WO2004011663A9 - Mikrobiologische verfahren zur herstellung von 7alpha-substituierten 11alpha-hydroxysteroiden - Google Patents

Mikrobiologische verfahren zur herstellung von 7alpha-substituierten 11alpha-hydroxysteroiden

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WO2004011663A9
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Rolf Bohlmann
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Hermann Kuenzer
Hans-Peter Muhn
Reinhard Nubbemeyer
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Ludwig Zorn
Rolf Bohlmann
Norbert Gallus
Hermann Kuenzer
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    • C12P33/12—Acting on D ring
    • C12P33/16—Acting at 17 position

Definitions

  • the invention relates to microbiological processes for the preparation of 7 ⁇ -substituted 11 ⁇ -hydroxysteroids, 7 ⁇ , 17 ⁇ -substituted 11ß-halogen steroids which can be prepared therefrom, production processes for the latter compounds and their use and pharmaceutical preparations which contain these compounds.
  • the invention relates to further 7 ⁇ -substituted 11 ⁇ -halogen steroids, namely 7 ⁇ -substituted Estra-1, 3.5 (10) -trienes, which are obtainable from the 7 ⁇ -substituted 11 ⁇ -hydroxysteroids.
  • Androgens especially testosterone, are used for the therapy of the virile climacterium and for the development of the male sexual organs as well as for male fertility control.
  • these hormones also have partial anabolic active components that, among other things, promote muscle growth.
  • the climacteric virile is characterized by an age-related decrease in the body's androgen production, so that a hormone replacement is carried out for its treatment (HRT: hormone replacement therapy).
  • LH-RH administration for male fertility control also leads to the release of LH and lower testosterone levels and libido, which are balanced by administration of testosterone drugs (DECummings et al., "Prostate-Sparing Effects of the Potent Androgen 7 ⁇ -Methyl-19-Nortestosterone: A Potential Alternative to Testosterone for Androgene Replacement and Male Contraception ", Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, Vol. 83, No. 12, pages 4212-4219 (1998)).
  • a combination therapy with the administration of androgens and a gestagen-active component can be used to control male fertility (see, for example, WO 01/60376 A and the documents cited therein).
  • estradiol In testosterone metabolism, a small portion of this compound is also converted to estradiol by aromatizing ring A of the steroid system, particularly in the brain, liver and adipose tissue. With regard to the overall effect of testosterone and its metabolites, estradiol is decisive for gender-specific behavior and the gonadotropin Regulation responsible. Therefore, its effect, like that of testosterone, can be regarded as favorable for the adult male (Cummings et al., Ibid.).
  • testosterone has been found to be unsatisfactory.
  • testosterone is rapidly excreted when administered orally, so that the effectiveness and duration of action of medicaments produced with it are unsatisfactory. Therefore, other testosterone derivatives have also been synthesized. Such derivatives are described, inter alia, in US Pat. No.
  • the aforementioned 7 ⁇ , 11 ⁇ -dimethyl derivatives like MeNT, have the aforementioned advantages, including improved pharmacokinetics, i.e. their effectiveness and duration of action are improved compared to testosterone.
  • these derivatives can only be produced via a complex synthesis route.
  • estr-4-en-3,17-dione and canrenone transforms into the corresponding 11 ⁇ -hydroxy analog using a microorganism selected from the group comprising Aspergillus nig cans, Rhizopus arrhizus and strains of Pestelotia can be.
  • a microorganism selected from the group comprising Aspergillus nig cans, Rhizopus arrhizus and strains of Pestelotia can be.
  • Shibahara et al., Biochim. Biophys. Acta, 202 (1970), 172-179 who reported that the microbiological 11 ⁇ -hydroxylation reaction on steroids was unpredictable.
  • the present invention is therefore based on the problem of finding derivatives of testosterone which are not sensitive to a reduction by means of 5 ⁇ -reductase and which also have improved pharmacokinetics. sen and which are particularly easy to manufacture. Accordingly, a very essential aspect of the present invention is to find a method for better accessibility of the preliminary products with which the preliminary products can be easily manufactured.
  • alkyl, alkylene, alkenyl, alkenylene, alkynyl, alkynylene groups can be either straight-chain or branched.
  • d- to C 18 -alkyl include, for example, methyl, ethyl, n-propyl, -propyl, ⁇ -butyl, / -butyl, f-butyl, n-pentyl, -pentyl, f-pentyl, neo-pentyl, ⁇ -Hexyl, 1-methyl-n-pentyl, 2-methyl-n-pentyl, 3-methyl-n-pentyl, 4-methyl-n-pentyl, 1-ethyl-n-butyl, 2-ethyl-n-butyl etc.
  • Alicyclic alkyl is either a cycloalkyl or a cycloalkyl which is substituted by one or more alkyl groups and which is bonded directly via the cycloalkyl ring or via one of the alkyl groups.
  • an alicyclic alkenyl is either a cycloalkenyl or a cycloalkenyl or cycloalkyl substituted with one or more alkenyl groups or with one or more alkenyl and alkyl groups or with one or more alkyl groups, which is directly via the cycloalkenyl ring or via one of the alkenyl or optionally Alkyl groups is bonded, at least one double bond being contained in the alicyclic alkenyl.
  • Aryl can be phenyl but also 1-naphthyl, 2-naphthyl.
  • Aryl basically also includes heteroaryl, in particular 2-, 3- and 4-pyridinyl, 2- and 3-furyl-, 2- and 3-thienyl, 2- and 3-pyrrolyl, 2-, 4- and 5 imidazolyl, pyridazinyl, 2-, 4- and 5-pyrimidinyl and 3- and 4-pyridazinyl.
  • Halogen is fluorine, chlorine, bromine or iodine.
  • compositions are salts of the corresponding compounds with inorganic or organic acids, for example with hydrochloric acid, hydrobromic acid, hydroiodic acid, acetic acid, citric acid, oxalic acid, tartaric acid and methanesulfonic acid.
  • the esters can be formed in particular with succinic acid.
  • R is the grouping P-Q, where
  • P is a Cr to C 4 alkylene and Q is hydrogen, Cr to C alkyl or C to C 4 fluoroalkyl (alkyl partially or completely fluorinated) and the group PQ is bonded to the steroid backbone via P,
  • R 10 represents H, CH 3 or CF 3 .
  • R> 13 is methyl or ethyl.
  • a microorganism selected from the group comprising Aspergillus sp., Beauveria sp., Glomerella sp., Gnomonia sp., Haplosporella sp. and Rhizopus sp., hydroxylated and oxidized in one process step.
  • Aspergillus awamon, Aspergillus fischen, Aspergillus malignus, Aspergillus niger, Beauveria bassiana, Glomerella cingulata, Gnomonia cingulata, Haplosporella hesperedica and Rhizopus stolonifer are particularly preferred, in particular Aspergillus awamori (CBS), Aspergillus20, Aspergillus20, Aspergillus20 IMI 16061), Aspergillus niger (ATCC 9142), Beauveria bassiana (ATCC 7159), Glomerella cingulata (CBS 15226, CBS 23849, CBS 98069, ATCC 56596, ATCC 64682, IFO 6425), Gnomonia cingulata (CBS 15226), Hapicaporella CBS 20837) and Rhizopus stolonifer (ATCC 15441) can be used.
  • CBS Aspergillus awamor
  • this microbiological production process can also be carried out in two stages, the hydroxylation and oxidation reactions taking place in successive reaction steps.
  • the course of the reaction can be controlled via the reaction time: by interrupting the reaction after a certain reaction time, for example, the hydroxylated but not yet oxidized species can be isolated. Both process steps can therefore be carried out separately or in a mixed fermentation:
  • the compound having the general formula 3, A can be used in a first microbiological process step using a first microorganism selected from the group comprising Aspergillus sp., Beauveria sp., Gibberella sp., Glomerella sp., Gnomonia sp., Metarrhician sp ., Nigrospora sp., Rhizopus sp. and Verticillium sp., are hydroxylated in the 11 position, whereby a 7 ⁇ -substituted steroid with a hydroxy group in the 11 ⁇ position is formed.
  • This compound has the general formula C:
  • R 7 , R 10 and R 13 have the same meanings as previously given for the compounds with the general formula 4, B.
  • Aspergillus malignus Aspergillus melleus, Aspergillus niger, Aspergillus ochraceus, Beauveria bassiana, Gibberella fujikuroi, Gibberella zeae, Glomerella cingulata, Glomerella fusaroides, Gnomonia cingulata, Metarrhician anisopiausiausiaiausiaiausiausiaia, noprousia sp used.
  • Aspergillus malignus IM1 16061
  • Aspergillus melleus CBS
  • Aspergillus niger ATCC 11394
  • Aspergillus ochraceus NRRL 405, CBS 13252, ATCC 46504)
  • Beauveria bassiana ATCC 7159, IFO 5838, ATCC 13144, IFO 4848, CBS 11025, CBS 12736
  • Gibberella fujikuroi ATCC 14842
  • Gibberella zeae CBS 4474
  • Glomerella cingulata ATCC 10534, CBS 23849, CBS 23749, ATCC 16646, ATCC 16052, IFO 6459, IFO 6425, IFO 6470 , CBS 98069, IFO 7478, IFO 5257, ATCC 64682, ATCC 15470
  • Glomerella fusaroides ATCC 9552
  • Gnomonia cingulata CBS 15226
  • the intermediate product C is then in a second microbiological process step using a second microorganism selected from the group comprising Bacillus sp., Mycobacterium sp., Nocardia sp. and Pseudomonas sp., with the general formula 4, B, to form the 7 ⁇ -substituted 11 ⁇ -hydroxysteroids.
  • a second microorganism selected from the group comprising Bacillus sp., Mycobacterium sp., Nocardia sp. and Pseudomonas sp., with the general formula 4, B, to form the 7 ⁇ -substituted 11 ⁇ -hydroxysteroids.
  • Bacillus lactimorbus Bacillus sphaericus, Mycobacterium neoaurum, Mycobacterium smegmatis, Nocardia corallina, Nocardia globerula, Nocardia minima, Nocardia restrictus, Nocardia rubropertincta, Nocardia salmonicolor and Pseudomonas testosteroni (BacillusCCCC), (Bacillus 245cc), (70), in particular Bacillus lactobacterium (70), (70) ATCC 9626, NRRL B-3683, NRRL B-3805), Mycobacterium smegmatis (ATCC 14468), Nocardia corallina (ATCC 31338) Nocardia globerula (ATCC 9356), Nocardia minima (ATCC 19150), Nocardia restrictus (NCIB 10027), Noctaia rubia (ATCC 14352), Nocardia salmonicolor (ATCC 19149) and Pseudomonas testosteroni
  • R 7 , R 10 and R 13 have the same meanings as given for the compounds with the general formula 4, B, are prepared.
  • This reaction is carried out using a microorganism selected from the group comprising Aspergillus sp., Beauveria sp., Curvularia sp., Gibberella sp., Glomerella sp., Gnomonia sp., Haplosporella sp., Helicostylum sp., Nigrospora sp. , Rhizopus sp. and Syncephalastrum sp., wherein the steroid backbone is hydroxylated in the 11 ⁇ -position and thus the 7 ⁇ -substituted 11 ⁇ -hydroxysteroid with the general formula 4, B is formed.
  • Aspergillus alliaceus Aspergillus awamori, Aspergillus fischeri, Aspergillus malignus, Aspergillus melleus, Aspergillus nidualans, Aspergillus niger, Aspergillus ochraceus, Aspergillus variecolor, Beauveria bassiana, Curvularia lunata, Gib- berella zeae, Glomerella cingulata, Glomerella fusaroides, Gnomonia cingulata, Haplosporella hesperedica, Helicostylum piriformae, Nigrospora sphaerica, Rhizopus oryzae and Syncephalastrum racemosum, with Aspergillus alliausus, (AsCCillus20), Aspergillusus, Aspergillus 20, Aspergillus (ATCC 10020), Aspergillus (ATCC 10060) malignant (IMI 16061), Asper
  • Processes are particularly suitable in which 7 ⁇ -substituted 11 ⁇ -hydroxysteroids having the general formula 4, B are prepared, in which R 7 independently represents CH 3 and / or R 10 represents H and / or R 13 represents .
  • CH 3 stands.
  • the process is usually carried out.
  • a sterilized nutrient solution for the strain is first prepared and this nutrient solution is then inoculated with the culture solution of the strain in order to grow the strain.
  • the pre-culture produced in this way is then placed on a fermenter, which is also charged with a suitable nutrient solution.
  • the starting substance is then added to the fermenter, in the present case either a compound with the general formula 3, A or a compound with the general formula D, so that the reaction according to the invention can proceed.
  • the mixture of substances is conventionally purified to isolate the desired 7 ⁇ -substituted 11 ⁇ -hydroxysteroid.
  • R 3 represents H, C to C 4 alkyl, Cr to C 4 alkanoyl or a cyclic C 3 to C ether with the O atom of the OR 3 radical,
  • R 7 is the grouping PQ, where
  • P represents a Cr to C 4 alkylene and Q represents hydrogen, C to C 4 alkyl or Cr to C 4 fluoroalkyl (alkyl partially or completely fluorinated) and the group PQ is bonded to the steroid skeleton via P,
  • R 11 is a halogen
  • R 13 is methyl or ethyl
  • R 17 for H, d to C 18 alkyl, alicyclic C to C 8 alkyl, Cr to C 8 alkenyl, alicyclic Cr to Ci 8 alkenyl, Cr to C 8 alkynyl, C to C 18 - Alkylaryl, Cr to C 8 -alkylene nitrile or for the grouping PQ, where the grouping PQ has the aforementioned meaning,
  • R 17 ' for H, Cr to C 18 alkyl, alicyclic d to C 18 alkyl, d to C 8 alkenyl, alicyclic Cr to C 18 aikenyl, Cr to C 8 alkynyl or Cr to C -is-alkylaryl, where R 17 'can also be bonded to the 17 ⁇ -oxy group via a keto group, and where R 17' also additionally with one or more groups NR 8 R 19 or one or more groups
  • R 17 ' is additionally substituted by a group NR 18 R 19 , this can be a methylamino, dimethylamino, ethylamino, diethylamino, cyclohexylamino, dicyclohexylamino, phenylamino, diphenylamino, benzylamino or Act dibenzylamino group.
  • the compounds with the general formulas 10 and 12 are androgenic compounds.
  • estrogens estrogen receptor-affine compounds
  • radicals R 3 , R 7 , R 10 , R 11 , R 13 , R 17 and R 17 ' have the same meanings as the corresponding radicals in the general formula 8, 10, 12.
