WO2019017355A1 - 間葉系幹細胞誘引剤 - Google Patents

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Definitions

  • the present invention relates to an attractant for mesenchymal stem cells comprising at least one selected from the group consisting of iris extract, olive leaf extract, and chamomile extract, and an agent for suppressing aging factor production comprising the attractant, And agent for promoting regeneration of dermis.
  • Regenerative medicine In the area of regenerative medicine aiming to regenerate tissue anew, various stem cells are being used to restore the function of the lost tissue. Regenerative medicine is applied not only to the medical field but also to the cosmetic field such as hair regeneration and skin regeneration.
  • Stem cells are defined as cells having self-replication ability and differentiation ability to differentiate into other types of cells.
  • Stem cells include pluripotent stem cells capable of differentiating into cell lines of all lineages forming one individual such as embryonic stem cells (ES cells) and induced pluripotent stem cells (iPS cells), It is known that there are somatic stem cells having pluripotency capable of differentiating into multiple lineages, although they are not pluripotent, in each tissue in an adult living body.
  • ES cells embryonic stem cells
  • iPS cells induced pluripotent stem cells
  • Embryonic stem cells can be obtained only from embryos in the early development stage, and risk to the mother at the time of collection and ethical problems are added, so it is difficult to easily use them in research and clinical fields, and beauty field Its use is difficult. Although there are few ethical problems with induced pluripotent stem cells, there is a risk of canceration due to gene transfer. Therefore, in the cosmetic field, research is being conducted on the use of somatic stem cells rather than the use of embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells, but the frequency of occurrence is so low that isolation is difficult, and self-renewal ability and It is also difficult to culture in large amounts while maintaining differentiation ability.
  • Somatic stem cells are known to contribute to tissue repair at the time of tissue damage, maintenance of tissue homeostasis and aging. Somatic stem cells are known to be present in various tissues, and as stem cells present in skin tissue, epidermal stem cells present in the epidermal layer, mesenchymal stem cells present in the dermal layer and subcutaneous fat layer, etc. It has been known.
  • Mesenchymal stem cells are known to be attracted to the trauma site when the skin is traumatized. Mesenchymal stem cells attracted to the trauma site are thought to activate surrounding skin cells to promote cell proliferation and to differentiate themselves into skin cells to block the trauma and contribute to healing. It has been shown that certain flavonoids have the attraction of mesenchymal stem cells (Non-patent Document 2: PLOS ONE DOI: 10. 137 / journal. Pone. 0144166). Mesenchymal stem cells involved in the healing of skin damage include, in addition to bone marrow-derived mesenchymal stem cells delivered via blood vessels, adipose stem cells present in subcutaneous tissue, and organs such as sebaceous glands, sweat glands, and hair follicles.
  • mesenchymal stem cells that were present around or in the vicinity of blood vessels.
  • mesenchymal stem cells bone marrow-derived stem cells have been mainly targeted for research in the past, but when adipose stem cells are isolated from adipose tissue, they are easily obtained and differentiated into various cell lineages. Because it has pluripotency, it is expected to be applied to various regenerative treatments (Non-patent Document 3: World J Stem Cells 2014 January 26; 6 (1): 65-68).
  • Dermal mesenchymal stem cells exist near blood vessels, but there are many unknown points in their differentiation ability and properties, and their future applications are expected to be studied.
  • An object of the present invention is to develop a drug having an action of attracting stem cells.
  • the present inventors screened a cosmetic material capable of attracting mesenchymal stem cells in developing a cosmetic for improving the skin aging phenomenon, and the iris extract, olive leaf extract and chamomile extract Have found that they each induce mesenchymal stem cells, and have led to the present invention. Therefore, the present invention relates to the following.
  • a mesenchymal stem cell attractant comprising at least one member selected from the group consisting of iris extract, olive leaf extract, and chamomile extract.
  • An agent for suppressing aging factor production comprising the inducer according to item 1.
  • An aging improver comprising the inducer according to item 1 or the agent for suppressing aging factor production according to item 2.
  • a dermal regeneration enhancer comprising the attractant according to item 1.
  • the extract according to item 5, wherein the disease is an articular cartilage disease such as osteoarthritis, heart disease, muscular dystrophy, dermal wound or injury.
  • a cosmetic method or non-treatment through the administration of at least one member selected from the group consisting of iris extract, olive leaf extract, and chamomile extract, and by attracting mesenchymal stem cells present in the dermis. Method.
  • [15] Ameliorates the appearance of wrinkles, sags and the like through induction of mesenchymal stem cells of at least one extract selected from the group consisting of iris extract, olive leaf extract and chamomile extract Because of non-therapeutic use.
  • a method for suppressing aging comprising administering at least one member selected from the group consisting of iris extract, olive leaf extract, and chamomile extract, in a subject in need of attracting mesenchymal stem cells.
  • a method for promoting dermal regeneration comprising administering at least one member selected from the group consisting of iris extract, olive leaf extract, and chamomile extract, in a subject in need of dermal regeneration.
  • At least one member selected from the group consisting of iris extract, olive leaf extract, and chamomile extract for the preparation of a preparation for treatment or suppression of senescence induced by attraction of mesenchymal stem cells present in the dermis.
  • the use of extracts [19] Use of at least one extract selected from the group consisting of iris extract, olive leaf extract, and chamomile extract for the preparation of a dermal regenerating agent by attracting mesenchymal stem cells present in the dermal layer .
  • the mesenchymal stem cell attractant of the present invention has an action of attracting mesenchymal stem cells.
  • Mesenchymal stem cells can activate dermal fibroblasts through the action of at least one of differentiation into dermal fibroblasts, production of cytokines, and suppression of senescent factors, thereby allowing senescence to occur. It is possible to suppress or improve and regenerate the dermis.
  • FIG. 1 (A) shows a schematic diagram of the Transwell system, in which the normal (young) fibroblasts are cultured in the upper layer, and the senescent fibroblasts are cultured in the lower layer.
  • 1 (B) to (D) show (B) collagen 1A1 (COL1A1), (B) in the case where cells are not cultured in the lower layer (Blank) and when senescent fibroblasts are cultured in the lower layer (+ Senescent)
  • FIG. 1 (A) shows a schematic diagram of the Transwell system, in which the normal (young) fibroblasts are cultured in the upper layer, and the senescent fibroblasts are cultured in the lower layer.
  • 1 (B) to (D) show (B) collagen 1A1 (COL1A1), (B) in the case where cells are
  • FIG. 2 is a graph showing changes in MMP1 gene expression in fibroblasts in the upper layer when gene expression of CFD is suppressed in senescent fibroblasts in the lower layer of the Transwell system (B).
  • FIG. 3 is a graph showing a comparison of gene expression levels of senescent factors (A) IGFBP7, (B) RSPO4 and (C) CFD between senescent fibroblasts and normal (young) fibroblasts.
  • FIG. 4 is a graph showing that (A) MMP1 gene was increased in a dose-dependent manner and (B) collagen 1 gene was decreased in expression when IGFBP7 and RSPO4 were added.
  • FIG. 3 is a graph showing a comparison of gene expression levels of senescent factors (A) IGFBP7, (B) RSPO4 and (C) CFD between senescent fibroblasts and normal (young) fibroblasts.
  • FIG. 4 is a graph showing that (A) MMP1 gene was increased
  • FIG. 5 is a photograph (A) and a graph (B) showing that in the co-culture system of fibroblasts and mesenchymal stem cells, the presence of mesenchymal stem cells increases the thickness of the fibroblast layer. is there.
  • FIG. 6 is photographs (A) and graphs (B) showing that in the co-culture system of collagen gel and mesenchymal stem cells, the presence of mesenchymal stem cells reduces the size of collagen gel.
  • FIG. 7 is a graph showing that in the co-culture system of senescent fibroblasts and mesenchymal stem cells, the presence of mesenchymal stem cells reduces the expression of IGFBP7, which is a senescent factor.
  • FIG. 8 is a graph showing that (A) iris extract, (B) olive leaf extract, and (C) chamomile extract each have a mesenchymal stem cell attraction.
  • the present invention relates to a mesenchymal stem cell attractant comprising at least one selected from the group consisting of iris extract, olive leaf extract, and chamomile extract.
  • the mesenchymal stem cell attractant refers to an agent capable of attracting mesenchymal stem cells.
  • the iris extract refers to an extract of a perennial plant of the family Iridaceae, which is native to the Mediterranean coast. More preferably, it refers to an extract from the family Irids of the family Irid, Scutellaria spp., Iris germanica, Iris germanica, Iris germanica Var.
  • the site to be extracted includes whole grass, leaves, flowers, and roots, but particularly when roots are used as a raw material, extracts of roots are preferable because aromatic extracts are obtained.
  • the extraction method can use arbitrary methods, an extract can be obtained by performing steam distillation and solvent extraction about the dried root as an example. Although any extraction solvent can be used as the solvent, an extract obtained by extraction with an aqueous ethanol solution or 50% (v / v) butylene glycol can also be used.
