advantage of easy separation and purification because it is secreted in the medium, but was difficult to produce large-scale as E. coli.
  • the present inventors have diligently tried to develop a production process suitable for the novel long-acting insulin analogue complex of the present inventors with improved half-life in vivo compared to natural insulin, and as a result, the novel long-acting insulin analogue of the present inventors is used when Clostripine is used.
  • the present invention was completed by confirming that the composite can be produced efficiently.
  • the present invention includes an insulin B chain mutation represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 in which the 22nd amino acid of the insulin B chain in natural insulin is substituted with lysine (Lys) in arginine (Arg). And reacting the insulin analog complex with albumin binding domain with Clostripine, thereby providing a method for preparing an active insulin analog complex.
  • the invention also provides an active, sustained insulin analogue complex prepared by the above method.
  • Figure 2 shows the results of confirming the expression of the sustained insulin analog complex 1-10 in recombinant E. coli by SDS-PAGE. Introducing one or more mutations in the insulin sequence maintained protein expression in E. coli.
  • Figure 3 monitors the solubilization solution and refolding process of ABD-fused insulin analog 4 by RP-HPLC.
  • the retention time shift was observed in RP-HPLC as the tertiary structure was formed.
  • Figure 4 shows the results of confirming the SDS-PAGE active insulin production efficiency of ABD-fusion insulin analogue 4 by Clostripine with DTT addition.
  • FIG. 5 shows the results of SDS-PAGE confirming the active insulin production efficiency of ABD-fused insulin analogue 4 according to the treatment time of Clostripine and CpB.
  • Figure 6 shows the results of confirming the high pH range of the active insulin production efficiency of ABD-fusion insulin analog 4 when the treatment with Clostripine and CpB by SDS-PAGE.
  • Figure 7 shows the results confirmed by SDS-PAGE of the active insulin production efficiency of ABD-fusion insulin analogue 4 with the addition of Clostripine and DTT.
  • FIG. 11 is a result of analyzing the formation of hexamer (hexamer) by adding zinc (zinc) and phenol (phenol) to the ABD-fusion insulin analogue 4 according to an embodiment of the present invention by size exclusion chromatography.
  • Insulin analogs which have substituted some of the amino acids of natural insulin, can be used as basal insulin therapeutics because of their increased half-life in vivo, and when these insulin analogs are combined with albumin in the human body, their half-life in vivo can be further increased and used as a weekly formulation. have.
  • the present inventors have found that the substitution of some of the native insulin amino acids may increase the half-life of insulin, and in addition, when the albumin binding domain is fused, the half-life is further increased by binding to albumin in vivo. .
  • the active form preparations that cause long-lasting persistence due to cleavage of albumin binding domains A difficult problem occurred.
  • Clostripine as an enzyme capable of converting the active form of insulin without inducing the cleavage of the albumin binding domain, which induces the cleavage of insulin itself. Cutting was prevented.
  • the present invention provides an insulin comprising an insulin B chain mutation represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 in which the 22nd amino acid of the insulin B chain in natural insulin is substituted with lysine (Lys) in arginine (Arg). It relates to an active preparation of a sustained insulin analogue complex comprising a; reacting the insulin analogue complex with the analog and albumin binding domain with Clostripine.
  • an insulin analogue comprising an insulin B chain mutation represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 in which the 22nd amino acid of the insulin B chain in natural insulin is substituted with lysine (Lys) in arginine (Arg)
  • lysine (Lys) in arginine (Arg) In addition to the substitution in which the 22nd amino acid in the native insulin B chain is replaced with lysine (Lys) in arginine (Arg), it means that it may include additional mutations in other amino acids of the insulin A chain or insulin B chain.
  • the insulin analogue is that the third amino acid of the insulin A chain represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 is substituted in valine (Val) with leucine (Leu);
  • the eighth amino acid of the insulin A chain represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 is replaced by threonine (Thr) with aspartic acid (Asp);
  • the tenth amino acid of the insulin A chain represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 is substituted for isoleucine (Ile) with lysine (Lys);
  • the 14th amino acid of the insulin A chain represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 is substituted for tyrosine (Tyr) with glutamic acid (Glu);
  • the 19th amino acid of the insulin A chain represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 is substituted with phenylalanine (Phe) in tyrosine (Tyr);
  • the albumin binding domain may be characterized in that it comprises an albumin binding motif represented by the following amino acid sequence.
  • X a is selected from D and E;
  • X b is selected from D and E;
  • X c is selected from A and E.
  • X a is D
  • X b is D
  • X c is A
  • the albumin binding domain may be characterized by comprising the following amino acid sequence.
  • [BM] is an albumin binding motif as defined above
  • X 3 is selected from C, E, Q and S;
  • X 6 is selected from C, E and S;
  • X 7 is selected from A and S;
  • X 10 is selected from A, R and S;
  • X 14 is selected from A, C, K and S;
  • X 43 is selected from A and K;
  • X 44 is selected from A, E and S.
  • the albumin binding domain may be represented by an amino acid sequence selected from the group consisting of the amino acid sequences of SEQ ID NO: 6 to SEQ ID NO: 13, but is not limited thereto.
  • the albumin binding domain may be preferably an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6.
  • the insulin complex or insulin analog complex in the insulin or insulin analogue of the B-chain-C-chain-A-chain sequence, fusion of albumin binding domain to the C-terminus of the A-chain protein refolding Preferred in view of yield, enzymatic yield and insulin activity.
  • the A-chain and albumin binding domain can be fused by a linker.
  • the polynucleotide encoding the insulin analogue and the nucleotide encoding the albumin binding domain may be introduced into a recombinant vector so that the insulin analogue and the albumin binding domain are fused and expressed.
  • the function of the insulin analogue complex according to the invention depends on the tertiary structure of the complex. Therefore, in the present invention, the sustained insulin analogue complex can make small changes in the amino acid sequence constituting the complex without affecting its function. Therefore, the present invention encompasses variants of albumin binding domains or sustained insulin analogue complexes that maintain albumin binding properties and high resistance to enzyme cleavage. For example, amino acid residues belonging to a particular functional group of amino acid residues (eg, hydrophobicity, hydrophilicity, polarity, etc.) may be substituted with other amino acid residues belonging to the same functional group.
  • a particular functional group of amino acid residues eg, hydrophobicity, hydrophilicity, polarity, etc.
  • albumin binding and “binding affinity for albumin” refer to properties of polypeptides or proteins that can be tested using surface plasmon resonance techniques, such as, for example, in a Biacore instrument.
  • albumin binding affinity can be tested in an experiment in which albumin or a fragment thereof is fixed on a sensor chip of the device and a sample containing the polypeptide or protein to be tested is delivered to the chip.
  • the polypeptide or protein to be tested is immobilized on the sensor chip of the device and the sample or fragment thereof containing albumin is delivered to the chip.
  • the albumin may be serum albumin derived from a mammal such as human serum albumin.
  • surface plasmon resonance methods can also be performed when quantitative measurements, such as measuring K D values for interactions, are required.
  • binding values can be defined via a Biacore2000 instrument (Biacore AB).
  • Albumin is properly fixed to the measurement sensor chip, and polypeptide or protein samples to be measured for affinity are prepared by step dilution and injected in any order.
  • the K D value can then be calculated from the results using, for example, a 1: 1 Langmuir binding model of BIAevaluation 4.1 software provided by Biacore AB.
  • the albumin to which the insulin analogue complexes bind may be selected from human serum albumin, rat serum albumin, cynomolgus serum albumin and mouse serum albumin, but is not limited thereto. no.
  • the albumin to which the insulin analog complex binds is human serum albumin.
  • albumin binding motif and albumin binding domain shall include the contents described in Korean Patent Publication No. 10-2015-0058454 corresponding to International Publication WO2014048977. .
  • the insulin analogue and albumin binding domain are peptide binding; Polypeptide linkers; Or polyethylene glycol, polypropylene glycol, ethylene glycol-propylene glycol copolymer, polyoxyethylated polyol, polyvinyl alcohol, polysaccharide, dextran, polyvinyl ethyl ether, biodegradable polymer, fatty acid, nucleotide, lipid polymer, chitin, hyaluronic acid And it may be characterized in that coupled to each other via a non-peptidyl linker selected from the group consisting of a combination thereof, but is not limited thereto.
  • GGGGS repeating sequence
  • the insulin analogue and albumin binding domain may be bound to each other by a polypeptide linker, and the polypeptide linker may be (GGGGS) n (n is an integer of 1 to 6), but is not limited thereto.
  • the polypeptide linker may be represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5.
  • the present invention may be characterized by adding a reducing agent when reacting with the Clostripine, the reducing agent is a group consisting of cysteine, b-mercaptoethanol, TCEP, GSH and DTT It may be characterized in that selected from, but is not limited thereto.
  • the reducing agent it is preferable to add 0.1 to 0.5 mM of DTT, and more preferably to add 0.1 to 0.4 mM of DTT.
  • the DTT may be added only once at an initial time when the insulin analog complex reacts with Clostripine, i.e., at the start of the reaction, and may be added 2 to 5 times after the reaction is initiated. It is most preferred in the simplicity and efficiency of the production process that it is added at the beginning of the reaction with Clostripine and further added after 3-6 hours of reaction.
  • the Clostripine may be added at a concentration of 0.1 to 5 Units per 1 mg of protein at each addition, preferably at a concentration of 0.5 to 2 Units, but is not limited thereto.
  • the insulin analog complex may be further reacted with CpB by adding carboxypeptidase B (hereinafter referred to as CpB) when reacting with Clostripine or after Clostripine.
  • CpB carboxypeptidase B
  • CpB may be added together at the time when the insulin analogue complex initiates the reaction with Clostripine.
  • the Clostripine and / or CpB may be characterized in that the reaction in a condition of pH 6 ⁇ 9, preferably 6.5 ⁇ 7.5, 4 ⁇ 40 °C, preferably 30 ⁇ 40 °C temperature
  • the reaction may be performed under conditions, but is not limited thereto.
  • the CpB may be added at a concentration of 0.001 to 1 Unit per 1 mg of protein, preferably at a concentration of 0.001 to 0.1 Unit, but is not limited thereto.
  • the present invention relates to an active active insulin analogue complex prepared by the above method.
  • the insulin analog complex may be obtained by culturing a recombinant microorganism in which a polynucleotide encoding the same is introduced into a host cell in a recombinant vector, and then crushing and purifying it.
  • the recombinant vector may typically be constructed as a vector for cloning or a vector for expression, and may be constructed as a vector for using prokaryotic or eukaryotic cells as host cells.
  • the term "vector” refers to a nucleic acid construct that is a recombinant vector capable of expressing a protein of interest in an appropriate host cell, and that includes an essential regulatory element operably linked to express a nucleic acid insert.
  • the present invention can produce a recombinant vector comprising a nucleic acid encoding an insulin analog complex, by transforming or transfecting the recombinant vector into a host cell, to obtain the insulin analog complex of the present invention Can be.