  • R 1 is H and / or R 7 is CH 3 and / or R 11 is fluorine and / or R 13 is CH 3 and / or R 17 is H, CH 3 , C to C 18 alkynyl, in particular Ethinyl, CH 2 CN or CF 3 and / or R 17 ' for H.
  • Particularly suitable 7 ⁇ , 17 ⁇ -substituted 11 ⁇ -halogen steroids according to the invention with the general formula 8,10,12 are:
  • the 7 ⁇ -substituted 11 ⁇ -hydroxysteroids thus obtained are converted into the corresponding 7 ⁇ -substituted 11 ⁇ -halogen steroids 5 by nucleophilic substitution with a halodehydroxylation reagent:
  • Suitable halodehydroxylation reagents are all the compounds customary for this purpose, for example fluorine, chlorine, hydrobromic or hydroiodic acid, thionyl chloride or thionyl bromide, phosphorus pentachloride, phosphorus oxychloride, N-chlorosuccinimide, triphenylphosphine / carbon tetrachloride, HF / pyridine or diethylaminosulphuryl / fluorotrifluoride-5 / fluorotrifluoride or non-fluoride, trifluoride or preferably Diazabicyclo [5.4.0] undecene.
  • Compound 10 is then prepared from 5 by selective alkylation at C 17 of the ring framework (see Scheme I).
  • Conventional alkylation reagents can be used for the selective alkylation, for example Grignard compounds and organometallic compounds, in particular alkyl lithium compounds.
  • ethynylmagnesium bromide can be used as the alkylating agent to prepare the corresponding 17 ⁇ -ethynyl-17 ⁇ -hydroxy-estr-4-en-3-one from the estr-4-en-3,17-dione.
  • the compounds with the general formula 10 are used and isomerized so that the ⁇ 4 double bond in a ⁇ 5 (10) double bond is isomerized.
  • a cyclic ether is first formed in the 3-position. The ⁇ 4 double bond is then isomerized into the ⁇ 5 (10) double bond, the 7 ⁇ , 17 ⁇ -substituted 11 ⁇ -halogen steroid having the general formula 12 being formed, and the protective group being split off again.
  • the corresponding 11 ⁇ -halogen steroid with the general formula 5 is formed from the 7 ⁇ -substituted 11 ⁇ -hydroxysteroid with the general formula 4, B obtained by microbiological hydroxylation and oxidation by halodehydroxylation in a nucleophilic substitution reaction.
  • R 3 , R 7 , R 11 and R 13 have the same meanings as described above. If R 3 is H, these compounds can be synthesized directly. If a radical other than H is R 3 , the corresponding ethers or esters must be formed in a known manner after the 1,3,5 (10) triene ring has been formed by oxidation.
  • a particularly preferred 7 ⁇ -substituted 11ß-haloestra-1, 3.5 (10) -triene with the general formula 6 is 11ß-fluoro-3-hydroxy-7 ⁇ -methylestra-1, 3.5 (10) - triene-17 -one.
  • the 7 ⁇ -substituted 11 ⁇ -halogen steroids with the general formula 9 can also be prepared from the substances with the general formula 4, B obtained by microbiological hydroxylation and oxidation from the 7 ⁇ -substituted steroids having the general formula 3, A or D that also have androgenic effects:
  • R 7 , R 1i and R 13 have the same meanings as previously indicated.
  • a particularly preferred compound is 11 ⁇ -fluoro-17ß-hydroxy-7 ⁇ -methyltr-4-en-3-one.
  • the compounds with the general formula 9 and their pharmaceutically acceptable addition salts, esters and amides also have androgenic activity.
  • estr-4-en-3,17-dione 5 is reduced to the 17 ⁇ -hydroxy-estr-4-en-3-one 9, for example with a borohydride.
  • the compounds with the general formula 9 can furthermore be converted into the corresponding 7 ⁇ -substituted 11 ⁇ -haloestra-5 (10) -enes:
  • R 7 , R 10 , R 1i and R 13 have the meanings as in the general formula 8, 10 , 12, being transformed.
  • the compounds with the general formula 9 are isomerized by shifting the ⁇ double bond into a ⁇ 5 (1 ⁇ double bond.
  • a cyclic ether in the 3-position is first formed for this purpose.
  • the ⁇ 4 double bond isomerized into the ⁇ 5 (10) double bond, the 7 ⁇ -substituted 11 ⁇ -halogen steroid mentioned above forming, and the protective group then split off again.
  • R 7 , R 10 , R i1 and R 13 have the meanings as in the general formula 8, 10 , 12,
  • the compounds with the general formula 5 are isomerized by shifting the ⁇ 4 double bond into a ⁇ 5 (1 ⁇ double bond.
  • a cyclic ether in the 3-position is first formed for this purpose the ⁇ 4 double bond isomerized into the ⁇ 5 (10) double bond, the 7 ⁇ -substituted 11 ⁇ -halogen steroid mentioned above being formed, and the protective group finally being split off again.
  • All of the compounds mentioned can also be further esterified or etherified, provided that corresponding hydroxyl groups are in the 3- or 17-position.
  • compound 9 can be converted into a corresponding 17 ⁇ ether or 17 ⁇ -esters can be converted.
  • a preferred compound is 11 ⁇ -fluoro-17ß- (4-sulfamoylbenzoxy) -7 ⁇ -methyltr-4-en-3-one.
  • the substituents on the oxy-oxygen atom at C 17 are in principle the same radicals which are also given for R 17 ' .
  • the 7 ⁇ , 17 ⁇ -substituted 11 ⁇ -halogen steroids with the general formula 8, 10, 12 are suitable for the production of medicaments.
  • the present invention therefore also relates to the use of the compounds mentioned with the general formula 8, 10, 12 for the production of medicaments and to pharmaceutical preparations which contain at least one of the compounds mentioned with the general formula 8, 10, 12 and at least contain a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the 7 ⁇ , 17 ⁇ -substituted 11 ⁇ -halogen steroids according to the invention with the general formula 10, 12 are compounds with a strong androgenic effect without the side effects mentioned, for example stimulation of the prostate (in particular no benign prostatic hyperplasia).
  • the compounds are easily synthesized. It has been shown that the compounds according to the invention having the general formula 10 or 12 can not only be used for male HRT, but that these compounds are also suitable as effective male contraceptives without the additional administration of further active ingredients if a sufficient dosage is used to to lower the blood levels of LH, testosterone produced in the body and FSH (follicle stimulating hormone) sufficiently. This is because the 11 ⁇ -halogen steroids according to the invention inhibit the release of LH and FSH.
  • LH stimulates the Leydig cells so that testosterone is secreted. If the blood level of LH is kept low, the body's own testosterone release also drops. Testosterone is needed for spermatogenesis, while FSH stimulates the germ cells. Sufficiently high FSH and LH blood levels are therefore required for effective spermatogenesis, with a sufficiently high LH blood level leading to the testosterone release required for spermatogenesis. Since treatment exclusively with the 7 ⁇ , 17 ⁇ -substituted 11ß-halogen steroids without additional active ingredients for sterilization can already lead to effective male contraception, the administration of a suitable drug can be considerably simplified and the cost of use can be significantly reduced.
  • the 7 ⁇ , 17 ⁇ -substituted 11 ⁇ -halogen steroids according to the invention can also be used in combination with a gestagen in order to control male fertility.
  • the 7 ⁇ , 17 ⁇ -substituted 11 ⁇ -halogen steroids according to the invention effectively inhibit 5 ⁇ -reductase and the steroid-11-hydroxylase [CYP11B (P450c11), G.Zhang, WLMiller, Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, Vol. 81 , Pages 3254-3256 (1996)], so that, for example, stimulation of the prostate is selectively avoided and these compounds have improved pharmacokinetics.
  • the inhibition of 11-hydroxylase leads to a reduced deactivation of the androgenic compounds and to their reduced excretion from the human body. This improves the effectiveness and duration of action of these compounds compared to known compounds, especially after oral administration.
  • these compounds are particularly suitable for use in male fertility control and for androgen replacement therapy with a reduced tendency to 5 ⁇ -reduction while at the same time maintaining the ability to aromatize to estrogenic steroids and having a favorable influence on serum lipids and the central nervous system.
  • the original state is reached again, so that the male person is no longer sterile and the spermatogenesis takes place again in the original scope.
  • the active ingredient or the preparation In order to constantly achieve the state of temporary sterility over a desired period of time, the active ingredient or the preparation must be administered continuously, the administration being repeated periodically, depending on the form of use, daily, at a shorter or a greater time interval.
  • the non-sterile state of the male person may not be restored immediately but only slowly, the time period required for this being dependent on various factors, for example on the dosage, the body constitution of the person and the parallel administration of other medicines.
  • the dosage of the 7 ⁇ , 17 ⁇ -substituted 11 ⁇ -halogen steroids must be set so high that the blood levels of LH and FSH each do not exceed 2.5 IU / ml (IU: International Units ), in particular at most 1.0 IUJml, and of testosterone at most 10 nmol / l, in particular at most 3 nmol / l.
  • the dosage is set lower. In this case, effective levels are sought which enable blood levels for LH and FSH of more than 2.5 IUJml each and for testosterone of more than 10 nmol / l.
  • the dosages of the 7 ⁇ , 17 ⁇ -substituted 11 ⁇ -halogen steroids according to the invention with the general formula 10 or 12 required for adjusting the blood level of LH, FSH and testosterone depend on a large number of factors and therefore have to be determined in an application-specific manner. First of all, the dosage of course depends on the type of therapy.
  • the dosage also depends on the type of 7 ⁇ , 17 ⁇ -substituted 11 ⁇ -halogen steroid and its bioavailability. Furthermore, the type of application 10 is essential for the amount to be applied. Finally, the dosage also depends on the physical constitution of the person using it and on other factors, for example the fact whether other medicines are being given in parallel.
  • the compounds can be administered orally and parenterally, for example i.p. (intraperitoneal), i.v. (intravenous), i.m. (intramuscularly) or percutaneously.
  • the connections can also be implanted into the tissue.
  • the amount of the compounds to be administered can vary within a wide range insofar as an effective amount is applied. In dependence of
  • the amount of the compound administered can vary within a wide range.
  • the daily dose is in the range of 0.1 to 100 mg.
  • the preferred daily dosage in humans is 0.1 to 10 mg.
  • the duration of use depends on the purpose to be achieved.
  • capsules, pills, tablets, coated tablets and liquids or other known oral dosage forms are used as pharmaceutical table preparations used.
  • the medicaments can be formulated in such a way that they either release the active substances in a short time and release them to the body or have a depot effect, so that a longer-lasting, slow supply of active substance to the body is achieved.
  • the metering units can contain one or more pharmaceutically acceptable carriers, for example substances for adjusting the rheology of the medicament, surface-active substances, solubilizers, microcapsules, microparticles, granules, thinners, binders, such as starch , Sugar, sorbitol and gelatin, also fillers such as silica and talc, lubricants, dyes, fragrances and other substances.
  • pharmaceutically acceptable carriers for example substances for adjusting the rheology of the medicament, surface-active substances, solubilizers, microcapsules, microparticles, granules, thinners, binders, such as starch , Sugar, sorbitol and gelatin, also fillers such as silica and talc, lubricants, dyes, fragrances and other substances.
  • the 7 ⁇ , 17 ⁇ -substituted 11 ⁇ -halogen steroids according to the invention can in particular also be formulated in the form of a solution which is intended for oral administration and which in addition to the active 11 ⁇ -halogen steroid as the following constituents is a pharmaceutically acceptable oil and / or a pharmaceutically acceptable one contains lipophilic, surface-active substance and / or a pharmaceutically acceptable hydrophilic, surface-active substance and / or a pharmaceutically acceptable water-miscible solvent.
  • WO-A-97/21440 for this purpose, reference is also made to WO-A-97/21440.
  • the compounds can also be formulated as cyclodextrin chlate.
  • the compounds are reacted with ⁇ -, ⁇ - or ⁇ -cyclodextrin or their derivatives.
  • these dosage forms contain adjuvants, for example substances for adjusting the rheology of the pharmaceuticals, surface-active agents, preservatives, solubilizers, thinners, substances for increasing the permeability for the steroids according to the invention through the skin, dyes, fragrances and skin protection agents, such as conditioners and moisture regulators - Ren.
  • adjuvants for example substances for adjusting the rheology of the pharmaceuticals, surface-active agents, preservatives, solubilizers, thinners, substances for increasing the permeability for the steroids according to the invention through the skin, dyes, fragrances and skin protection agents, such as conditioners and moisture regulators - Ren.
  • other active substances can also be contained in the medicament.
  • the active ingredients can be dissolved or suspended in a physiologically acceptable diluent.
  • Oils with or without the addition of a solubilizer, a surface-active agent, a suspending or emulsifying agent are very often used as diluents. Examples of oils used are olive oil, peanut oil, cottonseed oil, soybean oil, castor oil and sesame oil.
  • Any liquid carrier in which the compounds according to the invention are dissolved or emulsified can be used to formulate an injectable preparation. These liquids often also contain substances for regulating the viscosity, surface-active substances, preservatives, solubilizers, thinners and other additives with which the solution is adjusted isotonic.
  • Other active substances can also be administered together with the 7 ⁇ , 17 ⁇ -substituted 11ß-halogen steroids.
  • the 11 ⁇ -halogen steroids according to the invention can thus be used in the form of a depot injection or an implant preparation, for example subcutaneously, which can be formulated in such a way that a delayed release of the active substance is made possible.
  • Known techniques can be used for this purpose, for example depots that dissolve or work with a membrane.
  • implants can contain, for example, biodegradable polymers or synthetic silicones, for example silicone rubber.
  • the 11 ⁇ -halogen steroids according to the invention can also be incorporated into a plaster for percutaneous administration, for example.
  • % KH 2 P0 4 , 0.2% by weight K 2 HP0 4 , 0.05% by weight KCI, 0.05% by weight MgS0 4 7H 2 0 and 0.002% by weight FeS0 4 7H 2 0 (pH 6.0) was inoculated with a slant tube culture of the strain Gnomonia cingulata (CBS 15226) and shaken for 72 hours at 28 ° C.
  • the culture broth was harvested and extracted for 12 hours with 10 liters of methyl isobutyl ketone and for 5 hours with 5 liters of methyl isobutyl ketone.
  • the combined organic phases were evaporated to dryness.
  • the silicone oil was washed out with hexane. After chromatography on silica gel with a gradient of hexane and ethyl acetate, 1.64 g (39%) of 11 ⁇ -hydroxy-7 ⁇ -methyltr-4-en-3,17-dione were isolated.
