CN100339486C - 制备7α－被取代的11α－羟基甾族化合物的微生物方法 - Google Patents

制备7α－被取代的11α－羟基甾族化合物的微生物方法 Download PDF

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Abstract

一种新型的制备用于制备通式(8、10、12)化合物的前体物的方法。在该合成中，用微生物反应制备通式4，B的化合物。基团R7、R10、R11、R13、R17和R17′和U-V-W-X-Y-Z的含义如权利要求书中所述。

Description

制备7α-被取代的11α-羟基甾族化合物的微生物方法
技术领域
本发明涉及制备7α-被取代的11α-羟基甾族化合物的微生物方法及可由其制备的7α，17α-被取代的11β-卤素甾族化合物，后者化合物的制备方法及其应用以及包含这些化合物的药物制剂。此外，本发明涉及其他7α-被取代的11β-卤素甾族化合物，即可由7α-被取代的11α-羟基甾族化合物得到的7α-被取代的雌-1，3，5(10)-三烯。
背景技术
雄激素、特别是睾酮被用于治疗男性更年期症状和用于男性性器官发育以及男性节育。此外，这些激素也具有可促进例如肌肉生长的部分合成代谢活性成分。
男性更年期的特征为年龄相关的内源性雄激素生成减少，因此对其进行激素替代治疗(HRT：激素替代治疗)。
除精子发生的减少外，服用LH-RH用于男性节育还导致释放LH以及睾酮水平和性欲的下降，这些作用通过服用睾酮药物抵消(D.E.Cummings等，“Prostate-Sparing Effects of the Potent Androgen 7α-Methyl-19-Nortestosterone：A Potential Alternative to Testosterone forAndrogen Replacement and Male Contraception.”Journal of ClinicalEndocrinology and Metabolism，Vol.83，No.12，pages 4212-4219(1998))。
服用雄激素和孕激素活性成分进行联合治疗可用于控制男性生育力(例如参见WO 01/60376 A及其所引用文献)。
就使用睾酮进行治疗而言，据发现副作用由于基质细胞和腺体数目的增加而发展为特别是前列腺肥大(BPH：良性前列腺增生)。在孕酮的受5α-还原酶调节的代谢中，形成二氢孕酮(DHT)，其又可导致例如BPH的发生(Cummings等，同上；WO 99/13883 A1)。因此，在临床实践中通过抑制5α-还原酶来治疗BPH(非那雄胺)。
雄激素性甾族化合物睾酮在人体内的迅速代谢进一步不仅导致有害的DHT生成，还使得必须口服更高的剂量以达到所希望的睾酮疗效水平。因此必须使用其他可选择的调剂方式如肌肉注射或大贴片(largepatch)等。
为在上述适应症领域中替代睾酮，提出了7α-甲基-19-去甲睾酮(MeNT)，其一方面由于与雄激素受体的结合力更高因而具有比睾酮更高的生物学效果，另一方面由于7α-甲基的空间位阻而可能阻碍5α-还原酶的代谢(Cummings等，同上，WO 99/13883 A1，WO 99/13812 A1，US-A-5,342,834)。
在睾酮的代谢期间，特别是在脑、肝脏和脂肪组织中，该化合物的一小部分还通过甾体系统A环的芳香化反应生成雌二醇。就睾酮和其代谢产物的总体功能而言，雌二醇是性别特异性行为和促性腺激素调节的本质原因。因此，其功能正如睾酮之于成年男性的功能一样，被认为是有益的(Cummings等，同上)。
然而，发现睾酮的药代动力学并不令人满意。特别是在口服给药时，睾酮迅即被排泄，使得由此制备的药物的有效性及作用的延续不尽人意。因此合成了其他的睾酮衍生物。这种衍生物记载于例如US-A-5,952,319中，具体为19去甲睾酮的7α，11β-二甲基衍生物，即7α，11β-二甲基-17β-羟基雌-4-烯-3-酮、7α，11β-二甲基-17β-庚酰氧基雌-4-烯-3-酮、7α，11β-二甲基-17β-[[(2-环戊基乙基)-羰基]-氧基]-雌-4-烯-3-酮、7α，11β-二甲基-17β-(苯基乙酰氧基)-雌-4-烯-3-酮以及7α，11β-二甲基-17β-[[(反式-4-[正丁基]环己基)-羰基]-氧基]-雌-4-烯-3-酮。
上述7α，11β-二甲基衍生物如MeNT具有前述优点，包括药代动力学性质得以改善，例如其有效性和作用的延续与睾酮相比得以改善。然而，这些衍生物仅可通过昂贵的合成方法制备。
合成甾族化合物的微生物方法记载于EP 0 900 283B1。该文指出雌-4-烯-3，17-二酮和坎利酮可使用选自下组的微生物转化为对应的11α-羟基类似物：黑曲霉(Aspergillus nigricans)、无根根霉(Rhizopus arrhizus)和盘多毛孢属(Pestelotia)菌株。然而，其说明书的介绍中还参考了Shibahara等，Biochim.Biophys.Acta，202(1970)，172-179，该文报道甾族化合物中的微生物11α-羟基化反应可能是无法预知的。
因此，本发明所基于的问题为找到对5α-还原酶不敏感、药代动力学性质得以改善且特别容易制备的睾酮衍生物。因此，本发明一个非常有意义的方面包括找到其中初始产物容易生产的方法。
本发明所基于的问题通过以下方面解决的：如权利要求1、3和6所述的微生物学制备7α-被取代的甾族化合物的方法及如权利要求11所述的7α，17α-被取代的11β-卤素甾族化合物、如权利要求23、24和25所述的制备7α，17α-被取代的11β-卤素甾族化合物的方法、如权利要求26所述的7α，17α-被取代的11β-卤素甾族化合物的应用、如权利要求27所述的含有这些7α，17α-被取代的11β-卤素甾族化合物的药物制剂以及如权利要求21所述的7α-被取代的11β-卤雌-1，3，5(10)-三烯。所要求保护的主题的优选的实施方式记载于从属权利要求中。
定义
