WO2002072817A1

WO2002072817A1 - Nouvelle proteine, gene codant ladite proteine et procede d'utilisation correspondant

Info

Publication number: WO2002072817A1
Application number: PCT/JP2002/002295
Authority: WO
Inventors: Yoshimitsu Takakura
Original assignee: Japan Tobacco Inc.; Syngenta Limited
Priority date: 2001-03-12
Filing date: 2002-03-12
Publication date: 2002-09-19
Also published as: CA2692552C; US7855282B2; PT1369476E; CA2692552A1; HK1147504A1; CN1505681A; US20100251429A1; US20110107469A1; CA2440424C; EP1369476B1; EP1865059B1; JP2008200038A; DK1865059T3; DK1369476T3; EP1369476A1; JP4758448B2; US7776333B2; US20050089983A1; DE60237073D1; ATE474919T1

Description

明細書

新規タンパク質、それをコードする遺伝子及びそれらの利用法技術分野

本発明は、抗菌活性を有する新規なタンパク質とその製造法、それをコードする遺伝子、及ぴ上記タンパク質及び遺伝子の利用法に関するものである。詳細には、本発明は、少なくともイネいもち病菌に対する抗菌活性を有するタモギタケ由来タンパク質、上記タンパク質をコードする遺伝子、並びに上記タンパク質及ぴ上記遺伝子の利用法に関する。

本出願は、 2 0 0 1年 3月 1 2日に提出された日本特許出願特願 2 0 0 1— 6 8 8 9 4号を基礎とする優先権主張出願である。当該日本特許出願の内容は全て本明細書に援用される。

背景技術

従来、植物病原菌に対して抗菌活性のある植物のタンパク質として、キチナ一ゼ、 β— 1 , 3—グルカナーゼなどの溶菌酵素が知られている。 I n V i t r o実験では、これらの酵素は単独でも効果があるが（S c h l umb a um e t a 1 . ( 1 9 8 6) N a t u r e 3 2 4 : p . 3 6 5 - 3 6 7) 一般に 2種類以上の酵素を組み合わせることにより、より高い効果が出ることが知られている（Ma u c h e t a 1 . ( 1 9 8 8) P l a n t P h y s i o l . 8 8 : p . 9 3 6— 9 4 2) 。これら溶菌酵素が糸状菌の生育を抑制する濃度は一般的には、単独の場合数" i ^〜数百 i gZm l程度、組み合わせの場合でも各々数 μ g/m 1程度を必要とすることが知られている。しかしながら、これらの溶菌酵素の中で、イネの重要病害であるいもち病菌（Ma g n a p o r t h e g r i s e a ) に対して抗菌的に働くことが証明されたものは未だ報告されていない。

一方、ディフェンシンをはじめとする小分子量 A F P (An t i一 f u n g a 1 p e p t i d e) も抗微生物活性をもつ。このうちイネのいもち病菌に抗菌的に働くものとして、 C a—AMP l (特表平 8— 5 0 5 0 4 8) 、 C B— 1 ( O i t a e t a 1 . (1 9 9 6) B i o s c i . B i o t e c h. B i o c h em. 60 : p . 48 1 -48 3) 、 R s— AF P 1と R s— AF P 2 (T e r r a s e t a 1. (1 99 2) J . B i o l . C h e m. 2 6 7 : p . 1 5 3 0 1— 1 53 09) 、及ぴ A c e— AM P 1 (特表平 9一 5 0

1 424) が報告されている。これらの低分子のペプチドは数// g/m 1程度で上記病原菌を含む各種の植物病原菌の生育を 50 %阻害する。

溶菌酵素あるいは低分子量抗菌ペプチドの遺伝子を単離、植物に導入し、病害抵抗性植物を作出しようという試みもなされている（B r o g 1 i e e t a 1. (1 9 9 1) S c i e n c e 254 ： p . 1 1 94- 1 1 97 ； T e r r a s e t a 1. ( 1 9 9 5) Th e P l a n t C e l l 7 : p . 5 7 3 - 5 8 8) 。イネにおける研究では、最近イネ由来キチナーゼを過剰発現した形質転換イネのいもち病抵抗性が増強されたことが報告された（N i s h i z a w a e t a 1. (1 9 9 9) Th e o r A p p 1 G e n e t 9 9 : 3

8 3 - 3 90) 。

これらの他に遺伝子導入による病原菌抵抗性植物の作出例として、 PRタンパク質（A l e x a n d e r e t a 1. (1 9 9 3) P r o c . N a t l . Ac a d. S c i . USA 90 : p. 7 3 2 7— 7 33 1) 、グルコースォキシダーゼ（Wu e t a 1. (1 9 9 5) P l a n t C e l l 7 ： p • 1 3 5 7- 1 3 6 8) 、スチノレベンシンターゼ (H a i n e t a 1. ( 1

9 93) N a t u r e 3 6 1 ： . 1 5 3 - 1 56) などが報告されている o

しかし、現状では、必ずしも実用化レベルの抵抗性を付与された植物体が得られていないことが多い。この理由としては、導入した遺伝子の発現レベルが低いことがあげられるが、より本質的には、これまでに報告されている抗菌タンパク質自体の抗菌力が低いことによるものと考えられる。従って、従来の抗菌タンパク質よりさらに強力な抗菌ダンパク質を同定して利用を図ることが望まれている発明の開示本発明の目的の 1つは、比較的低濃度でイネの重要病害であるいもち病菌をはじめとする様々な植物病原菌の生長を抑止できる新規な抗菌タンパク質を検索、同定することである。

本発明の別の目的は、上記の新規タンパク質をコードする遺伝子をクローニングし、その塩基配列を特定することである。

本発明のさらに別の目的は、本発明の遺伝子を宿主生物 (微生物、動物または植物など）に導入して形質転換体を作出し、本発明の遺伝子の利用を図ることである。

本発明のさらに別の目的は、本発明の抗菌タンパク質を含む抗菌剤を提供することである。

図面の簡単な説明

図 1は、本発明抗菌タンパク質によるいもち病菌の生育阻害の様相を示す（8 0°C、 1 0分処理したタンパク質画分を添加した。培養開始 48時間後の結果）図 2は、 Q— S e p h a r o s e F Fカラムによって分離されたタモギタケタンパク質の各画分の電気泳動像と抗菌性との関係を示す。 Mは分子量マーカーを、 FTはカラム通過画分を示す。またレーン下の記号（―、 +、 ++) は抗菌活性の強さを示す。括弧内の抗菌活性は本発明で精製したものとは別の抗菌活性を示す。

図 3は、 Mo n o Qカラムによるタモギタケ抗菌タンパクの分離のチャートと抗菌活性との関係を示す。抗菌活性を示した溶出位置を +で示した。

図 4は、 Mo n o Qカラムによるタモギタケ抗菌タンパクの分離の電気泳動像と抗菌活性との関係を示す。レーン上の番号は図 3の画分番号に一致し、 Mは分子量マーカーを、 O r iは M o n o Qにかけた Q— s e p h a r o s e画分をそれぞれ示す。またレーン下の記号（―、十、 +十、 + + +) は抗菌活性の強さを示す。抗菌タンパク（1 5 kD a) を矢印で示した。

図 5は、 S u p e r o s e 6によるタモギタケ抗菌タンパク質の精製チヤ一トと抗菌活性との関係を示す。矢印は G e l f i l t r a t i o n s t a n d a r d (B I O— RAD社製）の溶出位置を示す。抗菌活性を示した画分の位置を +で示した。

図 6は、 S u p e r o s e 6によるタモギタケ抗菌タンパク質の精製の電気泳動像と抗菌活性との関係を示す。レーン上の番号は図 5の画分番号に一致し、 O r iは S u p e r o s e 6にかけた M o n o Q画分を、 Mは分子量マーカーを示す。またレーン下の記号（一、十、 ++) は抗菌活性の強さを示す。抗菌タンパク質（1 5 kD a) を矢印で示した。

図 7は、 t a ma v i d i n l と t a ma v i d i n 2、ストレプトァビジンとそのホモローグ、アビジンのアミノ酸配列（成熟タンパク質領域）の分子系統樹を示す。

図 8は、ピオチン添加による抗菌活性の消失実験の結果を示す。マイクロタイタープレートに 1ノ ₂ PD培地に懸濁したいもち病菌の胞子を入れ、そこへ 1

000 n g/m 1の濃度の精製 t a ma v i d i n l、ストレプトアビジン、ァビジンを添加したゥエル、さらに同濃度のそれらタンパク質に加え 1 00 n g/ m 1の濃度のビォチンを加えたゥエル、さらにタンパク質無添加のゥヱルを作成し、 28 °Cで 48時間培養した。 50 n g/m 1の濃度の精製 t a m a V i d

1 nを添加したゥエルも同時に示した。

図 9は、大腸菌発現組換え t ama V i d i n 2のイミノビォチンカラムによる精製を示す。 Cは I PTG誘導をかけない大腸菌の総可溶性タンパク質画分を、 Tは ImMの I PT,Gによってタンパク質発現誘導をかけた大腸菌の総可溶性タンパク質画分を示す。 Fは、 ImMの I PTGによって、タンパク質発現誘導をかけた大腸菌の総可溶性タンパク質のうちイミノビォチンカラムに結合せず、通過したタンパク質の画分を、 Wは同カラムの洗浄処理によって溶出された画分を、 Eは酸性緩衝液により溶出された画分をそれぞれ示す。 Tamav i d i n 2タンパク質（およそ 1 5 kD a) を矢印で示し、分子量マーカー（LMW マ一カーキット： Ph a rma c i a LKB社製）を Mで示した。

発明の詳細な説明

上記課題を解決することを目的として、本発明者らは、先ず、いもち病菌に対する i n v i t r oでの抗菌活性を検定するためのアツセィ系を確立した。さらに、食用キノコの一つであるタモギタケからタンパク質を抽出し、イオン交換カラム、ゲル濾過カラムを組み合わせ、各画分を上記抗菌アツセィに供試することにより、抗菌タンパク画分を同定、抗菌タンパクを分離 ·精製した。さらに精製タンパクの部分アミノ酸配列を決定し、これをもとにオリゴ DNAを合成し、 RT_ P C Rにより当該タンパクをコードする部分長 c DNAを得た。次いで、この部分長 c DNAををプローブとしてタモギタケ子実体 c DNAライブラリーをスクリーユングすることにより当該タンパクをコードする完全長の c DN Aを同定し、全塩基配列を決定した。こうしてタモギタケ抗菌タンパクの全アミノ酸配列と、それをコードする遺伝子の DNA配列を同定し、本発明を完成するに至った。

即ち、本発明の第 1の側面によれば、タモギタケの水性抽出液から硫安沈殿法で沈殿する画分から得ることができ、少なくともイネいもち病菌に対する抗菌活性を有し、 S D S _ P AGE法で分子量が約 1 5 k D aである、抗菌タンパク質が提供される。

本発明の抗菌タンパク質は典型的には、本明細書中の配列表の配列番号 2で表される 1 43個のアミノ酸配列で特徴づけられる。本タンパク質は、 SD S— P AGEで分子量がおよそ 1 5 kD a (本明細書において後述する配列表の配列番号 2の配列のうち第 8番目から第 1 43番目のアミノ酸配列からなるポリべプチドに相当）と見積もられるポリペプチドが一つのユニットとなっている。また本タンパク質は、ゲル濾過カラムで分子量が約 3 0 kD aであることを特徴とするタンパク質として同定された。

本発明の抗菌タンパク質はまた、配列表の配列番号 4で表される 1 4 1個のァミノ酸を有するタンパク質を含む。配列番号 4のアミノ酸配列を有するタンパク質も、前記配列番号 2のァミノ酸配列を有するタンパク質と同様に SD S— PA GEで分子量がおよそ 1 5 kD aと見積もられるポリペプチドが一つのュニットとなっており、ゲル濾過力ラムで分子量が約 3 0 k D aである。

本発明の抗菌タンパク質は、配列番号 2又は 4に記載のアミノ酸配列のみでなく、当該配列において 1から複数個のアミノ酸変異を有するアミノ酸配列若しくはこの配列と 5 2 %以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、イネいもち病菌に対する抗菌活性を示す抗菌タンパク質も含む。

本発明の抗菌タンパク質は、好ましくは、配列表の配列番号 2又は 4に記載のァミノ酸配列と 5 2 %以上、より好ましくは 6 0 %以上、さらに好ましくは 7 0 %以上、さらにより好ましくは 8 0 %以上、特に好ましくは 9 0 %以上、最も好ましくは 9 5 %以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する。

本発明の抗菌タンパク質に関して、各々の具体的アミノ酸配列と「5 2 %以上の相同性を有するタンパク質」という定義は、少なくとも 5 2 %の相同性を有していればよいことを意味するが、好ましくは 6 0 %以上、より好ましくは 7 0 % 以上、さらに好ましくは 8 0 %以上、特に好ましくは 9 0 %以上、最も好ましくは 9 5 %以上の相同性を有するァミノ酸配列を有するタンパク質が意図される。本発明の第 2の側面によれば、配列表の配列番号 2又は 4の部分ァミノ酸配列からなるポリぺプチド、例えば、配列番号 2の部分ァミノ酸配列 8— 1 4 3又は配列番号 4の部分アミノ酸配列 8— 1 4 1からなるポリぺプチド；並びに上記ァミノ酸配列の何れかの中に 1〜複数個のアミノ酸変異を有するポリべプチドおよぴ上記アミノ酸配列の何れかと 5 2 %以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するポリぺプチドであって、ィネいもち病菌に対する抗菌活性を示す当該ポリぺプチド；の単独又は何れかのポリペプチドの組み合せから成る抗菌タンパク質が提供される。

本発明の第 3の側面によれば、タモギタケの水性抽出液から硫安 7 5 %飽和を使用する硫安沈殿法で沈殿する画分を回収する工程；および

上記画分をイオン交換クロマトグラフィーにかけ N a C 1濃度 5 O mMから 6

0 O mMの濃度で溶出する画分を回収する工程；

を含む、本発明の抗菌タンパク質の製造方法が提供される。

本発明の第 4の側面によれば、本発明の抗菌タンパク質をコードする遺伝子が提供される。

本発明の遺伝子は、典型的には、配列番号 1の塩基 7 1— 5 0 2の塩基配列又は配列番号 3の塩基 2 2 6 - 6 5 1の塩基配列（以下、本明細書中、単に「配列番号 1又は 3の塩基配列」という場合もある）、上記塩基配列中に 1〜複数個の塩基の置換、欠失、揷入及ぴ z又は付加を有する塩基配列、または上記塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダィズする塩基配列を有する。