  • Olive leaf extract is an extract derived from the leaves of olive (Olea europaea), which is a plant of the family Moxaceae native to the Mediterranean coast from Punjab, India, or its related species, and has an antioxidative action and promotion of collagen production An action, an anti-inflammatory action and an anti-allergic action are expected. It is preferable to extract an olive leaf extract as a raw material, and the extraction method can perform arbitrary methods, for example, steam distillation and solvent extraction. Although any extraction solvent can be used as the solvent, an extract obtained by extraction with 50% (v / v) butylene glycol can also be used.
  • the chamomile extract is an extract of chamomile (Matricaria chamomilla), which is an annual herb of the asteraceae family widely distributed from Europe to West Asia, or a related species thereof.
  • the chamomile extract is preferably extracted with chamomile flowers as a raw material, and the extraction method may be any method such as steam distillation or solvent extraction.
  • any extraction solvent can be used as the solvent, an extract obtained by extraction with a 50% (v / v) aqueous solution of ethanol or an aqueous solution of butylene glycol can also be used.
  • these extracts are cosmetic materials, they are preferably added to cosmetics.
  • a mesenchymal stem cell attractant one of the above-mentioned extracts can be used alone, or two or more can be mixed and used.
  • the mesenchymal stem cell attractant may be used in combination with an existing mesenchymal stem cell attractant such as SDF1 ⁇ (CXCL20).
  • SDF1 ⁇ CXCL20
  • a composition containing iris extract, olive leaf extract and / or chamomile extract can also be used as a mesenchymal stem cell attractant.
  • extraction solvents used to obtain plant extracts include water or aliphatic monohydric alcohols such as methanol, ethanol and propanol; aliphatic polyhydric alcohols such as glycerin, propylene glycol and 1,3-butylene glycol; acetone Ketones; esters such as diethyl ether, dioxane, acetonitrile, acetic acid ethyl ester; aromatics such as xylene, benzene, toluene; and organic solvents such as halogenated alkyls such as chloroform. These extraction solvents may be used singly or in combination of two or more.
  • the mixing ratio of the extraction solvent to be mixed is not particularly limited, and can be appropriately adjusted.
  • the extraction solvent is preferably a water-containing extraction solvent containing at least water.
  • the method of extraction for obtaining a plant extract is not particularly limited, and a conventional known general extraction method can be adopted.
  • the extraction site part of each plant can be used as it is as an extraction raw material, or it can be dried.
  • purification treatments such as filtration, deodorization, decolorization and the like can be appropriately performed.
  • the adipose stem cell attractant or skin sagging or aging improver is used by being added to the final product.
  • the concentration of each of the above extracts contained in the final product is not particularly limited.
  • the extract is typically extracted to about 0.001 to It is blended in the range of 10% by mass, preferably in the range of 0.001 to 1% by mass, and most preferably in the range of 0.01 to 0.5% by mass.
  • mesenchymal stem cells refer to stem cells derived from any tissue generally classified as mesenchymal. Tissues classified as mesenchymal include bone marrow, placenta, adipose tissue, dermis, etc.
  • stem cells derived from these tissues include bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hereinafter simply referred to as bone marrow stem cells), placenta Derived mesenchymal stem cells, adipose tissue derived mesenchymal stem cells (hereinafter referred to simply as adipose stem cells), dental pulp derived mesenchymal stem cells, umbilical cord blood derived mesenchymal stem cells, dermis derived mesenchymal stem cells (hereinafter referred to simply as dermal stem cells) And some of the dermal papilla cells are also considered to be mesenchymal stem cells.
  • the inducer of mesenchymal stem cells of the present invention may have an attractant action on mesenchymal stem cells derived from any tissue.
  • mesenchymal stem cells derived from any tissue in view of application in the cosmetic field and skin regeneration field, from the viewpoint of exerting an attracting action by transdermal administration, it is particularly preferable to have an attracting action on dermal stem cells, adipose stem cells and dermal papilla cells.
  • Bone marrow-derived mesenchymal stem cells are stem cells present in bone marrow. Bone marrow stem cells have the ability to differentiate into various tissues such as cardiac muscle cells, skeletal muscle cells, vascular endothelial cells, chondrocytes, osteocytes and adipocytes. Bone marrow-derived mesenchymal stem cells are characterized as CD105, CD73, CD90 as positive markers, but are not intended to be limited to cells expressing these markers. Bone marrow mesenchymal stem cells are released into the blood in response to a signal such as tissue damage and are thought to perform a healing function at the wound site.
  • a signal such as tissue damage
  • Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells can be simply referred to as adipose stem cells, and is a type of mesenchymal stem cells present in adipose tissue.
  • Adipose stem cells are known to have migration ability (Non-patent Document 3 and Patent Document 2), and are considered to be able to move through adipose tissue.
  • the adipose stem cells are characterized by the expression of CD90 marker, CD105 marker and the like, but are not intended to be limited to cells expressing these markers.
  • Dermis-derived mesenchymal stem cells can be simply referred to as dermal stem cells and are stem cells present in the dermis. Dermal stem cells recruit fibroblasts and contribute to the maintenance of dermal layer homeostasis through differentiation into fibroblasts or activation of fibroblasts. Dermal mesenchymal stem cells are mainly present in the dermal layer, as pericyte-like cell populations, around microvascular sites and organs such as sebaceous glands, sweat glands, and hair follicles. It is thought to be activated when the skin is damaged and to differentiate into fibroblasts and myofibroblasts, contributing to skin regeneration and repair.
  • Dermal stem cells are characterized by double positive for CD34 and NG2, but are not intended to be limited to cells expressing these markers. It is thought that dermal stem cells are replenished through blood vessels, since capillaries are placed around each organ where dermal stem cells are present. Thus, dermal stem cells may have properties close to bone marrow mesenchymal stem cells.
  • the attraction of mesenchymal stem cells can be confirmed either in vitro or in vivo.
  • in vitro experiments it is possible to determine the attraction effect of mesenchymal stem cell attractant by culturing mesenchymal stem cells in a medium having a difference in concentration of mesenchymal stem cell attractant to detect migration.
  • Confirmation in vivo can be examined for the presence or absence of attraction by calculating the number or ratio of mesenchymal stem cells in a tissue section after administration of a mesenchymal stem cell attractant.
  • the mesenchymal stem cell attractant of the present invention can attract mesenchymal stem cells to the administration site when administered.
  • the cells that can be attracted are not limited as long as they are mesenchymal stem cells, but in particular, bone marrow stem cells, dermal stem cells, dermal papilla cells, and adipose stem cells can be attracted. Furthermore, in a more preferred embodiment, bone marrow stem cells and dermal stem cells can be attracted.
  • mesenchymal stem cells can be attracted to the dermal layer.
  • the induced mesenchymal stem cells suppress dermal senescence and contribute to dermal regeneration through various actions. Such effects include, for example, suppression of senescence factors secreted by senescent cells, activation of normal cells, and differentiation into dermal cells.
  • senescent cells decrease in division ability with time and also change in cell activity. Such cells are called senescent cells, and senescent cells can be affected not only by the passage of time but also by stress such as ultraviolet light and active oxygen. Senescent cells reduce the secretion of substances secreted by normal cells, and secrete substances called senescence factors.
  • IGFBP7, CFD, or RSPO4 was found as the aging factor. Aging factor is a factor that is produced from senescent cells and that contributes to senescence by acting on other cells.
  • the aging factor specified in the present invention acts on fibroblasts to reduce collagen fiber as a dermal component such as collagen and elastic fibers such as elastin and fibrin, production of collagen fiber and elastic fiber degrading enzyme, For example, it participates in skin aging via promotion of activities such as collagenase and protease.
  • Mesenchymal stem cells can suppress the production of senescence factor by senescent cells and can suppress the function of senescence factor.
  • Mesenchymal stem cells attracted to the dermis can suppress the reduction of the dermis component and the decomposition of the dermis component by suppressing the production and function of the aging factor, thereby suppressing the senescence of the dermis can do. Therefore, the inducer of mesenchymal stem cells of the present invention can be used as an agent for suppressing aging factor production and an agent for improving skin aging.
  • Mesenchymal stem cells are also known to increase the activity of cells in the dermal layer.
  • the mechanism of action is not clear and is not limited to the following, but it is considered that cytokines such as TGF- ⁇ produced by mesenchymal stem cells act.
  • dermal fibroblasts proliferate and promote the production of dermal elastic components such as collagen fibers and elastic fibers, and are also involved in the maturation of these elastic fibers and collagen fibers.
  • the mesenchymal stem cells themselves differentiate into fibroblasts to supply dermal cells, thereby achieving regeneration of the dermis.
  • the attractant of mesenchymal stem cells of the present invention can be used as collagen fiber or elastic fiber (for example, collagen, elastin or fibrin) production promoter, dermal regeneration agent, or aging improver.
