KR101268763B1 - Ｗｎｔ 신호전달 작용제를 포함하는 망막기원세포의 망막세포로의 분화 유도 또는 망막세포의 증식 유도용 조성물 - Google Patents
Ｗｎｔ 신호전달 작용제를 포함하는 망막기원세포의 망막세포로의 분화 유도 또는 망막세포의 증식 유도용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 Wnt 신호전달 작용제를 포함하는 망막기원세포 (retinal progenitor cell)의 망막세포 (retinal cell)로의 분화 유도 또는 망막세포의 증식 유도용 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 조성물은 태생기의 세포 분화과정과 유사한 과정을 재현함으로써 단기간 동안 풍부한 수의 망막세포, 특히 광수용체세포 (photoreceptor cell)의 증식 및 분화를 유도할 수 있으며, 분화 유도된 망막세포는 변성 또는 손상된 망막에 이식 시, 망막 내에서 효과적으로 생착 및 융합되어 망막 변성을 방지 또는 회복시킬 수 있는 능력을 지니고 있어 세포치료에 효과적으로 이용할 수 있다.
Description
본 발명은 단시간 내 풍부한 개수로의 망막세포의 증식을 유도하는 조성물 및 망막기원세포에서 망막세포로의 분화 유도용 조성물에 관한 것으로, 상세하게는 Wnt 신호전달 작용제를 포함하는 망막기원세포의 망막세포, 특히 광수용체세포로의 분화 유도 또는 광수용체세포의 증식 유도용 조성물에 관한 것이다.
실명(失明)은 의학적으로 광각이 없는 것을 말하며, 현재 세계적으로 전 인구의 0.2-0.5%인 수천만 명의 환자가 앓고 있는 질환으로, 개인적, 사회적 및 경제적으로 커다란 손실을 가져오고 있다. 전 세계적으로 실명의 가장 큰 원인 중 하나로서 망막의 광수용체세포 (photoreceptor cell)의 변성을 들 수 있는데, 이는 선천적 요인 또는 다른 다양한 원인들에 의해 발생한다. 망막미형성, 망막 변성 (retinal degeneration), 노인성 황반변성 (aged macular degeneration), 당뇨병성 망막 질환 (diabetic retinopathy), 망막색소변성 (retinitis pigmentosa), 선천성망막위축증, 레버씨 선천성 흑암시 (Leber congenital amaurosis), 망막박리, 녹내장 (glaucoma), 시신경병증 및 외상 등 많은 질환들이 이 질환에 해당된다. 현재까지 이 질환들에 대한 근본적인 치료를 위한 약물요법은 없으며, 이들 질환의 원인이며 결과인 기능부전의 광수용체세포를 새로운 광수용체세포로 이식하는 것이 가장 가능성 있는 치료법으로 여겨지고 있다. 광수용체세포 이식법은 망막 변성을 지연시키거나, 억제하고, 퇴화 또는 변성된 망막을 재생한 후 망막 기능을 향상시켜 실명을 방지하거나 또는 손상된 시력을 재생시킬 수 있을 것으로 평가되고 있다.
이러한 변성된 망막세포의 대체와 보호를 위한 세포치료법의 후보로 다양한 줄기세포 (stem cell), 즉, 골수줄기세포 (bone marrow stem cell: BMS), 망막줄기세포 (retinal stem cell: RSC), 배아줄기세포 (embryonic stem cell: ESC), 유도 전분화능 줄기세포 (induced pluripotent stem cell: iPSC) 및 체세포핵치환 줄기세포 (somatic cell nuclear transfer cell: SCNT) 등을 이용한 치료 가능성이 대두되고 있다.
그러나 줄기세포로부터 망막세포 (특히, 광수용체세포)로의 분화 및 이를 이용한 세포치료에 대한 연구 성과는 미진한 상태에 있다. 이들 줄기세포로부터 망막세포로의 분화가 가능할 경우 1) 효과적인 세포 치료를 위한 무한한 세포공급이 가능하며, 2) 지금까지 알려지지 않은 배아세포 (embryonic cell) 및 망막기원세포 (retinal progenitor)로부터의 망막 세포로의 분화 기전이 규명되고, 3) 망막의 분화 관련 유전자 및 분자들의 발견 및 그에 의한 병변 규명과, 4) 망막 변성질환의 발생기전 파악, 그리고 5) 망막 변성방지 및 망막 신경보호를 위한 약제 개발에도 이용 가능할 것이다.
최초의 인간 배아줄기세포주가 확립된 이후부터, 인간 배아줄기세포는 매우 다양한 종류의 세포로 분화될 수 있는 능력을 가지고 있으며, 상기 분화된 세포들이 각종 장기에서 발생하는 질환들을 치료할 수 있는 인간 세포치료법에 적용될 수 있을 것으로 제안되어 왔다. 즉, 인간 배아줄기세포는 성상을 정확히 규명할 수 있고, 임상 치료 시, 기능부전의 세포를 새로운 세포로 치환하기 위한 세포를 풍부히 공급할 수 있는 강력한 후보자로 여겨지고 있다. 인간 배아줄기세포 유래-망막 광수용체세포 (human ESC derived-retinal photoreceptor cell)를 완전히 규명된 재생 가능한 조건에서 생산하여 이식에 이용할 수 있다면, 이는 망막의 광수용체세포 질환들에 매우 강력한 그리고 효험 있는 치료법이 될 것이다. 인간 배아줄기세포에서 유도된 각종 장기를 구성하는 분화 세포들은 정상적인 분화 과정을 통해 형성되는 해당 세포들과 동일한 성상 및 기능을 가질 수 있을 것으로 가정되어 왔다. 이 가능성에 근거하여, 발달 단계와 유사한 환경을 제공하는 분화 유도법이 췌장 호르몬-발현 내분비세포 (D'Amour, et al., Nat. Biotechnol., 2006; 24: 1392-401), 신경세포 (Pankratz, et al., Stem Cells 2007; 25: 1511-20), 근육세포 (Barberi et al., Nat. Med., 2007; 13: 642-8), 혈관내피세포 (Wang, et al., Nat. Biotechnol., 2007; 25: 317-8) 분화 등에서 시도되고 있다. 망막 질환에서도 인간 배아줄기세포로부터 분화된, 망막 세포의 대표적인 세포인 광수용체세포를 생산하고자 많은 시도들이 있었으나, 성적은 매우 저조하였다.
현재까지의 가장 큰 성공 중 하나로 보고된 연구결과는 망막 기원세포가 인간 배아줄기세포로부터 효과적으로 유도되었다는 것이나, 유도된 망막 기원세포로부터 광수용체세포의 분화는 실패하였다 (분화율 0.01% 미만)(Lamba et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2006; 103: 12769-74). 또 다른 하나는 인간 배아줄기세포로부터 광수용체세포를 성공적으로 분화시켰다고 보고하였으나, 이는 총 분화 유도기간이 200일 이상 걸리며, 그 분화율도 8%로서 매우 미미하기 때문에, 이를 임상에 적용하여 실명을 치료하기에는 현실적으로 불가능한 성적이다 (Osakada et al., Nat. Biotechnol., 2008; 26: 215-24).
Wnt 신호전달은 기관의 발달이나 세포 증식, 형태, 운동성과 세포운명 결정 등과 같은 다양한 발달 과정을 조절하는 것으로 알려져 있다 (Wodarz & Nusse, Annu Rev Cell Dev Biol. 1998; 14: 59-88). 조직의 종류, 세포의 분화 정도에 따라 분화를 촉진하거나 억제하는 것으로 알려져 있으며, 현재까지 태생시 발달 및 세포 생물학과 관련하여 Wnt3a을 포함한 Wnt 신호전달 체계는 세포의 분화를 억제하고 미분화 세포의 유지 및 증식에 깊이 관여한다고 보고되어 왔다 (Aubert, et al., Nat. Biotechnol., 2002; 20: 1240-5). 그러나, 현재까지 척추동물의 눈형성 양식 (eye patterning) 및 눈의 신경발생 (neurogenesis)에 있어서, Wnt 신호전달 체계가 분화 및 증식에 미치는 영향에 대해서는 알려져 있지 않았다.
이에 본 발명자들은 생체 내의 망막세포, 특히 광수용체세포 분화 과정과 매우 유사한 환경을 시험관 내에서 새롭게 구현하여 인간 배아줄기세포로부터 망막의 광수용체세포로의 분화를 극대화하기 위해 예의 노력한 결과, 각 분화 단계별의 분화 관련 인자 및 그 억제제 실험을 통해, Wnt 신호전달 작용제가 망막세포 증식 및 줄기세포로부터 망막세포, 특히 광수용체세포로의 분화 및 성숙에 중요한 인자임을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 Wnt 신호전달 작용제를 포함하는 망막세포 증식 유도용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 Wnt 신호전달 작용제를 포함하는 망막기원세포에서 망막세포, 특히 광수용체세포로의 분화 유도용 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 하나의 양태로서 본 발명은 Wnt 신호전달 작용제를 포함하는, 망막세포 (retinal cell) 증식 유도용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 용어, "Wnt 신호전달 작용제"란 배아 발생기 동안 세포운명 결정, 구조의 재구성, 극성, 형태, 유착 및 성장, 미분화 세포의 유지와 증식 등과 같은 다양한 과정을 조절하는 Wnt 신호전달계에서 신호전달을 활성화하는 물질을 의미한다 (Logan & Nusse, Annu. Rev. Cell Dev. Biol., 2004; 20: 781-810). 이때, Wnt 신호전달계는 Wnt에 의해 매개되는 신호를 전달하거나 또는 베타-카테닌에 의해 매개되는 신호를 전달할 수 있는 것인 한, 제한 없이 포함될 수 있다. Wnt 신호전달이란 Wnt 신호전달 활성화를 유발하는 최초 물질인 Wnt와 그 수용체의 결합에 의해 시작되거나 또는 세포 내 Wnt 신호전달의 하위 효과물질인 베타-카테닌 (beta-catenin)의 안정화로 인해 매개되는 일련의 반응을 말한다. Wnt 신호전달 작용제는 다음과 같다.
1) Wnt 단백질의 직접적 첨가: Wnt 신호전달을 유발하는 최초 물질인 Wnt는 분비성 당단백질로 19종류가 알려져 있다: Wnt1, Wnt2, Wnt2b, Wnt3, Wnt3a, Wnt4, Wnt5a, Wnt5b, Wnt6, Wnt7a, Wnt7b, Wnt8a, Wnt8b, Wnt9a, Wnt9b, Wnt10a, Wnt10b, Wnt11, Wnt16b 등이 있다.
2) 베타-카테닌을 증가시키는 물질: 대부분의 세포는 베타-카테닌 증가에 의해 Wnt 신호전달에 반응한다. 즉, 베타-카테닌의 비인산화형 (또는 안정화) 증가는 세포의 핵 내의 베타-카테닌 유입의 증가를 의미한다.
3) Dishevelled의 인산화 또는 Wnt의 보조수용체인 LRP 꼬리의 인산화.
4) GSK3（glycogen synthase kinase 3: 글루코겐 합성효소 키나제)의 억제제: 리튬 (Li), LiCl, 이가 아연 (bivalent Zn), BIO (6-bromoindirubin-3'-oxime), SB216763, SB415286, QS11 수화물 (QS11 hydrate), TWS119, 켄폴론 (Kenpaullone), 알스터폴론 (alsterpaullone), 인디루빈-3-옥심 (Indirubin-3′-oxime), TDZD-8, Ro 31-8220 메탄설폰산염 (Ro 31-8220 methanesulfonate salt) 등이 있다.
5) Axin, APC 등과 같은 Wnt 신호전달계의 음성적 조절자 (negative regulator)를 억제하는 물질이나, RNAi 등이 있다.
6) 노린 (Norrin), R-스폰딘 2 (R-spondin2) 등과 같이 Wnt 신호전달계를 활성화시킬 수 있는 단백질 : 노린은 Frizzled 4 수용체와 결합하며, R-스폰딘 2는 Frizzled 8 및 LRP6와 반응한다.
7) 트랜스펙션 (transfection) 등을 포함하는 유전자 전이 (gene transfer): Wnt 과발현 구성물 또는 베타-카테닌 과발현 구성물을 이용할 수 있다.
바람직한 일 실시태양으로 상기 Wnt 신호전달 작용제는 Wnt 신호전달을 활성화시킬 수 있는 물질은 제한 없이 사용할 수 있으며, 그 예로는 Wnt1, Wnt2, Wnt2b, Wnt3, Wnt3a, Wnt4, Wnt5a, Wnt5b, Wnt6, Wnt7a, Wnt7b, Wnt8a, Wnt8b, Wnt9a, Wnt9b, Wnt10a, Wnt10b, Wnt11, Wnt16b; 베타-카테닌을 증가시키는 물질; 리튬, LiCl, 이가 아연, BIO, SB216763, SB415286, CHIR99021, QS11 수화물, TWS119, 켄폴론, 알스터폴론, 인디루빈-3-옥심, TDZD-8 또는 Ro 31-8220 메탄설폰산염인 GSK3 억제제; Axin 억제제, APC 억제제, 노린 또는 R-스폰딘 2이며, 가장 바람직하게는 Wnt3a, Wnt1, Wnt5a, Wnt11, 노린, LiCl, BIO 또는 SB415286이다.
바람직한 일 실시태양으로 상기 망막세포 증식 유도용 조성물에 사용되는 Wnt 신호전달 작용제의 농도는, 상기 Wnt 신호전달 작용제 중 LiCl, BIO 및 SB415286을 제외한 나머지는 0.01~500 ng/ml이며, 바람직하게는 0.1~200 ng/ml이며, 더 바람직하게는 1~100 ng/ml이다. 상기 Wnt 신호전달 작용제 중 LiCl의 배지 내 농도는 0.1~50 mM이고, 바람직하게는 2.5~5 mM이며, BIO의 배지 내 농도는 0.1~50 μM이고, 바람직하게는 1~10 μM이며, SB415286의 배지 내 농도는 0.1~500 μM이고, 바람직하게는 1~100 μM이다. 본 발명의 일 구현예에서는, Wnt3a 및 Wnt1의 경우에는 50 ng/ml, Wnt5a 및 Wnt11의 경우에는 50 ng/ml 또는 100 ng/ml, 노린의 경우에는 50 ng/ml, LiCl의 경우에는 2.5 mM 또는 5 mM, BIO의 경우에는 2 μM, SB415286의 경우에는 30 μM의 농도로 사용한다.
본 발명에서 용어, "망막 (retina)"이란 안구의 가장 안쪽에 위치한 투명한 신경막으로서 시각과 직접적인 관련이 있다. 망막의 바깥쪽은 색소상피세포들로 이루어진 망막색소상피층이 덮고 있다. 넓은 의미로는 내층의 신경망막과 외층의 망막색소상피층을 포함하여 망막이라고도 일컫는다. 망막은 안구의 뒤쪽 2/3에 형성되어 있으며, 발생학적으로는 뇌의 일부가 튀어나와 자라서 생긴 조직이다. 망막은 모두 5층으로 이루어진 5단 케익 모양을 하고 있는데, 3층의 신경핵층이 존재하고, 그 사이를 2층의 신경망층이 채우고 있는 구조이다. 3층의 신경핵층은 가장 바깥쪽의 광수용체세포의 핵들로 이루어진 외핵층과 수평세포 (horizontal cell), 두극세포 (bipolar cell), 무축삭세포 (amacrine cell), 뮐러아교세포 (Muller glial cell 또는 Muller cell) 핵들로 이루어진 내핵층, 가장 안쪽의 망막신경절세포 (retinal ganglion cell: RGC)의 핵들로 이루어진 망막신경절세포층으로 구성되어 있다. 눈의 각막과 렌즈를 통과한 빛은 망막신경절세포층, 내핵층을 차례로 거쳐 외핵층에 도달하며, 외핵층을 구성하고 있는 광수용체세포에서 빛에 의한 신경흥분이 일어난다. 신경흥분은 빛의 유입 과정과 반대 방향으로 전도되는데, 광수용체세포가 빛에 의해 자극되면 신경전류가 내핵층으로 전달되고 다음으로 망막신경절세포층를 통하여 시신경섬유로 전달된다.
본 발명에서 용어, "망막세포 (retinal cell)"란 망막을 구성하는 세포들로서, 간상체 및 원추체 광수용체세포를 포함하는 광수용체세포, 망막신경절세포, 수평세포, 두극세포, 무축삭세포, 뮐러아교세포 및 색소상피세포를 포함한다. 본 발명의 증식 유도용 조성물은 망막세포를 증식시키며, 이 중 광수용체세포를 특이적으로 증식시킨다.
본 발명에서 용어, "광수용체세포 (photoreceptor cell)"란 각막과 렌즈를 통해서 들어온 빛에너지를 세포 내 시각색소를 이용해 전기에너지로 변환시켜 뇌로 전달케하는, 형태와 색채를 인지하게 하는 시각의 가장 중요한 세포를 의미한다. 광수용체세포층에는 밝은 빛을 수용하는 원추체 세포와 약한 빛을 수용하는 간상체 세포가 있다. 원추체 세포는 망막의 중앙부인 황반 부근에 많이 분포하여, 형태와 색채를 인지하는 역할을 하는 반면, 간상체 세포는 망막의 주변부에 주로 분포하며, 형태와 명암을 인지하는 역할을 한다. 광수용체세포는 리커버린 (Recoverin, 간상체 광수용체세포 및 원추체 광수용체세포), 로돕신 (Rhodopsin, 간상체 광수용체세포), 페리페린2 (Peripherin2, 간상체 광수용체세포), 롬1 (rom1, 간상체 광수용체세포, 원추체 광수용체세포), Pde6b (간상체 광수용체세포), 어레스틴 새그 (Arrestin sag, 간상체 광수용체세포), 포스듀신 (Phosducin, 간상체 광수용체세포 및 원추체 광수용체세포), 시냅토피신 (Synaptophysin, 간상체 광수용체세포 및 원추체 광수용체세포), 빨강/초록옵신 (red/green opsin, 원추체 광수용체세포), 파랑옵신 (blue opsin, 원추체 광수용체세포) 등과 같은 마커들이 1개 이상, 2개 이상, 또는 3개 이상 발현되는 특징 등을 가질 수 있다.
바람직한 일 실시태양으로, 본 발명의 망막세포 또는 광수용체세포는 인간을 포함한 동물에서 유래할 수 있으며, 동물이란 인간 및 영장류뿐만 아니라, 소, 돼지, 양, 말, 개, 쥐 (마우스), 랫트 및 고양이 등의 가축을 포함하며, 바람직하게는 인간 유래의 광수용체세포이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, Wnt 신호전달 작용제가 망막세포의 증식에 중요한 인자임을 확인하기 위하여, Wnt 신호전달 작용제인 Wnt3a (W), Shh 신호전달 작용제인 Shh (S) 및 레티노산 (R)을 조합하여 배양액을 만들어, 각 배양액별로 인간 배아줄기세포에 투여하는 시간을 달리하여 29일간 배양한 후 분화된 망막세포의 총 세포수를 분석하였다 (실시예 9).
그 결과, 총 세포수는 W+/S+/R+가 3.98 (± 0.64) × 106으로 제일 많았으며, 그 다음은 W+/S-/R+와 W+/S+/R-로 각각 2.74 (± 0.36) × 106과 2.21 (± 0.67) × 106이었다. W-/S-/R-와 W-/S+/R+는 0.87 (± 0.38) × 106 과 0.73 (± 0.16) × 106으로 제일 낮았다 (도 23 및 표 8). 상기 결과는 세포 증식의 효과는 S와 R의 존재 유무와 상관없이 W의 존재 유무에 좌우되는 것으로, 세포 증식 대부분이 Wnt3a의 효과임을 확인하였다. 특히, 두 배양액 W+/S+/R+와 W-/S+/R+의 경우를 비교하면, 3.98 × 106 대 0.73 × 106으로서 5배 이상 차이를 보였다 (도 23 및 표 8). 이는 Wnt3a가 세포증식에 주된 역할을 하는 분화인자임을 다시 한 번 강조하는 것이다. 상기 결과에 따라 (W+/S+/R+) 배양액에서 4주간 배양한 결과, 미분화세포가 3.98 × 106개의 분화세포로 증식하였는데 (도 23 및 표 8), 이는 최초 접종된 세포의 257배에 해당하는 세포수로 Wnt 신호전달 작용제가 망막세포 증식에 사용될 수 있음을 처음으로 밝힌 것이다.
본 발명에서 용어, "줄기세포"란 동물의 내배엽 (endoderm), 중배엽 (mesoderm) 및 외배엽 (ectoderm)유래의 세포로 분화할 수 있는 전분화능 (pluripotency), 또는 조직 또는 기능에 있어 밀접하게 관련된 세포로 분화할 수 있는 다분화능 (multipotency)을 갖는 세포를 의미한다.
본 발명에서 동물이란 인간 및 영장류뿐만 아니라, 소, 돼지, 양, 말, 개, 쥐 (마우스), 랫트 및 고양이 등의 가축을 포함하며, 바람직하게는 인간이다.
본 발명에서 용어, "배아줄기세포"란 동물 수정란이 모체의 자궁에 착상하기 직전인 포배기 배아에서 내세포괴를 추출하여 체외에서 배양한 것으로 동물의 모든 세포로 분화할 수 있는 전분화능 (pluripotency)을 가지는 세포를 의미하며, 이에 제한되는 것은 아니나, 넓은 의미로는 배아줄기세포로부터 유래한 배아체 (embryoid body) 또는 유도 전분화능 줄기세포 (induced pluripotent stem cell: iPS cell)와 같은 유사 줄기세포들도 포함한다.
본 발명에서 용어, "성체줄기세포"란 각 조직 내 존재하는 줄기세포를 분리해 체외에서 배양한 것으로 다분화능 (multipotency)을 가지는 세포를 의미하며, 골수줄기세포, 망막줄기세포, 망막 내 뮐러아교세포, 신경줄기세포 등이 있다.
하나의 양태로서 본 발명은 Wnt 신호전달 작용제를 포함하는, 망막기원세포 (retinal progenitor cell)에서 망막세포로의 분화 유도용 조성물을 제공한다. 바람직하게는 상기 망막세포는 광수용체세포일 수 있다.