  • IFO 6425 strain Glomerella cingulata
  • a 20 l fermenter was inoculated with this preliminary cultivation, which was charged with 19 l sterile medium of the same final composition as described for the preculture.
  • 1.0 ml of silicone oil and 1.0 ml of Synperonic were added before the sterilization to combat foam.
  • a growth phase of 12 h at 0.7 bar overpressure a temperature of 28 ° C, aeration of 10 1 / min and a stirring speed of 350 rpm
  • a solution of 2.0 g of 17 ⁇ -hydroxy-7 ⁇ -methyltr-4 -en-3-one added in 30 ml DMF. It was stirred and aerated.
  • a 2 1 Erlenmeyer flask containing 500 ml of a nutrient solution sterilized for 30 min at 121 ° C in an autoclave from 0.5% by weight glucose, 0.5% by weight bacto yeast extract, 0.1% by weight. % Peptone and 0.2% by weight corn steep liquor (pH 7.5) was inoculated with four cryoballs of a culture of the strain Bacillus sphaericus (ATCC 7055) and for 24 hours at 28 ° C. on a rotary shaker at 165 rpm shaken.
  • ATCC 7055 Bacillus sphaericus
  • CBS 13252 strain Aspergillus ochraceus
  • This pre-cultivation was inoculated with a 10 1 fermenter which was charged with 9.5 1 sterile medium of the same final composition as described for the preculture.
  • 0.5 ml of silicone oil and 0.5 ml of Synperonic were added to combat foam before sterilization. After a growth phase of 6 h at 0.7 bar overpressure, a temperature of 28 ° C, aeration of 5 1 / min and a stirring speed of 350 rpm, a solution of 1.0 g of 7 ⁇ -methyltr-4-en-3 , 17-dione in 15 ml DMF added. It was stirred and aerated. After 22 hours, the culture broth was harvested and extracted twice with 71 methyl isobutyl ketone for 4 hours.

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Abstract

Es wird ein neuartiger Syntheseweg für die Herstellung von Vorprodukten für die Herstellung von Verbindungen mit der allgemeinen Formel (8,10,12) be-schrieben. Bei dieser Synthese entstehen in einer mikrobiologischen Umset-zung Verbindungen mit der allgemeinen Formel (4,B). Die Bedeutungen der Reste R7, R10, R11, R13, R17 und R17' sowie der Gruppierung U-V-W-X-Y-Z sind in den Patentansprüchen angegeben.

Description

Mikrobiologische Verfahren zur Herstellung von 7α-substituierten 11α- Hydroxysteroiden
Beschreibung:
Die Erfindung betrifft mikrobiologische Verfahren zur Herstellung von 7α-sub- stituierten 11α-Hydroxysteroiden, daraus herstellbare 7α,17α-substituierte 11ß- Halogensteroide, Herstellungsverfahren für letztere Verbindungen sowie deren Verwendung und pharmazeutische Präparate, die diese Verbindungen enthalten. Außerdem betrifft die Erfindung weitere 7α-substituierte 11 ß-Halogenste- roide, nämlich 7α-substituierte Estra-1 , 3,5(10)-triene, die aus den 7α-substitu- ierten 11α-Hydroxysteroiden erhältlich sind.
Zur Therapie des Klimakterium virile und zur Entwicklung der männlichen Sexualorgane sowie zur männlichen Fertilitätskontrolle werden Androgene, insbesondere Testosteron, eingesetzt. Außerdem besitzen diese Hormone auch partielle anabole Wirkkomponenten, die unter anderem das Muskelwachstum fördern.
Das Klimakterium virile ist durch einen altersbedingten Rückgang der körpereigenen Androgenproduktion gekennzeichnet, so daß zu deren Behandlung ein Hormonersatz durchgeführt wird (HRT: hormone replacement therapy).
Die LH-RH-Gabe zur männlichen Fertilitätskontrolle führt neben einer Verminderung der Spermatogenese auch zur Ausschüttung von LH und zur Absenkung von Testosteronspiegeln und Libido, die durch Verabreichung von Testosteron-Arzneimitteln ausgeglichen werden (D.E.Cummings et al., "Prostate- Sparing Effects of the Potent Androgen 7α-Methyl-19-Nortestosterone: A Potential Alternative to Testosterone for Androgene Replacement and Male Contraception", Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, Vol. 83, Nr. 12, Seiten 4212-4219 (1998)). Eine Kombinationstherapie unter Gabe von Androgenen und einer gestagen wirksamen Komponente kann zur Kontrolle der männlichen Fertilität angewendet werden (siehe beispielsweise WO 01/60376 A sowie die darin zitierten Do- kumente).
Bei einer Behandlung mit Testosteron hat sich gezeigt, daß sich Nebenwirkungen einstellen, insbesondere eine Vergrößerung der Prostata durch numerische Zunahme der Zellen und Drüsen des Stromas (BPH: benigne Prostatahyperpla- sie). Bei dem durch 5α-Reduktase vermittelten Metabolismus von Testosteron entsteht Dihydrotestosteron (DHT), das unter anderem zum Auftreten der BPH führen kann (Cummings et al., ibid.; WO 99/13883 A1). Die Inhibition der 5α- Reduktase wird daher zur Behandlung der BPH in der Klinik eingesetzt (Fi- nasteride).
Der schnelle Metabolismus des androgenen Steroids Testosteron im Körper des Menschen führt ferner nicht nur zur Bildung des unerwünschten DHT, sondern auch dazu, daß eine orale Gabe hoher Dosen erforderlich ist, um den gewünschten Wirkspiegel von Testosteron zu erreichen. Daher sind alternative Darreichungsformen, wie .m.-lnjektionen oder große Pflaster, nötig.
Zum Ersatz des Testosterons in den erwähnten Indikationsbereichen wurde 7α- Methyl-19-nortestosteron (MeNT) vorgeschlagen, das zum einen eine höhere biologische Wirksamkeit als Testosteron aufweist, da es eine höhere Bindungs- affinität zu den Androgenrezeptoren hat. Zum anderen widersteht es wegen einer sterischen Hinderung durch die 7α-Methylgruppe vermutlich der Metaboli- sierung durch 5α-Reduktase (Cummings et al., ibid., WO 99/13883 A1, WO 99/13812 A1, US-A-5,342,834).
Beim Metabolismus von Testosteron wird ferner ein geringer Teil dieser Verbindung durch Aromatisierung des Ringes A des Steroidsystems zu Estradiol umgesetzt, insbesondere im Gehirn, in der Leber und im Fettgewebe. Estradiol ist hinsichtlich der Gesamtwirkung des Testosterons und dessen Metaboliten maßgeblich für das geschlechtsspezifische Verhalten und die Gonadotropin- Regulation verantwortlich. Daher ist dessen Wirkung ebenso wie die des Testosterons für den erwachsenen Mann als günstig anzusehen (Cummings et al., ibid.).
Allerdings hat sich herausgestellt, daß die Pharmakokinetik von Testosteron nicht befriedigend ist. Insbesondere wird Testosteron bei oraler Darreichung schnell wieder ausgeschieden, so daß die Wirksamkeit und Wirkdauer von damit hergestellten Arzneimitteln unbefriedigend ist. Daher wurden auch andere Testosteron-Derivate synthetisiert. Derartige Derivate sind unter anderem in US-A-5,952,319 beschrieben, insbesondere 7α-,11ß-Dimethylderivate von 19- Nortestosteron, nämlich 7α,11ß-Dimethyl-17ß-hydroxyestr-4-en-3-on, 7α,11ß- Dimethyl-17ß-heptanoyloxyestr-4-en-3-on, 7α,11 ß-Dimethyl-17ß-[[(2-cyclopen- tylethyl)-carbonyl]-oxy]-estr-4-en-3-on, 7α,11 ß-Dimethyl-17ß-(phenylacetyloxy]- estr-4-en-3-on und 7α,11ß-Dimethyl-17ß-[[(trans-4-[π-butyl]cyclohexyl)-carbo- nyl]-oxy]-estr-4-en-3-on.
Die genannten 7α,11 ß-Dimethylderivate weisen wie MeNT die vorgenannten Vorteile auf, einschließlich einer verbesserten Pharmakokinetik, d.h. deren Wirksamkeit und Wirkdauer sind gegenüber Testosteron verbessert. Diese De- rivate sind allerdings nur über einen aufwendigen Syntheseweg herstellbar.
Eine Synthese von Steroiden auf mikrobiologischem Wege ist in EP 0 900 283 B1 beschrieben. Dort wird angegeben, daß Estr-4-en-3,17-dion und Canrenon unter Verwendung eines Mikroorganismus, ausgewählt aus der Gruppe, umfas- send Aspergillus nig cans, Rhizopus arrhizus und Stämmen des Pestelotia, in das korrespondierende 11 α-Hydroxyanalogon transformiert werden können. Allerdings wird in der Beschreibungseinleitung auch auf Shibahara et al., Bio- chim. Biophys. Acta, 202 (1970), 172-179 hingewiesen, die berichtet haben, dass die mikrobiologische 11 α-Hydroxylierungsreaktion an Steroiden unvorher- sagbar sei.
Von daher liegt der vorliegenden Erfindung das Problem zugrunde, Derivate des Testosterons zu finden, die gegenüber einer Reduktion mittels 5α-Reduk- tase nicht empfindlich sind, die auch eine verbesserte Pharmakokinetik aufwei- sen und die insbesondere leicht herstellbar sind. Ein sehr wesentlicher Aspekt der vorliegenden Erfindung besteht demgemäß darin, zur besseren Zugänglichkeit der Vorprodukte ein Verfahren zu finden, mit dem die Vorprodukte leicht herstellbar sind.
Das der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende Problem wird gelöst durch mikrobiologische Verfahren zur Herstellung von 7α-substituierten Steroiden nach den Ansprüchen 1, 3 und 6, 7α,17α-substituierte 11 ß-Halogensteroide nach Anspruch 11 , Verfahren zur Herstellung 7α,17α-substituierter 11ß-Halo- gensteroide nach den Ansprüchen 23, 24 und 25, die Verwendung dieser 7α,17α-substituierten 11 ß-Halogensteroide nach Anspruch 26, pharmazeutische Präparate, die diese 7α,17α-substituierten 11 ß-Halogensteroide enthalten, nach Anspruch 27 sowie 7α-substituierte 11ß-Halogenestra-1 ,3,5(10)-triene nach Anspruch 21. Bevorzugte Ausführungsformen der beanspruchten Gegens- tände sind in den Unteransprüchen angegeben.
Definitionen:
Die nachfolgenden Definitionen beziehen sich auf alle Teile der Beschreibung und der Ansprüche sowie auf das anliegende Schema I:
Alle Gruppierungen, Reste oder sonstigen strukturellen Einheiten können jeweils unabhängig voneinander innerhalb der angegebenen Bedeutungsberei- ehe variiert werden.
Alle Alkyl-, Alkylen-, Alkenyl-, Alkenylen-, Alkinyl-, Alkinylen-Gruppen können entweder geradkettig oder verzweigt sein. Beispielsweise kann eine Propenyl- gruppe durch eine der nachfolgenden chemischen Strukturen: -CH=C-CH3, -CH2-C=CH2, -C(CH3)=CH2 beschrieben werden. Somit fallen unter d- bis C18- Alkyl beispielsweise Methyl, Ethyl, n-Propyl, -Propyl, π-Butyl, /-Butyl, f-Butyl, n- Pentyl, -Pentyl, f-Pentyl, neo-Pentyl, π-Hexyl, 1-Methyl-n-pentyl, 2-Methyl-n- pentyl, 3-Methyl-n-pentyl, 4-Methyl-n-pentyl, 1-Ethyl-n-butyl, 2-Ethyl-n-butyl usw. Alicyclisches Alkyl ist entweder ein Cycloalkyl oder ein mit einer Alkylgruppe oder mehreren Alkylgruppen substituiertes Cycloalkyl, das direkt über den Cycloalkylring oder über eine der Alkylgruppen gebunden ist.
In gleicher Weise ist ein alicyclisches Alkenyl entweder ein Cycloalkenyl oder ein mit einer oder mehreren Alkenylgruppen oder mit einer oder mehreren Alkenyl- und Alkylgruppen oder mit einer oder mehreren Alkylgruppen substituiertes Cycloalkenyl oder Cycloalkyl, das direkt über den Cycloalkenylring oder über eine der Alkenyl- oder gegebenenfalls Alkylgruppen gebunden ist, wobei mindestens eine Doppelbindung in dem alicyclischen Alkenyl enthalten ist.
Aryl kann zum einen Phenyl aber auch 1-Naphthyl, 2-Naphthyl sein. Aryl schließt grundsätzlich auch Heteroaryl mit ein, insbesondere 2-, 3- und 4-Pyri- dinyl, 2- und 3- Furyl-, 2- und 3-Thienyl, 2- und 3-Pyrrolyl, 2-, 4- und 5-lmidazo- lyl, Pyridazinyl, 2-, 4- und 5-Pyrimidinyl sowie 3- und 4-Pyridazinyl.
Halogen ist Fluor, Chlor, Brom oder lod.
Pharmazeutisch verträgliche Additionssalze sind Salze der entsprechenden Verbindungen mit anorganischen oder organischen Säuren, beispielsweise mit Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, lodwasserstoffsäure, Essigsäure, Citronensäure, Oxalsäure, Weinsäure und Methansulfonsäure. Die Ester können insbesondere mit Bernsteinsäure gebildet werden.
Hochgestellte Ziffern an den Symbolen R, beispielsweise R13, bezeichnen deren Stellung am Steroidringgerüst, wobei die C-Atome im Steroidringgerüst nach lUPAC-Nomenkiatur numeriert sind. Hochgestellte Ziffern an den Symbolen C, beispielsweise C10, bezeichnen die Stellung des jeweiligen Kohlenstoff- atoms im Steroidringgerüst. Erfindunqsbeschreibunq:
Die neuartigen mikrobiologischen Verfahren dienen zur Herstellung der 7α-sub- stituierten 11α-Hydroxysteroide mit der allgemeinen Formel 4,B:
Figure imgf000008_0001
4,B worin
R die Gruppierung P-Q ist, wobei
P ein Cr bis C4-Alkylen und Q einen Wasserstoff, C-r bis C -Alkyl- oder C bis C4-Fluoralkyl (Alkyl teilweise oder vollständig fluoriert) darstellen und die Gruppierung P-Q über P an das Steroidgrund- gerüst gebunden ist,
R10 für H, CH3 oder CF3 steht, und
R >13 Methyl oder Ethyl ist.