  • Regeneration of the dermis refers to restoration of elasticity of the skin as the elastic component of the dermis increases and matures. Wrinkles and sag that deteriorate the appearance of the skin and give an old-fashioned appearance are caused by a decrease in the content of elastic fibers and collagen fibers that are elastic components in the dermal layer. Therefore, the inducer of mesenchymal stem cells of the present invention can be used as a wrinkle improving agent, a sagging or firming improving agent, or an aging improving agent.
  • the dermis is mainly composed of cellular components such as fibroblasts, histiocytes, mast cells, plasma cells and dendritic cells, and interstitial components that fill the cells.
  • the stromal component is roughly classified into collagen fibers composed of collagen, elastic fibers composed of fibrin and elastin, and glycoproteins or proteoglycans existing between fibers and cells as a main component.
  • the mesenchymal stem cell attractant of the present invention can be administered to a subject suffering from aging of appearance such as sagging or wrinkles of the skin.
  • the causes of the sagging may include a decrease in function of the expression muscle, a decrease in elasticity of the skin supporting the expression muscle, an increase in subcutaneous fat, etc. These causes may cause the sagging independently or cooperatively to cause appearance. Bring about aging.
  • the subject is administered to a subject who suffers from skin sagging, and it is preferable that such a subject has the main cause of sagging to be a reduction in skin elasticity.
  • the mesenchymal stem cell inducer can be administered to a subject in need of dermal regeneration.
  • the mesenchymal stem cell attractant can be used as a therapeutic agent for skin damage and dermatitis, particularly atopic dermatitis.
  • mesenchymal stem cells are known to differentiate into various cells such as adipocytes, osteoblasts, chondrocytes, myocytes and nerve cells in addition to dermal fibroblasts (Non-patent Document 3) .
  • a mesenchymal stem cell attractant comprising at least one member selected from the group consisting of iris extract, olive leaf extract and chamomile extract according to the present invention is used as a pharmaceutical composition for treating or preventing such diseases. can do.
  • Such therapeutic / preventive applications are not limited to the above-mentioned use on skin such as dermal regeneration, aging improvement, wound healing and the like.
  • Non-Patent Document 3 chondrocytes derived from adipose stem cells, which are one of mesenchymal stem cells, can be used for the treatment of articular cartilage disease such as osteoarthritis, etc., adipose stem cell-derived osteoblasts It is disclosed that cells can be applied to bone defect sites and that differentiation to cardiac muscle and vascular cells contributes to improvement of cardiac function. Furthermore, since secretory factors from adipose stem cells result in enhanced angiogenesis, decreased cell apoptosis, and accelerated neural sprouting, in addition to direct regenerative medicine applications in which adipose stem cells differentiate into target cells, Indirect application to regenerative medicine through secretory factors is expected.
  • the mesenchymal stem cell attractant of the present invention can be used to treat or ameliorate a target condition of mesenchymal stem cells.
  • Amelioration of symptoms targeted for the treatment of mesenchymal stem cells includes hair growth promotion, wound healing, skin regeneration, muscle regeneration, soft tissue regeneration, bone regeneration, cardiac muscle regeneration, or nerve regeneration.
  • Non Patent Literature 4 describes that hair follicle regeneration is performed by functioning as skin Niche cells that control the activity of skin stem cells. Have been shown to contribute to promoting hair growth through attraction of adipose stem cells.
  • Non-Patent Document 5 discloses that contact between adipose stem cells and dermal fibroblasts promotes proliferation of dermal fibroblasts. It is known that it can be used for wound healing and skin regeneration.
  • non-patent document 6 shows a therapeutic effect in congenital muscular dystrophy targeting collagen type 6 by transplantation test of adipose stem cells, and the mesenchymal stem cells It is disclosed that one fat stem cell is also applicable to muscle regeneration.
  • articular cartilage diseases such as osteoarthritis, heart disease, muscular dystrophy, aging, tissue damage or wounds.
  • Therapeutic tissues include tissues specifically differentiated from mesenchymal stem cells, such as dermis, blood vessels, muscles, bones, hair and nerves, which can also be used for regeneration of these tissues. Therefore, the composition of the present invention is a composition for treating or preventing articular cartilage diseases such as osteoarthritis, heart disease, muscular dystrophy or various organs such as heart, liver, bone, muscle, nerve, skin, hair It can also be used as a composition for regenerative therapy of
  • the mesenchymal stem cell attraction of the present invention can be administered by any route such as oral or parenteral administration, but transdermal administration is preferred from the viewpoint of direct administration to the skin.
  • the percutaneously administered mesenchymal stem cell attractant can penetrate through appendages such as pores and sweat glands present in the skin. Since the appendage normally reaches the deepest part of the dermal layer, it can be delivered to the deep part of the dermal layer by permeating through the appendage.
  • the viscosity, surface tension, hydrophilicity and hydrophobicity of the skin sagging or aging improver can be appropriately selected. Furthermore, high frequency vibrations or sound waves can also be applied after application of the skin sagging or aging improver of the present invention to promote penetration into the deep dermis. From the viewpoint of administration to a damaged part of the skin, it can be used for transdermal administration by being formulated in an ointment or a puff.
  • the mesenchymal stem cell attractant of the present invention can be formulated into cosmetics, medicines, or quasi-drugs.
  • cosmetics for cosmetic purposes, it is preferable to incorporate in cosmetics.
  • the dosage form of the cosmetic compounded is optional, and can be formulated and used in the form of liquid, gel, foam, emulsion, cream, ointment, sheet and the like.
  • Cosmetics, medicines, or quasi-drugs to be formulated include preparations for external use, lotions, emulsions, creams, ointments, lotions, oils, basic cosmetics such as packs, face wash, skin wash, hair remover, Hair removal agent, after shave lotion, pre shave lotion, shaving cream, foundation, lipstick, blush, eye shadow, eyeliner, mascara and other makeup cosmetics, shampoo, rinse, hair treatment, pre-hair treatment, hair setting, perm agent, hair It can be applied to a variety of products such as tonics, hair dye, hair-growth and hair-care products, hair-care products and bath preparations.
  • basic cosmetics such as packs, face wash, skin wash, hair remover, Hair removal agent, after shave lotion, pre shave lotion, shaving cream, foundation, lipstick, blush, eye shadow, eyeliner, mascara and other makeup cosmetics, shampoo, rinse, hair treatment, pre-hair treatment, hair setting, perm agent, hair It can be applied to a variety of products such as tonics, hair dye,
  • the inducer of mesenchymal stem cells of the present invention can be formulated into cosmetics, medicines and the like and administered to a living body, but is not limited to such use.
  • the property of attracting mesenchymal stem cells can be used to isolate mesenchymal stem cells in vitro.
  • Example 1 Effect of senescent cells on normal cells
  • Cell culture Dermal fibroblasts established from the skin of the back of an adult (21 years old) were cultured in Dulbecco's modified Eagle's medium supplemented with 10% FBS.
  • normal fibroblasts young fibroblasts
  • cells having a culture period of less than 1 month and Pdl ⁇ 30 were used.
  • the same cells were cultured for 3 months or more, and cells whose growth was delayed (doubled time less than 0.5 / week, Pdl> 50) were used as senescent fibroblasts.
  • Normal fibroblasts were seeded on top of a 6-well transwell system (Falcon; Franklin Lakes, NJ) filled with Dulbecco's modified Eagle's medium supplemented with 10% FBS to a density of 1250 cells / cm 2 . Subconstructed aged fibroblasts and normal fibroblasts were seeded in the lower two wells of the Transwell system, respectively. The upper layer and the lower layer of the Transwell system were combined and cultured for 2 days in a 37 ° C., 5% CO 2 humidified atmosphere, and then the upper layer cell and the lower layer cell were respectively recovered using Qiazole (Qiagen).
  • Qiazole Qiazole
  • RNA was extracted using the RNeasy Protect Kit (Qiagen) according to the product instructions, and translated into cDNA using Superscript VILO (Invitrogen) according to the product instructions.
  • Real-time PCR was performed on a LightCycler (Roche) using 28S rRNA as an internal standard and a primer pair for the following genes. The results are shown in FIG.
  • the cycle threshold (Ct value) calculated by Lightcycler software ver. 3.5 was normalized for GAPDH mRNA of each sample. As shown in FIG.
  • siRNAs were designed to knock down CFD (SI00030100 or SI00030107; Qiagen, both have similar inhibitory effects), and siRNA (SI030640318; Qiagen) was used as a negative control.
  • the siRNA was introduced into senescent fibroblasts, and the CFD gene knockdown cells were seeded in the lower layer of the Transwell system according to the above-mentioned cell culture method, and cultured with the cells in the upper layer for 2 days.
  • the lower layer cells and the upper layer cells were obtained respectively, and the expression of CFD was examined for the lower layer cells and the gene expression of MMP1 was examined for the upper layer cells.
  • the expression of MMP1 from the cells in the upper layer was reduced. The results are shown in FIG. This result identified CFD as an aging factor.