본 발명에서 용어, "망막기원세포 (retinal progenitor cell)"란 망막에 존재하는 세포 및 망막색소상피세포로의 분화를 결정지을 수 있는 다분화능 (multipotent)을 가진 기원세포를 말한다. 망막기원세포는 다양한 줄기세포, 즉 망막줄기세포, 골수줄기세포, 지방줄기세포, 신경줄기세포, 배아줄기세포, 유도 전분화능 줄기세포, 체세포핵치환 줄기세포 등에서 분화가 유도된 세포이거나, 망막 내 존재 또는 추출된 망막기원세포일 수 있다. 망막기원세포는 일반적으로 대칭적 (symmetric) 또는 비대칭적 분열 (asymmetric division)을 할 수 있으며, 그 결과 다양한 망막세포들이나 망막색소상피세포로 분화하거나, 또는 증식과정을 통해 또 다른 망막기원세포를 형성할 수도 있어, 본 발명에서 "망막기원세포로 분화시키는 단계"의 세포들은 망막기원세포 이외에도 줄기세포로부터 망막세포로의 분화 과정 동안에 생성되는 다양한 단계의 세포들이 포함됨을 이해하여야 할 것이다. 망막기원세포로서는 신경 망막기원세포 (neural retinal progenitor cell)와 망막색소상피 기원세포 (retinal pigmented epithelial progenitor cell)가 있으며, Rax, Pax6, Chx10, Otx2, Sox2, Lhx2, Six3, Six6, Mitf 등과 같은 마커가 1개 이상, 2개 이상 또는 3개 이상 발현되는 특징을 가질 수 있다.
본 발명에서 용어, "기원세포 (progenitor cell)" 또는 "전구체 (precursor)"란 비대칭적 분열을 할 수 있는 세포를 의미하며, 비대칭적 분열로 인해 각 세포마다 계대수가 동일하더라도, 분화되는 쪽도 있고 증식되는 쪽도 있어서 나이 및 성질이 다를 수 있다.
본 발명에서 용어, "망막기원세포 (retinal progenitor cell)"는 상기한 바와 같이 망막 발생과정과 관련하여 다양한 종류의 망막 내 세포 (간상체 및 원추체 광수용체세포, 망막신경절세포, 수평세포, 두극세포, 무축삭세포, 뮐러아교세포)와 망막색소상피로 분화할 수 있으며, 그에 따른 발현 특징으로 Crx, 리커버린, 로돕신, 빨강/초록옵신, 파랑옵신, 페리페린2, PDE6B, SAG, Islet1/NF200, Prox1, PKC-a, Hu C/D, GFAP, RPE65 등에 해당하는 마커가 양성을 나타낼 수 있다. 그러나, 이와 같은 마커들의 발현은 성숙한 망막세포들이나 망막색소상피에서보다 강도가 미약하고, 발현의 양성비율은 낮다.
본 발명에서 용어, "신경 망막기원세포 (neural retinal progenitor cell)"란 망막기원세포 중 신경을 이루는 신경 망막기원세포로 분화된 세포를 의미한다. 즉, 신경 망막기원세포는 망막 내 신경세포 (간상체 및 원추체 광수용체세포, 망막신경절세포, 수평세포, 두극세포, 무축삭세포, 뮐러아교세포)로의 분화를 결정지을 수 있는 기원세포를 의미한다. 신경 망막기원세포는 일반적으로 대칭적 또는 비대칭적 분열을 할 수 있으며, 그 결과 다양한 망막세포로 분화하거나, 또는 증식과정을 통해 또 다른 신경 망막기원세포를 형성할 수도 있어, 본 발명에서 "신경 망막기원세포로 분화시키는 단계"의 세포들은 신경 망막기원세포 이외에도 줄기세포로부터 망막세포로의 분화 과정 동안에 생성되는 다양한 단계의 세포들이 포함됨을 이해하여야 할 것이다. 신경 망막기원세포는 Rax, Pax6, Chx10, Crx 등과 같은 마커가 1개 이상, 2개 이상 또는 3개 이상 발현되는 특징을 가질 수 있다.
신경 망막기원세포는 상기한 마커와 더불어 분화의 다음 단계 세포인 광수용체세포 전구체와 광수용체세포의 마커인 Crx, 리커버린, 로돕신 등을 발현하는 특징을 가질 수 있다. 신경 망막기원세포는 분화의 전단계 세포인 망막기원세포의 마커인 Otx2, Sox2, Lhx2, Six3, Six6 및 Mitf 등이 감소되는 특징을 가질 수 있다.
본 발명에서 용어, "망막색소상피 기원세포 (retinal pigmented epithelial progenitor cell)"란 망막기원세포 중 망막색소상피를 이루는 망막색소상피 기원세포로 분화된 세포를 의미한다. 망막색소상피 기원세포는 Mift 및 Pax6 등과 같은 마커가 1개 이상 또는 2개 이상 발현되는 특징을 가질 수 있다.
바람직한 일 실시태양으로, 상기 망막기원세포에서 망막세포로의 분화 과정은, (a) 망막기원세포를 Wnt 신호전달 작용제를 포함하는 배지에서 배양하여 신경 망막기원세포 (neural retinal progenitor cell)로 분화시키는 단계; (b) 상기 (a) 단계의 신경 망막기원세포를 Wnt 신호전달 작용제를 포함하는 배지에서 배양하여 광수용체세포 전구체 (photoreceptor cell precursor)로 분화시키는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계의 광수용체세포 전구체를 Wnt 신호전달 작용제를 포함하는 배지에서 배양하여 광수용체세포 또는 광수용체세포를 포함하는 망막세포로 분화시키는 단계를 수행하여 이루어질 수 있다.
본 발명에서 용어, "광수용체세포 전구체 (photoreceptor cell precursor)"란 광수용체세포로의 분화를 결정지을 수 있는 전구세포를 의미한다. 광수용체세포 전구체는 Crx (간상체 및 원추체 광수용체세포 전구체), Nrl (간상체 광수용체세포 전구체) 등과 같은 마커들이 1개 이상 또는 2개 이상 발현되는 특징을 가질 수 있다. 따라서 광수용체세포 전구체는 상기한 마커와 더불어 분화되어가는 광수용체세포의 마커인 리커버린, 로돕신, 페리페린2, 롬1 등을 1개 이상, 2개 이상, 또는 3개 이상 발현되는 특징을 가질 수 있다.
바람직한 일 실시태양으로, 상기 Wnt 신호전달 작용제는 Wnt 신호전달을 활성화시킬 수 있는 물질은 제한 없이 사용할 수 있으며, 그 예로는 Wnt1, Wnt2, Wnt2b, Wnt3, Wnt3a, Wnt4, Wnt5a, Wnt5b, Wnt6, Wnt7a, Wnt7b, Wnt8a, Wnt8b, Wnt9a, Wnt9b, Wnt10a, Wnt10b, Wnt11, Wnt16b; 베타-카테닌을 증가시키는 물질; 리튬, LiCl, 이가 아연, BIO, SB216763, SB415286, CHIR99021, QS11 수화물, TWS119, 켄폴론, 알스터폴론, 인디루빈-3-옥심, TDZD-8 또는 Ro 31-8220 메탄설폰산염인 GSK3 억제제; Axin 억제제, APC 억제제, 노린 또는 R-스폰딘 2이며, 가장 바람직하게는 Wnt3a, Wnt1, Wnt5a, Wnt11, 노린, LiCl, BIO 또는 SB415286이다.
바람직한 일 실시태양으로 상기 망막세포 증식 유도용 조성물에 사용되는 Wnt 신호전달 작용제의 농도는, 상기 Wnt 신호전달 작용제 중 LiCl, BIO 및 SB415286을 제외한 나머지는 0.01~500 ng/ml이며, 바람직하게는 0.1~200 ng/ml이며, 더 바람직하게는 1~100 ng/ml이며, 가장 바람직하게는 50 ng/ml이다. 상기 Wnt 신호전달 작용제 중 LiCl의 배지 내 농도는 0.1~50 mM이고, 바람직하게는 0.5~10 mM이며, 더 바람직하게는 1~10 mM이며; BIO의 배지 내 농도는 0.1~50 μM이고, 바람직하게는 0.1~10 μM이며, 더 바람직하게는 0.5~5 μM이며; SB415286의 배지 내 농도는 0.1~500 μM이고, 바람직하게는 1~100 μM이며, 더 바람직하게는 5~50 μM이다. 본 발명의 일 구현예에서는, Wnt3a 및 Wnt1의 경우에는 50 ng/ml, Wnt5a 및 Wnt11의 경우에는 50 ng/ml 또는 100 ng/ml, 노린의 경우에는 50 ng/ml, LiCl의 경우에는 2.5 mM 또는 5 mM, BIO의 경우에는 2 μM, SB415286의 경우에는 30 μM의 농도로 사용한다.
바람직한 일 실시태양으로 상기 (a) 단계의 망막기원세포를 신경 망막기원세포로 분화시키는 단계의 조성물은 IGF1R 작용제, BMP 신호전달 억제제, FGF 신호전달 작용제를 추가로 포함시킬 수 있고; 상기 (b) 단계의 신경 망막기원세포를 광수용체세포 전구체로 분화시키는 조성물은 상기 (a) 단계의 조성물에서 BMP 신호전달 억제제 및 FGF 신호전달 작용제를 제거하고, Shh 신호전달 작용제를 추가로 포함시킬 수 있고; 및 상기 (c) 단계의 광수용체세포 전구체를 광수용체세포 또는 광수용체세포를 포함하는 망막세포로 분화시키는 단계의 조성물은 상기 (b) 단계의 조성물에 RA를 추가로 포함할 수 있다.
이때, 상기 망막기원세포는 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법뿐만 아니라, 망막기원세포의 특징을 갖는 세포를 얻을 수 있는 방법이라면 이를 제한 없이 사용하여 수득할 수 있으나, 바람직하게는 상기 망막기원세포들은 (a') 줄기세포를 IGF1R 작용제, Wnt 신호전달 억제제 및 BMP 신호전달 억제제를 포함하는 배지에서 배양하여 부유 응집체 형태의 안구영역전구체 (eye field precursor)로 분화시키는 단계; 및 (b') 상기 (a') 단계의 부유 응집체 형태의 안구영역전구체를 FGF 신호전달 작용제를 추가로 포함하는 배지에서 배양하여 망막기원세포 (retinal progenitor cell)로 분화시키는 단계에 의해 수득되는 세포일 수 있다.
바람직한 일 실시태양으로, 상기 부유 응집체 형태의 안구영역전구체를 플레이트에 접착시켜 배양할 수 있으며, 세포 접착성의 플레이트는 당업계에 공지된 플레이트를 제한 없이 사용할 수 있으나, 바람직하게는 세포외 기질 (extracellular matrix), 예를 들면, 폴리-디-라이신, 라미닌, 폴리-L-라이신, 메트리젤 (matrigel), 아가 (agar), 폴리오르니틴 (polyornithine), 젤라틴, 콜라겐, 피브로넥틴 (fibronectin), 비트로넥틴 (vitronectin) 등으로 코팅된 플레이트를 사용할 수 있으며, 가장 바람직하게는 폴리-디-라이신/라미닌 플레이트에 접착시켜서 배양할 수 있다.
상기 플레이트에 접착시키는 부유 응집체 당 세포수는 최적의 효율을 나타낼 수 있는 세포수일 수 있으며, 200~400개로 이루어진 부유 응집체인 것이 바람직하다.
바람직한 일 실시태양으로, 상기 줄기세포는 이에 제한되는 것은 아니나, 골수줄기세포, 지방줄기세포, 양수줄기세포, 신경줄기세포, 망막줄기세포, 망막 내 뭘러아교세포, 배아줄기세포, 유도 전분화능 줄기세포 또는 체세포핵치환줄기세포를 포함하며, 가장 바람직하게는 인간 배아줄기세포 또는 유도 전분화능 줄기세포이다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 분화방법에 의해 인간 배아줄기세포뿐만 아니라 유도 전분화능 줄기세포도 광수용체세포를 포함하는 망막세포로 분화하는 것을 확인하였다.
본 발명에서 용어, "안구영역전구체 (eye field precursor)"란 태아발생기 분화과정에서 전뇌 신경판의 안구영역 (eye field)을 구성하는 기원세포에 특이적인 마커들 (eye field transcription factors; Zuber, et al., Development, 2003; 130: 5155-67)을 발현하는 기원세포를 의미한다. Six3, Rax, Pax6, Otx2, Lhx2, Six6 등과 같은 마커들이 1개 이상, 2개 이상 또는 3개 이상 발현되는 특징을 가질 수 있다.
본 발명에서 용어, "부유 응집체"란 배아줄기세포들의 집락을 마우스 체세포영양세포주 (MEF)와 혈청 공급 없이 비접착성의 배양기에서 최소 1일 이상 배양했을 때 형성되는 배지 내에 떠있는 세포 덩어리를 의미한다. 공급되는 배지의 조성에 따라 안구영역 전사인자 (eye field transcription factors)를 발현하는 안구영역전구체의 성격을 가질 수 있다.
본 발명에서 용어, "Wnt 신호전달 억제제"란 세포 외에 존재하는 Wnt 단백질과 세포막에 존재하는 Frizzled 수용체나 보조수용체인 LRP간의 결합을 방지하거나 또는 세포 내에서 Wnt에 의해 매개되는 신호전달을 억제하는 물질을 의미한다 (Kawano & Kypta, J. Cell Sci., 2003; 116: 2627-34). Wnt 신호전달 억제제는 Wnt에 의해 매개되는 신호전달을 억제할 수 있는 것인 한 특히 한정되지 않는다. Wnt 신호전달 억제제로서는 예를 들면, 보조수용체인 LRP의 억제제의 일종인 Dkk (Dickkopf) 패밀리 (Dkk-1, Dkk-2, Dkk-3 및 Dkk-4), Wise, Wnt 수용체 억제제 (sFRP: secreted Frizzled-related protein) 패밀리, Frizzled의 CRD 결합 도메인 (Frizzled-CRD domain)，WIF-1 (Wnt inhibitory factor-1), IWP-2, IWP-3, IWP-4, 서버러스, Wnt 항체, 도미넌트 네가티브 Wnt 단백, Axin의 과발현, APC (adenomatous polyposis coli)의 과발현, GSK (글루코겐 합성효소 키나제)의 과발현, 도미넌트 네가티브 TCF, 도미넌트 네가티브 Dishevelled 또는 카제인키나제 억제제 (CKI-7, D4476 등) 등을 들 수 있다. 바람직하게는 Dkk-1이다.
또한, 본 발명에서는 상기 Wnt 신호전달 억제제 이외에 RNAi와 같이 Wnt 신호전달계에 관여하는 각각의 구성요소를 억제하는 방법을 통해 Wnt 신호전달을 억제할 수도 있다.
바람직한 일 실시태양으로, 상기 IGF1R 작용제는 IGF-1 또는 IGF-2이며, 바람직하게는 IGF-2이다. 상기 IGF1R 작용제의 배지 내 농도는 0.01~100 ng/ml이며, 바람직하게는 0.1~50 ng/ml, 더 바람직하게는 1~20 ng/ml이며, 가장 바람직하게는 10 ng/ml이다.
바람직한 일 실시태양으로, 상기 BMP 신호전달 억제제는 노긴, 코르딘, 트위스티드 낭배형성 인자, 서버러스, 코코, 그렘린, PRDC, DAN, 단테, 폴리스타틴, USAG-1, 도조모르핀 또는 스클레로스틴이며, 바람직하게는 노긴이다. 상기 BMP 신호전달 억제제의 배지 내 농도는 0.01~100 ng/ml이며, 바람직하게는 0.1~50 ng/ml이며, 더 바람직하게는 0.5~20 ng/ml이며, 가장 바람직하게는 10 ng/ml이다.
바람직한 일 실시태양으로, 상기 FGF 신호전달 작용제는 FGFR 1c 또는 FGFR 3c를 활성화시키는 물질, FGF1, FGF2, FGF4, FGF8, FGF9, FGF17 또는 FGF19이며, 바람직하게는 FGF2이다. 상기 FGF 신호전달 작용제의 배지 내 농도는 0.01~100 ng/ml이며, 바람직하게는 0.1~50 ng/ml이며, 더 바람직하게는 1~20 ng/ml이며, 가장 바람직하게는 5 ng/ml이다.
바람직한 일 실시태양으로, 상기 Wnt 신호전달 작용제는 Wnt1, Wnt2, Wnt2b, Wnt3, Wnt3a, Wnt4, Wnt5a, Wnt5b, Wnt6, Wnt7a, Wnt7b, Wnt8a, Wnt8b, Wnt9a, Wnt9b, Wnt10a, Wnt10b, Wnt11, Wnt16b, 베타-카테닌을 증가시키는 물질, 리튬, LiCl, 이가 아연, BIO, SB216763, SB415286, CHIR99021, QS11 수화물, TWS119, 켄폴론, 알스터폴론, 인디루빈-3-옥심, TDZD-8, Ro 31-8220 메탄설폰산염, Axin 억제제, APC 억제제, 노린 또는 R-스폰딘 2이며, 가장 바람직하게는 Wnt3a, Wnt1, Wnt5a, Wnt11, 노린, LiCl, BIO 또는 SB415286이다. 상기 Wnt 신호전달 작용제의 배지 내 농도는, Wnt 신호전달 작용제 중 LiCl, BIO 및 SB415286을 제외한 나머지는 0.01~500 ng/ml이며, 바람직하게는 0.1~200 ng/ml이며, 더 바람직하게는 1~100 ng/ml이며, 가장 바람직하게는 50 ng/ml이다. 상기 Wnt 신호전달 작용제 중 LiCl의 배지 내 농도는 0.1~50 mM이고, 바람직하게는 0.5~10 mM이며, 더 바람직하게는 1~10 mM이며; BIO의 배지 내 농도는 0.1~50 μM이고, 바람직하게는 0.1~10 μM이며, 더 바람직하게는 0.5~5 μM이며; SB415286의 배지 내 농도는 0.1~500 μM이고, 바람직하게는 1~100 μM이며, 더 바람직하게는 5~50 μM이다. 본 발명의 일 구현예에서는, Wnt3a 및 Wnt1의 경우에는 50 ng/ml, Wnt5a 및 Wnt11의 경우에는 50 ng/ml 또는 100 ng/ml, 노린의 경우에는 50 ng/ml, LiCl의 경우에는 2.5 mM 또는 5 mM, BIO의 경우에는 2 μM, SB415286의 경우에는 30 μM의 농도로 사용한다.
바람직한 일 실시태양으로, 상기 Shh 신호전달 작용제는 Shh, Smo 수용체의 활성화 물질, Ptc에 의한 Smo 억제 작용의 억제제, Ci/Gli 단백질 패밀리를 증가시키는 물질, Ci/Gli 단백질의 세포 내 분해 억제제 또는 Shh 수용체 작용제인 Hg-Ag 또는 퍼모파민이며, 바람직하게는 Shh 또는 퍼모파민이다. 상기 Shh 신호전달 작용제의 배지 내 농도는 0.1~5,000 ng/ml이며, 바람직하게는 1~2,500 ng/ml이며, 더 바람직하게는 10~1,000 ng/ml이며, 가장 바람직하게는 250 ng/ml이다. 본 발명의 일 구현예에서는, 250 ng/ml의 Shh 또는 1 μM의 퍼모파민을 사용한다.
바람직한 일 실시태양으로 상기 RA는 트란스형 레티노산 또는 시스형 레티노산을 사용할 수 있으며, 상기 RA의 농도는 0.5~10,000 nM이며, 바람직하게는 5~5,000 nM이며, 더 바람직하게는 50~2,000 nM이며, 가장 바람직하게는 500 nM이다.
바람직하게는 상기 (a') 단계는 분화 유도 시작 후 1일∼30일간 수행하고, (b') 단계는 5일∼15일간 수행하고, (a) 단계는 1일∼30일간 수행하고, (b) 단계는 1일∼30일간 수행하고, (c) 단계는 1일∼60일간 수행하며, 가장 바람직하게는 (a') 단계는 4일, (b') 단계는 9일, (a) 단계는 5일, (b) 단계는 3일, (c) 단계는 8일~15일 동안 수행할 수 있으며, 줄기세포로부터 망막세포로의 분화 완료까지 약 29일이 소요되므로, 임상 치료에 효율적으로 이용될 수 있다.
상기 (a') 단계의 안구영역전구체로 분화시키는 단계는 태생기의 전뇌 발달을 유도 및 촉진하기 위해서는 Wnt와 BMP 신호전달 체계가 억제되어야 하기 때문에 (Piccolo, et al., Nature, 1999; 397: 707-10), Wnt 신호전달 억제제인 Dkk-1과 BMP 억제제로서 노긴을 포함하고, 전뇌의 안구영역 형성을 촉진하기 위해서 IGF1R 작용제로서 IGF-1를 포함하는 배지에서 배양한다.
(a') 단계에서 사용한 배지는 바람직하게는 0.01~100 ng/ml의 IGF-1, 0.01~10,000 ng/ml의 Dkk-1 및 0.01~100 ng/ml의 노긴을 포함하고, 가장 바람직하게는 5 ng/ml의 IGF-1, 1 ng/ml의 Dkk-1 및 1 ng/ml의 노긴을 포함할 수 있다.
또한, (a') 단계의 안구영역전구체로 분화시키는 단계에 사용되는 기본 배지는 당업계에서 통상적으로 사용되는 줄기세포 배양용 배지들을 제한 없이 사용할 수 있으나, 바람직하게는 10% 넉아웃 혈청 대체제, 1 mM 엘-글루타민, 0.1 mM 비필수아미노산, 0.1 mM 머캅토에탄올, 1% B27 보충제 (B27 supplement)가 포함된 DMEM/F12 배지를 사용할 수 있다
상기 (b') 단계의 망막기원세포로 분화시키는 단계는 Wnt 신호전달 억제제로서 Dkk-1과 BMP 억제제로서 노긴에 더하여, 전뇌의 안구영역 형성을 촉진하기 위한 IGF1R 작용제로서 IGF-1 및 망막기원세포의 증식을 촉진하기 위한 FGF 신호전달 작용제로서 FGF2를 포함하는 배지에서 수행한다.
(b') 단계의 배지는 바람직하게는 0.01~100 ng/ml의 IGF-1, 0.01~10,000 ng/ml의 Dkk-1, 0.01~100 ng/ml의 노긴 및 0.01~100 ng/ml의 FGF2를 포함하고, 가장 바람직하게는 10 ng/ml의 IGF-1, 10 ng/ml의 Dkk-1, 10 ng/ml의 노긴 및 5 ng/ml의 FGF2를 포함할 수 있다.
상기 (a) 단계의 신경 망막기원세포로 분화시키는 단계는 (b') 단계에서 수득된 망막기원세포를 신경 망막기원세포로 분화시키기 위해서, 신경 망막기원세포 발생에 필수적으로 요구되는 Pax6을 높은 비율로 유도, 생성하기 위해 Wnt 신호전달 억제제인 Dkk-1을 제거하고, Wnt 신호전달 활성화를 위한 Wnt 단백질인 Wnt3a를 포함하고, 태생기의 눈소포 (optic vesicle)와 눈술잔 (optic cup) 발생 단계에서 배쪽 (ventral) 망막색소상피를 신경계 망막으로 전환시키는 노긴, 망막색소상피 형성에 필요한 유전자들을 억제하고 신경 망막기원세포로 변화 분화시키는 FGF2 및 광수용체세포의 항세포사멸 (antiapoptosis)의 역할을 갖는 IGF-1을 포함하는 배지에서 수행한다.