下述定义涉及本说明书和权利要求书以及所附图I的各个部分：
所有的原子团、基团或其他结构单元在各种情况下可在其所表示的含义范围内彼此独立地变化。
所有的烷基、亚烷基、烯基、亚烯基、炔基以及亚炔基基团可为直链或支链。例如，丙烯基可由下述化学结构之一表示：-CH＝C-CH3、-CH2-C＝CH2或-C(CH3)＝CH2。因此，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基正丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、叔戊基、新戊基、正己基、1-甲基正戊基、2-甲基正戊基、3-甲基正戊基、4-甲基正戊基、1-乙基正丁基、2-乙基正丁基等都属于C1-C18烷基。
脂环族烷基为环烷基或者为被一个或者若干烷基取代的环烷基，其直接通过环烷基环或通过烷基之一键合。
与此相同，脂环族烯基为环烯基或者为被的一个或更多个烯基或者一个或更多个烷基取代的环烯基或环烷基，其直接通过环烯基环或通过烯基或任选的烷基之一键合，其中，该脂环族烯基至少包含一个双键。
另一方面，芳基可为苯基，以及1-萘基或2-萘基。原则上，芳基还包括杂芳基，特别是2-、3-和4-吡啶基、2-和3-呋喃基、2-和3-噻吩基、2-和3-吡咯基、2-、4-和5-咪唑基、哒嗪基、2-、4-和5-嘧啶基以及3-和4-哒嗪基。
卤素是氟、氯、溴或碘。
药物学相容性加成盐为对应化合物与无机或有机酸形成的盐，所述酸例如是氢氯酸、氢溴酸、氢碘酸、乙酸、柠檬酸、草酸、酒石酸和甲磺酸。特别是同琥珀酸成酯。
标记R的上标数字，例如R13是指其在甾体环骨架上的位置，甾体环骨架上的碳原子根据IUPAC命名法进行排号。标记C上的上标例如C10是指甾体环骨架中各个碳原子的位置。
发明内容
使用新型的微生物方法制备通式4，B的7α-被取代的11α-羟基甾族化合物：
Figure C0381769600081
其中
R7是P-Q基，而
P为C1-C4亚烷基，Q为氢、C1-C4烷基或C1-C4氟代烷基(被部分或完全氟化的烷基)，且P-Q基通过P键合于甾体骨架之上，
R10代表H、CH3或CF3，以及
R13为甲基或乙基。
在制备这些物质的第一种方法实施方案中，在一工艺步骤中羟基化和氧化适宜的通式3，A的7α-被取代的甾族化合物：
Figure C0381769600082
其中，R7、R10和R13具有同通式4，B中所述相同的含义，所述的羟基化和氧化使用选自以下组中的微生物：曲霉(Aspergillus sp.)、白僵菌(Beauveria sp.)、小丛壳(Glomerella sp.)、日规壳(Gnomonia sp.)、大单孢(Haplosporella sp.)以及根霉(Rhizopus sp.)。具体优选的为泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、费希氏曲霉(Aspergillus fischeri)、有毒曲霉(Aspergillus malignus)、黑色曲霉(Aspergillus niger)、蚕白僵菌(Beauveria bassiana)、苹果枯腐病菌(Glomerella cingulata)、Gnomoniacingulata、Haplosporella hesperedica以及葡枝根霉(Rhizopus stolonifer)，其中特别优选使用的是泡盛曲霉(CBS)、费希氏曲霉(ATCC1020)、有毒曲霉(IMI 16061)、黑色曲霉(ATCC 9142)、蚕白僵菌(ATCC 7159)、苹果枯腐病菌(CBS 15226，CBS 23849，CBS 98069，ATCC 56596，ATCC 64682，IFO 6425)、Gnomonia cingulata(CBS 15226)、Haplosporella hesperedica(CBS 20837)以及葡枝根霉(ATCC 15441)。
作为选择，该微生物学制备方法还可分两步实施，其中羟基化反应和氧化反应在连续的反应步骤中发生。反应的过程可通过反应时间控制：通过中断反应，例如在一段反应时间之后，可得到已羟基化但仍未氧化的类型。因此，两种工艺步骤可独自进行或混合发酵。
为此，在使用第一微生物的第一微生物学工艺步骤中所述通式3，A的化合物可被11-位羟基化，该第一微生物选自以下组中：曲霉(Aspergillus sp.)、白僵菌(Beauveria sp.)、赤霉(Gibberella sp.)、小丛壳(Glomerella sp.)、日规壳(Gnomonia sp.)、绿僵菌(Metarrhizium sp.)、黑孔菌(Nigrospora sp.)、根霉(Rhizopus sp.)以及轮枝孢(Verticilliumsp.)，其中生成11α-位具有羟基的7α-被取代的甾族化合物。该化合物具有通式C：
Figure C0381769600101
其中，R7、R10和R13具有同通式4，B中所述相同的含义。具体使用的为有毒曲霉(Aspergillus malignus)、蜂蜜曲霉(Aspergillus melleus)、黑色曲霉(Aspergillus niger)、赭色曲霉(Aspergillus ochraceus)、蚕白僵菌(Beauveria bassiana)、稻恶苗赤霉(Gibberella fujikuroi)、玉蜀黍赤霉(Gibberella zeae)、苹果枯腐病菌(Glomerella cingulata)、Glomerellafusaroides、Gnomonia cingulata、金龟子绿僵菌(Metarrhizium anisopliae)、球形黑孢(Nigrospora sphaerica)、米根霉(Rhizopus oryzae)、葡枝根霉(Rhizopus stolonifer)以及大丽花轮枝孢(Verticillium dahliae)。