  • IGFBP7 a candidate aging factor
  • RSPO4 a candidate aging factor
  • Example 2 Activation of normal cells by mesenchymal stem cells
  • Cell culture Dermal fibroblasts were purchased from Lonza, and a 6-well transwell system filled with Dulbecco's modified Eagle's medium supplemented with 10% FBS to a density of 1250 cells / cm 2 (Falcon; Franklin Lakes, NJ Sowed in the upper layer of Mesenchymal stem cells (MSC) were purchased from Lonza and cultured in Gibco medium. Subconstructed MSCs were seeded in the lower wells of the Transwell system. After 24 hours, the medium was changed to DMEM containing 10% FBS, 250 uM ascorbic acid, and coculture was started.
  • MSC Mesenchymal stem cells
  • FIG. 5A After 7 days, the upper layer was fixed with paraformaldehyde and stained with HE for observation (FIG. 5A). The thickness of the upper layer was measured and shown (FIG. 5B). Culture was performed with fibroblast alone without MSC as a control group. In the presence of MSC, dermal fibroblasts were activated and the degree of cell stratification increased (Student t test: P ⁇ 0.05).
  • Example 3 Maturation of collagen gel by mesenchymal stem cells
  • the collagen gel retained by fibroblasts obtained from Lonza was placed in the upper layer of a 6-well transwell system (Falcon; Franklin Lakes, NJ) filled with Dulbecco's modified Eagle's medium supplemented with 10% FBS.
  • Mesenchymal stem cells (MSC) were purchased from Lonza and cultured in MessenPro medium. Subconstructed MSCs were seeded in the lower wells of the Transwell system. After 24 hours, the medium was changed to DMEM containing 10% FBS, 250 uM ascorbic acid, and culture was started. Images were taken from the top two days later to compare the surface area of the collagen gel. Collagen culture was performed without MSC as a control group. The results are shown in FIG. 6 (Student t test: P ⁇ 0.05). In the presence of MSC, it can be seen that the collagen gel is contracting. This contraction is considered to be the result of increased elasticity as collagen matures.
  • Example 4 Suppression of senescence factor by mesenchymal stem cells
  • Cell culture senescent fibroblasts on top of a 6 well transwell system (Falcon; Franklin Lakes, NJ) filled with Dulbecco's modified Eagle's medium supplemented with 10% FBS to a density of 1250 cells / cm 2 Sowed.
  • Mesenchymal stem cells (MSC) were purchased from Lonza and cultured in MessenPro medium. Subconstructed MSCs were seeded in the lower wells of the Transwell system. After 24 hours, the medium was changed to DMEM containing 10% FBS, 250 ⁇ M ascorbic acid, and coculture was started. Two days later, cells were harvested using Qiazole (Qiagen).
  • the recovered cell lysate was examined for gene expression of senescence factor (IGFBP7) using the same method as RT-PCR described above. The results are shown in FIG. Culture was performed with fibroblast alone without MSC as a control group. In the presence of MSC, gene expression of IGFBP7 was significantly reduced (Student t test: P ⁇ 0.05).
  • Example 5 Determination of attraction of mesenchymal stem cells
  • Mesenchymal stem cell attraction test Mesenchymal-derived stem cells (Lonza) were cultured in a flask containing MessenPro RS medium (DMEM; GIBCO / BRL (Carlsbad, CA)) at 37 ° C. and 5% CO 2 humidification. When subconfluent, cells were harvested using Accutase (PAA (Linz, Austria)) and labeled with 2 ⁇ M PKH67 (Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)) according to the manufacturer's instructions .
  • PAA Accutase
  • 2 ⁇ M PKH67 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)

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Abstract

間葉系幹細胞の誘引剤、並びに当該誘引剤を含む、老化因子産生抑制剤、老化改善剤、及び真皮の再生促進剤の提供。 アイリス抽出物、オリーブ葉抽出物、及びカミツレ抽出物が、間葉系幹細胞誘因作用を有することを見いだしたことにより、間葉系幹細胞の誘引剤の発明に至った。また、間葉系幹細胞が、老化因子の産生を抑制し、また真皮線維芽細胞を活性化することを見出したことにより、当該誘引剤を含む、老化因子産生抑制剤、老化改善剤、及び真皮の再生促進剤に関する発明に至った。

Description

間葉系幹細胞誘引剤
　本発明は、アイリス抽出物、オリーブ葉抽出物、及びカミツレ抽出物からなる群から選ばれる少なくとも１を含む間葉系幹細胞の誘引剤、並びに当該誘引剤を含む、老化因子産生抑制剤、老化改善剤、及び真皮の再生促進剤に関する。