상기 (a) 단계의 배지는 바람직하게는 0.01~100 ng/ml의 IGF-1, 0.01~100 ng/ml의 노긴, 0.01~100 ng/ml의 FGF2 및 0.01~500 ng/ml의 Wnt3a를 포함하고, 가장 바람직하게는 10 ng/ml의 IGF-1, 10 ng/ml의 노긴, 5 ng/ml의 FGF2 및 50 ng/ml의 Wnt3a를 포함할 수 있다.
상기 (b) 단계의 광수용체세포 전구체로 분화시키는 단계는 Shh 신호를 저해하는 노긴을 제거하고, Shh에 의해 유도되는 로돕신 발현을 방해하지 않도록 FGF2를 제거하고, 간상체 광수용체세포 전구체를 증식시키는 효과가 있는 IGF-1, 광수용체세포로의 분화를 진행하는 Wnt 신호전달 활성화를 위한 Wnt 단백질로서 Wnt3a, 및 Shh를 포함하는 배지에서 수행한다.
상기 (b) 단계의 배지는 바람직하게는 0.01~100 ng/ml의 IGF-1, 0.01~500 ng/ml의 Wnt3a 및 0.1~5,000 ng/ml의 Shh를 포함하고, 가장 바람직하게는 10 ng/ml의 IGF-1, 50 ng/ml의 Wnt3a 및 250 ng/ml의 Shh를 포함할 수 있다.
상기 (c) 단계의 광수용체세포로 분화시키는 단계는 IGF-1, Wnt 신호전달 활성화를 위한 Wnt 단백질로서 Wnt3a, Shh, 및 광수용체세포의 분화를 좀 더 증진, 성숙시키기 위한 RA (retinoic acid)를 포함하는 배지에서 배양한다.
상기 (c) 단계의 배지는 바람직하게는 0.01~100 ng/ml의 IGF-1, 0.01~500 ng/ml의 Wnt3a, 0.01~5,000 ng/ml의 Shh 및 0.5~10,000 nM의 RA를 포함하고, 가장 바람직하게는 10 ng/ml의 IGF-1, 50 ng/ml의 Wnt3a, 250 ng/ml의 Shh 및 500 nM의 RA를 포함할 수 있다.
상기 (a) 내지 (c) 단계에서, Wnt3a의 대체물로서 Wnt1, Wnt5a, Wnt11, 노린, LiCl, BIO 또는 SB415286을 사용할 수 있고, Shh의 대체물로서 퍼모파민을 사용할 수 있다.
상기 (b'), (a), (b) 및 (c) 단계의 기본 배지로는 당업계에서 통상적으로 사용되는 배아줄기세포 분화용 배지들을 제한 없이 사용할 수 있는데, 바람직하게는 1 mM 엘-글루타민, 0.1 mM 비필수아미노산, 0.1 mM 머캅토에탄올, 1% B27 보충체, 1% N2 보충제 (N2 supplement)이 포함된 DMEM/F12 배지를 사용할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, Wnt 신호전달 작용제가 망막기원세포를 광수용체세포로 분화시키는데 결정적인 요소임을 확인하기 위하여, Wnt 신호전달 체계의 억제제인 Dkk-1의 농도를 10 ng/ml, 100 ng/ml 및 1 ㎍/ml로 달리하여 Wnt 신호전달 체계의 농도별 효과를 분석하였다. 억제제 실험은 인간 배아줄기세포 유래-망막기원세포에 Shh와 레티노산은 첨가하지 않고 Wnt3a를 50 ng/ml 첨가한 배양액 (I군), Wnt3a와 Dkk-1을 모두 첨가하지 않은 배양액 (II군), Dkk-1을 10 ng/ml 첨가한 배양액 (III군), Dkk-1을 100 ng/ml 첨가한 배양액 (IV군) 및 Dkk-1을 1 ㎍/ml 첨가한 배양액 (V군)의 5개 군으로 나누어 광수용체세포로 분화시켰다.
그 결과, 광수용체세포의 마커인 Crx (p=0.0247), 리커버린 (recoverin)(p=0.0113), 로돕신 (rhodopsin)(p=0.0166), 페리페린 2 (peripherin2)(p=0.0166)의 발현이 Dkk-1의 농도가 증가할수록 현저히 감소하였다. 각 마커 중에서 각 군사이의 유의성을 분석한 결과, Crx에서 I군 대 II군, IV군 대 V군과 리커버린에서 I군 대 II군을 제외한 각 군 사이에서 모두 통계적으로 유의미한 차이가 있었다 (유의미한 군 사이에서의 값: *: p<0.0001; **: p=0.0381)(표 10 및 도 24). 이와 같은 결과는 광수용체세포로의 분화 유도가 Wnt 신호전달 작용제에 의한 것이며, Wnt 신호전달 억제제에 의해 Wnt 신호전달 체계가 억제되면 광수용체세포의 생성도 거의 이루어지지 않는 것을 나타내는 것으로, 이로부터 Wnt 신호전달 작용제가 광수용체세포의 분화 유도에 결정적인 작용을 함을 확인하였다.
한편, 상기 Wnt3a 대체물로서 동일한 조건 및 기간 동안 Wnt 신호전달 작용제의 종류와 농도만을 50 ng/ml의 Wnt1, 50 ng/ml 또는 100 ng/ml의 Wnt5a 및 Wnt11, 50 ng/m의 노린, 2.5 mM 또는 5 mM의 LiCl, 2 μM의 BIO, 30 μM의 SB415286으로 달리하고, Shh의 대체물로 퍼모파민을 사용하여 상기와 동일하게 분화시킨 결과, Wnt3a 및 Shh를 사용한 결과와 동일한 양상으로 광수용체세포를 분화 및 성숙시켰다 (실시예 12).
본 발명의 조성물은 별도의 유전자 이식 과정 없이 단기간 동안 줄기세포로부터 풍부한 개수의 망막세포, 특히 광수용체세포로 증식 및 분화를 유도할 수 있다. 또한 본 발명의 조성물은 고효율로 풍부한 개수의 광수용체세포를 생성하여 유세포분석을 통한 광수용체세포만의 분리 또는 추가적인 광수용체세포의 증식 과정을 요구하지 않아 분화된 광수용체세포를 변성 또는 손상된 망막에 손쉽게 이식할 수 있으며, 상기 광수용체세포는 망막 내에서 효율적으로 생착 및 융합함으로써 망막 변성을 방지 또는 회복시킬 수 있는 능력을 지니고 있어 세포치료에 효과적으로 이용할 수 있다.
도 1은 세포 형태학적 사진이다.
(A)의 좌측도면은 미분화 상태의 인간 배아줄기세포의 세포집락 (계대수 29; 40배 현미경시야): 계대수 28로부터 계대배양되어 배양된 5일 후의 세포주이다. 미분화상태의 특징인 주변의 영양공급자세포인 마우스 배아 체세포주와 잘 격리되어 있으며, 편평한 표면을 지닌, 균일한 모양을 보이는 전형적인 미분화 상태의 인간 배아줄기세포 집락을 보이고 있다.
(A)의 우측도면은 부유응집체 (40배 현미경시야)로서, 도 1(A) 좌측도면의 미분화 상태의 인간 배아줄기세포 집락으로부터 분리되어 저접촉판에서 4일 배양된 부유응집체이다. 떠있는 둥근 공모양의 부유 응집체 형태를 보여주고 있다. 상기 부유응집체 1개당 약 292 ± 53여개의 세포로 구성되어 있다.
(B)~(H)는 망막세포로 분화되고 있는 세포 형태학적 사진이다.
(B)는 분화 유도 14일: 폴리-디-라이신/라미닌 플레이트에 옮겨 심어진 부유 응집체의 배양 10일 후, 즉, 미분화 상태의 인간 배아줄기세포로부터의 분화유도 14일 후의 세포 모양이다. 세포들의 집락인 부유 응집체 형태에서 분리되어 분화가 유도되고 있는 세포들이 관찰되고 있다. 적은 세포질과 둥글고 큰 핵으로 구성된 세포로 분화의 초기단계의 모양을 보이고 있다.
(C)는 분화 유도 19일: 미분화 상태의 인간 배아줄기세포로부터의 분화유도 19일 후의 세포 모양이다. 활발한 세포증식과 동시에 망막기원세포로의 분화가 일어나고 있으며, 다수의 소용돌이 모양 또는 둥근 꽃 모양의 로젯 (rosette) 형태의 세포군집들을 중심으로 세포증식과 분화가 일어나고 있다.
(D)는 분화유도 21일: 활발한 세포증식으로 인해 증가된 다수의 세포수를 보여주고 있다. 도 1(C)의 세포보다 세포질은 풍부하고, 상대적으로 핵의 크기는 감소한 분화가 진행된 세포의 형태를 띄고 있다. 일정한 주행성을 보이는 세포들이 관찰되기 시작한다.
(E)~(H)는 분화유도 29일째의 세포 집락들의 다양한 모양을 나타낸 것이다.
(E)는 대다수의 세포의 모양으로 특히 세포가 밀집되어 있는 영역에서 관찰된다. 도 1(D)의 분화유도 21일의 세포와 비교하였을 때, 세포수의 충실도는 동일하나, 세포질 양의 증가 및 좀 더 작고 농축된 세포핵을 지닌 분화된 형태를 보인다.
(F)는 도 1(E)의 세포들이 세포 밀도가 비교적 낮은 부분에서 보이는 모양이다. 세포의 집단별로 일정한 곳으로 주행하는 방향성을 보이고 있다. 보다 풍부한, 양끝이 뾰족한 모양의 세포질과 방추형 모양의 핵을 지니고 있다.
(G)는 일부에서 관찰되는 다수의 신경다발을 지닌 세포집락이다.
(H)의 좌측도면은 일부에서 관찰되는 긴 신경축삭을 보이는 세포집락이다.
(H)의 우측도면은 일부에서 분화된 신경세포 모양의 형태를 보인다.
* 현미경시야: (A)(좌, 우: 40배); (B)~ (G)(좌: 50배; 우: 200배); (H)(좌, 우: 200배).
도 2는 각각의 배양기간에 따른 망막세포 마커들인 Crx, 리커버린, 로돕신, 페리페린2 및 Ki67의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 3은 망막세포로의 분화유도 29일 후의 광수용체세포에 특이적인 리커버린 및 로돕신 발현을 나타내는 면역형광염색 결과이다.
미분화 상태의 인간 배아줄기세포로부터 분화된 광수용체세포에 대한 광수용체세포 특이 단백질의 발현을 평가하였다. 분화된 세포의 약 80% 이상에서 범 광수용체세포의 마커인 리커버린 및 광수용체세포 중 간상체세포의 특이적인 항원인 로돕신에 대해 동시에 양성반응을 보이고 있다.
(A) 및 (B)는 분화된 광수용체세포 집락의 사진이고, (C)는 세포밀도가 낮은 부분의 개별 세포들의 사진이다. 분화된 광수용체세포에서 리커버린 및 로돕신 항원의 형광발현양상을 잘 보여주고 있다.
* 현미경시야: (A) 100배; (B) 200배; (C) 400배.
* Merge: 리커버린 및 로돕신 항원의 형광발현양상을 합체한 사진으로 두 항원에 대해 동시에 양성을 보이는 세포는 노랑색으로 표현된다 (초록색 + 빨간색).
+ Merge/DAPI: DAPI는 모든 세포의 핵에 대한 염색으로 세포의 모집단을 나타낸다. Merge/DAPI는 리커버린 및 로돕신 두 항원의 형광발현양상과 DAPI의 형광양상을 합체한 사진으로 세포의 윤곽과 두 항원의 발현양상을 동시에 관찰할 수 있다.
도 4는 망막세포로의 분화 유도 29일 후의 광수용체세포에 특이적인 로돕신, 롬-1 및 페리페린2의 발현을 나타내는 면역형광염색 결과이다.
분화 유도된 광수용체세포에서 로돕신 양성인 간상체광수용체세포에서의 외분절의 마커인 롬-1 및 페리페린2의 발현양상을 관찰하였다.
(A)는 로돕신 및 롬-1의 양성을 보이는 세포집락이다.
(B)는 로돕신 및 롬-1의 양성을 보이는 개별 세포들이다. 한 세포 내에서의 명확히 다른 로돕신 및 롬-1의 특징적인 발현위치를 보이고 있다. 즉, 동일한 광수용체세포 내에서 분화가 진행될수록 로돕신 발현은 세포질 안쪽에 롬-1은 세포질의 가장 바깥쪽으로 위치하게 됨을 보여주고 있다.
(C)는 로돕신 및 페리페린2의 양성을 보이는 세포집락이다.
(D)는 로돕신 및 페리페린2의 양성을 보이는 개별 세포들이다.
*현미경시야: (A) 100배; (B) 400배; (C) 100배; (D) 400배.
도 5는 망막세포로의 분화유도 29일 후의 광수용체세포 특이적인 로돕신, 포스듀신 및 Pde6b의 발현을 나타내는 면역형광염색 결과이다. 이는 분화 유도된 광수용체세포가 빛에 대한 반응을 수행하는 단백질들을 발현함으로써, 단순한 단백질의 발현뿐만 아니라 광수용체세포의 고유한 기능도 수행할 수 있음을 보여주고 있다.
(A)는 분화 유도된 광수용체세포에서 로돕신 및 포스듀신 양성을 보이는 세포집락이다. (B)는 로돕신 및 포스듀신 양성을 보이는 개별 세포들이다.
(C)는 분화 유도된 광수용체세포에서 로돕신 및 Pde6b 양성을 보이는 세포집락이다. (D)는 로돕신 및 Pde6b 양성을 보이는 개별 세포들이다.
* 현미경시야: (A) 100배; (B) 400배; (C) 100배; (D) 400배.
도 6은 망막세포로의 분화유도 29일 후의 광수용체세포 특이적인 로돕신 및 시냅토피신의 발현을 나타내는 면역형광염색 결과이다.
(A)는 분화 유도된 광수용체세포에서 로돕신 및 시냅토피신 양성을 보이는 세포집락이다. 이는 분화 유도된 광수용체세포가 다른 망막 신경세포들과의 연접 (synapse) 기능을 할 수 있으며, 이들 세포가 망막신경회로에 참여하는 기능을 수행함을 나타낸다.
(B)는 로돕신 및 시냅토피신 양성을 보이는 개별 세포들이다.
* 현미경시야: (A) 100배; (B) 400배
도 7은 망막세포로의 분화유도 29일 후의 원추체 광수용체세포에 대한 특이적 면역형광염색 결과이다.
좌측도면은 파랑옵신 (blue-opsin) 양성을 보이는 세포집락이다.
우측도면은 파랑옵신 양성을 보이는 개별 세포들이다.
파랑옵신 항원 발현은 분화된 세포가 파랑옵신-원추체 광수용체세포임을 나타낸다.
* 현미경시야 (좌) 100배; (우) 400배.
도 8은 망막세포로의 분화유도 29일 후의 특징적인 광수용체세포 형태로 분화된 세포의 면역형광염색 결과이다. 좀 더 분화가 성숙된 다양한 세포들이 관찰된다.
좌측 도면은 리커버린과 로돕신 양성을 보이는 세포들로 광수용체세포의 특징적인 모양을 보이고 있다.
가운데 도면은 시냅토피신과 로돕신 양성을 보이는 세포들로 분화가 성숙된 모양을 보이고 있다.
우측 도면은 로돕신 양성을 보이는 세포들로 세포질내 풍부한 로돕신 분자가 특징적이다.
* 현미경시야 400배.
도 9는 망막세포로의 분화유도 29일 후의 신경 망막기원세포 및 광수용체세포 전구체에 대한 특이적 면역형광염색 결과이다.
(A)는 Rax 및 Pax6 양성을 보이는 세포집락이다.
(B)는 Rax 및 Pax6 양성을 보이는 개별 세포들이다.
두 항원간에 발현 강도의 차이는 있으나, 대부분의 세포가 두 항원을 동시에 발현하고 있다. 이는 분화유도 29일의 망막세포들이 신경 망막기원세포로부터 기원하였음을 나타낸다.
(C)는 증식세포의 마커인 Ki67 및 광수용체세포 전구체에 특이적 항원인 Crx 양성을 보이는 세포집락이다.
(D)는 Ki67과 Crx 양성을 보이는 개별 세포들이다.
대부분의 Crx 양성세포는 Ki67를 발현하지 않는다. 이는 광수용체세포 전구체는 세포증식 순환주기를 떠난 직후에 Crx를 발현하다는 것과 일치하는 소견이다. 그러나, 소수의 Crx 양성 세포는 Ki67이 아직 사라지지 않고 동시에 발현되기도 한다.
* 현미경시야 (A) 100배; (B) 400배; (C) 100배; (D) 400배.
도 10은 망막세포로의 분화유도 29일 후의 광수용체세포 이외의 망막세포들에 대한 특이적 면역형광염색 결과이다.
(A)는 Islet-1 및 NF-200에 동시에 양성을 보이는 세포집락 (좌측) 및 개별 세포들 (우측)이다. 이는 이 세포들이 망막의 세포들 중 망막신경절세포임을 나타낸다. 세포핵은 Islet-1이 양성이며, 세포의 축삭은 NF-200에 양성을 보이고 있다.
(B)는 PKC-α에 양성을 보이는 세포집락 (좌측) 및 세포집락의 개별 세포들 (우측)이다. 이는 이 세포들이 망막의 세포들 중 두극세포임을 나타낸다.
(C)는 Prox-1에 양성을 보이는 세포집락 (좌측) 및 개별 세포들 (우측)이다. 이는 이 세포들이 망막의 세포들 중 수평세포임을 나타낸다.
(D)는 GFAP에 양성을 보이는 세포집락 (좌측) 및 개별 세포들 (우측)이다. 이는 이 세포들이 망막의 세포들 중 뮐러아교세포임을 나타낸다.
(E)는 Rpe65와 ZO-1에 양성을 보이는 세포집락 (좌측) 및 개별 세포들 (우측)이다. 이는 이 세포들이 망막의 세포들 중 망막상피세포임을 나타낸다.
* 현미경시야 (A) 좌측 100배, 우측 400배; (B) 좌측 100배, 우측 400배; (C) 좌측 100배, 우측 400배; (D) 좌측 100배, 우측 400배; (E) 좌측 100배, 우측 400배.
도 11은 Wnt3a와 Shh에 대한 대체물로 각각 BIO와 퍼모파민을 사용한 결과이다. 망막세포로의 분화유도한 29일 후의 광수용체세포 전구체 및 광수용체세포에 대한 특이적 면역형광염색 결과를 보여주고 있다.
(A)는 증식세포의 마커인 Ki67 및 광수용체세포 전구체에 특이적 항원인 Crx 양성을 보이는 세포집락이다.
(B)는 Ki67과 Crx 양성을 보이는 개별 세포들이다.
(C)는 광수용체세포에 특이적인 리커버린 및 로돕신 발현을 나타내는 세포집락이다.
(D)는 리커버린 및 로돕신 양성을 보이는 개별 세포들의 사진이다.
* 현미경시야 (A) 100배; (B) 400배; (C) 100배; (D) 400배.
도 12는 Wnt3a와 Shh에 대한 대체물로 각각 BIO와 퍼모파민을 사용한 결과이다. 망막세포로의 분화유도한 29일 후의 광수용체세포에 대한 특이적인 로돕신, 페리페린2 및 롬-1의 발현을 나타내는 면역형광염색 결과이다.
(A)는 로돕신 및 페리페린2의 양성을 보이는 세포집락이다.
(B)는 로돕신 및 페리페린2의 양성을 보이는 개별 세포들이다.
(C)는 로돕신 및 롬-1의 양성을 보이는 세포집락이다.
(D)는 로돕신 및 롬-1의 양성을 보이는 개별 세포들이다.
*현미경시야: (A) 100배; (B) 400배; (C) 100배; (D) 400배.
도 13은 Wnt3a와 Shh에 대한 대체물로 각각 BIO와 퍼모파민을 사용한 결과이다. 망막세포로의 분화유도한 29일 후의 원추체 광수용체세포에 대한 특이적 면역형광염색 결과이다.
좌측 도면은 파랑옵신 (blue-opsin) 양성을 보이는 세포집락이다.
우측 도면은 파랑옵신 양성을 보이는 개별 세포들이다.
* 현미경시야 (좌) 100배; (우) 400배.
도 14는 인간 유도 전분화능 줄기세포 (human iPSC)의 특징적인 사진이다.
(A)는 세포형태학적 사진으로 좌측 도면은 미분화 상태의 인간 유도 전분화능 줄기세포의 세포집락 (계대수 43; 40배 현미경시야): 계대수 43으로부터 계대배양되어 배양된 6일 후의 세포주이다. 미분화상태의 특징인 주변의 영양공급자세포인 마우스 배아 체세포주와 잘 격리되어 있으며, 편평한 표면을 지닌, 균일한 모양을 보인다. 이는 전형적인 미분화 상태의 인간 배아줄기세포 집락의 특징이기도 하다. (A)의 우측 도면은 부유응집체 (40배 현미경시야)로서, 좌측 도면의 미분화 상태의 인간 유도 전분화능 줄기세포 집락으로부터 분리되어 저접촉판에서 4일 배양된 부유응집체이다. (B)는 미분화 인간 유도 전분화능 줄기세포의 특징적 마커들의 면역형광 염색결과이다. SSEA4와 Nanog이 강한 양성을 보이고 있는 세포 집락으로서 대부분 세포에서 동시 양성을 보이고 있다. 미분화 상태가 잘 유지되고 있슴을 나타낸다.
* 현미경시야 (가장 좌측) 40배; (나머지) 100배.
도 15는 인간 유도 전분화능 줄기세포의 망막세포로의 분화유도 29일 후의 광수용체세포에 특이적인 리커버린 및 로돕신 발현을 나타내는 면역형광염색 결과이다.
미분화 상태의 인간 유도 전분화능 줄기세포로부터 분화된 광수용체세포에 대한 광수용체세포 특이 단백질의 발현을 평가하였다.
(A)는 분화된 광수용체세포 집락의 사진이고, (B)는 세포밀도가 낮은 부분의 개별 세포들의 사진이다. (C)는 분화가 성숙된 광수용체세포의 사진이다.