就此而论，特别优选用于羟基化的为有毒曲霉(IMI 16061)、蜂蜜曲霉(CBS)、黑色曲霉(ATCC 11394)、赭色曲霉(NRRL 405，CBS 13252，ATCC 46504)、蚕白僵菌(ATCC 7159，IFO 5838，ATCC 13144，IFO 4848，CBS 11025，CBS12736)、稻恶苗赤霉(ATCC 14842)、玉蜀黍赤霉(CBS 4474)、苹果枯腐病菌(ATCC 10534，CBS 23849，CBS 23749，ATCC 16646，ATCC 16052，IFO6459，IFO 6470，CBS 98069，IFO 7478，IFO 5257，ATCC 64682，ATCC15470)、Glomerella fusaroides(ATCC 9552)、Gnomonia cingulata(CBS15226)、金龟子绿僵菌(IFO 5940)、球形黑孢(ATCC 12772)、米根霉(ATCC4858，ATCC 34102，ATCC 34102)、葡枝根霉(ATCC 6227b，ATCC 15441)以及大丽花轮枝孢(ATCC 11405)。
中间产物C随后在第二微生物学工艺步骤中通过使用第二微生物被氧化生成通式4，B的7α-被取代的11α-羟基甾族化合物，该第二微生物选自以下组中：芽孢杆菌(Bacillus sp.)、分枝杆菌(Mycobacterium sp.)、诺卡氏菌(Nocardia sp.)以及假单孢菌(Pseudomonas sp.)。具体使用的为乳病芽孢杆菌(Bacillus lactimorbus)、球形芽孢杆菌(Bacillussphaericus)、Mycobacterium neoaurum、耻垢分枝杆菌(Mycobacteriumsmegmatis)、珊瑚色诺卡氏菌(Nocardia corallina)、小球诺卡氏菌(Nocardia globerula)、最小诺卡氏菌(Nocardia minima)、限定诺卡氏菌(Nocardia restrictus)、深红色诺卡氏菌(Nocardia rubropertincta)、鲑色诺卡氏菌(Nocardia salmonicolor)以及睾丸酮假单孢菌(Pseudomonastestosteroni)。其中特别优选使用的为乳病芽孢杆菌(ATCC 245)、球形芽孢杆菌(ATCC 7055)、Mycobacterium neoaurum(ATCC 9626，NRRLB-3683，NRRL B-3805)、耻垢分枝杆菌(ATCC 14468)、珊瑚色诺卡氏菌(ATCC 31338)、小球诺卡氏菌(ATCC 9356)、最小诺卡氏菌(ATCC 19150)、限定诺卡氏菌(NCIB 10027)、深红色诺卡氏菌(ATCC 14352)、鲑色诺卡氏菌(ATCC 19149)以及睾丸酮假单孢菌(ATCC 11996)。
在第二种方法实施方案中，通式4，B的化合物可在微生物学反应中由通式D的7α-被取代的甾族化合物制备：
其中，R7、R10和R13具有同通式4，B的化合物中所述相同的含义。该反应使用选自下组的微生物进行：曲霉(Aspergillus sp.)、白僵菌(Beauveriasp.)、弯孢(Curvularia sp.)、赤霉(Gibberella sp.)、小丛壳(Glomerellasp.)、日规壳(Gnomonia sp.)、大单孢(Haplosporella sp.)、卷旋枝霉(Helicostylum sp.)、黑孢(Nigrospora sp.)、根霉(Rhizopus sp.)以及共头霉(Syncephalastrum sp.)。其中甾体骨架的11α-位被羟基化从而生成通式4，B的7α-被取代的11α-羟基甾族化合物。优选为洋葱曲霉(Aspergillus alliaceus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、费希氏曲霉(Aspergillus fischeri)、有毒曲霉(Aspergillus malignus)、蜂蜜曲霉(Aspergillus melleus)、构巢曲霉(Aspergillus nidualans)、黑色曲霉(Aspergillus niger)、赭色曲霉(Aspergillus ochraceus)、杂色曲霉(Aspergillus variecolor)、蚕白僵菌(Beauveria bassiana)、新月弯孢(Curvularia lunata)、玉蜀黍赤霉(Gibberella zeae)、苹果枯腐病菌(Glomerella cingulata)、Glomerella fusaroides、Gnomonia cingulata、Haplosporella hesperedica、梨形卷旋枝霉(Helicostylum piriformae)、球形黑孢(Nigrospora sphaerica)、米根霉(Rhizopus oryzae)以及总状共头霉(Syncephalastrum racemosum)，其中特别优选使用洋葱曲霉(ATCC10060)、泡盛曲霉(CBS)、费希氏曲霉(ATCC 1020)、有毒曲霉(IMI 16061)、蜂蜜曲霉(CBS)、构巢曲霉(ATCC 11267)、黑色曲霉(ATCC 9142，ATCC11394)、赭色曲霉(NRRL 405，ATCC 13252，ATCC 46504)、杂色曲霉(ATCC 10067)、蚕白僵菌(IFO 5838，ATCC 13144，IFO 4848，CBS 11025，CBS 12736，ATCC 7159)、新月弯孢(IX3)、玉蜀黍赤霉(CBS 4474)、苹果枯腐病菌(ATCC 10534，CBS 23849，CBS 23749，ATCC 16646，IFO 6459，IFO 6425，IFO 6470，ATCC 15093，ATCC 10529，IFO 5257，ATCC 56596，ATCC 64682)、Glomerella fusaroides(ATCC 9552)、Gnomonia cingulata(CBS 15226)、Haplosporella hesperedica(CBS 20837)、梨形卷旋枝霉(ATCC 8992)、球形黑孢(ATCC 12772)、米根霉(ATCC 4858)以及总状共头霉(IFO 4827)。