  • the nucleic acid encoding the insulin analogue and / or analogue complex thereof is operably linked to nucleic acid expression control sequences.
  • the term “operatively linked” means a functional binding between a nucleic acid expression control sequence (eg, a promoter, signal sequence, ribosomal binding site, transcription termination sequence, etc.) and another nucleic acid sequence.
  • the regulatory sequence will control the transcription and / or translation of the other nucleic acid sequence.
  • promoter refers to a non-readed nucleic acid sequence upstream of a coding region, ie, a polymerase, that contains a binding site for a polymerase and has a transcription initiation activity to an mRNA of a promoter subgene. It refers to the DNA region to initiate the transcription of the gene, and is located at the 5'-site of the mRNA transcription start site.
  • the vector of the present invention is a recombinant vector and the prokaryotic cell is a host
  • powerful promoters capable of promoting transcription e.g., tac promoter, lac promoter, lacUV5 promoter, lpp promoter, pL ⁇ promoter, pR ⁇ promoter, rac5 promoter, amp promoter, recA promoter, SP6 promoter, trp promoter, trc promoter, phoA promoter, araBAD promoter, T5 promoter and T7 promoter, etc.
  • promoters capable of promoting transcription e.g., tac promoter, lac promoter, lacUV5 promoter, lpp promoter, pL ⁇ promoter, pR ⁇ promoter, rac5 promoter, amp promoter, recA promoter, SP6 promoter, trp promoter, trc promoter, phoA promoter, araBAD promoter, T5 promoter and T7 promoter, etc.
  • vectors that can be used in the present invention are plasmids often used in the art (eg, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8 / 9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14).
  • plasmids often used in the art (eg, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8 / 9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14).
  • pGEX series, pET series, pPICZ ⁇ series, pUC19, etc. phage (e.g. ⁇ gt4 ⁇ ⁇ B, ⁇ -Charon, ⁇ z1 and M13, etc.) or viruses (e.g. SV
  • a promoter derived from the genome of the mammalian cell e.g., metallothionine promoter
  • a promoter derived from a mammalian virus e.g., adenovirus
  • Late promoters vaccinia virus 7.5K promoters
  • SV40 promoters SV40 promoters
  • cytomegalovirus promoters tk promoters of HSV
  • polyadenylation sequences e.g., plastic growth hormone terminators and SV40 derived poly adenylation sequences
  • the recombinant vectors of the present invention include antibiotic resistance genes commonly used in the art as selection markers, and include, for example, ampicillin, gentamicin, carbenicillin, chloramphenicol, streptomycin, kanamycin, geneticin, neomycin And resistance genes for tetracycline can be used.
  • the recombinant vector of the present invention may further comprise other sequences as necessary to facilitate purification of the protein of interest, ie insulin and / or its analog, which is to be recovered.
  • the additionally included sequence may be a tag purification tag sequence, such as glutathione S-transferase (Pharmacia, USA), maltose binding protein (NEB, USA), FLAG (IBI, USA) and 6 histidines. (hexahistidine) and the like, but the examples do not limit the type of sequence required for purification of the target protein. Fusion proteins expressed by recombinant vectors comprising such tag sequences can be purified by affinity chromatography.
  • glutathione-S-transferase when glutathione-S-transferase is fused, glutathione, which is a substrate of this enzyme, can be used, and when six histidine tags are used, a desired target protein can be easily recovered by using a Ni-NTA column. .
  • a transformant transformed with the vector Using a recombinant vector comprising the polynucleotide encoding the insulin analogue and / or analogue complex thereof, a transformant transformed with the vector can be constructed.
  • transformation refers to the introduction of DNA into a host cell so that the DNA can be replicated as a factor of a chromosome or by completion of chromosome integration. It means a phenomenon causing change.
  • any transformation method may be used, and may be easily performed according to conventional methods in the art.
  • the Hanahan method the electroporation method, the calcium phosphate precipitation method, the plasma fusion method, the silicon carbide fiber, which improved efficiency by using CaCl2 precipitation method and reducing material called DMSO (dimethyl sulfoxide) for CaCl2 precipitation method Agitation with Agrobacterial transformation, transformation with PEG, dextran sulfate, lipofectamine and dry / inhibition mediated transformation.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • the method for transforming a recombinant vector comprising a nucleic acid encoding an insulin analogue and / or an analogue complex thereof according to the present invention is not limited to the above examples, and the transformation or transfection methods commonly used in the art are limited. Can be used without.
  • a transformant of the present invention can be obtained by introducing a recombinant vector containing a nucleic acid encoding an insulin analog complex as a target nucleic acid into a host cell.
  • Suitable hosts for the present invention are not particularly limited as long as they allow expression of the nucleic acid of the present invention.
  • Specific examples of hosts that can be used in the present invention include Escherichia genus bacteria such as E. coli ; Bacillus subtilis (Bacillus subtilis) and Bacillus (Bacillus), such as bacteria belonging to the genus; Bacteria of the genus Pseudomonas , such as Pseudomonas putida ; Yeasts such as Pichia pastoris , Saccharomyces cerevisiae , and Schizosaccharomyces pombe ; Insect cells such as Spodoptera luciferda (SF9); And animal cells such as CHO, COS, BSC, and the like, but are not limited thereto.
  • active refers to a mature form in which insulin, insulin analogues or insulin analogue complexes can control blood glucose levels in vivo.
  • proinsulin the C-peptide is cleaved and the A and B chains of insulin are cut. It includes insulin, insulin analogue or insulin analogue complex.
  • ABD-fused insulin analogue is used in the same sense as the sustained insulin analogue complex in the present invention.
  • Human insulin is made in the form of pre-pro-insulin, which cuts the pre-sequence from the endoplasmic reticulum and processes it in the Golgi apparatus and vesicles to form mature insulin.
  • Proinsulin was designed to produce recombinant insulin by the process of expressing a protein in E. coli in the form of proinsulin and cutting the C chain using trypsin.
  • a fusion tag was inserted at the N-terminus and codon optimization was performed.
  • ABD albumin biding domain
  • PJ401 (DNA 2.0) vector was used as the expression vector, and the vector was digested with restriction enzymes NdeI and EcoRI, and then subjected to electrophoresis on 1% agarose gel to separate DNA fragments.
  • the gene structure for ABD-fusion insulin expression and DNA fragments obtained from the expression vector as described above were linked with T4 DNA ligase to prepare plasmids, and then each plasmid was introduced by calcium chloride method to transform E. coli BL21 (DE3). .
  • Transformed strains resistant to kanamycin were selected and plasmid DNA was isolated to confirm that the desired DNA was correctly inserted by analysis by restriction enzyme digestion.
  • NdeI -Fusion tag-ABD-Linker-B-chain-C-chain-A-chain- EcoRI gene structure When NdeI -Fusion tag-ABD-Linker-B-chain-C-chain-A-chain- EcoRI gene structure was designed, the yield of protein refolding was very low and was not suitable for the present invention.
  • amino acid sequence of the said site which comprises ABD-fusion insulin used by this invention is as follows.
  • Insulin production using recombinant E. coli is essential to convert proinsulin to the active form using trypsin.
  • trypsin cleaves di-basic amino acids with high efficiency and also cleaves a single amino acid, lysine (Lys) or arginine (Arg), making it difficult to produce intact, active insulin, and many in the ABD sequence. Lysine (Lys) and arginine (Arg) residues are included, it is more difficult to produce an intact ABD-fused insulin using trypsin.
  • Codon optimization for gene expression in E. coli was performed according to GeneArt's algorithm and the genes were synthesized to have substituted amino acids.
  • the plasmid thus prepared was introduced into E. coli BL21 (DE3) in the same manner as described in Example 1 to prepare recombinant E. coli.
  • each recombinant E. coli strain was inoculated in 100 mL LB medium and shaken at 37 ° C. for 16 hours to use as species culture.
  • 2 L LB medium was added to a 7 L fermenter (New Brunswick BioFlo) and sterilized, followed by seed culture.
  • the culture conditions were the temperature 35 °C air volume 3 vvm, agitation rate 1,000 rpm, pH was adjusted with ammonia and phosphoric acid to maintain 6.8. Feeding was started when the carbon source of the medium was depleted and protein expression was induced by IPTG at the same time. After induction of expression, the cells were further cultured for 10 hours, and the recombinant cells were recovered using a centrifuge.
  • ABD-fusion insulin analogues were expressed as inclusion bodies in Escherichia coli and showed similar expression levels in the vector system used in the present invention even when a mutation of the insulin site amino acid site was introduced (FIG. 2).
  • ABD-fused insulin or ABD-fused insulin analogs were suspended in crush buffers (20 mM Tris, 10 mM EDTA, 10% sucrose, 0.2 M NaCl, pH 8.0), and cells were disrupted using a high pressure homogenizer. .
  • the lysate was centrifuged at 7,000 rpm in a high speed centrifuge and soluble protein and some cell debris were removed to separate the precipitate containing inclusion bodies.
  • the separated inclusion body was washed in a buffer containing 1% Triton X-100, 0.2 M NaCl, 1 M Urea, and then centrifuged at 7,000 rpm.
  • the precipitated inclusion body was further washed twice with distilled water and then stored at -80 ° C until use.
  • Cryopreserved inclusion bodies were dissolved in solubilization buffer (25 mM Tris, 8 M Urea, 30 mM cysteine-HCl, pH 10.5), diluted in refolding buffer (25 mM Tris-HCl, pH 10.5) and 16 at 4 ° C. Time refolding was performed. The refolding was confirmed by RP-HPLC analysis. As the solubilization solution was analyzed in RP-HPLC, the hydrophobic protein peak was observed in 20 minutes, and the refolding solution was observed to move the peak in 16 minutes (Fig. 3). This is because as the refolding proceeds, hydrophobicity decreases compared to the solubilization state. Refolding proceeded until no protein peak shift was observed in RP-HPLC analysis.
  • Clostripine contains cysteine (Cys) at the active site, and thus reducing conditions are required to show the activity of the enzyme.
  • Cys cysteine
  • the refolding solution is treated with a reducing agent to maintain Clostripine activity, the disulfide bond at the insulin site is likely to be broken. Therefore, it is required to derive conditions that increase the yield of enzyme reaction without cleavage of disulfide bonds, and the treatment concentration and conditions for further treatment were tested using DTT, which is a reducing agent to be included in the enzyme reaction solution.
  • CpB carboxypeptidase B
  • CpB is an enzyme that cleaves the basic amino acid at the carboxy terminus, and the detailed conditions were also tested. Specifically, the treatment time of Clostripine and CpB, availability of simultaneous treatment, the amount of enzyme treatment, the enzyme treatment time, and the appropriate pH were evaluated.
