KR20200017079A - 클로스트리파인을 이용한 지속형 인슐린 아날로그 복합체의 활성형 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 인슐린 B 쇄의 22번째 아미노산을 아르지닌(Arg)에서 라이신(Lys)으로 치환하여 클로스트리파인과 반응하더라도 인슐린 B 쇄의 절단 없이 활성형으로의 전환이 가능한 지속형 인슐린 아날로그 복합체의 활성형 제조방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 제조방법은 종래 트립신을 이용하는 프로인슐린의 활성형 전환 방법에 의해 알부민 결합 도메인이 절단되어 지속형 인슐린 아날로그 복합체의 활성형으로의 전환이 어려운 점을 극복하였으며, 따라서 당뇨병의 지속형 치료제 생산에 유용하게 활용될 수 있다.
Description
본 발명은 클로스트리파인을 이용한 지속형 인슐린 아날로그 복합체의 활성형 제조방법에 관한 것으로, 더 상세하게는 인슐린 B 쇄의 22번째 아미노산을 아르지닌(Arg)에서 라이신(Lys)으로 치환하여 클로스트리파인과 반응하더라도 인슐린 B 쇄의 절단 없이 활성형으로의 전환이 가능한 지속형 인슐린 아날로그 복합체의 활성형 제조방법에 관한 것이다.
당뇨는 고혈당을 특징으로 하는 대사질환으로 유전적 요인과 환경적 요인의 복합적인 작용에 의해 발생한다. 당뇨는 1형 당뇨, 2형 당뇨, 임신성 당뇨 및 고혈당증 등의 상태를 유발하고, 췌장이 불충분한 양의 인슐린을 생성하거나 인체의 세포가 인슐린에 적절하게 반응하지 못해 포도당을 흡수하는 능력이 저하된 대사장애를 의미하며, 그 결과 포도당이 혈액 중에 축적되어 나타난다.
1형 당뇨는 인슐린 의존성 당뇨(IDDM) 및 청소년기-발병 당뇨라고도 불리며, 이는 베타 세포 파괴에 의해 유발되어 절대적인 인슐린 결핍을 유발한다. 반면 2형 당뇨는 비인슐린 의존 당뇨(NIDDM) 및 성인-발병 당뇨라고도 알려져 있으며, 이는 뚜렷한 인슐린 저항성과 이에 따른 인슐린 결핍 및/또는 인슐린 저항성과 동반되는 인슐린 분비 결핍과 관련되어 있다.
특히 당뇨는 심혈관 질환, 망막병증 등 다양한 합병증을 동반하기 때문에 혈당 조절 등 적절한 관리가 이루어지지 않을 경우 부담이 매우 큰 질환이다. 당뇨 치료제 세계 시장 규모는 2015년 417억달러에서 2022년 661억달러로 확대될 것으로 예측되는데 이는 항암제 시장에 이어 두 번째로 큰 영역이 될 것으로 예측된다. 전 세계적으로 2014년 기준 4억 22백만명의 성인이 당뇨를 앓고 있으며, 이는 전체 성인인구의 8.5%에 달하는데, 이는 1980년 4.5%에서 두 배 가까이 증가한 수치이다(WHO, 2016). 또한 당뇨로 인한 세계 보건 지출 총액은 2015년 기준 6,730억 달러 규모로 추산되며, 2040년까지 20-79세 당뇨 환자의 수는 6억 2천만명 규모로 증가할 것으로 예측되고 있다.
당뇨를 치료하기 위한 가장 대표적인 방법으로는 인슐린을 투여하여 환자의 혈당을 정상 수준으로 조절하는 방법이 있다. 인슐린은 인체의 췌장에서 분비되는 혈당 조절 호르몬으로, 혈액 내의 잉여 포도당을 세포로 옮겨 세포에 에너지원을 공급하는 한편 혈당을 정상 수준으로 유지시켜 주는 역할을 한다.
인슐린은 생산 경로에 따라 다양한 번역 후 변형 과정을 거치게 된다. 생산과 분비는 독립적이며, 제조된 인슐린은 분비를 위해 저장된다. C-펩타이드와 성숙 인슐린은 생물학적으로 활성을 나타내게 된다.
포유류에서 인슐린은 췌장의 베타 세포에서 합성되며, 인슐린은 두 개의 폴리펩타이드 사슬, 즉 A 쇄와 B 쇄로 구성되어 있으며, 이들은 이황화 결합으로 연결되어 있다. 초기 인슐린은 베타 세포에서 프리프로인슐린이라 불리는 단일한 폴리펩타이드로 합성된다. 프리프로인슐린은 신생 폴리펩타이드 사슬을 조면소포체(rough endoplasmic reticulum)로 이동시키는 24개 아미노산 잔기의 신호 펩타이드를 포함하고 있다. 신호 펩타이드는 조면소포체의 내강으로 이동한 후 절단되어 프로인슐린이 형성된다. 조면소포체에서 프로인슐린은 정확한 형태로 접힘(folding)이 일어나고 3개의 이황화 결합을 형성한다. 소포체에서 조립된 후 5~10분 후, 프로인슐린은 미성숙 과립이 형성되는 트랜스-골지 네트워크로 수송된다.
프로인슐린은 엑소프로테아제 카르복시펩티다아제 E와 프로호르몬 컨버타아제(PC1, PC2)로 알려진 세포 엔도펩티다아제의 활성에 의해 활성형 인슐린으로 성숙된다. 엔도펩티다아제는 2개의 위치에서 절단을 유도하여 C-펩타이드라 불리는 단편을 방출하고, 2개의 펩타이드 쇄인 B 쇄 및 A 쇄는 2개의 이황화 결합으로 연결되게 된다. 절단 부위는 각각 한 쌍의 염기성 잔기(라이신(Lys)-64와 아르지닌(Arg)-65, 아르지닌(Arg)-31과 아르지닌(Arg)-32) 뒤에 위치한다. C-펩타이드가 절단된 후에, 이들 2 쌍의 염기성 잔기는 카르복시펩티다아제에 의해 제거된다. C-펩타이드는 프로 인슐린의 중앙 부에 위치하며, 프로인슐린의 일차 구조는 순서에 따라 "B-C-A"에 해당한다(B 쇄와 A 쇄는 질량을 바탕으로 동정되었고, C-펩타이드는 추후에 발견되었다.).
만들어진 성숙 인슐린(활성형 인슐린)은 성숙 과립 내에 포장되어 있다가 대사신호(예: 류신(Leu), 아르지닌(Arg), 포도당, 만노오즈)와 미주 신경 자극에 의해 세포에서 순환계로 분비되게 된다.
당뇨를 치료하기 위해서는 활성형 인슐린을 투여하게 되는데, 활성형 인슐린을 제조하기 위한 유전자 재조합 인슐린 제조 기술로는, 우선, 일라이 릴리(Eli Lilly)사는 대장균을 이용하여 A 쇄와 B 쇄를 각각 발현시키고, in vitro에서 혼합시켜 이황화 결합을 만들고 A 쇄와 B 쇄를 연결시키는 방법을 사용하였으나, 생산효율이 좋지 않다는 문제점이 있었다. 이 후, 일라이 릴리(Eli Lilly)사는 프로인슐린을 발현시키고 in vitro 조건으로 이황화 결합을 만들고 나서, 트립신과 카르복시펩티다제 B로 C-펩타이드를 잘라내어 인슐린을 만드는 방법으로 전환하였다.
노보 노디스크(Novo Nordisk)사는 B 쇄와 A 쇄를 염기성의 아미노산 2개로 연결한 미니프로인슐린을 효모에서 발현시키고, 실험실적 조건으로 트립신 처리하여 인슐린을 수득하는 방법을 개발하였는데, 이 방법은 미니프로인슐린이 발현, 분비되는 과정에서 이황화 결합을 형성시키는 장점을 가지고 있고, 배지 중에 분비되기 때문에 분리 및 정제가 용이하다는 장점이 있으나, 대장균만큼 대규모의 생산에는 어려움 있었다.
유전자 재조합 인슐린의 신규한 제조방법의 개발은 이후에도 적극적으로 진행되었는데, 헥스트사는 신규 인슐린 유도체 또는 프리프로인슐린을 대장균에서 발현시키고, in vitro 조건에서 이황화 결합을 형성시키고, 리실엔도펩티다제 (lysylendopeptidase) 또는 클로스트리파인(clostripain)과 카르복시펩티다제 (carboxypeptidase) B로 처리하여 인슐린을 수득하는 방법을 개발하였고, 바이오테크놀로지 제너럴 코퍼레이션(BIO-TECHNOLOGY GENERAL CORP.)사가 대장균에서 슈퍼옥시드 디스뮤타제(SOD)에 프로인슐린을 연결한 융합단백질을 발현시켜 발현효과와 in vitro 조건에서의 이황화 결합 형성 효율을 향상시켰다. 인슐린으로 변환은 트립신과 카르복시펩티다아제 B로 행하였다. 이와 같이, 유전자 재조합 인슐린의 제조방법은 많은 시도가 있고, 발현 효율, 이황화 결합의 형성 효율, 인슐린으로 변환 방법의 관점에서 개량되고 있다(KR 10-2001-7013921).