特别适宜的是生成通式4，B的7α-被取代的11α-羟基甾族化合物的方法，其中彼此独立地R7代表CH3和/或R10代表H和/或R13代表CH3。
所述方法以普通方式实施。为此，通常首先为菌株制备灭菌营养液，然后将该营养液与菌株培养液接种以培养菌株。然后将该如此制备的预培养物加至可任选由适宜的营养液覆盖的发酵罐中。优选在菌株培养物的生长期之后将起始物质加入至发酵罐中，就此而言为通式3，A的化合物或通式D的化合物，从而可进行本发明的反应。反应结束之后，将混合物质用常规方法纯化分离得到所需的7α-被取代的11α-羟基甾族化合物。
由以此得到的通式4，B化合物，可通过本发明制备方法合成其他的本发明化合物。具体而言为通式8，10，12的7α，17α-被取代的11β-卤代甾族化合物以及他们的药物学相容性的加成盐、酯、酰胺生成优良的活性成分：
Figure C0381769600131
其中
U-V-W-X-Y-Z代表下列环结构之一：C1-C2-C3-C4＝C5-C10、C1-C2-C3-C4-C5＝C10、C1-C2-C3-C4-C5-C10，而在此情况下，氧代基(＝O)被键合至W(＝C3)上，或者代表环结构C1＝C2-C3＝C4-C5＝C10，而在此情况下，OR3被键合至W(＝C3)上，
R3代表H、C1-C4烷基、C1-C4烷酰基或具有OR3基之O原子的C3-C7环醚，
R7为P-Q基，而P为C1-C4亚烷基，Q为氢、C1-C4烷基或C1-C4氟代烷基(被部分或完全氟化的烷基)，且P-Q基通过P键合于甾体骨架之上，
R10可以在α-或β-位，其代表H、CH3或CF3，且仅在X-Y-Z不为C4-C5＝C10时存在，
R11为卤素，
R13为甲基或乙基，
R17代表H、C1-C18烷基、C1-C18脂环族烷基、C1-C18烯基、C1-C18脂环族烯基、C1-C18炔基、C1-C18烷芳基、C1-C8亚烷基腈或代表P-Q基，其中P-Q基具有上述的含义，
R17’代表H、C1-C18烷基、C1-C18脂环族烷基、C1-C18烯基、C1-C18脂环族烯基、C1-C18炔基、C1-C18烷芳基，其中R17’还可通过酮基键合至17β-氧基，且R17’还可另外被一个或更多个NR18R19基或一个或更多个SOxR20取代，其中，x＝0、1或2，且R18、R19和R20在所有情况下彼此独立地具有R17的含义。
这些化合物可通过通式4，B的7α-被取代的11α-羟基甾族化合物由另外的工艺步骤得到，其为具有强雄激素作用而没有上述副作用的有价值的活性成分。这些化合物适用于制备药物、特别是有效的避孕药物和用于激素替代治疗(HRT)的活性成分。
假如R17’另外被NR18R19取代，其可为甲基氨基、二甲基氨基、乙基氨基、二乙基氨基、环己基氨基、二环己基氨基、苯基氨基、二苯基氨基、苄基氨基或二苄基氨基。
特别适合的具有通式8、10、12的7α，17α-被取代的11β-卤素甾族化合物为其中U-V-W-X-Y-Z代表环结构C1-C2-C3-C4＝C5-C10、C1-C2-C3-C4-C5＝C10或C1＝C2-C3＝C4-C5＝C10的化合物。
第一种情况(U-V-W-X-Y-Z代表C1-C2-C3-C4＝C5-C10)为通式10的甾族化合物：
Figure C0381769600151
第二种情况(U-V-W-X-Y-Z代表C1-C2-C3-C4-C5＝C10)为通式12的甾族化合物：
Figure C0381769600152
通式10和12的化合物为雄激素化合物。
第三种情况(U-V-W-X-Y-Z代表C1＝C2-C3＝C4-C5＝C10)为通式8的甾族化合物：
Figure C0381769600161
这些化合物为雌激素(雌激素受体结合化合物)。
在上述三种情况中，R3、R7、R10、R11、R13、R17和R17’具有与通式8、10、12中相应的基团相同的含义。
彼此独立地，优选地，R1代表H和/或R7代表CH3和/或R11代表氟和/或R13代表CH3和/或R17代表H、CH3、特别是乙炔基的C1-C18炔基、CH2CN或CF3和/或R17’代表H。
通式8、10、12的7α，17α-被取代的11β-卤素甾族化合物中特别适于本发明的为：
17α-乙炔基-11β-氟-17β-羟基-7α-甲基雌-4-烯-3-酮(通式10)
17α-乙炔基-11β-氟-17β-羟基-7α-甲基雌-5(10)-烯-3-酮(通式12)
17α-乙炔基-11β-氟-7α-甲基雌-1，3，5(10)-三烯-3，17β-二醇(通式8)
可采用下述方法制备这些化合物：
对于制备其中U-V-W-X-Y-Z代表环结构C1-C2-C3-C4＝C5-C10的具有通式10的7α，17α-被取代的11β-卤素甾族化合物，使用由本发明微生物学制备方法获得的具有通式4，B的7α-被取代的11α-羟基甾族化合物作为起始物质。
在第一步合成中，通过使用卤代去羟基试剂进行亲核取代将这些以此获得的7α-被取代的11α-羟基甾族化合物转化为相应的7α-被取代的11β-卤素甾族化合物5：
Figure C0381769600171
所有通常用于该目的的化合物都可用作卤代去羟基试剂，例如氢氟酸、氢氯酸、氢溴酸或氢碘酸、亚硫酰氯或亚硫酰溴、五氯化磷、磷酰氯、N-氯代琥珀酰亚胺、三苯基膦/四氯化碳、HF/吡啶或二乙基氨基三氟化硫或优选为九氟丁烷磺酰氟(nonaflyl fluoride)/1，5-二氮杂二环[5.4.0]十一碳烯。
然后通过环骨架C17的选择性烷基化由化合物5制备化合物10(参见图1)。可使用普通烷基化试剂用于选择性烷基化，例如格利雅化合物和有机金属化合物，特别是烷基锂化合物。例如乙炔基溴化镁可用作烷基化剂由雌-4-烯-3，17-二酮制备相应的17α-乙炔基-17β-羟基雌-4-烯-3酮。
