WO2003000771A1 - Copolymere bloc a taux d'impuretes reduit, support polymere, preparations pharmaceutiques sous forme polymere et procede de preparation associe - Google Patents

Copolymere bloc a taux d'impuretes reduit, support polymere, preparations pharmaceutiques sous forme polymere et procede de preparation associe Download PDF

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WO2003000771A1
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WO
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block copolymer
group
amino acid
salt
impurities
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PCT/JP2002/006112
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French (fr)
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Takeshi Nakanishi
Kazuhisa Shimizu
Ryuji Uehara
Masanobu Suzuki
Megumi Machida
Tomoko Akutsu
Shigeto Fukushima
Original Assignee
Nippon Kayaku Kabushiki Kaisha
Japan Science And Technology Agency
Sakurai, Yasuhisa
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    • C08G69/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming a carboxylic amide link in the main chain of the macromolecule
    • C08G69/40—Polyamides containing oxygen in the form of ether groups
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    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Definitions

  • Block copolymer with reduced impurity content Polymer carrier, polymer drug formulation, and method for producing same
  • the present invention can be used also as a carrier at the yarn side for transporting drugs and the like.
  • the present invention relates to molecular pharmaceutical preparations and methods for producing them. Further, the present invention relates to a method for quantifying impurities in the block copolymer.
  • purification by precipitation is widely practiced as a method that can be used industrially.
  • This method is a method of purifying by removing impurities using a difference in solubility in a solvent, and removing low molecular weight components contained in a synthetic polymer compound such as a block copolymer. Is an excellent way.
  • impurities having a high molecular weight such as polyethylene glycols and polyacidic amino acids
  • the difference in solubility between the synthetic polymer compound such as a block copolymer and the solvent and the solvent is low. To a small extent, it has not been possible to sufficiently purify synthetic polymer compounds such as block copolymers by precipitation.
  • the removal of impurities having a high molecular weight contained in the block copolymer is not sufficient, and a purification method for obtaining a block copolymer that can be used for pharmaceutical preparations and the like is still not available. unknown.
  • a synthetic polymer such as a block copolymer is dissolved in a solvent and a high-performance liquid chromatography connected to a gel filtration column is used.
  • the present inventors have conducted intensive studies to solve the above-mentioned problems, and have found that Completed the invention.
  • R 1 represents a hydrogen atom or a lower alkyl group
  • R 2 represents a bonding group
  • R 3 represents a methylene group or an ethylene group
  • R 4 represents a hydrogen atom or an amino-protecting group.
  • n is an integer of 5 — 100
  • m is an integer of 2 — 3 0
  • X is an integer of 0 — 300, where X is greater than m. It is not good.
  • R 1 is an alkyl group having 1 to 5 carbon atoms
  • R 2 is an alkylene group having 1 to 5 carbon atoms
  • R 3 is a methylene group or an ethylene group
  • R 4 is a hydrogen atom Or an acyl group having 1 to 5 carbon atoms, where n is an integer from 5 to 100, m is an integer from 2 to 300, and x is an integer from 0 to 300, but X is larger than m.
  • R 1 turtle methyl group of the general formula (1) R 2 is Application Benefits methylene down group, R 3 is methylene, R 4 is Ri Asechiru group der, n represents 2 0- 5 0 0, m is The block copolymer or salt thereof according to the above 4), wherein 10 to 100, X is an integer of 0 to 100, and x is not larger than m.
  • the block copolymer-drug complex is in the form of a freeze-dried product.
  • the solvent is water that may contain an organic solvent that is miscible with water
  • the resin is a distributed adsorption resin capable of adsorbing a compound having an ether bond
  • the impurities are polyacidic amino acids.
  • the first embodiment of the present invention relates to a block copolymer of polyethylene glycols and a polyamic amino acid, or a salt thereof, having an impurity content of 10% by weight or less. .
  • the impurities were found to be polyethylene. It was clarified that the product was a glycol, and a polyamino acid, that is, a polyamino acid having a carboxylic acid as a side chain.
  • Polyethylene glycols include polyethylene glycol, one-end alkoxypolyethylene glycol, and the like.
  • Polyacid amino acids include polyglutamic acid and polyaspartic acid.
  • poly (amino acid) in the block copolymer of polyethylene glycols and poly (amino acid) one having a carboxyl group in the side chain and / or —
  • a polymer of amino acid preferably polyamino acid or polyaspartic acid.
  • the block copolymer include, for example, the above-mentioned general polymers.
  • R 1 represents a hydrogen atom or a lower alkyl group
  • R 2 represents a bonding group
  • R 3 represents a methylene group or an ethylene group
  • R 4 represents a hydrogen atom or an amino group protecting group.
  • n is an integer from 5 to 100
  • m is an integer from 2 to 300
  • X is an integer from 0 to 300, but X is not greater than m.
  • R 1 a hydrogen atom or a lower alkyl group can be mentioned, and a lower alkyl group is preferable. Specifically, a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, and an i-propyl group are preferred. Examples thereof include a pill group, and a methyl group is particularly preferable.
  • the linking group for R 2 include a hydrocarbon which may be branched, preferably an alkylene group, and specifically, an ethylene group, a trimethylene group, and a tertiary group. Examples thereof include a trimethylene group and the like, and an ethylene group and a trimethylene group are particularly preferable.
  • R 3 include a methylene group or an ethylene group, and a methylene group is preferred.
  • R 4 examples include a protecting group for a hydrogen atom or an amino group, and the protecting group for an amino group is not particularly limited as long as it is a commonly used amino group protecting group. And a lower acetyl group, specifically, a formyl group, an acetyl group, a propionyl group, a butylyl group and the like, and an acetyl group is particularly preferable.
  • n is an integer from 5 — 1 0 0 0, preferably 20-500, particularly preferably 80-300, m is 2 — 300, preferably 10 — 100, especially preferred is an integer of 20 — 50, X is 0 — 300, preferably 0 — 100, Particularly preferred is an integer from 0 to 50, where X is not greater than m.
  • Examples of the salt of the block copolymer in the present invention include an alkali metal salt, an alkaline earth metal salt, an ammonium salt, an organic ammonium salt and the like, for example, a sodium salt, a potassium salt, and the like. Salt, calcium salt, ammonium salt, triethyl ammonium salt and the like are preferred.
  • the impurities contained in the block copolymer do not form micelles and are considered to have no performance as a polymer carrier for drugs, genes, and the like. Is preferably 10% or less, more preferably 5% or less.
  • the polyethylene glycols are ion-exchanged. Polyethylene glycol, which is purified by resin to obtain a pro-sodium copolymer with polyacidic amino acid, and after removing protective groups as necessary, is purified using a partition adsorption resin. Block copolymers of choles and poly (amino acids) or block copolymers of poly (ethylene glycols) and poly (amino acids) related to the method for producing these salts.
  • the above-mentioned polyethylene glycols and polyamic acid Block copolymers similar to pro- and link copolymers with phosphoric acid are preferred. Good.
  • the protecting group is not particularly limited as long as it protects the carboxylic acid group of the side chain of the acidic amino acid. Examples thereof include an ester with a lower alcohol and substitution. And an ester with an aryl group-substituted lower alcohol which may be used. Specific examples include methyl ester, ethyl ester, propyl ester, butyl ester, benzyl ester, phenyl ester, p-methoxybenzyl ester, and p-nitrobenzyl ester.
  • an appropriate method usually used depending on the protecting group can be used, for example, hydrolysis with an acid or an alkali, hydrogenolysis with a catalyst, or the like. No.
  • the block copolymer can be produced by various methods.
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. H06-26832 discloses one end of the block copolymer.
  • a method is described in which a hydroxy-terminated derivative of methoxypolyethylene glycol is modified with an aspartic acid derivative to polymerize it, protect the amino group, and hydrolyze the ester bond to produce the product. Purification methods to obtain highly efficient block copolymers are not yet available. Not known.
  • Modification of one-terminal methoxypolyethylene glycol to an amino group at the hydroxyl group terminus can be carried out by using a reaction known in the art, for example, a method of reacting ethyleneimine or the like, an acrylonitrile, or the like.
  • a method of adding Michael to rilonitrile and the like and then reducing the nitrile group and converting it to an amino group, and replacing the hydroxyl group with a halogen group and then adding an alcohol such as ethanolamine It can be carried out by a method of reacting monoamine, a method of directly converting a hydroxyl group to a nitrile group, and then reducing and converting it to an amino group.
  • Polyethylene glycols whose ends have been modified to amino groups include polystyrene glycols at one end that are incompletely modified, such as polyethylene glycol at one end having a hydroxyl group at the end or at the end. Contains polyethylene glycol at one end to which acrylonitrile is added.
  • Polyethylene glycols that are not completely denatured can be separated and removed by using an ion exchanger having an acidic functional group.
  • the ion exchanger used is not particularly limited as long as it has an acidic functional group.
  • Examples of the ion exchange resin include Diaion SKIB (manufactured by Mitsubishi Chemical Corporation) and Diaion PK-216 (Mitsubishi Chemical).
  • Daikin WK—10 Mitsubishi Chemical Corporation
  • Diaion WK20 Mitsubishi Chemical
  • Amberlite 120B Roam 'And'Noise' Japan
  • FANNOLIGHT 200C Roam 'And'Noise Japan
  • Amberlite IRC—50 Roam'And'Noise Japan Japan
  • Amberlite door IRC 7 6 mouth one-time 'A down de Bruno, made Ichisu di ya Roh 1?
  • CM—Sephadex 650 (Pharmacia) and the like can be used.
  • SP—Toyopearl 65,0 and CM-Sephadex 650 are preferably used.
  • unmodified end-end methoxypolyethylene glycol Is dissolved in a solvent.
  • the solvent used is not particularly limited as long as it can be used for ion exchange, but water or a mixed solvent of water and an organic solvent, for example, water / methanol, water / acetonitrile, and the like are preferable.
  • methoxypolyethylene glycol having a terminal modified with an amino group at one end is reacted with, for example, N-carboxylic acid anhydride of an amino acid having a carboxyl group in the side chain protected, to obtain a protein.
  • the terminal amino group is acetylated with acetic anhydride or the like, if necessary.
  • the protecting group on the side chain is deprotected to obtain a poly (ethylene glycol) acidic amino acid block copolymer.
  • the acid block copolymer contains a polyacidic amino acid as an impurity, but can be purified by a partition adsorption resin.
  • the distribution adsorption resin include silica gel, silicate powder, silica gel modified with hydrocarbon, styrene-divinylbenzene resin, etc., and preferably, styrene-vinylvinylbenzene resin.
  • HP-20 SS manufactured by Mitsubishi Chemical Corporation
  • the method for purifying the obtained poly (ethylene glycol) poly (amino acid acid block copolymer) may be the batch method.
  • the column method may be used, but preferably, the column method is used.
  • a polyethylene glycol-polyacid amino acid block copolymer is dissolved in a solvent.
  • the solvent used is not particularly limited as long as it has a basic property to dissociate the polyacidic amino acid and can be used for the partition adsorption resin.
  • a mixed solvent of an aqueous solution of a metal hydroxide and an organic solvent, for example, an aqueous solution of sodium hydroxide-methanol, and an aqueous solution of sodium hydroxide-acetonitrile are preferred.
  • Polyethylene glycol-poly (acidic amino acid block copolymer solution) dissolved in a solvent is passed through a column filled with a partitioning / adsorption resin, and then a 7i aqueous solution of sodium oxide Alternatively, a mixed solvent of an aqueous sodium hydroxide solution and an organic solvent is passed through a column to remove the polyamic acid. After that, a less polar solvent, For example, the adsorbed poly (ethylene glycol) acidic amino acid block copolymer is eluted using a mixed solvent of water and organic solvent with an increased ratio of organic solvent.
