WO2008053892A1 - Produit pharmaceutique servant à favoriser la régénération fonctionnelle d'un tissu endommagé - Google Patents

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WO2008053892A1
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Katsuto Tamai
Takehiko Yamazaki
Yasufumi Kaneda
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Genomix Co., Ltd.
Osaka University
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    • G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells

Definitions

  • the present invention relates to a medicament for promoting functional regeneration of damaged tissue.
  • Stem cells that can be mobilized to an injured site include tissue stem cells that exist in the damaged part or in the vicinity thereof, and bone marrow-derived stem cells that exist in peripheral blood. Recently, it has been reported that bone marrow-derived cells contribute to the regeneration of many damaged tissues, but the mechanism of bone marrow-derived cell recruitment to damaged tissues is unclear. Bone marrow-derived cells here are distinguished from hematopoietic stem cells capable of differentiating into blood cells (leukocytes, erythrocytes), and are present in stem cells or bone marrow represented by cells that have been called bone marrow mesenchymal stem cells. Tissue progenitor cell populations.
  • Bone marrow mesenchymal stem cells are undifferentiated stem cells that have the ability to differentiate into osteoblasts, adipocytes, and chondrocytes, and further differentiate into other mesenchymal cells such as fibroblasts, muscle cells, stromal cells, and tendon cells. It is possible to do. In recent years, it has been proved that bone marrow mesenchymal stem cells differentiate into nerve cells, as well as epithelial cells (skin keratinocytes, etc.) and vascular endothelial cells (Non-patent Document 9).
  • Tissue progenitor cells are defined as undifferentiated cells that have the ability to unidirectionally differentiate into specific tissue cells other than the blood system, and are used for the aforementioned mesenchymal tissue, epithelial tissue, nerve tissue, parenchymal organ, and vascular endothelium. Including undifferentiated cells having differentiation ability.
  • HMGB1 High mobility group box 1 protein
  • HMGB1 High mobility group box 1 protein
  • DNA in the cell And regulates chromatin structure to regulate gene expression (Non-patent Document 1)
  • 2) Inflammatory site force in TNF- ⁇ , IL-1, LPS Secreted by existing monocytes and macrophages and bound extracellularly to RAGE (glycation end product receptor) (Non-patent document 2) Inducing a strong inflammatory reaction (Non-patent document 3), 3 ) Released from cells necrotic due to septicemia to surrounding tissues (Non-patent document 4), 4) Involved in the development of inflammation in septic patients with severe infection (Non-patent document 5), 5)
  • administration to the infarcted region promotes the division and proliferation of stem cells existing in the myocardium to promote myocardial regeneration and functional recovery (Patent Document 1),
  • HMGB1 administered to the injured site is treated with vascular progenitor cells administered simultaneously. Induces muscle tissue regeneration (non-specialty) Permits 7), 8) In neurons, functions such as inducing neurite formation (Non-Patent Document 8) are known.
  • mesenchymal stem cells that can be differentiated into bone marrow-derived stem cells, particularly osteoblasts, chondrocytes, and fat cells, into damaged tissues.
  • brain tissue damage The main causes of brain tissue (cell) damage are cerebral contusion caused by trauma and cerebral ischemic disease. Other causes include those resulting from brain surgery such as brain tumor removal surgery. In particular, it is difficult to remove all gliomas that originate from brain parenchymal cells, and in order to avoid motor and language dysfunction, it is necessary to limit the excision to palliative removal. In addition, malignant gliomas have not been effective enough for immunotherapy and gene therapy, which have been actively studied in recent years, including chemotherapy and radiation therapy, which have a poor life prognosis. Therefore, it would be ideal if there is a treatment that removes as many tumor cells as possible and recovers the resulting brain function damage.
  • Non-patent literature l Bustin et al., Mol Cell Biol, 19: 5237-5246, 1999
  • Non-Patent Document 2 Horiet et al., J. Biol. Chem., 270, 25752-25761, 1995
  • Non-Patent Document 3 Wang et al., Science, 285: 248-251, 1999
  • Non-Patent Document 4 Muller et al., EMBO J, 20: 4337-4340, 2001
  • Non-Patent Document 5 Wang et al., Science, 285: 248-251, 1999
  • Non-Patent Document 6 Germani et al., J. Leukoc. Biol., 81, 2007 electronic journal version
  • Non-Patent Document 7 Palumbo et al., J. Cell Biol., 164: 441-449, 2004
  • Non-Patent Document 8 Merenmies et al., J. Biol. Chem., 266: 16722-16729, 1991
  • Non-Patent Document 9 Yaojiong et al., Stem cells, 25: 2648-1659
  • Patent Document 1 Special Table 2005-537253
  • An object of the present invention is to isolate and identify a factor that mobilizes cells that differentiate into a damaged tissue to a damaged site, and to provide an invention using the factor.
  • the present inventors examined the possibility that bone marrow-derived cells are mobilized from the extra-skin tissue to the transplanted skin piece in the process of engrafting the transplanted skin piece in the living tissue, and contribute to the regeneration of the skin tissue, 1) Bone marrow-derived cells are mobilized in large quantities in the transplanted skin, 2) The mobilized bone marrow-derived cells are dermal fibroblasts, adipocytes, muscle cells, vascular endothelial cells, epidermal keratinocytes in the transplanted skin pieces.
  • HMGB1, HMGB2, and HMGB3 released from the necrotic tissue of the transplanted skin, and 4) Purified HMGB1, HMGB2, and HMGB3 promote the migration of mesenchymal stem cells that have been isolated and cultured from bone marrow.
  • a tissue regeneration promoter containing the following components (a) to (i)! /;
  • a tissue regeneration promotion kit containing the following components ( a ) to (i):
  • An extract of cells produced by a method comprising a step of immersing cells in a solvent, wherein the extract has bone marrow-derived cell-inducing activity.
  • a method for producing a cell extract having bone marrow-derived cell inducing activity comprising a step of immersing cells in a solvent.
  • step (b) a step of bringing the extract obtained in step (a) into contact with immobilized heparin;
  • a method for producing a heparin-binding fraction having bone marrow-derived cell-inducing activity including the following steps;
  • step ⁇ the step of contacting the extract obtained in step ⁇ with immobilized heparin
  • a bone marrow-derived cell inducer comprising:
  • tissue regeneration promoter comprising: [12] The extract as described in [5] or the extract prepared by the method as described in [6], the fraction as described in [7] or the fraction as prepared by the method as described in [8] A kit for promoting tissue regeneration.
  • a method for evaluating whether a cell extract contains a factor that induces a test cell comprising the following steps, wherein the test cell induction activity in step (b) is compared with a control: If it is high, the cell extract is judged to contain a factor that induces the test cell;
  • step (b) A step of measuring the inducing activity of the test cell by the extract prepared in step (a).
  • a method for screening a cell extract containing a factor for inducing a test cell comprising the following steps;
  • the factor that induces the test cell is purified using the test cell induction activity as an index.
  • a method for identifying a factor that induces a test cell comprising the step of:
  • a method for inducing bone marrow-derived cells in damaged tissue comprising administering a substance described in any one of the following ⁇ to ⁇ to the damaged tissue:
  • a method for promoting regeneration of damaged tissue comprising the step of administering a substance described in any of (a) to (i) below to any of the following:
  • a method for promoting regeneration of damaged tissue comprising the step of administering the extract according to [5] or the extract produced by the method according to [6] and a tissue-damaged subject.
  • a method for promoting regeneration of damaged tissue comprising the step of administering the fraction according to [7] or the fraction produced by the method according to [8] to a subject whose tissue is damaged.
  • FIG. 1 is a diagram showing a method for preparing a GFP bone marrow transplanted mouse.
  • FIG. 2 A photograph showing the accumulation of GFP fluorescence in transplanted skin pieces observed after skin transplantation to the back of mice transplanted with GFP bone marrow.
  • the upper left photo shows the macroscopic image of the skin graft
  • the upper middle photo shows the HE tissue image of the recipient skin near the boundary between the transplanted skin and the recipient skin (shown as “I”)
  • the upper right photo shows the HE tissue image of the skin graft.
  • the lower left photo shows the accumulation of GFP fluorescence in the skin graft
  • the lower middle photo shows the enlarged image of the skin graft
  • the lower right photo shows the accumulation of GFP fluorescence in the enlarged skin.
  • FIG. 3 is a photograph showing bone marrow-derived epidermal cells and bone marrow-derived dermal fibroblasts accumulated on the skin grafted on the back of a GFP bone marrow-transplanted mouse.
  • the first row from the left is DAPI staining (nuclear staining).
  • the upper photo shows a weakly magnified image (100x) of the skin at the skin, and the middle photo shows its magnified image (200x).
  • the lower row shows the hair follicle with a strong magnified image (200x).
  • the second column from the left is the GFP fluorescence image of each region in the first column
  • the third column from the left is the immunostained image of the keratin 5 (5)
  • the fourth column from the left is the overlay of the respective fluorescence. Shows an image (Merge). Many GFP positive epidermal cells and dermal fibroblasts have been observed.
  • FIG. 4 is a diagram showing a flow of identification of bone marrow-derived mesenchymal stem cell inducing factor in skin extract.
  • FIG. 5 is a diagram showing a method for extracting regeneration-inducing factor (bone marrow-derived mesenchymal stem cell mobilization factor) from excised skin pieces.
  • FIG. 6 is a photograph showing the results of measuring the bone marrow-derived mesenchymal stem cell migration activity of the skin extract using Boyden Chamber 1;
  • the upper left photo shows the bone marrow mesenchyme that has migrated from the upper tank of Boyden's chamber 1 to the skin extract side (lower tank side) through a microscopic hole on the silicon film and adhered to the lower side of the silicon film.
  • Stem cells stained with a blue dye are shown from the top immediately after the start of culture (Oh), 12 hours later (12h), and 24 hours later (24h) (4 wells each).
  • the upper right photo shows a strong magnified image of Oh
  • the lower left photo shows a 12h strong magnified image
  • the lower right photo shows a 24h strong magnified image.
  • Fig. 8 is a photograph showing the results of measuring the migration activity of bone marrow-derived mesenchymal stem cells of HMGB1 using a Boyden chamber.
  • the upper two images are stained images of bone marrow-derived mesenchymal stem cells that have migrated into the skin extract, and the middle two images are stained images of bone marrow-derived mesenchymal stem cells that have migrated to the purified HMGB1 sample.
  • FIG. 9 shows a method for measuring in vivo bone marrow-derived mesenchymal stem cell inducing activity.
  • FIG. 13 A photograph 24 hours after the start of culture of migrating cells in the silicon tube.
  • the photo on the left shows a bright field image of fibroblast-like cells and epithelial cell-like cells growing on a cultured plastic petri dish, and the photo on the right shows a GFP fluorescence image in the anther field.
  • the left and right photos have the same field of view, the left photo is bright field, the right photo is through a fluorescent filter (B and D detect GFP fluorescence, F detects keratin 5 fluorescence) .
  • FIG. 15 is a photograph of the HMGB family in a newborn mouse skin extract detected using the Western blot method.
  • FIG. 16 shows MAP of HMGB family expression vector in mammalian cells.
  • Cytomegalovirus enhancer has chicken ⁇ -actin promoter and synthesizes HMGB family cDNA (complementary DNA) that exists in the promoter stream in large quantities.
  • FIG. 17 is a photograph showing the results of Western blot analysis of a purified recombinant Flag tag-HMGB family fusion protein expressed in HEK293 cells.
  • FIG. 18 is a graph showing bone marrow mesenchymal stem cell migration activity of recombinant HMGB1 'HMGB2' HMGB3 using a boyden chamber. All the recombinant proteins showed migration activity compared to the control group.
  • FIG. 22 This is a photograph in which the bone marrow mesenchymal stem cell migration activity of cultured cell lines HEK293 and HeLa extracts was confirmed using the Boyden chamber method. V and miscellaneous cultured cell lines also showed human bone marrow mesenchymal stem cell migration activity.
  • Fig. 23A is a photograph of a mouse fixed on a stereotaxic apparatus, a midline incision in the head with a scalpel, and burr using a drill.
  • Figure 23B is a photograph of a portion of the brain tissue aspirated by applying negative pressure to the brain using a syringe.
  • Fig. 23A is a photograph of a mouse fixed on a stereotaxic apparatus, a midline incision in the head with a scalpel, and burr using a drill.
  • Figure 23B is a photograph of a portion of the brain tissue aspirated by applying negative pressure to the brain using a syringe.
  • FIG. 23C is a photograph after injection of the purified column of the column into the skin extract dissolved in the fibrin glue preparation (fibrinogen), followed by 5 ⁇ 1 injection of the fibrin glue preparation (thrombin).
  • Figure 23D and Figure 23 ⁇ are photographs two weeks after treatment with the brain injury model. Compared with control 23D, accumulation of GFP-positive cells was observed in the skin extract of the 23% treated group with the purified purine column.
  • Figures 23F and 23G are photographs 6 weeks after the brain injury model treatment. Compared to control 23F, accumulation of GFP-positive cells was observed in 23G of the treatment group using the purified fraction of palin column in the skin extract.
  • the present invention provides a bone marrow-derived cell inducer comprising at least one of the components described in ⁇ to ⁇ below.
  • bone marrow-derived cells for example, bone marrow-derived mesenchymal stem cells
  • the inducer can be used as a reagent necessary for regenerative medicine, basic research for regenerative medicine development and clinical research.
  • bone marrow-derived cells for example, bone marrow-derived mesenchymal stem cells
  • test tube It is possible to conduct tissue regeneration induction studies by mobilization of bone marrow-derived cells (for example, bone marrow-derived mesenchymal stem cells).
  • the above inducer is also used as a so-called prophylactic drug for preventing a decrease in tissue organ function due to a decrease in tissue stem cells, or for aging. Expected to be used as an anti-aging drug that delays the progress of change.
  • the present invention also provides a tissue regeneration promoting agent or a tissue regeneration promoting kit containing at least one of the components described in the following (a) to (i).
  • the tissue regeneration-promoting agent or tissue regeneration-promoting kit is administered at or near the damaged tissue site, so that bone marrow-derived cells circulating in the blood (for example, bone marrow-derived mesenchymal stem cells) are transferred to peripheral blood.
  • the tissue regeneration promotion kit includes (1) the above extract or the fraction dissolved in fibrinogen, and (2) a tissue regeneration promotion kit containing thrombin, or (1) the above extract or the above Examples of the kit for promoting tissue regeneration include (2) fibrinogen and (3) thrombin. In the present invention, it can be force s using a commercially available fibrinogen and thrombin.
  • the present invention relates to a method for producing an extract of cells having bone marrow-derived cell-inducing activity, including a step of immersing cells in a solvent.
  • the present invention also relates to an extract of cells produced by the production method, which has bone marrow-derived cell inducing activity.
  • tissue-derived cells cell lines established from tissue-derived cells (for example, Hela, the power exemplified by HEK293 are not limited to these), isolated Examples include cells, non-isolated cells (for example, cells present in isolated tissues), cells into which DNA encoding HMGB1, HMGB2, or HMGB3 protein has been introduced.
  • the tissue may be any tissue, for example, living skin tissue, biopsy (surgical) tissue (brain, lung, heart, liver, stomach, small intestine, large intestine, kidney, kidney, bladder, spleen, uterus Testis, blood, etc.), but is not limited thereto.
  • the solvent examples include physiological saline, PBS (Phosphate-buffered saline), and force S exemplified by TBS (Tris-buffered saline), but are not limited thereto.
  • the time for immersing the cells and tissues in the solvent is a sufficient time to induce cell necrosis. That is, 1 to 48 hours (for example, 6 to 48 hours), preferably 12 to 24 hours. A certain force is not limited to this time. Therefore, “the process of immersing cells in a solvent” can be rephrased as “the process of immersing cells in a solvent for a sufficient time necessary to induce necrosis” and “the process of necrosing cells”.
  • the temperature at which cells and tissues are immersed in a solvent is 4 ° C to 25 ° C (eg, 4 ° C to 8 ° C), preferably 4 ° C.
  • the pH for immersing cells and tissues in a solvent is not limited to this, which is exemplified by pH 7 to 8, preferably pH 7.5.
  • the force of the phosphate buffer having a concentration of 10 mM to 50 mM, preferably 10 to 20 mM as a component of the buffer solution is not limited thereto.
  • the cells and tissues can be removed from the solvent containing the cells and tissues.
  • the method for removing cells and tissues from the solvent is not particularly limited as long as it is a method well known to those skilled in the art.
  • the force that can remove cells and tissues from the solvent by centrifuging at 4 ° C to 25 ° C (for example, 4 ° C) and gravity acceleration of 10G to 4000G (for example, 440G) and separating the supernatant.
  • the supernatant can be used as a cell or tissue extract.
  • the present invention relates to a method for producing a heparin-bound fraction having bone marrow-derived cell-inducing activity, which comprises the following steps.
  • the present invention also relates to a heparin-binding fraction produced by the production method and having a bone marrow-derived cell-inducing activity.
  • step (b) a step of bringing the extract obtained in step (a) into contact with immobilized heparin;
  • Immobilized heparin is obtained by covalently binding heparin to an insoluble carrier.
  • insoluble carrier carrier examples include Sepharose beads (3 ⁇ 4epharose 4B, 3 ⁇ 4epnarose 6B: E Healthcare), but are not limited thereto.
  • Palin Hitrap Hepalin HP column: GE Healthcare may be used.
  • the contact conditions of cell or tissue extract and immobilized heparin are about pH 7-8 (preferably pH 7.5), salt concentration of 0-200 mM, preferably about 100-200 mM. It is not limited to these.
  • the time during which the extract and the immobilized heparin are in contact with each other is not particularly limited, but it is preferably maintained for 5 minutes or more from the viewpoint of sufficiently adsorbing the heparin-binding fraction to the immobilized heparin.
  • the temperature is 4 to 8 ° C., preferably 4 ° C.
  • the force is not limited to these.
  • the elution conditions of the heparin-binding fraction adsorbed on the immobilized heparin are exemplified by pH 7-8 and salt concentration 200-1000 mM (preferably lOOOmM), but are not limited thereto. .
  • the present invention relates to a method for producing an anion-exchanger-bound fraction having bone marrow-derived cell-inducing activity including the following steps.
  • the present invention also relates to an anion exchanger-binding fraction produced by the production method and having a bone marrow-derived cell inducing activity.
  • step (b) a step of bringing the extract obtained in step (a) into contact with immobilized heparin
  • step (d) a step of contacting the heparin-binding fraction obtained in step (c) with an anion exchanger
  • anion exchanger A step of eluting the anion exchanger-bound fraction from the anion exchanger.
  • the anion exchanger is not limited to these, which can be exemplified by an exchanger using DEAE (diethylaminoethyl) or Q (quaternary ammonium).
  • anion exchangers e.g., Sourcel5Q, Source30Q, MonoQ, MiniQ, PC3.2 / 3, Mini Q4.6 / 50 ⁇ , ⁇ Tra ibX Columns, niTrap SP HP, w Sepharose High Perrormance, Hiload 1 6/10 Q Sepharose HP, HiPrep 16/10 SP XL, Q Sepharose XL, HiPrer 16/10 Q FF, Hi Prep 16 / lODEAE FF, Q Sepharose Fast Flow, DEAE Sepharose Fast Flow (all using GE Healthcare) May be.
  • anion exchangers e.g., Sourcel5Q, Source30Q, MonoQ, MiniQ, PC3.2 / 3, Mini Q4.6 / 50 ⁇ , ⁇ Tra ibX Columns, niTrap SP HP, w Sepharose High Perrormance, Hiload 1 6/10 Q Sepharose HP, HiPrep 16/10 SP XL, Q Sepharose XL, HiPrer 16/10 Q FF,
  • the contact conditions between the heline-binding fraction and the anion exchanger are limited to pH 7 to 9 (preferably pH 8), salt concentration of 0 to 100 mM, preferably 50 mM, and so on. Absent.
  • the time during which the extract and the anion exchanger are in contact with each other is not particularly limited, but it is preferably maintained for 5 minutes or more from the viewpoint of sufficiently adsorbing the anion exchanger bound fraction to the anion exchanger. .
  • the temperature includes 4 to 16 ° C, preferably 4 ° C, but is not limited thereto.
  • examples of elution conditions for the anion exchanger-bound fraction adsorbed on the anion exchanger are about pH 7-9 (preferably about pH 8) and salt concentration 100-2000 mM (preferably about lOOOOmM).
  • Force S which is not limited to these.
  • the present invention also relates to an inducer of bone marrow-derived cells containing the above extract or fraction, or the extract produced by the above method or the fraction produced by the above method.
  • bone marrow-derived cells for example, bone marrow-derived mesenchymal stem cells
  • the inducer can be used as a reagent necessary for regenerative medicine, basic research for regenerative medicine development and clinical research.
  • bone marrow-derived cells for example, bone marrow-derived mesenchymal stem cells
  • tissue regeneration induction studies by mobilization of bone marrow-derived cells (eg, bone marrow-derived mesenchymal stem cells) in vitro.
  • regeneration of damaged tissue can be accelerated
  • an inducer / promoter for functional tissue regeneration It can be expected to be used as a so-called preventive medicine that prevents a decrease in tissue / organ function due to a decrease in tissue stem cells, or as an anti-aging medicine that delays the progression of age-related changes.
  • the present invention provides a tissue regeneration promoting agent or a tissue regeneration promoting kit comprising the above extract or fraction, or the extract produced by the method or the fraction produced by the method.
  • the tissue to be regenerated is not particularly limited as long as it is damaged tissue, for example, living skin tissue, biopsy (surgical) tissue (brain, lung, heart, liver, stomach , Small intestine, large intestine, viscera, kidney, bladder, spleen, kidney, testis and blood).
  • the tissue regeneration-promoting agent or tissue regeneration-promoting kit is administered at or near the damaged tissue site, so that bone marrow-derived cells circulating in the blood (eg, bone marrow-derived mesenchymal stem cells) are transferred to peripheral blood.
  • the tissue regeneration promotion kit includes (1) the above extract or the fraction dissolved in fibrinogen, and (2) the tissue regeneration promotion kit containing thrombin, or (1) the above extract or the above fraction.
  • a kit for promoting tissue regeneration comprising (2) fibrinogen and (3) thrombin can be exemplified. In the present invention, it can be determined by using commercially available fibrinogen or thrombin.
  • Bone marrow-derived cells for example, bone marrow-derived mesenchymal stem cells
  • the damaged tissue include tissues damaged by various pathological conditions causing ischemia, ischemia / hypoxia, trauma, burns, inflammation, autoimmunity, gene abnormality, etc. Is not to be done. Injured tissues also include necrotic tissues.
  • the tissue in the present invention is not particularly limited as long as it is a tissue in which bone marrow-derived cells (for example, bone marrow-derived mesenchymal stem cells) can be differentiated.