可使用并异构化通式10的化合物，使Δ4双键异构化为Δ5(10)双键，由此可用于制备其中U-V-W-X-Y-Z代表环结构C1-C2-C3-C4-C5＝C10的具有通式12的7α，17α-被取代的11β-卤素甾族化合物。为保护3-酮基，首先为此目的在3位生成环醚。然后，将Δ4双键异构化为Δ5(10)双键，从而生成具有通式12的7α，17α-被取代的11β-卤素甾族化合物，且保护基再次断裂。
为制备另外的其中U-V-W-X-Y-Z代表环结构C1＝C2-C3＝C4-C5＝C10的具有通式8的7α，17α-被取代的11β-卤素甾族化合物，其工艺如下：
首先，如上所述，通过在亲核取代反应中进行卤去羟基化使用由微生物学羟基化和氧化制得的通式4，B的7α-被取代的11α-羟基甾族化合物制备通式5的相应的11β-卤素甾族化合物。
由前者通过例如铜(II)盐氧化生成通式6的7α-被取代的雌-1，3，5(10)-三烯：
Figure C0381769600181
其中R3、R7、R11和R13的含义如上所述。若R3代表H，则这些化合物可直接合成。若另一个基团替代R3中的H，则相应的醚或酯必须在氧化生成1，3，5(10)-三烯环之后通过已知的方法制得。
由于具有通式6的7α-被取代的11β-卤素雌-1，3，5(10)-三烯以及其药物学相容性的加成盐、酯和酰胺是新的，因此，在本发明中要求作为合成具有通式8的7α，17α-被取代的11β-卤素甾族化合物的中间产物得到保护。
一种特别优选的通式6的7α-被取代的11β-卤素雌-1，3，5(10)-三烯为11β-氟-3-羟基-7α-甲基雌-1，3，5(10)-三烯-17-酮。
本发明通式8的7α，17α-被取代的11β-卤素甾族化合物可以由通式6的7α-被取代的11β-卤素雌-1，3，5(10)-三烯制备，其方法与上述通过选择性氧化环骨架C17制备通式10的方法相同。
此外，通式9的7α-被取代的11β-卤素甾族化合物也可通过由通式3，A或D的微生物学羟基化和氧化制得的通式4，B的物质制备，且所述7α-被取代的11β-卤素甾族化合物也具有雄激素作用：
Figure C0381769600191
其中，R7、R11和R13的含义如上所述。一种特别优选的化合物是11β-氟-17β-羟基-7α-甲基雌-4-烯-3-酮。通式9的化合物以及其药物学相容性的加成盐、酯和酰胺也都具有雄激素作用。
为制备通式9化合物，将雌-4-烯-3，17-二酮5用氢化硼还原为17β-羟基-雌-4-烯-3-酮9。
此外，通式9化合物可被转化为相应的7α-被取代的11β-卤素雌-5(10)-烯：
Figure C0381769600192
其中，R7、R10、R11和R13的含义如在通式8、10、12中所述的相同。为此目的，将通式9的化合物的Δ4双键异构化为Δ5(10)双键。为保护3-酮基，首先为此目的在3-位生成环醚。然后，将Δ4双键异构化为Δ5(10)双键，从而生成7α-被取代的11β-卤素甾族化合物，且保护基再次断裂。
最后，相应的7α-被取代的11β-卤素雌-5(10)-烯可通过将Δ4双键异构化为Δ5(10)双键由通式5化合物转化而成。
Figure C0381769600201
其中，R7、R10、R11和R13的含义如在通式8、10、12中所述的相同。为此目的，将通式5的化合物的Δ4双键异构化为Δ5(10)双键。为保护3-酮基，首先为此目的在3-位生成环醚。然后，将Δ4双键异构化为Δ5(10)双键，从而生成上述的7α-被取代的11β-卤素甾族化合物，且保护基再次断裂。
若3-或17β-位具有相应的羟基，所有上述的化合物可被进一步酯化或醚化。例如，化合物9可被转化为相应的17β-醚或17β-酯。一种优选的化合物是11β-氟-17β-(4-氨磺酰基苯甲酰氧基)-7α-甲基雌-4-烯-3-酮。基本上与R17’所述相同的基团也适合用作C17氧-氧原子上的取代基。
特别地，通式8、10、12的7α，17α-被取代的11β-卤素甾族化合物适用于制备药物。本发明因此涉及上述通式8、10、12化合物在制备药物中的应用以及含有至少一种上述通式8、10、12化合物以及至少一种药物学相容性载体的药物制剂。
本发明通式10、12的7α，17α-被取代的11β-卤素甾族化合物是具有强烈的雄激素作用而没有上述副作用例如刺激前列腺(特别是非良性前列腺增生)的化合物。这些化合物容易合成。据发现，本发明这些通式10或12的化合物不仅可用于男性HRT，并且如果进行充分的测量以充分降低LH、体内生成的睾酮以及FSH(促卵泡激素)的血液浓度，即使在不另外服用其他活性成分的情况下这些化合物也可用作高效男性避孕药。这依赖本发明抑制LH和FSH释放的11β-卤素甾族化合物。LH刺激间质细胞，从而睾酮得以分泌。如果LH的血液浓度在低水平维持，则内源性睾酮的释放也下降。精子发生需要睾酮，而FSH刺激精子细胞。因此有效的精子发生要求FSH和LH血液浓度必须足够高，而足够高的LH血液浓度导致精子发生必须的睾酮的释放。
既然不使用另外的绝育活性成分仅使用7α，17α-被取代的11β-卤素甾族化合物进行治疗已可提供高效的男性避孕法，可大幅简化适用于此目的的药物的服用，且应用的成本可由此显著降低。
本发明的7α，17α-被取代的11β-卤素甾族化合物还可与孕激素联合应用以控制男性生育力。
并且，本发明的7α，17α-被取代的11β-卤素甾族化合物可有效抑制5α-还原酶和甾体-11-羟基化酶[CYP11B(P450c11)，G.Zhang，W.L.Miller，Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism，Vol.81，pages3254-3256(1996)]，从而例如可选择性避免对前列腺的刺激，且这些化合物具有经改善的药代动力学性质。11-羟基化酶的抑制减少雄激素化合物的灭活，并导致其自人类身体的分泌减少。因此，这些化合物的有效性以及作用的持续相对于已知化合物而言有所改善，特别是在口服给药后。
由于上述原因，这些化合物降低了对5α-还原酶的趋向性且同时获得芳化生成雌激素甾族化合物的能力以及对血清脂质和中枢神经具有有益作用，特别适用于节育以及雄激素替代治疗。
