EA008147B1

EA008147B1 - МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ 7α-ЗАМЕЩЁННЫХ 11α-ГИДРОКСИСТЕРОИДОВ

Info

Publication number: EA008147B1
Application number: EA200500224A
Authority: EA
Inventors: Людвиг Цорн; Рольф Больманн; Норберт Галлус; Германн Кюнцер; Ханс-Петер Мун; Райнхард Нуббемейер
Original assignee: Шеринг Акциенгезельшафт
Priority date: 2002-07-24
Filing date: 2003-07-24
Publication date: 2007-04-27
Also published as: CA2492079A1; CO5690563A2; WO2004011663A9; JP2006503813A; WO2004011663A2; WO2004011663A3; PH12005500143B1; ECSP055630A; MXPA05001024A; HK1081999A1; RS20050045A; KR101041328B1; NO20050980L; HRP20050172A2; EP1523568A2; NZ549529A; EA200500224A1; EA010572B1; CN100339486C; IL166358A0

Abstract

Описывается микробиологический способ получения 7α-замещенных 11α-гидроксистероидов общей формулы 4,Вв которой Rпредставляет собой группировку P-Q, где Р обозначает C-Cалкилен, a Q обозначает водород, C-Cалкил или C-Cфторалкил, и эта группировка P-Q через Р связана со стероидным каркасом, Rможет находиться в α- либо β-положении и представляет собой Н, CHили CFи Rпредставляет собой метил или этил, из соответствующего 7α-замещенного 17β-гидроксистероида путем гидроксилирования и окисления с использованием микроорганизма, выбранного из группы, включающей Aspergillus sp., Beauveria sp., Glomerella sp., Gnomonia sp., Haplosporella sp. и Rhizopus sp.

Description

Настоящее изобретение относится к микробиологическим способам получения 7а-замещенных 11а-гидроксистероидов, к получаемым из них 7а,17а-замещенным Ιΐβ-галогенстероидам, к способам получения последних соединений, а также к их применению и к фармацевтическим препаратам, содержащим эти соединения. Кроме того, изобретение относится к другим 7а-замещенным 11βгалогенстероидам, конкретно к 7а-замещенным эстра-1,3,5(10)-триенам, получаемым из 7а-замещенных 11 а-гидроксистероидов.

Для терапии климактерических расстройств у мужчин (С11тас1егшт ут1е) и для развития мужских половых органов, равно как и для контроля репродуктивной способности (фертильности) мужчин применяют андрогены, прежде всего тестостерон. Кроме того, эти гормоны содержат также обладающие частично анаболическим действием активные компоненты, которые среди прочего способствуют росту мышц.

Климактерический период у мужчин характеризуется естественным, обусловленным возрастными изменениями организма снижением выработки андрогенов, для восполнения недостатка которых проводят гормонзаместительную терапию (ГЗТ).

Введение в организм ЛГ (лютеинизирующего гормона) и РГ (рилизинг-гормона) с целью контроля фертильности мужчин наряду с уменьшением сперматогенеза приводит также к избыточной активизации (высыпанию) ЛГ и к снижению уровня тестостерона и угасанию либидо, для повышения которых используют лекарственные средства, содержащие тестостерон (Ό.Ε. Ситтшдк и др., Рго51а1е-8раппд ЕГГесГ оГ Изе Ро1еп1 Апйгодеп 7а-Ме1йу1-19-Ыог1е81о81егопе: А Ро1епйа1 Айегпайуе Ю Тейо^егопе Гог Апйгодеп Вер1асетеп1 апй Ма1е Соп1гасер1юп, 1оита1 оГ С11шса1 Епйосппо1оду апй Ме!аЬо1щт, т. 83, № 12, 1998, сс. 4212-4219).

Для контроля мужской фертильности может применяться комбинированная терапия с использованием андрогенов и обладающего гестагенным действием компонента (см., например, заявку XVО 01/60376 А, а также источники, приведенные в этой публикации в качестве ссылки).

При лечении с использованием тестостерона было установлено появление побочных эффектов, таких прежде всего, как увеличение предстательной железы, обусловленное ростом числа клеток и желез стромы (доброкачественная гиперплазия простаты, ДГП). При метаболизме тестостерона, опосредованном 5а-редуктазой, образуется дигидротестостерон (ДГТ), который среди прочего может привести к ДГП (Ситтшдк и др., см. выше; заявка νθ 99/13883 А1). Поэтому в клинической практике подавление 5а-редуктазы используют для лечения ДГП (применение финастеридов).

Быстрый метаболизм андрогенного стероида, коим является тестостерон, в организме человека приводит далее не только к образованию нежелательного ДГТ, но и обусловливает необходимость перорального введения высоких доз для достижения требуемого эффективного уровня тестостерона. Поэтому возникает необходимость в использовании альтернативных лекарственных форм, таких как внутримышечные инъекции или большие пластыри.

Для замены тестостерона, применяемого при вышеназванных показаниях, был предложен 7аметил-19-нортестостерон (МеНТ), биологическая эффективность которого, во-первых, выше по сравнению с тестостероном, поскольку он обладает более высокой аффинностью к андрогенным рецепторам, и который, во-вторых, образуя благодаря 7а-метильной группе своеобразный стерический барьер, препятствует, как предполагают, процессу метаболизма под действием 5а-редуктазы (Ситттдк и др., см. выше; νθ 99/13883 А1; АО 99/13812 А1; И8 5342834).

При метаболизме тестостерона, кроме того, некоторая часть этого соединения в результате ароматизации кольца А стероидной системы превращается в эстрадиол, прежде всего подобное происходит в головном мозге, в печени и в жировой ткани. Эстрадиол касательно общего действия тестостерона и его метаболитов в решающей степени ответствен за обусловленные спецификой пола свойства и регуляцию, осуществляемую гонадотропинами. Поэтому действие эстрадиола, равно как и действие тестостерона в организме взрослого мужчины следует рассматривать как положительный фактор (Ситттдк и др., см. выше).

Вместе с тем было установлено, что фармакокинетика тестостерона является неудовлетворительной. Прежде всего при пероральном введении тестостерон быстро снова выводится из организма, вследствие чего эффективность и продолжительность действия лекарственных средств на основе тестостерона также не дает удовлетворительных результатов. Поэтому был синтезирован целый ряд производных тестостерона. Подобные производные описаны, в частности, в патенте И8 5952319. Прежде всего речь идет о 7а,11 β-диметильных производных 19-нортестостерона, таких конкретно, как 7а,11в-диметил-17вгидроксиэстр-4-ен-3-он, 7а,11 в-диметил-17в-гептаноилоксиэстр-4-ен-3-он, 7а,11 в-диметил-17в-[[(2циклопентилэтил)карбонил]окси]эстр-4-ен-3-он, 7а,11 в-диметил-17в-(фенилацетилокси]эстр-4-ен-3-он и 7а,11 в-диметил-17 β-| [(транс-4-[н-бутил] циклогексил)карбонил]окси] эстр-4-ен-3 -он.

Названные 7α,11β-диметильные производные обладают аналогично МеНТ такими же преимуществами, включая улучшенную фармакокинетику, иными словами, их эффективность и продолжительность действия подняты на более высокий уровень по сравнению с тестостероном. Однако существенным недостатком этих производных является их требующий значительных материально-технических затрат

- 1 008147 синтез.

Одна из возможностей синтеза стероидов микробиологическим путем описана в ЕР 0900283 В1. В этой публикации указывается, что эстр-4-ен-3,17-дион и канренон с использованием определенного микроорганизма, выбранного из группы, включающей АкрегдШик шдпсапк, Ρΐιίζοριίδ аггЫхих и штаммы Рс51с1оОа. можно трансформировать в соответствующий 11а-гидроксианалог. Вместе с тем во вступительной части описания названной публикации дается ссылка на работу ЗЫЬайата и др. авторов в ΒίοсЫш. Вюрйук. Лс1а 202, 1970, сс. 172-179, где говорится, что осуществляемая микробиологическим путем реакция 11а-гидроксилирования стероидов относится к реакциям, не поддающимся точному расчету.

Исходя из вышеизложенного, в основу настоящего изобретения была положена задача получить производные тестостерона, которые отличались бы невосприимчивостью к восстановлению под действием 5а-редуктазы, обладали бы улучшенной фармакокинетикой и прежде всего характеризовались бы простотой и легкостью их получения. Один из крайне важных аспектов настоящего изобретения состоит в соответствии с этим в разработке с целью упростить получение форпродуктов такого способа, который без проблем позволял бы получать эти форпродукты.

