KR102017386B1 - 이식된 지방세포의 생착 증진용 조성물 및 지방 이식용 세포 치료제 조성물 - Google Patents

Abstract

본 명세서에서는 메게스트롤 아세테이트 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는, 이식된 지방세포의 생착 증진용 또는 지방재생촉진 조성물이 제공된다. 또한, 본 명세서에서는 메게스트롤 아세테이트와 지방세포를 포함하는, 지방 이식용 세포 치료제 조성물이 제공된다.

Description

이식된 지방세포의 생착 증진용 조성물 및 지방 이식용 세포 치료제 조성물{COMPOSITION FOR PROMOTING ENGRAFTMENT OF TRANSPLANTABLE ADIPOCYTES AND CELLULAR COMPOSITON FOR TREATING OF FAT TRANSPLANTATION}

본 발명은 이식된 지방세포의 생체 내 (in- vivo) 생존률을 증가시킴으로써 생착을 증진시키는, 이식된 지방세포의 생착 증진용 조성물과 지방 이식 치료에 이용되는 지방 이식용 세포 치료제 조성물에 관한 것이다.

지방 이식술은 어느 한 부위로부터 지방조직을 취하여 또 다른 부위에 이식하는 것을 포함하는 시술을 의미한다. 이러한 지방 이식술은 안면 주름, 주름살, 곰보 자국과 같은 미용상의 작은 결함 부위를 복구하는데 뿐만 아니라, 유방, 둔부 확대 및 재건에도 이용된다. 특히 자가 지방 이식술은 거부 반응의 가능성이 거의 없고, 자연스러운 결과를 얻을 수 있다는 장점을 갖고 있어 성형외과적 시술로서 빈번하게 시행되고 있다.

그러나, 단순히 지방 흡입으로부터 얻어진 지방을 이식할 경우, 이식 후 이식된 지방의 부피의 약 10 내지 90 %가 흡수되어, 이식의 효과가 떨어지는 문제가 발생하게 된다. 이러한 생착률의 감소는, 흡입 과정 중 발생되는 지방세포의 손상과 이식된 지방으로의 산소 및 영양분 공급의 차단, 지방재생 과정의 차단이라는 기전으로 설명될 수 있다. 특히 최신의 연구 결과에 의하면 지방을 이식할 시에, 대부분의 지방은 이식 후 수일 내로 생존성을 잃게 되는데, 이때 지방줄기세포가 활성화되어 지방재생이 일어나게 되어 최종적인 지방생존량이 결정되게 된다고 한다. 이에, 환자에게 만족스런 시술 결과를 제공하기 위해 추가시술이 빈번하게 시행된다.

이상의 문제점을 해결하기 위해, 지방조직을 원심분리하여 소량씩 이식하는 방법이 소개된 바 있고, 지방 줄기세포를 이식하는 새로운 기법 등도 개발되었으나, 아직까지 그 효과는 만족스럽지 못하다. 나아가, 지방세포의 생체 내 생착률을 높이기 위해 과량의 지방세포를 이식하기도 하나 이 경우, 지방의 괴사, 지방 낭종, 석회화등의 또 다른 부작용이 야기될 수 있다.

이러한 이유로, 지방 이식술에 임상적으로 적용되어 이식된 지방세포의 생존률을 높임으로써 생착률을 증진시킬 수 있는 새로운 조성물, 나아가 지방 이식이 필요한 부위에 대하여 근본적인 치료 효과를 제공할 수 있는 새로운 세포 조성물의 개발이 지속적으로 요구된다.

발명의 배경이 되는 기술은 본 발명에 대한 이해를 보다 용이하게 하기 위해 작성되었다. 발명의 배경이 되는 기술에 기재된 사항들이 선행기술로 존재한다고 인정하는 것으로 이해되어서는 안 된다.

메게스트롤 아세테이트 (megestrol acetate) 는 합성 프로게스테론으로서, 암 또는 AIDS 환자의 식욕부진, 악액질 또는 원인불명의 현저한 체중감소의 치료에 이용될 수 있다.

본 발명의 발명자들은, 식욕을 증진시키고 체중을 증가 시키는 메게스트롤 아세테이트의 효과에 주목하였고, 이에 대하여 지속적으로 연구해왔다. 그 결과, 본 발명의 발명자들은 메게스트롤 아세테이트가 지방세포 특히, 지방 줄기세포 (adipose-derived stem cell) 의 증식 (proliferation) 및 이동 (migration) 을 촉진하며, 지방세포로의 분화를 촉진한다는 것을 발견하기에 이르렀다. 특히, 본 발명의 발명자들은, 지방 줄기세포로부터 지방세포로 분화되는 것이 촉진된다는 점에 있어서, 메게스트롤 아세테이트가 지방 줄기세포 내의 글루코코르티코이드 수용체 (glucocorticoid receptor) 에 작용한다는 것을 발견하였다.

이에, 본 발명의 발명자들은 메게스트롤 아세테이트가 지방 이식술에 임상적으로 이용될 수 있음을 인지할 수 있었다.

그 결과, 본 발명의 발명자들은 메게스트롤 아세테이트를 포함하는, 이식된 지방세포의 생체 내 생존률을 증가시킴으로써 세포 생착률을 증가시키는 새로운 조성물을 개발하기에 이르렀다. 나아가, 본 발명의 발명자들은 메게스트롤 아세테이트와 지방세포를 포함하는 지방조직이 결손되어 이식이 필요한 부위에 적용될 수 있어, 연부 조직의 결손 및 외형적 결함을 치료할 수 있는 세포 조성물을 개발하였다.