In einer ersten Verfahrensvariante zur Herstellung dieser Substanzen wird ein geeignetes 7α-substituiertes Steroid mit der allgemeinen Formel 3,A:
Figure imgf000008_0002
3,A worin R7, R10 und R13 dieselben Bedeutungen haben wie für die Verbindungen mit der allgemeinen Formel 4,B angegeben,
unter Verwendung eines Mikroorganismus, ausgewählt aus der Gruppe, umfas- send Aspergillus sp., Beauveria sp., Glomerella sp., Gnomonia sp., Haplospo- rella sp. und Rhizopus sp., in einem Verfahrensschritt hydroxyliert und oxidiert. Besonders bevorzugt sind Aspergillus awamon, Aspergillus fischen, Aspergillus malignus, Aspergillus niger, Beauveria bassiana, Glomerella cingulata, Gnomonia cingulata, Haplosporella hesperedica und Rhizopus stolonifer, wobei insbe- sondere Aspergillus awamori (CBS), Aspergillus fischen (ATCC 1020), Aspergillus malignus (IMI 16061), Aspergillus niger (ATCC 9142), Beauveria bassiana (ATCC 7159), Glomerella cingulata (CBS 15226, CBS 23849, CBS 98069, ATCC 56596, ATCC 64682, IFO 6425), Gnomonia cingulata (CBS 15226), Haplosporella hesperedica (CBS 20837) und Rhizopus stolonifer (ATCC 15441) eingesetzt werden.
Alternativ kann dieses mikrobiologische Herstellverfahren auch in zwei Stufen durchgeführt werden, wobei die Hydroxylierungs- und die Oxidationsreaktion in aufeinander folgenden Reaktionsschritten ablaufen. Der Reaktionsablauf kann über die Reaktionsdauer gesteuert werden: Indem die Reaktion beispielsweise nach einer bestimmten Reaktionszeit unterbrochen wird, kann die hydroxylierte, aber noch nicht oxidierte Spezies isoliert werden. Beide Verfahrensschritte können daher separat oder in einer Mischfermentation durchgeführt werden:
Hierzu kann die Verbindung mit der allgemeinen Formel 3,A in einem ersten mikrobiologischen Verfahrensschritt unter Verwendung eines ersten Mikroorganismus, ausgewählt aus der Gruppe, umfassend Aspergillus sp., Beauveria sp., Gibberella sp., Glomerella sp., Gnomonia sp., Metarrhizium sp., Nigrospora sp., Rhizopus sp. und Verticillium sp., in 11 -Stellung hydroxyliert werden, wobei sich ein 7α-substituiertes Steroid mit einer Hydroxygruppe in 11α-Stellung bildet. Diese Verbindung hat die allgemeine Formel C:
Figure imgf000010_0001
worin R7, R10 und R13 dieselben Bedeutungen haben wie zuvor für die Verbindungen mit der allgemeinen Formel 4,B angegeben. Besonders werden Asper- gillus malignus, Aspergillus melleus, Aspergillus niger, Aspergillus ochraceus, Beauveria bassiana, Gibberella fujikuroi, Gibberella zeae, Glomerella cingulata, Glomerella fusaroides, Gnomonia cingulata, Metarrhizium anisopliae, Nigrospo- ra sphaerica, Rhizopus oryzae, Rhizopus stolonifer und Verticillium dahliae eingesetzt. Hierbei werden insbesondere Aspergillus malignus (IM1 16061), Asper- gillus melleus (CBS), Aspergillus niger (ATCC 11394), Aspergillus ochraceus (NRRL 405, CBS 13252, ATCC 46504), Beauveria bassiana (ATCC 7159, IFO 5838, ATCC 13144, IFO 4848, CBS 11025, CBS 12736), Gibberella fujikuroi (ATCC 14842), Gibberella zeae (CBS 4474), Glomerella cingulata (ATCC 10534, CBS 23849, CBS 23749, ATCC 16646, ATCC 16052, IFO 6459, IFO 6425, IFO 6470, CBS 98069, IFO 7478, IFO 5257, ATCC 64682, ATCC 15470), Glomerella fusaroides (ATCC 9552), Gnomonia cingulata (CBS 15226), Metarrhizium anisopliae (IFO 5940), Nigrospora sphaerica (ATCC 12772), Rhizopus oryzae (ATCC 4858, ATCC 34102, ATCC 34102), Rhizopus stolonifer (ATCC 6227b, ATCC 15441) und Verticillium dahliae (ATCC 11405) für die Hydroxylierung eingesetzt.
Das Zwischenprodukt C wird danach in einem zweiten mikrobiologischen Verfahrensschritt unter Verwendung eines zweiten Mikroorganismus, ausgewählt aus der Gruppe, umfassend Bacillus sp., Mycobacterium sp., Nocardia sp. und Pseudomonas sp., unter Bildung der 7α-substituierten 11α-Hydroxysteroide mit der allgemeinen Formel 4,B oxidiert. Besonders werden Bacillus lactimorbus, Bacillus sphaericus, Mycobacterium neoaurum, Mycobacterium smegmatis, Nocardia corallina, Nocardia globerula, Nocardia minima, Nocardia restrictus, Nocardia rubropertincta, Nocardia salmonicolor und Pseudomonas testosteroni verwendet, wobei insbesondere Bacillus lactimorbus (ATCC 245), Bacillus sphaericus (ATCC 7055), Mycobacterium neoaurum (ATCC 9626, NRRL B- 3683, NRRL B-3805), Mycobacterium smegmatis (ATCC 14468), Nocardia corallina (ATCC 31338) Nocardia globerula (ATCC 9356), Nocardia minima (ATCC 19150), Nocardia restrictus (NCIB 10027), Nocardia rubropertincta (ATCC 14352), Nocardia salmonicolor (ATCC 19149) und Pseudomonas testosteroni (ATCC 11996) eingesetzt werden.
In einer weiteren Verfahrensvariante können die Verbindungen mit der allgemeinen Formel 4,B in einer mikrobiologischen Reaktion aus 7α-substituierten Steroiden mit der allgemeinen Formel D:
Figure imgf000011_0001
worin R7, R10 und R13 dieselben Bedeutungen haben wie zu den Verbindungen mit der allgemeinen Formel 4,B angegeben, hergestellt werden. Diese Reaktion wird unter Verwendung eines Mikroorganismus, ausgewählt aus der Gruppe, umfassend, Aspergillus sp., Beauveria sp., Curvularia sp., Gibberella sp., Glomerella sp., Gnomonia sp., Haplosporella sp., Helicostylum sp., Nigrospora sp., Rhizopus sp. und Syncephalastrum sp., durchgeführt, wobei das Steroid- grundgerüst in 11α-Stellung hydroxyliert wird und somit das 7α-substituierte 11α-Hydroxysteroid mit der allgemeinen Formel 4,B entsteht. Bevorzugt werden Aspergillus alliaceus, Aspergillus awamori, Aspergillus fischeri, Aspergillus malignus, Aspergillus melleus, Aspergillus nidualans, Aspergillus niger, Aspergillus ochraceus, Aspergillus variecolor, Beauveria bassiana, Curvularia lunata, Gib- berella zeae, Glomerella cingulata, Glomerella fusaroides, Gnomonia cingulata, Haplosporella hesperedica, Helicostylum piriformae, Nigrospora sphaerica, Rhizopus oryzae und Syncephalastrum racemosum, wobei insbesondere Aspergillus alliaceus (ATCC 10060), Aspergillus awamori (CBS), Aspergillus fischeri (ATCC 1020), Aspergillus malignus (IMI 16061 ), Aspergillus melleus (CBS), Aspergillus nidualans (ATCC 11267), Aspergillus niger (ATCC 9142, ATCC 11394), Aspergillus ochraceus (NRRL 405, ATCC 13252, ATCC 46504), Aspergillus variecolor (ATCC 10067), Beauveria bassiana (IFO 5838, ATCC 13144, IFO 4848, CBS 11025, CBS 12736, ATCC 7159), Curvularia lunata (IX3), Gibberella zeae (CBS 4474), Glomerella cingulata (ATCC 10534, CBS 23849, CBS 23749, ATCC 16646, IFO 6459, IFO 6425, IFO, 6470, ATCC 15093, ATCC 10529, IFO 5257, ATCC 56596, ATCC 64682), Glomerella fusaroides (ATCC 9552), Gnomonia cingulata (CBS 15226), Haplosporella hesperedica (CBS 20837), Helicostylum piriformae (ATCC 8992), Nigrospora sphaeri- ca (ATCC 12772), Rhizopus oryzae (ATCC 4858) und Syncephalastrum racemosum (IFO 4827) eingesetzt werden.
Besonders geeignet sind Verfahren, bei denen 7α-substituierte 11α-Hydroxyste- roide mit der allgemeinen Formel 4,B hergestellt werden, in denen unabhängig voneinander R7 für CH3 steht und/oder R10 für H steht und/oder R13 für.CH3 steht.
Das Verfahren wird in üblicherweise durchgeführt. Hierzu wird typischerweise zunächst eine sterilisierte Nährlösung für den Stamm hergestellt und diese Nährlösung dann mit der Kulturlösung des Stammes beimpft, um den Stamm anzuzüchten. Die auf diese Weise hergestellte Vorkultur wird dann auf einen Fermenter gegeben, der ebenfalls mit einer geeigneten Nährlösung beschickt ist. Vorzugsweise nach einer Anwachsphase für die Kultur des Stammes wird dann die Ausgangssubstanz zum Fermenter zugegeben, im vorliegenden Falle also entweder eine Verbindung mit der allgemeinen Formel 3,A oder eine Verbindung mit der allgemeinen Formel D, so daß die erfindungsgemäße Reaktion ablaufen kann. Nach Abschluß der Reaktion wird das Stoffgemisch in her- kömmlicher Weise aufgereinigt, um das gewünschte 7α-substituierte 11α- Hydroxysteroid zu isolieren.
Aus den so erhaltenen Verbindungen mit der allgemeinen Formel 4,B können weitere erfindungsgemäße Verbindungen mit ebenfalls erfindungsgemäßen Herstellverfahren synthetisiert werden. Insbesondere stellen die 7α,17α-substi- tuierten 11 ß-Halogensteroide mit der allgemeinen Formel 8,10,12:
Figure imgf000013_0001
8,10,12
worin
U-V-W-X-Y-Z für eine der Ringstrukturen C -C2-C3-C4=C5-C10,
C1-C2-C3-C4-C5=C10 oder C1-C2-C3-C4-C5-C10 steht, wobei in diesem Fall eine Oxogruppe (=0) an W (=C3) gebunden ist, oder für die Ringstruktur
C^C^C^C^C^C6, wobei in diesem Falle der Rest OR3 an W (= C3) gebunden ist,
R3 für H, C bis C4-Alkyl, Cr bis C4-Alkanoyl oder einen cyclischen C3- bis C -Ether mit dem O-Atom des OR3-Rests steht,
R7 die Gruppierung P-Q ist, wobei
P ein Cr bis C4-Alkylen und Q einen Wasserstoff, C bis C4-Alkyl- oder Cr bis C4-Fluoralkyl (Alkyl teilweise oder vollständig fluoriert) darstellt und die Gruppierung P-Q über P an das Steroidgrundge- rüst gebunden ist,
R10 α- oder ß-ständig sein kann und für H, CH3 oder CF3 steht und nur dann vorhanden ist, wenn X-Y-Z nicht C4-C5=C10 ist,
R11 ein Halogen ist, R13 Methyl oder Ethyl ist,
R17 für H, d- bis C18-Alkyl, alicyclisches C bis Cι8-Alkyl, Cr bis Cι8-Al- kenyl, alicyclisches Cr bis Ci8-Alkenyl, Cr bis Cι8-Alkinyl, C bis C18- Alkylaryl, Cr bis C8-Alkylennitril oder für die Gruppierung P-Q steht, wo- bei die Gruppierung P-Q die vorgenannte Bedeutung hat,
R17' für H, Cr bis C18-Alkyl, alicyclisches d- bis C18-Alkyl, d- bis Cι8-Al- kenyl, alicyclisches Cr bis C18-Aikenyl, Cr bis Cι8-Alkinyl oder Cr bis C-is-AIkylaryl steht, wobei R17' auch über eine Ketogruppe an die 17ß- Oxygruppe gebunden sein kann, und wobei R17' auch zusätzlich mit einer oder mehreren Gruppen NR 8R19 oder einer oder mehreren Gruppen
SOxR20 substituiert sein kann, wobei x = 0, 1 oder 2 und R18, R19 und R20 jeweils unabhängig voneinander dieselbe Bedeutung wie R17 haben können.
sowie deren pharmazeutisch verträgliche Additionssalze, Ester und Amide vorteilhafte Wirkstoffe dar. Diese durch weitere Verfahrensschritte aus dem 7α- substituierten 11α-Hydroxysteroid mit der allgemeinen Formel 4,B erhältlichen Verbindungen sind wertvolle Wirkstoffe mit stark androgener Wirkung ohne die erwähnten Nebenwirkungen. Diese Verbindungen eignen sich zur Herstellung von Arzneimitteln und insbesondere von wirksamen Kontrazeptiva und von Wirkstoffen zur Hormonersatztherapie (HRT).
Falls R17' mit einer Gruppe NR18R19 zusätzlich substituiert ist, kann es sich hierbei um eine Methylamino-, Dimethylamino-, Ethylamino-, Diethylamino-, Cyclo- hexylamino-, Dicyclohexylamino-, Phenylamino-, Diphenylamino-, Benzylamino- oder Dibenzylaminogruppe handeln.
Besonders geeignete 7α,17α-substituierte 11 ß-Halogensteroide mit der allgemeinen Formel 8,10,12 sind Verbindungen, bei denen U-V-W-X-Y-Z für die Ringstruktur C1-C2-C3-C4=C5-C10, C1-C2-C3-C4-C5=C10 oder C =C2-C3=C4-C5=C10 steht.
Im ersten Fall (U-V-W-X-Y-Z = C1-C2-C3-C4=C5-C10) handelt es sich um Ste- roide mit der allgemeinen Formel 10:
Figure imgf000015_0001
10
Im zweiten Fall (U-V-W-X-Y-Z = C1-C2-C3-C4-C5=C10) handelt es sich um Ste- roide mit der allgemeinen Formel 12:
Figure imgf000015_0002
12
Bei den Verbindungen mit den allgemeinen Formeln 10 und 12 handelt es sich um androgene Verbindungen.