  • a purified block copolymer of polyethylene glycol and a poly (amino acid) is condensed with an anthracycline anticancer agent. And a high molecular weight carrier obtained by the above method.
  • Examples of the molecular carrier include those represented by the following general formula (3) or (4).
  • the present invention also includes these o salts.
  • R represents a hydroxyl group or an anthracycline anticancer drug residue
  • R 1 represents a hydrogen atom or a lower alkyl group
  • R 2 represents a bonding group
  • R 3 represents a methylene group or an ethylene group.
  • R 4 represents water Represents an elementary atom or a protecting group for an amino group
  • n is an integer of 5—100
  • m is an integer of 2—300
  • x + y is an integer of 0—300
  • x + y is not greater than m.
  • R in the compound of the general formula (3) or (4) in the present invention include a hydroxyl group or an anthracycline anticancer drug residue.
  • the bonding order of the constituent parts is not limited, and may be random or regular.
  • the binding mode between the side chain carboxylic acid residue of the polyacidic amino acid portion of the block copolymer and the anthracycline anticancer drug residue is not particularly limited, but the anthracycline type
  • An amide bond with an amino group of an anticancer drug is preferred.
  • an amide bond by a primary amino group of an amino sugar moiety of an anthracycline anticancer drug is preferable.
  • the ratio of the binding of the anthracycline anticancer drug to the side chain carboxylic acid residue of the poly (amino acid) moiety is 1 to 100%, and micelles are formed. Considering the ability to perform, 10 to 60% is preferable, and 30 to 55% is particularly preferable.
  • the residue of an anthracycline-based anticancer agent include residues such as daunorilevicin, doxorubicin, aclarubicin, epirubicin, and pyrarubicin, but a doxorubicin residue is preferable. .
  • R 1 , R 2 , R 3 , R 4 , n and m preferably have the same range as described above. Good.
  • X + y represents an integer of 0 — 300, preferably 0 — 100, particularly preferably 0 — 50, and X and y are integers satisfying the above conditions. It can be any value, including zero.
  • a block copolymer of purified poly (ethylene glycol) and poly (amino acid) is condensed with a reaction aid, and then the condensed compound
  • the present invention relates to a method for producing a polymer carrier by reacting an anthracycline-based anticancer agent after separating the same.
  • the polymer carrier is prepared by the method disclosed in International Publication No. WO97 / 12895 panflett, that is, a block copolymer and an anthracycline anticancer agent are carbodimidized.
  • the above production method can be used for both purified and purified
  • the polymer is dissolved in an organic solvent, a dehydrating condensing agent and a reaction aid are added to react, the alkyl urea derivative generated by the reaction is filtered, and the active ester is separated from the filtrate. Subsequently, after adding an anthracycline-based anticancer drug or a salt thereof in an organic solvent to the obtained active ester form, a base is added if necessary, and the reaction is carried out. Let go.
  • the organic solvent is not particularly limited as long as the reactant is dissolved, but a non-aqueous polar solvent is preferable, and examples thereof include dimethylformamide, dimethylacetamide, and 1,3-dimethyl-1--2-yl. Midazolidinone and the like, and dimethylformamide is preferred.
  • a condensing agent usually used for peptide synthesis is used, and dicyclohexyl carpoimide (DCC) or the like is used.
  • DCC dicyclohexyl carpoimide
  • EDC Ethyl 3— (3—Dimethylaminopropyl) Carbodiimide
  • reaction aid a reaction aid usually used for peptide synthesis is used.
  • an N-hydroxy compound may be mentioned, and N-hydroxysuccinimide N-hydroxypentazotriazole is preferred.
  • the base used is not particularly limited, but an organic base such as triethylamine is preferred.
  • an anthracycline anticancer drug the anthracycline anticancer drug which provides the above antracecycline anticancer drug residue Compounds.
  • an anthracycline-based anticancer drug is contained in the inner core of micelles formed by a polymer carrier produced from a block copolymer of purified polyethylene glycol and polyacid amino acid.
  • the present invention relates to a high-molecular-weight pharmaceutical preparation comprising an encapsulated block copolymer-drug complex.
  • the anthracycline-based anticancer drug include daunorubicin, aclarubicin, epirubicin, pyrarubicin and the like, and salts thereof, and doxorubicin or a salt thereof is preferable.
  • one embodiment of the present invention is a high-molecular-weight pharmaceutical preparation containing the block copolymer-drug complex in the form of a lyophilized product.
  • the method for producing the polymer pharmaceutical preparation is not particularly limited. However, the method described in JP-A-7-690900, that is, a method in which a block copolymer and an anthracycline anticancer agent are dissolved, is used. A mixed solvent of dimethylformamide and water may be subjected to a dialysis operation using a dialysis membrane and an ultrafiltration operation using an ultrafiltration membrane, and a freeze-drying method may be applied as necessary.
  • the block copolymer and the anthracycline anticancer agent in a mixed solvent of water and a low boiling point organic solvent miscible with water such as ethanol, and concentrating the resulting solution.
  • a method may be employed in which the low-boiling organic solvent is distilled off and freeze-dried as necessary.
  • the sixth aspect of the present invention is directed to the above-mentioned polyethylene glycols and In quantifying impurities in the block copolymer with the acidic amino acid, the block copolymer was dissolved in a solvent, the solution was treated with a resin, and the treated solution was subjected to gel filtration column. High-performance liquid chromatography A method for quantitative determination in one process.
  • the block copolymer of the polyethylene glycols and the poly (amino acid) in the present invention and the impurities in the block copolymer are as described above.
  • the solvent for dissolving a block copolymer of polyethylene glycols and polyamic amino acid in the quantitative analysis of polyethylene glycols as impurities is as follows. Any solvent that can dissolve the block copolymer can be used, but is preferably an aqueous solution whose pH has been adjusted with an appropriate salt, or an organic solvent such as a solvent. A mixed solvent with evening ethanol, ethanol, acetonitril, tetrahydrofuran, or the like is used.
  • a salt used for preparing the pH a salt having a buffering action which is usually used can be used, but phosphate, borate, sodium hydrogencarbonate, and fluoric acid can be used. Salt and tris hydrochloride are preferred.
  • Solvents for quantifying polyamino acids as impurities include polyethylene glycols and polyacid amino acids when measuring polyethylene glycols.
  • Dissolve block copolymer with acid Any solvent capable of dissociating the side chain carboxylic acid can be used, but is preferably an aqueous solution whose pH has been adjusted by a suitable salt, or an aqueous solution thereof or an organic solvent.
  • a mixed solvent with a solvent for example, methanol, ethanol, acetonitril, tetrahydrofuran, or the like is used.
  • the solvent preferably has a pH of 5 to 13 for dissociating the carboxylic acid in the side chain, and the salts used for this purpose include the above-mentioned phosphates, borates and sodium bicarbonate. Umium salt, fumarate, tris hydrochloride, etc. are used.
  • a resin for treating a solution of the block copolymer when quantifying the polyethylene glycol contained as an impurity in the block copolymer comprises the block copolymer.
  • ion-exchange resins capable of forming counter-ions with the ion-dissociating groups of the copolymer i.e., anion-exchange resins, such as dialkylamines, trialkylamines, and dialkylamineamines.
  • anion-exchange resins such as dialkylamines, trialkylamines, and dialkylamineamines.
  • Any substance having a basic functional group such as can be used without any particular limitation.
  • the analytical method may be the column method or the notch method, but preferably the column method.
  • ion-exchange resins such as DIAION SA10A (Mitsubishi Chemical), DIAION PA318 (Mitsubishi Chemical), and DIAION SA20A (Mitsubishi Chemical) Made), Diaion WA30 (Mitsubishi Chemical), Diaion WA10 (Mitsubishi Chemical), Amberlite IRA402 (Machine 'And' Haas Jiannon), Amberlite MR904 (Rohm 'And' Haas Japana), Amberlite IRA410 (Rohm 'And' Haas Jiyano, "Nam”), Amberlite G IRA 93 (made by ROHM & NODE NO. 1 JANON), Amberlite IRA 68 (made by ROHM & NO.
  • the polyethylene glycols eluted without being adsorbed to the resin after the above resin treatment were used.
  • the carrier of the gel filtration column used for the determination of impurities in the present invention is not particularly limited as long as it is used in high-performance liquid chromatography, but the impurities in the block copolymer are roughly determined.
  • a material having an exclusion limit molecular weight suitable for the molecular weight of the compound is used.
  • polyethylene glycol for example, S h 0 de 0 H pak SB—803 HQ (Showa Denko), Shodex 0 H pak SB—800.25 HQ (Showa Denko), Shodex 0 H pak SB—804 HQ (Showa Denko)
  • Asahipak GF-310 HQ Asahi Kasei Kogyo
  • Asahipak GF-510 HQ Asahi Kasei Kogyo
  • Etc. can be used.
  • Asahipak GS-320 HQ manufactured by Asahi Kasei Corporation
  • Shodex OH pak Q-802 manufactured by Showa Denko KK
  • the high performance liquid chromatography performed in the present invention can be performed by a commercially available high performance liquid chromatography apparatus.
  • the resin for treating the copolymer solution is preferably a resin that adsorbs the block copolymer having an ether bond, that is, a distribution adsorption resin, such as silica gel, silicate powder, and hydrocarbon. And modified vinyl gel resin.
  • a silica gel modified with a hydrocarbon a silica gel modified with a hydrocarbon having 1 to 30 carbon atoms is preferable, and a silica gel modified with a hydrocarbon having 4 to 18 carbon atoms is preferable.
  • Series Force gels are particularly preferred.
  • the analysis method may be either the column method or the Notch method, but preferably the column method.
  • a column packed with a commercially available distribution adsorption resin can be used, and a column of any size can be used.
  • commercially available solid-phase extraction columns for analysis for example, Sep —: Pak C 18 (manufactured by Wow Products), Sep —; Pak C 18 (manufactured by Wo Isuzu) ), Sep — Pak C 8 (War Yuichis) Bond E 1 ut C 18 (Varian), Bond Elut C 8 (Norian) etc. can also be used.
  • Sep-Pak C18 is preferably used.
  • polyacidic amino acid contained as an impurity in the block copolymer For the determination of polyacidic amino acid contained as an impurity in the block copolymer, a solution dissolved in a solvent capable of dissociating carboxylic acid was subjected to the above resin treatment, and eluted without being adsorbed to the resin. This is possible by quantifying the polyamic acid thus obtained by high performance liquid chromatography using a gel filtration column. This method allows the eluted solution to be concentrated to a high concentration, thus enabling highly sensitive quantitative analysis of polyamic amino acids.
  • Amount of impurities contained in block copolymer Impurities Do not purify Perform purification Polyethylene glycols 6.0% by weight
  • Polyaspartic acid 7.5% by weight 2.4% by weight
  • the reaction mixture was diluted with diisopropilene (IPE) 4.7 Toluene and ethanol (EtOH) was added dropwise to a mixed solvent of 0.53 liters, and the resulting precipitate was filtered and mixed with a mixed solution of IPE and EtOH (9: After washing with 1) and IPE, vacuum-drying was performed to obtain 11.67 g of methoxypolyethylene glycol monopoly ( ⁇ -benzyl L-aspartate) copolymer N-acetylated compound at one end.
  • IPE diisopropilene
  • EtOH ethanol
  • the obtained lyophilized product was dissolved in 320 mL of dimethylformamide (DMF) and added dropwise to a mixed solvent of 2.56 liter of hexane and 0.64 liter of ethyl acetate. .
