WO2010067543A1 - ポリ－３－ヒドロキシアルカン酸の製造方法およびその凝集体 - Google Patents

ポリ－３－ヒドロキシアルカン酸の製造方法およびその凝集体 Download PDF

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poly
hydroxyalkanoic acid
pha
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aggregate
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滝田昌輝
柳田義文
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Kaneka Corp
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    • Y10T428/2982—Particulate matter [e.g., sphere, flake, etc.]

Definitions

  • the present invention relates to a method of forming poly-3-hydroxyalkanoic acid aggregates from an aqueous poly-3-hydroxyalkanoic acid suspension and aggregates obtained thereby.
  • Poly-3-hydroxyalkanoic acid (hereinafter abbreviated as PHA) is a thermoplastic polyester that is produced and stored as an energy storage substance in cells of many microbial species and has biodegradability.
  • PHA Poly-3-hydroxyalkanoic acid
  • non-petroleum-derived plastics are attracting attention due to increased environmental awareness.
  • biodegradable plastics such as PHA which are taken into the natural material circulation and do not harm the decomposition products are attracting attention, and their practical application is eagerly desired.
  • PHA produced and accumulated by microorganisms in the microbial cells is expected to have little adverse effect on the ecosystem because it is incorporated into the natural carbon cycle process.
  • PHA produced by microorganisms usually forms granules and accumulates in the cells of the microorganisms
  • a process of separating and removing the PHA from the cells of the microorganisms is necessary. It is.
  • Patent Document 1 a method of solubilizing and removing biological components other than PHA by physical treatment, chemical treatment or biological treatment.
  • Patent Document 2 a method of solubilizing and removing biological components other than PHA by physical treatment, chemical treatment or biological treatment.
  • Patent Document 3 a method of combining a treatment for crushing PHA-containing microbial cells and a surfactant treatment (Patent Document 1), a method of performing a crushing treatment after adding an alkali and performing a heat treatment (Patent Document 2), and the like can be mentioned.
  • Patent Document 3 a method has been proposed in which an aqueous suspension of microbial cells is treated with sodium hypochlorite or an enzyme to solubilize biological components other than PHA to obtain PHA.
  • Patent Document 4 a method of heating the PHA suspension
  • Patent Document 5 a method of repeating heating and cooling
  • the present invention when industrially separating and purifying PHA produced by microorganisms, reduces the amount of contaminants derived from bacterial cell constituents and suppresses the amount of organic solvent used, such as salts and polymer flocculants. It is an object of the present invention to obtain PHA particles having an arbitrary volume average particle diameter with high productivity without performing addition or high temperature treatment.
  • the present inventors can add a salt or a polymer flocculant at a relatively low temperature without heating to near the melting point of PHA.
  • the present invention was completed by finding that PHA aggregates.
  • the present invention relates to a method for producing PHA, wherein the pH of an aqueous PHA suspension is adjusted to an acidic region to obtain an aggregate of PHA.
  • the acidic region is preferably an acidic region having a pH of 2 or more.
  • the amount of organic nitrogen present in the aqueous PHA suspension is preferably 6000 ppm or less per PHA weight.
  • the solvent contained in the PHA aqueous suspension preferably contains water, an organic solvent compatible with water, or a mixed solvent of water and the organic solvent.
  • PHA is a group consisting of 3-hydroxypropionate, 3-hydroxybutyrate, 3-hydroxyvalerate, 3-hydroxyhexanoate, 3-hydroxyheptanoate, and 3-hydroxyoctanoate
  • a copolymer composed of two or more selected 3-hydroxyalkanoic acids is preferred.
  • PHA is a two-component copolymer of 3-hydroxyhexanoate and 3-hydroxybutyrate, or a three-component copolymer of 3-hydroxyhexanoate, 3-hydroxybutyrate, and 3-hydroxyvalerate. It is preferably a coalescence.
  • PHA is preferably produced using microorganisms.
  • the microorganism is preferably a microorganism belonging to the genus Aeromonas, Alkagenes, Ralstonia, or Capriavidas.
  • the microorganism is a Capriavidas necker.
  • the present invention also relates to a PHA aggregate having an organic nitrogen content of 500 ppm or less produced by the above method.
  • the PHA aggregate has a volume average particle diameter of 20 ⁇ ⁇ .
  • the PHA produced by the microorganism can be purified without an extraction operation with an organic solvent, and the temperature is lower than the melting point of PHA without adding a third component such as a salt or a polymer flocculant.
  • a third component such as a salt or a polymer flocculant.
  • Can aggregate PHA It is possible to obtain a PHA aggregate with good productivity and less fine powder while preventing contamination of bacterial cell constituents. The obtained PHA aggregate does not need to be concerned about the influence on the quality due to the addition of the third substance, and the molecular weight reduction of PHA due to heating can be avoided.
  • the microorganism used in the present invention is not particularly limited as long as it is a microorganism that generates PHA in cells.
  • a microorganism isolated from nature, a microorganism deposited at a depositary of a strain (for example, IFO, ATCC, etc.), or a mutant or transformant that can be prepared from them can be used.
  • the genus Capriavidus, the genus Alcaligenes, the genus Ralstonia, the genus Pseudomonas, the genus Bacillus, the genus Azotobacter, the genus Nocardia examples include bacteria.
  • microorganisms belonging to the genus Aeromonas, Alkagenes, Ralstonia, or Capriavidas are preferred.
  • strains such as A. lipolytica, A. latus, Aeromonas caviae, A. hydrophila, C. necator, etc. Is more preferable, and Capriavidas nexator is most preferable.
  • a transformant obtained by introducing a target PHA synthase gene and / or a mutant thereof into the microorganism Can also be used.
  • the PHA synthase gene used for the preparation of such a transformant is not particularly limited, but a PHA synthase gene derived from Aeromonas caviae is preferred. By culturing these microorganisms under appropriate conditions, it is possible to obtain microbial cells that accumulate PHA in the cells.
  • the culture method is not particularly limited. For example, the method described in JP-A No. 05-93049 is used.
  • PHA is a general term for polymers having 3-hydroxyalkanoic acid as a monomer unit.
  • the 3-hydroxyalkanoic acid constituting the compound is not particularly limited, and specifically, a copolymer of 3-hydroxybutyrate (3HB) and another 3-hydroxyalkanoic acid, or 3-hydroxyhexanoate ( And a copolymer of 3-hydroxyalkanoic acid containing 3HH).
  • 3-hydroxypropionate, 3-hydroxybutyrate, 3-hydroxyvalerate, 3-hydroxyhexanoate, 3-hydroxyheptanoate and 3-hydroxyoctanoate examples also include copolymers having the above 3-hydroxyalkanoic acid as a monomer unit.
  • a copolymer containing 3HH as a monomer unit for example, a two-component copolymer (PHBH) of 3HB and 3HH (Macromolecules, 28, 4822-4828 (1995)), or 3HB and 3-hydroxyvalerate ( 3HV) and 3HH ternary copolymer (PHBVH) (Japanese Patent No. 2777757, Japanese Patent Application Laid-Open No. 08-289797) are more preferred from the viewpoint of the physical properties of the resulting polyester.
  • PHBH two-component copolymer
  • 3HV 3-hydroxyvalerate
  • PHBVH 3HH ternary copolymer
  • composition ratio of each monomer unit constituting the two-component copolymer PHBH of 3HB and 3HH is not particularly limited, but when the total of all monomer units is 100 mol%, 3HH units are 1 to A composition ratio of 99 mol%, preferably 1 to 50 mol%, more preferably 1 to 25 mol% is suitable.