Im dritten Fall (U-V-W-X-Y-Z = C1 =C2-C3=C4-C5=C6) handelt es sich um Ste- roide mit der allgemeinen Formel 8:
Figure imgf000016_0001
8
Diese Verbindungen sind Estrogene (Estrogenrezeptor-affine Verbindungen).
In allen drei Fällen haben die Reste R3, R7, R10, R11, R13, R17 und R17' dieselben Bedeutungen wie die entsprechenden Reste in der allgemeinen Formel 8,10,12.
Vorzugsweise stehen unabhängig voneinander R1 für H und/oder R7 für CH3 und/oder R11 für Fluor und/oder R13 für CH3 und/oder R17 für H, CH3, C bis C18-Alkinyl, insbesondere Ethinyl, CH2CN oder CF3 und/oder R17' für H.
Besonders geeignete erfindungsgemäße 7α,17α-substituierte 11 ß-Halogensteroide mit der allgemeinen Formel 8,10,12 sind:
17α-Ethinyl-11ß-fluor-17ß-hydroxy-7α-methylestr-4-en-3-on (Formel 10) 17α-Ethinyl-11ß-fluor-17ß-hydroxy-7α-methylestr-5(10)-en-3-on (Formel 12) 17α-Ethinyl-11ß-fluor-7α-methylestra-1, 3,5(10)-trien-3,17ß-diol (Formel 8).
Zur Herstellung dieser Verbindungen können folgende Herstellungswege eingeschlagen werden:
Zur Herstellung von 7α,17α-substituierten 11 ß-Halogensteroiden mit der allgemeinen Formel 10, in denen U-V-W-X-Y-Z für die Ringstruktur C1-C2-C3-C4=C5-C10 steht, werden als Ausgangssubstanzen die mit dem erfindungsgemäßen mikrobiologischen Herstellungsverfahren erhältlichen 7α-sub- stituierten 11α-Hydroxysteroide mit der allgemeinen Formel 4,B eingesetzt.
In einem ersten Syntheseschritt werden diese so erhaltenen 7α-substituierten 11α-Hydroxysteroide durch nukleophile Substitution mit einem Halodehydroxy- lierungsreagens in die entsprechenden 7α-substituierten 11 ß-Halogensteroide 5 umgewandelt:
Figure imgf000017_0001
4,B
Als Halodehydroxylierungsreagentien kommen alle hierfür üblichen Verbindungen in Frage, beispielsweise Fluor-, Chlor, Brom- oder lodwasserstoffsäure, Thionylchlorid oder Thionylbromid, Phosphorpentachlorid, Phosphoroxychlorid, N-Chlorsuccinimid, Triphenylphosphin/Tetrachlorkohlenstoff, HF/Pyridin oder Diethylaminoschwefeltrifluorid oder vorzugsweise Nonaflylfluorid/1 ,5-Diazabi- cyclo[5.4.0]undecen.
Aus 5 wird anschließend durch selektive Alkylierung an C17 des Ringgerüsts die Verbindung 10 hergestellt (siehe hierzu Schema I). Zur selektiven Alkylierung können übliche Alkylierungsreagentien verwendet werden, beispielsweise Grignardverbindungen und organometallische Verbindungen, insbesondere Al- kyllithium-Verbindungen. Beispielsweise kann zur Herstellung des entsprechenden 17α-Ethinyl-17ß-hydroxy-estr-4-en-3-ons aus dem Estr-4-en-3,17-dion Ethinylmagnesiumbromid als Alkylierungsagens verwendet werden.
Zur Herstellung der 7α,17α-substituierten 11 ß-Halogensteroide, in denen U-V-W-X-Y-Z für die Ringstruktur C1-C2-C3-C4-C5=C10 steht und die die allgemeine Formel 12 haben, werden die Verbindungen mit der allgemeinen Formel 10 eingesetzt und isomerisiert, so daß die Δ4-Doppelbindung in eine Δ5(10)- Doppelbindung isomerisiert wird. Um die 3-Ketogruppe zu schützen, wird hierzu zunächst ein cyclischer Ether in 3-Stellung gebildet. Anschließend wird die Δ4- Doppelbindung in die Δ5(10)-Doppelbindung isomerisiert, wobei sich das 7α,17α- substituierte 11 ß-Halogensteroid mit der allgemeinen Formel 12 bildet, und die Schutzgruppe wieder abgespalten.
Zur Herstellung der weiteren 7α,17α-substituierten 11 ß-Halogensteroide mit der allgemeinen Formel 8, in denen U-V-W-X-Y-Z für C1=C2-C3=C -C5=C10 steht, wird wie folgt vorgegangen:
Zunächst wird wie zuvor bereits beschrieben, aus dem durch mikrobiologische Hydroxylierung und Oxidation erhaltenen 7α-substituierten 11α-Hydroxysteroid mit der allgemeinen Formel 4,B durch Halodehydroxylierung in einer nukleo- philen Substitutionsreaktion das entsprechende 11 ß-Halogensteroid mit der allgemeinen Formel 5 gebildet.
Aus diesem wird dann durch Oxidation, beispielsweise mit einem Kupfer(II)- Salz, ein 7α-substituiertes Estra-1 ,3,5(10)-trien mit der allgemeinen Formel 6 gebildet:
Figure imgf000018_0001
worin R3, R7, R11 und R13 dieselben Bedeutungen haben wie vorstehend bezeichnet. Sofern R3 für H steht, können diese Verbindungen unmittelbar synthetisiert werden. Soll ein anderer Rest als H für R3 stehen, müssen die entsprechenden Ether oder Ester auf bekannte Weise gebildet werden, nachdem der 1 ,3,5(10)-Trienring durch Oxidation gebildet worden ist.
Auch die 7α-substituierten 11 ß-Halogenestra-1 , 3,5(10)-triene mit der allgemeinen Formel 6 sowie deren pharmazeutisch verträgliche Additionssalze, Ester und Amide sind neu und werden daher als Zwischenprodukte bei der Synthese der ebenfalls erfindungsgemäßen 7α, 17α-substituierten 11 ß-Halogensteroide mit der allgemeinen Formel 8 beansprucht.
Ein besonders bevorzugtes 7α-substituiertes 11ß-Halogenestra-1 ,3,5(10)-trien mit der allgemeinen Formel 6 ist 11ß-Fluor-3-hydroxy-7α-methylestra-1 , 3,5(10)- trien-17-on.
Aus dem 7α-substituierten 11 ß-Halogenestra-1 ,3,5(10)-trien mit der allgemeinen Formel 6 kann in gleicher Weise, wie zuvor für die Synthese der Verbindung mit der allgemeinen Formel 10 beschrieben ist, durch selektive Alkylie- rung am C17 des Ringgerüsts das erfindungsgemäße 7α,17α-substituierte 11ß- Halogensteroid mit der allgemeinen Formel 8 gebildet werden.
Weiterhin können aus den durch mikrobiologische Hydroxylierung und Oxidation aus den 7α-substituierten Steroiden mit der allgemeinen Formel 3,A oder D gewonnenen Substanzen mit der allgemeinen Formel 4,B auch die 7α-substi- tuierten 11 ß-Halogensteroide mit der allgemeinen Formel 9 hergestellt werden, die ebenfalls androgene Wirkung aufweisen:
Figure imgf000020_0001
worin R7, R1i und R13 dieselben Bedeutungen wie zuvor angegeben haben. Eine besonders bevorzugte Verbindung ist 11ß-Fluor-17ß-hydroxy-7α-methylestr- 4-en-3-on. Die Verbindungen mit der allgemeinen Formel 9 sowie deren pharmazeutisch verträglichen Additionssalze, Ester und Amide weisen ebenfalls androgene Wirkung auf.
Zur Herstellung der Verbindungen mit der allgemeinen Formel 9 wird das Estr- 4-en-3,17-dion 5 zum 17ß-Hydroxy-estr-4-en-3-on 9 reduziert, beispielsweise mit einem Borhydrid.
Die Verbindungen mit der allgemeinen Formel 9 können weiterhin in die entsprechenden 7α-substituierten 11ß-Halogenestra-5(10)-ene:
Figure imgf000020_0002
wobei R7, R10, R1i und R13 die Bedeutungen wie in der allgemeinen Formel 8,10,12 haben, umgewandelt werden. Hierzu werden die Verbindungen mit der allgemeinen Formel 9 durch Verschiebung der Δ -Doppelbindung in eine Δ5(1 ^-Doppelbindung isomerisiert. Um die 3-Ketogruppe zu schützen, wird hierzu zunächst ein cyclischer Ether in 3-Stellung gebildet. Anschließend wird die Δ4-Doppelbindung in die Δ5(10)-Doppelbindung isomerisiert, wobei sich das vorstehend angegebene 7α-substituierte 11 ß-Halogensteroid bildet, und die Schutzgruppe anschließend wieder abgespalten.
Schließlich können aus den Verbindungen mit der allgemeinen Formel 5 durch Isomerisierung der Δ4-Doppelbindung in die Δ5(10)-Doppelbindung auch die entsprechenden 7α-substituierten 11ß-Halogenestra-5(10)-ene:
Figure imgf000021_0001
wobei R7, R10, Ri1 und R13 die Bedeutungen wie in der allgemeinen Formel 8,10,12 haben,
umgewandelt werden. Hierzu werden die Verbindungen mit der allgemeinen Formel 5 durch Verschiebung der Δ4-Doppelbindung in eine Δ5(1 ^-Doppelbindung isomerisiert. Um die 3-Ketogruppe zu schützen, wird hierzu wiederum zunächst ein cyclischer Ether in 3-Stellung gebildet. Anschließend wird die Δ4- Doppelbindung in die Δ5(10)-Doppelbindung isomerisiert, wobei sich das vorstehend angegebene 7α-substituierte 11 ß-Halogensteroid bildet, und die Schutzgruppe schließlich wieder abgespalten.
Alle genannten Verbindungen können auch weiter verestert oder verethert werden, sofern entsprechende Hydroxygruppen in 3- oder 17ß-Stellung vorhanden sind. Beispielsweise kann die Verbindung 9 in einen entsprechenden 17ß-Ether oder 17ß-Ester umgewandelt werden. Eine bevorzugte Verbindung ist 11ß- Fluor-17ß-(4-sulfamoylbenzoxy)-7α-methylestr-4-en-3-on. Als Substituenten am Oxy-Sauerstoffatom an C17 kommen grundsätzlich dieselben Reste in Frage, die auch für R17' angegeben sind.
Insbesondere die 7α,17α-substituierten 11 ß-Halogensteroide mit der allgemeinen Formel 8,10,12 sind geeignet zur Herstellung von Arzneimitteln. Daher bezieht sich die vorliegende Erfindung auch auf die Verwendung der genannten Verbindungen mit der allgemeinen Formel 8,10,12 zur Herstellung von Arz- neimitteln sowie auf pharmazeutische Präparate, die mindestens eine der genannten Verbindungen mit der allgemeinen Formel 8,10,12 sowie mindestens einen pharmazeutisch verträglichen Träger enthalten.
Bei den erfindungsgemäßen 7α,17α-substituierten 11 ß-Halogensteroiden mit der allgemeinen Formel 10,12 handelt es sich um Verbindungen mit stark androgener Wirkung ohne die genannten Nebenwirkungen, beispielsweise Stimulation der Prostata (insbesondere keine benigne Prostatahyperplasie). Die Verbindungen sind leicht synthetisierbar. Es sich gezeigt, daß die erfindungsgemäßen Verbindungen mit der allgemeinen Formel 10 oder 12 nicht nur zur männlichen HRT eingesetzt werden können, sondern daß sich diese Verbindungen auch ohne zusätzliche Verabreichung von weiteren Wirkstoffen als wirksame männliche Kontrazeptiva eignen, wenn eine ausreichende Dosierung vorgenommen wird, um den Blutspiegel von LH, von im Körper produziertem Testosteron sowie von FSH (follikelstimulierendes Hormon) genügend abzusen- ken. Dies liegt daran, daß die erfindungsgemäßen 11 ß-Halogensteroide die Ausschüttung von LH und FSH inhibieren. LH stimuliert die Leydig-Zellen, so daß Testosteron sezerniert wird. Wird der Blutspiegel von LH niedrig gehalten, sinkt auch die körpereigene Testosteronausschüttung. Testosteron wird für die Spermatogenese benötigt, während FSH die Keimzellen stimuliert. Daher sind für eine wirksame Spermatogenese ausreichend hohe FSH- und LH-Blutspiegel erforderlich, wobei ein ausreichend hoher LH-Blutspiegel zu der für die Spermatogenese erforderlichen Testosteron-Ausschüttung führt. Da eine Behandlung ausschließlich mit den 7α,17α-substituierten 11ß-Halogen- steroiden ohne zusätzliche Wirkstoffe zur Sterilisation bereits zur wirksamen männlichen Kontrazeption führen kann, kann die Verabreichung eines hierfür geeigneten Arzneimittels wesentlich vereinfacht und die Kosten der Anwendung deutlich gesenkt werden.
Die erfindungsgemäßen 7α,17α-substituierten 11 ß-Halogensteroide können auch in Kombination mit einem Gestagen eingesetzt werden, um die männliche Fertilität zu kontrollieren.
Überdies inhibieren die erfindungsgemäßen 7α,17α-substituierten 11ß-Halo- gensteroide wirksam 5α-Reduktase und die Steroid-11-Hydroxylase [CYP11B (P450c11), G.Zhang, W.L.Miller, Journal of Clinical Endocrinology and Metabo- lism, Vol. 81 , Seiten 3254-3256 (1996)], so daß beispielsweise selektiv die Sti- mulation der Prostata vermieden wird und diese Verbindungen eine verbesserte Pharmakokinetik aufweisen. Die Inhibition der 11-Hydroxylase führt zu einer verminderten Desaktivierung der androgenen Verbindungen und zu deren verringerter Ausscheidung aus dem menschlichen Körper. Dadurch sind die Wirksamkeit und Wirkdauer dieser Verbindungen gegenüber bekannten Verbindun- gen insbesondere nach oraler Applikation verbessert.
Aus den vorstehenden Gründen eignen sich diese Verbindungen besonders zur Anwendung in der männlichen Fertilitätskontrolle sowie zur Androgenersatzthe- rapie mit verminderter Neigung zur 5α-Reduktion bei gleichzeitig erhaltener Aro- matisierbarkeit zu estrogenen Steroiden und günstigem Einfluß auf Serumlipide und das Zentralnervensystem.