  • the deposited precipitate is filtered, washed with a mixed solution of hexane and ethyl acetate (4: 1) and hexane, dried in vacuo, and then dried in vacuo at the end of methoxypolyethylene glycol aspartic acid.
  • 33.20 g of a copolymer N-acetyl compound was obtained.
  • One-terminal methoxypolyethylene glycol-polyaspartic acid copolymer N-acetylated compound 28.85 g obtained in Production Example 4 was dissolved in 577.7 mL of dimethylformamide, and the solution was dissolved at 35 ° C. Heated. 19.75 g of dicyclohexylcarpoimide (DCC) and 11.01 g of N-hydroxysuccinimide (HOSu) were caloried and reacted for 1 hour. The produced dicyclohexyl urea was filtered with a cotton plug. After the obtained filtrate was diluted with 2.3 liters of ethyl acetate, 3.5 liters of hexane was added to the filtrate.
  • DCC dicyclohexylcarpoimide
  • HOSu N-hydroxysuccinimide
  • the precipitated precipitate is filtered, washed with a hexane: ethyl acetate (3: 1) solution, and dried under vacuum to obtain a methoxypolyethylene glycol at one end. There were obtained 33.82 g of an N-acetylated mono-H0Su active ester in a call-polyaspartic acid copolymer.
  • the reaction mixture was added dropwise to a mixed solvent of 4.0 liters of ethyl acetate and 16.0 liters of hexane, and the deposited precipitate was filtrated, and a hexane: ethyl acetate (3: 1) solution was used. After washing, it was dried under vacuum. Next, the obtained precipitate is suspended in 590 mL of acetonitrile, and thereto is added 178 OmL of water, and the mixture is heated and stirred at 35 ° C. After confirming that the precipitate was dissolved, stirring was continued for 1 hour, and then the reaction solution was concentrated under reduced pressure to remove acetonitril and freeze-dried.
  • the obtained lyophilized product was redissolved in 1.074 liter of dimethylformamide, and the solution was dissolved in a mixed solvent of 2.15 liter of ethyl acetate and 8.60 liter of hexane. Was dropped.
  • the deposited precipitate is filtered, washed with a hexane: ethyl acetate (3: 1) solution, and dried in vacuo. Dry.
  • the precipitate obtained at the end was suspended in 1074 mL of anhydrous ethanol, and stirred at 35 ° C for 2 hours. The suspension was filtered, washed with anhydrous ethanol, and then washed.
  • Example 1 One hour later, the solution was filtered through a membrane filter (Millipore; GV evening: 0.22 m), and the solvent was distilled off under reduced pressure to remove the block copolymer-drug complex. A body solution is obtained, freeze-dried, and 22.96 g of a freeze-dried product of the lock copolymer-drug complex was obtained.
  • a membrane filter Micropore; GV evening: 0.22 m
  • N-acetylated compound-doxorubicin condensate 50 mg obtained in Production Example 6 was precisely weighed, and 4% SDS: acetonitrile was obtained. (1: 1) solution was dissolved in 25 mL. This solution was analyzed by high performance liquid chromatography under the following conditions. The content of free doxorubicin hydrochloride was 1.29% by weight, the impurity derived from doxorubicin was 0.15% by weight (absorbance).
  • polyethylene glycols and polyamino acids contained as impurities in a block copolymer of polyethylene glycols and polyamino acids have been removed. It is possible to provide high-purity block copolymers, and to produce polymer carriers that can be used as pharmaceutical or gene carriers by condensing them with antitracycline anticancer drugs. In addition, it is possible to provide a high-molecular-weight pharmaceutical preparation containing an anthracycline anticancer drug in the core of micelles formed by the high-molecular carrier.
  • the present invention it is possible to quantify impurities such as polyethylene glycols and polyacidic amino acids having a carboxylic acid in the side chain in the block copolymer. Thus, it is possible to obtain useful information for improving the method for producing block copolymers, formulating production standards and controlling processes.

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Description

明 不純物含有量の低減したブロ ッ ク共重合体、 高分子担体及び高分子医薬製剤並びにその製造方法
技術分野 本発明は、 薬物等を運搬する糸際に担体と しても使用され得る 田
純度の高いプロ ッ ク共重合体及び該プロ ッ ク共重合体にアン ト ラサイ ク リ ン系制癌剤の縮合した、 薬剤担持にも使用 し得る高 分子担体及び該高分子担体によって形成される高分子医薬製剤 並びにそれらの製造法に関する。 さ ら に、 本発明は該ブロ ッ ク 共重合体中の不純物の定量方法に関する。 背景技術 ミ セルを形成する高分子担体を用い、 薬物、 遺伝子等を生体 内の目的の場所に運搬しょう とする試みは知られているが、 当 該用途に使用される プロ ッ ク共重合体において不純物の除去が 十分になされていたとは必ずしも言えない。 プロ ッ ク共重合体等の合成高分子化合物の精製は、 従来、 透 析、 限外ろ過、 沈析等の方法で行われてきた。 透析、 限外ろ過による精製法は、 分子量の差に着目 して分離、 精製を行う 方法であ る。 一般に透析膜、 限外ろ過膜は、 膜を透 過でき る最大分子量によ つて種類分けされているが、 その分画 分子量の精度には、 大きな幅がある。 従って、 透析、 限外ろ過 によ り ブロ ッ ク共重合体等合成高分子を精製する方法では、 目 的とする合成高分子の分子量と不純物の分子量との間に大きな 差がない場合には、 十分な精製を行う こ とができなかった。 ま た、 これらの方法は工業的には不向きであ り 、 も っぱら実験室 における精製法である。
—方、 沈析による精製法は、 工業的にも対応可能な方法と し て広 く 実施されている。 この方法は溶媒に対する溶解度の差を 利用 して不純物を除去する こ とによ り 精製する方法であ り 、 ブ ロ ッ ク共重合体等の合成高分子化合物に含まれる低分子量成分 を除去するには優れた方法である。 しか しながら、 ポ リ エチレ ングリ コール類ゃポ リ酸性ア ミ ノ酸等の分子量が大きい不純物 の場合、 プロ ッ ク共重合体等の合成高分子化合物と不純物の溶 媒への溶解度の差が少な く 、 沈析によ り プロ ッ ク共重合体等合 成高分子化合物を十分に精製する こ とはで きていない。