  • Clostripine was activated by inducing auto-cleavage because it is present in pro-form form. To this end, freeze-dried clostripine (Worthington, USA) was dissolved in distilled water and then activated with activation buffer (500 mM Tris, 50 mM DTT, 25 mM CaCl2 pH 7.8) and activated for 30 minutes at 4 ° C. Clostripine activated to 0.1 to 5 units per mg of refolded protein was added and reacted at 25 to 40 ° C. for 2 to 8 hours. After Clostripine reaction, CpB was added to 0.001 to 1 unit per mg of protein to further react. The enzyme reaction was stopped by lowering the pH to 3.5 or less using HCl.
  • activation buffer 500 mM Tris, 50 mM DTT, 25 mM CaCl2 pH 7.8
  • both Clostripine and CpB In order to convert the ABD-fused proinsulin analog into active form, both Clostripine and CpB must be treated. In order to cut the insulin C-peptide and fusion tag, Clostripine should be treated first and CpB should be processed in order to remove Arginine (Arg) of the cut site, but in order to shorten the preparation time. Two or four hours after Clostripine treatment, the conditions for treating CpB and Clostripine and CpB were simultaneously compared.
  • Clostripine is pH 7.4-7.8, CpB is known to show the optimum activity at pH 9.0. Since the optimum pH range of the two enzymes is different, the simultaneous treatment was performed to determine the pH that maximizes the efficiency of active insulin conversion. In the present invention, the theoretical pI values of all ABD-fused insulin analogues according to Table 2 were close to 6, causing precipitation concerns. Therefore, the condition below pH 6.0 was excluded, and the precipitate increased from pH 9.0 and above, and the evaluation range was between pH 6.0 and 9.0.
  • the purpose of this study was to determine the temperature range in which Clostripine and CpB showed optimal activity.
  • the temperature was evaluated at 10 ⁇ 30 °C except for the temperature below 4 °C and the temperature above 40 °C.
  • the temperature is increased to 10 °C, 20 °C, 30 °C it was found that the less the unconverted type, the faster the conversion to the active type.
  • the concentration of DTT was confirmed that the faster the conversion to the active form.
  • Samples enzymatically treated with Clostripine and CpB were first purified according to the manufacturer's method using Fractogel® EMD COO- (M) (Merck) ion exchange resin chromatography, followed by Pharmprep® P100 RP-18e (Merck). G) was subjected to secondary phase purification using reverse phase chromatography.
  • the active ABD-fusion insulin analog could be purified through two purification processes as shown in FIG. 10.
  • Insulin receptor binding capacity was measured by binding the native insulin and ABD-fusion insulin analogs diluted to five or more concentrations, respectively.
  • Analogues 1, 3, and 10 which showed glucose-lowering ability below 50% of insulin glargine, were excluded from the candidate material.
  • Insulin has a stable structure by binding to zinc in the body to form hexamers.
  • Hexamer insulin is used in formulation studies and may play an important role in increasing half-life in the body. Therefore, it was analyzed by size exclusion chromatography whether the ABD-fusion insulin analog retained the properties of hexamer formation. As a result, it was confirmed that the analog 4 maintains the ability to form hexamer according to the addition of zinc and phenol (FIG. 11). Hexamer formation was also observed in all analogs except analogs 7, 9 and 10. As a result, analog Nos. 7 and 9 of the analogs having the sequences shown in Table 2 did not form hexamers and were further excluded from the candidates.
  • the half-life of the native insulin showed a significantly increased half-life of the ABD-fused insulin analogue compared to that known as 5 minutes.
  • Analog 11 which replaced only insulin B chain 22, had a half-life of 7.2 hours, and Analog 4, which had the greatest half-life increase, was evaluated to have a half-life of 9.9 hours.
  • the method for preparing an active insulin analogue complex according to the present invention is an active form of a novel sustained insulin analogue complex developed by the present inventors by cleaving albumin binding domains by an active conversion method of proinsulin using trypsin. The conversion was difficult. In order to overcome this problem, Clostripine was used to convert the novel long-acting insulin analogue complex into an active form, which can be usefully used for the production of a long-acting therapeutic agent for diabetes.

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Abstract

본 발명은 인슐린 B 쇄의 22번째 아미노산을 아르지닌(Arg)에서 라이신(Lys)으로 치환하여 클로스트리파인과 반응하더라도 인슐린 B 쇄의 절단 없이 활성형으로의 전환이 가능한 지속형 인슐린 아날로그 복합체의 활성형 제조방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 제조방법은 종래 트립신을 이용하는 프로인슐린의 활성형 전환 방법에 의해 알부민 결합 도메인이 절단되어 지속형 인슐린 아날로그 복합체의 활성형으로의 전환이 어려운 점을 극복하였으며, 따라서 당뇨병의 지속형 치료제 생산에 유용하게 활용될 수 있다.

Description

클로스트리파인을 이용한 지속형 인슐린 아날로그 복합체의 활성형 제조방법
본 발명은 클로스트리파인을 이용한 지속형 인슐린 아날로그 복합체의 활성형 제조방법에 관한 것으로, 더 상세하게는 인슐린 B 쇄의 22번째 아미노산을 아르지닌(Arg)에서 라이신(Lys)으로 치환하여 클로스트리파인과 반응하더라도 인슐린 B 쇄의 절단 없이 활성형으로의 전환이 가능한 지속형 인슐린 아날로그 복합체의 활성형 제조방법에 관한 것이다.
당뇨는 고혈당을 특징으로 하는 대사질환으로 유전적 요인과 환경적 요인의 복합적인 작용에 의해 발생한다. 당뇨는 1형 당뇨, 2형 당뇨, 임신성 당뇨 및 고혈당증 등의 상태를 유발하고, 췌장이 불충분한 양의 인슐린을 생성하거나 인체의 세포가 인슐린에 적절하게 반응하지 못해 포도당을 흡수하는 능력이 저하된 대사장애를 의미하며, 그 결과 포도당이 혈액 중에 축적되어 나타난다.
1형 당뇨는 인슐린 의존성 당뇨(IDDM) 및 청소년기-발병 당뇨라고도 불리며, 이는 베타 세포 파괴에 의해 유발되어 절대적인 인슐린 결핍을 유발한다. 반면 2형 당뇨는 비인슐린 의존 당뇨(NIDDM) 및 성인-발병 당뇨라고도 알려져 있으며, 이는 뚜렷한 인슐린 저항성과 이에 따른 인슐린 결핍 및/또는 인슐린 저항성과 동반되는 인슐린 분비 결핍과 관련되어 있다.
특히 당뇨는 심혈관 질환, 망막병증 등 다양한 합병증을 동반하기 때문에 혈당 조절 등 적절한 관리가 이루어지지 않을 경우 부담이 매우 큰 질환이다. 당뇨 치료제 세계 시장 규모는 2015년 417억달러에서 2022년 661억달러로 확대될 것으로 예측되는데 이는 항암제 시장에 이어 두 번째로 큰 영역이 될 것으로 예측된다. 전 세계적으로 2014년 기준 4억 22백만명의 성인이 당뇨를 앓고 있으며, 이는 전체 성인인구의 8.5%에 달하는데, 이는 1980년 4.5%에서 두 배 가까이 증가한 수치이다(WHO, 2016). 또한 당뇨로 인한 세계 보건 지출 총액은 2015년 기준 6,730억 달러 규모로 추산되며, 2040년까지 20-79세 당뇨 환자의 수는 6억 2천만명 규모로 증가할 것으로 예측되고 있다.
당뇨를 치료하기 위한 가장 대표적인 방법으로는 인슐린을 투여하여 환자의 혈당을 정상 수준으로 조절하는 방법이 있다. 인슐린은 인체의 췌장에서 분비되는 혈당 조절 호르몬으로, 혈액 내의 잉여 포도당을 세포로 옮겨 세포에 에너지원을 공급하는 한편 혈당을 정상 수준으로 유지시켜 주는 역할을 한다.
인슐린은 생산 경로에 따라 다양한 번역 후 변형 과정을 거치게 된다. 생산과 분비는 독립적이며, 제조된 인슐린은 분비를 위해 저장된다. C-펩타이드와 성숙 인슐린은 생물학적으로 활성을 나타내게 된다.
포유류에서 인슐린은 췌장의 베타 세포에서 합성된다. 인슐린은 두 개의 폴리펩타이드 사슬, 즉 A 쇄와 B 쇄로 구성되어 있으며, 이들은 이황화 결합으로 연결되어 있다. 초기 인슐린은 베타 세포에서 프리프로인슐린이라 불리는 단일한 폴리펩타이드로 합성된다. 프리프로인슐린은 신생 폴리펩타이드 사슬을 조면소포체(rough endoplasmic reticulum)로 이동시키는 24개 아미노산 잔기의 신호 펩타이드를 포함하고 있다. 신호 펩타이드는 조면소포체의 내강으로 이동한 후 절단되어 프로인슐린이 형성된다. 조면소포체에서 프로인슐린은 정확한 형태로 접힘(folding)이 일어나고 3개의 이황화 결합을 형성한다. 소포체에서 조립된 후 5~10분 후, 프로인슐린은 미성숙 과립이 형성되는 트랜스-골지 네트워크로 수송된다.
프로인슐린은 엑소프로테아제 카르복시펩티다아제 E와 프로호르몬 컨버타아제(PC1, PC2)로 알려진 세포 엔도펩티다아제의 활성에 의해 활성형 인슐린으로 성숙된다. 엔도펩티다아제는 2개의 위치에서 절단을 유도하여 C-펩타이드라 불리는 단편을 방출하고, 2개의 펩타이드 쇄인 B 쇄 및 A 쇄는 2개의 이황화 결합으로 연결되게 된다. 절단 부위는 각각 한 쌍의 염기성 잔기(라이신(Lys)-64와 아르지닌(Arg)-65, 아르지닌(Arg)-31과 아르지닌(Arg)-32) 뒤에 위치한다. C-펩타이드가 절단된 후에, 이들 2 쌍의 염기성 잔기는 카르복시펩티다아제에 의해 제거된다. C-펩타이드는 프로 인슐린의 중앙 부에 위치하며, 프로인슐린의 일차 구조는 순서에 따라 "B-C-A"에 해당한다(B 쇄와 A 쇄는 질량을 바탕으로 동정되었고, C-펩타이드는 추후에 발견되었다.).
만들어진 성숙 인슐린(활성형 인슐린)은 성숙 과립 내에 포장되어 있다가 대사신호(예: 류신(Leu), 아르지닌(Arg), 포도당, 만노오즈)와 미주 신경 자극에 의해 세포에서 순환계로 분비되게 된다.
당뇨를 치료하기 위해서는 활성형 인슐린을 투여하게 되는데, 활성형 인슐린을 제조하기 위한 유전자 재조합 인슐린 제조 기술로는, 우선, 일라이 릴리(Eli Lilly)사는 대장균을 이용하여 A 쇄와 B 쇄를 각각 발현시키고, in vitro에서 혼합시켜 이황화 결합을 만들고 A 쇄와 B 쇄를 연결시키는 방법을 사용하였으나, 생산효율이 좋지 않다는 문제점이 있었다. 이 후, 일라이 릴리(Eli Lilly)사는 프로인슐린을 발현시키고 in vitro 조건으로 이황화 결합을 만들고 나서, 트립신과 카르복시펩티다제 B로 C-펩타이드를 잘라내어 인슐린을 만드는 방법으로 전환하였다.