이에 본 발명이 해결하고자 하는 과제는, 지방 이식술에 임상적으로 적용하여 이식된 지방세포의 높은 생착률을 제공할 수 있는, 메게스트롤 아세테이트 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 이식된 지방세포의 생착 증진용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는, 지방 이식이 필요한 부위에 직접적으로 적용 가능한, 메게스트롤 아세테이트 및 지방세포를 포함하는 지방 이식용 세포 치료제 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명이 해결하고자 하는 또 다른 과제는, 연조직 증대를 위하여 지방재생이 필요한 모든 임상적 상황에 대하여 그 효과를 극대화시킬 수 있는 지방재생 증진용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 과제들은 이상에서 언급한 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 메게스트롤 아세테이트를 포함하는, 이식된 지방세포의 생착 증진용 조성물이 제공된다.

본 명세서 사용되는 용어, "메게스트롤 아세테이트"는 항 안드로겐 활성을 갖는 합성 프로게스테론으로서, 암환자 또는 HIV/에이즈 환자의 식욕을 자극하고 체중을 증가시키는데 이용되고, 유방 및 자궁내막암의 치료에 이용될수 있다. 이때 메게스트롤 아세테이트는, 메게이스 (Megace), 또는 메게스테롤 아세테이트 (megesterol acetate), MA와 상호 교환적으로 이용될 수 있다.

한편, 메게스트를 아세테이트는 지방세포의 증식 및 이동을 촉진하고, 지방 줄기세포로부터 지방세포로의 분화를 촉진할 수 있다. 이는 메게스트를 아세테이트에 의해 활성화되는 지방세포 또는 지방 줄기세포 내의 글루코코르티코이드 수용체의 인산화와 연관될 수 있다. 즉, 메게스트롤 아세테이트는 지방세포, 나아가 지방 줄기세포의 글루코코르티코이드 수용체에 작용함으로써 이식된 이들 세포들의 생체 내 생존률을 증가시킬 수 있다. 이에, 메게스트롤 아세테이트는 지방 이식술을 진행한 환자에게 적용될 경우, 이식된 지방세포의 생체 내 생착률 증진 효과를 제공할 수 있다.

본 명세서 사용되는 용어, "지방세포"는 지방조직에서 지방을 저장하는 세포를 의미한다. 이때, 본 명세서에서 이용되는 지방세포는 백색 지방세포 (white adipocyte), 갈색 지방세포 (brown adipocyte) 를 포함할 수 있고, 나아가, 지방으로부터 유래한 지방 줄기세포를 더 포함할 수 있다.

이에 이식된 지방세포는 환자의 지방조직이 결손된 부위, 또는 연부 조직이 결손된 부위에 이식된 지방세포, 또는 지방 줄기세포를 의미할 수 있다.

본 명세서 사용되는 용어, "생착"은 이식된 장기, 조직, 세포가 목표 부위에서 그 기능이 정상적으로 발휘하는 상태를 의미한다. 본 명세서에서 생착은, 이식된 지방세포 또는 지방 줄기세포의 생착일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

한편, 지방 줄기세포의 생체 내 생존률은 지방 이식술의 치료 효과와 연관될 수 있다. 이에, 지방 줄기세포의 생체 내 생존률을 증가시키는 것은, 이식된 조직 내에서 오랜 기간동안 지방 줄기세포로부터 지방세포로의 분화에 기여한다는 것을 의미할 수 있다. 그 결과, 이식된 지방 줄기세포의 생체 내 높은 생존률을 제공하는 것은, 지방세포의 생착률의 증진, 나아가 지방 이식술의 치료 효과의 증진으로도 이어질 수 있다.

이에 따라, 본 발명의 일 실시예에 따른 이식된 지방세포의 생착 증진용 조성물은, 지방재생 촉진용 조성물로서 이요될 수 있다.

이식된 지방세포의 생착률 증진, 나아가 지방 재생 촉진을 위해, 조성물 내에서 메게스트롤 아세테이트의 1 일 투여량은 200 mg/kg 내지 1000 mg/kg로 설정될 수 있다. 그러나, 메게스트롤 아세테이트의 1 일 투여량은 이에 제한되는 것은 아니며, 목적 부위의 종류, 환자의 상태, 약물 형태, 투여경로, 목적하는 효과에 따라 다양하게 설정될 수 있다.

본 명세서 사용되는 용어, "1 일 투여량"은 진료, 치료 등을 목적으로 하루에 인체에 투여하는 물질의 양을 의미한다. 이때, 1 일 투여량은 환자의 체중 (kg) 에 비례하게 설정될 수 있다. 또한, 이식된 지방세포의 생착 증진용 조성물의 투여는 하루에 1 회 투여될 수 있고, 수회에 나누어 투여될 수 있다.