对本发明通式10和12化合物进行精囊试验以测定其雄激素作用并观察其不出现上述副作用。进行子宫生长试验检测本发明通式8化合物的雌激素作用。
本发明通式10或12的7α，17α-被取代的11β-卤素甾族化合物或者本发明包含这些化合物的药物制剂极其适于治疗非不育(non-sterile)男性患者，基本上也适于雄性哺乳动物。男性避孕的应用仅使男性患者暂时不育。在本发明的活性成分或药物制剂应用结束之后，又重新回到原来的状态，从而男性患者恢复生殖能力，且精子发生重新回到原有程度。为了在所希望的期间稳定保持暂时不育的状况，应当连续服用该活性成分或制剂，其中视给药形式而言，该给药每日或以更短或更长的间隔周期性重复进行。在该活性成分或制剂一次或重复给药结束之后，男性患者的非不育状况任选地并不立刻恢复而是仅缓慢地恢复，其中该过程必需的时间间隔取决于各种因素，例如剂量、患者的身体状态以及其他药物并行给药。
如果给药的目的包括避孕，7α，17α-被取代的11β-卤素甾族化合物的剂量必须设定为高，从而在各种情况下LH和FSH的血液浓度最高为2.5I.E./ml(I.E.：国际单位)，特别是最多1.0I.E./ml，且睾酮的血液浓度最高为10nmol/l，特别是最多3nmol/l。
若本发明的7α，17α-被取代的11β-卤素甾族化合物用于HRT而无需达到避孕效果，设置其剂量为低。就此而言，试图达到可使LH和FSH的血液浓度各自大于2.5I.E./ml且睾酮的血液浓度大于10nmol/l的效果水平。
本发明通式10或12的7α，17α-被取代的11β-卤素甾族化合物用于调节LH、FSH和睾酮血液浓度所需的剂量取决于许多因素，因而必须以给药特异性模式确定。首先，该剂量自然地依赖于治疗的种类。如果该化合物是被用于男性避孕，则必须提供比用于HRT情况下显著增高的剂量。该剂量还取决于7α，17α-被取代的11β-卤素甾族化合物的种类及其生物利用度。给药方式对于给药量也十分重要。最后，该剂量还取决于要治疗的患者的身体素质或其他因素，例如是否并行服用其他药物。
这些化合物可经口和非胃肠道例如ip(腹腔内)、iv(静脉内)、im(肌内)或皮内给药。它们还可植入组织内。如果给药有效量，所给药的这些化合物的量可在宽范围内变动。根据所要治疗的疾病以及制剂的类型，所给药化合物的用量可在宽范围内变化。在人体内，每日剂量为0.1到100mg。人体内优选的每日剂量为0.1到10mg。给药间期取决于所要达到的目的。
可应用的剂型为胶囊剂、丸剂、片剂、包衣片、霜剂、软膏、洗剂、液体制剂如糖浆剂、凝胶、可注射液体例如ip、iv、im或皮内注射等。由此，视各种类型而定，各种剂型逐步或在短时间内将全部剂量的本发明化合物释放。
对于口服给药，作为药物制剂应用的是胶囊剂、丸剂、片剂、包衣片剂和液体制剂或其他已知的口服剂型。在这种情况下，药物可以一定方式配制，使得其或者能够在短时间内释放活性成分并将其传递至体内，或者使其具有储库效应，从而得以长时间、缓缓向身体饲以活性成分。除7α，17α-被取代的11β-卤素甾族化合物外，该剂量单位可含有一种或更多种药物相容性载体，例如调节药物流变学性质的物质、表面活性剂、增溶剂、微囊、微粒、颗粒、稀释剂、粘合剂如淀粉、糖、山梨醇和明胶，以及填充剂如硅酸和滑石粉、润滑剂、染料、香料以及其他物质。
特别地，本发明的7α，17α-被取代的11β-卤素甾族化合物还可被配制为用于口服的溶液的形式，其除活性11β-卤素甾族化合物外还含有下列成分：药物相容性油和/或药物相容性的亲脂性表面活性剂和/或药物相容性亲水性表面活性剂和/或药物相容性水互溶性溶剂。就此而言，可参考WO-A-97/21440。
为使甾族化合物达到更好的生物利用度，这些化合物还可配制成环糊精包合物。用于此目的时，将这些化合物同α-、β-或γ-环糊精或其衍生物反应。
若应用可局部使用的霜剂、软膏、洗剂和液体，它们的组成必须使得本发明的化合物能够以足够的量饲于机体。在这些剂型中，含有例如调节药物流变学性质的物质、表面活性剂、防腐剂、增溶剂、稀释剂增加本发明化合物通过皮肤的透过能力的物质、染料、香料、以及如调节液(conditioner)和保湿液的护肤剂的辅料。其他活性成分也可同本发明甾族化合物一同包含于该药物之内。
用于非胃肠道给药时，该活性成分可溶解或悬浮于生理相容性的稀释剂中。作为稀释剂，通常应用的是含有或不含增溶剂、表面活性剂、助悬剂或乳化剂的油。所使用的油的实例为橄榄油、花生油、棉籽油、大豆油、蓖麻油和芝麻油。为配制可注射制剂，可使用本发明的化合物在其中可溶解或乳化的任何液态载体。这些液体通常含有调节粘度的物质、表面活性剂、防腐剂、增溶剂、稀释剂以及其他添加剂，通过这些添加剂使该溶液等渗。其他活性成分也可与7α，17α-被取代的11β-卤素甾族化合物一同给药。
本发明的11β-卤素甾族化合物可以例如经皮的储库式注射剂或植入制剂的形式给药，其可以一定形式配制，使得活性成分可缓慢释放。就此而言，可使用已知技术，例如能够溶解或同膜一同起作用的储库。植入剂可含有惰性材料，例如生物可降解的聚合物或合成硅氧烷例如硅橡胶。本发明的11β-卤素甾族化合物还可包含于例如贴片中用于经皮给药。
下述实施例用于更详细地解释本发明。
实施例
A.微生物方法合成
11α-羟基-7α-甲基-雌-4-烯-3，17-二酮(化合物4，B)
实施例1
Figure C0381769600251
将Gnomonia cingulata菌株(CBS 15226)的斜面杆菌培养物接种于装有含3重量％葡萄糖、1重量％玉米浆、0.2重量％NaNO3、0.1重量％KH2PO4、0.2重量％K2HPO4、0.05重量％KCl、0.05重量％MgSO4·7H2O以及0.002重量％FeSO4·7H2O(pH 6.0)的1000ml在高压灭菌器中121℃灭菌30分钟的营养液的2升Erlenmeyer烧瓶中，在28℃下于165rpm的旋转振荡器中振摇72小时。如此预培养后，再接种于覆以19升与如上所述的预培养物最终组分相同的无菌培养基的20升发酵罐中。此外，另外再加入1.0ml硅油和1.0ml的synperonic(乙氧基化氧代醇，oxoalcoholethoxylate)以减少起泡。于0.7bar的超压、28℃温度下经过为期12小时的生长期后，以20升/分钟通气、250rpm搅拌并加入4.0g 17β-羟基-7α-甲基雌-4-烯-3-酮的40ml DMF溶液。继续搅拌并通气。135小时后，收获培养肉汤，用10升甲基异丙基酮萃取12小时，然后用5升甲基异丙基酮萃取5小时。合并有机相并蒸干。用己烷洗除硅油。以己烷和乙酸乙酯成梯度的硅胶色谱法纯化，分离得到1.64g(39％)的11α-羟基-7α-甲基雌-4-烯-3，17-二酮。