本発明の遺伝子は、一般的には、配列番号 1の攆基 7 1 - 5 0 2の塩基配列又は配列番号 3の塩基 2 2 6— 6 5 1の塩基配列と好ましくは 6 0 %以上、より好ましくは 7 0 %以上、さらに好ましくは 8 0 %以上、特に好ましくは 9 0 %以上、最も好ましくは 9 5 %以上の相同性を有する塩基配列を有する。

本発明の第 5の側面によれば、タモギタケ由来の抗菌タンパク質を得るための才リゴヌクレオチドであって、

配列表の配列番号 1又は 3に示す抗菌タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列から以下の条件を満たすように 2つの領域を選択し：

1 ) 各領域の長さが 1 5— 3 0塩基であること；

2 ) 各領域中の G + Cの割合が 4 0 - 6 0 %であること；

上記領域と同じ塩基配列若しくは上記領域に相補的な塩基配列を有する一本鎖 D N Aを製造し、または、上記一本鎖 D N Aによってコードされるアミノ酸残基を変化させないように遺伝子暗号の縮重を考慮した一本鎖 D N Aの混合物を製造し、さらに必要であれば上記抗菌タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列に対する結合特異性を失わないように修飾した上記一本鎖, D N Aを製造する

ことを含む方法により製造された当該オリゴヌクレオチドが提供される。

本発明のオリゴヌクレオチドは、好ましくは配列表の配列番号 1 0ないし 1 7 の何れか 1項に記載のヌクレオチド配列を有する。

本発明の第 6の側面によれば、上記オリゴヌクレオチドの 2種の組をプライマ一として用いて、タモギタケ子実体 c D N Aライブラリーを鎵型にして増幅反応を行い本発明の抗菌タンパク質をコードする遺伝子の一部を増幅し、得られた増幅産物をプロープとして使用して上記 c D N Aライプラリーをスクリーニングして完全長 c D N Aクローンを単離することを含む、本発明の遺伝子の単離方法が提供される。

本発明の第 7の側面によれば、本発明の遺伝子を含む組換えベクターが提供される。本発明の組換えベクターにおいて、好ましくは、ベクターは発現ベクターである。

本発明の第 8の側面によれば、宿主生物に本発明の組換えべクターを導入して得られる形質転換体が提供される。

本発明の第 9の側面によれば、本発明の抗菌タンパク質を有効成分として含む抗菌剤が提供される。

発明の実施の形態

以下、本発明の説明のために、好ましい実施形態に関して詳述する。

タモギタケ由来抗菌タンパク質

本発明の第一の側面によれば、植物病原菌 ί,こ対して抗菌効果のあるタモギタケ由来のタンパク質が提供される。本発明のタンパク質は本明細書に記載した特徴を有する限り、その起源、製法などは限定されない。即ち、本発明の抗菌タンパク質は、天然産のタンパク質、遺伝子工学的手法により組換え D N Aから発現させたタンパク質、あるいは化学合成タンパク質の何れでもよい。

本発明のタンパク質は典型的には、配列表の配列番号 2に記載の 1 4 3個のァミノ酸配列又は配列番号 4に記載の 1 4 1個のアミノ酸配列を有する。しかし、天然のタンパク質の中にはそれを生産する生物種の品種の違いや、生態型（e c o t y p e ) の違いによる遺伝子の変異、あるいはよく似たアイソザィムの存在などに起因して 1から複数個のアミノ酸変異を有する変異タンパク質が存在することは周知である。なお、本明細書で使用する用語「アミノ酸変異」とは、 1または複数個のアミノ酸の置換、欠失、揷入及ぴ Z又は付加などを意味する。本発明のタンパク質は、クローニングされた遺伝子の塩基配列からの推測に基づいて、配列番号 2または 4に記載のアミノ酸配列を有するが、その配列を有するタンパク質のみに限定されるわけではなく、本明細書中に記載した特性を有する限り全ての相同タンパク質を含むことが意図される。相同性は少なくとも 5 2 %以上、好ましくは 6 0 %以上、より好ましくは 7 0 %以上、さらに好ましくは 8 0 % 以上、特に好ましくは 9 0 %以上、最も好ましくは 9 5 %以上である。

また、一般的に、同様の性質を有するアミノ酸同士の置換（例えば、ある疎水性アミノ酸から別の疎水性アミノ酸への置換、ある親水性アミノ酸から別の親水性アミノ酸への置換、ある酸性アミノ酸から別の酸性アミノ酸への置換、あるいはある塩基性アミノ酸から別の塩基性アミノ酸への置換）を導入した場合、得られる変異タンパク質は元のタンパク質と同様の性質を有することが多い。遺伝子組換え技術を使用して、このような所望の変異を有する組換えタンパク質を作製する手法は当業者に周知であり、このような変異タンパク質も本発明の範囲に含まれる。 f列えば、 Mo l e c u l a r C l o n i n g 2 n d e d i t i o n (S a mb r o o k e t a 1. (1 9 89) ) に記載の部位特異的突然変異誘発法等が使用可能である。

本明細書において、相同性のパーセントは、例えば A l t s c h u 1 ら（Nu c 1. Ac i d s . R e s . 2 5. ， p. 3 3 89- 3402, 1 9 9 7) に記载されている B LASTプログラムを用！/、て配列情報と比較し決定することが可能である。当該プログラムは、ィンターネット上で N a t i o n a l C e n t e r f o r B i o t e c h n o l o g y I n f o r ma t i o n (NCB 1) 、あるいは DNA D a t a B a n k o f J a p a n (DDB J) のウェブサイトから利用することが可能である。 B LAS Tプログラムによる相同性検索の各種条件（パラメーター）は同サイトに詳しく記載されており、一部の設定を適宜変更することが可能であるが、検索は通常デフオルト値を用いて行う。あるいは、 GENETYX (S o f t w a r e D e v e l o pme n t C o. ， L t d. ) や DNAS I S (日立ソフトウエアエンジニアリング社）のような遺伝子配列解析ソフトを用いて、配列情報を比較し、決定することが可能である。

本発明のタモギタケ由来抗菌タンパク質およびその遺伝子、さらにそのホモ口ーグとそれにコードされるアミノ酸配列をもつタンパク質について、 G e n e B a n kデータベースの B L AS Tによる相同性検索を行った。本発明の第一のタモギタケ由来抗菌タンパク質のアミノ酸配列（配列番号 2の全アミノ酸配列）のァータベース検索の結果、 s t r e p t my c e s v i o l a c e u sのストレプトアビジン v 2 (寄託番号： Q 5 3 5 3 3， B a y e r e t a 1. ( 1 9 9 5) B i o c h i m B i o p h y s A c t a 1 26 3 : p . 6 0- 6 6) 、ストレプトアビジン v 1 (寄託番号： Q 5 35 32) 、 s t r e p t my c e s a v i d i n i i のストレプトアビジン（寄託番号： P 2 2 6 2 9, A r g a r a n a e t a 1 . ( 1 9 8 6) Nu c l e i c A c i d s R e s 1 4 : p . 1 8 7 1 _ 1 8 8 2 ) 等が相同性を有するものとしてヒットした。相同性は 3つともに 1 2 8ァミノ酸に渡り、それぞれ 5 0 % 、 4 9 %、 4 9 %であった。また、コアストレプトアビジンミュータント w.7 9 f (C h a i n B) (F r e i t a g e t a 1 . ( 1 9 9 7) P r o t e i n S c i . 6 : p . 1 1 5 7 - 1 1 6 6) と 1 2 0ァミノ酸に渡り、 5 1. 7%の相同性を示した。

これらより低い相同性で卵白アビジン（G o p e e t a 1 . ( 1 9 8 7 ) Nu c l e i c A c i d s R e s 1 5 : p . 3 5 9 5— 3 6 0 6) やいくつかのアビジン関連タンパク質（K e i n a n e n e t a 1 . ( 1 9 9 4) E u r J B i o c h e m 2 2 0 : p . 6 1 5— 6 2 1 ) もヒットした。以外のことから、本タンパク質は新規なタンパク質であると考えられる。本発明の第 2のタモギタケ由来抗菌タンパク質のアミノ酸配列（配列番号 4の全アミノ酸配列）のデータベース検索の結果では、ストレプトアビジン v 2、 v l、ストレプトアビジンとそれぞれ 5 0%、 4 8 %、 4 8 %の相同性を示した本抗菌タンパク質は食用キノコタモギタケから精製された新規なストレプトァビジン様タンパク質であるので「t a m a V i d i n」と命名した。本明細書において、精製したタンパク質由来の遺伝子を t a m 1、それがコードするァミノ酸配列を有するタンパク質を t a ma v i d i n l、 t a m 1のホモロ^ "グを t a m2、それがコードするアミノ酸配列を有するタンパク質を t a m a V i d i n 2と呼ぶこととする。

また、配列番号 2及ぴ 4のアミノ酸残基 1一 7は抗菌タンパク質の前駆体のリーダーペプチドの相当すると考えられる。よって、配列番号 2のアミノ酸残基 8 一 1 4 3及び配列番号 4の 8 _ 1 4 1は、抗菌タンパク質の成熟型である。従つて、本発明によれば、配列番号 2の部分ァミノ酸配列 8— 1 4 3又は配列番号 4 の部分アミノ酸配列 8— 1 4 1からなるポリべプチド、並びに上記アミノ酸配列の何れかの中に 1〜複数個のアミノ酸変異を有するポリべプチドおよび上記アミノ酸配列の何れかと 5 1 %より高い相同性を有するアミノ酸配列を有するポリぺプチドであってイネいもち病菌に対する抗菌活性を示す当該ポリべプチド、の単独又は何れかのポリべプチドの組み合せから成る抗菌タンパク質も提供される。本発明のタンパク質の精製および単離は、硫安沈殿法、イオン交換クロマトグラフィー（Mo n o Q、'Q S e p h a r o s eまたは DEAEなど）、ゲノレろ過（S u p e. r o s e 6, S u p e r o s e 1 2等）などのタンパク質の精製おょぴ単離のために慣用される方法を適宜組み合わせて行うことができる。例えば、下記の実施例において記載するように、細粉化したタモギタケを緩衝液で抽出した後、ろ過し、その上清に硫安（硫酸アンモニゥム）を好適な濃度、例えば 7 5%飽和になるまで添加して静置することにより本発明のタンパク質を含む沈殿が得られる。この沈殿をさらに透析した後、イオン交換クロマトグラフィーにかけ、塩濃度のグラジェント（例えば、塩化ナトリウムで 5 OmMから 6 0 OmM) で溶出し、所望のタンパク質を含む画分を抗菌活性を指標に回収する。さらにゲルろ過を行い、分子量 30 kD a付近の画分を回収すればよい。限定されるわけではないが、本発明の抗菌タンパク質は SD S— PAGEで分子量が約 1 5 k D aである。

あるいは、本発明による配列番号 1の DNA配列の 7 1 (若しくは 92) から 5 02の配列から成る D N A配列、または配列番号 3の 226 (若しくは 24 7 ) から 6 5 1の配列から成る DNA配列を、大腸菌や酵母あるいは昆虫やある種の動物細胞に、それぞれの宿主で増幅可能な発現ベクターを用いて公知の導入法を用いて導入、発現させることにより、当該タンパク質を大量に得ることができる。

本発明によってこのタンパク質のアミノ酸配列おょぴそれをコードする DNA 配列が開示されれば、この配列またはその一部を利用して、ハイブリダィゼーシヨンや、 PCRという遺伝子工学の基本的手法を用いて、他の生物種、好ましくは菌類、より好ましくはキノコ、カビ、酵母などの含まれる真菌類（Eumy c o t a) 、多くのキノコが属する担子菌類 (B a s i d i omy c o t i n a) 、さらに好ましくはタモギタケの属するハラタケ類（Ag a r i c a l e s) のキノコ例えばヒラタケ、シィタケ、ナラタケ、マツタケ、シメジ類、エノキタケ、マイタケ、アンズタケ、エリンギタケなどから同様の生理活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が単離され得ると考えられる。このような場合、それらの新規タンパク質も本発明の範囲に含まれるものである。

抗菌タンパク質遺伝子

本発明はまた、本発明の抗菌タンパク質をコードする遺伝子をも提供する。遺伝子の種類は特に限定されず、天然由来の DNA、組換え DNA、化学合成 DN

Aの何れでもよく、またゲノム DNAクローン、 c DN Aクローンの何れでもよい。

本発明の遺伝子は典型的には、配列番号 1又は 3に記載の塩基配列を有するが、これは本発明の一例を示すにすぎない下記の実施例で得られたクローンの塩基配列である。天然の遺伝子の中にはそれを生産する生物種の品種の違いや、生態型（e c o t y p e) の違いに起因する少数の変異やよく似たアイソザィムの存在に起因する少数の変異が存在することは当業者に周知である。従って、本発明の遺伝子は、配列表の配列番号 1又は 3に記載の塩基配列を有する遺伝子のみに限定されるわけではなく、本発明の抗菌タンパク質をコードする全ての遺伝子を包含する。

特に、本発明によってこのタンパク質のアミノ酸配列おょぴそれをコードする DNA配列が開示されれば、この配列またはその一部を利用して、ハイブリダィゼーシヨンや核酸増幅反応等の遺伝子工学の基本的手法を用いて、他の生物種から同様の生理活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を容易に単離することができる。このような場合、そのような遺伝子も本発明の範囲に含まれる。