  • composition ratio of each monomer unit constituting the three-component copolymer PHBVH of 3HB, 3HV, and 3HH is not particularly limited, but when the total of all the monomer units is 100 mol%, for example,
  • the composition ratio of 3HB units is preferably 1 to 95 mol%
  • the composition ratio of 3HV units is 1 to 96 mol%
  • the composition ratio of 3HH units is preferably 1 to 30 mol%.
  • an acid is added to the aqueous PHA suspension in order to adjust the pH of the aqueous PHA suspension to the acidic region in carrying out the aggregation step.
  • the acid used for this purpose is not particularly limited, and may be either an organic acid or an inorganic acid, and may be volatile. Also, for example, any of strong acids such as sulfuric acid and hydrochloric acid, and weak acids such as phosphoric acid and acetic acid can be used.
  • the pH of the aqueous PHA suspension during aggregation is preferably an acidic region of pH 2 or higher, more preferably an acidic region of pH 3 or higher, and further preferably an acidic region of pH 4 or higher.
  • the upper limit of the preferred acidic region is an acidic region having a pH of 7 or less, more preferably an acidic region having a pH of 6 or less, and even more preferably an acidic region having a pH of 5 or less.
  • a heating operation can be performed during the aggregation step.
  • the heating temperature at that time is not particularly limited, but is lower than the melting point of PHA, preferably 5 ° C. or more, preferably 10 ° C. or more, more preferably 20 to 30 ° C. lower than the melting point of PHA. .
  • a lower temperature is desirable to prevent the molecular weight reduction of PHA. Specifically, it is preferably 150 ° C. or lower, more preferably 120 ° C.
  • heating temperature is not specifically limited, In order to manufacture the aggregate with a larger particle size, 20 degreeC or more is preferable and 30 degreeC or more is more preferable.
  • time required for the temperature rise differs depending on the apparatus size and capacity, it is necessary to sufficiently heat until reaching a temperature at which PHA aggregates and the particle size increases.
  • the heating time is approximately 5 hours or less, preferably 2 hours or less, more preferably 1 hour or less, and even more preferably 30 minutes or less after reaching the heating temperature. Heating for at least 1 second or more is preferred.
  • the PHA concentration in the aqueous PHA suspension is not particularly limited, but in consideration of the influence of stirring, it is preferably 40% by weight or less, more preferably 20% by weight or less, and still more preferably 10% by weight or less.
  • the lower limit of the PHA concentration is not particularly limited, but is preferably 1% by weight or more for efficient aggregation. These operations may be continuous or batch.
  • the aqueous suspension may or may not be stirred.
  • Aggregation in the present invention means that the volume average particle size of PHA particles is 5 times or more, preferably 10 times or more, more preferably 15 times or more than the PHA volume average particle size before the aggregation operation. Yes.
  • the solvent contained in the aqueous suspension in the present invention may include water, an organic solvent compatible with water, or a mixed solvent of water and the organic solvent.
  • the organic solvent may be used alone or in combination of two or more.
  • the concentration of the organic solvent in the mixed solvent of water and the organic solvent is not particularly limited as long as it is not more than the solubility of the organic solvent to be used in water.
  • the organic solvent compatible with water is not particularly limited, but for example, methanol, ethanol, 1-propanol, 2-propanol, 1-butanol, 2-butanol, iso-butanol, pentanol, hexanol , Alcohols such as heptanol, ketones such as acetone and methyl ethyl ketone, ethers such as tetrahydrofuran and dioxane, nitriles such as acetonitrile and propionitrile, amides such as dimethylformamide and acetamide, dimethyl sulfoxide, pyridine and piperidine Can be mentioned.
  • methanol, ethanol, 1-propanol, 2-propanol, 1-butanol, 2-butanol, iso-butanol, acetone, methyl ethyl ketone, tetrahydrofuran, dioxane, acetonitrile, propionitrile, etc. are easy to remove. Is preferred. Further, methanol, ethanol, 1-propanol, 2-propanol, 1-butanol, 2-butanol, iso-butanol, acetone and the like are more preferable because they are easily available. More preferred are methanol, ethanol, and acetone. In addition, as long as the essence of the present invention is not impaired, other solvents and components derived from bacterial cells and compounds generated during purification may be included.
  • impurities contained in the aqueous PHA suspension Prior to the aggregation step for aggregating PHA by adjusting the pH of the aqueous PHA suspension to the acidic region, impurities contained in the aqueous PHA suspension (particularly derived from biological components or culture substrates other than PHA) It is preferable to reduce the amount of organic nitrogen in the aqueous PHA suspension by performing a step of decomposing and / or removing the component. As a result, PHA is efficiently aggregated in the subsequent aggregation process, and acquisition of PHA having a high degree of purification is facilitated. As a measure of the decomposition and / or removal of impurities, it can be expressed by the amount of organic nitrogen per PHA weight contained in the aqueous PHA suspension.
  • the amount of organic nitrogen is preferably 6000 ppm or less per PHA weight, more preferably 4000 ppm or less, still more preferably 2000 ppm or less, even more preferably 1500 ppm or less, and most preferably 1000 ppm or less.
  • the crushing method is not particularly limited, but conventionally known methods such as French press, homogenizer, X-press, ball mill, colloid mill, DYNO mill, ultrasonic homogenizer, etc., utilizing fluid shear force, solid shear force, and grinding Can be used.
  • methods using drugs such as acids, alkalis, surfactants, organic solvents, cell wall synthesis inhibitors, methods using enzymes such as lysozyme, pectinase, cellulase, thymolyase, methods using supercritical fluids, and osmotic pressure crushing methods , Freezing method, dry pulverization method and the like.
  • a self-digestion method using the action of protease, esterase and the like contained in the cell itself is also a kind of disruption method.
  • the crushing method it is desirable to select a method for suppressing a decrease in molecular weight of PHA due to a series of treatments.
  • these crushing methods may be used independently and may combine several methods. Further, batch processing may be performed, or continuous processing may be performed.
  • the PHA aqueous suspension obtained by crushing PHA-containing cells by the above method contains proteins, nucleic acids, lipids, sugar components, other cell components, and culture substrate residues in cells. It is mixed. It is preferable to carry out a dehydration step for separating water containing these proteins and the like before the decomposition and / or removal step described below. Thereby, the amount of impurities contained in the aqueous PHA suspension can be reduced, and the subsequent decomposition and / or removal process can be efficiently performed.
  • a method of dehydration The method by filtration, centrifugation, and sedimentation separation is mentioned.
  • the concentration of PHA in the aqueous suspension subjected to the decomposition and / or removal step is not particularly limited, but is preferably 50 g / L or more, more preferably 100 g / L or more, still more preferably 200 g / L or more, and even more preferably. 300 g / L or more. Further, the dehydration step may be performed for the purpose of adjusting the concentration of PHA in the aqueous suspension.
  • the method for decomposing and / or removing impurities such as biological components other than PHA is not particularly limited, and examples thereof include a method using an enzyme.
  • the enzyme used include proteolytic enzymes, lipolytic enzymes, cell wall degrading enzymes, and nucleolytic enzymes. Specific examples of these enzymes include the following. These may be used alone or in combination of two or more.
  • Enzymes used for degrading impurities such as biological components other than PHA are limited to the above. However, any enzyme that has an activity of degrading biological components may be used as long as it can be used for industrial products.
  • commercially available enzyme detergents for washing can be used.
  • it may be an enzyme composition containing an enzyme stabilizer, a recontamination preventive agent and the like and an enzyme, and is not limited to the enzyme alone.
  • proteolytic enzymes that are included in the above examples, protease A, protease P, protease N (above, Amano Enzyme), esperase, alcalase, zabinase, Everase (above, Novozyme) etc. are industrial. It can be preferably used from the viewpoint of decomposition activity. However, it is not limited to these.
  • the enzyme treatment time is preferably carried out until a desired degree of treatment is achieved, and is usually 0.5 to 2 hours.