본 발명자들은 천연 인슐린에 비해 생체 내 반감기가 증가되어 지속성이 향상된 본 발명자들의 신규 지속형 인슐린 아날로그 복합체에 적합한 생산 공정을 개발하고자 예의 노력한 결과, 클로스트리파인을 이용하는 경우 본 발명자들의 신규 지속형 인슐린 아날로그 복합체를 효율적으로 생산할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 신규한 지속형 인슐린 아날로그 복합체의 활성형 제조방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은, 천연형 인슐린에서 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 인슐린 B 쇄의 22번째 아미노산이 아르지닌(Arg)에서 라이신(Lys)으로 치환된 변이를 포함하고 알부민 결합 도메인이 결합된 인슐린 아날로그 복합체를 클로스트리파인과 반응시키는 단계;를 포함하는 활성형 인슐린 아날로그 복합체의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 방법으로 제조된 활성형의 지속형 인슐린 아날로그 복합체를 제공한다.
본 발명에 따른 활성형 인슐린 아날로그 복합체 제조방법은 종래 트립신을 이용하는 프로인슐린의 활성형 전환 방법에 의해 알부민 결합 도메인이 절단되어 본 발명자들에 의해 개발된 신규한 지속형 인슐린 아날로그 복합체의 활성형으로의 전환이 어려운 점을 극복하기 위하여, 클로스트리파인을 이용하여 신규 지속형 인슐린 아날로그 복합체의 활성형으로의 전환이 가능하게 하였고, 이는 당뇨병의 지속형 치료제 생산에 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 인슐린 B 쇄의 22번 아르지닌(Arg)을 라이신(Lys)으로 치환하여 지속형 인슐린 아날로그 복합체를 제작한 후 클로스트리파인으로 처리하여 그 안정성을 확인한 결과이다. 인슐린의 B 쇄의 22번 위치에 아르지닌(Arg)을 포함하는 경우, 절단이 발생되나 라이신(Lys)으로 치환하면 B 쇄의 절단이 현저히 감소함을 질량분석기를 통해 확인하였다.
도 2는 재조합 대장균에서 지속형 인슐린 아날로그 복합체 1-10의 발현을 SDS-PAGE로 확인한 결과이다. 인슐린 서열에 하나 이상의 변이를 도입하여도 대장균에서의 단백질 발현은 유지되었다.
도 3은 지속형 인슐린 아날로그 복합체의 가용화 용액 및 재접힘 과정을 RP-HPLC로 모니터링 하였다. 가용화를 통해 단백질 구조를 풀어 준 후 재접힘을 유도하면 3차 구조를 형성함에 따라 RP-HPLC에서 retention time의 이동이 관찰되었다.
도 4는 DTT 첨가에 따른 클로스트리파인에 의한 ABD-융합 인슐린 아날로그 4의 활성형 인슐린 생성 효율을 SDS-PAGE로 확인한 결과이다.
도 5는 클로스트리파인과 CpB의 처리 시간에 따른 ABD-융합 인슐린 아날로그 4의 활성형 인슐린 생성 효율을 SDS-PAGE로 확인한 결과이다.
도 6은 클로스트리파인과 CpB를 동시 처리하는 경우 ABD-융합 인슐린 아날로그 4의 활성형 인슐린 생성 효율이 높은 pH 범위를 SDS-PAGE로 확인한 결과이다.
도 7은 클로스트리파인 및 DTT의 추가적인 첨가에 따른 ABD-융합 인슐린 아날로그 4의 활성형 인슐린 생성 효율을 SDS-PAGE로 확인한 결과이다.
도 8은 본 발명의 일실시예에 따른 최적의 효소반응 조건에 따른 ABD-융합 인슐린 아날로그 4의 활성형 인슐린 전환 효율 증가 및 불순물 감소 효과를 확인한 결과이다. (주요 불순물 분자량 10,296 Da, 활성형 분자량 11,238 Da)
도 9는 클로스트리파인과 CpB를 동시 처리하는 경우 ABD-융합 인슐린 아날로그 4의 활성형 인슐린 생성 효율이 높은 온도 범위를 SDS-PAGE로 확인한 결과이다.
도 10은 ABD-융합 인슐린 아날로그 4를 클로스트리파인과 CpB로 절단한 후 정제하여 SDS-PAGE로 분석한 결과이다.
도 11은 본 발명의 일실시예에 따른 지속형 인슐린 아날로그 복합체에 아연(zinc)과 페놀(phenol)을 첨가하여 헥사머(hexamer) 형성 여부를 크기 배제 크로마토그래피로 분석한 결과이다.
도 12는 본 발명의 일실시예에 따른 지속형 인슐린 아날로그 복합체의 혈당 강하능을 평가한 결과이다.
도 2는 재조합 대장균에서 지속형 인슐린 아날로그 복합체 1-10의 발현을 SDS-PAGE로 확인한 결과이다. 인슐린 서열에 하나 이상의 변이를 도입하여도 대장균에서의 단백질 발현은 유지되었다.
도 3은 지속형 인슐린 아날로그 복합체의 가용화 용액 및 재접힘 과정을 RP-HPLC로 모니터링 하였다. 가용화를 통해 단백질 구조를 풀어 준 후 재접힘을 유도하면 3차 구조를 형성함에 따라 RP-HPLC에서 retention time의 이동이 관찰되었다.
도 4는 DTT 첨가에 따른 클로스트리파인에 의한 ABD-융합 인슐린 아날로그 4의 활성형 인슐린 생성 효율을 SDS-PAGE로 확인한 결과이다.
도 5는 클로스트리파인과 CpB의 처리 시간에 따른 ABD-융합 인슐린 아날로그 4의 활성형 인슐린 생성 효율을 SDS-PAGE로 확인한 결과이다.
도 6은 클로스트리파인과 CpB를 동시 처리하는 경우 ABD-융합 인슐린 아날로그 4의 활성형 인슐린 생성 효율이 높은 pH 범위를 SDS-PAGE로 확인한 결과이다.
도 7은 클로스트리파인 및 DTT의 추가적인 첨가에 따른 ABD-융합 인슐린 아날로그 4의 활성형 인슐린 생성 효율을 SDS-PAGE로 확인한 결과이다.
도 8은 본 발명의 일실시예에 따른 최적의 효소반응 조건에 따른 ABD-융합 인슐린 아날로그 4의 활성형 인슐린 전환 효율 증가 및 불순물 감소 효과를 확인한 결과이다. (주요 불순물 분자량 10,296 Da, 활성형 분자량 11,238 Da)
도 9는 클로스트리파인과 CpB를 동시 처리하는 경우 ABD-융합 인슐린 아날로그 4의 활성형 인슐린 생성 효율이 높은 온도 범위를 SDS-PAGE로 확인한 결과이다.
도 10은 ABD-융합 인슐린 아날로그 4를 클로스트리파인과 CpB로 절단한 후 정제하여 SDS-PAGE로 분석한 결과이다.
도 11은 본 발명의 일실시예에 따른 지속형 인슐린 아날로그 복합체에 아연(zinc)과 페놀(phenol)을 첨가하여 헥사머(hexamer) 형성 여부를 크기 배제 크로마토그래피로 분석한 결과이다.
도 12는 본 발명의 일실시예에 따른 지속형 인슐린 아날로그 복합체의 혈당 강하능을 평가한 결과이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
천연형 인슐린의 아미노산 일부를 치환한 인슐린 아날로그는 생체 내 반감기가 증가하여 기저 인슐린 치료제로 활용될 수 있고, 이러한 인슐린 아날로그가 인체 내에서 알부민과 결합하면 생체 내 반감기는 더욱 증가하여 일주 제형으로 활용할 수 있다.
본 발명자들은 천연형 인슐린 아미노산의 일부를 치환하는 경우 인슐린의 생체 내 반감기를 증가시킬 수 있고, 여기에 추가로 알부민 결합 도메인이 융합시키면 생체 내에서 알부민과 결합하여 반감기가 더욱 증가한다는 것을 확인할 수 있었다. 하지만, 아미노산 일부가 치환된 인슐린 아날로그에 알부민 결합 도메인을 융합시키는 경우 이를 활성형으로 제조하는 과정에서 종래 사용하던 트립신을 사용할 때, 알부민 결합 도메인 자체의 절단이 야기되어 지속성이 오래 유지되는 활성형 제조가 어려운 문제점이 발생하였다.
