WO2005123902A1 - 無血清浮遊培養による胚性幹細胞の神経分化誘導法 - Google Patents

無血清浮遊培養による胚性幹細胞の神経分化誘導法 Download PDF

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WO2005123902A1
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stem cells
serum
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Yoshiki Sasai
Kiichi Watanabe
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Riken
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    • C12N5/0621—Eye cells, e.g. cornea, iris pigmented cells
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    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/02—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells

Definitions

  • the present invention relates to a method for inducing differentiation of embryonic stem cells, which comprises culturing embryonic stem cells as suspended aggregates in a serum-free medium, a cell culture obtained by the method, and the like.
  • Embryonic stem cells are a good candidate for a cell source for cell transplantation for Parkinson's disease-diabetes.
  • embryonic stem cells derived from mice and human primates often require co-existence with mouse-derived supporting cells (stroma cells) for culture and differentiation induction, which is a clinical application.
  • stroma cells mouse-derived supporting cells
  • mice and monkeys can produce dopamine-secreting neurons that are expected to be applied to transplantation therapy for Parkinson's disease, and motor neurons that are expected to be applied to amyotrophic lateral sclerosis.
  • an object of the present invention is to develop a highly practicable method that enables the induction of differentiation of embryonic stem cells, particularly the induction of differentiation into forebrain tissues such as telencephalic tissues.
  • the present inventors have proposed that forebrain tissues, especially telencephalic tissues could be induced only with low efficiency by the SDIA method and the multi-step fractionation method.1) Co-culture with a feeder cell in the SDIA method, 2) Addition of fibroblast growth factor (FGF) to the culture medium in a multi-stage method, 3) Treatment of serum of embryoid body and retinoic acid (RA) 1 Creating an environment in which it is difficult to induce differentiation of the forebrain Based on this hypothesis, we investigated the conditions for inducing embryonic stem cells in the absence of feeder cells, FGF, serum, and RA.
  • FGF fibroblast growth factor
  • RA retinoic acid
  • the present inventors have found that culturing suspension aggregates of embryonic stem cells in a serum-free medium can induce neural cells with high efficiency from ES cells, particularly, feeder cells, FGF, serum and Z.
  • ES cells particularly, feeder cells, FGF, serum and Z.
  • 85-95% of cells can be induced to differentiate into nervous system cells under the condition of the absence of RA and by optimizing other various culture conditions.
  • the present inventors have succeeded in efficiently guiding not only forebrain tissues such as telencephalic tissues and cerebellar tissues but also sensory organ cells.
  • the differentiation of embryonic stem cells can be induced without using animal-derived cells as an induction source, so that transplantation of cells obtained by culturing embryonic stem cells is reduced to the risk level of allogeneic transplantation it can. That is, the present invention is as follows:
  • the serum-free medium is a medium that substantially does not contain a No d a1 signonole promoter and / or a Wnt signainole promoter.
  • the serum-free medium is a medium substantially free of retinoic acid
  • Retinal cells having the ability to differentiate into photoreceptors induced to differentiate from ES cells.
  • INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention is useful from the viewpoint of application of cell therapy to neurodegenerative diseases, sensory organ diseases, and the like, because differentiation of neural cells and sensory organ cells can be efficiently induced.
  • the present invention is also intended to efficiently induce differentiation of forebrain tissue (particularly telencephalic tissue), which has been difficult with conventional differentiation methods, and to enable the induction of cerebellar M differentiation, which has been unsuccessful in the past.
  • the present invention is particularly useful from the viewpoint of application of cell therapy to diseases that have abnormalities in tissues such as forebrain tissue, cerebellar tissue, and retinal tissue, because it enables differentiation induction of retinal tissue that can be efficiently separated by the optic nerve. It is.
  • the present invention is further useful because it can induce differentiation of embryonic stem cells without using animal-derived cells as an induction source, and can reduce the transplantation of cells obtained by culturing embryonic stem cells to a risk level of allogeneic transplantation.
  • the present invention provides a method for inducing differentiation of embryonic stem cells, which comprises culturing embryonic stem cells as suspended aggregates in a serum-free medium.
  • a method for inducing differentiation of embryonic stem cells which comprises culturing embryonic stem cells as suspended aggregates in a serum-free medium.
  • embryonic stem cells refers to cells that can be cultured in vitro and have pluripotency that can be divided into all cells constituting a living body.
  • embryonic stem cells for example, cells derived from a warm-blooded animal, preferably a mammal can be used. Mammals include, for example, mice, rats, guinea pigs, hamsters, egrets, cats, dogs, sheep, pigs, horses, horses, goats, monkeys, and humans.
  • the embryonic stem cells used in the method of the present invention include, for example, embryonic stem cells (hereinafter, referred to as mammals) established by culturing early embryos before implantation.
  • mammals embryonic stem cells
  • embryonic stem cells I embryonic stem cells established by culturing early embryos produced by nuclear transfer of somatic cell nuclei
  • embryonic stem cells III Embryonic stem cells in which genes on the chromosomes of embryonic stem cells I or II have been modified using genetic engineering techniques.
  • embryonic stem cells I include embryonic stem cells established from the inner cell mass constituting the early embryo, EG cells established from primordial germ cells, and pluripotency of the early embryo before implantation A cell population (eg, primitive ectoderm) having the above, a cell isolated, or a cell obtained by culturing the cell.
  • a cell population eg, primitive ectoderm having the above, a cell isolated, or a cell obtained by culturing the cell.
  • Embryonic stem cells I can be prepared by culturing early embryos before implantation according to the method described in the literature (Manipulating the Mouse Embryo A Laboratory Manual, second edition, Cold Spring Haroor Laboratory Press (1994)). In monkey.
  • Embryonic stem cells II include, for example, Wilinut et al. (Nature, 385, 810 (1997)), Cibelli et al. (Science, 280, 1256 (1998)), Akira Iriya et al. (Protein nucleic acid enzyme, 44, 892 (1999)), Baguisi et al. (Nature Biotechnology, 17, 456 (1999)), Wakayama 3 ⁇ 4 (Nature, 394, 369 (1998); Nature Genetics, 22, 127 (1999); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 14984 ( 1999)), and the methods reported by Rideoutlll et al. (Nature Genetics, 24, 109 (2000)) and the like, for example, can be prepared as follows.
  • the medium in which the nucleus-providing cells are cultured can be cultured for 3 to 10 days from a medium containing 5 to 30%, preferably 10% of fetal calf serum (eg, M2 medium).
  • the cell cycle is quiescent (GO phase or G phase) by changing the culture to an oligotrophic medium containing fetal calf serum at 0 to 1%, more preferably 0.5 ° / 0 , preferably for 5 days. It can be initialized by inducing the first period.
  • the cells can be initialized by injecting the nucleus of the cell that provides the nucleus into an enucleated unfertilized egg of a mammal of the same species and culturing it for several hours, preferably for about 1 to 6 hours.
  • the reprogrammed nuclei are able to start developing in enucleated unfertilized eggs.
  • Several methods are known for initiating development of reprogrammed nuclei in enucleated unfertilized eggs.
  • the cell cycle is induced to a quiescent state (GO phase or G1 phase), and the initialized nucleus is transplanted into an enucleated unfertilized egg of the same mammal by electrofusion, etc., to activate the egg and develop You can get started.
  • the nuclei initialized by injecting nuclei into enucleated unfertilized eggs of the same mammal are transplanted to enucleated unfertilized eggs of the same mammal again by a method using a micromanipulator, etc.
  • an egg activating substance eg, strontium
  • a cell division inhibitor eg, cytochalasin B
  • Embryonic stem cells II can be produced, for example, by using homologous recombination technology.
  • genes on the chromosome that are modified in the production of embryonic stem cells II include genes for histocompatibility 14 antigens and disease-related genes based on disorders of nervous system cells. Modification of the target gene on the chromosome is performed using the Manipulating the Mouse Embryo A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory
  • a genomic gene of a target gene to be modified eg, a histocompatibility antigen gene or a disease-related gene
  • a target vector By introducing the prepared target vector into embryonic stem cells and selecting cells that have undergone homologous recombination between the target gene and the target vector, it is possible to produce embryonic stem cells with modified genes on the chromosome. it can.
  • Genome alker TM Kits manufactured by CL0NTECH
  • the genomic gene of the target gene can be isolated.
  • the target vector can be used in either a replacement type or an insertion type.
  • a selection method a method such as positive selection, promoter selection, negative selection, and polyselection can be used.
  • Examples of a method for selecting a target homologous recombinant from the selected cell lines include a Southern hybridization method and a PCR method for genomic DNA.
  • Embryonic stem cells can be obtained from a predetermined institution, or a commercially available product can be purchased.
  • human embryonic stem cells, KhES-], KhES-2 and KhES-3 are available from the Kyoto University Research Institute for Regenerative Medicine.
  • Embryonic stem cells can be maintained and cultured by a method known per se.
  • embryonic stem cells can be maintained by culture with feeder-free cells supplemented with fetal calf serum (FCS), Knockout TM Serum Replacement (KSR), and LIF.
  • FCS fetal calf serum
  • KSR Knockout TM Serum Replacement
  • differentiated cells of embryonic stem cells can be obtained.
  • the differentiated cells of embryonic stem cells may be any of endodermal, mesodermal, and ectodermal cells, but are preferably ectodermal cells.
  • Examples of the ectodermal cells include neural cells, epidermal cells, sensory organ cells, pigment cells, and neural crest-derived cannabis cells.
  • a cell obtained by the method of the present invention can be confirmed by a method known per se, for example, expression of a cell marker.
  • a cell obtained by the method of the present invention is an endoderm cell or a mesodermal cell depends on an endodermal cell marker-(for example, Soxl7, AFP), a mesodermal cell, Marker 1 (for example,
  • Neural cell markers include, for example, NCAM, Tu J1, tyrosine hydroxylase (TH), serotonin, nestin, MAP2, MAP2 ab, NeuN, GAB A, glutamate, ChAT, So x1.
  • epidermal cell markers eg, cytokeratin
  • sensory organ cell markers eg, IL-4
  • RPE RPE, rhodopsin), pigment cell markers (eg, TRP-1), and neural crest-derived mesenchymal cell markers (eg, SMA)
  • TRP-1 pigment cell markers
  • SMA neural crest-derived mesenchymal cell markers
  • nervous cells and sensory organ cells will be described in detail as examples of ectodermal cells that can be induced to differentiate by the method of the present invention.
  • Neural cells obtained by the method of the present invention include, for example, neural stem cells, neural cells, neural tube cells, neural crest cells, and the like.
  • Neural stem cells refer to cells that have the ability to differentiate into nerve cells, astrocytes and oligodendrocytes, and have a strong self-renewal ability. It has a function to supply strocytes and oligodendrocytes. Therefore, there are two methods for confirming that they are neural stem cells: a method of actually transplanting them into the brain to confirm their differentiation potential, and a method of inducing neural stem cells to differentiate into neural cells, astrocytes, and oligodendrocytes in vitro. Confirmation method and the like (Mol. Cell. Neuroscience, 8, 389 (1997); Science, 283, 534 (1999)).
  • neural stem cells having such functions can be stained with an anti-nestin antibody that recognizes the cytoskeletal protein nestin, a marker that has been confirmed to be expressed in neural progenitor cells (Science, 276, 66 (1997)). Therefore, neural stem cells can be confirmed by staining with an anti-nestin antibody.
  • a neuron is a cell having a function of receiving stimulation from another nerve cell or a stimulus receiving cell and transmitting the stimulus to another nerve cell, muscle or gland cell.
  • Nerve cells can be classified according to the difference in neurotransmitters produced by the nerve cells. For example, neurons are classified according to differences in secretory neurotransmitters. Neurons classified by these neurotransmitters include, for example, dopamine-secreting neurons, acetylcholine-secreting neurons, serotonin-secreting neurons, noradrenaline-secreting neurons, and adores Examples include narin-secreting neurons and glutamate-secreting neurons. Dopamine-secreting neurons, noradrenaline-secreting neurons, and adrenaline-secreting neurons are collectively called catecholamine-secreting neurons.
  • neural cells such as neural stem cells and neural cells obtained by the method of the present invention can be characterized by cell markers.
  • the nervous system cells obtained by the method of the present invention are soxyl at a high frequency, for example, about 80% or more, preferably about 80-90%.
  • the neural cells obtained by the method of the present invention are characterized by being positive for a forebrain nerve cell marker and a cerebellar nerve cell marker described later.
  • nerve cells can be classified according to the location where the nerve cells are located.
  • Nerve cells classified by these locations include, for example, forebrain nerve cells, midbrain nerve cells, cerebellar nerve cells, hindbrain nerve cells, and spinal cord nerve cells.
  • the method of the present invention can induce differentiation of any of these nerve cells, and particularly, can efficiently induce differentiation of forebrain nerve cells and cerebellar nerve cells.
  • forebrain nerve cells and cerebellar nerve cells will be described in detail.
  • forebrain nerve cells can be more efficiently induced to differentiate as nerve cells.
  • Forebrain neurons are neurons that exist in forebrain tissues (that is, tissues composed of telencephalon and diencephalon) or progenitor cells that are determined to differentiate into nerve cells that exist in forebrain tissues.
  • Forebrain neurons can be classified into telencephalic neurons and diencephalon neurons (eg, thalamic cells, hypothalamic cells). Telencephalic neurons can be further classified into dorsal cells (eg, cerebral cortical cells) and ventral cells (eg, cerebral basal nucleus cells).
  • telencephalic neurons can be efficiently induced among forebrain neurons.
  • the method of the present invention can efficiently induce differentiation of ventral telencephalic neurons among telencephalic neurons, and conversely, suppress differentiation into ventral forebrain neurons. it can.
  • the ventral telencephalic neurons refer to neurons present in the ventral telencephalic filaments, or progenitor cells determined to differentiate into neurons present in ventral telencephalic tissue.
  • the ventral telencephalic fibers include, for example, the basal ganglia.
  • ventral telencephalic neurons can be confirmed by a method known per se, for example, expression of a ventral telencephalic neuronal marker.
  • ventral telencephalic neuronal markers include basal ganglia neuronal markers (eg, Gsh2, Mash1) and hypothalamic neuronal markers (eg, Nkx2.1, Nkx2.2). No.
  • the method of the present invention can efficiently induce differentiation of dorsal telencephalic neurons among telencephalic neurons, and conversely, can suppress differentiation into dorsal forebrain neurons.
  • Dorsal telencephalic neurons refer to neurons present in dorsal telencephalic tissues or precursor cells that have been determined to differentiate into neurons present in dorsal telencephalic tissues.
  • the dorsal telencephalic tissue includes, for example, the cerebral cortex.
  • dorsal telencephalic neurons can be confirmed by a method known per se, for example, expression of a dorsal telencephalic neuronal marker.
  • the dorsal telencephalic neuronal markers include cerebral cortical neuronal markers (eg, Pax6, Em1).
  • forebrain nerve cells obtained by the method of the present invention can be characterized by a cell marker.
  • the forebrain neurons obtained by the method of the present invention have a high frequency, for example, about 10% or more, preferably about 10% to 50%, more preferably about 10% to 30%, and Bf1 It is positive.
  • Bf1 + cells can be induced from embryonic stem cells only at a frequency of about 1%, but Bf1 + cells can be obtained at a high frequency by the method of the present invention. That It has become possible.
  • the Bf1 + cells obtained by the method of the present invention for example, about 20% or more, preferably about 20 to 80%, more preferably about 20 to 50% of the cells may be Gsh-positive. Further, among the Bf1 + cells obtained by the method of the present invention, for example, about 5% or more, preferably about 5 to 50%, more preferably about 5 to 20% of the cells are NkX2.1 positive. Can be Furthermore, of the Bf1 + cells obtained by the method of the present invention, for example, about 10% or more, preferably about 10 to 90%, more preferably about 10 to 50% of the cells are Pax-positive. possible. In addition, of the Bf1 + cells obtained by the method of the present invention, for example, about 5% or more, preferably about 5 to 50%, more preferably about 5 to 20%, and most preferably about 10 to 20% % Of cells may be Emxl positive.
  • cerebellar nerve cells can be efficiently induced to differentiate as nerve cells.
  • Cerebellar nerve cells refer to nerve cells present in cerebellar tissue or precursor cells determined to differentiate into nerve cells present in cerebellar tissue. Examples of cerebellar nerve cells include cerebellar granule cells, Purkinje cells, and precursor cells of these cells. Although no report has been made so far on the successful induction of cerebellar nerve cell differentiation, the method of the present invention has made it possible to obtain cerebellar nerve cells.
  • cerebellar nerve cells can be confirmed by a method known per se, for example, expression of a cerebellar nerve cell marker.
  • cerebellar nerve cell markers include cerebellar granule cell markers (eg, Math1, Pax6, Zic1) and Purkinje cell markers (eg, L7).
  • Whether or not the cells obtained by the method of the present invention are cerebellar neurons can be confirmed by their phenotype. For example, whether the obtained cells are cerebellar granule cells or not can be determined by adhering to parallel fiber axons and being able to move, and by identifying that Z or T type axons are extending. You can check.
  • the cerebellar nerve cells obtained by the method of the present invention Can be characterized.
  • the cerebellar nerve cells obtained by the method of the present invention have a high frequency, for example, 30% or more, preferably about 30-60%, more preferably about 40% -50. It is Ma th with a frequency of / 0 .
  • Math 1+ cells obtained by the method of the present invention for example, about 40% or more, preferably about 40 to 60%, more preferably about 50% of the cells are positive for Pax6 and / or Zic1. possible. Further, among Math 1+ cells obtained by the method of the present invention, for example, about 40% or more, preferably about 40 to 80%, more preferably about 50 to 60% of the cells may be Ki 67 positive. .
  • sensory organ cells can be efficiently induced from embryonic stem cells.
  • Sensory organ cells refer to neural cells existing in the sensory organ, or progenitor cells that are determined to affect cells present in the sensory organ.
  • Sensory organ cells obtained by the method of the present invention include retinal cells, olfactory epithelial cells, and inner ear hair cells. Whether or not the cells obtained by the method of the present invention are sensory organ cells can be confirmed by a method known per se, for example, expression of a sensory organ cell marker.
  • Examples of sensory organ cells include Rx (retinal progenitor cells), Crx (photoreceptor cells), and rhodopsin (receptor cells).
  • retinal cells ie, retinal cells or precursor cells thereof
  • retinal cells can be efficiently induced among sensory organ cells.
  • sensory organ cells obtained by the method of the invention can be characterized by a cell marker.
  • the sensory organ cells obtained by the method of the present invention are Rx positive at a high frequency, for example, at a frequency of 5% or more, preferably about 5 to 20%, more preferably about 10% to 15%.
  • RX + cells obtained by the method of the present invention for example, about 1% or more, preferably about 1 to 10%, more preferably about 1 to 5% of cells are positive for Crx and Z or oral dopsin.
  • the retinal cells obtained by the method of the present invention can be visualized by tissue culture with retinal tissue. Differentiate efficiently into cells, for example, about 10% or more, preferably about 10.1. Rhodopsin positive rates of 30% (eg, about 20%) may be exhibited.
  • the retinal cells obtained by the method of the present invention also have the ability to invade the photoreceptor cell layer, and are about 30% or more, for example, about 30% to 50% (e.g., (Approximately 40%) may be rhodopsin positive, and may exhibit photoreceptor cell-specific morphology such as outer segment structure.
  • “Cultivating embryonic stem cells as suspended aggregates” means culturing a group of embryonic stem cells that have aggregated and formed a mass in a culture medium under conditions that are non-adherent to a cell incubator. .
  • suspension culture will be referred to as necessary.
  • embryonic stem cells When embryonic stem cells are cultured in suspension, it is necessary to use Z or efficient differentiation induction (e.g., for ectoderm cells such as neural cells and sensory organ cells) to facilitate the formation of suspended aggregates. It is preferable to perform the culture in the absence of feeder cells for differentiation induction).
  • Z or efficient differentiation induction e.g., for ectoderm cells such as neural cells and sensory organ cells
  • the medium used for suspension culture can be prepared using a medium used for culturing animal cells as a basal medium.
  • a basal medium for example, BME medium, BGJ medium, CMRL 1066 medium, Glasgow MEM medium, Improved MEM Zinc Option medium, IMDM medium, Medium 199 medium, Eagle MEM medium, ⁇ medium, DMEM medium, ham medium, RPMI 1640
  • the medium is not particularly limited as long as it can be used for culturing animal cells, such as a medium, Fischer's medium, and a mixed medium thereof.
  • the serum-free medium means a medium containing no conditioned or unpurified serum, and no medium containing a purified blood-derived component or an animal tissue-derived component (for example, a growth factor) is contained. It corresponds to serum medium.
  • the serum-free medium used in the suspension culture may contain, for example, a serum substitute.
  • Serum substitutes include, for example, albumin (eg, lipid-rich albumin), transferrin, fatty acids, insulin, collagen precursors, trace elements, 2-mercaptoethanol or 3 'thiodaldaricerol, or equivalents thereof. Etc. may be appropriately contained.
  • albumin eg, lipid-rich albumin
  • transferrin fatty acids
  • insulin eg. lipid-rich albumin
  • transferrin transferrin
  • fatty acids eg. lipid-rich albumin
  • insulin e.g, transferrin
  • fatty acids e.g, transferrin
  • insulin e.g., transferrin
  • fatty acids e.g., transferrin
  • fatty acids e.g., transferrin, fatty acids, insulin, collagen precursors, trace elements, 2-mercaptoethanol or 3 'thiodaldaricerol, or equivalents thereof. Etc. may
  • the serum-free medium used in the method of the present invention includes fatty acids or lipids, amino acids (eg, non-essential amino acids), vitamins, growth factors, cytokines, antioxidants,
  • 2-mercaptoethanol can contain 2-mercaptoethanol, pyruvic acid, buffering agents, and the like.
  • 2-mercaptoethanol is not limited as long as it is used at a concentration suitable for culturing embryonic stem cells, for example, about 0.05 to 1.0 mM, preferably about 0.1 to 0.5 mM, More preferably, it can be used at a concentration of about 0.2 mM.