노보 노디스크(Novo Nordisk)사는 B 쇄와 A 쇄를 염기성의 아미노산 2개로 연결한 미니프로인슐린을 효모에서 발현시키고, 실험실적 조건으로 트립신 처리하여 인슐린을 수득하는 방법을 개발하였는데, 이 방법은 미니프로인슐린이 발현, 분비되는 과정에서 이황화 결합을 형성시키는 장점을 가지고 있고, 배지 중에 분비되기 때문에 분리 및 정제가 용이하다는 장점이 있으나, 대장균만큼 대규모의 생산에는 어려움 있었다.
유전자 재조합 인슐린의 신규한 제조방법의 개발은 이후에도 적극적으로 진행되었는데, 헥스트사는 신규 인슐린 유도체 또는 프리프로인슐린을 대장균에서 발현시키고, in vitro 조건에서 이황화 결합을 형성시키고, 리실엔도펩티다제 (lysylendopeptidase) 또는 클로스트리파인(clostripain)과 카르복시펩티다제 (carboxypeptidase) B로 처리하여 인슐린을 수득하는 방법을 개발하였고, 바이오테크놀로지 제너럴 코퍼레이션(BIO-TECHNOLOGY GENERAL CORP.)사가 대장균에서 슈퍼옥시드 디스뮤타제(SOD)에 프로인슐린을 연결한 융합단백질을 발현시켜 발현효과와 in vitro 조건에서의 이황화 결합 형성 효율을 향상시켰다. 인슐린으로 변환은 트립신과 카르복시펩티다아제 B로 행하였다. 이와 같이, 유전자 재조합 인슐린의 제조방법은 많은 시도가 있고, 발현 효율, 이황화 결합의 형성 효율, 인슐린으로 변환 방법의 관점에서 개량되고 있다(KR 10-2001-7013921).
본 발명자들은 천연 인슐린에 비해 생체 내 반감기가 증가되어 지속성이 향상된 본 발명자들의 신규 지속형 인슐린 아날로그 복합체에 적합한 생산 공정을 개발하고자 예의 노력한 결과, 클로스트리파인을 이용하는 경우 본 발명자들의 신규 지속형 인슐린 아날로그 복합체를 효율적으로 생산할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 신규한 지속형 인슐린 아날로그 복합체의 활성형 제조방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은, 천연형 인슐린에서 인슐린 B 쇄의 22번째 아미노산이 아르지닌(Arg)에서 라이신(Lys)으로 치환된 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 인슐린 B쇄 변이를 포함하고 알부민 결합 도메인이 결합된 인슐린 아날로그 복합체를 클로스트리파인과 반응시키는 단계;를 포함하는 활성형 인슐린 아날로그 복합체의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 방법으로 제조된 활성형의 지속형 인슐린 아날로그 복합체를 제공한다.
도 1은 인슐린 B 쇄의 22번 아르지닌(Arg)을 라이신(Lys)으로 치환하여 지속형 인슐린 아날로그 복합체를 제작한 후 클로스트리파인으로 처리하여 그 안정성을 확인한 결과이다. 인슐린의 B 쇄의 22번 위치에 아르지닌(Arg)을 포함하는 경우, 절단이 발생되나 라이신(Lys)으로 치환하면 B 쇄의 절단이 현저히 감소함을 질량분석기를 통해 확인하였다.
도 2는 재조합 대장균에서 지속형 인슐린 아날로그 복합체 1-10의 발현을 SDS-PAGE로 확인한 결과이다. 인슐린 서열에 하나 이상의 변이를 도입하여도 대장균에서의 단백질 발현은 유지되었다.
도 3은 ABD-융합 인슐린 아날로그 4의 가용화 용액 및 재접힘 과정을 RP-HPLC로 모니터링 하였다. 가용화를 통해 단백질 구조를 풀어 준 후 재접힘을 유도하면 3차 구조를 형성함에 따라 RP-HPLC에서 retention time의 이동이 관찰되었다.
도 4는 DTT 첨가에 따른 클로스트리파인에 의한 ABD-융합 인슐린 아날로그 4의 활성형 인슐린 생성 효율을 SDS-PAGE로 확인한 결과이다.
도 5는 클로스트리파인과 CpB의 처리 시간에 따른 ABD-융합 인슐린 아날로그 4의 활성형 인슐린 생성 효율을 SDS-PAGE로 확인한 결과이다.
도 6은 클로스트리파인과 CpB를 동시 처리하는 경우 ABD-융합 인슐린 아날로그 4의 활성형 인슐린 생성 효율이 높은 pH 범위를 SDS-PAGE로 확인한 결과이다.
도 7은 클로스트리파인 및 DTT의 추가적인 첨가에 따른 ABD-융합 인슐린 아날로그 4의 활성형 인슐린 생성 효율을 SDS-PAGE로 확인한 결과이다.
도 8은 본 발명의 일실시예에 따른 최적의 효소반응 조건에 따른 ABD-융합 인슐린 아날로그 4의 활성형 인슐린 전환 효율 증가 및 불순물 감소 효과를 확인한 결과이다. (주요 불순물 분자량 10,296 Da, 활성형 분자량 11,238 Da)
도 9는 클로스트리파인과 CpB를 동시 처리하는 경우 ABD-융합 인슐린 아날로그 4의 활성형 인슐린 생성 효율이 높은 온도 범위를 SDS-PAGE로 확인한 결과이다.
도 10은 ABD-융합 인슐린 아날로그 4를 클로스트리파인과 CpB로 절단한 후 정제하여 SDS-PAGE로 분석한 결과이다.
도 11은 본 발명의 일실시예에 따른 ABD-융합 인슐린 아날로그 4에 아연(zinc)과 페놀(phenol)을 첨가하여 헥사머(hexamer) 형성 여부를 크기 배제 크로마토그래피로 분석한 결과이다.
도 12는 본 발명의 일실시예에 따른 ABD-융합 인슐린 아날로그 의 혈당 강하능을 평가한 결과이다.
발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
천연형 인슐린의 아미노산 일부를 치환한 인슐린 아날로그는 생체 내 반감기가 증가하여 기저 인슐린 치료제로 활용될 수 있고, 이러한 인슐린 아날로그가 인체 내에서 알부민과 결합하면 생체 내 반감기는 더욱 증가하여 일주 제형으로 활용할 수 있다.
본 발명자들은 천연형 인슐린 아미노산의 일부를 치환하는 경우 인슐린의 생체 내 반감기를 증가시킬 수 있고, 여기에 추가로 알부민 결합 도메인이 융합시키면 생체 내에서 알부민과 결합하여 반감기가 더욱 증가한다는 것을 확인할 수 있었다. 하지만, 아미노산 일부가 치환된 인슐린 아날로그에 알부민 결합 도메인을 융합시키는 경우 이를 활성형으로 제조하는 과정에서 종래 사용하던 트립신을 사용할 때, 알부민 결합 도메인 자체의 절단이 야기되어 지속성이 오래 유지되는 활성형 제조가 어려운 문제점이 발생하였다.
이에, 본 발명에서는 알부민 결합 도메인의 절단을 유도하지 않으면서도 인슐린의 활성형 전환이 가능한 효소로써 클로스트리파인을 사용하고자 하였으나, 이는 인슐린 자체의 절단을 유도하는바, 인슐린 아미노산을 치환함으로써 인슐린 자체의 절단을 방지하였다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서 천연형 인슐린에서 인슐린 B 쇄의 22번째 아미노산이 아르지닌(Arg)에서 라이신(Lys)으로 치환된 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 인슐린 B쇄 변이를 포함하는 인슐린 아날로그와 알부민 결합 도메인이 결합되어 있는 인슐린 아날로그 복합체를 클로스트리파인과 반응시키는 단계;를 포함하는 지속형 인슐린 아날로그 복합체의 활성형 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에서, “천연형 인슐린에서 인슐린 B 쇄의 22번째 아미노산이 아르지닌(Arg)에서 라이신(Lys)으로 치환된 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 인슐린 B쇄 변이를 포함하는 인슐린 아날로그”는 천연형 인슐린 B쇄에서 22번째 아미노산이 아르지닌(Arg)에서 라이신(Lys)으로 치환된 변이 이외에도 인슐린 A쇄 또는 인슐린 B쇄의 다른 아미노산에서의 추가 변이를 포함할 수 있음을 의미한다.
본 발명에서, 상기 인슐린 아날로그는 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 인슐린 A 쇄의 3번째 아미노산이 발린(Val)에서 루신(Leu)으로 치환; 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 인슐린 A 쇄의 8번째 아미노산이 트레오닌(Thr)에서 아스파르트산(Asp)으로 치환; 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 인슐린 A 쇄의 10번째 아미노산이 이소루신(Ile)에서 라이신(Lys)으로 치환; 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 인슐린 A 쇄의 14번째 아미노산이 티로신(Tyr)에서 글루탐산(Glu)으로 치환; 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 인슐린 A 쇄의 19번째 아미노산이 티로신(Tyr)에서 페닐알라닌(Phe)으로 치환; 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 인슐린 B 쇄 변이의 5번째 아미노산이 히스티딘(His)에서 트레오닌(Thr)으로 치환; 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 인슐린 B 쇄 변이의 9번째 아미노산이 세린(Ser)에서 아스파르트산(Asp)으로 치환; 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 인슐린 B 쇄 변이의 13번째 아미노산이 글루탐산(Glu)에서 알라닌(Ala)으로 치환; 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 인슐린 B 쇄 변이의 17번째 아미노산이 루신(Leu)에서 글루타민(Gln)으로 치환; 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 인슐린 B 쇄 변이의 24번째 아미노산이 페닐알라닌(Phe)에서 세린(Ser)으로 치환된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산이 추가로 치환된 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 알부민 결합 도메인은 하기 아미노산 서열로 표시되는 알부민 결합 모티프를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
GVSDFYKKLIXaKAKTVEGVEALKXbXcI
상기에서, 서로 독립적으로,
Xa는 D와 E로부터 선택되고;
Xb는 D와 E로부터 선택되고;
Xc는 A 와 E로부터 선택된다.
본 발명의 일실시예에서, Xa는 D이고, Xb는 D이며, Xc는 A이다.
본 발명의 일 양태에 따른 일 실시형태에서, 상기 알부민 결합 도메인은 하기 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
LAX3AKX6X7ANX10ELDX14Y-[BM]-LX43X44LP
상기에서, [BM]은 상기에서 정의된 바와 같은 알부민 결합 모티프이고,
서로 독립적으로,
X3는 C, E, Q 및 S로부터 선택되고;
X6는 C, E 및 S로부터 선택되고;
X7는 A 및 S로부터 선택되고;
X10는 A, R 및 S로부터 선택되고;
X14는 A, C, K 및 S로부터 선택되고;
X43는 A 및 K로부터 선택되고;
X44는 A, E 및 S로부터 선택된다.