タモギタケ由来抗菌タンパク質をコードする遺伝子の DNA配列（配列番号 1 の 71— 502の DNA配列）およぴ第 2のタモギタケ由来抗菌タンパク質をコ一ドする遺伝子の DN A配列（配列番号 3の 226— 651の DNA配列）を用いた G e n e B a n kデータベースの B L A S T検索では、非常に短い範囲（2 3 b p) で相同性の見られる配列がいくつか検出されたに過ぎず、ストレプトァビジンの DN A配列等は検出されてこなかった。これは、本発明の新規タンパク質をコードする DN A配列は DN Aレベルではストレプトアビジンの DN A配列等と相同性があまり高くないことを意味する。より詳細には、遺伝子配列解析ソフト GENETYX—WI N v e r 3. 2 (S o f t w a r e D e v e l o pme n t C o. , L t d. ) を用いて、本発明のタモギタケ抗菌タンパク質（t a ma V i d i n 1及ぴ 2 ) とストレブトアビジン (ストレプトアビジンはストレプトアビジン V 2、 V 1 とそれぞれ 9アミノ酸、 1アミノ酸異なるだけである）のアミノ酸配列全体の相同性を解析した。その結果、本発明の t a m 1のコードする t ama v i d i n lのアミノ酸配列で 46. 7 %、 t a m 2のコードする t ama v i d i n 2のァミノ酸配列で 48. 1 %の相同性（アミノ酸同一性）を示した。一方、 DNA配列（配列表の配列番号 1および 3) 全体ではストレプトアビジンとの相同性は 1: a m 1で 5 3. 8 %、 t a m2では 5 1. 0%であった。また t a m 1にコードされるタモギタケ抗菌タンパク質と卵白アビジンとの相同性はアミノ酸配列で 3 1. 2% 、 DNA配列で4 2. 4%であり、 t a m2にコードされるタモギタケ抗菌タンパク質と卵白アビジンとの相同性はアミノ酸配列で 3 6. 2%、 DNA配列で 4 1. 8 %であった。なお、 t a m a V i d i n lと t a m a v i d i n 2のアミノ酸配列間、並びにそれらをコードする遺伝子 t a m 1と t a m 2の DNA配列間の相同性はそれぞれ 6 5. 5%、 64. 5%であった。

ストレプト了ビジンと比較した場合、本発明の t a ma v i d i n l、 t arn a v i d i n 2は N末端側が 33アミノ酸短くなっているが、ビォチンとの結合に関与していると考えられているトリプトファン（W) 残基（G i t 1 i n e t a 1. ( 1 9 8 8) B i o c h e m. J 2 56 : p. 2 7 9- 282) , チロシン（Y) 残基（G i t l i n e t a l (1 9 90) B i o c h e m J 2 6 9 : p. 5 27 _ 5 3 0) は全て保存されている（配列番号 2のァミノ酸配列のうち第 34、第 45番目の Y、第 8 2、第 9 8、第 1 1 0番目の W、配列番号 4のアミノ酸配列のうち、第 34、第 45番目の Y、第 80、第 9 6、第 1 08番目の W) 。

また成熟タンパク質領域と考えられる部分（配列番号 2のァミノ酸配列のうち第 8番目から第 1 43番目のアミノ酸配列、配列番号 4のアミノ酸配列のうち第 8番目から第 14 1番目のアミノ酸配列）の平均分子量はそれぞれ、 1 5 1 58 . 4、 1 473 2. 2と算出され、成熟ストレプトアビジンや成熟アビジンの平均分子量（それぞれ 1 649 0. 6、 1 4342. 9) と似ている。

ストレプトァビジンは放,镍菌 S t r e p tmy c e s a v i d i n i i由来、アビジンは鳥類（G a l i u s g a l l u s) の卵白由来である。これまでにストレプトアビジンによく似たタンパク質として、 S t r e p t my c e s V i o 1 a c e u s力ら前述のストレプトアビジン v lおよび v 2 (B a y e r e t a 1. 丄 9 9 5 B i o c h i m B i o p h y s A c t a 1 26 3 : p . 6 0- 6 6) またアビジン遺伝子のホモローグとして鳥類からァビジン連遺子 (a v r l— a v r 5， K e i n a n e n e t a 1 . ( 1 9 94) E u r J B i o c h e m 2 20 : p. 6 1 5- 6 2 1 ) が単離されている。ストレプトアビジンとストレプトアビジン v lおよび V 2とのアミノ酸配列の違いはそれぞれ 1アミノ酸、 9アミノ酸であり、アビジンとアビジン関連タンパク質とのアミノ酸配列の相同性は 68 - 78%、 DNA配列の相同性は 8 8 - 9 2%である。ストレプトアビジンとアビジンの相同性はァミノ酸配列で 2 9. 2%、 DNA配列で46. 8%である。

一方、本発明の抗菌タンパク質の好ましい一態様である t a m a V i d i n 1 および 2は担子菌タモギタケ（P l e u r o t u s c o r n u c o p i a e) 由来であり、先述のようにストレプトアビジンとのアミノ酸配列相同性はそれぞれ 46. 7%、 4 8. 1 %、またアビジンとのアミノ酸配列相同性はそれぞれ 3 1. 2%、 36. 2%である。この様に t a m a V i d i n 1、 2は、放線菌のストレプトアビジンのグループ、鳥類のアビジンのグループとは異なる第 3のグループを形成している。放線菌、鳥類以外からこのようなアビジン様タンパク質が単離されたのはこれが初めてである。 t ama v i d i n l、 2はキノコ類のアビジン様タンパク質であるが、他のキノコ類にも同様なタンパク質が含まれている可能性は高いと予測される。 t a ma v i d i n l、 2のアミノ酸配列、 t a mi , t am2の DNA配列は、そのようなタンパク質およびその遺伝子をさらに検索、単離することに利用し得る。

相同遺伝子のスクリ一二ングのために使用するハイブリダイゼーシヨン条件は特に限定されないが、一般的にはストリンジェントな条件が好ましく、例えば、 Cu r r e n t P r o t o c o l s i n Mo l e c u l a r B i o l o g y V o l . 1 (J o h n W i l e y a n d S o n s , I n c. ) や Mo l e c u l a r C l o n i n g 2 n d e d i t i o n (S amb r o o k e t a 1. ( 1 98 9) ) に記載されているように、 5 X S S C、 5 XD e n h a r d t ' s s o l u t i o n, 1 %SD S、 2 5。Cなレヽし 68°C で、.数時間から一晩などのハイプリダイゼーシヨン条件を使用することが考えられる。この場合、ハイプリダイゼーシヨンの温度としては、より好ましくは 45 °Cないし 6 8°C (ホルムアミド無し）または 30°Cないし 42°C (50%ホルムアミド）を挙げることができる。洗浄の条件としては、例えば 0. 2 X S S Cで 45°Cないし 6 8 °Cが挙げられる。ホルムアミド濃度、塩濃度及ぴ温度な'どのハ • ィプリダイゼーシヨン条件を適宜設定することによりある一定の相同性以上の相同性を有する塩基配列を含む DN Aをクローニングできることは当業者に周知であり、このようにしてクローニングされた相同遺伝子は全て本発明の範囲の中に含まれる。

核酸増幅反応は、例えば、複製連鎖反応（PCR) (サイキら、 1 98 5， S c i e n c e 23 0, p. 1 3 50— 1 3 54) 、ライゲース連鎖反応（L C R) (ウーら、 1 9 8 9, G e n om i c s 4， p. 5 60— 56 9 ;パリンガーら、 1 9 9 0， G e n e 8 9， p. 1 1 7— 1 22 ；ノラニーら、 1 99 1， P r o c. Na t l . Ac a d. S c i . USA 88， ρ·. 1 8 9- 1 9 3 ) および転写に基づく増幅（コ一ら、 1 98 9， P r o c. Na t l . A c a d . S c i . USA 8 6， p . 1 1 73 - 1 1 7 7) 等の温度循環を必要とする反応、並びに鎖置換反応（SDA) (ウォーカーら、 1 99 2， P r o c . N a t 1. Ac a d. S c i . USA 8 9, p. 3 9 2— 3 9 6 ; ウォーカーら、 1 9 9 2， N u c . Ac i d s . R e s . 20, p. 1 6 9 1— 1 6 96) 、自己保持配列複製（ 3 S R) (グァテリら、 1 9 90， P r o c . N a t l . A c a d. S c i . USA 87, p . 1 8 74- 1 8 78) および Q βレプリカーゼシステム（リザィノレディら、 1 98 8， B i o T e c h n o l o g y 6, p. 1 1 9 7 - 1 202) 等の恒温反応を含む。また、欧州特許第 0 5 25 88 2号に記載されている標的核酸と変異配列の競合増幅による核酸配列に基づく増 Φ畐 (Nu c l e i c Ac i d S e q u e n c e B a s e d Amp l i f i c a t i o n : NAS AB A) 反応等も利用可能である。好ましくは P CR法である。

上記のようなハイプリダイゼーシヨン、核酸増幅反応等を使用してクローニングされる相同遺伝子は、配列表の配列番号 1に記載の塩基配列に対して好ましくは 60%以上、より好ましくは 70%以上、さらに好ましくは 80%以上、特に好ましくは 90%以上、最も好ましくは 95%以上の相同性を有する。

オリゴヌクレオチド

本発明によればまた、タモギタケ由来の抗菌タンパク質を得るためのオリゴヌクレオチドであって、

配列表の配列番号 1または 3に示す抗菌タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列から以下の条件を満たすように 2つの領域を選択し：

1) 各領域の長さが 1 5 _ 30塩基であること；

2) 各領域中の G + Cの割合が 40— 60%であること；

上記領域と同じ塩基配列若しくは上記領域に相補的な塩基配列を有する一本鎖 D NAを製造し、または、上記一本鎖 DNAによってコードされるアミノ酸残基を変化させないように遺伝子暗号の縮重を考慮した一本鎖 DN Aの混合物を製造し、さらに必要であれば上記抗菌タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列に対する結合特異性を失わないように修飾した上記一本鎖 DN Aを製造する

ことを含む方法により製造された当該オリゴヌクレオチドが提供される。本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば本発明の遺伝子を検出もしくは単離するためのハイブリダイゼーション、あるいは適当な 2種をプライマー対として用いた P C R等の増幅反応に用いることが可能である。

本発明のオリゴヌクレオチドは、好ましくは配列表の配列番号 10— 1 9の何れかに記載のヌクレオチド配列を有する。配列番号 1 0— 1 3のヌクレオチド配列は、配列番号 9のアミノ酸配列に基づいて、そのタンパク質の一部をコードする遺伝子断片のクローニングのための P C R用プライマーとして設計されたものであり、当該アミノ酸をコードすることが可能な全ての塩基をミッタスしたプライマ一である。配列番号 14一 1 7のヌクレオチドは t.amlと t a m 2遺伝子の全塩基配列を解読するためにプライマーウォーク用として合成されたプライマ一である。配列番号 1 8— 1 9のヌクレオチドは、配列番号 4のアミノ酸配列を有する組換え t a ma V i d i n 2タンパク質を発現するための発現ベクターを構築するために、全 OR Fを増幅するために配列番号 3に基づいて作成された P CR用プライマーである。

本発明の遺伝子の部分断片は、上記オリゴヌクレオチドの適切な組み合せを使用してタモギタケ子実体 c DN Aライプラリーを铸型にして P CR等の核酸増幅反応を行うことにより増幅させて単離することができる。かくして得られた増幅産物をプローブとして使用してさらに c DN Aライブラリーをプラークハイプリダイゼーションなどでスクリ一ユングすることにより完全長の c DNAクローンを単離することができる。核酸増幅反応の手順及ぴ条件、プラークハイブリダィゼーシヨンの条件などは当業者に周知である。

例えば、限定されるわけではないが、ハイブリダィゼーシヨンの条件としては、 Cu r r e n t P r o t o c o l s i n Mo l e c u l a r B i o l o g y Vo l . 1 (J o h n W i l e y a n d S o n s , I n c. ) や M o l e c u l a r C l o n i n g (S a mb r o o k e t a 1. 上記）に記載されているように、温度条件が場合によっては室温程度、洗浄も例えば 2xS S Cなど通常よりも高い塩濃度で、温度も 3 7°C程度というように力なりストリンジエンシーを低くとることが想定される。

組換え抗菌タンパク質の製造

本発明のタンパク質は極めて強力な抗菌活性をもつ。例えばイネのいもち病菌に対しては 50 n g/m 1 という非常に低い濃度で胞子の発芽を完全に抑制する (後述の実施例 4を参照）。この濃度においては長時間のインキュベーションの後にも胞子の発芽はみられないことから、本発明のタンパク質のいもち病菌に対. する効果は、生長の部分的阻害というよりはむしろ、殺菌効果であると考えられる。このような低い濃度（ナノグラムオーダー）で、病原菌の生育を完全に抑止できる抗菌タンパク質は本発明者の知る範囲では現在までに報告されていない。後述の実施例においては、抗菌タンパク質の精製のための抗菌アツセィのための植物病原菌としてイネの最重要病害であるいもち病菌を使用したが、同定したタモギタケ抗菌タンパク質が、これ以外の紋枯病菌等の植物病害にも大差ないレべルで抗菌効果を有している可能性は極めて高い。

このように本発明のタモギタケ由来の抗菌タンパク質は強い抗菌活性を有していることから、本発明のタンパク質は、抗菌剤や農薬などの薬剤としてそれが活性のある形で含まれるような製剤として利用することができる。この場合、本タンパク質は、例えば後述の実施例に従ってタモギタケよりイオン交換カラム、ゲル濾過カラムを用いて精製され得る。しかし、本発明のタモギタケ抗菌タンパク質をコードする配列番号 1の 7 1— 502又は配列番号 3の 2 26— 6 5 1の塩基配列を有する DNAを、大腸菌や酵母あるいは昆虫やある種の動物細胞に、それぞれの宿主で増幅可能な発現ベクターを用いて導入、発現させることにより、当該タンパクをより簡便かつ大量に製造することができる（実施例 5) 。

本発明によればまた、本発明の遺伝子を含む組換えベクターが提供される。プラスミドなどのベクターに本発明の遺伝子の DN A断片を組み込む方法としては、例ば、 S amb r o o k, J . ら， Mo l e c u l a r C l o n i n g, A L a b o r a t o r y Ma n u a l (2 n d e d i t i o n) , C o l d S p r i n g Ha r b o r L a b o r a t o r y, 1. 53 ( 1 9 8 9 ) に記載の方法などが挙げられる。簡便には、市販のライゲーシヨンキット（例えば、宝酒造製等）を用いることもできる。このようにして得られる組換えべクター（例えば、組換えプラスミド）は、宿主細胞（例えば、 E— c o i 1 TB 1， L E 3 92または X L— 1 B 1 u e等）に導入される。

プラスミドを宿主細胞に導入する方法としては、 S a mb r o o k, J . ら， Mo l e c u l a r C l o n i n g, A L a b o r a t o r y M a n u a 1 (2 n d e d i t i o n) , C o l d S p r i n g H a r b o r L a b o r a t o r y, 1. 74 (1 9 8 9) に記載のリン酸カルシウム法または塩化カルシゥム Z塩化ルビジゥム法、エレクト口ポレーシヨン法、エレクトロインジヱクシヨン法、 PEGなどの化学的な処理による方法、遺伝子銃などを用いる方法などが挙げられる。