Положенная в основу настоящего изобретения задача решается с помощью микробиологических способов получения 7а-замещенных стероидов согласно пп.1, 3 и 6 формулы изобретения, с помощью 7а,17а-замещенных Πβ-галогенстероидов согласно п.11 формулы изобретения, способов получения 7а,17а-замещенных Πβ-галогенстероидов согласно пп.23, 24 и 25 формулы изобретения, благодаря применению этих 7а,17а-замещенных Πβ-галогенстероидов согласно п.26 формулы изобретения, благодаря фармацевтическим препаратам, содержащим эти 7а,17а-замещенные Πβ-галогенстероиды, согласно п.27 формулы изобретения, а также с помощью 7а-замещенных Πβ-галогенэстра-1,3,5(10)триенов согласно п.21 формулы изобретения. Предпочтительные варианты осуществления изобретения представлены в зависимых пунктах формулы изобретения.

Пояснения

Нижеследующие пояснения относятся ко всем разделам описания и к пунктам формулы изобретения, а также к прилагаемой схеме I.

Все группировки, остатки и иные структурные единицы могут соответственно независимо друг от друга варьироваться в указанных диапазонах значений.

Все алкильные, алкиленовые, алкенильные, алкениленовые, алкинильные и алкиниленовые группы могут иметь либо прямую, либо разветвленную цепь. Так, например, пропенильную группу можно представить в виде следующих химических структур: -СН=С-СН₃, -СН₂-С=СН₂ и -С(СН₃)=СН₂. Тем самым под понятие С^^алкил подпадают, например, метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, изобутил, трет-бутил, и-пентил, изопентил, трет-пентил, неопентил, н-гексил, 1-метил-н-пентил, 2-метил-н-пентил, 3-метил-н-пентил, 4-метил-н-пентил, 1-этил-н-бутил, 2-этил-н-бутил и т. д.

Алициклический алкил представляет собой либо циклоалкил, либо замещенный одной алкильной группой или несколькими алкильными группами циклоалкил, который присоединен непосредственно через циклоалкильное кольцо или через одну из алкильных групп.

Аналогично этому алициклический алкенил представляет собой либо циклоалкенил, либо замещенный одной или несколькими алкенильными группами или одной либо несколькими алкенильными и алкильными группами, или одной либо несколькими алкильными группами циклоалкенил или циклоалкил, который присоединен непосредственно через циклоалкенильное кольцо или через одну из алкенильных либо соответственно через одну из алкильных групп, при этом в алициклическом алкениле содержится по меньшей мере одна двойная связь.

Арил может представлять собой фенил, а также 1-нафтил или 2-нафтил. Понятие арил включает в принципе также гетероарил, прежде всего 2-, 3- и 4-пиридинил, 2- и 3-фурил, 2- и 3-тиенил, 2- и 3пирролил, 2-, 4- и 5-имидазолил, пиридазинил, 2-, 4- и 5-пиримидинил, а также 3- и 4-пиридазинил.

Галоген представляет собой фтор, хлор, бром или йод.

Фармацевтически приемлемыми аддитивными солями служат соли соответствующих соединений с неорганическими и органическими кислотами, такими как, например, хлористо-водородная кислота, бромисто-водородная кислота, иодисто-водородная кислота, уксусная кислота, лимонная кислота, щавелевая кислота, винная кислота и метансульфоновая кислота. Эфиры можно образовывать прежде всего с янтарной кислотой.

Числа, напечатанные в виде верхнего индекса при соответствующем символе В, например В¹³, обозначают его положение в стероидном каркасе, при этом С-атомы в этом каркасе имеют нумерацию согласно номенклатуре ИЮПАК. Числа, напечатанные в виде верхнего индекса при соответствующем символе С, например С¹⁰, обозначают положение соответствующего атома углерода в стероидном каркасе.

- 2 008147

Описание изобретения

Микробиологические способы нового типа предназначены для получения 7а-замещенных 11αгидроксистероидов общей формулы 4,В

в которой

В⁷ представляет собой группировку Р-Р, где

Р обозначает С₁-С₄алкилен, а С) обозначает водород, С₁-С₄алкил или С₁-С₄фторалкил (алкил частично либо полностью фторирован), и эта группировка Р^ через Р связана со стероидным каркасом,

В¹⁰ представляет собой Н, СН₃ или СР₃ и

В¹³ представляет собой метил или этил.

В одном из первых вариантов способа получения данных соединений соответствующий 7αзамещенный стероид общей формулы 3,А

в которой В⁷, В¹⁰ и В¹³ имеют те же значения, что и указанные для соединении общей формулы 4,В, с использованием соответствующего микроорганизма, выбранного из группы, включающей АзрегдШиз зр., Веаиуепа зр., О1отеге11а зр., Опотота зр., Нар1озроге11а зр. и 1Вн/ориз зр., на соответствующей стадии способа гидроксилируют и окисляют. Особенно предпочтительны АзрегдШиз аматол, АзрегдШиз йзсйеп, АзрегдШиз тайдпиз, АзрегдШиз тдег, Веаиуепа Ъазз1апа, О1отеге11а ст§и1а!а, Опотота стаи1а1а, Нар1озроге11а НезрегеШса и 1Вн/ориз з1о1от!ег, при этом целесообразно использовать в первую очередь АзрегдШиз аматол (СВ8), АзрегдШиз йзсйеп (АТСС 1020), АзрегдШиз тайдпиз (ΙΜΙ 16061), АзрегдШиз пшег (АТСС 9142), Веаиуепа Ъазз1апа (АТСС 7159), О1отеге11а стди1а!а (СВ8 15226, СВ8 23849, СВ8 98069, АТСС 56596, АТСС 64682, ΙΡΘ 6425), Опотота стриЫа (СВ8 15226), Нар1озроге11а Незрегебюа (СВ8 20837) и ВЫ/ориз з1о1от!ег (АТСС 15441).

Этот микробиологический способ можно осуществлять также по двухстадийному механизму, проводя последовательно реакцию гидроксилирования и реакцию окисления. Протекание реакции можно регулировать за счет ее продолжительности. Так, например, прекратив реакцию по истечении определенного промежутка времени, можно выделять гидроксилированные, но еще не окисленные продукты. Обе указанные стадии можно проводить поэтому раздельно или же по смешанной ферментативной реакции.

С этой целью соединение общей формулы 3,А на первой стадии микробиологического способа с использованием одного из микроорганизмов, выбранного из группы, включающей АзрегдШиз зр., Веаиуепа зр., О1ЪЪеге11а зр., О1отеге11а зр., Опотота зр., Ме1аггН17шт зр., Мдгозрога зр., ВЫ/ориз зр. и УегйсШшт зр., гидроксилируют в положении 11с образованием в результате 7а-замещенного стероида с гидроксигруппой в положении 11. Такое соединение соответствует общей формуле С

- 3 008147

в которой К⁷, К¹⁰ и К¹³ имеют те же значения, что и указанные выше для соединений общей формулы 4,В. Прежде всего используют следующие микроорганизмы: АзрегдШиз тайдпиз, АзрегдШиз те11еиз, АзрегдШиз П1§ег, АзрегдШиз осйгасеиз, Веаиуепа Ьазз1апа, О1ЬЬеге11а Гицкигоц О1ЬЬеге11а /еае, О1отеге11а стди1а1а, О1отеге11а Гизаго1без, Опотота стди1а1а, Ме1агг1н/1ит атзорНае, Ыщгозрога зрйаепса, КЫ/ориз огу/ае, КШ/ориз з1о1отГег и УегйсШшт баййае. Наиболее предпочтительно использовать для гидроксилирования АзрегдШиз тайдпиз (ΙΜΙ 16061), АзрегдШиз те11еиз (СВ8), АзрегдШиз тдег (АТСС 11394), АзрегдШиз осйгасеиз (ЫККЬ 405, СВ8 13252, АТСС 46504), Веаиуепа Ьазз1апа (АТСС 7159, ΙΡΟ 5838, АТСС 13144, ΙΡΟ 4848, СВ8 11025, СВ8 12736), О1ЬЬеге11а 1иркиго1 (АТСС 14842), О1ЬЬеге11а /еае (СВ8 4474), О1отеге11а сшди1а!а (АТСС 10534, СВ8 23849, СВ8 23749, АТСС 16646, АТСС 16052, ΙΡΟ 6459, ΙΡΟ 6425, ΙΡΟ 6470, СВ8 98069, ΙΡΟ 7478, ΙΡΟ 5257, АТСС 64682, АТСС 15470), О1отеге11а 1изаго1без (АТСС 9552), Опотота стди1а1а (СВ8 15226), Ме1аггЫ7шт атзорНае (ΙΡΟ 5940), Ы1дгозрога зрйаепса (АТСС 12772), К1н/ориз огу/ае (АТСС 4858, АТСС 34102, АТСС 34102), КЫ/ориз з!о1ош1ег (АТСС 6227Ь, АТСС 15441) и УеШсШтт баЬКае (АТСС 11405).