분화된 광수용체세포에서 리커버린 및 로돕신 항원의 형광발현양상을 잘 보여주고 있다.
* 현미경시야: (A) 100배; (B) 400배; (C) 400배.
도 16은 망막세포들에 대한 특이적 유전자에 대한 역전사중합효소 연쇄반응 (RT-PCR)의 결과이다. 미분화 상태의 인간 배아줄기세포를 망막세포로 분화 유도한 후 29일에, 분화된 세포들의 망막기원세포 관련 유전자, 광수용체세포 관련 유전자 및 기타 망막세포들의 관련 유전자들의 mRNA의 발현 유무와 정도를 알아보기 위하여 RT-PCR을 수행하였다.
(A)는 망막기원세포 관련 유전자들인 RAX (495 bp), PAX6 (275 bp), SIX3 (307 bp), SIX6 (272 bp), LHX2 (285 bp) 및 CHX10 (281 bp) 등의 RT-PCR 증폭산물의 결과이다. 이중에서 특히 RAX 및 PAX6의 발현은 정량적 대조유전자인 GAPDH (증폭산물 크기: 302 bp) 유전자와 비슷한 정도로 발현되고 있다. 반면, 분화된 대뇌피질 관련 유전자인 ARX (462 bp), 분화된 중배엽 관련 유전자인 T (541 bp) 및 분화된 내배엽 관련 유전자인 AFP (318 bp) 등의 RT-PCR 증폭산물은 관찰되지 않았다. 이는 본 발명에 따른 분화 방법이 망막 관련 유전자들의 mRNA 발현에 특이적인 방법임을 시사한다.
(B)는 광수용체세포 관련 유전자 및 기타 망막세포들의 관련 유전자들의 mRNA의 발현 결과이다. 광수용체세포 관련 유전자인 CRX (353 bp), NRL (206 bp), RCVRN (150 bp), RHO (258 bp), PDE6B (409 bp), SAG (400 bp) 및 OPN1SW (206 bp) 등의 RT-PCR 증폭산물이 관찰되었다. 망막신경절세포의 유전자인 ATHO7 (246 bp) 및 POU4F2 (175 bp), 무축삭세포의 유전자인 NEUROD1 (523 bp), 두극세포의 유전자인 ASCL1 (467 bp) 등의 RT-PCR 증폭산물들도 관찰되었다.
광수용체세포 관련 유전자들의 특성은 다음과 같다. CRX는 광수용체세포 전구체 특이적 전사유전자 (transcription gene)이고, NRL은 간상체 광수용체세포 특이적 전사유전자이다. RCVRN (recoverin)은 원추체 및 간상체 광수용체세포 모두에서 양성을 보이는 범광수용체세포의 유전자이고, RHO (rhodopsin)은 간상체광수용체세포의 특이적 유전자이다. PDE6B 및 SAG (인간특이적 arrestin 유전자)는 광수용체세포의 광전환 회로에 관여하는 유전자들이다. 이들 유전자의 발현으로 광수용체세포의 기능과 관련된 분화성숙이 이뤄지고 있음을 확인하였다. 한편, OPN1SW은 소파장 (파랑옵신)-원추체광수용체세포의 특이적 유전자다. M: marker.
도 17은 광수용체세포의 특이적 유전자에 대한 역전사중합효소 연쇄반응 (RT-PCR) 및 염기서열 분석 결과이다.
미분화 상태의 인간 배아줄기세포를 망막세포로 분화유도한 29일째에, 분화된 세포들을 대상으로 광수용체세포 특이적 유전자인 RCVRN (NM_002903.2) 및 RHO (NM_000539.3)에 대한 RT-PCR을 수행하였으며, 또한 이들 증폭산물들이 RCVRN 및 RHO 유전자임을 입증하기 위해 염기서열분석을 수행하였다.
(A)는 아가로스겔 전기영동 결과로 150 bp 크기의 RCVRN의 RT-PCR 증폭산물 및 258 bp 크기의 RHO의 RT-PCR 증폭산물을 보여주고 있다. M: marker.
(B)는 염기서열분석의 크로마토그램 (chromatogram) 결과로 RCVRN (위쪽) 및 RHO (아래쪽)의 염기서열을 보여주고 있다. 두 유전자들의 염기서열은 인간의 표준염기서열 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)과 완벽히 일치함을 확인하였다. 즉, 분화된 광수용체세포에서 발현하는 RCVRN 및 RHO 유전자는 인간의 RCVRN 및 RHO 유전자의 발현임을 확인하였다.
도 18은 인간 배아줄기세포 유래 광수용체세포를 망막 변성 마우스인 rd/SCID에 이식한 후 이식군과 비이식군의 망막전위도를 비교한 결과이다.
(A) 8주령 비이식 마우스의 망막전위도. 특징적인 망막전위도 파형이 관찰되지 않으며, b-파 진폭은 우측 눈과 좌측 눈이 각각 6.29 uV 및 0.0542 uV를 나타내었다.
(B) 이식 4주 후의 8주령 마우스의 망막전위도. 광수용체세포를 이식하지 않은 우측 눈과 비교하였을 때 광수용체세포를 이식한 좌측 눈에서는 망막전위도 파형이 관찰되고 있으며, b-파 진폭도 74.5 uV로 높게 나타나고 있다. 인간 배아줄기세포 유래 광수용체세포가 이식된 rd/SCID 마우스는 망막전위도 검사에서 빛 자극에 대해 명확한 반응을 나타내었다.
도 19는 인간 배아줄기세포 유래 광수용체세포를 망막 변성 마우스인 rd/SCID에 이식한 후 이식군과 비이식군에서 망막전위도의 b-파 진폭을 비교한 그래프이다.
이들 rd/SCID 마우스의 광수용체세포가 이식된 눈에서의 망막전위도 b-파는 특징적인 파형을 나타내었으며, 48.4 (± 13.4) μV (표본수 = 13)의 진폭을 나타내었다. 그러나, 비이식군에서는 특징적인 파형이 관찰되지 않았고, b-파 진폭도 10.3 (± 2.5) μV (표본수 = 17)로 이식군과는 통계적으로 유의미한 차이를 보였다 (p<0.0001)(표 6, 도 19).
도 20은 망막 변성 마우스 모델 (rd/SCID)에 대한 인간 배아줄기세포 유래 광수용체세포 이식 후의 형광면역염색 결과이다.
이식 4 주일 후, 인간의 미토콘드리아와 광수용체세포에 특이적인 항체인 로돕신 및 리커버린을 이용하여 인간 배아줄기세포 유래 광수용체세포 이식의 망막 내 생착률을 분석하였다. 로돕신 및 리커버린 항원에 대해 양성반응을 보이는 세포가 인간의 미토콘드리아 항원에도 동시에 양성 반응을 보이는 경우, 세포는 인간 배아줄기세포에서 분화된 광수용체세포라고 판정하였다.
(A) 이식군의 인간 특이적 미토콘드리아와 로돕신 염색 결과이다. 4~5층의 로돕신 양성 세포층이 새롭게 외핵층 (outer nuclear layer: ONL)을 형성하였다. (B) 비이식군의 인간 특이적 미토콘드리아 및 로돕신 염색 결과이다. 대조군 (control)로서 세포를 이식하지 않은 (비이식군) 동일 연령 (8주)의 rd/SCID 마우스이다. 한 층의 망막 외핵층만 관찰되었는데 이는 대부분 원추체 광수용체세포로만 구성된 층으로, 간상체 광수용체세포는 변성으로 거의 관찰되지 않았고, 다만 변성이 진행 중인 잔여세포 2개만 양성반응을 보였다.
(C)는 이식군의 인간 특이적 미토콘드리아 및 리커버린 염색결과이다. 4~5층의 리커버린 양성 세포층이 새롭게 외핵층을 형성하였다. 내핵층 (inner nuclear layer: INL)에 더하여 외핵층에 4~5 층의 리커버린 양성 세포층이 새롭게 형성되었다.
(D) 대조군인 비이식군의 인간 특이적 미토콘드리아 및 리커버린 염색 결과이다. 총 40개의 세포에서 양성반응을 나타내었다. 단층의 리커버린 양성 외핵층은 원추체-광수용체세포들이며, 내측핵층의 리커버린 세포는 원추체-두극세포이다.
* 현미경시야 (A) 및 (C) 좌상: 200 배; (A)~(D): 400배.
* ONL: outer nuclear layer, 외핵층
INL: inner nuclear layer, 내핵층
RGC: retinal ganglion cell, 망막신경절세포.
도 21은 망막 변성 마우스 모델 (rd/SCID)에 대한 인간 배아줄기세포 유래 광수용체세포 이식 후 결과에 대한 평가 그래프이다.
로돕신은 비이식군에서는 망막의 400배 현미경 관찰 시야당 총 세포 199개 중 2개의 세포에서 양성반응을 보인반면 (양성률: 1.0%), 이식군에서는 관찰 시야당 총 세포 215개 중 88개의 세포에서 양성반응을 보였다 (양성률: 40.8%)(p<0.0001). 따라서, 마우스 망막의 해당 절편의 약 40%의 면적이 이식된 간상체 광수용체세포로 새롭게 형성되었음을 알 수 있다. 리커버린은 비이식군에서는 관찰 시야당 총 세포 168개 중 40개의 세포에서 양성반응을 보였으나 (양성률: 23.8%), 이식군에서는 관찰 시야당 총 세포 292개 중 120개의 세포에서 양성반응을 보여 (양성률: 41.0%) 통계적으로 유의미한 차이를 보였다 (p<0.0001).
도 22는 망막 변성 마우스 모델 (rd/SCID)에 대한 인간 배아줄기세포유래-광수용체세포 이식 후의 형광면역염색 결과이다.
이식 4 주일 후, 인간의 미토콘드리아 및 광수용체세포의 항체인 시냅토피신을 분석하였다. 인간 특이적 미토콘드리아 및 시냅토피신 염색 결과이다. 4-5층의 시냅토피신 양성 세포층이 새롭게 외핵층을 형성하고 있는 것이 관찰되었고, 이는 새롭게 형성된 외핵층의 광수용체세포가 이식된 마우스 망막 내의 다른 세포들과 연접할 수 있음을 의미한다.
* 현미경 시야 좌상: 200배; 그 외: 400배.
도 23은 배양액 조성인자인 Wnt3a (W), Shh (S) 및 레티노산 (R)의 조합에 따른 평균 세포수에 대한 그래프이다.
도 24는 Wnt3a와 그 억제제인 Dkk-1의 농도에 다른 광수용체세포 마커들의 양성 세포율을 나타낸 그래프이다. Shh와 레티노산은 첨가되지 않은 조건에서의 실험 결과이다 (*: P<0.0001; **: P=0.0381).
(A)의 좌측도면은 미분화 상태의 인간 배아줄기세포의 세포집락 (계대수 29; 40배 현미경시야): 계대수 28로부터 계대배양되어 배양된 5일 후의 세포주이다. 미분화상태의 특징인 주변의 영양공급자세포인 마우스 배아 체세포주와 잘 격리되어 있으며, 편평한 표면을 지닌, 균일한 모양을 보이는 전형적인 미분화 상태의 인간 배아줄기세포 집락을 보이고 있다.
(A)의 우측도면은 부유응집체 (40배 현미경시야)로서, 도 1(A) 좌측도면의 미분화 상태의 인간 배아줄기세포 집락으로부터 분리되어 저접촉판에서 4일 배양된 부유응집체이다. 떠있는 둥근 공모양의 부유 응집체 형태를 보여주고 있다. 상기 부유응집체 1개당 약 292 ± 53여개의 세포로 구성되어 있다.
(B)~(H)는 망막세포로 분화되고 있는 세포 형태학적 사진이다.
(B)는 분화 유도 14일: 폴리-디-라이신/라미닌 플레이트에 옮겨 심어진 부유 응집체의 배양 10일 후, 즉, 미분화 상태의 인간 배아줄기세포로부터의 분화유도 14일 후의 세포 모양이다. 세포들의 집락인 부유 응집체 형태에서 분리되어 분화가 유도되고 있는 세포들이 관찰되고 있다. 적은 세포질과 둥글고 큰 핵으로 구성된 세포로 분화의 초기단계의 모양을 보이고 있다.
(C)는 분화 유도 19일: 미분화 상태의 인간 배아줄기세포로부터의 분화유도 19일 후의 세포 모양이다. 활발한 세포증식과 동시에 망막기원세포로의 분화가 일어나고 있으며, 다수의 소용돌이 모양 또는 둥근 꽃 모양의 로젯 (rosette) 형태의 세포군집들을 중심으로 세포증식과 분화가 일어나고 있다.
(D)는 분화유도 21일: 활발한 세포증식으로 인해 증가된 다수의 세포수를 보여주고 있다. 도 1(C)의 세포보다 세포질은 풍부하고, 상대적으로 핵의 크기는 감소한 분화가 진행된 세포의 형태를 띄고 있다. 일정한 주행성을 보이는 세포들이 관찰되기 시작한다.
(E)~(H)는 분화유도 29일째의 세포 집락들의 다양한 모양을 나타낸 것이다.
(E)는 대다수의 세포의 모양으로 특히 세포가 밀집되어 있는 영역에서 관찰된다. 도 1(D)의 분화유도 21일의 세포와 비교하였을 때, 세포수의 충실도는 동일하나, 세포질 양의 증가 및 좀 더 작고 농축된 세포핵을 지닌 분화된 형태를 보인다.
(F)는 도 1(E)의 세포들이 세포 밀도가 비교적 낮은 부분에서 보이는 모양이다. 세포의 집단별로 일정한 곳으로 주행하는 방향성을 보이고 있다. 보다 풍부한, 양끝이 뾰족한 모양의 세포질과 방추형 모양의 핵을 지니고 있다.
(G)는 일부에서 관찰되는 다수의 신경다발을 지닌 세포집락이다.
(H)의 좌측도면은 일부에서 관찰되는 긴 신경축삭을 보이는 세포집락이다.
(H)의 우측도면은 일부에서 분화된 신경세포 모양의 형태를 보인다.
* 현미경시야: (A)(좌, 우: 40배); (B)~ (G)(좌: 50배; 우: 200배); (H)(좌, 우: 200배).
도 2는 각각의 배양기간에 따른 망막세포 마커들인 Crx, 리커버린, 로돕신, 페리페린2 및 Ki67의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 3은 망막세포로의 분화유도 29일 후의 광수용체세포에 특이적인 리커버린 및 로돕신 발현을 나타내는 면역형광염색 결과이다.
미분화 상태의 인간 배아줄기세포로부터 분화된 광수용체세포에 대한 광수용체세포 특이 단백질의 발현을 평가하였다. 분화된 세포의 약 80% 이상에서 범 광수용체세포의 마커인 리커버린 및 광수용체세포 중 간상체세포의 특이적인 항원인 로돕신에 대해 동시에 양성반응을 보이고 있다.
(A) 및 (B)는 분화된 광수용체세포 집락의 사진이고, (C)는 세포밀도가 낮은 부분의 개별 세포들의 사진이다. 분화된 광수용체세포에서 리커버린 및 로돕신 항원의 형광발현양상을 잘 보여주고 있다.
* 현미경시야: (A) 100배; (B) 200배; (C) 400배.
* Merge: 리커버린 및 로돕신 항원의 형광발현양상을 합체한 사진으로 두 항원에 대해 동시에 양성을 보이는 세포는 노랑색으로 표현된다 (초록색 + 빨간색).
+ Merge/DAPI: DAPI는 모든 세포의 핵에 대한 염색으로 세포의 모집단을 나타낸다. Merge/DAPI는 리커버린 및 로돕신 두 항원의 형광발현양상과 DAPI의 형광양상을 합체한 사진으로 세포의 윤곽과 두 항원의 발현양상을 동시에 관찰할 수 있다.
도 4는 망막세포로의 분화 유도 29일 후의 광수용체세포에 특이적인 로돕신, 롬-1 및 페리페린2의 발현을 나타내는 면역형광염색 결과이다.
분화 유도된 광수용체세포에서 로돕신 양성인 간상체광수용체세포에서의 외분절의 마커인 롬-1 및 페리페린2의 발현양상을 관찰하였다.
(A)는 로돕신 및 롬-1의 양성을 보이는 세포집락이다.
(B)는 로돕신 및 롬-1의 양성을 보이는 개별 세포들이다. 한 세포 내에서의 명확히 다른 로돕신 및 롬-1의 특징적인 발현위치를 보이고 있다. 즉, 동일한 광수용체세포 내에서 분화가 진행될수록 로돕신 발현은 세포질 안쪽에 롬-1은 세포질의 가장 바깥쪽으로 위치하게 됨을 보여주고 있다.
(C)는 로돕신 및 페리페린2의 양성을 보이는 세포집락이다.
(D)는 로돕신 및 페리페린2의 양성을 보이는 개별 세포들이다.
*현미경시야: (A) 100배; (B) 400배; (C) 100배; (D) 400배.
도 5는 망막세포로의 분화유도 29일 후의 광수용체세포 특이적인 로돕신, 포스듀신 및 Pde6b의 발현을 나타내는 면역형광염색 결과이다. 이는 분화 유도된 광수용체세포가 빛에 대한 반응을 수행하는 단백질들을 발현함으로써, 단순한 단백질의 발현뿐만 아니라 광수용체세포의 고유한 기능도 수행할 수 있음을 보여주고 있다.
(A)는 분화 유도된 광수용체세포에서 로돕신 및 포스듀신 양성을 보이는 세포집락이다. (B)는 로돕신 및 포스듀신 양성을 보이는 개별 세포들이다.
(C)는 분화 유도된 광수용체세포에서 로돕신 및 Pde6b 양성을 보이는 세포집락이다. (D)는 로돕신 및 Pde6b 양성을 보이는 개별 세포들이다.
* 현미경시야: (A) 100배; (B) 400배; (C) 100배; (D) 400배.
도 6은 망막세포로의 분화유도 29일 후의 광수용체세포 특이적인 로돕신 및 시냅토피신의 발현을 나타내는 면역형광염색 결과이다.
(A)는 분화 유도된 광수용체세포에서 로돕신 및 시냅토피신 양성을 보이는 세포집락이다. 이는 분화 유도된 광수용체세포가 다른 망막 신경세포들과의 연접 (synapse) 기능을 할 수 있으며, 이들 세포가 망막신경회로에 참여하는 기능을 수행함을 나타낸다.
(B)는 로돕신 및 시냅토피신 양성을 보이는 개별 세포들이다.
* 현미경시야: (A) 100배; (B) 400배
도 7은 망막세포로의 분화유도 29일 후의 원추체 광수용체세포에 대한 특이적 면역형광염색 결과이다.
좌측도면은 파랑옵신 (blue-opsin) 양성을 보이는 세포집락이다.
우측도면은 파랑옵신 양성을 보이는 개별 세포들이다.
파랑옵신 항원 발현은 분화된 세포가 파랑옵신-원추체 광수용체세포임을 나타낸다.
* 현미경시야 (좌) 100배; (우) 400배.
도 8은 망막세포로의 분화유도 29일 후의 특징적인 광수용체세포 형태로 분화된 세포의 면역형광염색 결과이다. 좀 더 분화가 성숙된 다양한 세포들이 관찰된다.
좌측 도면은 리커버린과 로돕신 양성을 보이는 세포들로 광수용체세포의 특징적인 모양을 보이고 있다.
가운데 도면은 시냅토피신과 로돕신 양성을 보이는 세포들로 분화가 성숙된 모양을 보이고 있다.
우측 도면은 로돕신 양성을 보이는 세포들로 세포질내 풍부한 로돕신 분자가 특징적이다.
* 현미경시야 400배.
도 9는 망막세포로의 분화유도 29일 후의 신경 망막기원세포 및 광수용체세포 전구체에 대한 특이적 면역형광염색 결과이다.
(A)는 Rax 및 Pax6 양성을 보이는 세포집락이다.
(B)는 Rax 및 Pax6 양성을 보이는 개별 세포들이다.
두 항원간에 발현 강도의 차이는 있으나, 대부분의 세포가 두 항원을 동시에 발현하고 있다. 이는 분화유도 29일의 망막세포들이 신경 망막기원세포로부터 기원하였음을 나타낸다.
(C)는 증식세포의 마커인 Ki67 및 광수용체세포 전구체에 특이적 항원인 Crx 양성을 보이는 세포집락이다.
(D)는 Ki67과 Crx 양성을 보이는 개별 세포들이다.
대부분의 Crx 양성세포는 Ki67를 발현하지 않는다. 이는 광수용체세포 전구체는 세포증식 순환주기를 떠난 직후에 Crx를 발현하다는 것과 일치하는 소견이다. 그러나, 소수의 Crx 양성 세포는 Ki67이 아직 사라지지 않고 동시에 발현되기도 한다.
* 현미경시야 (A) 100배; (B) 400배; (C) 100배; (D) 400배.
도 10은 망막세포로의 분화유도 29일 후의 광수용체세포 이외의 망막세포들에 대한 특이적 면역형광염색 결과이다.
(A)는 Islet-1 및 NF-200에 동시에 양성을 보이는 세포집락 (좌측) 및 개별 세포들 (우측)이다. 이는 이 세포들이 망막의 세포들 중 망막신경절세포임을 나타낸다. 세포핵은 Islet-1이 양성이며, 세포의 축삭은 NF-200에 양성을 보이고 있다.
(B)는 PKC-α에 양성을 보이는 세포집락 (좌측) 및 세포집락의 개별 세포들 (우측)이다. 이는 이 세포들이 망막의 세포들 중 두극세포임을 나타낸다.
(C)는 Prox-1에 양성을 보이는 세포집락 (좌측) 및 개별 세포들 (우측)이다. 이는 이 세포들이 망막의 세포들 중 수평세포임을 나타낸다.
(D)는 GFAP에 양성을 보이는 세포집락 (좌측) 및 개별 세포들 (우측)이다. 이는 이 세포들이 망막의 세포들 중 뮐러아교세포임을 나타낸다.
(E)는 Rpe65와 ZO-1에 양성을 보이는 세포집락 (좌측) 및 개별 세포들 (우측)이다. 이는 이 세포들이 망막의 세포들 중 망막상피세포임을 나타낸다.
* 현미경시야 (A) 좌측 100배, 우측 400배; (B) 좌측 100배, 우측 400배; (C) 좌측 100배, 우측 400배; (D) 좌측 100배, 우측 400배; (E) 좌측 100배, 우측 400배.
도 11은 Wnt3a와 Shh에 대한 대체물로 각각 BIO와 퍼모파민을 사용한 결과이다. 망막세포로의 분화유도한 29일 후의 광수용체세포 전구체 및 광수용체세포에 대한 특이적 면역형광염색 결과를 보여주고 있다.