  • the amount of the enzyme used depends on the type and activity of the enzyme and is not particularly limited, but is preferably 0.001 to 10 parts by weight with respect to 100 parts by weight of PHA, and more preferably 0.001 to 5 parts by weight from the viewpoint of cost. Part is more preferred.
  • Other methods for decomposing impurities such as biological components other than PHA include methods using hypochlorous acid and hydrogen peroxide.
  • hypochlorous acid the pH of the system is set to an alkaline region, and PHA with a low residual amount of chlorine can be obtained by carrying out the process under conditions where heat, light, and contact with metal are suppressed.
  • the pH is desirably 8 or more, more desirably 10 or more, and further desirably 12 or more.
  • the treatment temperature is preferably 40 ° C. or lower, more preferably 30 ° C. or lower, further preferably 20 ° C. or lower, and preferably 10 ° C. or lower in order to reliably exhibit the effect.
  • filtration, centrifugation, or the like can be performed in order to separate PHA and water containing impurities such as other biological components.
  • the filtration method is not particularly limited, but a method using Nutsche or the like, or a method such as suction filtration or pressure filtration is desirable.
  • filtration devices with pressing functions such as filter presses, tube presses, plate presses, gauge presses, belt presses, screw presses, disc presses, centrifugal dehydrators, and multi-chamber cylindrical filters can be selected. is there.
  • a continuous type such as a multi-chamber cylindrical filter is desirable.
  • Examples of a method for removing particles from a continuous filter include a string method, a scraper method, and a precoat scraper method.
  • a membrane separation method may be used.
  • a filtration method including membrane separation dead-end filtration or cross-flow filtration can be selected. Any of these can be selected based on filterability, the degree of blockage of the filter medium, membrane, and the like.
  • the pressure may be reduced, vacuumed, or pressurized.
  • a method using centrifugal force may be used.
  • Various materials such as paper, woven fabric, nonwoven fabric, screen, sintered plate, unglazed, polymer film, punching metal, and wedge wire can be selected as the filter medium. Either can be selected based on productivity and the degree of blockage.
  • a filter aid may or may not be used. When using a filter aid, there are a method of pre-coating the filter medium (pre-coating method) and a method of pre-adding to the filter stock solution (body feed method).
  • the method of centrifugation in the dehydration step is not particularly limited, but a centrifugal sedimentator, a centrifugal dehydrator, or the like can be used. If it is a centrifugal settling machine, a separator plate type, a cylindrical type, and a decanter type are mentioned. Examples of the separation plate type include a disk type, a self-cleaning type, a nozzle type, a screw decanter type, and a skimming type. There are a batch type and a continuous type depending on the method of discharging sedimentation components. As for the centrifugal dehydrator, there are a batch type and a continuous type. With these devices, it is possible to separate the sediment containing PHA and the culture solution components by the specific gravity difference.
  • dehydration step Other methods that can be used in the dehydration step include flotation, electrophoresis, and cyclone treatment. Methods such as filtration, centrifugation, and flotation may be used alone or in combination.
  • the recovered PHA can be washed with water or the like to obtain a PHA with a further increased degree of purification.
  • an organic solvent other than water may be used, or water and an organic solvent may be mixed and used.
  • the pH of water may be adjusted.
  • an organic solvent preferably a hydrophilic solvent, specifically methanol, ethanol, acetone, acetonitrile, tetrahydrofuran, ketones, amines, or the like is used.
  • a surfactant or the like may be added to water.
  • a mixture of a plurality of these organic solvents and water may be used.
  • a culture process for culturing a microorganism having the ability to produce PHA in cells a crushing process for crushing the microorganism containing PHA, and an aqueous solution containing the crushed microorganism
  • a dehydration step for separating water from the suspension a purification step for decomposing and / or removing impurities, a washing step for washing PHA, and a PHA aggregate by adjusting the pH of the obtained PHA aqueous suspension to an acidic region
  • PHA agglomerates can be efficiently produced.
  • the present invention does not necessarily require that all the steps described above be performed.
  • the PHA aggregate having a high degree of purification can be obtained by performing the aggregation step of the present invention after performing the purification step and / or the washing step for decomposing and / or removing impurities derived from the cells and the culture substrate in this way. Can be obtained. Further, if necessary, the obtained aggregate is further washed by the above-described washing methods, whereby a PHA aggregate having a higher degree of purification can be obtained.
  • the volume average particle size of the obtained PHA aggregate is preferably 20 ⁇ m or more, more preferably 30 ⁇ m or more, and further preferably 100 ⁇ m or more.
  • the upper limit is not particularly limited, a PHA aggregate having a volume average particle size of about 5000 ⁇ m or less can be obtained according to the present invention.
  • the PHA aggregate having a low organic nitrogen content thus prepared is easy to process from the viewpoint of volume average particle size.
  • it since it has few impurities, it can be expected to be used in various applications, for example, general-purpose products such as films and bottles, as well as medical applications because of its low allergen.
  • the amount of organic nitrogen in the solid content was calculated by comparing this absorbance with a calibration curve prepared using a leucine sample.
  • the amount of organic nitrogen per weight of solid content was defined as the amount of organic nitrogen (per PHA weight) in the aqueous PHA suspension.
  • Example 1 Preparation of cell culture solution Ralstonia eutropha KNK-005 strain described in International Publication No. 2008/010296 [0049] was cultured by the method described in [0050]-[0053] and PHA A bacterial cell culture solution containing bacterial cells containing Ralstonia and Eutropha are now classified as Capriavidas Necka.
  • Example 2 Sterilization Method The bacterial cell culture solution obtained in Example 1 was sterilized by heating and stirring at an internal temperature of 60 to 80 ° C. for 20 minutes.
  • Example 3 0.2% by weight sodium dodecyl sulfate was added to the sterilized bacterial cell culture solution obtained in Example 2. Furthermore, after adding sodium hydroxide so that pH might be set to 11.0, it heat-retained at 50 degreeC for 1 hour. Thereafter, high-pressure crushing was performed at a pressure of 450 to 550 kgf / cm 2 using a high-pressure crusher (high-pressure homogenizer model PA2K manufactured by Niroso Avi).
  • the pH of this aqueous PHA suspension was adjusted to 3, 4, 5, 6 or 7 using sulfuric acid, and the temperature was adjusted to 30 ° C., 50 ° C. or 70 ° C. with stirring to cause aggregation.
  • the heating time was 60 ° C.
  • the volume average particle diameter of the obtained aggregate was measured using a particle size measuring apparatus (manufactured by Shimadzu Corporation, SALD-300V type). The results are shown in Table 1. From this, it was found that as the pH of the aqueous PHA suspension is made more acidic, PHA tends to aggregate even at lower temperatures.
  • Example 4 0.2% by weight sodium dodecyl sulfate was added to the sterilized bacterial cell culture solution obtained in Example 2. Furthermore, after adding sodium hydroxide so that pH might be set to 11.0, it heat-retained at 50 degreeC for 1 hour. Thereafter, high-pressure crushing was performed at a pressure of 450 to 550 kgf / cm 2 using a high-pressure crusher (high-pressure homogenizer model PA2K manufactured by Niroso Avi).
  • the pH of this aqueous PHA suspension was adjusted to 4 using sulfuric acid, and the temperature was adjusted to 70 ° C. while stirring to cause aggregation over 30 minutes.
  • the volume average particle size of the obtained aggregate was measured using a particle size measuring device (SALD-300V type, manufactured by Shimadzu Corporation)
  • SALD-300V type manufactured by Shimadzu Corporation
  • the volume average particle size before the aggregation operation was 1.5.
  • the volume average particle diameter after the operation was 218.2 ⁇ high.