ベクターは、簡便には当業界において入手可能な組換え用ベクター (例えば、プラスミド DNAなど）に所望の遺伝子を常法により連結することによって調製することができる。用いられるベクターの具体例としては、大腸菌由来のプラスミドとして、例えば、 p B l u e s c r i p t、 pUC 1 8、 pUC 1 9、 p B R 3 22、 p T r c 9 9 Aなどが例示されるがこれらに限定されない。

所望のタンパク質を生産する目的においては、特に、発現べククーが有用である。発現ベクターの種類は、原核細胞および/または真核細胞の各種の宿主細胞中で所望の遺伝子を発現し、所望のタンパク質を生産する機能を有するものであれば特に限定されないが、例えば、大腸菌用発現ベクターとして、 p QE— 3 0 、 p QE— 6 0、 pMAL— C 2、 pMAL— p 2、 p S E 420などが好ましく、酵母用発現ベクターとして pYE S 2 (サッカロマイセス属）、 p P I C 3 . 5 K、 p P I C 9K、 p AO 8 1 5 (以上ピキア属）、昆虫用発現ベクターとして p B a c PAK8/9、 p BK 28 3、 pVL 1 3 92、 p B 1 u e B a c 4. 5などが好ましい。

形質転換体は、所望の発現ベクターを宿主細胞に導入することにより調製することができる。用いられる宿主細胞としては、本発明の発現ベクターに適合し、形質転換され得るものであれば特に制限はなく、本発明の技術野において通常使用される天然の細胞、または人工的に樹立された組換え細胞など種々の細胞を用いることが可能である。例えば、細菌（ェシエリキア属菌、バチルス属菌）、酵母（サッカロマイセス属、ピキア属など）、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞などが挙げられる。

宿主細胞は、大腸菌、酵母、植物細胞または昆虫細胞が好ましく、具体的には、大腸菌（M1 5、 JM1 09、 B L 2 1等）、酵母（ I NVS c l (サッカロマイセス属）、 G S 1 1 5、 KM 7 1 (以上ピキア属）など）、昆虫細胞（Bm N4、カイコ幼虫など）などが例示される。また、動物細胞としてはマウス由来、アフリカッメガエル由来、ラット由来、ハムスター由来、サル由来またはヒト由来の細胞若しくはそれらの細胞から樹立した培養細胞株などが例示される。さらに、植物細胞に関しては、細胞培養が可能であれば特に限定されないが、例えば、タバコ、ァラビドプシス、イネ、トウモロコシ、コムギ由来の細胞などが例示される。宿主細胞として細菌、特に大腸菌を用いる場合、一般に発現ベクターは少なくとも、プロモーター/オペレーター領域、開始コドン、所望の抗菌タンパク質をコードする遺伝子、終止コドン、ターミネータ一および複製可能単位から構成される。

宿主細胞として酵母、植物細胞、動物細胞または昆虫細胞を用いる場合には、一般に発現ベクターは少なくとも、プロモーター、関始コドン、所望の抗菌タンパク質をコードする遺伝子、終止コドン、ターミネータ一を合んでいることが好ましい。またシグナルペプチドをコードする DNA、ェンハンサー配列、所望の遺伝子の 5 '側および 3 '側の非翻訳領域、選択マーカー領域または複製可能単位などを適宜含んでいてもよい。

本発明のベクターにおいて、好適な開始コドンとしては、メチォニンコドン（ ATG) が例示される。また、終止コドンとしては、常用の終止コドン（例えば、 TAG、 TGA、 TAAなど）が例示される。

複製可能単位とは、宿主細胞中でその全 DN A配列を複製することができる能力をもつ DNAを意味し、天然のプラスミド、人工的に修飾されたプラスミド（天然のプラスミドから調製されたプラスミド）および合成プラスミド等が含まれる。好適なプラスミドとしては、 E. c o i 1ではプラスミド p QE 30、 p E Tまたは p CALもしくはそれらの人工的修飾物（pQE 30、 p ETまたは p CALを適当な制限酵素で処理して得られる DNAフラグメント） ,ヽ酵母ではプラスミド pYE S 2もしくは p P I C 9 Kが、また昆虫細胞ではプラスミド p B a c PAK 8/ 9等があげられる。

ェンハンサー配列、ターミネータ一配列については、例えば、それぞれ SV4 0に由来するもの等、当業者において通常使用されるものを用いることができる選択マーカーとしては、通常使用されるものを常法により用いることができる。例えばテトラサイクリン、アンピシリン、またはカナマイシンもしくはネオマイシン、ハイグロマイシンまたはスぺクチノマイシン等の抗生物質耐性遺伝子などが例示される。発現ベクターは、少なくとも、上述のプロモーター、開始コドン、所望の抗菌タンパク質をコードする遺伝子、終止コドン、およびターミネータ一領域を連続的かつ環状に適当な複製可能単位に連結することによつて調製することができる

。またこの際、所望により制限酵素での消化や T4DNAリガーゼを用いるライゲーシヨン等の常法により適当な DNAフラグメント（例えば、リンカ一、他の制限酵素部位など）を用いることができる。

本発明の発現ベクターの宿主細胞への導入 [形質転換（形質移入） ] は従来公知の方法を用いて行うことができる。

例えば、細菌（E. c o i l , B a c i l l u s s u b t i l i s等）の場合は、例えば C o h e nらの方法 [P r o c . N a t l . A c a d. S c i . USA, 6 9， 2 1 1 0 (1 9 72) ] 、プロトプラスト法 [Mo l . G e n. G e n e t . , 1 68， 1 1 1 (1 9 7 9) ] やコンビテント法 [J . Mo l . B i o l . , 56， 20 9 (1 9 7 1) ] によって、 S a c c h a r omy c e s c e r e v i s i a eの場合は、列えば H i n n e nらの方法 [P r o c. N a t l . Ac a d. S c i . USA, 75， 1 9 2 7 ( 1 9 78) ] ゃリチウム法 [J . B a c t e r i o l . , 1 5 3, 1 6 3 (1 9 8 3) ] によって、植物細胞の場合は、例えばリーフディスク法 [S c i e n c e， 22 7, 1 2 9 ( 1 98 5) ] 、エレクトロボレ一ション法 [Na t u r e, 3 1 9, 79 1 (1 986) ] によって、動物細胞の場合は、例えば G r a h a mの方法 [V i r o l o g y, 5 2， 45 6 (1 9 73) 〕、昆虫細胞の場合は、例えば S umm e r sらの方法 [Mo l . C e l l . B i o l . , 3， 2 1 5 6 - 2 1 6 5 (1 9 83) ] によってそれぞれ形質転換することができる。

本願発明の DN Α断片を用いて病害抵抗性植物を作出する目的においては、植物形質転換用ベクターが有用である。植物用ベクターとしては、植物細胞中で当該遺伝子を発現し、当該タンパク質を生産する能力を有するものであれば特に限定されないが、例えば、 p B I 2 2 1、 p B I 1 2 1 (以上、 C 1 o n t e c h 社製）、及ぴこれらから派生したベクターが挙げられる。また、特に単子葉植物の形質転換には、 p I G 1 2 1 Hm、 p TOK 2 3 3 (以上、 H i e i ら， P I a n t J . ， 6， 2 7 1 - 28 2 (1 9 94) ) 、 p S B 424 (Koma r i ら， P l a n t J . , 1 0， 1 6 5— 1 74 (1 9 9 6) ) などが例示される。

形質転換植物は、上述のベクターの ;3—グルクロニダーゼ (GUS) 遺伝子の部位に本願発明の DNA断片を入れ替えて植物形質転換用ベクターを構築し、これを植物に導入することで調整することができる。植物形質転換用ベクターは、少なくともプロモーター、翻訳開始コドン、所望の遺伝子（本願発明の DNA配列またはその一部）、翻訳終始コドンおよびターミネータ一を含んでいることが好ましい。また、シグナルペプチドをコードする DNA、ェンハンサー配列、所望の遺伝子の 5 ' 側および 3 ' 側の非翻訳領域、選抜マーカー領域などを適宜含んでいてもよい。

プロモーター、ターミネータ一は植物細胞で機能するものであれば特に限定されないが、構成的発現をするプロモーターとしては、上記ベクターに予め組み込まれている 3 5 Sプロモーターの他に、ァクチン、ュビキチン遺伝子のプロモーターなどが例示される。しかしながら、より好適には誘導性のプロモーターを組み入れて用いてもよい。こうすることで病害虫が形質転換植物に接触した時にのみ、当該タンパクが生産され、抵抗性となる。用いられるべき誘導性プロモータ一としてはフエ二ルァラニンアンモニアリァーゼ、キチぅ "一ゼ、グルカナーゼ、チォニン、オズモチンあるいは病害虫ゃストレスに反応するその他の遺伝子のプ口モーターが考えられる。

植物への遺伝子導入法としては、ァグロバタテリゥムを用いる方法（Ho r s c h e t a l . ， S c i e n c e, 227, 1 2 9 (1 9 8 5) 、 H i e i e t a 1. , P l a n t J . ， 6， p. 2 7 1— 28 2 (1 994) ) 、ェレクトロポレーション法 (F r o mm e t a 1. , N a t u r e, 3 1 9 ， 7 9 1 (1 9 8 6) ) 、？£0法（？ & 3 2 0 3 1^ e t a 1. , E MB O J . ， 3， 2 7 1 7 (1 984) ) 、マイク口インジエタション法（C r o s s wa y e t a l . , Mo l . G e n. G e n e t . , 202, 1 7 9 ( 1 9 86) ) 、微小物衝突法（Mc C a b e e t a 1. , B i o/T e c h n o l o g y, 6， 92 3 (1 98 8) ) などが挙げられるが、所望の植物に遺伝子を導入する方法であれば特に限定されない。また、宿主となる植物種も本発明の植物形質転換用ベクターに適合し、形質転換されうるものであればに限定されず、本発明の技術分野において通常使用される植物、例えば双子葉植物ではタバコ、ァラビドプシス、トマト、キユウリ、ニンジン、ダイズ、パレイショ、テンサイ、カブ、ハクサイ、ナタネ、ヮタ、ペチュニアなどが挙げられ、単子葉植物では、イネ、トウモロコシ、コムギなどが挙げられる。

本発明のタンパクは、上記の如く調製された発現ベクターを含む形質転換細胞を栄養培地で培養することによって発現（生産）することができる。栄養培地は、宿主細胞（形質転換体）の生育に必要な炭素源、無機窒素源もしくは有機窒素源を含んでいることが好ましい。炭素源としては、たとえばグルコース、デキストラン、可溶性デンプン、ショ糖、メタノールなどが、例示される。無機窒素源もしくは有機窒素源としては、例えばアンモニゥム塩類、硝酸塩類、アミノ酸、コーンスチープ ' リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、パレイショ抽出液などが例示される。また、所望により他の栄養素（例えば無機塩（例えば、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシゥム）、ビタミン類、抗生物質（例えばテトラサイクリン、ネオマイシン、アンピシリン、カナマイシン等）など）を含んでいてもよい。

培養は、当業界において知られている方法により行われる。培養条件、例えば温度、培地の p H及ぴ培養時間は、本発明のタンパクが大量に生産されるように適宜選択される。限定されるわけではないが、例えば大腸菌での発現の場合、組換えタンパク質発現のための培養条件として、好ましくは 4 °Cないし 4 0 °Cの温度で培養し、 0 . O l mMないし 5 . O mMの I P T Gによる誘導を行う。

本発明のタンパクは、上記培養により得られる培養物より以下のようにして取得することができる。すなわち、本発明のタンパクが宿主細胞内に蓄積する場合に'は、遠心分離やろ過などの操作により宿主細胞を集め、これを適当な緩衝液（例えば濃度が 1 0 M〜 1 0 0 mM程度のトリス緩衝液、リン酸緩衝液、 H E P E S緩衝液、 M E S緩衝液などの緩衝液。 p Hは用いる緩衝液によって異なるが、 p H 5 . 0〜9 . 0の範囲が望ましい）に懸濁した後、用いる宿主細胞に適した方法で細胞を破壊し、遠心分離により宿主細胞の内容物を得る。一方、本発明のタンパクが宿主細胞外に分泌される場合には、遠心分離やろ過などの操作により宿主細胞と培地を分離し、培養ろ液を得る。宿主細胞破壌液、あるいは培養ろ液はそのまま、または硫安沈殿と透析を行なった後に'、本発明のタンパク質の精製、単離に供することができる。

精製 ·単離の方法としては、以下の方法が挙げることができる。即ち、当該タンバクに 6 Xヒスチジンや G S T、マルトース結合タンパクといったタグを付けている場合には、一般に用いられるそれぞれのタグに適したァフィ二ティーク口マトグラフィ一による方法を挙げることができる。例えば、限定するわけではないが、本明細書で後述する実施例 4では、 Ν—末端に 6 Xヒスチジンのタグを有する組換え抗菌タンパク質を発現させた。当該組換えタンパク質は、 6 Χヒスチジンに親和性を有する N i一 NT Aァガロース（Q i a g e n社）を使用して精製した。一方、そのようなタグを付けずに本発明のタンパクを生産した場合には、例えば後述する実施例に詳しく述べられている方法、即ちイオン交換クロマトグラフィ一による方法を挙げることができる。また、これに加えてゲルろ過や疎水性クロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィーなどを組み合わせる方法も挙げることができる。また、 Ho f ma n nらの文献（P r o c . Na t l . A c a d. S c i . USA, 77 : . 46 6 6 -46 6 8 (1 9 80) ) に記載されているように、ィミノピオチンァフィ二ティーカラムを用いて精製する方法も適用することができるだろう。後述の実施例 5では、 50mLの大腸菌培養液から組換え t ama v i d i n 2タンパク質を 1 m gの収量で得た。

上記のように遺伝子工学手法により得られた、あるいは天然源より精製された本発明の抗菌タンパク質は、抗菌活性を有する。抗菌活性は、限定されるわけではないが、例えば、マイクロタイタープレートに培地 (例えば、 1 / 2 PD培地、シユークロース一ペプトン培地等）に懸濁したいもち病菌の胞子を入れ、そこへ本発明の抗菌タンパク質を所期の濃度、例えば、 l O n gZm 1— 1 000 n g /m 1、好ましくは 50 n g /m 1の濃度で添加し、 28 °Cで 48時間培養する。そして、いもち病菌の成長，増殖（例えば、菌糸の伸長）力、抗菌タンパク質を加えない場合と比較して抑制されるか否かを判断することによって、抗菌活性を測定することが可能である（実施例 4) 。あるいは、下記の方法も使用可能である。シャーレに作成した寒天培地の中心にいもちの菌叢を置き、その周りに上述の濃度の本発明の抗菌タンパク質の水溶液の一定量を滴下し、 2 8°Cで 48時間一 1週間程度培養する。そして、抗菌タンパク質を滴下した部分におけるいもち病菌の菌糸の伸長が、滴下しない部分に比較して抑制されるか否かを判断することによって、 '抗菌活性を測定することが可能である。