По завершении гидроксилирования промежуточный продукт формулы С на второй стадии микробиологического способа с использованием другого микроорганизма, выбранного из группы, включающей ВасШиз зр., МусоЬаОепит зр., Ыосагб1а зр. и Рзеиботопаз зр., окисляют с образованием в результате 7а-замещенных 11-а-гидроксистероидов общей формулы 4,В. В этих целях используют прежде всего следующие микроорганизмы: ВасШиз 1асйтогЬиз, ВасШиз зрйаепсиз, МусоЬаОепит пеоаигит, МусоЬас1елит зтедтайз, Ыосагб1а согаШпа, Ыосагб1а д1оЬеги1а, Ыосагб1а тШ1та, Ыосагб1а гезйгсШз, Ыосагб1а гиЬгорегйпОа, Ыосагб1а за1тотсо1ог и Рзеиботопаз 1ез1оз1егоп1, наиболее предпочтительно при этом использовать ВасШиз 1асйтогЬиз (АТСС 245), ВасШиз зрйаепсиз (АТСС 7055), МусоЬаОепит пеоаигит (АТСС 9626, ЫККЬ В-3683, ЫККЬ В-3805), МусоЬаОепит зтедтабз (АТСС 14468), Ыосагб1а согаШпа (АТСС 31338), Ыосагб1а д1оЬеги1а (АТСС 9356), Ыосагб1а ттта (АТСС 19150), Ыосагб1а гезйгсШз (ЫСШ 10027), Ыосагб1а гиЬгорегйпОа (АТСС 14352), Ыосагб1а за1тотсо1ог (АТСС 19149) и Рзеиботопаз 1ез1оз1егот (АТСС 11996).

Согласно еще одному варианту способа соединения общей формулы 4,В можно получать с помо

в которой К⁷, К¹⁰ и К¹³ имеют те же значения, что и указанные для соединений общей формулы 4,В. Данную реакцию проводят с использованием соответствующего микроорганизма, выбранного из группы, включающей АзрегдШиз зр., Веаиуепа зр., Сигуи1апа зр., О1ЬЬеге11а зр., О1отеге11а зр., Опотота зр., Нар1озроге11а зр., Нейсоз1у1ит зр., Ы1дгозрога зр., КЫ/ориз зр. и 8упсерйа1аз1гит зр., при этом стероидный каркас гидроксилируют в положении 11α, и в результате образуется 7а-замещенный 11αгидроксистероид общей формулы 4,В. Предпочтительны для этой цели следующие микроорганизмы: АзрегдШиз аШасеиз, АзрегдШиз аматол, АзрегдШиз ПзсИеп, АзрегдШиз тайдпиз, АзрегдШиз те11еиз, АзрегдШиз тбиа1апз, АзрегдШиз тдег, АзрегдШиз осйгасеиз, АзрегдШиз уапесо1ог, Веаиуепа Ьазз1апа, Сигуи1апа 1ипа1а, О1ЬЬеге11а /еае, О1отеге11а стди1а1а, О1отеге11а 1изаго1без, Опотота стди1а!а, Нар1озроге11а Иезрегебюа, Нейсоз1у1ит рпДогтае, Ы1дгозрога зрйаепса, КШ/ориз огу/ае и 8упсерйа1аз1гит гасетозит, прежде всего при этом используют АзрегдШиз аШасеиз (АТСС 10060), АзрегдШиз аматол (СВ8), АзрегдШиз йзсйеп (АТСС 1020), АзрегдШиз тайдпиз (Μ 16061), АзрегдШиз те11еиз (СВ8), АзрегдШиз тбиа1апз (АТСС 11267), АзрегдШиз тдег (АТСС 9142, АТСС 11394), АзрегдШиз осйгасеиз

- 4 008147 (ΝΚΚΕ 405, АТСС 13252, АТСС 46504), АзрегддИиз уапесо1ог (АТСС 10067), Веаиуепа Ьазз1апа (ГРО 5838, АТСС 13144, 1РО 4848, СВ8 11025, СВ8 12736, АТСС 7159), Сигуи1апа 1ипа1а (1X3), О1ЬЬеге11а /еае (СВ8 4474), О1отеге11а ешдиЫа (АТСС 10534, СВ8 23849, СВ8 23749, АТСС 16646, 1РО 6459, 1РО 6425, 1РО, 6470, АТСС 15093, АТСС 10529, 1РО 5257, АТСС 56596, АТСС 64682), О1отеге11а ГизагоЛез (АТСС 9552), Опотоша ст§и1а1а (СВ8 15226), Нар1озроге11а ЬезрегеЛеа (СВ8 20837), Не11соз1у1ит ртГогтае (АТСС 8992), №§гозрога зрИаепса (АТСС 12772), КЪ17ориз огу/ае (АТСС 4858) и 8упсерйа1аз1гит гасетозит (ГРО 4827).

Наиболее пригодными являются способы, с помощью которых получают 7а-замещенные 11αгидроксистероиды общей формулы 4,В, где независимо друг от друга К⁷ представляет собой СН3 и/или К¹⁰ представляет собой Н, и/или К¹³ представляет собой СН3.

Способ осуществляют по обычной методике. Обычно сначала приготавливают стерилизованный питательный раствор для штамма и затем для культивирования штамма в этот питательный раствор вносят содержащий его культуральный раствор. Далее полученную таким путем предварительную культуру переносят в ферментер, в который загружен также соответствующий питательный раствор. Предпочтительно после начальной стадии выращивания культуры штамма в ферментер добавляют затем исходное вещество, в рассматриваемом случае либо соединение общей формулы 3,А, либо соединение общей формулы Ό, инициируя таким образом предлагаемую в изобретении реакцию. По завершении реакции смесь веществ для выделения требуемого 7а-замещенного 11 α-гидроксистероида очищают по обычной технологии.

Из полученных таким путем соединений общей формулы 4,В можно синтезировать другие предлагаемые в изобретении соединения с помощью также предлагаемых в изобретении способов. Прежде всего 7а,17а-замещенные 11в-галогенстероиды общей формулы 8,10,12

в которой

И-У-Ш-Χ-Υ-Ζ представляет собой одну из циклических структур С¹-С²-С³-С⁴=С⁵-С¹⁰, С¹-С²-С³-С⁴С⁵=С¹⁰ или С¹-С²-С³-С⁴-С⁵-С¹⁰, при этом в данном случае оксогруппа (=О) связана с \Ш( С³) или представляет собой циклическую структуру С¹=С²-С³=С⁴-С⁵=С⁶, при этом в данном случае остаток ОК³ связан с Ш (=С³),

К³ представляет собой Н, С1-С₄алкил, С1-С₄алканоил или простой циклический С₃-С₇эфир с Оатомом остатка ОК³,

К⁷ представляет собой группировку Р-Р, где

Р обозначает С1-С₄алкилен, а Р обозначает водород, С1-С₄алкил или С1-С₄фторалкил (алкил частично либо полностью фторирован), и эта группировка Р-Р через Р связана со стероидным каркасом,

К¹⁰ может находиться в α- либо β-положении и представляет собой Н, СН₃ или СР₃, однако он присутствует лишь при условии, что Χ-Υ-Ζ не обозначает С⁴-С⁵=С¹⁰,

К¹¹ представляет собой галоген,

К¹³ представляет собой метил или этил,

К¹⁷ представляет собой Н, С₁-С₁₈алкил, алициклический С₁-С₁₈алкил, С₁-С₁₈алкенил, алициклический С₁-С₁₈алкенил, С₁-С₁₈алкинил,

С₁-С₁₈алкиларил, С₁-С₈алкиленнитрил или группировку Р-Р, где эта группировка Р-Р имеет указан ное выше значение,

К¹⁷ представляет собой Н, С1-С18алкил, алициклический С1-С18алкил, С1-С18алкенил, алициклический С1-С18алкенил, С1-С18алкинил или С1-С18алкиларил, при этом К¹⁷ может быть также через кетогруппу связан с 17в-оксигруппой и, кроме того, К¹⁷ дополнительно может быть замещен одной или несколькими группами №К.¹⁸К¹⁹ либо одной или несколькими группами 8ОХК²⁰, где х обозначает 0, 1 или 2, а К¹⁸, 19 20 17

К и К каждый независимо друг от друга может иметь те же значения, что и К , равно как и их фармацевтически приемлемые аддитивные соли, сложные эфиры и амиды представляют собой действующие вещества, которые обладают целым рядом важных преимуществ. Эти получаемые в результате проведения других стадий способа из 7а-замещенного 11 α-гидроксистероида общей формулы 4,В соединения являются ценными активными веществами с ярко выраженным андрогенным действием, не проявляя при их применении упомянутых выше побочных эффектов. Данные соединения пригодны для получения

- 5 008147 соответствующих лекарственных средств, и прежде всего эффективных контрацептивов и действующих веществ для гормонзаместительной терапии (ГЗТ).

В случае дополнительного замещения К¹⁷ группой ΝΚ¹⁸Κ¹⁹ речь может идти о метиламино-, диметиламино-, этиламино-, диэтиламино-, циклогексиламино-, дициклогексиламино-, фениламино-, дифениламино-, бензиламино- или дибензиламиногруппе.