상기 알부민 결합 도메인은, 서열번호 6 내지 서열번호 13의 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 상기 알부민 결합 도메인은 바람직하게는 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 인슐린 복합체 또는 인슐린 아날로그 복합체는 B-chain - C-chain - A-chain 순서의 인슐린 또는 인슐린 아날로그에서, A-chain의 C-말단에 알부민 결합 도메인을 융합하는 것이 단백질 재접힘 수율, 효소처리 수율 및 인슐린 활성의 관점에서 바람직하다. 이 경우, A-chain과 알부민 결합 도메인은 링커에 의해 융합될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 인슐린 아날로그를 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 알부민 결합 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드는 상기 인슐린 아날로그와 알부민 결합 도메인이 융합되어 발현될 수 있도록 재조합 벡터에 도입된 것일 수 있다.
본 발명에 따른 인슐린 아날로그 복합체의 기능은 복합체의 삼차 구조에 따라 달라진다. 따라서, 본 발명에서 지속형 인슐린 아날로그 복합체는 그 기능에 영향을 미치지 않으면서 복합체를 구성하는 아미노산 서열에 작은 변화를 줄 수 있다. 그러므로, 본 발명은 알부민 결합 특성 및 효소 절단에 대한 높은 저항성을 유지하는 알부민 결합 도메인 또는 지속형 인슐린 아날로그 복합체의 변이체를 포함한다. 예를 들어, 아미노산 잔기의 특정 기능기 그룹에 속한(예를 들어, 소수성, 친수성, 극성 등) 아미노산 잔기는 같은 기능기에 속한 다른 아미노산 잔기로 치환될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "알부민 결합"과 "알부민에 대한 결합 친화성"은 예컨대, Biacore 기기에서와 같이 표면 플라즈몬(plasmon) 공명 기술을 사용하여 시험할 수 있는 폴리펩타이드 또는 단백질의 특성을 의미한다. 예를 들면, 알부민 결합 친화성은 알부민 또는 그의 단편을 기기의 센서 칩(sensor chip) 위에 고정하고, 테스트할 폴리펩타이드 또는 단백질을 포함하는 샘플을 그 칩으로 전달하는 실험에서 테스트할 수 있다.
다른 방법으로, 테스트할 폴리펩타이드 또는 단백질은 기기의 센서 칩 위에 고정하고, 알부민을 포함한 샘플 또는 그의 단편을 칩으로 전달한다. 이와 관련하여 알부민은 인간 혈청 알부민 같은 포유동물에서 유래한 혈청 알부민일 수 있다. 당업자는 상기 실험에 의해 얻어진 결과를 해석하여 알부민에 대한 폴리펩타이드 또는 단백질의 결합 친화성의 정량적인 측정을 확립할 수 있다. 예를 들어, 상호작용에 대한 KD값 측정 같은 정량적인 측정이 요구되는 경우, 표면 플라즈몬 공명 방법을 또한 수행할 수 있다. 예컨대, 결합 값은 Biacore2000 기기(Biacore AB)를 통해 정의할 수 있다. 알부민은 측정 센서 칩에 적절히 고정하고, 친화성을 측정할 폴리펩타이드 또는 단백질 샘플은 단계희석에 의해 준비하여 임의의 순서로 주입한다. 이어서 KD값은 예를 들어 기기제조업체(Biacore AB)에 의해 제공된 BIAevaluation 4.1 소프트웨어의 1:1 Langmuir 결합 모델을 사용하여 상기 결과로부터 계산할 수 있다.
본 발명의 일 실시형태에서, 인슐린 아날로그 복합체가 결합하는 알부민은 인간 혈청 알부민, 래트(rat) 혈청 알부민, 원숭이(cynomolgus) 혈청 알부민 및 마우스(mouse) 혈청 알부민으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
하나의 특정 실시형태에서, 인슐린 아날로그 복합체가 결합하는 알부민은 인간 혈청 알부민이다.
본 발명의 명세서에 있어서, 알부민 결합 모티프 및 알부민 결합 도메인(또는, 알부민 결합 폴리펩타이드)에 관한 설명은 국제공개특허 WO2014048977에 상응하는 대한민국 공개특허 10-2015-0058454호에 기재된 내용을 포함하는 것으로 한다.
상기 인슐린 아날로그와 알부민 결합 도메인은 펩타이드 결합; 폴리펩타이드 링커; 또는 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜-프로필렌 글리콜 공중합체, 폴리옥시에틸화폴리올, 폴리비닐알콜, 다당류, 덱스트란, 폴리비닐에틸에테르, 생분해성 고분자, 지방산, 뉴클레오티드, 지질중합체, 키틴, 히아루론산 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 비펩타이드성 링커를 통해 서로 결합된 것을 특징으로 할 수 있으나 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에서 인슐린 아날로그와 알부민 결합 도메인 사이에는 (GGGGS)n (여기서, n=1 내지 6의 정수) 서열이 반복된 링커가 삽입될 수 있다. 이는 링커가 도입되지 않으면 재접힘 수율이 낮았으나, (GGGGS) 서열이 2번 이상 반복될 경우 재접힘 수율에는 큰 차이를 보이지 않는다는 실험결과에 따른 것이다. 한편, n수가 증가할수록 클로스트리파인에 의한 활성형 인슐린 전환율이 높게 나타났으나 체내동태에는 큰 영향을 미치지 않았다. 상기와 같은 결과를 종합하면, 링커는 GGGGS 서열이 2 내지 4번 반복된 형태로 구성하는 것이 바람직하다.
따라서, 본 발명에서 인슐린 아날로그와 알부민 결합 도메인은 폴리펩타이드 링커에 의해 서로 결합될 수 있으며, 상기 폴리펩타이드 링커는 (GGGGS)n (n은 1 내지 6의 정수)일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 바람직하게, 상기 폴리펩타이드 링커는 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시될 수 있다.
본 발명에서, 상기 클로스트리파인과의 반응시 환원제를 첨가하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 환원제는 시스테인(cysteine), b-머캅토에탄올(b-mercaptoethanol), TCEP, GSH 및 DTT로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 상기 환원제로는 0.1~0.5 mM의 DTT를 첨가하는 것이 바람직하며, 0.1~0.4 mM의 DTT를 첨가하는 것이 더욱 바람직하다.
상기 DTT는 인슐린 아날로그 복합체가 클로스트리파인과 반응하는 초기, 즉 반응 개시 시점에 1회만 첨가할 수 있고, 반응 개시 시점에 첨가한 후, 2~5회 추가로 첨가할 수 있으나, 인슐린 아날로그 복합체와 클로스트리파인과의 반응 초기에 첨가하고, 반응 3~6시간 후 추가로 첨가하는 것이 생산 공정의 간편성 및 효율성에서 가장 바람직하다. 상기 클로스트리파인은 각 첨가시 단백질 1 mg 당 0.1~5 Unit의 농도로 첨가할 수 있으며, 바람직하게는 0.5~2 Unit의 농도로 첨가할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에서, 상기 인슐린 아날로그 복합체는 클로스트리파인과 반응시 또는 클로스트리파인과 반응 이후 카르복시펩티다아제 B(carboxypeptidase B, 이하 CpB)를 첨가하여 CpB와 추가로 반응시키는 것을 특징으로 할 수 있다. 이 경우, CpB는 인슐린 아날로그 복합체는 클로스트리파인과 반응을 개시하는 시점에 함께 첨가될 수 있다.
본 발명에서, 상기 클로스트리파인 및/또는 CpB는 pH 6~9, 바람직하게는 6.5~7.5인 조건에서 반응시키는 것을 특징으로 할 수 있으며, 4~40℃, 바람직하게는 30~40℃인 온도 조건에서 반응시키는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
상기 CpB는 단백질 1 mg 당 0.001~1 Unit의 농도로 첨가할 수 있으며, 바람직하게는 0.001~0.1 Unit의 농도로 첨가할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 방법으로 제조된 활성형 활성형 인슐린 아날로그 복합체에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 인슐린 아날로그 복합체는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 재조합 벡터 형태로 숙주 세포에 도입된 재조합 미생물을 배양한 후, 이를 파쇄하고 정제하여 수득된 것일 수 있다.
본 발명에서 재조합 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있고, 원핵세포 또는 진핵세포를 숙주세포로 사용하기 위한 벡터로서 구축될 수 있다.
본 발명에서 용어, "벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 재조합 벡터로서, 핵산 삽입물이 발현되도록 작동 가능하게 연결된 필수적인 조절요소를 포함하는 핵산 구조물(construct)을 의미한다. 본 발명은 인슐린 아날로그 복합체를 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 벡터를 제조할 수 있는데, 상기 재조합 벡터를 숙주세포에 형질전환(transformation) 또는 형질감염(transfection) 시킴으로써, 본 발명의 인슐린 아날로그 복합체를 수득할 수 있다.
본 발명에서 인슐린 아날로그 및/또는 이의 아날로그 복합체를 코딩하는 핵산은 핵산 발현 조절서열에 작동 가능하게 연결된다. 본 발명에서 용어, "작동 가능하게 연결된(operatively linked)"은 핵산 발현 조절서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 라이보좀 결합부위, 전사 종결서열 등)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.
본 발명에서 용어, "프로모터"는 폴리머라제에 대한 결합 부위를 포함하고 프로모터 하위 유전자의 mRNA로의 전사 개시 활성을 가지는, 코딩 영역의 상위(upstream)의 비해독된 핵산 서열, 즉, 폴리머라제가 결합하여 유전자의 전사를 개시하도록 하는 DNA 영역을 말하며, mRNA 전사 개시부위의 5'-부위에 위치한다.
예를 들어, 본 발명의 벡터가 재조합 벡터이고 원핵세포를 숙주로 하는 경우에, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예: tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, pLλ프로모터, pRλ프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로모터, trp 프로모터, trc 프로모터, phoA 프로모터, araBAD 프로모터, T5 프로모터 및 T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합부위 및 전사/해독 종결서열을 포함하는 것이 일반적이다.
또한, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드(예: pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈, pPICZα 시리즈, pUC19 등), 파지(예: λgt4·λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스(예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
한편, 본 발명의 벡터가 재조합 벡터이고 진핵세포를 숙주로 하는 경우에, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터(예: 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 우두바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열(예: 소성장 호르몬 터미네이터 및 SV40 유래 폴리 아데닐화 서열)을 일반적으로 갖는다.
또한, 본 발명의 재조합 벡터는 선택 마커로서 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 사용될 수 있다.