抗 1¾剤

本発明のタンパクは強い抗菌活性をもつ。例えば我々の用いた抗菌アツセィではイネのいもち病菌に対して 5 0 n g/ 1 という低い濃度で菌糸の成長を抑制する。後述の実施例においては、抗菌アツセィ用の植物病原菌としてイネの最重要病害であるいもち病菌と紋枯病菌を使用し、本発明で同定したタモギタケ抗菌タンパクはこれらに対して抗菌作用を示した。本発明のタンパク質がいもち病菌以外の他の植物病原菌に対しても抗菌効果を有している可能性が高い。

このように本発明のタモギタケ由来の抗菌タンパク質は強い抗菌活性を有していることから、抗菌剤や農薬などの薬剤としてそれが活性のある形で含まれるような製剤として利用することができる。この場合、本発明のタンパクをコードする DNA配列を用いれば、先述のように例えば大腸菌や酵母などで機能する発現ベクターにその D N Aを組み込んで大量に製造することができる。

本発明の抗菌タンパク質は新規なストレプトアビジン様タンパク質であることから、ビタミンの一種であるピオチン（ビタミン H) と結合することが示唆される。一方いもち病菌はその生育にビォチンが必要であることが知られている。これらのことから、本抗菌タンパク質はアツセィ培地に存在する遊離ビォチンと結合し、これが培地中のビォチン欠乏を引き起こし、結果としていもち病菌の生育が抑えられたことが示唆された。実際、後述する実施例 4に記載されるように、アツセィ培地中にビォチンを過剰に添加すると本発明の t a ma v i d i n lの抗菌活性は消去された。さらに本発明者は市販のストレプトアビジンおょぴアビジンにも t a ma v i d i n lと同様にイネいもち病菌に対する抗菌作用があることを見出し、この作用はやはりピオチンにより打ち消されることを明らかにした。本発明によってビタミンの一種であるビォチンの量を制御することにより、病害抵抗性特にいもち病菌抵抗性を植物に付与できる可能性が示唆された。この様にビタミンを制御することによって病害抵抗性を付与できる可能性があることはこれまでに知られていなかった。これは全く新しい概念である。この概念も本発明に含まれる。例えば、本発明の抗菌タンパク質を有効成分として含む製剤の農薬としての利用が挙げられる。この場合、本発明の抗菌タンパク質以外のビォチン結合十生タンノク質 (伊!!えほ、 s t r e p t m y c e s a v i d i n i iのストレプトアビジンや卵白アビジン、およびそれらのホモローグなど）も同じ概念に含まれる。

よって、本発明によれば、本発明の抗菌タンパク質を有効成分として含む抗菌剤が提供される。本発明の抗菌剤は通常、植物の全身または局所的に、散布することができる。

散布量は、植物の種類、生育段階、症状、散布方法、処理時間、散布するタンパク質の種類（全長のタンパク質、該タンパク質の一部を置換、欠失、挿入及び Z又は付加したクンパク質など）、生育している場所の気候、生育している場所の土壌などにより異なるが、一日一回から複数回毎日ないし数日おきに散布することができる。散布量は種々の条件により変動する。本発明の抗菌剤の散布に際しては、必要に応じて、溶液剤、懸濁剤、乳濁剤などを混合して散布することも可能である。水性または非水性の溶液剤、懸濁剤としては、一つまたはそれ以上の活性物質が、少なくとも一つの不活性な希釈剤として混合される。水性の希釈剤としては、例えば蒸留水、食塩水などが挙げられる。非水性の希釈剤としては、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ォリーブ油のような植物油、ェタノールのようなアルコール類などが挙げられる。

このような抗菌組成物は、さらに防腐剤、湿潤剤、乳化剤、分散別または安定化剤（例えばアルギニン、ァスパラギン酸など）などの捕助剤を含んでいてもよレ、。

これらは、必要に応じてパクテリア保留フィルターを通す濾過、殺菌剤の配合または照射によって無菌化される。これらはまた、例えば凍結乾燥法などによつて無菌の固体組成物の形態で製造し、使用前に無菌の蒸留水または他の溶媒に溶解して使用することもできる。

このようにして得られる抗菌剤の剤形としては、使用する用途に応じて決めればよく、上記のような添加物と混合し、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、液剤、乳剤等の形態により散布することができる。

また本発明の抗菌タンパク質をコードする遺伝子を植物に導入することで病害抵抗性植物を作成することも可能であろう。即ち、例えば植物で機能するプロモ一ターと本発明の抗菌タンパク質をコードする遺伝子を連結し、さらにその下流に植物で機能するターミネータ一を付加したコンストラクトを植物に導入することで病害抵抗性植物の作成が可能である。この場合、 t a m a V i d i nの植物細胞外への分泌を促すために、本発明の抗菌タンパク質をコードする遺伝子の 5 ' 側に植物で機能する細胞外分泌シグナルぺプチドをコ一ドする D N A配列を付加することも可能である。あるいはまた植物細胞あるいは細胞外での抗菌タンパク質の蓄積を促すために遺伝子の使用コドン（ c o d 0 n u s a g e ) をそのアミノ酸は変化させないように単子葉あるいは双子葉植物用に変化させることも可能である。このような組み合わせを用いた病害抵抗性植物の作出方法も本発明に含まれるものである。

t a m a V i d i n、ァビジン、ストレプトアビジン、あるいはそれらとよく似たタンパク質の病害抵抗性植物の作出への適用、およびィネ以外の植物への適用も本発明に含まれるものである。本発明において解析した病原菌はイネいもち病菌であるが、この病原菌以外にもピオチンをその生育に必要とするその他の、植物病原菌、病原細菌に効果を発揮する可能性は十分にあると考えられる。

さらに植物病原菌のみならず、ビォチンがその生育に必須である動物特にヒトや家畜の病原菌にも同様の効果を発揮することは当然考えられるので、本発明の抗菌タンパク質、アビジンまたはストレプトアビジン、およびそれらとよく似たタンパク質をそのような場面に治療薬として使用する場合、これは本発明の範疇に属するものである。

ストレプトアビジンに関しては既にその D N A配列が開示されているが（G a r w i n e t a 1 . WO / 8 6 0 2 0 7 7 ) 、先述のごとく本発明の t a m 1および t am2のDNA配列は、通常のデータベース検索を行ってもストレプトァビジンの DN Aを抽出することはなく、核酸 ·アミノ酸配列解析ソフトを使用してストレプトアビジンとの DN Aの相同性を強制的に比較しても実際に 5 1 . 0〜5 3. 8%と高い値は示さなかった。

ストレプトアビジンやアビジンは、ピオチン、およびその誘導体と非常に強い結合能を有することから、分子生物学、生化学などの様々な場面において実験試薬として既に広く利用されている。例えば核酸やタンパク検出系への利用（L i a n g . WO/9 7 07 244) や、ストレプトアビジンやアビジンを融合タンパク質として発現しビォチンとの結合能を用いて精製する方法（S k e r r a e t a 1. E P 8 3 59 34, Ko p e t z k i . WO/ 97 1 1 1 8 6 ) などが挙げられる。本発明の t ama v i d i n l、 t ama v i d i n 2もこれらの現在広く知られている、または報告されている使用方法に用いることが出来る。

植物に関連するストレプトアビジンあるいはアビジンについてはこれまでにァビジンを利用した雄性不稔植物の作出（How a r d a n d A l b e r t s e n. WO/9640949) 、ストレプトアビジンあるいはアビジンの殺虫タンパクとしての応用（C z a p l a e t a 1. WO/94009 92) 、植物におけるアビジンの生産（B a s z c z y n s k i e t a 1. US P a t . No. 5 7 6 7 3 7 9) などが報告されている。なおこれらの文献に記載されているストレプトアビジンあるいはアビジンの利用法が本発明のタモギタケ由来の抗菌タンパク質にも適用されうる。

先行技術文献

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3. 特表平 8 - 505048

4. O i t a e t a 1. (1 9 96) B i o s c i . B i o e c h . B i o c h e m. 6 0 : p . 48 1—48 3 5. T e r r a s e t a 1 . ( 1 9 9 2) J . . B i o l . C h e m . 2 6 7 ： . 1 5 3 0 1 - 1 5 3 0 9

6. 特表平 9 - 5 0 1 4 2 4

7. B r o g l i e e t a 1 . ( 1 9 9 1 ) S c i e n c e 2 5 4 : p . 1 1 9 4 - 1 1 9 7

8. T e r r a s e t a 1 . ( 1 9 9 5) Th e P l a n t C e 1 1 7 : p . 5 7 3 - 5 8 8

9. N i s i z a w a e t a 1 . ( 1 9 9 9) T e o r A p 1 G e n e t 9 9 : 3 8 3 - 3 9 0

1 0. A l e x a n d e r e t a 1. ( 1 9 9 3) P r o c . N a t 1. A c a d. S c i . USA 9 0 : p . 7 3 2 7 - 7 3 3 1

1 1. Wu e t a 1 . ( 1 9 9 5) P l a n t C e l l 7 : p . 1 3 5 7 - 1 3 6 8

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'21. G a r w i n e t a 1. WO/ 8602077

22. L i a n g . WO/9 707 244

23. S k e r r a e t a l . E P 8 3 5 934

24. K o p e t z k i . WO/ 9 7 1 1 1 8 6

25. H o wa r d a n d A l b e r t s e n. WO/ 9 640949

26. C z a p 1 a e t a 1. WO/ 94009 92

27. B a s z c z y n s k i e t a 1. US P a t . No . 5 7 6 7 3 79 以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によつて限定されることはない。

実施例

実施例 1 アツセィ系の構築

1) 検定系の確立

病原菌の培養：イネいもち病菌（菌株 TUS— 1、レース 3 3 7 ;農林水産省東北農業試験場より分譲）はオートミル培地（D i f c o社製， 1%ショ糖添加 ) 上で培養して分生胞子を得て、接種源とした。胞子液は必要に応じて 1 0%グリセロールを加えて、一 8 0°Cで保存した。

イネ紋枯病菌（菌株 J T 8 7 2) は 1 2ジャガイモ煎汁培地（ 0培地： 0 i f c o社製）で 2日間培養し、 5mm程度の菌糸塊 3個をテフロンホモジナイザ一で 1 / 2 P D培地とともに軽く磨砕して得られた断片化菌糸を接種源とした上記の接種源を 9 6穴マイクロタイタープレート（コ一二ング社製）に 1ゥェル当たりいもち病菌分生胞子は約 1， 000個、紋枯病菌は断片化菌糸が約 30 0個になる様に 1 00 / 1の 1Z2 PD培地とともに加え、 28 °Cの恒温器で 4 8時間培養した。菌の増殖はマイクロプレートリーダー（B i o— R a d社製 B e n c hma r k) で 5 9 5 nmの吸光度を測定した。 2) タモギタケからのタンパク質抽出

市販のタモギタケ (P l e u r o t u s c o r n u c o p i a e ) 子実体 1 0 0 gをあらかじめハサミで細かく切断後、液体窒素を用いて凍結して乳鉢で細粉となるまで磨枠し、 3 0 0m lの1 0 0mM H E P E S _ K O H緩衝液 p H 7. 5を加えて緩やかに撹拌しながら 4°Cで 3 0分間抽出を行った。抽出液はミラクロスでろ過後、 1 0， 0 0 0xg、 2 0分間の遠心を行った。上清に硫安を 7 5 %飽和になるように加えて、ー晚 4 °Cで静置した。次に 1 5， 0 0 0xg、 2 0分間の遠心で沈殿させて、沈殿物を 3 m 1の 1 0 mM HE P E S _KOH 緩衝液、 p H 7. 5に溶解し、透析チューブ（S p e c t r aZP o r l MW C〇 6 - 8 0 0 0, S p e c t r um Me d i c a l I n d u s t r i e s社製）を用いて 2 0 mM HE P E S— KOH緩衝液、 p H 7. 5に対して透析を行った。不溶物を遠心によって除去しタモギタケタンパク質試料とした。タモギタケタンパク質試料のタンパク質濃度は牛血清アルブミン（B S A) を標準タンパク質として B r a d f o r d法で測定した。

実施例 2 抗菌タンパクの精製

1 ) タモギタケ粗タンパク試料の抗菌活性

上記のいもち病菌、紋枯病菌の培養系に培養開始直後にタモギタケタンパク質試料を一定量加えて、培養 2日後（4 6— 4 8時間後）の吸光度を測定して抗菌性の有無について判定した。その結果、タモギタケの抽出物の中にはいもち病菌、紋枯病菌両菌に対して高い抗菌活性をもつ物質が含まれていることが明らかとなった。阻害の様式は、いもち病菌の場合、発芽の完全抑制や菌糸の生長阻害が観察され、紋枯病菌の場合は菌糸の生長阻害が観察された。いもち病菌の細胞の場合、その細胞質が細胞壁から離れ原形質分離様の様相を呈していた。

検出された抗菌活性の性質をさらに詳しく解析するために、熱処理を行い残存活性を調査した。熱処理は 6 0、 8 0°Cを 1 0分間行い抗菌アツセィを行った。活性の強さはタンパク質試料を希釈することにより推定した。その結果 6 0。C処理ではいもち、紋枯病菌両方に対する抗菌活性は無処理と同等の活性が保持されていた。一方 8 0°C処理では紋枯病菌に対する抗菌活性は消失した。ところがいもち病菌に対する抗菌活性は、 8 0°C処理によって原形質分離を起こさせる活性は消失したものの、菌糸の先端を膨張させて生長を停止させる新規な活性が存在することが明らかとなった（図 1) 。

さらにタモギタケ粗タンパク試料熱処理画分に含まれるこれらの活性をつかさどる本体のおよその分子量を把握するため、限外濾過膜によりサンプルを分画し、抗菌活性を調査した。限外濾過膜はウルトラフリー MC 1 0, 000 NMW L フィルターユニット（カットオフ分子量 1 0000、ミリポア社製）を用い、膜を通過した画分と膜を通過しなかった画分に分けてアツセィを行った。その結果全ての活性は膜不通過画分のみに存在していた。従って活性本体の分子量は少なくとも 1 00 00以上であることが予想された。