(A)는 증식세포의 마커인 Ki67 및 광수용체세포 전구체에 특이적 항원인 Crx 양성을 보이는 세포집락이다.
(B)는 Ki67과 Crx 양성을 보이는 개별 세포들이다.
(C)는 광수용체세포에 특이적인 리커버린 및 로돕신 발현을 나타내는 세포집락이다.
(D)는 리커버린 및 로돕신 양성을 보이는 개별 세포들의 사진이다.
* 현미경시야 (A) 100배; (B) 400배; (C) 100배; (D) 400배.
도 12는 Wnt3a와 Shh에 대한 대체물로 각각 BIO와 퍼모파민을 사용한 결과이다. 망막세포로의 분화유도한 29일 후의 광수용체세포에 대한 특이적인 로돕신, 페리페린2 및 롬-1의 발현을 나타내는 면역형광염색 결과이다.
(A)는 로돕신 및 페리페린2의 양성을 보이는 세포집락이다.
(B)는 로돕신 및 페리페린2의 양성을 보이는 개별 세포들이다.
(C)는 로돕신 및 롬-1의 양성을 보이는 세포집락이다.
(D)는 로돕신 및 롬-1의 양성을 보이는 개별 세포들이다.
*현미경시야: (A) 100배; (B) 400배; (C) 100배; (D) 400배.
도 13은 Wnt3a와 Shh에 대한 대체물로 각각 BIO와 퍼모파민을 사용한 결과이다. 망막세포로의 분화유도한 29일 후의 원추체 광수용체세포에 대한 특이적 면역형광염색 결과이다.
좌측 도면은 파랑옵신 (blue-opsin) 양성을 보이는 세포집락이다.
우측 도면은 파랑옵신 양성을 보이는 개별 세포들이다.
* 현미경시야 (좌) 100배; (우) 400배.
도 14는 인간 유도 전분화능 줄기세포 (human iPSC)의 특징적인 사진이다.
(A)는 세포형태학적 사진으로 좌측 도면은 미분화 상태의 인간 유도 전분화능 줄기세포의 세포집락 (계대수 43; 40배 현미경시야): 계대수 43으로부터 계대배양되어 배양된 6일 후의 세포주이다. 미분화상태의 특징인 주변의 영양공급자세포인 마우스 배아 체세포주와 잘 격리되어 있으며, 편평한 표면을 지닌, 균일한 모양을 보인다. 이는 전형적인 미분화 상태의 인간 배아줄기세포 집락의 특징이기도 하다. (A)의 우측 도면은 부유응집체 (40배 현미경시야)로서, 좌측 도면의 미분화 상태의 인간 유도 전분화능 줄기세포 집락으로부터 분리되어 저접촉판에서 4일 배양된 부유응집체이다. (B)는 미분화 인간 유도 전분화능 줄기세포의 특징적 마커들의 면역형광 염색결과이다. SSEA4와 Nanog이 강한 양성을 보이고 있는 세포 집락으로서 대부분 세포에서 동시 양성을 보이고 있다. 미분화 상태가 잘 유지되고 있슴을 나타낸다.
* 현미경시야 (가장 좌측) 40배; (나머지) 100배.
도 15는 인간 유도 전분화능 줄기세포의 망막세포로의 분화유도 29일 후의 광수용체세포에 특이적인 리커버린 및 로돕신 발현을 나타내는 면역형광염색 결과이다.
미분화 상태의 인간 유도 전분화능 줄기세포로부터 분화된 광수용체세포에 대한 광수용체세포 특이 단백질의 발현을 평가하였다.
(A)는 분화된 광수용체세포 집락의 사진이고, (B)는 세포밀도가 낮은 부분의 개별 세포들의 사진이다. (C)는 분화가 성숙된 광수용체세포의 사진이다.
분화된 광수용체세포에서 리커버린 및 로돕신 항원의 형광발현양상을 잘 보여주고 있다.
* 현미경시야: (A) 100배; (B) 400배; (C) 400배.
도 16은 망막세포들에 대한 특이적 유전자에 대한 역전사중합효소 연쇄반응 (RT-PCR)의 결과이다. 미분화 상태의 인간 배아줄기세포를 망막세포로 분화 유도한 후 29일에, 분화된 세포들의 망막기원세포 관련 유전자, 광수용체세포 관련 유전자 및 기타 망막세포들의 관련 유전자들의 mRNA의 발현 유무와 정도를 알아보기 위하여 RT-PCR을 수행하였다.
(A)는 망막기원세포 관련 유전자들인 RAX (495 bp), PAX6 (275 bp), SIX3 (307 bp), SIX6 (272 bp), LHX2 (285 bp) 및 CHX10 (281 bp) 등의 RT-PCR 증폭산물의 결과이다. 이중에서 특히 RAX 및 PAX6의 발현은 정량적 대조유전자인 GAPDH (증폭산물 크기: 302 bp) 유전자와 비슷한 정도로 발현되고 있다. 반면, 분화된 대뇌피질 관련 유전자인 ARX (462 bp), 분화된 중배엽 관련 유전자인 T (541 bp) 및 분화된 내배엽 관련 유전자인 AFP (318 bp) 등의 RT-PCR 증폭산물은 관찰되지 않았다. 이는 본 발명에 따른 분화 방법이 망막 관련 유전자들의 mRNA 발현에 특이적인 방법임을 시사한다.
(B)는 광수용체세포 관련 유전자 및 기타 망막세포들의 관련 유전자들의 mRNA의 발현 결과이다. 광수용체세포 관련 유전자인 CRX (353 bp), NRL (206 bp), RCVRN (150 bp), RHO (258 bp), PDE6B (409 bp), SAG (400 bp) 및 OPN1SW (206 bp) 등의 RT-PCR 증폭산물이 관찰되었다. 망막신경절세포의 유전자인 ATHO7 (246 bp) 및 POU4F2 (175 bp), 무축삭세포의 유전자인 NEUROD1 (523 bp), 두극세포의 유전자인 ASCL1 (467 bp) 등의 RT-PCR 증폭산물들도 관찰되었다.
광수용체세포 관련 유전자들의 특성은 다음과 같다. CRX는 광수용체세포 전구체 특이적 전사유전자 (transcription gene)이고, NRL은 간상체 광수용체세포 특이적 전사유전자이다. RCVRN (recoverin)은 원추체 및 간상체 광수용체세포 모두에서 양성을 보이는 범광수용체세포의 유전자이고, RHO (rhodopsin)은 간상체광수용체세포의 특이적 유전자이다. PDE6B 및 SAG (인간특이적 arrestin 유전자)는 광수용체세포의 광전환 회로에 관여하는 유전자들이다. 이들 유전자의 발현으로 광수용체세포의 기능과 관련된 분화성숙이 이뤄지고 있음을 확인하였다. 한편, OPN1SW은 소파장 (파랑옵신)-원추체광수용체세포의 특이적 유전자다. M: marker.
도 17은 광수용체세포의 특이적 유전자에 대한 역전사중합효소 연쇄반응 (RT-PCR) 및 염기서열 분석 결과이다.
미분화 상태의 인간 배아줄기세포를 망막세포로 분화유도한 29일째에, 분화된 세포들을 대상으로 광수용체세포 특이적 유전자인 RCVRN (NM_002903.2) 및 RHO (NM_000539.3)에 대한 RT-PCR을 수행하였으며, 또한 이들 증폭산물들이 RCVRN 및 RHO 유전자임을 입증하기 위해 염기서열분석을 수행하였다.
(A)는 아가로스겔 전기영동 결과로 150 bp 크기의 RCVRN의 RT-PCR 증폭산물 및 258 bp 크기의 RHO의 RT-PCR 증폭산물을 보여주고 있다. M: marker.
(B)는 염기서열분석의 크로마토그램 (chromatogram) 결과로 RCVRN (위쪽) 및 RHO (아래쪽)의 염기서열을 보여주고 있다. 두 유전자들의 염기서열은 인간의 표준염기서열 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)과 완벽히 일치함을 확인하였다. 즉, 분화된 광수용체세포에서 발현하는 RCVRN 및 RHO 유전자는 인간의 RCVRN 및 RHO 유전자의 발현임을 확인하였다.
도 18은 인간 배아줄기세포 유래 광수용체세포를 망막 변성 마우스인 rd/SCID에 이식한 후 이식군과 비이식군의 망막전위도를 비교한 결과이다.
(A) 8주령 비이식 마우스의 망막전위도. 특징적인 망막전위도 파형이 관찰되지 않으며, b-파 진폭은 우측 눈과 좌측 눈이 각각 6.29 uV 및 0.0542 uV를 나타내었다.
(B) 이식 4주 후의 8주령 마우스의 망막전위도. 광수용체세포를 이식하지 않은 우측 눈과 비교하였을 때 광수용체세포를 이식한 좌측 눈에서는 망막전위도 파형이 관찰되고 있으며, b-파 진폭도 74.5 uV로 높게 나타나고 있다. 인간 배아줄기세포 유래 광수용체세포가 이식된 rd/SCID 마우스는 망막전위도 검사에서 빛 자극에 대해 명확한 반응을 나타내었다.
도 19는 인간 배아줄기세포 유래 광수용체세포를 망막 변성 마우스인 rd/SCID에 이식한 후 이식군과 비이식군에서 망막전위도의 b-파 진폭을 비교한 그래프이다.
이들 rd/SCID 마우스의 광수용체세포가 이식된 눈에서의 망막전위도 b-파는 특징적인 파형을 나타내었으며, 48.4 (± 13.4) μV (표본수 = 13)의 진폭을 나타내었다. 그러나, 비이식군에서는 특징적인 파형이 관찰되지 않았고, b-파 진폭도 10.3 (± 2.5) μV (표본수 = 17)로 이식군과는 통계적으로 유의미한 차이를 보였다 (p<0.0001)(표 6, 도 19).
도 20은 망막 변성 마우스 모델 (rd/SCID)에 대한 인간 배아줄기세포 유래 광수용체세포 이식 후의 형광면역염색 결과이다.
이식 4 주일 후, 인간의 미토콘드리아와 광수용체세포에 특이적인 항체인 로돕신 및 리커버린을 이용하여 인간 배아줄기세포 유래 광수용체세포 이식의 망막 내 생착률을 분석하였다. 로돕신 및 리커버린 항원에 대해 양성반응을 보이는 세포가 인간의 미토콘드리아 항원에도 동시에 양성 반응을 보이는 경우, 세포는 인간 배아줄기세포에서 분화된 광수용체세포라고 판정하였다.
(A) 이식군의 인간 특이적 미토콘드리아와 로돕신 염색 결과이다. 4~5층의 로돕신 양성 세포층이 새롭게 외핵층 (outer nuclear layer: ONL)을 형성하였다. (B) 비이식군의 인간 특이적 미토콘드리아 및 로돕신 염색 결과이다. 대조군 (control)로서 세포를 이식하지 않은 (비이식군) 동일 연령 (8주)의 rd/SCID 마우스이다. 한 층의 망막 외핵층만 관찰되었는데 이는 대부분 원추체 광수용체세포로만 구성된 층으로, 간상체 광수용체세포는 변성으로 거의 관찰되지 않았고, 다만 변성이 진행 중인 잔여세포 2개만 양성반응을 보였다.
(C)는 이식군의 인간 특이적 미토콘드리아 및 리커버린 염색결과이다. 4~5층의 리커버린 양성 세포층이 새롭게 외핵층을 형성하였다. 내핵층 (inner nuclear layer: INL)에 더하여 외핵층에 4~5 층의 리커버린 양성 세포층이 새롭게 형성되었다.
(D) 대조군인 비이식군의 인간 특이적 미토콘드리아 및 리커버린 염색 결과이다. 총 40개의 세포에서 양성반응을 나타내었다. 단층의 리커버린 양성 외핵층은 원추체-광수용체세포들이며, 내측핵층의 리커버린 세포는 원추체-두극세포이다.
* 현미경시야 (A) 및 (C) 좌상: 200 배; (A)~(D): 400배.
* ONL: outer nuclear layer, 외핵층
INL: inner nuclear layer, 내핵층
RGC: retinal ganglion cell, 망막신경절세포.
도 21은 망막 변성 마우스 모델 (rd/SCID)에 대한 인간 배아줄기세포 유래 광수용체세포 이식 후 결과에 대한 평가 그래프이다.
로돕신은 비이식군에서는 망막의 400배 현미경 관찰 시야당 총 세포 199개 중 2개의 세포에서 양성반응을 보인반면 (양성률: 1.0%), 이식군에서는 관찰 시야당 총 세포 215개 중 88개의 세포에서 양성반응을 보였다 (양성률: 40.8%)(p<0.0001). 따라서, 마우스 망막의 해당 절편의 약 40%의 면적이 이식된 간상체 광수용체세포로 새롭게 형성되었음을 알 수 있다. 리커버린은 비이식군에서는 관찰 시야당 총 세포 168개 중 40개의 세포에서 양성반응을 보였으나 (양성률: 23.8%), 이식군에서는 관찰 시야당 총 세포 292개 중 120개의 세포에서 양성반응을 보여 (양성률: 41.0%) 통계적으로 유의미한 차이를 보였다 (p<0.0001).
도 22는 망막 변성 마우스 모델 (rd/SCID)에 대한 인간 배아줄기세포유래-광수용체세포 이식 후의 형광면역염색 결과이다.
이식 4 주일 후, 인간의 미토콘드리아 및 광수용체세포의 항체인 시냅토피신을 분석하였다. 인간 특이적 미토콘드리아 및 시냅토피신 염색 결과이다. 4-5층의 시냅토피신 양성 세포층이 새롭게 외핵층을 형성하고 있는 것이 관찰되었고, 이는 새롭게 형성된 외핵층의 광수용체세포가 이식된 마우스 망막 내의 다른 세포들과 연접할 수 있음을 의미한다.
* 현미경 시야 좌상: 200배; 그 외: 400배.
도 23은 배양액 조성인자인 Wnt3a (W), Shh (S) 및 레티노산 (R)의 조합에 따른 평균 세포수에 대한 그래프이다.
도 24는 Wnt3a와 그 억제제인 Dkk-1의 농도에 다른 광수용체세포 마커들의 양성 세포율을 나타낸 그래프이다. Shh와 레티노산은 첨가되지 않은 조건에서의 실험 결과이다 (*: P<0.0001; **: P=0.0381).
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예
1: 줄기세포의 배양
<1-1> 인간 배아줄기세포의 배양
인간 배아줄기세포주 (human embryonic stem cell: hESC)인 H9 (WA09, 정상핵형 XX)와 H7 (WA07, 정상핵형, XX)을 WiCell 연구기관 (WiCell Research Institute, Madison, WI, USA)에서 구입하였다.
미분화 상태의 인간 배아줄기세포주를 유지하고 증식시키기 위해 (H9 세포주: 계대수 25∼33; H7 세포주: 계대수 23∼28), 인간 배아줄기세포를 방사선이 조사된 마우스 배아체세포주 (mouse embryonic fibroblasts, MEF, ATCC, Manassas, VA, USA) 또는 마이토마이신이 처리된 마우스 배아체세포주 (EmbryoMax Primary Mouse Embryo Fibroblasts, Millipore, Billerica, MA, USA) 등의 영양공급자세포 (feeder cells) 위에서 하기와 같은 배양액으로 증식시켰다: 배아줄기세포 배양액 [DMEM/F12 (Invitrogen, Grand Island, NY, USA)액, 20% (v/v) 넉아웃 혈청 대체제 (KnockOut serum replacement, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), 1 mM의 엘-글루타민 (L-glutamine, Invitrogen), 0.1 mM의 비필수 아미노산 (nonessential amino acids, Invitrogen), 0.1 mM의 머갑토에탄올 (mercaptoethanol, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), 4 ng/ml 인간 재조합 FGF2 (human recombinant basic fibroblast growth factor, Invitrogen)].
상기 배양액을 매일 교체하였으며, 미분화상태의 줄기세포를 유지하기 위해 배양세포를 1:9∼1:15의 비율로 6일∼7일마다 수기법이나 콜라제나제 V (collagenase IV, Invitrogen) 처리로 계대배양 (passage)한 후, 새로운 마우스 배아체세포주 영양공급자세포에 상기 인간 배아줄기세포를 옮겨주었다. 이때, 인간 배아줄기세포의 계대배양 시, 미분화된 인간 배아줄기세포의 특이적 항원인 Oct-4와 SSEA-4 (Chemicon, Temecula, CA, USA)에 대한 면역화학염색법을 주기적으로 수행하여 분화 정도를 측정하였으며, 분화된 세포는 제거하였다. 한편, 인간 배아줄기세포의 분화에 원치 않는 영향을 줄 수 있는 마이코플라즈마 감염 여부를 감시하기 위해서, 마이코얼러트 마이코플라즈마 검출 키트 (MycoAlert mycoplasma detection kit, Lonza, Rockland, ME, USA)를 사용해 배아줄기세포주의 마이코플라즈마 감염을 주기적으로 검사, 확인하였다.
<1-2> 인간 유도 전분화능 줄기세포 (induced pluipotent stem cell, iPSC)의 배양
인간 유도 전분화능 줄기세포인 iPS (Foreskin)-1 (Clone 1)(정상핵형 XY)을 WiCell 연구기관 (WiCell Research Institute, Madison, WI, USA)에서 구입하였다.
미분화 상태의 인간 유도 전분화능 줄기세포를 유지하고 증식시키기 위해 (계대수 37∼47), 인간 유도 전분화능 줄기세포를 방사선이 조사된 마우스 배아체세포주 (MEF, ATCC, Manassas, VA, USA) 또는 마이토마이신이 처리된 마우스 배아체세포주 (Millipore, Billerica, MA, USA) 등의 영양공급자세포 위에서 하기와 같은 배양액으로 증식시켰다: 배아줄기세포 배양액 [DMEM/F12 (Invitrogen, Grand Island, NY, USA)액, 20% (v/v) 넉아웃 혈청 대체제 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), 1 mM의 엘-글루타민 (Invitrogen), 0.1 mM의 비필수 아미노산 (Invitrogen), 0.1 mM의 머갑토에탄올 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), 10 ng/ml 인간 재조합 FGF2 (Invitrogen)].
상기 배양액을 매일 교체하였으며, 미분화상태의 줄기세포를 유지하기 위해, 배양세포는 1:4∼1:6의 비율로 6일∼7일마다 수기법이나 콜라제나제 IV (Invitrogen) 처리로 계대배양한 후, 새로운 마우스 배아체세포주 영양공급자세포에 상기 인간 유도 전분화능 줄기세포를 옮겨주었다. 이때, 인간 유도 전분화능 줄기세포의 계대배양 시, 미분화된 인간 유도 전분화능 줄기세포의 특이적 항원인 SSEA-4 (Chemicon, Temecula, CA, USA)와 Nanog (abcam, Cambridge, MA, USA)에 대한 면역화학염색법을 주기적으로 수행하여 분화 정도를 측정하였으며, 분화된 세포는 제거하였다.
한편, 인간 유도 전분화능 줄기세포의 분화에 원치 않는 영향을 줄 수 있는 마이코플라즈마 감염 여부를 감시하기 위해서, 마이코얼러트 마이코플라즈마 검출 키트 (MycoAlert mycoplasma detection kit, Lonza, Rockland, ME, USA)를 사용해 배아줄기세포주의 마이코플라즈마 감염을 주기적으로 검사, 확인하였다.
실시예 2: 인간 배아줄기세포 또는 인간 유도 전분화능 줄기세포로부터 안구영역전구체로의 분화
먼저, 실시예 1의 방법으로 배양된 인간 배아줄기세포 또는 인간 유도 전분화능 줄기세포 (도 1 및 도 14)를 마우스 배아체세포주로부터 분리하여 6-홈 저접촉판 (ultra-low attachment plates, Corning Incorporated, Corning, NY, USA)으로 각각 옮겨주었다.
상기 6-홈 저접촉판으로 옮긴 인간 배아줄기세포 또는 인간 유도 전분화능 줄기세포에 안구영역전구체 유도 배양액 [DMEM/F12, 10% 넉아웃 혈청 대체제, 1 mM의 엘-글루타민, 0.1 mM의 비필수 아미노산, 0.1 mM의 머캅토에탄올, 1% B27 보충체 (B27 supplement, Invitrogen), 1 ng/ml의 재조합 노긴 (recombinant noggin; R&D Systems), 1 ng/ml의 재조합 Dkk-1 (recombinant Dickkopf-1, R&D Sytstems), 5 ng/ml의 재조합 IGF-1 (recombinant insulin-like growth factor-1, R&D Systems)을 공급한 후, 3일째에 흡입하여 버리고 새 배양액으로 교체하는 형식으로 4∼5 일간 배양하여 배양액 내에서 부유하는 공모양의 부유 응집체 형태로 존재하는 안구영역전구체 (eye field precursor)를 수득하였다 (도 1).
실시예
3: 안구영역전구체로부터
망막기원세포로의
분화
상기 실시예 2에서 생성된 안구영역전구체 (부유 응집체 형태)를, 6홈 폴리-디-라이신/라미닌 플레이트 (poly-D-lysine/laminin-coated plate, BD Biosciences)에 53 ± 8개씩 (292 ± 53 세포/부유 응집체), 8-홈 폴리-디-라이신/라미닌 플레이트에는 12 ± 4개씩 심은 후, 망막기원세포 유도 배양액 [DMEM/F12 (Invitrogen), 1 mM의 엘-글루타민 (Invitrogen), 0.1 mM의 비필수 아미노산 (Invitrogen), 0.1 mM의 머캅토에탄올 (Sigma-Aldrich), 1% B27 보충체, 1% N2 보충제 (Invitrogen), 10 ng/ml의 Dkk-1, 10 ng/ml의 노긴, 10 ng/ml의 IGF-1, 5 ng/ml의 FGF2]을 9일간 공급하면서 배양하여 망막기원세포 (retinal progenitor cell)로 분화시켰다.