이에, 본 발명에서는 알부민 결합 도메인의 절단을 유도하지 않으면서도 인슐린의 활성형 전환이 가능한 효소로써 클로스트리파인을 사용하고자 하였으나, 이는 인슐린 자체의 절단을 유도하는바, 인슐린 아미노산을 치환함으로써 인슐린 자체의 절단을 방지하였다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서 천연형 인슐린에서 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 인슐린 B 쇄의 22번째 아미노산이 아르지닌(Arg)에서 라이신(Lys)으로 치환된 변이를 포함하고 알부민 결합 도메인이 결합된 인슐린 아날로그 복합체를 클로스트리파인과 반응시키는 단계;를 포함하는 지속형 인슐린 아날로그 복합체의 활성형 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에서, 상기 인슐린은 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 인슐린 A 쇄의 3번째 아미노산이 발린(Val)에서 루신(Leu)으로 치환; 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 인슐린 A 쇄의 8번째 아미노산이 트레오닌(Thr)에서 아스파르트산(Asp)으로 치환; 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 인슐린 A 쇄의 10번째 아미노산이 이소루신(Ile)에서 라이신(Lys)으로 치환; 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 인슐린 A 쇄의 14번째 아미노산이 티로신(Tyr)에서 글루탐산(Glu)으로 치환; 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 인슐린 A 쇄의 19번째 아미노산이 티로신(Tyr)에서 페닐알라닌(Phe)으로 치환; 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 인슐린 B 쇄의 5번째 아미노산이 히스티딘(His)에서 트레오닌(Thr)으로 치환; 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 인슐린 B 쇄의 9번째 아미노산이 세린(Ser)에서 아스파르트산(Asp)으로 치환; 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 인슐린 B 쇄의 13번째 아미노산이 글루탐산(Glu)에서 알라닌(Ala)으로 치환; 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 인슐린 B 쇄의 17번째 아미노산이 루신(Leu)에서 글루타민(Gln)으로 치환; 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 인슐린 B 쇄의 24번째 아미노산이 페닐알라닌(Phe)에서 세린(Ser)으로 치환된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산이 추가로 치환된 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 알부민 결합 도메인은 하기 아미노산 서열로 표시되는 알부민 결합 모티프를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
GVSDFYKKLIXaKAKTVEGVEALKXbXcI
상기에서, 서로 독립적으로,
Xa는 D와 E로부터 선택되고;
Xb는 D와 E로부터 선택되고;
Xc는 A 와 E로부터 선택된다.
본 발명의 일실시예에서, Xa는 D이고, Xb는 D이며, Xc는 A이다.
본 발명의 일 양태에 따른 일 실시형태에서, 상기 알부민 결합 도메인은 하기 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
LAX3AKX6X7ANX10ELDX14Y-[BM]-LX43X44LP
상기에서, [BM]은 상기에서 정의된 바와 같은 알부민 결합 모티프이고,
서로 독립적으로,
X3는 C, E, Q 및 S로부터 선택되고;
X6는 C, E 및 S로부터 선택되고;
X7는 A 및 S로부터 선택되고;
X10는 A, R 및 S로부터 선택되고;
X14는 A, C, K 및 S로부터 선택되고;
X43는 A 및 K로부터 선택되고;
X44는 A, E 및 S로부터 선택된다.
상기 알부민 결합 도메인은, 서열번호 6 내지 서열번호 13의 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 상기 알부민 결합 도메인은 바람직하게는 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열일 수 있다. 본 발명에 따른 인슐린 아날로그 복합체의 기능은 복합체의 삼차 구조에 따라 달라진다. 따라서, 본 발명에서 지속형 인슐린 아날로그 복합체는 그 기능에 영향을 미치지 않으면서 복합체를 구성하는 아미노산 서열에 작은 변화를 줄 수 있다. 그러므로, 본 발명은 알부민 결합 특성 및 효소 절단에 대한 높은 저항성을 유지하는 알부민 결합 도메인 또는 지속형 인슐린 아날로그 복합체의 변이체를 포함한다. 예를 들어, 아미노산 잔기의 특정 기능기 그룹에 속한(예를 들어, 소수성, 친수성, 극성 등) 아미노산 잔기는 같은 기능기에 속한 다른 아미노산 잔기로 치환될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "알부민 결합"과 "알부민에 대한 결합 친화성"은 예컨대, Biacore 기기에서와 같이 표면 플라즈몬(plasmon) 공명 기술을 사용하여 시험할 수 있는 폴리펩타이드 또는 단백질의 특성을 의미한다. 예를 들면, 알부민 결합 친화성은 알부민 또는 그의 단편을 기기의 센서 칩(sensor chip) 위에 고정하고, 테스트할 폴리펩타이드 또는 단백질을 포함하는 샘플을 그 칩으로 전달하는 실험에서 테스트할 수 있다.
다른 방법으로, 테스트할 폴리펩타이드 또는 단백질은 기기의 센서 칩 위에 고정하고, 알부민을 포함한 샘플 또는 그의 단편을 칩으로 전달한다. 이와 관련하여 알부민은 인간 혈청 알부민 같은 포유동물에서 유래한 혈청 알부민일 수 있다. 당업자는 상기 실험에 의해 얻어진 결과를 해석하여 알부민에 대한 폴리펩타이드 또는 단백질의 결합 친화성의 정량적인 측정을 확립할 수 있다. 예를 들어, 상호작용에 대한 KD값 측정 같은 정량적인 측정이 요구되는 경우, 표면 플라즈몬 공명 방법을 또한 수행할 수 있다. 예컨대, 결합 값은 Biacore2000 기기(Biacore AB)를 통해 정의할 수 있다. 알부민은 측정 센서 칩에 적절히 고정하고, 친화성을 측정할 폴리펩타이드 또는 단백질 샘플은 단계희석에 의해 준비하여 임의의 순서로 주입한다. 이어서 KD값은 예를 들어 기기제조업체(Biacore AB)에 의해 제공된 BIAevaluation 4.1 소프트웨어의 1:1 Langmuir 결합 모델을 사용하여 상기 결과로부터 계산할 수 있다.
본 발명의 일 실시형태에서, 인슐린 아날로그 복합체가 결합하는 알부민은 인간 혈청 알부민, 래트(rat) 혈청 알부민, 원숭이(cynomolgus) 혈청 알부민 및 마우스(mouse) 혈청 알부민으로부터 선택한다.
하나의 특정 실시형태에서, 인슐린 아날로그 복합체가 결합하는 알부민은 인간 혈청 알부민이다.
본 발명의 명세서에 있어서, 알부민 결합 모티프 및 알부민 결합 도메인(또는, 알부민 결합 폴리펩타이드)에 관한 설명은 대한민국 공개특허 10-2015-0058454호에 기재된 내용을 포함하는 것으로 한다.
상기 인슐린 아날로그와 알부민 결합 도메인은 펩타이드 결합; 폴리펩타이드 링커; 또는 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜-프로필렌 글리콜 공중합체, 폴리옥시에틸화폴리올, 폴리비닐알콜, 다당류, 덱스트란, 폴리비닐에틸에테르, 생분해성 고분자, 지방산, 뉴클레오티드, 지질중합체, 키틴, 히아루론산 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 비펩타이드성 링커를 통해 서로 결합된 것을 특징으로 할 수 있으나 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에서 인슐린 아날로그와 알부민 결합 도메인 사이에는 (GGGGS)n (여기서, n=1 내지 6의 정수) 서열이 반복된 링커가 삽입될 수 있다. 이는 링커가 도입되지 않으면 재접힘 수율이 낮았으나, (GGGGS) 서열이 2번 이상 반복될 경우 재접힘 수율에는 큰 차이를 보이지 않는다는 실험결과에 따른 것이다. 한편, n수가 증가할수록 클로스트리파인에 의한 활성형 인슐린 전환율이 높게 나타났으나 체내동태에는 큰 영향을 미치지 않았다. 상기와 같은 결과를 종합하면, 링커는 GGGGS 서열이 2 내지 4번 반복된 형태로 구성하는 것이 바람직하다.
따라서, 본 발명에서 인슐린 아날로그와 알부민 결합 도메인은 폴리펩타이드 링커에 의해 서로 결합될 수 있으며, 상기 폴리펩타이드 링커는 (GGGGS)n (n은 1 내지 6의 정수)일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 바람직하게, 상기 폴리펩타이드 링커는 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시될 수 있다.
본 발명에서, 상기 클로스트리파인과의 반응시 환원제를 첨가하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 환원제는 시스테인(cysteine), b-머캅토에탄올(b-mercaptoethanol), TCEP, GSH 및 DTT로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 상기 환원제로는 0.1~0.5 mM의 DTT를 첨가하는 것이 바람직하며, 0.1~0.4 mM의 DTT를 첨가하는 것이 더욱 바람직하다.