实施例2
Figure C0381769600261
将Glomerella cingulata菌株(IFO 6425)的斜面杆菌培养物接种于装有含3重量％葡萄糖、1重量％玉米浆、0.2重量％NaNO3、0.1重量％KH2PO4、0.2重量％K2HPO4、0.05重量％KCl、0.05重量％MgSO4·7H2O以及0.002重量％FeSO4·7H2O(pH 6.0)的1000ml在高压灭菌器中121℃灭菌30分钟的营养液的2升Erlenmeyer烧瓶中，在28℃下于165rpm的旋转振荡器中振摇72小时。如此预培养后，再接种于覆以19升与如上所述的预培养物最终组分相同的无菌培养基的20升发酵罐中。此外，另外再加入1.0ml硅油和1.0ml的synperonic以减少起泡。于0.7bar的超压、28℃温度下经过为期12小时的生长期后，以10升/分钟通气、350rpm搅拌并加入2.0g 17β-羟基-7α-甲基雌-4-烯-3-酮的30ml DMF溶液。继续搅拌并通气。19小时后，收获培养肉汤，用20升甲基异丙基酮萃取16小时，然后用20升甲基异丙基酮萃取23小时。合并有机相并蒸干。将残渣大部分溶解于甲醇中。滤除硅油。蒸发浓缩，以二氯甲烷和丙酮成梯度的硅胶色谱法纯化，分离得到1.55g(73％)的11α，17β-二羟基-7α-甲基雌-4-烯-3-酮。从丙酮/二异丙基醚中重结晶后，分离得到熔点为163℃、[α]D＝-16°(CHCl3，c＝0.501)的白色晶体827mg(39％)。
将源自Bacillus sphaericus菌株(ATCC 7055)培养物的四个低温层(cryosphere)接种于装有含0.5重量％葡萄糖、0.5重量％细菌用酵母抽提物、0.1重量％蛋白胨以及0.2重量％玉米浆(pH 7.5)的500ml在高压灭菌器中121℃灭菌30分钟的营养液的2升Erlenmeyer烧瓶中，在28℃下于165rpm的旋转振荡器中振摇24小时。如此预培养后，再向含有500ml与如上所述的预培养物最终组分相同的无菌培养基的4个2升发酵罐中每个接种10％的该培养肉汤。于165rpm的旋转振荡器中、28℃温度下经过为期4小时的生长期后，向各烧瓶中加入50mg的11α，17β-二羟基-7α-甲基雌-4-烯-3-酮在2.5ml DMF中的溶液。继续搅拌48小时。合并的培养肉汤用2升的甲基异丁基酮萃取2次。将合并的有机相用硫酸钠干燥并蒸干。就此而言，得到630mg油状晶体残留物。从丙酮/二异丙基醚中重结晶后，分离得到103mg(49.2％)熔点为189℃、[α]D＝+40.4°(CHCl3，c＝0.529)的黄色晶体(直接结晶而不经过前述色谱纯化)。
实施例3
将赭色曲霉菌株(CBS 13252)的半斜面杆菌培养物接种于装有含3重量％葡萄糖、1重量％玉米浆、0.2重量％NaNO3、0.1重量％KH2PO4、0.2重量％K2HPO4、0.05重量％KCl、0.05重量％MgSO4·7H2O以及0.002重量％FeSO4·7H2O(pH 6.0)的500ml在高压灭菌器中121℃灭菌30分钟的营养液的2升Erlenmeyer烧瓶中，在28℃下于165rpm的旋转振荡器中振摇72小时。如此预培养后，再接种于覆以9.5升与如上所述的预培养物最终组分相同的无菌培养基的10升发酵罐中。此外，另外再加入0.5ml硅油和0.5ml的synperonic以减少起泡。于0.7bar的超压、28℃温度下经过为期6小时的生长期后，以5升/分钟通气、350rpm搅拌并加入1.0g 7α-甲基雌-4-烯-3，17-二酮的15ml DMF溶液。继续搅拌并通气。22小时后，收获培养肉汤并用7升甲基异丙基酮萃取2次4小时。合并有机相并蒸干。将残渣大部分溶解于甲醇中。滤除硅油。蒸发浓缩，以二氯甲烷和丙酮成梯度的硅胶色谱发纯化，分离得到0.78g(74％)的11α-羟基-7α-甲基雌-4-烯-3，17-二酮。从丙酮/二异丙基醚中重结晶后，分离得到熔点为200℃、[α]D＝+52°(CHCl3，c＝0.5905)的白色晶体311mg(29.6％)。
B.化学制备方法
实施例4：11β-氟-17β-羟基-7α-甲基雌-4-烯-3-酮的制备
a)11β-氟-7α-甲基-雌-4-烯-3，17-二酮
0℃下逐滴将11.5ml全氟丁烷-1-磺酰氟加入13.08克11α-羟基-7α-甲基-雌-4-烯-3，17-二酮(根据本发明[A部分]的微生物合成法制备)在250ml甲苯和18.2ml的1，8-二氮杂二环[5，4，0]十一碳-7-烯中的溶液中。1小时后，将其用2M盐酸中和，加入水中，用乙酸乙酯萃取4次，用饱和氯化钠溶液洗涤，然后真空蒸干浓缩。将粗产品用己烷/乙酸乙酯成梯度的硅胶色谱纯化后，得到8.7克11β-氟-7α-甲基-雌-4-烯-3，17-二酮。
熔点：101.4℃，[α]D＝+135.8°(CHCl3)。
b)11β-氟-17β-羟基-7α-甲基雌-4-烯-3-酮：
在0℃将8.7克11β-氟-7α-甲基-雌-4-烯-3，17-二酮在148ml四氢呋喃中的溶液逐滴与29.5ml 1M四氢呋喃中的三叔丁氧基氢化锂铝混合并在0℃搅拌5.5小时。然后，在0℃加入稀硫酸后将反应溶液加入冰水中，用乙酸乙酯萃取三次，洗至中性，用硫酸钠干燥，真空蒸发浓缩并用己烷/乙酸乙酯硅胶色谱纯化。得到5.8克11β-氟-17β-羟基-7α-甲基雌-4-烯-3-酮，熔点为143-144℃，[α]D＝+89.9°(CHCl3)。