  • skin tissue, bone tissue, cartilage tissue, muscle tissue, adipose tissue examples include all tissues in the living body, including myocardial tissue, nervous system tissue, lung tissue, gastrointestinal tissue, liver * bile * winning tissue, and urinary organs.
  • tissue regeneration promoter not only skin diseases such as refractory skin ulcer, skin wound, bullous disease, and alopecia, but also cerebral infarction, myocardial infarction, fracture, lung infarction, gastric ulcer, enteritis, etc. Tissue damage
  • a treatment for inducing functional tissue regeneration becomes possible.
  • Examples of animal species to which the above tissue regeneration promoter is administered include humans and non-human animals, and examples include humans, mice, rats, monkeys, pigs, inu, usagis, wilds, musters, guinea pigs and the like. However, it is not limited to these.
  • the bone marrow-derived cells of the present invention are hematopoietic stem cells and cells other than leukocytes, erythrocytes, and platelets derived therefrom, and are present in stem cells or bone marrow represented by cells that have been called bone marrow mesenchymal stem cells.
  • the bone marrow-derived cells of the present invention are cells that can be isolated by bone marrow blood collection or peripheral blood collection.
  • Hematopoietic stem cells are non-adherent cells, and the bone marrow-derived cells of the present invention can be obtained as adherent cells by mononuclear cell fraction cell culture in blood obtained by bone marrow blood collection or terminal blood collection.
  • the bone marrow-derived cells of the present invention contain mesenchymal stem cells, and can be identified by osteoblasts (identified by recognizing calcium deposition when differentiation is induced), chondrocytes (alcian blue staining positive, safranin-0 staining). Can be identified by positive), adipocytes (can be identified by positive Sudan III staining), mesenchymal cells such as fibroblasts, smooth muscle cells, stromal cells, tendon cells, nerve cells, epithelial cells (For example, epidermal keratinocytes and intestinal epithelial cells express the cytokeratin family), and preferably have the ability to differentiate into vascular endothelial cells, but the differentiated cells are not limited to the above cells. In addition, it also includes the ability to differentiate into parenchymal organ cells such as kidneys and viscera.
  • bone marrow-derived mesenchymal stem cells are cells existing in the bone marrow, and are collected directly from the bone marrow or indirectly from other tissues (mesenchymal tissues such as blood, skin, and fat). It is a cell that can be cultured and proliferated as an adherent cell (made of plastic or glass), and has the ability to differentiate into mesenchymal tissues such as bone, cartilage, and fat. It can be obtained by collecting peripheral blood or collecting it from mesenchymal tissue. Bone marrow-derived mesenchymal stem cells also have the ability to differentiate into epithelial tissues such as keratinocytes that constitute the skin by administering cells once attached to the culture dish to the damaged part of the living body! Also has features.
  • the bone marrow-derived mesenchymal stem cells of the present invention are pluripotent stem cells, which can be identified by osteoblasts (which can be identified by the recognition of calcium deposition when differentiation is induced), chondrocytes (Alcian blue) In addition to staining positive, safranin-0 staining positive, etc.), adipocytes (identifiable by Zudan III staining positive, etc.), for example, fibroblasts, smooth muscle cells, skeletal muscle cells, stromal cells, tendon cells, etc.
  • epidermal keratinocytes intestinal epithelial cells are cytokeratin family
  • It preferably has the ability to differentiate into endothelial cells, and further to organ cells such as liver, kidney, and viscera.
  • the differentiated cells are not limited to the above cells.
  • human bone marrow mesenchymal stem cells are exemplified by bone marrow blood collection, peripheral blood blood collection, fat collection, and cells that can be obtained as adherent cells by culturing directly or after separation of mononuclear cell fraction. Is not to be done.
  • As a marker of human bone marrow mesenchymal stem cells is exemplified by bone marrow blood collection, peripheral blood blood collection, fat collection, and cells that can be obtained as adherent cells by culturing directly or after separation of mononuclear cell fraction. Is not to be done.
  • Power S that can be exemplified by all or part of Lin negative, CD45 negative, CD44 positive S, but is not limited to these.
  • mouse bone marrow mesenchymal stem cells are not limited to the power that can be exemplified by, for example, cells that can be obtained by the method described in the Examples.
  • markers for mouse bone marrow mesenchymal stem cells include, but are not limited to, all or a part of Lin negative, CD45 negative, CD44 positive, Sca_l positive, c_kit negative.
  • Tissue progenitor cells are defined as undifferentiated cells that have the ability to unidirectionally differentiate into specific tissue cells other than the blood system, and are applied to the mesenchymal tissue, epithelial tissue, nerve tissue, parenchymal organ, and vascular endothelium described above. Including undifferentiated cells having differentiation ability.
  • the extract, the heparin-binding fraction, the anion exchanger-bound fraction, or the components described in (a) to (i) above is not particularly limited as long as it does not inhibit the induction of bone marrow-derived cells (for example, bone marrow-derived mesenchymal stem cells) or the promotion of tissue regeneration.
  • the tissue regeneration promoter of the present invention includes at least one of the extract, the heparin binding fraction, the anion exchanger binding fraction, or the components described in (a) to (i) above.
  • HMGB1, HMGB2, or HMGB3 In addition to one component, related molecules (group) that enhance the functional tissue regeneration inducing function of HMGB1, HMGB2, or HMGB3, molecules that suppress actions other than the expected effects of HMGB1, HMGB2, or HMGB3 (group) ), Proliferation of bone marrow-derived cells (eg, bone marrow-derived mesenchymal stem cells) And factors that control differentiation, these factors, or other factors that enhance and maintain cell function.
  • the animal species that is the source of the extract, heparin-binding fraction, anion exchanger-binding fraction, HMGB1, HMGB2, or HMGB3 protein in the inducer or tissue regeneration promoter of the present invention is a human or non-human animal.
  • force S that can be exemplified by humans, mice, rats, monkeys, pigs, rabbits, rabbits, wilds, musters, guinea pigs, etc., and the same animal species as the animal species to which the above extract is administered. preferable.
  • the HMGB1 protein in the inducer or tissue regeneration promoter of the present invention is not limited to force S, which can be exemplified by a protein containing the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1, 3, or 5.
  • the HMGB1 protein of the present invention also includes proteins functionally equivalent to the protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, 3 or 5. Examples of such a protein include 1) an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, inserted, and / or added in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1, 3 or 5.
  • a protein encoded by DNA that hybridizes under stringent conditions which is an isolated protein that is functionally equivalent to a protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, 3, or 5. It is done.
  • the HMGB2 protein in the inducer or tissue regeneration promoter of the present invention is not limited to force S, which can be exemplified by a protein comprising the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 7, 9, or 11.
  • the HMGB2 protein of the present invention also includes proteins functionally equivalent to the protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 7, 9, or 11. Examples of such a protein include 1) an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 7, 9 or 11.
  • An isolated protein functionally equivalent to a protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 7, 9 or 11, and 2) a base sequence set forth in SEQ ID NO: 8, 10 or 12
  • a protein encoded by a DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 7, 9, or 11 An isolated protein functionally equivalent to the
  • the HMGB3 protein in the inducer or tissue regeneration promoter of the present invention is not limited to the ability that can be exemplified by the protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 13 or 15.
  • the HMGB3 protein of the present invention also includes proteins functionally equivalent to the protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 13 or 15. Examples of such a protein include 1) an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 13 or 15.
  • An isolated protein that is functionally equivalent to a protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 or 15 is SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 9, 11, 13, or 15 can be a protein homologue or paralogue.
  • a protein functionally equivalent to the protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 or 15 is prepared by a method known by those skilled in the art (Experimental Medicine separate volume 'genes Engineering Handbook, PP246-251, Yodosha, 1991).
  • bone marrow-derived cells for example, bone marrow-derived mesenchymal stem cells
  • a protein having an inducing activity As a protein functionally equivalent to the protein comprising the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 or 15, bone marrow-derived cells (for example, bone marrow-derived mesenchymal stem cells) And a protein having an inducing activity.
  • the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, or 15 consists of an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, inserted, and / or added.
  • a protein functionally equivalent to a protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, or 15 includes a naturally occurring protein.
  • eukaryotic genes have a polymorphism, as is known for interferon genes and the like.
  • One or more amino acids may be substituted, deleted, inserted and / or added due to a change in the base sequence caused by this polymorphism.
  • mutant proteins are also included in the present invention.
  • substitution of base pairs by nitrite treatment of DNA is known (Hirose, S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 79: 7258-7260, 1982). In this method, mutations are introduced! / By treating the segment with nitrous acid, it is possible to introduce base pair substitution randomly in a specific segment.
  • a gapped duplex method (Kramer W. and Fritz HJ., Methods in Enzymol., 154: 350-367, 1987).
  • a circular double-stranded vector that clones the gene to be mutated is made into a single strand, and a synthetic oligonucleotide having a mutation at the target site is hybridized.
  • Complementary single-stranded DNA derived from a vector that has been linearized by cutting with a restriction enzyme is annealed to the circular single-stranded vector, and the gap between the synthetic nucleotide is filled with DNA polymerase and further ligated. To make a complete double-stranded circular vector.
  • the number of amino acids to be modified is typically within 50 amino acids, preferably within 30 amino acids, and more preferably within 5 amino acids (eg, 1 amino acid).
  • the protein of the present invention is a protein to which a conservative substitution has been added in the above amino acid substitution, comprising a protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 or 15. Functionally equivalent proteins are included. Conservative substitution is considered to be important in the case of substituting amino acids in domains important for protein activity. Such conservative substitutions of amino acids are well known to those skilled in the art.
  • amino acid groups corresponding to conservative substitutions include basic amino acids (eg, lysine, arginine, histidine), acidic amino acids (eg, aspartic acid, glutamic acid), uncharged polar amino acids (eg, glycine, asparagine).
  • basic amino acids eg, lysine, arginine, histidine
  • acidic amino acids eg, aspartic acid, glutamic acid
  • uncharged polar amino acids eg, glycine, asparagine
  • Glutamine serine, threonine, tyrosine, cysteine
  • non-polar amino acids eg, alanine, Norin, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine, tryptophan
  • ⁇ -branched amino acids eg, threonine, Norin, Isoleucine
  • aromatic amino acids for example, tyrosine, phenylarayun, tryptophan, histidine
  • a hybridizer As a method for obtaining a protein functionally equivalent to the protein comprising the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 or 15, a hybridizer
  • the method of using Chillon can be mentioned. That is, DNA encoding the HMGB1, HMGB2, or HMGB3 protein according to the present invention as shown in SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, or 16 or a fragment thereof is used as a probe and hybridized therewith. DNA can be isolated. When hybridization is performed under stringent conditions, highly homologous DNA is selected as the base sequence and the resulting isolated protein is functionally compatible with HMGB1, HMGB2, or HMGB3 proteins. Increased likelihood of containing equivalent protein.
  • a highly homologous base sequence can show, for example, 70% or more, preferably 90% or more identity.
  • the stringent conditions specifically indicate conditions such as 6 X SSC, 40% formamide, hybridization at 25 ° C, and washing at 1 X SSC, 55 ° C. be able to.
  • the stringency depends on conditions such as salt concentration, formamide concentration, and temperature, but those skilled in the art will readily set these conditions to obtain the required stringency.
  • homologs of HMGB1, HMGB2, or HMGB3 proteins other than the protein containing the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 or 15 can be obtained.
  • the encoding DNA can be isolated.
  • a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, or 15 A protein functionally equivalent to the quality usually has high homology with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, or 15.
  • High homology refers to sequence identity of at least 30% or more, preferably 50% or more, more preferably 80% or more (eg, 95% or more).
  • the identity of base sequences and amino acid sequences can be performed using a homozygous search site using the Internet [eg, FASTA, BLAST, PS to BLAST, and SSEARCH in Japan DNA Data Bank (DDBJ).
  • the protein according to the present invention or a functionally equivalent protein thereof is subjected to various modifications such as physiological modifications such as sugar chains, labels such as fluorescent or radioactive substances, or fusion with other proteins. It can be an added protein.
  • the modification by the sugar chain may be different depending on the host to be expressed depending on the host to be expressed.
  • any HMGB1, HMGB2 or HMGB2 according to the present invention may be used as long as it exhibits the same properties as the HMG Bl, HMGB2 or HMGB3 protein disclosed herein.
  • HMGB3 protein or functionally equivalent protein may be used as long as it exhibits the same properties as the HMG Bl, HMGB2 or HMGB3 protein disclosed herein.
  • HMGB1, HMGB2, or HMGB3 protein is not only a biomaterial but also a The gene to be loaded can be incorporated into an appropriate expression system and obtained as a recombinant.
  • the DNA encoding HMGB1, HMGB2, or HMGB3 protein described above may be incorporated into an appropriate expression system for expression.
  • Examples of host / vector systems applicable to the present invention include the expression vector pGEX and E. coli.
  • pGEX can express foreign genes as fusion proteins with dartathione S-transferase (GST) (Gene, 67: 31-40, 1988), so it incorporates genes encoding HMGB1, HMGB2, or HMGB3 proteins.
  • GST dartathione S-transferase
  • IPTG isopropylthio- ⁇ -D-galacto side
  • HMGB1, HMGB2, or HMGB3 proteins include the following.
  • vectors for expression of fusion tannin using histidine tag, HA tag, FLAG tag, etc. are commercially available.
  • yeast it is known that yeasts of the genus Pichia are effective for the expression of proteins having sugar chains.
  • expression systems using baculovirus vectors that host insect cells are also useful (Bio / Technology, 6: 47-55, 1988).
  • mammalian cells are used for vector transfection using promoters such as CMV, RSV, or SV40, and any of these host / vector systems can be HMGB1, HMGB2, or It can be used as an expression system for HMGB3 protein.
  • the gene can be introduced using a viral vector such as a retrovirus vector, an adenovirus vector, and an adeno-associated virus vector.
  • the obtained protein of the present invention can be isolated from the inside of a host cell or extracellular (such as a medium) and purified as a substantially pure and homogeneous protein.
  • separation and purification methods used in normal protein purification can be used. It is not limited at all. For example, select chromatography column, filter, ultrafiltration, salting out, solvent precipitation, solvent extraction, distillation, immunoprecipitation, SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, isoelectric focusing, dialysis, recrystallization, etc. When combined, they can separate and purify proteins.
  • chromatography examples include affinity chromatography, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, gel filtration, reverse phase chromatography, adsorption chromatography, etc. (Marshak et al., Strategies) for Protein Purification a nd Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996). These chromatography can be performed using liquid phase chromatography, for example, liquid phase chromatography such as HPLC and FPLC.
  • the protein of the present invention is preferably a substantially purified protein.
  • substantially purified means that the purity of the protein of the present invention (ratio of the protein of the present invention in the whole protein component) is 50% or more, 60% or more, 70% or more, 80% or more, It means 90% or more, 95% or more, 100% or close to 100%. The upper limit close to 100% depends on the purification technique and analysis technique of those skilled in the art, and is, for example, 99.999%, 99.99%, 99.9%, 99%, etc.
  • a protein purified by any purification method is included in the substantially purified protein as long as it has the above-described degree of purification.
  • a substantially purified protein can be exemplified by appropriate selection or combination, but is not limited thereto.
  • the cells that release or secrete HMGB1, HMGB2, or HMGB3 protein in the inducer or tissue regeneration promoter of the present invention basically correspond to all tissue-derived cells in vivo.
  • Examples of cells that can be easily collected and cultured include fibroblasts (for example, normal skin fibroblasts and cell lines derived therefrom), but are not limited thereto.
  • cells that secrete HMGB1, HMGB2, or HMGB3 protein may be DNA encoding HMGB1, HMGB2, or HMGB3 protein, or HMG Binds DNA encoding the secretion signal (ATG CAG ACA GAC ACA CTC CTG CTA TGG GTA CTG CTG CTG T GG GTT CCA GGT TCC ACT GGT GAC; SEQ ID NO: 17) to the DNA encoding the Bl, HMGB2, or HMGB3 protein
  • a vector prepared by inserting the prepared DNA into a publicly known expression vector or gene therapy vector is used for mammalian cells such as fibroblasts (for example, normal skin fibroblasts and cell lines derived therefrom) It can also be produced by introducing it into insect cells or other cells.
  • fibroblasts for example, normal skin fibroblasts and cell lines derived therefrom
  • the DNA encoding the HMGB1, HMGB2, or HMGB3 protein in the inducer or tissue regeneration promoter of the present invention may be genomic DNA or genomic DNA as long as it encodes an HMGB1, HMGB2, or HMGB3 protein. It may be natural DNA or artificially synthesized DNA. DNA encoding HMGB1, HMGB2, or HMGB3 protein is usually contained in the inducer or tissue regeneration promoter of the present invention in a state of being inserted into a vector (for example, a gene therapy vector).
  • a vector for example, a gene therapy vector
  • the vector for gene therapy in the present invention includes plasmid vectors, retrovirus vectors, lentiwinoles vectors, adenowinoles vectors, adenoassociate winoles vectors, Sendai winoles betaters, Sendai winoles envelope vectors, nopiroman virus vectors.
  • the force which can be illustrated is not limited to these.
  • the gene therapy vector may contain a promoter DNA sequence that effectively induces gene expression, a factor that controls gene expression, and a molecule that is necessary to maintain the stability of DNA.
  • a partial peptide of HMGB1, HMGB2, or HMGB3 protein which is a bone marrow-derived cell (for example, bone marrow-derived mesenchymal stem cell)
  • a peptide having an inducing activity, a cell secreting the partial peptide, or a vector inserted with a DNA encoding the partial peptide can also be contained.
  • the administration method of the inducer or tissue regeneration promoter of the present invention may be orally or parenterally administered.
  • Specific examples of such administration methods include injection administration, nasal administration, pulmonary administration, and transdermal administration.
  • injection administration include, for example, intravenous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, subcutaneous injection, etc.
  • the inducer or tissue regeneration promoter of the present invention is systemically or locally (for example, subcutaneous, intradermal, skin).
  • the administration method can be appropriately selected depending on the age and symptoms of the patient.
  • the dose can be selected in the range of O.OOOOOOlmg to lOOOmg per kg body weight. Alternatively, for example, the dose can be selected in the range of 0.00001 to 100000 mg / body per patient. Even when cells that secrete HMGB1, HMGB2, or HMGB3 proteins or gene therapy vectors containing HMGB1, HMGB2, or HMGB3 protein-encoded DNA are administered, HMGB1, HMGB2, or HMGB3 It is possible to administer the dose so that the amount is within the above range. However, the inducer and tissue regeneration promoter of the present invention are not limited to these doses.
  • the inducer or tissue regeneration promoter of the present invention can be formulated according to a conventional method (for example, Remingtons Pharmaceutical Science, latest edition, MarK Publishing and ompany, Easton, USA).
  • the carrier and additives to be used may be included.
  • surfactants, excipients, coloring agents, flavoring agents, preservatives, stabilizers, buffering agents, suspending agents, tonicity agents, binders, disintegrating agents, lubricants, fluidity promoters, flavoring agents
  • the present invention is not limited to these, and other commonly used carriers can be used as appropriate.
  • Specific examples include light anhydrous silicic acid, lactose, crystalline cellulose, mannitol, starch, carmellose calcium, callus, polybulassal cetylaminoacetate, polybulurpyrrolidone, gelatin, medium-chain fatty acid tridalylide, polyoxy
  • Examples include ethylene hydrogenated castor oil 60, sucrose, carboxymethylcellulose, corn starch, and inorganic salts.
  • the use of the inserted vector, the partial peptide of the HMGB1, HMGB2, or HMGB3 protein, the cell secreting the partial peptide, or the vector encoding the DNA encoding the partial peptide is as follows (1) or (2) It can also be expressed as
  • Examples of subjects whose tissues have been damaged include humans and non-human animals, such as humans, mice, rats, monkeys, pigs, nu, magpies, moths, musters, and guinea pigs. Not limited.
  • the present invention is a method for evaluating whether or not a cell or tissue extract contains a factor that induces a test cell, comprising the following steps, the test cell in step (b): A method for determining that a factor that induces a test cell is contained in a cell or tissue extract when the inducing activity of is higher than that of a control is provided.
  • step (b) A step of measuring the inducing activity of the test cell by the extract prepared in step (a).
  • the test cell in the present invention is a cell (damaged cell) that may contribute to regeneration of damaged tissue. As long as it can be expressed as a cell expected to induce tissue regeneration), there is no particular limitation.
  • Test cells in the present invention include, but are not limited to, undifferentiated cells and cells in various stages of differentiation.
  • the test cells in the present invention include, but are not limited to, stem cells and non-stem cells.
  • examples of the test cell in the present invention include circulating cells and non-circulating cells. The non-circulating cells can be exemplified by tissue-settlement cells.
  • examples of the test cell in the present invention include circulating blood cells and circulating non-blood cells.
  • examples of the test cell in the present invention include cells that may be required for regenerating damaged tissue.
  • test cells in the present invention include bone marrow-derived cells, bone marrow-derived hematopoietic cells, bone marrow-derived mesenchymal cells, cells derived from damaged tissues, and tissue derived from the same type of tissue that requires regeneration due to damage.
  • Cells, tissue-derived cells different from tissues that need to be regenerated due to damage tissue-derived cells of individuals with damaged tissues, tissue-derived cells of the same species other than individuals with damaged tissues, and individuals with damaged tissues Other than these, tissue-derived cells of different individuals, cell lines established from the above-mentioned cells and tissue-derived cells, tissue-derived cancer cells described above, cells obtained by genetically modifying the above-described cells, and the like. Not limited.
  • These cells include cells having the characteristics described above.
  • Test cells in the present invention include bone marrow, damaged tissue, tissue of the same type as tissue that is required to be regenerated due to damage, tissue different from tissue that is required to be regenerated due to damage, and tissue of an individual having damaged tissue. Examples thereof include cells isolated directly or indirectly from tissues of the same species other than individuals having damaged tissues, or tissues of heterologous individuals other than individuals having damaged tissues.
  • the test cells in the present invention include bone marrow, damaged tissue, tissue of the same type as tissue that needs to be regenerated due to damage, tissue different from tissue that needs to be regenerated due to damage, and individuals having damaged tissue.
  • Examples also include cultured cells derived from tissues, tissues of the same species other than individuals having damaged tissues, or tissues of heterologous individuals other than individuals having damaged tissues.
  • the test cells in the present invention include bone marrow, damaged tissue, tissue of the same type as tissue that requires regeneration due to damage, tissue different from tissue that requires regeneration due to damage, tissue of an individual having damaged tissue, damage Tissues of allogeneic individuals other than those with tissues, or Examples also include cells obtained by modifying cells derived from tissues of different individuals other than individuals having damaged tissues or cultured cells by genetic engineering techniques or cell biological techniques.