このよう に、 ブロ ッ ク共重合体に含まれる、 分子量の大きな 不純物の除去は十分ではな く 、 医薬製剤等にも使用でき る よう なプロ ッ ク共重合体を得るための精製法は未だ知 られていない。
さ ら に、 ミ セル形成性両親媒性プロ ッ ク共重合体について、 ブロ ッ ク共重合体中の不純物を定量するための従来方法も満足 な分析結果を与えるものではなかった。
プロ ッ ク共重合体等の合成高分子は、 従来方法では、 溶媒に 溶解し、ゲルろ過カラムを接続した高速液体クロマ ト グラフ ィ一
V g e 1 p e r me a t i o n c h r o ma t o g r a p h y : G P C ) によって分析されていた。
しかし、 プロ ヅク共重合体とこれに含まれる不純物の間の分子 量の差が小さい場合、 両者を明瞭なピーク と して分離する こ とは 困難であ り、 不純物の定量法と しての性能は不十分であった。
また、 両者の分子量の差が十分であ っても、 不純物の量が少 ない場合、 明瞭なピークは得られなかった。 これはゲルろ過の 分離機構が分子拡散を利用 しているために、 ク ロマ トグラ ム上 では ピーク が広が り やす く 、 量的に少ない成分については十分 な ピーク高さが得られないこ とによる。 このため、 十分な性能 を有する定量法とは言い難かった。
その上、 分子量の差のみに基づいて主成分と不純物と を分離 定量するために、 不純物の構造、 由来等の定性的な情報は一切 得られなかった。
発明の開示
本発明者らは、 上記課題を解決するため鋭意研究の結果、 本 発明を完成 した。
即ち、 本発明は、
1 ) 不純物の含有率が 1 0 重量％以下である こ とを特徴とす る、 ポ リ エチレ ングリ コ一ル類とポ リ 酸性ア ミ ノ酸とのプロ ヅ ク共重合体またはこれらの塩
2 ) 不純物がポ リ エチレ ングリ コール類およびポ リ酸性アミ ノ酸類であ る上記 1 ) に記載のプロ ッ ク共重合体またはこれら の塩。
3 ) ポ リ 酸性ア ミ ノ酸がポ リ アス ノ ラギン酸である上記 1 ) または 2 ) に記載のブロ ッ ク共重合体またはこれらの塩。
4 ) プロ ック共重合体が一般式 （ 1 ) で表される共重合体である 上記 1 ) または 2 ) に記載のブロ ック共重合体またはこれらの塩。
Figure imgf000006_0001
(式中、 R 1は水素原子または低級アルキル基を表し、 R 2は結 合基を表し、 R 3はメチレン基またはエチレン基を表し、 R 4は水 素原子またはァミ ノ基の保護基を表 し、 nは 5 — 1 0 0 0、 m は 2 — 3 0 0、 Xは 0 — 3 0 0 の整数を示すが、 Xは mよ り大 き く ないも の とする。 ） '
5 ) 一般式 （ 1 ) の R 1が炭素数 1〜 5 のアルキル基、 R 2が 炭素数 1〜 5 のアルキレ ン基、 R 3がメ チレ ン基またはエチレ ン 基、 R 4が水素原子または炭素数 1 〜 5 のァシル基であ り 、 nは 5 — 1 0 0 0、 mは 2 — 3 0 0、 xは 0 — 3 0 0の整数を示す が、 Xは mよ り大き く ないものとする上記 4 ) に記載のブロ ヅ ク共重合体またはこれらの塩。
6 ) 一般式 （ 1 ) の R 1がメ チル基、 R 2が ト リ メチレ ン基、 R 3がメチレン基、 R 4がァセチル基であ り、 nは 2 0— 5 0 0、 mは 1 0 — 1 0 0、 Xは 0 — 1 0 0の整数を示すが、 xは mよ り 大き く ないものとする上記 4 ) に記載のプロ ヅク共重合体ま たはこれらの塩。
7 ) 上記 1 ) 乃至 6 ) のいずれかに記載のブロ ッ ク共重合体 またはこれ らの塩の製造法であって、 ポ リ エチレ ングリ コール 誘導体をィ オン交換樹脂によ り精製し、 プロ ツ ク共重合体と し、 必要に応じて保護基を除去した後、 分配吸着樹脂を用いて精製 する こ とを特徴とする前記製造法。
8 ) 上記 1 ) 乃至 6 ) のいずれかに記載のブロ ッ ク共重合体 のポ リ 酸性ア ミ ノ酸とアン ト ラサイ ク リ ン系制癌剤残基が縮合 されている こ とを特徴とする高分子担体。 9 ) ポ リ 酸性ア ミ ノ酸とアン ト ラサイ ク リ ン系制癌剤残基と の縮合が、 ポ リ酸性アミ ノ酸の側鎖カルボン酸とアン ト ラサイ ク リ ン系制癌剤残基の縮合である上記 8 ) の高分子担体。
1 0 ) アン ト ラサイ ク リ ン系制癌剤残基が ドキソルビシン残 基である上記 8 ) 又は 9 ) に記載の高分子担体。
1 1 ) ポ リ酸性ア ミ ノ 酸におけるアン ト ラサイ ク リ ン系制癌 剤残基の結合割合が、 3 0 〜 5 5 %である上記 8 ) 又は 9 ) に 記載の高分子担体。
1 2 ) 上記 8 ) 乃至 1 1 ) のいずれかに記載の高分子担体の 製造法であ って、 上記 1 ) 乃至 6 ) に記載のブロ ッ ク共重合体 と反応助剤の縮合化合物を分離後、 該縮合化合物にアン ト ラサ ィ ク リ ン系制癌剤を反応させる こ とを特徴とする前記製造法。
1 3 ) アン ト ラサイ ク リ ン系制癌剤が ドキソルビシンまたは その塩である上記 1 2 ) に記載の高分子担体の製造法。
1 4 ) 上記 8 ) 乃至 1 1 ) のいずれかに記載の高分子担体が作 る ミセルの内核にアン ト ラサイ ク リ ン系制癌剤が内包されてい るブロック共重合体—薬剤複合体を含んでなる高分子医薬製剤。
1 5 ) ア ン ト ラサイ ク リ ン系制癌剤が ドキソルビシン又はそ の塩である上記 1 4 ) に記載の高分子医薬製剤。
1 6 ) 前記ブロ ッ ク共重合体—薬剤複合体が凍結乾燥物の形 態で含まれる こ とを特徴とする上記 1 4 ) 又は 1 5 ) に記載の 高分子医薬製剤。
1 7 ) 上記 1 ) に記載のポ リ エチレ ング リ コール類とポ リ酸 性アミ ノ酸とのプロ ツク共重合体における不純物の定量方法で あって、 該ブロ ッ ク共重合体を溶媒に溶解 し、 この溶解液を樹 脂処理 し、 その処理液をゲルろ過カラムを用いた高速液体クロ マ ト グラフ ィ 一処理する こ とを特徴とする前記定量方法。
1 8 ) 溶媒が水と混和する有機溶媒を含んでいて も よい水で あ り 、 樹脂がイ オン交換樹脂であ り、 不純物がポ リ エチレ ング リ コール類である上記 1 7 ) に記載の定量方法。
1 9 ) 溶媒が水と混和する有機溶媒を含んでいて も よい水で あ り 、 樹脂がエーテル結合を有する化合物を吸着で きる分配吸 着樹脂であ り 、 不純物がポ リ酸性ア ミ ノ酸である上記 1 7 ) に 記載の定量方法。
発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明を詳細に説明する。
本発明の第 1 の態様は、 不純物の含有率が 1 0 重量％以下で ある、 ポ リ エチレ ングリ コ一ル類とポ リ酸性アミ ノ 酸とのプロ ヅ ク共重合体またはこれらの塩に関する。 該ブロ ッ ク共重合体 に含まれる不純物を分析 した結果、 不純物は、 ポ リ エチレ ング リ コール類、 およびポ リ 酸性アミ ノ酸、 即ちカルボン酸を側鎖 にもつポ リ アミ ノ酸である こ とが明らかとなった。 ポ リ エチレ ング リ コール類と しては、 ポ リエチレ ング リ コール、 片末端ァ ルコキシポ リ エチレ ング リ コール等が挙げられる。 ポ リ酸性ァ ミ ノ酸と しては、 ポ リ グルタ ミ ン酸、 ポ リ アスパラ ギン酸が挙 げられる。
本発明において、 ポ リ エチレングリ コール類とポ リ酸性ア ミ ノ酸とのプロ ツ ク共重合体におけるポ リ酸性ア ミ ノ 酸と して、 側鎖にカルボキシル基を持つひ一および または /? —ア ミ ノ酸 のポ リ マーが挙げられ、 好ま し く はポ リ グル夕 ミ ン酸またはポ リ アスパラギン酸であ り 、 ブロ ック共重合体と しては、 例えば、 上記の一般式 （ 1 ) 若し く は （ 2 ) のプロ ヅ ク共重合体または れらの塩が挙げられる
Figure imgf000010_0001
(式中、 R 1は水素原子または低級アルキル基を表し、 R 2は結 合基を表し、 R 3はメチレン基またはエチレン基を表し、 R 4は水 素原子またはァミ ノ 基の保護基を表し、 nは 5 — 1 0 0 0、 m は 2 — 3 0 0、 Xは 0 — 3 0 0 の整数を示すが、 Xは mよ り 大 き く ないものとする。 ）
更に、 R 1 と しては水素原子または低級アルキル基が挙げられ るが、 低級アルキル基が好ま し く 、 具体的にはメ チル基、 ェチ ル基、 n—プロ ピル基、 i一プロ ピル基等が挙げられるが、 特 にメ チル基が好ま しい。 R 2の結合基と しては、 分岐 していても 良い炭化水素が挙げられる が、 好ま し く はアルキレ ン基であ り 、 具体的にはエチレ ン基、 ト リ メ チレ ン基、 テ ト ラ メ チレ ン基等 が挙げられ、 エチ レ ン基、 ト リ メチレ ン基が特に好ま しい。 R 3 と してはメ チレ ン基またはエチレ ン基が挙げられる が、 メ チレ ン基が好ま しい。
R 4 と しては水素原子またはアミ ノ基の保護基が挙げられ、ァ ミ ノ基の保護基と しては通常用い られるア ミ ノ基の保護基であ れば特に限定されないが、 好ま し く は低級ァシル基、 具体的に はホル ミル基、 ァセチル基、 プロ ピオニル基、 プチロイ ル基等 が挙げ られ、 ァセチル基が特に好ま しい。 nは 5 — 1 0 0 0、 好ま し く は 2 0 - 5 0 0、 特に好ま し く は 8 0 - 3 0 0 の整数、 mは 2 — 3 0 0 、 好ま し く は 1 0 — 1 0 0 、 特に好ま し く は 2 0 — 5 0 の整数、 Xは 0 — 3 0 0、 好ま し く は 0 — 1 0 0、 特に好ま し く は 0 — 5 0 の整数を示すが、 Xは mよ り 大き く な いものである。
本発明におけるプロ ック共重合体の塩と しては、 アル力 リ金属 塩、 アルカ リ土類金属塩、 アンモニゥム塩、 有機アンモニゥム塩 等が挙げられ、 例えばナ ト リ ウム塩、 カ リ ウム塩、 カルシウム塩 アンモニゥム塩、 ト リエチルアンモニゥム塩等が好ま しい。
該プロ ッ ク共重合体に含まれる不純物は、 ミセルを形成せず、 薬物、 遺伝子等の高分子担体と しての性能は有 しないと考え ら れるため、医薬用途に用いるためには、不純物の含有率は 1 0 % 以下であることが好ま し く、 5 %以下である こ とが更に好ま しい また、 本発明の第 2 の態様は、 ポ リ エチ レ ング リ コール類を イ オン交換樹脂によ り精製 し、 ポ リ酸性ア ミ ノ酸とのプロ 、ソ ク 共重合体と し、 必要に応 じて保護基を除去 した後に分配吸着樹 脂を用いて精製するポリ エチ レ ングリ コール類とポ リ酸性アミ ノ酸とのブロ ッ ク共重合体またはこれらの塩の製造法に関する ポ リ エチレ ングリ コ ール類とポ リ 酸性アミ ノ酸とのプロ ヅ ク共 重合体と しては、 前記のボ リエチ レ ングリ コール類とポ リ酸性 ア ミ ノ 酸とのプロ 、リ ク共重合体と同様なプロ ッ ク共重合体が好 ま しい。 保護基で保護されている場合、 保護基と しては、 通常 酸性ア ミ ノ 酸の側鎖の力ルポキシル基を保護する も のであれば 特に限定されないが， 例えば， 低級アルコールとのエステル、 置換 していても良いァ リ ール基置換低級アルコールとのエステ ル等が挙げられる。 具体的にはメ チルエステル、 ェチルエステ ル、 プロ ピルエステル、 ブチルエス テル、 ベン ジルエステル、 フ エ ネ チルエステル、 p — メ ト キシベンジルエステル、 p —二 ト 口べンジルエステル等である。保護基の除去の方法と しては、 保護基に応 じて通常用い られる適当な方法を用い得るが、 例え ば酸またはアル力 リ による加水分解、 触媒等を用いた加水素分 解等が挙げられる。