  • the serum-free medium used for the suspension culture is not particularly limited as long as it is as described above. From the standpoint of avoiding the complexity of preparation while maintaining the above, a serum-free medium containing an appropriate amount of commercially available KSR (for example, 1-20%) is used as such a serum-free medium.
  • GMEM or dMEM 0.1 mM 2-mercaptoethanol, 0.1 mM non-essential amino acid Mix, 1 mM sodium pyruvate
  • GMEM or dMEM 0.1 mM 2-mercaptoethanol, 0.1 mM non-essential amino acid Mix, 1 mM sodium pyruvate
  • the incubator used for the suspension culture is not particularly limited as long as the suspension culture of the cells is possible.
  • the incubator is preferably non-adherent.
  • the non-cell-adhesive incubator those in which the surface of the incubator has not been artificially treated (for example, coated with an extracellular matrix or the like) for the purpose of improving the adhesion to cells can be used.
  • the concentration of embryonic stem cells at the start of culture can be appropriately set so as to form floating aggregates of embryonic stem cells more efficiently.
  • the concentration of embryonic stem cells at the start of culture The concentration is not particularly limited as long as it is a concentration capable of forming suspended aggregates of, for example, about IX 10 4 to about 5 ⁇ 10 5 cells Zm 1, preferably about 3 ⁇ 10 4 to about 1 ⁇ 10 5 cells m 1 Can be
  • the culture temperature is not particularly limited, but is, for example, about 30 to 40 ° C, preferably about 37X. Also, C0 2 concentration, for example about 1-10%, preferably about 5%.
  • the dispersed embryonic stem cells are placed in an appropriate medium (for example, 5% KSR, 100X essential amino acid solution 5 ml, 100 X pyruvate 5 ml and 1 X 10- 1 M 2- mercaptoethanol 0. 5 ml medium was added. may contain a suitable amount of such factors, which will be described later as needed.) And seeded in a non-adherent incubator at a cell concentration of 1 ⁇ 10 4 to 5 ⁇ 10 6 cells / ml, e.g., CO 2 insufflated with 5% CO 2 for 37 days for at least 5 days. There is a method of culturing in a cuvette.
  • an appropriate medium for example, 5% KSR, 100X essential amino acid solution 5 ml, 100 X pyruvate 5 ml and 1 X 10- 1 M 2- mercaptoethanol 0. 5 ml medium was added. may contain a suitable amount of such factors, which will be described later as needed.
  • the aggregates can be treated as they are or subjected to dispersion treatment (for example, trypsin ZEDTA treatment), and then the cells can be further cultured under adhesive conditions (hereinafter, abbreviated as adhesive culture as necessary).
  • adhesive culture it is preferable to use a cell-adhesive incubator, for example, an incubator coated with an extracellular matrix or the like (eg, poly-D-lysine, laminin, fibronectin).
  • culture temperature in the adhesion culture culture conditions such as co 2 concentration, Ru can be readily determined by one skilled in the art.
  • a known differentiation-inducing substance can be used in combination.
  • a known substance for inducing differentiation into neural cells can be used in combination.
  • Such differentiation inducers include, for example, NGF
  • suspension culture method and the combination method of suspension culture and adhesion culture it is possible to obtain fractionated cells such as ectodermal cells from embryonic stem cells by appropriately setting the culture period and the like. it can.
  • neural cells and sensory organ cells can be more efficiently induced to differentiate by appropriately further combining the methodologies described below.
  • Forebrain neurons can be induced to differentiate from embryonic stem cells by the above-mentioned suspension culture or, if necessary, by a combination of the above-mentioned suspension culture and adhesion culture.
  • the following methodology can be used in combination.
  • One methodology is substantially free of one, preferably two, and more preferably all selected from the group consisting of fibroblast growth factor (FGF), retinoic acid (RA), and a BMP signal enhancer Suspension culture of embryonic stem cells in a serum-free medium or a serum-free medium in which one, preferably two, and more preferably all are selected from the group consisting of FGF, RA, and BMP signal promoter are substantially inactivated. It is.
  • FGF fibroblast growth factor
  • RA retinoic acid
  • BMP signal enhancer Suspension culture of embryonic stem cells in a serum-free medium or a serum-free medium in which one, preferably two, and more preferably all are selected from the group consisting of FGF, RA, and BMP signal promoter are substantially inactivated. It is.
  • Such a methodology is useful, for example, in promoting differentiation into forebrain neurons (particularly telencephalic neurons).
  • the BMP signal promoter is not particularly limited as long as it can enhance BMP-mediated signal transduction.
  • Examples of the BMP signonole promoter include proteins belonging to the BMP family (eg, BMP2, BMP4, BMP7, GDF), BMP receptor, and Smad protein.
  • the serum-free medium A BMP signal enhancer for which contamination is not desired is BMP4.
  • One, preferably two, and more preferably a serum-free medium substantially free of one selected from the group consisting of FGF, RA and BMP signal enhancer is composed of FGF, RA and BMP signal enhancer
  • a serum-free medium containing no, preferably two, more preferably none selected from the group, or the formation of suspended aggregates of embryonic stem cells and / or the cultivation of the aggregates (for example, for the purpose of inducing differentiation) A serum-free medium containing these factors in an amount that does not adversely affect the culture.
  • Such a serum-free medium can be prepared, for example, by not adding the above factor as a medium component or removing the above factor from a medium containing the factor (for example, using anti-FGF antibody, anti-RA antibody, and anti-BMP antibody). Can be prepared.
  • a serum-free medium selected from the group consisting of FGF, RA and BMP signal promoters contain the above-mentioned factors.
  • the addition of the inhibitor to the serum-free medium reduces the activity of FGF, RA and BMP signal promoters to such an extent that they do not adversely affect the formation of suspended aggregates of embryonic stem cells and the culture of Z or the aggregates. Refers to lost serum-free medium.
  • a serum-free medium can be appropriately prepared by adding an appropriate inhibitor of FGF, RA, or BMP signal promoter to the medium.
  • the FGF inhibitor include an anti-FGF antibody, a soluble FGF receptor, and an FGF receptor inhibitor (eg, Su5402).
  • RA inhibitors include anti-RA antibodies, soluble RA receptors, and RA receptor inhibitors.
  • the BMP signal inhibitor include an anti-BMP antibody, a soluble BMP receptor, and a BMP receptor inhibitor.
  • Another methodology is suspension culture of embryonic stem cells in the presence of a Nodal signal inhibitor and / or a Wnt signal inhibitor.
  • Such methodologies include, for example, forebrain This is useful for improving and stabilizing the efficiency of differentiation into nerve cells (especially telencephalic nerve cells).
  • the combined use of a Nodal signal inhibitor and a Wnt signal inhibitor can be expected to further improve the effect.
  • the No d a1 signal inhibitor is not particularly limited as long as it can suppress No d a1 mediated signal transduction.
  • Nodal signal inhibitors include, for example, Lefty-A, Lefty-B, Lefty-1, Lefty-2, soluble No da1 receptor, Nodal antibody, and Nodal receptor inhibitor. Among them, Lefty-A is preferable.
  • the concentration of the Noda1 signal inhibitor used in the suspension culture can be a concentration that can promote the neuronal differentiation of the suspended aggregates or achieve the above-mentioned usefulness.
  • concentrations may be, for example, about 0.1 to 100 ⁇ g / m 1 for Lefty, preferably about 0.5 to 50 g / m 1, more preferably about 1.0 to: I 0 gZm 1, Preferably it can be about 5 g1.
  • the Nodal signal inhibitor may be already added to the medium at the start of embryonic stem cell culture, but may be added to the medium several days after culturing (for example, at or after 10 days of culturing). Preferably, the Nodal signal inhibitor is added to the medium at a time within 5 days of the culture.
  • the Wnt signal inhibitor is not particularly limited as long as it can suppress Wnt-mediated signal transduction.
  • Wnt signal ⁇ inhibitors include Dkk1, Cerberus protein, Wnt receptor inhibitor, soluble Wnt receptor, Wnt antibody, casein kinase inhibitor, dominant negative Wnt protein.
  • Dkk1 or Cerberus protein is preferred.
  • the concentration of the Wnt signal inhibitor used in the suspension culture may be such that it promotes menstrual differentiation of the suspended aggregates or achieves the above-mentioned usefulness.
  • a concentration can be, for example, about 0.05 to 20 / z gZml for Dkk1, preferably about 0,5.
  • the Wnt signal inhibitor may be added to the medium at the beginning of the culture of embryonic stem cells, but may be added to the medium several days after the culture (for example, within 10 days of the culture). Les ,. Preferably, the Wnt signal inhibitor is added to the medium at a time within 5 days of culture.
  • the suspension culture of embryonic stem cells can of course be performed in the absence of a Nodal signal inhibitor and a Z or Wnt signal inhibitor. It is also possible to switch these culture conditions during suspension culture.
  • Another methodology is a serum-free medium that is substantially free of Nodal signal promoter and Z or Wnt signal promoter, or Noda1 signal promoter and Z or Wnt signal promoter are substantially inactive.
  • This is a suspension culture of embryonic stem cells in a serum-free medium.
  • Such a methodology is useful, for example, in promoting differentiation into forebrain nerve cells (particularly telencephalic nerve cells).
  • a serum-free medium that is substantially free of Nodal signal promoter and Z or Wnt signal promoter is a serum-free medium that contains no Nodal signal promoter and / or no Wnt signal promoter, or embryonic Noda1 signal promoter and Z or Wnt signal in an amount that does not adversely affect the formation of floating aggregates of stem cells and z or the culture of the aggregates (for example, culture for differentiation induction).
  • a serum-free medium containing an accelerator refers to a serum-free medium containing an accelerator.
  • a serum-free medium that is substantially free of Nodal signal promoter and Z or Wnt signal promoter is, for example, the absence of Noda1 signal promoter and / or Wnt signal promoter as a medium component, or It can be prepared by removing the No da1 signal promoter and / or the Wnt signal promoter from the medium containing the No da1 signal promoter and the Z or Wnt signal promoter.
  • a serum-free medium in which the No da1 signal promoter and / or the Wnt signal promoter are substantially inactivated is defined as a No. 1 serum-free medium containing the Nodal signal promoter and / or the Wnt signal promoter.
  • the Nodal signal promoter is not particularly limited as long as it can enhance Nodal-mediated signal transduction.
  • Examples of Nodall signal nanoreceptors include Nodal, proteins belonging to the TGF0 family (eg, activin), Smad proteins, and activated Nodal receptors.
  • the No d a1 signal promoter whose contamination in the serum-free medium is not desired is No d a1.
  • the Wnt signal promoter is not particularly limited as long as it can enhance Wnt-mediated signal transduction.
  • the Wnt signal promoter include proteins belonging to the Wnt family (for example, Wnt 1 to 16), GSK3 inhibitors, Wnt receptors, and Li + ions.
  • the Wnt signal promoter that is not desired to be mixed into the serum-free medium is Wnt 3a.
  • the suspension culture of embryonic stem cells can of course be performed in the presence of a Nodal signal promoter and a Z or Wnt signal promoter. It is also possible to switch these culture conditions during suspension culture.
  • Another methodology is to continue the suspension culture for at least 5 days. Such a methodology is useful, for example, in promoting differentiation into forebrain neurons (particularly telencephalic neurons). It goes without saying that forebrain nerve cells can be induced to differentiate more efficiently than conventional methods, even if the culture is performed for less than 5 days.
  • Yet another methodology is suspension culture of embryonic stem cells in the presence of a Shh signal promoter. Such a methodology is useful, for example, in promoting differentiation into ventral telencephalic neurons and in suppressing differentiation into dorsal telencephalic neurons.
  • the Shh signal promoter is not particularly limited as long as it can enhance signaling transmitted by Shh.
  • Examples of the Shh signal enhancer include proteins belonging to the Hedgehog family (eg, Shh), Shh receptors, and Shh receptor agonists, with Shh being preferred.
  • the concentration of the Shh signal promoter used in the suspension culture may be such that the above-mentioned usefulness can be achieved.
  • concentrations are, for example, about 1.0-1000 nM, Preferably it may be about 5.0-500 nM, more preferably about 10-500 nM, most preferably about 30-300 nM.
  • the Shh signal promoter may be already added to the medium at the start of embryonic stem cell culture, but can be added to the medium after 2 days of suspension culture, preferably after 4 days of suspension culture.
  • the suspension culture of embryonic stem cells can of course be performed in the absence of a Shh signal promoter. It is also possible to switch these culture conditions during suspension culture.
  • Another methodology is suspension culture of embryonic stem cells in the presence of a Shh signal inhibitor. It is expected that the addition of the Shh signal promoter promotes the differentiation of embryonic stem cells into ventral forebrain neurons and suppresses the differentiation of embryonic stem cells into dorsal forebrain neurons. Therefore, it is considered that the use of a Shh signal inhibitor can be expected to have effects such as suppression of ventral forebrain neuronal cell differentiation and promotion of dorsal forebrain neuronal cell differentiation.
  • the Shh signal inhibitor is not particularly limited as long as it can enhance Shh-mediated signal transduction.
  • Examples of the Shh signal inhibitor include an antibody against the Shh signal promoter, a dominant negative mutant of the Shh signal promoter, a soluble Shh receptor, and an Shh receptor antagonist.
  • Shh antibodies and Shh dominant negative mutants are preferred.
  • the suspension culture of embryonic stem cells can of course be performed in the absence of a Shh signal inhibitor. It is also possible to switch these culture conditions during suspension culture.
  • Another methodology is to perform adherent culture after suspension culture of embryonic stem cells.
  • the cells can be subjected to adherent culture as is or after dispersion treatment (eg, trypsin / EDTA treatment).
  • dispersion treatment eg, trypsin / EDTA treatment
  • it is preferable to use a cell-adhesive incubator for example, an incubator coated with an extracellular matrix or the like (eg, poly-D-lysine, laminin, fibronectin).
  • the adherent culture can be performed, for example, for 1 day or more, preferably 1 to 14 S, more preferably 2 to 5 days.
  • Yet another methodology is to perform adherent culture after suspension culture in the presence of a Wnt signal promoter. Such a methodology is useful, for example, in promoting differentiation into dorsal telencephalic neurons and in suppressing differentiation into ventral telencephalic neurons.
  • Wnt signal promoters used for adhesion culture after suspension culture include proteins belonging to the Wnt family (eg, Wnt 3a), 033 inhibitors, ⁇ 1 t receptors, and Li + ions Among them, Wnt 3a is preferred.
  • the concentration of the Wnt signal promoter used in the adhesion culture after the suspension culture is not limited as long as the above-mentioned usefulness can be achieved, but, for example, about 0.1 to 500 for Wnt3a. ng / m and preferably about 1.0 ⁇ :! O OngZm1, more preferably about 5.0-50 ng Noml, most preferably about 50 ngZm1.
  • the Wnt signal promoter may be added to the medium at the beginning of the adherent culture, and may be added to the medium several days immediately after the adherent culture (for example, 4 days after the start of the adherent culture or within 10 days of the adherent culture). It may be added. Preferably, the Wnt signal promoter is added to the medium at a time within 5 days of the adherent culture.
  • telencephalic nerve cells e.g. telencephalic nerve cells, ventral telencephalic neurons, dorsal telencephalic neurons.
  • forebrain nerve cells or specific forebrain nerve cells e.g, telencephalic nerve cells, ventral telencephalic neurons, dorsal telencephalic neurons.
  • Cerebellar nerve cells can be induced to differentiate from embryonic stem cells by the above-mentioned suspension culture or, if necessary, by a combination of the above-mentioned suspension culture and adhesion culture.
  • the methodology described below can be used together from the viewpoint of improving the differentiation efficiency of cerebellar nerve cells.
  • One methodology is to use embryonic embryos in serum-free media that is substantially free of FGF and / or RA, or in serum-free media in which FGF and / or Z or RA are substantially inactivated. This is a suspension culture of stem cells. Such a methodology is useful, for example, when promoting differentiation into cerebellar nerve cells. The details of the methodology are as described above.
  • Another methodology is to continue the suspension culture for at least 5 days. Such a methodology is useful, for example, in promoting differentiation into cerebellar neurons. It goes without saying that cerebellar nerve cells can be induced to differentiate more efficiently than conventional methods, even if the culture is performed for less than 5 days.
  • Another methodology is suspension culture of embryonic stem cells in the presence of a Wnt signal promoter.
  • a Wnt signal promoter is useful, for example, in promoting differentiation into cerebellar nerve cells and specific cerebellar nerve cells (eg, cerebellar granule cells, cerebellar Purkinje cells).
  • the Wnt signal promoter is the same as described above.
  • the concentration of the Wnt signal promoter used in the suspension culture may be such that the above-mentioned utility can be achieved.
  • the concentration can be, for example, Wn t 3 about 0. l ⁇ 1000 ng / ml for a, preferably about 1. 0 ⁇ 1 00 ng / / ml, more rather preferably about 2. 0 ⁇ 50 ng / m 1 Most preferably, it may be about 5.0 to 50 ng / ml.
  • the Wnt signal promoter may be already added to the medium at the start of embryonic stem cell culture, or may be added to the medium several days after the culture.
  • the Wnt signal promoter is added to the medium at a time of 5 to 10 days of culture, preferably 5 to 8 days.
  • the suspension culture of embryonic stem cells can of course be performed in the absence of a Wnt signal promoter. It is also possible to switch these culture conditions during suspension culture.
  • Yet another methodology is suspension culture of embryonic stem cells in the presence of a BMP signal enhancer.
  • a BMP signal enhancer is useful for promoting differentiation into cerebellar nerve cells and specific cerebellar nerve cells (eg, cerebellar granule cells, cerebellar Purkinje cells).
  • the BMP signal promoter is the same as described above.
  • the concentration of the BMP signal promoter used for the suspension culture may be such that the above-mentioned usefulness can be achieved.
  • a concentration is, for example, about 0. 0.1 to 1.0 nM, preferably about 0.05 to 1 nM, more preferably about 0.1 to 1.0 nM, most preferably about 0.5 to 1.0 nM.
  • the BMP signal promoter may be already added to the medium at the start of embryonic stem cell culture, or may be added to the medium several days after the culture.
  • the BMP signal promoter is added to the medium at a time of 5 to 10 days of culture, preferably 5 to 8 days.
  • Suspension culture of embryonic stem cells can also be performed in the absence of a BMP signal promoter. It is also possible to switch these culture conditions during suspension culture.
  • cerebellar nerve cells particularly cerebellar granule cells and cerebellar Purkinje cells
  • the above two methodologies can be combined. That is, suspension culture of embryonic stem cells in the presence of a Wnt signal promoter and a BMP signal promoter is also preferable.
  • FGF embryonic stem cells
  • FGF may be already added to the medium at the start of embryonic stem cell culture, but may be added to the medium several days after culture. For example, FGF is added to the medium at a time of 4 to 12 days in culture, preferably 5 to 10 days.
  • the suspension culture of embryonic stem cells can of course be performed in the absence of FGF. It is also possible to switch these culture conditions during suspension culture.
  • the concentration of FGF used in the suspension culture can be such that the above-mentioned utility can be achieved.
  • the concentration can be, for example, FGF for 8 b about 0. l ⁇ 500 ng / m 1, preferably from about 1 to 20,011 8 / / 1111, more preferably about 1 0 ⁇ 200 ng / m 1, and most preferably about 20 1100 ng / ml.
  • the aggregate can be used for adhesion culture as it is or after dispersion treatment (for example, trypsin ZEDTA treatment).
  • dispersion treatment for example, trypsin ZEDTA treatment
  • aggregates may be subjected to adherent culture.
  • a cell-adhesive incubator for example, an incubator coated with an extracellular matrix or the like (eg, poly-D-lysine, laminin, fibronectin).
  • an extracellular matrix or the like eg, poly-D-lysine, laminin, fibronectin.
  • it can be carried out for 1 day or more, preferably for 1 to 20 days, more preferably for 5 to 20 days, most preferably for 10 to 15 days.
  • cerebellar nerve cells or specific cerebellar nerve cells eg, cerebellar granule cells, cerebellar Purkinje cells.
  • cerebellar nerve cells or specific cerebellar nerve cells eg, cerebellar granule cells, cerebellar Purkinje cells.
  • the obtained cerebellar nerve cells can be further separated.
  • the obtained cerebellar nerve cells can be further separated. For example, as described in Example 9, after Math1 + cells are separated, they are aggregated with mammalian fetal or neonatal cerebellum dispersed cells and co-cultured to induce further differentiation.
  • the method of the present invention is extremely useful because it enables induction of various neural cells.
  • Sensory organ cells can be derived from embryonic stem cells by the above-mentioned suspension culture or, if necessary, by a combination of the above-mentioned suspension culture and adhesion culture.
  • One methodology is a serum-free medium substantially free of one, preferably two, more preferably all selected from the group consisting of FGF, RA and BMP signal promoter, or FGF, RA and BMP signal promoter
  • suspension culture of embryonic stem cells is performed in a serum-free medium, preferably two, and more preferably all of them are substantially inactivated.
  • Such a methodology is useful, for example, in promoting differentiation into sensory organ cells.
  • the details of the methodology are as described above.
  • Another methodology is to continue the suspension culture for at least 5 days.
  • Such a methodology is useful, for example, in promoting differentiation into sensory organ cells. Needless to say, sensory organ cells can be induced to differentiate more efficiently than conventional methods, even if the culture is performed for less than 5 days.
  • Another methodology is the addition of serum to a serum-free medium containing suspended aggregates of embryonic stem cells (cultured for several days). Such a methodology is useful, for example, in promoting differentiation into sensory organ cells (eg, retinal cells, visual cells).
  • sensory organ cells eg, retinal cells, visual cells.
  • Serum from any animal, preferably mammal, can be used as the serum.
  • the mammal from which the serum is derived is the same as the mammal from which the embryonic stem cells are derived (described above).