실시예
4:
망막기원세포로부터
신경
망막기원세포로의
분화
상기 실시예 3에서 생성된 망막기원세포를 신경 망막기원세포로 분화시키기 위해, 13일째 되는 날 Dkk-1의 투여를 중단하고, 노긴, IGF-1, FGF2 및 Wnt3a의 혼합물로 구성된 신경 망막기원세포 분화 배양액을 만들어 5일간 공급하면서 배양하여 신경 망막기원세포로 분화시켰다 (도 1). 상기 신경 망막기원세포 분화 배양액의 구체적인 조성은 다음과 같다: [DMEM/F12 (Invitrogen), 1 mM의 엘-글루타민 (Invitrogen), 0.1 mM의 비필수아미노산 (Invitrogen), 0.1 mM의 머캅토에탄올 (Sigma-Aldrich), 1% B27 보충체 (Invitrogen), 1% N2 보충제 (Invitrogen), 10 ng/ml의 노긴, 10 ng/ml의 IGF-1, 5 ng/ml의 FGF2, 50 ng/ml의 재조합 Wnt3a (recombinant Wnt3a, R&D Systems)]
실시예 5: 신경 망막기원세포로부터 광수용체세포 전구체로의 분화
상기 실시예 4에서 생성된 신경 망막기원세포에 광수용체세포 전구체 분화배양액 [DMEM/F12 (Invitrogen), 1 mM의 엘-글루타민 (Invitrogen), 0.1 mM의 비필수 아미노산 (Invitrogen), 0.1 mM의 머캅토에탄올 (Sigma-Aldrich), 1% B27 보충제 (Invitrogen), 1% N2 보충제 (Invitrogen), 10 ng/ml의 IGF-1, 50 ng/ml의 Wnt3a, 250 ng/ml의 재조합 Shh (recombinant Sonic Hedgehog amino terminal peptide, Shh, R&D Systems)]를 3일간 공급하면서 배양하여 광수용체세포 전구체 (photoreceptor cell precursor)로 분화시켰다. 이전 단계에서 첨가해주던 노긴과 FGF2는 배양액에 첨가하지 않았다 (도 1).
실시예 6: 광수용체세포 전구체로부터 광수용체세포로의 분화
상기 실시예 5에서 생성한 광수용체세포 전구체에 광수용체세포 분화배양액 [DMEM/F12 (Invitrogen), 1 mM의 엘-글루타민 (Invitrogen), 0.1 mM의 비필수 아미노산 (Invitrogen), 0.1 mM의 머캅토에탄올 (Sigma-Aldrich), 1% B27 보충제 (Invitrogen), 1% N2 보충제 (Invitrogen), 10 ng/ml의 IGF-1, 50 ng/ml의 Wnt3a, 250 ng/ml의 Shh, 500 nM의 올-트란스-레티노산 (all-trans retinoic acid, RA, Sigma-Aldrich)]을 8일 이상 공급하면서 배양하여 광수용체세포로 분화시켰다.
상기 실시예 2 내지 6의 모든 배양액은 2∼3일마다 교체하였고, 상기 세포들은 5% 이산화탄소 (CO2), 37℃에서 배양하였다. 모든 유도 및 분화실험은 최소한 3회 이상 반복하여 수행하였으며 동일한 결과가 나타남을 확인하였다.
실시예 7: 세포분화 관련 표지인자 발현 조사
<7-1> 면역화학염색법 및 세포분화 관련 표지인자 단백질 발현 확인
상기 실시예 3 내지 6에서 얻은 세포의 분화를 확인하기 위해 하기와 같이 면역화학염색법을 수행하였다.
안구영역전구체 (부유 응집체 형태)를 폴리-디-라이신/라미닌이 코팅된 8-홈 슬라이드 (BD Biosciences, Bedford, MA)에서 망막기원세포, 신경 망막기원세포, 광수용체세포 전구체 및 광수용체세포 분화의 배양조건과 동일하게 배양하였다. 각 단계별로 배양이 완료된 세포들을 4% 파라포름알데하이드 (paraformaldehyde, Sigma-Aldrich)로 고정한 후, 3% BSA (Jackson Immunoresearch Laboratory, Bar Harbor, ME, USA)와 0.25% 트리톤-엑스-100 (Triton X-100, Sigma-Aldrich)이 함유된 PBS로 비특이적 반응을 차단시켰다.
90분의 차단과정 후, 각 단계의 슬라이드를 하기와 같은 분화 유도된 세포 단계의 특이 항체들과 함께 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켰다: 토끼-Blue-opsin (1:500, Chemicon), 양-Chx10 (1:100, Chemicon), 토끼-Crx (1:200, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), 토끼-GFAP (1:200, Invitrogen), 마우스-인간 특이적 미토콘드리아 (human specific mitochondria, 1:50, Chemicon), 토끼-인간 특이적 미토콘드리아 (1:200, Chemicon), 마우스-Islet1 (1:10, Developmental Studies Hydroma Bank, DSHB; Iowa City, IA, USA), 마우스-Ki67 (1:100, Vector Laboratories, Peterborough, England), 마우스-Mitf (1:1,000, abcam, Cambridge, MA, USA), 마우스-네스틴 (1:250, BD Sciences), 토끼-뉴로필라멘트-200 (1:1,000, Sigma-Aldrich), 토끼-Otx2 (1:100, abcam), 토끼-Pax2 (1:250, abcam), 마우스-Pax6 (1:2, DSHB), 마우스-페리페린2 (1:500, GenScript, Piscataway, NJ, USA), 토끼-Rax (1:250, abcam), 토끼-리커버린 (1:1,000, Chemicon), 마우스 망막상피세포 65 (retinal pigment epithelium 65, RPE65, 1:100, Chemicon), 토끼-로돕신 (1:500, Sigma-Aldrich), 마우스-로돕신 (1:500, Ret-P1, Lab Vision, Fremont, CA, USA), 마우스-로돕신 (1:2,000, Ret-P1, Sigma-Aldrich), 마우스-롬1 (1:50, ABR-Affinity Bioreagents, Golden, CO, USA), 토끼-PDE6 beta (1:100, abcam), 토끼-포스듀신 (1:500, Santa Cruz Biotechnology), 마우스-PKC-alpha (1:500, Sigma-Aldrich), 마우스-Prox1 (1:2,000, Chemicon), 마우스-Sox2 (1:250, R&D Systems), 토끼-시냅토피신 (1:2,000, Santa Cruz Biotechnology), 및 토끼-ZO-1 (1:100, Zymed-Invitrogen).
상기 항체들은 1% BSA와 0.25% 트리톤X-100이 함유된 PBS 용액에 희석하여 사용하였다. 슬라이드에서 배양된 각 단계의 세포들을 PBS로 각각 5분간 3회 세척한 후, Cy3 (1:800, Jackson Immunoresearch Laboratory) 또는 Alexa488 (1:500, Invitrogen)이 결합된 종-특이 이차항체와 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 일차항체와 이차항체에 대한 적절한 기준 물질을 이용해 비특이적 염색이나, 항체간 상호반응 여부를 확인하였다. 이 후, 상기 세포들을 PBS로 각각 5분씩 3회 세척한 후, DAPI (4',6-diamidino-2 phenylindole)를 포함하는 벡타쉴드 (Vectashield, Vector Laboratories)로 핵 염색을 수행한 후, 형광현미경 (epifluorescence microscope, Nikon Eclipse, E800, Tokyo, Japan)과 공초점 현미경 (confocal microscope, Leica, Leica Microsystems Inc, Bannockburn, IL, USA or Zeiss LSM510, Carl Zeiss, Inc, Thornwood, NY, USA)으로 관찰하였다.
각 항체에 대한 양성 반응은 400배에서 무작위적으로 20 시야를 추출한 후 500개의 세포를 계수한 후 평가하였으며, 양성 비율에 대한 판정은 최소 3회 이상 각 항체를 평가한 후 실시하였다. 상기에서 얻은 데이터를 SAS 9.1 버전의 GEE (Generalized Estimating Equations) 모델 및 크루스칼-월리스 검사 (Kruskal-Wallis Test)와 매드칼크 (Medcalc) 8.1.1.0 버전의 블랜드-알트만 플롯 (Bland-Altman plot, Bland and Altman, 1986)을 이용한 통계적 방법으로 유의성을 평가하였다. 모든 데이터는 평균 ± 평균의 표준오차 (mean ± standard error of the mean, S.E.M)로 기술하였다. p 값은<0.05 일 때 통계적으로 유의하다고 평가하였다.
그 결과, 상기 실시예 3의 방법에 의해 생성된 망막기원세포는 전뇌의 안구영역전구체 및 망막기원세포의 표지항원의 양성률이 Rax가 86.6 ± 3.0%, Pax6가 63.9 ± 0.9%, Otx2가 76.4 ± 2.0%, Sox2가 83.0 ± 1.9%, Chx10가 46.3 ± 1.0%로 나타났다. 한편, 망막색소상피 기원세포의 표지항원인 Mitf는 17.2 ± 0.4%, 신경기원세포의 표지항원인 네스틴은 65.7 ± 2.7% 이었다 (표 1 및 표 2).
| 마커 | 평균 ± 평균표준오차 (%, 표본수 = 3) | |||
| 13일 | 18일 | 21일 | 30일 | |
| Rax | 86.6 (± 3.0) | 98.2 (± 0.9) | 97.6 (± 0.6) | 97.8 (± 0.7) |
| Pax6 | 63.9 (± 0.9) | 89.1 (± 2.5) | 61.6 (± 0.5) | 89.7 (± 1.9) |
| Otx2 | 76.4 (± 2.0) | 61.5 (± 0.6) | 63.3 (± 2.9) | 57.2 (± 2.4) |
| Sox2 | 83.0 (± 1.9) | 68.1 (± 1.1) | 49.1 (± 1.6) | 69.1 (± 4.0) |
| Chx10 | 46.3 (± 1.0) | 64.5 (± 1.6) | 48.5 (± 3.9) | 41.6 (± 2.0) |
| Nestin | 65.7 (± 2.7) | 18.0 (± 1.4) | 14.3 (± 2.3) | 8.5 (± 0.9) |
| Mitf | 17.2 (± 0.4) | 2.7 (± 1.0) | 18.6 (± 1.3) | 24.7 (± 0.3) |
상기 실시예 4의 방법에 의해 생성된 신경 망막기원세포는 Pax6 양성률이 63.9%에서 89.1%로, Rax의 양성률이 86.6%에서 98.2%로, Chx10의 양성률이 46.3%에서 64.5%로 동시에 증가 (p<0.0001)하여, Pax6의 양성률 증가가 신경 망막기원세포 (Rax+과 Pax6+이 동시 양성인 세포)의 증가임을 입증하였다 (표 1 및 표 2).
| 마커 | 통계적 유의성 (p 값) | ||
| 13일 대 18일 | 18일 대 21일 | 21일 대 30일 | |
| Rax | < 0.0001 | 0.5308 | 0.7897 |
| Pax6 | < 0.0001 | < 0.0001 | < 0.0001 |
| Otx2 | < 0.0001 | 0.4596 | 0.0505 |
| Sox2 | < 0.0001 | < 0.0001 | < 0.0001 |
| Chx10 | < 0.0001 | < 0.0001 | 0.0531 |
| Nestin | < 0.0001 | 0.1077 | 0.0010 |
| Mitf | < 0.0001 | < 0.0001 | 0.0134 |
*통계적 유의수준: p<0.05
표 1 및 표 2를 참고하면, 신경기원세포의 마커인 네스틴은 65.7%에서 18.0%로 현저히 감소 (p<0.0001)하였는데, 이로써 분화 18일째 신경기원세포의 증식은 억제되고 신경망막세포의 증식 및 분화가 촉진됨을 알 수 있다.
한편, 증식세포의 마커인 Ki67은 87.5%에서 31.5%의 급격한 감소 (p<0.0001)를 나타내었는데, 이는 세포의 분화가 증식보다 더 활발히 일어나고 있음을 나타내는 것이다 (도 2, 표 3 및 표 4).
| 마커 | 평균 ± 평균표준오차 (%, 표본수=3) | |||
| 13일 | 18일 | 21일 | 30일 | |
| Crx | 12.8 (± 1.6) | 80.1 (± 0.2) | 54.8 (± 4.2) | 39.5 (± 7.4) |
| Recoverin | 35.8 (± 0.4) | 68.5 (± 2.6) | 61.3 (± 1.8) | 82.4 (± 4.6) |
| Rhodopsin | 35.3 (± 1.7) | 52.9 (± 3.4) | 60.4 (± 3.2) | 81.2 (± 2.5) |
| Peripherin2 | 5.6 (± 0.3) | 13.9 (± 2.4) | 26.0 (± 0.4) | 41.2 (± 2.0) |
| Ki67 | 87.5 (± 1.3) | 31.5 (± 0.5) | 58.4 (± 4.1) | 30.2 (± 6.1) |
| 마커 | 통계적 유의성 (p 값) | ||
| 13일 대 18일 | 18일 대 21일 | 21일 대 30일 | |
| Crx | < 0.0001 | < 0.0001 | 0.0326 |
| Recoverin | < 0.0001 | 0.0079 | < 0.0001 |
| Rhodopsin | < 0.0001 | 0.0489 | < 0.0001 |
| Peripherin2 | < 0.0001 | < 0.0001 | < 0.0001 |
| Ki67 | < 0.0001 | < 0.0001 | < 0.0001 |
*통계적 유의수준: p<0.05
광수용체세포 전구체 마커인 Crx 양성률이 Wnt3a 첨가 전의 12.8%에서 Wnt3a 첨가 후에는 80.1%로 극적인 증가를 보였다 (p<0.0001)(도 2, 표 3 및 표 4). 또한, 범 광수용체세포의 마커인 리커버린이 35.8%에서 68.5% (p<0.0001)로, 간상체 광수용체세포 마커인 로돕신이 35.3%에서 52.9% (p<0.0001)로, 광수용체세포의 외분절 마커인 페리페린2가 5.6%에서 13.9% (p<0.0001)로 발현이 증가하였다 (도 2, 표 3 및 표 4). 초기 색소상피기원세포의 항원마커인 Mitf (Baumer, et al., Development, 2003; 130: 2903-15)는 양성률이 전단계 17.2%에서 2.7%로 감소하였다 (p<0.0001)(표 1 및 표 2). 또한, 망막기원세포 마커인 Otx2 (p<0.0001) 및 Sox2 (p<0.0001)의 양성률은 감소하였는데, 이는 신경 망막기원세포로의 분화가 일어났음을 나타내는 것이다.
상기 실시예 5의 방법에 의해 생성된 광수용체세포 전구체는 망막기원세포 및 신경 망막기원세포의 표지항원인 Pax6 (89.1%에서 61.6%로 감소, p<0.0001), Chx10 (64.5%에서 48.5%로 감소, p<0.0001) 및 Sox2 (68.1%에서 49.1%로 감소, p<0.0001)의 발현이 감소하였다 (표 1 및 표 2). 광수용체세포 전구체의 표지항원인 Crx도 80.1%에서 54.8%로 감소하였다 (p<0.0001)(도 2, 표 3 및 표 4). 반면, 광수용체세포의 표지항원인 로돕신 (52.9%에서 60.5%로 증가, p=0.0489)과, 광수용체세포의 외분절의 표지항원인 페리페린2 (13.9%에서 26.0%로 증가, p<0.0001)의 발현이 증가하여 광수용체세포의 분화와 성숙이 일어남을 알 수 있었다 (도 2, 표 3 및 표 4). 또한, 감소한 Ki67의 양성률이 31.5%에서 58.4%로 다시 증가하는 것이 발견되었는데 (p<0.0001)(도 2, 표 3 및 표 4), 이는 Shh가 세포의 증식을 촉진시킴을 나타내는 것이다.
상기 실시예 6의 방법에 의해 생성된 광수용체세포는 정량적 항원검사에서 배양된 모든 세포의 82.4 ± 4.6%가 광수용체세포 [간상체 (rod photoreceptor cell)와 원추체 (cone photoreceptor cell)]의 범용 마커인 리커버린에 대해 양성반응을 나타내었고 (도 3), 모든 세포의 81.2 ± 2.5%는 광수용체세포 중 간상체세포의 특이적 항원인 로돕신에 대해 양성반응을 나타내었다 (도 3). 로돕신 양성인 모든 세포가 리커버린에 양성을 나타내어, 이들 항원들의 양성반응의 타당성이 검증되었다.
한편, 좀 더 정확한 로돕신의 양성 판정 및 본 발명의 방법으로 형성된 로돕신 분자의 완전성 (integrity)을 평가하기 위해서, 서로 다른 항원결정부위 (epitope)에 반응하는 하기와 같은 2 종의 로돕신 항체를 사용하였다: 인간-특이적 재조합 로돕신 (인간 로돕신의 두 번째 세포외 고리의 아미노산으로 구성)과 Ret-P1 (로돕신 분자의 N-말단기에 위치하는 아미노산 잔기의 4번-10번까지로 구성).
인간-특이적 재조합 로돕신 양성률과 Ret-P1 양성률 값의 일치 정도를 알아보고자 블랜드-알트만 플롯으로 분석한 결과, 두 항체의 양성률의 차이 값은 통계적으로 유의미한 차이가 없는 것으로 확인되어 (두 항체의 양성률 차이 값의 평균 -1.00; 95% 신뢰구간: -13.6∼11.6), 인간-특이적 재조합 로돕신과 Ret-P1 항체에 모두 반응하며, 그 양성률의 차이는 거의 없음을 확인하였다. 이는 본 발명의 방법으로 형성된 로돕신 분자는 성상이 서로 다른 두 항원결정 부위를 모두 지니고 있음을 시사하는 것이다.
간상체 광수용체세포의 외분절 (outer segment)의 마커인 페리페린2 (Prph2)와 롬1 (retinal outer segment membrane protein 1, rom1)은 각각 배양된 모든 세포의 41.2 ± 2.0%와 76.0 ± 4.6%에서 양성이었다 (도 4). 두 마커 모두 로돕신 양성인 세포에서만 관찰되었다 (도 4). 광수용체세포의 빛에 대한 반응, 즉 기능을 나타내는 포스듀신의 양성률은 49.8 ± 2.2%이었으며 (도 5), 다른 망막 신경세포들과의 연접 (synapse) 기능을 나타내는 시냅토피신은 43.0 ± 2.0%가 양성을 나타내어 (도 6), 이들 세포가 망막신경회로에 참여하여 빛자극을 신경전기자극으로 전환 및 전달하는 기능을 수행함을 알 수 있었다. 이상의 결과는 본 발명이 매우 높은 효율로 인간 배아줄기세포를 광수용체세포의 기능을 수행할 수 있는 단계로까지 분화시킬 수 있음을 증명하는 것이다.
다른 광수용체세포인 파랑옵신 양성-원추체 광수용체세포 (blue opsin-cone photoreceptor cell)는 전체 세포의 80.2 ± 0.6%에서 관찰되었다 (도 7). 이들 세포는 로돕신 양성을 보이는 세포 군집과 근접한 위치에서 발견되거나, 동일한 세포 군집에서 발견되었으며, 이 중 일부는 로돕신과 파랑옵신에 대해 동시에 양성반응을 보였다. 상기 결과는 본 발명의 분화 방법에 따라 인간 배아줄기세포로부터 간상체 및 원추체 광수용체세포 모두를 분화시킬 수 있음을 보여준다.
또한 광수용체세포 전구체의 마커인 Crx는 39.5 ± 7.4%가 양성이었고, 증식세포 (세포증식 순환주기의 후기 G1 단계에서 M 단계까지)의 핵항원 마커인 Ki67은 전체 세포의 30.2 ± 6.1%에서 양성이었다. 광수용체세포 전구체는 세포증식 순환주기를 떠난 직후 Crx를 발현한다고 보고되어 있다. 본 발명에서도 역시 대부분의 인간 배아줄기세포 유래의 Crx 양성 세포는 증식 마커인 Ki67이 음성이었다. 그러나, Crx 양성 세포의 5.5 ± 1.7%는 동시에 Ki67도 발현하고 있음이 관찰되었다 (도 9).
이상의 결과들은 망막세포의 분화를 유도 및 촉진하는 본 발명의 분화 방법이 인간 배아줄기세포 유래-망막기원세포로부터 광수용체세포를 효율적으로 분화시키며, 또한 태생 전기 및 후기 망막 신경세포계를 따라 단계적인 분화가 진행되는 태생기 망막기원세포의 특징과 같이 다단계 분화를 유도하고 있음을 보여준다. 또한 망막기원세포 마커인 Pax6의 양성률은 89.7 ± 1.9%이었고, Pax6는 분화된 망막신경세포 중 하나인 무축삭세포 (amacrine cell)에서도 나타났다. 한편, 망막기원세포 중 망막색소상피 (retinal pigmented epithelium, RPE) 기원세포의 마커인 Mitf의 양성률은 24.7 ± 0.3%, 분화된 망막색소상피 마커인 ZO-1의 양성률은 12.5 ± 1.4%로 나타났으며, 이들 세포는 분화된 망막색소상피 마커인 RPE65에 대해서도 양성을 나타내었다 (도 10).
<7-2>
역전사
중합효소연쇄반응
및 세포분화 관련
표지인자
RNA
발현 확인
상기 실시예 6에서 얻은 광수용체세포의 분화를 확인하기 위해 분화유도 29일째에 역전사 중합효소 연쇄반응 (Reverse transcriptase-polymerase chain reaction, RT-PCR)을 수행하였다.