메게스트롤 아세테이트의 함량은, 조성물의 전체 질량에 대하여 1 질량 % 내지 10 질량 %일 수 있다. 그러나, 메게스트롤 아세테이트의 유효 함량은 이에 제한되는 것은 아니며, 본 발명의 일 실시예에 따른 이식된 지방세포의 생착 증진용 조성물 및 본 발명의 다른 실시예에 따른 지방재생 촉진용 조성물의 투여로 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 투여 대상이 되는 개체의 종류, 연령, 체중, 일반적인 건강 상태, 질병의 증세나 정도, 성별, 식이, 배설, 해당 개체에 동시 또는 다른 시기에 함께 사용되는 약물 기타 조성물의 성분 등을 비롯한 여러 인자 및 의약 분야에서 잘 알려진 유사 인자에 따라 다양해질 수 있다. 나아가, 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 목적하는 치료에 효과적인 메게스트롤 에세테이트의 함량을 용이하게 결정하고 처방할 수 있다.

한편, 본 발명의 일 실시예에 따른 이식된 지방세포의 생착 증진용 조성물은 경구 투여 형태를 가질 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 일 실시예에 따른 이식된 지방세포의 생착 증진용 조성물은 경구 투여를 위해 고형 제제, 액상 제제로 제조될 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 일 실시예에 따른 이식된 지방세포의 생착 증진용 조성물이 고형 제제로 제조되는 경우, 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제의 형태로 제조될 수 있다. 이러한 고형 제제는 1 개 이상의 부형제 예를 들어, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로오스, 락토오스 또는 젤라틴을 더 포함할 수 있다. 또한 고형 제제의 조성물은 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 등과 같은 윤활제들을 더 포함할 수 있다. 나아가, 본 발명의 일 실시예에 따른 이식된 지방세포의 생착 증진용 조성물이 액상 제제로 제조되는 경우, 수용액, 현탁액 및 약학적으로 허용 가능한 지방 및 오일, 알코올 또는 유기 용매뿐, 에스테르, 에멀젼, 시럽 또는 엘릭시르, 비발포성 과립으로부터 재구성된 현탁액, 및 발포성 과립으로부터 재구성된 발포성 제제의 형태로 제조될 수 있다. 이때, 액상 제제의 조성물은 불활성 담체와 결합하여 액상 투약 제형으로 경구 투여될 수 있다. 적절한 불활성 담체로는 에탄올, 글리세롤, 물과 같은 약학적으로 허용 가능한 불활성 담체가 있을 수 있다. 나아가, 액상 제제의 조성물은 용매, 방부제, 유화제, 현탁화제, 희석제, 감미제, 증점제 및 용융조제를 더 포함할 수 있다. 또한 환자 허용성 (patient acceptance) 을 증가시키기 위해 액상 제제의 조성물은 착색제 및 향미제를 더 포함할 수 있다.

한편, 메게스트롤 아세테이트는 지방 이식술에 있어서 결함이 있는 부위에 직접 투입될 수 있는, 지방 이식용 세포 치료제 조성물로서 이용될 수 있다.

이에, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 메게스트롤 아세테이트 및 지방세포를 포함하는, 지방 이식용 세포 치료제 조성물이 제공된다.

본 명세서 사용되는 용어, "지방 이식"은 어느 한 부위로부터 지방조직을 취하여 또 다른 부위에 이식하는 것을 포함하는 지방 이식술을 의미할 수 있다. 구체적으로, 지방 이식술은 안면 주름, 주름살, 곰보 자국과 같은 작은 결함 부위의 복구, 나아가 유방, 둔부 확대 및 재건등의 미용을 목적으로 하는 지방 이식 시술뿐만 아니라, 안면 등의 반흔에 의한 함몰, 방사선조사 등에 의한 연조직 손상으로 인한 변형, 안면반측 위축증이나 강피증 등의 변형, 하악부의 발육부전과 같은 연부 조직의 결손에 따른 외형적 결함의 치료를 목적으로 하는 지방 이식 시술을 포함할 수 있다. 그러나, 지방 이식은 이에 제한되는 것은 아니며, 외부로부터 지방조직 또는 지방세포를 이식하거나 지방세포 또는 지방줄기세포에 탈세포화 과정 등 세포에 특수한 조작을 가하여 얻어지는 물질을 주입하는 것을 포함하는 모든 행위를 포함할 수 있다.

본 명세서 사용되는 용어, "세포 치료제"는 세포와 조직의 기능을 복원하기 위하여 살아 있는 자가 (autologous), 동종 (allogenic), 이종 (xenogenic) 세포를 체외에서 증식, 선별하거나 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등 일련의 행위를 통하여 치료, 진단, 예방 목적으로 사용되는 모든 의약품을 의미할 수 있다. 본 명세서에서 세포 치료제는 결손된 지방조직의 복구를 위해, 결함부위 또는 그 인접부위에 이식될 수 있는 세포 그 자체를 의미할 수 있다. 이에 세포 치료제는, 표적 부위에 이식되어 결함을 복구하는 지방세포 및 지방 줄기세포일 수 있다. 이때, 세포 치료제는 이식된 세포의 생체 내 생존률, 나아가 생착률을 높여줄 수 있는 메게스트롤 아세테이트를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 세포 치료제 조성물 내에서 지방세포의 생체 내 생존률은, 메게스트롤 아세테이트를 처리하지 않은 지방세포의 생체 내 생존률보다 5 % 내지 10 % 높을 수 있다. 그러나, 생체내 생존률 증가 효과는 이에 제한되는 것은 아니며, 메게스트롤 아세테이트의 농도 등에 따라, 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 치료제 조성물 내에서 지방세포의 생체 내 생존률은 그렇지 않은 지방세포의 생체 내 생존률보다 2 배 내지 10 배 높을 수도 있다.