  • the obtained aggregate was washed with alkaline water having a pH of 11.5 and methanol.
  • the organic nitrogen content of the PHA aggregate after washing was 426 ppm per PHA. Thereby, a PHA aggregate having an organic nitrogen content of 500 ppm or less could be obtained.

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Abstract

　微生物が産生するポリ－３－ヒドロキシアルカン酸を工業的に分離・精製するに際し、菌体構成成分に由来する夾雑物を低減しつつ、有機溶媒の使用量を抑制し、かつ、生産性よく任意の体積平均粒径のポリ－３－ヒドロキシアルカン酸凝集体を得ることができる。本発明では、ポリ－３－ヒドロキシアルカン酸水性懸濁液のｐＨを酸性領域に調整してポリ－３－ヒドロキシアルカン酸の凝集体を得る。

Description

ポリ－３－ヒドロキシアルカン酸の製造方法およびその凝集体
　本発明は、ポリ－３－ヒドロキシアルカン酸水性懸濁液からポリ－３－ヒドロキシアルカン酸凝集体を形成する方法、及びそれにより得られる凝集体に関する。
　ポリ－３－ヒドロキシアルカン酸（以後、ＰＨＡと略す）は、多くの微生物種の細胞にエネルギー蓄積物質として生成、蓄積される熱可塑性ポリエステルであり、生分解性を有している。現在、環境への意識の高まりから非石油由来のプラスチックが着目されている。中でも、自然界の物質循環に取り込まれ分解生成物が有害とならないＰＨＡの様な生分解性プラスチックが注目されており、その実用化が切望されている。特に、微生物が菌体内で生成蓄積するＰＨＡは、自然界の炭素循環プロセスに取り込まれることから生態系への悪影響が小さいと予想されている。
　微生物が生成するＰＨＡは、通常顆粒体を形成してその微生物の菌体内に蓄積されるため、ＰＨＡをプラスチックとして利用するためには、微生物の菌体内からＰＨＡを分離して取り出すという工程が必要である。また、プラスチックとして使用するためにはＰＨＡの純度を高くし、菌体構成成分等の夾雑物の含有量を低くすることが望まれる。
　ＰＨＡ以外の生物由来成分を分解および／または除去する方法として、ＰＨＡ以外の生物由来成分を物理的処理、化学的処理または生物学的処理によって可溶化させて除去する方法が提案されている。例えば、ＰＨＡ含有微生物菌体を破砕する処理と界面活性剤処理を組み合わせる方法（特許文献１）、アルカリを添加し加熱処理を行った後に破砕処理を行う方法（特許文献２）などが挙げられる。その他、微生物菌体の水性懸濁液を次亜塩素酸ナトリウムや酵素などで処理してＰＨＡ以外の生物由来成分を可溶化し、ＰＨＡを得る方法（特許文献３）も提案されている。
　また、ＰＨＡ含有微生物の菌体を破砕もしくはＰＨＡ以外の生物由来成分を可溶化して得た水性懸濁液からＰＨＡを取り出す手段としては、遠心分離機やろ過などの分離操作、あるいはスプレードライなどの乾燥操作が挙げられる。ただし、菌体が生産したＰＨＡ粒子をそのまま一次粒子として取り出すと、微粉が多くなり、製品としてのハンドリングが困難となるという問題を抱えている。
　塩などを添加すると微細なスラリー状固液分散液中の固体粉末を凝集できることは一般に知られている。しかし、ＰＨＡに加えて、タンパク質など、破砕された細胞から漏出する細胞質成分を含む水性懸濁液から目的のＰＨＡだけを凝集させることは極めて困難であり、いまだにその例がない。活性汚泥処理などに広く用いられる硫酸アルミニウムなどを用いても、水性懸濁液中のほぼ全ての成分を凝集させてしまうため目的物であるＰＨＡだけを選択的に凝集させることはできない。また、高分子凝集剤などで選択的にＰＨＡを凝集できたとしてもこれらの添加剤はＰＨＡと分離することが困難であるため、高分子材料としての品質に影響を及ぼしてしまう。
　凝集剤によらない方法としては、ＰＨＡ懸濁液を加熱する方法（特許文献４）、加熱と冷却を繰り返す方法（特許文献５）などが知られていた。いずれの方法でもＰＨＡの融点付近まで加熱するため、加熱に伴うＰＨＡの分子量低下が懸念されていた。
　一方、ＰＨＡを有機溶媒に溶解した後、溶解度の低い有機溶媒や水を添加することで、溶解したＰＨＡを析出させる方法が知られていた。この方法によると、ＰＨＡ溶液を精製できるため、最も純度の高いＰＨＡが得られていた。このような溶媒抽出方法として、低級ケトンなどを抽出溶剤とする例（特許文献６）、テトラヒドロフランを用いる例（特許文献７）などが報告されている。ＰＨＡを溶解した有機溶媒に貧溶媒を添加すれば、ＰＨＡを析出させることができ、添加する溶媒種や、温度や添加量などの添加条件や、添加時の攪拌条件などにより析出体の形状や大きさを比較的任意にコントロールすることが可能であった。
　このように有機溶媒からＰＨＡを析出させることで析出物の形状や大きさをコントロールできる点は、水溶性溶媒を用いて精製したＰＨＡに微粉が多いという課題に対して非常に有効なものであった。しかし、抽出する際に大量の有機溶媒を使用する点や、そもそも分解性の高いＰＨＡを溶解させるためにこれを加熱すると、精製工程においてＰＨＡの分子量が低下してしまう点など根本的な課題を抱えていた。
　このように、微生物が産生するＰＨＡを工業的に分離・精製する際、菌体構成成分に由来する夾雑物を低減しつつ、環境に配慮し、かつ、生産性よく任意の体積平均粒径のＰＨＡ粒子を得ることが出来ないという問題が存在していた。さらに、ＰＨＡ粒子の凝集を支配しているパラメータが不明であったために、この課題の解決策の提示はより困難を極めていた。
特表平０８－５０２４１５号公報 国際公開第２００４／０６５６０８号 特開２００５－３４８６４０号公報 特表２０００－５０２３９９号公報 特表２００２－５１７５８２号公報 特表平１０－５０４４６０号公報 特開平０７－７９７８８号公報
　本発明は、微生物が産生するＰＨＡを工業的に分離・精製するに際し、菌体構成成分に由来する夾雑物を低減しつつ、有機溶媒の使用量を抑制し、塩や高分子凝集剤などの添加や高温処理を行わず、かつ、生産性よく任意の体積平均粒径のＰＨＡ粒子を得ることを課題とする。
　本発明者らは、ＰＨＡを含む水性懸濁液のｐＨを酸性領域に調整することで、ＰＨＡの融点付近まで加熱することなく比較的低温で塩や高分子凝集剤などの添加をせずともＰＨＡが凝集することを見出し、本発明を完成させた。
　本発明は、ＰＨＡ水性懸濁液のｐＨを酸性領域に調整して、ＰＨＡの凝集体を得ることを特徴とする、ＰＨＡの製造方法に関する。
　本発明では、酸性領域がｐＨ２以上の酸性領域であることが好ましい。
　本発明では、ＰＨＡ水性懸濁液中に存在する有機窒素量がＰＨＡ重量当たり６０００ppm以下であることが好ましい。
　本発明では、ＰＨＡ水性懸濁液に含まれる溶媒が、水、水と相溶性のある有機溶媒、又は、水と前記有機溶媒との混合溶媒を含むことが好ましい。