본 발명의 재조합 벡터는 회수되는 목적 단백질, 즉 인슐린 및/또는 이의 아날로그의 정제를 용이하게 하기 위하여 필요에 따라 다른 서열을 추가로 포함할 수 있다. 상기 추가로 포함될 수 있는 서열은 단백질 정제용 태그 서열일 수 있으며, 예컨대, 글루타티온 S-트랜스퍼라제(Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질(NEB, USA), FLAG(IBI, USA) 및 6개 히스티딘(hexahistidine) 등이 있으나, 상기 예들에 의하여 목적 단백질의 정제를 위하여 필요한 서열의 종류가 제한되는 것은 아니다. 상기와 같은 태그 서열을 포함하는 재조합 벡터에 의해 발현된 융합 단백질은 친화성 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다. 예컨대, 글루타티온-S-트랜스퍼라제가 융합된 경우에는 이 효소의 기질인 글루타티온을 이용할 수 있고, 6개 히스티딘 태그가 이용된 경우에는 Ni-NTA 칼럼을 이용하여 원하는 목적 단백질을 용이하게 회수할 수 있다. 상기 인슐린 아날로그 및/또는 이의 아날로그 복합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 이용하여, 상기 벡터가 형질전환된 형질전환체가 구축될 수 있다.
본 발명에서 용어, "형질전환(transformation)"이란 DNA를 숙주세포 내로 도입하여 DNA가 염색체의 인자로서 또는 염색체 통합 완성에 의해 복제 가능하게 되는 것으로, 외부의 DNA를 세포 내로 도입하여 인위적으로 유전적인 변화를 일으키는 현상을 의미한다.
본 발명의 형질전환 방법은 임의의 형질전환 방법이 사용될 수 있으며, 당업계의 통상적인 방법에 따라 용이하게 수행할 수 있다. 일반적으로 형질전환 방법에는 CaCl2 침전법, CaCl2 침전법에 DMSO(dimethyl sulfoxide)라는 환원물질을 사용함으로써 효율을 높인 Hanahan 방법, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘 침전법, 원형질 융합법, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반법, 아그로박테리아 매개 형질전환법, PEG를 이용한 형질전환법, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환법 등이 있다.
본 발명에 따른 인슐린 아날로그 및/또는 이의 아날로그 복합체를 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 벡터를 형질전환시키기 위한 방법은 상기 예들에 국한되지 않으며, 당업계에서 통상적으로 사용되는 형질전환 또는 형질감염 방법이 제한 없이 사용될 수 있다.
본 발명에서는 목적 핵산인 인슐린 아날로그 복합체를 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 벡터를 숙주세포 내로 도입함으로써 본 발명의 형질전환체(transformant)를 획득할 수 있다.
본 발명에 적합한 숙주는 본 발명의 핵산을 발현하도록 하는 한 특별히 제한되지 않는다. 본 발명에 사용될 수 있는 숙주의 특정한 예로는 대장균(E. coli)과 같은 에스케리키아(Escherichia) 속 세균; 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)와 같은 바실러스(Bacillus) 속 세균; 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)와 같은 슈도모나스(Pseudomonas) 속 세균; 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)와 같은 효모; 스포도프테라 프루기페르다(SF9)와 같은 곤충세포; 및 CHO, COS, BSC 등과 같은 동물세포가 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 "활성형"이란 인슐린, 인슐린 아날로그 또는 인슐린 아날로그 복합체가 생체 내에서 혈당량을 조절할 수 있는 성숙한 형태를 의미하며, 프로인슐린의 형태에서 C-펩타이드가 절단되고 인슐린의 A 쇄와 B 쇄를 포함하는 인슐린, 인슐린 아날로그 또는 인슐린 아날로그 복합체를 나타낸다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예에서, ABD-융합 인슐린 아날로그는 본 발명에서 지속형 인슐린 아날로그 복합체와 동일한 의미로 사용된다.
실시예 1. ABD-융합 인슐린의 발현 벡터 및 균주 제작
인간의 인슐린은 프리프로인슐린(pre-pro-insulin) 형태로 만들어져 소포체에서 프리-서열(pre sequence)이 잘려나가고, 골지체와 소포 내에서 프로세싱되어 성숙된 형태의 인슐린을 형성하게 된다. 이를 응용하여 프로인슐린 형태로 대장균에서 단백질을 발현시킨 후 트립신을 이용하여 C 쇄를 잘라내는 공정으로 재조합 인슐린을 생산하고자, 프로인슐린을 설계하였다. 대장균에서 프로인슐린의 발현 및 정제 효율을 높이기 위하여 N-말단에는 융합 태그(fusion tag)를 삽입하였고, 코돈 최적화(codon optimization)하였다.
인슐린에 ABD(albumin biding domain)를 융합시킬 수 있는 부위는 이론적으로 4개 부위이지만, A 쇄의 N 말단은 인슐린의 활성에 중요한 위치이므로 융합 위치에서 제외하였고, B 쇄의 N 말단은 인슐린 헥사머 형성에 중요하지만 인슐린의 활성은 유지될 수 있으므로 융합 위치에 포함시켰다. 인슐린 B 쇄와 C 쇄 사이에 ABD가 삽입되는 경우 단백질 폴딩에 영향을 줄 것으로 판단되어 이러한 구조는 배제하였으며, 이에 B-C-A 쇄 혹은 A-C-B 쇄의 순서로 후보물질을 디자인하였고, 최종적으로 하기 3가지 형태로 ABD-융합 인슐린의 발현을 위한 유전자 구조를 설계하였다.
Figure PCTKR2019008958-appb-I000001
발현 벡터로는 pJ401(DNA 2.0) 벡터를 사용하였으며 벡터를 제한효소 NdeI과 EcoRI으로 절단한 후, 1% 아가로스 겔 상에서 전기영동하여 DNA 절편을 분리하였다. ABD-융합 인슐린 발현을 위한 상기 유전자 구조와 상기와 같이 발현 벡터에서 얻은 DNA 절편을 T4 DNA 리가제로 연결하여 플라스미드를 제작한 후, 염화칼슘법으로 각 플라스미드를 도입하여 대장균 BL21(DE3)을 형질전환 시켰다. 카나마이신에 저항성을 지닌 형질전환된 균주를 선별하고 플라스미드 DNA를 분리하여, 제한효소 절단에 의한 분석방법으로 원하는 DNA가 제대로 삽입되었는지를 확인하였다.
NdeI - Fusion tag - ABD - Linker - B-chain - C-chain - A-chain - EcoRI 유전자 구조로 설계하였을 경우 단백질 재접힘 수율이 매우 낮아 본 발명에 적합하지 않은 것으로 판단되었다. NdeI - Fusion tag - A-chain - C-chain - B-chain - Linker - ABD - EcoRI 구조의 유전자로 ABD-융합 인슐린을 제조하였을 경우 인슐린의 활성은 확인되었으나, 재접힘과 효소처리 수율이 낮아 활성형 인슐린 제조방법으로 적절치 않음을 확인하였다. 그러므로 상기 3가지 형태의 ABD-융합 인슐린 중, NdeI - Fusion tag - B-chain - C-chain - A-chain - Linker - ABD - EcoRI 구조를 선택하여 이후 실험을 진행하였다.
A 쇄와 알부민 결합 도메인(ABD) 사이에는 (GGGGS) 서열 1 내지 6회 반복된 링커를 삽입하였다. 이 경우, 링커가 없으면 재접힘 수율이 매우 낮았었고 (GGGGS) 서열이 2번 이상 반복될 경우 재접힘 수율에는 큰 차이를 보이지 않았다. 한편, (GGGGS)n 서열에서 n수가 증가할수록 클로스트리파인에 의한 활성형 인슐린 전환율이 높아졌으나 체내동태에는 큰 영향을 미치지 않았다. 이상 결과를 종합하여 링커는 GGGGS 서열이 2~4번 반복된 형태로 구성 하였다.
본 발명에서 사용된 ABD-융합 인슐린을 구성하는 해당 부위의 아미노산 서열은 하기와 같다.
Figure PCTKR2019008958-appb-T000001
실시예 2. 인슐린 아미노산 서열이 변경된 ABD-융합 인슐린 아날로그 제작
재조합 대장균를 이용한 인슐린 제조에는 트립신을 이용하여 프로인슐린을 활성형으로 전환하는 과정이 필수적이다. 그러나 트립신은 이염기성(di-basic) 아미노산을 높은 효율로 절단하며 단일 아미노산인 라이신(Lys)이나 아르지닌(Arg) 부위도 절단하기 때문에 온전한 활성형의 인슐린을 제조하기 어렵고, ABD 서열 내에도 다수의 라이신(Lys)과 아르지닌(Arg) 잔기가 포함되어 있어 트립신을 이용하여 활성을 갖는 온전한 ABD-융합 인슐린을 제조하는 것은 더욱 어렵다.
이에 트립신을 대체할 수 있는 효소로 클로스트리파인(clostripain)을 활용하여 활성형 전환을 유도하고자 하였다. 이 경우, 클로스트리파인은 ABD-융합 인슐린과 반응하면 인슐린 B 쇄의 22번 위치의 아르지닌(Arg)에 절단이 발생하였다. 이를 해결하고자, B 쇄 22번 위치를 라이신(Lys)으로 치환한 결과 클로스트리파인에 의한 인슐린 절단이 현저히 감소하여 ABD가 융합된 활성형 인슐린을 효과적으로 제조할 수 있었다(도 1).
상기 변이와 더불어, ABD-융합 인슐린의 안정성과 생체 내 반감기를 보다 향상시키기 위하여 인슐린에 추가 변이를 도입하였다. A 쇄와 B 쇄에 각각 5개의 아미노산을 치환하였으며, 치환된 위치는 하기 표 2와 같다.
Figure PCTKR2019008958-appb-T000002
대장균에서 유전자 발현을 위한 코돈 최적화는 GeneArt사의 알고리즘에 따라 수행하였으며 치환된 아미노산을 갖도록 유전자를 합성하였다.
이와 같이 제작된 플라스미드는 실시예 1에 기재된 방식과 동일하게 대장균 BL21(DE3)에 도입하여 재조합 대장균을 제작하였다.
실시예 3. ABD-융합 인슐린 아날로그의 발현
ABD-융합 인슐린 아날로그의 발현을 위하여, 각 재조합 대장균 균주를 100 mL LB 배지에 접종하고 37℃에서 16시간 동안 진탕 배양하여 종 배양액으로 사용하였다. 7 L 발효기(New Brunswick BioFlo)에 2 L의 LB 배지를 넣고 멸균 후 종 배양액을 접종하였다. 배양 시 조건은 온도 35℃공기량 3 vvm, 교반 속도 1,000 rpm로 하고, pH는 6.8이 유지되도록 암모니아와 인산으로 조절하였다. 배지의 탄소원이 고갈될 시점에 feeding을 시작하고 동시에 IPTG로 단백질 발현을 유도하였다. 발현 유도 후 10시간 추가 배양하였고 원심 분리기를 이용하여 재조합 균체를 회수하였다.