К особенно пригодным для использования в указанных целях 7а,17а-замещенным Ιΐβ-галоген стероидам общей формулы 8,10,12 относятся соединения, в которых Ц-У-^-Χ-Υ-Ζ представляет собой циклическую структуру С¹-С²-С³-С⁴=С⁵-С¹⁰, С¹-С²-С³-С⁴-С⁵=С¹⁰ или С¹=С²-С³=С⁴-С⁵=С¹⁰.

В первом случае (Ц-У-^-Χ-Υ-Ζ обозначает С¹-С²-С³-С⁴=С⁵-С¹⁰) речь идет о стероидах общей формулы 10

Во втором случае (И-У-^-Χ-Υ-Ζ обозначает С¹-С²-С³-С⁴-С⁵=С¹⁰) речь идет о стероидах общей формулы 12

Соединения общих формул 10 и 12 представляют собой соединения с андрогенным действием.

В третьем случае (Ц-У-^-Χ-Υ-Ζ обозначает С¹=С²-С³=С⁴-С⁵=С¹⁰) речь идет о стероидах общей формулы 8

Эти соединения представляют собой эстрогены (соединения с аффинностью к эстрогенным рецепторам).

Во всех трех случаях остатки К³, К⁷, К¹⁰, К¹¹, К¹³, К¹⁷ и К¹⁷ имеют те же значения, что и соответствующие остатки в общей формуле 8, 10, 12.

Предпочтительно независимо друг от друга К¹ представляет собой Н и/или К⁷ представляет собой СН3, и/или К¹¹ представляет собой фтор, и/или К¹³ представляет собой СН3, и/или К¹⁷ представляет собой Н, СН₃, С₁-С₁₈алкинил, прежде всего этинил, СН₂С№ или СР₃, и/или К¹⁷ представляет собой Н.

К особенно пригодным для использования предлагаемым в изобретении 7а,17а-замещенным 11 βгалогенстероидам общей формулы 8,10,12 относятся следующие соединения:

17а-этинил-11в-фтор-17в-гидрокси-7а-метилэстр-4-ен-3-он (формула 10), 17а-этинил-11в-фтор-17в-гидрокси-7а-метилэстр-5(10)-ен-3-он (формула 12), 17а-этинил-11в-фтор-7а-метилэстра-1,3,5(10)-триен-3,17в-диол (формула 8).

Эти соединения можно синтезировать следующим путем:

Для получения 7а,17а-замещенных Πβ-галогенстероидов общей формулы 10, где Ц-У-^-Χ-Υ-Ζ

- 6 008147 представляет собой циклическую структуру С¹-С²-С₃-С⁴=С⁵-С¹⁰, в качестве исходных веществ используют получаемые с помощью микробиологического способа по изобретению 7а-замещенные 11αгидроксистероиды общей формулы 4,В.

На первой стадии синтеза полученные таким образом 7а-замещенные 11 α-гидроксистероиды посредством нуклеофильного замещения галодегидроксилирующим реагентом превращают в соответст-

В качестве галодегидроксилирующих реагентов могут рассматриваться все обычно используемые для подобных целей соединения, например фтористо-, хлористо-, бромисто- или иодисто-водородная кислота, тионилхлорид либо тионилбромид, пентахлорид фосфора, оксихлорид фосфора, Νхлорсукцинимид, трифенилфосфин/тетрахлорметан, НЕ/пиридин или трифторид диэтиламиносеры или предпочтительно нонафлилфторид/1,5-диазабицикло[5.4.0]ундецен.

Из соединения формулы 5 можно затем путем селективного алкилирования у атома С¹⁷ каркаса получать соединение формулы 10 (см. схему I). Для селективного алкилирования могут использоваться обычные алкилирующие реагенты, например соединения Гриньяра и металлоорганические соединения, прежде всего алкиллитиевые соединения. Так, например, для получения соответствующего 17а-этинил17р-гидроксиэстр-4-ен-3-она из эстр-4-ен-3,17-диона в качестве алкилирующего реагента можно использовать этинилмагнийбромид.

Для получения 7а,17а-замещенных 11 β-галогенстероидов, в которых ϋ-ν-^-Χ-Υ-Ζ представляет собой циклическую структуру С¹-С²-С³-С⁴-С⁵=С¹⁰ и которые соответствуют общей формуле 12, используют и изомеризуют соединения общей формулы 10, в результате чего двойная связь Δ⁴ изомеризуется в двойную связь Δ⁵⁽¹⁰⁾. Для защиты 3-кетогруппы сначала образуют простой циклический эфир в положении 3. Затем двойную связь Δ⁴ изомеризуют в двойную связь Δ⁵⁽¹⁰⁾ с образованием при этом 7α,17αзамещенного 11 β-галогенстероида общей формулы 12, после чего защитную группу снова отщепляют.

При получении других 7а,17а-замещенных 11 β-галогенстероидов общей формулы 8, где ϋ-ν-^-ΧΥ-Ζ представляет собой циклическую структуру С³=С²-С³=С⁴-С⁵=С¹⁰, работают следующим образом:

Сначала, как уже описывалось выше, из полученного в результате микробиологического гидроксилирования и окисления 7а-замещенного 11α-гидроксистероида общей формулы 4,В путем галодегидроксилирования по реакции нуклеофильного замещения образуют соответствующий 11 β-галогенстероид общей формулы 5.

Затем из этого 11 β-галогенстероида путем окисления, например солью меди(11), образуют 7 α-

в которой В³, В⁷, В¹¹ и В¹³ имеют указанные выше значения. Если В³ представляет собой Н, то эти соединения можно синтезировать непосредственно.

Если же В³ имеет значение, отличное от Н, то после образования путем окисления 1,3,5(10)триенового кольца необходимо по обычной методике образовывать соответствующие простые и сложные эфиры.

7α-замещенные 11β-галогенэстра-1,3,5(10)-триены общей формулы 6, равно как и их фармацевтически приемлемые аддитивные соли, сложные эфиры и амиды являются новыми и включены поэтому в объем настоящего изобретения в качестве промежуточных продуктов, используемых при синтезе также предлагаемых в изобретении 7α,17α-замещенных 11 β-галогенстероидов общей формулы 8.

Одним из особенно предпочтительных 7α-замещенных 11β-галогенэстра-1,3,5(10)-триенов общей

- 7 008147 формулы 6 является 11в-фтор-3-гидрокси-7а-метилэстра-1,3,5(10)-триен-17-он.

Из 7а-замещенного 11в-галогенэстра-1,3,5(10)-триена общей формулы 6 аналогично описанному выше синтезу соединения общей формулы 10 путем селективного алкилирования у атома С¹⁷ каркаса можно образовывать предлагаемый в изобретении 7а,17а-замещенный Πβ-галогенстероид общей формулы 8.

Кроме того, из полученных в результате микробиологического гидроксилирования и окисления из 7а-замещенных стероидов общей формулы 3,А или Ό веществ общей формулы 4,В могут быть получены также обладающие андрогенным действием 7а-замещенные Πβ-галогенстероиды общей формулы 9:

в которой К⁷, К¹¹ и К¹³ имеют указанные выше значения. Одним из особенно предпочтительных соединений является 11в-фтор-17в-гидрокси-7а-метилэстр-4-ен-3-он. Соединения общей формулы 9, равно как и их фармацевтически приемлемые аддитивные соли, сложные эфиры и амиды также обладают андрогенным действием.

Для получения соединений общей формулы 9 эстр-4-ен-3,17-дион формулы 5 восстанавливают до 17в-гидроксиэстр-4-ен-3-она формулы 9, например с помощью соответствующего борогидрида.

Соединения общей формулы 9 можно превращать, кроме того, в соответствующие 7а-замещенные 11в-галогенэстра-5(10)-ены формулы

в которой К⁷, К¹⁰, К¹¹ и К¹³ имеют те же значения, что и указанные в общей формуле 8,10,12. С этой целью соединения общей формулы 9 изомеризуют за счет смещения двойной связи Δ⁴ в двойную связь Δ⁵⁽¹⁰⁾. Для защиты 3-кетогруппы сначала образуют простой циклический эфир в положении 3. Затем двойную связь Δ⁴ изомеризуют в двойную связь Δ⁵⁽¹⁰⁾ с образованием при этом вышеуказанного 7 αзамещенного 11 β-галогенстероида, после чего защитную группу снова отщепляют.

Еще одна возможность получения соответствующих 7а-замещенных 11в-галогенэстра-5(10)-енов формулы

в которой К⁷, К¹⁰, К¹¹ и К¹³ имеют те же значения, что и указанные в общей формуле 8,10,12, заключается в том, что их образуют из соединений общей формулы 5 за счет изомеризации двойной связи Δ⁴ в двойную связь Δ⁵⁽¹⁰⁾. С этой целью соединения общей формулы 5 изомеризуют за счет смещения двойной связи Δ⁴ в двойную связь Δ⁵⁽¹⁰⁾. Для защиты 3-кетогруппы сначала образуют простой циклический эфир в положении 3. Затем двойную связь Δ⁴ изомеризуют в двойную связь Δ⁵⁽¹⁰⁾ с образованием при этом вышеуказанного 7а-замещенного 11 β-галогенстероида, после чего защитную группу снова отщепляют.