本発明の不純物含有量の低減 したポ リ ェチレ ング リ コール類 とポ リ酸性アミ ノ酸とのプロ ック共重合体と して、 例えば一般式 ( 1 ) で表される化合物についてその精製法を具体的に説明する 該ブロ ッ ク共重合体の合成方法は、 種々の方法に よ り 製造す る こ とができ、 例えば、 特開平 6 — 2 0 6 8 3 2 号公報には片 末端メ トキシボ リ エチレ ングリ コールの水酸基末端を変性させ たものにァスパラギン酸誘導体を重合反応させ、 ァ ミ ノ基を保 護 し、 エステル結合を加水分解して製造する方法が記載されて いるが、 純度の高い プロ ヅ ク共重合体を得るための精製法は未 だ知 られていない。
片末端メ トキシポ リ エチレ ングリ コールの水酸基末端のアミ ノ基への変性は、 当業界において公知の反応を利用する方法、 例えば、 エチレ ンイ ミ ン等を反応させる方法、 ァク リ ロ二 ト リ ルゃメ 夕 リ ロニ ト リル等にマイ ケル付加を行った後二 ト リ ル 基を還元 しア ミ ノ基に変換する方法、 水酸基をハロゲン基に置 換 した後エタ ノールア ミ ン等のアルコ一ルア ミ ンを反応させる 方法、 水酸基を直接二 ト リル基に変換後還元 しア ミ ノ基に変換 する方法等によって行う こ とができ る。
末端をァ ミ ノ基に変性したポ リ エチ レングリ コール中には、 変性が不完全である片末端ポ リ エチレ ングリ コール類、 例えば 末端が水酸基である片末端ポ リ エチレ ング リ コールや末端にァ ク リ ロニ ト リ ルが付加 した片末端ポ リ エチレ ングリ コール等が 含まれている。
これらの変性が不完全であるポ リエチレ ングリ コール類は、 酸性の官能基をもつイオン交換体を用いる こ とで分別除去する こ とが可能である。 用いるイ オン交換体は酸性の官能基を持つ ものな らば特に限定されないが、 例えばイ オン交換樹脂と して ダイ ヤイ オン S K I B (三菱化学社製） 、 ダイヤイ オン P K— 2 1 6 (三菱化学社製） 、 ダイ ヤイ オン W K— 1 0 (三菱化学 社製） 、 ダイ ヤイ オ ン W K 2 0 (三菱化学社製） 、 アンバーラ イ ト 1 2 0 B ( ロ ーム ' ア ン ド ' ノヽ一ス ' ジャパ ン社製） 、 ァ ンノ 一ラ イ ト 2 0 0 C ( ロ ーム ' ア ン ド ' ノヽ一ス ' ジヤ ノ ン社 製） 、 アンバーラ イ ト I R C— 5 0 ( ローム ' ア ン ド ' ノヽ一ス · ジャパン社製） 、 ア ンバーラ イ ト I R C 7 6 ( 口一ム ' ア ン ド · ノ、 一ス · ジ ヤ ノ1? ン社製） 、 ダ ウ ェ ヅ ク ス 5 0 W ( ダ ウ ケ ミ カ ル社製） 、 ゲリレ イ オ ン 交換体 と し て S P — セ フ ア デ ヅ ク ス （ S e p h a d e x ) C - 2 5 ( フ アルマシア ' ノ ィ ォテ ク社製） 、 S P — S e p h a d e x C— 5 0 ( フ ア ルマ シア ' パイ ォテ ク社製） 、 C M - S e p h a d e x C - 2 5 ( フ ァ ルマシア ' ノ ィ ォテ ク社製） 、 C M— S e p h a d e x C - 5 0 ( フ アルマシア ' ノ ィ ォテ ク社製） 、 S P — ト ヨ ノ 一ル
( T o y o p e a r l ) 5 5 0 (東ソ一社製） 、 S P — ト ヨ パール 6 5 0 (東ソ一社製） 、 C M— S e p h a d e x 5 5 0
( フ アルマシア社製） 、 C M— S e p h a d e x 6 5 0 (フ アルマシア社製） 等が使用で き、 特に S P— T o y o p e a r l 6 5 0、 C M- S e p h a d e x 6 5 0 を用いるのが好ま しレ、 c 得 ら れたポ リ エチ レ ン グ リ コ ールを精製する方法はバ ッ チ法 で も カ ラ ム法で も構わないが、 好ま し く はカ ラ ム法で行な う 。 即 ち、 未端を変性 した片末端メ ト キシポ リ エチ レ ン グ リ コ ール を溶媒に溶解する。 用いる溶媒はイ オン交換に使用できる もの な らば特に制限はないが、 水も し く は水—有機溶媒の混合溶媒、 例えば水一メ タ ノ ール、 水ーァセ トニ ト リ ル等が好ま しい。 続 いて H + フ オームに再生 した前記ィ オン交換体をカ ラ ムに充填 したものに通液したのち、 水も し く は水一有機溶媒の混合溶媒 でカラムを洗浄し、 変性が不完全なポ リ エチレ ング リ コール類 を除去する。 その後に、 塩基性物質を添加 した溶媒、 好ま し く はアンモニア水あるいはア ンモニア水—有機溶媒の混合溶媒で 吸着した未端がア ミ ノ基に変性した片末端メ ト キシポ リ エチ レ ングリ コールを溶出させる。 溶出 した溶液を濃縮、 凍結乾燥等 適当な処理を行ない末端をァ ミ ノ基に変性 した純度の高い片末 端メ トキシポ リエチ レ ングリ コールを得る。
次に、 末端をァ ミ ノ基に変性した片末端メ トキシポ リ エチレ ングリ コールと、 例えば側鎖のカルボキシル基を保護したア ミ ノ酸の N —力ルボン酸無水物とを反応させ、 プロ ッ ク共重合体 を合成 した後、 必要に応 じて無水酢酸等で未端のア ミ ノ基をァ セチル化する。 その後、 必要に応 じて側鎖の保護基を脱保護し て、 ポ リ エチ レ ング リ コ一ルーポ リ酸性ア ミ ノ酸プロ ッ ク共重 合体を得る。
こ う して得られたポ リ エチレ ング リ コ 一ルーポ リ 酸性アミ ノ 酸プロ ック共重合体には不純物と してポリ酸性アミ ノ酸が含ま れているが、 分配吸着樹脂によ り精製する こ とが可能である。 分配吸着樹脂と しては、 シ リ カゲル、 ケィ 酸塩粉末、 炭化水素 で修飾されたシ リ カゲル、 スチレ ン一ジビニルベンゼン樹脂等 が挙げられるが、 好ま し く はスチレ ンージビニルベンゼン樹脂、 更に好ま しく は H P — 2 0 S S (三菱化学社製） が用いられる 得られたポ リ エチ レング リ コ一ルーポリ酸性ア ミ ノ酸ブ ロ ヅ ク共重合体を精製する方法はバ ッチ法でもカラム法でも構わな いが、 好ま し く はカ ラム法でおこなう 。 即ち、 ポ リ エチ レ ング リ コール—ポ リ酸性アミ ノ 酸ブ口 ッ ク共重合体を溶媒に溶解す る。用いる溶媒はポ リ酸性アミ ノ酸を解離させる塩基性をもち、 かつ分配吸着樹脂に使用で きる ものな らば特に制限はないが、 アル力 リ金属水酸化物水溶液も し く はアル力 リ金属水酸化物水 溶液—有機溶媒の混合溶媒、 例えば水酸化ナ ト リ ウム水溶液― メ タ ノ ール、 水酸化ナ ト リ ゥム水溶液—ァセ トニ ト リ ル等が好 ま しい。 溶媒に溶解 したポ リ エチレ ングリ コール一ポ リ 酸性ァ ミ ノ 酸プロ ッ ク共重合体溶液を、 分配吸着樹脂をカ ラムに充填 したも のに通液したのち、 7i 酸化ナ ト リ ウム水溶液も し く は水 酸化ナ ト リ ゥム水溶液一有機溶媒の混合溶媒をカラ ムに通し、 ポ リ酸性ア ミ ノ酸を除去する。 その後に、 極性の小さい溶媒、 例えば有機溶媒の比率を高めた水一有機溶媒の混合溶媒を用い て、 吸着したポ リ エチレ ング リ コ一ルーポ リ酸性ア ミ ノ酸プロ ッ ク共重合体を溶出する。 溶出 した溶液を濃縮、 凍結乾燥、 お よび沈析等適当な後処理を行ない純度の高いポ リ エチレ ングリ コール一ポ リ酸性アミ ノ酸プロ ヅ ク共重合体を得る。 本発明の第 3 の態様は、 精製された、 ポ リ エチレ ング リ コ一 ル類とポ リ 酸性アミ ノ酸とのプロ ッ 3ク共重合体とアン ト ラサイ ク リ ン系制癌剤を縮合して得られる高ノ分 m子担体に関する。 該高
X
分子担体と しては、 下記一般式 （ 3 ) または （ 4 ) で表される が挙げられる。本発明にはこれらの o塩も含まれる。
R
Figure imgf000018_0001
(3)
Rl†OCH2CH2+0-R2-CO†NHCHCG1 ~ fNHCHR3C0 0H n x
COR
(4)
(式中、 Rは水酸基またはアン ト ラサイ ク リ ン系制癌剤残基を 表 し、 R 1は水素原子または低級アルキル基を表し、 R 2は結合 基を表し、 R 3はメチレ ン基またはエチ レン基を表し、 R 4は水 素原子またはァ ミ ノ 基の保護基を表 し、 nは 5 — 1 0 0 0、 m は 2 — 3 0 0、 x + yは 0 — 3 0 0 の整数を示すが、 x + yは mよ り大き く ないものとする。 )
本発明における一般式 （ 3 ) または （ 4 ) の化合物の R と し ては、 水酸基またはアン ト ラサイ ク リ ン系制癌剤残基が挙げら れる。 プロ ヅ ク共重合体のポ リ酸性ア ミ ノ 酸部分において、 そ の構成各部分の結合順序は限定されず、 ラ ンダムであっても規 則的であっても よい。 プロ ヅ ク共重合体のポ リ酸性アミ ノ酸部 分の側鎖カルボン酸残基とアン ト ラサイ ク リ ン系制癌剤残基と の結合様式は特に限定されないが、 アン ト ラサイ ク リ ン系制癌 剤のア ミ ノ基とのア ミ ド結合が好ま しい。 特にアン ト ラサイ ク リ ン系制癌剤のア ミ ノ糖部分の 1 級ァ ミ ノ基による アミ ド結合 が好ま しい。 ポ リ酸性ア ミ ノ酸部分の側鎖カルボン酸残基に対 するアン ト ラ サイ ク リ ン系制癌剤の結合 して い る割合は、 1 〜 1 0 0 %であ り 、 ミ セルを形成する能力を考慮する と、 1 0 〜 6 0 %が好ま し く 、 3 0〜 5 5 %が特に好ま しい。 アン ト ラ サイ ク リ ン系制癌剤残基と しては、 ダウノ リレ ビシ ン、 ドキソル ビシン、 アク ラル ビシン、 ェ ピル ビシ ン、 ピラル ビシン等の残 基が挙げられるが、 ドキソルビシン残基が好ま しい。
R 1、 R 2、 R 3、 R 4、 nおよび mは前記と同様な範囲が好 ま しい。
また、 x + yは 0 — 3 0 0、 好ま し く は 0 — 1 0 0、 特に好 ま し く は 0 — 5 0 の整数を示 し、 X及び yは上記条件を満たす 整数であれば 0 を含むいかなる値も と り得る。
また、 本発明の第 4の態様は、 精製したポ リ エチ レ ングリ コ ールとポ リ酸性ア ミ ノ酸とのプロ ッ ク共重合体と反応助剤とを 縮合させ、 次いでこの縮合化合物を分離後、 アン ト ラサイ ク リ ン系制癌剤を反応させる こ とによる高分子担体の製造法に関す る。 該高分子担体は、 国際公開第 W 0 9 7 / 1 2 8 9 5 号パン フ レ ツ トに開示の方法、 即ちブロ ッ ク共重合体とアン ト ラサイ ク リ ン系制癌剤をカルボジィ ミ ド型の脱水縮合剤で縮合する こ とで得 られるが、 その際に活性中間体であるァシルイ ソ尿素が 分子内転移 してァシル尿素を副生 し、 ァシル尿素が付加 した高 分子担体を生 じる。 プロ ッ ク共重合体と反応助剤との縮合化合 物を分離する こ とに よ り ァシル尿素の副生を抑え、 ァシル尿素 の付加の少ない高分子担体が提供可能となった。 なお、 ァシル 尿素の副生付加 した量は、 ガスク ロマ ト グラ フ ィ 一の注入口の 温度を十分高く してお く こ とによ り 、 ァシル尿素か ら熱分解 し たィ ソシァネー ト誘導体を測定する こ とで定量される。