상기 DTT는 인슐린 아날로그 복합체가 클로스트리파인과 반응하는 초기, 즉 반응 개시 시점에 1회만 첨가할 수 있고, 반응 개시 시점에 첨가한 후, 2~5회 추가로 첨가할 수 있으나, 인슐린 아날로그 복합체와 클로스트리파인과의 반응 초기에 첨가하고, 반응 3~6시간 후 추가로 첨가하는 것이 생산 공정의 간편성 및 효율성에서 가장 바람직하다. 상기 클로스트리파인은 각 첨가시 단백질 1 mg 당 0.1~5 Unit의 농도로 첨가할 수 있으며, 바람직하게는 0.5~2 Unit의 농도로 첨가할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에서, 상기 인슐린 아날로그 복합체는 클로스트리파인과 반응시 또는 클로스트리파인과 반응 이후 카르복시펩티다아제 B(carboxypeptidase B, 이하 CpB)를 첨가하여 CpB와 추가로 반응시키는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서, 상기 클로스트리파인 및/또는 CpB는 pH 6~9, 바람직하게는 6.5~7.5인 조건에서 반응시키는 것을 특징으로 할 수 있으며, 4~40℃, 바람직하게는 30~40℃인 온도 조건에서 반응시키는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
상기 CpB는 단백질 1 mg 당 0.001~1 Unit의 농도로 첨가할 수 있으며, 바람직하게는 0.001~0.1 Unit의 농도로 첨가할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 방법으로 제조된 활성형 인슐린 아날로그 또는 활성형 인슐린 아날로그 복합체에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 인슐린 아날로그 또는 인슐린 아날로그 복합체는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 재조합 벡터 형태로 숙주 세포에 도입된 재조합 미생물을 배양한 후, 이를 파쇄하고 정제하여 수득된 것일 수 있다.
본 발명에서 재조합 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있고, 원핵세포 또는 진핵세포를 숙주세포로 사용하기 위한 벡터로서 구축될 수 있다.
본 발명에서 용어, "벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 재조합 벡터로서, 핵산 삽입물이 발현되도록 작동 가능하게 연결된 필수적인 조절요소를 포함하는 핵산 구조물(construct)을 의미한다. 본 발명은 인슐린 아날로그 또는 이의 아날로그 복합체를 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 벡터를 제조할 수 있는데, 상기 재조합 벡터를 숙주세포에 형질전환(transformation) 또는 형질감염(transfection) 시킴으로써, 본 발명의 인슐린 아날로그 및/또는 이의 아날로그 복합체를 수득할 수 있다.
본 발명에서 인슐린 아날로그 및/또는 이의 아날로그 복합체를 코딩하는 핵산은 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 본 발명에서 용어, "작동 가능하게 연결된(operatively linked)"은 핵산 발현 조절서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 라이보좀 결합부위, 전사 종결서열 등)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.
본 발명에서 용어, "프로모터"는 폴리머라제에 대한 결합 부위를 포함하고 프로모터 하위 유전자의 mRNA로의 전사 개시 활성을 가지는, 코딩 영역의 상위(upstream)의 비해독된 핵산 서열, 즉, 폴리머라제가 결합하여 유전자의 전사를 개시하도록 하는 DNA 영역을 말하며, mRNA 전사 개시부위의 5'-부위에 위치한다.
예를 들어, 본 발명의 벡터가 재조합 벡터이고 원핵세포를 숙주로 하는 경우에, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예: tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, pLλ프로모터, pRλ프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로모터, trp 프로모터, trc 프로모터, phoA 프로모터, araBAD 프로모터, T5 프로모터 및 T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합부위 및 전사/해독 종결서열을 포함하는 것이 일반적이다.
또한, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드(예: pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈, pPICZα 시리즈, pUC19 등), 파지(예: λgt4·λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스(예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
한편, 본 발명의 벡터가 재조합 벡터이고 진핵세포를 숙주로 하는 경우에, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터(예: 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 우두바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열(예: 소성장 호르몬 터미네이터 및 SV40 유래 폴리 아데닐화 서열)을 일반적으로 갖는다.
또한, 본 발명의 재조합 벡터는 선택 마커로서 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 사용될 수 있다.
본 발명의 재조합 벡터는 회수되는 목적 단백질, 즉 인슐린 및/또는 이의 아날로그의 정제를 용이하게 하기 위하여 필요에 따라 다른 서열을 추가로 포함할 수 있다. 상기 추가로 포함될 수 있는 서열은 단백질 정제용 태그 서열일 수 있으며, 예컨대, 글루타티온 S-트랜스퍼라제(Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질(NEB, USA), FLAG(IBI, USA) 및 6개 히스티딘(hexahistidine) 등이 있으나, 상기 예들에 의하여 목적 단백질의 정제를 위하여 필요한 서열의 종류가 제한되는 것은 아니다. 상기와 같은 태그 서열을 포함하는 재조합 벡터에 의해 발현된 융합 단백질은 친화성 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다. 예컨대, 글루타티온-S-트랜스퍼라제가 융합된 경우에는 이 효소의 기질인 글루타티온을 이용할 수 있고, 6개 히스티딘 태그가 이용된 경우에는 Ni-NTA 칼럼을 이용하여 원하는 목적 단백질을 용이하게 회수할 수 있다. 상기 인슐린 아날로그 및/또는 이의 아날로그 복합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 이용하여, 상기 벡터가 형질전환된 형질전환체가 구축될 수 있다.
본 발명에서 용어, "형질전환(transformation)"이란 DNA를 숙주세포 내로 도입하여 DNA가 염색체의 인자로서 또는 염색체 통합 완성에 의해 복제 가능하게 되는 것으로, 외부의 DNA를 세포 내로 도입하여 인위적으로 유전적인 변화를 일으키는 현상을 의미한다.
본 발명의 형질전환 방법은 임의의 형질전환 방법이 사용될 수 있으며, 당업계의 통상적인 방법에 따라 용이하게 수행할 수 있다. 일반적으로 형질전환 방법에는 CaCl2 침전법, CaCl2 침전법에 DMSO(dimethyl sulfoxide)라는 환원물질을 사용함으로써 효율을 높인 Hanahan 방법, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘 침전법, 원형질 융합법, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반법, 아그로박테리아 매개 형질전환법, PEG를 이용한 형질전환법, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환법 등이 있다.
본 발명에 따른 인슐린 아날로그 및/또는 이의 아날로그 복합체를 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 벡터를 형질전환시키기 위한 방법은 상기 예들에 국한되지 않으며, 당업계에서 통상적으로 사용되는 형질전환 또는 형질감염 방법이 제한 없이 사용될 수 있다.
목적 핵산인 인슐린 아날로그 및/또는 이의 아날로그 복합체를 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 벡터를 숙주세포 내로 도입함으로써 본 발명의 형질전환체(transformant)를 획득할 수 있다.
본 발명에 적합한 숙주는 본 발명의 핵산을 발현하도록 하는 한 특별히 제한되지 않는다. 본 발명에 사용될 수 있는 숙주의 특정한 예로는 대장균(E. coli)과 같은 에스케리키아(Escherichia) 속 세균; 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)와 같은 바실러스(Bacillus) 속 세균; 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)와 같은 슈도모나스(Pseudomonas) 속 세균; 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)와 같은 효모; 스포도프테라 프루기페르다(SF9)와 같은 곤충세포; 및 CHO, COS, BSC 등과 같은 동물세포가 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 "활성형"이란 인슐린, 인슐린 아날로그 또는 인슐린 아날로그 복합체가 생체 내에서 혈당량을 조절할 수 있는 성숙한 형태를 의미하며, 프로인슐린의 형태에서 C-펩타이드가 절단되고 인슐린의 A 쇄와 B 쇄를 포함하는 인슐린, 인슐린 아날로그 또는 인슐린 아날로그 복합체를 나타낸다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예에서, ABD-융합 인슐린 아날로그는 본 발명에서 지속형 인슐린 아날로그 복합체와 동일한 의미로 사용된다.
실시예
1.
ABD
-융합 인슐린의 발현 벡터 및 균주 제작
인간의 인슐린은 프리프로인슐린(pre-pro-insulin) 형태로 만들어져 소포체에서 프리-서열(pre sequence)이 잘려나가고, 골지체와 소포 내에서 프로세싱되어 성숙된 형태의 인슐린을 형성하게 된다. 이를 응용하여 프로인슐린 형태로 대장균에서 단백질을 발현시킨 후 트립신을 이용하여 C 쇄를 잘라내는 공정으로 재조합 인슐린을 생산하고자, 프로인슐린을 설계하였다. 대장균에서 프로인슐린의 발현 및 정제 효율을 높이기 위하여 N-말단에는 융합 태그(fusion tag)를 삽입하였고, 코돈 최적화(codon optimization)하였다.
인슐린에 ABD(albumin biding domain)를 융합시킬 수 있는 부위는 이론적으로 4개 부위이지만, A 쇄의 N 말단은 인슐린의 활성에 중요한 위치이므로 융합 위치에서 제외하였고, B 쇄의 N 말단은 인슐린 헥사머 형성에 중요하지만 인슐린의 활성은 유지될 수 있으므로 융합 위치에 포함시켰다. 인슐린 B 쇄와 C 쇄 사이에 ABD가 삽입되는 경우 단백질 폴딩에 영향을 줄 것으로 판단되어 이러한 구조는 배제하였으며, 이에 B-C-A 쇄 혹은 A-C-B 쇄의 순서로 후보물질을 디자인하였고, 최종적으로 하기 3가지 형태로 ABD-융합 인슐린의 발현을 위한 유전자 구조를 설계하였다.