  • the concentration of serum is not limited as long as it can efficiently differentiate sensory organ cells, for example, about 0.5 to 30%, preferably about 1.0 to 20%, and more. Preferably it can be about 3-10%, most preferably about 5%.
  • the time when serum is added to a serum-free medium containing suspended aggregates of embryonic stem cells is not particularly limited as long as it can be used for sensory organ cells, for example, within 3 to 7 days from the start of suspension culture. It is. In addition, differentiation into sensory organ cells is possible even in the absence of serum. It is also possible to switch the conditions in the presence or absence of serum during the suspension culture.
  • Shh signal enhancers are added to serum-free media containing suspended aggregates of embryonic stem cells (cultured for several days). Such a methodology is useful, for example, in promoting differentiation into sensory cells (eg, retinal cells, visual cells).
  • the Shh signal promoter is the same as described above.
  • the concentration of the Shh signal promoter used in the suspension culture is not limited as long as the concentration of the Shh signal promoter can be promoted to sensory organ cells, and is, for example, about 0. 5-10OnM, more preferably about 1.0-50Nm, most preferably It can be about 3.0-30 nM.
  • the timing of adding the Shh signal promoter to the serum-free medium containing suspended aggregates of embryonic stem cells is not particularly limited as long as differentiation into sensory organ cells is possible, for example, within 7 days from the start of suspension culture (Eg, 3-7 days).
  • the differentiation into sensory organ cells can be performed even in the absence of a Shh signal promoter. It is also possible to switch the conditions in the presence or absence of the Shh signal promoter during the suspension culture.
  • Another methodology is suspension culture of embryonic stem cells in the presence of Noda1 signal promoters such as Noda1 and activin. Such a methodology is useful, for example, in promoting differentiation into sensory organ cells (eg, retinal cells, visual cells).
  • the Noda1 signal promoter is the same as described above.
  • the concentration of the Noda1 signal promoter used in the suspension culture may be a concentration that can produce sensory organ cells more efficiently. Such a concentration is, for example, about 1 to 10,000 ng Zml, preferably about 10 n! 10001000 ng / ml, more preferably about 20-500 ng / ml, most preferably about 50-200 ng / ml.
  • the time to add the No da1 signal enhancer to a serum-free medium containing suspended aggregates of embryonic stem cells is not particularly limited as long as differentiation into sensory organ cells can be performed. Within S (eg, after 3-7 days). The differentiation into sensory organ cells is possible even in the absence of the Noda1 signonole promoter. It is also possible to switch the conditions in the presence or absence of the Nodal signal promoter during the suspension culture.
  • Combination of serum and S hh signal promoter, combination of serum and No da1 signal promoter, combination of S hh signal promoter and Noda 1 signal promoter, serum and S hh signal promoter and N oda 1 signal Combinations of accelerators are also preferred.
  • Wnt signal inhibitors such as Dkk1 and / or Left
  • This is a suspension culture of embryonic stem cells in the presence of a No da1 signal inhibitor such as y-A.
  • a methodology is useful, for example, in promoting differentiation into sensory organ cells (eg, retinal cells, visual cells). Combinations of powerful methodologies are also preferred.
  • the Wnt signal inhibitor and the Nodal signal inhibitor are the same as described above.
  • the concentration of the Wnt signal inhibitor used in the suspension culture may be such that the above-mentioned utility can be achieved.
  • concentrations can be, for example, from about 0.01 to about LOk j gZml for Dkk1, preferably from about 0.1 to 10 ; ug / nil, more preferably from about 0.5 to 5.0 gZml, most preferably It can be about 1.0 / g / m1.
  • the concentration of the No da1 signal inhibitor used in the suspension culture may be such that the above-mentioned utility can be achieved.
  • Such a concentration is, for example, about 0.01 to 20 At g / m 1 for Lefty-A, preferably about 0.05 to 5; 81111, more preferably about 0.1 to 1. gZm. 1, most preferably about 0.5 z gZml.
  • the Wn ⁇ signal inhibitor and the No da1 signal inhibitor may be already added to the medium at the start of embryonic stem cell suspension culture, or may be added to the medium, for example, within 5 days after the start of culture. You may. Of course, they may be added to the medium at different times.
  • a combination of predetermined factors such as Lefty (eg, Lefty-A), Dkk1, serum, Suspension culture of embryonic stem cells in the presence of activin is also preferred.
  • the suspension culture of the embryonic stem cells can of course be performed in the absence of a Wnt signal inhibitor and / or a Noda1 signal inhibitor. It is also possible to switch these culture conditions during the suspension culture.
  • Another methodology is to perform adherent culture after suspension culture of embryonic stem cells.
  • the aggregate can be used for adhesion culture as it is or after dispersion treatment (for example, trypsin / EDTA treatment).
  • a cell-adhesive incubator for example, for example, it is preferable to use an incubator coated with an Itoda extracellular matrix or the like (for example, poly-D-lysine, laminin, fibronectin).
  • the period of the adhesion culture can be, for example, 1 S or more.
  • Yet another methodology is to perform long-term culture under adherent conditions after suspension culture. Such a methodology is useful for promoting differentiation into sensory organ cells, particularly photoreceptors.
  • the culture period for long-term culture is not particularly limited as long as it allows differentiation into sensory organ cells, but for example, for example, 3 days or more, preferably 5 to 25 days, more preferably 7 to 25 days. It can be for 20 days, most preferably 7 to 18 days.
  • the various methodologies described above can be applied and adapted to efficiently obtain sensory organ cells or specific sensory organ cells (for example, retinal cells, visual cells). For example, by combining methodologies that produce the same effect, better effects can be expected.
  • the method of the present invention is extremely useful because it enables differentiation induction of various sensory organ cells.
  • the present invention also relates to a cell culture obtained by the method of the present invention.
  • the cell culture of the present invention can be, for example, a floating aggregate of embryonic stem cells, a cell obtained by dispersing a floating aggregate, a cell obtained by culturing a dispersion-treated cell, and the like.
  • the present invention provides homogenous cells isolated and purified to such an extent that they can be administered to a subject from such a cell culture, for example, forebrain nerve cells such as telencephalic nerve cells, nervous system cells such as cerebellar nerve cells, and retina. Provide sensory organ nerve cells such as precursor cells.
  • the cells obtained by the method of the present invention are used for replenishing neural cells, for example, forebrain nerve cells, therapeutic agents for diseases based on disorders of sensory organ cells, or cell damage in other causes. And so on.
  • Diseases based on nervous system disorders include, for example, Parkinson's disease, spinocerebellar degeneration, Huntington's chorea, Alzheimer's disease, ischemic brain disease (eg, stroke), epilepsy, brain injury, spinal cord injury, motor nerve disease , Neurodegenerative diseases, retinitis pigmentosa, age-related macular degeneration, inner ear deafness, multiple sclerosis, amyotrophic lateral sclerosis, ⁇ illness caused by poison damage Illness and the like.
  • diseases based on disorders of forebrain nerve cells include, for example, Huntington's disease, Alzheimer's disease, ischemic brain disease (eg, stroke), and brain injury.
  • diseases based on cerebellar nerve cell disorders include spinocerebellar degeneration, alcoholic cerebellar degeneration, and cerebellar trauma.
  • diseases based on disorders of sensory organ cells include retinal pigment degeneration, macular degeneration, glaucoma, and diabetic retinopathy.
  • conditions in which replenishment of these cells is desired include after brain surgery (eg, after removal of a brain tumor).
  • nervous system cells and sensory system cells are used as a therapeutic agent for a disease based on the damage of the cells
  • the cells are transplanted into a subject after increasing the purity of the cells. Is preferred.
  • any known method for cell separation and purification can be used.
  • a method using a flow cytometer eg, Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988), Monoclonal Antibodies. "Principles and practice, Third Edition, Acad. Press (1993), Int. Immunol., 10, 275 (1998)), Banning method (for example, Monoclonal Antibodies and practice, Third Edition, Acad.Press (1993), Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL Pressat Oxford University Press (1996), J. Immunol., 141, 2797 (1988)), density differences in sucrose concentration (See, for example, Tissue Culture Technology (Third Edition), Asakura Shoten (1996)).
  • the method for increasing the purity of the differentiated cells of the present invention comprises a step of culturing cells obtained by inducing differentiation of the embryonic stem cells as described above, for example, neural cells and sensory organ cells in a medium containing an anticancer agent. including.
  • an anticancer agent include mitomycin C, 5-fluorouracil, adoriamycin, ara C, and methotrexate.
  • These anticancer agents are preferably used at a concentration that is more cytotoxic to cells in an undifferentiated state than cells in which differentiation has been induced.
  • the optimal concentration can be determined by performing culture using these anticancer agents in accordance with the culture method described above. using a medium containing at 1-1 times the concentration of 0 0 minutes, 5% of the diacid I inhibit carbon in aerated C 0 2 incubator for several hours at 3 7 ° C, a method is preferred properly cultured 2 hours Can be mentioned.
  • any medium can be used as long as it can culture the cells induced to differentiate.
  • the above-mentioned medium and the like can be mentioned.
  • cells of individuals who have provided somatic cells for example, neural cells and sensory organ cells can be obtained.
  • the cells of such individuals are not only effective as transplantation medicines themselves, but also useful as diagnostic materials for judging whether or not existing drugs are effective against the individuals.
  • susceptibility to oxidative stress and senescence can be determined by culturing the cells induced by elongation for a long period, and neurodegeneration can be determined by comparing the function and longevity with cells from other individuals.
  • the risk of an individual to a disease such as a disease can be evaluated, and the evaluation data is useful for providing an effective preventive method for a disease diagnosed as having a high future incidence.
  • Cells induced to differentiate from embryonic stem cells for example, nervous system cells, can be transplanted into a patient at a disease site by a method known per se (see, for example, Nature Neuroscience, 2, 1137 (1999)).
  • Example 1 Suspension cultures of ES cells aggregate in the absence of serum
  • mouse embryonic stem cells derived from E14
  • EB5 cells (Nature Genet., Vol. 24: 372) were used for serum-free floating culture (SFEB: Serum-free Floating culture of Embryoid body-like Aggregates). 2000)).
  • ES cells obtained by maintaining and culturing ES cells by a normal culture method using a single feeder-free cell supplemented with 1% fetal calf serum, 10% KSR (Knockout Serum Replacement), and LIF were used for the SFEB method.
  • KSR Keratin Serum Replacement
  • LIF LIF
  • GMEM 500 ml, 100 XNEAA 5 ml, 100 X pyruvate 5 ml, 1 X 10 _1 M 2 was used as the medium.
  • EB5 cells were cultured under adherence under the same conditions as in the SFEB method except that a gelatin-coated culture dish was used, and used as a control.
  • mouse ES cells in which GFP (green fluorescent protein) was knocked in by homologous recombination with the neural marker Soxl gene (hereinafter referred to as Soxl / GFP-mES cells Omitted Naure Biotechnology Vol. 21: 183-186 (2003)).
  • the culture conditions were the same as the SFEB method described in 1.1 above, except that Soxl / GFP-mES cells were used as ES cells.
  • Soxl / GFP-mES + cells increased for 3 to 5 days, while E-forcedherin + cells gradually decreased for the first 5 days. Similar results were obtained by immunostaining tests. Moreover, after 5 days of SFEB method, a 60- 85% of the cells are Soxl- GFP-positive, if you started in a range of 3 X 10 4 ⁇ 1 X 10 5 Initial cells / ml of culture, Soxl -High percentage of GFP + population (> 60%).
  • Example 2 Inhibition of endogenous Nodal and Wnt signals further improves the efficiency of ESEB differentiation into neural cells by SFEB method
  • the inventors of the present invention aimed to further enhance the efficiency of differentiation into neural cells by the SFEB method by inhibiting Nodal, Wnt, and BMP, which are differentiation promoters for mesodermal cells, It was decided whether the differentiation efficiency would be improved.
  • the eyes were added to the medium.
  • the concentrations used were Lefty-A; 5 ⁇ g / ml, Dkkl; 1 ⁇ g / ml, and BMPRIA-Fc receptobody; 1.5 / z g / ml, respectively.
  • the frequency of Soxl-GFP + cells was increased by addition of Lefty-A or Dkkl.
  • the absolute value of GFP expression fluctuated by about 10 to 15% from experiment to experiment even under the condition of the optimal initial cell density of 5 ⁇ 10 4 cells / ml.
  • the addition of Lefty-A or Dkkl stabilized the value of GFP expression.
  • the combined use of Lefty-A and Dkkl significantly reduced the frequency of Soxl-GFP + cells to about 90%.
  • the initial cell density is high (2 x 10 5 cells / ml)
  • the Soxl-GFP + cells were maintained at a high frequency (about 80%).
  • the addition of BMPRIA-Fc receptobody did not significantly affect the frequency of Soxl-GFP + cells.
  • Example 3 Analysis of neural differentiation mechanism by SFEB method
  • the present inventors determined on day 3 and day 4 of culture that the proportion of Soxl-GFP + cells was increasing, whether or not cell death was increasing in the non-neural population. J. Oncology, 1, 639-648 (1992)).
  • SFEB method enables ES cells to differentiate into telencephalic neurons with high efficiency
  • Mouse ES cells (EB5 cells) were subjected to serum-free suspension culture by SFEB method for 5 days in the same manner as in Example 1, then dispersed by trypsin'EDTA treatment, and seeded on a polyD lysine'laminin-coated cell culture slide. 2 days in differentiation medium (as above), GMEM + N2 medium (composition: GMEM + lxN-2 Supplement (manufactured by Gibco, diluted with xlOO concentration), 0.1 MM non-essential amino acid, 1 fflM The cells were cultured with sodium pyruvate (0.1 mM 2-mercaptoethanol) for 3 days. The finally obtained differentiated cells were analyzed by a fluorescent antibody method using an anti-Bfl antibody. For comparison, the nerve cells of ES cells were analyzed by the SDIA method and analyzed similarly by the fluorescent antibody method.
  • Antibodies to the markers include anti-Pax6 antibody (manufactured by DSHB), anti-Gsh2 antibody, and anti-Nkx2.1. Antibodies were used. As the anti-Gsh2 antibody and anti-Nkx2, l antibody, those prepared by immunizing a rabbit with a synthetic peptide were used.
  • the Bfl + cells As a result, of the Bfl + cells, about 40% of the cells expressed markers (Pax 6- positive) for the dorsal part of the cerebrum (the cerebral cortex, etc.), and 2 ⁇ % of the cells in the ventral middle part of the cerebrum (basal cerebrum) Nucleus, etc.) (Gsh2 positive) was expressed. In addition, about 10% of the cells expressed Nkx2.1 in the most ventral part of the telencephalon (occurring in the hypothalamus, etc.).
  • SFEB method can efficiently induce the differentiation of ES cells into telencephalic neurons, and can induce the differentiation of cells such as cerebral cortex, basal ganglia, and hypothalamus as telencephalic neurons.
  • telencephalic neurons can induce the differentiation of cells such as cerebral cortex, basal ganglia, and hypothalamus as telencephalic neurons.
  • Example 5 Differentiation of ES cells into telencephalic neurons is important during the first 5 days after culture
  • Bfl + cells occurred frequently (11%) when cultured for 5 days by the SFEB method, and then further cultured for 5 days by the SDIA method. Conversely, when cells were cultured for the first 5 days by the SDIA method and further cultured for 5 days in laminin'poly-D-lysine'fibronectin-coated dishes, only a few Bfl + cells were observed (2%).
  • Example 6 SFEB Method Induces Progenitor Cells in Caudal Tissue by Combined Use of Retinoic Acid Treatment
  • RA retinoic acid
  • the present inventors decided to test whether or not the expression of the partial region marker in SFEB fluctuated due to an exogenous patterning factor.
  • Shh R & D ⁇ M
  • telencephalic neurons induced by SFEB respond to Shh signaling in a manner similar to embryos.
  • ES cells were cultured for 5 days by the SFEB method to induce neuronal differentiation in the same manner as in Examples 4 and 6, followed by dissemination by trypsin'EDTA treatment and seeding on poly D-lysine / laminin-coated cell culture slides, followed by culture did.
  • Wnt3a was added at a concentration of 5 ng / ml or 50 ng / ml from day 6 and cultured for a total of 10 days. The number of cells positive for both Nkx2.1 and Bfl decreased significantly, while the number of cells positive for both dorsal telencephalic markers Pax6 and Bfl increased.
  • At 50 ng / ml Wnt3a about 75% of Bfl-positive cells expressed Pax6, a dorsal marker, and about 10% expressed Emxl, a marker of cerebral cortical progenitor cells .
  • Neural differentiation of ES cells was induced by the SFEB method in the same manner as in Example 4, except that serum-free suspension culture was maintained for 7 days. B27 supplement for 1 day culture from day 7
  • Suspension culture was maintained using Neurobasal (Gibco) medium supplemented with (Gibco). After 5 days until culture 8 days, 0.5 nM BMP4 (R & D), 10 ng / ml Wnt3a (R & D), and 50 ng / ml FGF8b (R & D) were added to the medium. Eight days after the start of the culture, the cell mass is directly or after dispersing by trypsin 'EDTA treatment, and then seeded on a polyD-lysine' laminin-coated cell culture slide, and adherent culture is performed using a Neurobasal medium with cascade supplemented with B27 supplement. Was.
  • Immunostaining performed on day 9 revealed many cells expressing markers Mathl, Pax6, and Zicl, which are specific to precursor cells of cerebellar granule cells. 40-50% of cells were Mathl positive ⁇ 4, of which more than 50% were Pax6 or Zicl positive. Furthermore, it is known that progenitor cells of cerebellar granule cells contain actively dividing cells, but about half of Mathl-positive cells expressed a dividing-specific cell marker, Ki67. . In addition, treatment of BMP and Wnt was essential for induction of such a granule cell marker, but treatment of FGF was not essential.
  • the culture that started adhesion culture with the cell mass on the eighth day of culture was cultured for a total of 20 days, and large neurons positive for cerebellar Purkinje cell-specific marker L7 were found in approximately 50% of the cell mass. It was confirmed that multiple (about 10) existed.
  • this differentiation induction efficiency is a combination of BMP4 and Wnt, when the combination with FGF8b was examined, unlike differentiation of granule cells, BMP4 was not present in cerebellar Purkinje cells. And FGF8b were also effective, with 14 cell counts increasing four-fold compared to the combination of BMP4 and Wnt.
  • Example 10 Induction of cerebellar neural progenitor cells by combination of BMP and Wnt
  • Example 11 1 Induction of differentiation of retinal progenitor cells by SFEB method
  • EB5 cells were subjected to serum-free suspension culture by the SFEB method for 5 days, and the cell mass was then intactly seeded onto a polyD-lysine 'laminin / fibronectin-coated cell culture slide to differentiate SFEB containing KSR
  • the cells were cultured in the medium for a total of 8 days.
  • immunostaining was performed using an antibody prepared by himself for the retinal progenitor cell-specific marker Rx, an Rx-positive cell population was confirmed in a cell mass (colony) of about 15 to 30 mm.
  • Treatment with 5% fetal bovine serum, 100 ng / ⁇ activin (manufactured by R & D), or 3-30 ri Shh between 3 and 5 days after the start of cultivation can increase the positive rate of Rx colonies by 50% (approx. 2 times).
  • separate culture on day 0-5;! / G / ml Dkkl and 0.5 ⁇ g / ml Lefty-A added about 70% of the cells became Rx-positive, and even at the cell level. About 10-15% of cells became positive.
  • serum or Shh or activin treatment was also possible, and the colony positive rate was further increased by about 5 to 10%.
  • Human embryonic stem cells were obtained from human blastocyst-derived embryonic stem cells established at the Norio Nakatsuji Laboratory of the Kyoto University Regenerative Medicine Laboratory, according to the guidelines for human ES cells. under 5% C0 2 Te, mouse embryonic fibroblasts (mitomycin treated with inactivated; MEF) were cultured and maintained on a plated plastic culture dishes. The culture medium used was based on D-MEM-F12 (Sigma D6421) and the final 20% KSR
  • the dissociated ES cell clumps were seeded at a rate of 3500 clumps in a 35 mm culture dish, and cultured for 15 days without serum.
  • Use 2 ml of differentiation induction medium mouse supplemented with the same G-MEM, KSR, and 2-mercaptoethanol; KSR was supplemented with 5%, 10%, or 20%).
  • KSR was supplemented with 5%, 10%, or 20%.
  • the Nodal inhibitor Lefty A (1 ⁇ g / ral)
  • the Wnt inhibitor Dkkl 500 ng / ml
  • the BMP inhibitor soluble BMPR1A-Fc (1. 5 // g / ml; all manufactured by R & D).
  • human ES cells could be cultured in serum-free suspended aggregates in the presence of 10% and 20% KSR. Proliferation was poor at 5% KSR, and many were killed by suspension culture for 15 days. Immunostaining after 5 days of adherent culture showed that almost all cell colonies were positive for the neural progenitor cell marker nestin and negative for the undifferentiated ES cell marker 0ct3 / 4. The cerebral progenitor cell marker Bfl was positive in 50% of the colonies. (Discussion)
  • the present inventors have successfully developed a method for culturing suspended aggregates that enables selective neural differentiation of ES cells in vitro.
  • the efficiency, speed, and manageability of this procedure are comparable to the SDIA method.
  • the SFEB method does not require the presence of feeder cells, serum, or growth factors with neural patterning activity (eg, FGF, BMP, Wnt). Rather, the efficiency of neural differentiation is even more enhanced when endogenous Wnt and Nodal signals are antagonized.
  • SFEB embryoid bodies
  • AFP and Hnf4 primordial germ layer markers
  • the mesodermal marker contained only a small number of Branchyury-positive cells.
  • ES cells cultured on a collagen-coated dish and treated with BMP are efficiently induced to differentiate into flkl + outer plates.
  • BMP treated ES cells, E- Ca d + / 0ct3 / 4- cells typically Hisoto endoderm
  • neural cells and sensory organ cells can be efficiently induced to differentiate, it is possible to apply cell therapy to neurodegenerative diseases, sensory organ diseases and the like.