  • test cells in the present invention include bone marrow, damaged tissue, tissue of the same type as tissue that requires regeneration due to damage, tissue different from tissue that requires regeneration due to damage, individual tissue having damaged tissue, Examples also include tumor cells derived from tissues of the same species other than individuals having damaged tissues, or tissues of different individuals other than individuals having damaged tissues.
  • test cell in the present invention examples include a cell population containing a plurality of single cell populations having specific properties, or a single cell population having specific properties.
  • Specific examples of the former include cells collected directly or indirectly from bone marrow or damaged tissues (blood, skin, fat, etc.), and examples of the latter include bone marrow-derived mesenchymal stem cells and skin fountain fibroblasts.
  • the force s that can be exemplified is not limited to this.
  • cells or tissues are first immersed in a solvent.
  • the cells are not particularly limited, but tissue-derived cells, tissue-derived cell forces, established cell lines (for example, Hela, force S that can be exemplified by HE 293, but not limited thereto), isolation Examples thereof include cells that have been isolated, cells that have not been isolated (for example, cells that are present in isolated tissues), cells into which DNA encoding HMGB1, HMGB2, or HMGB3 proteins has been introduced.
  • the tissue may be any tissue, for example, living skin tissue, biopsy (surgical) tissue (brain, lung, heart, liver, stomach, small intestine, large intestine, kidney, kidney, bladder, spleen, uterus , Testis, blood, etc.) and damaged tissues.
  • the solvent is not limited to the forces exemplified by physiological saline, PBS, and TBS.
  • the time for immersing the cells and tissues in the solvent is preferably a sufficient time (usually 24 hours or more) necessary to induce cell necrosis, but is not limited to this time.
  • the cells and tissues can be removed from the solvent containing the cells and tissues after the cells and tissues are immersed in the solvent.
  • the method for removing cells and tissues from the solvent is not particularly limited as long as it is a method well known to those skilled in the art.
  • Test cell induction activity is, for example, the force that can be measured by the method described in the Examples, but is not limited thereto, and can also be measured by other methods for measuring cell migration ability in vitro or in vivo.
  • the cell-derived extract or tissue-derived extract and the test cell are brought close to each other across, for example, a membrane having a hole (for example, a membrane having a hole of 8 meters). Next, it is confirmed whether or not the test cell migrates to the cell or tissue extract side.
  • an extract of cells or tissues is administered to the GFP bone marrow transplanted mouse described in the Examples.
  • a GFP bone marrow transplanted mouse is prepared by transplanting bone marrow cells isolated from a transgenic mouse (GFP mouse) into which an enhanced green fluorescent protein (EGFP) gene has been introduced into a lethal radiation irradiated mouse. That power S. More specifically, bone marrow cells (about 10 5 cells / mouse) collected from the long bones of GFP mice were administered into the tail vein of mice immediately after irradiation with lethal radiation (10 Gy), and engraftment was performed. Wait (usually more than 6 weeks are required). Next, it is confirmed whether or not the GFP positive bone marrow-derived cell force cell or tissue-derived extract as a test cell is mobilized to the administration site.
  • GFP mouse transgenic mouse
  • EGFP enhanced green fluorescent protein
  • the present invention also provides a method for screening a cell or tissue extract containing a factor that induces a test cell, comprising the following steps.
  • the present invention induces a test cell from an extract determined to contain a factor that induces the test cell by the evaluation method or the screening method, using the test cell induction activity as an index.
  • a method for identifying a factor that induces a test cell comprising the step of purifying the factor.
  • the purification of the factor that induces the test cell is not limited in any way by using the separation and purification methods used in normal protein purification. For example, select chromatography column, filter, ultrafiltration, salting out, solvent precipitation, solvent extraction, distillation, immunoprecipitation, SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, isoelectric focusing, dialysis, recrystallization, etc. When combined, it is possible to separate and purify proteins.
  • the purified factor can be identified by methods well known to those skilled in the art, such as mass spectrometry. By using the identified factors, regeneration of damaged tissue can be promoted. Therefore, the factor is a factor that promotes regeneration of damaged tissue or a factor that contributes to regeneration of damaged tissue. It is possible to express S. The factor can also be expressed as a candidate that promotes regeneration of damaged tissue or a candidate that contributes to regeneration of damaged tissue.
  • a single cell population having a specific property may be migrated from a cell population containing a plurality of single cell populations having a specific property.
  • the method of the present invention identifies both a single cell population having specific properties and an agent that induces the cell population.
  • Newborn mouse skin female was transplanted to the dorsal skin of GFP bone marrow transplanted mice obtained after engraftment of transplanted bone marrow cells (6 weeks).
  • the transplanted skin piece was collected by biopsy under inhalation anesthesia, and frozen skin (6 m) was prepared using a microtome with a cooling device, fixed with 4% paraformaldehyde (30 minutes), and cell nuclei in tissue were DAPI. After staining and immunostaining with an epidermal cell-specific keratin 5 antibody, the tissue was encapsulated and the presence of GFP-positive bone marrow-derived cells was examined with a confocal laser microscope. In addition, some specimens were examined for tissue structure by HE staining. Results: In the living skin transplantation system for mice transplanted with GFP bone marrow, a strong accumulation of GFP fluorescence consistent with the regenerated skin area was observed (Fig. 2).
  • mice bone marrow-derived mesenchymal stem cells were collected from the bone of the femur or the crus, 10% fetal ⁇ shea serum free D-MEM the (Na Ca lai Co.) Cell culture medium was seeded on a cell culture dish and cultured under conditions of 37 ° C and carbon dioxide concentration of 5%. When the area occupied by the cells grows to 70 to 100% of the culture dish bottom area, the cells are detached from the culture dish using 0.25% trypsin lmMEDTA (Nacalai), and the same conditions are applied. And subcultured. The passage work was repeated at least 5 times.
  • adherent cells were isolated and cultured, and cell surface antigens were analyzed by flow cytometry, and confirmed to be Lin negative, CD45 negative, CD44 positive, Sca-1 positive, and c_kit negative. It was confirmed that these cells were able to differentiate into bone cells and adipocytes and had the properties of bone marrow mesenchymal stem cells.
  • Boyden's chamber 1 In order to confirm that bone marrow mesenchymal stem cell inducing activity exists in the obtained skin extract, Boyden's chamber 1 was used, and the C57BL6 mouse already derived from the bone marrow The migration activity against leaf stem cells was examined. Specifically, put the skin extract (25 1) into the lower tank (volume 25 1) of Boyden's chamber, place a polycarbonate membrane with 8 ⁇ m fine holes, and touch Boyden Place the upper chamber of the chamber (capacity 5 0 1) and put bone marrow-derived mesenchymal stem cell suspension (5xl0 4 / 50ml culture solution: DM EM / 10% urine fetal serum) in the C02 incubator The cells were cultured at 37 ° C for 4-24 hours.
  • the upper tank of the chamber 1 was removed, the silicon thin film was taken out, and the number of bone marrow-derived mesenchymal stem cells that had migrated to the lower tank of the chamber through the fine holes was quantitatively examined by staining.
  • heparinity column chromatography and anion exchange column (Q column) chromatography were performed.
  • the skin extract was diluted 10-fold with 9 volumes of 20 mM phosphate buffer pH 7.5 at 4 ° C (Dilution A).
  • 20 mM phosphate buffer pH 7.5 (30 ml) was poured into HiTrap Hepalin HP column (column volume: 5 ml, GE Healthcare) to equilibrate the force ram. Further, Diluent A was bound to the column. The column was then washed with 20 mM phosphate buffer pH 7.5, lOOmM NaCl (30 ml).
  • HC1 H 8.0 Diluted with HC1 H 8.0 (Diluent B). Pre-load 50 mM Tris HC1 H 8.0 (30 ml) with HiT The column was equilibrated by flowing into a rap mono Q column (column volume: lml, GE Healthcare). Further, Diluent B was bound to the column. To elute the adsorbed protein, Tris HC 1 H 8.0, lOOOOmM NaCl was flowed into the column, and the eluate was fractionated into tubes. All of the above purification steps are preferably performed at 4 ° C, more preferably at a force of 4-8 ° C, which can be performed at 4-16 ° C. This eluate was evaluated by the migration activity evaluation method using the Boyden chamber described in 2).
  • the obtained bone marrow-derived mesenchymal stem cell purified sample is mixed in Matrigel to a volume of about 10%, and inserted into a silicon tube with a diameter of about 1 mm and a length of 5 mm, which is then transplanted into a GFP bone marrow.
  • the mice were implanted subcutaneously on the back of the mouse. Two weeks later, the inserted tube was taken out, and the GFP fluorescence emitted from the bone marrow-derived cells migrated into the tube was quantitatively analyzed by a fluorescence measuring device.
  • migratory cells were removed from the tube, seeded in DMEM / 10% urine fetal serum medium, and cultured in a C02 incubator to examine the in vivo mobilization activity of bone marrow-derived mesenchymal stem cells.
  • Cells cultured continuously for 2 weeks were fixed with 2% paraformaldehyde at 25 ° C for 10 minutes, washed 4 times for 5 minutes each time with paraformaldehyde and treated with 2% skim milk solution. 10% with 2% skim milk containing 0.5% tween20 Anti-mouse keratin 5 antibody diluted 1:00 was reacted at 4 ° C for 16 hours.
  • the antibody was washed 4 times for 5 minutes each with PBS, and reacted with Alexa546-labeled anti-rabbit IgG antibody 1000-fold diluted with 2% skim milk at 25 ° C for 1 hour.
  • the experimental process of 1) to 8) above is summarized in Fig. 4.
  • HMGB1 has bone marrow-derived mesenchymal stem cell mobilization activity in vivo
  • a silicon tube containing this purified preparation was inserted subcutaneously into the back of a GFP bone marrow transplanted mouse, and the tube was added after 2 weeks.
  • the nature of the cells mobilized was examined (Fig. 9).
  • the HMGB1 purified sample contained many GFP-positive bone marrow-derived cells in the tube (about 3 times the control control).
  • Mobilized! / ( Figure 10).
  • Figure 11 shows a strong magnified image using a fluorescent stereomicroscope.
  • the GFP positive cells mobilized in the tube were taken out and cultured in DMEM / 10% urine fetal blood serum medium. As a result, the cells were in a round floating cell state immediately after the start of the culture (Fig. 12). Later, GFP-positive bone marrow-derived cells adhere to the culture dish and spinal fibroblasts It was confirmed that the cells proliferated as cells with cell-like morphology and circular epithelial cell-like morphology (Fig. 13). Furthermore, when these cells were cultured continuously for 2 weeks, cells showing hair follicle morphology were confirmed in GFP-positive bone marrow-derived cells. (Fig. 14A; bright field, weakly magnified, Fig. 14B; GFP fluorescence, weakly magnified, Fig.
  • the present inventors are the first in the world that free skin pieces produce HMGB1, and the produced HMGB1 has the activity of mobilizing bone marrow-derived mesenchymal stem cells in large quantities in the skin pieces.
  • the bone marrow-derived mesenchymal stem cells mobilized in the skin piece differentiate into mesenchymal cells such as fibroblasts, adipocytes, and smooth muscle cells in the skin tissue, and further form epidermal cell hair follicles. It was found that differentiation into cells induces functional regeneration of transplanted skin tissue.
  • This mobilization of bone marrow-derived mesenchymal stem cells and the resulting functional tissue regeneration by HMGB 1 is not only a transplant skin regeneration, but also a mechanism for inducing functional tissue regeneration at the time of damage to many organs with ischemia 'necrosis' Functioning! /, The power of being S expected easily. If it is possible to mobilize bone marrow-derived mesenchymal stem cells locally during regeneration of damaged tissue by developing pharmaceuticals using HM GB1 preparations, necessary functions that do not cause malfunction due to fibrotic scar healing I am convinced that functional tissue regeneration-guided medical care will be possible.
  • HMGB1 family in skin extract and examination of bone marrow mesenchymal stem cell-inducing activity
  • Method The presence or absence of HMGB protein family contained in newborn mouse skin extract was confirmed using Western blot method.
  • 10 skin extracts obtained in [Example 2] were electrophoresed using SDS-PAGE, and proteins separated in the gel were transferred to a PVDF membrane using a blotting apparatus (ATTO).
  • the ECL Western Blotting Detection System (GE Healthcare) was reacted with the same P VDF film, the ECL film was exposed to light and developed to confirm the presence of HMGB1, HMGB2, and HMGB3 proteins. Detected.
  • -Lys A plasmid vector pCAGGS for expressing a protein in mammalian cells was introduced so as to express the protein to which SEQ ID NO: 18) was added.
  • HEK 293 cultured cell line derived from human embryonic kidney cells
  • HMGB1, HMGB2, and HMGB3 proteins were incubated at 4 ° C for 16 hours, and then centrifuged at 4400 g for 5 minutes to collect the supernatant.
  • 100 L of Anti Flag antibody Gel (Sigma) per 50 mL of the supernatant was mixed and incubated at 4 ° C for 16 hours. The gel was collected by centrifugation and washed 5 times with PBS. Further, elution was carried out using 3X Flag peptide (final lOO ⁇ g / ml).
  • Recombinant protein expression was confirmed by Western blot using a mouse anti-Flag antibody diluted 1000-fold with S-T-PBS and a peroxidase-labeled anti-mouse IgG antibody (GE Healthcare) diluted 2000-fold with S-T-PBS.
  • the migration activity of mouse purified bone marrow mesenchymal stem cells of these purified recombinant proteins was evaluated using Boyden's chamber 1 as in [Example 2].
  • the skin of the back of 8 week-old C57BL / 6 mice was excised into a circular shape with a diameter of 8 m, and a skin ulcer model was prepared and purified there.
  • Each (100 ng) was mixed with an equal volume of hyaluronic acid solution at a concentration of lg / 100 mL PBS, and 100 L was administered to the ulcer surface. To prevent the ulcer surface from drying, it was covered with an adhesive transparent wound covering and protective material Tegaderm (Threem Healthcare), and the wound area was measured over time to determine the healing effect.
  • human bone marrow mesenchymal stem cells migrated with human skin extract and human purified HMGB1
  • evaluation was performed using a boyden chamber as in [Example 2].
  • Human skin with an area of lcm 2 was soaked in lml PBS, incubated for 16 hours at 4 ° C, and then centrifuged at 440G for 10 minutes at 4 ° C. Only the supernatant was collected and used as a human skin extract.
  • human bone marrow mesenchymal stem cells (Cbrex) were used as the cells to be placed in the upper part of the void chamber.
  • HMGB2 and HMGB3 bands were detected in addition to the HMGB1 band. Therefore, it was confirmed that the new mouse skin extract contained HMGB2 and HMGB3, which are family proteins, in addition to HMGB1! HMGB1 'HMGB2' HMGB3 expression vectors were constructed by adding a Flag tag to the N-terminus of each protein (Fig. 16). An expression vector was introduced into HEK293 cells, and the expressed protein was purified using a flag tag, and then the protein was confirmed using Western blotting (FIG. 17). When the migration activity of mouse bone marrow mesenchymal stem cells using these purified proteins was measured, the activity of any protein was confirmed (Fig. 18).
  • HMGB2 and HMGB3 are known as proteins having high homology with HMGB1.
  • HMGB2 and HMGB3 a family of HMGB1, were also produced from the free skin extract. Furthermore, a recombinant protein of HMGB1 'HMGB2' HMGB3 was prepared, bone marrow mesenchymal stem cell migration activity in vitro was confirmed, and the therapeutic effect of skin ulcer in vivo was also confirmed.
  • HMGB family 1 (HMGB 1 ⁇ HMGB2 ⁇ HMGB3) and recombinant HMGB family in newborn mouse free skin fragments have bone marrow mesenchymal stem cell induction activity and bone marrow-derived activity It has the activity of locally inducing stem cells that can differentiate into the epithelial system, and these induced bone marrow-derived cell groups differentiate into various cells such as epidermal keratinocytes, hair follicles and fibroblasts in the damaged tissue. It has become clear that it has the effect of promoting the healing of damaged tissue.
  • bone marrow mesenchymal stem cells are pluripotent stem cells
  • the whole or local administration of the HMGB family can be used to treat other tissue damage conditions, such as brain damage, myocardial infarction, and fractures. We are convinced that therapeutic effects can be expected as well.
  • human and mouse HMGB1 have 98% (213/215) homology in their amino acid sequences, and HMGB2 has 96% (202/210) homology in their amino acid sequences. It is known that HMGB3 has 97% (195/200) homology in the amino acid sequence constituting each. Therefore, human HMGB may have the same activity as mouse HMGB. From the results of this Example, human skin extract and HMGB1 are similar to mouse skin extract and bone marrow mesenchyme as HMGB1. It has become clear that it has the activity of inducing stem cells.
  • HMGB1 ELISA kit (Sinotest). Furthermore, the brain, heart and skin tissue extracts were bound to a heterogeneity column in the same manner as in [Example 2], and the bone marrow mesenchymal stem cell inducing activity of the protein in the bound fraction was measured using a boyden chamber. Confirmed
  • mice brain extract contained HMGB 1 equivalent to the newborn mouse skin extract. Furthermore, the inducing activity of bone marrow mesenchymal stem cells was observed in the mouse brain as well as the skin. A force that hardly contained HMGB1 in mouse intestinal extract and mouse heart extract Induction activity of mesenchymal stem cells was observed. In addition, the mouse brain and mouse heart-binding fractions had activity to induce bone marrow mesenchymal stem cells, similar to the mouse skin binding column. Table 1 shows the results of measuring the HMGB1 concentration and the inducing activity of bone marrow mesenchymal stem cells in each mouse tissue extract.
  • a novel method for functionally and easily extracting a plurality of bone marrow mesenchymal stem cell inducers containing HMGB1 functionally and easily can be developed. Furthermore, we developed a method for binding to a helin column to purify bone marrow mesenchymal stem cell inducers from tissue extracts. In addition, these components having bone marrow mesenchymal stem cell-inducing activity can be purified from the brain and heart using a heparin column in the same manner as the skin.
  • Example 5 Objective: To establish a method for extracting mesenchymal stem cell migration active substances from cultured cells.
  • Human fetal kidney-derived cultured cell line HEK293 and human cervical cancer cell line HeLa were each cultured in D-MEM (manufactured by nacalai) containing 10% fetal calf serum. Wash each cell with PBS Kiyoshigo, soaked for 16 hours in PBS (Nacalai Inc.) in 5ml of 10 7 cells of 4 ° C. The supernatant was collected by centrifuging at 4 ° C for 5 minutes at a gravitational acceleration of 440 G. Human bone marrow mesenchymal stem cells were placed in the upper layer of the void chamber, and a cell extract diluted 5-fold with DMEM was placed in the lower layer to confirm the migration activity of human bone marrow mesenchymal stem cells.
  • mice were irradiated with a single 10Gy X-ray! / And myelosuppressed mice were created.
  • Bone marrow cells were collected from the bilateral femur and lower leg bone of GFP mice. This was administered from the tail vein of myelosuppressed mice 24 hours after irradiation. Administration was performed under inhalation anesthesia with isoflurane.
  • mice transplanted with bone marrow cells from GFP mice were anesthetized with isoflurane and injected intraperitoneally with pentobarbital (45 mg / kg).
  • the mouse was fixed to a stereotaxic apparatus, and a midline incision was made in the head with a scalpel.
  • a burr head was drilled 2.5mm from the right side and 1mm from the front using a drill (Fig. 23A).
  • Fig. 23A With the tip at a position 3 mm deep from this site, an outer cylinder of a 20G Surfflow needle was inserted and fixed.
  • negative pressure was applied using a syringe, and a portion of the brain tissue was aspirated (FIG. 23B).
  • mice in the control group and the treatment group were perfused and fixed with 4% paraformaldehyde, and then the brains were excised. In addition, 4% paraformaldehyde was externally fixed. After dehydration with sucrose with a gradient of 15% and 30%, frozen sections were prepared.
  • Results Qualitatively shows GFP positive cell accumulation 2 and 6 weeks after administration. 2 weeks later (control; Fig. 23D, purified fraction of palin column in skin extract; Fig. 23E) and 6 weeks later (Control; Figure 23F: Purin column purified fraction in skin extract; Figure 23G) GFP-positive cells tended to be more concentrated at the damaged site in the treatment group than in the control group. Discussion: By administering the purified fraction of the palin column to the skin extract, bone marrow-derived cells accumulated at the brain tissue defect site, indicating neuronal morphology.
  • Bone marrow-derived mesenchymal stem cells are known to be differentiated into nerve cells, and it was clarified from this result that regeneration of the nervous system cells at the brain injury site can be induced by the purified fraction of the palin column in the skin extract. This can also be applied to nerve regeneration at the site of cerebral tissue injury in cerebral ischemic disease or cerebral contusion.
  • a bone marrow-derived cell for example, bone marrow-derived mesenchymal stem cell; the same shall apply hereinafter
  • cell extract having an inducing activity
  • a heparin-binding fraction having a bone marrow-derived cell inducing activity
  • a bone marrow-derived cell inducing activity An anion exchanger binding fraction having been provided.
  • a cell extract, a heparin-binding fraction, an anion exchanger-binding fraction, a bone marrow-derived cell inducer and tissue regeneration promoter containing HMGB1, HMGB2, or HMGB3 were provided.
  • HMGB1, HMGB2, and HMGB3 fall into hypoxia due to a decrease in blood flow, are released from tissue cells in the direction of necrosis, and have an action of mobilizing bone marrow-derived cells or various cells derived from them locally.
  • the mobilized bone marrow-derived cells are differentiated into the cell lineages required by each tissue, thereby promoting the recovery of the function lost due to anaemia and necrosis, so-called functional tissue regeneration.
  • a cell extract, heparin-binding fraction, anion-exchanger-binding fraction, HMGB1, HMGB2, or HMGB3 to an intractable skin ulcer caused by a blood flow disorder in the skin.
  • a cell extract, heparin-binding fraction, anion-exchanger-binding fraction, HMGB1, HMGB2, or HMGB3 to an intractable skin ulcer caused by a blood flow disorder in the skin.
  • bone marrow-derived cells are mobilized and the mobilized cells differentiate into vascular endothelial cells, local blood flow is improved.
  • differentiation into fibroblasts, nerve cells, hair follicle cells, and even epidermis cells induces and promotes functional skin regeneration with the necessary skin-attached organs for fibrotic scar healing.
  • HMGB1, HMGB2, and HMGB3 can be expected to be effective as well.