NdeI - Fusion tag - B-chain - C-chain - A-chain - Linker - ABD - EcoRI
NdeI - Fusion tag - ABD - Linker - B-chain - C-chain - A-chain - EcoRI
NdeI - Fusion tag - A-chain - C-chain - B-chain - Linker - ABD - EcoRI
발현 벡터로는 pJ401(DNA 2.0) 벡터를 사용하였으며 벡터를 제한효소 NdeI과 EcoRI으로 절단한 후, 1% 아가로스 겔 상에서 전기영동하여 DNA 절편을 분리하였다. ABD-융합 인슐린 발현을 위한 상기 유전자 구조와 상기와 같이 발현 벡터에서 얻은 DNA 절편을 T4 DNA 리가제로 연결하여 플라스미드를 제작한 후, 염화칼슘법으로 각 플라스미드를 도입하여 대장균 BL21(DE3)을 형질전환 시켰다. 카나마이신에 저항성을 지닌 형질전환된 균주를 선별하고 플라스미드 DNA를 분리하여, 제한효소 절단에 의한 분석방법으로 원하는 DNA가 제대로 삽입되었는지를 확인하였다.
NdeI - Fusion tag - ABD - Linker - B-chain - C-chain - A-chain - EcoRI 유전자 구조로 설계하였을 경우 단백질 재접힘 수율이 매우 낮아 인슐린과 ABD의 융합이 어려울 것으로 판단되었다. 또한 NdeI - Fusion tag - A-chain - C-chain - B-chain - Linker - ABD - EcoRI 순서로 유전자를 설계하였을 경우도 재접힘과 효소처리 수율이 낮아 활성형 인슐린 제조방법으로 적절치 않음을 확인하였다. 다만 NdeI - Fusion tag - A-chain - C-chain - B-chain - Linker - ABD - EcoRI 구조의 유전자로 ABD-융합 인슐린을 제조하였을 경우 인슐린의 활성은 확인되었으나, 재접힘과 효소처리 수율이 낮아 활성형 인슐린 제조방법으로 적절치 않음을 확인하였다. 그러므로 상기 3가지 형태의 ABD-융합 인슐린 중, NdeI - Fusion tag - B-chain - C-chain - A-chain - Linker - ABD - EcoRI 구조를 선택하여 이후 실험을 진행하였다.
A 쇄와 알부민 결합 도메인(ABD) 사이에는 (GGGGS) 서열 1 내지 6회 반복된 링커를 삽입하였다. 이 경우, 링커가 없으면 재접힘 수율이 매우 낮았었고 (GGGGS) 서열이 2번 이상 반복될 경우 재접힘 수율에는 큰 차이를 보이지 않았다. 한편, (GGGGS)n 서열에서 n수가 증가할수록 클로스트리파인에 의한 활성형 인슐린 전환율이 높아졌으나 체내동태에는 큰 영향을 미치지 않았다. 이상 결과를 종합하여 링커는 GGGGS 서열이 2~4번 반복된 형태로 구성 하였다.
본 발명에서 사용된 ABD-융합 인슐린을 구성하는 해당 부위의 아미노산 서열은 하기와 같다.
| Sequence | Sequence ID No. | |
| Fusion Tag | MATTSTGNSAHHHHHHSSGSAR | 1 |
| B chain | FVNQHLCGSHLVEALYLVCGEKGFFYTPKT | 2 |
| C chain | RREAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQAR | 3 |
| A chain | GIVEQCCTSICSLYQLENYCN | 4 |
| Linker | GGGGSGGGGS | 5 |
| ABD | LAEAKEAANAELDSYGVSDFYKKLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP | 6 |
실시예
2. 인슐린 아미노산 서열이 변경된
ABD
-융합 인슐린 아날로그 제작
재조합 대장균를 이용한 인슐린 제조에는 트립신을 이용하여 프로인슐린을 활성형으로 전환하는 과정이 필수적이다. 그러나 트립신은 이염기성(di-basic) 아미노산을 높은 효율로 절단하며 단일 아미노산인 라이신(Lys)이나 아르지닌(Arg) 부위도 절단하기 때문에 온전한 활성형의 인슐린을 제조하기 어렵고, ABD 서열 내에도 다수의 라이신(Lys)과 아르지닌(Arg) 잔기가 포함되어 있어 트립신을 이용하여 활성을 갖는 온전한 ABD-융합 인슐린을 제조하는 것은 더욱 어렵다.
이에 트립신을 대체할 수 있는 효소로 클로스트리파인(clostripain)을 활용하여 활성형 전환을 유도하고자 하였다. 이 경우, 클로스트리파인은 ABD-융합 인슐린과 반응하면 인슐린 B 쇄의 22번 위치의 아르지닌(Arg)에 절단이 발생하였다. 이를 해결하고자, B 쇄 22번 위치를 라이신(Lys)으로 치환한 결과 클로스트리파인에 의한 인슐린 절단이 현저히 감소하여 ABD가 융합된 활성형 인슐린을 효과적으로 제조할 수 있었다(도 1).
상기 변이와 더불어, ABD-융합 인슐린의 안정성과 생체 내 반감기를 보다 향상시키기 위하여 인슐린에 추가 변이를 도입하였다. A 쇄와 B 쇄에 각각 5개의 아미노산을 치환하였으며, 치환된 위치는 하기 표 2와 같다.
| Analogue | Modified sequence |
| Analogue 1 | A쇄 3번 V→L |
| Analogue 2 | A쇄 8번 T→D |
| Analogue 3 | A쇄 10번 I→K |
| Analogue 4 | A쇄 14번 Y→E |
| Analogue 5 | A쇄 19번 Y→F |
| Analogue 6 | B쇄 5번 H→T |
| Analogue 7 | B쇄 9번 S→D |
| Analogue 8 | B쇄 13번 E→A |
| Analogue 9 | B쇄 17번 L→Q |
| Analogue 10 | B쇄 24번 F→S |
| Analogue 11 | A쇄, B쇄 추가 변이 없음 |
대장균에서 유전자 발현을 위한 코돈 최적화는 GeneArt사의 알고리즘에 따라 수행하였으며 치환된 아미노산을 갖도록 유전자를 합성하였다.
이와 같이 제작된 플라스미드는 실시예 1에 기재된 방식과 동일하게 대장균 BL21(DE3)에 도입하여 재조합 대장균을 제작하였다.
실시예
3.
ABD
-융합 인슐린 아날로그의 발현
ABD-융합 인슐린 아날로그의 발현을 위하여, 각 재조합 대장균 균주를 100 mL LB 배지에 접종하고 37℃에서 16시간 동안 진탕 배양하여 종 배양액으로 사용하였다. 7 L 발효기(New Brunswick BioFlo)에 2 L의 LB 배지를 넣고 멸균 후 종 배양액을 접종하였다. 배양 시 조건은 온도 35℃공기량 3 vvm, 교반 속도 1,000 rpm로 하고, pH는 6.8이 유지되도록 암모니아와 인산으로 조절하였다. 배지의 탄소원이 고갈될 시점에 feeding을 시작하고 동시에 IPTG로 단백질 발현을 유도하였다. 발현 유도 후 10시간 추가 배양하였고 원심 분리기를 이용하여 재조합 균체를 회수하였다.
ABD-융합 인슐린 아날로그는 대장균에서 봉입체 (inclusion body)로 발현되었으며 인슐린 부위 아미노산 부위의 변이를 도입하여도 본 발명에서 사용하는 벡터시스템 내에서 유사한 발현수준을 나타내었다(도 2).
실시예
4. 세포 파쇄 및
가용화
/
재접힘
유도
ABD-융합 인슐린 또는 ABD-융합 인슐린 아날로그를 발현하는 균체를 각각 파쇄버퍼 (20 mM Tris, 10 mM EDTA, 10% sucrose, 0.2 M NaCl, pH 8.0)에 현탁하고 고압균질기를 이용하여 세포를 파쇄하였다. 파쇄액을 고속 원심분리기에서 7,000 rpm으로 원심분리하고, 용해성 단백질과 일부 세포파편을 제거하여, 봉입체가 포함된 침전물을 분리하였다. 분리된 봉입체는 1% Triton X-100, 0.2 M NaCl, 1M Urea를 포함하는 버퍼에 세척한 후, 7,000 rpm에서 원심분리 하였다. 침전된 봉입체는 증류수로 2회 추가 세척한 후 사용시까지 -80℃에 보관하였다.
냉동 보관한 봉입체를 가용화 버퍼 (25 mM Tris, 8 M Urea, 30 mM cysteine-HCl, pH 10.5)에 넣어 용해시킨 후 재접힘 버퍼(25 mM Tris-HCl, pH 10.5)에 희석하고 4 ℃에서 16 시간 재접힘을 수행하였다. 재접힘 여부는 RP-HPLC 분석을 통하여 확인하였는데, 가용화 용액을 RP-HPLC에서 분석시 소수성이 높아 20분대에서 단백질 피크가 관찰되었고, 재접힘액은 16분대로 피크가 이동함을 관찰하였다(도 3). 이는 재접힘이 진행되면 가용화 상태에 비해 소수성이 감소하기 때문이다. 재접힘의 종료는 RP-HPLC분석시 단백질 피크의 이동이 더 이상 관찰되지 않을 때까지 진행하였다.