上記製造法をよ り 具体的に説明する と、 精製したプロ ッ ク共 重合体を有機溶媒に溶解し、 脱水縮合剤と反応助剤を添加 し反 応させ、 反応によ り 生じたアルキル尿素誘導体をろ過し、 ろ液 か ら活性エステル体を分離する。 続いて、 得られた活性エステ ル体に有機溶媒中でアン ト ラサイ ク リ ン系制癌剤またはその塩 を添加後、 必要があれば塩基を加えて反応させ、 反応溶液か ら 高分子担体を単離する。 有機溶媒と しては、 反応物が溶解すれ ば特に限定されないが、 非水性極性溶媒が好ま し く 、 例えばジ メ チルホルムア ミ ド、 ジメ チルァセ ト アミ ド、 1 ， 3 —ジメチ ル一 2 —ィ ミ ダゾ リ ジノ ン等が挙げられ、 ジメ チルホルムア ミ ドが好ま しい。 プロ ック共重合体と反応助剤との縮合に用い ら れる脱水縮合剤と しては、 通常べプチ ド合成に用い られる縮合 剤が用い られるが、 ジシク ロへキシルカルポジイ ミ ド （ D C C ) や 1 —ェチルー 3 — ( 3 —ジメ チルァ ミ ノ プロ ピル） カルボジ イ ミ ド （ E D C ) 等が好ま しい。 反応助剤と しては通常べプチ ド合成に用い られる反応助剤が用い られる。 例えば、 N — ヒ ド ロ キシ化合物が挙げられ、 N — ヒ ド ロキシスクシンイ ミ ドゃ N — ヒ ド ロキシペンゾ ト リ アゾ一ル等が好ま しい。 用いる塩基と しては、 特に限定されないが、 ト リ ェチルァ ミ ン等の有機塩基 が好ま しい。 アン ト ラサイ ク リ ン系制癌剤と しては、 前記のァ ン ト ラサイ ク リ ン系制癌剤残基を与えるアン ト ラサイ ク リ ン系 化合物が挙げられる。
更に本発明の第 5 の態様は、 精製したポリエチレングリ コール とポリ酸性アミ ノ酸とのブロ ック共重合体から製造される高分子 担体が作る ミセルの内核にアン トラサイ ク リ ン系制癌剤が内包さ れているブロ ッ ク共重合体—薬剤複合体を含んでなる高分子医薬 製剤に関する。 該アン トラサイ ク リ ン系制癌剤と しては、 ダウノ ルビシ ン、 アク ラルビシン、 ェピルビシ ン、 ピラルビシン等又は その塩が挙げられるが、 ドキソルビシン又はその塩が好ま しい。 また、 該プロ ッ ク共重合体—薬剤複合体が凍結乾燥物の形態で含 まれる高分子医薬製剤も本発明の 1 つの態様である。 前記高分子 医薬製剤の製造方法は特に限定されないが、 特開平 7— 6 9 9 0 0 号公報に記載されている製法、 すなわちプロ ック共重合体とアン トラサイ ク リ ン系制癌剤を溶解したジメチルホルムアミ ド と水の 混合溶媒を透析膜を用いた透析操作及び限外ろ過膜を用いた限外 ろ過操作に付し、 必要に応じて凍結乾燥する方法を適用 しても よ い。 又、 エタノール等の水と混和可能な低沸点有機溶媒と水との 混合溶媒にブロ ック共重合体とアン トラサイ ク リ ン系制癌剤を溶 解し、 得られる溶液を濃縮する こ とによ り低沸点有機溶媒を留去 して、 必要に応じて凍結乾燥する方法でもよい。
本発明の第 6 の態様は、 前記ポ リ エチレ ングリ コ一ル類とポ リ酸性アミ ノ 酸とのプロ ッ ク共重合体中の不純物の定量に際し 該ブロ ック共重合体を溶媒に溶解し、 この溶解液を樹脂処理 し、 その処理液をゲルろ過カラムを用いた高速液体ク ロマ ト グラフ ィ 一処理する定量方法に関する。
本発明におけるポ リエチレ ング リ コール類とポ リ酸性ア ミ ノ 酸との プロ ッ ク共重合体および該ブロ ッ ク共重合体中の不純物 については、 すでに述べた通り である。
本発明において、 不純物と してポ リ エチ レ ングリ コール類を 定量分析する際のポ リエチレ ングリ コール類とポ リ酸性ア ミ ノ 酸とのプロ ッ ク共重合体を溶解する溶媒と しては、 プロ ッ ク共 重合体を溶解で きる任意の溶媒が利用でき るが、 好ま し く は適 当な塩によ り p Hが調整された水溶液、 も し く はそれら と有機 溶媒、 例えばメ 夕 ノ ール、 エタ ノ ール、 ァセ トニ ト リル、 テ ト ラ ヒ ド ロ フ ラ ン等との混合溶媒が用い られる。 p Hを調製する ために使用する塩と しては、 通常使用される緩衝作用を有する 塩が用い得る が、 リ ン酸塩、 ホウ酸塩、 炭酸水素ナ ト リ ウム塩、 フ 夕 ル酸塩、 ト リ ス塩酸塩等が好ま しい。
また、 不純物と してポ リ ア ミ ノ 酸を定量する際の溶媒と して は、 ポ リ エチ レ ング リ コール類を測定する際にポ リ エチレ ング リ コール類とポ リ酸性ァ ミ ノ酸とのプロ ッ ク共重合体を溶解で き、 側鎖のカルボン酸を解離させる こ とがで きる任意の溶媒が 利用で きるが、 好ま し く は適当な塩に よ り p Hが調整された水 溶液、 も し く はそれら と有機溶媒、 例えばメ タ ノ ール、 ェ夕 ノ ール、 ァセ トニ ト リ ル、 テ ト ラ ヒ ド ロ フラ ン等との混合溶媒が 用い られる。 側鎖のカルボン酸を解離させるために溶媒の p H は 5 〜 1 3 が好ま し く 、 そのために使用する塩と しては、 前記 の リ ン酸塩、 ホウ酸塩、 炭酸水素ナ ト リ ウ ム塩、 フ 夕ル酸塩、 ト リ ス塩酸塩等が用い られる。
本発明においてプロ ッ ク共重合体に不純物と して含まれるポ リ エチ レ ング リ コール類を定量する際に該プロ ヅ ク共重合体の 溶液を処理するための樹脂は、 該プロ ッ ク共重合体のイ オン解 離基と対イ オンを形成で きるイ オン交換樹脂、 即ち陰イ オン交 換樹脂が好ま し く 、 ジアルキルア ミ ン類、 ト リ アルキルアミ ン 類、 ジアルキルェ夕 ノールアミ ン類等の塩基性の官能基を持つ ものであれば特に制限されず使用 し得る。 分析法と してはカラ ム法で も ノ ヅ チ法でも構わないが、 好ま し く はカラ ム法でおこ なう 。
カラ ム法ではオープンカラムにイ オン交換樹脂、 例えばダイ ャイオン S A 1 0 A (三菱化学社製） ， ダイヤイオン P A 3 1 8 (三菱化学社製） ， ダイ ヤイ オン S A 2 0 A (三菱化学社製） ， ダイヤイ オン WA 3 0 (三菱化学社製） ， ダイヤイオン WA 1 0 (三菱化学社製） 、 ア ンバー ラ イ ト I R A 4 0 2 (口一ム ' アン ド ' ハース ジ ヤ ノ ン社製） ， ア ンバーラ イ ト M R 9 0 4 (ローム ' アン ド ' ハース ジ ャパ ン社製） , ア ンバーライ ト I R A 4 1 0 (ローム ' アン ド ' ハース ジヤノ、"ン社製） ， ァ ンバ一ラ イ ト I R A 9 3 (ローム ' ア ン ド ' ノヽ一ス ジ ヤノ ン 社製），アンバーライ ト I R A 6 8 (ロ ム 'アン ド 'ノヽ一ス ジ ャパ ン社製） 、 ダウエッ クス 6 6 (ダウ · ケ ミ カル日本社製） 、 セルロースイ オン交換体， 例えば C e 1 1 e x Q A E (バイ ォラ ッ ド社製） ， C e 1 1 e X P E I (ノ ィォラ ッ ド社製） ， C e 1 1 e D ( ノ、、ィ ォラ ッ ド社製） ， C e l l e x D E 5 2 (バイ オラ ヅ ド社製） 、 ゲルイ オン交換体， 例えば Q A E - S e p h a d e x A 2 5 (フアルマシア .ノ ィ ォテク社製） Q A E - S e p h a d e x A 5 0 ( フ アルマシア ' ノ ィ ォテ ク社製） 、 D E A E — S e p h a d e x A 2 5 ( フアルマシ ァ ' ノ ィ ォテク社製） ， D E A E— S e p h a d e x A 5 0 (フアルマシア ' バイオテク社製） 、 D E A E— S e p a r o s e C L - 6 B (フアルマシア . バイオテク社製） 、 D E A E— B i o G e l A (フ アルマシア · バイ オテク社製） 等を充填 して行 う方法や、 予めイ オン交換樹脂が充填された、 高速液体クロマ ト グラ フ ィ 一による前処理法に使用される市販の力一 ト リ ヅ ジ 例えば S e p — P a k Q M A (ゥ ォ一夕一ズ社製） ， S e p - P a k N H 2 (ウォー夕一ズ社製） 、 B o n d E 1 u t P S A (バ リ アン社製） ， B o n d E 1 u t D MA ( ノ リ アン社製） ， B o n d E l u t S A X ( ノ リ アン社製） 等 を用いる方法があ るが、 分析の容易さから カー ト リ ッジを用い るのが好ま しい。 特に好ま し く は S e p— P a k Q M Aを用 いる。
該プロ ヅ ク共重合体に不純物と して含まれるポ リ エチレ ング リ コール類の定量分析では、 上記樹脂処理を経て樹脂に吸着せ ずに溶出 して きたポ リ エチ レ ングリ コ一ル類を、 ゲルろ過カラ ムを用いた高速液体ク ロマ ト グラフ ィ 一に よ って分析結果を得 る こ とが可能であ る。 この方法では、 溶出 した溶液を高濃度に 濃縮する こ とが可能であ るため、 ポ リ エチ レ ング リ コール類を 高感度で定量分析する こ とが可能である。
本発明で不純物の定量に使用するゲルろ過カラムの担体と し ては、 高速液体ク ロマ ト グラフ ィ 一で用い られる ものであれば 特に制限されないが， ブロ ッ ク共重合体中の不純物のおおよそ の分子量に応 じて適当な排除限界分子量のものが用いられる。 ポ リ エチレ ング リ コール類の定量用には， 例えば S h 0 d e 0 H p a k S B— 8 0 3 H Q (昭和電工社製） 、 S h o d e x 0 H p a k S B— 8 0 2. 5 HQ (昭和電工社製） 、 S h o d e x 0 H p a k S B— 8 0 4 H Q (昭和電工社製） 等が使用で き、 ポ リ酸性アミ ノ 酸の定量用には， 例えば A s a h i p a k G F - 3 1 0 H Q (旭化成工業社製） 、 A s a h i p a k G F - 5 1 0 H Q (旭化成工業社製） 等が使用で きる。 その 他， A s a h i p a k G S— 3 2 0 H Q (旭化成工業社製） や S h o d e x O H p a k Q - 8 0 2 (昭和電工社製） 等 も使用でき る。 本発明において実施される高速液体クロマ トグ ラフ ィ 一は、 市販の高速液体ク ロマ ト グラ フ ィ ー装置によって 行なう こ とができ る。