2) イオン交換カラムによる精製

次に抗菌タンパクの精製を行った。粗タンパク試料 1 5 0mg/2 0m lをまず、イオン交換単体 Q S e p h a r o s e FF (P h a r ma c i a社製）を充填した自製カラム（内径 1. 5 cmX長さ 1 0 cm、単体容量 1 0m l ) にかけ、抗菌タンパクを部分精製した。流速は 2m 1 Z分とし、基本緩衝液は 50 mM T r i s pH8. 0， 50 mM N a C 1、溶出緩衝液は 50 mM T r i s p H 8. 0, 600 mM N a C 1を、グラジェント（N a C 1で 5 OmMから 600mM) は、 1 00分間かけた。各画分（ 1 2. 5m l ) の一部をいもち病菌に対する抗菌アツセィと、 SD S_P AGE電気泳動に供試した。各画分のタンパク質溶液に等量の 2 xS D S泳動用緩衝液（S amb r o o k e t a 1. ( 1 98 9) Mo l e c u l a r C l o n i n g 2 n d e d i t i o n C o l d S p r i n g H a r b o r) をカロえ、 9 5 °Cで 5分間処理した後、 L a e mm 1 i (L a e mm l i (1 9 70) N a t u r e 2 27 : p . 6 80 - 6 8 5. ) の方法に従い、 S D S— PAG E電気泳動を行つた。ゲルは 1 5%の PAGE L (AT TO社製）を用い、銀染色 I Iキットヮコ一（和光純薬社製）によりタンパク質を検出した。タンパクのおよその分子量と量を見積もるため、分子量マーカー（LMW マーカーキット： Ph a r ma c i a LKB社製、分子量の大きい順に 94 kD a、 6 7 kD a、 43 kD a、 30 kD a、 20. l kD a、 14. 4 k D a ) を泳動した。.タンパク質の銀染色による電気泳動像と抗菌性の強さとの関係を図 2に示した。抗菌活性として N a C 1濃度が 1 6 OmMのピークと、 240 mM〜 280m Mのピークの二つが現れた。 1 60 mMのピークに含まれるタンパク質は、菌糸の先端を膨張させて生長を停止させ、 70°C、 1 0分の処理でもその活性は失活しなかった。一方 240mM〜280 mMのピークに含まれるタンパク質はいもち菌細胞に原形質分離を生じさせ、同熱処理により失活した。そこで前者の 1 6 OmMのピークに含まれる抗菌タンパク質の精製を試みた。

N a C 1濃度が 1 20mM〜240 mMに相当する画分を透析チューブ（S p e c t r a/P o r l MW CO 6 - 8 000, S p e c t r um Me d i c a 1 I n d u s t r i e s社製）に移し、 50 mM T r i s— H C 1 p H8. 0、 5 OmM N a C 1に対して 4 °Cでー晚透析を行った。 C e n t r i p r e p - 1 0 (分画分子量 1 0， 000、 Am i c o n社製）を用いて濃縮した後、 70°Cで 3 0分間熱処理を行った。遠心後上清を 0. 22μπιでフィルタ一濾過した。このタンパクサンプル（約 1 0m 1 ) を Mo n o Q HR 5/5 (P h a r ma c i a社製）による抗菌タンパクの分離精製に供試した。流速は 1 m l /m i nとし、基本緩衝液は 5 OmM T r i s -HC 1 , p H 8. 0， 50 mM N a C 1、溶出緩衝液は 50 mM T r i s -HC 1 , H 8. 0， 50 OmM N a C lを用い、グラジェント（N a C 1で 50 mMから 500 m M) は、試料を打った 20分後から 40分間かけた。各画分（1 m l ) の一部をいもち病菌に対する抗菌アツセィと、 SD S— PAGE電気泳動に供試した。まず、 HP L Cのチャートと抗菌性の強さとの関係を図 3に示した。その結果、イオン強度（N a C 1濃度）が 200 πιΜ〜 26 0 mM付近に抗菌タンパクの溶出ピークが現れた。

電気泳動像と抗菌性の強さの関係を図 4に示した。各レーンの上に表示した数字は図 3の画分の番号に準じて表示した。抗菌性と関連すると考えられるタンパクのパンドを精査すると、約 1 5 k Dの 2つのバンドが有力候補として挙げられた（図 4矢印）。このバンドの濃度と抗菌活性の度合いは正の相関関係にあるので、このパンドが抗菌タンパク質本体である可能性が示唆された。

3) ゲルろ過カラムによる精製と分子量の推定タモギタケ抗菌タンパクの精製、そして n a t i v eな状態での分子量を推定するため、上記の M o n o Q画分の # 4 1一 46をウルトラフリ一 MC 1 0， 000 NMWL フィルターユニット（ミリポア社製）で濃縮し、ゲル濾過力ラム S u p e r o s e 6 HR 1 0/30 (P h a r ma c i a社製）に供試した。流速は 0. 5 m 1 /分とし、緩衝液は 5 OmM ME S -N a OH p H 6. 0、 50 mM N a C lを用いた。まず G e l f i l t r a t i o n s t a n d a r d (B I〇一 RAD社製）によりタンパクの分子量とおよその溶'出時間を把握した後、抗菌活性のある Mo n o Q画分を打ち込んだ。

その結果、 A2 8 0でタンパクをモニターすると 30 kD aを頂点とする鋭いピークが現れた（図 5) 。抗菌活性は 30 k D aのピークと近接したその前後に集中した。このことから、タモギタケの有する抗菌性は、ゲル濾過でおよそ 30 kDの分子量を有する単一のタンパク質に由来することが分かった。また、各フラタシヨン（0. 2 5m l ) を S D S _ PAGE後銀染色すると、 3 0 kD a付近にのみ、図 4で見られた 1 5 kD aのバンドが検出された（図 6) 。 1 5 kD a以外のバンドは見られなかったことから、抗菌性に寄与しているのは 1 5 k D aのタンパク質であることが再度強く示唆された。分子量マーカー（20. I k D aのトリプシンインヒビター) から、デンシトメ一ターにより抗菌タンパクの量を推定し、イネいもち病菌に対する 5 0%生長阻害濃度を算出すると、およそ 50 n g /m 1 となった。生重量 1 00 gのタモギタケ子実体から上記の方法で精製され得る当該抗菌タンパク質の量はおよそ 0. 2mgであった。 ' 実施例 3 c DNAの単離

1) タモギタケ抗菌タンパクのアミノ酸配列の解読

上記の S u p e r o s e 6画分をウルトラフリー MC 1 0, 000 NMW L (ミリポア社製）で濃縮し、 SDS— PAGE電気泳動した。トリスを除去し、グリシンを含まない緩衝液系で PVDF膜（ミリポア社製）へ転写し、クマシ一ブリリアントブルー R_ 25 0で軽く染色した後、脱色した。その後、抗菌性に関与すると考えられた 1 5 k D aのタンパクパンドを切り出した。また 1 5 k D aのタンパク質をリシルエンドぺプチダーゼ（和光純薬工業社製）若しくは V 8プロテアーゼ（和光純薬工業社製）で部分消化した。その結果、リシルエンドべプチダーゼ消化からは 14 k D aが、若しくは V 8 プロテアーゼ消化がらは 1 4 kD aと 1 2 kD aが得られた。これらのパンドを同様に泳動後膜に転写した。次いで、気相プロテインシークェンサ一（HPG 1 005 A P r o t e i n S e q u e n c i n g s y s t em) を用レヽて、 N末端アミノ酸配列をェドマン分解法により決定した。

その結果、 1 5 kD aタンパクからは次のような 44アミノ酸：

N末端一 Leu Xaa Gly Xaa Trp Tyr Asn Glu Leu Gly Xaa Xaa Met Asn Leu Thr Ala Asn Lys Asp Gly Ser Leu Xaa Gly Thr Tyr His Ser Asn Val Gly Glu Val Pro Xaa Xaa Tyr His Leu Ala Gly Arg Tyr— C末端（配列番号 5) が決定された（上記アミノ酸配列において、 X a aは未定、以下同様）。また、 1 4 k D aタンパクのリシルェンドぺプチダーゼ消化物からは次のような 5 0ァミノ酸：

N末端— Asp Gly Ser Leu Thr Gly Thr Tyr His Ser Asn Val Gly Glu Val Pro Pro Thr Tyr His Leu Ser Gly Arg Tyr Asn Leu Gin Pro Pro Ser Gly Gin Gly Val Thr Leu Gly Xaa Ala Val Ser Phe Glu Asn Thr Xaa Ala Asn Val- C . 末端（配列番号 6 )

また、 1 4 k D aタンパクの V 8プロテアーゼ消化物からは次のような 2 1アミノ酸：

N末) ii¾_Leu Thr Gly Thr Trp Tyr Asn lu Leu Gly Ser Thr Met Asn Leu Thr Ala Asn Lys Asp Gly— C末端（配列番号 7 ) ' また、 1 2 k D aタンパクからは次のような 2 3アミノ酸

N末端一 Leu Thr Gly Thr Xaa Tyr Asn Glu Leu Gly Ser Thr Xaa Asn Leu Thr Ala Asn Xaa Asp Gly Xaa Leu— C末端（配列番号 8)

が決定された。

最終的に次のような 6 9アミノ酸が決定された。

N末端— Leu Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Glu Leu Gly Ser Thr Met Asn Leu Thr Ala Asn Lys Asp Gly Ser Leu Thr Gly Thr Tyr His Ser Asn Val Gly Glu Val Pro Pro Thr Tyr His Leu Ser Gly Arg Tyr Asn Leu Gin Pro Pro Ser Gly Gin Gly Val Thr Leu Gly Xaa Ala Val Ser Phe Glu Asn Thr Xaa Ala Asn Val 一 C末端（配列番号 9)

2) 縮重プライマーの設計

1) 'で決定されたアミノ酸配列を基に、考えられる全ての塩基がミッタスされた 4つのプライマーを合成した。括弧内の数字は縮重度を示す。

TMR 1 ： 5 -acnggnacntggtayaayg-3 ' (256)

(配列番号 9の 2番目のアミノ酸残基 Th rないし 8番目の G 1 uに対応） (配列番号 1 0)

TMR 2 ： 5 -garytiggiwsnacnatgaa-3' (2 5 6)

(配列番号 9の 8番目のアミノ酸残基 G 1 uないし 14番目の A s nに対応）

(配列番号 1 1 )

TMF 1 ： 5' -gtrttytcraaiswiacn-3' (1 28)

(配列番号 9の 5 9番目のアミノ酸残基 A 1 aないし 6 5番目の Th rに対応 ) (配列番号 1 2 )

TMF 2 ： 5 -cciarigtnacnccytgncc-3' (2 56)

(配列番号 9の 5 1番目のアミノ酸残基 G 1 yないし 5 7番目の G 1 yに対応 ) (配列番号 1 3) 但し、上記において「 i」は「イノシン」を、「r」は「_§又は」を、「y 」は「。又は 1:」を、「w」は「&又は」を、「s」は「又は。」を、そして「n」は「a又は g又は c又.は t」をそれぞれ表す。

3) タモギタケ子実体 c DNAライプラリーの構築

タモギタケ子実体から S D Sフエノール法で全核酸を抽出し、塩化リチウム沈殿により全 RN Aを回収した。ここから mRNA p u r i f i c a t i o n k i t (P a r ma c i a社製）によりタモギタケ m R N Aを調製した。子実体約 5 gから 1 0 μ gの mRNAが得られた。このうち 5 /i gを ZAP c DN A s y n t h e s i s k i t (S t r a t a g e n e社製）に供試し、 c DNAを合成した。。ゲル濾過カラムによりおよそ 0. 5〜5 k bの c DNAを分画し、 Un i— ZAP XR ベクター（S t r a t a g e n e社製）にライゲーシヨンし、 G i g a p a c k l l l (S t r a t a g e n e社製）によりノヽ⁰ ッケージングを行った。全ての手順はキット添付の説明書に従った。構築したタモギタケ子実体 c DNAライブラリーのタイターは、およそ 3 00万 p f uと算出された。

4) RT— P C Rによるプローブの取得

2) で合成したプライマーを用いて 3) で合成した c DNAを錶型に P C Rを行い、ライブラリーをスクリーユングするためのプローブとなるタモギタケ抗菌タンパクの部分長 c DN Aの増幅を試みた。反応条件は以下のように行った。 5 0 1の反応液中に、 c DNA 1 0 n g， 1 OxE x t a q b u f f e r 5 μ 1 , 2. 5 mM 各 dNTP s 4 μ 1 , プライマー 5ピコモルノ各配列 , Ε t a q (T a k a r a社製） +T a q START 抗体（ C 1 o n t e c h社製） 1 μ 1をそれぞれ含み、プログラムテンプコントロールシステム P C— 700 (ASTEK社）を用いて、 94°C 3分を 1回、 94 °C 1分、 5 0°C 1分、 7 2°C 1分を3 5 回、 7 2 °C 6分を 1回行った。その結果、 TMR 1 -TMRF 1 TMR 1— TMRF 2、 TMR2— TMRF 1、 TM R 2 -TMR F 2の全てのプライマー組み合わせにおいて、各々およそ 1 5 0〜 1 90 b pの産物が増幅された。

これらの P CR産物をゲル精製し、ベクター p CR I I ( I n v i t r o g e n社製）にクローニングした。これらのクローンの塩基配列を決定した結果、 1 ) で決定されたアミノ酸配列と全く同じアミノ酸配列をコードする c DNA (T MR2— TMRF 1、 TMR 2— TMR F 2の組み合わせ由来。特に TMR 2— TMRF 2の組み合わせ由来の c DNAを TM1 00と命名）と、 1) で決定されたアミノ酸配列と約 75%の相同性を有するアミノ酸配列をコードする c DN A (TMR 1—TMRF 1、 TM R 1— TM R F 2の組み合わせ由来。特に TM R 1 -TMRF 1の組み合わせ由来の c DNAをTM7 5と命名）の二種類が含まれていた。