ABD-융합 인슐린 아날로그는 대장균에서 봉입체 (inclusion body)로 발현되었으며 인슐린 부위 아미노산 부위의 변이를 도입하여도 본 발명에서 사용하는 벡터시스템 내에서 유사한 발현수준을 나타내었다(도 2).
실시예 4. 세포 파쇄 및 가용화/재접힘 유도
ABD-융합 인슐린 또는 ABD-융합 인슐린 아날로그를 발현하는 균체를 각각 파쇄버퍼 (20 mM Tris, 10 mM EDTA, 10% sucrose, 0.2 M NaCl, pH 8.0)에 현탁하고 고압균질기를 이용하여 세포를 파쇄하였다. 파쇄액을 고속 원심분리기에서 7,000 rpm으로 원심분리하고, 용해성 단백질과 일부 세포파편을 제거하여, 봉입체가 포함된 침전물을 분리하였다. 분리된 봉입체는 1% Triton X-100, 0.2 M NaCl, 1M Urea를 포함하는 버퍼에 세척한 후, 7,000 rpm에서 원심분리 하였다. 침전된 봉입체는 증류수로 2회 추가 세척한 후 사용시까지 -80℃에 보관하였다.
냉동 보관한 봉입체를 가용화 버퍼 (25 mM Tris, 8 M Urea, 30 mM cysteine-HCl, pH 10.5)에 넣어 용해시킨 후 재접힘 버퍼(25 mM Tris-HCl, pH 10.5)에 희석하고 4 ℃에서 16 시간 재접힘을 수행하였다. 재접힘 여부는 RP-HPLC 분석을 통하여 확인하였는데, 가용화 용액을 RP-HPLC에서 분석시 소수성이 높아 20분대에서 단백질 피크가 관찰되었고, 재접힘액은 16분대로 피크가 이동함을 관찰하였다(도 3). 이는 재접힘이 진행되면 가용화 상태에 비해 소수성이 감소하기 때문이다. 재접힘은 RP-HPLC분석시 단백질 피크의 이동이 더 이상 관찰되지 않을 때까지 진행하였다.
실시예 5. 효소를 이용한 활성형 전환
재조합 대장균을 이용한 인슐린의 제조에는 트립신을 이용한 프로인슐린의 활성형으로의 전환이 요구되나, ABD-융합 인슐린 또는 ABD-융합 인슐린 아날로그는 그 서열 내에 트립신에 의한 다수의 절단 부위를 가지고 있으므로, 트립신을 대체 가능한 효소로 클로스트리파인(clostripain)을 이용하여 활성형 전환을 유도하고자 하였다.
클로스트리파인을 이용하여 활성형 전환을 유도할 때, ABD-융합 인슐린에서 특이적으로 인슐린 B 쇄의 22번 위치에서 절단이 일어나 온전한 형태의 인슐린을 제조하기 어렵기 때문에, B 쇄 22번 위치를 아르지닌(Arg)에서 라이신(Lys)으로 치환한 ABD-융합 인슐린 아날로그를 활용하여 활성형의 인슐린을 제조하고자 하였다. 한편, 이하 모든 실험은 특별한 언급이 없는 경우 ABD-융합 인슐린 아날로그 4를 이용하여 실험을 진행하였다.
클로스트리파인은 활성 부위에 시스테인(Cys)을 포함하고 있어 효소의 활성을 보이기 위해서는 환원조건을 필요로 한다. 또한, 클로스트리파인 활성 유지를 위해 재접힘 용액에 환원제를 처리한다면 인슐린 부위의 이황화 결합이 끊어질 가능성이 높다. 이에 이황화 결합의 절단 없이 효소반응 수율을 높이는 조건 도출이 요구되는바, 효소반응액에 포함될 환원제인 DTT를 사용하여 처리 농도와 추가 처리에 대한 조건을 실험하였다.
전구체 형태의 ABD-융합 인슐린 아날로그를 활성형으로 전환 시키기 위해서는 추가적으로 카르복시펩티다아제 B(carboxypeptidase B, CpB)도 필요로 한다. CpB는 카르복시 말단의 염기성 아미노산을 절단하는 효소로 그 상세 조건도 함께 실험하였다. 구체적으로는 클로스트리파인과 CpB의 처리시간, 동시처리 가능 여부, 효소처리 양, 효소처리 시간 및 적정 pH를 평가하였다.
클로스트리파인은 전구체(pro-form) 형태로 존재하기 때문에 자가절단(auto-cleavage)를 유도하여 활성화시켰다. 이를 위해서 동결 건조된 클로스트리파인(Worthington, USA)을 증류수에 녹인 후 활성화 버퍼 (500 mM Tris, 50 mM DTT, 25 mM CaCl2 pH 7.8)를 가하여 4 ℃에서 30분간 활성화 하였다. 재접힘된 단백질 1 mg당 0.1~5 unit 되도록 활성화된 클로스트리파인을 첨가하고 25~40℃에서 2~8시간 반응시켰다. 클로스트리파인 반응 후 CpB를 단백질 1 mg당 0.001~1 unit 되도록 첨가하여 추가 반응하였다. 효소반응은 HCl을 이용하여 pH를 3.5 이하로 낮추어 중단되도록 하였다.
5-1. DTT 첨가에 따른 활성형 전환 효율 평가
클로스트리파인과 CpB에 대한 효소 반응 조건을 확인하고자, DTT 농도를 0~0.4mM이 되도록 재접힘 용액에 첨가한 후, 클로스트리파인에 의한 활성형 인슐린의 생성 정도를 SDS-PAGE로 관찰하였다. 0.5 mM 농도를 초과하는 DTT를 첨가할 경우 인슐린 A 쇄와 B 쇄 사이의 이황화 결합(disulfide bond)이 끊어지는 것을 확인하였다 (결과 미첨부).
한편, 도 4에서 볼 수 있듯이, 효소 반응액에 DTT를 첨가하지 않으면 ABD-융합 인슐린 아날로그의 활성형으로 전환율이 낮지만, DTT 농도가 증가할수록 활성형으로의 전환 수율이 증가함을 확인할 수 있었다.
5-2. CpB 첨가 시기에 따른 활성형 인슐린 전환 효율 평가
ABD-융합 프로인슐린 아날로그를 활성형으로 전환하기 위해서는 클로스트리파인과 CpB를 모두 처리하여야 하는데, 이 때 CpB 첨가 시기에 대해 확인해 보고자 하였다. 인슐린 C-펩타이드와 융합 태그(fusion tag)를 절단하기 위하여 클로스트리파인을 먼저 처리하고 잘린 부위의 아르지닌(Arg)을 제거하기 위해 CpB를 처리하는 순서로 진행하여야 하나, 제조 시간을 단축하기 위하여 클로스트리파인 처리 후 2시간 또는 4시간 후 CpB를 처리하는 조건과 클로스트리파인과 CpB를 동시에 처리하는 조건을 비교하였다.
그 결과, 도 5에서 볼 수 있듯이, 클로스트리파인과 CpB를 동시에 처리하여도 클로스트리파인을 먼저 처리하는 조건에 비해 효소 반응 양상이 다르지 않은 것으로 확인된바, 공정의 효율성 향상을 위하여 클로스트리파인과 CpB를 동시에 처리하기로 하였다.
5-3. 클로스트리파인과 CpB 동시 처리시 pH 조건
클로스트리파인의 최적 활성은 pH 7.4~7.8, CpB는 pH 9.0에서 최적 활성을 나타내는 것으로 알려져 있다. 두 효소의 최적 pH 범위가 다르므로, 동시에 처리하여 활성형 인슐린 전환 효율을 최대로 나타내는 pH를 확인하고자 하였다. 본 발명에서 표 2에 따른 모든 ABD-융합 인슐린 아날로그의 이론적 pI 값이 6에 가까워 침전이 우려되었다. 이에 pH 6.0이하의 조건은 제외하였고 pH 9.0이상 에서는 침전물(aggregate)이 증가하여 평가 범위는 pH 6.0~9.0 사이로 진행되었다.
pH 6.5~8.5 범위에서 두 효소를 동시에 처리하는 경우 높은 활성형 인슐린 전환 효율을 나타냈으나, 도 6에 나타난 바와 같이, pH 6.5~7.5 범위에서 활성형 인슐린 전환 효율이 특히 높은 것으로 확인되었다.
5-4. 클로스트리파인 및 DTT 추가 첨가에 따른 활성형 인슐린 전환 효율 평가
실시예 5-1에서 확인된 바와 같이 DTT를 첨가하는 경우 클로스트리파인에 의한 활성형 인슐린 전환 효율이 증가한다. 그러나 DTT의 반감기는 높은 pH와 온도에서 급격하게 짧아지는 것으로 알려져 있어 장시간의 효소 반응에서 클로스트리파인의 활성을 유지하기 어려운 것으로 판단되었다. 이에 클로스트리파인의 활성을 장시간 유지할 수 있는 방법을 탐색하고자 하였다.
이를 위하여 효소 반응 시작 시점부터 4.5시간 후 1 U/mg의 클로스트리파인을 추가로 첨가하는 방법과 0.2 mM의 DTT를 추가로 첨가하는 방법을 비교 평가한 결과, 도 7에 나타난 것과 같이 클로스트리파인을 추가로 첨가하여도 추가적인 활성형 전환 수율은 크게 증가하지 않았으나, DTT를 추가로 첨가하자 클로스트리파인의 첨가 없이도 활성형으로 전환되는 정도가 크게 증가하였다. 추가로 클로스트리파인과 DTT를 둘 다 첨가한 경우에는 상대적으로 미전환형이 적고, 활성형으로 전환수율이 높아진 것으로 관측되었다.
효소 반응액을 질량분석기를 통해 분석한 결과, DTT를 첨가하는 경우 활성형 인슐린의 전환 정도를 크게 증가시켰으나, DTT와 클로스트리파인을 동시에 추가하는 경우에는 오히려 인슐린의 비특이적 절단을 유도하여 불순물이 증가하는 것으로 나타나, 환원제인 DTT만 첨가하는 것이 인슐린의 활성형 전환에 유리함을 확인할 수 있었다(도 8 참조).
5-5. 온도에 따른 활성형 인슐린 전환 효율 평가
클로스트리파인과 CpB가 최적 활성을 보이는 온도범위를 확인하고자 하였다. 이때 생산스케일에서의 공정운영을 감안하여 4℃ 이하의 온도, 40℃ 이상의 온도 조건을 배제하고 10~30℃ 조건에서 평가하였다. 그 결과, 도 9에서와 같이, 10℃, 20℃, 30℃로 온도가 높아짐에 따라 미전환형이 적고, 활성형으로의 전환이 빠르게 진행되는 것을 알 수 있었다. 또한, DTT의 농도가 높을수록 활성형으로의 전환이 더 빠르게 진행되는 것을 확인하였다.
실시예 6. ABD-융합 인슐린 아날로그 정제
클로스트리파인과 CpB를 이용하여 효소처리된 샘플을 Fractogel® EMD COO- (M) (Merck사) 이온교환 수지 크로마토그래피를 사용하여 제조자 방식에 따라 1차 정제한 후 Pharmprep® P100 RP-18e (Merck사)을 역상 크로마토그래피로 사용하여 제조자 방식에 따라 2차 정제하였다.