한편, 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 치료제 조성물에서 지방세포의 생착률의 증진을 위해 메게스트롤 아세테이트의 농도는 지방 이식용 세포 치료제 조성물에 대하여 5 μM 내지 50 μM일 수 있다 나아가, 지방세포는 지방 이식용 세포 치료제 조성물의 전체 부피에 대하여 1 X 10⁵ CFU/ml 내지 1 X 10⁷ CFU/ml일 수 있다. 그러나, 지방 이식용 세포 치료제 조성물 내에서의 메게스트롤 아세테이트의 농도 및 지방세포의 부피는 이에 제한되는 것은 아니며, 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 치료제 조성물의 투여로 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 투여 대상이 되는 개체의 종류, 연령, 체중, 일반적인 건강 상태, 질병의 증세나 정도, 성별, 식이, 배설, 해당 개체에 동시 또는 다른 시기에 함께 사용되는 약물 기타 조성물의 성분 등을 비롯한 여러 인자 및 의약 분야에서 잘 알려진 유사 인자에 따라 다양해질 수 있다. 나아가, 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 목적하는 치료에 효과적인, 메게스트롤 아세테이트의 농도 및 지방세포의 농도를 용이하게 결정하고 처방할 수 있다.

지방 이식용 세포 치료제 조성물은 정맥 주사, 근육내 주사, 피하 주사 또는 피내 주사를 위한 멸균 주사 용액의 형태로 제형화될 수 있고, 기관 내 및 피부 국소 도포를 위한 외용제 형태로 제형화될 수 있다. 그러나, 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 치료제 조성물의 제형은 이에 제한되는 것은 아니며, 목적하는 해당 부위에 세포 치료제 조성물들이 도달할 수 있는 한 임의의 투여 경로 및 투여 방식에 따라 다양한 형태로 제형화될 수 있다.

지방 이식용 세포 치료제 조성물이 멸균 주사 용액의 형태로 제형화되는 경우, 현탁제, 용해보조제, 안정화제, 등장화제, 보존제, 흡착방지제, 계면활성제, 희석제, pH 조정제, 무통화제, 완충제, 함황환원제, 산화방지제를 더 포함할 수 있다. 또한, 지방 이식용 세포 치료제 조성물이 외용제 형태로 제형화되는 경우, 조성물은 개별 치료제로서 기관 내 또는 피부에 도포되거나 다른 치료제와 병용하여 도포될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 지방 이식용 세포 치료제 조성물의 투여에 있어서 이상의 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 지방 이식용 세포 치료제 조성물의 투여량 및 도포량은 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 다만, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것에 불과하므로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것으로 해석되어서는 아니된다.

본 발명은, 이식된 지방세포에 대하여 생체 내에서의 높은 생착률을 제공하고, 과량의 지방 이식에 따른 부작용이 유발되지 않는 조성물을 제공함으로써, 안정적으로 임상에 적용할 수 있는 효과가 있다.

또한, 본 발명은 종래의 지방 이식술이 낮은 세포 생착률로 인해 재이식술이 필수임에 따라 발생되는 비용적 시간적 부담을 줄여줄 수 있는 효과가 있다.

본 발명은, 지방 이식이 필요한 부위에 직접적으로 적용 가능한 지방 이식용 세포 치료제 조성물을 제공함으로써, 신체 부피 대체물로 이용될 수 있는 효과가 있다. 이에, 이식 부위에 대하여 지방세포가 성숙함에 따라 이식세포의 부피가 점진적으로 증가될 수 있어, 본 발명은 연부 조직의 결손 및 외형적 결함의 치료에 효과적일 수 있다.

본 발명은, 지방줄기세포를 활성화시킴에 따라, 지방재생을 촉진하게 되고, 결과적으로, 지방생존량이 증가될 수 있는 효과가 있다.

또한, 본 발명은, 생체 내 생존률을 증가시킴에 따라 효과적인 지방 이식 결과를 제공할 수 있는, 조성물 내에서의 메게스트롤 아세테이트의 유효함량 및 1 일 투여량을 제공할 수 있는 효과가 있다.

본 발명에 따른 효과는 이상에서 예시된 내용에 의해 제한되지 않으며, 더욱 다양한 효과들이 본 명세서 내에 포함되어 있다.