5) 完全長 c DNAのスクリーニング 4) で得られた c DNAクローン TM 1 00、 TM 75をベクターから切り出し、これをプローブに用いてタモギタケ子実体 c DNAライブラリーをスクリーニングした。 1 4 X 1 0 c mの角形シャーレに ZAP c DNA s y n t h e s i s k i t (S t r a t a g e n e社製）の説明書きに従って、約 20， 0 00 p f uのファージを宿主菌 XL 1— b 1 u e MRF ' とともにプレーティングした。プラークを Hy b o n d— N +ナイロンメンブレンフィルター (Am e r s h am社製）に接触させ、メンプレン添付の説明書きに従ってアルカリ処理を行い DNAを変性させ、メンプレン上に固定させた。プローブは r e d i p r i m,e I I™ DNA l a b e l l i n g s y s t em Ame r s h am社製）を用いて³² Pラベルした。ハイプリダイゼーシヨンは 0. 5M

N aHP0₄ (p H 7. 2) 、 7%SDS、 1 mM E D T A中で 6 5。Cで一晚、洗浄の条件は 40 mM N a H P 0₄ (p H 7. 2) 、 1 %SDS、 1 mM £0下八中で6 5°〇、 20分を 2回行った。 1次スクリーニングで約 1 60， 000 p f uのファージから TM1 00プローブで 600個、 TM7 5プロープで 30個のポジティブクローンが得られた。うち TM 1 00プローブで 24個、 TM7 5プローブで 1 2個のクローンに関して、 2次スクリーニング、プラークの精製を兼ねた 3次スクリーニングを行い、選抜されたクローン全てについて Z A P c DNA s y n t h e s i s k i t (S t r a t a g e n e社製）の説明書きに従って、 i n v i v o e x c i s i o nを行った。その結果、 T M 1 00プローブで 1 8個、 TM 75プローブで 1 2個のクローンが、ファージミドベクター _p B l u e s c r i p t' S Kに組み込まれた c D N Aとして回収された。これらのクローンに関して制限酵素分析によりインサート長を同定した

6) 塩基配列の決定

上記の各 c DNAクローンについて、最長のクローンの全塩基配列を両鎖とも決定した。まず、 M 1 3プライマー（ t a k a r a ) を用いて、 AB I P R I SM蛍光シークェンサ一（Mo d e l 3 1 0 G e n e t i c A n a 1 y z e r , P e r k i n E l me r社製）でクローンの 5，、 3 ' 両部分の塩基配列を決定した。次に、 TM1 00由来の最長クローンの 5，部分の塩基配列情報を基に、ブラィマー

TMl O O i n RV : g T C AAg g C g TT A CTC T g g

(配列番号 1 4)

を、同 3，部分の塩基配列情報を基にプライマー

TMl O O i n FW : CT g g g T g A g g AT C AC CTC

(配列番号 1 5 )

を、さらに TM7 5由来の最長クローンの 5 ' 部分の塩基配列情報を基に、プラィマー

TM75 i n R V： g AT g T C TAG g T g CCC TAC

(配列番号 1 6 )

を、同 3 ' 部分の塩基配列情報を基にプライマー

TM 7 5 i n FW： AC g ACT C A g A g A A g A ACT g

(配列番号 1 7 )

をそれぞれ合成し、配列決定に利用した。以上のようにして TM 1 00及ぴ TM 7 5由来の最長クローンについて DNAの両鎖の配列を解読し、全塩基配列を決定した。

その結果、タモギタケ抗菌タンパクをコードする c DNA (TM1 00プロ一ブ由来）は全長 6 7 1塩基からなり（配列番号 1) 、 1 43個のアミノ酸をコードしていた（配列番号 2) 。精製タンパク質から決定された N末端のアミノ酸は、配列番号 2のアミノ酸配列の 8— 76のアミノ酸残基に相当した。配列番号 2 のァミノ酸配列と精製タンパク質から直接決定された 6 7個のアミノ酸の相同性は、決定されなかった 2個のアミノ酸（配列番号 2のアミノ酸配列では第 6 5番目の W、およぴ第 7 3番目の Sに相当）以外の全てのアミノ酸が同一であった。このことから、クローニングした c DNAはタモギタケ抗菌タンパクをコードする遺伝子に由来すると結論された。

c DN A配列から決定されるタンパク質の N末と、実際の精製タンパク質の N末端は一致せず、翻訳開始メチォニンの 7アミノ酸後ろの L (ロイシン）カ、精製タンパク質の N末端であった。このことから、タモギタケ抗菌タンパク質は、まず前駆体型として翻訳された後、 N末のリーダー配列（7アミノ酸）が切り離されると推定された。推定成熟タンパクのアミノ酸配列（配列番号 2のうち 8 一 143の 1 36個のアミノ酸配列）から遺伝子配列解析ソフト GENET YX 一 WI N V e r 3. 2 (.S o f t wa r e D e v e l o pme n t C o. ， L t d. ) を用いて平均分子量を求めると 1 51 58. 4となり、等電点は 6 . 22と算出された。この分子量は精製タンパク質の SD S— PAGEによる見積もり（1 5 kD a) と良く一致した。また推定糖鎖付加部位が二力所（配列番号 2のアミノ酸残基 21、同 71の N) 存在していた。

一方、タモギタケ抗菌タンパクのホモローグをコードする c DNA (TM 75 由来）は全長 840塩基からなり（配列番号 3) 、 141個のアミノ酸をコードしていた（配列番号 4) 。この cDNAの 5' 側には 3個の ATGが存在するが、一つ目と二つ目の ATGから翻訳を開始するとそれらのすぐ後ろに終止コドンが現われ、それぞれ 12個、 3 1個のアミノ酸しかコードできない。 141個のアミノ酸をコードできるのは三番目の AT Gから翻訳が開始されたときのみである。またこの ATGの 1 02 b p上流には同じ読み枠で終止コドン TGAが位置していた。従って三番目の AT Gが翻訳開始コドンであることはほぼ確実である推定成熟ァミノ酸配列（配列番号 4のアミノ酸配列のうち 8 _ 141の残基からなる 1 34個のアミノ酸配列）から推定される分子量は 14732. 2、等電点は 8. 62と算出された。また推定糖鎖付加部位が一力所（配列番号 4のアミノ酸番号 1 1 5の N) 存在していた。 GENETYX— WI Nを用いて本発明のタモギタケ抗菌タンパク質とそのホモローグの相同性を解析したところ、ァミノ酸で 65. 5%、 DNAで64. 5 % (01 部分は72. 2 %) であった。本発明のタモギタケ由来抗菌タンパク質およびその遺伝子、さらにそのホモ口ーグとそれにコードされるアミノ酸配列をもつタンパク質について、 G e n e B a n kデータベースの B L AS Tによる相同性検索を行った。本発明のタモギタケ由来抗菌タンパク質のアミノ酸配列（配列番号 2の全アミノ酸配列）のデータベース検索の結果、 s t r e p tmy c e s v i o l a c e u sのス卜レプトアビジン v 2 (寄託番号： Q 53533， B a y e r e t a 1. (1 9 9 5 ) B i o c h i m B i o p h y s A c t a 1 26 3 : p . 60— 6 6. ) 、 v 1 (寄託番号： Q 53 5 3 2) 、 s t r e p tmy c e s a v i d i n i iのストレプトアビジン（寄託番号： P 2 26 29, A r g a r a n a e t a 1. ( 1 98 6) Nu c l e i c Ac i d s R e s 1 4 ： p. 1 8 7 1 _ 1 88 2) 等が相同性を有するものとしてヒットした。相同性は 3つともに 1 28ァミノ酸に渡り、それぞれ 50%、 49%、 49 %であつた。これちより低い相同性で卵白アビジン（G o p e e t a 1. (1 9 8 7 ) Nu c l e i c Ac i d s R e s 1 5 : p. 359 5 - 3 606. ) やいくつかのアビジン関連タンパク質（K e i n a n e n e t a 1. ( 1 9 94) E u r J B i o c h e m 2 20 : p. 6 1 5— 6 2 1. ) もヒットした。なお、ストレプトアビジンと 1アミノ酸のみ異なり、 N末端側、 C 末端側がそれぞれ 3 6アミノ酸分、 20アミノ酸分ストレブトアビジンよりも短くなつているコアストレプトアビジンミュータント w 7 9 f Ch a i nB (F r e i t a g e t a 1. ( 1 9 9 7) P r o t e i n S c i . 6 : . 1 1 5 7 - 1 1 6 6) もヒットした。相同性は 5 1. 7 %であつた。

以上のことから、本タンパク質は新規なタンパク質であると考えられた。本発明の第 2のタモギタケ由来抗菌タンパク質のアミノ酸配列（配列番号 4の全アミノ酸配列）のデータベース検索の結果では、ストレプトアビジン v 2、 v l、ストレプトアビジンとそれぞれ 50%、 48%、 48%の相同性を示した。

—方、第 1のタモギタケ由来抗菌タンパク質をコードする遺伝子の DNA配列 (配列番号 1の 7 1— 502) およぴ第 2のタモギタケ由来抗菌タンパク質をコードする遺伝子の DN A配列（配列番号 3の 2 26— 6 5 1 ) を用いた同データベース検索では、非常に短い範囲（23 b p) で相同性の見られる配列がいくつか検出されたに過ぎず、ストレプトアビジンの DN A配列等は検出されてこなかつた。これは、本発明の新規タンパク質をコードする DNA配列は DNAレベルではストレプトアビジンの DNA配列等と相同性があまり高くないことを意味する。

本抗菌タンパク質は食用キノコタモギタケから精製された新規なストレブトァビジン様タンパク質であるので' t ama v i d i n' と命名した。精製したタンパク質由来の遺伝子を t a m 1、それがコードするアミノ酸配列を有するタンノヽ⁰ク質を t a ma v i d i n l、 t am lのホモローグを t a m2、それがコードするアミノ酸配列を有するタンパク質を t a ma V i d i n 2と呼ぶこととする。遺伝子配列解析ソフト GENETYX—WI N v e r 3. 2を用いて本発明のタモギタケ抗菌タンパク質とストレプトアビジン（ストレプトアビジンはストレブトアビジン _V 2、 V 1 とそれぞれ 9アミノ酸、 1アミノ酸異なるだけである）のアミノ酸配列全体の相同性を解析したところ、 t amiのコードする t a ma v i d i n lのァミノ酸配列で 46. 7 %、 t a m 2のコードする t a m a v i d i η 2のアミノ酸配列で 48. 1 %の相同性（アミノ酸同一性）を示した。一方、 DNA配列（配列番号 1および 3) 全体ではストレプトアビジンとの相同性は t a mlで 5 3. 8 % (ORF部分では 5 6. 8 %) 、 t a m 2では 5 1. 0% (ORF部分では 5 7. 3%) であった。また t a m 1にコードされるタモギタケ抗菌タンパク質と卵白アビジンとの相同性はアミノ酸配列で 3 1. 2 %、 DNA配列で 42. 4%であり、 t a m2にコードされるタモギタケ抗菌タンパク質と卵白ァビジンとの相同性はァミノ酸配列で 36. 2 %、 D N A配列で 4 1. 8 %であった。

T ama v i d i n l、 t a ma v i d i n 2 ストレプトァビジン、ストレプトアビジン V I、ストレプトアビジン V2、およぴァビジンの成熟タンパク領域のアミノ酸配列の分子系統樹を、 GENETYX—W I Nを用いて U P G M A法により作成した。その結果、図 7に示した通り t ama v i d i n lおよぴ t ama v i d i n 2は、ストレプトアビジンのグループおよぴァビジンとは異なる第 3のグループを形成していることが明らかとなった。

ストレプトアビジンと比較した場合、本発明の t a ma v i d i n l、 t arn a v i d i n 2は N末端側が 3 3アミノ酸短くなっているが、ピオチンとの結合に関与していると考えられているトリプトフ.アン（W) 残基（G i t 1 i n e t a 1. ( 1 9 88) B i o c h em J 256 : p. 27 9 - 2 82 ) 、チロシン（Y) 残基（G i t l i n e t a 1. ( 1 9 90) B i o c e m J 26 9 : p . 5 2 7— 5 30 ) は全て保存されている（配列番号 2のアミノ酸配列のうち第 34、第 45番目の Y、第 82、第 9 8、第 1 1 0番目の W、配列表の配列番号 4のアミノ酸配列のうち、第 34、第 45番目の Y、第 80、第 9 6、第 1 08番目の W) 。

また成熟タンパク質領域と考えられる部分（配列番号 2のァミノ酸配列のうち 8 - 1 43の配列、配列番号 4のァミノ酸配列のうち 8— 1 4 1の配列）の平均分子量はそれぞれ 1 5 1 58. 4、 1 47 32. 2と算出され、成熟ストレプトァビジンや成熟ァビジンの平均分子量（それぞれ 1 6490. 6、 1 4342. 9) と似ていた。これらのことは、 t a m 1にコードされている t a m a V i d i n 1は勿論、 t a m 2にコードされている t a m a v i d i n 2 ίこつレヽてもビォチン結合能を有するタンパク質であることを強く示唆するものである。

実施例 4 ビォチン添加による抗菌活性消失実験

本発明の抗菌タンパク質は新規なストレプトアビジン様タンパク質であることから、ビタミンの一種である D—ビォチン（ビタミン Η、片山化学工業社製）と結合することが示唆される。一方いもち病菌はその生育にビォチンが必要であることが知られている。これらのことから、本抗菌タンパク質はアツセィ培地に存在する遊離ビォチンと結合し、これが培地中のビォチン欠乏を引き起こし、結果としていもち病菌の生育が抑えれると予測される。

ビォチン添加による抗菌活性の消失実験の結果を図 8に示す。具体的には、マイクロタイタ一プレートに 1Z2 PD培地に懸濁したいもち病菌の胞子を入れ、そこへ精製 t a ma v i d i n lを 5 0 n g /m 1または 1 O O O n g /m 1 の濃度で添加したゥエル、さらに 1 000 n g/m 1の t a m a V i d i n 1に加え 1 00 n g/m 1の濃度のビォチンを加えたゥヱル、またタンパク質無添加の対照ゥエルを設け、 2 8 °Cで 48時間培養した。

その結果、図 8に示されるように t a ma v i d i n l添加ゥヱルでは、 50 n g/m 1の濃度でもいもち病菌の菌糸の伸長はかなり抑えられた。これに対し、 t a ma v i d i n l ( 1 000 n g /m 1 ) とピオチンの両方を添加したゥエル、およぴ対照ゥエルでは菌糸は正常に伸長した。このように実際にアツセィ培地中にピオチンを過剰に添加すると本抗菌タンパク質の抗菌活性は消去された。これは過剰に加えたビォチンのある一定量が、アツセィに使用した t ama V i d i n 1の殆どと結合しその抗菌性を不活化したためであると推論された。さらに市販の卵白アビジン（S i g m a社製）、および s t r e p t my c e s アビジン i iのストレプトアビジン（S i gm a社製）を用い、 1 00 O n gZm 1の濃度で同様の試験を行った。その結果、両タンパクともに、いもち病菌に対して抗菌活性があり、その活性はピオチンで打ち消されることが明らかとなった（図 8) 。