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Description

明 細 書
損傷組織の機能的再生促進医薬
技術分野
[0001] 本発明は、損傷組織の機能的再生促進医薬に関する。
背景技術
[0002] 近年、損傷組織の修復過程に種々の幹細胞が寄与していることが明らかとなり、損 傷部位に幹細胞を多数動員することにより機能的組織再生を誘導する新たな再生医 療の開発が進められつつある。この新しい再生医療を実現するためには、 1)損傷部 位に動員可能な幹細胞が生体内に豊富に存在すること、 2)幹細胞を損傷部位に動 員する因子が単離 ·同定されていることが必要である。
[0003] 損傷部位に動員可能な幹細胞は、損傷部あるいはその近傍組織に存在する組織 幹細胞と、末梢血中に存在する骨髄由来幹細胞がある。近年骨髄由来細胞が多くの 損傷組織再生に寄与していることが報告されつつあるが、損傷組織への骨髄由来細 胞動員機構については不明である。ここでいう骨髄由来細胞は血液細胞（白血球、 赤血球)への分化能をもつ造血系幹細胞と区別され、これまで骨髄間葉系幹細胞と 呼ばれている細胞に代表される幹細胞もしくは骨髄中に存在する組織前駆細胞集 団を含む。骨髄間葉系幹細胞は骨芽細胞、脂肪細胞、軟骨細胞への分化能をもつ 未分化幹細胞で、さらに線維芽細胞、筋肉細胞、ストローマ細胞、腱細胞等、その他 の間葉系の細胞に分化することが可能とされている。近年では骨髄間葉系幹細胞が 神経細胞、さらには上皮系細胞（皮膚ケラチノサイト等）や血管内皮細胞に分化する ことが証明されている（非特許文献 9)。組織前駆細胞は、血液系以外の特定組織細 胞への一方向性分化能を持つ未分化細胞と定義され、上述した間葉系組織、上皮 系組織、神経組織、実質臓器、血管内皮への分化能を有する未分化細胞を含む。
[0004] HMGB1 (High mobility group box 1：高移動性グループ 1蛋白質）は生体内殆どす ベての細胞に存在する分子量約 25,000の蛋白質で、過去の報告によれば、 1)細胞 内で DNAと結合し、クロマチン構造を制御することにより遺伝子発現を調節している（ 非特許文献 1)、 2)炎症性サイト力イン TNF- αや IL-1、 LPSの作用により炎症組織に 存在する単球やマクロファージから分泌され、細胞外にお!/、て RAGE (糖化最終産物 受容体）に結合し (非特許文献 2)強力な炎症反応を誘導する (非特許文献 3)、 3)疎 血により壊死に陥った細胞から周囲の組織へと放出される（非特許文献 4)、 4)重症 感染症である敗血症患者における炎症の進展に関与している（非特許文献 5)、 5) 心筋梗塞モデルにおいて、梗塞部に投与することにより心筋内に存在する幹細胞の 分裂 ·増殖を促進して心筋の再生 ·機能回復を促進する（特許文献 1)、 6)疎血肝臓 モデル動物において、疎血状態作製前に前投与することにより、肝障害の程度を軽 減する（非特許文献 6)、 7)筋肉損傷モデルにおいて、損傷部位に投与した HMGB1 は、同時に投与した血管前駆細胞を損傷部位に誘導し、筋組織再生を促進する（非 特許文献 7)、 8)神経細胞において、神経突起の形成を誘導する（非特許文献 8)、 などの機能が知られている。しかし、骨髄由来幹細胞、特に骨芽細胞、軟骨細胞、脂 肪細胞、などに分化可能な、いわゆる間葉系幹細胞を損傷組織に動員するという報 告は過去にない。
従来、脳や脊髄の中枢神経細胞は一度障害を受けると、再生はおこらないとされて きた。しかし、近年神経幹細胞の存在およびこの誘導が可能になった。また、正常神 経系での神経幹細胞ニッチも同定されてきた。このため、もはや不可能とされていた 損傷中枢神経系細胞の回復も期待できるようになった。現在、脳脊髄損傷、変性疾 患などに対する神経再生に関する研究が果敢に展開されている。
脳組織 (細胞)損傷の原因として、外傷による脳挫傷、脳虚血性疾患が主要なもの である。他の原因として、脳腫瘍摘出手術をはじめとした脳外科的手術に起因するも のがあげられる。とくに、脳実質細胞から発生するような、神経膠腫の全摘出は困難 であり、運動や言語機能障害を避けるためには、姑息的摘出にとどまらざるを得えな い。また、悪性神経膠腫は生命予後も悪ぐ化学療法や放射線療法をはじめ、近年 研究が盛んに行われている免疫 ·遺伝子治療も十分な効果を示すまでには至ってい ない。よって、可及的に多くの腫瘍細胞の摘出を行い、その結果生じる脳機能損傷 を回復させるような治療があれば理想的である。
非特許文献 l : Bustinら、 Mol Cell Biol, 19 : 5237-5246、 1999年
非特許文献 2 : Horietら、 J. Biol. Chem.、 270、 25752-25761、 1995年 非特許文献 3 : Wangら、 Science, 285 : 248-251、 1999年
非特許文献 4 : Mullerら、 EMBO J、 20 : 4337-4340、 2001年
非特許文献 5 : Wangら、 Science, 285 : 248-251、 1999年
非特許文献 6 : Germaniら、 J. Leukoc. Biol. , 81、 2007電子ジャーナル版
非特許文献 7 : Palumboら、 J. Cell Biol. , 164 : 441-449、 2004年
非特許文献 8 : Merenmiesら、 J. Biol. Chem.、 266 : 16722-16729、 1991年
非特許文献 9 : Yaojiongら、 Stem cells, 25:2648-1659
特許文献 1：特表 2005-537253
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0005] 本発明は、損傷組織に分化する細胞を損傷部位に動員する因子を単離 ·同定し、 該因子を利用した発明を提供することを課題とする。
課題を解決するための手段
[0006] 損傷組織に分化する細胞の動員因子が明らかになれば、この因子を損傷部位に 投与することにより、末梢血中に存在する損傷組織に分化する細胞や局所組織に存 在する損傷組織に分化する細胞を損傷部位に多数動員することが可能になり、機能 的組織再生を促進する新たな再生医療の開発が可能になる。
[0007] 本発明者らは、移植皮膚片が生体組織に生着する過程で骨髄由来細胞が皮膚外 組織から移植皮膚片に動員され、皮膚組織再生に寄与している可能性を検討し、 1) 骨髄由来細胞が移植皮膚内に大量に動員されること、 2)動員された骨髄由来細胞 は移植皮膚片内で真皮線維芽細胞、脂肪細胞、筋肉細胞、血管内皮細胞、表皮角 化細胞、のいずれにも分化しており、動員された骨髄由来細胞の中に骨髄由来間葉 系幹細胞が含まれていること、 3)骨髄由来間葉系幹細胞を末梢血から植皮片に動 員しているのは、移植皮膚の壊死組織から放出された HMGB1、 HMGB2、 HMGB3で あること、 4)精製した HMGB1、 HMGB2、 HMGB3は、骨髄から分離'培養した間葉系 幹細胞の遊走を促進すること、 5)骨髄間葉系幹細胞を遊走する HMGB1を含む活性 物質を皮膚、脳、心臓を含む多数の臓器抽出液力 へパリンァフィ二ティーカラムを 利用しカラムクロマトグラフィー法で簡便に精製できること、 6)骨髄間葉系幹細胞を 遊走する活性物質を培養細胞から簡便に抽出できること、 7)皮膚抽出液へノ リンカ ラム精製画分が脳損傷時に骨髄由来細胞を大量に動員することを世界で初めて明 らかにした。本願は、この知見に基づき、以下の発明を提供するものである。
〔i〕以下の ωから ωの!、ずれかに記載の成分を含有する、骨髄由来細胞の誘導 剤；
(a) HMGBlタンパク質
(b) HMGB1タンパク質を分泌する細胞
(c) HMGBlタンパク質をコードする DNAが揷入されたベクター
(d) HMGB2タンパク質
(e) HMGB2タンパク質を分泌する細胞
(f) HMGB2タンパク質をコードする DNAが揷入されたベクター
(g) HMGB3タンパク質
(h) HMGB3タンパク質を分泌する細胞
(i) HMGB3タンパク質をコードする DNAが揷入されたベクター。
〔2〕骨髄由来細胞が骨髄由来間葉系幹細胞である、〔1〕に記載の誘導剤。
〔3〕以下の（a)から（i)の!/、ずれかに記載の成分を含有する、組織再生促進剤；
(a) HMGBlタンパク質
(b) HMGB1タンパク質を分泌する細胞
(c) HMGBlタンパク質をコードする DNAが揷入されたベクター
(d) HMGB2タンパク質
(e) HMGB2タンパク質を分泌する細胞
(f) HMGB2タンパク質をコードする DNAが揷入されたベクター
(g) HMGB3タンパク質
(h) HMGB3タンパク質を分泌する細胞
(i) HMGB3タンパク質をコードする DNAが揷入されたベクター。
〔4〕以下の（a)から（i)のレ、ずれかに記載の成分を含有する、組織再生促進用キット；
(a) HMGBlタンパク質
(b) HMGB1タンパク質を分泌する細胞 (c) HMGBlタンパク質をコードする DNAが揷入されたベクター
(d) HMGB2タンパク質
(e) HMGB2タンパク質を分泌する細胞
(f) HMGB2タンパク質をコードする DNAが揷入されたベクター
(g) HMGB3タンパク質
(h) HMGB3タンパク質を分泌する細胞
(i) HMGB3タンパク質をコードする DNAが揷入されたベクター。
〔5〕細胞を溶媒に浸す工程を含む方法で製造される細胞の抽出液であって、骨髄由 来細胞誘導活性を有する抽出液。
〔6〕細胞を溶媒に浸す工程を含む骨髄由来細胞誘導活性を有する細胞の抽出液の 製造方法。
〔7〕以下の工程を含む方法で製造されるへパリン結合画分であって、骨髄由来細胞 誘導活性を有する画分；
(a)細胞を溶媒に浸す工程、
(b)工程 (a)で得られる抽出液を固定化へパリンに接触させる工程、および
(c)固定化へノ リンからへノ リン結合画分を溶出する工程。
〔8〕以下の工程を含む骨髄由来細胞誘導活性を有するへパリン結合画分の製造方 法；
ω細胞を溶媒に浸す工程、
(b)工程 ωで得られる抽出液を固定化へパリンに接触させる工程、および
(C)固定化へノ リンからへノ リン結合画分を溶出する工程。
〔9〕〔5〕に記載の抽出液もしくは〔6〕に記載の方法によって製造された抽出液、また は〔7〕に記載の画分もしくは〔8〕に記載の方法によって製造された画分を含有する、 骨髄由来細胞の誘導剤。
〔10〕骨髄由来細胞が骨髄由来間葉系幹細胞である、〔9〕に記載の誘導剤。
[11]〔5〕に記載の抽出液もしくは〔6〕に記載の方法によって製造された抽出液、また は〔7〕に記載の画分もしくは〔8〕に記載の方法によって製造された画分を含有する、 組織再生促進剤。 〔12〕〔5〕に記載の抽出液もしくは〔6〕に記載の方法によって製造された抽出液、また は〔7〕に記載の画分もしくは〔8〕に記載の方法によって製造された画分を含有する、 組織再生促進用キット。
〔13〕以下の工程を含む、細胞の抽出液に被験細胞を誘導する因子が含まれるか否 かを評価する方法であって、工程 (b)における被験細胞の誘導活性力 対照と比較 して高い場合に、細胞の抽出液に被験細胞を誘導する因子が含まれると判定される 方法；
(a)細胞の抽出液を調製する工程、および
(b)工程 (a)で調製された抽出液による被験細胞の誘導活性を測定する工程。
〔14〕以下の工程を含む、被験細胞を誘導する因子が含まれる細胞の抽出液をスクリ 一ユングする方法；
(a)複数の抽出液について、〔13〕に記載の方法で、該抽出液に被験細胞を誘導す る因子が含まれるか否かを評価する工程、および
(b)工程 ωで被験細胞を誘導する因子が含まれると評価された抽出液を選択する 工程
〔15〕〔13〕または〔14〕に記載の方法によって、被験細胞を誘導する因子を含むと判 定された抽出液から、被験細胞の誘導活性を指標に、被験細胞を誘導する因子を精 製する工程を含む、被験細胞を誘導する因子の同定方法。
tie]以下の ωから ωの!/、ずれかに記載の物質を、組織が損傷した対象に投与す る工程を含む、該損傷した組織に骨髄由来細胞を誘導する方法；
(a) HMGBlタンパク質
(b) HMGB1タンパク質を分泌する細胞
(c) HMGBlタンパク質をコードする DNAが揷入されたベクター
(d) HMGB2タンパク質
(e) HMGB2タンパク質を分泌する細胞
(f) HMGB2タンパク質をコードする DNAが揷入されたベクター
(g) HMGB3タンパク質
(h) HMGB3タンパク質を分泌する細胞 (i) HMGB3タンパク質をコードする DNAが揷入されたベクター。
〔17〕骨髄由来細胞が骨髄由来間葉系幹細胞である、〔16〕に記載の方法。
〔18〕以下の（a)から（i)の!/、ずれかに記載の物質を、組織が損傷した対象に投与す る工程を含む、該損傷した組織の再生を促進する方法；
(a) HMGBlタンパク質
(b) HMGB1タンパク質を分泌する細胞
(c) HMGBlタンパク質をコードする DNAが揷入されたベクター
(d) HMGB2タンパク質
(e) HMGB2タンパク質を分泌する細胞
(f) HMGB2タンパク質をコードする DNAが揷入されたベクター
(g) HMGB3タンパク質
(h) HMGB3タンパク質を分泌する細胞
(i) HMGB3タンパク質をコードする DNAが揷入されたベクター。
〔19〕〔5〕に記載の抽出液または〔6〕に記載の方法によって製造された抽出液を、組 織が損傷した対象に投与する工程を含む、該損傷した組織に骨髄由来細胞を誘導 する方法。
〔20〕〔7〕に記載の画分または〔8〕に記載の方法によって製造された画分を、組織が 損傷した対象に投与する工程を含む、該損傷した組織に骨髄由来細胞を誘導する 方法。
〔21〕骨髄由来細胞が骨髄由来間葉系幹細胞である、〔19〕または〔20〕に記載の方 法。
〔22〕〔5〕に記載の抽出液または〔6〕に記載の方法によって製造された抽出液、組織 が損傷した対象に投与する工程を含む、該損傷した組織の再生を促進する方法。 〔23〕〔7〕に記載の画分または〔8〕に記載の方法によって製造された画分を、組織が 損傷した対象に投与する工程を含む、該損傷した組織の再生を促進する方法。 〔24〕骨髄由来細胞の誘導剤の製造における以下の（a)から（i)の!/、ずれかに記載 の物質の使用；
(a) HMGBlタンパク質 (b) HMGB1タンパク質を分泌する細胞
(c) HMGBlタンパク質をコードする DNAが揷入されたベクター
(d) HMGB2タンパク質
(e) HMGB2タンパク質を分泌する細胞
(f) HMGB2タンパク質をコードする DNAが揷入されたベクター
(g) HMGB3タンパク質
(h) HMGB3タンパク質を分泌する細胞
(i) HMGB3タンパク質をコードする DNAが揷入されたベクター。
〔25〕骨髄由来細胞が骨髄由来間葉系幹細胞である、〔24〕に記載の使用。
〔26〕組織再生促進剤の製造における以下の（a)から（i)の!/、ずれかに記載の物質 の使用；
(a) HMGBlタンパク質
(b) HMGB1タンパク質を分泌する細胞
(c) HMGBlタンパク質をコードする DNAが揷入されたベクター
(d) HMGB2タンパク質
(e) HMGB2タンパク質を分泌する細胞
(f) HMGB2タンパク質をコードする DNAが揷入されたベクター
(g) HMGB3タンパク質
(h) HMGB3タンパク質を分泌する細胞
(i) HMGB3タンパク質をコードする DNAが揷入されたベクター。
〔27〕骨髄由来細胞の誘導剤の製造における〔5〕に記載の抽出液または〔6〕に記載 の方法によって製造された抽出液の使用。
〔28〕骨髄由来細胞の誘導剤の製造における〔7〕に記載の画分または〔8〕に記載の 方法によって製造された画分の使用。
〔29〕骨髄由来細胞が骨髄由来間葉系幹細胞である、〔27〕または〔28〕に記載の使 。
〔30〕組織再生促進剤の製造における〔5〕に記載の抽出液または〔6〕に記載の方法 によって製造された抽出液の使用。 〔31〕組織再生促進剤の製造における〔7〕に記載の画分または〔8〕に記載の方法に よって製造された画分の使用。
図面の簡単な説明
[図 1]GFP骨髄移植マウス作製法を示す図である。
[図 2]GFP骨髄移植マウス背部への皮膚移植後に観察した移植皮膚片に対する GFP 蛍光集積を示す写真である。上段左の写真は皮膚移植部の肉眼像を、上段中央の 写真は移植皮膚とレシピエント皮膚の境界部（「 I」で示した部分）近傍でレシピエン ト皮膚の HE組織像を、上段右の写真は植皮皮膚の HE組織像を示す。また下段左の 写真は植皮皮膚への GFP蛍光の集積を、下段中央の写真は植皮部の拡大像を、下 段右の写真は同拡大部皮膚への GFP蛍光の集積を示す。
[図 3]GFP骨髄移植マウス背部への移植皮膚片に集積した骨髄由来表皮細胞、骨髄 由来真皮線維芽細胞を示す写真である。左から 1列目は DAPI染色 (核染色）で、上 段の写真は植皮部皮膚の弱拡大像（100倍)を、中段の写真はその強拡大像 (200倍 )で表皮'真皮境界部を、下段は強拡大像 (200倍)で毛包部を示す。左から 2列目は 1列目のそれぞれの領域の GFP蛍光像、左から 3列目はそのケラチン 5 ( 5)の免疫染 色像を、左から 4列目はそれぞれの蛍光を重ね合わせた像 (Merge)を示す。 GFP陽 性表皮細胞および真皮線維芽細胞が多数観察されている。
[図 4]皮膚抽出液内の骨髄由来間葉系幹細胞誘導因子同定の流れを示す図である
〇
[図 5]切除皮膚片からの再生誘導因子 (骨髄由来間葉系幹細胞動員因子)抽出法を 示す図である。
[図 6]ボイデン ·チャンバ一を用いた皮膚抽出液の骨髄由来間葉系幹細胞遊走能活 性測定結果を示す写真である。上段左の写真はボイデン 'チャンバ一の上槽内から シリコン膜上の微細穴を通過して皮膚抽出液側（下槽側）に遊走し、シリコン膜下槽 側に付着している骨髄間葉系幹細胞を、青色色素にて染色した像で、上から培養開 始直後（Oh)、 12時間後（12h)、 24時間後（24h)の染色像 (各 4ゥエルずつ）を示す。 上段右の写真は Ohの強拡大像、下段左の写真は 12hの強拡大像、下段右の写真は 24hの強拡大像を示す。 園 7]皮膚抽出液精製分画標品群におけるボイデンチヤンバーを用いた骨髄由来間 葉系幹細胞遊走能活性測定結果と、それぞれの精製分画標品の SDS-PAGE電気泳 動の結果との対応を示す写真である。左から第 1レーン (M.W.)は分子量マーカーを 泳動、第 2レーン (C.E.)は精製前皮膚抽出液を泳動、第 3レーン (H.E.)はへパリンァ フィニティーカラム結合分画（中間精製分画）を泳動、第 4〜 13レーン (A.E.)は種々 の NaCl濃度で溶出した陰イオン交換カラム結合分画 (最終精製分画)を泳動した後 の銀染色像を示す。さらに、骨髄由来間葉系幹細胞遊走活性の最も強い最終精製 分画番号 4の泳動ゲル銀染色像（レーン 7)における各染色バンドを切り出して質量 分析およびデータベース解析を行った結果、「―」で示したバンドが HMGB1であるこ とが明らかとなった。
園 8]ボイデンチヤンバーを用いた HMGB1の骨髄由来間葉系幹細胞遊走活性測定 結果を示す写真である。上段の二つは皮膚抽出液中へ遊走した骨髄由来間葉系幹 細胞の染色像を、中段の二つは HMGB1精製標品へ遊走した骨髄由来間葉系幹細 胞の染色像を、下段は中段に用いた HMGB1精製標品に抗 HMGB1ポリクロナール抗 体を加えて中和した溶液へ遊走した骨髄由来間葉系幹細胞の染色像 (殆ど遊走活 性は消失)を示す。
[図 9]生体内骨髄由来間葉系幹細胞誘導活性測定法を示す図である。
園 10]HMGB1による生体内骨髄由来間葉系幹細胞動員活性を示す写真である。 H MGB1分画 (最終精製分画番号 4)は、対象コントロール (最終精製分画番号 1)の約 3 倍の動員活性を示した。
園 11]HMGB1分画 (最終精製分画番号 4)により生体内で動員された細胞の強拡大 の写真である。
園 12]シリコンチューブ内遊走細胞の培養開始直後の写真である。左の写真は培地 内に播種した遊走細胞の明視野像を、右の写真はその喑視野における GFP蛍光像 を示す。
園 13]シリコンチューブ内遊走細胞の培養開始 24時間後の写真である。左の写真は 培養プラスチックシャーレに付着して増殖している線維芽細胞様細胞および上皮細 胞様細胞の明視野像を、右の写真はその喑視野における GFP蛍光像を示す。 園 14]シリコンチューブ内遊走細胞の培養開始 2週間後の写真である。左右の写真 は同一の視野で、左の写真は明視野、右の写真は蛍光フィルター（Bおよび Dは GFP の蛍光を検出する、 Fはケラチン 5の蛍光を検出する）を通した写真である。培養ブラ スチックシャーレに円形にコロニーを形成する骨髄由来 GFP陽性細胞集団の左側に 、線状の毛髪状の形態を認めるく Δ (矢印）で示す〉。 Fは骨髄由来細胞が毛髪状の 形態変化を呈しさらにケラチン 5を発現して!/、ることを示して!/、る (Δ (矢印）で示す)。
[図 15]新生マウス皮膚抽出液中の HMGBファミリーを Western blot法を用いて検出し た写真である。
[図 16]哺乳類細胞における HMGBファミリーの発現ベクターの MAPを示す図である。 cytomegalovirus enhancerど chicken β— actin promoterを持 、プロモータト流に存 在する HMGBファミリーの cDNA (complementary DNA:相補 DNA)力 Sコードする mRNA を大量に合成する。
[図 17]HEK293細胞に発現させた精製リコンビナント Flag tag-HMGBファミリー融合タ ンパクの Western blotの結果を示す写真である。
[図 18]ボイデンチヤンバーを用いたリコンビナント HMGB1 'HMGB2 'HMGB3の骨髄 間葉系幹細胞遊走活性を示す図である。いずれのリコンビナントタンパクもコントロー ル群に比べ遊走活性を示した。
園 19]マウスの皮膚潰瘍治療モデルにおける HMGBファミリーによる治療結果を示 す図である。 HMGB1 'HMGB2 'HMGB3いずれもコントロール群に比べ有意に潰瘍面 積の縮小効果を示した。
園 20]ヒト HMGB1及びヒト皮膚抽出液がヒト骨髄由来間葉系幹細胞を遊走する活性 をボイデン 'チャンバ一を用いて確認した写真である。
園 21]マウス心臓、マウス脳及びマウス皮膚抽出液中の骨髄間葉系幹細胞誘導活性 物質をへパリンカラムで精製し、ボイデン 'チャンバ一を用いて、活性を確認した写真 である。