　組織を新しく再生することを目指す再生医学の領域において、失われた組織の機能を回復させるために、各種幹細胞の活用が試みられている。再生医学は、医療領域のみならず、毛髪再生や皮膚再生など美容領域にも応用されてきている。
　幹細胞は、自己複製能と他の種類の細胞に分化する分化能を有する細胞と定義されている。幹細胞としては、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）のように一個体を形成する全ての系統の細胞種へ分化することのできる分化万能性を有する幹細胞の他、成人の生体内の各組織にも、分化万能性はないが、複数系統へ分化できる分化多能性を有する体性幹細胞が存在することが知られている。
　胚性幹細胞は発生初期の胚からしか得ることができず、採取時の母体への危険性や倫理的な問題なども加わって、手軽に研究・臨床の場に利用することは難しく、美容領域での利用は困難である。また、誘導多能性幹細胞については、倫理的な問題は少ないものの、遺伝子を導入することによる癌化のリスクが存在する。したがって、美容領域では、胚性幹細胞や誘導多能性幹細胞の利用よりは、体性幹細胞の利用について研究が進んでいるが、その存在頻度が非常に低く単離が難しく、また自己複製能力と分化能力を維持させながら大量に培養することも困難である。
　体性幹細胞は、組織の損傷時における組織修復、組織の恒常性の維持や老化に寄与していることが知られている。体性幹細胞は、様々な組織において存在することが知られており、皮膚組織に存在する幹細胞としては、表皮層に存在する表皮幹細胞と、真皮層及び皮下脂肪層に存在する間葉系幹細胞などが知られている。
　表皮では、表皮基底層に表皮幹細胞が存在することが良く知られており、また毛包のバルジ領域と呼ばれる領域には、毛包上皮幹細胞や皮膚色素幹細胞が存在することが報告されている。一方、真皮には脂肪、グリア、軟骨、筋肉など複数の細胞系列に分化する皮膚由来前駆細胞（skin-derived precursors：SKP）が存在すること（非特許文献１：Wong CE et al., J Cell Biol. 175:1005-1015, 2006）が報告され、さらに真皮間葉系幹細胞と呼ばれる細胞が単離されている（特許文献１：WO2011/034106）。
　間葉系幹細胞は、皮膚が外傷を受けた際に、外傷部位に誘引されることが知られている。外傷部位に誘引された間葉系幹細胞は、周囲の皮膚細胞を活性化して、細胞増殖を促すとともに、自身も皮膚細胞へと分化して、外傷を塞ぎ、治癒に貢献すると考えられており、ある種のフラボノイドが、間葉系幹細胞の誘引作用を有することが示されている（非特許文献２：PLOS ONE DOI:10.137/journal.pone.0144166）。皮膚損傷の治癒に関与する間葉系幹細胞は、血管を介して運搬されてきた骨髄由来間葉系幹細胞の他に、皮下組織に存在する脂肪幹細胞や、皮脂腺、汗腺、毛包などの器官の周囲や、血管付近に存在していた真皮間葉系幹細胞であると考えられる。間葉系幹細胞としては、従来は骨髄由来幹細胞が主に研究の対象とされてきたが、脂肪組織から脂肪幹細胞が単離されると、その入手の容易性と、種々の細胞系列へと分化することができる多分化能を有することから、様々な再生治療への応用が期待されている（非特許文献３：World J Stem Cells 2014 January 26; 6(1): 65-68）。真皮間葉系幹細胞は、血管付近に存在しているが、その分化能や性質については未知の点が多く、その応用については今後の研究が期待されている。
国際公開第２０１１／０３４１０６号 特表２０１３－５０７９５６号公報
J Cell Biol. 175:1005-1015, 2006 PLOS ONE DOI:10.137/journal.pone.0144166 World J Stem Cells 2014 January 26; 6(1): 65-68 Cell, (2011)146, 761-771 Journal of Dermatological Science (2007) 48, 15- 24 Stem Cell Research & Theapy 2014, 5;21
　本発明は、幹細胞を誘引する作用を有する薬剤の開発を課題とする。
　本発明者らは、皮膚の老化現象を改善する化粧料を開発するに当たり、間葉系幹細胞の誘引を可能にする化粧品素材をスクリーニングしたところ、アイリス抽出物、オリーブ葉抽出物、及びカミツレ抽出物が、それぞれ間葉系幹細胞を誘引することを見出し、本発明に至った。したがって、本発明は、以下に関する。
[１]　アイリス抽出物、オリーブ葉抽出物、及びカミツレ抽出物からなる群から選ばれる少なくとも１を含む、間葉系幹細胞の誘引剤。
[２]　項目１に記載の誘引剤を含む、老化因子産生抑制剤。
[３]　項目１に記載の誘引剤、又は項目２に記載の老化因子産生抑制剤を含む、老化改善剤。
[４]　項目１に記載の誘引剤を含む、真皮の再生促進剤。
[５]　間葉系幹細胞の誘因を介して、間葉系幹細胞により治療又は改善される疾患の治療において使用するための、アイリス抽出物、オリーブ葉抽出物、及びカミツレ抽出物からなる群から選ばれる少なくとも１の抽出液。
［６］　前記疾患が、関節軟骨疾患、例えば変形性関節症等、心臓病、筋ジストロフィー、真皮の創傷又は損傷である、項目５に記載の抽出液。
[７]　アイリス抽出物、オリーブ葉抽出物、及びカミツレ抽出物からなる群から選ばれる少なくとも１を投与することを含み、真皮に存在する間葉系幹細胞を誘引することを介する美容方法又は非治療的方法。
［８］間葉系幹細胞の誘因により、老化因子産生が抑制される、項目７に記載の美容方法又は非治療的方法。
［９］間葉系幹細胞の誘因により、真皮の再生が促進される、項目７に記載の美容方法又は非治療的方法。
［１０］間葉系幹細胞を誘引することにより、たるみやしわなどの外観上の老化を改善される、項目７～９のいずれか一項に記載の美容方法又は非治療的方法。
[１１]　老化の治療又は予防において使用するための、間葉系幹細胞の誘引剤。
[１２]　真皮の再生治療において使用するための、間葉系幹細胞の誘引剤。
[１３]　前記誘引剤が、アイリス抽出物、オリーブ葉抽出物、及びカミツレ抽出物からなる群から選ばれる少なくとも１の抽出物を含む、項目１１又は１２に記載の誘引剤。
［１４］アイリス抽出物、オリーブ葉抽出物、及びカミツレ抽出物からなる群から選ばれる少なくとも１の抽出物を、間葉系幹細胞の誘引剤としての非治療的使用。
［１５］アイリス抽出物、オリーブ葉抽出物、及びカミツレ抽出物からなる群から選ばれる少なくとも１の抽出物の、間葉系幹細胞の誘因を介してしわ、たるみなどの外観上の老化を改善するため非治療的使用。
[１６]　間葉系幹細胞の誘引を必要とする対象において、アイリス抽出物、オリーブ葉抽出物、及びカミツレ抽出物からなる群から選ばれる少なくとも１を投与することを含む、老化の抑制方法。
[１７]　真皮の再生を必要とする対象において、アイリス抽出物、オリーブ葉抽出物、及びカミツレ抽出物からなる群から選ばれる少なくとも１を投与することを含む、真皮の再生促進方法。
[１８]　真皮に存在する間葉系幹細胞の誘引による老化の治療又は抑制のための製剤の製造のための、アイリス抽出物、オリーブ葉抽出物、及びカミツレ抽出物からなる群から選ばれる少なくとも１の抽出物の使用。
[１９]　真皮に存在する間葉系幹細胞の誘引による真皮の再生剤の製造のための、アイリス抽出物、オリーブ葉抽出物、及びカミツレ抽出物からなる群から選ばれる少なくとも１の抽出物の使用。
　本発明の間葉系幹細胞誘引剤は、間葉系幹細胞を誘引する作用を有する。間葉系幹細胞は、真皮線維芽細胞への分化、サイトカインの産生、及び老化因子の抑制のうちの少なくとも１の作用を介して、真皮線維芽細胞を活性化することができ、これにより老化を抑制又は改善し、真皮の再生を図ることができる。
図１(Ａ)は、トランスウェルシステムの模式図を示しており、上層において通常（若い）線維芽細胞が培養され、下層において老化線維芽細胞が培養される。図１（Ｂ）～（Ｄ）は、下層に細胞を培養しない場合（Blank）と、下層に老化線維芽細胞が培養された場合（+Senescent)における、（Ｂ）コラーゲン１Ａ１（COL1A1)、（Ｃ）エラスチン（ELN)、及び（Ｄ）マトリクスメタロプロテイナーゼ１（MMP１）の遺伝子発現量の比較を示すグラフである。 図２は、トランスウェルシステムの下層の老化線維芽細胞において、ＣＦＤの遺伝子発現を抑制した場合（Ａ）の、上層の線維芽細胞におけるＭＭＰ１遺伝子発現の変化を示すグラフである（Ｂ）。 図３は、老化線維芽細胞と通常（若い）線維芽細胞との間における老化因子（Ａ）ＩＧＦＢＰ７、（Ｂ）ＲＳＰＯ４、及び（Ｃ）ＣＦＤの遺伝子発現量の比較を示すグラフである。 図４は、ＩＧＦＢＰ７及びＲＳＰＯ４を添加した場合に、（Ａ）ＭＭＰ１遺伝子が用量依存的に発現増加したこと、及び（Ｂ）コラーゲン１遺伝子が、発現低下したことを示すグラフである。 図５は、線維芽細胞と間葉系幹細胞との共培養系において、間葉系幹細胞の存在により、線維芽細胞層の厚さが増加することを示す写真（Ａ）及びグラフ（Ｂ）である。 図６は、コラーゲンゲルと間葉系幹細胞との共培養系において、間葉系幹細胞の存在により、コラーゲンゲルのサイズが低下することを示す写真（Ａ）及びグラフ（Ｂ）である。 図７は、老化線維芽細胞と間葉系幹細胞との共培養系において、間葉系幹細胞の存在により、老化因子であるＩＧＦＢＰ７の発現が低下することを示すグラフである。 図８は、（Ａ）アイリス抽出物、（Ｂ）オリーブ葉抽出物、及び（Ｃ）カミツレ抽出物が、それぞれ間葉系幹細胞の誘引作用を有することを示すグラフである。