Die androgene Wirkung und die Feststellung, dass die genannten Nebenwirkungen nicht auftreten, wurde mit einem Samenblasentest für die erfindungs- gemäßen Verbindungen mit den allgemeinen Formeln 10 und 12 ermittelt. Die Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Verbindungen mit der allgemeinen Formel 8 wurde mit einem Uteruswachstumstest auf estrogene Wirkung überprüft. Die erfindungsgemäßen 7α,17α-subsituierten 11 ß-Halogensteroide mit der allgemeinen Formel 10 oder 12 bzw. die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Präparate, die diese Verbindungen enthalten, eignen sich hervorragend zur Behandlung von nicht-sterilen männlichen Personen sowie grundsätzlich auch von männlichen Säugetieren. Eine Anwendung zur männlichen Kontrazeption führt dazu, daß die männlichen Personen nur vorübergehend steril werden. Nach Beendigung der Anwendung der erfindungsgemäßen Wirkstoffe bzw. der pharmazeutischen Präparate wird der ursprüngliche Zustand wieder erreicht, so daß die männliche Person nicht mehr steril ist und die Spermatogenese wieder im ursprünglichen Umfange stattfindet. Um den Zustand der vorübergehenden Sterilität über einen gewünschten Zeitraum konstant zu erreichen, ist die Verabreichung des Wirkstoffes bzw. des Präparats kontinuierlich durchzuführen, wobei die Verabreichung je nach der Anwendungsform täglich, in einem kürzeren oder auch in einem größeren Zeitabstand periodisch zu wiederholen ist. Nach Been- digung der einmaligen oder wiederholten Verabreichung des Wirkstoffes oder des Präparats wird der nicht-sterile Zustand der männlichen Person gegebenenfalls nicht sofort sondern erst langsam wiederhergestellt, wobei die hierfür erforderliche Zeitspanne von verschiedenen Faktoren, beispielsweise von der Dosierung, der Körperkonstitution der Person und der parallelen Gabe anderer Arzneimittel, abhängt.
Falls der Zweck der Anwendung in der Kontrazeption besteht, muß die Dosierung der 7α,17α-substituierten 11 ß-Halogensteroide so hoch eingestellt werden, daß die Blutspϊegel von LH und FSH jeweils höchstens 2,5 I.E./ml (I.E.: Interna- tionale Einheiten), insbesondere höchstens 1 ,0 I.EJml, und von Testosteron höchstens 10 nmol/l, insbesondere höchstens 3 nmol/l, betragen.
Falls die erfindungsgemäßen 7α,17α-substituierten 11 ß-Halogensteroide zur HRT eingesetzt werden sollen, ohne daß eine Kontrazeption erreicht werden soll, wird die Dosierung niedriger angesetzt. Für diesen Fall werden Wirkspiegel angestrebt, die Blutspiegel für LH und FSH von jeweils mehr als 2,5 I.EJml und für Testosteron von mehr als 10 nmol/l ermöglichen. Die zur Einstellung des Blutspiegels von LH, FSH und Testosteron benötigten Dosierungen der erfindungsgemäßen 7α,17α-substituierten 11 ß-Halogensteroide mit der allgemeinen Formel 10 oder 12 hängen von einer Vielzahl von Faktoren ab und müssen daher anwendungsspezifisch bestimmt werden. Zu- 5 nächst ist die Dosierung natürlich von der Art der Therapie abhängig. Falls die Verbindungen zur männlichen Kontrazeption eingesetzt werden sollen, müssen wesentlich höhere Dosen gegeben werden als bei einem Einsatz zur HRT. Ferner richtet sich die Dosierung auch nach der Art des 7α,17α-substituierten 11 ß- Halogensteroids und dessen Bioverfügbarkeit. Ferner ist die Art der Anwendung 10 wesentlich für die zu applizierende Menge. Schließlich hängt die Dosierung auch von der Körperkonstitution der anwendenden Person und von weiteren Faktoren ab, beispielsweise dem Umstand, ob parallel weitere Arzneimittel gegeben werden.
15 Die Verbindungen können oral und parenteral, beispielsweise i.p. (intraperito- neal), i.v. (intravenös), i.m. (intramuskulär) oder perkutan, verabreicht werden. Die Verbindungen können auch in das Gewebe implantiert werden. Die zu verabreichende Menge der Verbindungen kann innerhalb eines weiten Bereiches schwanken, soweit eine wirksame Menge appliziert wird. In Abhängigkeit von
20. dem zu behandelnden Zustand und der Art der Darreichung kann die Menge der verabreichten Verbindung in einem weiten Bereich variieren. Beim Menschen liegt die tägliche Dosis im Bereich von 0,1 bis 100 mg. Die bevorzugte tägliche Dosierung beim Menschen beträgt 0,1 bis 10 mg. Die Dauer der Anwendung hängt von dem zu erreichenden Zweck ab.
25
Zur Anwendung kommen Kapseln, Pillen, Tabletten, Dragees, Cremes, Salben, Lotionen, Flüssigkeiten, wie Sirupe, Gele, injizierbare Flüssigkeiten, beispielsweise zur i.p.-, i.v.-, i.m.- oder perkutanen Injektion, usw. in Frage, wobei die einzelnen Darreichungsformen die erfindungsgemäßen Verbindungen je nach
30 deren Art allmählich oder die gesamte Menge in kurzer Zeit an den Körper abgeben.
Zur oralen Verabreichung werden Kapseln, Pillen, Tabletten, Dragees und Flüssigkeiten oder andere bekannte orale Darreichungsformen als pharmazeu- tische Präparate eingesetzt. In diesem Falle können die Arzneimittel in der Weise formuliert sein, daß sie die Wirkstoffe entweder in kurzer Zeit freisetzen und an den Körper abgeben oder eine Depotwirkung aufweisen, so daß eine länger anhaltende, langsame Zufuhr von Wirkstoff zum Körper erreicht wird. Die Do- sierungseinheiten können neben dem 7α,17α-substituierten 11 ß-Halogensteroid einen oder mehrere pharmazeutisch verträgliche Träger enthalten, beispielsweise Stoffe zur Einstellung der Rheologie des Arzneimittels, oberflächenaktive Stoffe, Lösungsvermittler, Mikrokapseln, Mikropartikel, Granulate, Verdünner, Bindemittel, wie Stärke, Zucker, Sorbit und Gelatine, ferner Füll- Stoffe, wie Kieselsäure und Talkum, Gleitmittel, Farbstoffe, Duftstoffe und andere Stoffe.
Die erfindungsgemäßen 7α,17α-substituierten 11 ß-Halogensteroide können insbesondere auch in Form einer Lösung formuliert werden, die für die orale Verabreichung bestimmt ist und die neben dem aktiven 11 ß-Halogensteroid als folgende Bestandteile ein pharmazeutisch verträgliches Öl und/oder eine pharmazeutisch verträgliche lipophile, oberflächenaktive Substanz und/oder eine pharmazeutisch verträgliche hydrophile, oberflächenaktive Substanz und/oder ein pharmazeutisch verträgliches mit Wasser mischbares Lösungsmittel enthält. Hierzu wird außerdem auf WO-A-97/21440 verwiesen.
Um eine bessere Bioverfügbarkeit des Steroids zu erreichen, können die Verbindungen auch als Cyclodextrinchlatrate formuliert werden. Hierzu werden die Verbindungen mit α-, ß- oder γ-Cyclodextrin oder deren Derivaten umgesetzt.
Falls Cremes, Salben, Lotionen und äußerlich anwendbare Flüssigkeiten eingesetzt werden sollen, müssen diese so beschaffen sein, daß die erfindungsgemäßen Verbindungen dem Körper in ausreichender Menge zugeführt werden. In diesen Darreichungsformen sind Hilfsstoffe enthalten, beispielsweise Stoffe zur Einstellung der Rheologie der Arzneimittel, oberflächenaktive Mittel, Konservierungsmittel, Lösungsvermittler, Verdünner, Stoffe zur Erhöhung der Per- meationsfähigkeit für die erfindungsgemäßen Steroide durch die Haut, Farbstoffe, Duftstoffe und Hautschutzmittel, wie Konditionierer und Feuchteregulato- ren. Zusammen mit den erfindungsgemäßen Steroiden können auch andere Wirkstoffe in dem Arzneimittel enthalten sein.
Zur parenteralen Verabreichung können die Wirkstoffe in einem physiologisch verträglichen Verdünnungsmittel gelöst oder suspendiert sein. Als Verdünnungsmittel werden sehr häufig Öle mit oder ohne Zusatz eines Lösungsvermittlers, eines oberflächenaktiven Mittels, eines Suspendier- oder Emulgiermittels verwendet. Beispiele für verwendete Öle sind Olivenöl, Erdnußöl, Baum- wollsamenöl, Sojabohnenöl, Rizinusöl und Sesamöl. Zur Formulierung eines injizierbaren Präparats kann ein beliebiger flüssiger Träger verwendet werden, in dem die erfindungsgemäßen Verbindungen gelöst oder emulgiert sind. Diese Flüssigkeiten enthalten häufig auch Stoffe zur Regulation der Viskosität, oberflächenaktive Stoffe, Konservierungsstoffe, Lösungsvermittler, Verdünner und weitere Zusatzstoffe, mit denen die Lösung isotonisch eingestellt wird. Zusam- men mit den 7α,17α-substituierten 11ß-Halogensteroiden können auch andere Wirkstoffe verabreicht werden.
Die erfindungsgemäßen 11 ß-Halogensteroide lassen sich so in Form einer Depotinjektion oder eines Implantatpräparats, beispielsweise subkutan, anwenden, die so formuliert sein können, daß eine verzögerte Wirkstoff-Freigabe ermöglicht wird. Hierzu können bekannte Techniken eingesetzt werden, beispielsweise sich auflösende oder mit einer Membran arbeitende Depots. Implantate können als inerte Materialien beispielsweise biologisch abbaubare Polymere enthalten oder synthetische Silikone, beispielsweise Silikonkautschuk. Die er- findungsgemäßen 11 ß-Halogensteroide können ferner zur perkutanen Verabreichung beispielsweise in ein Pflaster eingearbeitet werden.
Die nachfolgend angegebenen Beispiele dienen zur näheren Erläuterung der Erfindung: A. Mikrobiologische Synthese:
11α-Hydroxy-7α-methyl-estr-4-en-3,17-dion (Verbindung 4,B):
Beispiel 1:
Mikrobiologische Hydroxylierung und Oxidation
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Figure imgf000028_0002
B
Ein 2 1-Erlenmeyerkolben, der 1000 ml einer 30 min bei 121°C im Autoklaven sterilisierten Nährlösung aus 3 Gew.-% Glucose, 1 Gew.-% Maisquellwasser, 0,2 Gew.-% NaN03, 0,1 Gew.-% KH2P04, 0,2 Gew.-% K2HP04, 0,05 Gew.-% KCI, 0,05 Gew.-% MgS047H20 und 0,002 Gew.-% FeS047H20 (pH 6,0) enthielt, wurde mit einer Schrägröhrchen-Kultur des Stammes Gnomonia cingulata (CBS 15226) beimpft und 72 h lang bei 28°C auf einem Rotationsschüttler mit 165 UpM geschüttelt. Mit dieser Vorzucht wurde ein 20 1-Fermenter beimpft, der mit 19 1 sterilem Medium der gleichen Endzusammensetzung, wie für die Vor- kultur beschrieben, beschickt war. Außerdem wurden vor dem Sterilisieren noch 1 ,0 ml Siliconöl und 1 ,0 ml Synperonic (Oxoalkoholethoxylat) zur Schaumbekämpfung zugegeben. Nach einer Anwachsphase von 12 h bei 0,7 bar Überdruck, einer Temperatur von 28°C, einer Belüftung von 20 1/min und einer Rührgeschwindigkeit von 250 UpM wurde eine Lösung von 4,0 g 17ß-Hydroxy- 7α-methylestr-4-en-3-on in 40 ml DMF zugegeben. Es wurde weitergerührt und belüftet. Nach 135 h wurde die Kulturbrühe geerntet und 12 h lang mit 10 1 Me- thylisobutylketon und 5 h lang mit 5 1 Methylisobutylketon extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden bis zur Trockene eingeengt. Das Siliconöl wurde mit Hexan herausgewaschen. Nach Chromatographie an Kieselgel mit einem Gradienten aus Hexan und Ethylacetat wurden 1,64 g (39 %) 11α- Hydroxy-7α-methylestr-4-en-3,17-dion isoliert.
Beispiel 2:
Mikrobiologische Oxidation
Figure imgf000029_0001
Figure imgf000029_0002
B
Ein 2 1-Erlenmeyerkolben, der 1000 ml einer 30 min lang bei 121 °C im Autoklaven sterilisierten Nährlösung aus 3 Gew.-% Glucose, 1 Gew.-% Maisquellwasser, 0,2 Gew.-% NaN03, 0,1 Gew.-% KH2P04, 0,2 Gew.-% K2HP04, 0,05 Gew.-% KCI, 0,05 Gew.-% MgS047H20, und 0,002 Gew.-% FeS047H20 (pH 6,0) enthielt, wurde mit einer Schrägröhrchen-Kultur des Stammes Glome- rella cingulata (IFO 6425) beimpft und 72 h lang bei 28°C auf einem Rotationsschüttler mit 165 UpM geschüttelt. Mit dieser Vorzucht wurde ein 20 1 Fermenter beimpft, der mit 19 1 sterilem Medium der gleichen Endzusammensetzung, wie für die Vorkultur beschrieben, beschickt war. Außerdem wurden vor dem Sterilisieren noch 1 ,0 ml Siliconöl und 1 ,0 ml Synperonic zur Schaumbekämpfung zugegeben. Nach einer Anwachsphase von 12 h bei 0,7 bar Überdruck, einer Temperatur von 28°C, einer Belüftung von 10 1/min und einer Rührgeschwindigkeit von 350 UpM wurde eine Lösung von 2,0 g 17ß-Hydroxy-7α-methylestr- 4-en-3-on in 30 ml DMF zugegeben. Es wurde weitergerührt und belüftet. Nach 19 h wurde die Kulturbrühe geerntet und 16 h lang mit 20 1 Methylisobutylketon und 23 h lang mit 201 Methylisobutylketon extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden bis zu Trockne eingeengt. Der Rückstand wurde in Methanol weitgehend gelöst. Das Siliconöl wurde abfiltriert. Es wurde eingeengt, und nach Chromatographie an Kieselgel mit einem Gradienten aus Dichlor- methan und Aceton wurden 1,55 g (73 %) 11α,17ß-Dihydroxy-7α-methylestr-4- en-3-on isoliert. Nach der Umkristallisation aus Aceton/Diisopropylether wurden 827 mg (39 %) weiße Kristalle vom Schmelzpunkt 163°C und [α]D = -16° (CHCI3, c = 0,501) isoliert.