園 22]培養細胞株 HEK293および HeLa抽出液のヒト骨髄間葉系幹細胞遊走活性を ボイデンチヤンバー法を用いて確認した写真である。 V、ずれの培養細胞株もヒト骨髄 間葉系幹細胞遊走活性を示した。 園 23]図 23Aはマウスを脳定位固定装置に固定し、メスにて頭部に正中切開しドリル を用いて穿頭を施した写真である。図 23Bは脳にシリンジを用いて、陰圧をかけ、脳 組織を一部吸引した写真である。図 23Cはフイブリン糊製剤（フイブリノゲン）に溶解し た皮膚抽出液へノ リンカラム精製画分を 5 1注入し、次にフイブリン糊製剤（トロンビ ン）を 5 ^ 1注入した後の写真である。図 23D,および図 23Εは脳損傷モデル治療後 2 週間後の写真である。コントロールの 23Dに比べ皮膚抽出液へパリンカラム精製画 分による治療群の 23Εで GFP陽性細胞の集積が認められた。図 23F,および図 23G は脳損傷モデル治療後 6週間後の写真である。コントロールの 23Fに比べ皮膚抽出 液へパリンカラム精製画分による治療群の 23Gで GFP陽性細胞の集積が認められた
〔発明の実施の形態〕
本発明は、以下の ωから ωに記載の成分のうち少なくとも 1つの成分を含有する 、骨髄由来細胞の誘導剤を提供する。
(a) HMGBlタンパク質
(b) HMGB1タンパク質を分泌する細胞
(c) HMGBlタンパク質をコードする DNAが揷入されたベクター
(d) HMGB2タンパク質
(e) HMGB2タンパク質を分泌する細胞
(f) HMGB2タンパク質をコードする DNAが揷入されたベクター
(g) HMGB3タンパク質
(h) HMGB3タンパク質を分泌する細胞
(i) HMGB3タンパク質をコードする DNAが揷入されたベクター。
該誘導剤を使用することにより、局所 (上記成分の投与'添加部位やその近傍）に 骨髄由来細胞 (例えば骨髄由来間葉系幹細胞）を誘導して組織の機能的再生を促 進することが可能になるため、該誘導剤は、再生医療、再生誘導医療開発のための 基礎研究および臨床研究に必要な試薬として使用することができる。例えば、実験 動物における必要な生体組織に骨髄由来細胞（例えば骨髄由来間葉系幹細胞）を 動員し、組織修復、組織機能再建の程度を検討することが可能になる。また試験管 内で骨髄由来細胞（例えば骨髄由来間葉系幹細胞）の動員による組織再生誘導研 究を fiうこと力できる。
また、上記誘導剤を使用することにより、損傷組織の再生を促進することができる。 また、上記誘導剤には、機能的組織再生誘導 ·促進剤としての用途のみならず、組 織幹細胞の減少による組織'臓器機能の低下を予防する、いわゆる予防医薬として の用途、あるいは加齢性変化の進行を遅延させる、抗加齢医薬としての用途が期待 できる。
本発明はまた、以下の（a)から（i)に記載の成分のうち少なくとも 1つの成分を含有 する、組織再生促進剤または組織再生促進用キットを提供する。
(a) HMGBlタンパク質
(b) HMGB1タンパク質を分泌する細胞
(c) HMGBlタンパク質をコードする DNAが揷入されたベクター
(d) HMGB2タンパク質
(e) HMGB2タンパク質を分泌する細胞
(f) HMGB2タンパク質をコードする DNAが揷入されたベクター
(g) HMGB3タンパク質
(h) HMGB3タンパク質を分泌する細胞
(i) HMGB3タンパク質をコードする DNAが揷入されたベクター。
該組織再生促進剤または組織再生促進用キットは、損傷組織部位またはその近傍 に投与されることで、血液中に循環している骨髄由来細胞（例えば骨髄由来間葉系 幹細胞)を、末梢血中から該損傷組織に誘導 (局所誘導する)することを特徴とする。 また組織再生促進用キットとしては、（1)フイブリノゲンに溶解した上記抽出液もしく は上記画分等、および（2)トロンビンを含む組織再生促進用キット、または、（1)上記 抽出液もしくは上記画分等、（2)フイブリノゲン、および（3)トロンビンを含む組織再生 促進用キットが例示できる。本発明においては、市販のフイブリノゲンやトロンビンを 使用すること力 sできる。例えば、フイブリノゲン HT-Wi (ベネシス一三菱ゥエルファーマ 一）、ベリプラスト（ZLBベーリング）、ティシール（バクスター）、ボルヒール（化血研）、タ ココンブ（ZLBベーリング）が挙げられる力 これらに制限されるものではない。 本発明は、細胞を溶媒に浸す工程を含む骨髄由来細胞誘導活性を有する細胞の 抽出液の製造方法に関する。また、本発明は、該製造方法で製造される細胞の抽出 液であって、骨髄由来細胞誘導活性を有する抽出液に関する。
溶媒に浸される細胞としては、特に制限はないが、組織由来細胞、組織由来細胞 から樹立された株化細胞（例えば、 Hela、 HEK293が例示できる力 これらに制限され ない）、単離された細胞、単離されていない細胞（例えば単離された組織中に存在す る細胞）、 HMGB1、 HMGB2、または HMGB3タンパク質をコードする DNAが導入され た細胞などが例示できる。上記組織としては、どのような組織でもよぐ例えば、生体 皮膚組織、体内生検 (手術)組織 (脳、肺、心臓、肝臓、胃、小腸、大腸、瞵臓、腎臓 、膀胱、脾臓、子宮、精巣や血液など）が例示できるが、これらに制限されるものでは ない。
上記溶媒としては生理食塩水、 PBS (Phosphate-buffered saline)、 TBS (Tris-buffere d saline)が例示できる力 S、これらに制限されない。また、細胞や組織を溶媒に浸す時 間としては、細胞壊死が誘導されるために必要 ·十分な時間、すなわち 1時間から 48 時間（例えば 6時間から 48時間）、好ましくは 12から 24時間である力 この時間に限定 されるものではない。よって、「細胞を溶媒に浸す工程」は「壊死が誘導されるために 必要 ·十分な時間、細胞を溶媒に浸す工程」や「細胞を壊死させる工程」と言い換え ること力 Sできる。また、細胞や組織を溶媒に浸す温度として 4°Cから 25°C (例えば 4°C から 8°C)、好ましくは 4°Cが例示できる力 これに制限されない。また、細胞や組織を 溶媒に浸す pHとしては pH7から 8、好ましくは pH7.5が例示できる力 これに制限され ない。また、緩衝液の成分として、 10 mM〜50mM、好ましくは 10〜20mMの濃度のリ ン酸緩衝液が挙げられる力、これに制限されない。
また、本発明においては、細胞や組織を溶媒に浸した後に、細胞や組織を含む溶 媒から該細胞ゃ該組織を取り除くこともできる。溶媒から細胞や組織を取り除く方法 は当業者に周知な方法であれば、特に制限されない。例えば、 4°C〜25°C (例えば 4 °C)、また重力加速度 10G〜4000G (例えば 440G)で遠心し、上清を分取すること により、溶媒から細胞や組織を取り除くことができる力 これに制限されない。該上清 を細胞や組織の抽出液として利用できる。 [0012] さらに、本発明は、以下の工程を含む骨髄由来細胞誘導活性を有するへパリン結 合画分の製造方法に関する。また、本発明は、該製造方法で製造されるへパリン結 合画分であって、骨髄由来細胞誘導活性を有する画分に関する。
(a)細胞や組織を溶媒に浸す工程、
(b)工程 (a)で得られる抽出液を固定化へパリンに接触させる工程、および
(c)固定化へパリンからへパリン結合画分 (へパリン精製画分、へパリンカラム精製画 分とも表現しうる）を溶出する工程。
固定化へパリンとは、へパリンを不溶性担体に共有結合させたものである。上記不 '溶十生担体どし" dよ、 Sepharose beads(¾epharose 4B,¾epnarose 6B : E Healthcare) が例示されるが、これに制限されるものではない。本発明においては、市販の固定化 へパリン (Hitrap Hepalin HP column: GE Healthcare)を用いてもよい。
細胞や組織の抽出液と固定化へパリンの接触条件としては、 pH7〜8程度（このまし くは pH7.5)、塩濃度は 0〜200mM、好ましくは 100〜200mM程度が例示される力 こ れらに制限されない。抽出液と固定化へパリンとが接触している時間は特に限定され ないが、へパリン結合画分を固定化へパリンに十分吸着させるという観点では 5分以 上保持されることが好ましい。また、温度としては、 4〜8°C、好ましくは 4°Cが挙げられ る力 これらに制限されない。さらに、固定化へパリンに吸着したへパリン結合画分の 溶出条件としては、 pH7〜8程度、塩濃度 200〜1000mM (好ましくは lOOOmM程度）が 例示されるが、これらに制限されるものではない。
[0013] さらに、本発明は、以下の工程を含む骨髄由来細胞誘導活性を有する陰イオン交 換体結合画分の製造方法に関する。また、本発明は、該製造方法で製造される陰ィ オン交換体結合画分であって、骨髄由来細胞誘導活性を有する画分に関する。
(a)細胞や組織を溶媒に浸す工程、
(b)工程 (a)で得られる抽出液を固定化へパリンに接触させる工程、
(c)固定化へノ リンからへノ リン結合画分を溶出する工程、
(d)工程 (c)で得られるへパリン結合画分を陰イオン交換体に接触させる工程、およ び
(e)陰イオン交換体から陰イオン交換体結合画分を溶出する工程。 陰イオン交換体としては、 DEAE (diethylaminoethyl)や Q (quaternary ammonium)を 利用した交換体が例示できる力 これらに制限されない。本発明においては、市販の 陰イオン交換体 (例えば Sourcel5Q ,Source30Q, MonoQ,MiniQ,PC3.2/3,Mini Q4.6/ 50 ΡΒ,Ηι Tra ibX Columns, niTrap SP HP,w Sepharose High Perrormance, Hiload 1 6/10 Q Sepharose HP,HiPrep 16/10 SP XL,Q Sepharose XL,HiPrer 16/10 Q FF，Hi Prep 16/lODEAE FF,Q Sepharose Fast Flow, DEAE Sepharose Fast Flow (いずれも GE Healthcare》を用いてもよい。
へノ リン結合画分と陰イオン交換体の接触条件としては、 pH7〜9程度（好ましくは p H8)、塩濃度は 0〜100mM、好ましくは 50mM程度が例示される力 S、これらに制限され ない。抽出液と陰イオン交換体とが接触している時間は特に限定されないが、陰ィォ ン交換体結合画分を陰イオン交換体に十分吸着させるという観点では 5分以上保持 されることが好ましい。また、温度としては、 4〜16°C、好ましくは 4°Cが挙げられるが、 これらに制限されない。さらに、陰イオン交換体に吸着した陰イオン交換体結合画分 の溶出条件としては、 pH7〜9程度 (好ましくは、 pH 8程度)、塩濃度 100〜2000mM (好 ましくは lOOOmM程度）が例示される力 S、これらに制限されるものではない。
また、本発明は、上記抽出液もしくは上記画分、または上記方法によって製造され た抽出液もしくは上記方法によって製造された画分を含有する、骨髄由来細胞の誘 導剤に関する。
該誘導剤を使用することにより、局所 (上記成分の投与'添加部位やその近傍）に 骨髄由来細胞 (例えば骨髄由来間葉系幹細胞）を誘導して組織の機能的再生を促 進することが可能になるため、該誘導剤は、再生医療、再生誘導医療開発のための 基礎研究および臨床研究に必要な試薬として使用することができる。例えば、実験 動物における必要な生体組織に骨髄由来細胞（例えば骨髄由来間葉系幹細胞）を 動員し、組織修復、組織機能再建の程度を検討することが可能になる。また試験管 内で骨髄由来細胞（例えば骨髄由来間葉系幹細胞）の動員による組織再生誘導研 究を fiうこと力できる。
また、上記誘導剤を使用することにより、損傷組織の再生を促進することができる。 また、上記誘導剤には、機能的組織再生誘導 ·促進剤としての用途のみならず、組 織幹細胞の減少による組織'臓器機能の低下を予防する、いわゆる予防医薬として の用途、あるいは加齢性変化の進行を遅延させる、抗加齢医薬としての用途が期待 できる。
[0015] さらに、本発明は、上記抽出液もしくは上記画分、または上記方法によって製造さ れた抽出液もしくは上記方法によって製造された画分を含有する、組織再生促進剤 または組織再生促進用キットに関する。再生される組織としては、特に制限はなぐ 損傷している組織である限り、どのような組織でもよぐ例えば、生体皮膚組織、体内 生検 (手術)組織 (脳、肺、心臓、肝臓、胃、小腸、大腸、勝臓、腎臓、膀胱、脾臓、子 宮、精巣や血液など）が例示できる。
該組織再生促進剤または組織再生促進用キットは、損傷組織部位またはその近傍 に投与されることで、血液中に循環している骨髄由来細胞（例えば骨髄由来間葉系 幹細胞)を、末梢血中から該損傷組織に誘導 (局所誘導する)することを特徴とする。 また組織再生促進用キットとしては、（1)フイブリノゲンに溶解した上記抽出液もしく は上記画分等、および（2)トロンビンを含む組織再生促進用キット、または（1)上記 抽出液もしくは上記画分等、（2)フイブリノゲン、および（3)トロンビンを含む組織再生 促進用キットが例示できる。本発明においては、市販のフイブリノゲンやトロンビンを 使用すること力でさる。
[0016] 損傷組織に動員された骨髄由来細胞（例えば骨髄由来間葉系幹細胞）は、種々の 細胞に分化し、損傷組織の機能的再生および機能維持、機能強化に寄与する。本 発明において、損傷組織としては、虚血、疎血 ·低酸素状態をきたす種々の病態、外 傷、熱傷、炎症、自己免疫、遺伝子異常などによって損傷した組織が挙げられるが、 これら原因に限定されるものではない。また、損傷組織には、壊死組織も含まれる。 本発明における組織としては、骨髄由来細胞（例えば骨髄由来間葉系幹細胞）が 分化可能な組織である限り、特に制限はないが、例えば皮膚組織、骨組織、軟骨組 織、筋組織、脂肪組織、心筋組織、神経系組織、肺組織、消化管組織、肝 *胆*勝組 織、泌尿 '生殖器など、生体内のすべての組織が例示できる。また、上記組織再生促 進剤を用いることで、難治性皮膚潰瘍、皮膚創傷、水疱症、脱毛症などの皮膚疾患 はもとより、脳梗塞、心筋梗塞、骨折、肺梗塞、胃潰瘍、腸炎、などの組織損傷にお いて、機能的組織再生を誘導する治療が可能となる。上記組織再生促進剤が投与さ れる動物種としては、ヒト又は非ヒト動物が挙げられ、例えば、ヒト、マウス、ラット、サル 、ブタ、ィヌ、ゥサギ、ノ、ムスター、モルモットなどが例示できる力 これらに限定される ものではない。
本発明の骨髄由来細胞は、造血系幹細胞及びこれに由来する白血球、赤血球、 血小板以外の細胞であり、これまで骨髄間葉系幹細胞と呼ばれている細胞に代表さ れる幹細胞もしくは骨髄中に存在する組織前駆細胞集団を含む。本発明の骨髄由 来細胞としては、骨髄採血、あるいは末梢血採血により単離することができる細胞で ある。造血系幹細胞は非付着細胞であり、本発明の骨髄由来細胞は、骨髄採血、末 梢血採血により得られた血液中の単核球分画細胞培養により付着細胞として得られ る。また、本発明の骨髄由来細胞は間葉系幹細胞を含み、骨芽細胞（分化を誘導す るとカルシウムの沈着を認めることで特定可能）、軟骨細胞（アルシアンブルー染色 陽性、サフラニン- 0染色陽性などで特定可能）、脂肪細胞 (ズダン III染色陽性で特 定可能）、さらには線維芽細胞、平滑筋細胞、ストローマ細胞、腱細胞、などの間葉 系細胞、さらには神経細胞、上皮細胞（たとえば表皮角化細胞、腸管上皮細胞はサ イトケラチンファミリーを発現する）、血管内皮細胞への分化能力を有することが好ま しいが、分化後の細胞は上記細胞に限定されるものではなぐ肝臓、腎臓、勝臓など の実質臓器細胞への分化能も含む。
本発明において、骨髄由来間葉系幹細胞とは、骨髄内に存在する細胞であって、 骨髄から直接あるいはその他の組織 (血液や皮膚、脂肪などの間葉系組織)から間 接的に採取され、（プラスチックあるいはガラス製)培養皿への付着細胞として培養' 増殖可能であり、骨、軟骨、脂肪などの間葉系組織への分化能を有するという特徴を 持つ細胞であり、骨髄血採血、末梢血採血、さらには間葉組織からの採取によって 取得することができる。また骨髄由来間葉系幹細胞は一度培養皿へ付着させた細胞 を生体の損傷部に投与することにより、例えば皮膚を構成するケラチノサイトなどの上 皮系組織への分化能も有すると!/、う特徴も持つ。
本発明の骨髄由来間葉系幹細胞は多能性幹細胞であり、骨芽細胞（分化を誘導 するとカルシウムの沈着を認めること等で特定可能）、軟骨細胞（アルシアンブルー 染色陽性、サフラニン- 0染色陽性等で特定可能）、脂肪細胞 (ズダン III染色陽性等 で特定可能）の他に、例えば線維芽細胞、平滑筋細胞、骨格筋細胞、ストローマ細 胞、腱細胞などの間葉系細胞、神経細胞、色素細胞、表皮細胞、毛包細胞 (サイトケ ラチンファミリー、ヘアケラチンファミリ一等を発現する)、上皮系細胞 (たとえば表皮角 化細胞、腸管上皮細胞はサイトケラチンファミリ一等を発現する）、内皮細胞、さらに 肝臓、腎臓、勝臓等の実質臓器細胞に分化する能力を有することが好ましいが、分 化後の細胞は上記細胞に限定されるものではない。
また、ヒト骨髄間葉系幹細胞は骨髄採血、末梢血採血、脂肪採取し、直接あるいは 単核球分画を分離後に培養して付着細胞として取得することができる細胞が例示で きる力 これに制限されるものではない。ヒト骨髄間葉系幹細胞のマーカーとしては、
Lin陰性、 CD45陰性、 CD44陽性、の全部または一部が例示できる力 S、これらに制限 されるものではない。
また、マウス骨髄間葉系幹細胞は、例えば、実施例の記載の方法によって取得でき る細胞が例示できる力 これに制限されるものではない。マウス骨髄間葉系幹細胞の マーカーとしては、 Lin陰性、 CD45陰性、 CD44陽性、 Sca_l陽性、 c_kit陰性、の全部 または一部が例示できる力 これらに制限されるものではない。
組織前駆細胞は、血液系以外の特定組織細胞への一方向性分化能を持つ未分 化細胞と定義され、上述した間葉系組織、上皮系組織、神経組織、実質臓器、血管 内皮への分化能を有する未分化細胞を含む。
本発明の誘導剤、および本発明の組織再生促進剤において、上記抽出液、上記 へパリン結合画分、上記陰イオン交換体結合画分、または、上記 (a)から (i)に記載 の成分のうち少なくとも 1つの成分以外の成分としては、骨髄由来細胞（例えば骨髄 由来間葉系幹細胞）の誘導や組織再生促進を阻害しない限り、特に制限はない。例 えば、本発明の組織再生促進剤には、上記抽出液、上記へパリン結合画分、上記陰 イオン交換体結合画分、または、上記（a)から（i)に記載の成分のうち少なくとも 1つ の成分に加え、 HMGB1、 HMGB2、または HMGB3の機能的組織再生誘導機能を強 化する関連分子（群）、 HMGB1、 HMGB2、または HMGB3の期待される効果以外の 作用を抑制する分子 (群）、骨髄由来細胞 (例えば骨髄由来間葉系幹細胞）の増殖 や分化を制御する因子、これら因子あるいは細胞の機能を強化'維持するその他の 因子を含むことが可能である。
本発明の誘導剤や組織再生促進剤における抽出液、へパリン結合画分、陰イオン 交換体結合画分、 HMGB1、 HMGB2、または HMGB3タンパク質の起源となる動物種 としては、ヒト又は非ヒト動物が挙げられ、例えば、ヒト、マウス、ラット、サル、ブタ、ィヌ 、ゥサギ、ノ、ムスター、モルモットなどが例示できる力 S、上記抽出液等が投与される動 物種と同じ動物種であることが好ましい。
本発明の誘導剤や組織再生促進剤における HMGB1タンパク質としては、配列番 号： 1、 3または 5に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質が例示できる力 S、これらに限 定されるものではない。本発明の HMGB1タンパク質には、配列番号： 1、 3または 5に 記載のアミノ酸配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質も含まれる。その ようなタンパク質としては、例えば、 1)配列番号： 1、 3または 5に記載のアミノ酸配列 において 1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、揷入、および/または付加したアミ ノ酸配列からなり、配列番号： 1、 3または 5に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質と 機能的に同等な単離されたタンパク質、および、 2)配列番号：2、 4または 6に記載の 塩基配列を含む DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズする DNAによりコー ドされるタンパク質であって、配列番号： 1、 3または 5に記載のアミノ酸配列を含むタ ンパク質と機能的に同等な単離されたタンパク質が挙げられる。
本発明の誘導剤や組織再生促進剤における HMGB2タンパク質としては、配列番 号： 7、 9または 11に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質が例示できる力 S、これらに 限定されるものではない。本発明の HMGB2タンパク質には、配列番号： 7、 9または 1 1に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質も含まれる。そ のようなタンパク質としては、例えば、 1)配列番号： 7、 9または 11に記載のアミノ酸配 列において 1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、揷入、および/または付加したァ ミノ酸配列からなり、配列番号： 7、 9または 11に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質 と機能的に同等な単離されたタンパク質、および、 2)配列番号：8、 10または 12に記 載の塩基配列を含む DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズする DNAにより コードされるタンパク質であって、配列番号： 7、 9または 11に記載のアミノ酸配列を含 むタンパク質と機能的に同等な単離されたタンパク質が挙げられる。
本発明の誘導剤や組織再生促進剤における HMGB3タンパク質としては、配列番 号： 13または 15に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質が例示できる力 これらに限 定されるものではない。本発明の HMGB3タンパク質には、配列番号： 13または 15に 記載のアミノ酸配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質も含まれる。その ようなタンパク質としては、例えば、 1)配列番号： 13または 15に記載のアミノ酸配列 において 1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、揷入、および/または付加したアミ ノ酸配列からなり、配列番号： 13または 15に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質と 機能的に同等な単離されたタンパク質、および、 2)配列番号：14または 16に記載の 塩基配列を含む DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズする DNAによりコー ドされるタンパク質であって、配列番号： 13または 15に記載のアミノ酸配列を含むタ ンパク質と機能的に同等な単離されたタンパク質が挙げられる。