도 1a는 본 발명의 다양한 실시예에 따른 조성물에 이용되는 메게스트롤 아세테이트 처리에 따른, 지방 줄기세포의 증식을 나타내는 결과이다.
도 1b는 본 발명의 다양한 실시예에 따른 조성물에 이용되는 메게스트롤 아세테이트 처리에 따른, 지방 줄기세포의 이동을 나타내는 결과이다.
도 1c는 본 발명의 다양한 실시예에 따른 조성물에 이용되는 메게스트롤 아세테이트 처리에 따른, 지방 줄기세포의 오일 레드 O 염색 결과 및 지방 축적률을 나타내는 결과이다.
도 2a는 본 발명의 다양한 실시예에 따른 조성물에 이용되는 메게스트롤 아세테이트 처리에 따른, 지방 줄기세포 내의 다양한 수용체의 발현 수준을 나타내는 결과이다.
도 2b 및 2c는 본 발명의 다양한 실시예에 따른 조성물에 이용되는 메게스트롤 아세테이트 처리에 따른, 지방 줄기세포 내의 글루티코르티코이드 수용체와 연관된 유전자의 발현 수준을 나타내는 결과이다.
도 2d는 본 발명의 다양한 실시예에 따른 조성물에 이용되는 메게스트롤 아세테이트와, 글루티코르티코이드 수용체의 siRNA 처리에 따른, 지방 줄기세포의 오일 레드 O 염색 결과 및 지방 축적률을 나타내는 결과이다.
도 2e는 본 발명의 다양한 실시예에 따른 조성물에 이용되는 메게스트롤 아세테이트와, 글루티코르티코이드 수용체의 siRNA 처리에 따른, 지방세포 마커 유전자의 발현 수준을 나타내는 결과이다.
도 3a는 본 발명의 다양한 실시예에 따른 조성물에 이용되는 메게스트롤 아세테이트 처리에 따른, 마우스의 몸무게, 이식된 지방의 무게 및 부피를 나타내는 결과이다.
도 3b는 본 발명의 다양한 실시예에 따른 조성물에 이용되는 메게스트롤 아세테이트 처리에 따른, 지방세포 이식 후 마우스로부터 채취한 지방조직의 H&E 염색 결과를 나타내는 결과이다.
도 3c는 본 발명의 다양한 실시예에 따른 조성물에 이용되는 메게스트롤 아세테이트 처리에 따른, 지방세포 이식 후 마우스로부터 채취한 지방조직내의 페릴리핀 (perilipin) 염색 결과를 나타내는 결과이다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나, 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.

이하에서는 실시예 1 내지 실시예 3을 참조하여, 본 발명의 다양한 실시예에 따른 조성물들에 이용되는 메게스트롤 아세테이트의 효과에 대하여 설명한다. 이때, 지방 줄기세포를 예를 들어 설명하였으나, 조성물들의 효과는 이에 제한되어 나타나지 않고 지방세포에 적용하였을 때도 동일하게 나타날 수 있다.

실시예 1: 메게스트롤 아세테이트의 지방 줄기세포의 세포 증식, 세포 이동 및 지방세포로의 분화 촉진의 효과

이하에서는, 도 1a 내지 도 1c를 참조하여 발명의 일 실시예에 따른 다양한 실시예에 따른 조성물들에 이용되는 메게스트롤 아세테이트의 지방 줄기세포의 증식, 세포 이동 및 지방세포로의 분화 촉진 효과에 대하여 구체적으로 설명한다.

도 1a는 본 발명의 다양한 실시예에 따른 조성물에 이용되는 메게스트롤 아세테이트 처리에 따른, 지방 줄기세포의 증식을 나타내는 결과이다.

본 실험에서는 5 x 10³ cell/well 밀도의 지방 줄기세포를 24시간 동안 배양한 48-웰 플레이트에, 메게스트롤 아세테이트 (MA) 를 1, 5, 10 및 50 μM의 농도로 48시간 처리한 후 셀 카운팅 키트-8 (cell countinf kit-8) 을 이용하여 증식된 세포 수를 측정하였다.

도 1a를 참조하면, 메게스트롤 아세테이트 (MA) 의 처리 농도가 증가됨에 따라, 지방 줄기세포의 증식률이 증가되는 것으로 나타난다. 특히, 메게스트롤 아세테이트의 처리 농도가 10 μM일 때, 지방 줄기세포의 세포수는 메게스트롤 아세테이트를 처리하지 않았을 때보다 약 1.5 배 높은 수준을 나타낸다. 이러한 결과는, 메게스트롤 아세테이트가 지방 줄기세포의 세포 증식을 증가시킨 다는 것을 의미할 수 있다.

도 1b는 본 발명의 다양한 실시예에 따른 조성물에 이용되는 메게스트롤 아세테이트 처리에 따른, 지방 줄기세포의 이동을 나타내는 결과이다.

본 실험을 위해 먼저 1.5 x 10⁴ cell/well 밀도의 지방 줄기세포가 배치된 트렌스웰 멤브레인 플레이트 (transwell membrane plate) 의 상부 챔버 에 16 내지 20 시간 동안, 0.2 %의 FBS를 함유하는 α-MEM 중의 메게스트롤 아세테이트 10 μM이 처리되었다. 이후 20 분 동안 아이스-콜드 메탄올을 처리하여 고정하였고, 그 다음 상온에서 30 분 동안 10 % 크리스탈 바이올렛 용액을 처리하여 세포를 고정하였다. 상부 챔버에 남아있는 세포는 코튼 면봉으로 제거되었고, 맴브레인의 아랫면에 남아있는 세포는 세포 이동의 측정을 위해 광학현미경을 이용하여 계수하였다.

도 1b의 (a) 및 (b)를 참조하면, 대조군에 비하여 메게스트롤 아세테이트를 처리한 플레이트 상에서 크리스탈 바이올렛 용액에 의해 고정된 지방 줄기세포의 수가 많은 것으로 나타난다. 도 1b의 (c)를 참조하면, 10 μM의 메게스트롤 아세테이트 처리 농도에서 세포 이동 배수의 변화는 대조군에 비하여 약 4배 이상 큰 것으로 나타난다. 이러한 결과는, 메게스트롤 아세테이트가 지방 줄기세포의 세포 이동을 증가시킨 다는 것을 의미할 수 있다.