RNeasy 미니 키트 (Qiagen, Valencia, CA, USA)를 사용하여 총 RNA를 추출한 후 DNaseI (Applied Biosystems/Ambion, Austin, TX, USA)을 처리하여 DNA를 제거하였다. RNA 500 ng을 랜덤 헥사머 (random hexamer, Invitrogen)와 역전사 중합효소 (Omniscript reverse transcriptase, Qiagen)를 이용하여 cDNA로 역전사시켰다. 모든 중합효소 연쇄반응 (PCR)은 1x PCR 완충액, 1.5 mM의 MgCl2, 0.2 mM의 dNTPs, 50 ng의 DNA, 0.5 U의 AmpliTaq Gold (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)와 하기 표 5에 나타낸 프라이머 각각 10 pmoles를 이용해 실시하였다.
| 유전자 | 서열번호 | 프라이머 서열 (5' to 3') | 증폭산물 크기 (bp) |
| PAX6 |
1 | Foward: aacagacacagccctcacaaaca | 275 |
| 2 | Reverse: cgggaacttgaactggaactgac | ||
| SIX3 |
3 | Foward: cgggagtggtacctacagga | 307 |
| 4 | Reverse: ttaccgagaggatggaggtg | ||
| SIX6 |
5 | Foward: cctgcaggatccatacccta | 272 |
| 6 | Reverse: tgatggagatggctgaagtg | ||
| LHX2 |
7 | Foward: ccaaggacttgaagcagctc | 285 |
| 8 | Reverse: tgccaggcacagaagttaag | ||
| RAX |
9 | Foward: ggcaaggtcaacctaccaga | 495 |
| 10 | Reverse: gtgctccttggctttcagac | ||
| CRX |
11 | Foward: gtgtggatctgatgcaccag | 353 |
| 12 | Reverse: tgagatgcccagagggtct | ||
| CHX10 |
13 | Foward: ggcgacacaggacaatcttt | 281 |
| 14 | Reverse: atccttggctgacttgagga | ||
| NRL |
15 | Foward: ggcactgaccacatcctctc | 206 |
| 16 | Reverse: ggaggcactgagctgtaagg | ||
| RCVRN |
17 | Foward: agctccttccagacgatgaa | 150 |
| 18 | Reverse: caaactggatcagtcgcaga | ||
| RHO |
19 | Foward: taagcccatgagcaacttcc | 258 |
| 20 | Reverse: agctgcccatagcagaaaaa | ||
| RBP3 |
21 | Foward: cagcccatatccctgagaat | 291 |
| 22 | Reverse: agcacaagatgggaatggag | ||
| PDE6B |
23 | Foward: aggagaccctgaacatctacc | 409 |
| 24 | Reverse: atgaagcccacttgcagc | ||
| OPN1SW |
25 | Foward: ctgggcactgtagcaggtct | 206 |
| 26 | Reverse: tgcaggccctcagggatg | ||
| ASCL1 |
27 | Foward: catctcccccaactactcca | 467 |
| 28 | Reverse: cttttgcacacaagctgcat | ||
| NEUROD1 |
29 | Foward: gccccagggttatgagactatcact | 523 |
| 30 | Reverse: ccgacagagcccagatgtagttctt | ||
| ATHO7 |
31 | Foward: tcgcatcatcagacctatgg | 246 |
| 32 | Reverse: ccgaacaggacaaactcaca | ||
| POU4F2 |
33 | Foward: caaccccaccgagcaata | 175 |
| 34 | Reverse: gtgcacgggatggtattcat | ||
| ARX | 35 | Foward: tgaaacgcaaacagaggcgcta | 462 |
| 36 | Reverse: tgatgaaagctgggtgtcggaaca | ||
| AFP | 37 | Foward: tttagctgacctggctaccat | 318 |
| 38 | Reverse: cagcttgtgacaggttctgg | ||
| T |
39 | Foward: ccgtctccttcagcaaagtc | 541 |
| 40 | Reverse: caattgtcatgggattgcag | ||
| GAPDH |
41 | Foward: agccacatcgctcagacacc | 302 |
| 42 | Reverse: gtactcagcgccagcatcg | ||
| SAG |
43 | Foward: aaaaagtgccaccaaacagc | 400 |
| 44 | Reverse: acgtcattcttgtctctcttcc |
모든 PCR 반응은 94℃에서 10분간 초기 DNA 변성 반응을 거친 후, 35회의 증폭 주기 (94℃에서 30초, 60℃에서 30초, 72℃에서 1분)을 수행시킨 후, 72℃에서 10분간 최종 연장반응을 시켰다. 상기에서 얻은 PCR 반응물을 2% 아가로즈 젤 (agarose gel)에 전기영동하여 분리시킨 후 분석하였다.
상기의 모든 실험은 3회 반복하였으며, 인간의 GAPDH를 각 검체에서 mRNA 정량을 위한 기준으로 사용하였다.
그 결과, 망막기원세포 관련 유전자들인 RAX, PAX6, SIX3, SIX6, LHX2 및 CHX10 등의 RT-PCR 증폭산물이 관찰되었다. 이 중에서 특히 RAX와 PAX6의 발현은 정량적 대조유전자인 GAPDH 유전자와 비슷한 정도로 많은 양이 발현되었다. 광수용체세포 및 기타 망막세포들 관련 유전자들의 mRNA의 발현 양상을 조사한 결과, 광수용체세포 관련 유전자인 CRX, NRL, RCVRN, RHO, PDE6B, SAG 및 OPN1SW 등의 RT-PCR 증폭산물이 관찰되었고, 망막신경절세포 관련 유전자인 ATHO7 및 POU4F2, 무축삭세포 관련 유전자인 NEUROD1, 두극세포 관련 유전자인 ASCL1 등의 RT-PCR 증폭산물들도 관찰되었다 (도 16).
<7-3> 염기서열분석을 통한 분화된 세포의
광수용체세포
특이적 유전자인
리커버린과
로돕신
유전자의
mRNA
발현 확인
상기 실시예 6에서 얻은 광수용체세포의 분화를 확인하기 위해, 분화유도 29일째에 광수용체세포 특이적 유전자인 리커버린 (RCVRN: NM_002903.2) 및 로돕신 (RHO: NM_000539.3) 유전자에 대한 mRNA 발현을 염기서열분석 (Sequencing)을 통해 확인하였다.
PCR로 증폭한 산물을 퀴아퀵 96-웰 PCR 정제 키트 (QIAquick 96-well PCR purification kit, Qiagen, Valencia, CA)로 정제한 후, 염기서열분석 키트 (BigDye terminator cycle sequencing ready reaction kit, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 사용해 상기 표 5에 명시되어 있는 정방향 또는 역방향 프라이머로 염기서열 분석을 수행하였다. 반응 후 형광표지된 절편을 에탄올 침강법으로 정제하고, 증류수에 재부유한 후, ABI PRISM 3700 DNA 분석기 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)로 영동하였다. 염기서열 결과는 시퀀서 (Sequencher, Gene Codes Corporation, Ann Arbor, MI, USA)를 이용해 분석하였다.
그 결과, 본 발명에 따라 분화된 광수용체세포에서 발현된 RCVRN 및 RHO 유전자들의 염기서열이 인간의 표준염기서열 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)과 완벽하게 일치함을 확인하였는데, 이는 상기 광수용체세포에서 발현되는 RCVRN 및 RHO 유전자가 인간의 RCVRN 및 RHO 유전자의 발현임을 나타내는 것이다 (도 17).
실시예
8: 인간 배아줄기세포로부터 분화된
광수용체세포의
이식 및 이식 세포의 평가
<8-1> 분화된
광수용체세포의
이식
상기 실시예 6에서 생성된 광수용체세포의 실명 환자에로의 이식 가능성과 임상 적용 가능성을 확인하기 위해, 면역이 억제된 망막 변성 마우스 모델인 rd/SCID 마우스에 상기 분화된 광수용체세포의 이식 실험을 실시하였다.
모든 동물실험은 서울대학교의과대학/서울대학교병원의 의학연구심의위원회의 인증과 서울대학교와 서울대학교병원의 동물실험윤리위원회의 인증을 받은 후, 안과/시력 연구의 동물실험에 대한 ARVO 법 규정 (ARVO Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research)에 따라 수행하였다. 본 이식 실험에는 4주령의 C3H/Prkdc 마우스 (rd/SCID, Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, USA)를 사용하였다. 대조군으로는 상기 분화된 광수용체세포를 이식하지 않은 rd/SCID 마우스를 사용하였다.
본 발명에 따라 인간 배아줄기세포로부터 분화된 광수용체포를 포함하는 망막세포는 아큐타제를 사용해 단세포로 분리하였고, 둘베코 PBS (Dulbecco's PBS, D-PBS, Invitrogen)에 6∼10 × 104 세포/㎕ 농도로 현탁하여 현탁액을 만들었다. 수술은 해부현미경 (SZ51, Olympus, Tokyo, Japan)을 통해 수행하였다. 졸레틸 (zoletil, 7.5 mg/kg, Virbac Laboratoires, Carros, France)과 자일라진 (xylazine, 10 mg/kg, 바이엘코리아, 한국)의 혼합액을 마우스의 복강 내에 주사하여 마취시킨 후, 산동제 (Mydrin-P, Santen Pharmaceutical Co., Osaka, Japan)와 0.5% 프로파라카인 (proparacaine, Alcaine 0.5%, Alcon, Inc., Puurs, Belgium)을 점안하였다. 각 마우스마다 상기에서 준비된 1 ㎕의 세포 현탁액을 10 ㎕ 주사기 (NanoFil microsyringe, World Precision Instruments, WPI, Sarasota, FL, USA)와 35 게이지 (gauge) 크기의 주사바늘 (WPI)을 사용해 망막하 공간에 이식하였다.
<8-2> 망막 변성 마우스로의 이식 후
망막전위도
평가
본 발명에 따라 인간 배아줄기세포로부터 분화된 광수용체세포가 이식된 마우스의 망막 기능을 평가하기 위해, 이식 3~5주일 후 망막전위도 (electroretinography, ERG, Roland Consult, Wiesbaden, Germany)를 검사하였다. 망막전위도 검사를 위해 마우스는 하루 전날부터 암순응 하에 적응시켰다. 검사 전처리로는 졸레틸 (7.5 mg/kg, Virbac Laboratoires, Carros, France)과 자일라진 (10 mg/kg, 바이엘코리아, 한국)의 혼합액을 마우스의 복강 내에 주사하여 마취시킨 후, 산동제 (Mydrin-P, Santen Pharmaceutical Co., Osaka, Japan)와 0.5% 프로파라카인 (proparacaine, Alcaine 0.5%, Alcon, Inc., Puurs, Belgium)을 점안하였다. 이때, 안구건조 방지를 위해 비디식 겔 (Vidisic Gel, Dr. Mann Parma, Berlin, Germany)을 함께 점안하였다.
망막전위도 검사는 체온유지판 (mouse table, Roland Consult, Wiesbaden, Germany)에서 37℃로 체온을 유지한 상태에서 레티포트 시스템 (RETIport System, Roland Consult, Wiesbaden, Germany)을 이용하여 -25, -10, 0 dB의 빛 자극강도에서 망막신경의 반응을 기록한 후, 레티-스캔 시스템 (RETI-scan System, Roland Consult, Wiesbaden, Germany) 프로그램을 이용해 결과를 분석하였다. 각 검사 시마다 양성 기준으로 치료하지 않은 C57BL6 마우스, 음성 기준으로 치료하지 않은 C3H/Prkdc 마우스 (rd/SCID)에 대해 상기와 동일하게 망막전위도 검사를 수행하였다.
검사 후 조직학적 확인을 위해 이산화탄소 주입 및 경추 탈골을 유도하여 안락사시킨 후 안구를 적출하여 면역형광염색을 수행하였다. 구체적으로, 안락사 직후 안구를 적출하여 4% 파라포름알데하이드로 4℃에서 하룻밤 동안 고정시켰다. 고정 후 상기 안구를 10%와 30% 설탕 (sucrose, Sigma-Aldrich) 용액에서 동결보호 과정을 거친 후, OCT 동결절편 용액 (Tissue-Tek, Sakura, Tokyo, Japan)에 넣어 -80℃에서 즉시 냉동 보관하였다. 한편, 일부 마우스는 이식 4 주일 후, 전기망막전위도 검사를 수행하지 않고 이산화탄소 주입 및 경추 탈골을 유도하여 안락사시킨 후 안구를 적출하여 상기와 동일하게 면역형광염색을 수행하였다.
망막전위도의 회복은 병변 망막 내로 이식된 세포의 효과 및 효능을 나타내며, 특히 광수용체세포가 이식된 마우스의 망막 내 로돕신 양성은 망막전위도의 b-파 진폭과 밀접한 관계가 있다. 망막전위도 평가시점에서 동일 연령 (7~9주)의 비이식군 rd/SCID 마우스는 망막전위도 검사 시 빛 자극에 대해 아무런 반응을 나타내지 않았다 (도 18A). 반면, 광수용체세포가 이식된 rd/SCID 마우스는 망막전위도 검사에서 빛 자극에 대해 명확한 반응을 나타내었다 (도 18B). 이들 rd/SCID 마우스의 광수용체세포가 이식된 눈에서의 망막전위도 b-파는 특징적인 파형을 나타내었으며 (도 18B), 48.4 (± 13.4) μV (표본수 = 13)의 진폭을 나타내었다 (도 19). 그러나, 비이식군에서는 특징적인 파형이 관찰되지 않았고, b-파 진폭도 10.3 (± 2.5) μV (표본수 = 17)로 이식군과는 통계적으로 유의미한 차이를 보였다 (p<0.0001)(표 6, 도 19).
| 비이식군 (평균 ± 평균표준오차) (표본수 = 17) |
이식군 (평균 ± 평균표준오차 ) (표본수 = 13) |
|
| b-파 진폭 (uV) | 10.3 (± 2.5) | 48.4 (± 13.4) |
<8-3> 면역화학염색 및 이식된 세포의 평가
상기 냉동절편을 16 ㎛ 두께로 잘라 유리 슬라이드 (Muto Pure Chemicals Co., Tokyo, Japan)에 고정한 후, 본 발명에 따른 광수용체세포 이식군과 비이식 대조군에 대해 상기 실시예 <7-1>에서 설명한 바와 같이 인간의 미토콘드리아와 광수용체세포에 특이적인 항체를 이용한 면역화학염색법으로 이식된 세포를 평가하였다 (평가 마우스 수 = 13).
그 결과, 망막 변성 마우스의 망막 내에 광수용체세포가 이식된 경우 이식 부위에서 4∼5층의 새로운 광수용체세포층이 형성되었고, 이는 로돕신과 리커버린을 나타내는 세포들로 이루어진 외핵층을 포함하였다 (도 20). 광수용체세포 이식군과 비이식군 사이에서 로돕신과 리커버린의 양성률은 현저한 차이를 보였다. 즉, 로돕신은 비이식군에서는 망막의 관찰 시야당 총 세포 199개 중 2개의 세포에서 양성반응을 보였다 (양성률: 1.0%). 그러나, 이식군에서는 4∼5층의 로돕신 양성 세포층이 새롭게 외핵층을 형성하였고, 망막의 관찰 시야당 총 세포 215개 중 88개의 세포에서 양성반응을 보였다 (양성률: 40.8%)(p<0.0001)(표 7 및 도 21). 따라서, 마우스 망막의 해당 절편의 약 40%의 면적이 이식된 간상체 광수용체세포로 새롭게 형성되었음을 알 수 있다. 또한, 정상 망막 내 광수용체세포에서 관찰되는 외분절층 내 로돕신 디스크가 이식군 마우스의 광수용체세포에서 관찰되었다 (도 20). 로돕신 디스크는 빛 자극 시 빛에너지를 전기에너지로 바꾸는 일차적인 구조로, 이식 마우스의 생착/분화된 광수용체 특히, 외분절층의 로돕신 디스크가 망막전위도의 빛 자극에 대한 반응을 유도하였으며, 이것이 b-파 진폭을 증가시킨 것으로 판단되었다.
리커버린은 비이식군에서는 망막의 관찰 시야당 총 세포 168개 중 40개의 세포에서 양성반응을 보였으나 (양성률: 23.8%), 이식군에서는 망막의 관찰 시야당 총 세포 292개 중 120개의 세포에서 양성반응을 보였다 (양성률: 41.0%)(p<0.0001)(표 7 및 도 21). 비이식군에서 리커버린은 내측핵층의 두극세포와 외핵층의 원추성 광수용체세포를 의미하며, 이식군에서는 내핵층에 더하여 외핵층에 4∼5층의 리커버린 양성 세포층이 새롭게 형성되어 있음을 확인되었는데, 상기 결과는 이식된 인간 배아줄기세포 유래 광수용체세포가 망막 내에서 자신의 위치를 찾아서 생착하고, 변성으로 소실된 외핵층을 효과적으로 재건하였음을 나타내는 것이다.
| 마커 | 이식하지 않은 대조군 | 이식군 | ||||
| 양성 세포수 | 총 세포수 | 양성률 (%) | 양성 세포수 | 총 세포수 | 양성률 (%) | |
| 로돕신 | 2 | 199 | 1 | 88 | 215 | 40.8 |
| 리커버린 | 40 | 168 | 23.8 | 120 | 292 | 41.0 |
또한, 이식 후 생착된 세포들은 시냅토피신이 양성으로 발현되었는데, 이로부터 이식된 세포가 기존의 마우스 내 망막 세포들과 연접하여 망막신경 및 빛 회로에 참가하고 있음을 확인하였다 (도 17). 시냅토피신 양성은 새롭게 형성된 외핵층의 광수용체세포가 이식된 마우스 망막 내의 다른 세포들과 연접하여 광세포수용체세포가 빛에 반응하는 회로 기능을 수행할 수 있음을 의미한다.
상기 결과들은 본 발명에 의해 인간 배아줄기세포로부터 분화된 광수용체세포가 마우스 망막의 기능적 회로에 연결되어 참여할 수 있고, 이식된 마우스에서 세포 본래의 기능을 수행할 수 있으며, 광수용체세포의 소실로 실명이 된 마우스의 시력 회복 및 치료의 가능성이 있음을 나타낸다.
실시예
9:
망막세포
증식에 대한
Wnt
신호전달 작용제의 증식 효과 실험
본 발명에 따른 분화 방법에서 Wnt 신호전달 작용제가 망막기원세포를 망막세포로 분화시키는데 주요 분화인자임을 확인하기 위해, Wnt3a (W), Shh (S) 및 레티노산 (R)의 3가지 분화인자에 대해 다양한 조합의 배양액을 제조하여 세포증식 효과를 조사하였다 (도 18 및 표 8). 이를 위해 상기 분화인자들을 본 발명에 따른 분화 방법의 배양 단계 및 시기에 맞춰 배양액에 첨가하였다. 즉, Wnt3a는 배양 13일째에 50 ng/ml의 농도로, Shh는 배양 18일째에 250 ng/ml의 농도로, 레티노산은 21일째에 500 nM의 농도로 배양액에 첨가한 후, 각 배양액별로 인간 배아줄기세포를 29일간 배양한 다음 총 세포수 분석실험을 수행하였다.
6-웰 세포 배양 플레이트의 한 웰당 1.3 (± 0.1)× 106 세포 농도로 접종된 미분화 인간 배아줄기세포에서 303 ± 12개의 부유 응집체가 형성되었고, 분화를 위해 53개의 부유 응집체 (미분화 인간배아줄기세포 1.55 × 104 세포에 해당)를 다시 플레이트의 한 웰에 접종하였다.
총 세포수에 대한 배양액간의 통계학적 분석을 위해 크루스칼-월리스 검사를 시행한 결과, p 값은 0.0026으로 5개 배양액간의 세포수에 유의미한 차이가 있음을 확인하였다. 이에 어떤 집단간에 차이가 있는지 추가 분석을 시행하였다. 추가 분석은 fdr 방법을 이용하여 1종 오류가 보정된 p 값으로 판단하였다. 그 결과를 하기 표 8에 나타냈다.
| 세포수 (x 106) (평균±평균표준오차) |
3.98 (±0.64) |
0.73 (± 0.16) |
2.21 (±0.67) |
2.74 (±0.36) |
0.87 (±0.38) |
|
| 배양액 주 조성인자 |
Wnt3a (50 ng/ml) |
＋ | - | ＋ | ＋ | - |
| Shh (250 ng/ml) |
＋ | ＋ | ＋ | - | - | |
| RA (500 nM) |
＋ | ＋ | - | ＋ | - | |
그 결과, 총 세포수는 본 프로토콜의 조성인 W+/S+/R+가 3.98 (± 0.64) × 106으로 제일 많았으며, 그 다음은 W+/S-/R+와 W+/S+/R-로 각각 2.74 (± 0.36) × 106과 2.21 (± 0.67) × 106이었다. W-/S-/R-와 W-/S+/R+는 0.87 (± 0.38) × 106 과 0.73 (± 0.16) × 106으로 제일 낮았다. 상기 결과에서 세포증식 효과가 S와 R의 존재 유무와 상관없이 W의 존재 유무에 좌우되는 것임을 알 수 있는데, 이는 대부분의 세포증식 효과가 Wnt3a의 작용에 의한 것임을 의미하는 것이다. 특히, 두 배양액 W+/S+/R+와 W-/S+/R+의 경우를 비교하면, 3.98 × 106 대 0.73 × 106으로서 5배 이상 차이를 보였다. 이 역시 Wnt3a가 세포증식에 주된 역할을 하는 인자임을 입증하는 결과이다.
분석 결과, 배양액 조성 W+/S+/R+ 대 W-/S+/R+ (p=0.03967), W+/S+/R+ 대 W-/S-/R- (p=0.03967), W-/S+/R+ 대 W+/S-/R+ (p=0.03967) 사이에 유의미한 차이가 존재하였다 (유의수준 p<0.05)(도 21). 즉, 1.55 × 104 개의 인간 배아줄기 미분화세포는 W+/S+/R+ 배양액 조성에서 배양 4주 후, 3.98 × 106 개의 분화세포로 증식하였는데, 이는 처음에 접종하였던 세포의 257배에 해당하는 세포수이다.
실시예
10:
망막세포
분화에 대한
Wnt
신호전달 작용제의 역할 확인 실험
망막기원세포로부터 신경 망막기원세포 및 광수용체세포를 분화시키기 위해, 분화 실시 13일째 되는 날 Dkk-1 (10 ng/ml)의 투여를 중단하고 노긴, IGF-1, bFGF 및 Wnt3a (50 ng/ml)의 혼합물로 구성된 배양액을 제조하여 5일간 공급하였다.
Wnt3a는 전뇌 및 안구영역전구체 형성을 유도하기 위해서는 초기 태생기 동안에 제거되어야 하지만, 후기 태생기 동안에는 Wnt3a 농도가 증가함에 따라 Pax6 양성세포가 농도-의존적으로 비례하여 증가하게 된다. Pax6은 태생기의 망막 생성기간 동안 세포분열을 하고 있는 즉, 증식성의 모든 망막기원세포에서 발현될 뿐만 아니라 (Marquart 2002), 신경 망막기원세포 발생에 필수적으로 요구된다. 따라서, 높은 비율의 Pax6 발현은 곧 고효율의 신경 망막기원세포로의 분화를 의미하므로, Pax6을 높은 비율로 유도, 생성하기 위해서 Wnt3a의 억제제인 Dkk-1은 제거하는 반면 Wnt3a는 공급하였다. Wnt3a 첨가 전후에 따른 망막세포 마커들의 변화를 하기 표 9에 나타내었다.
| 마커 | 평균 ± 평균표준오차 (%, 표본수=3) | 통계적 유의성 (p 값) |
|
| Wnt3a 투여 전, (배양 13일째) |
Wnt3a 투여 후, (배양 18일째) |
||
| Rax | 86.6 (± 3.0) | 98.2 (± 0.9) | < 0.0001 |
| Pax6 | 63.9 (± 0.9) | 89.1 (± 2.5) | < 0.0001 |
| Otx2 | 76.4 (± 2.0) | 61.5 (± 0.6) | < 0.0001 |
| Sox2 | 83.0 (± 1.9) | 68.1 (± 1.1) | < 0.0001 |
| Chx10 | 46.3 (± 1.0) | 64.5 (± 1.6) | < 0.0001 |
| 네스틴 | 65.7 (± 2.7) | 18.0 (± 1.4) | < 0.0001 |
| Mitf | 17.2 (± 0.4) | 2.7 (± 1.0) | < 0.0001 |
| Crx | 12.8 (± 1.6) | 80.1 (± 0.2) | < 0.0001 |
| 리커버린 | 35.8 (± 0.4) | 68.5 (± 2.6) | < 0.0001 |
| 로돕신 | 35.3 (± 1.7) | 52.9 (± 3.4) | < 0.0001 |
| 페리페린2 | 5.6 (± 0.3) | 13.9 (± 2.4) | < 0.0001 |
| Ki67 | 87.5 (± 1.3) | 31.5 (± 0.5) | < 0.0001 |
그 결과, Wnt3a 투여 후 Pax6 양성률이 63.9%에서 89.1%로 증가하였다 (p<0.0001). 또한, Rax의 양성률은 86.6%에서 98.2%로 증가하고 (p<0.0001), Chx10의 양성률은 46.3%에서 64.5%로 증가하였는데 (p<0.0001), 이로부터 Wnt 신호전달 체계가 Rax 및 Chx10의 양성률을 동시에 증가시키는 것을 알 수 있다. 상기 결과는 Pax6의 양성률 증가가 신경 망막기원세포 (Rax+와 Pax6+이 동시 양성인 세포)의 증가임을 입증하는 것이다 (표 9).