  • forebrain tissues particularly telencephalic tissues
  • Differentiation induction Therefore, cell therapy can be applied to diseases in which forebrain tissue and cerebellar tissue are abnormal.
  • animal-derived cells are not used as an induction source, it is possible to reduce the transplantation of cells obtained by culturing embryonic stem cells to a risk level of allogeneic transplantation.
  • the present application is based on Japanese Patent Application No. 2004-181870, filed in Japan on June 18, 2004, the contents of which are incorporated herein by reference.

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Abstract

本発明は、臨床応用可能な胚性幹細胞の分化誘導法、特に胚性幹細胞からの前脳神経細胞の分化誘導法を提供する。より詳細には、本発明は、無血清培地において胚性幹細胞を浮遊凝集体として培養することを特徴とする、胚性幹細胞の分化誘導方法、特に、胚性幹細胞からの、前脳神経細胞、小脳神経細胞等の神経系細胞、感覚器系細胞の分化誘導法；無血清培地において胚性幹細胞を浮遊凝集体として培養することにより得られる、胚性幹細胞の浮遊凝集体；並びに、胚性幹細胞の浮遊凝集体に由来する細胞、特に前脳神経細胞、小脳神経細胞等の神経系細胞、網膜前駆細胞等の感覚器系細胞などを提供する。

Description

明細書
無血清浮遊培養による胚性幹細胞の神経分化誘導法
技術分野
本発明は、 無血清培地において胚性幹細胞を浮遊凝集体として培養することを 特徴とする、 胚性幹細胞の分化誘導方法、 当該方法により得られる細胞培養物な どに関する。
背景技術
胚性幹細胞は、 パーキンソン病ゃ糖尿病に対する細胞移植への細胞ソースの有 力な候補である。 しかし、 マウス、 ヒ トの霊長類に由来する胚性幹細胞も培養お よび分化誘導にマウス由来の支持細胞 （スト口一マ細胞） との共存が必要である ことが多く、 このことが臨床応用へ向けての大きな障壁となっている。
最近、 本発明者らは、 マウスやサルの胚性幹細胞から高効率で神経細胞へ分化 誘導する方法 （S D I A法） を開発した （国際公開 W001/088100号パンフレット、 国際公開 TO03/042384号パンフレット、 Kawasakiら， Neuron, vol. 28, p. 31- 40 (2000)、 Kawasakiら， Proceedings oi the National Academy of Sciences of the USA, vol. 99, p. 1580-1585 (2002)、 Mizusekiら， Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, vol. 100, p. 5828-5833 (2003)、 Ootoら， Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. , vol. 44, p. 2689-2693 (2003)参照） 。 この方法を用いて、 パーキンソン病の移植治療への 応用が期待されるドパミン分泌神経細胞、 筋萎縮性側索硬化症への治療応用が想 定されている運動ニューロンの試験管内産生にマウス、 サルの胚性幹細胞から成 功している （国際公開 W001/088100号パンフレット、 国際公開 W003/042384号パ ンフレット、 Kawasakiら， Neuron, vol. 28, p. 31-40 (2000)、 Kawasakiら， Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, vol. 99， p. 1580-1585 (2002)、 Mizusekiら， Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, vol. 100， p. 5828 - 5833 (2003)、 Ooto ら， Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. , vol. 4, p. 2689-2693 (2003)参照） 。 また、 胚性幹細胞から神経細胞を分化誘導する他の方法としては、 多段階分化法 が知られている （Lee ら， Nature Biotech. , vol. 18, p. 675-679 (2000)参照） 。 しかしながら、 S D I A法、 多段階分化法では、 ドパミン神経などの中脳組織 は効率良く分化誘導できるが、 終脳組織等の前脳組織は低効率でしか誘導できな かった。
以上のような背景から、 胚性幹細胞から終脳糸 fl^等の前脳糸！^を効率良く分ィヒ 誘導できる方法の開発が切望されていた。
発明の開示
従って、 本発明の目的は、 胚性幹細胞の分化誘導、 特に終脳組織等の前脳組織 への分化誘導を可能とする、 実用性の高い方法を開発することである。
本発明者らは、 S D I A法、 多段階分ィ匕法により前脳組織、 特に終脳組織が低 効率でしか分化誘導できなかった理由として、 1 ) S D I A法におけるフィーダ 一細胞との共培養、 2 ) 多段階法における線維芽細胞増殖因子 （F G F ) の培地 への添加、 3 ) 胚様体 （embryoid body) の血清及びレチノイン酸 （R A) 処理 1 前脳を分化誘導し難い環境を作っているとの仮説をもとに、 フィーダ一細胞、 F G F、 血清、 R Aの非存在下において胚性幹細胞の分ィヒ誘導条件を鋭意検討し た。 その結果、 本発明者らは、 無血清培地における胚性幹細胞の浮遊凝集体の培 養により、 E S細胞から神経系細胞を高効率で分化誘導できること、 特に、 フィ ーダー細胞、 F G F、 血清及び Z又は R Aの非存在下という条件により、 並びに 他の種々の培養条件を至適化することにより、 8 5〜9 5 %の細胞を神経系細胞 に分化誘導できることを見出した。 また、 同時に、 かかる条件下での培養により、 終脳組織等の前脳組織及び小脳組織のみならず、 感覚器系細胞を効率良く分ィ匕誘 導することにも成功した。 さらに、 この方法によれば、 誘導源として動物由来細 胞を使用することなく胚性幹細胞を分化誘導できるため、 胚性幹細胞の培養によ り得られる細胞の移植が同種移植のリスクレベルまで軽減できる。 即ち、 本発明 は下記の通りである：
( 1 ) 無血清培地において胚 14幹細胞を浮遊凝集体として培養することを特徴と する、 胚性幹細胞の分化誘導方法；
(2) 胚性幹細胞の浮遊凝集体がフィーダ一細胞の非存在下で培養される、 上記
(1) の方法；
(3) 胚性幹細胞の浮遊凝集体が、 No d a lシグナル阻害剤又は Wn tシグナ ル阻害剤の存在下で培養される、 上記 （1) の方法；
(4) 胚性幹細胞の浮遊凝集体が、 No d a lシグナル阻害剤及び Wn tシグナ ル阻害剤の存在下で培養される、 上記 （1) の方法；
(5) No d a lシグナル阻害剤が L e f t y— Aである、 上記 （3) 又は (4) の方法；
(6) Wn tシグナル阻害剤が Dk k 1である、 上記 （3) 又は （4) の方法；
(7) 無血清培地が、 No d a lシグナノレ促進剤及び/又は Wn tシグナノレ促進 剤を実質的に含有しない培地である、 上記 （1) の方法；
(8) 無血清培地が、 FGFを実質的に含有しない培地である、 上記 （1) 又は
(2) の方法；
(9) 無血清培地が、 レチノイン酸を実質的に含有しない培地である、 上記
(I) 又は （2) の方法；
(1 0) 無血清培地が、 BMPを実質的に含有しない培地である、 上記 （1) 又 は （2) の方法；
(I I) 培養開始時の胚性幹細胞の濃度が、 1 X 1 04〜5 X 1 05細胞/ m 1 である、 上記 （1) の方法；
(1 2) 胚性幹細胞の培養が、 細胞非接着性培養器中で行われる、 上記 （1) の 方法；
(1 3) 胚性幹細胞の浮遊凝集体が少なくとも 5日間培養されることを特徴とす る、 上記 （1) の方法；
(1 4) 神経系細胞の分化誘導方法である、 上記 （1) の方法；
(1 5) 胚性幹細胞の浮遊凝集体の培養後に、 接着培養することをさらに含む、 上記 （ 1 ) の方法； (1 6) 前 神経細胞の分化誘導方法である、 上記 （1) 又は （1 5) の方法；
(1 7) 終脳神経細胞の分化誘導方法である、 上記 (1) 又は （1 5) の方法；
(1 8) S h hシグナル促進剤の存在下で培養する、 上記 （1) 又は （1 5) の 方法；
(1 9) S h hシグナル促進剤が S h hである、 上記 （1 8) の方法；
(20) 腹側終脳神経細胞への分化を促進する方法である、 上記 （1) 又は （1 5 ) の方法；
(2 1) Wn tシグナル促進剤の存在下で接着培養を行う、 上記 （1 5) の方 法；
(22) Wn tシグナル促進剤が Wn t 3 aである、 上記 （2 1) の方法；
(23) 背側終脳神経細胞への分化を促進する方法である、 上記 （1) 又は （1 5) の方法；
(24) Wn tシグナル促進剤及ぴ _ 又は BMPシグナル促進剤の存在下で培養 する、 上記 （1) の方法；
(25) B MPシグナル促進剤及び/又は F G Fの存在下で培養する、 上記 (1) の方法；
(26) 小脳神経細胞の分化誘導法である、 上記 (1) 、 (24) 又は （25) の方法；
(2 7) 小脳顆粒細胞又は小脳プルキンェ細胞の分ィヒ誘導法である、 上記 （1) 、 (24) 又は （25) の方法；
(28) 無血清培地における胚性幹細胞の浮遊凝集体の培養中に血清を添加する ことを特徴とする、 上記 （1) の方法；
(2 9) S h hシグナル促進剤の存在下で培養する、 上記 （28) の方法；
(30) No d a lシグナル促進剤の存在下で培養する、 上記 （28) 又は （2 9) の方法；
(3 1) Wn tシグナル阻害剤及び/又は No d a 1シグナル阻害剤の存在下で 培養する、 上記 （28) 又は （29) の方法； (32) L e f t y— A、 D k k 1及びァクチビンの存在下で培養する、 上記 (28) の方法；
(33) 感覚器系細胞の分化誘導法である、 上記 （28) の方法；
(34) 網膜系細胞の分化誘導法である、 上記 （32) の方法；
(35) 無血清培地において胚性幹細胞を浮遊凝集体として培養することにより 得られる、 胚性幹細胞の浮遊凝集体；
(36) 上記 （1) 〜 （34) のいずれかの方法により得られうる細胞培養物；
(37) E S細胞から分化誘導された小脳神経細胞；
(38) 小脳顆粒細胞である、 上記 （37) の細胞；
(39) 小脳プルキンェ細胞である、 上記 （37) の細胞；
(40) ES細胞から分化誘導された、 視細胞への分化能を有する網膜系細胞。 本発明は、 神経系細胞、 感覚器系細胞を効率的に分化誘導できるため神経変性 疾患、 感覚器疾患等に対する細胞治療の応用という観点から有用である。 本発明 はまた、 従来の分化法では困難であった前脳組織 （特に終脳組織） を効率的に分 化誘導でき、 また、 従来成功し得なかった小脳 Mの分化誘導を可能とするとと もに、 視神経に効率良く分ィヒされ得る網膜組織の分化誘導を可能とするため、 前 脳組織、 小脳組織、 網膜組織等の組織に異常がある疾患に対する細胞治療の応用 という観点から特に有用である。 本発明はさらに、 誘導源として動物由来細胞を 使用することなく胚性幹細胞を分化誘導でき、 胚性幹細胞の培養により得られる 細胞の移植を同種移植のリスクレベルまで軽減できるため有用である。
発明を実施するための最良の形態
本発明は、 無血清培地において胚性幹細胞を浮遊凝集体として培養することを 特徴とする、 胚性幹細胞の分化誘導方法を提供する。 以下、 本発明の詳細を説明 する。
(1. 胚性幹細胞）
「胚性幹細胞 （ES細胞） 」 とは、 インビトロにおいて培養することが可能で、 かつ、 生体を構成するすべての細胞に分ィヒしうる多分化能を有する細胞をいう。 胚性幹細胞としては、 例えば温血動物、 好ましくは哺乳動物に由来する細胞を 使用できる。 哺乳動物としては、 例えば、 マウス、 ラット、 モルモット、 ハムス ター、 ゥサギ、 ネコ、 ィヌ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ゥマ、 ャギ、 サル、 ヒトが挙 tヂられる。
具体的には、 本発明の方法で用いられる胚性幹細胞としては、 例えば、 着床以 前の初期胚を培養することによって樹立した哺乳動物等の胚性幹細胞 （以下、
「胚性幹細胞 I」 と省略） 、 体細胞の核を核移植することによって作製された初 期胚を培養することによって樹立した胚性幹細胞 （以下、 「胚性幹細胞 I I」 と 省略） 、 および胚性幹細胞 I又は I Iの胚性幹細胞の染色体上の遺伝子を遺伝子 工学の手法を用いて改変した胚性幹細胞 （以下、 「胚性幹細胞 I I I」 と省略） が挙げられる。
より具体的には、 胚性幹細胞 Iとしては、 初期胚を構成する内部細胞塊より樹 立された胚性幹細胞、 始原生殖細胞から樹立された E G細胞、 着床以前の初期胚 の多分化能を有する細胞集団 （例えば、 原始外胚葉） 力、ら単離した細胞、 あるい はその細胞を培養することによって得られる細胞などが挙げられる。
胚性幹細胞 Iは、 着床以前の初期胚を、 文献 （Manipulating the Mouse Embryo A Laboratory Manual, second edition, Cold Spring Haroor Laboratory Press (1994) ) に記載された方法に従って培養することにより調製することがで さる。
胚性幹細胞 I Iは、 例えば、 Wilinutら （Nature, 385, 810 (1997) )、 Cibelli ら (Science, 280， 1256 (1998) )、 入谷明ら (蛋白質核酸酵素， 44, 892 (1999) ) 、 Baguisiら （Nature Biotechnology, 17, 456 (1999))、 Wakayama ¾ (Nature, 394, 369 (1998)； Nature Genetics, 22, 127 (1999)； Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96， 14984 (1999))、 Rideoutlllら （Nature Genetics, 24, 109 (2000) ) 等によって報告された方法を用いることにより、 例えば以下のよう に作製することができる。
哺乳類動物細胞の核を摘出後初期化 （核を再び発生を繰り返すことができるよ うな状態に戻す操作） し、 除核した哺乳動物の未受精卵に注入する方法を用いて 発生を開始させ、 発生を開始した卵を培養することによって、 他の体細胞の核を 有し、 力つ正常な発生を開始した卵が得られる。
体細胞の核を初期化する方法としては複数の方法が知られている。 例えば、 核 を提供する側の細胞を培養している培地を、 5〜3 0 %、 好ましくは 1 0 %の仔 ゥシ胎児血清を含む培地 （例えば、 M 2培地） から 3〜 1 0日、 好ましくは 5日 間、 0〜 1 %、 より好ましくは 0 . 5 °/0の仔ゥシ胎児血清を含む貧栄養培地に変 えて培養することで細胞周期を休止期状態 （G O期もしくは G 1期） に誘導する ことで初期化することができる。
また、 同種の哺乳動物の除核した未受精卵に、 核を提供する側の細胞の核を注 入し、 数時間、 好ましくは約 1〜6時間培養することで初期化することができる。 初期化された核は除核された未受精卵中で発生を開始することが可能となる。 初期化された核を除核された未受精卵中で発生を開始させる方法としては複数の 方法が知られている。 細胞周期を休止期状態 （G O期もしくは G 1期） に誘導し 初期化した核を、 電気融合法などによって同種の哺乳動物の除核した未受精卵に 移植することで卵子を活性化し発生を開始させることができる。
同種の哺乳動物の除核した未受精卵に核を注入することで初期化した核を、 再 度マイクロマユピュレーターを用いた方法などによって同種の哺乳動物の除核し た未受精卵に移植し、 卵子活性化物質 （例えば、 ストロンチウムなど） で刺激後、 細胞分裂の阻害物質 （例えば、 サイトカラシン Bなど） で処理し第二極体の放出 を抑制することで発生を開始させることができる。 この方法は、 哺乳動物が、 例 えばマウスなどの場合に好適である。
いったん発生を開始した卵が得られれば、 Manipulating the Mouse Embryo A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory
Press (1994)； Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993) ; バイオマ二ユアノレシリーズ 8ジーンターゲッティン グ， E S細胞を用いた変異マウスの作製， 羊土社 （1995) 等に記載の公知の方法 を用い、 胚性幹細胞を取得することができる。
胚性幹細胞 I I Iは、 例えば、 相同組換え技術を用いることにより作製できる。 胚性幹細胞 I I Iの作製に際して改変される染色体上の遺伝子としては、 例えば、 組織適合 14抗原の遺伝子、 神経系細胞の障害に基づく疾患関連遺伝子などがあげ られる。 染色体上の標的遺伝子の改変は、 Manipulating the Mouse Embryo A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory
Press (1994)； Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993)； バイオマ二ユアノレシリーズ 8ジーンターゲッティン グ， E S細胞を用いた変異マウスの作製， 羊土社 (1995) 等に記載の方法を用レ、、 行なうことができる。
具体的には、 例えば、 改変する標的遺伝子 （例えば、 組織適合性抗原の遺伝子 や疾患関連遺伝子など） のゲノム遺伝子を単離し、 単離したゲノム遺伝子を用い て標的遺伝子を相同組換えするためのターゲットベクターを作製する。 作製した ターゲットベクターを胚性幹細胞に導入し、 標的遺伝子とタ一ゲットベクターの 間で相同組換えを起こした細胞を選択することにより、 染色体上の遺伝子を改変 した胚性幹細胞を作製することができる。
標的遺伝子のゲノム遺伝子を単離する方法としては、 Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) や Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987- 1997)等に記載された公知の方法があげられる。 また、 ゲノム D N Aライ ブラリースクリ一ユングシステム （Genome Systems製）や Universal
Genome alker™ Kits (CL0NTECH製）などを用いることにより、 標的遺伝子のゲノ ム遺伝子を単離することができる。
標的遺伝子を相同組換えするためのターゲットベクターの作製、 及び相同組換 え体の効率的な選別は、 Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993)； パイォマニユアノレシリーズ 8ジーンタ一ゲッ ティング， E S細胞を用いた変異マウスの作製， 羊土社 （1995)等に記載の方法 にしたがって ί乍製することができる。 なお、 ターゲットベクターは、 リプレース メント型、 インサーシヨン型いずれでも用いることができ、 また、 選別方法とし ては、 ポジティブ選択、 プロモーター選択、 ネガティブ選択、 ポリ Α選択などの 方法を用いることができる。
選別した細胞株の中から目的とする相同組換え体を選択する方法としては、 ゲ ノム DNAに対するサザンハイブリダイゼーション法ゃ PCR法等があげられる。 また、 胚性幹細胞は、 所定の機関より入手でき、 また、 市販品を購入すること もできる。 例えば、 ヒト胚性幹細胞である KhES -】、 KhES-2及び KhES-3は、 京 都大学再生医科学研究所より入手可能である。
胚性幹細胞は、 自体公知の方法により維持培養できる。 例えば、 胚性幹細胞は、 ゥシ胎児血清 （FCS) 、 Knockout™ Serum Replacement (KSR) 、 L I Fを 添加した無フィーダー細胞による培養により維持できる。
(2. 本発明の方法により胚性幹細胞から分化誘導可能な細胞）
本発明の方法により、 胚性幹細胞の分化細胞を得ることができる。 胚性幹細胞 の分化細胞は、 内胚葉系細胞、 中胚葉系細胞、 外胚葉系細胞のいずれであっても よいが、 好ましくは外胚葉系細胞である。 外胚葉系細胞としては、 例えば、 神経 系細胞、 表皮系細胞、 感覚器系細胞、 色素細胞、 神経堤由来間菜細胞が挙げられ る。
本発明の方法により得られた細胞がいずれの細胞であるかは、 自体公知の方法、 例えば細胞マ一カーの発現により確認できる。 例えば、 本発明の方法により得ら れた細胞が内胚葉系細胞又は中胚葉系細胞であるか否かは、 内胚葉系細胞マーカ ― (例えば、 S o x l 7、 AF P) 、 中胚葉系細胞マーカ一 （例えば、
Brachyury, F 1 k 1、 Mo x) の発現により確認できる。
本発明の方法により得られた細胞が外胚葉系細胞であるか否かは、 例えば、 神 経系細胞マ一力一の発現により確認できる。 神経系細胞マーカーとしては、 例え ば、 NCAM、 Tu J 1、 チロシン水酸化酵素 （TH) 、 セロトニン、 ネスチン、 MAP 2, MAP 2 a b, Ne uN、 GAB A, グルタメート、 ChAT、 S o x 1が挙げられる。
また、 本発明の方法により得られた細胞が外胚葉系細胞である力否かは、 表皮 系細胞マーカー （例えば、 サイトケラチン） 、 感覚器系細胞マ一カー （例えば、
R P E、 ロドプシン） 、 色素細胞マーカー （例えば、 T R P— 1 ) 、 神経堤由来 間葉系細胞マーカー （例えば、 S MA) の発現により確認することもできる。 以下、 本発明の方法により分化誘導可能な外胚葉系細胞の例として、 神経系細 胞、 感覚器系細胞について詳述する。
( 2 . 1 . 神経系細胞）
本発明の方法により得られる神経系細胞としては、 例えば、 神経幹細胞、 神経 細胞、 神経管の細胞、 神経堤の細胞などが挙げられる。
神経幹細胞とは、 神経細胞、 ァストロサイト （astrocyte) およびオリゴデン ドロサイト （oligodendrocyte) に分ィヒしうる能力を有し、 力つ自己複製能力を 有する細胞をいい、 脳内において神経細胞、 ァストロサイト、 オリゴデンドロサ イトを供給する機能を有している。 従って、 神経幹細胞であることを確認する方 法としては、 実際に脳に移植してその分化能を確認する方法、 インビトロで神経 幹細胞を神経細胞、 ァストロサイト、 オリゴデンドロサイトに分化誘導させて確 認する方法などが挙げられる (Mol. Cell. Neuroscience, 8, 389 (1997)； Science, 283, 534 (1999))。 また、 このような機能を有した神経幹細胞は、 神 経前駆細胞での発現が確認されているマ一カーである細胞骨格蛋白質ネスチンを 認識する抗ネスチン抗体で染色可能である （Science, 276, 66 (1997) )。 従って、 抗ネスチン抗体で染色することにより神経幹細胞を確認することもできる。