　本発明では、ＰＨＡが、３－ヒドロキシプロピオネート、３－ヒドロキシブチレート、３－ヒドロキシバレレート、３－ヒドロキシヘキサノエート、３－ヒドロキシヘプタノエート、および３－ヒドロキシオクタノエートからなる群より選択される２種以上の３－ヒドロキシアルカン酸から構成される共重合体であることが好ましい。
　本発明では、ＰＨＡが、３－ヒドロキシヘキサノエートと３－ヒドロキシブチレートの２成分共重合体、または３－ヒドロキシヘキサノエートと３－ヒドロキシブチレートと３－ヒドロキシバレレートの３成分共重合体であることが好ましい。
　本発明では、ＰＨＡが、微生物を用いて産出されることが好ましい。
　本発明では、微生物が、アエロモナス属、アルカリゲネス属、ラルストニア属、または、カプリアビダス属に属する微生物であることが好ましい。
　本発明では、微生物が、カプリアビダス・ネケータであることが好ましい。
　また本発明は、上記方法で製造される有機窒素量が５００ｐｐｍ以下であるＰＨＡ凝集体にも関する。
　前記ＰＨＡ凝集体は、体積平均粒径が２０・壕ネ上であることが好ましい。
　本発明によると、微生物が産出したＰＨＡを有機溶媒による抽出操作によらず精製することができ、しかも、塩や高分子凝集剤などの第三成分を添加せず、ＰＨＡの融点よりも低い温度でＰＨＡを凝集させることができる。菌体構成成分の混入を防ぎつつ、生産性よく、微粉の少ないＰＨＡ凝集体を得ることができる。得られるＰＨＡ凝集体は、第三物質添加による品質への影響を懸念する必要がなくなり、また、加熱によるＰＨＡの分子量低下を避けることができる。
　本発明に用いる微生物は、細胞内にＰＨＡを生成する微生物である限りにおいて、特に限定されない。天然から単離された微生物や菌株の寄託機関（例えばＩＦＯ、ＡＴＣＣ等）に寄託されている微生物、または、それらから調製し得る変異体や形質転換体等を使用できる。例えばカプリアビダス（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ）属、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）属、シュウドモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、アゾトバクター（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）属、ノカルディア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）属、アエロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）属の菌等が挙げられる。なかでも、アエロモナス属、アルカリゲネス属、ラルストニア属、または、カプリアビダス属に属する微生物が好ましい。特に、アルカリゲネス・リポリティカ（Ａ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、アルカリゲネス・ラトゥス（Ａ．ｌａｔｕｓ）、アエロモナス・キャビエ（Ａ．ｃａｖｉａｅ）、アエロモナス・ハイドロフィラ（Ａ．ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）、カプリアビダス・ネケータ（Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ）等の菌株がより好ましく、カプリアビダス・ネケータが最も好ましい。また、微生物が、本来ＰＨＡの生産能力を有しない場合、もしくは生産量が低い場合には、該微生物に目的とするＰＨＡの合成酵素遺伝子および／またはその変異体を導入し、得られる形質転換体を用いることもできる。このような形質転換体の作製に用いるＰＨＡの合成酵素遺伝子としては特に限定されないが、アエロモナス・キャビエ由来のＰＨＡ合成酵素の遺伝子が好ましい。これら微生物を適切な条件で培養することで、菌体内にＰＨＡを蓄積した微生物菌体を得ることができる。その培養方法については特に限定されないが、例えば特開平０５－９３０４９号公報等に記載された方法が用いられる。
　本発明におけるＰＨＡとは、３－ヒドロキシアルカン酸をモノマーユニットとする重合体の総称である。構成する３－ヒドロキシアルカン酸としては特に限定されないが、具体的には、３－ヒドロキシブチレート（３ＨＢ）と他の３－ヒドロキシアルカン酸との共重合体、または、３－ヒドロキシヘキサノエート（３ＨＨ）を含む３－ヒドロキシアルカン酸の共重合体などが挙げられる。さらに、３－ヒドロキシプロピオネート、３－ヒドロキシブチレート、３－ヒドロキシバレレート、３－ヒドロキシヘキサノエート、３－ヒドロキシヘプタノエート及び３－ヒドロキシオクタノエートからなる群より選択される２種以上の３－ヒドロキシアルカン酸をモノマーユニットとする共重合体なども挙げられる。なかでもモノマーユニットとして３ＨＨを含む共重合体、例えば、３ＨＢと３ＨＨとの２成分共重合体（ＰＨＢＨ）（Macromolecules, 28, 4822-4828 (1995)）、または、３ＨＢと３－ヒドロキシバレレート（３ＨＶ）と３ＨＨとの３成分共重合体（ＰＨＢＶＨ）（特許第２７７７７５７号公報、特開平０８－２８９７９７号公報）が、得られるポリエステルの物性の面からより好ましい。ここで３ＨＢと３ＨＨの２成分共重合体ＰＨＢＨを構成する各モノマーユニットの組成比については特に限定されるものではないが、全モノマーユニットの合計を１００モル％とした時に、３ＨＨユニットが１～９９モル％、好ましくは１～５０モル％、より好ましくは１～２５モル％といった組成比が好適である。また、３ＨＢと３ＨＶと３ＨＨとの３成分共重合体ＰＨＢＶＨを構成する各モノマーユニットの組成比については特に限定されるものではないが、全モノマーユニットの合計を１００モル％とした時に、例えば、３ＨＢユニットの組成比は１～９５モル％、３ＨＶユニットの組成比は１～９６モル％、３ＨＨユニットの組成比は１～３０モル％といった範囲が好適である。
　本発明において凝集工程の実施にあたり、ＰＨＡ水性懸濁液のｐＨを酸性領域に調整するため、ＰＨＡ水性懸濁液に酸を添加する。このために使用する酸は特に限定されず、有機酸、無機酸のいずれでもよく、揮発性の有無は問わない。また、例えば、硫酸、塩酸などの強酸、リン酸や酢酸などの弱酸いずれも使用できる。また、凝集に際してＰＨＡ水性懸濁液のｐＨを、好ましくはｐＨ２以上の酸性領域、より好ましくはｐＨ３以上の酸性領域、さらに好ましくはｐＨ４以上の酸性領域とする。また、好ましい酸性領域の上限は、ｐＨ７以下の酸性領域、より好ましくはｐＨ６以下の酸性領域、さらにより好ましくはｐＨ５以下の酸性領域である。また、得られるＰＨＡ凝集体の粒度をより高めるために、凝集工程の際に加熱操作を実施することができる。その際の加熱温度は特に限定されないが、ＰＨＡの融点より低いものであり、ＰＨＡの融点より５℃以上低いことが好ましく、１０℃以上低いことがより好ましく、２０～３０℃低いことがさらに好ましい。ＰＨＡの分子量低下を抑止するため、より低い温度が望ましい。具体的には、好ましくは１５０℃以下、より好ましくは１２０℃以下、さらに好ましくは９０℃以下である。加熱温度の下限は特に限定されないが、より大きい粒径の凝集体を製造するため、２０℃以上が好ましく、３０℃以上がより好ましい。装置サイズや能力により昇温に必要な時間は異なるが、ＰＨＡが凝集し粒度が高まる温度に到達するまで十分に加熱する必要がある。加熱時間は、前記加熱温度に達してから、概ね５時間以下、好ましくは２時間以下、より好ましくは１時間以下、さらにより好ましくは３０分以下である。少なくとも１秒間以上の加熱が好ましい。また、ＰＨＡ水性懸濁液中のＰＨＡ濃度に関しても特に限定されないが、攪拌する際にはその影響などを考慮して、好ましくは４０重量％以下、より好ましくは２０重量％以下、さらにより好ましくは１０重量％以下である。ＰＨＡ濃度の下限は特に限定されないが、凝集を効率よく行うため、１重量％以上が好ましい。これらの操作は連続式でもバッチ式でもよい。また、水性懸濁液を攪拌してもよいし、撹拌しなくともよい。本発明における凝集とは、ＰＨＡ粒子の体積平均粒径が、凝集操作前のＰＨＡ体積平均粒径に対して５倍以上、望ましくは１０倍以上、より望ましくは１５倍以上となることを指している。