실시예
5. 효소를 이용한 활성형 전환
재조합 대장균을 이용한 인슐린의 제조에는 트립신을 이용한 프로인슐린의 활성형으로의 전환이 요구되나, ABD-융합 인슐린 또는 ABD-융합 인슐린 아날로그는 그 서열 내에 트립신에 의한 다수의 절단 부위를 가지고 있으므로, 트립신을 대체 가능한 효소로 클로스트리파인(clostripain)을 이용하여 활성형 전환을 유도하고자 하였다.
클로스트리파인을 이용하여 활성형 전환을 유도할 때, ABD-융합 인슐린에서 특이적으로 인슐린 B 쇄의 22번 위치에서 절단이 일어나 온전한 형태의 인슐린을 제조하기 어렵기 때문에, B 쇄 22번 위치를 아르지닌(Arg)에서 라이신(Lys)으로 치환한 ABD-융합 인슐린 아날로그를 활용하여 활성형의 인슐린을 제조하고자 하였다. 한편, 이하 모든 실험은 특별한 언급이 없는 경우 ABD-융합 인슐린 아날로그 4를 이용하여 실험을 진행하였다.
클로스트리파인은 활성 부위에 시스테인(Cys)을 포함하고 있어 효소의 활성을 보이기 위해서는 환원조건을 필요로 한다. 또한, 클로스트리파인 활성 유지를 위해 재접힘 용액에 환원제를 처리한다면 인슐린 부위의 이황화 결합이 끊어질 가능성이 높다. 이에 이황화 결합의 절단 없이 효소반응 수율을 높이는 조건 도출이 요구되는바, 효소반응액에 포함될 환원제인 DTT를 사용하여 처리 농도와 추가 처리에 대한 조건을 실험하였다.
전구체 형태의 ABD-융합 인슐린 아날로그를 활성형으로 전환 시키기 위해서는 추가적으로 카르복시펩티다아제 B(carboxypeptidase B, CpB)도 필요로 한다. CpB는 카르복시 말단의 염기성 아미노산을 절단하는 효소로 그 상세 조건도 함께 실험하였다. 구체적으로는 클로스트리파인과 CpB의 처리시간, 동시처리 가능 여부, 효소처리 양, 효소처리 시간, 효소처리 온도 및 적정 pH를 평가하였다.
클로스트리파인은 전구체(pro-form) 형태로 존재하기 때문에 자가절단(auto-cleavage)를 유도하여 활성화시켰다. 이를 위해서 동결 건조된 클로스트리파인(Worthington, USA)을 증류수에 녹인 후 활성화 버퍼 (500 mM Tris, 50 mM DTT, 25 mM CaCl2 pH 7.8)를 가하여 4 ℃에서 30분간 활성화 하였다. 재접힘된 단백질 1 mg당 0.1~5 unit 되도록 활성화된 클로스트리파인을 첨가하고 25~40℃에서 2~8시간 반응시켰다. 클로스트리파인 반응 후 CpB를 단백질 1 mg당 0.001~1 unit 되도록 첨가하여 추가 반응하였다. 효소반응은 HCl을 이용하여 pH를 3.5 이하로 낮추어 중단되도록 하였다.
5-1.
DTT
첨가에 따른 활성형 전환 효율 평가
클로스트리파인과 CpB에 대한 효소 반응 조건을 확인하고자, DTT 농도를 0~0.4mM이 되도록 재접힘 용액에 첨가한 후, 클로스트리파인에 의한 활성형 인슐린의 생성 정도를 SDS-PAGE로 관찰하였다. 0.5 mM 농도 이상의 DTT를 첨가할 경우 인슐린 A 쇄와 B 쇄 사이의 이황화 결합(disulfide bond)이 끊어지는 것을 확인하였다 (결과 미첨부).
그 결과, 도 4에서 볼 수 있듯이, 효소 반응액에 DTT를 첨가하지 않으면 ABD-융합 인슐린 아날로그의 활성형으로 전환율이 낮지만, DTT 농도가 증가할수록 활성형으로의 전환 수율이 증가함을 확인할 수 있었다.
5-2.
CpB
첨가 시기에 따른 활성형 인슐린 전환 효율 평가
ABD-융합 프로인슐린 아날로그를 활성형으로 전환하기 위해서는 클로스트리파인과 CpB를 모두 처리하여야 하는데, 이 때 CpB 첨가 시기에 대해 확인해 보고자 하였다. 인슐린 C-펩타이드와 융합 태그(fusion tag)를 절단하기 위하여 클로스트리파인을 먼저 처리하고 잘린 부위의 아르지닌(Arg)을 제거하기 위해 CpB를 처리하는 순서로 진행하여야 하나, 제조 시간을 단축하기 위하여 클로스트리파인 처리 후 2시간 또는 4시간 후 CpB를 처리하는 조건과 클로스트리파인과 CpB를 동시에 처리하는 조건을 비교하였다.
그 결과, 도 5에서 볼 수 있듯이, 클로스트리파인과 CpB를 동시에 처리하여도 클로스트리파인을 먼저 처리하는 조건에 비해 효소 반응 양상이 다르지 않은 것으로 확인된바, 공정의 효율성 향상을 위하여 클로스트리파인과 CpB를 동시에 처리하기로 하였다.
5-3.
클로스트리파인과
CpB
동시 처리시 pH 조건
클로스트리파인의 최적 활성은 pH 7.4~7.8, CpB는 pH 9.0에서 최적 활성을 나타내는 것으로 알려져 있다. 두 효소의 최적 pH 범위가 다르므로, 동시에 처리하여 활성형 인슐린 전환 효율을 최대로 나타내는 pH를 확인하고자 하였다. 본 발명에서 표 2에 따른 모든 ABD-융합 인슐린 아날로그의 이론적 pI 값이 6에 가까워 침전이 우려되었다. 이에 pH 6.0이하의 조건은 제외하였고 pH 9.0이상 에서는 침전물(aggregate)이 증가하여 평가 범위는 pH 6.0~9.0 사이로 진행되었다.
pH 6.5~8.5 범위에서 두 효소를 동시에 처리하는 경우 높은 활성형 인슐린 전환 효율을 나타냈으나, 도 6에 나타난 바와 같이, pH 6.5~7.5 범위에서 활성형 인슐린 전환 효율이 특히 높은 것으로 확인되었다.
5-4.
클로스트리파인
및
DTT
추가 첨가에 따른 활성형 인슐린 전환 효율 평가
실시예 5-1에서 확인된 바와 같이 DTT를 첨가하는 경우 클로스트리파인에 의한 활성형 인슐린 전환 효율이 증가한다. 그러나 DTT의 반감기는 높은 pH와 온도에서 급격하게 짧아지는 것으로 알려져 있어 장시간의 효소 반응에서 클로스트리파인의 활성을 유지하기 어려운 것으로 판단되었다. 이에 클로스트리파인의 활성을 장시간 유지할 수 있는 방법을 탐색하고자 하였다.
이를 위하여 효소 반응 시작 시점부터 4.5시간 후 1 U/mg의 클로스트리파인을 추가로 첨가하는 방법과 0.2 mM의 DTT를 추가로 첨가하는 방법을 비교 평가한 결과, 도 7에 나타난 것과 같이 클로스트리파인을 추가로 첨가하여도 추가적인 활성형 전환 수율은 크게 증가하지 않았으나, DTT를 추가로 첨가하자 클로스트리파인의 첨가 없이도 활성형으로 전환되는 정도가 크게 증가하였다. 추가로 클로스트리파인과 DTT를 둘 다 첨가한 경우에는 상대적으로 미전환형이 적고, 활성형으로 전환수율이 높아진 것으로 관측되었다.
효소 반응액을 질량분석기를 통해 분석한 결과, DTT를 첨가하는 경우 활성형 인슐린의 전환 정도를 크게 증가시켰으나, DTT와 클로스트리파인을 동시에 추가하는 경우에는 오히려 인슐린의 비특이적 절단을 유도하여 불순물이 증가하는 것으로 나타나, 환원제인 DTT만 첨가하는 것이 인슐린의 활성형 전환에 유리함을 확인할 수 있었다(도 8 참조).
5-5. 온도에 따른 활성형 인슐린 전환 효율 평가
클로스트리파인과 CpB가 최적 활성을 보이는 온도범위를 확인하고자 하였다. 이때 생산스케일에서의 공정운영을 감안하여 4℃ 이하의 온도, 40℃ 이상의 온도 조건을 배제하고 10~30℃ 조건에서 평가하였다. 그 결과, 도 9에서와 같이, 10℃, 20℃, 30℃로 온도가 높아짐에 따라 미전환형이 적고, 활성형으로의 전환이 빠르게 진행되는 것을 알 수 있었다. 또한, DTT의 농도가 높을수록 활성형으로의 전환이 더 빠르게 진행되는 것을 확인하였다.