도 1c는 본 발명의 다양한 실시예에 따른 조성물에 이용되는 메게스트롤 아세테이트 처리에 따른, 지방 줄기세포의 오일 레드 O 염색 결과 및 지방 축적률을 나타내는 결과이다.

본 실험을 위해 먼저 완전 배지를 포함하는 12-웰 플레이트에 4 x 10⁴ cell/well 밀도의 지방 줄기세포를 배양하였고, 융합 (confluent) 이후에 지방세포 유도 배지로 대체되었다. 그 다음 메게스트롤 아세테이트를 첨가한 후 2 주 동안 배양하였고, 분화된 지방세포를 관찰하기 위해 오일 레드 O 용액을 2 시간 동안 처리 한후, 세척하였다. 마지막으로, 염색된 지방세포는 30 분 동안 이소프로판올 (isopropanol) 을 처리하여 배양하였다. 이후, 마이크로 플레이트 리더 (microplate reader) 를 이용하여 492 nm 에서 염색된 세포를 관찰하였고, 지방 축적률을 측정하였다.

도 1c의 (a) 및 (b)를 참조하면, 대조군에 비해 메게스트롤 에세테이트를 처리한 플레이트 상에 분화된 지방세포의 수가 많은 것으로 관찰된다. 나아가, 도 1c의 (c)를 참조하면, 메게스트롤 아세테이트의 처리에 따른 지방 축적률이 대조군에 비하여 약 2 배 가량 높은 것으로 나타난다. 이러한 결과는, 메게스트롤 아세테이트가 지방 줄기세포에 대하여 지방세포로의 분화를 촉진한다는 것을 의미할 수 있다.

이상의 실시예 1의 결과로, 메게스트롤 아세테이트를 포함하는 본 발명의 일 실시예에 따른 다양한 조성물들은 이식된 조직 내에서 지방 줄기세포의 증식 및 세포 이동을 촉진하고 지방세포로의 분화를 촉진함으로써, 생체 내 생착률을 효과적으로 높일 수 있다.

실시예 2: 메게스트롤 아세테이트에 의한 지방 줄기세포 내의 글루코코르티코이드 수용체의 인산화 증가

이하에서는 도 2a 내지 2e를 참조하여, 본 발명의 다양한 조성물에서 이용되는 메게스트롤 아세테이트에 의한 지방 줄기세포 내의 글루코코르티코이드 수용체의 인산화 활성화에 대하여 설명한다.

도 2a는 본 발명의 다양한 실시예에 따른 조성물에 이용되는 메게스트롤 아세테이트 처리에 따른, 지방 줄기세포 내의 다양한 수용체의 발현 수준을 나타내는 결과이다.

본 실험에서는 메게스트롤 에세테이트 10 μM의 처리에 따른 줄기세포 내의 프로게스테론 수용체, 글루코코르티코이드 수용체, 미네랄로코르티코이드 수용체 및 안드로겐 코르티코이드 수용체의 mRNA의 발현 수준이 측정되었다.

도 2a의 (a)를 참조하면, 메게스트롤 에세테이트의 처리에 따라 핵 수용체 중 글루코코르티코이드 수용체의 mRNA의 발현 수준이 다른 핵 수용체의 mRNA의 발현 수준 보다 높은 것으로 나타난다. 도 2a의 (b)를 참조하면, 인산화된 글루티코르티코이드 수용체 (p-글루티코르티코이드) 의 수준이 증가된 것으로 나타난다. 이러한 결과는, 메게스트롤 아세테이트가 지방 줄기세포 내의 글루코코르티 수용체에 작용하여, 이의 인산화를 증가시킨 다는 것을 의미할 수 있다.

도 2b 및 2c는 본 발명의 다양한 실시예에 따른 조성물에 이용되는 메게스트롤 아세테이트 처리에 따른, 지방 줄기세포 내의 글루티코르티코이드 수용체와 연관된 유전자의 발현 수준을 나타내는 결과이다.

본 실험에서는 RT² 프로파일러 PCR 분석 (RT² profiler PCR array) 을 통해 글루티코르티코이드 수용체와 연관된 유전자의 발현 수준을 측정하였다.

도 2b를 참조하면, 메게스트롤 아세테이트 10 μM를 처리한 실험군에서, 글루티코르티코이드 수용체와 연관된 유전자들 중 ANGPTL4, DUSP1, ERRF11, FKBP5, GLUL 및 TSC22D3 유전자의 발현수준이 대조군에 비하여 약 2.5 배 증가된 것으로 나타난다. 보다 구체적으로 도 2c를 참조하면, 메게스트롤 아세테이트를 처리했을 때 지방 줄기세포 내에서의 DUSP1 유전자의 발현 수준은 대조군에 비하여 약 1.8 배 높은 것으로 나타나고, ERRF11 유전자의 발현 수준은 대조군에 비하여 약 5 배 높은 것으로 나타난다. 이러한 결과는, 메게스트롤 아세테이트가 지방 줄기세포 내의 글루코코르티코이드 수용체와 연관된 유전자의 발현 수준을 높이는 것을 의미할 수 있다.