神経細胞 （neuron) とは、 他の神経細胞あるいは刺激受容細胞からの刺激を受 け別の神経細胞、 筋あるいは腺細胞に刺激を伝える機能を有する細胞をいう。 神経細胞は、 神経細胞が産生する神経伝達物質の違いにより分類でき、 例えば、 分泌する神経伝達物質などの違いで分類されている。 これらの神経伝達物質で分 類される神経細胞としては、 例えば、 ドパミン分泌神経細胞、 アセチルコリン分 泌神経細胞、 セロトニン分泌神経細胞、 ノルアドレナリン分泌神経細胞、 ァドレ ナリン分泌神経細胞、 グルタミン酸分泌神経細胞などがあげられる。 ドパミン分 泌神経細胞、 ノルアドレナリン分泌神経細胞、 アドレナリン分泌神経細胞を総称 してカテコールァミン分泌神経細胞と呼ぶ。
あるいは、 本発明の方法により得られる神経幹細胞、 神経細胞等の神経系細胞 は、 細胞マーカーにより特徴付けることができる。 本発明の方法により得られる 神経系細胞は、 高頻度、 例えば約 8 0 %以上、 好ましくは約 8 0〜 9 0 %の頻度 で、 S o x l l^性である。 また、 本突明の方法により得られる神経系細胞は、 後 述する前脳神経細胞マーカー、 小脳神経細胞マーカ一が陽性であることを特徴と する。
別の観点では、 神経細胞は、 神経細胞が存在する部位の違いにより分類できる。 これらの存在部位で分類される神経細胞としては、 例えば、 前脳神経細胞、 中脳 神経細胞、 小脳神経細胞、 後脳神経細胞、 脊髄神経細胞などが挙げられる。 本発 明の方法はこれら任意の神経細胞を分化誘導できるが、 なかでも、 前脳神経細胞、 小脳神経細胞を効率的に分化誘導できる。 以下、 前脳神経細胞、 小脳神経細胞に ついて詳述する。
( 2 . 1 . 1 . 前脳神経細胞）
本発明の方法によれば、 神経細胞として前脳神経細胞、 特に終脳神経細胞がよ り効率的に分化誘導できる。 前脳神経細胞とは、 前脳組織 （即ち、 終脳及び間脳 から構成される組織） に存在する神経細胞、 あるいは前脳組織に存在する神経細 胞への分化が決定付けられている前駆細胞をいう。 前脳神経細胞は、 終脳神経細 胞、 間脳神経細胞 （例えば、 視床細胞、 視床下部細胞） に分類できる。 終脳神経 細胞はさらに、 背側細胞 （例えば、 大脳皮質細胞） 、 腹側細胞 （例えば、 大脳基 底核細胞） に分類できる。
本発明の方法により得られた細胞が前脳神経細胞であるか否かは、 自体公知の 方法、 例えば、 前脳神経細胞マーカ一の発現により確認できる。 前脳神経細胞マ —カーとしては、 O t X 1 (前脳） 、 B f 1 (終脳） 、 E m x 1 (終脳背側） 、 G s h 2及びN k x 2 . 1 (終脳腹側） などが挙げられる。 本発明の方法によれば、 前脳神経細胞のなかでも終脳神経細胞を効率的に分ィ匕 誘導できる。
一つの局面では、 本発明の方法は、 終脳神経細胞のなかでも、 腹側終脳神経細 胞を効率的に分化誘導でき、 また逆に、 腹側前脳神経細胞への分化を抑制するこ とができる。 腹側終脳神経細胞とは、 腹側終脳糸«に存在する神経細胞、 あるい は腹側終脳組織に存在する神経細胞への分化が決定付けられている前駆細胞をい う。 腹側終脳繊としては、 例えば、 大脳基底核が挙げられる。
本発明の方法により得られた細胞が腹側終脳神経細胞であるか否かは、 自体公 知の方法、 例えば、 腹側終脳神経細胞マーカーの発現により確認できる。 腹側終 脳神経細胞マーカーとしては、 例えば、 大脳基底核神経細胞マーカー （例えば、 G s h 2、 M a s h 1 ) 、 視床下部神経細胞マーカー （例えば、 N k x 2 . 1、 N k x 2 . 2 ) が挙げられる。
別の局面では、 本発明の方法は、 終脳神経細胞のなかでも、 背側終脳神経細胞 を効率的に分化誘導でき、 また逆に、 背側前脳神経細胞への分化を抑制すること ができる。 背側終脳神経細胞とは、 背側終脳組織に存在する神経細胞、 あるいは 背側終脳組織に存在する神経細胞への分化が決定付けられている前駆細胞をいう。 背側終脳組織としては、 例えば、 大脳皮質が挙げられる。
本発明の方法により得られた細胞が背側終脳神経細胞であるか否かは、 自体公 知の方法、 例えば、 背側終脳神経細胞マーカーの発現により確認できる。 背側終 脳神経細胞マーカーとしては、 例えば、 大脳皮質神経細胞マーカー （例えば、 P a x 6、 E m 1 ) が挙げられる。
あるいは、 別の観点では、 本発明の方法により得られる前脳神経細胞 （特に、 終脳神経細胞） は、 細胞マーカーにより特徴付けることができる。 本発明の方法 により得られる前脳神経細胞は、 高頻度、 例えば約 1 0 %以上、 好ましくは約 1 0〜 5 0 %、 より好ましくは約 1 0 %〜 3 0 %の頻度で、 B f 1陽性である。 従 来の S D I A法では、 約 1 %の頻度でしか、 胚性幹細胞から B f 1 +細胞を分ィ匕 誘導できなかったが、 本発明の方法により、 高頻度で B f 1 +細胞を得ることが 可能となった。
本発明の方法により得られる B f 1+細胞のうち、 例えば約 20%以上、 好ま しくは約 20〜 80 %、 より好ましくは約 20〜 50 %の細胞が、 G s h陽性で あり得る。 また、 本発明の方法により得られる B f 1+細胞のうち、 例えば約 5 %以上、 好ましくは約 5〜 50 %、 より好ましくは約 5〜 20 %の細胞が、 N k X 2. 1陽性であり得る。 さらに、 本発明の方法により得られる B f 1+細胞 のうち、 例えば約 1 0 %以上、 好ましくは約 1 0〜 90 %、 より好ましくは約 1 0〜50%の細胞が、 P a x陽性であり得る。 また、 本発明の方法により得られ る B f 1 +細胞のうち、 例えば約 5 %以上、 好ましくは約 5〜 50 %、 より好ま しくは約 5〜20%、 最も好ましくは約 1 0〜20%の細胞が、 Emx l陽性で あり得る。
(2. 1. 2. 小脳神経細胞）
本発明の方法によれば、 神経細胞として小脳神経細胞が効率的に分化誘導でき る。 小脳神経細胞とは、 小脳組織に存在する神経細胞、 あるいは小脳組織に存在 する神経細胞への分化が決定付けられている前駆細胞をいう。 小脳神経細胞とし ては、 例えば、 小脳顆粒細胞、 プルキンェ細胞、 これら細胞の前駆細胞が挙げら れる。 小脳神経細胞の分化誘導に成功したという報告はこれまでになされていな かったが、 本発明の方法により、 小脳神経細胞を得ることが可能となった。
本発明の方法により得られた細胞が小脳神経細胞であるか否かは、 自体公知の 方法、 例えば、 小脳神経細胞マーカーの発現により確認できる。 小脳神経細胞マ 一力一としては、 例えば、 小脳顆粒細胞マーカ一 （例えば、 Ma t h 1、 P a x 6、 Z i c 1) 、 プルキンェ細胞マーカー （例えば、 L 7) が挙げられる。
また、 本発明の方法により得られた細胞が小脳神経細胞である力否かは、 その 表現型により確認できる。 例えば、 得られた細胞が小脳顆粒細胞であるか否かは、 平行線維軸索に接着して移動可能であること、 及び Z又は T型の軸索が伸長して いることを識別することで確認できる。
あるいは、 本発明の方法により得られる小脳神経細胞は、 細胞マーカーにより 特徴付けることができる。 本発明の方法により得られる小脳神経細胞は、 高頻度、 例えば 30%以上、 好ましくは約 30〜60%、 より好ましくは約 40%〜5 0。/0の頻度で、 Ma t h である。
本発明の方法により得られる Ma t h 1+細胞のうち、 例えば約 40%以上、 好ましくは約 40〜60%、 より好ましくは約 50%の細胞が、 P a x 6及び/ 又は Z i c 1陽性であり得る。 また、 本発明の方法により得られる Ma t h 1 + 細胞のうち、 例えば約 40 %以上、 好ましくは約 40〜 80 %、 より好ましくは 約 50〜 60 %の細胞が、 K i 67陽性であり得る。
(2. 2. 感覚器系細胞）
本発明の方法によれば、 胚性幹細胞から感覚器系細胞が効率的に分化誘導でき る。 感覚器系細胞とは、 感覚器に存在する神経細胞、 あるいは感覚器に存在する 細胞への分ィヒが決定付けられている前駆細胞をいう。 本発明の方法により得られ る感覚器系細胞としては、 網膜細胞、 嗅上皮細胞、 内耳有毛細胞が挙げられる。 本発明の方法により得られた細胞が感覚器系細胞であるカゝ否かは、 自体公知の 方法、 例えば、 感覚器系細胞マーカーの発現により確認できる。 感覚器系細胞マ 一力一としては、 例えば、 Rx (網膜前駆細胞） 、 C r x (視細胞） 、 ロドプシ ン （視細胞） が挙げられる。
本発明の方法によれば、 感覚器系細胞のなかでも網膜系細胞 （即ち、 網膜細胞 又はその前駆細胞） を効率的に分化誘導できる。
あるいは、 本発明の方法により得られる感覚器系細胞は、 細胞マーカーにより 特徴付けることができる。 本発明の方法により得られる感覚器系細胞は、 高頻度、 例えば 5 %以上、 好ましくは約 5〜 20 %、 より好ましくは約 1 0 %〜 1 5 %の 頻度で、 R x陽性である。
本発明の方法により得られる R X +細胞のうち、 例えば約 1 %以上、 好ましく は約 1〜 1 0 %、 より好ましくは約 1〜 5 %の細胞が、 C r x及び Z又は口ドプ シン陽性であり得る。
本発明の方法により得られる網膜系細胞は、 網膜組織との組織培養により、 視 細胞に効率良く分化し、 例えば約 1 0 %以上、 好ましくは約 1 0。1。〜 3 0 % (例、 約 2 0 %) のロドプシン陽性率を示し得る。 本発明の方法により得られる網膜系 細胞はまた、 視細胞層内への侵入能を有し、 視細胞内に侵入した細胞の約 3 0 % 以上、 例えば約 3 0 %〜5 0 % (例、 約 4 0 %) がロドプシン陽性であり得、 さ らに、 外節構造などの視細胞特異的な形態を示し得る。
( 3 . 無血清培地における胚性幹細胞の浮遊凝集体の培養方法）
胚性幹細胞を 「浮遊凝集体として培養する」 とは、 集合し塊を形成した胚性幹 細胞群を、 培養培地中において、 細胞培養器に対し非接着性の条件下で培養する ことをいう。 以下、 このような培養を、 必要に応じて浮遊培養と省略する。
胚性幹細胞を浮遊培養する場合、 浮遊凝集体の形成をより容易にするため、 並 びに Zあるいは、 効率的な分化誘導 （例えば、 神経系細胞、 感覚器系細胞等の外 胚葉系細胞への分化誘導） のために、 フィーダ一細胞の非存在下で培養を行うの が好ましい。
浮遊培養で用いられる培地は、 動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地と して調製することができる。 基礎培地としては、 例えば、 BME培地、 BGJ 培地、 CMRL 1066培地、 Glasgow MEM培地、 Improved MEM Zinc Option培地、 IMDM培地、 Medium 199培地、 Eagle MEM培地、 α ΕΜ培地、 DMEM培地、 ハム培地、 RPMI 1640培地、 Fischer' s培地、 およびこれらの混合培地など、 動物細胞の培養に 用いることのできる培地であれば特に限定されない。
胚性幹細胞を浮遊培養する場合、 培地としては無血清培地が用いられる。 ここ で、 無血清培地とは、 無調整又は未精製の血清を含まない培地を意味し、 精製さ れた血液由来成分や動物組織由来成分 （例えば、 増殖因子） が混入している培地 は無血清培地に該当するものとする。
浮遊培養で用いられる無血清培地は、 例えば、 血清代替物を含有するものであ り得る。 血清代替物は、 例えば、 アルブミン （例えば、 脂質リッチアルブミン） 、 トランスフェリン、 脂肪酸、 インスリン、 コラーゲン前駆体、 微量元素、 2—メ ルカプトエタノール又は 3 ' チオールダリセロール、 あるいはこれらの均等物な どを適宜含有するものであり得る。 かかる血清代替物は、 例えば、 W0 9 8 / 3 0 6 7 9記載の方法により調製できる。 また、 本発明の方法をより簡便に実施す るために、 血清代替物は市販のものを利用できる。 かかる市販の血清代替物とし ては、 例えば、 knockout Serum Replacement (,Κ S R) 、 Chemically-defined Lipid concentrated (Gibco ± ) 、 Glutamax (Gibco ± ) が挙げられる。
また、 本発明の方法で用いられる無血清培地は、 脂肪酸又は脂質、 アミノ酸 (例えば、 非必須アミノ酸） 、 ビタミン、 増殖因子、 サイトカイン、 抗酸化剤、
2—メルカプトエタノール、 ピルビン酸、 緩衝剤、 無 類等を含有できる。 例 えば、 2—メルカプトエタノールは、 胚性幹細胞の培養に適する濃度で使用され る限り限定されないが、 例えば約 0 . 0 5〜 1 . O mM、 好ましくは約 0 . 1 〜 0 . 5 mM、 より好ましくは約 0 . 2 mMの濃度で使用できる。
浮遊培養に用いられる無血清培地は、 上述したようなものである限り特に限定 されない。 し力しながら、 調製の煩雑さを回避するという観点からは、 かかる無 血清培地として、 市販の KSRを適量 （例えば、 1 -20%) 添加した無血清培地
(GMEM又は d MEM、 0 . 1 mM 2—メルカプトエタノール、 0 . 1 mM 非必須アミノ酸 M i x、 1 mMピルビン酸ナトリウム） を使用できる。
浮遊培養で用いられる培養器は、 細胞の浮遊培養が可能なものであれば特に限 定されないが、 例えば、 フラスコ、 組織培養用フラスコ、 ディッシュ、 ペトリデ ッシュ、 組織培養用ディッシュ、 マルチディッシュ、 マイクロプレート、 マイク ロウエノレプレー ト、 マノレチプレー ト、 マノレチウエノレプレー ト、 チャンパースライ ド、 シャーレ、 チューブ、 卜レイ、 培養パック、 ローラ一ボトルが挙げられる。 胚性幹細胞を浮遊培養する場合、 培養器は細胞非接着性であることが好ましい。 細胞非接着性の培養器としては、 培養器の表面が、 細胞との接着性を向上させる 目的で人工的に処理 （例えば、 細胞外マトリックス等によるコーティング処理） されていないものを使用できる。
培養開始時の胚性幹細胞の濃度は、 胚性幹細胞の浮遊凝集体をより効率的に形 成させるように適宜設定できる。 培養開始時の胚性幹細胞の濃度は、 胚性幹細胞 の浮遊凝^体を形成可能な濃度である限り特に限定されないが、 例えば、 約 I X 104〜約 5 X 105細胞 Zm 1、 好ましくは約 3 X 104〜約1 X 105細胞 m 1であり得る。
浮遊培養における培養温度、 CO 2濃度等の他の培養条件は適宜設定できる。 培養温度は、 特に限定されるものではないが、 例えば約 30〜40°C、 好ましく は約 37Xである。 また、 C02濃度は、 例えば約 1〜10%、 好ましくは約 5%である。
具体的には、 浮遊培養としては、 例えば、 胚性幹細胞の維持培養後、 分散処理 した胚性幹細胞を適切な培地 （例えば、 G l a s g ow MEM培地 500 m 1に 5%の KSR、 100 X非必須アミノ酸溶液 5 m l、 100 Xピルビン酸 5 mlおよび 1 X 10— 1 M 2—メルカプトエタノール 0. 5 m lを添加し た培地。 必要に応じて後述する因子などを適量含んでいてもよい。 ) に懸濁し、 細胞非接着性の培養器に、 1 X 104〜5X 106細胞/ m 1の細胞濃度で播種 し、 例えば、 少なくとも 5日間 37 で 5%の二酸化炭素を通気した CO 2イン キュベータ一にて培養する方法が挙げられる。
浮遊培養後、 凝集塊をそのまま、 あるいは分散処理 （例えば、 トリプシン ZE DTA処理） し、 次いで細胞を接着条件下でさらに培養できる （以下、 必要に応 じて接着培養と省略） 。 なお、 接着培養では、 細胞接着性の培養器、 例えば、 細 胞外マトリックス等 （例えば、 ポリ Dリジン、 ラミニン、 フイブロネクチン） に よりコーティング処理された培養器を使用することが好ましい。 また、 接着培養 における培養温度、 co2濃度等の培養条件は、 当業者であれば容易に決定でき る。
浮遊培養及び接着培養では、 既知の分化誘導物質を併用できる。 例えば、 胚性 幹細胞から神経系細胞を分化誘導する場合には、 既知の神経系細胞への分化誘導 物質を併用できる。 このような分化誘導物質としては、 例えば、 NGF
(Biochem. Biophys. Res. Commun. , 199, 552 (1994)) 、 レチノイン酸 (Dev. Biol., 168, 342 (1995); J. Neurosci. , 16, 1056 (1996)) 、 BMP阻害因子 (Nature, 376, 333-336 (1995)) 、 I GF (Genes & Development, 15, 3023-8 (2003)) が挙げられる。 また、 胚性幹細胞から感覚器系細胞を分化誘導する場合 には、 既知の感覚器系細胞への分化誘導物質を併用できる。 このような分化誘導 物質としては、 例えば、 FGF、 S h h、 血清などが挙げられる。
上述した浮遊培養法、 及び浮遊培養と接着培養との組合せ法によれば、 培養期 間等を適宜設定することで、 胚性幹細胞から外胚葉系細胞等の分ィヒ細胞を得るこ とができる。 しかしながら、 後述する方法論を適宜さらに組合せることで、 神経 系細胞、 感覚器系細胞をより効率的に分化誘導できる。
(3. 1. 神経系細胞の分化誘導）
神経系細胞として前脳神経細胞、 小脳神経細胞の分化誘導を例に挙げ、 より好 適な浮遊培養を行うために組合せるべき方法論を以下詳述する
(3. 1. 1. 前脳神経細胞の分化誘導）
前脳神経細胞は、 上述した浮遊培養により、 又は必要に応じて上述した浮遊培 養と接着培養との組合せにより胚性幹細胞から分化誘導できる。 好ましくは、 前 脳神経細胞の分化効率の向上 ·安定化等の観点から、 以下に述べる方法論を併用 できる。
一つの方法論は、 綠維芽細胞増殖因子 （FGF) 、 レチノイン酸 (RA) 及び BMPシグナル促進剤からなる群より選ばれる 1つ、 好ましくは 2つ、 より好ま しくは全てを実質的に含有しない無血清培地、 あるいは FGF、 RA及び BMP シグナル促進剤からなる群より選ばれる 1つ、 好ましくは 2つ、 より好ましくは 全てが実質的に不活化された無血清培地における、 胚性幹細胞の浮遊培養である。 かかる方法論は、 例えば、 前脳神経細胞 （特に終脳神経細胞） への分化を促進す る場合に有用である。
BMPシグナル促進剤は、 BMPにより媒介されるシグナル伝達を増強し得る ものである限り特に限定されない。 BMPシグナノレ促進剤としては、 例えば、 B MPファミ リーに属する蛋白 （例えば、 BMP 2、 BMP 4、 BMP 7、 GD F) 、 BMP受容体、 Sma d蛋白が挙げられる。 好ましくは、 無血清培地への 混入が所望されない BMPシグナル促進剤は、 BMP 4である。
FGF、 R A及び BMPシグナル促進剤からなる群より選ばれる 1つ、 好まし くは 2つ、 より好ましくは全てを実質的に含有しない無血清培地とは、 FGF、 RA及び BMPシグナル促進剤からなる群より選ばれる 1つ、 好ましくは 2つ、 より好ましくは全てを全く含有しない無血清培地、 あるいは胚性幹細胞の浮遊凝 集体の形成、 及び/又は当該凝集体の培養 （例えば、 分化誘導を目的とする培 養） に不利な影響を与えない程度の量でこれら因子を含有する無血清培地をいう。 かかる無血清培地は、 例えば、 培地成分としての上記因子の未添加、 または上記 因子を含有する培地からの上記因子の除去処理 （例えば、 抗 FGF抗体、 抗 RA 抗体、 抗 BMP抗体の使用） により調製できる。
FGF、 R A及び BMPシグナル促進剤からなる群より選ばれる 1つ、 好まし くは 2つ、 より好ましくは全てが実質的に不活ィヒされた無血清培地とは、 上記因 子を含有する無血清培地に対する阻害剤の添加により、 胚性幹細胞の浮遊凝集体 の形成、 及び Z又は当該凝集体の培養に不利な影響を与えない程度にまで FGF、 R A及ぴ BMPシグナル促進剤の活性が喪失した無血清培地をいう。 かかる無血 清培地は、 FGF、 RA、 BMPシグナル促進剤に対する阻害剤を適量培地に添 加することで適宜調製できる。 FGF阻害剤としては、 例えば、 抗 FGF抗体、 可溶型 FGF受容体、 FGF受容体阻害剤 （例えば、 Su 5402) が挙げられ る。 RA阻害剤としては、 例えば、 抗 RA抗体、 可溶型 RA受容体、 RA受容体 阻害剤が挙げられる。 BMPシグナル阻害剤としては、 例えば、 抗 BMP抗体、 可溶型 BMP受容体、 BMP受容体阻害剤が挙げられる。
なお、 胚性幹細胞の浮遊培養において、 FGF、 RA、 BMPシグナル促進剤 を含有する無血清培地、 あるいは FGF、 RA、 BMPシグナル促進剤が不活化 されていない無血清培地を使用することも勿論可能である。 また、 浮遊培養の途 中に、 これら培養条件を切り替えることも可能である。
別の方法論は、 No d a lシグナル阻害剤及び/又は Wn tシグナル阻害剤の 存在下における、 胚性幹細胞の浮遊培養である。 かかる方法論は、 例えば、 前脳 神経細胞 （特に終脳神経細胞） への分化効率を向上 ·安定化させる場合に有用で ある。 また、 No d a lシグナル阻害剤、 Wn tシグナル阻害剤の併用により、 さらに著しレ、効果が期待できる。
No d a l シグナル阻害剤は、 No d a lにより媒介されるシグナル伝達を抑 制し得るものである限り特に限定されなレ、。 No d a lシグナル阻害剤としては、 例えば、 L e f t y— A、 L e f t y— B、 L e f t y— 1、 L e f t y— 2、 可溶型 No d a 1受容体、 No d a l抗体、 No d a l受容体阻害剤が挙げられ るが、 なかでも、 L e f t y— Aが好ましい。
浮遊培養に用いられる No d a 1シグナル阻害剤の濃度は、 浮遊凝集体の神経 分化促進、 あるいは上記有用性を達成可能であるような濃度であり得る。 かかる 濃度は、 例えば L e f t yについては約 0. 1〜1 00〃 g/m 1、 好ましくは 約 0. 5〜50 g/m 1、 より好ましくは約 1. 0〜： I 0 gZm 1、 最も好 ましくは約 5 g 1であり得る。
No d a lシグナル阻害剤は、 胚性幹細胞の培養開始時に既に培地に添加され ていてもよいが、 培養数日後 （例えば、 培養 1 0日以內の時期） に培地に添加し てもよレ、。 好ましくは、 No d a 1シグナル阻害剤は、 培養 5日以内の時期に培 地に添加される。
Wn tシグナル阻害剤は、 Wn tにより媒介されるシグナル伝達を抑制し得る ものである限り特に限定されない。 Wn tシグナ^^阻害剤としては、 例えば、 D k k 1、 Cerberus蛋白、 Wn t受容体阻害剤、 可溶型 Wn t受容体、 Wn t抗 体、 カゼインキナーゼ阻害剤、 ドミナントネガティブ Wn t蛋白が挙げられる力 なかでも、 D k k 1又は Cerberus蛋白が好ましい。
浮遊培養に用いられる Wn tシグナル阻害剤の濃度は、 浮遊凝集体の祌経分化 促進、 あるいは上記有用性を達成可能であるような濃度であり得る。 かかる濃度 は、 例えば Dk k 1については約 0. 05〜20 /z gZm l、 好ましくは約 0.