实施例5：11β-氟-17β-(4-氨磺酰基苯甲酰氧基)-7α-甲基雌-4-烯-3-酮的制备
室温下将500mg 11β-氟-17β-羟基-7α-甲基雌-4-烯-3-酮的7.5ml吡啶溶液与750mg 4-氨磺酰基苯甲酸、800mg的N，N-二环己基碳化二亚胺以及125mg的p-甲苯磺酸混合并搅拌8.5小时。然后将其加入碳酸氢钠溶液中，用二氯甲烷萃取4次，洗至中性，用硫酸钠干燥，然后真空蒸发浓缩并用二氯甲烷/丙酮硅胶色谱纯化。得到302mg的11β-氟-17β-(4-氨磺酰基苯甲酰氧基)-7α-甲基雌-4-稀-3-酮，其熔点为232℃。[α]D＝+100.5°(CHCl3)。
实施例6：17α-乙炔基-11β-氟-17β-羟基-7α-甲基雌-4-烯-3-酮的制备
a)11β-氟-3-甲氧基-7α-甲基雌-3，5-二烯-17-酮
在80℃将2克11β-氟-7α-甲基雌-4-烯-3，17-二酮的20ml 2，2-二甲氧基丙烷溶液与200mg的甲苯磺酸吡啶搅拌6.5小时。然后用乙酸乙酯稀释，用碳酸氢钠溶液和氯化钠溶液洗涤，用硫酸钠干燥并真空蒸发浓缩。得到2克11β-氟-3-甲氧基-7α-甲基雌-3，5-二烯-17-酮粗产品。
b)17α-乙炔基-11β-氟-17β-羟基-7α-甲基雌-4-烯-3-酮
在0℃将9.17克氯化铈(III)的60ml四氢呋喃溶液逐滴与74.2ml的乙炔溴化镁(0.5M的四氢呋喃)溶液混合并在0℃下搅拌1小时。然后逐滴加入2克11β-氟-3-甲氧基-7α-甲基雌-3，5-二烯-17-酮粗产品的40ml四氢呋喃溶液并在0℃下再搅拌3.5小时。纯制步骤为加入饱和氯化铵溶液、将其加至水中、用乙酸乙酯萃取三次、用半浓盐酸、碳酸氢钠溶液和氯化钠溶液洗涤、硫酸钠干燥、真空蒸发浓缩并用己烷/乙酸乙酯硅胶色谱纯制。得到1.15克熔点为218-220℃的纯17α-乙炔基-11β-氟-17β-羟基-7α-甲基雌-4-烯-3-酮。[α]D＝+19.2°(CHCl3)。
实施例7：17α-乙炔基-11β-氟-17β-羟基-7α-甲基雌-5(10)-烯-3-酮的制备
a)3，3-亚乙二氧基-17α-乙炔基-11β-氟-7α-甲基雌-5(10)-烯-17β-醇
在室温下将700mg 17α-乙炔基-11β-氟-17β-羟基-7α-甲基雌-4-烯-3-酮的7ml二氯甲烷和4.7ml乙二醇溶液与2.3ml的原甲酸酯和30mg的p-甲苯磺酸水合物搅拌6.5小时。然后将其加入碳酸氢钠溶液，用乙酸乙酯萃取三次，洗至中性，用硫酸钠干燥，真空蒸发浓缩并用己烷/乙酸乙酯硅胶色谱纯化。得到205mg的3，3-亚乙二氧基-17α-乙炔基-11β-氟-7α-甲基雌-5(10)-烯-17β-醇。
b)17α-乙炔基-11β-氟-17β-羟基-7α-甲基雌-5(10)-烯-3-酮
在室温下将205mg的3，3-亚乙基二氧-17α-乙炔基-11β-氟-7α-甲基雌-5(10)-烯-17β-醇在27ml甲醇和3.6ml水中的溶液与361mg的草酸一同搅拌24小时。然后将其加入碳酸氢钠溶液，用乙酸乙酯萃取三次，洗至中性，用硫酸钠干燥，真空蒸发浓缩并用己烷/乙酸乙酯硅胶色谱纯化。得到95mg熔点为112-114℃的17α-乙炔基-11β-氟-17β-羟基-7α-甲基雌-5(10)-烯-3-酮。
实施例8：17α-乙炔基-11β-氟-7α-甲基雌-1，3，5(10)-三烯-3，17β-二醇的制备
a)11β-氟-3-羟基-7α-甲基雌-1，3，5(10)-三烯-17-酮
将500mg 11β-氟-7α-甲基雌-4-烯-3，17-二酮的16.5ml乙腈溶液与400mg溴化铜(II)在25℃下搅拌6.5小时。然后用乙酸乙酯稀释，用碳酸氢钠溶液和氯化钠溶液洗涤，硫酸钠干燥，真空蒸发浓缩并用己烷/丙酮硅胶色谱纯化。得到280mg熔点为185-186℃的纯11β-氟-3-羟基-7α-甲基雌-1，3，5(10)-三烯-17-酮。
b)17α-乙炔基-11β-氟-7α-甲基雌-1，3，5(10)-三烯-3，17β-二醇
在0℃下将2.03克氯化铈(III)的7.5ml四氢呋喃悬浮液逐滴与16.5ml的乙炔溴化镁(0.5M的四氢呋喃)溶液混合并在0℃下搅拌0.5小时。然后逐滴加入280mg 11β-氟-3-羟基-7α-甲基雌-1，3，5(10)-三烯-17-酮的2.8ml四氢呋喃溶液并在0℃下再搅拌3.5小时。纯制步骤为加入饱和氯化铵溶液、将其加至水中、用乙酸乙酯萃取四次、洗至中性、用硫酸钠干燥、真空蒸发浓缩并用己烷/乙酸乙酯硅胶色谱纯制。
得到220mg熔点为115-117℃的17α-乙炔基-11β-氟-7α-甲基雌-1，3，5(10)-三烯-3，17β-二醇。

Claims (5)

1、制备通式4，B的7α-被取代的11α-羟基甾族化合物的微生物方法：
Figure C038176960002C1
其中，R7是P-Q基，而
P为C1-C4亚烷基，Q为氢、C1-C4烷基或C1-C4氟代烷基，且P-Q基通过P键合于甾体骨架之上，
R10可为α位或β位，且代表H、CH3或CF3，以及
R13为甲基或乙基，
其中使用微生物将通式D的7α-被取代的甾族化合物羟基化：
Figure C038176960002C2
其中，R7、R10和R13具有与上述相同的含义，所述微生物选自以下组中：白僵菌、弯孢、赤霉、小丛壳、日规壳、大单孢、卷旋枝霉、黑孢、根霉以及共头霉。
2、如权利要求1所述的方法，其中所述微生物选自以下组中：蚕白僵菌、新月弯孢、玉蜀黍赤霉、苹果枯腐病菌、Glomerella fusaroides、Gnomonia cingulata、Haplosporella hesperedica、梨形卷旋枝霉、球形黑孢以及总状共头霉。
3、如权利要求1或2所述的微生物方法，其中R7代表CH3。
4、如权利要求1或2所述的微生物方法，其中R10代表H。
5、如权利要求1或2所述的微生物方法，其中R13代表CH3。
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