配列番号： 1、 3、 5、 7、 9、 11、 13または 15に記載のアミノ酸配列を含むタンパク 質と機能的に同等な単離されたタンパク質は、配列番号： 1、 3、 5、 7、 9、 11、 13ま たは 15に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質のホモログあるいはパラログでありうる 。配列番号： 1、 3、 5、 7、 9、 11、 13または 15に記載のアミノ酸配列を含むタンパク 質と機能的に同等なタンパク質は、当業者によって公知の方法 (実験医学別冊 '遺 伝子工学ハンドブック， PP246-251,羊土社、 1991年発行）で単離することができる。 配列番号： 1、 3、 5、 7、 9、 11、 13または 15に記載のアミノ酸配列を含むタンパク 質と機能的に同等なタンパク質としては、骨髄由来細胞 (例えば骨髄由来間葉系幹 細胞）の誘導活性を有するタンパク質が挙げられる。
配列番号： 1、 3、 5、 7、 9、 11、 13または 15に記載のアミノ酸配列において 1若しく は複数のアミノ酸が置換、欠失、揷入、および/または付加したアミノ酸配列からなり 、配列番号： 1、 3、 5、 7、 9、 11、 13または 15に記載のアミノ酸配列を含むタンパク 質と機能的に同等なタンパク質は、天然に存在するタンパク質を含む。一般に真核 生物の遺伝子は、インターフェロン遺伝子等で知られているように、多型現象 (polymo rphism)を有する。この多型現象によって生じた塩基配列の変化によって、 1または複 数個のアミノ酸が、置換、欠失、揷入、および/または付加される場合がある。このよ うに自然に存在するタンパク質であって、かつ配列番号： 1、 3、 5、 7、 9、 11、 13また は 15に記載のアミノ酸配列において、 1若しくは複数のアミノ酸力 置換、欠失、揷入 、および/または付加したアミノ酸配列を有し、配列番号： 1、 3、 5、 7、 9、 11、 13ま たは 15に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質は、本 発明の HMGB1、 HMGB2、または HMGB3タンパク質に含まれる。
[0021] また、配列番号： 1、 3、 5、 7、 9、 11、 13または 15に記載のアミノ酸配列からなるタ ンパク質と機能的に同等なタンパク質である限り、人為的に作製された変異タンパク 質も本発明に含まれる。与えられた塩基配列に対してランダムに変異を加える方法と しては、たとえば DNAの亜硝酸処理による塩基対の置換が知られている（Hirose, S. et al.， Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 79:7258-7260， 1982)。この方法では、変異を導 入した!/、セグメントを亜硝酸処理することにより、特定のセグメント内にランダムに塩基 対の置換を導入することができる。あるいはまた、 目的とする変異を任意の場所にも たらす技術としては gapped duplex法等がある（Kramer W. and Fritz HJ., Methods in Enzymol., 154:350-367， 1987)。変異を導入すべき遺伝子をクローユングした環状 2 本鎖のベクターを 1本鎖とし、 目的とする部位に変異を持つ合成オリゴヌクレオチドを ハイブリダィズさせる。制限酵素により切断して線状化させたベクター由来の相補 1本 鎖 DNAを、前記環状 1本鎖ベクターにァニールさせ、前記合成ヌクレオチドとの間の ギャップを DNAポリメラーゼで充填し、更にライゲーシヨンすることにより完全な 2本鎖 環状ベクターとする。
改変されるアミノ酸の数は、典型的には 50アミノ酸以内であり、好ましくは 30アミノ酸 以内であり、さらに好ましくは 5アミノ酸以内（例えば、 1アミノ酸)であると考えられる。
[0022] アミノ酸を人為的に置換する場合、性質の似たアミノ酸に置換すれば、もとのタンパ ク質の活性が維持されやすいと考えられる。本発明のタンパク質には、上記アミノ酸 置換において保存的置換が加えられたタンパク質であって、配列番号： 1、 3、 5、 7、 9、 11、 13または 15に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパ ク質が含まれる。保存的置換は、タンパク質の活性に重要なドメインのアミノ酸を置換 する場合などにぉレ、て重要であると考えられる。このようなアミノ酸の保存的置換は、 当業者にはよく知られている。 [0023] 保存的置換に相当するアミノ酸のグループとしては、例えば、塩基性アミノ酸 (例え ばリジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性アミノ酸（例えばァスパラギン酸、グルタミン 酸）、非荷電極性アミノ酸（例えばグリシン、ァスパラギン、グルタミン、セリン、スレオ ニン、チロシン、システィン）、非極性アミノ酸（例えばァラニン、ノ リン、ロイシン、イソ ロイシン、プロリン、フエ二ルァラニン、メチォニン、トリプトファン）、 β分岐アミノ酸（例 えばスレオニン、ノ リン、イソロイシン）、および芳香族アミノ酸（例えばチロシン、フエ 二ルァラユン、トリプトファン、ヒスチジン）などが挙げられる。
また、非保存的置換によりタンパク質の活性などをより上昇 (例えば恒常的活性化 型タンパク質などを含む）させることも考えられる。
[0024] この他、配列番号： 1、 3、 5、 7、 9、 11、 13または 15に記載のアミノ酸配列を含むタ ンパク質と機能的に同等なタンパク質を得る方法として、ハイブリダィゼーシヨンを利 用する方法を挙げることができる。すなわち、配列番号： 2、 4、 6、 8、 10、 12、 14また は 16に示すような本発明による HMGB1、 HMGB2、または HMGB3タンパク質をコード する DNA、あるいはその断片をプローブとし、これとハイブリダィズすることができる D NAを単離する。ハイブリダィゼーシヨンをストリンジェントな条件下で実施すれば、塩 基配列としては相同性の高い DNAが選択され、その結果として単離されるタンパク質 には HMGB1、 HMGB2、または HMGB3タンパク質と機能的に同等なタンパク質が含 まれる可能性が高まる。相同性の高い塩基配列とは、たとえば 70%以上、望ましくは 90 %以上の同一性を示すことができる。
[0025] なおストリンジェントな条件とは、具体的には例えば 6 X SSC、 40%ホルムアミド、 25°C でのハイブリダィゼーシヨンと、 1 X SSC、 55°Cでの洗浄といった条件を示すことができ る。ストリンジエンシーは、塩濃度、ホルムアミドの濃度、あるいは温度といった条件に 左右されるが、当業者であればこれらの条件を必要なストリンジエンシーを得られるよ うに設定することは自明である。
ハイブリダィゼーシヨンを利用することによって、たとえば配列番号： 1、 3、 5、 7、 9、 11、 13または 15に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質以外の HMGB1、 HMGB2、 または HMGB3タンパク質のホモログをコードする DNAの単離が可能である。
[0026] 配列番号： 1、 3、 5、 7、 9、 11、 13または 15に記載のアミノ酸配列を含むタンパク 質と機能的に同等なタンパク質は、通常、配列番号： 1、 3、 5、 7、 9、 11、 13または 1 5に記載のアミノ酸配列と高い相同性を有する。高い相同性とは、少なくとも 30%以 上、好ましくは 50%以上、さらに好ましくは 80%以上（例えば、 95%以上）の配列の同 一性を指す。塩基配列やアミノ酸配列の同一性は、インターネットを利用したホモ口 ジー検索サイトを利用して行うことができる [例えば日本 DNAデータバンク (DDBJ)に おいて、 FASTA、 BLAST, PSト BLAST、および SSEARCH等の相同性検索が利用で きる [例えば日本 DNAデータバンク（DDBJ)のウェブサイトの相同性検索（Search and Analysis)のヘーン； http://www.ddbj.mg.ac.p/E_mail/homoiogy_j.html]。 よた、 Nat ional Center for Biotechnology Information (NCBI)において、 BLASTを用いた検索 を fiうことができる（例えば NCBIのホームページのウェブサイトの BLASTのページ； ht tp：〃 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/; Altschul, S.F. et al., J. Mol. Biol., 1990， 215(3 ):403-10; Altschul, S.F. & Gish, W.， Meth. Enzymol., 1996， 266:460-480; Altschul, S.F. et al., Nucleic Acids Res., 1997， 25:3389-3402) ]。
[0027] 例えば Advanced BLAST 2.1におけるアミノ酸配列の同一性の算出は、プログラム に blastpを用い、 Expect値を 10、 Filterは全て OFFにして、 Matrixに BLOSUM62を用 レヽ、 Gap existence cost、 Per residue gap cost、および Lambda ratioをでれてれ 11、 1 、 0.85 (デフォルト値）に設定して検索を行い、同一性（identity)の値 (％)を得ることが できる（Karlin, S. and S. F. Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68; arlin, S. and S. F. Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-7)。
[0028] 本発明によるタンパク質、またはその機能的に同等なタンパク質は、糖鎖等の生理 的な修飾、蛍光や放射性物質のような標識、あるいは他のタンパク質との融合といつ た各種の修飾を加えたタンパク質であることができる。ことに後に述べる遺伝子組換 え体にぉレ、ては、発現させる宿主によって糖鎖による修飾に差異が生じる可能性が ある。し力もたとえ糖鎖の修飾に違いを持っていても、本明細書中に開示された HMG Bl、 HMGB2、または HMGB3タンパク質と同様の性状を示すものであれば、いずれも 本発明による HMGB1、 HMGB2、または HMGB3タンパク質、または機能的に同等な タンパク質である。
[0029] HMGB1、 HMGB2、または HMGB3タンパク質は、生体材料のみならず、これをコー ドする遺伝子を適当な発現系に組み込んで遺伝子組換え体 (recombinant)として得 ることもできる。 HMGB1、 HMGB2、または HMGB3タンパク質を遺伝子工学的な手法 によって得るためには、先に述べた HMGB1、 HMGB2、または HMGB3タンパク質をコ ードする DNAを適当な発現系に組み込んで発現させれば良い。本発明に応用可能 なホスト/ベクタ一系としては、例えば、発現ベクター pGEXと大腸菌を示すことがで きる。 pGEXは外来遺伝子をダルタチオン S-トランスフェラーゼ（GST)との融合タンパ ク質として発現させることができる（Gene, 67:31-40， 1988)ので、 HMGB1、 HMGB2、 または HMGB3タンパク質をコードする遺伝子を組み込んだ pGEXをヒートショックで B L21のような大腸菌株に導入し、適当な培養時間の後に isopropylthio- β -D-galacto side (IPTG)を添加して GST融合 HMGB1、 GST融合 HMGB2、または GST融合 HMGB3 タンパク質の発現を誘導する。本発明による GSTはダルタチオンセファロース 4Bに吸 着するため、発現生成物はァフィ二ティクロマトグラフィーによって容易に分離 ·精製 することが可能である。
[0030] HMGB1、 HMGB2、または HMGB3タンパク質の recombinantを得るためのホスト/ ベクター系としては、この他にも次のようなものを応用することができる。まず細菌をホ ストに利用する場合には、ヒスチジンタグ、 HAタグ、 FLAGタグ等を利用した融合タン ノ^の発現用ベクターが市販されている。酵母では、 Pichia属酵母が糖鎖を備えたタ ンパク質の発現に有効なことが公知である。糖鎖の付加という点では、昆虫細胞をホ ストとするバキュロウィルスベクターを利用した発現系も有用である（Bio/Technology, 6:47-55, 1988)。更に、哺乳動物の細胞を利用して、 CMV、 RSV、あるいは SV40等の プロモーターを利用したベクターのトランスフエクシヨンが行われており、これらのホス ト/ベクター系は、いずれも HMGB1、 HMGB2、または HMGB3タンパク質の発現系と して利用すること力できる。また、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ァ デノ随伴ウィルスベクター等のウィルスベクターを利用して遺伝子を導入することもで きる。
[0031] 得られた本発明のタンパク質は、宿主細胞内または細胞外 (培地など)から単離し、 実質的に純粋で均一なタンパク質として精製することができる。タンパク質の分離、精 製は、通常のタンパク質の精製で使用されている分離、精製方法を使用すればよぐ 何ら限定されるものではない。例えば、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾 過、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、 SDS-ポリアクリルアミドゲル電気 泳動、等電点電気泳動法、透析、再結晶等を適宜選択、組み合わせればタンパク質 を分離、精製すること力 Sできる。
[0032] クロマトグラフィーとしては、例えばァフィ二ティークロマトグラフィー、イオン交換クロ マトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着ク 口マトグラフィ一等が挙げられる (Marshak et al.， Strategies for Protein Purification a nd Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Cold Spring Harbo r Laboratory Press, 1996)。これらのクロマトグラフィーは、液相クロマトグラフィー、例 えば HPLC、 FPLC等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。
[0033] また、本発明のタンパク質は、実質的に精製されたタンパク質であることが好ましい 。ここで「実質的に精製された」とは、本発明のタンパク質の精製度 (タンパク質成分 全体における本発明のタンパク質の割合）が、 50%以上、 60%以上、 70%以上、 80 %以上、 90%以上、 95%以上、 100%若しくは 100%に近いことを意味する。 100%に 近い上限は当業者の精製技術や分析技術に依存するが、例えば、 99.999%、 99.99 %、 99.9%, 99%などである。
[0034] また、上記の精製度を有するものであれば、如何なる精製方法によって精製された ものでも、実質的に精製されたタンパク質に含まれる。例えば、上述のクロマトグラフィ 一力ラム、フィルター、限外濾過、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、 SDS -ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動法、透析、再結晶等を適宜選択、 または組み合わせることにより、実質的に精製されたタンパク質を例示できるが、これ らに限定されるものではない。
[0035] 本発明の誘導剤や組織再生促進剤における HMGB1、 HMGB2、または HMGB3タ ンパク質を放出または分泌する細胞としては、基本的に生体内のすべての組織由来 細胞が該当する。採取および培養が容易な細胞としては、線維芽細胞（例えば正常 皮膚線維芽細胞およびそれに由来する株化細胞）が例示できるが、これに限定され るものではない。また、 HMGB1、 HMGB2、または HMGB3タンパク質を分泌する細胞 は、 HMGB1、 HMGB2、または HMGB3タンパク質をコードする DNA、あるいは、 HMG Bl、 HMGB2、または HMGB3タンパク質をコードする DNAに分泌シグナルをコードす る DNA(ATG CAG ACA GAC ACA CTC CTG CTA TGG GTA CTG CTG CTG T GG GTT CCA GGT TCC ACT GGT GAC；配列番号： 17)を結合させた DNAを、公 知の発現ベクターや遺伝子治療用ベクターに揷入することで作製されたベクターを、 線維芽細胞（例えば正常皮膚線維芽細胞およびそれに由来する株化細胞）などの 哺乳類細胞や昆虫細胞、その他の細胞に導入することによつても作製することができ る。これら細胞が由来する動物種に特に制限はないが、組織再生が行われる対象動 物種の細胞、対象自身の細胞、あるいは組織再生が行われる対象の血縁にあたる 者に由来する細胞を使用することが好ましい。
[0036] 本発明の誘導剤や組織再生促進剤における HMGB1、 HMGB2、または HMGB3タ ンパク質をコードする DNAは、 HMGB1、 HMGB2、または HMGB3タンパク質をコード する限り、 cDNAであっても、ゲノム DNAであってもよく、また、天然の DNAであっても、 人工的に合成された DNAであってもよい。 HMGB1、 HMGB2、または HMGB3タンパク 質をコードする DNAは、通常、ベクター（例えば遺伝子治療用ベクター）に揷入され た状態で、本発明の誘導剤や組織再生促進剤に含有される。
[0037] 本発明における遺伝子治療用ベクターとしては、プラスミドベクター、レトロウイルス ベクター、レンチウイノレスベクター、アデノウイノレスベクター、アデノアソシエートウイノレ スベクター、センダイウイノレスベタター、センダイウイノレスエンベロープベクター、ノ ピ ローマウィルスベクター、などが例示できる力 これらに限定されるものではない。該 遺伝子治療用ベクターには、遺伝子発現を効果的に誘導するプロモーター DNA配 列や、遺伝子発現を制御する因子、 DNAの安定性を維持するために必要な分子が 含まれてもよい。
[0038] なお、本発明の誘導剤、および本発明の組織再生促進剤においては、 HMGB1、 H MGB2、または HMGB3タンパク質の部分ペプチドであって骨髄由来細胞（例えば骨 髄由来間葉系幹細胞）の誘導活性を有するペプチド、該部分ペプチドを分泌する細 胞、または、該部分ペプチドをコードする DNAが揷入されたベクターを含有することも できる。
[0039] 本発明の誘導剤や組織再生促進剤の投与方法は、経口投与または非経口投与が 挙げられ、係る投与方法としては具体的には、注射投与、経鼻投与、経肺投与、経 皮投与などが挙げられる。注射投与の例としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注 射、腹腔内注射、皮下注射などによって本発明の誘導剤や組織再生促進剤を全身 または局部的 (例えば、皮下、皮内、皮膚表面、眼球あるいは眼瞼結膜、鼻腔粘膜、 口腔内および消化管粘膜、膣 ·子宮内粘膜、または損傷部位など）に投与できる。 また、患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。 HMGB1、 HM GB2、または HMGB3タンパク質を投与する場合、例えば、一回の投与につき、体重 1 kgあたり O.OOOOOOlmgから lOOOmgの範囲で投与量が選択できる。あるいは、例えば、 患者あたり 0.00001から 100000mg/bodyの範囲で投与量が選択できる。 HMGB1、 HM GB2、または HMGB3タンパク質を分泌する細胞や HMGB1、 HMGB2、または HMGB3 タンパク質をコードする DNAが揷入された遺伝子治療用ベクターを投与する場合も、 損傷組織において、 HMGB1、 HMGB2、または HMGB3タンパク質の量が上記範囲内 となるように投与すること力 Sできる。し力、しながら、本発明の誘導剤や組織再生促進剤 はこれらの投与量に制限されるものではない。
[0040] 本発明の誘導剤や組織再生促進剤は、常法に従って製剤化することができ (例え は、 Remington s Pharmaceutical Science, latest edition, MarK Publishing し ompany, Easton, U.S.A) ,医薬的に許容される担体や添加物を共に含むものであってもよい。 例えば界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、 等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等が挙げられるが、こ れらに制限されず、その他常用の担体が適宜使用できる。具体的には、軽質無水ケ ィ酸、乳糖、結晶セルロース、マンニトール、デンプン、カルメロースカルシウム、カル ス、ポリビュルァセタールジェチルァミノアセテート、ポリビュルピロリドン、ゼラチン、 中鎖脂肪酸トリダリセライド、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油 60、白糖、カルボキシメ チルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等を挙げることができる。
[0041] また、上述した細胞抽出液、へパリン結合画分、陰イオン交換体結合画分、 HMGB 1、 HMGB2、または HMGB3タンパク質、 HMGB1、 HMGB2、または HMGB3タンパク質 を分泌する細胞、 HMGB1、 HMGB2、または HMGB3タンパク質をコードする DNAが揷 入されたベクター、 HMGB1、 HMGB2、または HMGB3タンパク質の部分ペプチド、該 部分ペプチドを分泌する細胞、または該部分ペプチドをコードする DNAが揷入され たベクターの用途は、以下（1)または（2)のように表現することもできる。