Ein 2 1-Erlenmeyerkolben, der 500 ml einer 30 min lang bei 121 °C im Autoklaven sterilisierten Nährlösung aus 0,5 Gew.-% Glucose, 0,5 Gew.-% Bacto-He- feextrakt, 0,1 Gew.-% Pepton und 0,2 Gew.-% Maisquellwasser (pH 7,5) enthielt, wurde mit vier Kryo-Kugeln einer Kultur des Stammes Bacillus sphaericus (ATCC 7055) beimpft und 24 h lang bei 28°C auf einem Rotationsschüttler mit 165 UpM geschüttelt. Mit dieser Vorzucht wurden vier 2 1 Erienmeyerkolben, die 500 ml steriles Medium der gleichen Zusammensetzung, wie für die Vorkultur beschrieben, enthielten, mit je 10 % dieser Kulturbrühe beimpft. Nach einer Anwachsphase von 4 h bei einer Temperatur von 28°C auf einem Rotationsschüttler mit 165 UpM wurde in jeden Kolben eine Lösung von 50 mg 11α,17ß- Dihydroxy-7α-methylestr-4-en-3-on in 2,5 ml DMF gegeben. Es wurde 48 h weitergeschüttelt. Die vereinigten Kulturbrühen wurden zweimal mit 2 1 Methylisobutylketon extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über Natriumsulfat getrocknet und bis zu Trockne eingeengt. Dabei wurden 630 mg eines ölig-kristallinen Rückstands erhalten. Nach der Umkristallisation aus Ace- ton/Diisopropylether wurden 103 mg (49,2 %) gelbliche Kristalle vom Schmelzpunkt 189°C und [α]D = +40,4° (CHCI3, c = 0,529) isoliert (Direktkristallisation ohne vorherige chromatographische Aufreinigung). Beispiel 3:
Figure imgf000031_0001
B
Ein 2 1-Erlenmeyerkolben, der 500 ml einer 30 min lang bei 121 °C im Autoklaven sterilisierten Nährlösung aus 3 Gew.-% Glucose, 1 Gew.-% Maisquellwasser, 0,2 Gew.-% NaN03) 0,1 Gew.-% KH2P04, 0,2 Gew.-% K2HP04, 0,05 Gew.-% KCI, 0,05 Gew.-% MgS047H20, und 0,002 Gew.-% FeS047H20 (pH 6,0) enthielt, wurde mit einer halben Schrägröhrchen-Kultur des Stammes Aspergillus ochraceus (CBS 13252) beimpft und 72 h lang bei 28°C auf einem Rotationsschüttler mit 165 UpM geschüttelt. Mit dieser Vorzucht wurde ein 10 1 Fermenter beimpft, der mit 9,5 1 sterilem Medium der gleichen Endzusammensetzung, wie für die Vorkultur beschrieben, beschickt war. Außerdem wurden vor dem Sterilisieren noch 0,5 ml Siliconöl und 0,5 ml Synperonic zur Schaumbekämpfung zugegeben. Nach einer Anwachsphase von 6 h bei 0,7 bar Überdruck, einer Temperatur von 28°C, einer Belüftung von 5 1/min und einer Rührgeschwindigkeit von 350 UpM wurde eine Lösung von 1 ,0 g 7α-Methylestr-4- en-3,17-dion in 15 ml DMF zugegeben. Es wurde weitergerührt und belüftet. Nach 22 h wurde die Kulturbrühe geerntet und zweimal 4 h lang mit 71 Methyl- isobutylketon extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden bis zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wurde in Methanol weitgehend gelöst. Das Siliconöl wurde abfiltriert. Es wurde eingeengt, und nach Chromatographie an Kieselgel mit einem Gradienten aus Dichlormethan und Aceton wurden 0,78 g (74 %) 11α-Hydroxy-7α-methylestr-4-en-3,17-dion isoliert. Nach der Umkristallisation aus Aceton/Diisopropylether wurden 311 mg (29,6 %) weiße Kristalle vom Schmelzpunkt 200°C und [α]D = +52° (CHCI3, c = 0,5905) isoliert. B. Chemisches Herstellungsverfahren:
Beispiel 4: Herstellung von 11ß-Fluor-17ß-hydroxy-7α-methylestr-4-en-3-on:
a) 11 ß-Fluor-7α-methyl-estr-4-en-3,17-dion:
Zu einer Lösung von 13,08 g 11α-Hydroxy-7α-methyl-estr-4-en-3,17-dion (hergestellt mittels erfindungsgemäßer mikrobiologischer Synthese [Teil A]) in 250 ml Toluol und 18,2 ml 1 ,8-Diazabicyclo[5,4,0]undec-7-en wurden bei 0°C 11 ,5 ml Perfluorbutan-1-sulfonsäurefluorid getropft. Nach 1 h wurde mit 2M- Salzsäure neutralisiert, auf Wasser gegeben, viermal mit Ethylacetat extrahiert, mit gesättigter Natriumchlorid-Lösung gewaschen, getrocknet und im Vakuum eingeengt. Nach Chromatographieren des Rohproduktes an Kieselgel mit ei- nem Hexan/Ethylacetat-Gradienten wurden 8,7 g 11 ß-Fluor-7α-methyl-estr-4- en-3,17-dion erhalten. Schmelzpunkt: 101,4°C, [α]D : +135,8° (CHCI3).
b) 11ß-Fluor-17ß-hydroxy-7α-methylestr-4-en-3-on:
Eine Lösung von 8,7 g 11ß-Fluor-7α-methyl-estr-4-en-3,17-dion in 148 ml Tetrahydrofuran wurde bei 0°C mit 29,5 ml 1M-Lithiumaluminiumtri-terf-butoxy- hydrid in Tetrahydrofuran tropfenweise versetzt und 5,5 h lang bei 0°C gerührt. Anschließend wurde bei 0°C verdünnte Schwefelsäure zugegeben, und die Reaktionslösung wurde auf Eiswasser gegeben, dreimal mit Ethylacetat extrahiert, neutral gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet, i.Vak. eingeengt, und an Kieselgel mit Hexan/Ethylacetat chromatographiert. Es wurden 5,8 g 11 ß-Fluor- 17ß-hydroxy-7α-methylestr-4-en-3-on, vom Schmelzpunkt 143-144°C erhalten. [α]D = +89.9° (CHCIs). Beispiel 5: Herstellung von 11ß-Fluor-17ß-(4-sulfamoylbenzoxy)-7α-methylestr- 4-en-3-on:
Eine Lösung von 500 mg 11ß-Fluor-17ß-hydroxy-7α-methylestr-4-en-3-on in 7,5 ml Pyridin wurde bei Raumtemperatur mit 750 mg 4-Sulfamoylbenzoesäure, 800 mg N,N-DicycIohexylcarbodiimid sowie 125 mg p-Toluolsulfonsäure versetzt und 8,5 h lang gerührt. Dann wurde auf Natriumhydrogencarbonat-Lösung gegeben, viermal mit Dichlormethan extrahiert, neutral gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet, i.Vak. eingeengt und an Kieselgel mit Dichlormethan/ Aceton chromatographiert. Es wurden 302 mg 11 ß-Fluor-17ß-(4-sulfamoyl- benzoxy)-7α-methylestr-4-en-3-on vom Schmelzpunkt 232°C erhalten. [α]o = +100.5 ° (CHCI3).
Beispiel 6: Herstellung von 17α-Ethinyl-11ß-fluor-17ß-hydroxy-7α-methylestr-4- en-3-on:
a) 11 ß-Fluor-3-methoxy-7α-methylestra-3,5-dien-17-on:
Eine Lösung von 2 g 11ß-Fluor-7α-methylestr-4-en-3,17-dion in 20 ml 2,2-Di- methoxypropan wurde mit 200 mg Pyridiniumtosylat 6,5 h lang bei 80°C gerührt. Dann wurde mit Ethylacetat verdünnt, mit Natriumhydrogencarbonat- und Natriumchlorid-Lösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und i.Vak. eingeengt. Es wurden 2 g rohes 11ß-Fluor-3-methoxy-7α-methylestra-3,5-dien- 17-on erhalten.
b) 17α-Ethinyl-11 ß-fluor-17ß-hydroxy-7α-methylestr-4-en-3-on:
Eine Lösung von 9,17 g Cer-III-chlorid in 60 ml Tetrahydrofuran wurde bei 0°C tropfenweise mit 74,2 ml einer Ethinylmagnesiumbromid-Lösung (0,5 M in Tetrahydrofuran) versetzt und 1 h lang bei 0°C gerührt. Anschließend wurden eine Lösung von 2 g des rohen 11ß-Fluor-3-methoxy-7α-methylestra-3,5-dien- 17-on in 40 ml Tetrahydrofuran tropfenweise zugegeben und weitere 3,5 h lang bei 0°C gerührt. Zur Aufarbeitung wurde eine gesättigte Ammoniumchlorid-Lö- sung zugesetzt, auf Wasser gegeben, dreimal mit Ethylacetat extrahiert, mit halbkonzentrierter Salzsäure, Natriumhydrogencarbonat- und Natriumchlorid- Lösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet, i.Vak. eingeengt und an Kieselgel mit Hexan/Ethylacetat chromatographiert. Es wurden 1,15 g reines 17α-Ethinyl-11ß-fluor-17ß-hydroxy-7α-methylestr-4-en-3-on vom Schmelzpunkt 218-220°C erhalten. [α]D = +19.2° (CHCI3).
Beispiel 7: Herstellung von 17α-Ethinyl-11ß-fluor-17ß-hydroxy-7α-methylestr- 5(10)-en-3-on:
a) 3,3-Ethandiyldioxy-17α-ethinyl-11 ß-fluor-7α-methylestr-5(10)-en-17ß-ol:
Eine Lösung von 700 mg 17α-Ethinyl-11ß-fluor-17ß-hydroxy-7α-methylestr-4- en-3-on in 7 ml Dichlormethan und 4,7 ml Ethylenglykol wurde mit 2,3 ml Tri- methylorthoformiat und 30 mg p-Toluolsulfonsäurehydrat 6,5 h lang bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde auf Natriumhydrogencarbonat-Lösung gegeben, dreimal mit Ethylacetat extrahiert, neutral gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet, i.Vak. eingeengt und an Kieselgel mit Hexan/Ethylacetat chroma- tographiert. Es wurden 205 mg 3,3-Ethandiyldioxy-17α-ethinyl-11 ß-fluor-7α- methylestr-5(10)-en-17ß-ol erhalten.
b) 17α-Ethinyl-11 ß-fluor-17ß-hydroxy-7α-methylestr-5(10)-en-3-on:
Eine Lösung von 205 mg 3,3-Ethandiyldioxy-17α-ethinyl-11 ß-fluor-7α-methyl- estr-5(10)-en-17ß-ol in 27 ml Methanol und 3,6 ml Wasser wurde mit 361 mg Oxalsäure 24 h lang bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde auf Natriumhydrogencarbonat-Lösung gegeben, dreimal mit Ethylacetat extrahiert, neutral gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet, i.Vak. eingeengt und an Kieselgel mit Hexan/Ethylacetat chromatographiert. Es wurden 95 mg 17α-Ethinyl-11 ß- fluor-17ß-hydroxy-7α-methylestr-5(10)-en-3-on vom Schmelzpunkt 112-114°C erhalten. Beispiel 8: Herstellung von 17α-Ethinyl-11ß-fluor-7α-methylestra-1 ,3,5(10)- trien-3,17ß-diol:
a) 11 ß-Fluor-3-hydroxy-7α-methylestra-1 ,3,5(10)-trien-17-on: Eine Lösung von 500 mg 11ß-Fluor-7α-methylestr-4-en-3,17-dion in 16,5 ml Acetonitril wurde mit 400 mg Kupfer-II-bromid 6,5 h lang bei 25°C gerührt. Dann wurde mit Ethylacetat verdünnt, mit Natriumhydrogencarbonat- und Natriumchlorid-Lösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet, i.Vak. eingeengt und an Kieselgel mit Hexan/Aceton chromatographiert. Es wurden 280 mg reines 11 ß-Fluor-3-hydroxy-7α-methylestra-1 ,3,5(10)-trien-17-on vom Schmelzpunkt 185-186°C erhalten.
b) 17α-Ethinyl-11 ß-f luor-7α-methylestra-1 ,3,5(10)-trien-3, 17ß-diol:
Eine Suspension von 2,03 g Cer-III-chlorid in 7,5 ml Tetrahydrofuran wurde bei 0°C tropfenweise mit 16,5 ml einer Ethinylmagnesiumbromid-Lösung (0,5 M in Tetrahydrofuran) versetzt und 0,5 h lang bei 0°C gerührt. Anschließend wurden eine Lösung von 280 mg 11ß-Fluor-3-hydroxy-7α-methylestra-1, 3,5(10)-trien- 17-on in 2,8 ml Tetrahydrofuran tropfenweise zugegeben und weitere 3,5 h lang bei 0°C gerührt. Zur Aufarbeitung wurde eine gesättigte Ammoniumchlorid-Lö- sung zugesetzt, auf Wasser gegeben, viermal mit Ethylacetat extrahiert, neutral gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet, i.Vak. eingeengt und an Kieselgel mit Hexan/Ethylacetat chromatographiert.
Es wurden 220 mg 17α-Ethinyl-11ß-fluor-7α-methylestra-1 ,3,5(10)-trien-3,17ß- diol vom Schmelzpunkt 115-117°C erhalten.

Claims

Patentansprüche:
1. Mikrobiologisches Verfahren zur Herstellung von 7α-substituierten 11α- Hydroxysteroiden mit der allgemeinen Formel 4,B:
Figure imgf000036_0001
4,B
worin
R7 die Gruppierung P-Q ist, wobei
P ein Cr bis C4-Alkylen und Q einen Wasserstoff, C bis C4-Alkyl- oder Cr bis C4-Fluoralkyl darstellt und die Gruppierung P-Q über P an das Steroidgrundgerüst gebunden ist,
R10 α- oder ß-ständig sein kann und für H, CH3 oder CF3 steht, und
R13 Methyl oder Ethyl ist,
bei dem ein 7α-substituiertes Steroid mit der allgemeinen Formel 3,A:
Figure imgf000036_0002
3,A worin R7 R 0 und R13 dieselben Bedeutungen haben wie zuvor angegeben,
unter Verwendung eines Mikroorganismus, ausgewählt aus der Gruppe, umfas- send Aspergillus sp., Beauveria sp., Glomerella sp., Gnomonia sp., Haplosporella sp. und Rhizopus sp., hydroxyliert und oxidiert wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus ausgewählt ist aus der Gruppe, umfassend Aspergillus awamori, Asper- gillus fischeri, Aspergillus malignus, Aspergillus niger, Beauveria bassiana,
Glomerella cingulata, Gnomonia cingulata, Haplosporella hesperedica und Rhizopus stolonifer.