また、 本発明におけるポ リ エチレ ングリ コール類とポ リ酸性 アミ ノ酸とのプロ ヅ ク共重合体に不純物と して含まれるポ リ酸 性ア ミ ノ酸の定量に用い る該ブロ ッ ク共重合体の溶液を処理す る樹脂は、 エーテル結合を持つ該ブロ ッ ク共重合体を吸着する 樹脂、 即ち分配吸着樹脂が好ま し く 、 シ リ 力ゲル、 ケィ酸塩粉 末、 炭化水素で修飾されたシ リ 力ゲル、 スチ レ ンージビニルべ ンゼン樹脂等が挙げられる。 炭化水素で修飾されたシ リ カゲル と しては， 炭素数 1 から 3 0の炭化水素で修飾されたシ リ カゲ ルが好ま し く ， 炭素数 4 か ら 1 8の炭化水素で修飾されたシ リ 力ゲルが特に好ま しい。
分析法と してはカ ラム法でもノ ツチ法で も構わないが、 好ま し く はカラ ム法でお こな う 。 また， 市販の分配吸着樹脂を詰め たカラムも使用する こ とができ， 任意の大きさのも のが使われ る。 更に， 市販の分析用固相抽出カラム、 例えば S e p —： P a k C 1 8 (ウ ォー夕一ズ社製） ， S e p —； P a k t C 1 8 (ゥ ォ一夕ーズ社製） ， S e p — P a k C 8 (ウォー夕一ズ社製） B o n d E 1 u t C 1 8 (バリアン社製） ， B o n d E l u t C 8 (ノ リ アン社製） 等も用いる こ とがで き， 特に好ま し く は S e p - P a k C 1 8 が用い られる。
該ブロ ッ ク共重合体に不純物と して含まれるポ リ酸性アミ ノ 酸の定量は、 カルボン酸を解離するよ う な溶媒で溶解した溶液 を上記樹脂処理にかけ、 樹脂に吸着せずに溶出 して きたポ リ酸 性ア ミ ノ酸を、 ゲルろ過カラムを用いた高速液体ク ロマ ト グラ フ ィ 一で定量する こ とに よって可能である。 こ の方法は、 溶出 した溶液を高濃度に濃縮する こ とがで きる ため、 ポ リ酸性ア ミ ノ酸を高感度で定量分析する こ とが可能である。
なお、 これらの分析法を用いて実際に、 上記精製工程を経て 得られたポ リ エチレ ング リ コール類とポ リ アスパラギン酸との ブロ ッ ク共重合体と従来のポ リエチレ ング リ コール類とポ リ ア スパラギン酸とのブロ ッ ク共重合体のそれそれに含まれるポ リ エチレ ング リ コ一ル類およびポ リ アスパラ ギン酸の量を測定し た とこ ろ、 結果は以下の通り であった
プロック共重合体に含まれる不純物量 不純物 精製を行わない 精製を行う ポリエチレングリコ一ル類 6. 0重量％
ポリアスパラギン酸 7. 5重量％ 2. 4重量％ 実施例
以下、 実施例を示 し、 さ ら に詳し く この発明について説明す る。 ただ し、 この発明は以下の例に限定される ものではない。 製造例 1
H +フォームに再生した T o y o p e a r l 6 5 0 M ( 9 0 0 m L ) をガラスカラ ムに充填 した。 片末端メ ト キシ一片末端 3 一アミ ノ プロポキシポ リ エチレ ングリ コール （重量平均分子量 5 2 8 7 ) 2 9 . 9 7 gを 1 . 9 8 リ ッ ト ルの 1 0 %ァセ トニ ト リル水に溶解 し、 この溶液をカラムに通液した。 1 . 6 リ ツ ト ルの 1 0 % ァセ ト ニ ト リ ル水で カ ラ ム を洗浄 したの ち、 1 0 %ァセ ト ニ ト リル含有— 0 . 4 Mアンモニア水で展開 した。 目的化合物を含む分画を集め、 減圧下濃縮後、 凍結乾燥し、 精 製された片末端メ ト キシ―片末端 3 —アミ ノ プロボキシルポ リ エチレ ングリ コール 2 5 . 7 1 gを得た。
製造例 2
製造例 1 で得られた精製片末端メ ト キシ―片末端 3 — ァ ミ ノ プロポキシルポ リ エチレ ングリ コール 2 3 . 3 2 gをジメ チ ルスルホキシ ド （ D M S 0 ) 4 6 6 m Lに溶解し、 3 5 °Cに加 温した。 ^ —ベンジル L—ァスパルテー ト 一 N—力ルボン酸 無水物 （ B L A— N C A ) 4 2 . 8 7 gを加え、 2 2時間反応 を行った。 反応混合物をジイソプロピルェ一テル （ I P E ) 3. 7 3 リ ッ トルとエタ ノ ール （ E t 0 H ) 0 . 9 3 リ ッ トルの混合 溶媒中に滴下 し、 析出 した沈澱を、 ろ過し、 I P E と E t 0 H の混合溶液 （ 4 ： 1 ) および I P Eで洗浄 したのち、 真空乾燥 し片末端メ ト キシポ リ エチレ ング リ コール一ボ リ ( ?—ペンジ ル L—ァスパルテー ト ） 共重合体 5 4 . 2 9 g (ァスノ ラ ギン酸ュニ ヅ ト （単位） 数 2 9 . 0 ) を得た。
製造例 3
製造例 2 で得られた片末端メ ト キシポ リ エチ レ ングリ コール 一ポリ （ ? —ベンジル L—ァスパルテー ト ） 共重合体 5 2. 8 5 gをジメチルホルムア ミ ド 5 2 9 m Lに溶解 し、 3 5 °Cに加 温した。 無水酢酸 2 . 5 0 m Lを加え、 3時間反応を行った。 反応混合物をジイ ソ プロ ピルェ一テル （ I P E ) 4 . 7 6 リ ヅ ト ル とエタ ノ ール （ E t 0 H ) 0 . 5 3 リ ヅ ト ルの混合溶 媒中に滴下 し、 析出 した沈澱を、 ろ過し、 I P E と E t O Hの 混合溶液 （ 9 ： 1 ) および I P Eで洗浄したのち、 真空乾燥し 片末端メ ト キシポ リ エチ レ ング リ コール一ポ リ （ ^ —ベンジル L—ァスパルテー ト ） 共重合体 N—ァセチル化物 5 1 . 6 7 gを得た。
製造例 4
製造例 3 で得られた片末端メ ト キシポ リ エチレ ングリ コール 一ポ リ （ ? 一べンジル L—ァスパルテー ト ） 共重合体 N— ァセチル化物 5 0 . 1 9 gをァセ トニ ト リ ル 7 5 3 m Lお よび 0 . 2規定水酸化ナ ト リ ウム溶液 2 . 1 6 リ ッ トルで 5 時間反応させた。 反応混合物を 2規定塩酸で中和後、 減圧下濃 縮してァセ ト ニ ト リ ルを除去したのち、 酢酸ェチル 1 . 2 リ ッ トルで 3回抽出を行う。 水層を濃縮したのち、 溶液量を 1 . 3 リ ッ トルと し、 さ ら に 6規定水酸化ナ ト リ ウム 1 1 m Lを加 え塩基性と した水溶液を、 十分洗浄した H P — 2 0 S Sカラ ム （ 2 リ ヅ トル） に通液 した。 0 . 0 1規定水酸化ナ ト リ ウム 水溶液 （ 8 リ ッ ト ル） 、 水 （ 3 リ ッ ト ル） で洗浄後、 5 0 %ァ セ トニ ト リ ル一水 （ 6 リ ッ トル） で溶出する。 目的化合物を含 む分画を集め、 減圧下濃縮し、 H +フ ォームに再生した D o w e x 5 0 W 8 ( 5 2 0 m L ) に通液 し、 5 0 %ァセ トニ ト リル一水 ( 1 リ ッ トル） で洗浄した。 溶出 した溶液をさ ら に減圧下濃縮 したのち凍結乾燥した。 得られた凍結乾燥品をジメ チルホルム アミ ド （ D M F ) 3 2 0 m Lに溶解し、 へキサン 2 . 5 6 リ ヅ トルと酢酸ェチル 0 . 6 4 リ ッ トルの混合溶媒中に滴下し た。 析出 した沈澱を、 ろ過し、 へキサンと酢酸ェチルの混合溶 液 （ 4 ： 1 ) およびへキサンで洗浄したのち、 真空乾燥し片未 端メ ト キシポ リ エチレ ング リ コ一ルーポ リ アスパラ ギン酸共重 合体 N—ァセチル化物 3 3 . 2 0 gを得た。
製造例 5
製造例 4 で得られた片末端メ ト キシポ リ エチレ ングリ コール —ポリ アスパラギン酸共重合体 N—ァセチル化物 2 8 . 8 5 gをジメ チルホルムアミ ド 5 7 7 m L に溶解 し、 3 5 °Cに加 温した。 ジシクロへキシルカルポジイ ミ ド （ D C C ) 1 9 . 7 5 g、 N — ヒ ド ロキシスク シンイ ミ ド （ H O S u ) 1 1 . 0 1 g をカロえ、 1 時間反応させた。 生成したジシク ロへキシルゥ レア を綿栓ろ過 した。 得られたろ液を酢酸ェチル 2 . 3 リ ッ トル で希釈 したのち、 へキサン 3 . 5 リ ッ ト ルを添力 [I した。 析出 した沈殿をろ過 し、 へキサン ： 酢酸ェチル （ 3 ： 1 ) 溶液で洗 浄後、 真空乾燥する こ とで、 片末端メ ト キシポ リ エチレ ングリ コ ール—ポ リ アスパラ ギン酸共重合体 N —ァセチル化物一 H 0 S u活性エステル体 3 3 . 8 2 gを得た。
製造例 6
製造例 5 で得られた片末端メ トキシポ リ エチ レ ングリ コール —ポ リ アスパラギン酸共重合体 N—ァセチル化物— H O S u 活性エステル体 3 3 . 7 3 gをジメチルホルムアミ ド 1 . 3 5 リ ヅ トルに溶解 し、 3 5 °Cに加温した。 塩酸 ド キソルビシ ン 2 6 . 1 3 g を粉末のま ま添加 し、 反応液に懸濁させた後、 ト リ エチルァ ミ ン 8 . 1 6 m L を添力 Π し、 1 時間反応を行なつ た。 反応混合物 を酢酸ェチル 4 . 0 リ ッ ト ル、 へキサ ン 1 6 . 0 リ ッ トルの混合溶媒中に滴下 し、 析出 した沈殿をろ過 し、 へキサン ： 酢酸ェチル （ 3 ： 1 ) 溶液で洗浄後、 真空乾燥 した。 次に得られた沈殿をァセ トニ ト リル 5 9 0 m Lに懸濁さ せた後、 水 1 7 8 O m L を加え、 3 5 °Cで加温攪拌する。 沈殿 が溶解したこ とを確認してか ら 1 時間攪拌を続けた後、 反応溶 液を減圧下濃縮しァセ ト ニ ト リ ルを除去し、 凍結乾燥した。 得 られた凍結乾燥品をジメ チルホルムア ミ ド 1 . 0 7 4 リ ヅ ト ルに再溶解し、 溶液を酢酸ェチル 2 . 1 5 リ ッ トル、 へキサン 8 . 6 0 リ ツ トルの混合溶媒中に滴下 した。 析出 した沈殿をろ 過し、 へキサン ： 酢酸ェチル （ 3 ： 1 ) 溶液で洗浄後、 真空乾 燥する。 最後に得られた沈殿を無水エタ ノ ール 1 0 7 4 m Lに 懸濁させ、 3 5 °Cで 2時間攪袢 したのち、 懸濁液を ろ過 し、 無 水エタ ノールで洗浄後、 真空乾燥する こ とで片末端メ ト キシポ リ エチ レ ングリ コ一ルーポ リ アスパラギン酸共重合体 N—ァ セチル化物一 ドキソルビシン縮合体 4 5 . 3 9 g を得た。 こ のプロ ヅク共重合体のポ リ ァスパラギン酸部分の側鎖カルボン 酸残基に対する ドキソル ビシンの結合している割合は、 およそ 4 7 %であった。
製造例 7
製造例 6 で得られた片末端メ ト キシポ リ エチレ ングリ コール ーポ リ アスパラギン酸共重合体 N—ァセチル化物— ドキソル ビシ ン縮合体 2 0 . 0 0 gに注射用水 1 0 0 m Lを加え、 3 5 °C に加温 し懸濁させた。 0 . 5 N水酸化ナ ト リ ウム溶液を 6 . 0 m L加え攪拌 した後、 無水エタ ノ ール 1 0 0 m Lを加えた。 ブ 口 ヅ ク共重合体が溶解したこ と を確認した後、 塩酸 ドキソルビ シン 3 . 9 0 6 gを添加し溶解させた。 0 . 5 N水酸化ナ ト リ ウ ム 5 . 9 m Lを加え p Hを 6 に調整し、 注射用水 1 8 8 m Lを加 えた。 1時間後、 溶液をメ ンブラ ンフ ィ ル夕一 （ミ リポア ； G V 夕イ ブ 0. 2 2 〃 m) にてろ過した後、 減圧下溶媒を留去しプロ ック共重合体一薬剤複合体の溶液を得、 更に凍結乾燥を行い、 ブ ロ ック共重合体—薬剤複合体の凍結乾燥物 2 2 . 9 6 g を得た。 実施例 1