Все названные соединения можно также этерифицировать далее с образованием сложных или простых эфиров, но только при наличии соответствующих гидроксигрупп в положении 3 или 17β. Так, например, соединение формулы 9 можно превращать в соответствующий простой Ηβ-эфир или сложный

- 8 008147

17β-3φπρ. Одним из предпочтительных соединений данной группы является 11β-φτορ-17β-(4сульфамоилбензокси)-7а-метилэстр-4-ен-3-он. В качестве заместителей у атома кислорода оксигруппы при С¹⁷ пригодны в принципе такие же остатки, которые указаны для В¹⁷.

Прежде всего 7а,17а-замещенные 11 β-галогенстероиды общей формулы 8,10,12 пригодны для получения соответствующих лекарственных средств. С учетом этого настоящее изобретение относится также к применению названных соединений общей формулы 8,10,12 для получения соответствующих лекарственных средств, равно как и к фармацевтическим препаратам, содержащим по меньшей мере одно из указанных соединений общей формулы 8,10,12 и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель.

Предлагаемые в изобретении 7а,17а-замещенные 11 β-галогенстероиды общей формулы 10,12 представляют собой соединения с ярко выраженным андрогенным действием, не проявляя при их применении указанных выше побочных эффектов, таких, например, как стимуляция предстательной железы (прежде всего никакой доброкачественной гиперплазии простаты). К преимуществам соединений следует отнести и их простой в осуществлении синтез. Как было установлено, предлагаемые в изобретении соединения общей формулы 10 или 12 могут применяться не только для ГЗТ мужчин - они пригодны также без дополнительного введения в организм каких-либо иных действующих веществ в качестве эффективных мужских контрацептивов при соответственно подобранной дозировке с целью требуемого снижения уровня содержания в крови ЛГ, вырабатываемого в организме тестостерона и ФСГ (фолликулостимулирующего гормона). Это объясняется способностью предлагаемых в изобретении 11βгалогенстероидов ингибировать избыточную активацию (высыпание) ЛГ и ФСГ. ЛГ стимулирует клетки Лейдига таким образом, что они секретируют тестостерон. Если содержание ЛГ в крови поддерживать на низком уровне, то при этом снижается также выделение в организме тестостерона. Тестостерон используется для сперматогенеза, тогда как ФСГ стимулирует зародышевые клетки. Поэтому для эффективного сперматогенеза требуется достаточно высокий уровень содержания ФСГ и ЛГ в крови, при этом достаточно высокий уровень содержания ЛГ в крови обусловливает необходимую для сперматогенеза избыточную активацию тестостерона.

Поскольку использование для стерилизации только одних 7а,17а-замещенных 11βгалогенстероидов без добавления каких-либо дополнительных действующих веществ уже может привести к эффективной мужской контрацепции, это позволит не только существенно упростить введение соответствующего лекарственного средства, предназначенного для этих целей, но и значительно снизить расходы, связанные с его применением.

Для контроля мужской фертильности предлагаемые в изобретении 7а,17а-замещенные 11βгалогенстероиды могут применяться также в комбинации с гестагеном.

Помимо этого предлагаемые в изобретении 7а,17а-замещенные 11 β-галогенстероиды эффективно ингибируют 5а-редуктазу и стероид-11-гидроксилазу [СУР11В (Р450с11) Ο. Ζ1ιαη§. М.Ь. МШег, 1оигла1 о! С11П1са1 Еибосгшо1оду апб МеГаЬойкт, т. 81, 1996, сс. 3254-3256], благодаря чему удается, например, избирательным путем избежать стимулирующего воздействия на предстательную железу, и соединения проявляют улучшенную фармакокинетику. Ингибирование 11-гидроксилазы приводит к уменьшению степени дезактивации обладающих андрогенным действием соединений и к снижению их выделения из организма человека. Благодаря этому повышаются эффективность и продолжительность действия данных соединений по сравнению с известными соединениями, прежде всего при пероральном применении.

Вышеназванные свойства позволяют применять предлагаемые в изобретении соединения прежде всего для контроля репродуктивной способности мужчин, равно как и для андрогензаместительной терапии со сниженной склонностью к восстановлению 5а-редуктазы при одновременно сохраняемой ароматизации с образованием эстрогенных стероидов и положительном влиянии на сывороточные липиды и центральную нервную систему.

Андрогенное действие и отсутствие, как было предварительно установлено, вышеназванных побочных эффектов исследовали в опытах на семенных пузырьках с использованием предлагаемых в изобретении соединений общих формул 10 и 12. Эффективность же предлагаемых в изобретении соединений общей формулы 8 тестировали в опыте на эстрогенное действие, которое эти соединения оказывают на рост матки.

Предлагаемые в изобретении 7а,17а-замещенные 11 β-галогенстероиды общей формулы 10 или 12, равно как и предлагаемые в изобретении фармацевтические препараты, содержащие эти соединения, пригодны для исключительно успешного лечения не страдающих бесплодием мужчин, а также в принципе мужских особей животных-млекопитающих. Применение в целях мужской контрацепции приводит лишь к временной утрате мужчинами репродуктивной способности. По завершении приема действующих веществ по изобретению, соответственно фармацевтических препаратов первоначальное состояние восстанавливается, т.е. к мужчине возвращается репродуктивная способность и сперматогенез протекает в том же объеме, что и ранее. Для достижения временной стерильности и поддержания ее на постоянном уровне в течение требуемого промежутка времени действующее веществ, соответственно препарат необходимо вводить в организм постоянно, без перерывов, причем в зависимости от формы применения их

- 9 008147 следует назначать ежедневно, а в иных случаях предусмотреть периодическое повторение через определенные короткие или же длительные промежутки времени. После однократного или многократного введения действующего вещества либо препарата восстановление первоначального не стерильного состояния мужчины не обязательно происходит сразу, оно может восстанавливаться постепенно, для чего потребуется определенный период времени, зависящий от различных факторов, таких, например, как дозировка, особенности конституции человека и одновременный прием других лекарственных средств.

Если целью применения является контрацепция, то дозировку 7а,17а-замещенных 11 βгалогенстероидов следует выбирать настолько высокой, чтобы содержание ЛГ и ФСГ в крови составляло соответственно максимум 2,5 МЕ/мл, прежде всего максимум 1,0 МЕ/мл, а содержание тестостерона составляло максимум 10 нмолей/л, прежде всего максимум 3 нмоля/л.

Если предлагаемые в изобретении 7а,17а-замещенные 11 β-галогенстероиды предусматривается применять для ГЗТ без достижения при этом контрацепции, то дозировку следует выбирать более низкой. В этом случае стремятся достичь такого уровня действующих веществ, который обеспечивает содержание ЛГ и ФСГ в крови соответственно выше 2,5 МЕ/мл, а содержание тестостерона выше 10 нмолей/л.

Дозировка предлагаемых в изобретении 7а,17а-замещенных 11 β-галогенстероидов общей формулы 10 или 12, требуемая для регуляции уровня содержания в крови ЛГ, ФСГ и тестостерона, зависит от многих факторов и должна определяться поэтому, исходя из специфики применения. В первую очередь дозировка зависит, как очевидно, от вида терапии. Если соединения предполагается применять для мужской контрацепции, то их необходимо назначать в существенно более высоких дозах, чем при использовании для ГЗТ. Дозировка определяется далее типом 7а,17а-замещенного Πβ-галогенстероида и его биодоступностью. Специфика применения крайне важна также для выбора вводимого количества соединения. Кроме того, дозировка зависит от конституции человека и от иных факторов, таких, например, как необходимость учитывать возможный параллельный прием других лекарственных средств.

Соединения могут назначаться для перорального и парентерального введения, например интраперитонеального, внутривенного, внутримышечного или чрескожного. Соединения можно также имплантировать в ткань. Назначаемое для введения в организм количество соединений может варьироваться в широких пределах с учетом эффективности этого количества. Оно может варьироваться в широких пределах также в зависимости от состояния, подлежащего лечению, и от методики введения. Суточная доза для человека составляет от 0,1 до 100 мг. Предпочтительная суточная доза для человека составляет от 0,1 до 10 мг. Продолжительность применения соответствующего соединения определяется конечной целью.

Для практического применения могут предназначаться капсулы, пилюли, таблетки, драже, кремы, мази, примочки, жидкости, например сиропы, гели, инъецируемые жидкости, например для интраперитонеальной, внутривенной, внутримышечной или чрескожной инъекции, и т.п., при этом отдельные лекарственные формы высвобождают соединения по изобретению в зависимости от их типа постепенно или высвобождают все количество через короткий промежуток времени.