　本発明における水性懸濁液に含まれる溶媒は、水、水と相溶性のある有機溶媒、又は、水と前記有機溶媒との混合溶媒を含むものであってもよい。前記有機溶媒は１種類のみを使用してもよいし、２種類以上を併用してもよい。また、水と前記有機溶媒との混合溶媒中の前記有機溶媒の濃度としては、使用する有機溶媒の水への溶解度以下であれば特に限定されない。また、水と相溶性のある有機溶媒としては特に限定されるものではないが、例えばメタノール、エタノール、１－プロパノール、２－プロパノール、１－ブタノール、２－ブタノール、ｉｓｏ－ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、ヘプタノールなどのアルコール類、アセトン、メチルエチルケトンなどのケトン類、テトラヒドロフラン、ジオキサンなどのエーテル類、アセトニトリル、プロピオニトリルなどのニトリル類、ジメチルホルムアミド、アセトアミドなどのアミド類、ジメチルスルホキシド、ピリジン、ピペリジンなどが挙げられる。なかでも、メタノール、エタノール、１－プロパノール、２－プロパノール、１－ブタノール、２－ブタノール、ｉｓｏ－ブタノール、アセトン、メチルエチルケトン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、アセトニトリル、プロピオニトリルなどが除去の容易さの面などから好適である。さらに、メタノール、エタノール、１－プロパノール、２－プロパノール、１－ブタノール、２－ブタノール、ｉｓｏ－ブタノール、アセトンなどが入手容易であることからより好ましい。さらに好ましくは、メタノール、エタノール、アセトンである。なお、本発明の本質を損なわない限り、他の溶媒や菌体由来の成分および精製時に発生する化合物を含んでいても構わない。
　ＰＨＡ水性懸濁液のｐＨを酸性領域に調整することでＰＨＡを凝集させる凝集工程の前に、予め、ＰＨＡ水性懸濁液に含まれている不純物（特にＰＨＡ以外の生物由来成分や培養基質由来成分）を分解および／または除去する工程を実施することにより、ＰＨＡ水性懸濁液中の有機窒素量を低減することが好ましい。これにより、後の凝集工程でＰＨＡが効率よく凝集し、精製度の高いＰＨＡの取得が助長される。不純物の分解および／または除去の目安としてはＰＨＡ水性懸濁液中に含まれるＰＨＡ重量あたりの有機窒素量で表記できる。当該有機窒素量は、好ましくはＰＨＡ重量当たり６０００ｐｐｍ以下、より好ましくは４０００ｐｐｍ以下、さらに好ましくは２０００ｐｐｍ以下、さらにより好ましくは１５００ｐｐｍ以下、最も好ましくは１０００ｐｐｍ以下である。
　本発明においてＰＨＡ以外の生物由来成分等の不純物を分解および／または除去する前に、予め、ＰＨＡを含有する細胞を物理的処理、化学的処理もしくは生物学的処理によって破砕することが好ましい。これにより、後の分解および／または除去工程を効率的に実施することができる。破砕の方法としては特に限定されないが、従来公知のフレンチプレスやホモジナイザー、Ｘ－プレス、ボールミル、コロイドミル、ＤＹＮＯミル、超音波ホモジナイザーなどの、流体せん断力や固体せん断力、磨砕を利用した方法が使用しうる。また、酸やアルカリ、界面活性剤、有機溶剤、細胞壁合成阻害剤などの薬剤を用いる方法、リゾチーム、ペクチナーゼ、セルラーゼ、チモリアーゼなどの酵素を用いる方法、超臨界流体を用いる方法や、浸透圧破砕法、凍結法、乾燥粉砕法などが挙げられる。また、細胞自身に含まれるプロテアーゼやエステラーゼなどの作用を利用する自己消化法も破砕法の一種として挙げられる。上記破砕方法においては、一連の処理によるＰＨＡの分子量低下を抑える方法を選択することが望ましい。また、これらの破砕方法は単独で用いても良いし、複数の方法を組み合わせても良い。また、バッチ処理でも良いし、連続処理を行っても良い。
　通常、上記方法にてＰＨＡ含有菌体を破砕して得たＰＨＡ水性懸濁液には、細胞中のタンパク質や核酸、脂質、糖成分およびその他の菌体構成成分や、培養基質残分などが混入している。以降に述べる分解および／または除去工程の前に、これらのタンパク質等を含む水を分離する脱水工程を実施することが好ましい。これにより、ＰＨＡ水性懸濁液に含まれる不純物の量を低減し、後の分解および／または除去工程を効率よく実施することができる。脱水の方法としては特に限定されないが、ろ過や遠心分離、沈降分離による方法が挙げられる。分解および／または除去工程に供する水性懸濁液中のＰＨＡの濃度は特に限定されないが、５０ｇ／Ｌ以上が好ましく、１００ｇ／Ｌ以上がより好ましく、さらに好ましくは２００ｇ／Ｌ以上、さらにより好ましくは３００ｇ／Ｌ以上である。また、水性懸濁液中のＰＨＡの濃度を調整することを目的に、上記脱水工程を実施してもよい。
　ＰＨＡ以外の生物由来成分等の不純物を分解および／または除去する方法としては、特に限定されないが、例えば酵素を用いる方法を挙げることができる。使用する酵素としては、蛋白質分解酵素、脂質分解酵素、細胞壁分解酵素、核酸分解酵素等が挙げられる。これらの酵素の具体例としては下記のものが挙げられる。これらは、単独で用いてもよいし、２種以上を併用してもよい。
　（１）蛋白質分解酵素
　エスペラーゼ、アルカラーゼ、ペプシン、トリプシン、パパイン、キモトリプシン、アミノペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ等
　（２）脂質分解酵素
　リパーゼ、ホスホリパーゼ、コリンエステラーゼ、ホスファターゼ等
　（３）細胞壁分解酵素
　リゾチーム、アミラーゼ、セルラーゼ、マルターゼ、サッカラーゼ、α－グリコシダーゼ、β－グリコシダーゼ、Ｎ－グリコシダーゼ等
　（４）核酸分解酵素
　リボヌクレアーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ等
　ＰＨＡ以外の生物由来成分等の不純物の分解に用いられる酵素は、上記のものに限定されるわけではなく、工業的な製品に用いられ得るものであれば、生物由来成分を分解する活性を有する任意の酵素であってよい。また、一般に市販されている洗濯用酵素洗剤等も用いることができる。さらには、例えば、酵素の安定化剤や再汚染防止剤等と酵素とを含有する酵素組成物であってもよく、酵素のみには限定されない。好ましい蛋白質分解酵素としては、上記例示に含まれるもののうち、プロテアーゼＡ、プロテアーゼＰ、プロテアーゼＮ（以上、天野エンザイム社製）、エスペラーゼ、アルカラーゼ、ザビナーゼ、エバラーゼ（以上、ノボザイム社製）等が工業的に使用可能なものとして挙げられ、分解活性の点からも好適に使用できる。しかし、これらに限られるものではない。