실시예
6.
ABD
-융합 인슐린 아날로그 정제
클로스트리파인과 CpB를 이용하여 효소처리된 샘플을 Fractogel® EMD COO- (M) (Merck사) 이온교환 수지 크로마토그래피를 사용하여 1차 정제한 후 Pharmprep® P100 RP-18e (Merck사)을 역상 크로마토그래피로 사용하여 2차 정제하였다.
그 결과, 도 10에서와 같이 2번의 정제 과정을 통해 활성형 ABD-융합 인슐린 아날로그를 정제할 수 있었다.
실시예
7.
ABD
-융합 인슐린 아날로그의 알부민 결합력 측정
ABD-융합 인슐린 아날로그 단백질의 알부민 결합력을 측정하기 위하여, 표면 플라스몬 공명 분석법을 이용하였다. CM5칩에 재조합 인간 혈청 알부민을 아민 커플링 방법으로 고정화 시키고, 5개 이상의 농도로 희석한 ABD 또는 ABD-융합 인슐린 아날로그를 결합시켜 인간 혈청 알부민에 대한 친화도를 확인하였다.
그 결과, 하기 표 3에서와 같이, ABD 대비 친화도가 낮아졌으나 pM 수준의 알부민 결합력이 유지됨을 확인할 수 있었다.
| Analogue | Ka (1/Ms) | Kd (1/s) | KD (M) |
| Analogue 1 | 4.54 × 105 | 2.37 × 10-5 | 5.21 × 10-11 |
| Analogue 2 | 4.42 × 105 | 3.14 × 10-5 | 7.11 × 10-11 |
| Analogue 3 | 2.51 × 105 | 4.36 × 10-5 | 1.74 × 10-10 |
| Analogue 4 | 4.64 × 105 | 3.32 × 10-5 | 7.17 × 10-11 |
| Analogue 5 | 3.26 × 105 | 3.13 × 10-5 | 9.6 × 10-11 |
| Analogue 6 | 3.27 × 105 | 4.75 × 10-5 | 1.45 × 10-10 |
| Analogue 7 | 7.87 × 105 | 5.26 × 10-5 | 6.68 × 10-11 |
| Analogue 8 | 3.7 × 105 | 6.46 × 10-5 | 1.75 × 10-10 |
| Analogue 9 | 4.77 × 105 | 3.76 × 10-5 | 7.9 × 10-11 |
| Analogue 10 | 6.25 × 105 | 4.23 × 10-5 | 6.77 × 10-11 |
| ABD | 5.93 × 106 | 2.41 × 10-5 | 7.29 × 10-12 |
실시예
8.
천연형
인슐린,
ABD
-융합 인슐린 아날로그의 수용체 친화도 비교
천연형 인슐린, ABD-융합 인슐린 아날로그의 인슐린 수용체 결합력을 측정하기 위하여, 표면 플라스몬 공명 분석법을 이용하였다. CM5칩에 인슐린 수용체를 아민 커플링 방법으로 고정화 시키고, 5개 이상의 농도로 희석한 천연형 인슐린, ABD-융합 인슐린 아날로그를 각각 결합시켜 인슐린 수용체 친화도를 확인하였다.
그 결과 표 4에 나타난 바와 같이, 천연형 인슐린 대비 대부분의 ABD-융합 인슐린 아날로그의 친화도가 감소되었는데 가장 큰 감소폭을 보이는 아날로그 3이 천연형 인슐린 대비 19.4% 수준으로 확인되었다.
ABD-융합 인슐린 아날로그의 약효는 streptozotocin로 유도한 1형 당뇨모델에서 인슐린 글라진과 비교 평가하였다. 인슐린 글라진 대비 50% 이하의 혈당 강하능을 보이는 아날로그 1번과 3번 그리고 10번은 후보물질에서 제외하였다.
| Analogue | Ka (1/Ms) | Kd (1/s) | KD (M) |
| Analogue 1 | 8.54 × 104 | - | - |
| Analogue 2 | 4.38 × 104 | 3.15 × 10-3 | 7.2 × 10-8 |
| Analogue 3 | 2.52 × 104 | 2.18 × 10-3 | 8.65 × 10-8 |
| Analogue 4 | 2.82 × 104 | 1.31 × 10-3 | 4.65 × 10-8 |
| Analogue 5 | 4.07 × 104 | 2.34 × 10-3 | 5.75 × 10-8 |
| Analogue 6 | 5.23 × 104 | 2.27 × 10-3 | 4.33 × 10-8 |
| Analogue 7 | 5.05 × 104 | - | - |
| Analogue 8 | 4.86 × 104 | 1.47 × 10-3 | 3.04 × 10-8 |
| Analogue 9 | 2.13 × 104 | 1.29 × 10-3 | 6.06 × 10-8 |
| Analogue 10 | 3.83 × 104 | - | - |
| Insulin | 1.03 × 105 | 1.72 × 10-3 | 1.68 × 10-8 |
실시예
9.
Hexamer
형성
인슐린은 체내에서 아연(zinc)과 결합하여 헥사머(hexamer)를 형성함으로써 안정된 구조를 갖는다. 헥사머(Hexamer)를 이루는 인슐린의 특성은 제형연구에도 활용되며 체내의 반감기를 증대 시키는데 중요한 역할을 할 수 있다. 이에 ABD-융합 인슐린 아날로그가 헥사머(hexamer) 형성의 특성을 유지하고 있는지 크기 배제 크로마토그래피 (size exclusion chromatography)로 분석하였다. 그 결과, 아날로그 4는 아연(zinc)과 페놀(phenol) 첨가에 따라 헥사머(hexamer)를 형성능을 유지하고 있음을 확인하였다(도 11). Hexamer의 형성은 아날로그 7번, 9번, 10번을 제외하고 모든 아날로그에서도 확인되었다. 이에, 표 2의 서열을 가진 아날로그 중 아날로그 7번과 9번은 hexamer를 형성하지 않는 것으로 확인되어 후보물질에서 제외하였다.
실시예
10.
ABD
-융합 인슐린 아날로그의 체내동태 (
pharmacokinetics
) 및 혈당
강하능
평가
ABD-융합 인슐린 아날로그 6종의 체내동태를 확인하기 위해 정상 랫트 (SD rat, 6주령)에 피하 투여한 후 0, 1, 4, 8, 24, 48, 72, 96 시간에 채혈하였다. 각 시간에서의 ABD-융합 인슐린 아날로그의 혈중 내 잔여 농도는 ELISA를 이용하여 측정하였다. 또한, 채혈된 일부의 혈액을 이용하여 시간에 따른 혈당 수준을 혈당측정기를 이용하여 측정하였다.
그 결과, 하기 표 5에서 볼 수 있듯이, 천연형 인슐린의 반감기는 5분으로 알려져 있는 것과 비교하여 ABD가 융합된 인슐린 아날로그는 크게 증가된 반감기를 나타냈다. 인슐린 B쇄 22번만 치환한 아날로그 11은 7.2 시간의 반감기를 보였으며, 가장 큰 반감기 증대를 보인 아날로그 4는 9.9시간의 반감기를 갖는 것으로 평가 되었다.
정상 동물에서 혈당을 낮추어 유지시키는 시간을 분석했을 때, 아날로그 5번, 6번, 8번은 반감기의 증대가 확인되었지만 혈당 유지시간이 짧은 것으로 나타났다. 이에 반해 아날로그 4는 혈당을 낮추는 능력도 가장 우수하였으며 약효 유지시간도 가장 오래 지속되는 것을 확인하였다 (도 12).
| Parameter | Analogue 2 | Analogue 4 | Analogue 5 | Analogue 6 | Analogue 8 | Analogue 11 |
| T 1/2 (hr) | 9.4 ±3.4 | 9.9 ± 0.1 | 9.1 ± 0.7 | 8.4 ± 1.7 | 8.8 ± 0.4 | 7.2 ± 2.3 |
| MRT (hr) | 17.0 ± 2.2 | 22.1 ± 1.3 | 21.2 ± 0.3 | 15.9 ± 1.5 | 19.8 ± 1.5 | 16.3 ±0.9 |
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 청구항들과 그들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> DAEWOONG PHARMACEUTICAL CO., LTD.