Для перорального введения применяют капсулы, пилюли, таблетки, драже и жидкости или какиелибо другие пероральные лекарственные формы в качестве фармацевтических препаратов. В этих случаях подобные лекарственные средства можно изготавливать таким образом, чтобы обеспечить высвобождение ими действующих веществ либо через короткий промежуток времени, либо обеспечить эффект депо, что позволит действующему веществу поступать в организм постепенно, с замедлением (пролонгированное действие). Унифицированные дозы наряду с 7а,17а-замещенным Πβ-галогенстероидом могут содержать один или несколько фармацевтически приемлемых носителей, например вещества для регуляции реологических свойств лекарственного средства, поверхностно-активные вещества, гидротропные солюбилизаторы, микрокапсулы, микрочастицы, грануляты, разбавители, связующие, такие как крахмал, сахар, сорбит и желатин, а также наполнители, такие как кремниевая кислота и таль, смазки, красители, ароматизаторы и другие вещества.

Предлагаемые в изобретении 7а,17а-замещенные Πβ-галогенстероиды могут быть представлены также в виде раствора, предназначенного для перорального применения и содержащего наряду с активным Πβ-галогенстероидом в качестве других компонентов фармацевтически приемлемое масло и/или фармацевтически приемлемое липофильное, поверхностно-активное вещество, и/или фармацевтически приемлемое гидрофильное, поверхностно-активное вещество, и/или фармацевтически приемлемый смешивающийся с водой растворитель. В этом отношении можно сослаться, кроме того, на заявку XV О 97/21440.

Для достижения лучшей биодоступности стероида соединения можно использовать для получения циклодекстриновых клатратов. С этой целью соединения подвергают взаимодействию с α-, β- или γциклодекстрином либо с их производными.

Если предусматривается использовать кремы, мази, примочки и другие предназначенные для наружного применения жидкости, то данные лекарственные средства следует формировать таким образом, чтобы обеспечить для соединений по изобретению возможность поступления в организм в достаточном количестве. В состав таких лекарственных форм входят определенные вспомогательные вещества, на

- 10 008147 пример вещества для регуляции реологических свойств, поверхностно-активные вещества, консерванты, гидротропные солюбилизаторы, разбавители, вещества для повышения способности предлагаемых в изобретении стероидов проникать через кожу, красители, ароматизаторы и средства защиты кожи, такие как кондиционеры и регуляторы влажности. В состав лекарственного средства наряду со стероидами по изобретению могут входить и другие действующие вещества.

Для парентерального введения действующие вещества можно растворять или суспендировать в соответствующем физиологически совместимом разбавителе. В качестве разбавителей во многих случаях используют масла с добавлением или без добавления гидротропного солюбилизатора, поверхностноактивного вещества, суспендирующего или эмульгирующего агента. В качестве примера используемых в указанных целях масел можно назвать оливковое масло, арахисовое масло, хлопковое масло, соевое масло, касторовое масло и кунжутное масло. Для приготовления инъецируемого препарата может использоваться любой жидкий носитель, в котором предлагаемые в изобретении соединения находятся в растворенном либо эмульгированном виде. Подобные жидкости содержат часто также вещества для регулирования вязкости, поверхностно-активные вещества, консерванты, гидротропные солюбилизаторы, разбавители и другие добавки, с помощью которых раствору придают изотоничность. Вместе с 7α,17αзамещенными Ιΐβ-галогенстероидами в организм могут вводиться также другие действующие вещества.

Предлагаемые в изобретении 11 β-галогенстероиды могут применяться в виде депо-инъекции или имплантируемого препарата, например подкожно, которые можно формировать таким образом, чтобы обеспечить постепенное, замедленное высвобождение действующего вещества. В этих целях могут использоваться известные технологии, например растворяющиеся или снабженные мембраной депоформы. Имплантаты могут содержать в качестве инертных материалов, например, биологически разлагаемые полимеры или синтетические силиконы, например силиконовый каучук. При чрескожном введении предлагаемые в изобретении 11 β-галогенстероиды можно заделывать, например, в пластырь.

Ниже изобретение более подробно поясняется на примерах.

А. Микробиологический синтез

11а-гидрокси-7а-метилэстр-4-ен-3,17-дион (соединение 4,В)

Пример 1.

В 2-литровую колбу Эрленмейера после загрузки в нее 1000 мл стерилизованного в течение 30 мин при 121°С в автоклаве питательного раствора, содержащего 3 мас.% глюкозы, 1 мас.% жидкости, полученной после замачивания зерен кукурузы до набухания, 0,2 мас.% ΝαΝΟ₃, 0,1 мас.% КН₂РО₄, 0,2 мас.% К₂НРО₄, 0,05 мас.% КС1, 0,05 мас.% Мд8О₄-7Н₂О и 0,002 мас.% Ге8О₄-7Н₂О (рН 6,0), вносили инокулят культуры штамма Опотоша етди1а1а, выращенного на скошенном агаре (СБ8 15226), и в течение 72 ч при 28°С встряхивали на ротационном шейкере при 165 об./мин. Затем эту предварительную культуру вносили в 20-литровый ферментер, содержавший 19 л стерильной среды такого же конечного состава, что и описанный выше для предварительной культуры. Кроме того, перед стерилизацией для подавления ценообразования добавляли еще 1,0 мл силиконового масла и 1,0 мл 8упрегоше (этоксилат кетоспирта). По завершении начальной фазы роста, продолжавшейся в течение 12 ч при повышенном давлении 0,7 бара, температуре 28°С, аэрации с расходом 20 л/мин и скорости перемешивания 250 об./мин, добавляли раствор 4,0 г 17в-гидрокси-7а-метилэстр-4-ен-3-она в 40 мл ДМФ. Далее продолжали перемешивание и аэрацию. Через 135 ч культуральный бульон собирали и в течение 12 ч экстрагировали 10 л метилизобутилкетона и в течение 5 ч 5 л метилизобутилкетона. Объединенные органические фазы концентрировали досуха. Силиконовое масло удаляли путем промывки гексаном. После хроматографии на силикагеле с использованием градиента растворителей гексан/этилацетат выделили 1,64 г (39%) 11а-гидрокси-7аметилэстр-4-ен-3,17-диона.

- 11 008147

Пример 2.

В 2-литровую колбу Эрленмейера после загрузки в нее 1000 мл стерилизованного в течение 30 мин при 121 °С в автоклаве питательного раствора, содержащего 3 мас.% глюкозы, 1 мас.% жидкости, полученной после замачивания зерен кукурузы до набухания, 0,2 мас.% ΝαΝΟ₃, 0,1 мас.% КН₂РО₄, 0,2 мас.% К₂НРО₄, 0,05 мас.% КС1, 0,05 мас.% М§8О₄-7Н₂О и 0,002 мас.% Ре8О₄-7Н₂О (рН 6,0), вносили инокулят культуры штамма О1ошеге11а С1п§и1а1а (1РО 6425), выращенной на скошенном агаре, и в течение 72 ч при 28°С встряхивали на ротационном шейкере при 165 об./мин. Затем эту предварительную культуру вносили в 20-литровый ферментер, содержавший 19 л стерильной среды такого же конечного состава, что и описанный выше для предварительной культуры. Кроме того, перед стерилизацией для подавления ценообразования добавляли еще 1,0 мл силиконового масла и 1,0 мл 8упрегоп1с (этоксилат кетоспирта). По завершении начальной фазы роста, продолжавшейся в течение 12 ч при повышенном давлении 0,7 бара, температуре 28°С, аэрации с расходом 20 л/мин и скорости перемешивания 350 об./мин, добавляли раствор 2,0 г 17в-гидрокси-7а-метилэстр-4-ен-3-она в 30 мл ДМФ. Далее продолжали перемешивание и аэрацию. Через 19 ч культуральный бульон собирали и в течение 16 ч экстрагировали 20 л метилизобутилкетона и в течение 23 ч 20 л метилизобутилкетона. Объединенные органические фазы концентрировали досуха. Остаток практически полностью растворяли в метаноле. Силиконовое масло отфильтровывали. Затем концентрировали и после хроматографии на силикагеле с использованием градиента растворителей дихлорметан/ацетон выделили 1,55 г (73%) 11а,17в-дигидрокси-7а-метилэстр-4-ен-3-она. После перекристаллизации из ацетона/диизопропилового эфира выделили 827 мг (39%) белых кристаллов с температурой плавления 163°С и [α]_ο= -16° (СНС1₃, с=0,501).