　酵素処理時間は、所望の処理度を達成するまで行うのが好ましく、通常０．５～２時間である。酵素の使用量は、酵素の種類及び活性に依存し、特に制限はされないが、ＰＨＡ１００重量部に対して、０．００１～１０重量部が好ましく、さらにはコストの点から０．００１～５重量部がより好ましい。
　ＰＨＡ以外の生物由来成分等の不純物を分解するその他の方法としては、次亜塩素酸や過酸化水素を用いる方法が挙げられる。次亜塩素酸を用いる際は、系のｐＨをアルカリ領域とし、熱や光、金属との接触を抑制した条件で実施することで、塩素残量の低いＰＨＡを得ることができる。ｐＨは８以上が望ましく、より望ましくは１０以上、さらに望ましくは１２以上である。処理温度は４０℃以下が望ましく、より望ましくは３０℃以下であり、さらに望ましくは２０℃以下、確実に効果を発揮するためには１０℃以下で実施することが望ましい。
　上述したように前記脱水工程では、ＰＨＡと、それ以外の生物由来成分等の不純物を含む水を分離するために、ろ過や遠心分離等を実施することができる。ろ過の方法は特に制限がないが、ヌッチェなどを用いる方法や、吸引ろ過や加圧ろ過などの方法が望ましい。工業的にはフィルタープレス、チューブプレス、プレートプレス、ゲージプレス、ベルトプレス、スクリュープレス、円板プレスなどの圧搾機能を有したろ過装置や、遠心脱水機、多室円筒ろ過機なども選択可能である。生産性を高める場合には多室円筒ろ過機などの連続式が望ましい。連続式ろ過機の粒子の除滓方法として、ストリング方式、スクレパー方式、プレコートスクレパー方式などが挙げられる。また、膜分離方式を用いてもよい。膜分離を含めたろ過の方法としては、デッドエンドろ過、クロスフローろ過を選択することができる。いずれもろ過性やろ材、膜などへの閉塞の程度などから選択できる。また減圧、あるいは真空にしてもよいし、加圧してもよい。また、遠心力を用いる方法であってもよい。ろ材としては、紙、織布、不織布、スクリーン、焼結板、素焼、高分子膜、パンチングメタル、ウェッジワイヤーなど様々な素材を選択できる。いずれも生産性や閉塞の程度などから選択できる。また、ろ過助剤を用いてもよいし、用いなくともよい。ろ過助剤を用いる場合にも、ろ材に予めプレコートしておく方法（プレコート方式）、ろ過原液に予め添加しておく方法がある（ボディーフィード法）。
　前記脱水工程での遠心分離の方法は特に限定されないが、遠心沈降機や遠心脱水機等を使用できる。遠心沈降機であれば分離板型、円筒型、デカンター型が挙げられる。分離板型であれば、ディスク型、セルフクリーニング型、ノズル型、スクリューデカンター型、スキミング型などが挙げられる。それぞれ沈降成分の排出の方法により回分式と連続式がある。また遠心脱水機についても回分式と連続式が挙げられる。これらの機器によって比重差により、ＰＨＡを含む沈降物と、培養液成分とを分離することが可能である。
　前記脱水工程で使用可能な他の方法としてはフローテーション法、電気泳動法、サイクロン処理などが挙げられる。ろ過や遠心分離、またフローテーションなどの方法を単独で用いてもよいし、組み合わせてもよい。
　前記脱水工程でろ過や遠心分離などの方法でＰＨＡを回収した後、回収したＰＨＡを水等で洗浄することで、更に精製度を高めたＰＨＡを得ることができる。洗浄は水以外にも有機溶媒を使用してもよいし、水と有機溶媒を混合して用いても良い。また水のｐＨを調整してもよい。有機溶媒を洗浄溶媒として用いる場合、好ましくは、親水性溶媒、具体的にはメタノール、エタノール、アセトン、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、ケトン類、アミン類などを用いる。また界面活性剤などを水に添加してもよい。これらの有機溶媒や水を複数種類混合して用いてもよい。また、短時間であれば水やこれらの有機溶媒を加温あるいは蒸気として噴霧することで洗浄性を高めることもできる。
　以上説明したとおり、本発明の最も好適な態様によると、細胞内にＰＨＡを生成する能力を有する微生物を培養する培養工程、ＰＨＡを含有する前記微生物を破砕する破砕工程、破砕した微生物を含む水性懸濁液から水を分離する脱水工程、不純物を分解および／または除去する精製工程、ＰＨＡを洗浄する洗浄工程、及び得られたＰＨＡ水性懸濁液のｐＨを酸性領域に調整してＰＨＡ凝集体を得る凝集工程を順次実施することにより、ＰＨＡの凝集体を効率よく製造することができる。しかし本発明は必ずしも上記すべての工程を実施することを必要とするものではない。
　このようにして菌体由来および培養基質由来の不純物を分解および／または除去する精製工程、および／または、洗浄工程を実施した後に、本発明の凝集工程を行なうことで精製度の高いＰＨＡ凝集体を取得できる。また、必要に応じて、得られた凝集体を上記に挙げた洗浄方法にてさらに洗浄することで、より精製度の高いＰＨＡ凝集体を取得することができる。
　以上より、有機窒素量が５００ｐｐｍ以下、好ましくは４００ｐｐｍ以下、より好ましくは３００ｐｐｍ、さらに好ましくは２００ｐｐｍ以下、特に好ましくは１００ｐｐｍ以下のＰＨＡ凝集体を製造することが可能となった。また、以上により、微粉の少ないＰＨＡ凝集体を得ることができる。得られるＰＨＡ凝集体の体積平均粒径は、好ましくは２０μｍ以上、より好ましくは３０μｍ以上、さらに好ましくは１００μｍ以上である。上限は特に限定されないが、本発明により体積平均粒径が約５０００μｍ程度以下のＰＨＡ凝集体を得ることができる。
　このようにして作成された有機窒素含量の低いＰＨＡ凝集体は、体積平均粒径の観点からも加工しやすい。また、不純物も少ないため様々な用途、例えばフィルムやボトルなど汎用品は勿論のこと、低アレルゲンであるため医療用としても幅広い応用が期待できる。
　以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。
　（ＰＨＡ水性懸濁液中の有機窒素量（ＰＨＡ重量あたり）の算出法）
　ＰＨＡ水性懸濁液中の水溶性溶媒を全量蒸発させ残存する固形分を得た。この固形分に対して５ＭのＮａＯＨを添加し、９５℃で加水分解反応を実施した。この加水分解液を等量の６０％酢酸水溶液で中和し、酢酸緩衝液とニンヒドリン溶液を添加し１００℃で呈色反応を行った。この呈色反応液の吸光度を日立製作所社製レシオビーム分光光度計Ｕ－１８００形により測定した。この吸光度と、ロイシン試料を用いて作成した検量線とを比較することで、固形分中の有機窒素量を算出した。固形分の重量あたりの有機窒素量をもって、ＰＨＡ水性懸濁液中の有機窒素量（ＰＨＡ重量あたり）とした。
　（ＰＨＡ凝集体中の有機窒素量（ＰＨＡ重量あたり）の算出法）
　ＰＨＡ凝集体に対して５ＭのＮａＯＨを添加し、９５℃で加水分解反応を実施した。この加水分解液を等量の６０％酢酸水溶液で中和し、酢酸緩衝液とニンヒドリン溶液を添加し１００℃で呈色反応を行った。この呈色反応液の吸光度を日立製作所社製レシオビーム分光光度計Ｕ－１８００形により測定した。この吸光度と、ロイシン試料を用いて作成した検量線とを比較することで、ＰＨＡ凝集体中の有機窒素量を算出した。ＰＨＡ凝集体の重量あたりの有機窒素量をもって、ＰＨＡ凝集体中の有機窒素量（ＰＨＡ重量あたり）とした。