1〜 ： 1 0 gZm 1、 より好ましくは約 0, 5〜5. 0 g 1、 最も好まし くは約 1 / gZm 1であり得る。 Wn tシグナル阻害剤は、 胚性幹細胞の培養開始時に既に培地に添カ卩されてい てもよいが、 培養数日後 （例えば、 培養 10日以内の時期） に培地に添力 Πしても よレ、。 好ましくは、 Wn tシグナル阻害剤は、 培養 5日以内の時期に培地に添加 される。
なお、 胚性幹細胞の浮遊培養は、 No d a lシグナル阻害剤及び Z又は Wn t シグナル阻害剤の非存在下で行うことも勿論可能である。 また、 浮遊培養の途中 に、 これら培養条件を切り替えることも可能である。
また別の方法論は、 No d a lシグナル促進剤及び Z又は Wn tシグナル促進 剤を実質的に含有しない無血清培地、 あるいは No d a 1シグナル促進剤及び Z 又は Wn tシグナル促進剤が実質的に不活ィヒされた無血清培地における、 胚性幹 細胞の浮遊培養である。 かかる方法論は、 例えば、 前脳神経細胞 （特に終脳神経 細胞） への分化を促進する場合に有用である。
No d a lシグナル促進剤及び Z又は Wn tシグナル促進剤を実質的に含有し ない無血清培地とは、 No d a lシグナル促進剤及び /又は Wn tシグナル促進 剤を全く含有しない無血清培地、 あるいは胚性幹細胞の浮遊凝集体の形成、 及び z又は当該凝集体の培養 （例えば、 分化誘導を目的とする培養） に不利な影響を 与えない程度の量の No d a 1シグナル促進剤及び Z又は Wn tシグナル促進剤 を含有する無血清培地をいう。 No d a lシグナル促進剤及び Z又は Wn tシグ ナル促進剤を実質的に含有しない無血清培地は、 例えば、 培地成分としての No d a 1シグナル促進剤及び/又は Wn tシグナル促進剤の未添加、 または No d a 1シグナル促進剤及ぴ Z又は Wn tシグナル促進剤含有培地からの No d a 1 シグナル促進剤及び 又は Wn tシグナル促進剤の除去処理により調製できる。 また、 No d a 1シグナル促進剤及び/又は Wn tシグナル促進剤が実質的に 不活化された無血清培地とは、 No d a lシグナル促進剤及び/又は Wn tシグ ナル促進剤含有無血清培地に対する No d a 1シグナル阻害剤及び Z又は Wn t シグナル阻害剤の添加により、 胚性幹細胞の浮遊凝集体の形成、 及び Z又は当該 凝集体の培養に不利な影響を与えない程度にまで No d a 1シグナル促進剤及び /又は Wn tシグナル促進剤の活性が喪失した無血清培地をいう。
No d a lシグナル促進剤は、 No d a lにより媒介されるシグナル伝達を増 強し得るものである限り特に限定されない。 No d a lシグナノレ促進剤としては、 例えば、 No d a l、 TGF0ファミ リーに属する蛋白 （例えば、 ァクチビン） 、 Sma d蛋白、 活性型 No d a 1受容体が挙げられる。 好ましくは、 無血清培地 への混入が所望されない No d a 1シグナル促進剤は、 No d a lである。
Wn tシグナル促進剤は、 Wn tにより媒介されるシグナル伝達を増強し得る ものである限り特に限定されない。 Wn tシグナル促進剤としては、 例えば、 W n tファミリーに属する蛋白 （例えば、 Wn t 1〜 1 6) 、 G S K 3阻害剤、 W n t受容体、 L i +イオンが挙げられる。 好ましくは、 無血清培地への混入が所 望されない Wn tシグナル促進剤は、 Wn t 3 aである。
なお、 胚性幹細胞の浮遊培養は、 No d a l シグナル促進剤及び Z又は Wn t シグナル促進剤の存在下で行うことも勿論可能である。 また、 浮遊培養の途中に、 これら培養条件を切り替えることも可能である。
また別の方法論は、 浮遊培養を少なくとも 5日間継続することである。 かかる 方法論は、 例えば、 前脳神経細胞 （特に終脳神経細胞） への分化を促進する場合 に有用である。 なお、 5日未満の培養であっても勿論、 前脳神経細胞を、 従来法 に比べ効率的に分化誘導できることは云うまでもなレ、。
さらに別の方法論は、 S h hシグナル促進剤の存在下における胚性幹細胞の浮 遊培養である。 かかる方法論は、 例えば、 腹側終脳神経細胞への分化を促進する 場合、 背側終脳神経細胞への分化を抑制する場合に有用である。
S h hシグナル促進剤は、 S h hにより媒介されるシグナル伝達を増強し得る ものである限り特に限定されない。 S h hシグナノレ促進剤としては、 例えば、 Hedgehogファミリーに属する蛋白 （例えば、 S h h) 、 S h h受容体、 S hh 受容体ァゴニストが挙げられるが、 なかでも、 S h hが好ましい。
浮遊培養に用いられる S h hシグナル促進剤の濃度は、 上記有用性を達成可能 であるような濃度であり得る。 かかる濃度は、 例えば約 1. 0〜1000 nM、 好ましくは約 5. 0〜500 nM、 より好ましくは約 10〜 500 nM、 最も好 ましくは約 30〜 300 nMであり得る。
S h hシグナル促進剤は、 胚性幹細胞の培養開始時に既に培地に添加されてい てもよいが、 例えば浮遊培養 2日後以降、 好ましくは浮遊培養 4日後以降に培地 に添力 IIできる。
なお、 胚性幹細胞の浮遊培養は、 S h hシグナル促進剤の非存在下で行うこと も勿論可能である。 また、 浮遊培養の途中に、 この培養条件を切り替えることも 可能である。
また別の方法論は、 S hhシグナル阻害剤の存在下における、 胚性幹細胞の浮 遊培養である。 Shhシグナル促進剤の添加により、 胚性幹細胞の腹側前脳神経 細胞への分化が促進されること、 胚性幹細胞の背側前脳神経細胞への分化が抑制 されること等が予想される。 従って、 Shhシグナル阻害剤を用いれば、 腹側前 脳神経細胞分化の抑制、 背側前脳神経細胞分化の促進等の効果が期待できると考 えられる。
Shhシグナル阻害剤は、 Shhにより媒介されるシグナル伝達を増強し得る ものである限り特に限定されない。 S h hシグナル阻害剤としては、 例えば、 S h hシグナル促進剤に対する抗体、 S h hシグナル促進剤のドミナントネガティ ブ変異体、 可溶型 S hh受容体、 S h h受容体アンタゴニス トが挙げられるが、 なかでも、 Shh抗体、 S h hドミナントネガティブ変異体が好ましい。
なお、 胚性幹細胞の浮遊培養は、 Shhシグナル阻害剤の非存在下で行うこと も勿論可能である。 また、 浮遊培養の途中に、 この培養条件を切り替えることも 可能である。
また別の方法論は、 胚性幹細胞の浮遊培養後に接着培養を行うことである。 凝 集塊をそのまま、 あるいは分散処理 （例えば、 トリプシン/ EDTA処理） 後に、 細胞を接着培養に供することができる。 なお、 接着培養では、 細胞接着性の培養 器、 例えば、 細胞外マトリックス等 （例えば、 ポリ Dリジン、 ラミニン、 フイブ ロネクチン） によりコーティング処理された培養器を使用することが好ましい。 接着培養は、 例えば 1日以上、 好ましくは 1〜14 S、 より好ましくは 2〜 5日 行うことができる。
さらに別の方法論は、 浮遊培養後の接着培養を、 Wn tシグナル促進剤の存在 下で行うことである。 かかる方法論は、 例えば、 背側終脳神経細胞への分化を促 進する場合、 腹側終脳神経細胞への分化を抑制する場合に有用である。
浮遊培養後の接着培養に用いられる Wn tシグナル促進剤としては、 例えば、 Wn tファミリーに属する蛋白 （例えば、 Wn t 3 a) 、 03 3阻害剤、 ^^1 t受容体、 L i +イオンなどが挙げられるが、 なかでも Wn t 3 aが好ましい。 浮遊培養後の接着培養に用いられる Wn tシグナル促進剤の濃度は、 上記有用 性を達成可能であるような濃度である限り限定されないが、 例えば、 Wn t 3 a については約 0. 1〜500 n g/mし 好ましくは約 1. 0〜：！ O O n gZm 1、 より好ましくは約 5. 0〜50 n gノ m l、 最も好ましくは約 50 n g Zm 1であり得る。
Wn tシグナル促進剤は、 接着培養開始時に既に培地に添加されてもよく、 接 着培養直後から数日後 （例えば、 接着培養開始 4日以降、 または接着培養 1 0日 以内の期間） に培地に添加してもよい。 好ましくは、 Wn tシグナル促進剤は、 接着培養 5日以内の時期に培地に添加される。
上述した各種方法論は、 前脳神経細胞、 あるいは特定の前脳神経細胞 （例えば、 終脳神経細胞、 腹側終脳神経細胞、 背側終脳神経細胞） を効率的に得るために適 宜組合せることができる。 例えば、 同一の効果を奏する方法論を組合せることで、 より優れた効果が期待できる。
(3. 1. 2. 小脳神経細胞の分化誘導）
小脳神経細胞は、 上述した浮遊培養により、 又は必要に応じて上述した浮遊培 養と接着培養との組合せにより胚性幹細胞から分化誘導できる。 好ましくは、 小 脳神経細胞の分化効率の向上等の観点から、 以下に述べる方法論を併用できる。 一つの方法論は、 FGF及び 又は R Aを実質的に含有しない無血清培地、 あ るレ、は F G F及び Z又は R Aが実質的に不活ィヒされた無血清培地における、 胚性 幹細胞の浮遊培養である。 かかる方法論は、 例えば、 小脳神経細胞への分化を促 進する場合に有用である。 なお、 本方法論の詳細は上述した通りである。
別の方法論は、 浮遊培養を少なくとも 5日間継続することである。 かかる方法 論は、 例えば、 小脳神経細胞への分化を促進する場合に有用である。 なお、 5日 未満の培養であっても勿論、 小脳神経細胞を、 従来法に比べ効率的に分化誘導で きることは云うまでもない。
また別の方法論は、 Wn tシグナル促進剤の存在下における、 胚性幹細胞の浮 遊培養である。 かかる方法論は、 例えば、 小脳神経細胞、 及ぴ特定の小脳神経細 胞 （例えば、 小脳顆粒細胞、 小脳プルキンェ細胞） への分化を促進する場合に有 用である。 なお、 Wn tシグナル促進剤は上記と同様である。
浮遊培養に用いられる Wn tシグナル促進剤の濃度は、 上記有用性を達成可能 であるような濃度であり得る。 かかる濃度は、 例えば Wn t 3 aについては約 0. l〜1000 n g/m l、 好ましくは約 1. 0〜1 00 n g//m l、 より好まし くは約 2. 0〜50 n g/m 1、 最も好ましくは約 5. 0〜50 n g/ m lであ り得る。
Wn tシグナル促進剤は、 胚性幹細胞の培養開始時に既に培地に添加されてい てもよいが、 培養数日後に培地に添加してもよい。 例えば、 Wn tシグナル促進 剤は、 培養 5〜1 0日、 好ましくは 5〜8日の時期に培地に添加される。
なお、 胚性幹細胞の浮遊培養は、 Wn tシグナル促進剤の非存在下で行うこと も勿論可能である。 また、 浮遊培養の途中に、 これら培養条件を切り替えること も可能である。
さらに別の方法論は、 BMPシグナル促進剤の存在下における、 胚性幹細胞の 浮遊培養である。 かかる方法論は、 小脳神経細胞、 及び特定の小脳神経細胞 （例 えば、 小脳顆粒細胞、 小脳プルキンェ細胞） への分化を促進する場合に有用であ る。 なお、 BMPシグナル促進剤は上記と同様である。
浮遊培養に用いられる BMPシグナル促進剤の濃度は、 上記有用性を達成可能 であるような濃度であり得る。 かかる濃度は、 例えば BMP 4については約 0. 0 1〜； I 0 O nM、 好ましくは約 0. 05〜1 O nM、 より好ましくは約 0. 1 〜1. 0 nM、 最も好ましくは約 0. 5〜1. O nMであり得る。
BMPシグナル促進剤は、 胚性幹細胞の培養開始時に既に培地に添加されてい てもよいが、 培養数日後に培地に添加してもよい。 例えば、 BMPシグナル促進 剤は、 培養 5〜 1 0日、 好ましくは 5〜8日の時期に培地に添加される。
なお、 胚性幹細胞の浮遊培養は、 BMPシグナル促進剤の非存在下で行うこと も可能である。 また、 浮遊培養の途中に、 この培養条件を切り替えることも可能 である。
また、 小脳神経細胞、 特に小脳顆粒細胞、 小脳プルキンェ細胞への効率的な分 化を可能とするため、 上記 2つの方法論を組合せることができる。 即ち、 Wn t シグナル促進剤及び BM Pシグナル促進剤の存在下における胚性幹細胞の浮遊培 養もまた好ましい。
また別の方法論は、 FGFの存在下における、 胚性幹細胞の浮遊培養である。 FGFは、 胚性幹細胞の培養開始時に既に培地に添加されていてもよいが、 培養 数日後に培地に添カ卩してもよレ、。 例えば、 FGFは、 培養 4〜1 2日、 好ましく は 5〜10日の時期に培地に添加される。 なお、 胚性幹細胞の浮遊培養は、 FG Fの非存在下で行うことも勿論可能である。 また、 浮遊培養の途中に、 この培養 条件を切り替えることも可能である。
浮遊培養に用いられる FGFの濃度は、 上記有用性を達成可能であるような濃 度であり得る。 かかる濃度は、 例えば FGF 8 bについては約 0. l〜500 n g/m 1 , 好ましくは約1〜200118/ /1111、 より好ましくは約 1 0〜 200 n g/m 1、 最も好ましくは約 20〜 1 00 n g/m 1であり得る。
なお、 小脳神経細胞、 特に小脳プルキンェ細胞への効率的な分化を可能とする ため、 上記方法論を組合せることができる。 即ち、 BMPシグナル促進剤及び F GF (例えば、 F G F 8 b等の F G F 8 ) における胚性幹細胞の浮遊培養もまた 好ましい。
さらに別の方法論は、 胚性幹細胞の浮遊培養後に接着培養を行うことである。 凝集塊をそのまま、 あるいは分散処理 （例えば、 トリプシン Z E D T A処理） 後 に、 接着培養に供することができる。 例えば、 小脳プルキンェ細胞の分化を促進 する場合には、 凝集塊のまま接着培養に供してもよレ、。 なお、 接着培養では、 細 胞接着性の培養器、 例えば、 細胞外マトリックス等 （例えば、 ポリ Dリジン、 ラ ミニン、 フイブロネクチン〉 によりコーティング処理された培養器を使用するこ とが好ましい。 接着培養は、 例えば 1日以上、 好ましくは 1〜2 0日間、 より好 ましくは 5〜2 0日間、 最も好ましくは 1 0〜1 5日間行うことができる。
上述した各種方法論は、 小脳神経細胞、 あるいは特定の小脳神経細胞 （例えば、 小脳顆粒細胞、 小脳プルキンェ細胞） を効率的に得るために適宜組合せることが できる。 例えば、 同一の効果を奏する方法論を組合せることで、 より優れた効果 が期待できる。
また、 得られた小脳神経細胞をさらに分ィヒさせることもできる。 例えば、 実施 例 9記載のように M a t h 1 +細胞を分離した後、 哺乳動物の胎児又は新生児小 脳の分散細胞と凝集させ、 共培養することでさらなる分化を誘導できる
(Development 106, 441-447 (1989) ; Development 128, 3133-3144 (2001) ) 。 例えば、 かかる方法により、 平行線維軸索に接着して移動可能であるという特徴、 及び Z又は τ型の軸索の伸長という特徴を示す小脳顆粒細胞が得られる （これら は、 小脳顆粒細胞の特徴である） 。
以上の通り、 本発明の方法は、 種々の神経系細胞の分ィヒ誘導を可能とするため 極めて有用である。
( 3 . 2 . 感覚器系細胞の分化誘導）
感覚器系細胞は、 上述した浮遊培養により、 又は必要に応じて上述した浮遊培 養と接着培養との組合せにより胚性幹細胞から分ィヒ誘導できる。 好ましくは、 感 覚器系細胞の分化効率の向上等の観点から、 以下に述べる方法論を併用できる。 一つの方法論は、 F G F、 R A、 B M Pシグナル促進剤からなる群より選ばれ る 1つ、 好ましくは 2つ、 より好ましくは全てを実質的に含有しない無血清培地、 あるいは F G F、 R A及び B M Pシグナル促進剤からなる群より選ばれる 1つ、 好ましくは 2つ、 より好ましくは全てが実質的に不活化された無血清培地におけ る、 胚性幹細胞の浮遊培養である。 かかる方法論は、 例えば、 感覚器系細胞への 分化を促進する場合に有用である。 なお、 本方法論の詳細は上述した通りである。 別の方法論は、 浮遊培養を少なくとも 5日間継続することである。 かかる方法 論は、 例えば、 感覚器系細胞への分化を促進する場合に有用である。 なお、 5日 未満の培養であっても勿論、 感覚器系細胞を、 従来法に比べ効率的に分化誘導で きることは云うまでもない。
また別の方法論は、 胚性幹細胞の浮遊凝集体 （数日培養したもの） を含む無血 清培地への血清の添加である。 かかる方法論は、 例えば、 感覚器系細胞 （例えば、 網膜細胞、 視細胞） への分化を促進する場合に有用である。
血清は、 任意の動物、 好ましくは哺乳動物に由来する血清を使用できる。 血清 が由来する哺乳動物は、 胚性幹細胞が由来する哺乳動物 （上述） と同様である。 血清の濃度は、 感覚器系細胞を効率的に分化可能であるような濃度である限り限 定されないが、 例えば約 0 . 5〜3 0 %、 好ましくは約 1 . 0〜2 0 %、 より好 ましくは約 3〜 1 0 %、 最も好ましくは約 5 %であり得る。
胚性幹細胞の浮遊凝集体を含む無血清培地に血清を添加する時期は、 感覚器系 細胞への分ィヒを可能とする限り特に限定されないが、 例えば、 浮遊培養開始から 3〜 7日以内である。 なお、 感覚器系細胞への分化は、 血清の非存在下でも可能 である。 また、 浮遊培養の途中に、 血清の存在下又は非存在下の条件を切り替え ることも可能である。
さらに別の方法論は、 胚性幹細胞の浮遊凝集体 （数日培養したもの） を含む無 血清培地への S h hシグナル促進剤の添加である。 かかる方法論は、 例えば、 感 覚器系細胞 （例えば、 網膜細胞、 視細胞） への分化を促進する場合に有用である。 なお、 S h hシグナル促進剤は、 上記と同様である。
浮遊培養に用いられる S h hシグナル促進剤の濃度は、 感覚器系細胞への分ィ匕 を促進可能である限り限定されないが、 例えば約 0 . ；!〜 5 0 0 n M、 好ましく は約 0 . 5〜1 0 O n M、 より好ましくは約 1 . 0〜5 0 n M、 最も好ましくは 約 3. 0〜30 nMであり得る。
胚性幹細胞の浮遊凝集体を含む無血清培地に S h hシグナル促進剤を添加する 時期は、 感覚器系細胞への分化を可能とする限り特に限定されないが、 例えば、 浮遊培養開始から 7日以内 （例えば、 3〜7日） である。 なお、 感覚器系細胞へ の分化は、 S h hシグナル促進剤の非存在下でも可能である。 また、 浮遊培養の 途中に、 S h hシグナル促進剤の存在下又は非存在下の条件を切り替えることも 可能である。
また別の方法論は、 No d a 1、 ァクチビン等の No d a 1シグナル促進剤の 存在下における胚性幹細胞の浮遊培養である。 かかる方法論は、 例えば、 感覚器 系細胞 （例えば、 網膜細胞、 視細胞） への分化を促進する場合に有用である。 な お、 No d a 1シグナル促進剤は、 上記と同様である。
浮遊培養に用いられる No d a 1シグナル促進剤の濃度は、 感覚器系細胞をよ り効率的に産生できる濃度であり得る。 かかる濃度は、 例えば約 1〜10000 n gZml、 好ましくは約 10 n!！〜 1000 n gZm 1、 より好ましくは約 2 0〜500 n g/m l、 最も好ましくは約 50〜 200 n g /m 1であり得る。 胚性幹細胞の浮遊凝集体を含む無血清培地に No d a 1シグナル促進剤を添加 する時期は、 感覚器系細胞への分化を可能とする限り特に限定されないが、 例え ば、 浮遊培養開始から 7 S以内 （例えば、 3〜7日後） である。 なお、 感覚器系 細胞への分化は、 No d a 1シグナノレ促進剤の非存在下でも可能である。 また、 浮遊培養の途中に、 No d a lシグナル促進剤の存在下又は非存在下の条件を切 り替えることも可能である。
また、 感覚器系細胞への効率的な分化を可能とするため、 上記 3つの方法論を 組合せることができる。 即ち、 血清と S h hシグナル促進剤の併用、 血清と No d a 1シグナル促進剤の併用、 S hhシグナル促進剤と N o d a 1シグナル促進 剤の併用、 血清と S h hシグナル促進剤及び N o d a 1シグナル促進剤の併用も また好ましい。