그 결과, 도 10에서와 같이 2번의 정제 과정을 통해 활성형 ABD-융합 인슐린 아날로그를 정제할 수 있었다.
실시예 7. ABD-융합 인슐린 아날로그의 알부민 결합력 측정
ABD-융합 인슐린 아날로그 단백질의 알부민 결합력을 측정하기 위하여, 표면 플라스몬 공명 분석법을 이용하였다. CM5칩에 재조합 인간 혈청 알부민을 아민 커플링 방법으로 고정화 시키고, 5개 이상의 농도로 희석한 ABD 또는 ABD-융합 인슐린 아날로그를 결합시켜 인간 혈청 알부민에 대한 친화도를 확인하였다.
그 결과, 하기 표 3에서와 같이, ABD 대비 친화도가 낮아졌으나 pM 수준의 알부민 결합력이 유지됨을 확인할 수 있었다.
Figure PCTKR2019008958-appb-T000003
실시예 8. 천연형 인슐린, ABD-융합 인슐린 아날로그의 수용체 친화도 비교
천연형 인슐린, ABD-융합 인슐린 아날로그의 인슐린 수용체 결합력을 측정하기 위하여, 표면 플라스몬 공명 분석법을 이용하였다. CM5칩에 인슐린 수용체를 아민 커플링 방법으로 고정화 시키고, 5개 이상의 농도로 희석한 천연형 인슐린, ABD-융합 인슐린 아날로그를 각각 결합시켜 인슐린 수용체 친화도를 확인하였다.
그 결과 표 4에 나타난 바와 같이, 천연형 인슐린 대비 대부분의 ABD-융합 인슐린 아날로그의 친화도가 감소되었는데 가장 큰 감소폭을 보이는 아날로그 3이 천연형 인슐린 대비 19.4% 수준으로 확인되었다.
Figure PCTKR2019008958-appb-T000004
ABD-융합 인슐린 아날로그의 약효는 streptozotocin로 유도한 1형 당뇨모델에서 인슐린 글라진과 비교 평가하였다. 인슐린 글라진 대비 50% 이하의 혈당 강하능을 보이는 아날로그 1번과 3번 그리고 10번은 후보물질에서 제외하였다.
실시예 9. Hexamer 형성
인슐린은 체내에서 아연(zinc)과 결합하여 헥사머(hexamer)를 형성함으로써 안정된 구조를 갖는다. 헥사머(Hexamer)를 이루는 인슐린의 특성은 제형연구에도 활용되며 체내의 반감기를 증대 시키는데 중요한 역할을 할 수 있다. 이에 ABD-융합 인슐린 아날로그가 헥사머(hexamer) 형성의 특성을 유지하고 있는지 크기 배제 크로마토그래피 (size exclusion chromatography)로 분석하였다. 그 결과, 아날로그 4는 아연(zinc)과 페놀(phenol) 첨가에 따라 헥사머(hexamer)를 형성능을 유지하고 있음을 확인하였다(도 11). Hexamer의 형성은 아날로그 7번, 9번, 10번을 제외하고 모든 아날로그에서도 확인되었다. 이에, 표 2의 서열을 가진 아날로그 중 아날로그 7번과 9번은 hexamer를 형성하지 않는 것으로 확인되어 후보물질에서 추가로 제외하였다.
실시예 10. ABD-융합 인슐린 아날로그의 체내동태 (pharmacokinetics) 및 혈당 강하능 평가
ABD-융합 인슐린 아날로그 6종의 체내동태를 확인하기 위해 정상 랫트 (SD rat, 6주령)에 피하 투여한 후 0, 1, 4, 8, 24, 48, 72, 96 시간에 채혈하였다. 각 시간에서의 ABD-융합 인슐린 아날로그의 혈중 내 잔여 농도는 ELISA를 이용하여 측정하였다. 또한, 채혈된 일부의 혈액을 이용하여 시간에 따른 혈당 수준을 혈당측정기를 이용하여 측정하였다.
그 결과, 하기 표 5에서 볼 수 있듯이, 천연형 인슐린의 반감기는 5분으로 알려져 있는 것과 비교하여 ABD가 융합된 인슐린 아날로그는 크게 증가된 반감기를 나타냈다. 인슐린 B쇄 22번만 치환한 아날로그 11은 7.2 시간의 반감기를 보였으며, 가장 큰 반감기 증대를 보인 아날로그 4는 9.9시간의 반감기를 갖는 것으로 평가 되었다.
정상 동물에서 혈당을 낮추어 유지시키는 시간을 분석했을 때, 아날로그 5번, 6번, 8번은 반감기의 증대가 확인되었지만 혈당 유지시간이 짧은 것으로 나타났다. 이에 반해 아날로그 4는 혈당을 낮추는 능력도 가장 우수하였으며 약효 유지시간도 가장 오래 지속되는 것을 확인하였다 (도 12).
Figure PCTKR2019008958-appb-T000005
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 청구항들과 그들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
본 발명에 따른 활성형 인슐린 아날로그 복합체 제조방법은 종래 트립신을 이용하는 프로인슐린의 활성형 전환 방법에 의해 알부민 결합 도메인도 함께 절단되어 본 발명자들에 의해 개발된 신규한 지속형 인슐린 아날로그 복합체의 활성형으로의 전환이 어려운 문제점이 있었다. 이러한 문제점을 극복하기 위하여, 신규 지속형 인슐린 아날로그 복합체의 활성형으로의 전환을 위하여 클로스트리파인을 이용하였고, 이는 당뇨병의 지속형 치료제 생산에 유용하게 활용될 수 있다.
전자파일 첨부하였음.

Claims (18)

  1. 천연형 인슐린에서 인슐린 B 쇄의 22번째 아미노산이 아르지닌(Arg)에서 라이신(Lys)으로 치환된 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 인슐린 B쇄 변이를 포함하는 인슐린 아날로그와 알부민 결합 도메인이 결합되어 있는 인슐린 아날로그 복합체를 클로스트리파인과 반응시키는 단계;를 포함하는 지속형 인슐린 아날로그 복합체의 활성형 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 인슐린 아날로그는 하기 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산이 추가로 치환된 것을 특징으로 하는 제조방법:
    서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 인슐린 A 쇄의 3번째 아미노산이 발린(Val)에서 루신(Leu)으로 치환;
    서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 인슐린 A 쇄의 8번째 아미노산이 트레오닌(Thr)에서 아스파르트산(Asp)으로 치환;
    서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 인슐린 A 쇄의 10번째 아미노산이 이소루신(Ile)에서 라이신(Lys)으로 치환;
    서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 인슐린 A 쇄의 14번째 아미노산이 티로신(Tyr)에서 글루탐산(Glu)으로 치환;
    서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 인슐린 A 쇄의 19번째 아미노산이 티로신(Tyr)에서 페닐알라닌(Phe)으로 치환;
    서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 인슐린 B 쇄 변이의 5번째 아미노산이 히스티딘(His)에서 트레오닌(Thr)으로 치환;
    서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 인슐린 B 쇄 변이의 9번째 아미노산이 세린(Ser)에서 아스파르트산(Asp)으로 치환;
    서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 인슐린 B 쇄 변이의 13번째 아미노산이 글루탐산(Glu)에서 알라닌(Ala)으로 치환;
    서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 인슐린 B 쇄 변이의 17번째 아미노산이 루신(Leu)에서 글루타민(Gln)으로 치환; 및
    서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 인슐린 B 쇄 변이의 24번째 아미노산이 페닐알라닌(Phe)에서 세린(Ser)으로 치환.
  3. 제1항에 있어서, 상기 알부민 결합 도메인은 하기 아미노산 서열로 표시되는 알부민 결합 모티프를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
    GVSDFYKKLI XaKAKTVEGVE ALKXbXcI
    상기에서, 서로 독립적으로,
    Xa는 D와 E로부터 선택되고;
    Xb는 D와 E로부터 선택되고;
    Xc는 A와 E로부터 선택된다.
  4. 제3항에 있어서, 상기 알부민 결합 도메인은 하기 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
    LAX3AKX6X7ANX10ELDX14Y-[BM]-LX43X44LP
    상기에서, [BM]은 제3항에서 정의된 바와 같은 알부민 결합 모티프이고,
    서로 독립적으로,
    X3는 C, E, Q 및 S로부터 선택되고;
    X6는 C, E 및 S로부터 선택되고;
    X7는 A 및 S로부터 선택되고;
    X10는 A, R 및 S로부터 선택되고;
    X14는 A, C, K 및 S로부터 선택되고;
    X43는 A 및 K로부터 선택되고;
    X44는 A, E 및 S로부터 선택된다.
  5. 제4항에 있어서, 상기 알부민 결합 도메인은, 서열번호 6 내지 서열번호 13의 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 알부민 결합 도메인은 서열번호 6의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 인슐린 아날로그와 알부민 결합 도메인은 펩타이드 결합; 폴리펩타이드 링커; 또는 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜-프로필렌 글리콜 공중합체, 폴리옥시에틸화폴리올, 폴리비닐알콜, 다당류, 덱스트란, 폴리비닐에틸에테르, 생분해성 고분자, 지방산, 뉴클레오티드, 지질중합체, 키틴, 히아루론산 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 비펩타이드성 링커를 통해 서로 결합된 것을 특징으로 하는 제조방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 폴리펩타이드 링커는 (GGGGS)n (n은 1 내지 6의 정수)인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 폴리펩타이드 링커는 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 클로스트리파인과의 반응시 환원제를 첨가하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 환원제는 시스테인(cysteine), b-머캅토에탄올(b-mercaptoethanol), TCEP(Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride), GSH(Glutathione) 및 DTT(Dithiothreitol )로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  12. 제10항에 있어서, 상기 환원제로 0.1~0.5 mM의 DTT를 첨가하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 DTT는 인슐린 아날로그 복합체와 클로스트리파인과의 반응 초기에 첨가하고, 반응 3~6시간 후 추가로 첨가하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  14. 제1항에 있어서, 상기 클로스트리파인과의 반응시 또는 클로스트리파인과의 반응 이후 카르복시펩티다아제 B(carboxypeptidase B, CpB)를 첨가하여 반응시키는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 클로스트리파인 및/또는 카르복시펩티다아제 B(carboxypeptidase B, CpB)는 pH 6.0~9.0인 조건에서 반응시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 클로스트리파인 및/또는 카르복시펩티다아제 B(carboxypeptidase B, CpB)는 pH 6.5~7.5인 조건에서 반응시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제14항에 있어서, 상기 클로스트리파인 및/또는 카르복시펩티다아제 B(carboxypeptidase B, CpB)는 4~40℃인 조건에서 반응시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 제조방법으로 제조된 활성형의 지속형 인슐린 아날로그 복합체.
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