　（実施例１）菌体培養液の調製
　国際公開第２００８／０１０２９６号［００４９］に記載のラルストニア・ユートロファＫＮＫ－００５株を、同［００５０］－［００５３］に記載の方法で培養し、ＰＨＡを含有する菌体を含む菌体培養液を得た。なお、ラルストニア・ユートロファは、現在では、カプリアビダス・ネケータに分類されている。
　（実施例２）滅菌の方法
　実施例１で得られた菌体培養液を内温６０～８０℃で２０分加熱・攪拌処理し、滅菌処理を行った。
　（実施例３）
　実施例２で得られた滅菌済みの菌体培養液に対して０．２％重量のドデシル硫酸ナトリウムを添加した。さらに、ｐＨが１１．０になるように水酸化ナトリウムを添加した後、５０℃で１時間保温した。その後、高圧破砕機（ニロソアビ社製高圧ホモジナイザーモデルＰＡ２Ｋ型）で４５０～５５０ｋｇｆ／ｃｍ2の圧力で高圧破砕を行った。
　高圧破砕後の破砕液に対して等量の蒸留水を添加した。その後、高圧破砕後の破砕液を遠心分離した後、上清を排除した（３倍濃縮）。３倍濃縮したＰＨＡの水性懸濁液に、排除した上清と同量の水を添加して、懸濁し、０．２％重量のドデシル硫酸ナトリウムと、ＰＨＡの１／１００重量のプロテアーゼ（ノボザイム社製、エスペラーゼ）を添加し、ｐＨ１０で５０℃に保持したまま、２時間攪拌した。その後、ＰＨＡ濃度が１０重量％になるように調整した。得られたＰＨＡ水性懸濁液中に存在する有機窒素量は、ＰＨＡ重量当たり３４１５ｐｐｍであった。
　このＰＨＡ水性懸濁液のｐＨを、硫酸を用いて３、４、５、６又は７に調整し、撹拌しながら温度を３０℃、５０℃又は７０℃に調整して凝集させた。なお加熱時間は６０℃であった。得られた凝集体の体積平均粒径を、粒度測定装置（島津製作所製、ＳＡＬＤ－３００Ｖ型）を使って測定した。結果を表１に示した。これより、ＰＨＡ水性懸濁液のｐＨをより強酸性にするほど、より低温でもＰＨＡが凝集しやすいことが分かった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　（実施例４）
　実施例２で得られた滅菌済みの菌体培養液に対して０．２％重量のドデシル硫酸ナトリウムを添加した。さらに、ｐＨが１１．０になるように水酸化ナトリウムを添加した後、５０℃で１時間保温した。その後、高圧破砕機（ニロソアビ社製高圧ホモジナイザーモデルＰＡ２Ｋ型）で４５０～５５０ｋｇｆ／ｃｍ2の圧力で高圧破砕を行った。
　高圧破砕後の破砕液に対して等量の蒸留水を添加した。その後、高圧破砕後の破砕液を遠心分離した後、上清を排除した（２倍濃縮）。２倍濃縮したＰＨＡの水性懸濁液に、排除した上清と同量の水を添加して遠心分離し、上清を排除してから再度水を添加して懸濁し、０．２％重量のドデシル硫酸ナトリウムと、ＰＨＡの１／１００重量のプロテアーゼ（ノボザイム社、エスペラーゼ）を添加し、ｐＨ１０で５０℃に保持したまま、２時間攪拌した。その後、ＰＨＡ濃度が１０重量％になるように調整した。得られたＰＨＡ水性懸濁液中に存在する有機窒素量は、ＰＨＡ重量当たり５４８６ｐｐｍであった。
　このＰＨＡ水性懸濁液のｐＨを、硫酸を用いて４に調整し、撹拌しながら温度を７０℃に調整して３０分かけて凝集させた。得られた凝集体の体積平均粒径を、粒度測定装置（島津製作所製、ＳＡＬＤ－３００Ｖ型）を使って測定したところ、凝集操作前の体積平均粒径が１．５・高ノ対し、凝集操作後の体積平均粒径は２１８．２・高ナあった。さらに得られた凝集体をｐＨ１１．５のアルカリ水およびメタノールで洗浄した。洗浄後のＰＨＡ凝集体の有機窒素量はＰＨＡ当たり４２６ｐｐｍであった。これにより、有機窒素量５００ｐｐｍ以下のＰＨＡ凝集体を取得することができた。

Claims (17)

  1. 　ポリ－３－ヒドロキシアルカン酸水性懸濁液のｐＨを酸性領域に調整して、ポリ－３－ヒドロキシアルカン酸の凝集体を得ることを特徴とする、ポリ－３－ヒドロキシアルカン酸の製造方法。
  2. 　酸性領域がｐＨ２以上の酸性領域である請求項１記載のポリ－３－ヒドロキシアルカン酸の製造方法。
  3. 　酸性領域がｐＨ３以上の酸性領域である請求項２記載のポリ－３－ヒドロキシアルカン酸の製造方法。
  4. 　ポリ－３－ヒドロキシアルカン酸水性懸濁液中に存在する有機窒素量がポリ－３－ヒドロキシアルカン酸重量当たり６０００ppm以下である請求項１～３のいずれかに記載のポリ－３－ヒドロキシアルカン酸の製造方法。
  5. 　ポリ－３－ヒドロキシアルカン酸水性懸濁液中に存在する有機窒素量がポリ－３－ヒドロキシアルカン酸重量当たり４０００ppm以下である請求項４記載のポリ－３－ヒドロキシアルカン酸の製造方法。
  6. 　ポリ－３－ヒドロキシアルカン酸水性懸濁液に含まれる溶媒が、水、水と相溶性のある有機溶媒、又は、水と前記有機溶媒との混合溶媒を含む請求項１～５のいずれかに記載のポリ－３－ヒドロキシアルカン酸の製造方法。
  7. 　ポリ－３－ヒドロキシアルカン酸が、３－ヒドロキシプロピオネート、３－ヒドロキシブチレート、３－ヒドロキシバレレート、３－ヒドロキシヘキサノエート、３－ヒドロキシヘプタノエート、および３－ヒドロキシオクタノエートからなる群より選択される２種以上の３－ヒドロキシアルカン酸から構成される共重合体である請求項１～６のいずれかに記載のポリ－３－ヒドロキシアルカン酸の製造方法。
  8. 　ポリ－３－ヒドロキシアルカン酸が、３－ヒドロキシヘキサノエートと３－ヒドロキシブチレートの２成分共重合体、または３－ヒドロキシヘキサノエートと３－ヒドロキシブチレートと３－ヒドロキシバレレートの３成分共重合体である請求項７に記載のポリ－３－ヒドロキシアルカン酸の製造方法。
  9. 　ポリ－３－ヒドロキシアルカン酸が微生物を用いて産出される請求項１～８のいずれかに記載のポリ－３－ヒドロキシアルカン酸の製造方法。
  10. 　微生物が、アエロモナス属、アルカリゲネス属、ラルストニア属、または、カプリアビダス属に属する微生物である請求項９記載のポリ－３－ヒドロキシアルカン酸の製造方法。
  11. 　微生物が、カプリアビダス・ネケータである請求項１０記載のポリ－３－ヒドロキシアルカン酸の製造方法。
  12. 　微生物が形質転換体である請求項９記載のポリ－３－ヒドロキシアルカン酸の製造方法。
  13. 　微生物が、アエロモナス・キャビエ由来のポリ－３－ヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子および／またはその変異体が導入された形質転換体である請求項１２記載のポリ－３－ヒドロキシアルカン酸の製造方法。
  14. 　請求項１～１３のいずれかに記載の方法で製造され、有機窒素量が５００ｐｐｍ以下であるポリ－３－ヒドロキシアルカン酸凝集体。
  15. 　体積平均粒径が２０・壕ネ上である請求項１４に記載のポリ－３－ヒドロキシアルカン酸凝集体。
  16. 　体積平均粒径が３０・壕ネ上である請求項１５記載のポリ－３－ヒドロキシアルカン酸凝集体。
  17. 　体積平均粒径が１００・壕ネ上である請求項１６記載のポリ－３－ヒドロキシアルカン酸凝集体。
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