実施例 5 組換え T ama V i d i n 2タンパク質のピオチン結合活性

1) 発現べクタ一の構築

t am2遺伝子は本発明の t ami遺伝子のホモログとして単離された遺伝子であるが、この t am 2遺伝子によってコードされる t ama V i d i n 2が、実際にピオチン結合活性を示すか否かを調べた。具体的には t am2遺伝子を大腸菌に組み込み、組換え t ama V i d i n 2を発現させ、このタンパク質がィミノピオチンカラムで精製されるか否かを調べた。

先ず、実施例 3で得られた t am2遺伝子の全 ORF (配列表の配列番号 3のうち、第 2 2 6番目から第 6 5 1番目の塩基）を P CRにより増幅させるため、一組のプライマー

TM7 5 B s p 5 ： 5 ' - ACCAACATaTCA g AC g T T C AA - 3

(配列番号 1 8 )

TM 7 5 H i n 3 ： 5 ' -ATgAAAgCTTTTACTTCAACCTCag— 3 '

(配列番号 1 9 )

を合成した。 TM7 5 B s p 5には制限酵素 B s p LU 1 1 1の認識部位（下線で示した）が、 TM 7 5 H i n 3には制限酵素 H i n d I I Iの認識部位（下線で示した）がそれぞれ組み込まれている。これらのプライマーを使って t am 2遺伝子が組み込まれたプラスミド（p B l u e s c r i p t、実施例 3 (6) ) を铸型に P CRを行なった。 5 0 1の反応液中に、铸型プラスミド D N A 5 0 0 n g, l OxP y r o b e s t b u f f e r 5 ^ 1 , 2. 5 m M 各 dNTP s 4 β I , 各プライマ一 1 0 pmo l e s， Py r o b e s t DNA p o l yme r a s e (T a k a r a社製） 0. 5 1、をそれぞれ含み、プログラムテンプコントロールシステム P C— 7 0 0 (ASTEK社製）を用いて、 94°C、 3分を 1回、 94°C、 1分、 50で、 1分、 72°C、 1 分を 1 5回、 Ί 2。C、 6分を 1回行った。

得られた P CR産物を制限酵素 B s p LU 1 1 1 (Ro c h e社製）、 H i n d I I I (T a k a r a社製）で二重消化し、ゲル精製した。大腸菌発現用べクタ一は pT r c 99A (Ph a rma c i a LKB社製）を用いた。このべクタ一を制限酵素 N c o l (T a k a r a社製）、 H i n d I I Iで二重消化しゲル精製したものを、上述の制限酵素処理を施した P CR産物とライゲーシヨンし、大腸菌 TB 1に組み込んだ。組み込んだ t am2遺伝子の塩基配列を確認した。

2) 組換えタンパク質の発現とピオチンカラムによる精製 '

t am 2が組み込まれた発現べクタ一 p T r c 99 Aをもつ大腸菌 TB 1の単一コロニーを、抗生物質アンピシリンを含む LB培地に接種し、 OD₆。。=0. 5程度になるまで菌を前培養した。次いで、 I PTGを最終濃度で ImM加え、タンパク質発現を誘導し、 37°Cでさらに 4. 5時間振盪培養した。培養スケ一ルは 5 OmLとし、 I PTG ( I s o p r o p y l— β— D (―) — t h i o g a l a c t o py r a n o s i d e, 和光純薬社製）を加えないものを対照とした。菌体を遠心分離によって集め、タンパク質精製まで一 80°Cで保存した。

T ama V i d i n 2の精製は、 Ho f ma n nらの方法（P r o c . Na t 1. Ac a d. S c i . USA 77 : 4666 -466 8 (1 980) ) を参考に、イミノビォチンによる精製を行なった。菌体を 1. 5mLの緩衝液 A (5 OmM CAP S (3— [Cy c l o h e xy l am i n o] _ 1— p r o p an e s u l f o n i c a c i d、 S I GM A社製）、 p H 1 1， 50 mM N a C 1 ) 中に懸濁し、ソニケーシヨンにより菌体を破壊した。遠心後上清を総可溶性タンパク質とした。 2 _ Im i n o b i o t i n— Ag a r o s e (S I GMA社製） 0. 5mLを直径 0. 5 c m、長さ 5 c mのカラムに充填し、緩衝液 Aで平衡化した。このイミノビォチンァガロースカラムに、総可溶性タンパク質を通過させた。カラムを 5mLの 5 OmM CAP S ρΗ 1 1 , 500m Μ NaC lで洗浄後、 1. 5mLの50mM NH₄OAC pH4. 0により t ama v i d i n 2を溶出した。総可溶性タンパク質、カラム通過画分、洗浄画分、溶出画分を 1 5 % PAGEL (ATTO社製）を用いて SDS— PA GE電気泳動した。

泳動後、夕ンパク質を C o oma s s i e B r i l l i a n t B l u e R- 250 (和光純薬社製）で染色した。結果を図 9に示す。図 9に示すように、 ImMの I PTGによってタンパク質発現誘導をかけた大腸菌の総可溶性夕ンパク質画分（T) に、発現誘導をかけなかった場合（C) には存在しない 1 5 kD a付近のバンドが見られた。この分子量は t am 2遺伝子のコードする 14 1個のアミノ酸から推定される分子量 1 5467と良く一致した。

さらにこの 1 5 kD aタンパク質は、イミノビォチンカラム通過画分（F) 、同洗浄画分（W) には現れず、 50mM NH₄OAC pH4. 0による溶出画分（E) に現れた。溶出画分ではこの 1 5 kD aタンパク質が主要要素となつていた。この結果から、 t am2にコードされる t ama V i d i n 2は、ピオチンに結合することが明らかとなった。しかも上記に示す方法で簡便に精製され得ることが明らかとなった。 5 OmLの培養で得られる大腸菌発現組換え t am a v i d i n 2の収量はおよそ 1 mgであった。

効果

本発明の配列番号 2または 4のアミノ酸配列からなるポリべプチド、あるいはその一部の配列からなりかつビォチンまたはその誘導体と結合する能力を有するポリべプチドを含むことを特徴とするタンパク質成分を有効成分として含む製剤を作出すれば、抗菌剤としての利用が期待できる。

また、本発明の配列番号 1の 7 1 _ 502または 92— 502の配列を有する DNA、あるいは配列番号 3の 226— 651または 247— 651の配列を有する DNAを、植物細胞の中で機能しうる適当な構成的プロモーター、器官，時期特異的プロモーター、あるいはストレスや病害虫に反応する誘導性のプロモーター配列と、植物細胞で機能しうるターミネタ一配列の発現カセットに組み込み、植物細胞に導入、再生個体を得ることにより、病害抵抗性植物を作出できる。この場合本発明抗菌タンパク質をコードする DNA配列に細胞内小器官への輸送シグナルあるいは細胞外分泌へのシグナル配列をコードする D N A配列を接続することも可能である。本発明のタンパク質をコードする D N Aを、大腸菌、酵母、植物あるいは昆虫や例えばアフリカッメガエルなどの動物細胞で外来タンパク質を発現させることの出来るベクターに組み込み、当該細胞内で、本発明タンパク質を生産、大量精製することが可能となる。この場合本発明抗菌タンパク質をコードする D N A配列に細胞内小器官への輸送シグナルあるいは細胞外分泌へのシグナル配列をコードする D N A配列を接続することも可能である。

本発明タンパク質とピオチンとの強い相互作用は、現在ストレブトアビジンやァビジンにおいて広く利用されているような様々な分析技術に応用することが可能となる。

Claims

請求の範囲

1 . タモギタケの水性抽出液から硫安沈殿法で沈殿する画分から得ることができ、少なくともイネいもち病菌に対する抗菌活性を有し、 S D S— P A G E法で分子量が約 1 5 k D aの成分の存在を示す、抗菌タンパク質。

2 . N末端が、配列表の配列番号 9記載の N末端アミノ酸配列：

Leu Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Glu Leu Gly Ser Thr Met Asn Leu Thr Ala Asn Lys Asp Gly Ser Leu Thr Gly Thr Tyr His Ser Asn Val Gly Glu Val Pro Pro Thr Tyr His Leu Ser Gly Arg Tyr Asn Leu Gin Pro Pro Ser Gly Lrin Gly Val Thr Leu Gly Xaa Ala Val Ser Phe Glu Asn Thr Xaa Ala Asn Val

(ここにおいて X a aは不明である）

を有する、請求項 1に記載の抗菌タンパク質。

3 . 配列番号 2又は 4に記載のアミノ酸配列、あるいはこの配列中に 1から複数個のアミノ酸変異を有するアミノ酸配列若しくはこの配列と 5 2 %以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、イネいもち病菌に対する抗菌活性を示す抗菌

4 . 配列番号 2又は 4に記載のアミノ酸配列と 6 0 %以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する請求項 3に記載の抗菌タンパク質。

5 . 配列番号 2又は 4に記載のアミノ酸配列と 7 0 %以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する請求項 3に記載の抗菌タンパク質。

6 . 配列番号 2又は 4に記載のアミノ酸配列と 8 0 %以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する請求項 3に記載の抗菌タンパク質。

7 . 配列番号 2または 4に記載のアミノ酸配列と 9 0 %以上の相同性を有するァミノ酸配列を有する請求項 3に記載の抗菌タンパク質。

8 . 配列番号 2又は 4に記載のアミノ酸配列と 9 5 %以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する請求項 3に記載の抗菌タンパク質。

9 . 配列番号 2の部分ァミノ酸配列 8— 1 4 3又は配列番号 4の部分ァミノ酸配列 8 — 1 4 1からなるポリペプチド、並びに上記アミノ酸配列の何れかの中に 1〜複数個のアミノ酸変異を有するポリぺプチドおよび上記アミノ酸配列の何れかと 52%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドであってイネいもち病菌に対する抗菌活性を示す当該ポリぺプチド、の単独又は何れかのポリペプチドの組み合せから成る抗菌タンパク質。

1 0. タモギタケの水性抽出液から硫安 75%飽和を使用する硫安沈殿法で沈殿する画分を回収する工程；および

上記画分をイオン交換クロマトグラフィーにかけ N a C 1濃度 5 OmMから 6 00Mの濃度で溶出する画分を回収する工程；

を含む、請求項 1ないし 9のいずれか 1項に記載の抗菌タンパク質の製造方法。

1 1. 請求項 1ないし 9のいずれか 1項に記載の抗菌タンパク質をコードする遺伝子。

1 2. 配列番号 1の塩基 7 1— 502の塩基配列又は配列番号 3の塩基 2.2 6— 651の塩基配列、上記塩基配列中に 1〜複数個の塩基の置換、欠失、挿入及び Z又は付加を有する塩基配列、または上記塩基配列とストリンジェントな条件下でハイプリダイズする塩基配列を有する請求項 1 1に記載の遺伝子。

1 3. 配列番号 1の塩基 7 1— 502の塩基配列又は配列番号 3の塩基 22 6 -65 1の塩基配列と 60%以上の相同性を有する塩基配列を有する請求項 1 1又は 1 2に記載の遺伝子。

14. 配列番号 1の塩基 7 1— 502の塩基配列又は配列番号 3の塩基 22 6 - 651の塩基配列と 70%以上の相同性を有する塩基配列を有する請求項 1

1又は 1 2に記載の遺伝子。

1 5. 配列番号 1の塩基 71— 502の塩基配列又は配列番号 3の塩基 22 6- 6 5 1の塩基配列と 80%以上の相同性を有する塩基配列を有する請求項 1 1又は 1 2に記載の遺伝子。

1 6. 配列番号 1の塩基 7 1— 502の塩基配列又は配列番号 3の塩基 22 6- 65 1の塩基配列と 90%以上の相同性を有する塩基配列を有する請求項 1 1又は 1 2に記載の遺伝子。

1 7 . 配列番号 1の塩基 7 1— 5 0 2の塩基配列又は配列番号 3の塩基 2 2 6 - 6 5 1の塩基配列と 9 5 %以上の相同性を有する塩基配列を有する請求項 1 1又は 1 2に記載の遺伝子。

1 8 . タモギタケ由来の抗菌タンパク質をコードする遺伝子を得るためのォリゴヌクレオチドであって、

配列番号 1又は 3に示す抗菌タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列から以下の条件を満たすように 2つの領域を選択し：

1 ) 各領域の長さが 1 5— 3 0塩基であること；

2 ) 各領域中の G + Cの割合が 4 0— 6 0 %であること；

上記領域と同じ塩基配列若しくは上記領域に相捕的な塩基配列を有する一本鎖 D N Aを製造し、または、上記一本鎖 D N Aによってコードされるアミノ酸残基を変化させないように遺伝子暗号の縮重を考慮した一本鎖 D N Aの混合物を製造し、さらに必要であれば上記抗菌タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列に対する結合特異性を失わないように修飾した上記一本鎖 D N Aを製造する

ことを含む方法により製造された当該オリゴヌクレオチド。

1 9 . 配列番号 1 0ないし 1 9の何れかに記載のヌクレオチド配列を有する請求項 1 8に記載のォリゴヌクレオチド。

2 0 . 請求項 1 8又は 1 9に記載のオリゴヌクレオチドの 2種をプライマー対として用いて、タモギタケ子実体 c D N Aライブラリーを铸型にして核酸増幅反応を行い請求項 1ないし 9のいずれか 1項に記載の抗菌タンパク質をコードする遺伝子の一部を増幅し、得られた増幅産物をプローブとして使用して上記 c D N Aライブラリ一をスクリ一二ングして完全長 c D N Aクローンを単離することを含む、請求項 1 1ないし 1 7のいずれか 1項に記載の遺伝子の単離方法。

2 1 . 請求項 1 1ないし 1 7のいずれか 1項に記載の遺伝子を含む組換えべクタ一。

2 2 . ベクターが発現ベクターである請求項 2 1に記載の組換えベクター。

2 3 . 宿主生物に請求項 2 1または 2 2に記載の組換えベクターを導入して得られる形質転換体。

2 4 . 病害抵抗性植物である、請求項 2 3の形質転換体。

25. 請求項 1ないし 9のいずれか 1項に記載の抗菌タンパク質を有効成分として含む抗菌剤。

26. 請求項 2 3の形質転換体によって発現される、組換えタンパク質。