В 2-литровую колбу Эрленмейера после загрузки в нее 500 мл стерилизованного в течение 30 мин при 121°С в автоклаве питательного раствора, содержащего 0,5 мас.% глюкозы, 0,5 мас.% бактодрожжевого экстракта, 0,1 мас.% пептона и 0,2 мас.% жидкости, полученной после замачивания зерен кукурузы до набухания (рН 7,5), вносили четыре полученных криогенным путем шарика культуры штамма ВасШиз зрйаепсиз (АТСС 7055) и в течение 24 ч при 28°С встряхивали на ротационном шейкере при 165 об./мин. Затем эту предварительную культуру вносили в четыре 2-литровые колбы Эрленмейера, содержавших 500 мл стерильной среды такого же состава, что и описанный выше для предварительной культуры, при этом в каждую колбу инокулировали по 10% культурального бульона. По завершении начальной фазы роста, продолжавшейся в течение 4 ч при температуре 28°С с использованием ротационного шейкера при 165 об./мин, в каждую из четырех колб добавляли 50 мг 11а,17в-дигидрокси-7а-метилэстр-4-ен-3она в 2,5 мл ДМФ. Встряхивание продолжали еще в течение 48 ч. Объединенные культуральные бульоны дважды экстрагировали 2 л метилизобутилкетона. Объединенные органические фазы сушили над сульфатом натрия и концентрировали досуха. При этом получили 630 мг маслянисто-кристаллического остатка. После перекристаллизации из ацетона/диизопропилового эфира выделили 103 мг (49,2%) желтоватых кристаллов с температурой плавления 189°С и [α]_ο=+40,4° (СНС1₃, с=0,529) (непосредственная кристаллизация, без предварительной хроматографической очистки).

Пример 3.

В 2-литровую колбу Эрленмейера после загрузки в нее 500 мл стерилизованного в течение 30 мин при 121°С в автоклаве питательного раствора, содержащего 3 мас.% глюкозы, 1 мас.% жидкости, полученной после замачивания зерен кукурузы до набухания, 0,2 мас.% NаNО₃, 0,1 мас.% КН₂РО₄, 0,2 мас.%

- 12 008147

К₂НРО₄, 0,05 мас.% КС1, 0,05 мас.% Мд8О₄-7Н₂О и 0,002 мас.% Бе8О₄-7Н₂О (рН 6,0), вносили половину инокулята культуры штамма АкрегдШик осйгасеик (СВ8 13252), выращенного на скошенном агаре, и в течение 72 ч при 28°С встряхивали на ротационном шейкере при 165 об ./мин. Затем эту предварительную культуру вносили в 10-литровый ферментер, содержавший 9,5 л стерильной среды такого же конечного состава, что и описанный выше для предварительной культуры. Кроме того, перед стерилизацией для подавления ценообразования добавляли еще 0,5 мл силиконового масла и 0,5 мл 8уирегои1с (этоксилат кетоспирта). По завершении начальной фазы роста, продолжавшейся в течение 6 ч при повышенном давлении 0,7 бара, температуре 28°С, аэрации с расходом 5 л/мин и скорости перемешивания 350 об/мин, добавляли раствор 1,0 г 7а-метилэстр-4ен-3,17-диона в 15 мл ДМФ. Далее продолжали перемешивание и аэрацию. Через 22 ч культуральный бульон собирали и дважды в течение 4 ч экстрагировали 7 л метилизобутилкетона. Объединенные органические фазы концентрировали досуха. Остаток практически полностью растворяли в метаноле. Силиконовое масло отфильтровывали. Затем концентрировали и после хроматографии на силикагеле с использованием градиента растворителей дихлорметан/ацетон выделили 0,78 г (74%) 11а-гидрокси-7а-метилэстр-4-ен-3,17-диона. После перекристаллизации из ацетона/диизопропилового эфира выделили 311 мг (29,6%) белых кристаллов с температурой плавления 200°С и |α|_υ =+52° (СНС1₃, с=0,5905).

Б. Химический способ получения

Пример 4. Получение 11в-фтор-17в-гидрокси-7а-метилэстр-4-ен-3-она

а) 11 в-фтор-7а-метилэстр-4-ен-3.17-дион

К раствору 13,08 г 11а-гидрокси-7а-метилэстр-4-ен-3,17-диона (полученного предлагаемым в изобретении микробиологическим синтезом [раздел А]) в 250 мл толуола и 18,2 мл 1,8диазабицикло[5,4,0]ундец-7-ена при 0°С добавляли по каплям 11,5 мл фторангидрида перфторбутан-1сульфоновой кислоты. Через 1 ч нейтрализовали 2-молярной соляной кислотой, сливали на воду, четырежды экстрагировали этилацетатом, промывали насыщенным раствором хлорида натрия, сушили и концентрировали в вакууме. После хроматографии сырого продукта на силикагеле с использованием градиента растворителей гексан/этилацетат получили 8,7 г 11в-фтор-7а-метилэстр-4-ен-3,17-диона. Температура плавления 101,4°С, [а]_с=+135,8° (СНС1₃).

б) 11в-фтор-17в-гидрокси-7а-метилэстр-4-ен-3-он

Раствор 8,7 г 11в-фтор-7а-метилэстр-4-ен-3,17-диона в 148 мл тетрагидрофурана по каплям смешивали при 0°С с 29,5 мл 1-молярного алюмотритретбутоксигидрида лития и в течение 5,5 ч перемешивали при 0°С. Затем при 0°С добавляли разбавленную серную кислоту, после чего реакционный раствор сливали на смесь льда и воды, трижды экстрагировали этилацетатом, промывали до нейтрального состояния, сушили над сульфатом натрия, концентрировали в вакууме и хроматографировали на силикагеле с использованием гексана/этилацетата. В результате получили 5,8 г 11в-фтор-17в-гидрокси-7а-метилэстр4-ен-3-она с температурой плавления 143-144°С, [а]_с=+89,9° (СНС1₃).

Пример 5. Получение 11в-фтор-17в-(4-сульфамоилбензокси)-7а-метилэстр-4-ен-3-она

Раствор 500 мг 11в-фтор-17в-гидрокси-7а-метилэстр-4-ен-3-она в 7,5 мл пиридина смешивали при комнатной температуре с 750 мг 4-сульфамоилбензойной кислоты, 800 мг Ν,Νдициклогексилкарбодиимида и 125 мг η-толуолсульфоновой кислоты и перемешивали в течение 8,5 ч. Затем смесь сливали в раствор гидрокарбоната натрия, четырежды экстрагировали дихлорметаном, промывали до нейтрального состояния, сушили над сульфатом натрия, концентрировали в вакууме и хроматографировали на силикагеле с использованием дихлорметана/ацетона. В результате получили 302 мг 11в-фтор-17в-(4-сульфамоилбензокси)-7а-метилэстр-4-ен-3-она с температурой плавления 232°С, [α]π=+100,5° (СНС1₃).

Пример 6. Получение 17а-этинил-11в-фтор-17в-гидрокси-7а-метилэстр-4-ен-3-она

а) 11в-фтор-3-метокси-7а-метилэстр-3,5-диен-17-он

Раствор 2 г 11в-фтор-7а-метилэстр-4-ен-3,17-диона в 20 мл 2,2-диметоксипропана перемешивали совместно с 200 мг тозилата пиридиния в течение 6,5 ч при 80°С. Затем разбавляли этилацетатом, промывали раствором гидрокарбоната натрия и хлорида натрия, сушили над сульфатом натрия и концентрировали в вакууме. Таким путем получили 2 г сырого 11в-фтор-3-метокси-7а-метилэстра-3,5-диен-17-она.

б) 17а-этинил-11в-фтор-17в-гидрокси-7а-метилэстр-4-ен-3-он

Раствор 9,17 г хлорида церия(111) в 60 мл тетрагидрофурана по каплям смешивали при 0°С с 74,2 мл раствора этинилмагнийбромида (0,5-молярный раствор в тетрагидрофуране) и в течение 1 ч перемешивали при 0°С. Затем по каплям добавляли раствор 2 г сырого 11в-фтор-3-метокси-7а-метилэстр-3,5-диен17-она в 40 мл тетрагидрофурана и перемешивание продолжали еще в течение 3,5 ч при 0°С. Для последующей переработки добавляли насыщенный раствор хлорида аммония, сливали на воду, трижды экстрагировали этилацетатом, промывали полуконцентрированной соляной кислотой, раствором гидрокарбоната натрия и хлорида натрия, сушили над сульфатом натрия, концентрировали в вакууме и хроматографировали на силикагеле с использованием гексана/этилацетата. В результате получили 1,15 г чистого 17а-этинил-11в-фтор-17в-гидрокси-7а-метилэстр-4-ен-3-она с температурой плавления 218-220°С, [α]π=+19,2° (СНС1₃).

- 13 008147

Пример 7. Получение 17α-этинил-11β-фтор-17β-гидрокси-7α-метилэстр-5(10)-ен-3-она

а) 3,3-этандиилдиокси-17 а-этинил-11 β-фторН а-метилэстр-5(10)-ен-17β-ол

Раствор 700 мг 17α-этинил-11β-фтор-17β-гидрокси-7α-метилэстр-4-ен-3-она в 7 мл дихлорметана и 4,7 мл этиленгликоля перемешивали совместно с 2,3 мл триметилортоформиата и 30 мг гидрата птолуолсульфоновой кислоты в течение 6,5 ч при комнатной температуре. Затем смесь сливали в раствор гидрокарбоната натрия, трижды экстрагировали этилацетатом, промывали до нейтрального состояния, сушили над сульфатом натрия, концентрировали в вакууме и хроматографировали на силикагеле с использованием гексана/этилацетата. Таким путем получили 205 мг 3,3-этандиилдиокси-17α-этинил-11βфтор-7 а-метилэстр-5(10)-ен-17 β-ола.