(1)細胞抽出液、へパリン結合画分、陰イオン交換体結合画分、 HMGB1、 HMGB2、 HMGB3タンパク質、該タンパク質を分泌する細胞、該タンパク質をコードする DNAが 揷入されたベクター、該タンパク質の部分ペプチド、該部分ペプチドを分泌する細胞 、または該部分ペプチドをコードする DNAが揷入されたベクターを、組織が損傷した 対象に投与する工程を含む、該損傷した組織の再生を促進する方法、
(2)細胞抽出液、へパリン結合画分、陰イオン交換体結合画分、 HMGB1、 HMGB2、 HMGB3タンパク質、該タンパク質を分泌する細胞、該タンパク質をコードする DNAが 揷入されたベクター、該タンパク質の部分ペプチド、該部分ペプチドを分泌する細胞 、または該部分ペプチドをコードする DNAが揷入されたベクターを、組織が損傷した 対象に投与する工程を含む、該損傷した組織に骨髄細胞を誘導する方法、
(3)骨髄由来細胞の誘導剤または組織再生促進剤の製造における、細胞抽出液、 へパリン結合画分、陰イオン交換体結合画分、 HMGB1、 HMGB2、 HMGB3タンパク 質、該タンパク質を分泌する細胞、該タンパク質をコードする DNAが揷入されたべク ター、該タンパク質の部分ペプチド、該部分ペプチドを分泌する細胞、または該部分 ペプチドをコ一ドする DNAが揷入されたべクタ一の使用。
上記組織が損傷した対象としては、ヒト又は非ヒト動物が挙げられ、例えば、ヒト、マ ウス、ラット、サル、ブタ、ィヌ、ゥサギ、ノ、ムスター、モルモットなどが例示できる力 こ れらに制限されない。
[0042] また、本発明は、以下の工程を含む、細胞や組織の抽出液に被験細胞を誘導する 因子が含まれるか否力、を評価する方法であって、工程 (b)における被験細胞の誘導 活性が、対照と比較して高い場合に、細胞や組織の抽出液に被験細胞を誘導する 因子が含まれると判定される方法を提供する。
(a)細胞や組織の抽出液を調製する工程、および
(b)工程 (a)で調製された抽出液による被験細胞の誘導活性を測定する工程。
[0043] 本発明における被験細胞は、損傷組織の再生に寄与する可能性のある細胞（損傷 組織の再生を誘導することが期待される細胞とも表現できる）である限り、特に制限は ない。本発明における被験細胞としては、未分化な細胞、種々の分化段階にある細 胞が挙げられるが、これらに制限されない。また、本発明における被験細胞としては、 幹細胞、非幹細胞などが挙げられる力 これらに限定されるものではない。また、本 発明における被験細胞としては、循環性の細胞、非循環性の細胞が例示できる。該 非循環性の細胞としては、組織定住性の細胞が例示できる力 これに制限されな!/、。 また、本発明における被験細胞としては、循環性の血液細胞、循環性の非血液細胞 が例示できる。また、本発明における被験細胞としては、損傷した組織を再生するた めに必要とされる可能性のある細胞が例示できる。
[0044] また、本発明における被験細胞としては、骨髄由来細胞、骨髄由来造血系細胞、 骨髄由来間葉系細胞、損傷組織由来の細胞、損傷により再生が必要とされる組織と 同種の組織由来の細胞、損傷により再生が必要とされる組織と異なる組織由来の細 胞、損傷組織を有する個体の組織由来細胞、損傷組織を有する個体以外の同種個 体の組織由来細胞、損傷組織を有する個体以外の異種個体の組織由来細胞、上述 した細胞および組織由来細胞から樹立された株化細胞、上述した組織由来癌細胞、 上述した細胞を遺伝子工学的に改変した細胞、などが挙げられる力 これらに限定さ れない。これら細胞には、上述の特徴を有する細胞が含まれる。
[0045] 本発明における被験細胞としては、骨髄、損傷組織、損傷により再生が必要とされ る組織と同種の組織、損傷により再生が必要とされる組織と異なる組織、損傷組織を 有する個体の組織、損傷組織を有する個体以外の同種個体の組織、または損傷組 織を有する個体以外の異種個体の組織から直接または間接的に単離された細胞が 例示できる。また、本発明における被験細胞としては、骨髄、損傷組織、損傷により再 生が必要とされる組織と同種の組織、損傷により再生が必要とされる組織と異なる組 織、損傷組織を有する個体の組織、損傷組織を有する個体以外の同種個体の組織 、または損傷組織を有する個体以外の異種個体の組織由来の培養細胞も例示でき る。また本発明における被験細胞としては、骨髄、損傷組織、損傷により再生が必要 とされる組織と同種の組織、損傷により再生が必要とされる組織と異なる組織、損傷 組織を有する個体の組織、損傷組織を有する個体以外の同種個体の組織、または 損傷組織を有する個体以外の異種個体の組織由来の細胞あるいは培養細胞を遺伝 子工学的手法或いは細胞生物学的手法で修飾した細胞も例示できる。また本発明 における被験細胞としては、骨髄、損傷組織、損傷により再生が必要とされる組織と 同種の組織、損傷により再生が必要とされる組織と異なる組織、損傷組織を有する個 体の組織、損傷組織を有する個体以外の同種個体の組織、または損傷組織を有す る個体以外の異種個体の組織由来の腫瘍細胞も例示できる。
[0046] また、本発明における被験細胞としては、特定の性質を有する単一細胞集団を複 数種含有する細胞集団、または特定の性質を有する単一の細胞集団が例示できる。 前者の具体例としては、骨髄あるいは損傷組織 (血液、皮膚、脂肪など)から直接ま たは間接的に採取された細胞群、後者の例としては骨髄由来間葉系幹細胞や皮膚 泉維芽細胞が例示できる力 s、これに限定されるものではない。
[0047] 上記方法では、まず細胞や組織を溶媒に浸す。上記細胞としては、特に制限はな いが、組織由来細胞、組織由来細胞力、ら樹立された株化細胞（例えば、 Hela、 HE 2 93が例示できる力 S、これらに制限されない）、単離された細胞、単離されていない細 胞（例えば単離された組織中に存在する細胞）、 HMGB1、 HMGB2、または HMGB3タ ンパク質をコードする DNAが導入された細胞などが例示できる。上記組織としては、 どのような組織でもよぐ例えば、生体皮膚組織、体内生検（手術)組織 (脳、肺、心臓 、肝臓、胃、小腸、大腸、瞵臓、腎臓、膀胱、脾臓、子宮、精巣や血液など)、損傷組 織が例示できる。また、該溶媒としては、生理食塩水、 PBS、 TBSが例示できる力 こ れらに制限されない。また、細胞や組織を溶媒に浸す時間としては、細胞壊死が誘 導されるために必要 ·十分な時間（通常 24時間以上）であることが好ましいが、この時 間に限定されるものではない。また、本発明においては、細胞や組織を溶媒に浸した 後に、細胞や組織を含む溶媒から該細胞や該組織を取り除くこともできる。溶媒から 細胞や組織を取り除く方法は当業者に周知な方法であれば、特に制限されない。
[0048] 次いで、得られた細胞や組織の抽出液による被験細胞の誘導活性を測定する。対 照としては、細胞や組織を浸す前の溶媒が例示できる。被験細胞の誘導活性は、例 えば実施例の記載の方法で測定することができる力 これに限定されず、その他の 試験管内あるいは生体内細胞遊走能測定方法で測定することもできる。 [0049] 例えば、細胞由来抽出液や組織由来抽出液と被験細胞を、例えば穴を持つ膜 (例 えば 8 メートルの穴を持つ膜)を隔てて近接 '交通させる。次いで、被験細胞が細胞 や組織の抽出液の側に遊走するか否かを確認する。また、例えば、細胞や組織の抽 出液を、実施例に記載の GFP骨髄移植マウスに投与する。 GFP骨髄移植マウスは、 e nhanced green fluorescent protein (EGFP)遺伝子が導入されたトランスジェニックマウ ス（GFPマウス）から単離された骨髄細胞を、致死性放射線照射したマウスに移植す ることで作製すること力 Sできる。より具体的には、致死性放射線（10Gy)を照射した直 後のマウス尾静脈内に、 GFPマウスの長管骨から採取した骨髄細胞（約 105個/匹）を 投与し、生着を待つ（通常約 6週間以上が必要)。次いで、被験細胞としての GFP陽 性骨髄由来細胞力 細胞や組織由来抽出液の投与部位に動員されているか否かを 確認する。
[0050] また、本発明は、以下の工程を含む、被験細胞を誘導する因子が含まれる細胞や 組織の抽出液をスクリーニングする方法を提供する。
(a)複数の抽出液について、上記の評価方法で、該抽出液に被験細胞を誘導する 因子が含まれるか否かを評価する工程、および
(b)工程 ωで被験細胞を誘導する因子が含まれると評価された抽出液を選択する 工程
[0051] さらに、本発明は、上記の評価方法やスクリーニング方法によって、被験細胞を誘 導する因子を含むと判定された抽出液から、被験細胞の誘導活性を指標に、被験細 胞を誘導する因子を精製する工程を含む、被験細胞を誘導する因子の同定方法を 提供する。被験細胞を誘導する因子の精製には、通常のタンパク質の精製で使用さ れている分離、精製方法を使用すればよぐ何ら限定されるものではない。例えば、 クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、 免疫沈降、 SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動法、透析、再結晶 等を適宜選択、組み合わせればタンパク質を分離、精製すること力 Sできる。精製され た因子は、例えば質量分析等の当業者に周知の方法によって、同定することができ る。同定された因子を使用することで、損傷組織の再生を促進することができる。よつ て、該因子は、損傷組織の再生を促進する因子や損傷組織の再生に寄与する因子 と表現すること力 Sできる。また、該因子は、損傷組織の再生を促進する候補や損傷組 織の再生に寄与する候補と表現することもできる。
[0052] 本発明の方法においては、特定の性質を有する単一細胞集団を複数種含有する 細胞集団から、特定の性質を有する単一細胞集団が遊走されることもありうる。このよ うな場合は、本発明の方法によって、特定の性質を有する単一細胞集団、および、 該細胞集団を誘導する因子の両方が同定される。
なお本明細書において引用されたすベての先行技術文献は、参照として本明細書 に組み入れられる。
実施例
[0053] 以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に 制限されるものではない。
〔実施例 1〕
目的：生体移植皮膚組織の機能的再生時における骨髄由来細胞寄与の評価 方法：上記の目的に対して以下の方法により研究を行った。
1) GFP骨髄移植マウスに対する生体皮膚移植系を利用して、移植皮膚片の機能的 再生時の骨髄由来細胞寄与程度を検討した。具体的には、 C57BL/6雄マウス（6〜8 週齢）に致死量放射線（lOGy)を照射し、その直後に尾静脈より GFP (green fluoresce nt protein)トランスジエニックマウス由来骨髄細胞（5xl06個 /0.1ml生理的リン酸緩衝 溶液 PH7.4)を移植した（図 1)。
2)移植骨髄細胞の生着を待って（6週間）得られた GFP骨髄移植マウスの背部皮膚 に、新生マウス皮膚 (雌)を移植した。
3)移植皮膚片の生着と十分な皮膚組織再生を待って (4週間）、移植皮膚片領域に おける GFP蛍光の集積程度を、蛍光実体顕微鏡を利用して観察した。
4)吸入麻酔下に移植皮膚片を生検により採取し、冷却装置付ミクロトームを用いて 皮膚凍結切片（6 m)を作製、 4%パラホルムアルデヒド固定 (30分間）、組織内細胞 核を DAPIで染色、表皮細胞特異的ケラチン 5の抗体を用いて免疫染色を施行した後 、組織を封入して共焦点レーザー顕微鏡により GFP陽性骨髄由来細胞の存在を検 討した。また一部の標本は HE染色によりその組織構築を検討した。 結果： GFP骨髄移植マウスへの生体皮膚移植系にお!/、て、再生した皮膚領域に一 致した強い GFP蛍光の集積が観察された（図 2)。また、移植皮膚片の HE標本を用い た組織学的観察では、多数の毛包を含む皮膚組織の機能的再生が確認された（図 2 )。共焦点レーザー顕微鏡による観察では、ケラチン 5を発現している表皮角化細胞 、真皮線維芽細胞、さらには平滑筋細胞や脂肪細胞の多くが GFP蛍光を示し、これ らの細胞が骨髄由来であることが示された（図 3)。即ち、移植皮膚の機能的再生時 に必要な上皮系および間葉系細胞の多くが、骨髄由来幹細胞により供給されている ことが初めて明らかとなつた。
考察:これらの研究結果は、これまで臨床現場で日常的に行われている皮膚移植に おける皮膚再生時に、骨髄由来細胞が大きく寄与していることを初めて明確に示した ものであり、極めて画期的な発見である。
[0054] 骨髄内には造血系幹細胞と間葉系幹細胞の二つの幹細胞システムが存在すること が報告されている。今回の研究で示された、移植皮膚内に大量動員された骨髄由来 上皮系細胞および間葉系細胞が骨髄由来造血系幹細胞から供給されていると予想 するのは困難であり、移植組織の機能的再生には骨髄由来間葉系幹細胞が寄与し ている可能性が強く示唆される。即ち、植皮直後に疎血 ·壊死方向にある移植皮膚 組織力 骨髄由来間葉系幹細胞動員因子が放出され、骨髄から間葉系幹細胞を、 末梢血液循環を介して移植皮膚片内に動員し、機能的皮膚組織再生を誘導してい ることが予想された。
[0055] 〔実施例 2〕
目的:皮膚組織抽出液内に存在する骨髄間葉系幹細胞誘導因子の同定
方法:疎血状態にある切除皮膚からの放出が予想される骨髄間葉系幹細胞動員因 子の同定を目的として、以下の方法により研究を進めた。
1)マウス骨髄由来間葉系幹細胞を得るために、 C57BL/6マウスの骨髄細胞を大腿 骨もしくは下腿の骨から採取し、 10%胎仔ゥシ血清含 D-MEM(NaCalai社製)を細胞 培養培地として細胞培養皿に撒き、 37°C、炭酸ガス濃度 5%の条件下で培養した。細 胞が占める面積が培養皿底面積に対して 70から 100%に増殖した時点で、 0.25%トリ プシン lmMEDTA(Nacalai社製）を用いて細胞を培養皿からはがし、さらに同じ条件 で継代培養した。継代作業は少なくとも 5回以上繰り返した。さらにこれらの付着細胞 を単離培養しフローサイトメトリーによる細胞表面抗原の分析を行い Lin陰性、 CD45 陰性、 CD44陽性、 Sca-1陽性、 c_kit陰性であることを確認した。これらの細胞は骨細 胞、脂肪細胞に分化可能で骨髄間葉系幹細胞の性質を有することを確認した。
2)新生マウス 400匹から得た遊離皮膚片を生理的リン酸緩衝液 pH7.4 (PBS) 400ml内 に浸し、 4°Cで 24時間インキュベーションした後、組織を取り除くために、 4°Cの条件下 で 10分間、 440Gで遠心し上清を回収して皮膚抽出液を作製した。
3)得られた皮膚抽出液の中に骨髄間葉系幹細胞誘導活性が存在することを確認す るため、ボイデン 'チャンバ一を用い、本発明者らが既に株化している C57BL6マウス 骨髄由来間葉系幹細胞に対する遊走活性を検討した。具体的にはボイデン 'チャン バーの下槽 (容量 25 1)に皮膚抽出液（25 1)を揷入し、 8 μ mの微細穴を持つポリ カーボネートメンブレンを乗せ、さらにこれに接してボイデン ·チャンバー上槽（容量 5 0 1)を載せて、その中に骨髄由来間葉系幹細胞浮遊液（5xl04個 /50ml培養液: DM EM/10%ゥシ胎仔血清）を入れ、 C02インキュベーター内で 37°C、 4〜24時間培養し た。培養後、チャンバ一の上槽をはずし、シリコン薄膜を取り出して、その微細穴を通 過してチャンバ一下槽に遊走した骨髄由来間葉系幹細胞の数を染色により定量的 に検討した。
4)皮膚抽出液内の骨髄由来間葉幹細胞動員活性をもつ因子を精製するために、へ パリンァフィ二ティーカラム'クロマトグラフィー、および陰イオン交換カラム（Qカラム） クロマトグラフィーを施行した。皮膚抽出液を 4°Cの 9倍容 20 mMリン酸バッファー pH 7.5を用い 10倍に希釈した（希釈液 A)。あらかじめ、 20 mMリン酸バッファー pH 7.5 ( 30ml)を HiTrap Hepalin HP column (カラム容量： 5ml、 GE Healthcare)の中に流し力 ラムを平衡化した。さらに、希釈液 Aをカラムに結合させた。その後 20 mMリン酸バッ ファー pH 7.5, lOOmM NaCl (30ml)でカラムを洗浄した。吸着したタンパクを溶出す るため 20 mMリン酸バッファー pH 7.5, lOOOmM NaClをカラム内に流入し、溶出液を チューブに分画した。吸着画分をそれぞれ、 2)で説明したボイデン ·チャンバ一を利 用した遊走活性評価法により遊走能を有する画分を集めた。これを 9倍容 50 mM Tris
HC1 H 8.0で希釈した (希釈液 B)。あらかじめ、 50 mM Tris HC1 H 8.0(30ml)を HiT rap mono Q column (カラム容量： lml、 GE Healthcare)の中に流しカラムを平衡化し た。さらに、希釈液 Bをカラムに結合させた。吸着したタンパクを溶出するため Tris HC 1 H 8.0, lOOOmM NaClをカラム内に流入し、溶出液をチューブに分画した。以上の 精製過程はすべて 4〜16°Cで行うことが可能である力 4〜8°Cで行うことが好ましぐ 4 °Cで行うことが更に好ましい。この溶出液を 2)で説明したボイデン 'チャンバ一を利用 した遊走活性評価方法により評価した。
5)ボイデン ·チャンバ一による遊走活性評価およびカラム'クロマトグラフィーの組み 合わせを利用して得られた骨髄由来間葉系幹細胞動員活性を持つ皮膚抽出液由 来精製標品を、 SDS-PAGE電気泳動法により分子量を基にしてゲル内分画し、銀染 色により泳動蛋白のバンドを検出した。
6) 5)の SDS-PAGE電気泳動および銀染色により単一バンドとしてゲル内分画された 皮膚抽出液由来蛋白群の中で、骨髄由来間葉系幹細胞動員活性の最も強いクロマ トグラフィー精製標品から得られた蛋白バンドをすベて切り出して、質量分析および データベース解析により当該蛋白の同定を進めた。
7)同定した蛋白群の中から骨髄由来間葉系幹細胞動員活性を持つ候補蛋白を選 定し、その候補蛋白を含む精製標品を中和抗体で処理 (精製標品溶液 100 1を当 該蛋白のポリクロナール抗体 100倍希釈条件にて氷上で 30分間インキュベート）した 後、骨髄由来間葉系幹細胞動員活性の阻害程度を、ボイデン 'チャンバ一を用いた 遊走能アツセィにて検討した。
8)得られた骨髄由来間葉系幹細胞精製標品をマトリゲルの中に約 10%ボリュームと なるように混入し、直径約 lmm、 5mm長のシリコンチューブ内に挿入し、これを GFP骨 髄移植マウス背部皮下に移植した。 2週間後に揷入チューブを取り出して、チューブ 内に遊走した骨髄由来細胞から出る GFP蛍光を蛍光測定装置により定量的に解析し た。さらに、チューブ内から遊走細胞を取り出し、 DMEM/10%ゥシ胎仔血清培地に 播種して C02インキュベーター内で培養することにより、骨髄由来間葉系幹細胞の生 体内動員活性を検討した。 2週間継続して培養した細胞は 2%パラホルムアルデヒド で 25°Cの条件下で、 10分間固定した後、 5分間ずつ 4回 PBSを用いてパラホルムアル デヒドを洗浄し、 2%スキムミルク液で処理をし、 0.5% tween20含有 2%スキムミルクで 10 00倍に希釈した抗マウスケラチン 5抗体を 4°Cの条件下で 16時間反応させた。 5分間 ずつ 4回 PBSを用いて抗体を洗浄し、 2%スキムミルクで 1000倍に希釈した Alexa546標 識抗ゥサギ IgG抗体を 25°Cの条件下で 1時間反応させた。以上の 1)〜8)の実験過程 は図 4にまとめた。
結果:切除した新生マウス皮膚から PBS中に抽出した溶液（図 5)をスタート材料として 、上述した方法により骨髄由来間葉系幹細胞動員活性を持つ蛋白質の同定と機能 解析を進めた。ボイデン ·チャンバ一による遊走活性解析により、皮膚抽出液中に極 めて強い骨髄由来間葉系幹細胞誘導活性があることが示された（図 6)。この活性を 指標にしてへパリンァフィ二ティーカラムおよび陰イオン交換カラム（Qカラム）を用い て目的因子の精製を進め、得られた各分画を SDS-PAGE電気泳動にて解析した結 果、銀染色により単一バンドとしてゲル内分画された数個の蛋白を含む精製標品内 に強い骨髄由来間葉系幹細胞動員活性があることが示された（図 7レーン 7)。得られ た銀染色バンドを切り出して、質量分析、データベース解析を進めた結果、矢印で示 す分子量約 25,000の蛋白が HMGB1であることが明らかとなった（図 7)。この精製分 画（レーン 7)中に含まれる HMGB1が目的の骨髄由来間葉系幹細胞動員活性を持 つことを明らかにする目的で、抗 HMGB1ポリクロナール抗体による遊走阻害実験を 行った。その結果、抗 HMGB1ポリクロナール抗体が当該精製標品中の骨髄由来間 葉系幹細胞遊走活性を強く阻害することが明らかとなり（図 8)、皮膚抽出液内に存在 する骨髄由来幹細胞動員因子が HMGB1であることが明らかとなった。
さらに、 HMGB1が生体内で骨髄由来間葉系幹細胞動員活性を持つことを確認す る目的で、この精製標品を入れたシリコンチューブを GFP骨髄移植マウス背部皮下に 揷入し、 2週間後にチューブ内に動員された細胞の性質を検討した（図 9)。その結果 、対照コントロール（図 7における SDS-PAGEレーン 4に用いた精製標品）に比較して 、HMGB1精製標品は GFP陽性の骨髄由来細胞をチューブ内に多数 (対照コントロー ルの約 3倍)動員して!/、た（図 10)。図 11に蛍光実体顕微鏡による強拡大像を示す。 さらに、チューブ内に動員された GFP陽性細胞を取り出し、 DMEM/10%ゥシ胎仔血 清培地内で培養した結果、培養開始直後は円形の浮遊細胞状態であつたが（図 12 )、 24時間後には GFP陽性骨髄由来細胞は培養シャーレに付着し、紡錘系の線維芽 細胞様形態、さらには類円形の上皮細胞様形態の細胞として増殖することが確認さ れた（図 13)。さらにこれらの細胞を 2週間継続して培養すると GFP陽性骨髄由来細 胞の中に毛包の形態を呈する細胞を確認した。 （図 14A;明視野、弱拡大、図 14B ; GF P蛍光、弱拡大、図 14C明視野、強拡大、図 14D ; GFP蛍光、強拡大）また、上皮ケラ チノサイトのマーカーであるケラチン 5に対する免疫組織化学を行ったところ、 GFP陽 性骨髄由来細胞の中にケラチン 5陽性細胞を確認した。 （図 14E;明視野、図 14F;ケラ チン 5陽性細胞の蛍光）
[0058] 考察:今回本発明者らは、世界で初めて、遊離皮膚片が HMGB1を産生すること、 産生された HMGB1は骨髄由来間葉系幹細胞を皮膚片内に大量に動員する活性を 持つこと、皮膚片内に動員された骨髄由来間葉系幹細胞は皮膚組織内で線維芽細 胞、脂肪細胞、平滑筋細胞などの間葉系細胞に分化し、さらには表皮細胞毛包を形 成する細胞に分化することにより、移植皮膚組織の機能的再生を誘導していることを 見出した。この HMGB 1による骨髄由来間葉系幹細胞動員およびその結果としての 機能的組織再生は、移植皮膚再生のみならず、疎血'壊死を伴う多くの臓器'組織 損傷時に機能的組織再生誘導機序として機能して!/、ること力 S容易に予想される。 HM GB1製剤による医薬品を開発することにより、損傷組織再生時に骨髄由来間葉系幹 細胞を局所に動員することが可能になれば、線維性瘢痕治癒により機能不全に陥る ことの無い、必要な機能的器官の伴う機能的組織再生誘導医療が可能になると確信 する。