<120> METHOD FOR PRODUCING ACTIVE FORM OF LONG-ACTING INSULIN ANALOGUE
DERIVATIVE USING CLOSTRIPAIN
<130> P17-B267
<160> 13
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Fusion Tag
<400> 1
Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala His His His His His His
1 5 10 15
Ser Ser Gly Ser Ala Arg
20
<210> 2
<211> 30
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 2
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Lys Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr
20 25 30
<210> 3
<211> 35
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 3
Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly
1 5 10 15
Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu
20 25 30
Gln Ala Arg
35
<210> 4
<211> 21
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 4
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 5
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 5
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 6
<211> 46
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Engineered albumin binding polypeptide(ABD)
<400> 6
Leu Ala Glu Ala Lys Glu Ala Ala Asn Ala Glu Leu Asp Ser Tyr Gly
1 5 10 15
Val Ser Asp Phe Tyr Lys Lys Leu Ile Asp Lys Ala Lys Thr Val Glu
20 25 30
Gly Val Glu Ala Leu Lys Asp Ala Ile Leu Ala Ala Leu Pro
35 40 45
<210> 7
<211> 46
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Engineered albumin binding polypeptide
<400> 7
Leu Ala Glu Ala Lys Glu Ala Ala Asn Ala Glu Leu Asp Ser Tyr Gly
1 5 10 15
Val Ser Asp Phe Tyr Lys Lys Leu Ile Asp Lys Ala Lys Thr Val Glu
20 25 30
Gly Val Glu Ala Leu Lys Asp Glu Ile Leu Ala Ala Leu Pro
35 40 45
<210> 8
<211> 46
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Engineered albumin binding polypeptide
<400> 8
Leu Ala Glu Ala Lys Glu Ala Ala Asn Ala Glu Leu Asp Ser Tyr Gly
1 5 10 15
Val Ser Asp Phe Tyr Lys Lys Leu Ile Asp Lys Ala Lys Thr Val Glu
20 25 30
Gly Val Glu Ala Leu Lys Glu Ala Ile Leu Ala Ala Leu Pro
35 40 45
<210> 9
<211> 46
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Engineered albumin binding polypeptide
<400> 9
Leu Ala Glu Ala Lys Glu Ala Ala Asn Ala Glu Leu Asp Ser Tyr Gly
1 5 10 15
Val Ser Asp Phe Tyr Lys Lys Leu Ile Asp Lys Ala Lys Thr Val Glu
20 25 30
Gly Val Glu Ala Leu Lys Glu Glu Ile Leu Ala Ala Leu Pro
35 40 45
<210> 10
<211> 46
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Engineered albumin binding polypeptide
<400> 10
Leu Ala Glu Ala Lys Glu Ala Ala Asn Ala Glu Leu Asp Ser Tyr Gly
1 5 10 15
Val Ser Asp Phe Tyr Lys Lys Leu Ile Glu Lys Ala Lys Thr Val Glu
20 25 30
Gly Val Glu Ala Leu Lys Asp Ala Ile Leu Ala Ala Leu Pro
35 40 45
<210> 11
<211> 46
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Engineered albumin binding polypeptide
<400> 11
Leu Ala Glu Ala Lys Glu Ala Ala Asn Ala Glu Leu Asp Ser Tyr Gly
1 5 10 15
Val Ser Asp Phe Tyr Lys Lys Leu Ile Glu Lys Ala Lys Thr Val Glu
20 25 30
Gly Val Glu Ala Leu Lys Asp Glu Ile Leu Ala Ala Leu Pro
35 40 45
<210> 12
<211> 46
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Engineered albumin binding polypeptide
<400> 12
Leu Ala Glu Ala Lys Glu Ala Ala Asn Ala Glu Leu Asp Ser Tyr Gly
1 5 10 15
Val Ser Asp Phe Tyr Lys Lys Leu Ile Glu Lys Ala Lys Thr Val Glu
20 25 30
Gly Val Glu Ala Leu Lys Glu Ala Ile Leu Ala Ala Leu Pro
35 40 45
<210> 13
<211> 46
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Engineered albumin binding polypeptide
<400> 13
Leu Ala Glu Ala Lys Glu Ala Ala Asn Ala Glu Leu Asp Ser Tyr Gly
1 5 10 15
Val Ser Asp Phe Tyr Lys Lys Leu Ile Glu Lys Ala Lys Thr Val Glu
20 25 30
Gly Val Glu Ala Leu Lys Glu Glu Ile Leu Ala Ala Leu Pro
35 40 45
Claims (18)
- 천연형 인슐린에서 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 인슐린 B 쇄의 22번째 아미노산이 아르지닌(Arg)에서 라이신(Lys)으로 치환된 변이를 포함하고 알부민 결합 도메인이 결합된 인슐린 아날로그 복합체를 클로스트리파인과 반응시키는 단계;를 포함하는 지속형 인슐린 아날로그 복합체의 활성형 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 인슐린은 하기 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산이 추가로 치환된 것을 특징으로 하는 제조방법:
서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 인슐린 A 쇄의 3번째 아미노산이 발린(Val)에서 루신(Leu)으로 치환;
서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 인슐린 A 쇄의 8번째 아미노산이 트레오닌(Thr)에서 아스파르트산(Asp)으로 치환;
서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 인슐린 A 쇄의 10번째 아미노산이 이소루신(Ile)에서 라이신(Lys)으로 치환;
서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 인슐린 A 쇄의 14번째 아미노산이 티로신(Tyr)에서 글루탐산(Glu)으로 치환;
서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 인슐린 A 쇄의 19번째 아미노산이 티로신(Tyr)에서 페닐알라닌(Phe)으로 치환;
서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 인슐린 B 쇄의 5번째 아미노산이 히스티딘(His)에서 트레오닌(Thr)으로 치환;
서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 인슐린 B 쇄의 9번째 아미노산이 세린(Ser)에서 아스파르트산(Asp)으로 치환;
서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 인슐린 B 쇄의 13번째 아미노산이 글루탐산(Glu)에서 알라닌(Ala)으로 치환;
서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 인슐린 B 쇄의 17번째 아미노산이 루신(Leu)에서 글루타민(Gln)으로 치환; 및
서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 인슐린 B 쇄의 24번째 아미노산이 페닐알라닌(Phe)에서 세린(Ser)으로 치환. - 제1항에 있어서, 상기 알부민 결합 도메인은 하기 아미노산 서열로 표시되는 알부민 결합 모티프를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
GVSDFYKKLI XaKAKTVEGVE ALKXbXcI
상기에서, 서로 독립적으로,
Xa는 D와 E로부터 선택되고;
Xb는 D와 E로부터 선택되고;
Xc는 A와 E로부터 선택된다. - 제3항에 있어서, 상기 알부민 결합 도메인은 하기 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
LAX3AKX6X7ANX10ELDX14Y-[BM]-LX43X44LP
상기에서, [BM]은 제3항에서 정의된 바와 같은 알부민 결합 모티프이고,
서로 독립적으로,
X3는 C, E, Q 및 S로부터 선택되고;
X6는 C, E 및 S로부터 선택되고;
X7는 A 및 S로부터 선택되고;
X10는 A, R 및 S로부터 선택되고;
X14는 A, C, K 및 S로부터 선택되고;
X43는 A 및 K로부터 선택되고;
X44는 A, E 및 S로부터 선택된다. - 제4항에 있어서, 상기 알부민 결합 도메인은, 서열번호 6 내지 서열번호 13의 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
- 제5항에 있어서, 상기 알부민 결합 도메인은 서열번호 6의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 인슐린 아날로그와 알부민 결합 도메인은 펩타이드 결합; 폴리펩타이드 링커; 또는 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜-프로필렌 글리콜 공중합체, 폴리옥시에틸화폴리올, 폴리비닐알콜, 다당류, 덱스트란, 폴리비닐에틸에테르, 생분해성 고분자, 지방산, 뉴클레오티드, 지질중합체, 키틴, 히아루론산 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 비펩타이드성 링커를 통해 서로 결합된 것을 특징으로 하는 제조방법.
- 제7항에 있어서, 상기 폴리펩타이드 링커는 (GGGGS)n (n은 1 내지 6의 정수)인 것을 특징으로 하는 제조방법.
- 제8항에 있어서, 상기 폴리펩타이드 링커는 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 클로스트리파인과의 반응시 환원제를 첨가하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
- 제10항에 있어서, 상기 환원제는 시스테인(cysteine), b-머캅토에탄올(b-mercaptoethanol), TCEP(Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride), GSH(Glutathione) 및 DTT(Dithiothreitol )로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
- 제10항에 있어서, 상기 환원제로 0.1~0.5 mM의 DTT를 첨가하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
- 제12항에 있어서, 상기 DTT는 인슐린 아날로그 복합체와 클로스트리파인과의 반응 초기에 첨가하고, 반응 3~6시간 후 추가로 첨가하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 클로스트리파인과의 반응시 또는 클로스트리파인과의 반응 이후 카르복시펩티다아제 B(carboxypeptidase B, CpB)를 첨가하여 반응시키는 것을 특징으로 하는 제조방법.
- 제14항에 있어서, 상기 클로스트리파인 및/또는 카르복시펩티다아제 B(carboxypeptidase B, CpB)는 pH 6.0~9.0인 조건에서 반응시키는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제15항에 있어서, 상기 클로스트리파인 및/또는 카르복시펩티다아제 B(carboxypeptidase B, CpB)는 pH 6.5~7.5인 조건에서 반응시키는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제14항에 있어서, 상기 클로스트리파인 및/또는 카르복시펩티다아제 B(carboxypeptidase B, CpB)는 4~40℃인 조건에서 반응시키는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 제조방법으로 제조된 활성형의 지속형 인슐린 아날로그 복합체.
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