3. Mikrobiologisches Verfahren zur Herstellung von 7α-substituierten 11α- Hydroxysteroiden mit der allgemeinen Formel 4,B:
Figure imgf000037_0001
4,B
worin
R7 die Gruppierung P-Q ist, wobei
P ein Cr bis C-4-Alkylen und Q einen Wasserstoff, Cr bis C4-Alkyl- oder Cr bis C4-Fluoralkyl darstellt und die Gruppierung P-Q über P an das Steroidgrundgerüst gebunden ist,
R10 α- oder ß-ständig sein kann und für H, CH3 oder CF3 steht, und
R13 Methyl oder Ethyl ist, bei dem ein 7α-substituiertes Steroid mit der allgemeinen Formel 3,A:
Figure imgf000038_0001
3,A
worin R7, R10 und R13 dieselben Bedeutungen haben wie zuvor angegeben,
in einem ersten mikrobiologischen Verfahrensschritt unter Verwendung eines ersten Mikroorganismus, ausgewählt aus der Gruppe, umfassend Aspergillus sp., Beauveria sp., Gibberella sp., Glomerella sp., Gnomonia sp., Metarrhizium sp., Nigrospora sp., Rhizopus sp. und Verticillium sp., in 11α-Stellung hydroxy- liert wird unter Bildung eines 7α-substituierten 11α-Hydroxysteroids mit der allgemeinen Formel C:
Figure imgf000038_0002
worin R7, R10 und R13 dieselben Bedeutungen haben wie zuvor angegeben, und
das entstandene 7α-substituierte 11α-Hydroxysteroid mit der allgemeinen Formel C dann in einem zweiten mikrobiologischen Verfahrensschritt unter Verwendung eines zweiten Mikroorganismus, ausgewählt aus der Gruppe, umfas- send Bacillus sp., Mycobacterium sp., Nocardia sp. und Pseudomonas sp., unter Bildung des 7α-substituierten Steroids mit der allgemeinen Formel 4,B oxi- diert wird.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der erste Mikroorganismus ausgewählt ist aus der Gruppe, umfassend Aspergillus malignus, Aspergillus melleus, Aspergillus niger, Aspergillus ochraceus, Beauveria bassiana, Gibberella fujikuroi, Gibberella zeae, Glomerella cingulata, Glomerella fusaroides, Gnomonia cingulata, Metarrhizium anisopliae, Nigrospora sphaerica, Rhizopus oryzae, Rhizopus stolonifer und Verticillium dahliae.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 und 4, dadurch gekennzeichnet, daß der zweite Mikroorganismus ausgewählt ist aus der Gruppe, umfassend Bacillus lactimorbus, Bacillus sphaericus, Mycobacterium neoaurum, Mycobacterium smegmatis, Nocardia corallina, Nocardia globerula, Nocardia minima, Nocardia restrictus, Nocardia rubropertincta, Nocardia salmonicolor und Pseudomonas testosteroni.
6. Mikrobiologisches Verfahren zur Herstellung von 7α-substituierten 11α- Hydroxysteroiden mit der allgemeinen Formel 4,B:
Figure imgf000039_0001
4,B
worin
R7 die Gruppierung P-Q ist, wobei P ein Cr bis C -Alkylen und Q einen Wasserstoff, Cr bis C4-Alkyl- oder Cr bis C -Fluoralkyl darstellt und die Gruppierung P-Q über P an das Steroidgrundgerüst gebunden ist,
R 0 für H, CH3 oder CF3 steht, und
R13 Methyl oder Ethyl ist,
bei dem 7α-substituierte Steroide mit der allgemeinen Formel D:
Figure imgf000040_0001
D
worin R7, R10 und R13 dieselben Bedeutungen haben wie zuvor angegeben,
unter Verwendung eines Mikroorganismus, ausgewählt aus der Gruppe, umfassend, Aspergillus sp., Beauveria sp., Curvularia sp., Gibberella sp., Glomerella sp., Gnomonia sp., Haplosporella sp., Helicostylum sp., Nigrospora sp., Rhizopus sp. und Syncephalastrum sp., hydroxyliert werden.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus ausgewählt ist aus der Gruppe, umfassend Aspergillus alliaceus, Aspergillus awamori, Aspergillus fischeri, Aspergillus malignus, Aspergillus melleus, Aspergillus nidualans, Aspergillus niger, Aspergillus ochraceus, Aspergillus variecolor, Beauveria bassiana, Curvularia lunata, Gibberella zeae, Glomerella cingulata, Glomerella fusaroides, Gnomonia cingulata, Haplosporella hesperedica, Helicostylum piriformae, Nigrospora sphaerica, Rhizopus o- ryzae und Syncephalastrum racemosu .
8. Mikrobiologisches Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß R7 für CH3 steht.
9. Mikrobiologisches Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß R 0 für H steht.
10. Mikrobiologisches Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß R13 für CH3 steht.
11. 7α, 17α-substituierte 11 ß-Halogensteroide mit der allgemeinen Formel 8,10,12:
Figure imgf000041_0001
8,10,12
worin
U-V-W-X-Y-Z für eine der Ringstrukturen C1-C2-C3-C4=C5-C10, C1-C2-C3-C -C5=C10 oder C1-C2-C3-C4-C5-C10 steht, wobei in diesem Fall eine Oxogruppe (=0) an W (=C3) gebunden ist, oder für die Ringstruktur C1=C2-C3=C4-C5=C6, wobei in diesem Falle der Rest OR3 an W (= C3) gebunden ist,
R3 für H, C bis C4-Alkyl, Cr bis C -Alkanoyl oder einen cyclischen C3- bis C7-Ether mit dem O-Atom des OR3-Rests steht, R7 die Gruppierung P-Q ist, wobei
P ein C bis C4-Alkylen und Q einen Wasserstoff, C bis C4-Alkyl- oder C bis C -Fluoralkyl darstellt und die Gruppierung P-Q über P an das Steroidgrundgerüst gebunden ist, R10 α- oder ß-ständig sein kann und für H, CH3 oder CF3 steht und nur dann vorhanden ist, wenn X-Y-Z nicht C4-C5=C10 ist, R11 ein Halogen ist, R13 Methyl oder Ethyl ist, R17 für H, Cr bis C18-Alkyl, alicyclisches C bis C18-Alkyl, C bis Cι8-Al- kenyl, alicyclisches Cr bis Cia-Alkenyl, d- bis Cι8-Alkinyl, Cr bis C-ι8- Alkylaryl, d- bis C8-Alkylennitril oder für die Gruppierung P-Q steht, wobei die Gruppierung P-Q die vorgenannte Bedeutung hat, R17' für H, Cr bis C18-Alkyl, alicyclisches d- bis C18-Alkyl, Cr bis Cι8-Al- kenyl, alicyclisches Cr bis Cι8-Alkenyl, Cr bis Cι8-Alkinyl oder Cr bis
Cis-Alkylaryl steht, wobei R17' auch über eine Ketogruppe an die 17ß- Oxygruppe gebunden sein kann, und wobei R17' auch zusätzlich mit einer oder mehreren Gruppen NR18R19 oder einer oder mehreren Gruppen SOxR20 substituiert sein kann, wobei x = 0, 1 oder 2 und R18, R19 und R20 jeweils unabhängig voneinander dieselbe Bedeutung wie R17 haben können.
sowie deren pharmazeutisch verträgliche Additionssalze, Ester und Amide.
12. 7α, 17α-substituierte 11 ß-Halogensteroide nach Anspruch 11 , dadurch gekennzeichnet, daß U-V-W-X-Y-Z für die Ringstruktur C1-C2-C3-C4=C5-C10 oder C -C2-C3-C4-C5=C10 oder C1=C2-C3=C4-C5=C10 steht.
13. 7α,17α-substituierte 11 ß-Halogensteroide nach einem der Ansprüche 11 und 12, dadurch gekennzeichnet, daß R1 für H steht.
14. 7α,17α-substituierte 11 ß-Halogensteroide nach einem der Ansprüche 11 bis
13, dadurch gekennzeichnet, daß R7 für CH3 steht.
15. 7α,17α-substituierte 11 ß-Halogensteroide nach einem der Ansprüche 11 bis
14, dadurch gekennzeichnet, daß R11 für Fluor steht.
16. 7α,17α-substituierte 11 ß-Halogensteroide nach einem der Ansprüche 11 bis
15, dadurch gekennzeichnet, daß R13 für CH3 steht.
17. 7α,17α-substituierte 11 ß-Halogensteroide nach einem der Ansprüche 11 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß R17 für H, CH3) Cr bis Cι8-Alkinyl, CH2CN oder CF3 steht.
18. 7α,17α-substituierte 11 ß-Halogensteroide nach einem der Ansprüche 11 bis
17, dadurch gekennzeichnet, daß R 17 Ethinyl ist
19. 7α,17α-substituierte 11 ß-Halogensteroide nach einem der Ansprüche 11 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß R17' für H steht.
20. 7α,17α-substituierte 11 ß-Halogensteroide nach einem der Ansprüche 11 bis 19, nämlich
17α-Ethinyl-11 ß-fluor-17ß-hydroxy-7α-methylestr-4-en-3-on 17α-Ethinyl-11 ß-f luor-17ß-hydroxy-7α-methylestr-5(10)-en-3-on 17α-Ethinyl-11 ß-fluor-7α-methylestra-1 ,3,5(10)-trien-3,17ß-diol.
21. 7α-substituierte 11 ß-Halogenestra-1 ,3,5(10)-triene mit der allgemeinen Formel 6:
Figure imgf000043_0001
worin
R3 für H, d- bis C4-Alkyl, Cr bis C -Alkanoyl oder einen cyclischen C3- bis C7-Ether mit dem O-Atom des OR3-Rests steht, R7 die Gruppierung P-Q ist, wobei P ein Cr bis C -Alkylen und Q einen Wasserstoff, Cr bis C -Alkyl- oder Cr bis C4-Fluoralkyl darstellt und die Gruppierung P-Q über P an das Steroidgrundgerüst gebunden ist, R11 ein Halogen ist; R13 Methyl oder Ethyl ist.
sowie deren pharmazeutisch verträgliche Additionssalze, Ester und Amide.
22. 7α-substituierte 11ß-Halogenestra-1 ,3,5(10)-triene nach Anspruch 21 , näm- lieh
. 11 ß-Fluor-3-hydroxy-7α-methylestra-1 ,3,5(10)-trien-17-on.
23. Verfahren zur Herstellung von 7α,17α-substituierten 11ß-Halogensteroiden mit der allgemeinen Formel 10 nach einem der Ansprüche 11 bis 20, in denen
U-V-W-X-Y-Z für die Ringstruktur C1-C2-C3-C4=C5-C10 steht, mit folgenden Verfahrensschritten:
- Nukleophile Substitution in einem 7α-substituierten 11 α-Hydroxysteroid mit der allgemeinen Formel 4,B in 11 -Stellung mit einem Halodehydroxy- lierungsreagens;
- Umsetzen des dabei entstandenen 7α-substituierten 11 ß-Halogenste- roids mit einem Alkylierungsmittel selektiv am C17-Atom des Ringgerüsts zu dem 7α,17α-substituierten 11 ß-Halogensteroid mit der allgemeinen Formel 10.
24. Verfahren zur Herstellung von 7α,17α-substituierten 11 ß-Halogensteroiden mit der allgemeinen Formel 12 nach einem der Ansprüche 11 bis 20, in denen U-V-W-X-Y-Z für die Ringstruktur C1-C2-C3-C4-C5=C10 steht, mit folgenden Verfahrensschritten: - Nukleophile Substitution in einem 7α-substituierten 11α-Hydroxysteroid mit der allgemeinen Formel 4,B in 11 -Stellung mit einem Halodehydroxy- lierungsreagens,
- Umsetzen des dabei entstandenen 7α-substituierten 11 ß-Halogenste- roids mit einem Alkylierungsmittel selektiv am C17-Atom des Ringgerüsts zu dem 7α,17α-substituierten 11 ß-Halogensteroid mit der allgemeinen Formel 10,
- Isomerisieren des 7α, 17α-substituierten 11 ß-Halogensteroids mit der allgemeinen Formel 10 zu dem entsprechenden Isomer mit der allgemei- nen Formel 12, bei dem
U-V-W-X-Y-Z für die Ringstruktur C1-C2-C3-C4-C5=C10 steht.
25. Verfahren zur Herstellung von 7α,17α-substituierten 11 ß-Halogensteroiden mit der allgemeinen Formel 8 nach einem der Ansprüche 11 bis 20, in denen U-V-W-X-Y-Z für die Ringstruktur C1=C2-C3=C4-C5=C6 steht, mit folgenden Verfahrensschritten:
- Nukleophile Substitution in einem 7α-substituierten 11α-Hydroxysteroid mit der allgemeinen Formel 4,B in 11 -Stellung mit einem Halodehydroxy- lierungsreagens, - Oxidieren des dabei entstandenen 7α-substituierten 11 ß-Halogensteroids zum 7α-substituierten Estra-1 ,3,5(10)-trien mit der allgemeinen Formel 6 nach einem der Ansprüche 17 und 18;
- Umsetzen des 7α-substituierten Estra-1 ,3,5(10)-triens mit der allgemeinen Formel 6 mit einem Alkylierungsmittel selektiv am C17-Atom des Ringgerüsts zu dem 7α,17α-substituierten 11 ß-Halogensteroid mit der allgemeinen Formel 8.
26. Verwendung der 7α,17α-substituierten 11 ß-Halogensteroide mit der allgemeinen Formel 8,10,12 nach einem der Ansprüche 11 bis 20 zur Herstellung von Arzneimitteln.
27. Pharmazeutische Präparate, enthaltend mindestens ein 7α,17α-substituier- tes 11 ß-Halogensteroid mit der allgemeinen Formel 8,10,12 nach einem der Ansprüche 11 bis 20 sowie mindestens einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
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