도 2d는 본 발명의 다양한 실시예에 따른 조성물에 이용되는 메게스트롤 아세테이트와, 글루티코르티코이드 수용체의 siRNA 처리에 따른, 지방 줄기세포의 오일 레드 O 염색 결과 및 지방 축적률을 나타내는 결과이다. 도 2e는 본 발명의 다양한 실시예에 따른 조성물에 이용되는 메게스트롤 아세테이트와, 글루티코르티코이드 수용체의 siRNA 처리에 따른, 지방세포 마커 유전자의 발현 수준을 나타내는 결과이다.

본 실험에서는 글루코코르티코이드 수용체에 대한 siRNA (small interfering RNA) 가 이용된다. 보다 구체적으로, 지방 줄기세포가 48 웰 플레이트 또는 60 mm 디쉬에서 배양되었고, siRNA 50 μM의 혼합물을 지방 줄기세포에 투입시킨 후 24 시간 동안 배양한 후, qPCR을 이용하여 억제 (silencing) 를 평가하였다. 이때, 글루코코르티코이드 수용체에 대한 siRNA를 처리하지 않은 지방 줄기세포를 si대조군으로 설정하였고, 글루코코르티코이드 수용체에 대한 siRNA를 처리한 지방 줄기세포를 실험군 (siGR) 로 설정하였다.

도 2d의 (a) 내지 (d)를 참조하면, 메게스트롤 아세테이트를 첨가했을 때의 si대조군 (도 2d의 (b)) 과 대조적으로 siGR (도 2d의 (d)) 에서는 염색된 지방세포가 나타나지 않는다. 또한, 도 2d의 (e)를 참조하면, 메게스트롤 아세테이트의 처리했음에도, si대조군과 상이하게 siGR에서의 지방 축적률은 증가하지 않는 것으로 나타난다. 이는, siGR에 의해, 메게스트롤 아세테이트에 의해 유도되는 글루코코리티코이드 수용체의 인산화의 활성화가 저해된 것을 의미할 수 있다.

도 2e의 (a) 내지 (d)를 참조하면, si대조군과 대조적으로 지방세포 마커 유전자인 ADIPOQ, C/EBP-α, FABP4 및 PPAR-γ의 발현 수준이 현저하게 감소된 것을 알 수 있다. 이는, siGR에 의해, 메게스트롤 아세테이트에 의해 유도되는 지방세포의 증식 및 세포 이동이 저해됨에 따라 지방세포 마커 유전자의 발현이 감소된 것을 의미할 수 있다.

이상의 실시예 2의 결과로, 메게스트롤 아세테이트는 글루코코르티코이드 수용체에 작용함으로써 지방 줄기세포의 증식 및 세포 이동을 촉진하고 지방세포로의 분화를 촉진하는 것을 확인하였다. 이에, 메게스트롤 아세테이트를 포함하는 본 발명의 다양한 실시예에 따른 조성물들은 글루코코르티코이드 수용체의 인산화를 촉진함으로써, 이식된 지방세포의 생체 내 생착률을 높일 수 있다.

실시예 3: 생체 내에서의 메게스트롤 아세테이트에 의한 이식된 지방세포의 생착률 증강 효과

이하에서는 도 3a 내지 3c를 참조하여, 본 발명의 다양한 조성물에서 이용되는 메게스트롤 아세테이트에 의한 생체 내에서의 메게스트롤 아세테이트에 의한 이식된 지방세포의 생착률 증강 효과를 설명한다.

전술할 실험에서는, 마우스의 사타구니에서 1g의 지방을 취득해 동일한 마우스의 두피에 이식된 마우스 12 마리를 대조군으로, 대조군과 동일한 마우스에 메게스트롤 아세테이트를 2 주간 경구 복용시킨 마우스 12 마리를 실험군으로 설정하였다. 이식 후 6 주차에 실험군 및 대조군의 마우스를 희생시킨 후, 마우스로부터 분리한 지방에 대하여 지방세포의 생착률과 연관된 분석을 수행하였다.

도 3a는 본 발명의 다양한 실시예에 따른 조성물에 이용되는 메게스트롤 아세테이트 처리에 따른, 마우스의 몸무게, 이식된 지방의 무게 및 부피를 나타내는 결과이다.

도 3a의 (a) 내지 (c)를 참조하면, 6 주의 실험기간 동안 실험군 및 대조군 간의 통계적으로 유의한 몸무게 차이는 없는 것으로 나타난다. 나아가, 6 주차에 이식된 지방의 무게를 비교한 결과 메게스트롤 아세테이트를 투여한 실험군의 무게가 더 무거운 것으로 나타난다. 6 주차에 이식된 지방의 부피를 비교한 결과 메게스트롤 아세테이트를 투여한 실험군에서 통계적으로 유의하게 이식된 지방의 부피가 큰 것으로 나타난다. 이러한 결과는, 메게스트롤 아세테이트에 의해 마우스에 이식된 지방세포가 메게스트롤 아세테이트를 복용하지 않은 마우스에서보다 오랜 기간 동안 남아있음을 의미할 수 있다. 그 결과 이식된 지방세포의 세포 생착률 또한 메게스트롤 아세테이트를 복용한 마우스에서 보다 높을 수 있다.

도 3b는 본 발명의 다양한 실시예에 따른 조성물에 이용되는 메게스트롤 아세테이트 처리에 따른, 지방세포 이식 후 마우스로부터 채취한 지방조직의 H&E 염색 결과를 나타내는 결과이다.