製造例 4 で得られたブロ ッ ク共重合体 1 0 . 3 m g を 1 0 mM酢酸緩衝液 （ p H 7 . 0 , l m L ) に溶解し、 1 . 0 0 4 3 gのプロ ヅ ク共重合体溶液を得た。 このう ち 0 . 7 4 9 l g を あ らか じめメ タ ノール、 水、 1 0 m M酢酸緩衝液 （各 5 m L ) を通液 した S e p — P a k Q M Aカ ラ ム （ ウォー夕一ズ社 製） に通し、 さ らに 1 O mM酢酸緩衝液 （ 3 m L ) で洗浄する。 素通 り 分画と洗浄の分画をあわせて 4 . 1 1 7 1 gの溶液を得 た。 こ の溶液を以下の条件の、 ゲルろ過カラムを装着した高速 液体ク ロマ ト グラ フ ィ 一によって定量 した。 含まれるポ リ ェチ レングリ コ一ル類は 0 . 1 0 0 5 m g ( 1 . 3重量％) であった。 カラム ： S h o d e x 0 H p a k S B 8 0 3 + S B— G (昭和 電工社製）
カラム温度 ： 4 0 °C
移動相 ： 1 0 0 m M塩化ナ ト リ ウム水溶液
流速 ： 0 . 5 m L /分
検出器 ： 示差屈折率検出器
注入量 ： 5 0 〃 L 実施例 2
製造例 4で得られたプロ ヅク共重合体 1 0. 3 m gを 1 0 0 Mmリ ン酸緩衝液 （ p H 7 . 0 , 1 m L ) に溶解 しブロ ッ ク共 重合体溶液を得た。 これをあ らか じめメ 夕 ノール、 水、 1 0 0 mMリ ン酸緩衝液 （各 5 m L ) を通液した S e p— P a k C I 8 カラム （ウォー夕一ズ社製） に通し、 さ ら に l O O mMリ ン酸 緩衝液 （ 3 m L ) で洗浄する。 素通り 分画と洗浄の分画をあわ せて 4 . 1 7 3 5 gの溶液を得た。 この溶液を以下に示 した条 件の、 ゲルろ過カラ ムを装着した高速液体ク ロマ ト グラ フ ィ 一 によって定量 した。 含まれるポ リ アスパラギン酸は 0 . 2 5 0 m g ( 2 . 4重量％ ) であった。 カラム ： A s a h i p a k G F 3 1 0 H Q + A s a h i P a k G F - 1 B (旭化成工業ネ土製）
カラム温度 ： 4 0 °C
移動相 ： l O O mM リ ン酸緩衝液 （ ρ Η 7 · 0 )
流速 ： 0 . 5 m L /分
検出器 ： 示差屈折率検出器 （も し く は U V検出器）
注入量 ： 5 0 L 実施例 3
製造例 6 で得られた片末端メ トキシポ リ エチ レ ングリ コール ーポ リ アスパラギン酸共重合体 N —ァセチル化物— ドキソル ビシン縮合体 5 0 m g を精秤 し、 4 % S D S : ァセ トニ ト リ ル （ 1 ： 1 ) 溶液 2 5 m Lで溶解した。 こ の溶液を以下に示し た条件の高速液体ク ロマ ト グラ フ ィ ーによ って分析 したと ころ 遊離塩酸 ドキソルビシン含量 1 . 2 9 重量％、 ドキソルビシン 由来の不純物 0 . 1 5 重量％ (吸光度に基づ く 塩酸 ドキソルビ シン換算） である こ とが明らかになった。 カラム ： カプセルパ ヅ ク C I 8 U G 8 0 ζ> ja (資生堂社製） i . d . 4 . 6 m m x l 5 0 m m
カラム温度 ： 4 0 °C
移動相 ： （ A ) 0 . 2 % リ ン酸、 0 . 1 5 % S D S Z H 2 0 : C H a C N = 7 ： 3
( B ) 0 . 2 % リ ン酸、 0 . 1 5 % S D S / H 2 0 : C H a C N = 3 ： 7
グラジェン ト ： B % (分） ； 2 5 ( 0 ) 、 2 5 ( 1 3 ) 、 1 0 0 ( 3 0 ) 、 1 0 0 ( 4 0 )
流速 ： 1 . 0 m L /分 検出 ： U V ( 2 5 4 n m )
注入量 ： 2 0 L 実施例 4
製造例 6 で得られた片末端メ トキシポ リ エチレ ングリ コール ーポ リ アスパラギン酸共重合体 N—ァセチル化物一 ドキソル ビシン縮合体 3 O m g を精秤 し、 ジメ チルホルムアミ ド 1 m Lで溶解 した。 この溶液を下表に示 した条件のガスク ロマ ト グラ フ ィ 一にて分析 した。 転移 して結合している ジシク ロへキ シル尿素誘導体は 0 . 0 8 %以下 （検出限界以下） であった。 カラ ム ： T C一 1 (ジ一エルサイエンス社製） 、 3 0 m X 0 . 2 5 mm i . d . 、 膜厚 0 . 2 5 111
移動相 ： ヘ リ ウム 0 . 8 m L /分
カラム温度 ： 7 0 °C、 3 °CZ分、 8 8 °C、 1 5 °CZ分、 1 8 0 °C ( 5 分）
注入口 ： 2 9 0 °C
検出器 ： ： F I D ( 2 9 0 °C )
注入量 ： スプリ ッ ト （ 2 0 ： 1 ) 、 1 JLL L 発明の効果
本発明によって、 ポ リ エチレ ングリ コール類とポ リ酸性アミ ノ酸とのプロ ッ ク共重合体に不純物と して含まれるポ リ エチレ ング リ コール類およびポ リ酸性ア ミ ノ酸を除去した純度の高い プロ ッ ク共重合体の提供が可能とな り 、 それら とアン ト ラサイ ク リ ン系制癌剤の縮合した、 薬剤や遺伝子の担体と して医薬用 にも用い得る高分子担体を製造する こ とができ、 更に該高分子 担体の形成する ミ セルの内核にアン ト ラサイ ク リ ン系制癌剤を 内包する高分子医薬製剤を提供する こ とがで きる。
本発明に よ って除去される ブロ ッ ク共重合体に含まれる不純 物は、 ミセル形成等の機能を果たさないこ とは明ら かであ り、 これら を除去 した高分子担体は優れた性能を有する と考え られ る。 また、 この純度の高い高分子担体を用いて得られる高分子 製剤は臨床で使用可能な高純度の医薬製剤とな り 得る。
また、 本発明によ って、 該ブロ ッ ク共重合体中の不純物であ るポ リ エチ レ ング リ コール類および側鎖にカルボン酸を持つポ リ酸性アミ ノ 酸の定量が可能とな り、 プロ ッ ク共重合体の製造 法の改良、 製造規格の策定や工程管理に有用な情報を得る こ と がで きる。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 不純物の含有率が 1 0 重量％以下である こ と を特徴とす る、 ポ リ エチ レ ング リ コ一ル類とポ リ酸性アミ ノ 酸とのブロ ヅ ク共重合体またはこれらの塩
2 . 不純物がポ リ エチ レ ングリ コール類およびポ リ酸性アミ ノ酸類である請求項 1 記載のプロ ッ ク共重合体またはこれらの
3 . ポ リ 酸性ア ミ ノ酸がポ リ アスパラギン酸であ る請求項 1 または 2 に記載のプロ ッ ク共重合体またはこれら の塩。
4 プロ ッ ク共重合体が一般式 （ 1 ) で表される共重合体で ある請求項 1 または 2 に記載のプロ ッ ク共重合体またはこれら の塩。
Figure imgf000040_0001
(式中、 R 1は水素原子または低級アルキル基を表し、 R 2は結 合基を表し、 R 3はメチレン基またはエチレン基を表し、 R 4は水 素原子またはァ ミ ノ基の保護基を表し、 nは 5 — 1 0 0 0、 m は 2 — 3 0 0、 xは 0 — 3 0 0 の整数を示すが、 Xは mよ り大 き く ないものとする。 ）
5 . 一般式 （ 1 ) の R 1が炭素数 ；！ 〜 5 のアルキル基、 R 2が 炭素数 1 ~ 5 のアルキレ ン基、 R 3がメチレ ン基またはエチレン 基、 R 4が水素原子または炭素数 1〜 5 のァシル基であ り 、 nは 5 — 1 0 0 0、 mは 2 — 3 0 0、 xは 0 — 3 0 0 の整数を示す が、 Xは mよ り 大き く ないものとする請求項 4 に記載のプロ ッ ク共重合体またはこれらの塩。
6 . —般式 （ 1 ) の R 1がメチル基、 R 2が ト リ メチレ ン基、 R 3がメチレン基、 R 4がァセチル基であ り、 nは 2 0 — 5 0 0、 mは 1 0 — 1 0 0、 Xは 0 — 1 0 0 の整数を示すが、 xは mよ り大き く ないもの とする請求項 4 に記載のプロ ッ ク共重合体ま たはこれらの塩。
7 . 請求項 1 乃至 6 のいずれか 1 項に記載のプロ ック共重合 体またはこれらの塩の製造法であって、 ポ リ エチ レ ング リ コ一 ル誘導体をイ オン交換樹脂によ り精製し、 プロ ッ ク共重合体と し、 必要に応 じて保護基を除去した後、 分配吸着樹脂を用いて 精製する こ とを特徴とする前記製造法。
8 . 請求項 1 乃至 6 のいずれか 1項に記載のプロ ッ ク共重合 体のポ リ酸性ア ミ ノ 酸とアン ト ラサイ ク リ ン系制癌剤残基が縮 合されている こ と を特徴とする高分子担体。
9 . ポ リ酸性ア ミ ノ酸とアン ト ラサイ ク リ ン系制癌剤残基と の縮合が、 ポ リ 酸性ア ミ ノ酸の側鎖カルボン酸とアン ト ラサイ ク リ ン系制癌剤残基の縮合である請求項 8 記載の高分子担体。
1 0 . アン ト ラサイ ク リ ン系制癌剤残基が ドキソルビシン残 基である請求項 8 又は 9 に記載の高分子担体。
1 1 . ポ リ酸性ア ミ ノ 酸におけるアン ト ラサイ ク リ ン系制癌 剤残基の結合割合が、 3 0 〜 5 5 %である請求項 8 又は 9 に記 載の高分子担体。
1 2 . 請求項 8乃至 1 1 のいずれか 1項に記載の高分子担体 の製造法であって、 請求項 1乃至 6 に記載のプロ ッ ク共重合体 と反応助剤の縮合化合物を分離後、 該縮合化合物にアン ト ラサ ィ ク リ ン系制癌剤を反応させる こ とを特徴とする高分子担体の 製造法。
1 3 . アン ト ラサイ ク リ ン系制癌剤が ドキソルビシンまたは その塩である請求項 1 2 に記載の高分子担体の製造法。
1 4 . 請求項 8乃至 1 1 のいずれか 1項に記載の高分子担体 が作る ミセルの内核にアン ト ラサイ ク リ ン系制癌剤が内包され ている ブロ ッ ク共重合体—薬剤複合体を含んでなる高分子医薬 製剤。
1 5 . アン ト ラサイ ク リ ン系制癌剤が ドキソルビシン又はそ の塩である請求項 1 4 に記載の高分子医薬製剤。
1 6 . 前記プロ ツ ク共重合体—薬剤複合体が凍結乾燥物の形 態で含まれる こ とを特徴とする請求項 1 4 又は 1 5 に記載の高 分子医薬製剤。
7 請求項 1 に記載のポ リ エチレ ング リ コール類とポ リ酸 性ア ミ ノ酸とのプロ ッ ク共重合体における不純物の定量方法で あ って、 該ブロ ッ ク共重合体を溶媒に溶解 し、 こ の溶解液を樹 脂処理 し、 その処理液をゲルろ過カラムを用いた高速液体クロ マ ト グラフ ィ ー処理する こ とを特徴とする定量方法。
1 8 . 溶媒が水と混和する有機溶媒を含んでいて も よい水で あ り 、 樹脂がイ オン交換樹脂であ り 、 不純物がポ リ エチ レ ング リ コール類である請求項 1 7 に記載の定量方法。
1 9 . 溶媒が水と混和する有機溶媒を含んでいて も よい水で あ り 、 樹脂がエーテル結合を有する化合物を吸着で きる分配吸 着樹脂であ り、 不純物がポ リ酸性ア ミ ノ酸である請求項 1 7 に 記載の定量方法。
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