　本発明は、アイリス抽出物、オリーブ葉抽出物、及びカミツレ抽出物からなる群から選ばれる少なくとも１を含む、間葉系幹細胞の誘引剤に関する。間葉系幹細胞誘引剤とは、間葉系幹細胞を誘引することができる薬剤をいう。
　アイリス抽出物は、地中海沿岸を原産とするアヤメ科（Iridaceae)の多年草の抽出物をいう。より好ましくは、アヤメ科のシロバナイリス、ニオイイリス、ニオイアヤメ、オリス（Iris germanica Var.florentina）、又はその近縁種の抽出物をいう。抽出する部位としては、全草、葉、花、根が挙げられるが、特に根を原材料として用いた場合に、芳香性の抽出物が得られることから、根の抽出物が好ましい。抽出方法は任意の方法を用いることができるが、一例として、乾燥させた根について水蒸気蒸留や溶媒抽出を行うことで抽出物を得ることができる。また溶媒としては、任意の抽出溶媒を用いることができるが、エタノール水溶液や５０％（ｖ/ｖ）のブチレングリコールで抽出して得た抽出物を用いることもできる。
　オリーブ葉抽出物は、インド・パンジャブ地方から地中海沿岸を原産とするモクセイ科の植物であるオリーブ（Olea europaea）又はその近縁種の葉に由来する抽出物であり、抗酸化作用、コラーゲン産生促進作用、抗炎症作用、抗アレルギー作用が期待されている。オリーブ葉抽出物は、オリーブの葉を原材料として抽出することが好ましく、抽出方法は任意の方法、例えば水蒸気蒸留や、溶媒抽出を行うことができる。溶媒としては、任意の抽出溶媒を用いることができるが、５０％（ｖ/ｖ）のブチレングリコールで抽出して得た抽出物を用いることもできる。
　カミツレ抽出物は、ヨーロッパから西アジアにかけて広く分布するキク科の１年草であるカモミール（Matricaria chamomilla）又はその近縁種の抽出液である。カミツレ抽出物は、カモミールの花を原材料として抽出することが好ましく、抽出方法は任意の方法、例えば水蒸気蒸留や、溶媒抽出を行うことができる。溶媒としては、任意の抽出溶媒を用いることができるが、５０％（ｖ/ｖ）のエタノール水溶液やブチレングリコール水溶液で抽出して得た抽出物を用いることもできる。
　これらの抽出物は、化粧品素材であることから、化粧料に配合することが好ましい。間葉系幹細胞誘引剤として、前記抽出物の１種を単独で、又は２種以上を混合して用いることができる。間葉系幹細胞誘引剤は、既存の間葉系幹細胞誘引剤、例えばＳＤＦ１α（ＣＸＣＬ２０）などと組み合わせて使用されてもよい。アイリス抽出物、オリーブ葉抽出物、及び／又はカミツレ抽出物を含む組成物を間葉系幹細胞誘引剤として用いることもできる。
　植物抽出物を得るために用いる抽出溶媒としては、水、又は、メタノール、エタノール、プロパノールなどの脂肪族１価アルコール；グリセリン、プロピレングリコール、１，３－ブチレングリコールなどの脂肪族多価アルコール；アセトンなどのケトン類；ジエチルエーテル、ジオキサン、アセトニトリル、酢酸エチルエステルなどのエステル類；キシレン、ベンゼン、トルエンなどの芳香族類；クロロホルムなどハロゲン化アルキル類などの有機溶媒が挙げられる。これらの抽出溶媒は、１種が単独で、又は２種以上が混合されて用いられ得る。混合されてなる抽出溶媒の混合比は、特に限定されるものではなく、適宜調整することができる。前記抽出溶媒としては、少なくとも水を含む水含有抽出溶媒が好ましい。
　植物抽出物を得るための抽出の方法としては、特に制限されず、従来公知の一般的な抽出方法を採用することができる。抽出においては、抽出原料として各植物の抽出部位をそのまま若しくは乾燥させて用いることができる。抽出した後においては、必要に応じて、適宜、ろ過、脱臭、脱色などの精製処理を行うことができる。脂肪幹細胞誘引剤又は皮膚のたるみ若しくは老化改善剤は、最終製品に添加して用いられる。最終製品中に含まれる上記各抽出物の濃度は、特に限定されず、例えば、十分な脂肪幹細胞誘引効果を発揮する観点から概ね組成物に対して、抽出物を典型的には０．００１～１０質量％の範囲、好ましくは０．００１～１質量％の範囲、最も好ましくは０．０１～０．５質量％の範囲で配合される。
　本発明において間葉系幹細胞とは、一般に間葉系に分類される任意の組織由来の幹細胞をいう。間葉系に分類される組織として、骨髄、胎盤、脂肪組織、真皮などが挙げられ、それらの組織由来の幹細胞の例として、骨髄由来間葉系幹細胞（以下、単に骨髄幹細胞とする）、胎盤由来間葉系幹細胞、脂肪組織由来間葉系幹細胞（以下、単に脂肪幹細胞とする)、歯髄由来間葉系幹細胞、臍帯血由来間葉系幹細胞、真皮由来間葉系幹細胞（以下、単に真皮幹細胞とする）などが挙げられ、また毛乳頭細胞の一部も間葉系幹細胞であると考えられている。本発明の間葉系幹細胞の誘引剤は、任意の組織由来の間葉系幹細胞に対し誘引作用を有しうる。一例として、美容分野や皮膚再生分野での応用を鑑み、経皮投与で誘引作用を発揮させる観点から、特に真皮幹細胞、脂肪幹細胞、毛乳頭細胞に対して誘引作用を有することが好ましい。
　骨髄由来間葉系幹細胞は、骨髄に存在する幹細胞である。骨髄幹細胞は、心筋細胞、骨格筋細胞、血管内皮細胞、軟骨細胞、骨細胞、脂肪細胞といった多様な組織への分化能を有している。骨髄由来間葉系幹細胞は、ＣＤ１０５、ＣＤ７３、ＣＤ９０を陽性マーカーとして特徴付けられるが、これらのマーカーを発現する細胞に限定されることを意図するものではない。骨髄間葉系幹細胞は、組織の損傷などのシグナルに応じ、血液中に放出されて、創傷部における治癒機能を果たすと考えられている。
　脂肪組織由来間葉系幹細胞とは、単に脂肪幹細胞ということもでき、脂肪組織中に存在する間葉系幹細胞の一種である。脂肪幹細胞は、遊走能力を有することが知られており（非特許文献３及び特許文献２)、脂肪組織中を移動することができると考えられている。脂肪幹細胞は、ＣＤ９０マーカー、ＣＤ１０５マーカー等の発現により特徴付けられるが、これらのマーカーを発現する細胞に限定されることを意図するものではない。
　真皮由来間葉系幹細胞とは、単に真皮幹細胞ということもでき、真皮に存在する幹細胞である。真皮幹細胞は、線維芽細胞への分化、又は線維芽細胞の活性化を介して、線維芽細胞を補充して真皮層の恒常性の維持に寄与する。真皮間葉系幹細胞は、真皮層中、ペリサイト様の細胞集団として微小血管部位や、皮脂腺、汗腺、毛包などの器官の周囲に主に存在する。皮膚の損傷時に活性化し、線維芽細胞、筋線維芽細胞に分化して皮膚の再生・修復に寄与していると考えられる。真皮幹細胞は、ＣＤ３４及びＮＧ２の二重陽性により特徴付けられるが、これらのマーカーを発現する細胞に限定されることを意図するものではない。真皮幹細胞が存在する各器官の周囲には毛細血管が張り巡らされていることから、真皮幹細胞は、血管を通して補充されることが考えられる。したがって、真皮幹細胞は、骨髄間葉系幹細胞と近い性質を有しうる。
　間葉系幹細胞の誘引は、in vitro及びin vivoのいずれでも確認することができる。in vitroの実験では、間葉系幹細胞誘引剤の濃度差がある培地中で間葉系幹細胞を培養して遊走を検出することで、間葉系幹細胞誘引剤の誘引効果を決定することができる。in vivoでの確認は、間葉系幹細胞誘引剤を投与した後に組織切片にて間葉系幹細胞の数又は割合を算出することで、誘引の有無を調べることができる。
　本発明の間葉系幹細胞の誘引剤は、投与された場合に投与部位に間葉系幹細胞を誘引することができる。誘引できる細胞は、間葉系幹細胞であれば限定されないが、特に骨髄幹細胞、真皮幹細胞、毛乳頭細胞、脂肪幹細胞を誘引可能である。さらに、より好ましい態様では、骨髄幹細胞及び真皮幹細胞を誘引可能である。経皮投与される場合には、間葉系幹細胞は、真皮層に誘引されうる。誘引された間葉系幹細胞は、様々な作用を介して、真皮の老化を抑制し、真皮の再生に寄与する。このような作用として、一例として老化細胞により分泌される老化因子の抑制、正常細胞を活性化、及び真皮細胞への分化が挙げられる。
　細胞は、時間経過に伴い分裂能が減少し、また細胞活性も変化する。このような細胞を老化細胞といい、老化細胞は時間経過のみならず、紫外線や活性酸素などのストレスにも影響を受けうる。老化細胞は、正常細胞が分泌する物質の分泌量を低下させ、また老化因子とよばれる物質を分泌するようになる。本発明者らは、老化因子としてＩＧＦＢＰ７、ＣＦＤ、又はＲＳＰＯ４を見出した。老化因子は、老化した細胞から産生される因子であって、他の細胞に作用することで老化に寄与する因子をいう。本発明で特定された老化因子は、維芽細胞に作用することで、真皮成分である膠原線維、例えばコラーゲンや弾性線維、例えばエラスチン、フィブリンなどの産生低下、膠原線維や弾性線維の分解酵素、例えばコラゲナーゼやプロテアーゼなどの活性促進を介して、皮膚老化に関与する。間葉系幹細胞は、老化細胞による老化因子の産生を抑制し、また老化因子の機能を抑制することができる。真皮に誘引された間葉系幹細胞は、老化因子の産生や機能に対し抑制的に作用することで、真皮成分の減少、真皮成分の分解を抑制することができ、それにより真皮の老化を抑制することができる。したがって、本発明の間葉系幹細胞の誘引剤は、老化因子産生抑制剤、皮膚老化改善剤として使用することができる。