さらに別の方法論は、 D k k 1等の Wn tシグナル阻害剤及び/又は L e f t y— A等の No d a 1シグナル阻害剤の存在下における胚性幹細胞の浮遊培養で ある。 かかる方法論は、 例えば、 感覚器系細胞 （例えば、 網膜細胞、 視細胞） へ の分化を促進する場合に有用である。 力かる方法論の併用もまた好ましい。 なお、 Wn tシグナル阻害剤、 No d a lシグナル阻害剤は、 上記と同様である。
浮遊培養に用いられる Wn tシグナル阻害剤の濃度は、 上記有用性を達成可能 であるような濃度であり得る。 かかる濃度は、 例えば Dk k 1については約 0. 0 1〜： L O O j gZml 好ましくは約 0. l〜1 0 ;u g/ nil、 より好ましく は約 0. 5〜5. 0 gZml、 最も好ましくは約 1. 0 / g/m 1であり得る。 浮遊培養に用いられる No d a 1シグナル阻害剤の濃度は、 上記有用性を達成 可能であるような濃度であり得る。 かかる濃度は、 例えば L e f t y— Aについ ては約 0. 0 1〜20 At g/m 1、 好ましくは約 0. 05〜5；« 8ノ1111、 より 好ましくは約 0. 1〜1. gZm 1、 最も好ましくは約 0. 5 z gZm lで あり得る。
Wn ΐシグナル阻害剤及び No d a 1シグナル阻害剤は、 胚性幹細胞の浮遊培 養開始時に既に培地に添加されていてもよく、 また、 例えば、 培養開始から 5日 以内の時期に培地に添加されてもよい。 勿論、 異なる時期にそれぞれ培地に添加 されてもよい。
また、 感覚器細胞 （例えば、 網膜細胞、 視細胞） への分化を特に効率良く行う ために、 所定の因子の組合せ、 例えば、 L e f t y (例えば、 L e f t y— A) 、 D k k 1、 血清およびァクチビンの存在下における胚性幹細胞の浮遊培養もまた 好ましい。
なお、 胚性幹細胞の浮遊培養は、 Wn tシグナル阻害剤及び/又は No d a 1 シグナル阻害剤の非存在下で行うことも勿論可能である。 また、 浮遊培養の途中 に、 この培養条件を切り替えることも可能である。
また別の方法論は、 胚性幹細胞の浮遊培養後に接着培養を行うことである。 凝 集塊をそのまま、 あるいは分散処理 （例えば、 トリプシン/ EDTA処理） 後に、 接着培養に供することができる。 なお、 接着培養では、 細胞接着性の培養器、 例 えば、 糸田胞外マトリックス等 （例えば、 ポリ Dリジン、 ラミニン、 フイブロネク チン） によりコーティング処理された培養器を使用することが好ましい。 接着培 養の期間は、 例えば 1 S以上であり得る。
さらに別の方法論は、 浮遊培養後に、 接着条件下で長期培養することである。 かかる方法論は、 感覚器系細胞、 特に視細胞への分化を促進する場合に有用であ る。 長期培養のための培養期間は、 感覚器系細胞への分化を可能とする期間であ る限り特に限定されないが、 例えば、 例えば 3日以上、 好ましくは 5〜2 5日間、 より好ましくは 7〜2 0日間、 最も好ましくは 7〜1 8日間であり得る。
上述した各種方法論は、 感覚器系細胞、 あるいは特定の感覚器系細胞 （例えば、 網膜系細胞、 視細胞） を効率的に得るために適 且合せることができる。 例えば、 同一の効果を奏する方法論を組合せることで、 より優れた効果が期待できる。 以上の通り、 本発明の方法は、 種々の感覚器系細胞の分化誘導を可能とするた め極めて有用である。
( 4 . 細胞培養物、 及び医薬としての使用）
本発明はまた、 本発明の方法により得られる細胞培養物を する。 本発明の 細胞培養物は、 例えば、 胚性幹細胞の浮遊凝集体、 浮遊凝集体を分散処理した細 胞、 分散処理細胞の培養により得られる細胞などであり得る。 また、 本発明は、 かかる細胞培養物より被験体に投与し得る程度に単離 ·精製された均質な細胞、 例えば、 終脳神経細胞等の前脳神経細胞、 小脳神経細胞等の神経系細胞、 網膜前 駆細胞等の感覚器系神経細胞を提供する。
本発明の方法により得られた細胞は、 神経系細胞、 例えば前脳神経細胞、 感覚 器系細胞の障害に基づく疾患の治療薬、 又はその他の原因による細胞損傷状態に おいて当該細胞を補充するためなどに用いることができる。 神経系細胞の障害に 基づく疾患としては、 例えば、 パーキンソン病、 脊髄小脳変性症、 ハンチントン 舞踏病、 アルツハイマー病、 虚血性脳疾患 （例えば、 脳卒中） 、 てんかん、 脳外 傷、 脊髄損傷、 運動神経疾患、 神経変性疾患、 網膜色素変性症、 加齢黄斑変性症、 内耳性難聴、 多発性硬化症、 筋萎縮性側索硬化症、 祌経毒物の障害に起因する疾 患などが挙げられる。 具体的には、 前脳神経細胞、 特に終脳神経細胞の障害に基 づく疾患としては、 例えば、 ハンチントン舞踏病、 アルツハイマー病、 虚血'性脳 疾患 （例えば、 脳卒中） 、 脳外傷が挙げられる。 また、 小脳神経細胞の障害に基 づく疾患としては、 例えば、 脊髄小脳変性症、 アルコール性小脳変性症、 小脳部 の外傷が挙げられる。 また、 感覚器系細胞の障害に基づく疾患としては、 網膜色 素変性症、 黄班変性症、 緑内障、 糖尿病性網膜症が挙げられる。 さらに、 これら 細胞の補充が所望される状態としては、 脳外科手術後 （例えば、 脳腫瘍摘出後） が挙げられる。
また、 本発明の方法により得られた細胞、 例えば、 神経系細胞、 感覚器系細胞 を、 当該細胞の障害に基づく疾患の治療薬として用いる場合、 当該細胞の純度を 高めた後に被験体に移植することが好ましい。
細胞の純度を高める方法は、 公知となって ヽる細胞分離精製の方法であれば 、 ずれも用いることができるが、 例えば、 フローサイトメーターを用いる方法 （例 ば、 Antibodies- A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)、 Monoclonal Antibodies ." principles and practice, Third Edition, Acad. Press (1993)、 Int. Immunol. , 10， 275 (1998)参照) 、 バニング法 （例 えば、 Monoclonal Antibodies "· principles and practice, Third Edition, Acad. Press (1993)、 Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL Pressat Oxford University Press (1996)、 J. Immunol. , 141， 2797 (1988)参 照） 、 ショ糖濃度の密度差を利用する細胞分画法 （例えば、 組織培養の技術 （第 三版） ， 朝倉書店 ( 1 9 9 6 ) 参照） が挙げられる。
本発明の分化細胞の純度を高める方法は、 上述のような胚性幹細胞を分化誘導 して得られた細胞、 例えば、 神経系細胞、 感覚器系細胞を、 抗癌剤を含む培地中 で培養する工程を含む。 これにより、 未分ィ匕な状態の細胞を除去することができ、 より純度の高い分化細胞を得ることが可能で、 医薬としてより好適となる。 即ち、 抗癌剤で処理することにより、 目的とする分化細胞以外の細胞、 例えば未分化な 細胞を除去することができる。 ここで、 抗癌剤としては、 マイトマイシン C、 5—フルォロウラシル、 ァドリ アマイシン、 ァラ Cまたはメトトレキセートなどが挙げられる。 これら抗癌剤は、 分化誘導した細胞よりも未分化な状態の細胞に、 より細胞毒性を示す濃度で用い ることが好ましい。 具体的には、 上述した培養方法に準じて、 これら抗癌剤を用 レ、た培養を行い、 至適濃度を決定することができ、 例えば、 これら抗癌剤を生体 に用いる日本薬局方記載の濃度の 1 0 0分の 1〜1倍の濃度で含む培地を用い、 5 %の二酸ィヒ炭素を通気した C 02インキュベーターで、 3 7 °Cで数時間、 好ま しくは 2時間培養する方法を挙げることできる。
ここで使用する培地としては、 分化誘導した細胞を培養することが可能な培地 であればいかなるものも用いることができる。 具体的には、 上述の培地等を挙げ ることができる。
また、 移植医療においては、 組織適合性抗原の違いによる拒絶がしばしば問題 となるが、 体細胞の核を核移植した胚性幹細胞、 又は染色体上の遺伝子を改変し た胚性幹細胞を用いることで当該問題を克服できる。
また、 体細胞の核を核移植した胚性幹細胞を用いて分化誘導することで、 体細 胞を提供した個体の細胞、 例えば、 神経系細胞、 感覚器系細胞を得ることができ る。 このような個体の細胞は、 その細胞自身が移植医療として有効のみならず、 既存の薬物がその個体に有効力否かを判断する診断材料としても有用である。 さ らに、 分ィヒ誘導した細胞を長期に培養することで酸化ストレスや老化に対する感 受性の判定が可能であり、 他の個体由来の細胞と機能や寿命を比較することで神 経変性疾患等の疾患に対する個体のリスクを評価することができ、 それら評価デ ータは将来の発病率が高いと診断される疾患の効果的な予防法を提供するために 有用である。
胚性幹細胞から分化誘導された細胞、 例えば神経系細胞は、 自体公知の方法に より、 患者の疾患部位に移植できる （例えば、 Nature Neuroscience, 2， 1137 (1999) 参照） 。
以下の実施例により本発明をより具体的に説明するが、 実施例は本発明の単な る例示を示すものにすぎず、 本発明の範囲を何ら限定するものではない。 実施例
実施例 1 ： ES細胞の浮遊培養物は、 血清の非存在下で凝集する
1 . 1 . EB5細胞の浮遊培養による解析
初めに、 無血清浮遊凝集 （SFEB: Serum-free Floating culture of Embryoid body-like Aggregates) 法を用いて、 マウス ES細胞 （E14由来） である EB5細 胞 （Nature Genet. , Vol. 24： 372 (2000) ) を培養した。
具体的には、 ES細胞としては、 1% ゥシ胎児血清、 10% KSR (Knockout Serum Replacement) , LIFを添加した無フィーダ一細胞による通常の培養法により維持 培養されたものを SFEB法に用いた （Neuron, Vol. 28： 31-40 (2000) 参照）。 次 いで、 ES細胞コロニーをトリプシン · EDTA処理で単細胞にした後、 細胞非接着 性の培養プラスチックシャーレ （10 cm径） に 6 X 104細胞/ ml 10 ml播種し、 37 、 5% C02で 5日間インキュベートした。 このとき、 培地としては、 GMEM 500 ml、 100 XNEAA 5 ml, 100 X pyruvate 5 ml、 1 X 10_1 M 2 -メルカプトエタノール 0. 5 ml、 5% KSR (Knockout Serum Replacement) からなる分化培地を用いた。 ま た、 ゼラチンコート培養ディッシュを用いること以外は SFEB法と同様の条件で、 EB5細胞を接着下で培養し、 コントロールとした。
その結果、 SFEB法により ES細胞を浮遊凝集培養したとき、 ES細胞は十分に増 殖し、 多数の NCAM+細胞 （>60%) を生じた （免疫染色法により解析)。 一方、 接 着培養したコント口ールでは、 単一の ES細胞は少数の小さなコロニーしか形成 せず、 また、 このコロニーには、 僅かな NCAM+細胞 （く 20%) し力含まれていなか つた。
1 . 2 . レポーター遺伝子導入マウス E S細胞の浮遊培養による解析
次いで、 定量的な解析のため、 ES細胞として、 神経マーカー Soxl遺伝子に GFP (green fluorescent protein) を相同組換えにてノックインしたマウス ES 細胞 （以下、 必要に応じて、 Soxl/GFP- mES細胞と省略。 Naure Biotechnology Vol. 21： 183-186 (2003) 参照） を用いて、 SFEB法により培養した。 なお、 培 養条件は、 ES細胞として Soxl/GFP - mES細胞を用いた以外は、 上記 1 . 1 . の SFEB法と同様であった。
その結果、 FACSにより解析したところ、 Soxl/GFP-mES+細胞は 3〜5日間増加 したが、 E-力ドへリン +細胞は最初の 5日間除々に減少した。 また、 同様の結果 力 免疫染色試験により得られた。 さらに、 SFEB法の 5日後には、 60- 85%の細 胞が Soxl- GFP陽性であり、 培養を 3 X 104〜1 X 105初期細胞/ mlの範囲で開始し た場合に、 Soxl- GFP+集団の割合が高かった （>60%)。
以上 1 . 1 . 及び 1 . 2 . より、 適切な培養条件下で培養したとき、 ES細胞 は効率的に凝集し、 血清及びフィーダ一細胞の非存在下で神経系細胞を速やかに 生じることが示された。 実施例 2 ：内因性 Nodal、 Wntシグナルの阻害は、 SFEB法による ES細胞の神経 系細胞への分化効率をさらに向上させる
次いで、 本発明者らは、 SFEB法による神経系細胞への分化効率をより向上さ せるため、 中胚葉系細胞への分化促進剤である Nodal、 Wnt、 BMPの阻害により、 神経系細胞への分化効率が向上するか否かを検討することとした。 抗 Nodal試薬 としては Lefty-A (R&D社製）、 抗 ffnt試薬としては Dkkl (R&D社製）、 抗 BMP試 薬としては BMPRIA- Fc receptobody (R&D社製） を用いて、 SFEB法による培養 0 目に分ィヒ培地に添加した。 なお、 用いた濃度は、 それぞれ Lefty - A； 5 μ g/ml, Dkkl ; 1 μ g/ml, BMPRIA- Fc receptobody; 1. 5 /z g/mlであった。
その結果、 Lefty- A又は Dkklの添カ卩により、 Soxl-GFP+細胞の頻度が上昇する ことが明らかとなった。 また、 上記 1 . 2 . の方法では、 最適な初期細胞密度 5 X 104細胞/ mlの条件下でさえも、 GFP発現の絶対値が実験毎に 10〜15%程度変動 していたが、 予想外にも、 Lefty- A又は Dkklの添加により GFP発現の値が安定 化した。 さらに、 Lefty- A、 Dkklの併用により、 Soxl - GFP+細胞の頻度が約 90%と 著しく增カ卩した。 また興味深いことに、 初期の細胞密度が高い場合 （2 X 105細胞 /ml) であっても、 この併用により Soxl-GFP+細胞が高い頻度 （約 80%) で保たれ た。 一方、 BMPRIA-Fc receptobodyの添加は、 Soxl- GFP+細胞の頻度に有意に影 響しなかった。
次いで、 本発明者らは、 Nodal及ぴ Wntの効果を、 Nodal蛋白質 （R&D社製） 及び Wnt3a蛋白質 （R&D社製〉 を SFEB培養物に添加することで試験した。 その 結果、 SFEB法における 0〜5日目、 2〜5日目での Nodal蛋白質 （5 g /ml)、 W¾t3a蛋白質 （50 ng/ml) の添加は、 Soxl- GFP+細胞の頻度を有意に抑制するこ とが確認された。
以上より、 Nodal又は Wntシグナルの阻害により、 ES細胞の神経系細胞への分 化効率が向上し、 且つその分化効率が安定化すること、 並びに Nodal、 Wntシグ ナル双方の阻害により、 ES細胞の神経系細胞への分化効率が著しく向上するこ とが示唆された。 実施例 3 ： SFEB法による神経分化メカニズムの解析
次いで、 本発明者らは、 SFEB法による神経系細胞への優先的分化が、 培養中 の幾つかの選択バイアスによって引き起こされているのか、 又は神経運命への直 接的な分化によって引き起こされているのかを検討することとした。
先ず、 本発明者らは、 Soxl - GFP+細胞の割合が增加している培養 3日目及ぴ 4 日目に、 非神経集団で細胞死が増加しているか否かを TU ELアツセィ （Int. J. Oncology, 1, 639-648 (1992) ) により試験した。
その結果、 TUNEL+アポトーシス細胞の割合は、 Soxl- GFP— (3日目では 5. 5土 0. 7%、 4日目では 4. 8 ± 1. 4%、 n=3) と、 Soxl- GFP+ (3日目では 4. 8±0. 9%、 4日 目では 4. 6± 1· 5%、 n=3) 集団との間で有意差を示さなかった。 このことは、 Soxl-GFP細胞が、 SFEB法による培養中、 アポトーシスにより能動的に排除され ていないことを示す。
次に、 本発明者らは、 Soxl - GFP―、 Sox卜 GFP+集団における細胞増殖のパラメ一 タを BrdU取り込みアツセィ、 及びホスホヒストン H3免疫染色アツセィにより比 較した。
その結果、 BrdU標識細胞の割合 （30分間の暴露） は、 Soxl- GFP— (3日目では 45. 3±0. 4%、 4日目では 40. 9± 1. 2%、 n=3) と Sox卜 GFP+ (3日目では 49. 6土 2. 6%、 4日目では 42. 4± 1. 1%、 n=3) 集団との間で 10%未満の差異を示した。 同 様の状況が、 ホスホーヒストン H3+細胞の比率で観察された （Soxl- GFP—集団にお いて、 3日目では 1, 2±0. 5%、 4日目では 1. 0±0. 7%； Soxl-GFP+集団において、 3 日目では 1. 5 ±0. 7¾、 4日目では 1· 3±0. 6%、 η=3) 0 これらの結果は、 SFEB法に よる ES細胞の神経系細胞への高い分化効率に、 増幅の偏りが主要な役割を果た さないことを示す。
以上より、 SFEB法による優先的な神経分化が、 選択的な細胞死又は増殖では なく、 直接的な神経分化に起因することが示唆された。 実施例 4 ： SFEB法は、 ES細胞が終脳神経細胞に高効率で分化することを可能と する
マウス ES細胞 （EB5細胞） を、 実施例 1と同様に SFEB法により 5日間無血清 浮遊培養した後、 トリプシン ' EDTA処理により分散し、 ポリ D リジン 'ラミニ ンコートした細胞培養用スライドに播種して、 分化培地 （上記の通り） で 2日間、 GMEM+N2培地 （組成： GMEM+ lxN-2 Supplement (Gibco製、 xlOO濃度のものを希 釈して使用）、 0. 1 MM非必須アミノ酸、 1 fflM ピルビン酸ナトリゥム、 0. 1 mM 2 - メルカプトエタノール） で 3日間培養した。 最終的に得られた分化細胞を、 抗 Bfl抗体を用いて蛍光抗体法により解析した。 なお、 比較のため、 SDIA法により ES細胞の神経分ィヒを行い、.蛍光抗体法により同様に解析した。
その結果、 SFEB法による分化細胞のうち約 15%の細胞が、 終脳神経細胞に特異 的な核蛋白質である Bfl陽性であった。 一方、 SDIA法により得られた分ィ匕細胞 では、 ΒίΓ細胞の割合は僅かであった （約 1%)。
次いで、 Bfl以外のマ一力一の発現について検討することとした。 なお、 マー カーに対する抗体としては、 抗 Pax6抗体 （DSHB製）、 抗 Gsh2抗体、 抗 Nkx2. 1 抗体を用いた。 なお、 抗 Gsh2抗体、 抗 Nkx2, l抗体としては、 合成ペプチドをゥ サギに免疫して自ら作製したものを用いた。
その結果、 Bfl+細胞のうち、 約 40%の細胞が大脳背側部 （大脳皮質などが発 生） のマーカー （Pax6陽性） を発現し、 2δ%の細胞が大脳腹側中間部 （大脳基底 核などが発生） のマーカー （Gsh2陽性） を発現した。 また、 10%程度の細胞が終 脳最腹側部 （視床下部などが発生） の Nkx2. 1を発現していた。
以上より、 SFEB法は、 ES細胞から終脳神経細胞への分化を効率的に誘導でき ること、 並びに終脳神経細胞として大脳皮質、 大脳基底核、 視床下部等の細胞を 分化誘導できることが明らかとなった。 実施例 5 ： ES細胞から終脳神経細胞への分化は、 培養後初めの 5日間が重要で ある
SFEB法による ES細胞の Γ細胞への高効率の分化は、 極めて興味深い。 そこ で、 SFEB法、 SDIA法による Bfl+細胞への分化率の差異につき、 タイムウィンド ゥ （time window) の観点から、 詳細に検討することとした。