또한, 신경 망막기원세포에서는 발현되지 않는다고 알려진 (Yang et al, Mech Dev. 2000; 94: 287-91) 대부분의 중추신경계 신경기원세포들의 마커인 네스틴은 Wnt3a 투여 후 65.7%에서 18.0%로 현저히 감소하였는데 (p<0.0001), 이로써 Wnt 신호전달 체계가 신경기원세포의 증식은 억제하고 신경망막세포의 증식 및 분화는 촉진함을 확인하였다 (표 9).
증식세포 마커인 Ki67은 87.5%에서 31.5%로의 급격한 감소 (p<0.0001)를 보였는데, 이는 Wnt3a 투여로 세포의 분화가 증식보다 더 활발히 일어나고 있음을 의미한다. 광수용체세포 전구체는 신경 망막기원세포가 증식 순환주기를 떠난 직후 Crx가 발현되면서 형성된다. 따라서, Wnt 신호전달 체계에 의해 신경 망막기원세포의 증식 순환주기를 떠난 세포들은 Crx를 발현하는 광수용체세포 전구체로 분화되는 것을 알 수 있다 (표 9).
지금까지, 생체 내에서 망막기원세포로부터 Crx+광수용체세포 전구체를 유도하는 신호전달 체계의 정확한 생물학적 변화와 분자물질에 대해서는 보고된 바 없다 (Ikeda et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2005; 102: 11331-6). 그런데, 본 발명에 의해 Wnt3a가 광수용체세포 전구체 마커인 Crx 발현을 매우 강력하게 유도한다는 사실이 밝혀졌다. 즉, Crx 양성률이 Wnt3a 투여 전의 12.8%에서 Wnt3a 첨가 후 80.1%로 극적인 증가를 보였다 (p<0.0001)(표 9). 이렇게 증가된 Crx 발현은 광수용체세포의 분화 유도 및 생성에 영향을 미쳐 광수용체세포의 분화를 직접적으로 촉진하였다. 광수용체세포 마커인 리커버린 (35.8%에서 68.5%로 증가, p<0.0001)과 로돕신 (35.3%에서 52.9%로 증가, p<0.0001) 및 광수용체세포의 외분절 마커인 페리페린2 (5.6%에서 13.9%로 증가, p<0.0001)의 발현을 증가시켰다 (표 9).
반면, 망막색소상피 기원세포 (retinal pigmented epithelial progenitor cell) 마커인 Mitf는 17.2%에서 2.7%로 급격히 감소 (p<0.0001)하는 결과를 보여, Wnt 신호전달 체계가 신경망막세포 및 광수용체세포의 생성은 촉진하지만 망막색소상피의 형성은 억제한다는 것을 확인하였다 (표 9).
실시예
11:
망막세포
분화에 대한
분화인자인
Wnt
신호전달 작용제의 억제제 실험
<11-1>
망막세포
분화에 대한
분화인자인
Wnt
신호전달 작용제의 억제제 투여
인간 배아줄기세포로부터 망막세포, 특히 광수용체세포 분화에 대한 Wnt 신호전달 작용제의 기능을 규명하기 위해서, Wnt 신호전달 작용제의 억제제를 배지에 첨가하여 배양하였다. Wnt/Frizzled 신호전달의 억제제인 Dkk-1 (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)을 배양 13일째에 각각 10 ng/ml, 100 ng/ml 및 1 ㎍/ml의 농도로 첨가한 후, 16일간의 배양기간에 걸쳐서 동일한 농도를 유지하면서 억제제 농도에 따른 Wnt 신호전달 작용제의 효과를 분석하였다. 상기 Dkk-1은 PBS에 0.1% 농도로 희석된 소혈청알부민 (bovine serum albumin, BSA, Sigma-Aldrich)에 용해시켜 사용하였다.
구체적으로, 망막세포로의 분화 프로토콜에서 Wnt3a가 첨가되는 시기인 배양 13일째에 Wnt3a와 Dkk-1을 배양액에 다음과 같은 농도로 첨가하였다. 즉, Wnt3a를 50 ng/ml 농도로 첨가한 배양액 (I군), Wnt3a와 Dkk-1을 모두 첨가하지 않은 배양액 (II군), Dkk-1을 10 ng/ml 농도로 첨가한 배양액 (III군), 100 ng/ml 농도로 첨가한 배양액 (IV군), 및 1 ㎍/ml 농도로 첨가한 배양액 (V군)의 5개 군으로 나누어 각각 농도별로 배양 29일째까지 배양하였다. 이 실험에서는 다른 주요 분화인자인 Shh와 레티노산은 첨가하지 않았다.
<11-2>
면역형광염색
분석
상기 실시예 <11-1>의 세포 분화에 있어서 Wnt 신호전달 작용제의 효과를 알아보기 위해, 하기와 같은 면역형광염색 분석을 시행하였다.
폴리-디-라이신/라미닌 (poly-D-lysine/laminin, BD Biosciences)으로 코팅된 8-웰 슬라이드에서 Wnt3a와 Dkk-1의 조건별 (I군~V 군)로 배양된 세포들을 배양 29일째에 4% 파라포름알데하이드 (Sigma-Aldrich)로 고정한 후, 3% BSA (Jackson Immunoresearch Laboratory)와 0.25% 트리톤-엑스-100 (Sigma-Aldrich)이 함유된 PBS로 비특이적 반응을 차단시켰다.
90분의 차단과정 후, 각 단계의 슬라이드를 하기와 같은 분화 유도된 세포 단계의 특이 항체들과 함께 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켰다: 토끼-Blue-opsin (1:500, Chemicon), 양-Chx10 (1:100, Chemicon), 토끼-Crx (1:200, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), 토끼-GFAP (1:200, Invitrogen), 마우스-인간 특이적 미토콘드리아 (human specific mitochondria, 1:50, Chemicon), 토끼-인간 특이적 미토콘드리아 (1:200, Chemicon), 마우스-Islet1 (1:10, Developmental Studies Hydroma Bank, DSHB; Iowa City, IA, USA), 마우스-Ki67 (1:100, Vector Laboratories, Peterborough, England), 마우스-Mitf (1:1,000, abcam, Cambridge, MA, USA), 마우스-네스틴 (1:250, BD Sciences), 토끼-뉴로필라멘트-200 (1:1,000, Sigma-Aldrich), 토끼-Otx2 (1:100, abcam), 토끼-Pax2 (1:250, abcam), 마우스-Pax6 (1:2, DSHB), 마우스-페리페린2 (1:500, GenScript, Piscataway, NJ, USA), 토끼-Rax (1:250, abcam), 토끼-리커버린 (1:1,000, Chemicon), 마우스 망막상피세포 65 (retinal pigment epithelium 65, RPE65, 1:100, Chemicon), 토끼-로돕신 (1:500, Sigma-Aldrich), 마우스-로돕신 (1:500, Ret-P1, Lab Vision, Fremont, CA, USA), 마우스-로돕신 (1:2,000, Ret-P1, Sigma-Aldrich), 마우스-롬1 (1:50, ABR-Affinity Bioreagents, Golden, CO, USA), 토끼-PDE6 beta (1:100, abcam), 토끼-포스듀신 (1:500, Santa Cruz Biotechnology), 마우스-PKC-alpha (1:500, Sigma-Aldrich), 마우스-Prox1 (1:2,000, Chemicon), 마우스-Sox2 (1:250, R&D Systems), 토끼-시냅토피신 (1:2,000, Santa Cruz Biotechnology), 및 토끼-ZO-1 (1:100, Zymed-Invitrogen).
상기 항체들은 1% BSA와 0.25% 트리톤X-100이 함유된 PBS 용액에 희석하여 사용하였다. 상기 세포들을 PBS로 각각 5분간 3회 세척한 후, Cy3 (1:800, Jackson Immunoresearch Laboratory) 또는 Alexa488 (1:500, Invitrogen)이 결합된 종-특이 이차항체와 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 일차항체와 이차항체에 대한 적절한 기준 물질을 이용해 비특이적 염색이나 항체간 상호반응 여부를 확인하였다. 이 후, 상기 세포들을 PBS로 각각 5분씩 3회 세척한 후, DAPI (4',6-diamidino-2 phenylindole)를 포함하는 벡타쉴드 (Vectashield, Vector Laboratories)로 핵 염색을 수행한 후, 형광현미경 (epifluorescence microscope, Nikon Eclipse, E800, Tokyo, Japan)과 공초점 현미경 (confocal microscope, Leica, Leica Microsystems Inc, Bannockburn, IL, USA or Zeiss LSM510, Carl Zeiss, Inc, Thornwood, NY, USA)으로 관찰하였다.
각 항체에 대한 양성 반응은 400배에서 무작위적으로 20 시야를 추출한 후 500개의 세포를 계수한 후 평가하였으며, 양성 비율에 대한 판정은 최소 3회 이상 각 항체를 평가한 후 실시하였다. Wnt3a 및 Dkk-1의 농도 조건에 따른 양성률의 차이가 있는지를 알아보기 위해 상기에서 얻은 데이터를 집락효과 (cluster effect)를 보정한 후 SAS 9.1 버전의 GEE (Generalized Estimating Equations)를 이용한 통계학적 분석을 수행하여 유의성을 평가하였다. 모든 데이터는 평균 ± 평균의 표준오차 (mean ± standard error of the mean, S.E.M)로 기술하였다. p 값은 <0.05일 때 통계적으로 유의하다고 평가하였다.
그 결과, 항원 마커별로 각각의 농도 조건 분석에서, 광수용체세포의 마커들에서 5개 군 사이에 전체적으로 유의미한 차이가 있었다. 즉, Crx (p=0.0247), 리커버린 (p=0.0113), 로돕신 (p=0.0166), 페리페린2 (p=0.0166)의 발현이 Dkk-1의 농도가 증가할수록 현저히 감소하였다. 각 마커에 대해 각 군사이의 유의성을 분석한 결과, Crx에서 I군 대 II군, IV군 대 V군과, 리커버린에서 I군 대 II군을 제외한 각 군 사이에 모두 통계적으로 유의미한 차이가 있었다 (유의미한 군 사이에서의 값: *: p<0.0001; **: p=0.0381)(도 24, 표 10 및 11). Wnt3a와 그 억제제인 Dkk-1의 실험 결과로서, 분화 생성된 광수용체세포는 Wnt 신호전달 체계의 활성화에 의한 것이며, Wnt 신호전달 체계가 억제되면 광수용체세포의 생성도 거의 이루어지지 않는 것임이 증명되었다.
1 ㎍/ml 농도의 Dkk-1 처리에 의해서도 억제되지 않은 11.9%의 로돕신 양성률은 Dkk-1의 작용에 의해서는 억제되지 않는 Wnt 경로의 베타-카테닌 안정화이거나, Wnt4, Wnt5 및 Wnt11 등에 의한 신호경로 (non-canonical pathyway)의 활성화에 의한 것으로 생각된다. 또한, 망막기원세포의 마커인 Pax6의 발현도 5개 군 사이에 전체적으로 유의미한 차이가 있었고 (p=0.0275), Dkk-1의 농도가 증가할수록 발현이 감소하였다 (각 군 사이에서의 모든 p값: p<0.0001)(도 24, 표 10 및 11).
| 평균 ± 평균표준오차 (%, 표본수 = 3) | |||||
| 마커 | Wnt3a, 50 ng/ml (I군) |
Wnt3a (-), Dkk-1 (-) (II군) |
Dkk-1, 10 ng/ml (III군) |
Dkk-1, 100 ng/ml (IV군) |
Dkk-1, 1 ㎍/ml (V군) |
| Pax6 | 82.1 (± 4.0) | 64.0 (± 1.0) | 63.9 (± 0.9) | 51.8 (± 1.0) | 42.1 (± 2.1) |
| Crx | 32.5 (± 0.3) | 31.8 (± 3.8) | 54.3 (± 3.1) | 7.4 (± 1.1) | 7.5 (± 0.9) |
| 리커버린 | 72.3 (± 0.8) | 71.1 (± 0.8) | 55.1 (± 0.6) | 41.5 (± 1.3) | 15.2 (± 4.0) |
| 로돕신 | 73.8 (± 0.9) | 52.7 (± 1.0) | 49.1 (± 2.0) | 28.9 (± 0.5) | 11.9 (± 3.0) |
| 페리페린2 | 21.5 (± 0.3) | 16.4 (± 0.8) | 27.0 (± 1.0) | 2.1 (± 1.0) | 0.1 (± 0.1) |
| 통계적 유의성 (p 값) | ||||
| 마커 | I군 대 II군 | II군 대 III군 | III군 대 IV군 | IV군 대 V군 |
| Pax6 | < 0.0001 | 0.9036 | < 0.0001 | < 0.0001 |
| Crx | 0.8147 | < 0.0001 | < 0.0001 | 1.0000 |
| 리커버린 | 0.1864 | < 0.0001 | < 0.0001 | < 0.0001 |
| 로돕신 | < 0.0001 | 0.0381 | < 0.0001 | < 0.0001 |
| 페리페린2 | < 0.0001 | < 0.0001 | < 0.0001 | < 0.0001 |
*통계적 유의수준: p<0.05
* I 군: Wnt3a, 50 ng/ml; II 군: Wnt3a (-),Dkk-1 (-); III군: Dkk-1, 10 ng/ml;
IV 군: Dkk-1, 100 ng/ml; V 군: Dkk-1, 1 ㎍/ml.
실시예
12:
Wnt3a
및
Shh
대체물에 따른
망막세포
마커들의
양성률 확인
실시예 4 내지 6에 사용된 분화용 배지에서 재조합 Wnt3a 대신에 50 ng/ml의 재조합 Wnt1 (PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA), 50 ng/ml 및 100 ng/ml의 재조합 Wnt5a (recombinant Wnt5A, R&D Systems), 50 ng/ml 및 100 ng/ml의 재조합 Wnt11 (recombinant Wnt11, R&D Systems), 50 ng/ml의 재조합 노린 (recombinant Norrin, R&D Systems), 2.5 mM 및 5 mM의 LiCl (Sigma-Aldrich), 2 μM의 BIO (Sigma-Aldrich), 또는 30 μM의 SB415286 (Sigma-Aldrich)을 사용하고, 실시예 5 및 6에 사용된 분화용 배지에서 재조합 Shh 대신에 1 μM 퍼모파민 (Purmorphamine, Stemgent, Cambridge, MA, USA)을 사용하는 것을 제외하고는, 실시예 4 내지 6과 동일한 방법으로 망막기원세포로부터 신경 망막기원세포로의 분화, 신경 망막기원세포로부터 광수용체세포 전구체로의 분화, 및 광수용체세포 전구체로부터 광수용체세포로의 분화를 수행하였다.
다양한 Wnt3a 및 Shh 대체물을 사용하여 분화된 세포에 대해 상기 실시예 <7-1>과 동일한 방법으로 면역화학염색을 수행하여 망막세포 마커들의 양성율을 조사하였고, 그 결과를 하기 표 12 및 13에 나타내었다.
| 평균 ± 평균표준오차 (%, 표본수 = 3) | ||||||||
| 대체물 | 리커버린 | 로돕신 | 롬 | 페리페린2 | Crx | Ki67 | Pax6 | b-옵신 |
| Wnt1 (50 ng/ml) |
70.9 (±1.8) |
66.2 (±5.4) |
55.9 (±2.9) |
3.8 (±2.0) |
60.3 (±1.3) |
23.8 (±1.2) |
ND | 61.6 (±6.8) |
| Wnt5A (50 ng/mL) |
61.0 (±3.2) |
59.5 (±2.0) |
58.8 (±2.7) |
20.7 (±0.8) |
67.3 (±1.9) |
41.3 (±3.9) |
ND | 55.0 (±4.4) |
| Wnt5A (100 ng/ml) |
61.6 (±2.5) |
56.1 (±1.8) |
ND | 14.2 (±2.8) |
ND | ND | ND | ND |
| Wnt11 (50 ng/ml) |
65.3 (±2.7) |
51.8 (±7.7) |
50.2 (±7.4) |
0.5 (±0.3) |
65.9 (±5.8) |
40.1 (±5.2) |
ND | 30.6 (±6.2) |
| Wnt11 (100 ng/ml) |
61.8 (±4.1) |
59.1 (±5.4) |
ND | 10.7 (±2.9) |
ND | ND | ND | ND |
| Norrin (50 ng/ml) |
85.0 (±7.2) |
82.9 (±7.1) |
69.5 (±2.7) |
24.9 (±4.5) |
39.3 (±0.8) |
42.2 (±6.8) |
ND | 71.1 (±0.6) |
| BIO (2 uM) |
77.1 (±0.8) |
71.5 (±1.2) |
60.3 (±0.9) |
33.9 (±0.1) |
65.8 (±1.0) |
17.2 (±0.6) |
92.8 (±1.0) |
77.5 (±1.8) |
| SB415286 (30 uM) |
70.0 (±0.6) |
69.3 (±0.5) |
59.5 (±0.7) |
9.1 (±0.6) |
53.7 (±2.7) |
13.3 (±1.2) |
89.1 (±0.6) |
53.7 (±2.7) |
| LiCl (2.5 mM) |
64.1 (±2.9) |
56.2 (±1.7) |
ND | ND | ND | ND | ND | ND |
| LiCl (5 mM) |
78.9 (±4.4) |
68.5 (±2.2) |
ND | 1.5 (±0.9) |
5.0 (±1.7) |
33.3 (±2.2) |
ND | ND |
| 평균 ± 평균표준오차 (%, 표본수 = 3) | |||||
| 대체물 | 리커버린 | 로돕신 | 페리페린2 | Crx | Ki67 |
| 퍼모파민 (1 uM) |
76.5 (±0.9) |
73.5 (±1.2) |
41.5 (±1.2) |
71.6 (±0.8) |
24.3 (±0.5) |
상기 표 12 및 13에 나타난 바와 같이, Wnt3a 대체물로 Wnt1, Wnt5a, Wnt11, 노린, LiCl, BIO 및 SB415286을 사용하고, Shh 대체물로 퍼모파민을 사용하여 망막기원세포를 분화시키는 경우에도 Wnt3a 및 Shh를 사용하여 분화시키는 경우와 동일한 양상으로 망막세포 마커들의 양성률이 나타남을 확인하였다.
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- Wnt3a, Wnt1, Wnt5a, Wnt11, 노린 (norrin), LiCl, BIO (6-bromoindirubin-3'-oxime) 및 SB415286으로 이루어진 군에서 선택된 Wnt 신호전달 작용제를 유효성분으로 포함하는, 망막기원세포 (retinal progenitor cell)로부터 망막세포로의 분화 유도용 조성물.
- 제15항에 있어서, 상기 망막세포가 광수용체세포인 것인, 망막기원세포로부터 망막세포로의 분화 유도용 조성물.
- 제15항에 있어서, 상기 망막세포로의 분화 과정이,
(a) 망막기원세포를 Wnt3a, Wnt1, Wnt5a, Wnt11, 노린 (norrin), LiCl, BIO (6-bromoindirubin-3'-oxime) 및 SB415286으로 이루어진 군에서 선택된 Wnt 신호전달 작용제를 유효성분으로 포함하는 배지에서 배양하여 신경 망막기원세포 (neural retinal progenitor cell)로 분화시키는 단계;
(b) 상기 (a) 단계의 신경 망막기원세포를 Wnt 신호전달 작용제를 유효성분으로 포함하는 배지에서 배양하여 광수용체세포 전구체 (photoreceptor cell precursor)로 분화시키는 단계; 및
(c) 상기 (b) 단계의 광수용체세포 전구체를 Wnt 신호전달 작용제를 유효성분으로 포함하는 배지에서 배양하여 광수용체세포 또는 광수용체세포를 포함하는 망막세포로 분화시키는 단계를 수행하여 이루어지는 것인, 망막기원세포로부터 망막세포로의 분화 유도용 조성물.
- 제15항에 있어서, 상기 조성물은 노긴 (noggin), IGF-1 (insulin-like growth factor-1), 및 FGF2 (fibroblast growth factor 2)를 추가로 포함하는 것인, 망막기원세포로부터 망막세포로의 분화 유도용 조성물.
- 제15항에 있어서, 상기 조성물은 IGF-1 (insulin-like growth factor-1), 및 Shh (sonic hedgehog)를 추가로 포함하는 것인, 망막기원세포로부터 망막세포로의 분화 유도용 조성물.
- 제15항에 있어서, 상기 조성물은 IGF-1 (insulin-like growth factor-1), Shh (sonic hedgehog), 및 RA (retinoic acid)를 추가로 포함하는 것인, 망막기원세포로부터 망막세포로의 분화 유도용 조성물.
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- 삭제
- 제15항에 있어서, 상기 Wnt 신호전달 작용제의 배지 내 농도는 0.01 내지 500 ng/ml인 것인, 망막기원세포로부터 망막세포로의 분화 유도용 조성물.
- 제23항에 있어서, 상기 Wnt 신호전달 작용제의 배지 내 농도는 1 내지 100 ng/ml인 것인, 망막기원세포로부터 망막세포로의 분화 유도용 조성물.
- 삭제
- 삭제
- 제15항에 있어서, 상기 LiCl의 배지 내 농도는 0.1 내지 50 mM이고, BIO의 배지 내 농도는 0.1 내지 50 μM이고, SB415286의 배지 내 농도는 0.1 내지 500 μM인 것인, 망막기원세포로부터 망막세포로의 분화 유도용 조성물.
- 제27항에 있어서, 상기 LiCl의 배지 내 농도는 1 내지 10 mM이고, BIO의 배지 내 농도는 0.5 내지 5 μM이고, SB415286의 배지 내 농도는 5 내지 50 μM인 것인, 망막기원세포로부터 망막세포로의 분화 유도용 조성물.
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