　間葉系幹細胞が、真皮層の細胞の活性を増加させることも知られている。その作用機序は定かではなく、以下のものに限定されるものではないが、間葉系幹細胞が産生するＴＧＦ－βなどのサイトカインが作用するものと考えられる。これにより真皮線維芽細胞が増殖し、また膠原線維や弾性線維などの真皮の弾性成分の産生を促進するとともに、これらの弾性線維や膠原線維の成熟にも関与する。また、間葉系幹細胞が、真皮線維芽細胞の分裂を促進するほかに、間葉系幹細胞自体が線維芽細胞へと分化することで真皮細胞が供給されることで真皮の再生が図られる。本発明の間葉系幹細胞の誘引剤は、膠原線維や弾性線維（例えばコラーゲン、エラスチン又はフィブリン）産生促進剤、真皮再生剤、又は老化改善剤として使用できる。
　真皮の再生は、主に真皮の弾性成分が増加し、成熟することで、皮膚の弾力が回復することをいう。皮膚の外観を悪化させ、老けた印象を与えるシワやたるみは、真皮層中における弾性成分である弾性線維や膠原線維の含有量の低下に起因する。したがって、本発明の間葉系幹細胞の誘引剤は、シワ改善剤、たるみやハリの改善剤、老化改善剤として使用できる。
　真皮は、線維芽細胞、組織球、肥満細胞、形質細胞、及び樹状細胞などの細胞成分と、細胞の間を埋める間質成分とから主に構成される。間質成分は、コラーゲンから構成される膠原線維、フィブリンやエラスチンから構成される弾性線維、及び線維や細胞の間に存在する糖タンパク質やプロテオグリカンを主成分とする基質に大別される。
　本発明の間葉系幹細胞誘引剤は、皮膚のたるみやしわなどの外観の老化を患う対象に投与することができる。たるみの原因は、表情筋の機能低下、表情筋を支えている皮膚の弾力の低下、皮下脂肪の増大等が挙げられ、これらの原因は独立に又は協働して、たるみを引き起こし、外観の老化をもたらす。本発明では、皮膚のたるみを患う対象に投与されるが、このような対象は、たるみの主原因が、皮膚の弾力低下であることが好ましい。また、別の態様では、間葉系幹細胞誘因剤は、真皮の再生を必要とする対象に投与することができる。このような対象において皮膚の損傷部に投与することもできる。皮膚の損傷は、外傷、創傷、火傷、炎症部が挙げられる。特に、間葉系幹細胞の皮膚炎、例えばアトピー性皮膚炎などへの治療効果が知られている。したがって、間葉系幹細胞誘引剤は、皮膚の損傷や皮膚炎、特にアトピー性皮膚炎の治療薬として使用しうる。
　間葉系幹細胞は、真皮線維芽細胞の他、脂肪細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、筋細胞、及び神経細胞等の種々の細胞へと分化することが知られている（非特許文献３）。このような種々の細胞への分化能を利用することで、本発明の間葉系幹細胞の誘引剤を様々な疾患の治療に用いられうる。したがって、本発明のアイリス抽出物、オリーブ葉抽出物、及びカミツレ抽出物からなる群から選ばれる少なくとも１を含む間葉系幹細胞の誘引剤は、かかる疾患の治療又は予防用の医薬組成物として使用することができる。このような治療・予防用途は、上述される真皮再生、老化改善、創傷治癒などの皮膚に対する使用に限られるものではない。例えば、非特許文献３には、間葉系幹細胞の一つである脂肪幹細胞由来の軟骨細胞が、関節軟骨疾患、例えば変形性関節症等の治療に用いることができること、脂肪幹細胞由来の骨芽細胞が、骨欠損箇所に適用できること、心筋や血管細胞へと分化することで心機能の改善に寄与することが開示されている。さらに、脂肪幹細胞からの分泌因子により、血管新生の亢進、細胞アポトーシスの減少、及び神経発芽の促進が生じることから、脂肪幹細胞が標的細胞に分化する直接的な再生医療への応用の他に、分泌因子を介した間接的な再生医療への応用が期待されている。したがって、本発明の間葉系幹細胞誘引剤は、間葉系幹細胞の治療標的となる症状を治療又は改善するために用いることができる。間葉系幹細胞の治療標的となる症状の改善として、発毛促進、創傷治癒、皮膚の再生、筋肉の再生、軟組織の再生、骨の再生、心筋の再生、又は神経の再生が挙げられる。これらうち、間葉系幹細胞の一つである脂肪幹細胞と発毛促進との関係については、非特許文献４に、皮膚幹細胞の活性を制御する皮膚Niche細胞として機能することで、毛包の再生に寄与することが明らかになっており、脂肪幹細胞の誘引により発毛促進を可能にすることが開示されている。また、脂肪幹細胞と創傷治癒及び/又は皮膚の再生との関係については、非特許文献５に、脂肪幹細胞と真皮線維芽細胞とが接触することで真皮線維芽細胞の増殖を促すことが開示されており、創傷治癒や皮膚の再生に利用可能であることが知られている。さらに、脂肪幹細胞と筋肉再生との関係については、非特許文献６に脂肪幹細胞の移植試験により、コラーゲン６型を標的とする先天性筋ジストロフィーでの治療効果が示されており、間葉系幹細胞の一つである脂肪幹細胞は、筋肉再生にも利用可能であることが開示されている。間葉系幹細胞により治療又は改善される疾患としては、関節軟骨疾患、例えば変形性関節症等、心臓病、筋ジストロフィー、老化が挙げられ、組織の損傷又は創傷が挙げられる。治療組織としては、特に間葉系幹細胞から分化される組織、例えば真皮、血管、筋肉、骨、毛、神経が挙げられ、これらの組織の再生にも利用されうる。したがって、本発明の組成物は、関節軟骨疾患、例えば変形性関節症等、心臓病、筋ジストロフィーの治療又は予防用組成物、又は各種臓器、例えば心臓、肝臓、骨、筋肉、神経、皮膚、毛の再生治療用の組成物として使用することもできる。
　本発明の間葉系幹細胞誘引は、経口又は非経口投与など、任意の経路で投与することができるが、皮膚に直接投与する観点から経皮投与が好ましい。経皮投与された間葉系幹細胞誘引剤は、皮膚に存在する毛穴や汗腺などの付属器官を介して浸透することができる。付属器官は、通常真皮層の最深部に達していることから、付属器官を介して浸透することで、真皮層の深部へ薬物を送達しうる。皮膚のたるみ又は老化改善剤は、その粘度、表面張力、親水性、疎水性を適宜選択することができる。さらに、真皮深部への浸透を促進するために、本発明の皮膚のたるみ又は老化改善剤の適用後に、高周波数の振動又は音波を適用することもできる。皮膚の損傷部に投与する観点からは、軟膏や発布剤に剤形することで経皮投与に用いることができる。
　本発明の間葉系幹細胞誘引剤は、化粧品、医薬品、又は医薬部外品に配合することができる。美容の目的では化粧品に配合することが好ましい。配合される化粧品の剤型は任意であり、液体、ゲル、気泡、乳液、クリーム、軟膏、シート等の形態で配合して用いることができる。配合される化粧品、医薬品、又は医薬部外品としては、外用薬用製剤、化粧水、乳液、クリーム、軟膏、ローション、オイル、パック等の基礎化粧料、洗顔料や皮膚洗浄料、除毛剤、脱毛剤、アフターシェーブローション、プレシェーブローション、シェービングクリーム、ファンデーション、口紅、頬紅、アイシャドウ、アイライナー、マスカラ等のメークアップ化粧料、シャンプー、リンス、ヘアートリートメント、プレヘアートリートメント、整髪料、パーマ剤、ヘアートニック、染毛料、育毛・養毛料等の頭髪化粧料、浴用剤など様々な製品に応用できる。
　本発明の間葉系幹細胞の誘引剤は、化粧料、医薬品などに配合して生体に投与することができるが、そのような使用に限られるものではない。例えば間葉系幹細胞を誘引する性質を用いて、in vitroにおいて間葉系幹細胞の単離に用いることもできる。
　本明細書において言及される全ての文献はその全体が引用により本明細書に取り込まれる。
　以下に説明する本発明の実施例は例示のみを目的とし、本発明の技術的範囲を限定するものではない。本発明の技術的範囲は特許請求の範囲の記載によってのみ限定される。本発明の趣旨を逸脱しないことを条件として、本発明の変更、例えば、本発明の構成要件の追加、削除及び置換を行うことができる。
実施例１：老化細胞による、正常細胞への影響
細胞培養
　成人（２１歳）の背中の皮膚から樹立された真皮線維芽細胞を、１０％ＦＢＳを添加したダルベッコ改変イーグル培地で培養した。通常の線維芽細胞（若い線維芽細胞）として、１ヶ月未満の培養期間であり、Pｄｌ＜３０の細胞を用いた。同細胞を、３ヶ月以上培養し、増殖が遅くなった細胞（倍化時間が０．５／週未満、Ｐｄｌ＞５０）を老化線維芽細胞として用いた。通常の線維芽細胞を１２５０細胞／ｃｍ2の密度となるように、１０％ＦＢＳを添加したダルベッコ改変イーグル培地を満たした６ウェルのトランスウェルシステム（Falcon; Franklin Lakes, NJ)の上層に播種した。サブコンストラクト状態の老化線維芽細胞と通常の線維芽細胞を、それぞれトランスウェルシステムの下層の２つのウェルに播種した。トランスウェルシステムの上層及び下層を組み合わせて、３７℃５％ＣＯ2加湿雰囲気下で２日間培養後、上層の細胞と下層の細胞をそれぞれQiazole（Qiagen）を用いて回収した。
定量的ＲＴ－ＰＣＲ