[0059] 〔実施例 3〕
目的:皮膚抽出液中 HMGB1ファミリーの同定と骨髄間葉系幹細胞誘導活性の検討 方法：新生マウス皮膚抽出液中に含まれる HMGB蛋白ファミリ一の有無を Western bl ot法を用いて確認した。サンプルとして〔実施例 2〕で得られた皮膚抽出液を 10 を SDS-PAGE法を用いて電気泳動し、ゲル中で分離した蛋白をブロッテイング装置 (AT TO)を用い PVDF膜にトランスファーした。 3%スキムミルク 0.1% Tween 20含 PBS (S_T -PBS)にて、室温で 1時間インキュベートした後、 S-T-PBSで 1000倍に希釈したラビッ ト抗マウス HMGB1抗体、ラビット抗マウス HMGB2抗体、ラビット抗マウス HMGB3抗体 をそれぞれ 4°Cで 16時間反応させた。反応後、同 PVDF膜を S-T-PBSにて 5分間 5回 洗浄後、 S-T-PBSで 2000倍希釈したペルォキシダーゼ標識ャギ抗ラビット IgG抗体（ GE Healthcare)にて同 PVDF膜を 25°Cで 1時間インキュベートした。さらに S-T-PBSに て 5分間 5回洗浄後 ECL Western Blotting Detection System (GE Healthcare)を同 P VDF膜と反応させ、 ECL filmを感光させた後現像して HMGB1、 HMGB2、 HMGB3タ ンパクの存在を検出した。
[0060] 新生マウス皮膚から Trizol (invitrogen)を用いて RNAを抽出し更に Superscript III c DNA synthesis kit (Invitrogen)を用いて cDNAを合成した。この cDNAをテンプレー トとして HMGB1、 HMGB2、及び HMGB3の cDNAを PCR (ポリメラーゼ連鎖反応）法を 用いて増幅し、アミノ酸配列の N末端に Flag tagの配列（Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp -Lys ;配列番号： 18)を付加したタンパクを発現するように、哺乳類細胞でタンパクを 発現させるプラスミドベクター pCAGGSに揷入した。これらのプラスミドベクターを HEK 293 (ヒト胎児腎細胞由来培養細胞株）に遺伝子導入し 48時間培養しタンパクを発現 させた。 HMGB1、 HMGB2、及び HMGB3タンパクをそれぞれ発現させた細胞及び培 養上清は 4°Cで 16時間インキュベートした後、 4400g' 5分間遠心し上清を回収した。こ の上清 50mLあたり 100 Lの Anti Flag抗体 Gel (Sigma)を混合し 4°Cで 16時間インキ ュペートした。 遠心し Gelを回収した後 PBSを用いて、 5回洗浄した。更に 3X Flag pep tide (final lOO ^ g/ml) を用いて溶出した。リコンビナントタンパクの発現を S-T-PBS で 1000倍希釈したマウス抗 Flag抗体、及び S-T-PBSで 2000倍希釈したペルォキシ ダーゼ標識抗マウス IgG抗体（GE Healthcare)を用いた Western blot法にて確認し た。これらの精製リコンビナントタンパクのマウス骨髄間葉系幹細胞の遊走活性を〔実 施例 2〕と同様にボイデン 'チャンバ一を用いて評価した。また、 HMGBファミリーの in v ivoでの薬効を観察するために、 8週齢 C57BL/6マウスの背部皮膚を直径 8 mの円 形に切除し皮膚潰瘍モデルを作製し、そこに精製した^^〇81 \〇82 \〇83そ れぞれ（100 ng)を、 lg/100mL PBSの濃度のヒアルロン酸溶液と等量ずつ混合しその うち 100 Lを潰瘍面に投与した。潰瘍面は乾燥しないように、粘着性透明創傷被覆 •保護材 Tegaderm (スリーェムヘルスケア)で覆い、経時的に創傷面積を計測し治癒 効果を測定した。
[0061] さらにヒト骨髄間葉系幹細胞をヒト皮膚抽出液およびヒト精製 HMGB1が遊走する活 性があるかを調べるために、〔実施例 2〕と同様にボイデンチヤンバーを用いて評価し た。面積 lcm2のヒト皮膚を lmlの PBSに浸し、 4°Cの条件下で 16時間インキュベーショ ンした後、 4°Cの条件下で 10分間 440Gで遠心した。上清のみを回収し、ヒト皮膚抽出 液として使用した。また、ボイデンチヤンバーの上部に入れる細胞はヒト骨髄間葉系 幹細胞（C匪 brex社）を用いた。 （本細胞はフローサイトメトリーによる細胞表面抗原の 分析の結果、 CD105陽性、 CD166陽性、 CD29陽性、 CD44陽性、 CD34陰性、 CD45 陰性とされている。さらに分化誘導試験によって脂肪細胞、軟骨細胞、骨細胞への 分化が陽性である。）また、チャンバ一下部には、ヒト HMGB1を lOOng /well (R &D社） 及び PBSにて 10倍希釈したヒト皮膚抽出液を入れ、コントロールとして PBSを用いた。
[0062] 結果： Western blotの結果、 HMGB1のバンドの他に HMGB2や HMGB3のバンドが検 出された。よって新生マウス皮膚抽出液の中には、 HMGB1の他にファミリータンパク である HMGB2および HMGB3が含有されて!/、ること力 S確認された（図 15)。それぞれ のタンパクの N末端に Flag tagを付加した HMGB1 'HMGB2 'HMGB3の発現ベクター を作製した（図 16)。 HEK293細胞に発現ベクターを遺伝子導入し、発現したタンパク を Flag tagを用いて精製した後、 Western blot法を用いてタンパクを確認した（図 17 )。これらの精製タンパクを用いたマウス骨髄間葉系幹細胞の遊走活性を測定したと ころ、いずれのタンパクにおいても活性が確認された（図 18)。マウスの背部に作製し た潰瘍面積を 7日毎に計測したところ、非治療群に比べ HMGB1, 2および 3による治療 群の方が有意に潰瘍面積の縮小効果を確認できた（図 19)。マウスの場合と同様に 、ヒト HMGB1及びヒト皮膚抽出液はヒト骨髄間葉系幹細胞を遊走する活性があること が明ら力、となった（図 20)。
[0063] 考察： HMGB1と相同性が高いタンパクとして HMGB2及び HMGB3が知られている。
これらのタンパクも HMGB1と同様の性質を有することが期待される。そこで、遊離皮 膚片抽出液から HMGB1のファミリーである HMGB2および HMGB3も産生されることを 確認した。さらに HMGB1 'HMGB2 'HMGB3のリコンビナントタンパクを作製し、 in vitr oでの骨髄間葉系幹細胞遊走活性を確認し、 in vivoにおける皮膚潰瘍治療効果も 確認した。新生マウス遊離皮膚片中の HMGBファミリ一（HMGB 1 · HMGB2 · HMGB3) およびリコンビナント HMGBファミリーには骨髄間葉系幹細胞誘導活性や骨髄由来の 上皮系に分化可能な幹細胞を局所に誘導する活性があり、さらにこれらの誘導され た骨髄由来の細胞群が損傷組織において表皮ケラチノサイトや毛包や線維芽細胞 のようなさまざまな細胞に分化して損傷組織の治癒を促進する効果があることが明ら 力、になった。また骨髄間葉系幹細胞は多能性幹細胞であるので、他の組織損傷状 態、例えば、脳損傷、心筋梗塞、骨折などの組織損傷の治療に HMGBファミリーを全 身投与もしくは局所投与することで同様に治療効果が期待できると確信する。
[0064] また、ヒトとマウスの HMGB1はそれぞれを構成するアミノ酸配列で 98% (213/215)の 相同性があり、 HMGB2はそれぞれを構成するアミノ酸配列で 96%(202/210)の相同性 があり、 HMGB3はそれぞれを構成するアミノ酸配列で 97%(195/200)の相同性がある ことがわかっている。そこで、ヒトの HMGBがマウスの HMGBと同様の活性を有すること が考えられるが、本実施例の結果から、ヒトの皮膚抽出液や HMGB1がマウスの皮膚 抽出液や、 HMGB1と同様に骨髄間葉系幹細胞を誘導する活性があることが明らか になった。
[0065] 〔実施例 4〕
目的:骨髄間葉系幹細胞誘導因子組織抽出液の作製方法の確立
方法 : 6週齢 C57BL6—匹分の脳、心臓、腸、腎臓、肝臓及び新生マウス皮膚一匹分 を生理的リン酸緩衝液 pH7.4 (PBS) 1ml内に浸し、 4°Cで 24時間インキュベーションし た後、組織を取り除くために、 4°Cの条件下で 10分間、 440Gで遠心し上清を回収して 組織抽出液とした。得られた抽出液の中に骨髄間葉系幹細胞誘導活性が存在する ことを確認するため、ボイデン 'チャンバ一を用い、〔実施例 2〕と同様に骨髄由来間葉 系幹細胞に対する遊走活性を検討した。また、同じサンプル中に含まれる HMGB1の 濃度を HMGB1 ELISA kit (シノテスト)を用いて計測した。更に脳、心臓および皮膚の 組織抽出液を〔実施例 2〕と同様に、へノ リンァフィ二ティーカラムに結合させ、結合画 分のタンパクの骨髄間葉系幹細胞誘導活性をボイデンチヤンバーを用いて確認した
〇
[0066] 結果：マウス脳抽出液には新生マウス皮膚抽出液と同等の HMGB 1が含有されてレ、 た。さらに、骨髄間葉系幹細胞の誘導活性はマウス脳でも皮膚と同様に認められた。 マウス腸抽出液とマウス心臓抽出液中に HMGB1はほとんど含まれなかった力 骨髄 間葉系幹細胞の誘導活性は認められた。また、マウス脳、マウス心臓のへノ リンカラ ム結合画分はマウス皮膚のへノ リンカラム結合画分と同様に骨髄間葉系幹細胞を誘 導する活性があった（図 21)。表 1は、マウス各組織抽出液の HMGB1濃度と骨髄間 葉系幹細胞の誘導活性を測定した結果を示す。
[表 1]
Figure imgf000043_0001
ND:施行せず
[0068] 考察：皮膚のみならず脳でも臓器を生理的緩衝液に浸すだけと!/、う簡便な方法で H MGB1を簡便に抽出する方法を開発した。この方法は、他の臓器例えば、肝臓ゃ腎 臓でも同様である。また心臓や腸からの抽出液には HMGB1をほとんど含有しないに もかかわらず骨髄間葉系幹細胞誘導活性を認めた。このことは抽出液中に HMGB1と 異なる、他の骨髄間葉系幹細胞誘導物質が含まれていることが考えられる。これらの 抽出液に含まれる物質は、もともとそれぞれの組織に存在するものであり、生理的に は組織損傷時に骨髄間葉系幹細胞を損傷組織に誘導していると考えられる。本発明 によって HMGB1を含む複数の骨髄間葉系幹細胞誘導物質を各種臓器力 機能的 にかつ簡便に抽出する新規の方法を開発できた。さらに、組織抽出液から骨髄間葉 系幹細胞誘導物質を精製するためにへノ リンカラムに結合させる方法を開発した。ま た、これらの骨髄間葉系幹細胞誘導活性を有する成分は皮膚と同様の方法で脳や 心臓からもへパリンカラムを用いて精製することが可能である。
[0069] 〔実施例 5〕 目的:培養細胞から間葉系幹細胞遊走活性物質を抽出する方法を確立する。
方法：ヒト胎児腎由来培養細胞株 HEK293及びヒト子宮頸癌細胞株 HeLaはそれぞれ 10%胎仔牛血清含 D-MEM(nacalai社製）で培養した。それぞれの細胞を PBSで洗 浄後、細胞 107個を 4°Cの 5mlの PBS(nacalai社製)に 16時間浸した。重力加速度 440 Gで 4°Cで 5分間遠心し上清を回収した。ボイデンチヤンバーの上層にヒト骨髄間葉 系幹細胞をいれ、下層に DMEMで 5倍希釈した細胞抽出液をいれ、ヒト骨髄間葉系 幹細胞遊走活性を確認した。
結果： HEK293抽出液も HeLa抽出液も同様に骨髄間葉系幹細胞を遊走する活性を 示した（図 22)。
考察:培養細胞を PBSに浸すという簡便な方法で骨髄間葉系幹細胞を遊走する活性 物質を抽出することに成功した。
[0070] 〔実施例 6〕
目的：マウス脳欠損モデルを作成し、局所損傷部位に皮膚抽出液へパリンカラム精 製画分を徐放化して投与することで、自己の骨髄系に含まれる幹細胞を局所損傷部 位に遊走させ、神経系細胞の再生を誘導できな!/、か検討する。
方法：
(1)皮膚抽出液へノ リンカラム精製画分の作製
切除した新生マウス皮膚から PBS (—匹/ ml)中に 4°Cで 16時間インキュベーションし 抽出した皮膚抽出液を 4°Cの 9倍容 20 mMリン酸バッファー pH 7.5を用い 10倍に希 釈した。あらかじめ、 20 mMリン酸バッファー pH 7.5 (30011)を 1¾ Hepalin HP col umn (カラム容量： 5ml、 GE Healthcare)の中に流しカラムを平衡化した。さらに、希釈 液をカラムに結合させた。その後 20 mMリン酸バッファー pH 7.5, lOOmM NaCl (30ml )でカラムを洗浄した。吸着したタンパクを溶出するため 20 mMリン酸バッファー pH 7 .5， lOOOmM NaClをカラム内に流入し、溶出液をチューブに分画した。吸着画分をそ れぞれ、マウス骨髄由来細胞株の遊走活性を実施例 2で示したボイデンチヤンバー 法を用いて評価し遊走能を有する画分を集めた。この活性を有する溶液を皮膚抽出 液へパリン精製画分として以下の実施例に使用した。
[0071] (2)骨髄抑制マウスの作成 マウスに 10Gyの X線単回照射を行!/、、骨髄抑制マウスを作成した。
[0072] (3)骨髄抑制マウスへの GFPマウス骨髄移植
GFPマウスの両側大腿骨および下腿骨より骨髄細胞を採取した。これを照射後 24時 間経過した骨髄抑制マウスの尾静脈より投与した。なお、投与はイソフルランによる 吸入麻酔下に施行した。
[0073] (4)マウス脳損傷 (脳組織欠損)モデルの作成
GFPマウスの骨髄細胞を移植した骨髄抑制マウスにイソフルランにて吸入麻酔を行 い、ペントバルビタール (45mg/kg)を腹腔内に注入した。マウスを脳定位固定装置に 固定し、メスにて頭部に正中切開を加えた。ブレダマから右外側 2.5mm、前方 lmmに ドリルを用いて穿頭を施した (図 23A)。この部位から深さ 3mmの位置を先端にして、 2 0Gサーフロー針の外筒を揷入して固定した。ここでシリンジを用いて、陰圧をかけ、 脳組織を一部吸引した（図 23B)。
[0074] (5)皮膚抽出液へパリンカラム精製画分の脳組織欠損部への投与
前述の位置に、ハミルトンシリンジと 26Gシリンジを用いて、フイブリン糊製剤（フイブリ ノゲン）（ボルヒール (化血研)）に溶解した皮膚抽出液へノ リンカラム精製画分を 5 1 注入し、次にフイブリン糊製剤（トロンビン）（ボルヒール (化血研)）を 5 1注入した (図 23C)。この操作によって、皮膚抽出液へパリンカラム精製画分の徐放剤としての効 果を狙った。
[0075] (6)脳組織欠損部における神経系細胞再生効果の評価
コントロール群と治療群のマウスとを用いて評価した。適切な経過設定を決め（経時 的に）、マウスを 4%パラホルムアルデヒドにて灌流固定後、脳の切り出しを行った。さら に、 4%パラホルムアルデヒドを外固定した。 15%と 30%の勾配をつけたショ糖にて脱 水後、凍結切片を作成した。
DAPI(4 ,6-Diamidino-2-phenyiindole, dihydrochiorideノ solusionにて核染色を行レヽ、 退光防止剤を用いて封入した。共焦点レーザー顕微鏡にて損傷部位 (脳組織欠損 部）での GFP陽性細胞の集積を評価した。
結果:投与後、 2週間および 6週間後の GFP陽性細胞集積を定性的に示す。 2週間後 (コントロール；図 23D,皮膚抽出液へパリンカラム精製画分；図 23E)および 6週間後 (コントロール；図 23F皮膚抽出液へパリンカラム精製画分；図 23G)ともに、コント口 ール群に比して治療群の損傷部位に GFP陽性細胞の集積が高い傾向にあった。 考察:皮膚抽出液へパリンカラム精製画分投与により、骨髄由来細胞が脳組織欠損 部位に集積し神経細胞の形態を示した。骨髄由来間葉系幹細胞は神経細胞にも分 化することが知れており、本結果から、皮膚抽出液へパリンカラム精製画分によって 脳損傷部位における神経系細胞再生の誘導できることが明らかになった。また、これ は、脳虚血性疾患や脳挫傷における脳組織障害部位での神経再生にも応用可能で ある。
産業上の利用可能性
本発明によって、骨髄由来細胞 (例えば骨髄由来間葉系幹細胞。以下同様。）誘 導活性を有する細胞抽出液、骨髄由来細胞誘導活性を有するへパリン結合画分、 および、骨髄由来細胞誘導活性を有する陰イオン交換体結合画分が提供された。ま た、細胞抽出液、へパリン結合画分、陰イオン交換体結合画分、 HMGB1、 HMGB2、 または HMGB3を含有する骨髄由来細胞誘導剤や組織再生促進剤が提供された。細 胞抽出液、へパリン結合画分、陰イオン交換体結合画分、 HMGB1、 HMGB2、または HMGB3を骨髄由来細胞動員医薬として開発することにより、難治性損傷組織の機能 的再生を促進する新たな再生医療が可能になる。 HMGB1、 HMGB2、 HMGB3は、血 流低下により低酸素状態に陥り、壊死方向にある組織細胞から放出され、その局所 に骨髄由来細胞、あるいはそれを由来とする種々の細胞を動員する作用を持つ。動 員された骨髄由来細胞は、それぞれの組織で必要とされる細胞系譜に分化すること により、疎血 ·壊死により喪失した機能の回復、いわゆる機能的組織再生を促進する 。例えば、皮膚の血流障害によって生じた難治性皮膚潰瘍部に、細胞抽出液、へパ リン結合画分、陰イオン交換体結合画分、 HMGB1、 HMGB2、または HMGB3を投与 することにより、潰瘍面に骨髄由来細胞を動員し、動員された細胞が血管内皮細胞 に分化すれば局所の血流が改善される。同時に線維芽細胞、神経細胞、毛包細胞 、さらには表皮細胞に分化することにより、線維性瘢痕治癒ではなぐ必要な皮膚附 属器官を備えた機能的皮膚再生が誘導、促進される。心筋梗塞や脳梗塞などのそ の他臓器の疎血性壊死状態でも、その機能的組織再生誘導剤として細胞抽出液、 へパリン結合画分、陰イオン交換体結合画分、 HMGB1、 HMGB2、 HMGB3が同様に 有効であると期待できる。

Claims

請求の範囲
[1] 以下の（a)から（i)のいずれかに記載の成分を含有する、骨髄由来細胞の誘導剤;
(a) HMGBlタンパク質
(b) HMGB1タンパク質を分泌する細胞
(c) HMGBlタンパク質をコードする DNAが揷入されたベクター
(d) HMGB2タンパク質
(e) HMGB2タンパク質を分泌する細胞
(f) HMGB2タンパク質をコードする DNAが揷入されたベクター
(g) HMGB3タンパク質
(h) HMGB3タンパク質を分泌する細胞
(i) HMGB3タンパク質をコードする DNAが揷入されたベクター。
[2] 骨髄由来細胞が骨髄由来間葉系幹細胞である、請求項 1に記載の誘導剤。
[3] 以下の（a)から（i)の!/、ずれかに記載の成分を含有する、組織再生促進剤；
(a) HMGBlタンパク質
(b) HMGB1タンパク質を分泌する細胞
(c) HMGBlタンパク質をコードする DNAが揷入されたベクター
(d) HMGB2タンパク質
(e) HMGB2タンパク質を分泌する細胞
(f) HMGB2タンパク質をコードする DNAが揷入されたベクター
(g) HMGB3タンパク質
(h) HMGB3タンパク質を分泌する細胞
(i) HMGB3タンパク質をコードする DNAが揷入されたベクター。
[4] 以下の ωから ωの!、ずれかに記載の成分を含有する、組織再生促進用キット；
(a) HMGBlタンパク質
(b) HMGB1タンパク質を分泌する細胞
(c) HMGBlタンパク質をコードする DNAが揷入されたベクター
(d) HMGB2タンパク質
(e) HMGB2タンパク質を分泌する細胞 (f) HMGB2タンパク質をコードする DNAが揷入されたベクター
(g) HMGB3タンパク質
(h) HMGB3タンパク質を分泌する細胞
(i) HMGB3タンパク質をコードする DNAが揷入されたベクター。
[5] 細胞を溶媒に浸す工程を含む方法で製造される細胞の抽出液であって、骨髄由来 細胞誘導活性を有する抽出液。
[6] 細胞を溶媒に浸す工程を含む骨髄由来細胞誘導活性を有する細胞の抽出液の製 造方法。
[7] 以下の工程を含む方法で製造されるへパリン結合画分であって、骨髄由来細胞誘 導活性を有する画分；
(a)細胞を溶媒に浸す工程、
(b)工程 ωで得られる抽出液を固定化へパリンに接触させる工程、および
(c)固定化へノ リンからへノ リン結合画分を溶出する工程。
[8] 以下の工程を含む骨髄由来細胞誘導活性を有するへパリン結合画分の製造方法；
(a)細胞を溶媒に浸す工程、
(b)工程 (a)で得られる抽出液を固定化へパリンに接触させる工程、および
(c)固定化へノ リンからへノ リン結合画分を溶出する工程。
[9] 請求項 5に記載の抽出液もしくは請求項 6に記載の方法によって製造された抽出液
、または請求項 7に記載の画分もしくは請求項 8に記載の方法によって製造された画 分を含有する、骨髄由来細胞の誘導剤。
[10] 骨髄由来細胞が骨髄由来間葉系幹細胞である、請求項 9に記載の誘導剤。
[11] 請求項 5に記載の抽出液もしくは請求項 6に記載の方法によって製造された抽出液
、または請求項 7に記載の画分もしくは請求項 8に記載の方法によって製造された画 分を含有する、組織再生促進剤。
[12] 請求項 5に記載の抽出液もしくは請求項 6に記載の方法によって製造された抽出液
、または請求項 7に記載の画分もしくは請求項 8に記載の方法によって製造された画 分を含有する、組織再生促進用キット。
[13] 以下の工程を含む、細胞の抽出液に被験細胞を誘導する因子が含まれるか否かを 評価する方法であって、工程 (b)における被験細胞の誘導活性力 S、対照と比較して 高い場合に、細胞の抽出液に被験細胞を誘導する因子が含まれると判定される方法
(a)細胞の抽出液を調製する工程、および
(b)工程 ωで調製された抽出液による被験細胞の誘導活性を測定する工程。
[14] 以下の工程を含む、被験細胞を誘導する因子が含まれる細胞の抽出液をスクリー二 ングする方法；
(a)複数の抽出液について、請求項 13に記載の方法で、該抽出液に被験細胞を誘 導する因子が含まれるか否かを評価する工程、および
(b)工程 (a)で被験細胞を誘導する因子が含まれると評価された抽出液を選択する 工程
[15] 請求項 13または 14に記載の方法によって、被験細胞を誘導する因子を含むと判定 された抽出液から、被験細胞の誘導活性を指標に、被験細胞を誘導する因子を精製 する工程を含む、被験細胞を誘導する因子の同定方法。
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