본 실험에서는 비정상적인 지방조직의 염색을 위해 H&E 염색이 수행되었다.

도 3b를 참조하면, 실험군의 메게스트롤 아세테이트를 복용한 마우스로부터 채취한 지방조직에서보다, 대조군의 마우스로부터 취득한 지방조직에서 H&E 염색된 부위, 즉 비정상적인 지방세포가 많은 것으로 나타난다. 정상적인 지방세포에서 H&E의 염색이 어렵다는 점을 고려했을 때, 이상의 결과는 메게스트롤 아세테이트에 의해 6 주 동안 지방세포가 정상적인 지방조직의 형태로서 유지되고 보존된다는 것을 의미할 수 있다.

도 3c는 본 발명의 다양한 실시예에 따른 조성물에 이용되는 메게스트롤 아세테이트 처리에 따른, 지방세포 이식 후 마우스로부터 채취한 지방조직 내의 페릴리핀 염색 결과를 나타내는 결과이다.

본 실험에서는 지방세포의 생존성을 확인할 수 있는 페릴리핀 염색을 이용하였다.

도 3c를 참조하면, 대조군에 비하여 메게스트롤 아세테이트를 복용한 실험군으로부터 취득한 지방조직에서, 균일한 크기를 갖는 다량의 지방세포가 관찰된다. 이러한 결과는, 메게스트롤 아세테이트에 의해 이식된 지방세포가 높은 생존률을 보유하고 있음을 의미할 수 있다.

이상의 실시예 3의 결과로, 메게스트롤 아세테이트는 생체 내에서 이식된 지방세포를 정상적인 형태로 오랜 기간 동안 높은 생존률을 유지할 수 있도록 하는 것을 확인하였다. 이에, 메게스트롤 아세테이트는 생체 내에서 이식된 지방세포에 대하여 높은 생착률을 갖고 지방재생을 촉진하는 것에 기인할 수 있다. 따라서, 메게스트롤 아세테이트를 포함하는, 본 발명의 일 실시예에 따른 이식된 지방세포 생착 증진용 조성물은, 이식된 지방세포 특히 지방 줄기세포의 결함 부위로의 생착을 증신시킴으로써 지방 이식술의 치료 효과를 극대화 시킬 수 있다. 나아가, 본 발명의 일 실시예에 따른 메게스트롤 아세테이트 및 지방세포를 포함하는, 지방 이식용 세포 치료제 조성물은, 결함 부위에 직접 주입되어 높은 지방세포의 생착률을 제공함으로써 효과적인 세포 치료제로서 이용될 수 있다.

Claims (12)

1. 지방 이식술을 진행한 개체에 대한, 이식된 지방세포의 생착 증진용 조성물로서,
   메게스트롤 아세테이트 (megestrol acetate) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하고,
   상기 이식된 지방세포는, 상기 개체의 지방조직이 결손된 부위 및 연부 조직이 결손된 부위 중 적어도 하나의 부위에 이식된 지방세포이고,
   상기 이식된 지방세포의 생체 내 (in-vivo) 생존률은, 상기 메게스트롤 아세테이트가 투여되지 않은 개체에 이식된 지방세포의 생체 내 생존률 보다 5 % 내지 10 % 높은, 이식된 지방세포의 생착 증진용 조성물.
2. 제1항에 있어서,
   상기 조성물 내에서 상기 메게스트롤 아세테이트의 1 일 투여량은, 200 mg/kg 내지 1000 mg/kg인, 이식된 지방세포의 생착 증진용 조성물.
3. 제1항에 있어서,
   상기 메게스트롤 아세테이트의 함량은, 상기 조성물의 전체 질량에 대하여 1 질량 % 내지 10 질량 %인, 이식된 지방세포의 생착 증진용 조성물.
4. 제1항에 있어서,
   상기 조성물은 경구 투여 형태인, 이식된 지방세포의 생착 증진용 조성물.
5. 지방 이식이 필요한 부위에 적용 가능한, 지방 이식용 세포 치료제 조성물로서,
   메게스트롤 아세테이트 및 지방세포를 포함하고,
   상기 부위는, 지방조직이 결손된 부위 및 연부 조직이 결손된 부위 중 적어도 하나이고,
   상기 지방세포의 생체 내 (in-vivo) 생존률은, 메게스트롤 아세테이트를 처리하지 않은 지방세포의 생체 내 생존률보다 5 % 내지 10 % 높은, 지방 이식용 세포 치료제 조성물.
6. 제5항에 있어서,
   상기 지방세포는 지방 줄기세포인, 지방 이식용 세포 치료제 조성물.
7. 제5항에 있어서,
   상기 메게스트롤 아세테이트의 농도는 상기 조성물에 대하여 5 μM 내지 50 μM인, 지방 이식용 세포 치료제 조성물.
8. 삭제
9. 제5항에 있어서,
   상기 지방세포는 상기 조성물의 전체 부피에 대하여 1 X 10⁵ CFU/ml 내지 1 X 10⁷ CFU/ml인, 지방 이식용 세포 치료제 조성물.
10. 제5항에 있어서,
    상기 조성물은 정맥 주사, 근육내 주사, 피하 주사, 피내 주사, 기관내 및 피부 국소 도포 중 적어도 하나의 방법으로 투여되는 형태인, 지방 이식용 세포 치료제 조성물.
11. 삭제
12. 삭제

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