その結果、 Bfl+細胞は、 SFEB法により 5日間培養し、 次いで SDIA法によりさ らに 5日間培養したとき高頻度に生じた （11%)。 反対に、 SDIA法により初めの 5 日間培養し、 ラミニン'ポリ- D -リジン 'フイブロネクチンコートしたディッシ ュでさらに 5日間培養したとき僅かな Bfl+細胞のみが観察された （く 2%)。
以上より、 ES細胞から Bfl+細胞への効率的な分ィ匕には、 分化誘導期の初めの 5日間が決定的な役割を果たすことが示唆された。 実施例 6 ： SFEB法は、 レチノイン酸処理の併用により尾側 （caudal) 組織の前 駆細胞を誘導する
次いで、 SEFA法と尾側ィヒ （caudalizing) 因子との併用の効果を検討するため、 レチノイン酸 (RA) を用いて試験した。 なお、 SEFA法は、 実施例 1と同様に行 レ、、 RA (Sigma製）は培養 3-5日後に 0. 2 i Mとなるように培地に添加した。 その結果、 尾側化因子は、 ΒΠ+細胞をほぼ完全に排除した «1%以下)。 また、 RT-PCR解析により、 吻側マーカーである ΒΠ、 0tx2が RAによる SFEB誘導神経 細胞において完全に抑制されたのに対し、 尾側マーカー Hoxb4が誘導された。 以上より、 SEFA法と尾側化因子とを併用した場合、 尾側組織に対応する細胞 を分化誘導し得ることが示された。 実施例 7 ：パターン形成因子による亜領域 (subregional) マーカーの変動
次いで、 本発明者らは、 SFEBにおける部分領域マーカーの発現が、 外因性の パターン形成 （patterning) 因子により変動する力否かを検 I Tることとした。 なお、 パターン形成因子としては、 Shh (R&D ^M) を用いた。
その結果、 SFEB法による培養 4日目から、 Shhを 3 - 300 nM培地に添加すると、 用量依存的様式で、 Bfl+細胞のうち Pax6+細胞の割合が著しく減少し、 kx2. Γ細 胞、 Gsh+細胞などの腹側細胞の割合が約 2倍に増加した。 また、 総細胞数中の Bfl+細胞の占める割合は、 Shh処理により影響されなかった。 さらに、 Shh処理 は、 SFEB誘導神経組織の長期培養において、 腹側終脳の特徴を呈する神経細胞 (BflVlsletl/2 ChAT+) を増加させたが、 GluTl+グルタミン産生神経細胞 （典 型的には背側） の分化を抑制した。 このことは、 SFEBにより誘導される終脳神 経細胞は、 胚と同様の様式で Shhシグナリングに応答することを示す。
以上より、 SFEB法を Shh処理と組合せることで、 腹側終脳神経細胞を効率的 に分化誘導できること、 及び SFEBにより誘導される終脳神経細胞は、 胚と同様 の様式で Shhシグナリングに応答することが明らかとなった。 実施例 8 ： Wntシグナル因子による背側終脳組織の分ィヒ誘導
実施例 4、 6と同様に ES細胞を SFEB法で 5日間培養し神経分化誘導を行い、 引き続き、 トリプシン ' EDTA処理で分散しポリ Dリジン.ラミニンコートした 細胞培養用スライドに播種して、 培養した。 Wnt3aを 5 ng/mlまたは 50 ng/ml の濃度で 6日目より添加し合計 10日間培養したところ、 腹側終脳マーカ一であ る Nkx2. 1、 Bfl両陽性の細胞数は著しく低下し、 逆に背側終脳マーカーである Pax6、 Bfl両陽性の細胞数は増加した。 Wnt3a 50 ng/mlの場合、 Bfl陽性細胞の うち約 75%が背側マーカ一である Pax6を発現しており、 また約 1割が大脳皮質 前駆細胞のマーカーの一つである Emxlを発現した。
以上より、 SFEB法において Wntシグナルを培養後期に作用させることで、 背 側終脳細胞を効率的に分化誘導できることが示唆された。 実施例 9 ： BMPと Writの組合せによる小脳神経前駆細胞の分化誘導
無血清浮遊培養を 7日間維続したこと以外は、 実施例 4と同様に SFEB法で ES 細胞を神経分化誘導した。 培養 7日目から 1日間の培養には B27 supplement
(Gibco製） 添加の Neurobasal (Gibco製） 培地を用いて、 浮遊培養を維続した。 5日後より培養 8日まで 0. 5 nM BMP4 (R&D製）、 10 ng/ml Wnt3a (R&D製）、 50 ng/ml FGF8b (R&D製）を培地に添加した。 培養開始 8日後には細胞塊をそのまま あるいはトリプシン ' EDTA処理による分散後に、 ポリ Dリジン'ラミニンコー トした細胞培養用スライドに播種し、 B27 supplement添カ卩の Neurobasal培地を 用いて、 接着培養を行った。 9日で免疫染色を行ったところ、 小脳顆粒細胞の前 駆細胞に特異的なマーカー Mathl、 Pax6、 Zicl を発現している細胞を多数認めた。 40- 50%の細胞が Mathl陽^ 4であり、 そのうち 50%以上が Pax6や Zicl陽性であつ た。 さらに小脳顆粒細胞の前駆細胞には分裂が盛んな細胞が含まれていることが 知られているが、 Mathl陽性細胞の半分程度が分裂可能な細胞に特異的なマーカ 一 Ki67を発現していた。 なお、 このような顆粒細胞マーカーの誘導には BMPお よび Wntの処理が必須であつたが、 FGFの処理は必須ではなかった。
さらに培養 8日目に細胞塊のままで接着培養を開始したものを合計 20日間培 養したところ、 約 50%の細胞塊の中に小脳プルキンェ細胞特異的なマ一カー L7に 陽性の大型ニューロンが複数 （10個程度） 存在していることが確認された。 こ の分化誘導効率は BMP4と Wntの組み合わせであるが、 FGF8bとの組み合わせを 検討したところ、 顆粒細胞の分化と異なり、 小脳プルキンェ細胞分ィ匕には、 BMP4 と FGF8bとの組み合わせも有効であり、 14細胞数は BMP4と Wntの組み合わせ に比して 4倍に増加した。
小脳顆粒細胞前駆細胞を分離するために、 EB5細胞に Mathlプロモーター (Development 127， 127, 1185-1196 (2000) ) 下流に GFPを結合したマーカー遺 伝子を通常の方法で遺伝子導入した株を樹立した。 上記の要領で培養した 8 - 10 日の細胞から蛍光細胞ソータ一を用いて、 GFP陽性分画を分離したところ、 約 9 割の細胞が Mathl - GFP陽性の細胞に純ィヒされた。 これらの細胞は Pax6、 Ziclな どを発現していた。 またこれらの細胞を、 マウス胎児小脳や新生仔小脳の分散し た細胞と凝集させ、 共培養することでニューロンへの分化を誘導した
(Development 106, 441-447 (1989)； Development 128, 3133-3144 (2001) )。 す ると、 ES細胞から分化誘導した細胞は 2日目にはマウス小脳由来の小脳細胞が 伸展させた平衡線維軸索に接着した移動をすることが観察され （小脳顆粒細胞の 特徴の一つ） 、 さらに共培養開始後 2-3日目からは自ら小脳顆粒細胞の特徴であ る T型の軸索を伸ばしていることが確認された。
以上より、 本発明の方法を BMP、 Wntと組合せて用いることにより、 小脳組織 の神経細胞を分化誘導できることが示唆された。 実施例 1 0 ： BMPと Wntの組合せによる小脳神経前駆細胞の分ィヒ誘導
ES細胞からの小脳組織の分ィヒ誘導はこれまで報告がないが、 SDIA法で分化さ せた神経細胞を BMP4で処理することで Mathlが誘導されることは本発明者らが 既に報告している （Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100, 5828-5833参照）。 しか し、 Mathlは小脳以外にも橋、 延髄、 脊髄の背側中枢神経系の神経細胞にも発現 しており、 Mathlの発現だけでは小脳組織であるとは云えない。 そこで、 SDIA法 により ES細胞を PA6細胞上に播種して 0. 5-1 nMの ΒΜΡ4を 4日ないしは 5日目 から添加し、 9日間培養したところ、 1 - 2割程度の細胞が Mathl陽性になった。 しかしながら、 その殆どの細胞は他の小脳顆粒細胞のマーカーである Pax6、 Ziclなどを発現しておらず、 また Ki67 (分裂可能な細胞のマーカー） も陰性で あった。 従って、 SDIA法で誘導された Mathl陽性細胞は小脳の顆粒細胞ではな く、 橘、 延髄、 脊髄等の Mathl (4細胞であると想定された。
以上より、 本発明の方法が、 ES細胞からの小脳神経細胞の分化誘導に初めて 成功したことが確認された。 実施例 1 1 ： SFEB法による網膜前駆細胞の分化誘導
EB5細胞を SFEB法によって 5日間無血清浮遊培養を行い、 その後細胞塊をそ のまま、 ポリ Dリジン'ラミニン ·フイブロネクチンコートした細胞培養用スラ ィドに播種し、 KSRを含む SFEBの分化培地のまま、 合計 8日間培養した。 網膜 前駆細胞特異的なマーカー Rxに対する自ら作成した抗体を用いて免疫染色を行 つたところ、 15-30¾程度の細胞塊 （コロニー） に Rx陽性の細胞集団が確認され た。 培養開始後 3〜5日の間に 5%牛胎児血清、 または 100 ng/πιΐァクチビン (R&D製） 処理、 または 3-30 ri Shh処理をすることで、 Rxのコロニー陽性率が 50% (約 2倍） に増加した。 さらに、 別途培養 0-5日に；! / g/ml Dkkl、 0. 5 μ g/ml Lefty- Aを添加することで、 約 7割のコロ二一が Rx陽性となり、 細胞レべ ルでも 10- 15%程度の細胞が陽性となった。 Dkkl、 Nodal処理と同時に、 さらに血 清、 又は Shh、 またはァクチビン処理を行うことも可能であり、 コロニー陽 ^¾率 がさらに 5- 10%程度上昇した。 また、 これらの細胞を長期 （計 14〜18日） 接着 培養することで、 1 - 5%のコロニーに複数の視細胞マーカー Crxや口ドプシン陽性 の細胞を確認した。 ES細胞より SFEB法で LeftyA (0-5日目に添加） 、 Dkkl
(0-5日目に添加） 、 血清 （3 - 5日目のみに添加） 、 ァクチビン （4-6日目のみ に添加） 存在下に培養した場合、 全体の 2 - 3割の細胞が網膜前駆細胞に分化した 1 これらの細胞を蛍光標識後、 胎生 17. 5日のマウス網膜組織と 12日間共培養 することで、 2割の細胞が視細胞マーカ一ロドプシン陽性になった。 特に網膜組 織の視細胞層内に侵入した細胞については、 その 4割はマーカーロドプシン陽性 であり、 外節構造など視細胞に特異的な形態を示した。 実施例 1 2 ： ヒト ES細胞を用いた神経分化誘導
ヒト ES細胞は京都大学再生医科^究所中辻憲夫研究室で樹立したヒト胚盤 胞由来の胚性幹細胞をヒト ES細胞に関する指針に従い、 分与を受け、 中辻憲夫 研究室の方法に従い、 37 にて 5%C02下に、 マウス胎児線維芽細胞 （マイトマ イシン処理で不活性化； MEF) を蒔いたプラスチック培養皿の上で維持培養した。 用いた培養液は D~MEM- F12 (Sigma D6421) をベースに、 最終 20%の KSR
nvitrogen/ Gibco-BRL) 、 IX NEAA ^non-essential amino acids ;
invitrogen/Gibco-BRL)、 2 mM L-グルタミン酸、 0· 1 mMの 2 -メルカプトエタノ ールを添加したものである。 植え継ぎは 3-4日毎におこない、 解離液 （リン酸バ ッファ一緩衝生理的食塩水に 0 . 2 5 %トリプシン、 1 mg/ml コラ一ゲナ一ゼ IV液、 1 mM CaCl2を添加したもの；すべて invitrogen/Gibco-BRL) を用いて、 ES細胞をフィーダ一細胞から解離し、 ピぺット操作で 100個程度の小塊にした のち、 前日に播種した MEFのフィーダ一層のうえに蒔いた。
神経分化誘導には、 上記の解離させた ES細胞小塊を、 35 麵の培養皿に 3500 塊の割合で播種し、 15日間無血清浮遊凝集塊培養を行った。 培養液は 2 mlの分 化誘導培地 （マウスを同様の G-MEM、 KSR、 2 -メルカプトエタノールを添加した もの；ただし、 KSRは 5%、 10%または 20%の添加を試した） を用いた。 さらに分 化誘導培養開始後最初の 1 0日間は Nodal阻害剤の Lefty A ( 1 ^ g/ral) 、 Wnt 阻害剤の Dkkl (500 ng/ml)、 BMP阻害剤の可溶性 BMPR1A-Fc ( 1 . 5 // g/ml； すべ て R & D社製） を添加した。 1 5日間の無血清浮遊培養後、 ポリ- D-リジン/ラミ ェン /フイブロネクチンでコートした培養皿上に播種し、 接着培養 （培養液は同 じ分化誘導培地） を 5日間行い、 固定し免疫染色を行った。
その結果、 ヒ ト ES細胞は KSRが 10%および 20%存在下に無血清浮遊凝集塊培養 が可能であつた。 5%KSRでは増殖が悪く、 15日間の浮遊培養により多くが死滅し た。 5日間の接着培養後の免疫染色では、 ほぼすベての細胞コロニーで神経前駆 細胞マーカーのネスチンが陽性で、 未分化 ES細胞マーカーの 0ct3/4は陰性であ つた。 大脳前駆細胞のマーカー Bflは 50%のコロニーで陽性であった。 (考察）
SFEBにおける選択的神経分化
本発明者らは、 インビトロにおいて、 ES細胞の選択的神経分化を可能にする 浮遊凝集塊体の培養法の開発に成功した。 この手順の効率、 速度、 扱いやすさは、 SDIA法に匹敵する。 SFEB法は、 フィーダ一細胞、 血清、 神経パターン形成活性 を有する増殖因子 （例えば、 FGF、 BMP、 Wnt) の存在を必要としない。 むしろ、 神経分化の効率は、 内因性 Wnt及び Nodalシグナルが拮抗される場合に、 さらに より増強される。 これらの知見は、 ES細胞の浮遊凝集体が、 阻害因子の非存在 下で神経分化プログラムを自律的に開始することを示す。 原始内胚葉、 中胚葉を 効率的に生じる、 血清含有培地中で培養された胚様体 （EB) と対照的に、 4%未満 の SFEB凝集体のみが、 原始內胚葉マーカー AFP及び Hnf4、 又は中胚葉マーカ一 Branchyury陽性の細胞をごく一部含んでいた。
興味深いことに、 ES細胞凝集体の浮遊培養物自体は、 接着培養物とは、 細胞 運命の規定に対して異なる効果を有するようである。 例えば、 コラーゲンコート したディッシュ上で培養され、 BMP (5 nM) 処理された ES細胞は、 flkl+外側板 に効率的に分化誘導される。 一方、 SFEB法により培養され、 BMP処理された ES 細胞は、 E- Cad+/0ct3/4—細胞 （典型的には非外胚葉） を効率的に生成するが、 神 経分化を完全に抑制しつつ flkl+細胞を生成しなかった。 これらの R Aプロフィ ールの解析により、 この差異を調節しているシグナリングの種類を解明すること は興味深い。
産業上の利用可能性
本発明の方法によれば、 神経系細胞、 感覚器系細胞を効率的に分化誘導できる ため、 神経変性疾患、 感覚器疾患等に対する細胞治療の応用が可能となる。 また、 本発明の方法によれば、 従来の分化法では困難であった前脳組織 （特に終脳組 織） を効率的に分ィヒ誘導でき、 また、 従来成功し得なかった小脳組織の分化誘導 を可能とするため、 前脳組織、 小脳組織に異常がある疾患に対する細胞治療の応 用が可能となる。 さらに、 本発明によれば、 誘導源として動物由来細胞を使用し ていないため、 胚性幹細胞の培養により得られる細胞の移植を同種移植のリスク レベルまで軽減することが可能となる。 本出願は、 2 0 0 4年 6月 1 8日に日本で出願された特願 2 0 0 4 - 1 8 1 7 7 0を基礎としており、 その内容は本明細書中に援用される。

Claims

請求の範囲
1. 無血清培地において胚性幹細胞を浮遊凝集体として培養することを特徴とす る、 胚性幹細胞の分化誘導方法。
2. 胚性幹細胞の浮遊凝集体がフィーダ一細胞の非存在下で培養される、 請求の 範囲 1記載の方法。
3. 胚性幹細胞の浮遊凝集体が、 No d a lシグナル阻害剤又は Wn tシグナル 阻害剤の存在下で培養される、 請求の範囲 1記載の方法。
4. 胚性幹細胞の浮遊凝集体が、 No d a lシグナル阻害剤及ぴ Wn tシグナル 阻害剤の存在下で培養される、 請求の範囲 1記載の方法。
5. No d a 1シグナル阻害剤が L e f t y— Aである、 請求の範囲 3又は 4記 載の方法。
6. Wn tシグナル阻害剤が D k k 1である、 請求の範囲 3又は 4記載の方法。
7. 無血清培地が、 No d a lシグナル促進剤及び/又は Wn tシグナル促進剤 を実質的に含有しない培地である、 請求の範囲 1記載の方法。
8. 無血清培地が、 FGFを実質的に含有しない培地である、 請求の範囲 1又は 2記載の方法。
9. 無血清培地が、 レチノイン酸を実質的に含有しない培地である、 請求の範囲 1又は 2記載の方法。
1 0. 無血清培地が、 BMPを実質的に含有しない培地である、 請求の範囲 1又 は 2記載の方法。
1 1. 培養開始時の胚性幹細胞の濃度が、 1 X 1 04~ 5 X 1 05細胞/ m 1で ある、 請求の範囲 1記載の方法。
1 2. 胚性幹細胞の培養が、 細胞非接着性培養器中で行われる、 請求の範囲 1記 載の方法。
1 3. 胚性幹細胞の浮遊凝集体が少なくとも 5日間培養されることを特徴とする、 請求の範囲 1記載の方法。
1 4. 神経系細胞の分化誘導方法である、 請求の範囲 1記載の方法。
1 5. 胚性幹細胞の浮遊凝集体の培養後に、 接着培養することをさらに含む、 請 求の範囲 1記載の方法。
1 6. 前脳神経細胞の分化誘導方法である、 請求の範囲 1又は 1 5記載の方法。
1 7. 終脳神経細胞の分化誘導方法である、 請求の範囲 1又は 1 5記載の方法。
1 8. Sh hシグナル促進剤の存在下で培養する、 請求の範囲 1又は 1 5記載の 方法。
1 9. S h hシグナル促進剤が S h hである、 請求の範囲 1 8記載の方法。
20. 腹側終脳神経細胞への分ィヒを促進する方法である、 請求の範囲 1又は 1 5 記載の方法。
2 1. Wn tシグナル促進剤の存在下で接着培養を行う、 請求の範囲 1 5記載の 方法。
22. Wn tシグナル促進剤が Wn t 3 aである、 請求の範囲 2 1記載の方法。
23. 背側終脳神経細胞への分化を促進する方法である、 請求の範囲 1又は 1 5 記載の方法。
24. W n tシグナル促進剤及ぴ Z又は B M Pシグナル促進剤の存在下で培養す る、 請求の範囲 1記載の方法。
25. BMPシグナル促進剤及び Z又は FGFの存在下で培養する、 請求の範囲 1記載の方法。
26. 小脳神経細胞の分化誘導法である、 請求の範囲 1、 24又は 25記載の方 法。
2 7. 小脳顆粒細胞又は小脳プルキンェ細胞の分化誘導法である、 請求の範囲 1、 24又は 25記載の方法。
28. 無血清培地における胚性幹細胞の浮遊凝集体の培養中に血清を添加するこ とを特徴とする、 請求の範囲 1記載の方法。
29. S h hシグナル促進剤の存在下で培養する、 請求の範囲 28記載の方法。
30. No d a lシグナル促進剤の存在下で培養する、 請求の範囲 28又は 29 記載の方法。
31. Wn tシグナル阻害剤及び/又は N o d a 1シグナル阻害剤の存在下で培 養する、 請求の範囲 28又は 29記載の方法。
32. Le f t y— A、 Dk k 1及びァクチビンの存在下で培養する、 請求の範 囲 28記載の方法。
33. 感覚器系細胞の分化誘導法である、 請求の範囲 28記載の方法。
34. 網膜系細胞の分化誘導法である、 請求の範囲 32記載の方法。
35. 無血清培地において胚性幹細胞を浮遊凝集体として培養することにより得 られる、 胚性幹細胞の浮遊凝集体。
36. 請求の範囲 1〜 34のいずれか 1項記載の方法により得られうる細胞培養 物。
37. E S細胞から分化誘導された小脳神経細胞。
38. 小脳顆粒細胞である、 請求の範囲 37記載の細胞。
39. 小脳プルキンェ細胞である、 請求の範囲 37記載の細胞。
40. ES細胞から分化誘導された、 視細胞への分化能を有する網膜系細胞。
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