　回収した細胞ライセートから、RNeasy Protect Kit（Qiagen）を製品説明書に従い用いてＲＮＡを抽出し、そしてSuperscript VILO（Invitrogen）を製品説明書に従い用いてｃＤＮＡへと翻訳した。２８ＳｒＲＮＡを内部標準とし、下記の遺伝子についてのプライマー対を用いて、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（ロッシュ）にてリアルタイムＰＣＲを行った。結果を図１に示す。Lightcycler software ver.3.5により計算されたサイクル閾値（Ｃｔ値）を、各サンプルのＧＡＰＤＨｍＲＮＡについて正規化した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
 　図１（Ａ）に示されるように、老化線維芽細胞を下層に播種した場合、下層に細胞を播種しなかった場合に比べてＭＭＰ１の発現が有意に増加し、またエラスチン及びコラーゲンの発現が有意に減少した。通常の線維芽細胞（若い線維芽細胞）を下層に播種した場合は、下層に細胞を播種しなかった場合に比べて有意な変化が示されなかった。この結果から、老化細胞から、何らかの老化因子が分泌されることにより、培地を共有する真皮線維芽細胞において、遺伝子発現の変化が生じることが明らかになった。
老化線維芽細胞において発現が増加する遺伝子の特定
　若い線維芽細胞と、老化線維芽細胞とにおける遺伝子発現の違いを、マイクロアレイ分析により調べた。若い線維芽細胞の遺伝子発現量と比較して、２．５倍以上の発現量を示した遺伝子を同定した。下記の表に記載の遺伝子を老化因子の候補とした：
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　これらの老化因子の候補遺伝子のうち、ＣＦＤをノックダウンするようにｓｉＲＮＡを設計し（SI00030100又はSI00030107；Qiagen、両者は同様の阻害効果を有する）、ネガティブコントロールとしてｓｉＲＮＡ（SI030640318；Qiagen）を用いた。ｓｉＲＮＡを老化線維芽細胞に導入して、ＣＦＤ遺伝子をノックダウンした細胞を、上述の細胞培養法に従い、トランスウェルシステムの下層に播種し、上層の細胞と共に２日間培養を行った。下層の細胞と上層の細胞をそれぞれ取得し、下層の細胞についてはＣＦＤの発現、上層の細胞についてはＭＭＰ１の遺伝子発現を調べた。ＣＦＤがノックダウンされた老化線維芽細胞を下層に播種した場合に、上層の細胞からのＭＭＰ１の発現が低下した。結果を図２に示す。この結果により、ＣＦＤが老化因子であることを特定した。
老化細胞における老化因子の発現
　本発明者らにより特定された老化因子（ＣＦＤ）及び候補老化因子（ＩＧＦＢＰ７、ＲＳＰＯ４）の発現を、老化線維芽細胞と若い線維芽細胞とで比較した。老化線維芽細胞及び若い線維芽細胞をそれぞれ培養し、Qiazole（Qiagen）を用いて回収した。回収された細胞ライセートを、上述のＲＴ-ＰＣＲと同様の手法を用いて、老化因子の発現を調べた。下記のプライマー対を用いた。結果を図３に示す。本発明で特定された老化因子及び候補老化因子は、ともに老化線維芽細胞で発現が高くなることが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
老化因子の添加
　候補老化因子（ＩＧＦＢＰ７、ＲＳＰＯ４）のタンパク質（Serotec、R&D SYSTEMSより購入）を若い線維芽細胞を培養する培地に、０μg/ｍｌ、１０μｇ/ｍｌの濃度で添加し、２日間培養後、細胞をそれぞれQiazole（Qiagen）を用いて回収した。回収した細胞ライセートについて、定量的ＲＴ－ＰＣＲの欄で記載したのと同様に、ＭＭＰ１及びコラーゲンの発現量を調べた。結果を図４に示す。ＩＧＦＢＰ７及びＲＳＰＯ４は、コラーゲンの発現を低下させ、またＭＭＰ１の発現を増加させた。これにより、ＩＧＦＢＰ７及びＲＳＰＯ４も老化因子として作用することが示された。
実施例２：間葉系幹細胞による正常細胞の活性化
細胞培養
　真皮線維芽細胞はLonzaより購入し、１２５０細胞／ｃｍ2の密度となるように、１０％ＦＢＳを添加したダルベッコ改変イーグル培地を満たした６ウェルのトランスウェルシステム（Falcon; Franklin Lakes, NJ)の上層に播種した。間葉系幹細胞（ＭＳＣ）はLonzaより購入し、Gibco培地にて培養した。サブコンストラクト状態のＭＳＣを、トランスウェルシステムの下層のウェルに播種した。２４時間後に培地を１０％ＦＢＳ、２５０ｕＭアスコルビン酸を含むＤＭＥＭに交換し、共培養を開始した。７日後に上層をパラホルムアルデヒドにて固定し、ＨＥ染色を行い観察した（図５Ａ）。上層の厚みを計測して示した（図５Ｂ）。対照群としてＭＳＣ無しで線維芽細胞単独で培養を行った。ＭＳＣ存在下では、真皮線維芽細胞が活性化し、細胞の重層程度が増大した（スチューデントｔ検定：Ｐ＜０．０５）。
実施例３：間葉系幹細胞によるコラーゲンゲルの成熟
細胞培養
　Lonzaから取得した線維芽細胞が保持するコラーゲンゲルを、１０％ＦＢＳを添加したダルベッコ改変イーグル培地を満たした６ウェルのトランスウェルシステム（Falcon; Franklin Lakes, NJ)の上層に配置した。間葉系幹細胞（ＭＳＣ）はLonzaより購入し、MessenPro培地にて培養した。サブコンストラクト状態のＭＳＣを、トランスウェルシステムの下層のウェルに播種した。２４時間後に培地を１０％ＦＢＳ、２５０ｕＭアスコルビン酸を含むＤＭＥＭに交換し、培養を開始した。２日後に上から撮影を行い、コラーゲンゲルの表面積を比較した。対照群としてＭＳＣ無しでコラーゲンの培養を行った。結果を図６に示す（スチューデントｔ検定：Ｐ＜０．０５）。ＭＳＣが存在下では、コラーゲンゲルが収縮していることが分かる。この収縮は、コラーゲンが成熟することに伴い、弾力が増した結果と考えられる。
実施例４：間葉系幹細胞による老化因子の抑制
細胞培養
　老化線維芽細胞を、１２５０細胞／ｃｍ2の密度となるように、１０％ＦＢＳを添加したダルベッコ改変イーグル培地を満たした６ウェルのトランスウェルシステム（Falcon; Franklin Lakes, NJ)の上層に播種した。間葉系幹細胞（ＭＳＣ）はLonzaより購入し、MessenPro培地にて培養した。サブコンストラクト状態のＭＳＣを、トランスウェルシステムの下層のウェルに播種した。２４時間後に培地を１０％ＦＢＳ、２５０μＭアスコルビン酸を含むＤＭＥＭに交換し、共培養を開始した。２日後にQiazole（Qiagen）を用いて細胞を回収した。回収された細胞ライセートを、上述のＲＴ-ＰＣＲと同様の手法を用いて、老化因子（ＩＧＦＢＰ７）の遺伝子発現を調べた。結果を図７に示す。対照群としてＭＳＣ無しで線維芽細胞単独で培養を行った。ＭＳＣ存在下では、ＩＧＦＢＰ７の遺伝子発現は有意に減少した（スチューデントｔ検定：Ｐ＜０．０５）。
実施例５：間葉系幹細胞の誘引作用の決定
間葉系幹細胞の誘引試験
　間葉系由来幹細胞（Lonza)を、MessenPro RS培地(DMEM；GIBCO/BRL (Carlsbad, CA))を含むフラスコ中で、３７℃５％ＣＯ2加湿下で培養した。サブコンフルエントになった際にAccutase（PAA (Linz, Austria)）を用いて細胞を回収し、そして２μMのPKH６７（Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)）を用いて製品説明書に従い標識化した。３×１０4標識細胞／wellを２４well Fluoroblok plate(Becton Dickinson (Mountain View, CA))の上部ウェルに播種した。６時間のインキュベーション後に、培地をサプリメントを伴わないMessenPro RS培地(DMEM；GIBCO/BRL (Carlsbad, CA))に置き換えた。インキュベーションを１２時間続け、試験物質をFluoroblokの下部ウェルに０．１％の濃度で加えた。８時間後、Fluorobolok膜の下側を、蛍光フィルターを備えた顕微鏡を通して写真を撮り、膜を通して誘引された細胞を、Image J. を用いて孔サイズよりも大きい蛍光領域として計数した。脂肪由来幹細胞の誘引活性は、対照ウェルでの蛍光値と、試験ウェルでの蛍光値との比較により評価した。
　試験抽出物として、多数の化粧品素材をスクリーニングに供したところ、その中で、
アイリス抽出物（香栄興業）、オリーブ葉抽出物（丸善製薬）、及びカミツレ抽出物（丸善製薬）が、優れた間葉系幹細胞誘因活性を有することが示された。アイリス抽出物、オリーブ葉抽出物、及びカミツレ抽出物を添加したウェルは、抽出物を伴わず、抽出溶媒のみを含む対照ウェルと比較して有意に高い蛍光を示した（表１、図５Ａ及びＢ、スチューデントｔ検定：Ｐ＜０．０５）。アイリス抽出物、オリーブ葉抽出物、及びカミツレ抽出物の場合、その抽出溶媒は、５０％ブチレングリコールであり、試験抽出物の代わりにこの溶媒のみを対照ウェルに加えた。

Claims (3)

  1. 　アイリス抽出物、オリーブ葉抽出物、及びカミツレ抽出物からなる群から選ばれる少なくとも１を含む、間葉系幹細胞の誘引剤。
  2. 　請求項１に記載の誘引剤を含む、老化因子産生抑制剤。
  3. 　請求項１に記載の誘引剤を含む、真皮の再生促進剤。
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