б) 17α-этинил-11β-фтор-17β-гидрокси-7α-метилэстр-5(10)-ен-3-он

Раствор 205 мг 3,3-этандиилдиокси-17α-этинил-11β-фтор-7α-метилэстр-5(10)-ен-17β-ола в 27 мл метанола и 3,6 мл воды перемешивали совместно с 361 мг щавелевой кислоты в течение 24 ч при комнатной температуре. Затем смесь сливали в раствор гидрокарбоната натрия, трижды экстрагировали этилацетатом, промывали до нейтрального состояния, сушили над сульфатом натрия, концентрировали в вакууме и хроматографировали на силикагеле с использованием гексана/этилацетата. В результате получили 95 мг 17α-этинил-11β-фтор-17β-гидрокси-7α-метилэстр-5(10)-ен-3-она с температурой плавления 112-114°С.

Пример 8. Получение 17α-этинил-11β-фтор-7α-метилэстр-1,3,5(10)-триен-3,17β-диола

а) 11β-фтор-3-гидрокси-7α-метилэстра-1,3,5(10)-триен-17-он

Раствор 500 мг 11β-фтор-7α-метилэстр-4-ен-3,17-диона в 16,5 мл ацетонитрила перемешивали совместно с 400 мг бромида меди (II) в течение 6,5 ч при 25°С. Затем разбавляли этилацетатом, промывали раствором гидрокарбоната натрия и хлорида натрия, сушили над сульфатом натрия, концентрировали в вакууме и хроматографировали на силикагеле с использованием гексана/ацетона. Таким путем получили 280 мг чистого 11β-фтор-3-гидрокси-7α-метилэстр-1,3,5(10)-триен-17-она с температурой плавления 185-186°С.

б) 17а-этинил-11 β-фтор-7 а-метилэстра-1,3,5(10)-триен-3 ,Ηβ-диол

Суспензию 2,03 г хлорида церия(Ш) в 7,5 мл тетрагидрофурана по каплям смешивали при 0°С с 16,5 мл раствора этинилмагнийбромида (0,5-молярного в тетрагидрофуране) и в течение 0,5 ч перемешивали при 0°С. Затем по каплям добавляли раствор 280 мг 11β-фтор-3-гидрокси-7α-метилэстр-1,3,5(10)триен-17-она в 2,8 мл тетрагидрофурана и перемешивание продолжали еще в течение 3,5 ч при 0°С. Для последующей переработки добавляли насыщенный раствор хлорида аммония, затем сливали на воду, четырежды экстрагировали этилацетатом, промывали до нейтрального состояния, сушили над сульфатом натрия, концентрировали в вакууме и хроматографировали на силикагеле с использованием гексана/этилацетата. В результате получили 220 мг 17α-этинил-11β-фтор-7α-метилэстр-1,3,5(10)-триен-3,17βдиола с температурой плавления 115-117°С.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Микробиологический способ получения 7а-замещенных 11 α-гидроксистероидов общей формулы 4,В в которой

К⁷ представляет собой группировку Р-Р, где

Р обозначает С₁-С₄алкилен, а р обозначает водород, С₁-С₄алкил или С₁-С₄фторалкил, и эта группировка Р-р через Р связана со стероидным каркасом,

К¹⁰ может находиться в α- либо β-положении и представляет собой Н, СН₃ или СР₃ и

К¹³ представляет собой метил или этил, заключающийся в том, что 7а-замещенный стероид общей формулы 3,А

- 14 008147 в которой К⁷, К¹⁰ и К¹³ имеют указанные выше значения, гидроксилируют и окисляют с использованием микроорганизма, выбранного из группы, включающей Лзрег§111из зр., Веаиуепа зр., С1отеге11а зр., Спотота зр., Нар1озроге11а зр. и КЫ/ориз зр.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что микроорганизм выбран из группы, включающей Лзрегдй1из аххптоп, Лзрег§111из йзсйеп, ЛзрегдШиз тайдпиз, ЛзрегдШиз т§ег, Веаиуепа Ьазз1апа, О1отеге11а стци!а1а, Спотота стцикПа, Нар1озроге11а НезрегеШса и КЫ/ориз з1о1от£ег.
3. Микробиологический способ получения 7а-замещенных 11а-гидроксистероидов общей формулы 4,В в которой К⁷ представляет собой группировку Р^, где

Р обозначает С₁-С₄алкилен, а С обозначает водород, С₁-С₄алкил или С₁-С₄фторалкил, и эта группировка Р-9 через Р связана со стероидным каркасом,

К¹⁰ может находиться в α- либо β-положении и представляет собой Н, СН₃ или СР₃ и

К¹³ представляет собой метил или этил, заключающийся в том, что 7а-замещенный стероид общей формулы 3,А в которой К⁷, К¹⁰ и К¹³ имеют указанные выше значения, на первой стадии микробиологического способа с использованием соответствующего микроорганизма, выбранного из группы, включающей ЛзрегдШиз зр., Веаиуепа зр., С1ЬЬег-е11а зр., О1отеге11а зр., Спотота зр., Ме1аггЫ7шт зр., №§гозрога зр., КЫ/ориз зр. и УегйсШшт зр., гидроксилируют в положении 11α с образованием 7а-замещенного 11α- в которой

К⁷, К¹⁰ и К¹³ имеют указанные выше значения, затем образованный 7а-замещенный 11α- 15 008147 гидроксистероид общей формулы С на второй стадии микробиологического способа с использованием другого микроорганизма, выбранного из группы, включающей ВасШиз зр., МусоЬас1епит зр., ^сагШа зр. и Рзеидотопаз зр., окисляют с образованием 7α-замещенного стероида общей формулы 4,В.
4. Способ по п.3, отличающийся тем, что используемый на первой стадии микроорганизм выбран из группы, включающей ЛзрегдШиз таРдпиз, ЛзрегдШиз те11еиз, ЛзрегдШиз шдег, ЛзрегдШиз осИгасеиз, Веаиуепа Ьазз1апа, О1ЬЬеге11а ГиркшШ, О1ЬЬеге11а /еае, О1отеге11а сшди1а!а, О1отеге11аГизаго1д.ез, Опотота стдикПа, Ме1агг1и/1ит ашзорПае, №дгозрога зрИаепса, ВЫ/ориз огу/ае, ВЫ/ориз з!о1ошГег и Vе^ΐ^с^11шт ёаЫ1ае.
5. Способ по пп.3 и 4, отличающийся тем, что используемый на второй стадии микроорганизм выбран из группы, включающей ВасШиз 1асРтогЬиз, ВасШиз зрИаепсиз, МусоЬас1епит пеоаигит, МусоЬас1епит зтедтаРз, ^сагШа согаШпа, ^сагШа д1оЬеги1а, ^сагФа т1шта, ^сагШа гезРгсШз, ^сагШа гиЬгорегРпс1а, ^сагШа за1тошсо1ог и Рзеидотопаз 1ез1оз1егопт
6. Микробиологический способ получения 7α-замещенных 11 α-гидроксистероидов общей формулы 4,В в которой

В⁷ представляет собой группировку Р-0, где

Р обозначает С₁-С₄алкилен, а О обозначает водород, С₁-С₄алкил или С₁-С₄фторалкил, и эта группировка Р-0 через Р связана со стероидным каркасом,

В¹⁰ представляет собой Н, СН₃ или СЕ₃ и

В¹³ представляет собой метил или этил, заключающийся в том, что 7α-замещенные стероиды общей формулы Ώ в которой

В⁷, В¹⁰ и В¹³ имеют указанные выше значения, гидроксилируют с использованием микроорганизма, выбранного из группы, включающей Веаиуепа зр., Сигуи1апа зр., О1ЬЬеге11а зр., О1отеге11а зр., Опотоша зр., Нар1озроге11а зр., Нейсоз1у1ит зр., №дгозрога зр. и 8упсерИа1аз1гит зр.
7. Способ по п.6, отличающийся тем, что микроорганизм выбран из группы, включающей Веаиуепа Ьазз1апа, Сигуи1апа 1ипа1а, О1ЬЬеге11а /еае, О1отеге11а стдикПа, О1отеге11а Гизаго1дез, Опотоша сшди1а!а, Нар1озроге11а ИезрегеШса, НеПсоз1у1ит рШГогтае, №дгозрога зрйаепса и 8упсерйа1аз1гит гасетозит.
8. Микробиологический способ по одному из пп.1-7, отличающийся тем, что В⁷ представляет собой СН3.
9. Микробиологический способ по одному из пп.1-8, отличающийся тем, что В¹⁰ представляет собой Н.
10. Микробиологический способ по одному из пп.1-9, отличающийся тем, что В¹³ представляет собой СН3.